TW202417619A - 生產重組 ａａｖ 顆粒之方法 - Google Patents
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Abstract
本文報導一種溶解生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞之方法，該方法包含以下步驟：使哺乳動物細胞培養液接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑、較佳為 Triton CG 110，且從而溶解生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞並釋放生產的重組 AAV 顆粒，其中該哺乳動物細胞培養液包含經培養之生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞及用於培養該等生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞之培養基 (用過的培養基)。
Description
本發明處於基因治療的領域。更準確地說，本文報導了一種自生產性細胞中釋放重組 AAV 顆粒之方法，其中使用 Triton CG 110 來溶解細胞。
基因治療廣義上係指治療性投予基因物質以修飾活細胞的基因表現，因而改變其生物學特性。經過數十年的研究，基因治療已進入市場，並預期將變得越來越重要。一般來說，基因療法可分為活體內或離體方法。
目前，大多數活體內療法依賴於使用重組腺相關病毒 (rAAV) 載體進行 DNA 遞送。AAV 是一種小的、天然存在的、非致病性小病毒，其由無套膜之二十面體殼體組成。其包含大約 4.7 kb 之單股 DNA 基因體。野生型 AAV 載體的基因體攜帶兩種基因 rep 及 cap，其側翼是反向末端重複 (ITR)。ITR 對於順式病毒複製及包裝是必需的。rep 基因編碼四種不同的蛋白質，其表現係由兩個可選擇的啟動子 P5 及 P19 所驅動。此外，經由交替剪接產生不同的形式。Rep 蛋白具有多重功能，諸如，例如，DNA 結合、核酸內切酶及解旋酶活性。其在基因調控、位點特異性整合、切除、複製及包裝中發揮作用。cap 基因編碼三個殼體蛋白及一個組裝活化蛋白。藉由使用選擇性剪接及選擇性起始密碼子用法而達成差異表現這些蛋白質，且由位於 rep 基因之編碼區的單一啟動子 P40 驅動表現。
在經工程化之治療性 rAAV 載體中，病毒基因被轉基因表現卡匣替換，該表現卡匣之側翼仍接病毒 ITR，但在所選啟動子之控制下編碼所關注基因。與野生型病毒不同，經工程化 rAAV 載體不經歷位點特異性整合於宿主基因體中，而主要在轉導細胞核中維持游離基因體。
AAV 本身不具有複製能力，但需要輔助基因的功能。此在自然界中由共感染之輔助病毒所提供，諸如，例如腺病毒或單純皰疹病毒。例如，已知五個腺病毒基因，即 E1A、E1B、E2A、E4 及 VA 對 AAV 複製為必要者。與其他編碼蛋白質之輔助基因相比，VA 是一種小 RNA 基因。
為生產 rAAV 載體，將攜帶 ITR 側翼之轉基因的 DNA 導入至包裝宿主細胞株，其亦包含 rep 及 cap 基因以及所需之輔助基因。有許多方法可將這三組 DNA 元件導入至細胞中以及許多方法將其組合到不同 DNA 質體上 (參見，例如，Robert, M.A.等人，Biotechnol. J. 12 (2017) 1600193)。
已廣泛地使用兩種一般生產方法。在三重轉染方法中，包含 rep/cap 的質體及包含 rAAV 轉基因的質體與攜帶所需之腺病毒輔助基因的腺病毒輔助質體瞬時共轉染。該方法可使用 CHO 或 HEK 細胞進行。或者，可將 rep/cap 及病毒輔助基因體合在一個更大的質體上 (雙轉染方法)。第二種方法包括用兩個桿狀病毒感染昆蟲細胞 (Sf9)，一者攜帶 rAAV 基因體而另一者攜帶 rep 及 cap。在該系統中，桿狀病毒質體本身提供輔助功能。同樣地，單純皰疹病毒係與 HEK293 細胞或 BHK 細胞合併使用。最近 Mietzsch 等人 (Hum. Gene Ther. 25 (2014) 212-222; Hum. Gene Ther. Methods 28 (2017) 15-22) 將 rep 及 cap 穩定地整合到經工程化 Sf9 細胞的基因體中。對於這些細胞，攜帶 rAAV 轉基因的單桿狀病毒足以產生 rAAV 載體。Clark 等人 (Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1329-1341) 產生具有將 rep/cap 基因 及 rAAV 轉基因整合至其基因體中的 HeLa 細胞株。經由野生型腺病毒轉染細胞誘導 rAAV 載體的產生，並產生 rAAV 載體及腺病毒的混合原液。
Arvind Srivastava 等人報導了 AAV 病毒載體之製造挑戰及合理調配物開發 (J. Pharm Sci. 110 (2021) 2609-2624)。
Mafalda Moleirinho 等人報導了使用聚山梨醇酯 20 作為細胞溶解替代方案的臨床級溶瘤腺病毒純化 (Curr. Gene Ther. 18 (2018) 1-9).WO 2022/003565 報導了純化生物治療劑的清潔劑及方法。
本發明至少部分基於以下發現：AAV 親和力層析中重組 AAV 顆粒的回收率，即產率 (基於殼體的產率以及基於基因體的產率兩者)，受到影響/取決於清潔劑，該清潔劑用於在 AAV 親和力層析之前溶解生產重組 AAV 顆粒的細胞。
本發明進一步至少部分基於以下發現：在 AAV 親和力層析中獲得的滿的重組 AAV 顆粒與空的重組 AAV 顆粒之比率受到影響/取決於清潔劑，該清潔劑用於在 AAV 親和力層析之前溶解生產重組 AAV 顆粒的細胞。
已發現，藉由使用烷基聚葡萄糖苷清潔劑可以在 AAV 親和力層析中增加重組 AAV 顆粒的 (基於殼體的以及基於基因體的) 產率兩者以及滿的重組 AAV 顆粒與空的重組 AAV 顆粒之比率，該烷基聚葡萄糖苷清潔劑用於在 AAV 親和力層析步驟之前溶解生產重組 AAV 顆粒的細胞。
先前技術並沒有提出將烷基聚葡萄糖苷 (APG) 用於溶解生產 AAV 的細胞，更沒有提出解決提供增加重組 AAV 顆粒的產率及滿的重組 AAV 顆粒與空的重組 AAV 顆粒之比率的方法的問題。
因此，本發明包括下列實施例：
1. 一種溶解生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞之方法，其包含下列步驟：
- 使哺乳動物細胞培養液接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑，
並且從而溶解生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞，
其中哺乳動物細胞培養液包含經培養之生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞及用於培養該等生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞之培養基 (用過的培養基)。
2. 一種自生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞中釋放重組 AAV 顆粒之方法，其包含下列步驟：
- 使哺乳動物細胞培養液接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑，
並且從而溶解生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞，
其中哺乳動物細胞培養液包含經培養之生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞及用於培養該等生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞之培養基 (用過的培養基)。
3. 一種純化重組 AAV 顆粒之方法，其包含下列步驟：
- 使哺乳動物細胞培養液接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑，
- 自混合物中移除細胞碎片，以及
- 用 AAV 親和力層析來純化重組 AAV 顆粒，
並且從而純化重組 AAV 顆粒，
其中哺乳動物細胞培養液包含經培養之生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞及用於培養該等生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞之培養基 (用過的培養基)。
4. 一種純化重組 AAV 顆粒之方法，其包含下列步驟：
- 藉由使相應的哺乳動物細胞培養液與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸而自生產性哺乳動物細胞中釋放重組 AAV 顆粒，以及
- 用 AAV 親和力層析來純化重組 AAV 顆粒
從而純化重組 AAV 顆粒，
其中哺乳動物細胞培養液包含經培養之生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞及用於培養該等生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞之培養基 (用過的培養基)。
5. 一種生產包含編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸的重組 AAV 顆粒的方法，其中該方法包含下列步驟：
(i) 提供包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的一種或多種質體；
(ii) 提供包含核酸的質體，該核酸編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本，該轉錄本於 AAV ITR 之間穿插；
(iii) 將一種或多種哺乳動物細胞與提供的質體接觸並執行以下操作中之一者：進一步加入轉染試劑，並視情況地孵育質體/轉染試劑/細胞混合物；或提供物理方式諸如電流，以將核酸引入細胞中；
(iv) 培養經轉染之細胞；
(v) 收穫經培養之細胞及培養基以產生哺乳動物細胞培養液；
(vi) 藉由使哺乳動物細胞培養液接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑來溶解細胞，以產生哺乳動物細胞培養液溶解產物；以及
(vii) 視情況地用 AAV 親和力層析自培養液溶解產物中分離重組 AAV 顆粒；
從而生產包含編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸的重組 AAV 顆粒。
6. 一種生產包含編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸的重組 AAV 顆粒的方法，其中該方法包含下列步驟：
(i) 提供包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的一種或多種質體；
(ii) 提供包含核酸的質體，該核酸編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本；
(iii) 或者
(a) 藉由使一種或多種哺乳動物細胞與 (i) 提供的質體接觸，透過以下操作中之一者來產生穩定的經轉染之細胞：進一步加入轉染試劑並視情況地孵育質體/轉染試劑/細胞混合物，或提供物理方式諸如電流以將核酸引入細胞中；選擇第一經穩定轉染之細胞；使選定的第一經穩定轉染之細胞與 (ii) 提供的質體接觸並執行以下操作中之一者：進一步加入轉染試劑並視情況地孵育質體/轉染試劑/細胞混合物，或提供物理方式諸如電流以將核酸引入細胞中；或
(b) 藉由以下方式產生經瞬時轉染之細胞：使一種或多種哺乳動物與 (i) 及 (ii) 提供的質體接觸，並且執行以下操作中之一者：進一步加入轉染試劑並視情況地孵育質體/轉染試劑/細胞混合物，或提供物理方式諸如電流以將核酸引入細胞中；
從而產生經轉染之細胞；
(iv) 培養 (iii) 的轉染細胞；
(v) 收穫經培養之細胞及培養基以產生哺乳動物細胞培養液；
(vi) 藉由使哺乳動物細胞培養液接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑來溶解細胞，以產生哺乳動物細胞培養液溶解產物；以及
(vii) 視情況地用 AAV 親和力層析自哺乳動物細胞培養液溶解產物中分離重組 AAV 顆粒；
從而生產包含編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸的重組 AAV 顆粒。
7. 一種純化重組 AAV 顆粒之方法，其包含以下步驟：
a) 收穫經培養之生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞及包含 rAAV 顆粒的細胞培養上清液，以產生哺乳動物細胞培養液；
b) 視情況地濃縮在步驟 (a) 中產生的收穫物，以產生濃縮哺乳動物細胞培養液；
c) 藉由使培養液接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑來溶解步驟 (a) 中產生的哺乳動物細胞培養液或步驟 (b) 中產生的濃縮哺乳動物細胞培養液中包含的哺乳動物細胞，以產生哺乳動物細胞培養液溶解產物；
d) 處理在步驟 (c) 中產生的溶解產物以減少溶解產物中的污染核酸，從而產生核酸減少的溶解產物；
e) 視情況地過濾在步驟 (d) 中產生的核酸減少的溶解產物，以產生澄清溶解產物，且視情況地稀釋澄清溶解產物以產生經稀釋之澄清溶解產物；
f) 將在步驟 (d) 中獲得的核酸減少的溶解產物或在步驟 (e) 中產生的澄清溶解產物或經稀釋之澄清溶解產物經受 AAV 親和力管柱層析，以產生包含重組 AAV 顆粒的管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地濃縮管柱洗出液，以產生經濃縮之管柱洗出液；
從而純化重組 AAV 顆粒。
8. 如實施例 7 之方法，其進一步包含下列步驟：
g) 將在步驟 (f) 中產生的管柱洗出液或經濃縮之管柱洗出液經受粒徑篩析管柱層析 (SEC)，以產生包含 rAAV 顆粒的第二管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地稀釋第二管柱洗出液，以產生經稀釋之第二管柱洗出液；
h) 視情況地將在步驟 (g) 中產生的第二管柱洗出液或經稀釋之第二管柱洗出液經受陰離子交換層析，以產生包含 rAAV 顆粒的第三管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地稀釋第三管柱洗出液，以產生經稀釋之第三管柱洗出液；及
i) 過濾在步驟 (g) 中產生的第二管柱洗出液或經稀釋之第二管柱洗出液，或過濾在步驟 (h) 中產生的第三管柱洗出液或經濃縮之第三管柱洗出液，
並且從而純化重組 AAV 顆粒。
9. 如實施例 7 之方法，其進一步包含下列步驟
g) 將在步驟 (f) 中產生的管柱洗出液或經稀釋之管柱洗出液經受陽離子交換管柱層析，以產生包含 rAAV 顆粒的第二管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地稀釋管柱洗出液，以產生經稀釋之第二管柱洗出液；
h) 將在步驟 (g) 中產生的管柱洗出液或經稀釋之管柱洗出液經受陰離子交換層析，以產生包含 rAAV 顆粒的第三管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或生產/程序相關雜質分離，並視情況地濃縮第三管柱洗出液，以產生經濃縮之第三管柱洗出液，
並且從而純化重組 AAV 顆粒。
10. 如實施例 7 之方法，其進一步包含下列步驟：
g) 將在步驟 (f) 中產生的管柱洗出液或經稀釋之管柱洗出液經受陰離子交換層析，以產生包含 rAAV 顆粒的第二管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或生產/程序相關雜質分離，並視情況地濃縮第二管柱洗出液，以產生經濃縮之第二管柱洗出液；
h) 將在步驟 (g) 中產生的管柱洗出液或經稀釋之管柱洗出液經受陽離子交換管柱層析，以產生包含 rAAV 顆粒的第三管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地濃縮第三管柱洗出液，以產生經濃縮之第三管柱洗出液，
並且從而純化重組 AAV 顆粒。
11. 一種烷基聚葡萄糖苷清潔劑的用途，其用於溶解生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞，以在後續 AAV 親和力層析中提高所獲得的重組 AAV 顆粒之產率。
12. 一種烷基聚葡萄糖苷清潔劑的用途，其用於溶解生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞，以在後續 AAV 親和力層析中提高所獲得的 (在洗出液級分中) 滿的重組 AAV 顆粒與空的重組 AAV 顆粒之比率。
13. 一種烷基聚葡萄糖苷清潔劑的用途，其用於提高重組 AAV 顆粒之產率，其中用烷基聚葡萄糖苷清潔劑溶解生產 AAV 顆粒的哺乳動物細胞，且其中在後續 AAV 親和力層析中獲得重組 AAV 顆粒。
