JP2020048586A - 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＡＡＶベクター粒子ストックから空キャプシドを除去するかまたは空キャプシド数を減少させて、製造能力を増強する新規な方法を提供すること。【解決手段】本発明は、空キャプシドの量が減少したｒＡＡＶビリオンストックを調製するための、効率的かつ商業的に実現可能な方法を開発したことに基づく。本発明者らは、本明細書において、空キャプシドが、カラムクロマトグラフィー技術を使用することによって、遺伝物質を含むｒＡＡＶビリオン（「ＡＡＶベクター粒子」）から分離され得ることを見出した。ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとの混合物からＡＡＶの空キャプシドを分離するための方法が、記載される。この方法は、カラムクロマトグラフィー技術を使用し、商業的に実現可能なレベルの組換えＡＡＶビリオンを提供する。【選択図】なし

Description

（技術分野）
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを精製するための方法に関する。よ
り具体的には、本発明は、パッケージングされたゲノムを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）
ビリオンを、パッケージングされたｒＡＡＶビリオンとそのパッケージングされたゲノム
を欠くＡＡＶの空キャプシドとの両方を含むＡＡＶビリオン混合物から精製するための方
法に関する。

（背景）
治療上有効な量の遺伝子産物を安全かつ持続的に患者へと送達する遺伝子治療方法が、
現在開発中である。これらの方法を使用して、核酸分子が、患者へと直接導入され得る（
インビボ遺伝子治療）か、または患者もしくはドナーから単離された細胞中へと導入され
得、その後、その細胞は上記患者へと戻される（エキソビボ遺伝子治療）。その後、導入
された核酸は、その患者自身の細胞または移植細胞が望ましい治療産物を産生するように
仕向ける。遺伝子治療はまた、臨床家が、治療のために特定の器官または細胞標的（例え
ば、筋肉、血球、脳細胞など）を選択するのを可能にする。

核酸は、いくつかの方法で患者の細胞中へと導入され得る。その方法としては、ウイル
ス媒介性遺伝子送達、裸ＤＮＡ送達、およびトランスフェクション法が挙げられる。ウイ
ルス媒介性遺伝子送達は、大部分の遺伝子治療試験において使用されている（Ｃ．Ｐ．Ｈ
ｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１３：２２２〜２２５）。最も
一般的に使用される組換えウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイ
ルス、ポックスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を基にしている。

組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、ヒト遺伝子治療のための遺伝子送達ベクターと
しての見込みを保持していた。しかし、そのようなベクターを薬物として使用するための
１つの重要な障害は、商業的に実現可能なレベルでそのベクターを生成および精製するた
めの、真に拡張可能なプロセスの開発である。商業的使用のためにＡＡＶベクター生成を
拡張することに関与する難問の概説について、ＱｕおよびＷｒｉｇｈｔ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉ
ｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐ．（２０００）３：７５０〜７５５を
参照のこと。最近、ｒＡＡＶビリオンを精製するための拡張可能性のあるいくつかのカラ
ムクロマトグラフィー技術が、開発された。これらのカラムクロマトグラフィーベースの
精製方法は、ｒＡＡＶビリオンが、大規模精製され得ることを実証したが、カラムクロマ
トグラフィーを使用して精製ビリオンを調製すると、かなりの量のＡＡＶの空キャプシド
を含む。空キャプシドと、目的とする異種遺伝子を含むビリオン（「ＡＡＶベクター粒子
」）との代表的な比率は、約１０以上である。すなわち、回収されたベクターのうちの約
９０％は、空キャプシドである。

大量の空キャプシドの存在は、例えば、そのキャプシドタンパク質に対する望ましくな
い免疫応答を惹起することによって、または標的細胞表面結合部位について競合すること
によって、臨床的適用を妨害し得る。結果として、ｒＡＡＶビリオン調製物から上記空キ
ャプシドを除去する技術が、開発されている。これらの技術は、代表的には、超遠心分離
（例えば、塩化セシウムまたはイオジキサノール中で勾配遠心分離）に依存する。そのよ
うな遠心分離技術は、労働集約的であり、代表的には、低ベクター収率を生じ、かつ拡張
可能ではない。Ｋａｌｕｄｏｖら（２００２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１２
３５〜１２４３は、アニオン交換カラムを使用して、ｒＡＡＶ−２ベクター、ｒＡＡＶ−
４ベクター、およびｒＡＡＶ−５ベクターを精製する方法を記載する。しかし、その実験
は、溶出物をプールして画分を濃縮した後でさえ、パッケージされたゲノムとしてそれぞ
れ、２％、０．６％、および６．３％しか回収可能ではなかった。

従って、ＡＡＶベクター粒子ストックから空キャプシドを除去するかまたは空キャプシ
ド数を減少させて、製造能力を増強する新規な方法についての必要性が、存在する。

（発明の要旨）
本発明は、空キャプシドの量が減少したｒＡＡＶビリオンストックを調製するための、
効率的かつ商業的に実現可能な方法を開発したことに基づく。本発明者らは、本明細書に
おいて、空キャプシドが、カラムクロマトグラフィー技術を使用することによって、遺伝
物質を含むｒＡＡＶビリオン（「ＡＡＶベクター粒子」）から分離され得ることを見出し
た。この結果は、驚くべきものである。なぜなら、空キャプシドと、パッケージングされ
たキャプシドとは、同一の表面特性を有すると、以前には考えられていたからである。本
発明者らが知る限りでは、これは、ウイルス粒子の電荷および／または電荷密度が、空キ
ャプシドと完全粒子との間では異なることについての最初の証明である。本明細書中に記
載される技術は、ＡＡＶの空キャプシドをＡＡＶベクター粒子から分離するための効率的
かつ拡張可能な方法を提供する。

従って、一実施形態において、本発明は、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシド
とを含むＡＡＶ調製物からＡＡＶベクター粒子を精製して、ＡＡＶの空キャプシドを実質
的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための方法に関する。上記方法は、
（ａ）ＡＡＶベクター粒子を含む宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）上記宿主細胞を溶解して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含む
粗細胞溶解物を得る工程；
（ｃ）上記粗細胞溶解物を、第一のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、
上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合する条件下
で適用する工程；
（ｄ）上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドを、非分離条件下で溶
出して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物を提供する工
程；
（ｅ）上記工程（ｄ）からのＡＡＶ調製物を、第二のカチオン交換クロマトグラフィー
カラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラム
に結合する条件下で適用する工程；
（ｆ）低塩緩衝液を、上記工程（ｅ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶
出されＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
ならびに
（ｇ）ＡＡＶベクター粒子を含む上記工程（ｆ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの
空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
を包含する。

さらなる実施形態において、上記方法は、
（ｈ）上記工程（ｇ）からの画分を、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに対して
、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが存在する場合には上記カラ
ムに結合する条件下で、適用する工程；
（ｉ）低塩緩衝液を、上記工程（ｈ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが
溶出されＡＡＶベクター粒子が上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｊ）高塩緩衝液を、上記工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶
出される条件下で添加する工程；
（ｋ）ＡＡＶベクター粒子を含む上記工程（ｉ）からの画分を収集して、ＡＡＶの空キ
ャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
をさらに包含する。

なおさらなる実施形態において、本発明は、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシ
ドとを含むＡＡＶ調製物からＡＡＶベクター粒子を精製して、ＡＡＶの空キャプシドを実
質的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための方法に関する。上記方法は、
（ａ）ＡＡＶベクター粒子を含む宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）上記宿主細胞を溶解して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含む
粗細胞溶解物を得る工程；
（ｃ）上記粗細胞溶解物を清澄化して、清澄化した細胞溶解物を提供する工程；
（ｄ）上記清澄化した細胞溶解物を、機能的リガンドＲ−ＳＯ_３−を有するマトリック
スを含む第一のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒
子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｅ）上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドを、非分離条件下で溶
出して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物を提供する工
程；
（ｆ）上記工程（ｅ）からのＡＡＶ調製物を、第二のカチオン交換クロマトグラフィー
カラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラム
に結合する条件下で適用する工程；
（ｇ）低塩緩衝液を、上記工程（ｆ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶
出されＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｈ）ＡＡＶベクター粒子を含む工程（ｇ）からの溶出画分を収集する工程；
（ｉ）上記工程（ｈ）からの画分を、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに対して
、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが存在する場合には上記カラ
ムに結合する条件下で、適用する工程；
（ｊ）低塩緩衝液を、上記工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが
溶出されＡＡＶベクター粒子が上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｋ）高塩緩衝液を、上記工程（ｊ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶
出される条件下で添加する工程；ならびに
（ｌ）ＡＡＶベクター粒子を含む上記工程（ｋ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの
空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
を包含する。

別の実施形態において、本発明は、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含
むＡＡＶ調製物からＡＡＶベクター粒子を精製して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含
まないＡＡＶ生成物を提供するための方法に関する。上記方法は、
（ａ）ＡＡＶベクター粒子を含む宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）上記宿主細胞を溶解して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含む
粗細胞溶解物を得る工程；
（ｃ）上記粗細胞溶解物を、カチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、上記Ａ
ＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合する条件下で適用
する工程；
（ｄ）上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドを、非分離条件下で溶
出して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物を提供する工
程；
（ｅ）上記工程（ｄ）からのＡＡＶ調製物を、アニオン交換クロマトグラフィーカラム
に対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合
する条件下で適用する工程；
（ｆ）低塩緩衝液を、上記工程（ｅ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが
溶出されＡＡＶベクター粒子が上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｇ）高塩緩衝液を、上記工程（ｆ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶
出される条件下で添加する工程；
（ｈ）ＡＡＶベクター粒子を含む工程（ｇ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空キ
ャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
を包含する。

さらなる実施形態において、上記方法は、
（ｉ）上記工程（ｈ）からのＡＡＶ調製物を、第二のアニオン交換クロマトグラフィー
カラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが存在する場
合には上記カラムに結合する条件下で、適用する工程；
（ｊ）低塩緩衝液を、上記工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが
溶出されＡＡＶベクター粒子が上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｋ）高塩緩衝液を、上記工程（ｊ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶
出される条件下で添加する工程；
（ｌ）ＡＡＶベクター粒子を含む上記工程（ｋ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの
空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
をさらに包含する。

代替的な実施形態において、上記方法は、
（ｉ）上記工程（ｈ）からのＡＡＶ調製物を、第二のカチオン交換クロマトグラフィー
カラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラム
に結合する条件下で、適用する工程；
（ｊ）低塩緩衝液を、上記工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶
出されＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
ならびに
（ｋ）ＡＡＶベクター粒子を含む上記工程（ｊ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの
空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
をさらに包含する。

上記の方法すべての特定の実施形態において、上記第一のカチオン交換カラムおよび／
または第二のカチオン交換カラムは、カルボキシメチル化マトリックスまたはスルホン化
マトリックス（例えば、機能的リガンドＲ−ＳＯ_３−を含むマトリックス）を含む。

上記の方法すべてのさらなる実施形態において、上記ＡＡＶベクター粒子は、上記ＡＡ
Ｖ生成物中に少なくとも５０％の量（例えば少なくとも７５％の量、例えば少なくとも８
５％または少なくとも９０％の量）で存在する。

