CN105579465B - 用于基因转移到细胞、器官和组织中的变异aav和组合物、方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及腺相关病毒(AAV)血清型AAV‑Rh74和相关的AAV载体以及AAV‑Rh74和相关的AAV载体介导的基因转移方法和用途。特别是，AAV‑Rh74和相关的AAV载体将多核苷酸靶向细胞、组织或器官，用于表达(转录)编码治疗性蛋白质和肽的基因，以及用作或转录成抑制性核酸序列的多核苷酸。

Description

用于基因转移到细胞、器官和组织中的变异AAV和组合物、方 法及用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年4月28日提交的美国临时申请No.61/985365和2013年7月22日提交的美国临时申请No.61/857161的优先权，所有这些申请在此通过引用整体并入本文。
技术领域
由于所希望的基因不存在或其缺陷(功能丧失)或者不希望有的或有缺陷的基因的表达或者(功能增加)引起的遗传病导致多种疾病。功能丢失基因病症的一个示例是血友病，一种由凝血因子VIII(FVIII，A型血友病)或因子IX(FIX，B型血友病)缺乏造成的遗传性出血性疾病。功能增加的遗传病症的一个示例是亨廷顿病，一种由编码特别是基底神经节和大脑皮层中累积的突变蛋白并导致神经元逐渐破坏的病理性“HTT”基因(编码亨廷顿蛋白)引起的疾病。
当前治疗血友病在于根据需要、在发生出血的情况下或预防性地静脉内施用重组凝血因子。然而，这种治疗方法有几个缺点，例如需要反复输注、治疗成本、发生抗治疗因子免疫反应的风险以及潜在的致命性出血的风险。这些限制已促使开发基于基因的血友病治疗。为此，血友病对基于基因转移的治疗是理想的，因为：1)治疗窗很宽，因为刚刚高于正常值1％的水平已经可导致表型从严重变至中度，并且100％的水平与任意副作用均不相关；2)治疗性转基因的组织特异性表达要求不严格；以及3)在测量治疗功效的终点方面具有相当多的经验。此外，凝血因子的肝表达已被证实诱导对凝血因子本身的免疫耐受性，从而降低了针对凝血因子的潜在的有害的免疫反应的可能性。
目前，腺相关病毒(AAV)载体被认为是选择的基因转移载体，因为它们对基因在体内的递送具有最佳的安全性和疗效性能。在目前为止所分离的AAV血清型中，AAV2和AAV8已被用于靶向患有严重B型血友病的人类肝脏。两种载体均有效地工作，并且记录了治疗性转基因的AAV8长期表达的情况。人类的最近的数据表明，利用AAV载体靶向肝脏实现治疗水平的FIX转基因长期表达。
尽管这些数据是有价值的，但是在人类(野生型AAV的天然宿主)中对肝脏具有高取向的AAV血清型和低血清阳性率的识别基本上用于1)以最低的载体剂量在肝脏中实现治疗水平的转基因表达以降低触发抗AAV衣壳免疫应答的风险；和2)交替具有独特的血清阳性率的AAV血清将允许治疗那些由于预先存在的抗AAV体液免疫而不符合AAV基因转移的患者群体。本发明解决这些需求并提供其他的益处。
发明内容
本发明提供了腺相关病毒(AAV)血清型AAV-Rh74载体以及相关的AAV载体和病毒颗粒。除其他的类型之外，这样的载体尤其包括靶向肝脏的肝细胞的AAV-Rh74。作为多核苷酸序列递送的载体，AAV-Rh74和相关的AAV载体驱动多核苷酸在细胞中表达。编码蛋白质例如用于治疗应用的蛋白质的多核苷酸能在施用后以治疗水平进行表达。