14. 一種烷基聚葡萄糖苷清潔劑的用途，其用於提高重組 AAV 顆粒之產率，其中用烷基聚葡萄糖苷清潔劑溶解生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞且其中在後續 AAV 親和力層析步驟後判定產率。
15. 一種烷基聚葡萄糖苷清潔劑的用途，其用於在後續 AAV 親和力層析中提高所獲得的 (在洗出液級分中) 滿的重組 AAV 顆粒與空的重組 AAV 顆粒之比率，其中在 AAV 親和力層析之前用烷基聚葡萄糖苷清潔劑溶解生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞。
16. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中烷基聚葡萄糖苷清潔劑為 58.0 至 62.0 (w/v)% D-葡萄哌喃糖癸基辛基醣苷寡聚物與 38.0 至 42.0 (w/v)% 水之混合物。
17. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中烷基聚葡萄糖苷清潔劑具有 CAS 號 68515-73-1。
18. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中哺乳動物細胞培養液為粗製哺乳動物細胞培養液。
19. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中使接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係在經定義的烷基聚葡萄糖苷清潔劑濃度下，與烷基聚葡萄糖苷清潔劑一起孵育經定義的時間。
20. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中烷基聚葡萄糖苷清潔劑係在溶液中。
21. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中哺乳動物細胞培養液係以其體積之 2.5% 至 20% (2.5% (v/v) 至 20% (v/v)) 與包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液組合。
22. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中哺乳動物細胞培養液係以其體積之 5 % 至 10 % (5 % (v/v) 至 10 % (v/v)) 與包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液組合。
23. 如實施例 20 至 22 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液包含濃度為 5% 至 20% 的烷基聚葡萄糖苷清潔劑。
24. 如實施例 20 至 22 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液包含濃度為 7.5 % 至 15% 的烷基聚葡萄糖苷清潔劑。
25. 如實施例 20 至 22 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液較佳地包含濃度為約 10% 的烷基聚葡萄糖苷清潔劑。
26. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別持續 30 分鐘至 90 分鐘。
27. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別持續 45 分鐘至 75 分鐘。
28. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸分別較佳地持續約 60 分鐘。
29. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別在 25℃ 至 45℃ 之溫度下。
30. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別在 28℃ 至 42℃ 之溫度下。
31. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別在 32°C 至 40°C 之溫度下。
32. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸較佳地係分別在約 37℃ 之溫度下。
33. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別在攪拌或搖動的情況下進行的。
34. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別在不通氣的情況下進行的。
35. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別在使接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸期間不進行 pH 調節的情況下進行的。
36. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中在接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸後，分別添加矽藻土且培養混合物 5 至 20 分鐘。
37. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中在接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或矽藻土或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑或矽藻土接觸後，分別將混合物離心或/及無菌過濾。
38. 如實施例 20 至 37 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液包含緩衝鹽。
39. 如實施例 20 至 38 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液包含 TRIS。
40. 如實施例 20 至 39 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液包含濃度為 100 mM 至 1000 mM 的緩衝鹽。
41. 如實施例 20 至 40 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液包含濃度為 250 mM 至 750 mM 的緩衝鹽。
42. 如實施例 20 至 41 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液包含濃度為 400 mM 至 600 mM 的緩衝鹽。
43. 如實施例 20 至 42 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液包含濃度為約 500 mM 的緩衝鹽。
44. 如實施例 20 至 43 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液包含離子修飾劑鹽。
45. 如實施例 20 至 44 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液較佳地包含氯化鎂(II) 作為離子修飾劑鹽。
46. 如實施例 20 至 45 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液包含濃度為 5 mM 至 200 mM 的離子修飾劑鹽。
47. 如實施例 20 至 46 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液包含濃度為 7.5 mM 至 150 mM 的離子修飾劑鹽。
48. 如實施例 20 至 47 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液包含濃度為 10 mM 至 50 mM 的離子修飾劑鹽。
49. 如實施例 20 至 48 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液較佳地包含濃度為 10 mM 至 40 mM 的離子修飾劑鹽。
50. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別在 pH 6.5-9.0 之 pH 值下。
51. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別在 pH 6.5-8.0 之 pH 值下。
52. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別在 pH 7.0-7.5 之 pH 值下。
53. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別在 pH 6.5-9.0 的 pH 值下，並且在接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸後分別將 pH 值調節至 7.0-7.5 之 pH。
54. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別在 pH 6.5-8.0 的 pH 值下，並且在接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸後分別將 pH 值調節至 7.0-7.5 之 pH。
55. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係分別在 pH 7.0-7.5 的 pH 值下，並且在接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸後分別將 pH 值調節至約 7.5 之 pH。
56. 如實施例 20 至 55 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液具有 pH 7.2 至 7.8 之 pH 值。
57. 如實施例 20 至 56 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液具有 7.3 至 7.7 之 pH 值。
58. 如實施例 20 至 57 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液具有 7.4 至 7.6 之 pH 值。
59. 如實施例 20 至 58 中任一項之方法及用途，其中包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液較佳地具有約 7.5 之 pH 值。
60. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中使哺乳動物細胞培養液接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑及核酸酶。
61. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中使哺乳動物細胞培養液接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑及 DNase I。
62. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中較佳地使哺乳動物細胞培養液接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑及 Benzonase。
63. 如實施例 60 至 62 中任一項之方法及用途，其中加入 25 U/mL 至 100 U/mL 之核酸酶。
64. 如實施例 60 至 63 中任一項之方法及用途，其中較佳地加入 50 U/mL 之每種核酸酶。
65. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中生產重組 AAV 顆粒的細胞已藉由使用 PEI 進行轉染來獲得。
66. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中親和力層析係在包含交聯聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質的層析材料上，該基質與親和配體共價結合。
67. 如前述實施例中任一項之方法及用途，其中親和力層析係在包含交聯聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質的層析材料上，該基質與親和配體共價結合。
68. 如實施例 67 之方法及用途，其中親和配體為單域抗體片段 (VHH)。
69. 如實施例 67 至 68 中任一項之方法及用途，其中親和配體與 AAV 血清型 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10 及基於其的合成血清型特異性結合。
70. 如前述請求項中任一項之方法及用途，其中親和力層析係在包含交聯聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質的層析材料上，該基質與單域抗體片段 (VHH) 共價結合，該單域抗體片段與 AAV 血清型 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10 及基於其的合成血清型特異性結合。
除所描繪和要求保護的各種實施例之外，本文所揭示之主題還涉及具有本文所揭示和要求保護的特徵的其他組合的其他實施例。因此，本文所呈現之特定特徵可在本文所揭示之標的範圍內以其他方式彼此組合，使得本文所揭示之主題包括本文所揭示之特徵的任何合適的組合。出於說明和描述的目的，已經提供了本文所揭示之主題的特定實施例的前述描述。其並非旨在窮舉或將本文所揭示之標的限制為所揭示的那些實施例。
本發明至少部分基於以下發現：AAV 親和力層析中重組 AAV 顆粒的回收率，即產率 (基於殼體的產率以及基於基因體的產率兩者)，受到影響/取決於清潔劑，該清潔劑用於在 AAV 親和力層析之前溶解生產重組 AAV 顆粒的細胞。
本發明進一步至少部分基於以下發現：在 AAV 親和力層析中獲得的滿的重組 AAV 顆粒與空的重組 AAV 顆粒之比率受到影響/取決於清潔劑，該清潔劑用於在 AAV 親和力層析之前溶解生產重組 AAV 顆粒的細胞。
已發現，藉由使用烷基聚葡萄糖苷清潔劑可以在 AAV 親和力層析中增加重組 AAV 顆粒的 (基於殼體的以及基於基因體的) 產率兩者以及滿的重組 AAV 顆粒與空的重組 AAV 顆粒之比率，該烷基聚葡萄糖苷清潔劑用於在 AAV 親和力層析步驟之前溶解生產重組 AAV 顆粒的細胞。
定義
用於進行本發明的有用方法和技術描述於例如 Ausubel, F.M.(ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997); Glover, N.D., 及 Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985), Oxford University Press; Freshney, R.I.(ed.), Animal Cell Culture – a practical approach, IRL Press Limited (1986)；Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992)；Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987)；Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998)；Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y.(1987)。
使用重組 DNA 技術能產生核酸衍生物。此類衍生物可例如在個別或數個核苷酸位置藉由取代、改變、交換、缺失或插入而修飾。修飾或衍生化可例如藉由定點誘變的方式進行。此類修飾可容易地由熟習此項技術者進行 (參見例如 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA；Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization – a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England)。
亦必須注意，除非上下文另有明確規定，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」、「一種」及「該」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「一個細胞」包括複數個此類細胞及熟習此項技術者已知之其等效物，諸如此類。同樣，術語「一」 (或「一種」)、「一個或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。亦應注意，術語「包含」、「包括」及「具有」可互換使用。
