TW202405430A - 對於基因療法藥劑的先天免疫原性之樹突細胞試驗 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用於判斷個體的基因療法藥劑的先天免疫原性的方法。具體而言，該方法涉及使用分離的樹突細胞以監測對基因療法藥劑的先天免疫原性。例示性基因療法藥劑包括腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒(HSV)載體或脂質奈米顆粒。

Description

對於基因療法藥劑的先天免疫原性之樹突細胞試驗
本發明涉及使用樹突細胞判斷對基因療法藥劑的先天免疫原性的方法。
用於治療罕見遺傳疾病的基因療法的目前的成功在很大程度上依賴於腺相關病毒(AAV)載體，所述AAV載體提供了幾個有吸引力的特徵，包括組織特異性向性、靜止期細胞的轉導和轉基因表現的長期維持。然而，對AAV載體的免疫反應對成功的臨床轉化造成了重大挑戰。病毒載體的所有組分(衣殼、病毒基因體以及轉基因)觸發了涉及人免疫系統先天和適應性免疫兩者的啟動的免疫反應。由B細胞和T細胞觸發的對AAV的適應性免疫反應已相對好地表徵；然而，對通過AAV的先天免疫啟動瞭解得很少。在我們對於對AAV的先天性免疫反應的瞭解中，主要的挑戰在於在臨床試驗到離體環境中觀察到的免疫信號傳導的再現性很差。需要的是概括在若干人供體中對各種AAV血清型有反應的先天免疫特徵的新型測定。
將本文引用的所有參考文獻(包括專利申請和出版物)都通過引用以其整體併入。
在一些態樣，本發明提供了判斷個體對基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括a) 將來自所述個體的先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑一起培育，b) 與合適的對照相比，分析所述先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現，其中所述一種或多種細胞激素的改變的表現產生細胞激素特徵，其中與所述基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示所述個體對所述基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，從來自所述個體的周邊血液單核細胞中分離先天性免疫細胞。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞。在一些實施例中，所述樹突細胞源自個體的單核細胞。
在本發明的一些實施例中，所述方法進一步包括從個體中分離單核細胞，並且在樹突細胞培養基中培育所述單核細胞以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，之後將樹突細胞與基因療法藥劑一起培育。在一些實施例中，單核細胞是CD14+單核細胞。在一些實施例中，將單核細胞用樹突細胞培養基培育約5至約10天或約7至約8天以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞。在一些實施例中，在與步驟b) 的所述基因療法藥劑一起培育之前將先天性免疫細胞重新鋪板。在一些實施例中，將先天性免疫細胞重新鋪板到微孔盤中。
在本發明的一些實施例中，基因療法藥劑是病毒載體，並且其中將所述先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑以約1 × 10 3至約1 × 10 5或約1 × 10 4的MOI一起培育。在一些實施例中，基因療法藥劑是非病毒載體，並且其中將所述先天性免疫細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的非病毒載體一起培育。在一些實施例中，將先天性免疫細胞與基因療法藥劑一起培育約12小時至約36小時或約24小時。
在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的一種或多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。在一些實施例中，與合適的對照相比，細胞激素特徵中細胞激素的表現增加。在一些實施例中，合適的對照是來自未與基因療法藥劑一起培育的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現，或者其中合適的對照是來自與基因療法藥劑一起培育之前的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現。
在一些態樣，本發明提供了判斷個體對病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括a) 在單核細胞分化為樹突細胞的條件下，在樹突細胞培養基中培育來自所述個體的單核細胞，b) 將所述樹突細胞與所述病毒基因療法藥劑以約1 × 10 3至約1 × 10 5的MOI培育約12至約36小時，c)與合適的對照相比，分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現，其中所述一種或多種細胞激素的改變的表現產生細胞激素特徵，其中在與所述病毒基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示所述個體對所述病毒基因療法藥劑的先天免疫原性，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。在一些實施例中，單核細胞獲自來自個體的周邊血液單核細胞。在一些實施例中，單核細胞是CD14+單核細胞。在一些實施例中，將單核細胞在樹突細胞培養基中培育約7-8天以使所述單核細胞分化為樹突細胞。在一些實施例中，將樹突細胞與病毒基因療法藥劑以約1 × 10 4的MOI培育。在一些實施例中，將樹突細胞與病毒基因療法藥劑一起培育約24小時。
在本發明的一些實施例中，病毒載體是AAV顆粒。在一些實施例中，AAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV4衣殼、AAV5衣殼、AAV6衣殼、AAV7衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8衣殼、AAV9衣殼、AAV10衣殼、AAVrh10衣殼、AAV11衣殼、AAV12衣殼、AAVrh32.33衣殼、AAV-XL32衣殼、AAV-XL32.1衣殼、AAV LK03衣殼、AAV2R471A衣殼、AAV2/2-7m8衣殼、AAV DJ衣殼、AAV DJ8衣殼、AAV2 N587A衣殼、AAV2 E548A衣殼、AAV2 N708A衣殼、AAV V708K衣殼、山羊AAV衣殼、AAV1/AAV2嵌合衣殼、牛AAV衣殼、小鼠AAV衣殼、rAAV2/HBoV1(嵌合AAV/人類博卡病毒屬病毒1)、AAV2HBKO衣殼、AAVPHP.B衣殼或AAVPHP.eB衣殼或其功能變體。在一些實施例中，AAV衣殼包含酪胺酸突變、肝素結合突變或HBKO突變。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含含有一種或多種末端反向重複(ITR)的AAV基因體，其中所述一種或多種ITR是AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR或AAV12 ITR。在一些實施例中，AAV顆粒的所述一種或多種ITR和所述衣殼源自相同的AAV血清型。在一些實施例中，AAV顆粒的所述一種或多種ITR和所述衣殼源自不同的AAV血清型。
在本發明的一些實施例中，病毒載體是腺病毒顆粒。在一些實施例中，腺病毒顆粒包含來自以下的衣殼：腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、綿羊Ad或豬Ad 3型或其功能變體。
在本發明的一些實施例中，病毒載體是慢病毒顆粒。在一些實施例中，重組慢病毒顆粒經水皰性口炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、伊波拉病毒、瑪律堡病毒、莫柯拉病毒(Mokala virus)、狂犬病毒、RD114或其功能變體假型化。
在本發明的一些實施例中，病毒載體是單純皰疹病毒(HSV)顆粒。在一些實施例中，所述HSV顆粒是HSV-1顆粒或HSV-2顆粒或其功能變體。
在一些態樣，本發明提供了判斷個體對非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括a) 在單核細胞分化為樹突細胞的條件下，在樹突細胞培養基中培育來自所述個體的單核細胞，b) 將所述樹突細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的非病毒載體一起培育，c)與合適的對照相比，分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現，其中所述一種或多種細胞激素的改變的表現產生細胞激素特徵，其中在與所述非病毒基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示所述個體對所述非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。在一些實施例中，單核細胞獲自來自個體的周邊血液單核細胞。在一些實施例中，單核細胞是CD14+單核細胞。在一些實施例中，將單核細胞在樹突細胞培養基中培育約7-8天以使所述單核細胞分化為樹突細胞。在一些實施例中，將樹突細胞與非病毒基因療法藥劑一起培育約12小時至約36小時或約24小時。
在一些實施例中，基因療法藥劑包含編碼異源轉基因的核酸。在一些實施例中，異源轉基因可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，啟動子是組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導型啟動子。
在一些態樣，本發明提供了判斷基因療法藥劑的細胞激素特徵的方法，所述方法包括a) 將來自一個或多個個體的一種或多種先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑一起培育，b) 與合適的對照相比，分析所述一種或多種先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現，其中步驟b) 中所述一種或多種細胞激素的改變的表現指示所述基因療法藥劑的細胞激素特徵。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，從來自個體的周邊血液單核細胞中分離一種或多種先天性免疫細胞。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞。在一些實施例中，樹突細胞源自一個或多個個體的單核細胞。
在本發明的一些實施例中，所述方法進一步包括從一個或多個個體中分離單核細胞，並且在樹突細胞培養基中培育所述單核細胞以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，之後將樹突細胞與基因療法藥劑一起培育。在一些實施例中，單核細胞是CD14+單核細胞。在一些實施例中，將單核細胞用樹突細胞培養基培育約5至約10天或約7至約8天以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞。在一些實施例中，在與步驟b) 的所述基因療法藥劑一起培育之前將先天性免疫細胞重新鋪板。
在一些實施例中，基因療法藥劑是病毒載體，並且其中將所述先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑以約1 × 10 3至約1 × 10 5或約1 × 10 4的MOI培育。在一些實施例中，基因療法藥劑是非病毒載體，並且其中將所述先天性免疫細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的非病毒載體一起培育。在一些實施例中，將先天性免疫細胞與基因療法藥劑一起培育約12小時至約36小時或約24小時。
在本發明的一些實施例中，與合適的對照相比，細胞激素特徵中細胞激素的表現增加。在一些實施例中，合適的對照是來自未與基因療法藥劑一起培育的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現，或者其中合適的對照是來自與基因療法藥劑一起培育之前的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現。在一些實施例中，基因療法藥劑是病毒載體或非病毒載體。
在一些實施例中，病毒載體是AAV顆粒。在一些實施例中，AAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV4衣殼、AAV5衣殼、AAV6衣殼、AAV7衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8衣殼、AAV9衣殼、AAV10衣殼、AAVrh10衣殼、AAV11衣殼、AAV12衣殼、AAVrh32.33衣殼、AAV-XL32衣殼、AAV-XL32.1衣殼、AAV LK03衣殼、AAV2R471A衣殼、AAV2/2-7m8衣殼、AAV DJ衣殼、AAV DJ8衣殼、AAV2 N587A衣殼、AAV2 E548A衣殼、AAV2 N708A衣殼、AAV V708K衣殼、山羊AAV衣殼、AAV1/AAV2嵌合衣殼、牛AAV衣殼、小鼠AAV衣殼、rAAV2/HBoV1(嵌合AAV/人類博卡病毒屬病毒1)、AAV2HBKO衣殼、AAVPHP.B衣殼或AAVPHP.eB衣殼或其功能變體。在一些實施例中，AAV衣殼包含酪胺酸突變、肝素結合突變或HBKO突變。在一些實施例中，AAV病毒顆粒包含含有一種或多種末端反向重複(ITR)的AAV基因體，其中所述一種或多種ITR是AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR或AAV12 ITR。在一些實施例中，AAV顆粒的所述一種或多種ITR和所述衣殼源自相同的AAV血清型。在一些實施例中，AAV顆粒的所述一種或多種ITR和所述衣殼源自不同的AAV血清型。
在一些實施例中，病毒載體是腺病毒顆粒。在一些實施例中，腺病毒顆粒包含來自以下的衣殼：腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、綿羊Ad或豬Ad 3型或其功能變體。
在一些實施例中，病毒載體是慢病毒顆粒。在一些實施例中，重組慢病毒顆粒經水皰性口炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、伊波拉病毒、瑪律堡病毒、莫柯拉病毒(Mokala virus)、狂犬病毒、RD114、或其功能變體假型化。
在一些實施例中，病毒載體是單純皰疹病毒(HSV)顆粒。在一些實施例中，所述HSV顆粒是HSV-1顆粒、或HSV-2顆粒、或其功能變體。
在一些實施例中，基因療法藥劑包含編碼異源轉基因的核酸。在一些實施例中，異源轉基因可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，啟動子是組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導型啟動子。
在一些實施例中，本發明提供了用於在本發明的任何方法中使用的套組。
相關申請的交叉引用
本申請要求2022年4月12日提交的美國臨時申請號63/330,241的優先權權益，將其通過引用以其整體併入。
在一些態樣，本發明提供了判斷個體對基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括a) 將來自所述個體的先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑一起培育，b) 與合適的對照相比，分析所述先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現，其中所述一種或多種細胞激素的改變的表現產生細胞激素特徵，其中與所述基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示所述個體對所述基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，所述方法進一步包括從個體中分離單核細胞，並且在樹突細胞培養基中培育所述單核細胞以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，之後將樹突細胞與基因療法藥劑一起培育。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的一種或多種。在一些實施例中，判斷個體是否對基因療法藥劑具有先天免疫的方法在向所述個體投予所述基因療法藥劑之前判斷。在一些實施例中，判斷個體是否對基因療法藥劑具有先天免疫的方法在向所述個體投予所述基因療法藥劑之前判斷，從而在投予所述基因療法藥劑之前、期間或之後鑒定會受益於先天性免疫反應的調節劑的投予的個體。 通用技術
本文所述或參考的技術和程式通常是本領域技術人員很好理解和使用常規方法通常使用的，例如像在以下文獻中所述的廣泛使用的方法： Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook等人, 第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)； Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel, 等人編輯, 2003)；叢書 Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.)； PCR 2: A Practical Approach(M.J. MacPherson, B.D. Hames和G.R. Taylor編輯, 1995)； Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow和Lane, 編輯, 1988)； Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I. Freshney, 第6版, J. Wiley and Sons, 2010)； Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, 編輯, 1984)； Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook(J.E. Cellis, 編輯, Academic Press, 1998)； Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P. Mather和P.E. Roberts, Plenum Press, 1998)； Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures(A. Doyle, J.B. Griffiths, 和D.G. Newell, 編輯, J. Wiley and Sons, 1993-8)； Handbook of Experimental Immunology(D.M. Weir和C.C. Blackwell, 編輯, 1996)； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M. Miller和M.P. Calos, 編輯, 1987)； PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人, 編輯, 1994)； Current Protocols in Immunology(J.E. Coligan等人, 編輯, 1991)； Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人, 編輯, J. Wiley and Sons, 2002)； Immunobiology(C.A. Janeway等人, 2004)； Antibodies(P. Finch, 1997)； Antibodies: A Practical Approach(D. Catty., 編輯, IRL Press, 1988-1989)； Monoclonal Antibodies: A Practical Approach(P. Shepherd和C. Dean, 編輯, Oxford University Press, 2000)； Using Antibodies: A Laboratory Manual(E. Harlow和D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)； The Antibodies(M. Zanetti和J. D. Capra, 編輯, Harwood Academic Publishers, 1995)；和 Cancer: Principles and Practice of Oncology(V.T. DeVita等人, 編輯, J.B. Lippincott Company, 2011)。 定義
如本文所用，術語“IRAK降解劑”是異雙功能化合物，其以可測量的親和力結合和/或抑制(完全地或部分地)IRAK激酶和E3連接酶兩者，導致IRAK激酶的泛素化和隨後的降解。在某些實施例中，降解劑的DC 50小於約50 µM、小於約1 µM、小於約500 nM、小於約100 nM、小於約10 nM或小於約1 nM。如本文所用，術語“單價”是指沒有附加的E3連接酶結合部分的降解劑化合物。