上記の方法すべてのなおさらなる実施形態において、上記ＡＡＶベクター粒子は、ＡＡ
Ｖ−２またはＡＡＶ−５に由来する。

本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物からＡＡＶベクター粒
子を精製して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための
方法であって、該方法は、
（ａ）ＡＡＶベクター粒子を含む宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）該宿主細胞を溶解して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含む粗
細胞溶解物を得る工程；
（ｃ）該粗細胞溶解物を、第一のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、該
ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合する条件下で適用す
る工程；
（ｄ）該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドを、非分離条件下で溶出し
て、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物を提供する工程；
（ｅ）該工程（ｄ）からのＡＡＶ調製物を、第二のカチオン交換クロマトグラフィーカ
ラムに対して、該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合す
る条件下で適用する工程；
（ｆ）低塩緩衝液を、該工程（ｅ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出
されＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；なら
びに
（ｇ）ＡＡＶベクター粒子を含む該工程（ｆ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空
キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、前記第一のカチオン交換カラムは、カルボキシメチル化マ
トリックスまたはスルホン化マトリックスを含む、方法。
（項目３）
項目２に記載の方法であって、前記マトリックスは、機能的リガンドＲ−ＳＯ_３−を含む
、方法。
（項目４）
項目１に記載の方法であって、前記第二のカチオン交換カラムは、カルボキシメチル化マ
トリックスまたはスルホン化マトリックスを含む、方法。
（項目５）
項目４に記載の方法であって、前記マトリックスは、機能的リガンドＲ−ＳＯ_３−を含む
、方法。
（項目６）
項目１に記載の方法であって、
（ｈ）前記工程（ｇ）からの画分を、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに対して
、前記ＡＡＶベクター粒子および前記ＡＡＶの空キャプシドが存在する場合には該カラム
に結合する条件下で、適用する工程；
（ｉ）低塩緩衝液を、該工程（ｈ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが溶
出されＡＡＶベクター粒子が該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｊ）高塩緩衝液を、該工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出
される条件下で添加する工程；
（ｋ）ＡＡＶベクター粒子を含む該工程（ｊ）からの画分を収集して、ＡＡＶの空キャ
プシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目７）
ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物からＡＡＶベクター粒
子を精製して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための
方法であって、該方法は、
（ａ）ＡＡＶベクター粒子を含む宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）該宿主細胞を溶解して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含む粗
細胞溶解物を得る工程；
（ｃ）該粗細胞溶解物を清澄化して、清澄化した細胞溶解物を提供する工程；
（ｄ）該清澄化した細胞溶解物を、機能的リガンドＲ−ＳＯ_３−を有するマトリックス
を含む第一のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、該ＡＡＶベクター粒子お
よび該ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｅ）該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドを、非分離条件下で溶出し
て、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物を提供する工程；
（ｆ）該工程（ｅ）からのＡＡＶ調製物を、第二のカチオン交換クロマトグラフィーカ
ラムに対して、該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合す
る条件下で適用する工程；
（ｇ）低塩緩衝液を、該工程（ｆ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出
されＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｈ）ＡＡＶベクター粒子を含む工程（ｇ）からの溶出画分を収集する工程；
（ｉ）該工程（ｈ）からの画分を、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、
該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドが存在する場合には該カラムに結合
する条件下で、適用する工程；
（ｊ）低塩緩衝液を、該工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが溶
出されＡＡＶベクター粒子が該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｋ）高塩緩衝液を、該工程（ｊ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出
される条件下で添加する工程；ならびに
（ｌ）ＡＡＶベクター粒子を含む該工程（ｋ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空
キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
を包含する、方法。
（項目８）
ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物からＡＡＶベクター粒
子を精製して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための
方法であって、該方法は、
（ａ）ＡＡＶベクター粒子を含む宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）該宿主細胞を溶解して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含む粗
細胞溶解物を得る工程；
（ｃ）該粗細胞溶解物を、カチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、該ＡＡＶ
ベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合する条件下で適用する工程
；
（ｄ）該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドを、非分離条件下で溶出し
て、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物を提供する工程；
（ｅ）該工程（ｄ）からのＡＡＶ調製物を、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに
対して、該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合する条件
下で適用する工程；
（ｆ）低塩緩衝液を、該工程（ｅ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが溶
出されＡＡＶベクター粒子が該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｇ）高塩緩衝液を、該工程（ｆ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出
される条件下で添加する工程；
（ｈ）ＡＡＶベクター粒子を含む工程（ｇ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空キ
ャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
を包含する、方法。
（項目９）
項目８に記載の方法であって、
（ｉ）前記工程（ｈ）からのＡＡＶ調製物を、第二のアニオン交換クロマトグラフィー
カラムに対して、前記ＡＡＶベクター粒子および前記ＡＡＶの空キャプシドが存在する場
合には該カラムに結合する条件下で、適用する工程；
（ｊ）低塩緩衝液を、該工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが溶
出されＡＡＶベクター粒子が該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｋ）高塩緩衝液を、該工程（ｊ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出
される条件下で添加する工程；
（ｌ）ＡＡＶベクター粒子を含む該工程（ｋ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空
キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目１０）
項目８に記載の方法であって、
（ｉ）前記工程（ｈ）からのＡＡＶ調製物を、第二のカチオン交換クロマトグラフィー
カラムに対して、前記ＡＡＶベクター粒子および前記ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに
結合する条件下で、適用する工程；
（ｊ）低塩緩衝液を、該工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出
されＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；なら
びに
（ｋ）ＡＡＶベクターを含む該工程（ｊ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空キャ
プシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目１１）
項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、ＡＡＶベクター粒子は、前記
ＡＡＶ生成物中に少なくとも７５％の量で存在する、方法。
（項目１２）
項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、ＡＡＶベクター粒子は、前記
ＡＡＶ生成物中に少なくとも８５％の量で存在する、方法。
（項目１３）
項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、ＡＡＶベクター粒子は、前記
ＡＡＶ生成物中に少なくとも９０％の量で存在する、方法。
（項目１４）
項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ＡＡＶベクター粒子は、
ＡＡＶ−２に由来する、方法。
（項目１５）
項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ＡＡＶベクター粒子は、
ＡＡＶ−５に由来する、方法。
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、本明細書中の開示を考慮すると当業
者には容易に思い浮かぶ。

図１Ａおよび１Ｂは、ＡＡＶベクター粒子およびＡＡＶ空キャプシドの両方を含む粗溶解物の結合特徴を示す。図１Ａにおいて、試験した樹脂は、以下の通りであった：レーン１：コントロール；レーン２および３：ＭＡＣＲＯ ＰＲＥＰ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡから入手可能な強アニオン交換体）；レーン４および５：ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡから入手可能な強アニオン交換体）；レーン６および７：ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な強アニオン交換体）；レーン８および９：ＰＯＲＯＳ ５０Ｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な弱アニオン交換体）。図１Ｂにおいて、試験した樹脂は、以下の通りであった：レーン１：コントロール；レーン２および３：ＰＯＲＯＳ ５０ＰＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な弱アニオン交換体）；レーン４および５：ＳＯＵＲＣＥ ３０Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な強アニオン交換体）；レーン６および７：ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な弱アニオン交換体）；レーン８および９：Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な強アニオン交換体）。図１Ａおよび１Ｂの両方について、レーン２、４、６および８は、低塩（５０ｍＭ ＮａＣｌ）洗浄画分を使用し；レーン３、５、７および９は、高塩（１Ｍ ＮａＣｌ）洗浄画分を使用した。 図２は、実施例において記載されるように、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して分離する前および分離した後の、ＡＡＶ空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子（Ｖｇｓ）の分析を示す。 図３は、実施例において記載されるように、アニオン交換カラムからの画分の銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１：ＡＡＶベクター粒子；レーン２〜５：ベクター溶出画分；レーン６：タンパク質分子量標準物質。 図４は、実施例に記載されるように、カチオン交換カラムからの溶出画分（レーン１２〜２１）を示す銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 図５は、カチオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて、ＡＡＶベクター粒子からＡＡＶ空粒子を分離することを示す、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１：出発物質；レーン２〜４：カチオン交換カラムから溶出したベクターの３つの独立したサンプル。

（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、別段記載されなければ、ウイルス学、微生物学、分子生物学および組
換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用し、これらの方法は、当該分野の技術範囲内である。
このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（最新版）
；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ＆
ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
．（Ｎ．Ｇａｉｔ，編，最新版）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編，最新版）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編、最新
版）；ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ
（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，編）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，ｖ
ｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編）；Ｆｒｅｓ
ｈｎｅｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，第３版）；ならびにＡｕｓ
ｕｂｅｌら（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ）を参照のこと。
（１．定義）
本発明を記載するにあたって、以下の用語が使用され、以下に示されるように定義され
ると解釈される。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ
」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを示さなければ、複数形の指示対象を
包含することに注意しなければならない。従って、例えば、「（１つの）パッケージされ
たキャプシド」への言及は、２つ以上のこのようなキャプシドの混合物などを包含する。

「ベクター」とは、任意の遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、トラン
スポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなど）を意味し、これらは、適切な制
御エレメントと会合した場合に複製し得、細胞間で遺伝子配列を運び得る。従って、この
用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含す
る。

「ＡＡＶベクター」とは、以下の（しかし、それらの限定されない）アデノ随伴ウイル
ス血清型に由来するベクターを意味する：ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ
−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８。ＡＡＶベクターは、ＡＡ
Ｖ野生型遺伝子のうちの１つ以上（好ましくはｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子
）が、全てまたは一部欠失されているが、機能的隣接ＩＴＲ配列を保持している。機能的
ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに必要である。
従って、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製およびパッケージングに、シスで必要とされ
る少なくともそれらの配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を含むことが、本明細書で規定され
る。このＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、その配列が、機能的レス
キュー、複製およびパッケージングを提供する限りにおいて、例えば、ヌクレオチドの挿
入、欠失もしくは置換によって改変されていてもよい。

「ＡＡＶヘルパー機能」とは、ＡＡＶ遺伝子生成物（これは、次に、生産的なＡＡＶ複
製のためにトランスで機能する）を提供するように発現され得るＡＡＶ由来のコード配列
をいう。従って、ＡＡＶヘルパー機能は、主要ＡＡＶオープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）、ｒｅｐおよびｃａｐをともに含む。このＲｅｐ発現生成物は、多くの機能（とり
わけ、以下が挙げられる：ＡＡＶ ＤＮＡ複製起点の認識、結合およびニック形成；ＤＮ
Ａヘリカーゼ活性；ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節）
を有することが示された。このＣａｐ発現生成物は、必要なパッケージング機能を供給す
る。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターから失われているトランスでのＡＡＶ機能を
補完するために、本明細書で用いられる。

用語「ＡＡＶヘルパー構築物」は、一般に、ＡＡＶベクター（これは、目的のヌクレオ
チド配列を送達するための導入ベクターを生成するために使用される）から欠失されたＡ
ＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。ＡＡＶヘルパー構築物は、
ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子の一過性の発現を提供して、失われて
いる、ＡＡＶ複製に必須のＡＡＶ機能を補完するために一般に使用される；しかし、ヘル
パー構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲを欠いており、それら自体では、複製もパッケージングも
することができない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン
、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得る。多くのＡＡＶヘルパー構築物（
例えば、一般的に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５）が記載
されており、これらは、Ｒｅｐ発現生成物およびＣａｐ発現生成物の両方をコードする。
例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；
およびＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６−２９４５を参照
のこと。多くの他のベクターが記載されており、これらは、Ｒｅｐ発現生成物および／ま
たはＣａｐ発現生成物をコードする。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号および同
第６，３７６，２３７号を参照のこと。