亦必須注意，除非上下文另有明確規定，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」、「一種」及「該」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「一個細胞」包括複數個此類細胞及熟習此項技術者已知之其等效物，諸如此類。同樣，術語「一」 (或「一種」)、「一個或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。亦應注意，術語「包含」、「包括」及「具有」可互換使用。
術語「AAV 輔助功能」表示 AAV 衍生的編碼序列 (蛋白質)，其可經表現以提供 AAV 基因產物及 AAV 顆粒，而 AAV 顆粒另一方面以反式作用於生產 AAV 複製及包裝。因此，AAV 輔助功能包括 AAV 開放讀序框架 (ORF)，其包括 rep 及 cap 及其他例如某些 AAV 血清型的 AAP。rep 基因表現產物已被證明具有許多功能，其中包括：識別、結合及切口 DNA 複製之 AAV 起始點；DNA解旋酶活性；及調節來自 AAV (或其他異源性) 啟動子的轉錄。cap 基因表現產物 (殼體) 提供必要的包裝功能。AAV 輔助功能用於補充 AAV 載體基因體中缺失之反式 AAV 功能。
術語「約」表示其後接著之數值 +/-20% 的範圍。在某些實施例中，術語約表示其後數值之 +/- 10% 的範圍。在某些實施例中，術語約表示其後數值之 +/- 5 % 的範圍。
如本文所用，術語「包含」、「包括」、「具有 (having、has)」、「可」、「含有」及其變體意欲為不排除其他行為或結構之可能性之開放式連接詞 (open-ended transitional phrase)、術語、或字。術語「包含」亦包括術語「由…組成」。本揭露亦涵蓋「包含」本文所呈現之實施例或元件、「由其組成」及「基本上由其組成」之本文所呈現之實施例或元件，無論是否明確陳述。
如本文所用，術語「培養」係指在細胞被轉染及生產 AAV 顆粒的條件下將細胞維持在培養基中的步驟。
如本文所用，術語「培養液」表示培養結束時生物反應器的內容物。「培養液」包含死亡和存活的哺乳動物細胞、哺乳動物細胞碎片、培養基、藉由哺乳動物細胞產生的重組產物以及藉由哺乳動物細胞產生的其他代謝產物。
可互換使用的術語「空的顆粒」及「空的重組 AAV 顆粒」表示具有 AAV 蛋白殼但其全部或部分地缺乏編碼蛋白質或被轉錄成側翼為 AAV ITR 之所關注轉錄本之核酸的 AAV 顆粒，即載體。因此，空的顆粒不會將編碼蛋白質之核酸或被轉錄成所關注轉錄本的核酸轉移到標靶細胞中。
術語「內源」表示在細胞內天然發生的；由細胞天然地產生；同樣地，「內源基因座/細胞內源基因座」是細胞中天然存在的基因座。
如本文所用，術語「外源」是指核苷酸序列並非源自特定細胞，而是藉由 DNA 遞送方法導入該細胞中，例如經由病毒載體之轉染、電穿孔或轉導方法。因此，外源核苷酸序列是人工序列，其中人工性可能起源於例如不同起源之子序列的組合 (例如，具有 SV40 啟動子之重組酶辨識序列與綠色螢光蛋白之編碼序列是人工核酸) 或起源於序列之部件的缺失 (例如，僅編碼膜結合受體之細胞外域之序列或 cDNA) 或核酸鹼基之突變。術語「內源」是指源自細胞的核苷酸序列。「外源」核苷酸序列可具有在鹼基組成上相同的「內源」對應物，但是其中序列 (例如經由重組 DNA 技術)被導入細胞中而成為「外源」序列。
如本文所用之術語「饋料批次細胞培養」係指如下批式培養：首先將細胞及培養基供應至培養生物反應器中，且在培養過程期間連續或不連續地將額外的培養營養素供給至培養物中，在培養結束之前進行或不進行定期的細胞及/或產物收穫。
可互換使用的術語「滿的顆粒」及「滿的重組 AAV 顆粒」表示具有 AAV 蛋白殼並且其中入殼有編碼蛋白質或被轉錄成側翼為 AAV ITR 之所關注轉錄本之核酸的 AAV 顆粒，即載體。因此，滿的顆粒可將編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之入殼的核酸轉移到標靶細胞中。
可互換使用的術語「滿空比」和「滿的重組 AAV 顆粒與空的重組 AAV 顆粒比率」表示在包含重組 AAV 顆粒之樣品中或在重組 AAV 顆粒製劑中，滿的重組 AAV 顆粒的數量與重組 AAV 顆粒的總數 (滿的及空的) 之數學比率。由於滿的重組 AAV 顆粒的數量至多可以與重組 AAV 顆粒的總數相同，因此比率至多可以為 1。通常，該比率小於 1，並表現為百分比。藉由判定樣品或製劑中重組 AAV 顆粒入殼的核酸的數量來判定滿的重組 AAV 顆粒的數量。這可以藉由 PCR，尤其是數字微滴 PCR (ddPCR) 來完成。藉由判定樣品或製劑中殼體蛋白的數量來判定重組 AAV 顆粒的總數。這可以藉由 ELISA，尤其是藉由殼體蛋白特異性 ELISA 來完成。
「編碼 AAV 包裝蛋白之核酸」通常是指一種或多種核酸分子，其包括提供自 AAV 載體中缺失之 AAV 功能的核苷酸序列，其係用於產生轉導潛能之重組 AAV 顆粒。編碼 AAV 包裝蛋白之核酸通常用於提供表現 AAV rep 及/或 cap 基因，以補充 AAV 複製所需之缺失的 AAV 功能；然而，核酸構建體缺乏 AAV ITR，既無法複製亦無法自行包裝。編碼 AAV 包裝蛋白之核酸可為質體、噬菌體、轉座子、黏接質體、病毒或顆粒的形式。已描述許多核酸構建體，例如常用的質體 pAAV/Ad 及 pIM29+45，其編碼 rep 及 cap 基因兩者之表現產物。參見，例如，Samulski 等人，J. Virol. 63 (1989) 3822-3828；及 McCarty 等人，J. Virol. 65 (1991) 2936-2945。已經描述許多編碼 rep 及/或 cap 基因表現產物的質體 (例如，US 5,139,941 及US 6,376,237)。這些編碼 AAV 包裝蛋白之核酸中的任一者皆可包含根據本發明之 DNA 元件或核酸。
術語「編碼輔助蛋白之核酸」通常是指一個或多個核酸分子，其包括編碼提供腺病毒輔助功能之蛋白及/或 RNA 分子的核苷酸序列。可將具有編碼輔助蛋白之核酸的質體轉染到合適的細胞中，其中該質體然後能夠支持在該細胞中產生 AAV 顆粒。這些編碼輔助蛋白之核酸中的任一者皆可包含根據本發明之 DNA 元件或核酸。該術語明確排除傳染性病毒顆粒，因其存在於自然界中，例如腺病毒、皰疹病毒或牛痘病毒顆粒。
如本文所用，術語「可操作地連接」係指兩個或更多個組分的並置，其中組分處於使其能夠以預期方式起作用的關係。例如，如果啟動子及/或增強子起到調節編碼序列/開放讀序框架/基因之轉錄的作用，則該啟動子及/或該增強子可操作地連接至該編碼序列/開放讀序框架/基因。在某些實施例中，「可操作地連接」的 DNA 序列為連續的。在某些實施例中，例如，當需要連接兩個蛋白編碼區 (例如分泌前導子及多肽) 時，序列為連續的且在相同的讀框中。在某些實施例中，可操作地連接的啟動子位於編碼序列/開放讀序框架/基因的上游，且可與其相鄰。在某些實施例中，例如，關於調節編碼序列/開放讀序框架/基因之表現的增強子序列，雖然兩種組分不相鄰，但可為可操作地連接。如果增強子增加編碼序列/開放讀序框架/基因的轉錄，則增強子可操作地連接至該編碼序列/開放讀序框架/基因。可操作地連接的增強子可位於編碼序列/開放讀序框架/基因的上游、內部或下游，且可位於距該編碼序列/開放讀序框架/基因之啟動子相當遠的距離。
術語「包裝蛋白」是指非 AAV 衍生之病毒及/或細胞功能，AAV 其複製依賴這些功能。因此，該術語涵蓋 AAV 複製所需的蛋白質及 RNA，包括參與 AAV 基因轉錄之活化、階段特異性 AAV mRNA 剪接、AAV DNA 複製、Cap 表現產物合成及 AAV 殼體組裝之部分。基於病毒的輔助功能可源自任何已知的輔助病毒，例如腺病毒、皰疹病毒 (單純皰疹病毒 I 型除外) 及牛痘病毒。
如本文所用，「AAV包裝蛋白」是指 AAV 衍生的序列，其在反式中用於生產性 AAV 複製具有功能。因此，AAV 包裝蛋白由主要的 AAV 開放讀序框架 (ORF)、rep 及 cap 所編碼。rep 蛋白已被證明具有許多功能，其中包括：識別、結合及切口 DNA 複製之 AAV 起始點；DNA解旋酶活性；及調節來自 AAV (或其他異源性) 啟動子的轉錄。cap (殼體) 蛋白提供必要的包裝功能。本文所述之 AAV 包裝蛋白用於補充 AAV 載體中缺失之反式 AAV 功能。
如本文所用，術語「重組細胞」表示最終基因修飾後的細胞，例如，舉例而言，表現所關注多肽或生產 rAAV 顆粒，並可用於以任何規模生產該所關注多肽或 rAAV 顆粒的細胞。例如，「包含外源核苷酸序列的哺乳動物細胞」已進行重組酶介導的盒式交換 (RMCE)，從而將用於所關注多肽的編碼序列導入宿主細胞的基因體中，即為「重組細胞」。儘管細胞仍能進行進一步的 RMCE 反應，但其並不欲進行。
「重組 AAV 載體」源自病毒 (例如 AAV) 的野生型基因體，經由使用分子生物學方法從病毒 (例如 AAV) 中移除野生型基因體，將其以非天然核酸 (例如轉錄成轉錄本或編碼蛋白質的核酸) 替代。通常，對於 AAV，野生型 AAV 基因體的一個或兩個反向末端重複 (ITR) 序列保留在重組 AAV 載體中。「重組」AAV 載體與野生型病毒 AAV 基因體不同，因為病毒基因體的全部或部分已被相對於病毒基因體核酸之非天然 (即異源) 序列所替換。因此，將併入非天然序列之病毒載體 (例如，AAV) 定義為「重組」載體，其在 AAV 的情況下可稱為「rAAV 載體」。
重組載體 (例如，AAV) 序列可經包裝，在本文中稱為「顆粒」，其用於隨後在離體、活體外或活體內感染細胞 (轉導)。當重組載體序列被囊裝或包裝到 AAV 顆粒中時，該顆粒亦可稱為「rAAV」。此類顆粒包括囊裝或包裝載體基因體的蛋白質。具體實例包括病毒套膜蛋白，在 AAV 的情況下，包括殼體蛋白，例如 AAV VP1、VP2 及 VP3。
如本文所用，術語「血清型」是基於不同血清學之 AAV 殼體的區別。血清學獨特性是根據抗體對一個 AAV 與另一個 AAV 之間缺乏交叉反應性所判定。此種交叉反應性之差異通常是由於殼體蛋白序列/抗原決定基之差異 (例如，由於 AAV 血清型之 VP1、VP2 及/或 VP3 序列差異)。雖然包括殼體變異體之 AAV 變異體可能在血清學上與參考 AAV 或其他 AAV 血清型沒有差異，但與參考或其他 AAV 血清型相比，其有至少一個核苷酸或胺基酸殘基不同。
在傳統定義下，血清型代表所關注病毒已針對所有存在及特徵血清型之特異性血清進行中和活性測試，且未發現中和所關注病毒的抗體。隨著發現更多天然病毒分離株及/或產生殼體突變體，與目前存在之任何血清型可能存在或不存在血清學差異。因此，在新病毒 (例如 AAV) 不具血清學差異的情況下，此種新病毒 (例如 AAV) 為相應血清型的亞組或變異體。在許多情況下，尚未對具有殼體序列修飾之突變病毒進行中和活性的血清學測試以判定其是否屬於根據傳統血清型定義的另一種血清型。因此，為方便及避免重複，術語「血清型」泛指血清學上不同的病毒 (例如 AAV) 以及血清學上不明顯的病毒 (例如 AAV) ，其可為在亞組內或給定血清型的變異體。
如本文所用，術語「轉基因」方便地指所欲或已被導入到細胞或生物體的核酸。轉基因包括任何核酸，例如被轉錄成轉錄本或其編碼多肽或蛋白質的基因。
術語「Triton CG 110」表示烷基聚葡萄糖苷清潔劑。Triton CG 110 具有 CAS 號 68515-73-1。Triton CG 110 為 58.0 至 62.0 (w/v)% D-葡萄哌喃糖癸基辛基醣苷寡聚物與 38.0 至 42.0 (w/v)% 水之混合物。
「載體」是指重組質體序列的一部分，最終直接的或以單股或 RNA 的形式包裝或囊裝，以形成病毒 (例如 AAV) 顆粒。在重組質體用於構建或製備重組病毒顆粒的情況下，病毒顆粒不包括未對應該重組質體之載體序列的「質體」部分。重組質體之此非載體部分被稱為「質體骨架」，其對質體的選殖及擴增很重要，其為繁殖及重組病毒生產所需的過程，但本身並不包裝或囊裝到病毒 (例如，AAV) 顆粒中。因此，「載體」是指被病毒顆粒 (例如，AAV) 包裝或囊裝的核酸。
重組細胞
通常，為了高效且大規模生產重組 AAV 顆粒 (rAAV 顆粒)，細胞表現並且如果可能的話亦分泌該 rAAV 顆粒。此種細胞被稱為「重組細胞」或「重組生產細胞」。
為產生「重組生產細胞」，用生產該 rAAV 顆粒所需之核酸序列 (包括所需 AAV 輔助功能) 轉染合適的哺乳動物細胞。
為表現編碼序列 (即開放讀序框架)，需額外的調控元件，諸如啟動子及多腺苷酸化訊號 (序列)。因此，開放讀序框架可操作地連接至該額外的轉錄調控元件。此可經由將其整合到所謂的表現卡匣中來達成。表現卡匣在哺乳動物細胞中具有功能而所需的最小調控元件為在該哺乳動物細胞中具有功能的啟動子，其位於開放讀序框架的上游 (即 5')，以及在該哺乳動物細胞中具有功能的多腺苷酸化訊號序列，其位於開放讀序框架的下游 (即 3')。此外，終止子序列可能存在於多腺苷酸化訊號 (序列) 的 3' 端。為達到表現，啟動子、開放讀序框架/編碼區及多腺苷酸化訊號序列須以可操作地連接的形式排列。
同樣地，被轉錄成非蛋白質編碼 RNA 的核酸稱為「RNA 基因」。對於 RNA 基因的表現，亦需要額外的調控元件，諸如啟動子及轉錄終止訊號或多腺苷酸化訊號 (序列)。這些元件的性質及定位取決於所欲驅動表現 RNA 基因的 RNA 聚合酶。因此，RNA 基因通常亦被整合到表現卡匣中。
如果為 AAV 顆粒 (它由不同的 (單體) 殼體多肽及單股 DNA 分子組成，且亦需要其他腺病毒輔助功能來生產及封裝)，則需要許多表現卡匣，其包含之開放讀序框架/編碼序列是不同的。在此種情況下，至少需要用於所需輔助功能以及VA RNA 之每個轉基因的表現卡匣，形成AAV 載體之殼體的不同多肽。因此，每個輔助功能 E1A、E1B、E2A、E4orf6、VA RNA、rep 及 cap 基因都需要單獨的表現卡匣。HEK293 細胞組成型地表現 E1A 及 E1B 輔助功能。
在本發明之所有態樣及實施例的某些實施例中，每個表現卡匣自 5' 至 3' 方向包含啟動子、開放讀序框架/編碼序列或 RNA 基因及多腺苷酸化訊號序列及/或終止子序列。在某些實施例中，開放讀序框架編碼多肽，且表現卡匣包含具有或不具有額外終止子序列的多腺苷酸化訊號序列。在某些實施例中，表現卡匣包含 RNA 基因，啟動子為第 2 型 Pol III 啟動子且存在多腺苷酸化訊號序列或 polyU 終止子。參見，例如，Song 等人，Biochemical and Biophysical Research Communications 323 (2004) 573–578。在某些實施例中，表現卡匣包含RNA 基因，啟動子為第 2 型 Pol III 啟動子及 polyU 終止子序列。
在本發明之所有態樣及實施例的某些實施例中，開放讀序框架編碼多肽，啟動子為具有或不具有內含子 A 的人類 CMV 啟動子，多腺苷酸化訊號序列為 bGH (牛生長激素) polyA 訊號序列且終止子為 hGT (人類胃泌素終止子)。
在本發明之所有態樣及實施例的某些實施例中，啟動子為具有內含子 A 的人類 CMV 啟動子，多腺苷酸化訊號序列為 bGH 多腺苷酸化訊號序列且終止子為 hGT，除了 RNA 基因之表現卡匣及選擇標記之表現卡匣，其中對於選擇標記，啟動子為 SV40 啟動子，且多腺苷酸化訊號序列為 SV40 多腺苷酸化訊號序列，且不存在終止子，且其中對於 RNA 基因，啟動子為野生型第 2 型聚合酶 III 啟動子且終止子為聚合酶 II 或 III 終止子。
腺相關病毒 (AAV)
對於 AAV 及腺病毒或皰疹病毒輔助功能的一般回顧，參見 Berns and Bohensky, Advances in Virus Research, Academic Press., 32 (1987) 243-306。AAV 的基因體係在 Srivastava 等人，J. Virol.，45 (1983) 555-564 中描述。在 US 4,797,368 中，描述針對構建重組 AAV 載體的設計考慮 (亦參見 WO 93/24641)。描述 AAV 載體的其他參考文獻為 West 等人，Virol. 160 (1987) 38-47；Kotin，Hum. Gene Ther. 5 (1994) 793-801；及 Muzyczka，J. Clin. Invest. 94 (1994) 1351。在 US 5,173,414；Lebkowski 等人，Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 3988-3996；Tratschin 等人，Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 3251-3260；Tratschin 等人，Mol. Cell. Biol., 4 (1994) 2072-2081；Hermonat 及 Muzyczka，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6466-6470；Samulski 等人，J. Virol. 63 (1989) 3822-3828 中，描述重組 AAV 載體的構建。
腺相關病毒 (AAV) 是一種複製缺陷型小病毒。其只能在細胞中複製，其中某些病毒功能由共同感染之輔助病毒提供，諸如腺病毒、皰疹病毒以及在某些情況下，痘病毒例如牛痘。儘管如此，只要存在適當的輔助病毒功能，AAV 幾乎可在任何人類、猿類或囓齒動物來源之細胞株中複製。
如果不存在輔助病毒基因，AAV 會在其宿主細胞中建立潛伏期。其基因體整合到 19 號染色體 [(Chr) 19 (q13.4)] 中的特定位點，其稱為腺相關病毒整合位點 1 (AAVS1)。對於特定的血清型 (例如 AAV-2)，已發現其他整合位點，例如，舉例而言，在染色體 5 [(Chr) 5 (p13.3)] 上，稱為 AAVS2，以及在染色體 3 [(Chr) 3 (p24.3)] 上，稱為 AAVS3。