如本文所用，關於IRAK的術語“抑制劑”是以可測量的親和力結合和/或抑制(完全地或部分地)IRAK激酶的化合物。在某些實施例中，抑制劑的IC 50和/或結合常數小於約50 µM、小於約1 µM、小於約500 nM、小於約100 nM、小於約10 nM或小於約1 nM。
如本文所用，關於IRAK的術語“調節劑”是刺激、延遲、抑制和/或阻抑(完全地或部分地)IRAK激酶活性的化合物。
如本文所用，術語“基因療法”是指其中個體的細胞中的核酸(例如，基因、mRNA等)的表現被修飾以改變所述細胞的生物特性的療法。在一些例子中，基因療法包括遞送外源核酸以在個體的細胞中表現。在一些例子中，基因療法改變(例如，降解、抑制、增強)個體的細胞中外源基因的表現。在一些例子中，基因療法是體內療法。在一些例子中，基因療法是離體療法(例如，細胞療法)。
如本文所用，術語“基因療法藥劑”是指核酸(例如，表現構建體、miRNA、反義、shRNA、siRNA)或核酸與用於將核酸遞送至個體或細胞以修飾或操縱個體或細胞中的一種或多種核酸(例如，基因、mRNA)的表現以改變活細胞的生物特性的藥劑的組合。基因療法藥劑的例子包括但不限於病毒載體(例如，腺相關病毒、腺病毒、慢病毒、單純皰疹病毒、桿狀病毒)、細菌載體和非病毒載體(例如，包封包含治療性核酸和/或編碼治療性多肽的治療性核酸或質體DNA(例如，封閉端DNA)的脂質奈米顆粒(LNP))。
如本文所用，“載體”是指包含有待在體外或在體內遞送至宿主細胞中的核酸的重組質體或病毒。
如本文所用，術語“多核苷酸”或“核酸”是指任何長度的核苷酸(核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸)聚合形式。因此，此術語包括但不限於單股、雙股或多股DNA或RNA；基因體DNA；cDNA；DNA-RNA雜合體；或者包含嘌呤和嘧啶鹼基或其他天然的核苷酸鹼基、經化學修飾的或經生化修飾的核苷酸鹼基、非天然的核苷酸鹼基或衍生的核苷酸鹼基的聚合物。核酸的骨架可以包含糖和磷酸基團(如通常可以在RNA或DNA中發現的)或者經修飾的或經取代的糖或磷酸基團。可替代地，核酸的骨架可以包含合成亞基(如胺基磷酸酯)的聚合物，並且因此可以是寡去氧核苷胺基磷酸酯(P-NH 2)或混合的胺基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。另外，雙股核酸可以從化學合成的單股多核苷酸產物通過合成互補股並在適當的條件下使股退火或者通過使用DNA聚合酶用適當的引物從頭合成互補股來獲得。
術語“多肽”和“蛋白質”可互換使用以指代胺基酸殘基的聚合物，並且不限於最小長度。胺基酸殘基的此類聚合物可含有天然或非天然胺基酸殘基，並且包括但不限於胺基酸殘基的肽、寡肽、二聚體、三聚體和多聚體。所述定義涵蓋全長蛋白質以及其片段兩者。所述術語還包括多肽的轉譯後修飾，例如醣基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化等。此外，出於本發明的目的，“多肽”是指相對於天然序列包括修飾(如缺失、添加和取代)的蛋白質(通常在本質上是保守的)，只要該蛋白質保持所希望的活性即可。這些修飾可能是故意的(如通過定點誘變)，或者可能是偶然的(諸如通過產生蛋白質的宿主的突變或由於PCR擴增引起的錯誤)。
“重組病毒載體”是指包含一個或多個異源序列(即，非病毒來源的核酸序列)的重組多核苷酸載體。在重組AAV載體的情況下，重組核酸側接至少一個(例如，兩個)末端反向重複序列(ITR)。
“重組AAV載體(rAAV載體)”是指包含側接至少一個(例如，兩個)AAV末端反向重複序列(ITR)的一個或多個異源序列(即，非AAV來源的核酸序列)的多核苷酸載體。當此類rAAV載體存在於已感染合適的輔助病毒(或所述輔助病毒表現合適的協助工具)並且正在表現AAV rep和cap基因產物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主細胞中時，所述rAAV載體可以被複製並包裝在感染性病毒顆粒中。當將rAAV載體摻入較大多核苷酸中(例如，在染色體中或在用於選殖或轉染的另一種載體如質體中)時，則rAAV載體可稱為“前載體”，其可以通過在AAV包裝功能和合適協助工具的存在下複製和衣殼化被“挽救”。rAAV載體可以呈多種形式中的任何一種，包括但不限於質體、線性人工染色體、與脂質複合、包封在脂質體內和(在多個實施例中)衣殼化於病毒顆粒(特別是AAV顆粒)中。rAAV載體可以被包裝在AAV病毒衣殼中，以產生“重組腺相關病毒顆粒(rAAV顆粒)”。
“rAAV病毒”或“rAAV病毒顆粒”是指由至少一種AAV衣殼蛋白和衣殼化的rAAV載體基因體組成的病毒顆粒。
“重組腺病毒載體”是指包含側接至少一個腺病毒末端反向重複序列(ITR)的一個或多個異源序列(即，非腺病毒來源的核酸序列)的多核苷酸載體。在一些實施例中，重組核酸側接兩個末端反向重複序列(ITR)。當存在於表現從重組病毒基因體缺失的必要腺病毒基因(例如，E1基因、E2基因、E4基因等)的宿主細胞中時，此類重組病毒載體可以被複製並包裝在感染性病毒顆粒中。當將重組病毒載體摻入較大多核苷酸(例如，在用於選殖或轉染的染色體或另一種載體如質體中)時，重組病毒載體可稱為“前載體”，其可通過在腺病毒包裝功能的存在下複製和衣殼化而被“挽救”。重組病毒載體可以是多種形式中的任何一種，包括但不限於質體、線性人工染色體、與脂質複合、包封在脂質體內、和衣殼化於病毒顆粒(例如腺病毒顆粒)中。可將重組病毒載體包裝在腺病毒衣殼中以產生“重組腺病毒顆粒”。
“重組慢病毒載體”是指包含側接至少一個慢病毒末端重複序列(LTR)的一個或多個異源序列(即，非慢病毒來源的核酸序列)的多核苷酸載體。在一些實施例中，重組核酸側接兩個慢病毒末端重複序列(LTR)。當存在於已經感染合適協助工具的宿主細胞中時，此類重組病毒載體可以被複製並且包裝在感染性病毒顆粒中。可將重組慢病毒載體包裝在慢病毒衣殼中以產生“重組慢病毒顆粒”。
“重組單純皰疹載體(重組HSV載體)”是指包含側接HSV末端重複序列的一個或多個異源序列(即，非HSV來源的核酸序列)的多核苷酸載體。當存在於已經感染合適協助工具的宿主細胞中時，此類重組病毒載體可以被複製並且包裝在感染性病毒顆粒中。當將重組病毒載體摻入較大多核苷酸(例如，在用於選殖或感染的染色體或另一種載體如質體中)時，重組病毒載體可稱為“前載體”，其可通過在HSV包裝功能的存在下複製和衣殼化而被“挽救”。重組病毒載體可以是多種形式中的任何一種，包括但不限於質體、線性人工染色體、與脂質複合、包封在脂質體內、和衣殼化於病毒顆粒(例如HSV顆粒)中。可將重組病毒載體包裝在HSV衣殼中以產生“重組單純皰疹病毒顆粒”。
如本文所用，“固體脂質奈米顆粒”(SLN、sLNP)或“脂質奈米顆粒”(LNP)是指由脂質構成的奈米顆粒。在一些例子中，只有一層磷脂層並且顆粒內部的大部分由親脂性物質構成。諸如核酸的有效載荷可以嵌入內部。在一些例子中，脂質奈米顆粒是脂質體，其包含脂質雙層。
如本文所用，涉及基因療法時的術語“改善”可以指推進、加強、延長或以其他方式增加基因療法藥劑的治療性基因有效載荷的表現的行為。在一些實施例中，改善的基因療法是指其中和不與IRAK調節劑一起投予的基因療法相比，與IRAK調節劑一起投予的基因療法藥劑的治療性基因有效載荷的表現增加大於約10%、25%、50%、75%或100%中任一個的基因療法。在一些實施例中，改善的基因療法是指其中和不與IRAK調節劑一起投予的基因療法相比，與IRAK調節劑一起投予的基因療法藥劑的治療性基因有效載荷的表現時間延長了大於約10%、25%、50%、75%或100%中任一個的基因療法。在一些例子中，通過減少對基因療法藥劑的免疫反應(例如，先天性免疫反應)改善基因療法。在一些實施例中，改善的基因療法是指其中和不與IRAK調節劑一起投予的基因療法相比，對與IRAK調節劑一起投予的基因療法藥劑的免疫反應減少大於約10%、25%、50%、75%或100%中任一個的基因療法。在一些實施例中，將對基因療法藥劑的免疫反應的減少測量為與在不存在IRAK調節劑的情況下基因療法藥劑暴露於免疫細胞相比，在存在IRAK調節劑的情況下基因療法藥劑暴露於免疫細胞後細胞激素特徵的減少。
如本文所用，提及基因療法時的術語“調節”可以指改變、變動、變化、改善或以其他方式修飾基因療法藥劑的存在或活性的行為。例如，調節對基因療法藥劑的免疫反應可以指代導致改變、變動、變化、改善或以其他方式修飾對基因療法藥劑的免疫反應(例如，減少、延遲和/或消除對基因療法藥劑的免疫反應(例如，先天性免疫反應))的任何行為。
如本文所用，涉及對基因療法藥劑的免疫反應(例如，先天性性免疫反應)時的術語“細胞激素特徵”是指在先天性免疫細胞暴露於基因療法藥劑後一種或多種細胞激素的表現改變(例如，增加、減少)。在一些例子中，細胞激素特徵的細胞激素是TLR途徑(例如，TLR2、TLR3、TLR4或TLR9途徑)特有的。
先天性免疫細胞是介導先天免疫的白血細胞，並且包括嗜鹼性粒細胞、樹突細胞、嗜酸性粒細胞、朗格漢斯細胞、肥大細胞、單核細胞和巨噬細胞、嗜中性粒細胞和NK細胞。不同的AAV衣殼可以以不同的效率(通常稱為轉導效率)進入這些先天性免疫細胞。一些血清型(如AAV1)能有效地轉導某些免疫細胞(像單核細胞)，而像AAV6的其他AAV能有效地轉導諸如樹突細胞的細胞(Grimm, D等人, J. Virol., 2008, 82(12):5887-5911)。然而，所有AAV進入細胞後均引起免疫反應。該免疫反應的程度取決於AAV血清型和細胞類型。一旦AAV轉導宿主免疫細胞，它們就接合諸如TLR(即TLR9)的免疫受體。幾項使用小鼠模型的研究揭示，TLR9是參與AAV免疫原性的關鍵DNA感測器(Zhu, J等人, J Clin Invest. 2009;119(8):2388-2398；Ashley SN等人, Cell. Immunol. 2019, 346:103997)。一旦這些TLR被病毒啟動，它們就會分泌細胞激素，在受感染的細胞內建立抗病毒狀態並且警示鄰近細胞。(Carty, M和Bowie, AG, Clin Exp Immunol, 2010, 161(3):397-406；Lester, SN和Li, K, J Mol Biol.2014；426(6):1246-1264；Fitzgerald, KA和Kagan, JC, Cell, 2020 180(6):1044-1066)。
這些細胞激素還負責啟動包含B細胞和T細胞的適應性免疫系統，所述B細胞和T細胞產生抗體並且產生細胞毒性以分別殺死病毒感染的細胞。如本文所用，細胞激素的某些亞群的上調或下調稱為“細胞激素特徵”。這些包含一種或多種(例如，三種或更多種)細胞激素的細胞激素特徵可以用作疾病和療法成功的預測標記物。細胞激素特徵的例子見於Zuniga, J等人, Int. J. Infect. Diseases, 2020, 94:4-11，Bergamaschi, C等人, Cell Reports, 2021, 36:109504；Del Valle, DM等人, Nat. Med. 2020, 26:1636-1643。
“異源的”意指源自基因型不同於其所比較或其所引入或摻入的實體的其餘部分的實體。例如，通過基因工程技術引入不同細胞類型中的核酸是異源核酸(並且在表現時可以編碼異源多肽)。類似地，摻入病毒載體中的細胞序列(例如，基因或其部分)就該載體而言是異源核苷酸序列。
術語“轉基因”是指引入細胞中並且能夠被轉錄成RNA並且任選地在適當條件下轉譯和/或表現的核酸。在多個態樣，它賦予其所引入的細胞所需的特性，或以其他方式產生所需的治療或診斷結局。在另一個態樣，它可以被轉錄成介導RNA干擾的分子，如siRNA。
如關於病毒滴度使用的術語“基因體顆粒(gp)”、“基因體當量”或“基因體拷貝”是指含重組AAV DNA基因體的病毒粒子的數量，與感染性或功能性無關。特定載體製劑中基因體顆粒的數量可以通過諸如本文實例中或例如Clark等人 (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039；Veldwijk等人 (2002) Mol. Ther., 6:272-278中所述的程式來測量。
如關於病毒滴度使用的術語“感染單位(iu)”、“感染性顆粒”或“複製單位”是指感染性和複製型重組AAV載體顆粒的數量，如通過感染中心測定(也稱為複製中心測定)測量的，如例如McLaughlin等人 (1988) J. Virol., 62:1963-1973中所述。
如關於病毒滴度使用的術語“轉導單位(tu)”是指導致產生功能轉基因產物的感染性重組AAV載體顆粒的數量，如在功能測定中測量的，如本文實例中或例如以下文獻中所述：Xiao等人 (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124；或Fisher等人 (1996) J. Virol., 70:520-532(LFU測定)。
“末端反向重複”或“ITR”序列是本領域中熟知的術語，並且是指在病毒基因體末端發現的處於相反方向的相對較短的序列。
“AAV末端反向重複(ITR)”序列是本領域中熟知的術語，是存在於天然單股AAV基因體的兩端處的大約145個核苷酸的序列。ITR的最外側的125個核苷酸能以兩個可替代的方向中的任一個存在，導致不同AAV基因體之間以及單個AAV基因體兩端之間的異質性。最外側的125個核苷酸也含有幾個較短的自身互補性區域(指定為A、A'、B、B'、C、C'和D區)，使得在ITR的這個部分內發生股內鹼基配對。
“末端解股序列”或“trs”是AAV ITR的D區中的序列，其在病毒DNA複製期間被AAV rep蛋白切割。突變體末端解股序列難以被AAV rep蛋白切割。“AAV協助工具”是指允許AAV被宿主細胞複製和包裝的功能。AAV協助工具可以按多種形式中的任一種提供，包括但不限於協助AAV複製和包裝的輔助病毒或輔助病毒基因。其他AAV協助工具在本領域中是已知的，如基因毒性劑。
“AAV協助工具”是指允許AAV被宿主細胞複製和包裝的功能。AAV協助工具可以按多種形式中的任一種提供，包括但不限於協助AAV複製和包裝的輔助病毒或輔助病毒基因。其他AAV協助工具在本領域中是已知的，如基因毒性劑。
AAV的“輔助病毒”是指允許AAV(其是缺陷型細小病毒)被宿主細胞複製和包裝的病毒。已經鑒定了多種此類輔助病毒，包括腺病毒、皰疹病毒、痘病毒(如牛痘)和桿狀病毒。腺病毒涵蓋多種不同子群，但子群C的5型腺病毒(Ad5)是最常用的。人、非人哺乳動物和鳥類來源的許多腺病毒是已知的，並且可從如ATCC等保藏機構獲得。也可從如ATCC等保藏機構獲得的皰疹家族病毒包括例如單純皰疹病毒(HSV)、愛潑斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)和假狂犬病毒(PRV)。可從保藏機構獲得的桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾( Autographa californica)核型多角體病毒。
將關於參考多肽或核酸序列的“序列同一性百分比(%)”定義為在比對序列並引入空位(如果需要)以實現最大序列同一性百分比並且不將任何保守取代視為序列同一性的一部分之後，候選序列中與參考多肽或核酸序列中的胺基酸殘基或核苷酸相同的胺基酸殘基或核苷酸的百分比。用於判斷胺基酸或核酸序列同一性百分比的目的的比對可以用在本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用可公開獲得的電腦軟體程式，例如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人, 編輯, 1987), 增刊30, 第7.7.18章, 表7.7.1中描述的那些，並且包括BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。潛在的比對程式是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software，賓夕法尼亞州)。本領域技術人員可以判斷用於測量比對的適當參數，包括在所比較序列的全長上實現最大比對所需的任何演算法。出於本文目的，給定胺基酸序列A和、與或相對於給定胺基酸序列B的胺基酸序列同一性%(其可替代地表述為給定胺基酸序列A和、與或針對給定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列同一性%)計算如下：100乘以分數X/Y，其中X是通過序列比對程式在A與B的該程式比對中評定為相同匹配的胺基酸殘基數，並且其中Y是B中胺基酸殘基的總數。可以理解，當胺基酸序列A的長度不等於胺基酸序列B的長度時，A與B的胺基酸序列同一性%將不等於B與A的胺基酸序列同一性%。出於本文目的，給定的核酸序列C和、與或針對給定的核酸序列D的核酸序列同一性%(其可替代地表述為給定的核酸序列C和、與或針對給定的核酸序列D具有或包含一定核酸序列同一性%)計算如下：100乘以分數W/Z，其中W是通過序列比對程式在C與D的程式比對中評定為相同匹配的核苷酸的數量，並且其中Z是D中核苷酸的總數。可以理解，當核酸序列C的長度不等於核酸序列D的長度時，C與D的核酸序列同一性%將不等於D與C的核酸序列同一性%。
藥劑的“有效量”是指在必要的劑量和時間段內有效實現所需治療結果的量。例如，基因療法藥劑的有效量是指在必要的劑量和時間段內有效實現所需基因治療結果的量。在另一個例子中，IRAK調節劑的有效量可以指在必要的劑量和時間段內有效實現改善的基因療法的所需結果的量。
本發明的物質/分子(例如，基因療法藥劑和/或IRAK調節劑)的“治療有效量”可根據諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及物質/分子、激動劑或拮抗劑在個體中引發所需反應的能力等因素而變化。治療有效量也是其中治療上有益的效果超過物質/分子的任何毒性或有害影響的量。
提及細胞激素特徵時的術語“合適的對照”是來自未與所述基因療法藥劑一起培育的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現或來自與所述基因療法藥劑一起培育之前的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現。
涉及基因療法藥劑和先天性免疫反應調節劑(例如，IRAK調節劑)時的“組合”投予包括將基因療法藥劑和先天性免疫反應調節劑(例如，IRAK調節劑)以任意順序同時(並行)、連續或依序投予。
術語“並行”在本文用於指基因療法藥劑和先天性免疫反應調節劑(例如，IRAK調節劑)的投予，其中至少部分投予在時間上重疊。因此，並行投予包括當基因療法藥劑或先天性免疫反應調節劑(例如，IRAK調節劑)的投予在停止投予另一種藥劑/調節劑後繼續進行時的用劑方案。
如本文所用，術語“與……結合”是指除了一種治療模式之外還投予另一種治療模式。因此，“與……結合”是指在向個體投予一種治療模式之前、期間或之後投予另一種治療模式(基因療法藥劑或先天性免疫反應調節劑(例如，IRAK調節劑))。
“分離的”分子(例如，核酸或蛋白質)或細胞意指所述分子或細胞已經從其天然環境的組分中得以鑒定並分離和/或回收。
本文對“約”某一值或參數的提及包括(並描述)涉及該值或參數本身的實施例。例如，提及“約X”的描述包括“X”的描述。
除非另外指示，否則如本文所用，冠詞的單數形式“一個/一種(a)”、“一種/一種(an)”和“所述(the)”包括複數指示物。
應理解，本文所述的本發明的態樣和實施例包括“包含多個態樣和實施例”、“由多個態樣和實施例組成”和/或“基本上由多個態樣和實施例組成”。 用於判斷對基因療法藥劑的先天免疫原性的細胞測定
在一些態樣，本發明提供了用於判斷個體對基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，其中所述先天免疫原性可以針對所述基因療法藥劑的任何態樣；例如，遞送媒劑(例如，病毒衣殼或脂質奈米顆粒)、所述基因療法藥劑的核酸有效載荷和/或基因療法藥劑的任何其他組分。
在一些態樣，本發明提供了用於判斷個體對基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括a) 將來自所述個體的先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑一起培育，b) 分析所述先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的表現，其中與所述基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示對所述基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，從來自個體的血液(例如，周邊血液單核細胞)中分離先天性免疫細胞。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞。在一些實施例中，樹突細胞源自個體的單核細胞(例如，CD14+單核細胞)。如本文所用，術語“衍生”樹突細胞包括細胞(例如，單核細胞)分化以產生樹突細胞。在一些實施例中，所述方法進一步包括在樹突細胞與基因療法藥劑一起培育之前，從個體中分離單核細胞並且在其中樹突細胞源自(分化自)所述單核細胞的條件下在樹突細胞培養基中培育單核細胞。
在一些態樣，本發明提供了用於判斷個體對基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括a) 將來自所述個體的樹突細胞與所述基因療法藥劑一起培育，b) 分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的表現，其中與所述基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示對所述基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，從來自所述個體的周邊血液單核細胞中分離樹突細胞。在一些實施例中，樹突細胞源自個體的單核細胞(例如，CD14+單核細胞)。在一些實施例中，所述方法進一步包括從個體中分離單核細胞，並且在樹突細胞培養基中培育所述單核細胞以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，之後將樹突細胞與基因療法藥劑一起培育。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。