用語「補助機能」とは、ＡＡＶが、その複製に関して依存性である、非ＡＡＶ由来のウ
イルス機能および／または細胞機能をいう。従って、この用語は、ＡＡＶ複製に必要とさ
れるタンパク質およびＲＮＡ（ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡ
スプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現生成物の合成ならびにＡＡＶキャプシ
ドアセンブリに関与する部分を含む）を表す。ウイルスベースの補助機能は、既知のヘル
パーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型
以外）およびワクシニアウイルス）のいずれかに由来し得る。

用語「補助機能ベクター」とは、一般に、補助機能を提供するヌクレオチド配列を含む
核酸分子をいう。補助機能ベクターは、適切な宿主細胞にトランスフェクトされ得る。こ
こで、このベクターは、次いで、この宿主細胞におけるＡＡＶビリオン生成を支援し得る
。この用語から明示的に除外されるのは、天然に存在するままの感染性ウイルス粒子（例
えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスの粒子である。従っ
て、補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、またはコスミドの形
態であり得る。特に、アデノウイルス遺伝子の完全な補完が、補助ヘルパー機能に必ずし
も必須でないことが実証された。例えば、ＤＮＡ複製および後期遺伝子合成ができないア
デノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製に許容されることが示された。Ｉｔｏら，（１９７０
）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら（１９７１）Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ ４５：３１７。同様に、Ｅ２Ｂ領域およびＥ３領域内の変異は、ＡＡＶ複製を支
援することが示され、このことは、このＥ２Ｂ領域およびＥ３領域が、補助機能を提供す
ることにおそらく関与しないことを示す。Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１２６：５０５。しかし、Ｅ１領域を欠いたアデノウイルスまたはＥ４領域が欠失した
アデノウイルスは、ＡＡＶ複製を支援することができない。従って、Ｅ１Ａ領域またはＥ
４領域は、直接的にせよ間接的にせよ、ＡＡＶ複製に必要とされるようである。Ｌａｕｇ
ｈｌｉｍら（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８；Ｊａｎｉｋら（１９８１）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８；１９２５；Ｃａｒｔｅｒら（１９８
３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。他の特徴づけられたＡｄ変異体は、以下を含む
：Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｍら（１９８２）前出；Ｊａｎｉｋら（１９８１）前出；Ｏｓ
ｔｒｏｖｅら（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１０４：５０２）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａら
（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９；Ｓｔｒａｕｓｓら（１９７６）Ｊ
．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０；Ｍｙｅｒｓら（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５
；Ｊａｙら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２９２
７；Ｍｙｅｒｓら（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｃ
ａｒｔｅｒ，Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎｓ，Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔ
ｉｊｓｓｅｎ編、１９９０））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）前出）；Ｅ４（Ｃａ
ｒｔｅｒら（１９８３）前出；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））。Ｅ１Ｂコード領域に変異を
有するアデノウイルスによって提供される補助機能の研究により、矛盾する結果がもたら
されたが、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６−２１０は、
近年、Ｅ１Ｂ５５ｋが、ＡＡＶビリオン生成に必須である一方で、Ｅ１Ｂ１９ｋは必須で
ないことを報告した。さらに、国際公開ＷＯ９７／１７４５８およびＭａｔｓｈｕｓｈｉ
ｔａら（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３８−９４５は、種々のＡｄ遺伝
子をコードする補助機能ベクターを記載する。

特に好ましい補助機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウ
イルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノ
ウイルスＥ１Ａコード領域、およびインタクトなＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠くアデノウ
イルスＥ１Ｂ領域を含む。このようなベクターは、国際公開番号ＷＯ０１／８３７９７に
記載される。

「組換えウイルス」とは、例えば、異種核酸構築物を付加するかまたはこの構築物を粒
子に挿入することによって遺伝的に改変されたウイルスを意味する。

「ＡＡＶビリオン」とは、完全なウイルス粒子（例えば、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイル
ス粒子（ＡＡＶキャプシドタンパク質コードと会合した直鎖状の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノム
を含む））を意味する。この点に関して、いずれかの相補的センス（例えば、「センス」
鎖または「アンチセンス」鎖）の一本鎖ＡＡＶ核酸分子は、いずれか１つのＡＡＶビリオ
ンにパッケージングされ得、両方の鎖は、等しく感染性である。

用語「組換えＡＡＶビリオン」、「ｒＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶベクター粒子」、「
完全キャプシド」、「完全体」または「完全粒子」とは、ＡＡＶ ＩＴＲが両側に隣接し
ている、目的の異種ヌクレオチド配列をキャプシドに包んでいる、ＡＡＶタンパク質殻を
含む感染性の複製欠損ウイルスとして本明細書中に規定される。ｒＡＡＶビリオンは、そ
こに導入されるＡＡＶベクターを特定する配列、ＡＡＶヘルパー機能および補助機能を有
している適切な宿主細胞において生成される。このようにして、この宿主細胞は、その後
の遺伝子送達のための感染性組換えビリオン粒子へのＡＡＶベクター（目的の組換えヌク
レオチド配列を含む）のパッケージングに必要とされるＡＡＶポリペプチドをコードでき
るようにされる。

用語「空キャプシド」、「空粒子」、および「空」とは、ＡＶＶタンパク質の殻を含む
が、ＡＡＶ ＩＴＲが両側に隣接した目的の異種ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ド構築物の全体または一部を欠く、ＡＡＶビリオンをいう。従って、この空キャプシドは
、目的の遺伝子を宿主細胞へと移入するためには機能しない。

用語「宿主細胞」は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、補助機能ベ
クター、または他の移入ＤＮＡのレシピエントとして用いられ得るかまたは用いられた、
例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を示す。この用語は、トラン
スフェクトされた元の細胞の子孫を包含する。従って、「宿主細胞」は、本明細書中で用
いられる場合、一般に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞をいう。単一の
親細胞の子孫が、自然変異、偶発変異または意図的変異に起因して、元の親と形態または
ゲノムＤＮＡ相補体もしくはＤＮＡ相補体全体において必ずしも完全に同一というわけで
はないことが理解される。

用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを言及するために
用いられ、そして細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合、「トラン
スフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が当該分野で一般に公知であ
る。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ，Ｃｌｏｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅ
ｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技術を用いて、１以上の外因性ＤＮＡ部分
を適切な宿主細胞へと導入し得る。

本明細書中で用いられる場合、用語「細胞株」とは、連続増殖または長期増殖および分
裂をインビトロで行い得る細胞集団をいう。しばしば、細胞株は、単一の子孫細胞に由来
するクローン集団である。このようなクローン集団の保存または継代の間の核型における
自然変化または誘導された変化が生じ得ることがさらに当該分野で公知である。それゆえ
、言及される細胞株に由来する細胞は、先祖細胞または先祖培養物と正確には同一ではな
いかもしれず、そして言及される細胞株は、このような改変体を包含する。

ＡＡＶベクター粒子（パッケージングされたゲノム）を含むｒＡＡＶビリオンのストッ
クまたは調製物は、ストック中に存在するビリオンのうちの少なくとも約５０％〜９９％
以上が、パッケージングされたゲノムを含むｒＡＡＶビリオン（すなわち、ＡＡＶベクタ
ー粒子）である場合、ＡＡＶの空キャプシドを「実質的に含まない」。好ましくは、この
ＡＡＶベクター粒子は、ストック中に存在するビリオンのうちの、少なくとも約７５％〜
８５％、より好ましくは約９０％を構成し、さらにより好ましくは少なくとも約９５重量
％、またはさらにはストック中に存在するビリオンのうちの９９重量％以上、またはこれ
らの範囲の間の任意の整数を構成する。従って、ストックは、得られるストックの約４０
％〜約１％以下、好ましくは約２５％〜約１５％以下、さらに好ましくは約１０％以下、
さらにより好ましくは約５％〜約１％以下が空キャプシドを含む場合、ＡＡＶの空キャプ
シドを実質的に含まない。

「核酸」配列とは、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をいう。この用語は、ＤＮＡおよびＲ
ＮＡの公知の塩基アナログ（例えば、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メ
チルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒド
ロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキ
シメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル
、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、
１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメ
チルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メ
チルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウ
ラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシ
ン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ
−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル
−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プロイドウラシル、キューオシン、２−チオシ
トシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メ
チルウラシル、Ｂウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸
、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン
であるがこれらに限定されない）のいずれかを含む配列を含む。

「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コード」する配列は、適切な制御配
列の制御下においた場合に、インビボで、（ＤＮＡの場合）転写される、および（ｍＲＮ
Ａの場合）ポリペプチドへと翻訳される、核酸分子である。コード配列の境界は、５’（
アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端における翻訳停止コドン
によって決定される。転写終結配列は、コード配列の３’側に配置され得る。

用語ＤＮＡ「制御配列」とは、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写およ
び翻訳をまとまって提供する、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配
列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハン
サーなどをまとめていう。選択されたコード配列が、適切な宿主細胞において複製され得
、転写され得、そして翻訳され得る限り、これらの制御配列の全てがいつも存在する必要
があるわけではない。

用語「プロモーター」は、本明細書中で、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を言
及するために、その元々の意味で用いられ、ここで、この調節配列は、ＲＮＡポリメラー
ゼに結合し得かつ下流の（３’方向の）コード配列の転写を開始し得る遺伝子に由来する
。転写プロモーターは、「誘導性プロモーター」（ここで、このプロモーターに作動可能
に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによ
って誘導される）、「抑制性プロモーター」（ここで、このプロモーターに作動可能に連
結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって
誘導される）および「構成性プロモーター」を包含し得る。

「作動可能に連結される」とは、そのように記載される成分がそれらの通常の機能を果
たすように構成された構成要素の再配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結さ
れた制御配列は、コード配列の発現をもたらしえる。この制御配列は、その発現を導くよ
うに機能する限り、コード配列と連続する必要はない。従って、例えば、介在する、転写
されるが翻訳されない配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そして
プロモーター配列は、なおも、コード配列に「作動可能に連結され」ていると考えられる
。

本出願全体で特定の核酸分子中でのヌクレオチド配列の相対位置を記載する目的で、例
えば、特定のヌクレオチド配列が別の配列に対して「上流」、「下流」、「３’」、また
は「５’」に位置することが記載されている場合、これは、当該分野で慣習的であるよう
に言及されるＤＮＡ分子の「センス」鎖または「コーディング」鎖におけるこの配列の位
置であると理解されるべきである。

用語「異種」とは、核酸配列（例えば、コード配列および制御配列）に関する場合、通
常は一緒に連結していない配列、および／または特定の細胞に通常は関連していない配列
を示す。従って、核酸構築物またはベクターのうちの「異種」領域は、他の分子とは天然
で関連して見出されない別の核酸分子内のまたは別の核酸分子に結合した核酸のセグメン
トである。例えば、核酸構築物のうちの異種領域は、コード配列と天然では関連して見出
されない配列が隣接したコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列
自体が天然には見出されない構築物である（例えば、ネイティブ遺伝子とは異なるコドン
を有する合成配列）。同様に、細胞中に通常は存在しない構築物で形質転換された細胞は
、本発明の目的では異種であると考えられる。対立遺伝子改変体または天然に存在する変
異事象は、本明細書中で用いられる場合、異種ＤＮＡを生じない。

「単離された」によって、ヌクレオチド配列を言及する場合、同一の分子が同じ型の他
の生物学的高分子が実質的に存在せずに、存在することを意味する。従って、「特定のポ
リペプチドをコードする単離された核酸分子」とは、対象のポリペプチドをコードしない
他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいう；しかし、この分子は、その組成物の基
本的特徴に有害な影響を与えない、いくつかのさらなる塩基または部分を含み得る。