AAV 係歸類成不同的血清型。這些已根據參數進行分配，例如紅血球凝集、致腫瘤性及 DNA 序列同源性。目前為止，已鑑別出 10 多種不同的血清型及一百多種對應於不同 AAV 演化枝的序列。
殼體蛋白的類型及對稱性決定相應 AAV 的組織向性。例如，AAV-2、AAV-4 及 AAV-5 對視網膜具特異性，AAV-2、AAV-5、AAV-8、AAV-9 及 AAVrh-10 對腦具特異性，AAV-1、AAV-2 、AAV-6、AAV-8 及 AAV-9 對心臟組織具特異性，AAV-1、AAV-2、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9 及 AAV-10 對肝臟具特異性，AAV-1、AAV-2、AAV-5 及 AAV-9 對肺具特異性。
假型分型 (Pseudotyping) 表示一種包含 AAV 基因體在各種血清型之間交叉包裝的方法，即基因體以不同來源的殼體蛋白包裝。
野生型 AAV 基因體的大小約為 4.7 kb。AAV 基因體亦包含名為 rep 及 cap 的兩個重疊基因，其包含多個開放讀序框架 (參見，例如，Srivastava 等人，J. Viral.，45 (1983) 555-564；Hermonat 等人，J. Viral.51 (1984) 329-339；Tratschin 等人，J. Virol., 51 (1984) 611-619)。Rep 蛋白編碼開放讀序框架提供四種不同大小的蛋白，稱為 Rep78、Rep68、Rep52 及 Rep40。這些蛋白涉及 AAV 的複製、修復及整合。Cap 蛋白編碼開放讀序框架提供四種蛋白質，其為 VP1、VP2、VP3 及 AAP。VP1、VP2 及 VP3 為 AAV 顆粒之蛋白質殼體的一部分。組合之 rep 及 cap 開放讀序框架在其 5' 及 3' 末端的側翼為所謂的反向末端重複 (ITR)。針對複製，除 Rep 及 Cap 蛋白外，AAV 亦需要基因 E1A、E1B、E4orf6、E2A 及 VA 之產物或另一種輔助病毒之對應因子。
例如，在血清型 2 (AAV-2) 的 AAV 的情況下，每個 ITR 的長度為 145 個核苷酸，且位於約 4470 個核苷酸之編碼序列區的側翼。ITR 的 145 個核苷酸中，有 125 個核苷酸具有回文序列且可形成 T 形髮夾結構。此種結構在病毒複製過程中具有引子的功能。剩餘之 20 個未配對的核苷酸以 D 序列表示。
AAV 基因體包含三個用於表現 rep 及 cap 基因的轉錄啟動子 P5、P19 及 P40 (Laughlin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 5567-5571)。
ITR 序列必須與編碼區以順式存在。ITR 提供具功能之複製起點 (ori)、整合到標靶細胞之基因體所需的訊號，以及自標靶細胞染色體或重組質體中之有效切除及修復。ITR 進一步包含類複製起始元件，例如 Rep 蛋白結合位點 (RBS) 及末端解析位點 (TRS)。已發現 ITR 本身可具有 AAV 載體中轉錄啟動子的功能 (Flotte 等人，J. Biol. Chem. 268 (1993) 3781-3790；Flotte 等人，Proc. Natl. Acad . Sci. USA 93 (1993) 10163-10167)。
對於複製及殼體化病毒單股 DNA 基因體，分別需要 rep 及 cap 基因產物的反式結構。
rep 基因座包含兩個內部啟動子，稱為 P5 及 P19。其包含四種蛋白質的開放讀序框架。啟動子 P5 係可操作地連接至提供編碼 Rep 蛋白 Rep78 (阻滯細胞週期的染色質切口酶) 之非經剪接 4.2 kb mRNA 及編碼 Rep 蛋白 Rep68 (位點特異性核酸內切酶) 之經剪接 3.9 kb mRNA 的核酸序列。啟動子 P19 係可操作地連接至提供編碼 Rep 蛋白 Rep52 之非經剪接 mRNA 及編碼 Rep 蛋白 Rep40 之經剪接 3.3kb mRNA (用於積累及包裝的 DNA 解旋酶) 的核酸序列。
兩個較大的 Rep 蛋白 Rep78 及 Rep68 對 AAV 雙股 DNA 複製為必要，而較小的 Rep 蛋白 Rep52 及 Rep40 似對子代、單股 DNA 積累為必要 (Chejanovsky & Carter, Virology 173 (1989) 120-128)。
較大的 Rep 蛋白 Rep68 及 Rep78 可特異性地結合至 AAV ITR 的髮夾構型。其表現出確定的酶活性，其為解決 AAV 末端複製所需。表現 Rep78 或 Rep68 足以形成感染性顆粒 (Holscher, C. 等人，J. Virol. 68 (1994) 7169-7177 及 69 (1995) 6880-6885)。
認定所有 Rep 蛋白 (主要為 Rep78 及 Rep68) 都表現出調節活性，例如 AAV 基因之誘導及抑制以及對細胞生長的抑制作用 (Tratschin 等人，Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 2884-2894；Labow 等人，Mol. Cell. Biol., 7 (1987) 1320-1325；Khleif 等人，Virology, 181 (1991) 738-741)。
重組過表現 Rep78 造成具減少之細胞生長的表型，係由於誘導 DNA 損傷。由此宿主細胞在 S 期阻滯，從而促進病毒的潛伏感染 (Berthet, C. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 13634-13639)。
Tratschin 等人報導，P5 啟動子受到 Rep78 或 Rep68 的負自動調節 (Tratschin 等人，Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 2884-2894)。由於表現 Rep 蛋白的毒性作用，在 AAV 穩定整合後，已報導某些細胞僅具非常低的表現 (參見，例如 Mendelson 等人，Virol. 166 (1988) 154-165)。
cap 基因座包含一個啟動子，稱為 P40。啟動子 P40 係可操作地連接至提供 2.6 kb mRNA 的核酸序列，該 mRNA 經由選擇性剪接及使用選擇性起始密碼子而編碼 Cap 蛋白 VP1 (87 kDa，非經剪接 mRNA 轉錄本)、VP2 (72 kDa，來自經剪接 mRNA 轉錄本) 及 VP3 (61 kDa，來自替代的起始密碼子)。VP1 到 VP3 構成病毒殼體的構建塊。殼體具有與細胞表面受體結合並允許病毒在細胞內運輸的功能。VP3 約佔病毒顆粒蛋白總量的 90%。儘管如此，所有三種蛋白質對於生產有效之殼體皆為必要。
據報導，將所有三種殼體蛋白 VP1 到 VP3 不活化可防止積累單股子代 AAV DNA。VP1 胺基末端之突變 (「Lip-陰性」或「Inf-陰性」) 仍允許將單股 DNA 組裝成病毒顆粒，從而大幅度降低感染滴度。
AAP 開放讀序框架編碼組裝活化蛋白 (AAP)。其大小約為 22 kDa，可將天然 VP 蛋白運輸到核仁區進行殼體組裝。此開放讀序框架位於 VP3 蛋白編碼序列的上游。
在單一 AAV 顆粒中，僅包含一個單股 DNA 分子。其可能為「正」股或「負」股。含有 DNA 分子的 AAV 病毒顆粒具有感染性。在經感染的細胞內，親代感染單股被轉變為雙股，該雙股隨後被擴增。擴增產生出大量雙股 DNA 分子，其中單股被置換並包裝成殼體。
腺相關病毒 (AAV) 載體可轉導分裂細胞及休眠細胞。可假設使用 AAV 載體導入標靶細胞的轉基因將長期表現。使用 AAV 載體的一個缺點是可導入細胞的轉基因大小有限制。
病毒載體 (例如小病毒顆粒，其包括 AAV 血清型及其變異體) 提供一種將核酸以離體、活體外及活體內遞送到細胞中的方式，這些載體編碼蛋白質而使細胞表現所編碼的蛋白質。AAV 係作為基因治療載體的病毒，因其可穿透細胞並導入核酸/基因物質而使核酸/基因物質可在細胞中穩定地維持。此外，例如，這些病毒可將核酸/基因物質導入至特定位點。由於 AAV 與人類之致病性疾病無關，因此 AAV 載體能夠將異源多核苷酸序列 (例如治療蛋白質及藥劑) 遞送至人類病患，而不會引起實質性之 AAV 發病機制或疾病。
用作進行高效基因遞送之媒劑的 AAV 顆粒具有許多適用於此類應用的所欲特徵，包括對分裂細胞及非分裂細胞的向性。早期臨床經驗亦證實這些載體並無持續的毒性，且引起很小的免疫反應很小或檢測不到免疫反應。已知 AAV 在活體內及活體外經由受體介導的胞吞作用或胞吞轉送作用感染各種細胞類型。這些載體系統已在人類中進行測試，該等載體標靶至視網膜上皮、肝臟、骨骼肌、氣管、大腦、關節及造血幹細胞。
重組 AAV 顆粒通常不包括與發病機制相關的病毒基因。此種載體通常具有一個或多個全部或部分缺失的野生型 AAV 基因 (例如 rep 及/或 cap 基因)，但保留至少一個功能側翼 ITR 序列，此為修復、複製及將重組載體包裝成 AAV 顆粒所必需。例如，僅包括載體的必要部分，例如分別為 ITR 及 LTR 元件。因此，AAV 載體基因體包括複製及包裝所需的順式序列 (例如，功能 ITR 序列)。
重組 AAV 載體及其方法及用途包括任何病毒株或血清型。作為非限制性實例，重組 AAV 載體可基於任何 AAV 基因體，諸如，舉例而言，AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV 2i8、AAV rh74 或 AAV 7m8。此種載體可基於相同或者彼此不同的病毒株或血清型 (或亞群或變異體)。作為非限制性實例，基於一種血清型基因體的重組AAV 載體可與包裝載體的一種或多種殼體蛋白相同。此外，重組 AAV 載體基因體可基於與包裝載體之一種或多種 AAV 殼體蛋白不同的 AAV (例如 AAV2 ) 血清型基因體。例如，AAV 載體基因體可基於 AAV2，而三種殼體蛋白中的至少一種可為例如 AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV rh74、AAV 7m8 或其變異體。AAV 變異體包括 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV rh74 及 AAV 7m8 殼體的變異體及嵌合體。
在本發明之所有態樣及實施例的某些實施例中，rAAV 顆粒源自係選自由以下所組成之群組的 AAV：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV rh74 及 AAV 7m8，及其變異體 (例如，殼體變異體，例如胺基酸插入、加入、取代及缺失)，例如，如 WO 2013/158879、WO 2015/013313 及 US 2013/0059732 (揭露 LK01、LK02、LK03 等) 中所述。
在本發明之所有態樣及實施例的某些實施例中，rAAV 顆粒包含與 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV Rh74 或 AAV 7m8 殼體序列具有 70% 或更高序列同一性的殼體序列。
在本發明之所有態樣及實施例的某些實施例中，rAAV 顆粒包含與 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9 或 AAV10 ITR 序列具有 70% 或更高序列同一性的 ITR 序列
可將重組顆粒 (例如，rAAV 顆粒) 併入醫藥組成物中。此種醫藥組成物尤其可用於以活體內或離體向個體投予及遞送。在某些實施例中，醫藥組成物含有醫藥上可接受之載劑或賦形劑。此種類賦形劑包括本身不誘導對接受該組合物的個體有害之免疫反應的任何藥劑，且其投予不產生過度毒性。
US 5,998,205、US 6,228,646、US 6,093,699、US 6,100,242、WO 94/17810 及 WO 94/23744 描述用於產生腺病毒載體的方案；其全部內容經由引用併入本文。
重組 AAV 顆粒 (rAAV 顆粒)
本領域已知用於產生 rAAV 顆粒的不同方法。例如，使用 AAV 質體及 AAV 輔助序列進行轉染並與一種 AAV 輔助病毒 (例如腺病毒、皰疹病毒或牛痘病毒) 共感染，或使用重組 AAV 質體、AAV 輔助質體及輔助功能質體進行轉染。產生 rAAV 顆粒的非限制性方法描述於例如 US 6,001,650、US 6,004,797、WO 2017/096039 及 WO 2018/226887。在生產重組 rAAV 顆粒 (即在細胞培養系統中產生顆粒) 後，可從宿主細胞及細胞培養上清液中獲得 rAAV 顆粒並進行純化。
為產生重組 AAV 顆粒，需在單一哺乳動物細胞中表現 Rep 和 Cap 蛋白、輔助蛋白 E1A、E1B、E2A 及 E4orf6 以及腺病毒 VA RNA。可使用任何啟動子 (尤其是 CMV IE 啟動子) 表現輔助蛋白 E1A、E1B、E2A 及 E4orf6，如 Matsushita 等人所示 (Gene Ther. 5 (1998) 938-945)。因此，可使用任何啟動子。
通常，為生產重組 AAV 顆粒，將不同的互補質體共轉染到宿主細胞中。質體之一者包含夾在兩個順式作用 AAV ITR 之間的轉基因。子代重組基因體之複製及後續包裝所需之缺少的 AAV 元件 (即 Rep 及 Cap 蛋白的開放讀序框架) 以反式包含在第二質體中。過表現 Rep 蛋白造成抑制細胞生長的作用 (Li, J. 等人，J. Virol. 71 (1997) 5236-5243)。此外，AAV 複製需要包含輔助病毒基因的第三質體，即來自腺病毒的 E1、E4orf6、E2A 及 VA。
為減少所需質體的數量，Rep、Cap 及腺病毒輔助基因可組合在單一質體上。
或者，宿主細胞可已穩定表現 E1 基因產物。此種細胞為 HEK293 細胞。標示為 293 的人類胚胎腎殖株是在 1977 年經由將腺病毒 DNA 整合到人類胚胎腎細胞 (HEK 細胞) 中所產生的 (Graham, F.L. 等人，J. Gen. Virol. 36 (1977) 59-74)。HEK293 細胞株包含腺病毒血清型 5 基因體之鹼基對 1 至 4344。此涵蓋 E1A 及 E1B 基因以及腺病毒包裝訊號 (Louis, N. 等人，Virology 233 (1997) 423-429)。
當使用 HEK293 細胞時，缺少的 E2A、E4orf6 及 VA 基因可經由與腺病毒共感染或經由與 E2A、E4orf6 及 VA 表現質體共轉染來導入 (參見，例如Samulski, R.J. 等人，J. Virol. 63 (1989) 3822-3828; Allen, J.M. 等人，J. Virol. 71 (1997) 6816-6822；Tamayose, K. 等人，Hum. Gene Ther. 7 (1996) 507-513；Flotte, T.R. 等人，Gene Ther. 2 (1995) 29-37；Conway, J.E. 等人，J. Virol. 71 (1997) 8780-8789；Chiorini, J.A. 等人，Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1531-1541；Ferrari, F.K. 等人，J. Virol. 70 (1996) 3227-3234；Salvetti, A. 等人，Hum. Gene Ther. 9 (1998) 695-706；Xiao, X. 等人，J. Virol. 72 (1998) 2224-2232；Grimm, D. 等人，Hum. Gene Ther. 9 (1998) 2745-2760；Zhang, X. 等人，Hum. Gene Ther. 10 (1999) 2527-2537)。或者，可使用腺病毒/AAV 或單純皰疹病毒/AAV 雜合載體 (參見，例如 Conway, J.E. 等人，J. Virol. 71 (1997) 8780-8789；Johnston, K.M. 等人，Hum. Gene Ther. 8 (1997) 359-370：Thrasher, A.J. 等人，Gene Ther. 2 (1995) 481-485；Fisher, J.K. 等人，Hum. Gene Ther. 7 (1996) 2079-2087；Johnston, K.M. 等人，Hum. Gene Ther. 8 (1997) 359-370)。
為限制轉基因對特定組織的活性 (即限制整合位點)，可將轉基因可操作地連接至可誘導或組織特異性啟動子 (參見，例如，Yang，Y. 等人， Hum. Gene.6 (1995) 1203-1213)。
E1A
、
E1B
、
E2
及
E4
E1A 及 E1B (開放讀序框架) 之編碼序列可源自人類腺病毒，諸如，舉例而言，特別是人類腺病毒血清型 2 或血清型 5。人類 Ad5 (腺病毒血清型 5) 的示例性序列在 GenBank 條目 X02996、AC_000008 中找到，而人類 Ad2 的示例性序列在 GenBank 條目 AC_000007 中找到。核苷酸 505 至 3522 包含編碼人類腺病毒血清型 5 之 E1A 及 E1B 的核酸序列。EP 1 230 354 中所報導的質體 pSTK146 以及 WO 2007/056994 中所報導的質體 pGS119 及 pGS122 亦可作為 E1A 及 E1B 開放讀序框架的來源。