在一些態樣，本發明提供了用於判斷個體對基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括a) 從所述個體中分離先天性免疫細胞，b) 將所述先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑一起培育，c) 分析所述先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的表現，其中與所述基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示對所述基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，從來自所述個體的周邊血液單核細胞中分離先天性免疫細胞。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞。在一些實施例中，樹突細胞源自個體的單核細胞(例如，CD14+單核細胞)。
在一些態樣，本發明提供了用於判斷個體的基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括a) 從所述個體中分離單核細胞，b) 在樹突細胞培養基中培育所述單核細胞以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，c) 將所述樹突細胞與所述基因療法藥劑一起培育，d) 分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的表現，其中與所述基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示對所述基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。
在一些態樣，本發明提供了用於判斷個體對病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括：a) 將來自所述個體的先天性免疫細胞與所述病毒基因療法藥劑以約1 × 10 4的MOI培育約24小時，b) 分析所述先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的表現，其中與所述病毒基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示對所述病毒基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，從來自所述個體的周邊血液單核細胞中分離先天性免疫細胞。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞。在一些實施例中，樹突細胞源自個體的單核細胞(例如，CD14+單核細胞)。
在一些態樣，本發明提供了用於判斷個體對病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括：a) 將來自所述個體的樹突細胞與所述病毒基因療法藥劑以約1 × 10 4的MOI培育約24小時，b) 分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的表現，其中與所述病毒基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示對所述病毒基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，從來自所述個體的周邊血液單核細胞中分離樹突細胞。在一些實施例中，樹突細胞源自個體的單核細胞(例如，CD14+單核細胞)。在一些實施例中，所述方法進一步包括從個體中分離單核細胞，並且在樹突細胞培養基中培育所述單核細胞以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，之後將樹突細胞與基因療法藥劑一起培育。
在一些態樣，本發明提供了用於判斷個體對病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括：a) 獲得來自所述個體的周邊血液單核細胞(PBMC)，b) 從所述PBMC中分離先天性免疫細胞，c) 將所述先天性免疫細胞與所述病毒基因療法藥劑以約1 × 10 4的MOI培育約24小時，d) 分析所述先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的表現，其中與所述病毒基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示對所述病毒基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞，其中所述樹突細胞源自個體的單核細胞(例如，CD14+單核細胞)。在一些實施例中，所述方法進一步包括從個體中分離單核細胞，並且在樹突細胞培養基中培育所述單核細胞以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，之後將樹突細胞與基因療法藥劑一起培育。
在一些態樣，本發明提供了判斷個體對病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括a) 在單核細胞分化為樹突細胞的條件下，在樹突細胞培養基中培育來自所述個體的單核細胞，b) 將所述樹突細胞與所述病毒基因療法藥劑以約1 × 10 3至約1 × 10 5的MOI培育約12至約36小時，c) 與合適的對照相比，分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的改變(例如，增加、減少)的表現，其中所述一種或多種細胞激素的改變的表現產生細胞激素特徵，其中在與所述病毒基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示所述個體對所述病毒基因療法藥劑的先天免疫原性，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。在一些實施例中，單核細胞獲自來自個體的周邊血液單核細胞。在一些實施例中，單核細胞是CD14+單核細胞。在一些實施例中，將單核細胞用樹突細胞培養基培育約5至約10天或約7至約8天以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞。在一些實施例中，將單核細胞用樹突細胞培養基培育約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或多於12天中的任一個以衍生來自單核細胞的樹突細胞。在一些實施例中，在與步驟c) 的所述基因療法藥劑一起培育之前將樹突細胞重新鋪板。在一些實施例中，在與基因療法藥劑一起培育之前，將所述樹突細胞重新鋪板到微孔盤中。在一些實施例中，將樹突細胞與病毒基因療法藥劑以約1 × 10 3、約5 × 10 3、約1 × 10 4、約5 × 10 4或約1 × 10 5中的任一個的MOI培育。在一些實施例中，將樹突細胞與病毒基因療法藥劑按以下中的任一個的MOI培育：約1 × 10 3至約1 × 10 5、約5 × 10 3至約1 × 10 5、約1 × 10 4至約1 × 10 5、約5 × 10 4至約1 × 10 5、約1 × 10 3至約5 × 10 4、約5 × 10 3至約5 × 10 4、約1 × 10 4至約5 × 10 4、約1 × 10 3至約1 × 10 4、約5 × 10 3至約1 × 10 4、或約1 × 10 3至約5 × 10 3。在一些實施例中，將樹突細胞與病毒基因療法藥劑一起培育多於以下時間中的任一個：約12小時、約18小時、約24小時、約30小時或約36小時。在一些實施例中，將樹突細胞與病毒基因療法藥劑一起培育約12小時與約36小時、約18小時與約36小時、約24小時與約36小時、約30小時與約36小時、約12小時與約30小時、約18小時與約30小時、約24小時與約30小時、約12小時與約24小時、約18小時與約24小時、或約12小時與約18小時之間中的任一者的時間。
在一些態樣，本發明提供了用於判斷個體對病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括：a) 獲得來自所述個體的周邊血液單核細胞(PBMC)，b) 從所述PBMC中分離CD14+單核細胞，c) 將所述單核細胞在樹突細胞培養基中培育約7-8天以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，d) 將所述樹突細胞重新鋪板，e) 將所述樹突細胞與所述病毒基因療法藥劑以約1 × 10 4的MOI培育約24小時，f) 分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的表現，其中與病毒基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示對所述病毒基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。
在一些態樣，本發明提供了判斷個體對非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括a) 在單核細胞分化為樹突細胞的條件下，在樹突細胞培養基中培育來自所述個體的單核細胞，b) 將所述樹突細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的非病毒基因療法藥劑一起培育，c) 與合適的對照相比，分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的改變(例如，增加、減少)的表現，其中所述一種或多種細胞激素的改變的表現產生細胞激素特徵，其中在與所述非病毒基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示所述個體對所述非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。在一些實施例中，單核細胞獲自來自個體的周邊血液單核細胞。在一些實施例中，單核細胞是CD14+單核細胞。在一些實施例中，將單核細胞用樹突細胞培養基培育約5至約10天或約7至約8天以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞。在一些實施例中，將單核細胞用樹突細胞培養基培育約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或多於12天中的任一個以衍生來自單核細胞的樹突細胞。在一些實施例中，在與步驟c) 的所述非病毒基因療法藥劑一起培育之前將樹突細胞重新鋪板。在一些實施例中，在與基因療法藥劑一起培育之前，將所述樹突細胞重新鋪板到微孔盤中。在一些實施例中，將先天性免疫細胞與以下濃度的非病毒基因療法藥劑一起培育：約1 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約100 ng/mL、約100 ng/mL至約1 µg/mL、約1 µg/mL至約10 µg/mL、約10 µg/mL至約100 µg/mL、或約100 µg/mL至約1 mg/mL。在一些實施例中，將樹突細胞與非病毒基因療法藥劑一起培育多於以下時間中的任一個：約12小時、約18小時、約24小時、約30小時或約36小時。在一些實施例中，將樹突細胞與非病毒基因療法藥劑一起培育約12小時與約36小時、約18小時與約36小時、約24小時與約36小時、約30小時與約36小時、約12小時與約30小時、約18小時與約30小時、約24小時與約30小時、約12小時與約24小時、約18小時與約24小時、或約12小時與約18小時之間中的任一者的時間。
在一些態樣，本發明提供了用於判斷個體對非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括：a) 將來自所述個體的先天性免疫細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的所述非病毒基因療法藥劑一起培育約24小時，b) 分析所述先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的表現，其中與所述非病毒基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示對所述非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，從來自所述個體的周邊血液單核細胞中分離先天性免疫細胞。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞。在一些實施例中，樹突細胞源自個體的單核細胞(例如，CD14+單核細胞)。
在一些態樣，本發明提供了用於判斷個體對非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括：a) 將來自所述個體的樹突細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的所述非病毒基因療法藥劑一起培育約24小時，b) 分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的表現，其中與所述非病毒基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示對所述非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，從來自所述個體的周邊血液單核細胞中分離樹突細胞。在一些實施例中，樹突細胞源自個體的單核細胞(例如，CD14+單核細胞)。在一些實施例中，所述方法進一步包括從個體中分離單核細胞，並且在樹突細胞培養基中培育所述單核細胞以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，之後將樹突細胞與基因療法藥劑一起培育。
在一些態樣，本發明提供了用於判斷個體對非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括：a) 獲得來自所述個體的周邊血液單核細胞(PBMC)，b) 從所述PBMC中分離先天性免疫細胞，c) 將所述先天性免疫細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的所述非病毒基因療法藥劑一起培育約24小時，d) 分析所述先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的表現，其中與所述非病毒基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示對所述非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞。在一些實施例中，樹突細胞源自個體的單核細胞(例如，CD14+單核細胞)。
在一些態樣，本發明提供了用於判斷個體對非病毒基因療法藥劑(例如，LNP)的先天免疫原性的方法，所述方法包括：a) 獲得來自所述個體的周邊血液單核細胞(PBMC)，b) 從所述PBMC中分離CD14+單核細胞，c) 將所述單核細胞在樹突細胞培養基中培育約7-8天以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，d) 將所述樹突細胞重新鋪板，e) 將所述樹突細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的所述非病毒基因療法藥劑一起培育約24小時，f) 分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的表現，其中與所述基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示對所述基因療法藥劑的先天免疫原性。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。
在一些實施例中，從來自個體的PBMC中分離單核細胞。在一些實施例中，單核細胞是CD14+單核細胞。在一些實施例中，將單核細胞用樹突細胞培養基培育約5至約10天或約7至約8天以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞。在一些實施例中，將單核細胞用樹突細胞培養基培育約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或多於12天中的任一個以衍生來自單核細胞的樹突細胞。在一些實施例中，在與步驟c) 的所述基因療法藥劑一起培育之前將樹突細胞重新鋪板。在一些實施例中，在與基因療法藥劑一起培育之前，將所述樹突細胞重新鋪板到微孔盤中。
在一些實施例中，從獲自個體或多個個體的樣品中分離細胞(例如，PBMC、單核細胞和/或樹突細胞)。如本文所用，從個體獲得的“樣品”包括可以用於從一個或多個個體獲得PBMC、單核細胞和/或樹突細胞(如血液、尿液和/或組織)的任何合適的樣品。在一些實施例中，細胞獲自個體(例如，需要用基因療法藥劑治療(或已經用其治療)的個體)的血液。在一些實施例中，從經富集白細胞單采術產物中分離PBMC。在一些實施例中，使用Ficoll梯度從血液中分離PBMC。在一些實施例中，從Ficoll梯度收集含有白細胞和血小板的血沈棕黃層。在一些實施例中，在培養之前洗滌PBMC。在一些實施例中，在培養之前將PBMC洗滌一次、兩次、三次、四次、五次或多於五次。在一些實施例中，在培養之前用磷酸鹽緩衝鹽水洗滌細胞。在一些實施例中，在培養之前PBS進一步含有胎牛血清(FBS)或胎牛犢血清(FCS)。在一些實施例中，將FBC和/或FCS以約0.1%至約10%(v/v)之間的終濃度添加到PBS中。在一些實施例中，將FBC和/或FCS以約1%(v/v)的終濃度添加到PBS中。
在本發明的一些實施例中，從PBMC中分離單核細胞。在一些實施例中，從PBMC中分離CD14+單核細胞。在一些實施例中，通過親和純化從PBMC中分離單核細胞(例如，CD14+單核細胞)。在一些實施例中，使用特異性結合CD14的抗體從PBMC中分離CD14+單核細胞。在一些實施例中，抗CD14抗體附著於固體支持物(如珠或樹脂)。在一些實施例中，使用附著在磁珠上的抗CD14抗體從PBMC中純化CD14+抗體。在一些實施例中，磁珠是CD14微珠(Milteny Biotech)。
在本發明的一些實施例中，從PBMC純化的單核細胞(例如，CD14+單核細胞)分化為樹突細胞。在一些實施例中，通過在有利於分化為樹突細胞的細胞激素的存在下培育單核細胞，將來自PBMC的單核細胞分化為樹突細胞。在一些實施例中，通過將單核細胞在ImmunoCult™ DC分化培養基中培育約五天而從單核細胞衍生樹突細胞。在一些實施例中，ImmunoCult™ DC分化培養基進一步包含ImmunoCult™ DC分化補充劑。在一些實施例中，約五天后將ImmunoCult™ DC成熟補充劑添加到培養物中。在一些實施例中，在約第7天收穫分化的樹突細胞以用於本發明的測定。
在一些實施例中，將先天性免疫細胞(例如，樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或NK細胞)與病毒基因療法藥劑以1 × 10 3至約1 × 10 5或約1 × 10 4的MOI培育。在一些實施例中，將先天性免疫細胞與基因療法藥劑以少於約1 × 10 3、5 × 10 3、1 × 10 4、5 × 10 4、1 × 10 5或5 × 10 5中的任一個的MOI培育。
在一些實施例中，將先天性免疫細胞(例如，樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或NK細胞)與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的非病毒基因療法藥劑一起培育。在一些實施例中，將先天性免疫細胞與以下濃度的非病毒基因療法藥劑一起培育：約1 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約100 ng/mL、約100 ng/mL至約1 µg/mL、約1 µg/mL至約10 µg/mL、約10 µg/mL至約100 µg/mL、或約100 µg/mL至約1 mg/mL。
在一些實施例中，將先天性免疫細胞(例如，樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或NK細胞)與基因療法藥劑一起培育約12小時至約36小時或約24小時。在一些實施例中，將樹突細胞與基因療法藥劑一起培育約6小時與約48小時、約6小時與約36小時、約6小時與約24小時、約6小時與約18小時、約6小時與約12小時、約12小時與約48小時、約12小時與約36小時、約12小時與約24小時、約12小時與約18小時、約18小時與約48小時、約18小時與約36小時、約18小時與約24小時、約24小時與約48小時、約24小時與約36小時、或約36小時與約48小時之間。