（２．発明を実施する形態）
本発明を詳細に記載する前に、特定の処方または特定のプロセスのパラメーターももち
ろん変化し得るので、本発明が特定の処方にも特定のプロセスのパラメーターにも限定さ
れないことが理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、単に本発明の特定
の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定することを意図していないこともま
た理解されるべきである。

本明細書中に記載される方法および材料と類似するかまたは等価な多数の方法および材
料が本発明の実施において用いられ得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記
載される。

本発明は、ＡＡＶビリオンの精製ストック中に含まれるＡＡＶの空キャプシドの数を、
その中に含まれるＡＡＶベクター粒子の損失を最少にしながらも、減らすかまたは除去す
ることを包含する。本発明の方法は、ｒＡＡＶビリオンが精製されるプロセスと関係なく
用いられ得る。

ｒＡＡＶビリオンを生成するために当該分野で周知のいくつかの方法が存在する；例え
ば、ＡＡＶヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシ
ニアウイルス）のうちの１つとの同時感染を伴う、ベクターおよびＡＡＶヘルパー配列を
用いたトランスフェクション、または組換えＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパーベクター、
および補助機能ベクターを用いたトランスフェクション。ｒＡＡＶビリオンを生成するた
めの方法の詳細な記載については、米国特許第６，００１，６５０号および同第６，００
４，７９７号を参照のこと。

例えば、野生型ＡＡＶウイルスおよびヘルパーウイルスは、ｒＡＡＶビリオンを生成す
るための必要な複製機能を提供するために用いられ得る（例えば、米国特許第５．１３９
，９４１号を参照のこと）。あるいは、周知のヘルパーウイルスのうちの１つによる感染
に伴ったヘルパー機能遺伝子を含むプラスミドは、複製機能の供給源として用いられ得る
（例えば、米国特許第５，６２２，８５６号および同第５，１３９，９４１号を参照のこ
と）。同様に、補助機能遺伝子を含むプラスミドは、野生型ＡＡＶによる感染と組み合わ
せて用いられて必要な複製機能を提供し得る。これらの３つのアプローチは、ｒＡＡＶベ
クターと関連して組み合わされた場合、各々、ｒＡＡＶビリオンを生成するために充分で
ある。他のアプローチは、当該分野で周知であり、そしてまた、ｒＡＡＶビリオンを生成
するために当業者に用いられ得る。

本発明の好ましい実施形態では、三重トランスフェクション法（米国特許第６，００１
，６５０号に詳細に記載される）を用いて、ｒＡＡＶビリオンが生成される。なぜなら、
この方法は、感染性ヘルパーウイルスの使用を必要とせずに、ｒＡＡＶビリオンが、検出
可能なヘルパーウイルスが全く存在せずに生成されるのを可能にするからである。これは
、ｒＡＡＶビリオン生成のための３つのベクター（ＡＡＶヘルパー機能ベクター、補助機
能ベクター、およびｒＡＡＶ発現ベクター）の使用によって達成される。しかし、当業者
は、これらのベクターによってコードされる核酸配列が種々の組合せの２以上のベクター
上で提供され得ることを理解する。

本明細書中に説明したように、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的ＡＡＶ複製およ
びキャプシド形成のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、
ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、検出
可能なｗｔＡＡＶビリオンを全く生成することなく、効率的なＡＡＶベクター（すなわち
、機能的なｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）生成を支持する。こ
のようなベクターの一例であるｐＨＬＰ１９は、米国特許第６，００１，６５０号に記載
される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、上記で説明
したように、公知のＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。例えば、ＡＡＶヘルパー機能
ベクターは、ＡＡＶ−２由来のｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ−６由来のｃａｐ遺伝子を有し
得る；当業者は、他のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の組合せが可能であり、定義する
特徴がｒＡＡＶビリオン生成を支持する能力であることを認識する。

補助機能ベクターは、ＡＡＶが複製を依存する非ＡＡＶ由来ウイルス機能および／また
は細胞機能（すなわち、補助機能）についてのヌクレオチド配列をコードする。補助機能
は、ＡＡＶ複製に必要とされる機能（ＡＡＶ遺伝子の転写、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡ
スプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶキャプシド
アセンブリの活性化に関与する部分が挙げられるがこれらに限定されない）を包含する。
ウイルスベースの補助機能は、周知のヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘル
ペスウイルス（１型単純疱疹ウイルス以外）、およびワクシニアウイルス）のいずれかに
由来し得る。好ましい実施形態では、補助機能プラスミドｐＬａｄｅｎｏ５が用いられる
（ｐＬａｄｅｎｏ５に関する詳細は、米国特許第６，００４，７９７号に記載される）。
このプラスミドは、ＡＡＶベクター生成についてのアデノウイルス補助機能の完全なセッ
トを提供するが、複製能力があるアデノウイルスを形成するために必要な成分を欠いてい
る。

一旦ＡＡＶビリオンのストックが生成されると、多数の方法（以下に詳述される）を用
いて、感染性力価が決定され得、そしてＡＡＶの空キャプシドからＡＡＶベクター粒子が
精製され得る。

本発明をさらに理解するために、より詳細な考察を、組換えＡＡＶ発現ベクター、ＡＡ
Ｖヘルパーおよび補助機能、ＡＡＶビリオンを含む組成物、ならびにビリオンの送達に関
して以下に提供する。

（組換えＡＡＶ発現ベクター）
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）発現ベクターは、制御エレメント（転写開始領域を含む）、
目的のポリヌクレオチド、および転写末端領域を転写の方向に作動可能に連結した成分と
して提供するように、公知の技術を使用して構築される。この制御エレメントは、目的の
宿主細胞において機能的であるように選択される。作動可能に連結した成分を含む、結果
の構築物は、機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列と結合される（５’および３’）。

ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。たとえば、ＡＡＶ−２配列につ
いては、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５
：７９３−８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅ
ｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，
（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ（編））を参照のこと。本発明のベク
ターで使用されるＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例え
ば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変化され得る。加えて、ＡＡＶ Ｉ
ＴＲは、いくつかのＡＡＶ抗原型（ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、
ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、およびＡＡＶ−８などが挙げられるが、これらに
限定されない）のいずれかに由来し得る。さらに、５’および３’のＩＴＲは、ＡＡＶ発
現ベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接し、それらが意図されるように機能す
る限り（すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの所定の配列の切断およびレスキ
ューを可能にし、そして、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が受容細胞に存在する場合、受容細
胞ゲノム中にＤＮＡ分子を組込むことを可能にする）、必ずしも同一である必要はなく、
同一のＡＡＶ抗原型または単離物に由来する必要もない。

ＡＡＶベクターに使用するために適切なポリヌクレオチド分子は、約５キロベース（ｋ
ｂ）未満の大きさである。選択されるポリヌクレオチド配列は、インビボで被験体におけ
るそれらの転写または発現を方向付ける制御エレメントに作動可能に連結される。このよ
うな制御エレメントは、通常、選択遺伝子に関連する制御配列を含み得る。あるいは、異
種制御配列が、使用され得る。一般的に、有用な異種制御配列は、哺乳動物遺伝子または
ウイルス遺伝子をコードする配列に由来する制御配列を含む。例としては、ニューロン特
異的エノラーゼプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウ
ス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ Ｍ
ＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ
）プロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ））、ラウス肉腫
ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッ
ドプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、非ウイルス遺伝子
由来の配列（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子）もまた、本明細書中で使用を見出
す。このようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，ＣＡ）から市販されている。

上記ＡＡＶ発現ベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲによって結合される目的のポリヌクレオチ
ド分子を含み、ＡＡＶゲノムから切断される主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム
（「ＯＲＦ」）を有するＡＡＶゲノム中に選択配列を直接挿入することによって、構築さ
れ得る。ＡＡＶゲノムの他の部分はまた、複製およびパッケージング機能を可能にするよ
うにＩＴＲの十分な部分が残る場合に限り、削除され得る。このような構築物は、当該分
野で周知の技術を使用して設計され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号およ
び同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ ９２／０１０７０（１９９２年１月２
３日公開）およびＷＯ ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓ
ｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎ
ｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃ
ｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９
４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。

あるいは、ＡＡＶ ＩＴＲは、ウイルスゲノムからか、または別のベクター中に存在す
る、選択核酸構築物の同一で融合された５’および３’を含むＡＡＶベクターから、標準
的なライゲーション技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出に記載される）を使用して
切断され得る。例えば、ライゲーションは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、および０℃における４０μＭ ＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ
）単位 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（「付着末端」ライゲーション用）か、または１４℃にお
ける１ｍＭ ＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（「平
滑末端」ライゲーション用）において達成され得る。分子内の「付着末端」ライゲーショ
ンは、通常、３０〜１００μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（総最終濃度５〜１００ｎＭ）にお
いて実行される。ＩＴＲを含むＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第５，１３９，９４
１号に記載されている。特に、いくつかのＡＡＶベクターが上記特許明細書中に記載され
、アメリカン タイプ カルチャー コレクション（「ＡＴＣＣ」）から入手可能である
（受託番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５および５３２２６）。

本発明の目的のために、ＡＡＶ発現ベクターからｒＡＡＶビリオンを生成するために適
切な宿主細胞としては、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる
。これらの細胞は、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用され得るかもしくは使用さ
れており、例えば、浮遊培養物、バイオリアクターなどで増殖し得る。この用語は、トラ
ンスフェクトされたもとの細胞の子孫を含む。従って、本明細書中で使用される場合、「
宿主細胞」は、一般的に、外因性ＤＮＡ配列によってトランスフェクトされた細胞をいう
。安定なヒト細胞株である２９３（例えば、アメリカン タイプ カルチャー コレクシ
ョン（受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）を通じて容易に入手可能）由来の細胞が、本
発明の実施において好ましい。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型のＤＮＡ
フラグメントでトランスフェクトされたヒト胚性腎細胞株であり（Ｇｒａｈａｍら（１９
７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）、アデノウイルスのＥ１ａ遺伝子およびＥ
１ｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏら（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９４：４６０）
。上記２９３細胞株は、容易にトランスフェフェクトされ、ｒＡＡＶビリオンを生成する
特に都合のよいプラットフォームを提供する。

（ＡＡＶヘルパー機能）
上記ＡＡＶ発現ベクターを含む宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接して、ｒＡＡＶビリ
オンを生成するためのヌクレオチド配列を複製し、そしてキャプシド形成するために、Ａ
ＡＶヘルパー機能を提供し得なければならない。ＡＡＶヘルパー機能は、一般に、ＡＡＶ
に由来するコード配列である。この配列は、順生産的なＡＡＶ複製のためにトランスで機
能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するように発現され得る。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細
書中で、ＡＡＶ発現ベクターから失われる必須のＡＡＶ機能を補完するために使用される
。従って、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶ ＯＲＦ（すなわち、ｒｅｐコード領域
およびｃａｐコード領域）の１つもしくは両方、またはそれらの機能的ホモログを含む。

「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」によって、複製タンパク質のＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、
Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムのａｒｔ認識（ａｒｔ−ｒｅｃｏ
ｇｎｉｚｅｄ）領域が意味される。これらのＲｅｐ発現産物は、多くの機能（ＤＮＡ複製
のＡＡＶ起点の認識、結合、およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ
（または他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む）を有することが示されている
。このＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するために集合的に必要とされる。ＡＡＶ
のｒｅｐコード領域の記載については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
５８：９７−１２９；およびＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１を参照のこと。ＡＡＶのｒｅｐコード領域の適切な
ホモログとしては、ＡＡＶ−２のＤＮＡ複製を媒介することもまた公知であるヒトヘルペ
スウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子が挙げられる（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９４）
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０４：３０４−３１１）。