示例性的AAV-Rh74和相关的AAV载体包括AAV-Rh74变体。具体的衣壳变体包括在RH74 VP1衣壳序列(SEQ ID NO:1)的195、199、201或202氨基酸位中的任一个上具有氨基酸替代(substitution)的Rh74衣壳序列。在具体的方面，所述残基对应于RH74 VP1衣壳序列(SEQ ID NO:1)的195、199、201或202氨基酸位中的任一个上的A、V、P或N氨基酸。在更具体的方面，所述衣壳序列具有在RH74 VP1衣壳序列(SEQ ID NO:1)的第195氨基酸位的A残基；第199氨基酸位的V残基，第201氨基酸位的P残基，或第202氨基酸位的N残基。在进一步更具体的方面，所述衣壳序列具有以下的任意两个、三个或全部四个：在RH74 VP1衣壳序列(SEQID NO:1)的第195氨基酸位的A残基；第199氨基酸位的V残基，第201氨基酸位的P残基，或第202氨基酸位的N残基。
本发明的重组AAV颗粒包括任意衣壳变体例如RHM4-1(SEQ ID NO:5)、RHM15-1(SEQ ID NO:6)、RHM15-2(SEQ ID NO:7)、RHM15-3/RHM15-5(SEQ ID NO:8)、RHM15-4(SEQID NO:9)或RHM15-6(SEQ ID NO:10)的AAV衣壳序列。在具体的实施方式中，重组AAV颗粒被衣壳化或包装载体基因组(例如，病毒载体，如AAV载体基因组)。这样的本发明的重组AAV颗粒包括病毒(例如，AAV)载体基因组，其还包括异源多核苷酸序列。
AAV-Rh74和相关的AAV载体介导的多核苷酸转移所产生的蛋白表达水平，该蛋白表达水平比目前临床前和临床环境中研究的几种其他血清型显著更高。特别是，AAV-Rh74在小鼠和B型血友病狗中以至少相当或优于AAV8肝转导金标准的效率将多核苷酸靶向肝脏(参见例如图1和2)。AAV-Rh74变体比如例如衣壳变体RHM4-1(SEQ ID NO:5)在小鼠中以相当或优于AAV8和优于Rh74 AAV的效率将多核苷酸靶向肝脏(参见例如图5)。此外，非人灵长类的数据表明AAV-Rh74和AAV-Rh74变体例如RHM4-1在介导hFIX的肝脏来源的表达时比AAV8的效力高约两倍(参见例如图4和6)。
因此，AAV-Rh74和AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1)可用于递送多核苷酸例如基因编码序列以表达提供理想的或治疗有益效果的蛋白质，以及用于减少或抑制不期望有的或有缺陷的基因的表达从而治疗多种疾病的抑制性核苷酸。例如，AAV-Rh74和AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1)可用作载体以递送至细胞、组织和器官例如肝治疗基因(例如，FIX、FVIII)以治疗A型血友病、B型血友病等。这样的AAV-Rh74和AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1)载体也可用于递送用于广泛的其他代谢或血浆蛋白缺陷或用于其他治疗目的的基因，例如但不限于编码锌指核酸酶的基因以在肝进行基因组编辑，和用于局部(肝)递送免疫调节剂例如α-干扰素以用于治疗肝炎病毒感染，或实际上治疗需要肝转导或血流中存在治疗性转基因产物(其可通过靶向转基因用于肝表达来实现)的任意疾病。
除了通过AAV-Rh74和相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体比如衣壳变体(例如，RHM4-1)将多核苷酸经体外、离体和体内有效递送到细胞内之外，抗AAV-Rh74抗体在人类中的患病率比抗AAV2抗体的低，并且不同于抗AAV8抗体(表1)。由于低血清阳性率，AAV-Rh74和相关的AAV载体例如AAV-Rh74(衣壳)变体(例如，RHM4-1)可以较大的百分比用在人类中，否则将不适用于例如可能对其他AAV血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11等)是血清阳性的人类的基因转移。此外，AAV-Rh74和相关载体例如AAV-Rh74变体(包括衣壳变体(例如，RHM4-1))可有效地以高滴度产生(表2)。因此，AAV-Rh74和相关的AAV载体可大量产生以用于更普遍的临床疾病。