在一些實施例中，通過使來自一個個體或多個個體的特定免疫細胞與基因療法藥劑接觸並且判斷與先天性免疫反應相關的一種或多種細胞激素的改變(例如，增加/減少)的表現，來針對基因療法藥劑判斷特定免疫細胞(例如，樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞、NK細胞等)中的細胞激素特徵，其中一種或多種細胞激素表現變化(例如，表現增加或減少)的共性指示細胞激素特徵的存在。在一些實施例中，與先天性免疫反應相關的細胞激素與toll樣受體(TLR)途徑(例如，TLR2、TLR3、TLR4或TLR9途徑)相關。在一些實施例中，細胞激素特徵包括多於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種細胞激素中的任一者的表現變化。在一些實施例中，多個個體包含多於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個個體中的任一者。在一些實施例中，表現變化的共性包括在多個個體中大於約25%、50%、75%或90%的個體中先天性免疫細胞中細胞激素表現水平的相似變化。
在一些實施例中，本發明提供了判斷基因療法藥劑的細胞激素特徵的方法，所述方法包括a) 將來自一個或多個個體的一種或多種先天性免疫細胞(例如，樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞、NK細胞等)與所述基因療法藥劑一起培育，b) 與合適的對照相比，分析所述一種或多種先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的改變(例如，增加/減少)的表現，其中步驟b) 中所述一種或多種細胞激素的改變的表現指示所述基因療法藥劑的細胞激素特徵。在一些實施例中，先天性免疫細胞獲自來自一個或多個個體的血液樣品。在一些實施例中，先天性免疫細胞獲自來自一個或多個個體的PBMC。在一些實施例中，基因療法藥劑是病毒顆粒或脂質奈米顆粒。在一些實施例中，基因療法藥劑是腺相關病毒(AAV)顆粒、腺病毒顆粒、慢病毒顆粒或單純皰疹病毒(HAV)顆粒。在一些實施例中，基因療法藥劑是脂質奈米顆粒或脂質體。
在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的一種或多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的兩種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的三種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的四種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。
在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2中的一種或多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2中的兩種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2中的三種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、IL2和IL6的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、IL2和TNFα的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、IL2、IL6和TNFα的表現增加。
在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞，並且細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的一種或多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的兩種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的三種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的四種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。
在一些實施例中，先天性免疫細胞是樹突細胞，並且細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2中的一種或多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2中的兩種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2中的三種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、IL2和IL6的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、IL2和TNFα的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、IL2、IL6和TNFα的表現增加。
在一些實施例中，與在不存在基因療法藥劑的情況下培育的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現相比，或者與來自與基因療法藥劑一起培育之前的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現相比，細胞激素特徵中細胞激素的表現增加，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的一種或多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的兩種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的三種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的四種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。在一些實施例中，表現增加約10%、約20%、約25%、約50%、約75%、約100%或大於100%中的任一個鑒定出用基因療法藥劑和先天性免疫反應調節劑(例如，IRAK調節劑)治療的個體。
在一些實施例中，與在不存在基因療法藥劑的情況下培育的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現相比，或者與來自與基因療法藥劑一起培育之前的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現相比，細胞激素特徵中細胞激素的表現增加，其中所述細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2中的一種或多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2中的兩種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2中的三種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、IL2和IL6的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、IL2和TNFα的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、IL2、IL6和TNFα的表現增加。在一些實施例中，表現增加約10%、約20%、約25%、約50%、約75%、約100%或大於100%中的任一個鑒定出用基因療法藥劑和先天性免疫反應調節劑(例如，IRAK調節劑)治療的個體。
在一些實施例中，與在不存在基因療法藥劑的情況下培育的樹突細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現相比，或者與來自與基因療法藥劑一起培育之前的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現相比，細胞激素特徵中細胞激素的表現增加，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的一種或多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的兩種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的三種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的四種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。在一些實施例中，表現增加約10%、約20%、約25%、約50%、約75%、約100%或大於100%中的任一個鑒定出用基因療法藥劑和先天性免疫反應調節劑(例如，IRAK調節劑)治療的個體。
在一些實施例中，與在不存在基因療法藥劑的情況下培育的樹突細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現相比，或者與來自與基因療法藥劑一起培育之前的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現相比，細胞激素特徵中細胞激素的表現增加，其中所述細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2中的一種或多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2中的兩種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2中的三種或更多種的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、IL2和IL6的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、IL2和TNFα的表現增加。在一些實施例中，細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、IL2、IL6和TNFα的表現增加。在一些實施例中，表現增加約10%、約20%、約25%、約50%、約75%、約100%或大於100%中的任一個鑒定出用基因療法藥劑和先天性免疫反應調節劑(例如，IRAK調節劑)治療的個體。 基因療法藥劑
在一些態樣，本發明提供了用於在個體改進的基因療法中判斷對基因療法藥劑的先天免疫原性的方法；例如，通過鑒定出其中被組合投予調節對基因療法藥劑的先天性免疫反應的藥劑與基因療法藥劑(依序(在基因療法藥劑之前或之後)、同時)的個體。如本文所用，“調節”先天性免疫反應是指例如部分地或完全地刺激、延遲抑制和/或抑制先天性免疫反應。在一些實施例中，IRAK調節劑用於抑制個體的先天性免疫反應。在一些實施例中，基因療法藥劑是病毒顆粒或脂質奈米顆粒。在一些實施例中，基因療法藥劑是腺相關病毒(AAV)顆粒、腺病毒顆粒、慢病毒顆粒或單純皰疹病毒(HAV)顆粒。在一些實施例中，基因療法藥劑是脂質奈米顆粒或脂質體。 AAV
在一些實施例中，本發明提供了用於判斷個體對AAV顆粒的先天免疫原性的方法。在用於基因療法的AAV顆粒中，將編碼異源核酸(例如，治療性轉基因)的重組AAV(rAAV)基因體包裹在AAV衣殼中。在一些實施例中，病毒基因體包含在轉錄方向上可操作地連接的異源核酸和/或一種或多種以下組分：控制序列(包括轉錄起始序列和終止序列)，從而形成表現盒。
在一些實施例中，rAAV基因體包含一個或多個AAV末端反向重複(ITR)序列(通常為兩個AAV ITR序列)。例如，表現盒可以在5'和3'端側接至少一個功能性AAV ITR序列。“功能性AAV ITR序列”意指旨在用於挽救、複製和包裝AAV病毒粒子的ITR序列功能。參見Davidson等人, PNAS, 2000, 97(7)3428-32；Passini等人, J. Virol., 2003, 77(12):7034-40；和Pechan等人, Gene Ther., 2009, 16:10-16，將其全部通過引用以其整體併入本文。為了實施本發明的一些態樣，重組病毒基因體至少包含所有對於包裹到AAV衣殼中所必需的AAV序列和用於由AAV顆粒感染的物理結構。用於本發明的載體的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列(例如，如Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801中所描述的)，並且可以通過核苷酸的插入、缺失或取代而改變，或者AAV ITR可以源自幾種AAV血清型中的任何一種。目前已知超過40種AAV血清型，並且仍在鑒定出新的血清型和現有血清型的變體。參見Gao等人, PNAS, 2002, 99(18): 11854-6；Gao等人, PNAS, 2003, 100(10):6081-6；和Bossis等人, J. Virol., 2003, 77(12):6799-810。使用任何AAV血清型都被視為在本發明的範圍之內。在一些實施例中，rAAV載體是源自AAV血清型的載體，包括而不限於AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV LK03、AAV2R471A、AAV DJ、AAV DJ8、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV ITR等。在一些實施例中，AAV(例如，rAAV載體)中的核酸包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV LK03、AAV2R471A、AAV DJ、AAV DJ8、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV ITR等的ITR。在一些實施例中，AAV顆粒包含編碼側接一個或多個AAV ITR的異源轉基因的AAV載體。
在一些實施例中，AAV顆粒包含選自以下的衣殼蛋白：AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV4衣殼、AAV5衣殼、AAV6衣殼、AAV7衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8衣殼、AAV9衣殼、AAV10衣殼、AAVrh10衣殼、AAV11衣殼、AAV12衣殼、AAVrh32.33衣殼、AAV-XL32衣殼、AAV-XL32.1衣殼、AAV LK03衣殼、AAV2R471A衣殼、AAV2/2-7m8衣殼、AAV DJ衣殼、AAV DJ8衣殼、AAV2 N587A衣殼、AAV2 E548A衣殼、AAV2 N708A衣殼、AAV V708K衣殼、山羊AAV衣殼、AAV1/AAV2嵌合衣殼、牛AAV衣殼、小鼠AAV衣殼、rAAV2/HBoV1(嵌合AAV/人類博卡病毒屬病毒1)、AAV2HBKO衣殼、AAVPHP.B衣殼或AAVPHP.eB衣殼或其功能變體。AAV衣殼的“功能變體”意指該變體衣殼能夠包裝AAV基因體以產生感染性AAV病毒粒子。在另外的實施例中，rAAV顆粒包含來自進化枝A-F的AAV血清型的衣殼蛋白。
在一些態樣，本發明提供了包含重組自身互補型基因體(例如，自身互補的或自身互補型AAV載體)的AAV顆粒。具有自身互補型載體基因體的rAAV病毒顆粒和使用自身互補的AAV基因體的方法描述在美國專利號6,596,535；7,125,717；7,465,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054；和8,361,457；和Wang Z., 等人, (2003) Gene Ther10:2105-2111中，將其各自通過引用以其整體併入本文。包含自身互補型基因體的AAV顆粒將借助其部分互補的序列(例如，異源核酸的互補編碼股和非編碼股)迅速形成雙股DNA。在一些實施例中，載體包含編碼異源核酸的第一核酸序列和編碼該核酸的互補序列的第二核酸序列，其中第一核酸序列可以與第二核酸序列沿著其大部分或所有長度形成股內鹼基對。
在一些實施例中，第一異源核酸序列和第二異源核酸序列通過突變的ITR(例如，右ITR)連接。在一些實施例中，ITR包含多核苷酸序列5’-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG - 3’(SEQ ID NO:1)。突變的ITR包含含有末端解股序列的D區的缺失。因此，在複製rAAV基因體時，rep蛋白將不會在突變的ITR處切割病毒基因體，並且因此，以5'至3'順序包含以下的重組病毒基因體將被包裝在病毒衣殼中：AAV ITR、包括調節序列的第一異源多核苷酸序列、突變的AAV ITR、與第一異源多核苷酸反向的第二異源多核苷酸和第三AAV ITR。
使用不同的AAV血清型優化特定靶細胞的轉導或靶向特定靶組織(例如，病變組織)內的特定細胞類型。AAV顆粒可以包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。例如，AAV顆粒可以含有源自相同AAV血清型的一個或多個ITR和衣殼，或者AAV顆粒可以含有源自與AAV顆粒衣殼不同的AAV血清型的一個或多個ITR。
在一些實施例中，AAV衣殼包含突變，例如衣殼包含突變型衣殼蛋白。在一些實施例中，突變是酪胺酸突變或肝素結合突變。在一些實施例中，突變型衣殼蛋白保留形成AAV衣殼的能力。在一些實施例中，AAV顆粒包含AAV2或AAV5酪胺酸突變型衣殼(參見例如，Zhong L.等人, (2008) Proc Natl Acad Sci U S A105(22):7827-7832)，如Y444或Y730中的突變(根據AAV2編號)。在另外的實施例中，AAV顆粒包含來自進化枝A-F的AAV血清型的衣殼蛋白(Gao等人 , J. Virol. 2004, 78(12):6381)。
在本領域中已知許多方法用於產生用於基因療法的AAV顆粒，包括轉染、穩定細胞株生產和感染性雜交病毒生產系統，該系統包括腺病毒-AAV雜合體、皰疹病毒-AAV雜合體(Conway, JE等人, (1997) J. Virology71(11):8780-8789)和桿狀病毒-AAV雜合體(Urabe, M.等人, (2002) Human Gene Therapy13(16):1935-1943；Kotin, R. (2011) Hum Mol Genet. 20(R1): R2-R6)。用於產生AAV顆粒的AAV生產培養物都需要：1) 合適的宿主細胞；2) 合適的輔助病毒功能；3) AAV rep和cap基因和基因產物；4) 側接至少一個AAV ITR序列的核酸(如治療性核酸)；以及5) 支持產生AAV的合適的培養基和培養基組分。在一些實施例中，合適的宿主細胞是靈長類動物宿主細胞。在一些實施例中，合適的宿主細胞是人源細胞株，如HeLa、A549、293或Perc.6細胞。在一些實施例中，合適的輔助病毒功能由野生型或突變體腺病毒(如溫度敏感性腺病毒)、皰疹病毒(HSV)、桿狀病毒或提供協助工具的質體構建體提供。在一些實施例中，AAV rep和cap基因產物可以來自任何AAV血清型。通常但不是必須的，AAV rep基因產物與rAAV基因體的ITR具有相同血清型，只要rep基因產物可以發揮複製和包裝rAAV基因體的作用即可。本領域中已知的合適的培養基可以用於產生AAV顆粒。在一些實施例中，AAV協助工具由腺病毒或HSV提供。在一些實施例中，AAV協助工具由桿狀病毒提供，並且宿主細胞是昆蟲細胞(例如，草地貪夜蛾( Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞)。
用於產生AAV顆粒的一種方法是三重轉染方法。簡而言之，可以將含rep基因和衣殼基因的質體連同輔助腺病毒質體轉染(例如利用磷酸鈣法)到細胞株(例如，HEK-293細胞)中，並可以收集並任選地純化病毒。因此，在一些實施例中，通過將編碼AAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸以及編碼AAV輔助病毒功能的核酸三重轉染到宿主細胞中來產生AAV顆粒，其中核酸向宿主細胞的轉染得到能夠產生AAV顆粒的宿主細胞。
在一些實施例中，AAV顆粒可以通過生產細胞株方法產生(參見Martin等人, (2013) Human Gene Therapy Methods24:253-269；美國專利授予前公開號US2004/0224411；和Liu, X.L. 等人 (1999) Gene Ther.6:293-299)。簡而言之，可以用含有rep基因、衣殼基因和包含啟動子-異源核酸序列的載體基因體的質體穩定地轉染細胞株(例如，HeLa、293、A549或Perc.6細胞株)。可以篩選細胞株，以選擇用於AAV產生的前導殖株(lead clone)，然後可以將其擴增至生產生物反應器，並且用輔助病毒(例如，腺病毒或HSV)感染，以啟動AAV生產。隨後可以收穫病毒，可以使腺病毒失活(例如，通過加熱)和/或去除，並且可以純化AAV顆粒。因此，在一些實施例中，通過包含編碼rAAV基因體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸中的一種或多種的生產細胞株產生AAV顆粒。
