CN110938654A

CN110938654A - 一种细胞转染试剂及其应用

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Publication number: CN110938654A
Application number: CN201911267153.1A
Authority: CN
Inventors: 陈敬伟; 彭娟; 王凯花; 夏清梅; 王富杰; 潘讴东
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2020-03-31

Abstract

本发明属于生物技术与基因治疗领域，涉及一种细胞转染试剂及其应用，具体涉及一种细胞转染试剂及其在重组腺相关病毒载体生产中的应用。所述细胞转染试剂包括溶质PEI“MAX”、辅助试剂PBS和溶剂。使用本发明公开的细胞转染试剂进行重组腺相关病毒载体的生产，可以大大的提高病毒载体的产率，且降低了生产成本。

Description

一种细胞转染试剂及其应用

技术领域

本发明属于生物技术与基因治疗领域，涉及一种细胞转染试剂及其应用，具体涉及一种细胞转染试剂及其在重组腺相关病毒载体生产中的应用。

背景技术

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的一种方法。而将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体。重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated viral，AAV)由于具有低免疫原性，体内的感染效率极高，不同血清型AAV可以靶向心脏，肝脏，骨骼肌等组织，具有广泛的应用价值。

然而，AAV生产成本极高限制了其应用范围。James A.Allay采用传统钙转质粒工艺生产AAV单个细胞产量只能达到6.0×10³vgs，且质粒用量大，耗材用量大，纯化繁琐，极大地降低了相关科研人员工作效率^[1]。目前已有一些文献(例如Marc-André Robert，YongHong Chen等)报导了PEI转染质粒的方法生产AAV^[2,3]，但是这些报道的技术依然存在如下问题：1)产量仍较低，单个细胞产量只有10⁴～10⁵vgs；2)生产成本高(质粒用量高，耗材用量大)；3)生产周期偏长。

参考文献

[1]ALLAY J A,SLEEP S,LONG S,et al.Good manufacturing practiceproduction of self-complementary serotype 8adeno-associated viral vector fora hemophilia B clinical trial[J].Human gene therapy,2011,22(5):595-604.

[2]ROBERT M A,CHAHAL P S,AUDY A,et al.Manufacturing of recombinantadeno-associated viruses using mammalian expression platforms[J].Biotechnology journal,2017,12(3):

[3]CHEN Y H,KEISER M S,DAVIDSON B L.Adeno-Associated VirusProduction,Purification,and Titering[J].Current protocols in mouse biology,2018,8(4):e56.

发明内容

本发明克服了常规钙转染试剂和PEI转染试剂转染效率低，转染稳定性差等问题，提供了一种改良的PEI转染试剂及其在重组腺相关病毒载体(AAV)生产中的应用。

具体的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一个方面公开了一种细胞转染试剂，所述试剂包括溶质PEI“MAX”、辅助试剂PBS和溶剂。

线性聚乙烯亚胺盐酸盐(Linear Polyethylenimine Hydrochloride，PEI“MAX”)是线性化聚乙烯亚胺PEI 25,000的升级产品，是一种功能更为强大的瞬时转染试剂。与PEI25000的区别在于：1)完全水解(去乙酰化)2)PEI 25000的盐酸盐形式，具更高的水溶特性3)含更长连续性乙烯亚胺片段，其质子化氮水平比PEI25000提高11％以上。

优选的，所述溶质PEI“MAX”的浓度为1-10mg/mL。

应当理解，本发明公开的细胞转染试剂中溶质PEI“MAX”的浓度并不限于1-10mg/mL，本领域技术人员可以根据需要选择任意合适的溶质PEI“MAX”浓度，且均在本发明的保护范围之内。