E1A 為腺病毒 DNA 進入細胞核後所表現的第一個病毒輔助基因。E1A 基因編碼 12S 及 13S 蛋白，其係基於相同之 E1A mRNA 的選擇性剪接。表現 12S 及 13S 蛋白使活化其他病毒功能 E1B、E2、E3 及 E4。此外，表現 12S 及 13S 蛋白迫使細胞進入細胞週期的 S 期。如果只表現 E1A 衍生的蛋白質，細胞將會死亡 (細胞凋亡)。
E1B 為第二個表現的病毒輔助基因。其被 E1A 衍生的蛋白質 12S 及 13S 活化。E1B 基因衍生之 mRNA 可以兩種不同的方式剪接，產生第一個 55 kDa 轉錄本及第二個 19 kDa 轉錄本。E1B 55 kDa 蛋白參與調節細胞週期、防止在感染晚期之細胞 mRNA 的運輸以及防止 E1A 誘導的細胞凋亡。E1B 19 kDa 蛋白參與防止 E1A 誘導的細胞凋亡。
E2 基因編碼不同的蛋白質。E2A 轉錄本編碼單股結合蛋白 (SSBP)，其為 AAV 複製所必要者。
同樣地，E4 基因亦編碼數種蛋白質。E4 基因衍生的 34 kDa 蛋白 (E4orf6) 與 E1B 55 kDa 蛋白一起阻止細胞 mRNA 在細胞質中的積累，亦促進病毒 RNA 自細胞核運輸到細胞質中。
腺病毒
VA RNA
基因
病毒相關 RNA (VA RNA) 為調節轉譯之腺病毒 (Ad) 的非編碼 RNA。腺病毒基因體包含兩個獨立的拷貝：VAI (VA RNAI) 及 VAII (VA RNAII)。兩者均由 RNA 聚合酶 III 轉錄 (參見，例如 Machitani, M. 等人，J. Contr.Rel.154 (2011) 285-289)，該 RNA 聚合酶 III 來自 2 型聚合酶 III 啟動子。對於重組生產，腺病毒 VA RNA 基因可由任何啟動子驅動。
Ma, Y. 及 Mathews, M.B. 使用系統發育方法研究腺病毒相關 RNA 的結構、功能及進化(J. Virol. 70 (1996) 5083-5099)。他們根據 47 種已知人類腺病毒血清型，提供其比對及共有 VA RNA 序列。該揭露在此經由引用整體併入本申請案。
VA RNA、VAI 及 VAII 係由 157-160 個核苷酸 (nt) 所組成。
根據血清型，腺病毒含有一個或兩個 VA RNA 基因。咸認為 VA RNAI 係主要的前病毒，而 VA RNAII 可部分地彌補 VA RNAI 之缺失 (Vachon, V.K. 及 Conn, G.L.，Virus Res. 212 (2016) 39-52)。
雖然 VA RNA 非必要，但其經由克服細胞抗病毒機制在有效的病毒生長中仍扮演重要角色。亦即，雖然 VA RNA 對於病毒生長非必要，但在載體生成的起始步驟中，VA RNA 缺失之腺病毒無法生長，其中每個細胞僅存在數個病毒基因體拷貝，可能是因為未充分地表現阻斷細胞抗病毒機制之 VA RNA 以外的病毒基因 (參見 Maekawa, A. 等人，Nature Sci. Rep.3 (2013) 1136)。
Maekawa, A. 等人 (Nature Sci. Rep.3 (2013) 1136) 報導缺乏病毒相關 RNA 基因之腺病毒載體的高效生產，該腺病毒載體干擾細胞 RNAi 機制，其中組成型地表現及高度表現翻轉酶重組酶之經感染 HEK293 細胞經由 FLP 重組酶介導切除 VA RNA 基因座，以獲得 VA RNA 缺失之腺病毒。
人類腺病毒 2 VA RNAI 對應於 GenBank 條目 AC_000007 序列的核苷酸 10586-10810。人類腺病毒 5 VA RNAI 對應於 GenBank 條目 AC_000008 序列的核苷酸 10579-10820。
生產 rAAV 顆粒之方法
Carter 等人已經表明可刪除野生型 AAV 基因體中的整個 rep 及 cap 開放讀序框架並以轉基因替換 (Carter, B. J.，「Handbook of Parvoviruses」，P. Tijssen 主編，CRC Press，pp. 155-168 (1990))。此外，據報導，須維持 ITR 以保留複製、修復、包裝及將轉基因整合到標靶細胞之基因體中的功能。
當包含相應病毒輔助基因之細胞被 AAV 載體轉導時，或者反之亦然，當包含整合之 AAV 前病毒的細胞以合適之輔助病毒轉導時，AAV 前病毒被活化並再次進入裂解感染週期 (Clark, K.R. 等人，Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1329-1341；Samulski, R.J., Curr. Opin. Genet. Dev.3 (1993) 74-80)。
生產細胞含有 rep 及 cap 基因序列，以及側接有在經由藥物選擇所保留的一個或多個質體上的 ITR 序列的轉基因卡匣。這些細胞株中 rAAV 顆粒之生產通常發生在它們經感染所需之輔助功能之後。因此，將細胞用具有複製能力的 AdV (通為是野生型 Ad5) 或包含相應輔助基因的質體感染，以提供輔助病毒蛋白並啟動 rAAV 顆粒生產。包裝細胞株不同於生產細胞株，因為其僅含有 rep 及 cap 基因。
如本發明之方法包括用包含生產重組 AAV 顆粒所需之全部元件的核酸 (例如，質體) 轉導哺乳動物細胞的步驟。因此，由於質體編碼病毒包裝蛋白和/或輔助蛋白，細胞可生產重組病毒顆粒，其包括編碼所關注蛋白質的核酸或包含轉錄成所關注轉錄本的序列。
本發明提供重組 AAV 病毒顆粒生產平台，該平台包括包含如本發明之溶解步驟的特徵，該特徵與目前「工業標準」的重組 AAV 顆粒生產過程不同。
更一般地，用 DNA 轉染或轉導以重組生產 AAV 顆粒的細胞可稱為「重組細胞」。此種細胞例如可為任何哺乳動物細胞，其已被作為編碼包裝蛋白 (諸如 AAV 包裝蛋白) 之核酸 (質體)、編碼輔助蛋白之核酸 (質體) 以及編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸 (質體) (亦即置於兩個 AAV ITR 之間的轉基因) 的受體。該術語包括已經轉導或經轉染之原始細胞的子代。應當理解，由於自然、偶然或特意之突變，單一親代細胞的子代在形態學或基因體或總核酸互補方面不一定與原始親代完全相同。
許多適用於維持細胞存活率或提供細胞生長及/或增殖的細胞生長培養基為可商購獲得的。此類培養基的實例包括無血清真核生長培養基，例如用於維持存活率或提供哺乳動物 (例如人類) 細胞生長的培養基。非限制性實例包括 Ham's F12 或 F12K培養基 (Sigma-Aldrich)、FreeStyle (FS) F17培養基 (Thermo-Fisher Scientific)、MEM、DMEM、RPMI-1640 (Thermo-Fisher Scientific) 及其混合物。此類培養基可補充有維生素及/或微量礦物質及/或鹽及/或胺基酸，諸如哺乳動物 (例如人類) 細胞的必需胺基酸。
因此，本文提供一種使用如本發明之溶解步驟生產重組 AAV 載體或包含該等重組 AAV 載體之 AAV 顆粒的方法，該 AAV 載體包含編碼蛋白質之核酸或被轉錄成所關注轉錄本的核酸。
為此目的，將三個質體共轉染到哺乳動物細胞中。轉基因質體編碼在 AAV ITR 之間選殖的表現卡匣，而藉由共轉染第二包裝質體 (rep/cap 質體) 以反式提供 rep 及 cap 基因以確保 AAV 複製及包裝。第三質體，亦稱為輔助質體，含有最少的輔助病毒因子 (通常為腺病毒 E2A、EV 及 VA 基因)，但缺乏 AAV ITR。
本發明之一個態樣為一種生產重組 AAV 載體或包含該重組 AAV 載體之 AAV 顆粒的方法，該 AAV 載體包含編碼蛋白質之核酸或被轉錄成所關注轉錄本的核酸，該方法包含以下步驟：
(i) 提供包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的一種或多種質體；
(ii) 提供包含核酸的質體，該核酸編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本，該轉錄本於 AAV ITR 之間穿插；
(iii) 將一種或多種哺乳動物細胞與提供的質體接觸並執行以下操作中之一者：進一步加入轉染試劑，並視情況地孵育質體/轉染試劑/細胞混合物；或提供物理方式諸如電流，以將核酸引入細胞中；
(iv) 培養經轉染之細胞；
(v) 收穫經培養之細胞及培養基以產生哺乳動物細胞培養液；
(vi) 藉由使哺乳動物細胞培養液接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑來溶解細胞，以產生哺乳動物細胞培養液溶解產物；以及
(vii) 視情況地用 AAV 親和力層析自培養液溶解產物中分離重組 AAV 顆粒；
從而生產包含編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸的重組 AAV 顆粒。
本發明之一個態樣為一種生產重組 AAV 載體或包含該重組 AAV 載體之 AAV 顆粒的方法，該 AAV 載體包含編碼蛋白質之核酸或被轉錄成所關注轉錄本的核酸，該方法包含以下步驟：
(i) 提供包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的一種或多種質體；
(ii) 提供包含核酸的質體，該核酸編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本；
(iii) 或者
(a) 藉由使一種或多種哺乳動物細胞與 (i) 提供的質體接觸，透過以下操作中之一者來產生穩定的經轉染之細胞：進一步加入轉染試劑並視情況地孵育質體/轉染試劑/細胞混合物，或提供物理方式諸如電流以將核酸引入細胞中；選擇第一經穩定轉染之細胞；使選定的第一經穩定轉染之細胞與 (ii) 提供的質體接觸並執行以下操作中之一者：進一步加入轉染試劑並視情況地孵育質體/轉染試劑/細胞混合物，或提供物理方式諸如電流以將核酸引入細胞中；或
(b) 藉由以下方式產生經瞬時轉染之細胞：使一種或多種哺乳動物與 (i) 及 (ii) 提供的質體接觸，並且執行以下操作中之一者：進一步加入轉染試劑並視情況地孵育質體/轉染試劑/細胞混合物，或提供物理方式諸如電流以將核酸引入細胞中；
從而產生經轉染之細胞；
(iv) 培養 (iii) 的轉染細胞；
(v) 收穫經培養之細胞及培養基以產生哺乳動物細胞培養液；
(vi) 藉由使哺乳動物細胞培養液接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑來溶解細胞，以產生哺乳動物細胞培養液溶解產物；以及
(vii) 視情況地用 AAV 親和力層析自哺乳動物細胞培養液溶解產物中分離重組 AAV 顆粒；
從而生產包含編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸的重組 AAV 顆粒。
可藉由多種方式將核酸 (質體) 引入細胞中。
本領域已報導將 DNA 轉移到哺乳動物細胞中的多種方法。這些方法在根據本發明之方法中都是有用的。在所有態樣及實施例的某些實施例中，使用電穿孔、核轉染或顯微注射進行核酸轉移/轉染。在所有態樣及實施例的某些實施例中，使用無機物質 (例如，舉例而言，磷酸鈣/DNA 共沉澱)、陽離子聚合物 (例如，舉例而言，聚乙烯亞胺、DEAE-葡聚醣) 或陽離子脂質 (脂質體) 進行核酸轉移/轉染。磷酸鈣及聚乙烯亞胺為用於大規模核酸轉移的最常用轉染試劑 (參見，例如 Baldi 等人，Biotechnol. Lett.29 (2007) 677-684)，其中聚乙烯亞胺為較佳。
在無血清的懸浮培養物中生長並使用 PEI 作為轉染試劑改善轉染條件的效率及重現性，允許使用搖瓶、波動或攪拌罐生物反應器即時放大 AAV 生產。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，核酸 (質體) 以組成物的形式提供，該組成物與聚乙烯亞胺 (PEI) 組合，視情況地與細胞組合。在某些實施例中，組合物包括質體/PEI 混合物，其具有複數個組分：(a) 一個或多個包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的質體；(b) 包含編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸的質體；及 (c) 聚乙烯亞胺 (PEI) 溶液。在某些實施例中，質體的莫耳比範圍為約 1:0.01 至約 1:100，或莫耳比範圍為約 100: 1 至約 1:0.01，且組分 (a)、(b) 及 (c) 的混合物視情況地培育質體約 10 秒至約 4 小時的時間。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，組合物進一步包含細胞。在某些實施例中，細胞與組分 (a)、(b) 及/或 (c) 的質體/PEI 混合物接觸。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，組合物視情況地與細胞組合，該組合物進一步包含游離 PEI。在某些實施例中，細胞與游離 PEI 接觸。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，細胞已與組分 (a)、(b) 及/或 (c) 的混合物接觸至少約 4 小時，或約 4 小時至約 140 小時，或約 4 小時至約 96 小時。在一個較佳的實施例中，細胞已經與組分 (a)、(b) 及/或 (c) 及視情況之游離 PEI 的混合物接觸至少約 4 小時。
該組成物亦可以包含另外的質體或/及細胞。此種質體及細胞可與游離的 PEI 接觸。在某些實施例中，質體及/或細胞已與游離 PEI 接觸至少約 4 小時，或約 4 小時至約 140 小時，或約 4 小時至約 96 小時。
如本發明之方法亦包括轉染細胞之步驟。因此，該方法包括以下步驟：提供一種或多種質體；提供包含聚乙烯亞胺 (PEI) 的溶液；以及將質體與 PEI 溶液混合以產生質體/PEI 混合物。在某些實施例中，將此種混合物培育約 10 秒至約 4 小時範圍內的一段時間。在此類方法中，將細胞接著與質體/PEI 混合物接觸以產生質體/PEI 細胞培養物；然後加入游離 PEI 至產生之質體/PEI 細胞培養物中，以產生游離 PEI/質體/PEI 細胞培養物；然後將產生的游離 PEI/質體/PEI 細胞培養物培養至少約 4 小時，從而產生轉染細胞。在某些實施例中，質體包含以下一者或多者或全部：rep 開放讀序框架；cap 開放讀序框架；E1A、E1B、E2 及 E4orf6 開放讀序框架；及編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸。
此外，如本發明之方法包括生產經轉染之細胞 (其產生重組 AAV 載體或 AAV 顆粒) 的步驟，該方法包括：提供一個或多個質體，該質體包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸；提供包含編碼蛋白質或轉錄成所關注轉錄本之核酸的質體；提供包含聚乙烯亞胺 (PEI) 的溶液；將上述質體與 PEI 溶液混合，其中質體的莫耳比範圍為約 1:0.01 至約 1:100，或莫耳比範圍為約 100:1 至約 1:0.01，以產生質體/PEI 混合物 (且視情況地將質體/PEI 混合物培育約 10 秒至約 4 小時範圍內的一段時間)；將哺乳動物細胞與質體/PEI 混合物接觸，以產生質體/PEI 細胞培養物；向產生之質體/PEI 細胞培養物中加入游離 PEI 以產生游離 PEI/質體/PEI 細胞培養物；及將游離 PEI/質體/PEI 細胞培養物培育至少約 4 小時，從而產生經轉染之細胞，該經轉染之細胞產生包含編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸的重組 AAV 載體或顆粒，其中哺乳動物細胞已使用如本發明之方法獲得。
另外提供生產包含編碼蛋白質的核酸或被轉錄成所關注轉錄本之重組 AAV 載體或 AAV 顆粒之方法，該方法包括：提供一個或多個包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的質體；提供包含編碼所關注蛋白質或轉錄成所關注轉錄本之核酸的質體；提供包含聚乙烯亞胺 (PEI) 的溶液；將上述質體與 PEI 溶液混合，其中質體的莫耳比範圍為約 1:0.01 至約 1:100，或莫耳比範圍為約 100:1 至約 1:0.01，以產生質體/PEI 混合物 (且視情況地將質體/PEI 混合物培育約 10 秒至約 4 小時範圍內的一段時間)；將哺乳動物細胞與所述產生之質體/PEI 混合物接觸以產生質體/PEI 細胞培養物；向所述產生之質體/PEI 細胞培養物中加入游離 PEI 以產生游離 PEI/質體/PEI 細胞培養物；將產生之質體/PEI 細胞培養物或游離 PEI/質體/PEI 細胞培養物培育至少約 4 小時以產生經轉染之細胞；從所產生之經轉染之細胞中收穫所產生之經轉染之細胞及/或培養基，以產生培養液；使用如本發明之方法溶解細胞，並視情況地用 AAV 親和力層析步驟從培養液溶解產物中分離重組 AAV 載體或顆粒；從而產生包含編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸的重組 AAV 載體或顆粒。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，在不同時間點將 PEI 加入至質體及/或細胞。在某些實施例中，在質體/PEI 混合物與細胞接觸之前、同時或之後，將游離 PEI 加入至細胞。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，當細胞與質體/PEI 混合物接觸及/或與游離 PEI 接觸時，細胞具有特定密度及/或細胞生長階段及/或存活率。在一個較佳的實施例中，當細胞與質體/PEI 混合物接觸及/或當細胞與游離 PEI 接觸時，細胞的密度範圍為約 1*10^5 細胞/mL 至約 1*10^8 細胞/mL。在某些實施例中，當細胞與質體/PEI 混合物或與游離 PEI 接觸時，細胞的存活率為約 60% 或大於 60%，或其中當細胞與質體/PEI 混合物接觸時，細胞處於對數生長期，或當細胞與質體/PEI 混合物或與游離 PEI 接觸時，細胞的存活率為約 90% 或大於 90%，或者其中當細胞與質體/PEI 混合物或與游離 PEI 接觸時，細胞處於對數生長期。