在一些實施例中，編碼AAV rep和cap基因和/或AAV病毒基因體的核酸穩定地維持在生產細胞株中。在一些實施例中，將編碼AAV rep和cap基因和/或rAAV基因體的核酸在一種或多種質體上引入細胞株中以產生生產細胞株。在一些實施例中，將AAV rep、AAV cap和AAV基因體在相同質體上引入細胞中。在其他實施例中，將AAV rep、AAV cap和rAAV基因體在不同質體上引入細胞中。在一些實施例中，用質體穩定地轉染的細胞株在細胞株的多次傳代(例如，5、10、20、30、40、50或超過50次細胞傳代)中維持質體。例如，所述一種或多種質體可以在細胞複製時複製，或者所述一種或多種質體可以整合到細胞基因體中。已經鑒定了使質體能夠在細胞(例如，人細胞)中自主複製的多種序列(參見例如，Krysan, P.J.等人 (1989) Mol. Cell Biol. 9:1026-1033)。在一些實施例中，所述一種或多種質體可以含有允許對維持質體的細胞進行選擇的選擇性標記物(例如，抗生素抗性標記物)。通常用於哺乳動物細胞的選擇性標記物包括而不限於殺稻瘟素、G418、潮黴素B、博萊黴素、嘌呤黴素及其衍生物。用於將核酸引入細胞中的方法在本領域中是已知的，並且包括而不限於病毒轉導、陽離子轉染(例如，使用陽離子聚合物如DEAE-葡聚糖或陽離子脂質如lipofectamine)、磷酸鈣轉染、顯微注射、粒子轟擊、電穿孔和奈米顆粒轉染(關於更多細節，參見例如，Kim, T.K.和Eberwine, J.H. (2010) Anal. Bioanal. Chem. 397:3173-3178)。
在一些實施例中，生產細胞株源自靈長類動物細胞株(例如，非人靈長類動物細胞株，如Vero或FRhL-2細胞株)。在一些實施例中，細胞株源自人細胞株。在一些實施例中，生產細胞株源自HeLa、293、A549或PERC.6®(Crucell)細胞。例如，在將編碼AAV rep和cap基因和/或rAAV基因體的核酸引入和/或穩定維持/整合到細胞株中以產生生產細胞株之前，細胞株是HeLa、293、A549或PERC.6®(Crucell)細胞株或其衍生物。
在一些實施例中，生產細胞株適於在懸浮液中生長。如在本領域中已知的，錨定依賴性細胞通常不能在沒有基質(如微載劑珠)的情況下在懸浮液中生長。使細胞株適於在懸浮液中生長可以包括，例如，於具有攪拌槳的旋動培養中使細胞株生長，使用缺少鈣和鎂離子的培養基以防止結塊(和任選地消泡劑)，使用用滲矽化合物塗布的培養器皿，並且在每次傳代時選擇培養物中(而不是在大塊中或在器皿的側面上)的細胞。
本發明的AAV顆粒可以通過裂解生產培養物的宿主細胞或通過從生產培養物中收穫用過的培養基而從AAV生產培養物中收穫，條件是細胞在本領域中已知的引起AAV顆粒從完整細胞釋放到培養基中的條件下培養，如美國專利號6,566,118中更全面地描述的。裂解細胞的合適方法在本領域中也是已知的，並且包括例如多次冷凍/解凍循環、超聲處理、微流化和用化學品(如洗滌劑和/或蛋白酶)處理。
在另外的實施例中，純化AAV顆粒。如本文所用，術語“純化的”包括AAV顆粒的如下製劑，其缺乏至少一些也可以存在於AAV顆粒天然存在處或最初所製備的地方處的其他組分。因此，例如，分離的AAV顆粒可以使用純化技術使其從源混合物(如培養裂解物或生產培養上清液)富集而製備。能以多種方式測量富集情況，例如像根據溶液中存在的DNA酶抗性顆粒(DRP)或基因體拷貝(gc)的比例、或根據感染性，或者可以根據源混合物中存在的第二潛在干擾物質(如污染物，包括生產培養污染物或進程內污染物，包括輔助病毒、培養基組分等)來測量。
在一些實施例中，澄清AAV生產培養收穫物以除去宿主細胞碎片。在一些實施例中，通過經由一系列深度過濾器過濾來澄清生產培養收穫物，所述深度過濾器包括例如DOHC Millipore Millistak+ HC Pod級過濾器、A1HC Millipore Millistak+ HC Pod級過濾器和0.2 μm Filter Opticap XL1O Millipore Express SHC Hydrophilic Membrane過濾器。澄清也可以通過本領域中已知的多種其他標準技術來實現，如離心或通過本領域中已知的0.2 μm或更大孔徑的任何醋酸纖維素過濾器過濾。
在一些實施例中，用Benzonase ®進一步處理AAV生產培養收穫物以消化生產培養物中存在的任何高分子量DNA。在一些實施例中，Benzonase ®消化在本領域中已知的標準條件下進行，所述標準條件包括例如1-2.5單位/ml的Benzonase ®的終濃度，在範圍從環境溫度至37ºC的溫度下持續30分鐘至幾小時的時間段。
可以使用以下一個或多個純化步驟分離或純化AAV顆粒：平衡離心；流過式陰離子交換過濾；用於濃縮AAV顆粒的切向流過濾(TFF)；通過磷灰石層析捕獲AAV；輔助病毒的熱滅活；通過疏水相互作用層析捕獲AAV；通過尺寸排阻層析(SEC)進行緩衝液交換；奈米過濾；以及通過陰離子交換層析、陽離子交換層析或親和層析捕獲AAV。這些步驟可以單獨使用，以各種組合使用，或者以不同順序使用。在一些實施例中，所述方法以如下所述的順序包括所有步驟。純化AAV顆粒的方法見於例如以下文獻中：Xiao等人, (1998) Journal of Virology72:2224-2232；美國專利號6,989,264和8,137,948；和WO 2010/148143。 腺病毒
在一些實施例中，本發明提供了用於判斷個體對腺病毒顆粒的先天免疫的方法。用於基因療法的腺病毒載體通常是具有重組腺病毒(rAd)基因體的腺病毒顆粒，所述重組腺病毒基因體包含在被包裹到腺病毒衣殼中的兩個腺病毒ITR之間的一個或多個異源序列(即，非腺病毒來源的核酸)。在一些實施例中，異源序列編碼治療性轉基因。在一些實施例中，rAd基因體缺少一個或多個E1基因或包含一個或多個E1基因的缺陷拷貝，這使得腺病毒具有複製缺陷。腺病毒在大型(約950Å)無包膜二十面體衣殼內包括線性雙股DNA基因體。腺病毒具有大型基因體，可摻入超過30 kb異源序列(例如，替代E1和/或E3區)，使得它們特別適合與較大異源基因一起使用。還已知，它們感染分裂和非分裂細胞，且不會自然地整合到宿主基因體中(但雜合變體可具有這種能力)。在一些實施例中，腺病毒載體可以是具有以異源序列替代E1的第一代腺病毒載體。在一些實施例中，腺病毒載體可以是E2A、E2B和/或E4中具有額外突變或缺失的第二代腺病毒載體。在一些實施例中，腺病毒載體可以是第三代或內部破壞的(gutted)腺病毒載體，其缺失所有病毒編碼基因，只保留ITR和包裝信號，且需要反式輔助腺病毒進行複製和包裝。已經研究了將腺病毒顆粒用作暫態轉染哺乳動物細胞的載體以及基因療法載體。關於進一步說明，參見例如，Danthinne, X.和Imperiale, M.J. (2000) Gene Ther.7:1707-14以及Tatsis, N.和Ertl, H.C. (2004) Mol. Ther.10:616-29。
在一些實施例中，腺病毒顆粒包含含有治療性轉基因的rAd基因體。使用任何腺病毒血清型都被視為在本發明的範圍之內。在一些實施例中，腺病毒顆粒源自腺病毒血清型，包括而不限於AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu5、AdHu7、AdHu11、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、綿羊Ad和豬Ad 3型。腺病毒顆粒還包含衣殼蛋白。在一些實施例中，腺病毒顆粒包括一種或多種外來病毒衣殼蛋白。此類組合可以稱為假型腺病毒顆粒。在一些實施例中，用於假型腺病毒顆粒的外來病毒衣殼蛋白源自外來病毒或另一種腺病毒血清型。在一些實施例中，外來病毒衣殼蛋白源自(包括而不限於)呼腸孤病毒3型。用於假型腺病毒顆粒的載體和衣殼蛋白組合的例子可以見於以下參考文獻中(Tatsis, N.等人 (2004) Mol. Ther.10(4):616-629和Ahi, Y.等人 (2011) Curr. Gene Ther.11(4):307-320)。可使用不同的腺病毒血清型優化特定靶細胞的轉導或靶向特定靶組織(例如病變組織)內的特定細胞類型。由特定腺病毒血清型靶向的組織或細胞包括而不限於肺(例如HuAd3)、脾和肝(例如HuAd37)、平滑肌、滑膜細胞、樹突細胞、心血管細胞、腫瘤細胞株(例如HuAd11)和樹突細胞(例如經 呼腸孤病毒型 3 、 HuAd30 或 HuAd35假型化的HuAd5)。關於進一步說明，參見Ahi, Y.等人 (2011) Curr. Gene Ther.11(4):307-320，Kay, M.等人 (2001) Nat. Med.7(1):33-40以及Tatsis, N.等人 (2004) Mol. Ther.10(4):616-629。
本領域內已知許多生產腺病毒顆粒的方法。例如，對於內部破壞的腺病毒載體，可將腺病毒載體基因體和輔助腺病毒基因體轉染至包裝細胞株(例如，293細胞株)中。在一些實施例中，輔助腺病毒基因體可包含在其包裝信號側翼的重組位點，且可將兩個基因體轉染到表現重組酶的包裝細胞株中(例如，可使用Cre/loxP系統)，使得目的腺病毒載體的包裝效率高於輔助腺病毒(參見，例如Alba, R.等人 (2005) Gene Ther.12增刊1:S18-27)。可以使用標準方法收穫和純化腺病毒載體，諸如本文所述的那些。 慢病毒
在一些實施例中，本發明提供了用於判斷個體對慢病毒顆粒的先天免疫原性的方法。用於基因療法的慢病毒載體通常是具有重組慢病毒基因體的慢病毒顆粒，所述重組慢病毒基因體包含在兩個長末端重複序列(LTR)之間的一個或多個異源序列(即，非慢病毒來源的核酸序列)。在一些實施例中，異源序列編碼治療性轉基因。慢病毒是具有大約10 kb基因體的有義ssRNA逆轉錄病毒。慢病毒整合到分裂和非分裂細胞的基因體中。可如下生產慢病毒顆粒，例如，通過將多個質體(通常將慢病毒基因體和複製和/或包裝所需的基因分開以防止病毒複製)轉染到包裝細胞株中，所述包裝細胞株將修飾的慢病毒基因體包裝到慢病毒顆粒中。在一些實施例中，慢病毒顆粒可以指缺少包膜蛋白的第一代載體。在一些實施例中，慢病毒顆粒可以指缺少除gag/pol和tat/rev區以外的所有基因的第二代載體。在一些實施例中，慢病毒顆粒可以指第三代載體，其只含內源rev、gag和pol基因且具有用於在沒有tat基因的情況下進行轉導的嵌合LTR(參見Dull, T.等人 (1998) J. Virol.72:8463-71)。關於進一步說明，參見Durand, S.和Cimarelli, A. (2011) Viruses3:132-59。
使用任何慢病毒載體都被視為在本發明的範圍之內。在一些實施例中，慢病毒載體源自慢病毒，包括而不限於人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、人類免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、傑姆布拉納病(Jembrana disease)病毒(JDV)、綿羊髓鞘脫落病毒(VV)和山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)。慢病毒顆粒還包含衣殼蛋白。在一些實施例中，慢病毒顆粒包括一種或多種外來病毒衣殼蛋白。此類組合可稱為假型慢病毒顆粒。在一些實施例中，用於假型慢病毒顆粒的外來病毒衣殼蛋白源自外來病毒。在一些實施例中，用於假型慢病毒顆粒的外來病毒衣殼蛋白是水皰性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)。VSV-GP與無處不在的細胞受體相互作用，為假型慢病毒顆粒提供了廣泛組織向性。此外，認為VSV-GP為假型慢病毒顆粒提供了更高穩定性。在其他實施例中，外來病毒衣殼蛋白源自(包括而不限於)金迪普拉病毒、狂犬病毒、莫柯拉病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、辛德畢斯病毒、塞姆利基森林病毒(SFV)、委內瑞拉馬腦炎病毒、雷斯頓伊波拉病毒、薩伊伊波拉病毒、瑪律堡病毒、拉沙病毒、禽白血病病毒(ALV)、綿羊肺腺瘤逆轉錄病毒(JSRV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)、長臂猿白血病毒(GALV)、貓內源性逆轉錄病毒(RD114)、人T-嗜淋巴細胞病毒1(HTLV-1)、人泡沫病毒、綿羊髓鞘脫落病毒(MVV)、SARS-CoV、仙台病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人副流感病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、流感病毒、雞瘟病毒(FPV)或苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)。用於假型慢病毒顆粒的載體和衣殼蛋白組合的例子可見於例如Cronin, J.等人(2005). Curr. Gene Ther. 5(4):387-398。可使用不同的假型慢病毒顆粒優化特定靶細胞的轉導或靶向特定靶組織(例如病變組織)內的特定細胞類型。例如，由特定假型慢病毒顆粒靶向的組織包括而不限於肝(例如經VSV-G、LCMV、RRV或SeV F蛋白假型化)、肺(例如經伊波拉、瑪律堡、SeV F和HN或JSRV蛋白假型化)、胰島細胞(例如經LCMV蛋白假型化)、中樞神經系統(例如經VSV-G、LCMV、狂犬病或莫柯拉蛋白假型化)、視網膜(例如經VSV-G或莫柯拉蛋白假型化)、單核細胞或肌肉(例如經莫柯拉或伊波拉蛋白假型化)、造血系統(例如經RD114或GALV蛋白假型化)或癌細胞(例如經GALV或LCMV蛋白假型化)。關於進一步說明，參見Cronin, J.等人 (2005). Curr. Gene Ther.5(4):387-398以及Kay, M.等人 (2001) Nat. Med.7(1):33-40。
本領域內已知許多產生慢病毒顆粒的方法。例如，對於第三代慢病毒載體，含有帶gag和pol基因的目的重組慢病毒基因體的載體可與含rev基因的載體共同轉染到包裝細胞株(例如，293細胞株)中。目的重組慢病毒基因體還包含促進在不存在Tat的情況下進行轉錄的嵌合LTR(參見Dull, T.等人 (1998) J. Virol.72:8463-71)。可以使用本文所述的方法(例如，Segura MM, 等人, (2013) Expert Opin Biol Ther. 13(7):987-1011)收穫並且純化慢病毒載體。 HSV
在一些實施例中，本發明提供了用於判斷個體對HSV顆粒的先天免疫原性的方法。用於基因療法的HSV載體通常是具有重組HSV基因體的HSV顆粒，其包含在兩個末端重複序列(TR)之間的一個或多個異源序列(即，非HSV來源的核酸序列)。在一些實施例中，異源序列編碼治療性轉基因。HSV是具有大約152 kb基因體的包膜雙股DNA病毒。有利地，其大約一半的基因是非必需的，且可缺失以適應異源序列。HSV顆粒感染非分裂細胞。此外，它們自然地在神經元中建立潛伏期，通過逆向轉運行進，並可跨突觸轉移，使得它們有利於轉染神經元和/或有利於涉及神經系統的基因治療方法。在一些實施例中，HSV顆粒可以是複製缺陷型或複製型(例如，能夠通過使一種或多種晚期基因失活進行單次複製循環)。關於進一步說明，參見Manservigi, R.等人 (2010) Open Virol. J.4:123-56。
在一些實施例中，HSV顆粒包含含有轉基因的重組HSV基因體。使用任何HSV載體都被視為在本發明的範圍之內。在一些實施例中，HSV載體源自HSV血清型，包括而不限於HSV-1和HSV-2。HSV顆粒還包含衣殼蛋白。在一些實施例中，HSV顆粒包括一種或多種外來病毒衣殼蛋白。此類組合可稱為假型HSV顆粒。在一些實施例中，用於假型HSV顆粒的外來病毒衣殼蛋白源自外來病毒或來自另一種HSV血清型。在一些實施例中，在假型HSV顆粒中使用的外來病毒衣殼蛋白是水皰性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)。VSV-GP與無處不在的細胞受體相互作用，為假型HSV顆粒提供了廣泛組織向性。此外，認為VSV-GP為假型HSV顆粒提供了更高穩定性。其他實施例中，外來病毒衣殼蛋白可以來自不同HSV血清型。例如，HSV-1載體可以包含一種或多種HSV-2衣殼蛋白。可使用不同的HSV血清型優化特定靶細胞的轉導或靶向特定靶組織(例如病變組織)內的特定細胞類型。由特定腺病毒血清型靶向的組織或細胞包括而不限於中樞神經系統和神經元(例如HSV-1)。關於進一步說明，參見Manservigi, R.等人 (2010) Open Virol J4:123-156，Kay, M.等人 (2001) Nat. Med.7(1):33-40，以及Meignier, B.等人 (1987) J. Infect. Dis.155(5):921-930。
本領域內已知許多產生HSV顆粒的方法。可以使用標準方法收穫和純化HSV載體，諸如本文所述的那些。例如，對於複製缺陷型HSV載體，可將缺少所有即時早期(IE)基因的目的HSV基因體轉染到提供生產病毒所需基因(諸如ICP4、ICP27和ICP0)的補充細胞株中(參見例如，Samaniego, L.A.等人 (1998) J. Virol.72:3307-20)。可以使用所描述的方法收穫並純化HSV載體(例如，Goins, WF等人, (2014) Herpes Simplex Virus Methods in Molecular Biology 1144:63-79)。 非病毒基因療法藥劑
在一些實施例中，本發明提供了用於判斷對非病毒基因療法藥劑的先天性免疫反應的方法。非病毒載體遞送系統包括DNA質體、裸核酸和與遞送系統複合的核酸。例如，所述載體可以與脂質(例如陽離子或中性脂質)、脂質體、聚陽離子、脂質奈米顆粒或增強細胞對核酸的攝取的試劑複合。所述核酸可以與適用於本文所述任何遞送方法的試劑複合。在一些實施例中，核酸編碼治療性轉基因。
用於基因療法的脂質奈米顆粒通常包含包封在脂質顆粒中的載體基因體或與脂質複合的載體基因體。在一些實施例中，異源序列編碼治療性轉基因。在一些實施例中，將載體基因體配製在陽離子脂質體/核酸複合物(lipoplex)奈米顆粒或脂質體中。在一些實施例中，用於基因療法藥劑的陽離子脂質體/核酸複合物奈米顆粒配製品包含合成性陽離子脂質(R)-N,N,N-三甲基-2,3-二油醯基氧基-1-丙基氯化銨(DOTMA)和磷脂1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一些實施例中，DOTMA/DOPE脂質體組分被優化用於遞送和靶向個體中的細胞。
在一些實施例中，將包含載體基因體的核酸與包含一種或多種陽離子脂質(包括例如，(R)-N,N,N-三甲基-2,3-二油醯基氧基-1-丙基氯化銨(DOTMA)和磷脂1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE))的醫藥組合物混合。在一些實施例中，醫藥組合物包含至少一種脂質。在一些實施例中，醫藥組合物包含至少一種陽離子脂質。陽離子脂質可以是單陽離子的或多陽離子的。任何陽離子兩親分子(例如，包含至少一個親水性和親脂性部分的分子)是本發明意義內的陽離子脂質。在一些實施例中，正電荷由至少一種陽離子脂質貢獻並且負電荷由核酸貢獻。在一些實施例中，醫藥組合物包含至少一種輔助脂質。輔助脂質可以是中性脂質或陰離子脂質。輔助脂質可以是天然脂質(如磷脂或天然脂質的類似物)或完全合成的脂質或類脂分子，與天然脂質沒有相似之處。在一個實施例中，陽離子脂質和/或輔助脂質是形成雙層的脂質。輔助脂質的例子包括但不限於1,2-二-(9Z-十八碳烯醇)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其類似物或衍生物、膽固醇(Chol)或其類似物或衍生物和/或1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)或其類似物或衍生物。
在一些實施例中，至少一種陽離子脂質與至少一種輔助脂質的莫耳比為10 : 0至3 : 7，優選9 : 1至3 : 7、4 : 1至1 : 2、4 : 1至2 : 3、7 : 3至1 : 1或2 : 1至1 : 1，優選約1 : 1。在一些實施例中，在該比率中，陽離子脂質的莫耳量由陽離子脂質的莫耳量乘以陽離子脂質中的正電荷數得出。
在一些實施例中，脂質被包含在包封載體基因體的囊泡中。囊泡可以是多層囊泡、單層囊泡或其混合物。囊泡可以是脂質體。 載體基因體
在一些實施例中，本發明提供了用於判斷對用於將治療性轉基因遞送至個體中的期望靶標的基因療法藥劑的先天性免疫反應的方法。在一些實施例中，基因療法藥劑包含用於在個體的所需靶標中遞送和表現的治療性轉基因的載體基因體。
本發明考慮了基因療法藥劑用於引入一種或多種編碼治療性多肽和/或核酸的核酸序列以便包裝到病毒顆粒(針對病毒基因療法藥劑)中的用途。載體基因體可以包括建立治療性多肽和/或核酸的表現的任何元件，例如啟動子、本揭露的ITR、核糖體結合元件、終止子、增強子、選擇性標記物、內含子、polyA信號和/或複製起點。
在一些實施例中，治療性轉基因編碼治療性多肽。治療性多肽可以例如提供在細胞或生物體中不存在或以降低的水平存在的多肽和/或酶活性。可替代地，治療性多肽可以提供間接抵消細胞或生物體中的失衡的多肽和/或酶活性。例如，用於與代謝酶或活性缺陷引起的代謝物累積相關的病症的治療性多肽可以提供缺失的代謝酶或活性，或者它可以提供導致代謝物減少的替代代謝酶或活性。治療性多肽還可以通過例如作為顯性失活多肽起作用而用於降低多肽(例如，過表現、通過功能獲得性突變啟動或其活性以其他方式被錯誤調節的多肽)的活性。
本發明的載體基因體可以編碼作為細胞內蛋白質、錨定在細胞膜內、保留在細胞內或由用本發明的載體轉導的細胞分泌的多肽。對於由接受載體的細胞分泌的多肽，多肽可以是可溶的(即，不附著於細胞)。例如，可溶性多肽缺乏跨膜區並且從細胞分泌。鑑別和去除編碼跨膜結構域的核酸序列的技術是本領域中已知的。