「ＡＡＶ ｃａｐコード領域」によって、キャプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、お
よびＶＰ３をコードするＡＡＶゲノムのａｒｔ認識領域、またはそれらの機能的ホモログ
が意味される。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムのパッケージングのために集
合的に必要とされるパッケージング機能を与える。ＡＡＶ ｃａｐコード領域の記載につ
いては、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．およびＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（前出）を参照の
こと。

ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前か、または同
時に、ＡＡＶヘルパー構築物を用いて宿主細胞をトランスフェクトすることによって、宿
主細胞中に導入される。従って、ＡＡＶヘルパー構築物が使用され、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝
子および／またはｃａｐ遺伝子の、少なくとも一過性の発現を提供し、生産的なＡＡＶ感
染のために必須の失われたＡＡＶ機能を補完する。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ Ｉ
ＴＲを欠き、それ自体を複製もパッケージングもし得ない。

これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、ま
たはビリオンの形態であり得る。多くのＡＡＶヘルパー構築物（例えば、共通に使用され
るプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびＲｅｐとＣａｐとの両方の発現産物をコードするｐＩ
Ｍ２９＋４５）が記載されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．６５：２９３６−２９４５を参照のこと。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐの発現産物をコ
ードする多くの他のベクターが、記載されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４
１号を参照のこと。

（ＡＡＶ補助機能）
宿主細胞（またはパッケージング細胞）はまた、ｒＡＡＶビリオンを生成するために、
非ＡＡＶの機能、または「補助機能（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」を提供
され得なければならない。補助機能は、ＡＡＶがその複製のために依存する、非ＡＡＶ由
来のウイルス機能および／または細胞機能である。従って、補助機能としては、ＡＡＶ複
製（ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的なＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ
ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成およびＡＡＶキャプシド集合に関係する機能を含む
）の際に必要とされる、少なくともこれらの非ＡＡＶタンパク質およびＲＮＡが挙げられ
る。ウイルスベースの補助機能は、任意の公知のヘルパーウイルスに由来し得る。特に、
補助機能は、当業者に公知の方法を使用して宿主細胞に導入され得、次いで宿主細胞中で
発現される。代表的には、補助機能は、宿主細胞を関連のないヘルパーウイルスに感染さ
せることによって提供される。多くの適切なヘルパーウイルスが公知である。これらとし
ては、アデノウイルス；ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２
型）；およびワクシニアウイルスが挙げられる。非ウイルス性の補助機能（例えば、種々
の公知の薬剤のいずれかを使用する細胞の同期化（ｃｅｌｌ ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔ
ｉｏｎ）によって提供される機能）もまた、本明細書中で使用を見出される。例えば、Ｂ
ｕｌｌｅｒら（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４０：２４１−２４７；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ
ら（１９８５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４７：２１７−２２２；Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒら（
１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５２：１１０−１１７を参照のこと。あるいは、補助機
能は、上に記載されるような補助機能ベクターを使用して提供され得る。例えば、米国特
許第６，００４，７９７号および国際公開番号ＷＯ ０１／８３７９７を参照のこと。

補助機能を提供する核酸配列は、天然の供給源（例えば、アデノウイルス粒子のゲノム
から）から得られ得か、または当該分野で公知の組換え方法もしくは合成方法を使用して
構築され得る。上に説明したように、アデノウイルス遺伝子の完全な相補体が、補助ヘル
パー機能のために必要とされるわけではないことが示されている。特に、ＤＮＡ複製およ
び後期遺伝子の合成が不可能なアデノウイルス変異体が、ＡＡＶ複製に許容性であること
が示されている。Ｉｔｏら，（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３；Ｉｓｈ
ｉｂａｓｈｉら，（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７。同様に、Ｅ２Ｂ領域お
よびＥ３領域内の変異体は、ＡＡＶ複製を支持することが示されており、このことは、上
記Ｅ２Ｂ領域およびＥ３領域は、おそらく補助機能の提供に関与していないことを示して
いる。Ｃａｒｔｅｒら，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。しかしながら
、Ｅ１領域に欠陥のあるアデノウイルス、またはＥ４領域を欠くアデノウイルスは、ＡＡ
Ｖ複製を支持し得ない。従って、Ｅ１Ａ領域およびＥ４領域は、直接的または間接的にＡ
ＡＶ複製に必要とされる可能性が高い。Ｌａｕｇｈｌｉｎら，（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．４１：８６８；Ｊａｎｉｋら，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ７８：１９２５；Ｃａｒｔｅｒら，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：
５０５。他の特徴付けられたＡｄ変異体としては、以下が挙げられる：Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇ
ｈｌｉｎら（１９８２），前出；Ｊａｎｉｋら（１９８１），前出；Ｏｓｔｒｏｖｅら，
（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０４：５０２）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａら，（１９７５
）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９；Ｓｔｒａｕｓｓら，（１９７６）Ｊ Ｖｉｒ
ｏｌ．１７：１４０；Ｍｙｅｒｓら，（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５；Ｊａ
ｙら，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２９２７；
Ｍｙｅｒｓら，（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｃａ
ｒｔｅｒ，Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔ
ｉｏｎｓ，Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉ
ｊｓｓｅｎ（編），１９９０））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３），前出）；および
Ｅ４（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３），前出；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））。Ｅ１Ｂコード
領域に変異を有するアデノウイルスによって提供された補助機能の研究が相反する結果を
示しているにもかかわらず、Ｅ１Ｂ５５ｋが、ＡＡＶビリオン生成に必要とされる一方、
Ｅ１Ｂ１９ｋは必要とされないことが、最近報告された（Ｓａｍｕｌｓｋｉら，（１９８
８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６−２１０）。加えて、国際公開ＷＯ ９７／１７４５
８およびＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａら，（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３
８−９４５は、種々のＡｄ遺伝子をコードする補助機能ベクターを記載する。特に好まし
い補助機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４
ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１
Ａコード領域、およびインタクトなＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠くアデノウイルスＥ１Ｂ
領域を含む。このようなベクターは、国際公開番号ＷＯ ０１／８３７９７に記載される
。

宿主細胞をヘルパーウイルスに感染させるか、または宿主細胞を補助機能ベクターを用
いてトランスフェクションすることの結果として、ＡＡＶヘルパー構築物をトランス活性
化する補助機能が発現され、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質および／またはＣａｐタンパク質
を産生する。このＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶ発現ベクターから組換えＤＮＡ（目的のＤＮ
Ａを含む）を切断する。Ｒｅｐタンパク質はまた、ＡＡＶゲノムを二重にするために役割
を果たす。この発現されたＣａｐタンパク質は、キャプシド中に集合し、組換えＡＡＶゲ
ノムはキャプシド中にパッケージングされる。従って、生産性のＡＡＶ複製が後に続き、
ＤＮＡは、ｒＡＡＶビリオン中にパッケージングされる。

（ｒＡＡＶビリオンの精製）
組換えＡＡＶ複製に続いて、ｒＡＡＶビリオンは、種々の慣用的な精製方法（例えば、
カラムクロマトグラフィー、ＣｓＣｌ勾配など）を使用して、宿主細胞から精製され得る
。例えば、多くのカラム精製の工程（例えば、アニオン交換カラム、アフィニティーカラ
ムおよび／またはカチオン交換カラムによる精製）が、使用され得る。例えば、国際公開
番号ＷＯ ０２／１２４５５を参照のこと。さらに、感染が適用されて補助機能が発現さ
れる場合、残りのヘルパーウイルスは、公知の方法を使用して不活化され得る。例えば、
アデノウイルスは、約６０℃の温度まで、例えば２０分間以上加熱することによって不活
化され得る。この処理は、ヘルパーウイルスのみを効果的に不活化する。なぜならば、Ａ
ＡＶが非常に熱安定性である一方、ヘルパーアデノウイルスは熱不安定性だからである。

任意の数のレポーター遺伝子を含む組換えＡＡＶベクターが、感染性力価を決定するた
めに使用され得る。例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ
）、緑色蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼが、使用され得る。トランスフェクトさ
れた宿主細胞を収集した後、大きなスケールの生成物のために適切な技術を使用して（例
えば、微流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ））、トランスフェクトされた宿
主細胞を破壊することによって、溶解物が形成される。次いで、この溶解物はフィルター
処理され（例えば、０．４５μｍフィルターを通して）、そして、本明細書中に記載され
るようなカラムクロマトグラフィー方法を使用して精製される。任意のＡＡＶベクターの
感染性力価を決定するための他の技術もまた、報告されている。例えば、Ｚｈｅｎら，「
Ａｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔ
ｙ Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｅｖｅｎｔｓ．」Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００４）Ｉｎ，Ｐｒｅｓｓを参照
のこと。

次いで、精製されたＡＡＶストックが処理され、カラムクロマトグラフィー技術を使用
して空キャプシドを除去する。本発明の特に好ましい方法において、ｒＡＡＶ調製物は、
トランスフェクトされた細胞を溶解し、粗細胞溶解物を得ることによって得られる。次い
で、この粗細胞溶解物は清澄化され、当該分野で周知の技術（例えば、フィルター処理、
遠心分離など）によって細胞の破片を除去して清澄化細胞溶解物にされ得る。粗細胞溶解
物または清澄化細胞溶解物は、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとの両方を含
み、次いで、非分離条件下で第一のカチオン交換カラムに対して適用される。上記第一の
カチオン交換カラムは、細胞溶解物の調製物中に存在する細胞成分および他の成分から、
ＡＡＶベクター粒子およびＡＡＶの空キャプシドをさらに分離するために機能する。細胞
溶解物の最初の精製を行うための方法は、公知である。１つの代表的な方法が、米国特許
第６，５９３，１２３号に記載される。第一のカチオン交換カラムから回収された画分は
、次いで、ＡＡＶの空キャプシドをＡＡＶベクター粒子から分離する異なる溶出条件を使
用して、第二のイオン交換体（すなわち、第二のカチオン交換カラムおよび／またはアニ
オン交換カラム）に対して、適用される。

第一のカチオン交換カラムと第二のカチオン交換カラムとの両方に適切なカチオン交換
体が使用される場合、当該分野で公知の多種多様な材料を含む。特に好ましいのは、広範
なｐＨ範囲にわたってｒＡＡＶビリオンを結合し得る強力なカチオン交換体である。例え
ば、カルボキシメチル化カチオン交換マトリックスおよびスルホン化カチオン交換マトリ
ックスが、本明細書中の用途のために特に有用である。有用なマトリックス材料としては
、セルロースマトリックス（例えば、繊維性マトリックス、微粒子性マトリックス、およ
びビーズマトリックス）；アガロースマトリックス、デキストランマトリックス、ポリア
クリレートマトリックス、ポリビニルマトリックス、ポリスチレンマトリックス、シリカ
マトリックス、およびポリエーテルマトリックス；ならびに合成物が挙げられるが、これ
らに限定されない。本明細書中で特に好ましいのは、機能的リガンドＲ−ＳＯ_３ ⁻（好ま
しくは、スルホプロピル樹脂またはスルホエチル樹脂）を含むマトリックスである。代表
的なマトリックスとしては、ＰＯＲＯＳ ＨＳ、ＰＯＲＯＳ ＳＰ、ＰＯＲＯＳ Ｓ（す
べてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可
能な強力なカチオン交換体）、ＰＯＲＯＳ ＣＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な弱いカチオン交換体）、ＴＯＳＯＨＡ
ＡＳ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ５５０ＣおよびＭＥＲＣＫ ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ ＥＭ
Ｄ ＳＯ_３ ⁻−６５０（ｍ）、ならびにＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ、ＳＯＵＲＣＥ ３０Ｓ、
ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＳＰ ＦＦ、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＳＰ ＸＬ（すべてＡｍｅｒｓ
ｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能）が挙げられ
るが、これらに限定されない。