优选的，所述辅助试剂PBS浓度为10-100mM。

应当理解，本发明公开的辅助试剂PBS浓度并不限于10-100mM，本领域技术人员可以根据需要选择任意合适的溶质PBS浓度，且均在本发明的保护范围之内。

优选的，所述溶剂为双蒸水。

优选的，所述试剂的pH值为2.3～7.2。

在本发明的一些优选实施例中，所述溶质PEI“MAX”的浓度为2-10mg/mL，所述pH值为4.5-7.2。

优选的，所述细胞转染试剂PEI“MAX”与DNA的质量比为(2-3)：1。

本发明第二个方面公开了上述的试剂在AAV生产中的应用。

优选的，通过所述试剂将目的质粒转染到目的细胞中。

更优选的，所述质粒除了目的质粒之外还包括辅助质粒和血清型质粒。

在本发明的有些优选实施例中，所述目的质粒包含至少一个AAV反向末端重复序列和目的基因；所述血清型质粒包含AAV rep和cap基因，辅助质粒包含AAV生产所需的其他基因。

进一步的，所述目的质粒、血清型质粒和辅助质粒的质量比例为1：(1-2)：(1-3)。

在本发明的一些具体实施例中，所述目的质粒(pAAV-target)的用量为2-10μg、血清型质粒(rep/cap)的质粒用量为2-10μg、辅助质粒(pHelper)的用量为6-30μg。

优选的，所述血清型质粒包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV PHP.eB、AAV Retro或其他衍生质粒。

上述应用中，采用qPCR检测病毒产量，SDS-PAGE检测病毒纯度，具体方法参见文献[3]。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

使用本发明公开的细胞转染试剂进行重组腺相关病毒载体的生产，可以大大的提高病毒载体的产率，且降低了生产成本。

附图说明

图1为本发明实施例中不同浓度的转染试剂对病毒产量的影响；

图2为本发明实施例中不同pH的转染试剂对病毒产量的影响；

图3为本发明实施例中不同质粒用量对病毒产量的影响；

图4为本发明实施例中纯化后的病毒载体SDS-PAGE结果；

图5为本发明实施例中改良的细胞转染试剂对不同血清型AAV产量影响结果(图中VP1、VP2和VP3为AAV的三种结构蛋白)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1不同浓度的转染试剂对病毒产量的影响

细胞培养至转染所需的融合度：复苏HEK293T细胞(购买于ATCC)至10cm培养皿中进行培养，用含10％胎牛血清的DMEM培养3代后，按每个10cm培养皿接种9.0×10⁶个细胞的接种比例进行细胞扩增，细胞存活率大于90％；所述培养箱CO₂浓度为5％，温度为37℃，培养18h至细胞融合度达90％。

每皿中细胞转染试剂PEI“MAX”与DNA的质量比为2.8∶1，辅助试剂PBS浓度为10mM；配制A液和B液，步骤如下：

A液：按比例取一定量的PEI“MAX”(2、4、6、8、10mg/mL，pH＝6.30)用DMEM稀释至0.5mL，振荡混合均匀；

B液：取目的质粒(pAAV-CMV-EGFP-2A-MCS-3FLAG)用量为2.5μg、血清型质粒(AAV9)质粒用量为5μg、辅助质粒(pHelper)的用量7.5μg用DMEM稀释至0.5mL，振荡混合均匀；将A液与B液混合均匀，静置8min，同时将融合度90％的细胞的培养基更换为4mL DMEM。将混合后的试剂逐滴加入培养皿中，4h后向培养皿中加入5mL含20％胎牛血清的DMEM。

纯化：细胞培养48h后，将细胞吹下，收集至离心管中，在液氮中冷冻5min，在37℃中融化10min，重复三次。将冻融产物4000rpm离心30min，留取上清。将上清装入超速离心管中，在离心管底部垫0.5mL 60％的碘克沙醇，100000g离心1h，留取底部2.5mL溶液，病毒回收率约为90％。在超速离心管中，从上至下依次为1mL 15％的碘克沙醇，2mL 25％的碘克沙醇，2mL 40％的碘克沙醇，1mL60％的碘克沙醇。将超速离心留取液缓慢加入超速离心管中，用水平转子270000g梯度离心2h，吸取40％的碘克沙醇。