在一些實施例中，本發明的載體基因體編碼用於治療個體的疾病或病症的多肽。由本發明的基因療法藥劑治療的疾病和病症包括但不限於亨廷頓病(HD)、進行性核上性麻痹(PSP)、多系統萎縮症(MSA)、異染性腦白質營養不良(MLD)、肌萎縮側索硬化(ALS)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、先天性肌營養不良(CMD)、苯丙酮尿症(PKU)、肌營養不良(MD)、A1AT缺乏、局部節段性腎小球硬化症(FSGS)、胱胺酸尿症、血友病A、血友病B、高歇病(GBA)、帕金森病(PD)和龐貝病。
在一些實施例中，治療性多肽是亨廷頓蛋白(HTT)、tau、澱粉樣前體蛋白、α-突觸核蛋白、假芳基硫酸酯酶(ARSA)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、苯丙胺酸羥化酶(PAH)、抗肌萎縮蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)、半胱胺酸轉運蛋白、因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)、酸性β-葡糖苷酶、神經膠質源性生長因子(GDNF)、腦源性生長因子(BDNF)、酪胺酸羥化酶(TH)、GTP環水解酶(GTPCH)和/或胺基酸脫羧酶(AADC)或α-葡糖苷酶。
在一些實施例中，異源核酸編碼治療性核酸。在一些實施例中，治療性核酸可以包括而不限於siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA核酶(DNAzyme)。因此，治療性核酸可以編碼如下RNA，當從載體的核酸轉錄時，其可以通過干擾與本發明的病症相關的異常或過量蛋白質的轉譯或轉錄來治療病症。例如，本發明的核酸可以編碼通過高度特異性消除或減少編碼異常和/或過量蛋白質的mRNA來治療病症的RNA。治療性RNA序列包括RNAi、小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和/或核酶(如錘頭和髮夾核酶)，其可以通過高度特異性消除或減少編碼異常和/或過量蛋白質的mRNA來治療病症。
在一些實施例中，治療性多肽或治療性核酸用於治療CNS病症。不希望受理論束縛，認為治療性多肽或治療性核酸可以用於降低或消除其功能獲得與病症相關的多肽的表現和/或活性，或者增強多肽的表現和/或活性以補充與病症相關的缺陷(例如，其表現顯示相似或相關活性的基因的突變)。可以通過本發明的治療性多肽或治療性核酸治療的本發明的病症的非限制性例子(可以被靶向或提供的例示性基因提供在每種病症的圓括號中)包括中風( 例如，半胱天冬酶 -3 、 Beclin1 、 Ask1 、 PAR1 、 HIF1α 、 PUMA和/或Fukuda, A.M.和Badaut, J. (2013) Genes (Basel)4:435-456中描述的任何基因)、亨廷頓病(突變型 HTT)、癲癇( 例如， SCN1A 、 NMDAR 、 ADK和/或Boison, D. (2010) Epilepsia51:1659-1668中描述的任何基因)、帕金森病(α-突觸核蛋白)、葛雷克病(也稱為肌萎縮側索硬化症； SOD1)、阿茲海默病(tau，澱粉樣前體蛋白)、皮質基底節變性或CBD(tau)、皮質基底神經節變性或CBGD(tau)、額顳葉癡呆或FTD(tau)、進行性核上性麻痹或PSP(tau)、多系統萎縮症或MSA(α-突觸核蛋白)、腦癌(例如，腦癌中牽涉的突變型或過表現的致癌基因)和溶酶體貯積病(LSD)。本發明的病症可以包括涉及大面積皮質(例如，皮質的多於一個功能區域、皮質的多於一個葉和/或整個皮質)的那些。可以通過本發明的治療性多肽或治療性核酸治療的本發明的病症的其他非限制性例子包括創傷性腦損傷、酶功能病症症、精神病症(包括創傷後應激症候群)、神經變性疾病和認知病症(包括癡呆、自閉症和抑鬱症)。酶功能病症症包括而不限於腦白質營養不良(包括卡納萬病(Canavan’s disease))和下文描述的任何溶酶體貯積病。
在一些實施例中，治療性多肽或治療性核酸用於治療溶酶體貯積病。如在本領域中通常已知的，溶酶體貯積病是罕見的遺傳性代謝病症，其特徵在於溶酶體功能的缺陷。此類病症通常由適當的粘多糖、糖蛋白和/或脂質代謝所需的酶缺陷引起，導致溶酶體儲存的細胞材料的病理性積累。可以通過本發明的治療性多肽或治療性核酸治療的本發明的溶酶體貯積病的非限制性例子(可以被靶向或提供的例示性基因提供在每種病症的圓括號中)包括2型或3型高歇病(酸性β-葡糖苷酶， GBA)、GM1神經節苷脂貯積症(β-半乳糖苷酶-1， GLB1)、亨特病(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶， IDS)、克拉伯病(半乳糖神經醯胺酶， GALC)、甘露糖苷貯積症病(甘露糖苷酶，如α-D-甘露糖苷酶， MAN2B1)、β甘露糖苷貯積症(β-甘露糖苷酶， MANBA)、異染性腦白質營養不良病(假芳基硫酸酯酶A， ARSA)、粘脂質貯積症II/III型病(N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶， GNPTAB)、A型尼曼-皮克病(Niemann-Pick A disease)(酸性鞘磷脂酶， ASM)、C型尼曼-皮克病(尼曼-皮克C蛋白， NPC1)、龐貝病(酸性α-1,4-葡糖苷酶， GAA)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)(胺基己糖苷酶β亞基， HEXB)、A型聖菲利波病(Sanfilippo A disease)(N-磺基葡糖胺磺基水解酶， MPS3A)、B型聖菲利波病(N-α-乙醯胺基葡糖苷酶， NAGLU)、C型聖菲利波病(肝素乙醯輔酶A:α-胺基葡糖苷酶N-乙醯轉移酶， MPS3C)、D型聖菲利波病(N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶， GNS)、申德勒病(α-N-乙醯胺基半乳糖苷酶， NAGA)、斯萊病(β-葡糖醛酸糖苷酶， GUSB)、泰-薩克斯病(胺基己糖苷酶α亞基， HEXA)和沃爾曼病(溶酶體酸性脂肪酶， LIPA)。
在一些實施例中，治療性多肽編碼因子VIII、因子IX、肌微管素、存活運動神經元蛋白(SMN)、類視黃醇異構水解酶(RPE65)、NADH-泛醌氧化還原酶鏈4、脈絡膜缺損蛋白(CHM)、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶、精胺醯琥珀酸合成酶、β-珠蛋白、γ-珠蛋白、苯丙胺酸羥化酶、腎上腺腦白質營養不良蛋白(ALD)、抗肌萎縮蛋白、截短型抗肌萎縮蛋白、抗VEGF劑或其功能變體。
在一些實施例中，異源核酸可操作地連接至啟動子。例示性啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)即時早期啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子和CK6啟動子、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、TK啟動子、四環素反應型啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、嵌合肝臟特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子、巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-珠蛋白啟動子(CAG啟動子；Niwa等人, Gene, 1991, 108(2):193-9)和延伸因子1-α啟動子(EFl-α)啟動子(Kim等人, Gene, 1990, 91(2):217-23和Guo等人, Gene Ther., 1996, 3(9):802-10)。在一些實施例中，啟動子包含人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子或連接至雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子的巨細胞病毒增強子。啟動子可以是組成型、誘導型或阻抑型啟動子。在一些實施例中，本發明提供了包含編碼與CBA啟動子可操作地連接的本揭露的異源轉基因的核酸的重組載體。例示性啟動子和描述可見於例如美國專利授予前公開案20140335054。
組成型啟動子的例子包括而不限於逆轉錄勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子(任選地具有RSV增強子)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(任選地具有CMV增強子)[參見例如，Boshart等人, Cell, 41:521-530 (1985)]、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、13-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子和EFla啟動子[Invitrogen]。
誘導型啟動子允許調節基因表現，並且可以通過外源提供的化合物、環境因子(如溫度)或存在特定生理狀態(例如，急性期)、細胞的特定分化狀態或在僅複製細胞時進行調節。誘導型啟動子和誘導型系統可從多種商業來源獲得。已經描述了許多其他系統，並且可以由本領域技術人員容易地選擇。由外源提供的啟動子調節的誘導型啟動子的例子包括鋅誘導型綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(Dex)誘導型小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統(WO 98/10088)；蛻皮素昆蟲啟動子(No等人 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996))、四環素阻遏型系統(Gossen等人 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992))、四環素誘導型系統(Gossen等人 , Science, 268:1766-1769 (1995)，還參見Harvey等人 , Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998))、RU486誘導型系統(Wang等人 , Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)和Wang等人 , Gene Ther., 4:432-441 (1997))以及雷帕黴素誘導型系統(Magari等人 , J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))。在這種背景下可使用的仍其他類型的誘導型啟動子是通過特定生理狀態(例如，溫度、急性期)、細胞的特定分化狀態或在僅複製細胞時調節的那些。
在另一個實施例中，將使用用於轉基因的天然啟動子或其片段。當希望轉基因的表現應模擬天然表現時，可以使用天然啟動子。當必須暫時或發展地或以組織特異性方式或反應特定轉錄刺激物調節轉基因的表現時，可使用天然啟動子。在另外的實施例中，也可以使用其他天然表現控制元件，如增強子元件、多腺苷酸化位點或Kozak共有序列模擬天然表現。
在一些實施例中，調節序列賦予組織特異性基因表現能力。在一些情況下，組織特異性調節序列結合以組織特異性方式誘導轉錄的組織特異性轉錄因子。本領域中熟知此類組織特異性調節序列(例如，啟動子、增強子等)。
在一些實施例中，載體包含內含子。例如，在一些實施例中，內含子是源自雞β-肌動蛋白和兔β-珠蛋白的嵌合內含子。在一些實施例中，內含子是小鼠微小病毒(MVM)內含子。
在一些實施例中，載體包含多腺苷酸化(polyA)序列。多腺苷酸化序列的許多例子在本領域中是已知的，如牛生長激素(BGH)Poly(A)序列(參見例如，登錄號EF592533)、SV40多腺苷酸化序列和HSV TK pA多腺苷酸化序列。 套組和製品
如本文所述的基因療法藥劑(例如，AAV顆粒、腺病毒顆粒、慢病毒顆粒、HSV顆粒或脂質奈米顆粒)和/或用於分離如本文所述的樹突細胞的材料可以包含在被設計為例如用於在如本文所述的本發明的方法的一個中使用的套組或製品內。
在一些實施例中，套組或製品進一步包括使用分離的樹突細胞測定對基因療法藥劑的先天免疫原性的說明書。本文所述的套組或製品可以進一步包括從商業和用戶角度所需的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、注射筒和具有用於實施本文所述任何方法的說明書的包裝插頁。還可以包括合適的包裝材料，並且其可以是本領域中已知的任何包裝材料，包括例如小瓶(如密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、罐子、軟包裝(例如，密封的麥拉片(Mylar)或塑膠袋)等。可進一步將這些製品滅菌和/或密封。
在一些實施例中，套組或製品還含有一種或多種本文所述的緩衝液和/或醫藥上可接受的賦形劑(例如，如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub. Co.，新澤西州1991)中所述)。在一些實施例中，套組或製品包括一種或多種本文所述的醫藥上可接受的賦形劑、載劑、溶液和/或另外的成分。本文所述的套組或製品可以按單一單位劑量或按多劑量形式包裝。套組或製品的內容物通常配製成無菌的並且可以凍乾或作為基本上等滲的溶液提供。 例示性實施例
本發明包括以下列舉的實施例。
1.     一種判斷個體對基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括 a) 將來自所述個體的先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑一起培育， b) 與合適的對照相比，分析所述先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現，其中所述一種或多種細胞激素的改變的表現產生細胞激素特徵， 其中與所述基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示所述個體對所述基因療法藥劑的先天免疫原性。
2.     根據實施例1所述的方法，其中所述先天性免疫細胞是樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或自然殺手(NK)細胞。
3.     根據實施例1或2所述的方法，其中從來自所述個體的周邊血液單核細胞中分離所述先天性免疫細胞。
4.     根據實施例1-3中任一項所述的方法，其中所述先天性免疫細胞是樹突細胞。
5.     根據實施例4所述的方法，其中所述樹突細胞源自所述個體的單核細胞。
6.     根據實施例4或5所述的方法，其進一步包括從所述個體中分離單核細胞，並且在樹突細胞培養基中培育所述單核細胞以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，之後將所述樹突細胞與所述基因療法藥劑一起培育。
7.     根據實施例6所述的方法，其中所述單核細胞是CD14+單核細胞。
8.     根據實施例6或7所述的方法，其中將所述單核細胞用所述樹突細胞培養基培育約5至約10天或約7至約8天以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞。
9.     根據實施例1-8中任一項所述的方法，其中在與步驟b) 的所述基因療法藥劑一起培育之前將所述先天性免疫細胞重新鋪板。
10.   根據實施例9所述的方法，其中將所述先天性免疫細胞重新鋪板到微孔盤中。
11.   根據實施例1-10中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是病毒載體，並且其中將所述先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑以約1 × 10 3至約1 × 10 5或約1 × 10 4的MOI培育。
12.   根據實施例1-10中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是非病毒載體，並且其中將所述先天性免疫細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的非病毒載體一起培育。
13.   根據實施例1-12中任一項所述的方法，其中將所述先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑一起培育約12小時至約36小時或約24小時。
14.   根據實施例1-13中任一項所述的方法，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β的表現增加。
15.   根據實施例1-14中任一項所述的方法，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的一種或多種的表現增加。
16.   根據實施例1-15中任一項所述的方法，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α的表現增加。
17.   根據實施例1-15中任一項所述的方法，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β的表現增加。
18.   根據實施例1-17中任一項所述的方法，其中與合適的對照相比，所述細胞激素特徵中所述細胞激素的表現增加。
19.   根據實施例18所述的方法，其中所述合適的對照是來自未與所述基因療法藥劑一起培育的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現，或者其中所述合適的對照是來自與所述基因療法藥劑一起培育之前的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現。
20.   根據實施例1-10和13-19中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是病毒載體。
21.   一種判斷個體對病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括 a) 在其中單核細胞分化為樹突細胞的條件下，在樹突細胞培養基中培育來自所述個體的單核細胞， b) 將所述樹突細胞與所述病毒基因療法藥劑以約1 × 10 3至約1 × 10 5的MOI培育約12至約36小時， c) 與合適的對照相比，分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現，其中所述一種或多種細胞激素的改變的表現產生細胞激素特徵， 其中在與所述病毒基因療法藥劑一起培育後所述細胞激素特徵的表現指示所述個體對所述病毒基因療法藥劑的先天免疫原性，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。
22.   根據實施例21所述的方法，其中所述單核細胞獲自來自所述個體的周邊血液單核細胞。
23.   根據實施例21或22所述的方法，其中所述單核細胞是CD14+單核細胞。
24.   根據實施例21-23中任一項所述的方法，其中將所述單核細胞在樹突細胞培養基中培育約7-8天以使所述單核細胞分化為樹突細胞。
25.   根據實施例21-24中任一項所述的方法，其中將所述樹突細胞與所述病毒基因療法藥劑以約1 × 10 4的MOI培育。
26.   根據實施例21-25中任一項所述的方法，其中將所述樹突細胞與所述病毒基因療法藥劑一起培育約24小時。
27.   根據實施例20-26中任一項所述的方法，其中所述病毒載體是AAV顆粒。
28.   根據實施例27所述的方法，其中所述AAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV4衣殼、AAV5衣殼、AAV6衣殼、AAV7衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8衣殼、AAV9衣殼、AAV10衣殼、AAVrh10衣殼、AAV11衣殼、AAV12衣殼、AAVrh32.33衣殼、AAV-XL32衣殼、AAV-XL32.1衣殼、AAV LK03衣殼、AAV2R471A衣殼、AAV2/2-7m8衣殼、AAV DJ衣殼、AAV DJ8衣殼、AAV2 N587A衣殼、AAV2 E548A衣殼、AAV2 N708A衣殼、AAV V708K衣殼、山羊AAV衣殼、AAV1/AAV2嵌合衣殼、牛AAV衣殼、小鼠AAV衣殼、rAAV2/HBoV1(嵌合AAV/人類博卡病毒屬病毒1)、AAV2HBKO衣殼、AAVPHP.B衣殼或AAVPHP.eB衣殼或其功能變體。
29.   根據實施例28所述的方法，其中所述AAV衣殼包含酪胺酸突變、肝素結合突變或HBKO突變。
30.   根據實施例27-29中任一項所述的方法，其中所述AAV病毒顆粒包含含有一個或多個末端反向重複(ITR)的AAV基因體，其中所述一種或多種ITR是AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR或AAV12 ITR。
31.   根據實施例30所述的方法，其中所述AAV顆粒的所述一種或多種ITR和所述衣殼源自相同的AAV血清型。
32.   根據實施例30所述的方法，其中所述AAV顆粒的所述一種或多種ITR和所述衣殼源自不同的AAV血清型。
33.   根據實施例20-26中任一項所述的方法，其中所述病毒載體是腺病毒顆粒。