根据本发明，提供了重组AAV-Rh74载体和相关的AAV载体，例如，AAV-Rh74变体，例如衣壳变体(例如，RHM4-1)颗粒，其包括(衣壳化、包装)AAV载体基因组。在一个实施方式中，重组AAV载体包括异源多核苷酸序列。在另一个实施方式中，重组AAV载体基因组通过AAV-Rh74衣壳或相关的AAV，例如AAV-Rh74变体，例如衣壳变体(例如，RHM4-1)而被衣壳化或包装。
在包括(衣壳化、包装)重组AAV载体基因组的本发明的重组AAV载体，例如AAV-Rh74载体和相关的AAV载体，例如AAV-Rh74(衣壳)变体(例如，RHM4-1)颗粒中，所述异源多核苷酸序列可以或已转录并随后翻译成蛋白质。可替代地，所述异源多核苷酸可被转录成本身具有功能或活性的转录物(例如，作为抑制性核酸)。
在多个方面，所述异源多核苷酸序列编码治疗性蛋白。在具体的方面，所述蛋白是凝血因子(例如因子XIII、因子IX、因子X、因子VIII、因子VIIa或C蛋白)、CFTR(囊性纤维化跨膜调节蛋白)、抗体、视网膜色素上皮细胞特异性65kDa蛋白(RPE65)、促红细胞生成素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶(ADA)、金属转运体(ATP7A或ATP7)、磺酰胺酶、参与溶酶体贮积病(ARSA)的酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、β-25葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体氨基己糖苷酶、支链酮酸脱氢酶、激素、生长因子(例如，胰岛素样生长因子1和2、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和-4、脑源性神经营养因子、神经胶质源生长因子、转化生长因子α和β等等)、细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、白介素-2、白介素-4、白介素-12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、自杀基因产物(例如，单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶、肿瘤坏死因子等)、药物抗性蛋白(例如，提供对癌症疗法中使用的药物的抵抗)、肿瘤抑制蛋白(例如，p53、Rb、Wt-1、NF1、希佩尔-林道(VHL)、腺瘤性结肠息肉病(APC))、具有免疫调节特性的肽、耐受原性或免疫原性肽或蛋白Tregitopes或HCDR1、胰岛素、葡萄糖激酶、鸟苷酸环化酶2D(LCA-GUCY2D)、Rab护送蛋白1(无脉络膜)、LCA 5(LCA-Lebercilin)、鸟氨酸酮酸转氨酶(回旋形萎缩)、Retinoschisin 1(X连锁视网膜劈裂症)、USH1C(亚瑟综合征1C)、X连锁视网膜色素变性GTP酶(XLRP)、MERTK(RP的AR形式：色素性视网膜炎)、DFNB1(连接蛋白26耳聋)、ACHM 2、3和4(色盲)、PKD-1或PKD-2(多囊肾病)、TPP1、CLN2、溶酶体贮积病的基因缺陷病因(例如，硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、NPC1、VPC2、鞘脂激活蛋白等)、用于基因组编辑的一个或更多个锌指核酸酶或用作用于基因组编辑的修复模板的供体序列。
在另外的方面，所述异源多核苷酸序列编码治疗性蛋白，其反过来抑制受试者中存在(内源)的不希望有的或异常的(不正常的)蛋白的表达或功能。在进一步的方面，所述异源多核苷酸序列是当转录时被转录成抑制性核酸(例如，抑制性RNA)的多核苷酸。在更具体的方面，抑制性核酸是单链序列，或形成双链或三链序列。在另外的更具体的方面，抑制性核酸是微RNA(miRNA)、siRNA、shRNA、反式剪接RNA、反义RNA或三螺旋形成的RNA。