下に与えられるすべてのカラムクロマトグラフィープロトコルについて、カラムは、当
該分野で公知の標準的プロトコルを使用して、適切な緩衝液溶液で調製され得る。次いで
、サンプルがロードされる。使用される第一のカチオン交換カラムについて、条件は、空
キャプシドとＡＡＶベクター粒子との両方がカラム樹脂に結合し、続いて一緒に溶出され
るが、細胞溶解物中に存在する他の細胞成分および細胞の破片から分離されるような条件
である。例えば、空キャプシドおよび完全キャプシドは、適切なイオン強度の緩衝液を使
用して溶出される。適切な緩衝液としては、例えば、１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム、
好ましくは、１５〜４０（例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０など）ｍＭリン
酸ナトリウムが挙げられ、このリン酸ナトリウムは、塩（例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌ
）を例えば、１００〜７００ｍＭの濃度（例えば、２００〜４００ｍＭ（例えば、２００
、３００、３２５、３５０、３７０、３８０、４００など、またはこれらの範囲内の任意
の濃度））で含む。緩衝液のｐＨは、約３〜約９．５であり得、例えば、４〜８であり、
例えば、ｐＨ４、４．５、５、５．５、６など、またはこれらの範囲内の任意のｐＨであ
り得る。これらの画分は回収され、次いで、分離条件化でアニオン交換カラムおよび／ま
たは第二のカチオン交換カラムのどちらかに適用され得る。

続いて空のＡＡＶキャプシドをＡＡＶベクター粒子から分離するための工程において、
第二のカチオン交換カラムが使用される場合、２種の溶出緩衝液が使用される。１つは低
塩緩衝液であり、１つは高塩緩衝液である。特に、空キャプシドは、ＡＡＶベクター粒子
から、約ｐＨ６〜ｐＨ１２のｐＨにおける適切な緩衝液を使用して分離される。このｐＨ
は、好ましくは、ｐＨ７〜ｐＨ１０であり、さらにより好ましくはｐＨ７．５〜ｐＨ９．
５であり、例えば、ｐＨ７．５、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、９
．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、または示された範囲の間の任意のｐＨ
である。適切な緩衝液は、当該分野で周知であり、以下の緩衝液イオンを含む緩衝液が挙
げられるが、これらに限定されない：酢酸；マロン酸；ＭＥＳ：リン酸；ＨＥＰＥＳ、Ｂ
ＩＣＩＮＥなど。サンプルを溶出するために、開始緩衝液のイオン強度は、塩（例えば、
ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニアまたは硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩および／
もしくはリン酸塩を含む任意の他の塩）を使用することによって増加される。本発明の一
実施形態において、カラムはまず低塩濃度で処理される。この濃度は、例えば、１０〜２
００ｍＭの酢酸アンモニウムであり、例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５
０、５５、６０、６５、１００ｍＭまたはこれらの範囲内の任意の濃度である。この処理
は、ＡＡＶベクター粒子のカラム樹脂からの溶出を生じる。続いて、このカラムは、ＡＡ
Ｖの空キャプシドを溶出するために、より高塩濃度で処理される。第二の緩衝液としての
使用についての１つの例は、１００〜８００ｍＭの濃度、好ましくは、５００〜７００ｍ
Ｍであり、例えば、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００ｍＭ、またはこれ
らの示された範囲内の任意の濃度の酢酸アンモニウムである。これら条件を使用して、Ａ
ＡＶベクター粒子を早い画分に溶出し、空粒子を遅い画分に溶出する。

上に説明されるように、本発明の代替的方法において、第一のカチオン交換カラムから
の調製物は、第二のカチオン交換カラムの代わりにか、または第二のカチオン交換カラム
に加えてのいずれかで、アニオン交換カラムに対して適用される。アニオン交換カラムが
第二のカチオン交換カラムに加えて使用される場合、アニオン交換カラムは、第二のカチ
オン交換カラムの前か、または第二のカチオン交換カラムに続いて使用され得る。さらに
、第二のアニオン交換カラムは、第一のアニオン交換カラムの後に使用され得る。本発明
での使用についての多くの適切なアニオン交換体が公知であり、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない：ＭＡＣＲＯ ＰＲＥＰ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ
Ａから入手可能な強力なアニオン交換体）；ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈ
ｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡから入手可能な強力なアニオン交換体）；ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ（
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な
強力なアニオン交換体）；ＰＯＲＯＳ ５０Ｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な弱いアニオン交換体）；ＰＯＲＯＳ ５
０ＰＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入
手可能な弱いアニオン交換体）；ＳＯＵＲＣＥ ３０Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な強力なアニオン交換体）；Ｄ
ＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な弱いアニオン交換体）；Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な強
力なアニオン交換体）。

上記アニオン交換カラムはまず、標準的な緩衝液を使用して、製造者の仕様書に従って
平衡化される。例えば、カラムは、例えば、５〜５０ｍＭ（好ましくは、７〜２０ｍＭ、
例えば、１０ｍＭ）のリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化され得る。次いでサンプルがロー
ドされ、そして２種の溶出緩衝液が使用される。１つは低塩緩衝液であり、１つは高塩緩
衝液である。低塩洗浄および高塩洗浄のそれぞれに続いて、画分が回収され、そして画分
中のタンパク質が、標準的技術（例えば、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光
度のモニタリング）を使用して検出される。アニオン交換体を使用して、低塩溶出からの
タンパク質ピークは、ＡＡＶの空キャプシドを含み、そして高塩画分は、ＡＡＶベクター
粒子を含む。

特に、アニオン交換カラムに関して、空キャプシドは、約ｐＨ５〜ｐＨ１２のｐＨにお
ける適切な緩衝液を使用してＡＡＶベクター粒子から分離され得る。このｐＨは、好まし
くは、ｐＨ６〜ｐＨ１０であり、さらにより好ましくはｐＨ７〜ｐＨ９．５であり、例え
ば、ｐＨ７．１、７．２、７．３、７．４、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、
８．５、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、または示された範囲の間の
任意のｐＨである。アニオン交換カラムでの使用に適切な緩衝液は、当該分野で周知であ
り、一般的に本質的に陽イオン性であるか、または両性イオン性である。このような緩衝
液としては、以下の緩衝液イオンを含む緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない：
Ｎ−メチルピペラジン；ピペラジン；ビス−Ｔｒｉｓ；ビス−Ｔｒｉｓプロパン；トリエ
タノールアミン；Ｔｒｉｓ；Ｎ−メチルジエタノールアミン；１，３−ジアミノプロパン
；エタノールアミン；酢酸など。サンプルを溶出するために、開始緩衝液のイオン強度は
、塩（例えば、ＮａＣｌ塩、ＫＣｌ塩、硫酸塩、フマル酸塩または酢酸塩）を使用して、
適切なｐＨにおいて増加される。

本発明の一実施形態において、アニオン交換カラムは、まず、低塩濃度で処理される。
その濃度は例えば、１０〜１００ｍＭのＮａＣｌであり、例えば、１０、２０、２５、３
０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、１００ｍＭ、またはこれらの範囲内の
任意の濃度である。最初の処理に続いて、次いでカラムは、空キャプシドを溶出するため
に、高塩濃度（たとえば、より高いＮａＣｌ濃度、またはより強力なイオン強度を有する
別の緩衝液で）で処理される。第二の緩衝液としての使用についての１つの例は、酢酸ナ
トリウム緩衝液、または１００〜３００ｍＭの濃度を有するＴｒｉｓベースの緩衝液であ
る。この濃度は、好ましくは、１２５〜２００ｍＭであり、例えば、１２５、１３０、１
４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭ、またはこれらの示された
範囲内の任意の濃度である。空キャプシドがカラムから溶出された後、ＡＡＶベクター粒
子は、高濃度の塩を使用して回収され得る。溶出緩衝液としての使用についての１つの例
は、酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液である。酢酸ナトリウムの濃度は１
００〜５００ｍＭの範囲であり、好ましくは、１３０〜３００ｍＭであり、例えば、１０
０、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍＭ、
またはこれら示された範囲内の任意の濃度である。

上に記載される技術を使用して、９０％以上のＡＡＶの空キャプシドが、ＡＡＶベクタ
ー粒子から分離され得る。さらに、ＡＡＶベクター粒子の高い回収は、容易に達成される
。すなわち、１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、例えば、
６０％以上のＡＡＶベクター粒子が回収され得る。

空キャプシドおよびパッケージされたゲノムを有するＡＡＶベクター粒子をアッセイす
るための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｇｒｉｍｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２−１３３０；Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅ
ｒ．（２００３）７：１２２−１２８を参照のこと。変性キャプシドの試験のために、そ
の方法は、処理されたＡＡＶストックを上記３つのキャプシドタンパク質を分離可能な任
意のゲル（例えば、緩衝液中に３〜８％トリス−酢酸を含む勾配ゲル）からなるＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する工程、次いでサンプル物質が分離されるまでそ
のゲルを泳動する工程、およびそのゲルをナイロンまたはニトロセルロース膜（好ましく
はナイロン）にブロットする工程を包含する。抗ＡＡＶキャプシド抗体（好ましくは抗Ａ
ＡＶキャプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは上記Ｂ１抗ＡＡＶ−２モノクローナ
ル抗体）が次いで、変性キャプシドタンパク質に結合する一次抗体として使用される（Ｗ
ｏｂｕｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１−９２９３）。次いで二次抗
体が使用される。これは、その一次抗体に結合しその一次抗体との結合を検出するための
手段を含有するもの、より好ましくは、自身に共有結合された検出分子を含有する抗Ｉｇ
Ｇ抗体であり、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合されたヒツジ抗
マウスＩｇＧ抗体である。結合を検出するための方法は、その一次抗体とその二次抗体と
の間の結合を半定量的に決定するために使用され、好ましくは検出方法が放射性同位元素
放射、電磁放射線または比色変化を検出可能であり、最も好ましくは化学発光検出キット
である。

感染力価の試験のための、その方法は、約１００，０００の宿主細胞（好ましくはヒト
由来、最も好ましくはＨｅＬａ細胞）を、組織培養処理プレート（好ましくは２４ウェル
組織培養処理プレート）に播種し、そしてアデノウイルス（好ましくはアデノウイルス−
２血清型）および処理されたｒＡＡＶストックをその宿主細胞に加えてから約２４時間イ
ンキュベートする工程を包含する。その宿主細胞、アデノウイルスおよびｒＡＡＶストッ
クは、２４時間インキュベートされ、その後その宿主細胞は好ましくはホルムアルデヒド
およびグルタルアルデヒドで固定され、そしてｒＡＡＶ発現導入遺伝子を検出する適切な
薬剤で染色される（例えば、ｒＡＡＶ−ＬａｃＺ、Ｘ−ｇａｌが染色剤として企図される
）。他のレポーター遺伝子に対する他の薬剤は、当該分野において周知である。任意の導
入遺伝子を含有するベクターの感染力価を決定するためのより一般的な方法もまた、当該
分野において公知である。例えば、Ｚｈｅｎら、「Ａｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｔｉｔ
ｅｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）
Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ
Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｅｖｅｎｔｓ」Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．（２００４）（印刷中）を参照のこと。