34.   根據實施例33所述的方法，其中所述腺病毒顆粒包含來自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、綿羊Ad或豬Ad 3型或其功能變體的衣殼。
35.   根據實施例20-26中任一項所述的方法，其中所述病毒載體是慢病毒顆粒。
36.   根據實施例35所述的方法，其中所述重組慢病毒顆粒經水皰性口炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、伊波拉病毒、瑪律堡病毒、莫柯拉病毒、狂犬病毒、RD114或其功能變體假型化。
37.   根據實施例20-26中任一項所述的方法，其中所述病毒載體是單純皰疹病毒(HSV)顆粒。
38.   根據實施例37所述的方法，其中所述HSV顆粒是HSV-1顆粒或HSV-2顆粒或其功能變體。
39.   根據實施例1-10和12-19中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是脂質奈米顆粒。
40.   一種判斷個體對非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括 a) 在其中單核細胞分化為樹突細胞的條件下，在樹突細胞培養基中培育來自所述個體的單核細胞， b) 將所述樹突細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的所述非病毒載體一起培育， c) 與合適的對照相比，分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現，其中所述一種或多種細胞激素的改變的表現產生細胞激素特徵， 其中在與所述非病毒基因療法藥劑一起培育後所述細胞激素特徵的表現指示所述個體對所述非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。
41.   根據實施例40所述的方法，其中所述單核細胞獲自來自所述個體的周邊血液單核細胞。
42.   根據實施例40或41所述的方法，其中所述單核細胞是CD14+單核細胞。
43.   根據實施例40-42中任一項所述的方法，其中將所述單核細胞在樹突細胞培養基中培育約7-8天以使所述單核細胞分化為樹突細胞。
44.   根據實施例40-43中任一項所述的方法，其中將所述樹突細胞與所述非病毒基因療法藥劑一起培育約12小時至約36小時或約24小時。
45.   根據實施例1-44中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑包含編碼異源轉基因的核酸。
46.   根據實施例45所述的方法，其中所述異源轉基因可操作地連接至啟動子。
47.   根據實施例46所述的方法，其中所述啟動子是組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導型啟動子。
48.   一種判斷基因療法藥劑的細胞激素特徵的方法，所述方法包括 a) 將來自一個或多個個體的一種或多種先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑一起培育， b) 與合適的對照相比，分析所述一種或多種先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現， 其中步驟b) 中所述一種或多種細胞激素的改變的表現指示所述基因療法藥劑的細胞激素特徵。
49.   根據實施例48所述的方法，其中所述先天性免疫細胞是樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或自然殺手(NK)細胞。
50.   根據實施例48或49所述的方法，其中從來自所述個體的周邊血液單核細胞中分離所述一種或多種先天性免疫細胞。
51.   根據實施例48-50中任一項所述的方法，其中所述先天性免疫細胞是樹突細胞。
52.   根據實施例51所述的方法，其中所述樹突細胞源自所述一個或多個個體的單核細胞。
53.   根據實施例51或52所述的方法，其進一步包括從所述一個或多個個體中分離單核細胞，並且在樹突細胞培養基中培育所述單核細胞以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，之後將所述樹突細胞與所述基因療法藥劑一起培育。
54.   根據實施例53所述的方法，其中所述單核細胞是CD14+單核細胞。
55.   根據實施例53或54所述的方法，其中將所述單核細胞用所述樹突細胞培養基培育約5至約10天或約7至約8天以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞。
56.   根據實施例48-55中任一項所述的方法，其中在與步驟b) 的所述基因療法藥劑一起培育之前將所述先天性免疫細胞重新鋪板。
57.   根據實施例48-56中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是病毒載體，並且其中將所述先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑以約1 × 10 3至約1 × 10 5或約1 × 10 4的MOI培育。
58.   根據實施例48-56中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是非病毒載體，並且其中將所述先天性免疫細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的非病毒載體一起培育。
59.   根據實施例48-58中任一項所述的方法，其中將所述先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑一起培育約12小時至約36小時或約24小時。
60.   根據實施例48-59中任一項所述的方法，其中與合適的對照相比，所述細胞激素特徵中所述細胞激素的表現增加。
61.   根據實施例60所述的方法，其中所述合適的對照是來自未與所述基因療法藥劑一起培育的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現，或者其中所述合適的對照是來自與所述基因療法藥劑一起培育之前的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現。
62.   根據實施例48-57和59-61中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是病毒載體。
63.   根據實施例57或62所述的方法，其中所述病毒載體是AAV顆粒。
64.   根據實施例63所述的方法，其中所述AAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV4衣殼、AAV5衣殼、AAV6衣殼、AAV7衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8衣殼、AAV9衣殼、AAV10衣殼、AAVrh10衣殼、AAV11衣殼、AAV12衣殼、AAVrh32.33衣殼、AAV-XL32衣殼、AAV-XL32.1衣殼、AAV LK03衣殼、AAV2R471A衣殼、AAV2/2-7m8衣殼、AAV DJ衣殼、AAV DJ8衣殼、AAV2 N587A衣殼、AAV2 E548A衣殼、AAV2 N708A衣殼、AAV V708K衣殼、山羊AAV衣殼、AAV1/AAV2嵌合衣殼、牛AAV衣殼、小鼠AAV衣殼、rAAV2/HBoV1(嵌合AAV/人類博卡病毒屬病毒1)、AAV2HBKO衣殼、AAVPHP.B衣殼或AAVPHP.eB衣殼或其功能變體。
65.   根據實施例64所述的方法，其中所述AAV衣殼包含酪胺酸突變、肝素結合突變或HBKO突變。
66.   根據實施例63-65中任一項所述的方法，其中所述AAV病毒顆粒包含含有一個或多個末端反向重複(ITR)的AAV基因體，其中所述一種或多種ITR是AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR或AAV12 ITR。
67.   根據實施例66所述的方法，其中所述AAV顆粒的所述一種或多種ITR和所述衣殼源自相同的AAV血清型。
68.   根據實施例66所述的方法，其中所述AAV顆粒的所述一種或多種ITR和所述衣殼源自不同的AAV血清型。
69.   根據實施例57或62所述的方法，其中所述病毒載體是腺病毒顆粒。
70.   根據實施例69所述的方法，其中所述腺病毒顆粒包含來自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、綿羊Ad或豬Ad 3型或其功能變體的衣殼。
71.   根據實施例57或62所述的方法，其中所述病毒載體是慢病毒顆粒。
72.   根據實施例71所述的方法，其中所述重組慢病毒顆粒經水皰性口炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、伊波拉病毒、瑪律堡病毒、莫柯拉病毒、狂犬病毒、RD114或其功能變體假型化。
73.   根據實施例57或62所述的方法，其中所述病毒載體是單純皰疹病毒(HSV)顆粒。
74.   根據實施例73所述的方法，其中所述HSV顆粒是HSV-1顆粒或HSV-2顆粒或其功能變體。
75.   根據實施例48-56和58-61中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是脂質奈米顆粒。
76.   根據實施例48-75中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑包含編碼異源轉基因的核酸。
77.   根據實施例76所述的方法，其中所述異源轉基因可操作地連接至啟動子。
78.   根據實施例77所述的方法，其中所述啟動子是組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導型啟動子。
79.   一種用於在根據實施例1-78中任一項所述的方法中使用的套組。 實例
通過參考以下實例將更全面地理解本發明。然而，它們不應被解釋為限制本發明的範圍。應理解，本文所述的實例和實施例僅用於說明目的，並且根據它們進行的各種修改或改變應為本領域技術人員知曉，並且應包括在本申請的精神和範圍內以及所附申請專利範圍的範圍內。 實例 1 ：篩查不同 AAV 載體的先天免疫原性
此實例提供了用於測定AAV治療後的先天性免疫反應的策略。
對AAV載體的免疫反應對成功的臨床應用造成了挑戰。AAV觸發涉及先天性免疫系統和適應性免疫系統兩者的啟動的免疫反應。雖然相對好地表徵了對AAV的適應性免疫反應，但對由AAV引起的先天性免疫啟動瞭解得很少。 材料與方法
周邊血液單核細胞的製備。將來自四個供體的經富集白細胞單采術產物(AllCells)的血液傾倒入50 mL管中，並且以1 : 1的比率添加杜氏磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)。將血液加DBPS的混合物緩慢移液到含有15 mL Ficoll(GE17-5442-02)的單獨的50 mL管中，以確保血液和Ficoll相不混合。將混合物在室溫下以2000 RPM離心25分鐘(9加速並且無制動)。將含有周邊血液單核細胞(PBMC)的血沈棕黃層收集，轉移到新的管中，並且以400 RCF離心五分鐘。將PBMC用含有1%胎牛血清(FBS)或胎牛犢血清(FCS)的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌三次並且計數。
單核細胞的分離。遵循製造商的方案(Milteny Biotech，德國，訂單號130-050-201，方案可在網上萬維網miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0001260.PDF獲得)，使用CD14微珠從PBMC中分離CD14+單核細胞。簡言之，將PBMC與20 µL CD14微珠/10 7個總細胞在2ºC-8ºC下一起培育15分鐘。將PBMC施加到磁柱(Miltenyi；萬維網miltenyibiotec.com/US-en/products/ls-columns.html#130-042-401)上，並且允許未標記的細胞通過。洗滌柱三次後，將柱從磁性分離器(Miltneyi；萬維網miltenyibiotec.com/US-en/products/quadromacs-separator-and-starting-kits.html#130-091-051)中取出，放置在收集管上，並且通過將柱塞推入柱中來沖出磁性標記的CD14+單核細胞。
單核細胞的分化。遵循可網上獲得的製造商方案，使用ImmunoCult-ACF樹突細胞培養基、分化補充劑和成熟補充劑(Stem Cell Technologies，目錄號10986、10988和10989；萬維網cdn.stemcell.com/media/ Files/pis/DX20521-PIS_1_2_0.pdf?_ga=2.81451927.1035383195.1642105700-1174975582.1603298321)將CD14+單核細胞分化為樹突細胞。簡言之，將純化的CD14+單核細胞添加到含有分化補充劑的樹突細胞培養基中並且在37ºC下培育三天。在第3天，用含有分化補充劑的新鮮樹突細胞培養基替代培養基，並且將細胞再培育兩天。在第5天，將成熟補充劑以1比100稀釋度添加到細胞中(例如，每5 mL培養物添加50 µL補充劑)。在第7天收穫分化的樹突細胞。
rAAV 生產和滴定。使用標準的三重轉染方法(Sena-Esteves和Gao, Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.top095513, 2020)產生rAAV載體(AAV1、AAV2、AAVDJ和AAVrh32.33)。所測試的所有血清型都編碼相同的GFP轉基因。將病毒通過氯化銫超速離心進行純化，並且使用銀染色和定量聚合酶連鎖反應(qPCR)兩者進行滴定。 處理
將樹突細胞以200,000個細胞/孔鋪板於96孔板中。每個處理一式三份進行。以1e4 MOI用四種不同的AAV載體進行四種不同的處理。將細胞在培養箱中在37ºC、5% CO 2下培育24小時。在24 h後，將板離心並且收集培養基上清液。脂多糖LPS(300 ng/mL)(Sigma Aldrich Fine Chemicals Biosciences L2630100MG)用作陽性對照，已知其啟動toll樣受體4並且誘導細胞激素產生I人單核細胞源性樹突細胞。然後收集細胞培養基並且離心。將澄清的培養基通過兩種不同的方法進行分析，以檢測用不同AAV血清型激發後從樹突細胞釋放的不同細胞激素。兩種方法使用了由Nanobiotec(萬維網nanobiotecusa.com/immunoassay)進行的多重免疫測定(基於Luminex珠的測定)和由DC3 therapeutics(https://www.dc3therapeutics.com/services)進行的MSD(萬維網mesoscale.com/products/v-plex-proinflammatory-panel-1-human-kit-k15049d/)。PBMC分離、單核細胞純化和樹突細胞分化的實驗概要展示於 圖 1中。該圖還顯示如何用不同的AAV處理樹突細胞。 結果
基於由經處理的樹突細胞釋放的細胞激素，測試的所有四種血清型產生的免疫反應都比LPS弱( 圖 2)。雖然LPS誘導從每個供體測定的大多數細胞激素的顯著上調，但測試的不同AAV血清型誘導僅限於細胞激素亞群(IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α)的不太明顯的上調( 圖 2)。明顯地，該細胞激素亞群(即，細胞激素特徵)顯現在不同的AAV血清型中是保守的。 圖 2中呈現的資料基於Luminex技術，其中一些細胞激素超出或低於檢測限(aLOD/bLOD)，因此我們利用了MSD技術並且再次檢查來自相同供體細胞的細胞激素水平。如 圖 2中所見，使用正交MSD測定驗證相同的結果( 圖 3)。
在測試的AAV血清型中，發現AAVrh32.33產生最穩固且持續的先天免疫特徵( 圖 2 和 3)。通過觀察到的IL-6、TNF-α和IL-1β的更大上調證實了這一點。 討論
用於治療罕見遺傳疾病的基因療法的成功在很大程度上依賴於腺相關病毒(AAV)病毒載體，所述AAV病毒載體提供了許多有吸引力的特徵，包括組織特異性向性、靜止期細胞的轉導和修飾基因表現的維持。然而，對AAV載體的免疫反應對成功的臨床轉化造成了重大挑戰。衣殼、病毒基因體以及轉基因觸發了涉及免疫系統先天和適應性免疫兩者的啟動的免疫反應。由B細胞和T細胞觸發的適應性免疫反應在本領域已經有了一定程度的瞭解，對先天免疫啟動瞭解甚少。基於小鼠模型的研究表明，存在於細胞的內體中的TLR9a DNA感測器檢測AAV基因體並且啟動信號傳導級聯，最終導致細胞激素釋放(Ashley, SN等人, Cell Immunol.2019, 346:103997；(Zhu, J等人, J Clin Invest. 2009;119(8):2388-2398)。( 圖 1，右下圖)。這些細胞激素產生抗病毒反應並且觸發適應性免疫系統的啟動。瞭解這些先天性免疫反應的主要挑戰在於在臨床試驗到離體環境中觀察到的免疫反應的再現性很差。為了規避該挑戰並瞭解先天性免疫反應，我們現在開發了新型測定，所述測定概括了在不同人類供體中反應於不同AAV血清型的先天免疫特徵。我們使用了來自健康供體的人單核細胞性樹突細胞(moDC)，並且在用AAV載體激發後我們靈敏地檢測了從這些moDC釋放的細胞激素。 實例 2 ：篩查 LNP 的先天免疫原性
該實例提供了用於測定LNP遞送後的先天性免疫反應的策略。實例中描述的方法的一般示意圖描繪於 圖 4中。 材料與方法 分化樹突細胞的產生
使用實例1中所述的程式，製備血單個核細胞，並且分離單核細胞並且使其分化為樹突細胞。 LNP 處理和細胞激素測量
將人單核細胞性樹突細胞以96孔格式鋪板，並且使用標準方案(參見https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5577173/和https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5646367/)在37ºC下用10 ug LNP處理，並且24小時後收穫用於經由流式細胞術進行下游分析(如細胞毒性和靶基因表現)。收集培養基用於細胞激素分析。將細胞以2,000 rpm離心5分鐘，並且收集上清液以分析細胞激素。遵循製造商的方案利用luminex使用MILLIPLEX®人細胞激素/趨化介素/生長因子組套A 38 Plex預混合磁珠組套-免疫學多重測定目錄號HCYTA-60K-PX38測量細胞激素。 用於測定的試劑示於表1中。 表 1 ：試劑和供應商的列表
試劑 目錄號 供應商
生物素化人Siglec-2/CD22蛋白、Fc、Avitag™ SI2-H82E3-200ug Acrobiosystems Inc
CD22單株抗體(eBio4KB128(4KB128))、APC、eBioscience™、Invitrogen™ 17022942 Fisher Scientific
LIVE/DEAD™可固定近IR死細胞染色套組，用於633 nm或635 nm激發 L34975 Invitrogen
Pacific Blue™抗人CD11c抗體 337212 Biolegend
FITC抗人CD11b抗體 301330 Biolegend
PE抗人CD83抗體 305308 Biolegend
含2%胎牛血清的杜氏磷酸鹽緩衝鹽水(FACS緩衝液) 7905 Stem cells technologies
細胞活力測定
將樹突細胞(DC)重懸於FACS緩衝液中並且轉移到U形底96孔板。將細胞以2,000 rpm離心5分鐘，並且丟棄上清液。為了分析細胞活力，對活/死負染色細胞進行門控，並且將百分比判斷為細胞活力。將來自Invitrogen的LIVE/DEAD™可固定核-IR死細胞染色套組(用於633 nm或635 nm激發)目錄號L34975用於細胞染色。 通過流式細胞術得到的靶基因表現
將樹突細胞(DC)重懸於FACS緩衝液中並且轉移到U形底96孔板。將細胞以2,000 rpm離心5分鐘，並且丟棄上清液。為了分析靶基因的表現，將CD22蛋白用FACS緩衝液稀釋至終濃度為5 µg/ml終濃度。將每孔中的DC在4ºC下用100 µl稀釋的CD22處理30分鐘。將細胞用FACS緩衝液洗滌，然後在4ºC下用50 µl流動抗體主混合物(1 : 100抗hCD22 APC、1 : 100抗hCD11c太平洋藍、1 : 100 抗hCD11b FITC、1 : 100抗hCD83 PE和1 : 100活/死染色APC-Cy7)染色30分鐘。將細胞用FACS緩衝液洗滌2次，並且將細胞用流式細胞儀(Novocyte Penteon流式細胞儀系統5雷射器，Agilent Technology)運行。 結果 細胞活力
在LNP處理後24小時後收穫樹突細胞並且進行流式細胞術以評估細胞活力( 圖 5)。 圖 5中的每個點表示源自人供體的細胞。僅細胞條件未接受LNP處理，並且mRNA-LNP#1和mRNA-LNP#2是用兩種不同LNP處理的細胞，對於所有供體，活力與僅對照的細胞相同，表明LNP處理後無細胞毒性。樹突細胞系統可以用於評估LNP而不影響細胞活力。進行單因素方差分析以測量統計學顯著性。 轉導水平
在LNP處理後24小時後收穫樹突細胞並且進行流式細胞術以評估靶基因表現( 圖 6)。 圖 6中的每個點表示源自人供體的細胞。僅細胞條件未接受LNP處理，並且mRNA-LNP#1和mRNA-LNP#2是用兩種包封相同mRNA的不同LNP處理的細胞。如通過mRNA表現細胞的百分比測量的，通過LNP轉導來自所有不同供體的樹突細胞。進行單因素方差分析以測量統計學顯著性。這表明所公開的樹突細胞測定系統可以用於有效評估LNP轉導。 LNP 免疫原性