在进一步的更具体的方面，抑制性核酸抑制下述项的表达：亨廷顿(HTT)基因、与齿状核红核苍白球路易体萎缩相关的基因(例如，肌萎缩蛋白1、ATN1)；脊髓延髓性肌萎缩中X染色体上的雄激素受体、人Ataxin-1、-2、-3和-7、由(CACNA1A)编码的Cav2.1P/Q-电压依赖性钙通道、TATA结合蛋白、Ataxin 8反链(也被称为ATXN8OS)、脊髓小脑性共济失调中的丝氨酸/苏氨酸-蛋白磷酸酶2A 55kDa调节亚基Bβ异形体(1、2、3、6、7、8、12、17型)、脆性X综合征中的FMR1(脆性X智力低下1)、脆性X相关的震颤/共济失调综合征中的FMR1(脆性X智力低下1)、脆性XE精神发育迟滞中的FMR1(脆性X智力低下2)或AF4/FMR2家族成员2；强直性肌营养不良中的肌强直-蛋白激酶(MT-PK)；弗里德里希共济失调中的Frataxin；肌萎缩性侧索硬化中的超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的突变体；涉及帕金森氏病和/或阿尔茨海默氏病的发病机制的基因；载脂蛋白B(APOB)和前蛋白转化酶枯草溶菌素/可馨型9(PCSK9)、高胆固醇血症；HIV感染中的HIV Tat、转录基因的人类免疫缺陷病毒反式激活因子；HIV感染中的HIV TAR、HIV TAR、人类免疫缺陷病毒反式激活反应元件基因；HIV感染中的C-C趋化因子受体(CCR5)；劳斯肉瘤病毒(RSV)感染中的劳斯肉瘤病毒(RSV)核衣壳蛋白、丙型肝炎病毒感染中的肝特异性微RNA(miR-122)；P53、急性肾损伤或移植肾功能延迟移植或肾损伤急性肾功能衰竭；复发提前或转移性实体瘤的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2，LMP2也被称为蛋白酶体β亚基-9型(9PSMB)、转移性黑色素瘤；LMP7，也被称为蛋白酶亚基β型8(8PSMB)、转移性黑素瘤；MECL1，也被称为蛋白酶亚基β型10(10PSMB)，转移性黑素瘤；实体瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；实体瘤中的驱动蛋白纺锤体蛋白、慢性髓性白血病中的细胞凋亡抑制B细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；实体瘤中的核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)；实体瘤中的弗林蛋白酶；肝肿瘤中的Polo样激酶1(PLK1)、丙型肝炎感染中的甘油二酯酰基转移酶1(DGAT1)、家族性腺瘤性息肉病中的β-链蛋白；β2肾上腺素受体，青光眼；糖尿病性黄斑水肿(DME)或年龄相关性黄斑变性中的RTP801/Redd1，也被称为DNA损伤诱导转录蛋白4；年龄相关性黄斑变性或脉络膜新生血管中的血管内皮生长因子受体I(VEGFR1)，非动脉缺血性视神经病变中的胱天蛋白酶2；先天性厚甲中的角蛋白6A N17K突变蛋白；流感感染中的A型流感病毒基因组/基因序列；严重急性呼吸道症候群(SARS)感染中的严重急性呼吸道症候群(SARS)冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道合胞病毒感染中的呼吸道合胞病毒基因组/基因序列；埃博拉病毒感染中的纤维病毒埃博拉病毒基因组/基因序列；乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染中的乙型肝炎和丙型肝炎病毒基因组/基因序列；单纯疱疹病毒(HSV)感染中的单纯疱疹病毒(HSV)基因组/基因序列，柯萨奇病毒B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；原发性肌张力障碍中的基因(等位基因特异性沉默)样扭转蛋白A(TOR1A)的致病性等位基因沉默，pan-I类和HLA等位基因特异性移植；常染色体显性遗传性色素性视网膜炎(adRP)中的突变体视紫红质基因(RHO)；或结合任意上述的基因或序列的转录物的抑制性核酸。