（３．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。この例は、例示目的のみ
のために提供され、任意の方法において本発明の範囲を制限することを意図されない。

使用された数字（例えば量、温度など）に関して精度を保証するための努力はなされた
が、それに対するいくつかの実験誤差または偏差は、当然許容されるべきである。

（材料および方法）
（ｒＡＡＶ産生および精製）
ヒトＩＸ因子（ｒＡＡＶ−ｈＦＩＸ）をコードする遺伝子を含有する組み換えＡＡＶビ
リオンを、米国特許第６，００１，６５０号および同第６，００４，７９７号に記載され
るトリプルトランスフェクション（ｔｒｉｐｌｅ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法により
産生した。使用したプラスミドは、補助機能プラスミド「ｐｌａｄｅｎｏ５」、ＡＡＶヘ
ルパー機能プラスミド「ｐＨＬＰ１９」、および組み換えＡＡＶプラスミド「ｐｈＦＩＸ
−１６」であった。ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、ｒＡＡＶビリオンの産生のた
めに宿主細胞として使用した。

トランスフェクションされた２９３細胞を、トランスフェクション後約７２時間で回収
し、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ^ＴＭ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を使用した微細流動化（ｍｉｃｒｏｆ
ｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）により破砕し、そしてその粗製溶解物を収集し、連絡的フィル
タを通して細胞細片を除去して、清澄な細胞溶解物を作製した。パッケージされたキャプ
シドおよび空キャプシドを含有するその清澄な細胞溶解物を、次いで、他の細胞成分から
ＡＡＶベクター粒子およびＡＡＶの空キャプシドを精製するために、ＰＯＲＯＳ ５０Ｈ
Ｓカラムにロードした。このＡＡＶベクター粒子および空キャプシドを、このＰＯＲＯＳ
５０ＨＳカラムから、２０ｍＭリン酸ナトリウム、３７０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５
）を含有する緩衝液を使用して溶出した。ＡＡＶベクター粒子および空キャプシドの両方
を含有するこのＡＡＶ調製物を、その塩濃度を減少させるために２倍希釈し、Ｑ ＳＥＰ
ＨＡＲＯＳＥカラムを通してさらに精製し、流れて通過したＡＡＶベクター粒子および空
キャプシドを収集し、そして濃度および緩衝液の交換を限外濾過および透析濾過（ｄｉａ
ｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）技術を使用して行った。

最終的なＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラム精製産物は、ＡＡＶ空キャプシドおよび組み換え
ベクターゲノムを含有するＡＡＶベクター粒子の両方を含有した。各々に対するコントロ
ールサンプルを生成するために、塩化セシウムを攪拌しながら１．４１ｇ／ｍｌの密度ま
でＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラム精製物質に加え、次いでＴｉ７０ローターを使用して４５
，０００ｒｐｍで２３時間超遠心分離へ供した。この可視の空キャプシドおよびＡＡＶベ
クター粒子のバンドを、シリンジを使用して別々に汲み出した。この精製された空キャプ
シドおよびＡＡＶベクター粒子を、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、１４０ｍ
Ｍ ＮａＣｌおよび５％ソルビタール（ｓｏｒｂｉｔａｌ）からなる緩衝液に対して、透
析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用し、４℃での、３回の緩衝液交換によって、別々に透
析した。

（樹脂およびカラムクロマトグラフィー）
アニオン交換樹脂、カチオン交換樹脂、等電点樹脂および疎水的相互作用（ＨＩＣ）樹
脂を含む種々の型のクロマトグラフィー樹脂を、ＡＡＶ空キャプシドおよびＡＡＶベクタ
ー粒子を分離するための、その能力について試験した。ハイスループットの多岐管を、樹
脂のスクリーニングのために使用した。樹脂を、多岐管に設置された層高３ｃｍの使い捨
ての空のカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に充填した。このカラム
を、１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する緩衝液を使用して平衡化した。次いで０．２
μｍで濾過された清澄なＨＥＫ２９３細胞溶解物のＡＡＶベクターおよび空キャプシドを
、５０ｍＭの濃度のＮａＣｌ（塩）のカラム平衡緩衝液中に希釈し、次いでそのカラムに
ロードした。このカラムを、最初に平衡緩衝液で洗浄し、次いで１０ｍＭリン酸ナトリウ
ムおよび４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を含有する緩衝液でさらに洗浄し（低塩洗浄
）、非結合物質を洗い出した。カラムを、次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１Ｍ
ＮａＣｌを含有する溶出緩衝液で処理した（高塩洗浄）。低塩洗浄を使用して洗い出さ
れた物質を１つの画分として収集し、高塩洗浄を使用して洗い出された物質を別の画分と
して収集した。

使い捨てカラムを使用した初期スクリーニングに引き続き、より大きなスケールのカラ
ムクロマトグラフィー（ＢＩＯＣＡＤ７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
上で行われる）を使用し、有望な樹脂および条件をさらに調べた。ＸＫ１６ガラスカラム
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、線速度１５０ｃｍ／時間の定流量パッキ
ング法を使用して、種々の樹脂で充填した。クロマトグラフィーパラメーターを、種々の
方法（詳細は各実験結果を参照のこと）を使用してプログラムした。一般的に、そのプロ
グラムは、カラム平衡化工程、サンプルローディング工程、低塩洗浄工程、線形勾配工程
または段階的勾配工程、そして高塩洗浄工程の機能的なブロックを包含する。種々の画分
において溶出したＡＡＶベクター粒子および空キャプシドをモニターし、以下に記載され
た技術を使用して分析した。

（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング）
カラム画分からのサンプルを取り、還元剤（ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥロー
ディング緩衝液中で加熱し、そしてキャプシドタンパク質をプレキャスト勾配ポリアクリ
ルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で分解した。銀染色を、ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用して、製造者の説明書に従って実施した。同様に、ウエ
スタンブロット分析を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質のニトロセルロー
ス膜への移送に引き続いて行った。モノクローナル抗体（Ｂ１、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＭＡ）を、ウエスタンブロットによりＡＡＶキャプシ
ドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を検出するための一次抗体として使用した
。ヒツジ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ結合体（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）を二次抗体として使用
し、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）により検出した。

（定量リアルタイムＰＣＲ）
カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）濃度を、定量リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−
ＰＣＲ）により測定した。サンプルを希釈し、ＤＮａｓｅ Ｉで消化して、外来性ＤＮＡ
を除去した。ＤＮａｓｅの不活化後、サンプルをさらに希釈し、プライマーおよびそのプ
ライマー間のＤＮＡ配列に対して特異的なＴａｑＭａｎ^ＴＭ蛍光発生プローブを使用して
増幅した。規定されたレベルの蛍光に達するのに必要なサイクル数（閾値サイクル、Ｃｔ
）を、各サンプルに対して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７
００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで測定した。ＡＡＶベクタ
ーに含まれる配列と同一な配列を含有するプラスミドＤＮＡを、そのＱ−ＰＣＲ反応にお
ける標準曲線を作成するために利用した。上記サンプルから得られるＣｔ値を使用して、
そのプラスミドの標準曲線のＣｔ値に対して正規化することによりベクターゲノムの力価
を決定した。

（実施例１）
（空キャプシドおよびパッケージされたゲノムを有するＡＡＶベクター粒子の結合特性
）
ＡＡＶベクター粒子がアニオン交換カラムへ結合するか否か試験するために、複数の樹
脂を、ハイスループット多岐管技術を使用してスクリーニングした。ＡＡＶベクター粒子
および空キャプシドを含有する２９３細胞培養液の細胞溶解物を、ＮａＣｌ濃度を約５０
ｍＭまで減少させるために２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を使用して希釈し、そして各
カラムにロードした。このカラムを次いで洗浄し、上記された手順に従って溶出した。そ
の収集されたサンプルをウエスタンブロットに供し、画分中の上記ＡＡＶ粒子の分布を検
出した。図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、そのＡＡＶキャプシドタンパク質特異的
モノクローナル抗体は、高塩（１Ｍ ＮａＣｌ）溶出画分のみ（図１、３レーン、５レー
ン、７レーンおよび９レーン）においてタンパク質を検出した。このデータは明らかに、
ＡＡＶベクター粒子および空キャプシドの両方が、スクリーニングされた全てのアニオン
交換樹脂（弱交換体および強交換体の両方）に結合することを示す。

（実施例２）
（空キャプシドとＡＡＶベクター粒子との間の電荷の差異）
ＡＡＶ空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子を、ＣｓＣｌ勾配遠心分離を使用して分
離した。上記空キャプシドは、より低塩密度（約１．３ｇｍ／ｃｃ）で可視バンドとして
生じ、上記ＡＡＶベクター粒子は、より高塩密度（約１．３８〜１．４１ｇｍ／ｃｃ）で
可視バンドとして分布した。この空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子を、上に記載さ
れたように調製し、そしてカラムに別々にロードした。Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ、ＰＯＲ
ＯＳ ５０ＨＱおよびＵＮＯＳＰＨＥＲＥ Ｑの３つの樹脂を、空粒子と完全（ｆｕｌｌ
）粒子との間の溶出プロファイルを比較するために、同じプログラムを使用して行ったカ
ラムクロマトグラフィー泳動のために使用した。ＡＡＶ空キャプシドは、ＡＡＶベクター
粒子（より後の画分に溶出する）と比較して、より低塩濃度で溶出（より先の画分に溶出
）し；この現象は、全ての３つの試験されたアニオン樹脂に対して観察された。ＵＮＯＳ
ＰＨＥＲＥ Ｑ樹脂の場合、空キャプシドは、０〜５００ｍＭ ＮａＣｌの塩勾配におけ
る画分１０に溶出するが、ＡＡＶベクター粒子は、画分１１に溶出し；Ｑ ＳＥＰＨＡＲ
ＯＳＥカラムの場合、空キャプシドは画分１１、画分１２および画分１３に溶出するが、
ＡＡＶベクター粒子は画分１３、画分１４および画分１５に溶出した。酢酸ナトリウムの
より浅い勾配を使用した場合、同様の現象がＰＯＲＯＳ ５０ＨＱカラムで観察され；空
キャプシドは画分３０〜画分３６で溶出したが、ＡＡＶベクター粒子は画分３６〜画分４
０で溶出した。これらのデータは、明らかに、ＡＡＶ空キャプシドとＡＡＶベクター粒子
との間に基礎的な電荷の差異が存在すること、そしてこの２つの集団がカラムクロマトグ
ラフィー技術により、これらの特性を使用して分離され得ることを示す。これらの樹脂に
よる空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の分離を確認したところ、２６０／２８０ｎ
ｍでのＵＶ吸収の比が溶出画分において次第に増加し、これは差次的な溶出と一致する（
ＤＮＡを欠くより低い２６０／２８０比を有する空キャプシドが先に溶出する）。