除 PEI 以外，丙戊酸 (VPA) 可用於改善轉染效率。VPA 為分支短鏈脂肪酸，並抑制組蛋白脫乙醯酶活性。由於該原因，它通常作為重組蛋白生產的增強劑加入至哺乳動物細胞培養物中。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，所編碼之 AAV 包裝蛋白包括 AAV rep 及/或 AAV cap。在所有態樣及實施例的某些實施例中，此種 AAV 包裝蛋白包括任何 AAV 血清型的 AAV rep 及/或 AAV cap 蛋白。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，所編碼之輔助蛋白包括腺病毒 E1A 及 E1B、腺病毒 E2 及/或 E4、VA RNA 及/或非 AAV 輔助蛋白。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，使用特定量或比例之核酸 (質體)。在某些實施例中，包含編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸的質體及包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的一個或多個質體的總量係在每 mL 細胞約 0.1 μg 至約 15 μg 的範圍內。在某些實施例中，包含編碼蛋白質或轉錄成所關注轉錄本之核酸的質體與包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的一個或多個質體的莫耳比，係在約 1:5 至約 1:1 的範圍內，或在約 1:1 至約 5:1 的範圍內。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，第一質體包含編碼 AAV 包裝蛋白的核酸，且第二質體包含編碼輔助蛋白的核酸。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，包含編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本之核酸的質體、與包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸的第一質體、與包含編碼輔助蛋白之核酸的第二質體在共轉染中，莫耳比係在約 1-5: 1: 1，或 1: 1-5: 1，或 1: 1: 1-5的範圍內。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，細胞為哺乳動物細胞。在一個較佳實施例中，細胞為 HEK293 細胞或 CHO 細胞。
可使用培養真核細胞的常用條件進行培養，即約 37℃、95% 濕度及 8 vol.-% CO
2。可在含血清或無血清培養基中進行貼附培養或懸浮培養。懸浮培養可在任何發酵容器中進行，諸如，舉例而言，在攪拌釜反應器、波反應器、搖動反應器、振動器容器或旋轉容器或所謂的滾瓶中進行。可分別以高通量形式及篩選進行轉染，例如在 96 或 384 孔形式中進行。
如本發明之方法可包括任何血清型的 AAV 顆粒或其變異體。在所有態樣及實施例的某些實施例中，重組 AAV 顆粒包含以下中的任一者：AAV 血清型 1-12、AAV VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白，或經修飾或變體 AAV VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白，或野生型 AAV VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白。在所有態樣及實施例的某些實施例中，AAV 顆粒包含 AAV 血清型或 AAV 假型，其中 AAV 假型包括不同於 ITR 血清型的 AAV 殼體血清型。
提供或包括 AAV 載體或顆粒之根據本發明的方法亦可包括其他元件。此種元件的實例包括但不限於：內含子、表現控制元件、一種或多種腺相關病毒 (AAV) 反向末端重複 (ITR) 及/或填充物/填充多核苷酸序列。此種元件可位於編碼蛋白質或被轉錄成關注轉錄本的核酸內或側翼，或表現控制元件可操作地連接至核酸，該核酸編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本，或 AAV ITR 可位於核酸之 5'- 或 3'- 末端的側翼，該核酸編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本，或填充多核苷酸序列可位於核酸之 5'- 或 3'- 末端的側翼，該核酸編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄本。
表現控制元件包括組成型或可調節控制元件，諸如組織特異性表現控制元件或啟動子。
ITR 可為 AAV2 或 AAV6 或 AAV8 或 AAV9 血清型中的任一者，或其組合。AAV 顆粒可包括與 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV10、AAV11、AAV-2i8、AAV rh74 或 AAV 7m8 VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白具有 75% 或更多序列同一性的任何 VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白，或包含選自以下之任何經修飾或變異體 VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV10、AAV11、AAV-2i8、AAV rh74 及 AAV 7m8 AAV 血清型。
在產生如本文所述之重組病毒 (例如，AAV) 顆粒之後，如果需要，可使用各種習用方法從宿主細胞中純化及/或分離病毒 (例如，rAAV) 顆粒。此類方法包括管柱層析、CsCl 梯度、碘克沙醇 (iodixanol) 梯度等。
例如，可使用複數個管柱純化步驟，例如在陰離子交換管柱、親和性管柱及/或陽離子交換管柱上的純化。(參見，例如 WO 02/12455 及 US 2003/0207439)。或者或此外，可使用碘克沙醇或 CsCl 梯度步驟 (參見，例如 US 2012/0135515；及 US 2013/0072548)。此外，如果使用感染性病毒來表現包裝及/或輔助蛋白，則可使用各種方法將殘留病毒去活化。例如，可經由加熱到約 60℃ 的溫度例如 20 分鐘或更長時間將腺病毒去活化。此種處理有效地去活化輔助病毒，因為 AAV 是熱穩定的，而輔助腺病毒是熱不穩定的。
rAAV 載體生產及純化系統的目標是達成以最大限度降低/控制生產相關所產生雜質的策略，諸如蛋白質、核酸及載體相關雜質，包括野生型/假野生型 AAV 物種 (wtAAV) 及 AAV 囊裝之殘留 DNA 雜質。
考量 rAAV 顆粒僅占生物質的小級分，rAAV 顆粒需純化到一定程度之純度才能用作臨床人類基因治療產品 (參見，例如 Smith P.H. 等人，Mo.Therapy 7 (2003) 8348；Chadeuf G. 等人，Mo.Therapy 12 (2005) 744；來自 CHMP 基因治療專家小組會議報告，歐洲藥品管理局 EMEA/CHMP 2005, 183989/2004)。
作為起始步驟，通常為收獲產生 rAAV 顆粒的培養細胞，視情況地與收穫培養的細胞培養上清液 (培養基) 結合，其中已培養上清液中之產生 rAAV 顆粒的細胞 (懸浮或貼附)。可按原樣使用、適當使用、裂解或濃縮使用收穫之細胞及視情況的細胞培養上清液。此外，如果使用感染以表現輔助功能，則可將殘留的輔助病毒去活化。例如，可經由加熱到約 60℃ 的溫度例如 20 分鐘或更長時間將腺病毒去活化，這僅去活化輔助病毒，因為 AAV 是熱穩定的，而輔助腺病毒是熱不穩定的。
藉由如本發明之方法溶解收穫的培養液中的細胞，以釋放 rAAV 顆粒。在細胞裂解過程中同時或隨後在細胞裂解之後，加入核酸酶 (例如 benzonase) 以降解汙染 DNA。通常，將所得溶解產物澄清以移除細胞碎片 (例如經由過濾或離心)，以得到澄清之細胞裂解液。在一個特定的實例中，將溶解產物以微米孔徑的過濾器 (例如 0.1-10.0 µm 孔徑的過濾器，例如 0.45 µm 及/或孔徑 0.2 µm 的過濾器) 過濾，以產生澄清的溶解產物。
溶解產物 (視情況澄清溶解產物) 含有 AAV 顆粒 (包括 rAAV 載體及空殼體) 及生產/程序相關雜質，例如來自宿主細胞的可溶細胞組分，這些組分尤其可包括細胞蛋白質、脂質及/或核酸及細胞培養基組分。然後將視情況澄清溶解產物進行純化步驟，使用層析從雜質中純化 AAV 顆粒 (包含 rAAV 載體)。在第一層析步驟之前，可用合適的緩衝液稀釋或濃縮澄清溶解產物。
在細胞裂解、視情況澄清及視情況稀釋或濃縮之後，可使用複數個後續及順序層析步驟來純化 rAAV 顆粒。
第一層析步較佳地為使用 AAV 親和力層析配體的親和力層析步驟。
若第一層析步驟為親和力層析，則第二層層析步驟可為陰離子交換層析。因此，在所有態樣及實施例的某些實施例中，rAAV 顆粒經由親和力層析純化，然後經由陰離子交換層析或/及陽離子交換層析或/及粒徑篩析層析以任何順序或序列或組合純化。
例如，在下游處理期間，從完整殼體中去除空殼體係基於它們在陰離子交換層析中的不同等電點 (pI)。所有血清型的平均 pI 計算值對於完整殼體為 5.9，對於空殼體為 6.3 (Venkatakrishnan, B. 等人，J. Virol. 87 (2013) 4974-4984)。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，經由親和力層析純化 rAAV 顆粒，然後經由陰離子交換層析純化，然後經由粒徑篩析層析 (SEC) 純化。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，經由親和力層析純化 rAAV 顆粒，然後經由粒徑篩析層析 (SEC) 純化，然後經由陰離子交換層析純化。
陽離子交換層析的作用是將 AAV 顆粒與存在於澄清溶解產物及/或親和力或粒徑篩析層析之管柱洗出液中的細胞及其他組分分離。能以廣 pH 範圍結合 rAAV 顆粒之強力陽離子交換樹脂的實例包括但不限於任何基於磺酸之樹脂，如存在磺酸鹽官能基團 (包括經芳基及烷基取代之磺酸鹽) 之樹脂，例如磺丙基或磺乙基樹脂。代表性基質包括但不限於 POROS HS、POROS HS 50、POROS XS、POROS SP 及 POROS S (強力陽離子交換劑可自 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 獲得)。其他實例包括 Capto S、Capto S ImpAct、Capto S ImpRes (強力陽離子交換劑可自 GE Healthcare, Marlborough, MA, USA 獲得)，而商業 DOWEX®、AMBERLITE® 及 AMBERLYST® 系列樹脂可自 Aldrich Chemical Company (Milliwaukee, WI, USA) 獲得。弱陽離子交換樹脂包括但不限於任何基於羧酸的樹脂。例示性陽離子交換樹脂包括羧甲基 (CM)、磷 (基於磷酸官能基團)、甲基磺酸 (S) 及磺丙基 (SP) 樹脂。
陰離子交換層析的作用是將 AAV 顆粒與存在於澄清溶解產物及/或來自親和力或陽離子交換或粒徑篩析層析之管柱洗出液中的蛋白質、細胞及其他組分分離。陰離子交換層析亦可用於減少並由此控制洗出液中空殼體的量。例如，可用包含適當濃度 (例如，約 100-125 mM，例如 110-115 mM) 之 NaCl 溶液洗滌其上結合 rAAV 顆粒的陰離子交換管柱，且可在沒有顯著沖提 rAAV 顆粒的流動中沖提一部分空殼體。隨後，可使用包含更高濃度 (例如，約 130-300 mM NaCl) 之 NaCl 溶液沖提與陰離子交換管柱結合的 rAAV 顆粒，從而產生管柱洗出液，該管柱洗出液具有減少量或耗竭量之空殼體且成比例增加量之 rAAV 顆粒，該 rAAV 顆粒包含 rAAV 載體。
例示性陰離子交換樹脂包括但不限於基於聚胺樹脂及其他樹脂的陰離子交換樹脂。強力陰離子交換樹脂的實例包括通常基於季銨化氮原子的陰離子交換樹脂，包括但不限於季銨鹽樹脂，例如三烷基芐基銨樹脂。合適的交換層析材料包括但不限於 MACRO PREP Q (強力陰離子交換劑可自 BioRad, Hercules, CA, USA 獲得)；UNOSPHERE Q (強力陰離子交換劑可自 BioRad, Hercules, CA, USA 獲得)；POROS 50HQ (強力陰離子交換劑可自 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)；POROS XQ (強力陰離子交換劑可自 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 獲得)；POROS SOD (弱陰離子交換劑可自 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 獲得)；POROS 50PI (弱陰離子交換劑可自 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 獲得)；Capto Q、Capto XQ、Capto Q ImpRes 及 SOURCE 30Q (強力陰離子交換劑可自GE healthcare, Marlborough, MA, USA 獲得)；DEAE SEPHAROSE (弱陰離子交換劑可自 Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA 獲得)；Q SEPHAROSE (強力陰離子交換劑可自 Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA 獲得)。另外的例示性陰離子交換樹脂包括胺基乙基 (AE)、二乙基胺基乙基 (DEAE)、二乙基胺基丙基 (DEPE) 及季胺基乙基 (QAE)。
用於治療人類疾病之重組 AAV 顆粒的純化製造方法應達成以下目標：1) 一致的顆粒純度、效力及安全性；2) 製造方法的可擴展性；3) 可接受的製造成本。
WO 2019/006390 報導純化重組 AAV 顆粒的例示性方法。
下方概述純化重組腺相關病毒顆粒 (rAAV 顆粒) 及可擴展到大規模的生產方法。例如，針對 5 升、10 升、10-20 升、20-50 升、50-100 升、100-200 升、200–500 升或更多升體積的懸浮培養物。重組腺相關病毒顆粒純化及生產方法適用於各種 AAV 血清型/殼體變異體。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，純化 rAAV 顆粒包含以下步驟：
a) 收穫經培養之生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞及包含 rAAV 顆粒的細胞培養上清液，以產生哺乳動物細胞培養液；
b) 視情況地濃縮在步驟 (a) 中產生的收穫物，以產生濃縮哺乳動物細胞培養液；
c) 藉由使培養液接觸烷基聚葡萄糖苷清潔劑來溶解步驟 (a) 中產生的哺乳動物細胞培養液或步驟 (b) 中產生的濃縮哺乳動物細胞培養液中包含的哺乳動物細胞，以產生哺乳動物細胞培養液溶解產物；
d) 處理在步驟 (c) 中產生的溶解產物以減少溶解產物中的污染核酸，從而產生核酸減少的溶解產物；
e) 視情況地過濾在步驟 (d) 中產生的核酸減少的溶解產物，以產生澄清溶解產物，且視情況地稀釋澄清溶解產物以產生經稀釋之澄清溶解產物；
f) 將在步驟 (d) 中獲得的核酸減少的溶解產物或在步驟 (e) 中產生的澄清溶解產物或經稀釋之澄清溶解產物經受 AAV 親和力管柱層析，以產生包含重組 AAV 顆粒的管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地濃縮管柱洗出液，以產生經濃縮之管柱洗出液；
從而純化重組 AAV 顆粒。
在某些實施例中，保持步驟 (a) 至 (f) 並與以下步驟組合：
g) 將在步驟 (f) 中產生的管柱洗出液或經濃縮之管柱洗出液經受粒徑篩析管柱層析 (SEC)，以產生包含 rAAV 顆粒的第二管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地稀釋第二管柱洗出液，以產生經稀釋之第二管柱洗出液；
h) 視情況地將在步驟 (g) 中產生的第二管柱洗出液或經稀釋之第二管柱洗出液經受陰離子交換層析，以產生包含 rAAV 顆粒的第三管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地稀釋第三管柱洗出液，以產生經稀釋之第三管柱洗出液；及