将吸取的40％的碘克沙醇转移至50mL100kDa的赛多利斯超滤离心管中，用1×PBS稀释反复超滤5次，浓缩至0.5mL分装待用，经qPCR检测病毒产量。

病毒产量计算公式如下：

M_DNA(mol)＝m_DNA(g)/([DNA长度(bp)×617.96g/mol]+36.04g/mol)；

DNA拷贝数＝M_DNA(mol)×6.022×10²³molecules/mol；

滴度＝DNA拷贝数(qPCR检测)×稀释倍数×2；

产量＝滴度×体积；

617.96g/mol——每个碱基对的平均分子量；

36.04g/mol——DNA末端2个-OH和2个-H；

6.022×10²³——阿伏伽德罗常数。

结果如图1所示，从图中可以看出，PEI“MAX”浓度为2mg/mL时，病毒的产量最高。

实施例2不同pH的转染试剂对病毒产量的影响

细胞培养至转染所需的融合度，具体方法同实施例1。

每皿细胞转染试剂PEI“MAX”与DNA按2.8∶1的用量使用，辅助试剂PBS选择浓度为10mM；配制A液和B液，步骤如下：

A液：取一定量的PEI“MAX”(2mg/mL，pH＝4.5、5.4、6.3、7.2)用DMEM稀释至0.5mL，振荡混合均匀；

B液：取目的质粒(pAAV-CMV-MCS-EGFP-3FLAG)用量为2.5μg，血清型质粒(AAV9)质粒用量为5μg，辅助质粒(pHelper)的用量为7.5μg，用DMEM稀释至0.5mL，振荡混合均匀；将A液与B液混合均匀，静置8min，同时将融合度90％的细胞的培养基更换为4mLDMEM。将转染试剂逐滴加入培养皿中，4h后向培养皿中加入5mL含20％胎牛血清的DMEM。

纯化：具体方法同实施例1。将40％的碘克沙醇转移至50mL 100kDa的赛多利斯超滤离心管中，用1×PBS稀释反复超滤5次，浓缩至0.5mL分装待用，经qPCR检测单病毒产量。结果如图2所示，从图2可以看出，pH值为6.3时，病毒的产量最高。

实施例3不同质粒用量对病毒产量的影响

细胞培养至转染所需的融合度，具体方法同实施例1。

A液：取一定量的PEI“MAX”(2mg/mL，pH＝6.3)用DMEM稀释至0.5mL，振荡混合均匀；B液：取目的质粒(pAAV-CMV-MCS-EGFP-3FLAG)用量分别为2.5、5、7.5和10μg、血清型质粒(AAV9)质粒用量分别为5、10、15和20μg、辅助质粒(pHelper)的用量分别为7.5、15、22.5和30μg，用DMEM稀释至0.5mL，振荡混合均匀；将A液与B液混合均匀，静置8min，同时将融合度90％的细胞的培养基更换为4mLDMEM。将转染试剂逐滴加入培养皿中，4h后向培养皿中加入5mL含20％胎牛血清的DMEM。

纯化：具体方法同实施例1。将40％的碘克沙醇转移至50mL 100kDa的赛多利斯超滤离心管中，用1×PBS稀释反复超滤5次，浓缩至0.5mL分装待用，经qPCR检测病毒产量。结果如图3所示，从图中可以看出目的质粒、血清型质粒和辅助质粒的浓度分别为5、10和15μg时，病毒产量最高。