LNP處理後24小時後收集來自樹突細胞的培養基，並且進行Luminex分析以鑒定細胞激素特徵。與沒有LNP處理的細胞相比，包封mRNA的LNP特異性分泌細胞激素。分析顯顯示與各自的培養基對照組相比，諸如IP10( 圖 7A)、MIP1b( 圖 7B)、CXCL9( 圖 7C)和IL2( 圖 7D)的細胞激素在所有供體中上調。
圖 1顯示用於判斷不同的AAV載體的先天免疫原性的測定的示意圖。
圖 2顯示如通過Luminex測定判斷的來自AAV處理細胞的細胞激素水平。AAV血清型標示在每個圖上方；測定的細胞激素示於左側；供體ID沿每個圖的頂部顯示。每個圖內的顏色對應於與未感染的細胞相比的調節變化，並且在右下方小圖中標示。
圖 3顯示如通過正交MSD測定判斷的來自AAV處理細胞的細胞激素水平。AAV血清型標示在每個圖上方；測定的細胞激素示於左側；供體ID沿每個圖的頂部顯示。每個圖內的顏色對應於與未感染的細胞相比的調節變化，並且在右下方小圖中標示。
圖 4顯示測定LNP遞送後的先天性免疫反應的實驗示意圖。從經富集白細胞單采術產物(leukopaks)中分離出周邊血液單核細胞(PBMC)。從PBMC中純化CD14+單核細胞。將分化因子混合物添加到單核細胞中以允許分化為樹突細胞，並且最後添加成熟因子以獲得成熟的樹突細胞。將成熟樹突細胞用10 ug LNP處理24h。然後收穫細胞用於使用流式細胞術測量細胞毒性和靶基因表現，並且收集培養基用於評估細胞激素釋放。
圖 5顯示本揭露的樹突細胞系統可以用於評估LNP的免疫原性而不影響細胞活力。
圖 6顯示本揭露的樹突細胞系統可以用於有效評估LNP轉導。特別地，將根據本揭露產生的樹突細胞通過包封mRNA的LNP有效轉導。
圖 7A-7D顯示與沒有LNP處理的細胞相比，包封mRNA的LNP特異性分泌細胞激素。 圖 7A顯示IP10分泌的結果。 圖 7B顯示MIP1b分泌的結果。 圖 7C顯示CXCL9分泌的結果。 圖 7D顯示IL2分泌的結果。

Claims (88)

  1. 一種判斷個體對基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括 a) 將來自所述個體的先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑一起培育， b) 與合適的對照相比，分析所述先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現，其中所述一種或多種細胞激素的改變的表現產生細胞激素特徵， 其中與所述基因療法藥劑一起培育後細胞激素特徵的表現指示所述個體對所述基因療法藥劑的先天免疫原性。
  2. 如請求項1所述的方法，其中所述先天性免疫細胞是樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞或自然殺手(NK)細胞。
  3. 如請求項1或2所述的方法，其中從來自所述個體的周邊血液單核細胞中分離所述先天性免疫細胞。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的方法，其中所述先天性免疫細胞是樹突細胞。
  5. 如請求項4所述的方法，其中所述樹突細胞源自所述個體的單核細胞。
  6. 如請求項4或5所述的方法，所述方法進一步包括從所述個體中分離單核細胞，並且在樹突細胞培養基中培育所述單核細胞以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，之後將所述樹突細胞與所述基因療法藥劑一起培育。
  7. 如請求項6所述的方法，其中所述單核細胞是CD14+單核細胞。
  8. 如請求項6或7所述的方法，其中將所述單核細胞用所述樹突細胞培養基培育約5至約10天或約7至約8天以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞。
  9. 如請求項1-8中任一項所述的方法，其中在與步驟b) 的所述基因療法藥劑一起培育之前將所述先天性免疫細胞重新鋪板。
  10. 如請求項9所述的方法，其中將所述先天性免疫細胞重新鋪板到微孔盤中。
  11. 如請求項1-10中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是病毒載體或非病毒載體。
  12. 如請求項11所述的方法，其中所述病毒載體是AAV。
  13. 如請求項11所述的方法，其中所述非病毒載體是脂質奈米顆粒(LNP)。
  14. 如請求項1-10中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是病毒載體，並且其中將所述先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑以約1 × 10 3至約1 × 10 5或約1 × 10 4的MOI培育。
  15. 如請求項1-10中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是非病毒載體，並且其中將所述先天性免疫細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的非病毒載體一起培育。
  16. 如請求項1-15中任一項所述的方法，其中將所述先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑一起培育約12小時至約36小時或約24小時。
  17. 如請求項1-16中任一項所述的方法，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。
  18. 如請求項1-17中任一項所述的方法，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α中的一種或多種的表現增加。
  19. 如請求項1-18中任一項所述的方法，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα、IL-1β、MCP1和MIP-1α的表現增加。
  20. 如請求項1-18中任一項所述的方法，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα和IL-1β的表現增加。
  21. 如請求項1-16中任一項所述的方法，其中所述細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2中的一種或多種的表現增加。
  22. 如請求項1-16中任一項所述的方法，其中所述細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9和IL2的表現增加。
  23. 如請求項1-22中任一項所述的方法，其中與合適的對照相比，所述細胞激素特徵中所述細胞激素的表現增加。
  24. 如請求項23所述的方法，其中所述合適的對照是來自未與所述基因療法藥劑一起培育的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現，或者其中所述合適的對照是來自與所述基因療法藥劑一起培育之前的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現。
  25. 如請求項1-13和16-24中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是病毒載體。
  26. 一種判斷個體對病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括 a) 在其中單核細胞分化為樹突細胞的條件下，在樹突細胞培養基中培育來自所述個體的單核細胞， b) 將所述樹突細胞與所述病毒基因療法藥劑以約1 × 10 3至約1 × 10 5的MOI培育約12至約36小時， c) 與合適的對照相比，分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現，其中所述一種或多種細胞激素的改變的表現產生細胞激素特徵， 其中在與所述病毒基因療法藥劑一起培育後所述細胞激素特徵的表現指示所述個體對所述病毒基因療法藥劑的先天免疫原性，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα、和IL-1β的表現增加。
  27. 如請求項26所述的方法，其中所述單核細胞獲自來自所述個體的周邊血液單核細胞。
  28. 如請求項26或27所述的方法，其中所述單核細胞是CD14+單核細胞。
  29. 如請求項26-28中任一項所述的方法，其中將所述單核細胞在樹突細胞培養基中培育約7-8天以使所述單核細胞分化為樹突細胞。
  30. 如請求項26-29中任一項所述的方法，其中將所述樹突細胞與所述病毒基因療法藥劑以約1 × 10 4的MOI培育。
  31. 如請求項26-30中任一項所述的方法，其中將所述樹突細胞與所述病毒基因療法藥劑一起培育約24小時。
  32. 如請求項25-31中任一項所述的方法，其中所述病毒載體是AAV顆粒。
  33. 如請求項32所述的方法，其中所述AAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV4衣殼、AAV5衣殼、AAV6衣殼、AAV7衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8衣殼、AAV9衣殼、AAV10衣殼、AAVrh10衣殼、AAV11衣殼、AAV12衣殼、AAVrh32.33衣殼、AAV-XL32衣殼、AAV-XL32.1衣殼、AAV LK03衣殼、AAV2R471A衣殼、AAV2/2-7m8衣殼、AAV DJ衣殼、AAV DJ8衣殼、AAV2 N587A衣殼、AAV2 E548A衣殼、AAV2 N708A衣殼、AAV V708K衣殼、山羊AAV衣殼、AAV1/AAV2嵌合衣殼、牛AAV衣殼、小鼠AAV衣殼、rAAV2/HBoV1(嵌合AAV/人類博卡病毒屬病毒1)、AAV2HBKO衣殼、AAVPHP.B衣殼或AAVPHP.eB衣殼、或其功能變體。
  34. 如請求項33所述的方法，其中所述AAV衣殼包含酪胺酸突變、肝素結合突變、或HBKO突變。
  35. 如請求項32-34中任一項所述的方法，其中所述AAV病毒顆粒包含含有一種或多種末端反向重複(ITR)的AAV基因體，其中所述一種或多種ITR是AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR或AAV12 ITR。
  36. 如請求項35所述的方法，其中所述AAV顆粒的所述一種或多種ITR和所述衣殼源自相同的AAV血清型。
  37. 如請求項35所述的方法，其中所述AAV顆粒的所述一種或多種ITR和所述衣殼源自不同的AAV血清型。
  38. 如請求項25-31中任一項所述的方法，其中所述病毒載體是腺病毒顆粒。
  39. 如請求項38所述的方法，其中所述腺病毒顆粒包含來自以下的衣殼：腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、綿羊Ad、或豬Ad 3型、或其功能變體。
  40. 如請求項25-31中任一項所述的方法，其中所述病毒載體是慢病毒顆粒。
  41. 如請求項40所述的方法，其中所述重組慢病毒顆粒經水皰性口炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、伊波拉病毒、瑪律堡病毒、莫柯拉病毒、狂犬病毒、RD114、或其功能變體假型化。
  42. 如請求項25-31中任一項所述的方法，其中所述病毒載體是單純皰疹病毒(HSV)顆粒。
  43. 如請求項42所述的方法，其中所述HSV顆粒是HSV-1顆粒或HSV-2顆粒、或其功能變體。
  44. 如請求項1-10和15-20中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是脂質奈米顆粒。
  45. 如請求項21或請求項22所述的方法，其中所述基因療法藥劑是脂質奈米顆粒。
  46. 一種判斷個體對非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性的方法，所述方法包括 a) 在其中單核細胞分化為樹突細胞的條件下，在樹突細胞培養基中培育來自所述個體的單核細胞， b) 將所述樹突細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的所述非病毒載體一起培育， c) 與合適的對照相比，分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現，其中所述一種或多種細胞激素的改變的表現產生細胞激素特徵， 其中在與所述非病毒基因療法藥劑一起培育後所述細胞激素特徵的表現指示所述個體對所述非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性，其中所述細胞激素特徵包括IL6、TNFα、和IL-1β的表現增加。
  47. 如請求項46所述的方法，其中所述單核細胞獲自來自所述個體的周邊血液單核細胞。
  48. 如請求項46或47所述的方法，其中所述單核細胞是CD14+單核細胞。
  49. 如請求項46-48中任一項所述的方法，其中將所述單核細胞在樹突細胞培養基中培育約7-8天以使所述單核細胞分化為樹突細胞。
  50. 如請求項46-49中任一項所述的方法，其中將所述樹突細胞與所述非病毒基因療法藥劑一起培育約12小時至約36小時或約24小時。
  51. 如請求項1-50中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑包含編碼異源轉基因的核酸。
  52. 如請求項51所述的方法，其中所述異源轉基因可操作地連接至啟動子。
  53. 如請求項52所述的方法，其中所述啟動子是組成型啟動子、組織特異性啟動子、或誘導型啟動子。
  54. 一種判斷個體對脂質奈米顆粒(LNP)的先天免疫原性的方法，所述方法包括 a) 在其中單核細胞分化為樹突細胞的條件下，在樹突細胞培養基中培育來自所述個體的單核細胞， b) 將所述樹突細胞與所述LNP一起培育， c) 與合適的對照相比，分析所述樹突細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現，其中所述一種或多種細胞激素的改變的表現產生細胞激素特徵， 其中與所述LNP一起培育後所述細胞激素特徵的表現指示所述個體對所述非病毒基因療法藥劑的先天免疫原性。
  55. 如請求項54所述的方法，其中所述細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、和IL2中的一種或多種的表現增加。
  56. 如請求項54所述的方法，其中所述細胞激素特徵包括IP10、MIP1b、CXCL9、和IL2的表現增加。
  57. 一種判斷基因療法藥劑的細胞激素特徵的方法，所述方法包括 a) 將來自一個或多個個體的一種或多種先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑一起培育， b) 與合適的對照相比，分析所述一種或多種先天性免疫細胞的一種或多種細胞激素的改變的表現， 其中步驟b) 中所述一種或多種細胞激素的改變的表現指示所述基因療法藥劑的細胞激素特徵。
  58. 如請求項57所述的方法，其中所述先天性免疫細胞是樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞，或自然殺手(NK)細胞。
  59. 如請求項57或58所述的方法，其中從來自所述個體的周邊血液單核細胞中分離所述一種或多種先天性免疫細胞。
  60. 如請求項57-59中任一項所述的方法，其中所述先天性免疫細胞是樹突細胞。
  61. 如請求項60所述的方法，其中所述樹突細胞源自所述一個或多個個體的單核細胞。
  62. 如請求項60或61所述的方法，所述方法進一步包括從所述一個或多個個體中分離單核細胞，並且在樹突細胞培養基中培育所述單核細胞以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞，之後將所述樹突細胞與所述基因療法藥劑一起培育。
  63. 如請求項62所述的方法，其中所述單核細胞是CD14+單核細胞。
  64. 如請求項63或63所述的方法，其中將所述單核細胞用所述樹突細胞培養基培育約5至約10天或約7至約8天以衍生來自所述單核細胞的樹突細胞。
  65. 如請求項57-64中任一項所述的方法，其中在與步驟b) 的所述基因療法藥劑一起培育之前將所述先天性免疫細胞重新鋪板。
  66. 如請求項57-65中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是病毒載體，並且其中將所述先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑以約1 × 10 3至約1 × 10 5或約1 × 10 4的MOI培育。
  67. 如請求項57-65中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是非病毒載體，並且其中將所述先天性免疫細胞與濃度為約1 ng/mL至約1 mg/mL的非病毒載體一起培育。
  68. 如請求項57-67中任一項所述的方法，其中將所述先天性免疫細胞與所述基因療法藥劑一起培育約12小時至約36小時或約24小時。
  69. 如請求項57-68中任一項所述的方法，其中與合適的對照相比，所述細胞激素特徵中所述細胞激素的表現增加。
  70. 如請求項69所述的方法，其中所述合適的對照是來自未與所述基因療法藥劑一起培育的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現，或者其中所述合適的對照是來自與所述基因療法藥劑一起培育之前的先天性免疫細胞的細胞激素特徵中細胞激素的表現。
  71. 如請求項57-65和68-70中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是病毒載體。
  72. 如請求項66或71所述的方法，其中所述病毒載體是AAV顆粒。
  73. 如請求項72所述的方法，其中所述AAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV4衣殼、AAV5衣殼、AAV6衣殼、AAV7衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8衣殼、AAV9衣殼、AAV10衣殼、AAVrh10衣殼、AAV11衣殼、AAV12衣殼、AAVrh32.33衣殼、AAV-XL32衣殼、AAV-XL32.1衣殼、AAV LK03衣殼、AAV2R471A衣殼、AAV2/2-7m8衣殼、AAV DJ衣殼、AAV DJ8衣殼、AAV2 N587A衣殼、AAV2 E548A衣殼、AAV2 N708A衣殼、AAV V708K衣殼、山羊AAV衣殼、AAV1/AAV2嵌合衣殼、牛AAV衣殼、小鼠AAV衣殼、rAAV2/HBoV1(嵌合AAV/人類博卡病毒屬病毒1)、AAV2HBKO衣殼、AAVPHP.B衣殼或AAVPHP.eB衣殼或其功能變體。
  74. 如請求項73所述的方法，其中所述AAV衣殼包含酪胺酸突變、肝素結合突變或HBKO突變。
  75. 如請求項72-74中任一項所述的方法，其中所述AAV病毒顆粒包含含有一種或多種末端反向重複(ITR)的AAV基因體，其中所述一種或多種ITR是AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR或AAV12 ITR。
  76. 如請求項75所述的方法，其中所述AAV顆粒的所述一種或多種ITR和所述衣殼源自相同的AAV血清型。
  77. 如請求項75所述的方法，其中所述AAV顆粒的所述一種或多種ITR和所述衣殼源自不同的AAV血清型。
  78. 如請求項66或71所述的方法，其中所述病毒載體是腺病毒顆粒。
  79. 如請求項78所述的方法，其中所述腺病毒顆粒包含來自以下的衣殼：腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、綿羊Ad或豬Ad 3型或其功能變體。
  80. 如請求項66或71所述的方法，其中所述病毒載體是慢病毒顆粒。
  81. 如請求項80所述的方法，其中所述重組慢病毒顆粒經水皰性口炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、伊波拉病毒、瑪律堡病毒、莫柯拉病毒、狂犬病毒、RD114、或其功能變體假型化。
  82. 如請求項66或71所述的方法，其中所述病毒載體是單純皰疹病毒(HSV)顆粒。
  83. 如請求項82所述的方法，其中所述HSV顆粒是HSV-1顆粒或HSV-2顆粒、或其功能變體。
  84. 如請求項57-65和67-70中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑是脂質奈米顆粒。
  85. 如請求項67-84中任一項所述的方法，其中所述基因療法藥劑包含編碼異源轉基因的核酸。
  86. 如請求項85所述的方法，其中所述異源轉基因可操作地連接至啟動子。
  87. 如請求項86所述的方法，其中所述啟動子是組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導型啟動子。
  88. 一種用於在如請求項1-87中任一項所述的方法中使用的套組。
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