（実施例３）
（空キャプシドとＡＡＶベクター粒子との間の溶出効率および分解能における樹脂およ
び塩の効果）
このプロセスにおいてスクリーニングされる樹脂は、全てアニオン交換樹脂であるが、
差異（電荷密度、ビーズサイズおよび組成など）を示した。空キャプシドおよびＡＡＶベ
クター粒子の結合および分離の効率は、樹脂により変動した。この空キャプシドは、Ｑ
ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラム内で１１０ｍＭのＮａＣｌを使用して溶出した。対照的に、約
６５ｍＭのＮａＣｌが、ＵＮＯＳＰＨＥＲＥカラムを使用して空キャプシドを溶出するた
めに、十分であった。そしてＰＯＲＯＳ ＨＱカラムの場合は、約１３０ｍＭのＮａＣｌ
が、この空キャプシドを溶出するために十分であった。

複数の異なる塩もまた、溶出プロファイルの研究のために使用した。塩化ナトリウム、
酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウムおよびクエン酸ナトリウムを、並行比
較（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）に供した。上記のカラムクロマ
トグラフィー泳動を行うための同じプログラムを使用すると、塩化ナトリウムと比較して
酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウムを使用した場合、空キャプシド溶出は複数の画分
にわたって遅延した。これは、異なる塩はアニオン性カラムクロマトグラフィーにおいて
異なる特性を有し、そしてこれらの特性は上記ＡＡＶベクター粒子からの空キャプシドの
分離における分解能を強化するために使用され得ることを示唆する。

（実施例４）
（空キャプシドに対する溶出条件を定義する）
上で議論された実験データに基づいて、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ樹脂を使用して、ＡＡＶ
ベクター粒子から空キャプシドを分離するための、カラムクロマトグラフィーベースの技
術を開発した。上で記載されたようなＣｓＣｌ遠心分離を使用して調製された空キャプシ
ドを、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ樹脂を詰めたカラムに充填した。低塩（５０ｍＭ ＮａＣｌ
）の初期洗浄工程に引き続く分離泳動において、このカラムを、１５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、１６０ｍＭ酢酸ナトリウムまたは１７０ｍＭ酢酸ナトリウムのいずれかで洗浄した。
この空キャプシドは、１７０ｍＭ ＮａＡｃを使用した場合に最も効率的に溶出した。こ
の同じ塩の溶出プロフィールを使用した分離クロマトグラフィー泳動において、精製され
たＡＡＶベクター粒子はカラム内に残り、次いで高い濃度の塩化ナトリウムを使用した線
形の塩濃度を加えたとき、溶出した。

（実施例５）
（アニオン交換クロマトグラフィーを使用したＡＡＶベクター粒子からの空キャプシド
の分離）
空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子がカラムクロマトグラフィー技術を使用して分
離され得ることを実証するために、精製された空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子を
一緒に混合し、空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の両方を含有するサンプルを生成
した。９Ｅ＋１３粒子／ｍｌの濃度の３ｍｌの空キャプシドを、７Ｅ＋１２ベクターゲノ
ム（ｖｇ）／ｍｌの濃度の２ｍｌの完全粒子と混合した。その物質を、２０ｍＭのリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を使用して、さらに３倍に希釈した。１４ｍｌのこの希
釈物質を、２０ｍＬのベッド容量（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）で、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱカ
ラムに充填した。上に記載されたカラムクロマトグラフィー溶出プロファイルを使用し、
そしてそのデータは、その空キャプシドが１７０ｍＭ酢酸ナトリウムの塩条件で溶出する
がそのＡＡＶベクター粒子はカラム内に残り、次いでＮａＣｌ塩の線形勾配を使用して溶
出することを示した。その分離の過程にわたってそのカラムから溶出される物質のＵＶ吸
収パターン（２６０：２８０ｎｍ比）は、そのＡＡＶベクター粒子からのその空キャプシ
ドの効率的な分離と完全に一致し、そしてさらにそれを実証した。そのカラムから溶出さ
れる種々の画分を、キャプシドＥＬＩＳＡ、Ｑ−ＰＣＲ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＯＤ分
析を使用してさらに分析した。得られた全てのデータは、ＡＡＶベクター粒子からの空キ
ャプシドの分離が完全であり、そのＡＡＶベクター粒子中のベクターゲノムに対する粒子
の比は１：１であることを示した。このようにして、（そのカラムに充填された）出発物
質がベクター粒子より約１６倍多い空キャプシドを含んだとしても、このＡＡＶベクター
粒子はその空キャプシドから完全に分離された（図２）。

（実施例６）
（アニオン交換クロマトグラフィーを使用したＡＡＶベクター粒子からの空キャプシド
の分離におけるｐＨの効果）
空キャプシドを除去するための完全なカラムベースの精製プロセスを開発するために、
空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の両方を含有するカチオン交換カラム（ＰＯＲＯ
Ｓ ＨＳ）から回収したビリオンを、そのＰＯＲＯＳ ５０ＨＱカラムに加えた。ＣｓＣ
ｌ精製サンプルから空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子を分離するための類似の方法
を使用した場合、ＣｓＣｌ勾配の前精製および混合したサンプルに対して観察されたよう
な明確な分離は確認されなかったが、その２つの粒子の型は識別可能なままであった。す
なわち、空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の、部分的には分離するが不完全な分離
を観察した。カラムクロマトグラフィーの分解能に影響し得る複数のパラメーターを、そ
の分離効率を最適化するために試験した。試験されたパラメーターの中で、ｐＨがその分
離分解能を有意に強化することが見出された。ｐＨ７．４、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５およ
びｐＨ９．０の緩衝液を試験した。空ＡＡＶキャプシドは、高いｐＨ（例えばｐＨ９．０
）がそのプロセスにおいて使用された場合、そのカラムから早期の画分中に選択的に取り
出されたが、ＡＡＶベクター粒子は後期の画分中に、より高い塩濃度において溶出した。
ｐＨ９．０を使用して、その空キャプシドを、より高いＵＶ２８０シグナルおよびより低
いＵＶ２６０シグナルのＵＶ吸収シグネチャーパターンの単一ピークとして取り出した。
対照的に、第二のピークはＡＡＶベクター粒子を含み、ＤＮＡを含有する完全ＡＡＶベク
ター粒子に対して予想されたものと反対のＵＶ吸収パターン（ＵＶ２６０がＵＶ２８０よ
り優位を占める）を示した。この知見は、Ｑ−ＰＣＲおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイに
よりさらに確認され、その第二のピークがＡＡＶベクター粒子を含み、第一のピークが空
キャプシドを含むことを示した。

（実施例７）
（アニオン交換カラムクロマトグラフィーを使用したＡＡＶベクター粒子からのＡＡＶ
空キャプシド分離の手順）
上に記載された知見に基づいて、ＸＫ−１６ガラスカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）において、トリスベースの緩衝液（ｐ
Ｈ８．５）およびＰＯＲＯＳ ５０ＨＱカラム樹脂を使用して、上記ＡＡＶベクター粒子
からＡＡＶ空キャプシドを分離するために、手順を設計した。ＵＶ吸収パターンにより示
されたように、早期のセグメントに溶出された物質は空キャプシドを含有し、後期のセグ
メントはＡＡＶベクター粒子を含有した。これはＱ−ＰＣＲ分析によりさらに確認された
。より高い塩濃度で溶出したベクターを、純度を決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
析した。ベクターゲノムはＱ−ＰＣＲにより決定し、複製されたサンプルをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥに充填し、そして銀染色により染色した。コントロールとして利用するために、ＡＡ
Ｖベクター粒子のみを含有するｒＡＡＶビリオンを、ＣｓＣｌ遠心分離技術を使用して精
製し、そして同じベクターゲノムをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。

これらの技術を使用して、ベクターの約６０％を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色分
析に基づくと、回収されたベクターには、基本的に空キャプシドが存在しなかった（１０
未満の粒子が空キャプシドであった）（図３）。図３に示されるように、全てのレーンに
等しい数のベクターゲノムを充填した場合、空キャプシドを含まないベクターのコントロ
ール（レーン１）とカラムから溶出された画分に含まれるベクター（レーン２〜５）との
間には、バンドの濃さ（総タンパク質に対応する）において有意な差はなかった。

（実施例８）
（カチオン交換カラムクロマトグラフィーを使用したＡＡＶベクター粒子からの空キャ
プシドの分離）
カチオン交換カラムクロマトグラフィーについてもまた、ＡＡＶベクター粒子から空キ
ャプシドを分離するその能力を調査した。空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の両方
を含む第一のカチオン交換カラムからのＡＡＶ調製物（材料および方法の節に記載される
）を、ＰＯＲＯＳ ＨＳ樹脂に加えた。そのカラムを最初に、２００ｍＭ ＮａＣｌを含
む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した。第一のカチオン交換カ
ラムから得られたＡＡＶベクター粒子および空キャプシドの両方を含有するＡＡＶ調製物
を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を使用して希釈し、塩濃度を約２００ｍ
Ｍ ＮａＣｌまで減少させた。この物質を次いで、ＰＯＲＯＳ ＨＳカラムに充填した。
次いでｐＨ８．５の１０ｍＭトリスを含む５００ｍＭ〜７００ｍＭ酢酸アンモニウム勾配
を、そのカラムに適用した。この勾配溶出プロトコールを使用して、上記ＡＡＶベクター
粒子を最初に溶出し、空キャプシドから効率的に分離し、この空キャプシドを続いてより
高い酢酸アンモニウム濃度で溶出した。この分離に対する対照性は、空キャプシドがＡＡ
Ｖベクターと比較してより低い塩濃度で溶出したアニオン交換樹脂（上記の実施例７）を
使用しても観察された。

そのカチオン交換カラムにおける空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の相対的な結
合パターンおよび溶出パターンに関するさらなる情報は、このカラム溶出液のＵＶ吸収に
より提供された。例えば、カチオン交換カラムをｐＨ８．５で泳動した場合、そのクロマ
トグラフは、早期の画分において２６０ｎｍ吸収が優位なＵＶ吸収パターン（ＡＡＶベク
ター粒子に対応する）、および後期の溶出画分において２８０ｎｍ吸収が優位なＵＶ吸収
パターン（空キャプシドに対応する）を示した。図４に示されるように、同じベクターゲ
ノムをＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色分析に供する場合、タンパク質の量は早期の画分から後期
の画分に向かって有意に増加し、これは早期の画分がほとんど空キャプシドを含まないこ
とを示す。

これらの知見に基づいて、カチオン交換クロマトグラフィーを使用したＡＡＶベクター
（ＤＮＡ含有）粒子からの空ＡＡＶキャプシドの分離は達成され得る。図５は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルが実証する分離を示す。カチオン交換カラムから溶出された空キャプシドお
よびＡＡＶベクター粒子の両方を含むＡＡＶベクター調製物（分離を達成するために必要
とされる条件は使用されていなかった）を、次いでカチオン交換カラムに充填し、そして
酢酸アンモニウムを使用した段階勾配で溶出した。ベクターゲノムを含む画分をＱ−ＰＣ
Ｒを使用して同定し、これらの画分のアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色分析に供し
た。溶出された画分におけるタンパク質のシグナルが、その第二のカラムに充填された物
質に対して、ｖｇインプット当たりのタンパク質シグナルをほとんど含有しなかったこと
が明らかである。これは空キャプシドがそのＡＡＶベクター粒子から除去されたことを示
している。レーン２〜レーン４で示されるのは、３つの独立した実験から溶出されたベク
ターであり、この知見の一貫性および再現性を示している。

このように、ＡＡＶベクター粒子からの空キャプシドの分離のための方法が記載される
。本発明の好ましい実施形態がいくらか詳細に記載されたが、添付された特許請求の範囲
により定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明らかな改変がなされ
得ることが理解される。

Claims (1)

1. 本明細書中に記載の発明。

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