i) 過濾在步驟 (g) 中產生的第二管柱洗出液或經稀釋之第二管柱洗出液，或過濾在步驟 (h) 中產生的第三管柱洗出液或經濃縮之第三管柱洗出液，
並且從而純化重組 AAV 顆粒。
在某些實施例中，保持步驟 (a) 至 (f) 並與以下步驟組合：
g) 將在步驟 (f) 中產生的管柱洗出液或經稀釋之管柱洗出液經受陽離子交換管柱層析，以產生包含 rAAV 顆粒的第二管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地稀釋管柱洗出液，以產生經稀釋之第二管柱洗出液；
h) 將在步驟 (g) 中產生的管柱洗出液或經稀釋之管柱洗出液經受陰離子交換層析，以產生包含 rAAV 顆粒的第三管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或生產/程序相關雜質分離，並視情況地濃縮第三管柱洗出液，以產生經濃縮之第三管柱洗出液，
並且從而純化重組 AAV 顆粒。
在某些實施例中，保持步驟 (a) 至 (g) 並與以下步驟組合：
g) 將在步驟 (f) 中產生的管柱洗出液或經稀釋之管柱洗出液經受陰離子交換層析，以產生包含 rAAV 顆粒的第二管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或生產/程序相關雜質分離，並視情況地濃縮第二管柱洗出液，以產生經濃縮之第二管柱洗出液；
h) 將在步驟 (g) 中產生的管柱洗出液或經稀釋之管柱洗出液經受陽離子交換管柱層析，以產生包含 rAAV 顆粒的第三管柱洗出液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地濃縮第三管柱洗出液，以產生經濃縮之第三管柱洗出液，
並且從而純化重組 AAV 顆粒。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (b) 及/或步驟 (f) 及/或步驟 (g) 及/或步驟 (h) 的濃縮係經由超濾/滲濾，例如經由切向流過濾 (TFF)。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (b) 的濃縮將收穫的細胞及細胞培養上清液的體積減少約 2-20 倍。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (f) 及/或步驟 (g) 及/或步驟 (h)的濃縮將管柱洗出液的體積減少約 5-20 倍。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (d) 包括用核酸酶處理從而減少汙染核酸。核酸酶的非限制性實例包括 benzonase。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，經由過濾器來過濾步驟 (e) 的澄清溶解產物或稀釋澄清溶解產物。過濾器的非限制性實例為孔徑介於約 0.1 至 10.0 微米之間 (包括端值) 的過濾器。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (e) 之稀釋澄清溶解產物係使用緩衝磷酸鹽、乙酸鹽或 Tris 水溶液。溶液 pH 的非限制性實例為介於約 pH 4.0 與 pH 7.4 之間 (包括端值)。Tris 溶液 pH 的非限制性實例為大於 pH 7.5，例如介於約 pH 8.0 與 pH 9.0 之間 (包括端值)。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (g) 之稀釋第二管柱洗出液或步驟 (h) 之稀釋第三管柱洗出液係使用緩衝磷酸鹽、乙酸鹽或 Tris 水溶液。溶液 pH 的非限制性實例為介於約 pH 4.0 與 pH 7.4 之間 (包括端值)。Tris 溶液 pH 的非限制性實例為大於 pH 7.5，例如介於約 pH 8.0 與 pH 9.0 之間 (包括端值)。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，將步驟 (i) 產生的 rAAV 顆粒與界面活性劑一起調配，以產生 rAAV 顆粒調配物。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (g) 及/或 (h) 的陰離子交換管柱層析包含聚乙二醇 (PEG) 調製之管柱層析。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，在 rAAV 顆粒從管柱沖提之前，用 PEG 溶液洗滌步驟 (g) 及/或 (h) 的陰離子交換管柱層析。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，PEG 具有約 1,000 g/mol 至 80,000 g/mol 之範圍內 (包括端值) 的平均分子量。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，PEG 的濃度為約 4% 至約 10% (w/v) (包括端值)。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，在 rAAV 顆粒從管柱沖提之前，用界面活性劑水溶液洗滌步驟 (g) 及/或 (h) 的陰離子交換管柱。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，在 rAAV 顆粒從管柱沖提之前，用界面活性劑溶液洗滌步驟 (g) 及/或步驟 (h) 的陽離子交換管柱。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，PEG 溶液及/或界面活性劑溶液包含含水性 Tris-HCl/NaCl 緩衝液、水性磷酸鹽/NaCl 緩衝液或水性醋酸鹽/NaCl 緩衝液。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，緩衝液或溶液中的 NaCl 濃度係介於約 20-300 mM NaCl 之間 (包括端值) 或介於約 50-250 mM NaCl (包括端值) 之間的範圍內。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，界面活性劑包含陽離子界面活性劑或陰離子界面活性劑。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，界面活性劑包含十二碳鏈界面活性劑。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，界面活性劑包含十二烷基三甲基氯化銨 (DTAC) 或十二烷基肌胺酸鈉 (Sarkosyl)。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，以水性 Tris-HCl/NaCl 緩衝液自步驟 (f)、(g) 及/或 (h) 的陰離子交換管柱沖提出 rAAV 顆粒。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，Tris-HCl/NaCl 緩衝液包含100-400 mM NaCl (包括端值)，視情況地為具有約 pH 7.5 至約 pH 9.0 (包括端值) 之範圍內的 pH。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，用水性 Tris-HCl/NaCl 緩衝液洗滌步驟 (g) 及/或 (h) 的陰離子交換管柱。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，水性 Tris-HCl/NaCl 緩衝液中的 NaCl 濃度係在約 75-125 mM 的範圍內 (包括端值)。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，水性 Tris-HCl/NaCl 緩衝液具有約 pH 7.5 至約 pH 9.0 的pH (包括端值)。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，洗滌一次或多次步驟 (g) 及/或 (h) 的陰離子交換管柱，以減少第二管柱洗出液或第三管柱洗出液中空殼體的量。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，陰離子交換管柱之洗滌在 rAAV 顆粒沖提之前及/或在 rAAV 顆粒沖提時自管柱中移除空殼體，從而減少在第二管柱洗出液或第三管柱洗出液中空殼體的量。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，陰離子交換管柱之洗滌在 rAAV 顆粒沖提之前及/或在 rAAV 顆粒沖提時自管柱中移除總空殼體的量至少約 50%，從而減少在第二管柱洗出液或第三管柱洗出液中空殼體的量約 50%。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，水性 Tris-HCl/NaCl 緩衝液中的 NaCl 濃度係在約 110-120 mM 的範圍內 (包括端值)。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，沖提之 rAAV 顆粒及空殼體的比率及/或量係由洗滌緩衝液控制。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，自步驟 (g) 或/及 (h) 之陽離子交換管柱之水性磷酸鹽/NaCl 緩衝液或水性乙酸鹽/NaCl 緩衝液中，沖提出 rAAV 顆粒。緩衝液中之非限制性 NaCl 濃度為約 125-500 mM NaCl 的範圍內 (包括端值)。緩衝液之 pH 的非限制性實例為約 pH 5.5 至約 pH 7.5 之間 (包括端值)。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (g) 及/或 (h) 的陰離子交換管柱包含季銨官能基團，諸如季銨化聚乙烯亞胺。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，粒徑篩析管柱 (SEC) 具有約 10,000 g/mol 至約 600,000 g/mol 的分離/分餾範圍 (分子量) (包括端值)。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (g) 或/及 (h) 的陽離子交換管柱包含磺酸或官能基團諸如磺丙基。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，AAV 親和力管柱包含結合至 AAV 殼體蛋白的蛋白質或配體。蛋白質的非限制性實例包括結合至 AAV 殼體蛋白的抗體。更具體的非限制性實例包括結合至 AAV 殼體蛋白的單股駱馬 (駱駝科) 抗體。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，方法排除氯化銫梯度超速離心的步驟。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，相較於經由單一 AAV 親和力管柱純化產生或純化的 rAAV 顆粒，本方法產生的 rAAV 顆粒具有較高的純度。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，實質上同時進行步驟 (c) 及 (d)。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，在步驟 (c) 之後但在步驟 (f) 之前，將 NaCl 濃度調整至約 100-400 mM NaCl 的範圍內 (包括端值) 或至約 140-300 mM NaCl 的範圍內 (包括端值)。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，細胞為懸浮生長或貼附生長細胞。
在所有態樣及實施例的某些實施例中，細胞為哺乳動物細胞。非限制實例包括 HEK 細胞，諸如 HEK-293 細胞及 CHO 細胞，例如 CHO-K1 細胞。
用於判定含有轉基因之 rAAV 顆粒的感染滴度方法為本領域所習知 (參見，例如 Zhen 等人，Hum. Gene Ther. 15 (2004) 709)。用於測定具包裝轉基因之空殼體及 rAAV 顆粒的方法為習知 (參見，例如 Grimm 等人，Gene Therapy 6 (1999) 1322-1330；Sommer 等人，Malec. Ther. 7 (2003) 122-128)。
為判定降解/變性殼體的存在或數量，可對純化的 rAAV 顆粒進行 SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，該凝膠電泳由能夠分離三種殼體蛋白之的任何凝膠 (例如梯度凝膠) 所組成，然後運行凝膠直到樣品分離，並將凝膠轉印到尼龍膜或硝酸纖維素膜上。然後將抗 AAV 殼體抗體作為結合至變性殼體蛋白的初級抗體 (參見，例如 Wobus 等人，J. Viral.74 (2000) 9281-9293)。結合至初級抗體的二級抗體包含檢測初級抗體的方式。使用半定量檢測初級抗體與二級抗體之間的結合以判定殼體的數量。另一種方法是使用具 SEC 管柱的分析級 HPLC 或分析級超速離心機。
具體實施方式
本發明至少部分基於以下發現：AAV 親和力層析中重組 AAV 顆粒的回收率，即產率 (基於殼體的產率以及基於基因體的產率兩者)，受到影響/取決於清潔劑，該清潔劑用於在 AAV 親和力層析之前溶解生產重組 AAV 顆粒的細胞。
本發明進一步至少部分基於以下發現：在 AAV 親和力層析中獲得的滿的重組 AAV 顆粒與空的重組 AAV 顆粒之比率受到影響/取決於清潔劑，該清潔劑用於在 AAV 親和力層析之前溶解生產重組 AAV 顆粒的細胞。
已發現，藉由使用烷基聚葡萄糖苷清潔劑可以在 AAV 親和力層析中增加重組 AAV 顆粒的 (基於殼體的以及基於基因體的) 產率兩者以及滿的重組 AAV 顆粒與空的重組 AAV 顆粒之比率，該烷基聚葡萄糖苷清潔劑用於在 AAV 親和力層析步驟之前溶解生產重組 AAV 顆粒的細胞。
下文使用 Triton CG 110 作為烷基聚葡萄糖苷清潔劑的實例來舉例說明如本發明之方法。這呈現為僅對本發明概念之例示而不應解釋為限制。同樣地，可以使用任何其他烷基聚葡萄糖苷清潔劑。本發明之真實範疇如所附申請專利範圍中所闡述。
更詳細地，與目前「黃金標準」Triton X-100 (具有聚乙二醇側鏈的對三級辛苯酚衍生物) 相比，藉由使用 Triton CG 110 作為烷基聚葡萄糖苷清潔劑的實例，可以在 AAV 親和力層析中達成大於 5% 的絕對 AAV 顆粒回收率增加，即與當 Triton X-100 已用於溶解細胞時，絕對回收率為 72% 相比，當 Triton CG 110 已用於溶解細胞時，可達成 76% 之絕對回收率。
由於該方法旨在大規模生產重組 AAV 顆粒，因此即使 AAV 顆粒回收率的相對產率微小增加也會導致絕對產率大幅增加，並且從而帶來優勢。
在絕對 AAV 顆粒回收率增加的同時，與施加至 AAV 親和力層析材料的溶解產物中的比率相比，AAV 親和力層析洗出液中滿的重組 AAV 顆粒與空的重組 AAV 顆粒之比率增加。
更詳細地，已發現與目前「黃金標準」Triton X-100 相比，藉由使用 Triton CG 110 作為烷基聚葡萄糖苷清潔劑的實例，可以在 AAV 親和力層析中獲得大於 60% 的基因體回收率增加，即與當 Triton X-100 已用於溶解細胞時，絕對基因體產率為每 mL 2.8 x 1E11 個病毒基因體 (vg/mL) 相比，當 Triton CG 110 已用於溶解細胞時，絕對基因體產率為每 mL 4.7 x 1E11 個病毒基因體 (vg/mL)。與 Triton X-100 溶解培養液相比，在 Triton CG 110 溶解培養液的 AAV 親和力層析之洗出液中亦可以獲得大於 50% 的總病毒顆粒產率增加，即與當 Triton X-100 已用於溶解細胞時，絕對顆粒產率為每 mL 0.77 x 1E13 個病毒顆粒 (vp/mL) 相比，當 Triton CG 110 已用於溶解細胞時，絕對顆粒產率為每 mL 1.2 x 1E13 個病毒顆粒 (vp/mL)。
由於基因體產率的增加高於總病毒顆粒產率的增加，因此獲得了滿的重組 AAV 顆粒與空的重組 AAV 顆粒之比率的增加。
相應的資料顯示於下表中：
| Triton X-100 1% 最終濃度 | Triton CG 110 1% 最終濃度 | |
| 基因體滴度溶解產物 [vp/ml] (經調解之起始滴度)；施加相同體積 | 1.6 x10 11 | 1.6 x10 11 |
| Poros AAVX 洗出液中之殼體滴度 [vp/ml] | 0.77 x10 13 | 1.2 x10 13 |
| Poros AAVX 洗出液中之基因體滴度 [vg/ml] | 2.8 x10 11 | 4.7 x10 11 |
| vg/vp 比率 [%] 表示入殼之 DNA 的級分 | 3.6 | 3.9 |
| Poros AAVX 親和力層析後之基因體產率 [%] | 72.0 | 76.0 |
因此，本發明至少部分基於以下發現：使用 Triton CG 110 作為烷基聚葡萄糖苷清潔劑的實例溶解生產重組 AAV 顆粒的細胞導致滿的重組 AAV 顆粒的回收率增加。
Triton CG 110 最終濃度及溶解時間 (Triton CG 110 的存在下之孵育時間) 的不同組合已在小規模實驗中，使用三重 PEI 介導之轉染後 72 小時獲得的相同培養液的等分試樣進行測試。