实施例4新旧工艺产量对比

细胞培养至转染所需的融合度，具体方法同实施例1。

每皿细胞转染试剂PEI“MAX”与DNA按2.8∶1的用量使用，辅助试剂PBS浓度为10mM；配制A液和B液，步骤如下：

A液：取42μL的PEI“MAX”(2mg/mL，pH＝6.30)用DMEM稀释至0.5mL，振荡混合均匀；B液：取目的质粒(pAAV-target)用量为5μg、血清型质粒(rep/cap)：AAV9、AAV8、AAVPHP.eB、AAVretro、AAV1用量均为10μg、辅助质粒(pHelper)的用量15μg用DMEM稀释至0.5mL，振荡混合均匀；将A液与B液混合均匀，静置8min，同时将融合度90％的细胞的培养基更换为4mLDMEM。将转染试剂逐滴加入培养皿中，4h后向培养皿中加入5mL含20％胎牛血清的DMEM。

传统工艺钙转目的质粒(pAAV)用量为10μg、血清型质粒(rep/cap)质粒用量为10μg、辅助质粒(pHelper)的用量30μg。

纯化：具体方法同实施例1。将40％的碘克沙醇转移至50mL 100kDa的赛多利斯超滤离心管中，用1×PBS稀释反复超滤5次，浓缩至0.5mL分装待用，经qPCR检测每皿产量高达2.85×10¹²vgs，SDS-PAGE检测病毒达到电泳纯(如图5所示)。图5中泳道分别为：1—AAV9；2—AAV8；3—AAVPHP.eB；4—AAVretro；5—AAV1。

其中，SDS-PAGE检测方法如下：

1.从4℃冰箱取出2*Loading Buffer,-20℃冰箱取出BSA(0.1ug/ml)样本对照品，振荡离心后置于冰上；

2.样本体积为10ul，分别加入10ul 2*Loading Buffer；振荡混匀后离心(3000g,10S)，将样本放入95度沸水中煮5Min；

3.取出样本后，放入离心机离心(3000g,10S)，将样本按送样单中的顺序排列整齐，待上样；

4.从4度冰箱取出一块10％胶安置在电泳槽中，倒入电泳液，观察1min后，看是否漏液；

5.拔去胶板中的梳子，用1ml枪吹打胶孔，吹走胶孔中的杂质；

6.上样：每块胶上样10个，每孔20ul；

上样顺序如下：

Marker BSA0.2ug 0.4ug 0.8ug样本1，样本2，样本3，……

7.将槽中电泳液补满后，插入盖板，先调整电压为80V，电流300mA，时间30Min进行跑胶，当样本跑成一条直线时，后调整电压为120V，时间50Min左右进行跑胶，当样本跑到槽底时即可停止；

8.电泳结束后，使用染色脱色仪器进行染色脱色；

9.从电泳槽中取出胶放入盛有清水的皿中，同时从染色脱色仪中取出一块胶板，再放入一张滤纸；

10.将胶板放入皿中展开，把胶放在中间，无气泡后把滤纸盖在上面，然后合上盖子，放入仪器中进行操作；

11.在使用仪器前已经将染色脱色时间调整完毕(10Min))，直接将一块胶板放入仪器中进行染色脱色；

12.放入皿中拍照。

从图4可以看出，相对于传统工艺，采用新工艺(也就是采用本发明公开的细胞转染试剂进行转染)大大增加了得到的病毒产量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种细胞转染试剂，其特征在于，所述试剂包括溶质PEI“MAX”、辅助试剂PBS和溶剂。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述溶质PEI“MAX”的浓度为1-10mg/mL。

3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述辅助试剂PBS浓度为10-100mM。

4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述溶剂为双蒸水。

5.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂的pH值为2.3～7.2。

6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂在AAV生产中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过所述试剂将目的质粒转染到目的细胞中。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所用质粒除了目的质粒之外还包括辅助质粒和血清型质粒。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述目的质粒包含至少一个AAV反向末端重复序列和目的基因；所述血清型质粒包含AAV rep和cap基因，辅助质粒包含AAV生产所需的其他基因。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述目的质粒、血清型质粒和辅助质粒的质量比例为1：(1-2)：(1-3)。