已發現約 60 分鐘的孵育時間以及 1% (v/v) 的 Triton CG 110 之最終濃度提供最佳的總體結果。藉由在與烷基聚葡萄糖苷清潔劑 Triton CG 110 一起孵育後，與矽藻土一起孵育約 20 分鐘，更進一步地改善這一點。這些為本發明之較佳的實施例。
相應的資料顯示於下表中。
| 條件 | CG 110 最終濃度 [w/v] | triton 孵育時間 [min.] | 矽藻土孵育時間 [min.] | 濁度 [NTU] | 濁度減少 [NTU] | vp/mL [E10] | vg/mL [E9] | 滿空比 |
| 溶解前上清液 | 235.00 | 3.90 | 6.20 | 15.8 | ||||
| 冷凍/解凍 | 4.10 | 5.40 | 13.0 | |||||
| 0.1 % | 30 | 5 | 195.00 | 40.00 | 6.90 | 5.60 | 8.2 | |
| 0.1 % | 120 | 5 | 160.00 | 75.00 | 7.75 | 5.50 | 7.2 | |
| 1.5 % | 30 | 5 | 110.00 | 125.00 | 4.40 | 4.75 | 10.8 | |
| 1.5 % | 120 | 5 | 85.00 | 150.00 | 5.60 | 5.40 | 9.6 | |
| 0.8 % | 75 | 5 | 102.50 | 132.50 | 3.80 | 5.10 | 13.5 | |
| 0.8 % | 75 | 5 | 102.50 | 132.50 | 6.20 | 5.50 | 8.8 | |
| 1.0 % | 60 | 5 | 105.00 | 130.00 | 4.90 | 5.40 | 11.0 | |
| 1.0 % | 60 | 20 | 103.00 | 132.00 | 4.20 | 6.20 | 13.6 |
哺乳動物 HEK293 細胞已使用以下進行轉染：生產重組 AAV 顆粒所需的質體 (即包含轉基因之質體 (轉基因質體))、編碼 AAV 包裝蛋白的質體 (rep/cap 質體) 及包含在 HEK293 細胞中尚未包含之所需 AAV 輔助功能的質體 (輔助質體)。
更詳細地，為了生產重組 AAV 顆粒，使用 F17 培養基在 Wave 生物反應器 (10 L 工作體積) 中在批式製程中培養預培養之 HEK293 細胞，起始細胞密度為大約 1E6 個細胞/ml。
接種生物反應器幾小時後，進行使用三種質體 (輔助質體、轉基因質體、rep/cap 質體) 進行的 PEI (聚乙烯亞胺) 介導之轉染。基於接種後之細胞密度 (1 µg DNA/E6 個細胞) 計算總 DNA 量。三種質體之莫耳比為 1:1:1。使用量為 2 µg/1 µg 質體的轉染試劑。
在 37℃ 之溫度、70% 之濕度、5% 之 pCO2 下、在 30-35 rpm 攪拌器速度下進行培養，無需氧氣及 pH 控制。使用流速為約 500 ml/min 的空氣完成通氣。轉染後 72 h 終止培養。
在替代方法中，HEK 細胞可以在 4 天的饋料批式製程中培養，加入饋料及葡萄糖，起始細胞密度為大約 15 x 1E5 個細胞/ml。
可在接種後 24 h，進行使用三種質體 (輔助質體、轉基因質體、rep/cap 質體) 三重轉染進行的 PEI (聚乙烯亞胺) 介導之轉染。首先，將 20% v/v 新鮮培養基加入至培養物中。隨後，製備轉染混合物並加入至培養物中。總 DNA 濃度為 3 µg/mL，且三種質體之莫耳比為 1:1:1。使用濃度為 2.5 µg/1 µg 質體的轉染試劑，並以 1.5 µg/ml 培養物體積的濃度加入游離 PEI。
在發酵的第二天 (轉染後 24 h) 加入饋料 (例如來自 Xell AG 的 HEK FS 饋料補充劑) 作為大劑量饋料。在發酵的第一天及第三天加入葡萄糖作為大劑量饋料。藉由分別地加入 CO
2及 1 M Na
2CO
3來調節 pH 值，調節範圍為 0.05 pH 單位。如有必要，加入防沫劑溶液。在該過程中，對參數溫度、pH 值及 pO
2進行監測及控制。發酵製程在第 4 天 (三重轉染後 72 h) 藉由加入溶解緩衝液停止。
***
本文提及的所有參考文獻均經由引用併入本文。
***
提供以下實例以幫助理解本發明，但本發明之真實範圍在所附申請專利範圍中闡明。應當理解的是，在不脫離本發明之精神的前提下，可以對所提出的步驟進行修改。
實例
材料
細胞系
使用可商購獲得的 HEK293 細胞，用於使用用三種質體進行的瞬時轉染來生產 AAV 顆粒。
培養材料
根據供應商的操作說明製備培養基 (HEK ViP NB 粉末培養基，Xell AG)。HEK FS 饋料 (Xell AG) 及 F17 培養基已購入即用。培養基及饋料在 4℃ 下在黑暗中儲存，並根據製造商的說明進行消耗。校正劑在室溫下儲存 (葡萄糖溶液；碳酸鈉溶液；消泡劑溶液)。
實例
1
HEK293
細胞之培養及重組
AAV
顆粒之生產
通常，培養方法改編自標準方案 (參見，例如，Lindl, T., 「Zell- und Gewebekultur: Einführung in die Grundlagen sowie ausgewählte Methoden und Anwendungen」, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg/Berlin, 2002) 及相應的供應商的操作說明。
預培養
將 HEK 細胞解凍，並在搖瓶中在 37℃、70% 濕度、5% pCO2 及 120 rpm 搖動頻率下在培養基中繁殖兩至三週。細胞每三至四天發生分裂，並在培養基中擴增至生產培養的接種所需之體積。
生產培養
為了生產重組 AAV 顆粒，使用 F17 培養基在 Wave 生物反應器 (10 L 工作體積) 中在批式製程中培養預培養之 HEK293 細胞，起始細胞密度為 10 x E5 個細胞/ml。
接種生物反應器幾小時後，進行使用三種質體 (輔助質體、轉基因質體、rep/cap 質體) 進行的 PEI (聚乙烯亞胺) 介導之轉染。基於接種後之細胞密度 (1 µg DNA/E6 個細胞) 計算總 DNA 量。三種質體之莫耳比為 1:1:1。轉染試劑為 PEIpro (Polyplus)，量為 2 µg/1 µg 質體 DNA。
在 37℃ 之溫度、70% 之濕度、5% 之 pCO2 下、在 30-35 rpm 攪拌器速度下進行培養，無需氧氣及 pH 控制。使用流速為約 500 ml/min 的空氣完成通氣。轉染後 72 h 終止培養。
實例
2
溶解
為了將 AAV 顆粒釋放到細胞培養液中，將包含不同濃度之測試清潔劑的 10% (v/v) 溶解緩衝液 (500 mM TRIS，20 mM MgCl2，pH 7.5) 加入至培養液中。此外，加入 50 U/ml DNase I (牛胰臟，Roche) 及 37.5 mM MgSO4。然後將細胞培養液在 37℃ 下在攪拌下孵育不同時間，無需通氣及 pH 控制。相應的孵育後，將溶解產物無菌過濾。
實例
3
AAV
顆粒純化
對於親和力層析步驟，在 Äkta Avant 25 層析系統上使用包含來自 Thermo Fisher 的 10.5 mL AAVX 樹脂的管柱。該系統以約 300 cm/h 之流速運轉。用緩衝液 A (1x PBS，pH 7.4，0.001% Pluronic F-68) 平衡後，將 200 mL 溶解培養液施加至管柱，然後分別地用平衡緩衝液及 0.5 M NaCl (pH 6.0) 進行 2 次洗滌步驟。AAV 顆粒用 0.1 M 檸檬酸鈉溶液 (pH 2.4) 沖提。藉由加入 2 M Tris (pH 10) 將洗出液之 pH 調節至 pH 7.5。
| 步驟 | 緩衝液 | 管柱體積 [CV] |
| 平衡 | 1xPBS，pH 7.4 | 3 |
| 負載 | 溶解產物 | |
| 洗滌 I | 1xPBS，pH 7.4 | 4 |
| 洗滌 II | 0.5 M 氯化鈉 pH 6.0 | 4 |
| 洗滌 III | 1xPBS，pH 7.4 | 4 |
| 沖提 | 0.1 M 檸檬酸鈉 pH 2.4 | 3 |
實例
4
分析方法
用於總滴度判定的酶聯免疫吸附測定
(ELISA)
對於 AAV 殼體滴度判定，根據製造商的說明使用來自 PROGEN 的套組 (目錄號 PRAAV8)。
簡而言之，該測定為一種使用重組 AAV 殼體特異性抗體及生物素標記的檢測抗體作為捕獲抗體的夾心 ELISA。
將預塗之多滴度板 (MTP) 的孔分別地與 100 µL 標準品、樣品或對照品在 4℃ 下孵育過夜。次日，用如套組中提供之 ASSB 緩衝液 (1x) 將孔洗滌三次。此後，每孔加入 100 µL 包含生物素化檢測抗體 (根據製造商的說明稀釋) 的溶液，並在室溫下在搖動的情況下孵育兩小時。然後，用如套組中提供之 ASSB 緩衝液 (1x) 將孔洗滌三次。在下一步驟中，將 100 µl 包含與鏈黴親和素結合的辣根過氧化物酶的溶液加入至每個孔中，並在室溫下在搖動的情況下孵育 30 分鐘。然後，用如套組中提供之 ASSB 緩衝液 (1x) 將孔洗滌三次。對於呈色反應，將 100 µL 根據製造商的說明製備的包含 ABTS 的溶液加入至每個孔中並在搖動的情況下孵育。使用 MTP-ELISA-Reader Versa Max (Molecular Devices) 在 405 nm 判定顏色強度，參考波長為 490 nm，直至空白與具有最高濃度的標準品之間的消光差異達到約 1.5。
每個樣品、標準品及對照品都重複測量兩次。
基於藉由 4 參數擬合判定的標準曲線計算殼體的量 (殼體/mL)，例如根據 WiemerRodbard 演算法，使用標準品的平均值。
用於基因體滴度判定的數字微滴聚合酶鏈反應
(ddPCR)
用於酶促樣品處理之試劑：
1) DNase I 緩衝液 (NEB)：100 mM Tris-HCl，pH 7.6，25 mM MgSO4，5 mM CaCl2
2) DNase I (NEB)：0.2 U/µL
3) 蛋白酶 K (NEB；大約 20 mg/mL = 800 U/mL)：16 U/mL
4) 蛋白酶 K 緩衝液 (BioRad)：400 mM Tris-HCl，20 mM EDTA，2000 mM NaCl，1% SDS，pH 8
5) 十二烷基硫酸鈉 (SDS) 溶液： 10 % (w/v)
酶促樣品處理：
-混合 30 µL H2O、5 µL DNase I 緩衝液、5 µL DNase I、10 µL 樣品
-在 37℃ 下孵育 30 分鐘。
-加熱至 75℃ 持續 15 分鐘，以獲得經孵育的 DNase I-Mix
-短暫的冷卻及離心
-混合 42 µL H2O + 2 µL 蛋白酶 K + 5 µL 蛋白酶 K 緩衝液 + 1 µL 10 % SDS 溶液，並加入經孵育的 DNase I-Mix
-在 50℃ 下孵育 60 分鐘
-加熱至 95℃ 持續 15 分鐘。
-冷卻至 4℃
ddPCR ：對於病毒基因體滴定，進行了雙鏈化 ddPCR 測定。引子及探針係針對所使用之 CMV 啟動子並針對 polyA/3'UTR 序列設計。根據下表 (微滴數字 PCR 引導 - Bio-Rad) 製備 PCR 預混液。
| 組分 | 每孔體積 [µL] | 最終濃度 |
| Supermix (2x) | 11 | 1x |
| 20 µM CMV 正向引子 | 0.99 | 900 nM |
| 20 µM CMV 反向引子 | 0.99 | 900 nM |
| 20 µM CMV 探針 | 0.275 | 250 nM |
| 模板 | 5.5 | - |
| 水 | 0.99 | - |
| 總計 | 22 |
將經製備的預混液移液至 96 孔板中，每孔 16.5 µL。然後，進行預處理樣品的稀釋系列：使用 LoRentention Tips 將 10 µL 樣品轉移至 LoBind 管中的 90 µL 水中，並充分混合。此後，在數個稀釋步驟中將 5.5 µL 樣品加入至 96 孔板中的預混液溶液中。將板在 180℃ 下密封，以 2,200 rpm 渦旋 1 分鐘。並以 1,000 rpm 再離心 1 分鐘。使用自動微滴生成器裝置 (從每孔中取出 20 µL PCR 混合物)，每孔產生多達 20,000 個微滴，並轉移至另一個 96 孔板中。在 180℃ 下密封微滴板後，進行 PCR 運轉。相應的條件顯示於下表中。
| 週期數 | 變性 | 退火 | 最終伸長 | 結束 |
| 1 | 94℃，10 分鐘。 | |||
| 39 | 94℃，30 秒。 | 58°C，1 分鐘。 | ||
| 1 | 98°C，10 分鐘。 | 12℃，永遠 |
在微滴讀數儀中，測量每個微滴的螢光訊號。QuantaSoft 軟體處理讀數儀資料並計算標靶序列的每 20 µL 孔的拷貝數。初始樣品滴度可以用以下方程式判定：
Claims (15)
- 一種純化重組 AAV 顆粒之方法，其包含下列步驟： - 藉由使相應的哺乳動物細胞培養液與烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸而自生產性哺乳動物細胞中釋放重組 AAV 顆粒，以及 - 用 AAV 親和力層析來純化該等重組 AAV 顆粒 從而純化該等重組 AAV 顆粒， 其中該哺乳動物細胞培養液包含經培養之生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞及用於培養該等生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞之培養基。
- 一種烷基聚葡萄糖苷清潔劑的用途，其用於提高重組 AAV 顆粒之產率，其中用烷基聚葡萄糖苷清潔劑溶解生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞且其中在後續 AAV 親和力層析步驟後判定該產率。
- 一種烷基聚葡萄糖苷清潔劑的用途，其用於在後續 AAV 親和力層析中提高所獲得的 (在洗出液級分中) 滿的重組 AAV 顆粒與空的重組 AAV 顆粒之比率，其中在該 AAV 親和力層析之前用烷基聚葡萄糖苷清潔劑溶解生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法及用途，其中該烷基聚葡萄糖苷清潔劑為 58.0 至 62.0 (w/v)% D-葡萄哌喃糖癸基辛基醣苷寡聚物 (D-glucopyranose, oligomeric, decyl octyl glycoside) 與 38.0 至 42.0 (w/v)% 水之混合物。
- 如前述請求項中任一項之方法及用途，其中該烷基聚葡萄糖苷清潔劑具有 CAS 號 68515-73-1。
- 如前述請求項中任一項之方法及用途，其中該烷基聚葡萄糖苷清潔劑係在溶液中。
- 如前述請求項中任一項之方法及用途，其中該哺乳動物細胞培養液係以其體積之 5% 至 10% (5% (v/v) 至 10% (v/v)) 與包含烷基聚葡萄糖苷清潔劑的溶液組合。
- 如請求項 6 至 7 中任一項之方法及用途，其中包含該烷基聚葡萄糖苷清潔劑的該溶液包含濃度為約 10% 的該烷基聚葡萄糖苷清潔劑。
- 如前述請求項中任一項之方法及用途，其中分別地接觸該烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與該烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係持續約 60 分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法及用途，其中分別地接觸該烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與該烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸係在約 37°C 之溫度下。
- 如前述請求項中任一項之方法及用途，其中在接觸該烷基聚葡萄糖苷清潔劑或與該烷基聚葡萄糖苷清潔劑接觸後，分別添加矽藻土且培養混合物 5 至 20 分鐘。
- 如請求項 6 至 11 中任一項之方法及用途，其中包含該烷基聚葡萄糖苷清潔劑的該溶液包含濃度為 10 mM 至 40 mM 的氯化鎂(II)。
- 如請求項 6 至 12 中任一項之方法及用途，其中包含該烷基聚葡萄糖苷清潔劑的該溶液具有約 7.5 之 pH 值。
- 如前述請求項中任一項之方法及用途，其中使該哺乳動物細胞培養液接觸該烷基聚葡萄糖苷清潔劑及 50 U/mL 之選自去氧核糖核酸酶 I (DNase I) 及全能核酸酶 (Benzonase) 的核酸酶。
- 如前述請求項中任一項之方法及用途，其中該親和力層析係在包含交聯聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質的層析材料上，該基質與單域抗體片段 (VHH) 共價結合，該單域抗體片段與 AAV 血清型 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10 及基於其的合成血清型特異性結合。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP22184964.9 | 2022-07-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202417619A true TW202417619A (zh) | 2024-05-01 |
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