本发明的重组AAV载体以及AAV-Rh74和相关的AAV载体例如AAV-Rh74载体变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1)颗粒包括(衣壳化、包装)重组AAV载体基因组，包括顺式或反式作用的其他元件。在具体的实施方式中，重组病毒(例如，AAV)载体和/或AAV-Rh74载体或相关的AAV载体例如AAV-Rh74(衣壳)变体(例如，RHM4-1)颗粒，其包括(衣壳化、包装)重组AAV载体基因组，还具有：一个或更多个反向末端重复(ITR)序列，其位于异源多核苷酸序列的5’或3’末端的旁侧；表达调控序列，其驱动异源多核苷酸序列(例如，有助于异源多核苷酸序列的转录的启动子或增强子，例如组成型或调节型调控元件，或者组织特异性表达调控元件)的转录；位于异源多核苷酸序列的3’端的多腺嘌呤序列；选择性标记(例如，提供抗生素抗性例如卡那霉素抗性的蛋白质)和/或复制起点。
包括(衣壳化、包装)重组AAV载体基因组的本发明的重组AAV载体以及AAV-Rh74载体和相关的AAV载体例如包括衣壳变体(例如，RHM4-1)颗粒的AAV-Rh74变体还可包括其他元件。在一个实施方式中，重组载体基因组包括异源多核苷酸序列和填料或填充多核苷酸序列。在具体的方面，异源多核苷酸序列的长度小于约4.7Kb。在进一步具体的方面，异源多核苷酸序列的长度小于4.7Kb并位于两个腺相关病毒(AAV)ITR序列内。在其他具体的方面，填料或填充多核苷酸序列具有一定的长度，当与异源多核苷酸序列相组合时，异源多核苷酸序列和填料或填充多核苷酸序列的总组合长度介于约3.0-5.5Kb，或约4.0-5.0Kb，或约4.3-4.8Kb之间。
填料或填充多核苷酸序列可位于载体序列中的任意所期望的位置上，使得其不阻止载体的功能或活性。在一个方面，填料或填充多核苷酸序列不定位在位于异源多核苷酸序列的各自5’和/或3’末端旁侧的5’和/或3’ITR之间。在另一个方面，填料或填充多核苷酸序列可定位在位于异源多核苷酸序列的各自的5’和/或3’末端的旁侧的5’和/或3’ITR内。在另外的方面，填料或填充多核苷酸序列被定位在位于异源多核苷酸序列各自的5’和/或3’末端的旁侧的5’和/或3’ITR。在另外的方面，填料或填充多核苷酸序列被定位在异源多核苷酸序列内，例如类似于基因组核酸内的内含子。
因此，在多个实施方式中，填料或填充多核苷酸序列被定位为与AAV ITR序列相邻；被定位在两个腺相关病毒(AAV)ITR序列内；被定位在两个腺相关病毒(AAV)ITR序列之外；或具有两个填料或填充多核苷酸序列，被定位在两个腺相关病毒(AAV)ITR序列内的第一填料或填充多核苷酸序列，和被定位在两个腺相关病毒(AAV)ITR序列之外的第二填料或填充多核苷酸序列。
在更具体的方面，当被定位在两个腺相关病毒(AAV)ITR序列内时，填料或填充多核苷酸序列具有一定的长度，当与所述异源多核苷酸序列组合时，所述异源多核苷酸序列和填料或填充多核苷酸序列的总组合长度为约3.0-5.5Kb、约4.0-5.0Kb或约4.3-4.8Kb。在其他更具体的方面，当被定位在两个腺相关病毒(AAV)ITR序列之外时，填料或填充多核苷酸序列的长度大于4.7Kb、介于约5.0-10.0Kb或约6.0-8.0Kb之间。
在多个其他方面，填料或填充多核苷酸序列是长度为约1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5500-6000、6000-7000、7000-8000或8000-9000个核苷酸的序列。
通常，填料或填充多核苷酸序列是惰性的或无害的，并且不具有功能或活性。在多个具体的方面，填料或填充多核苷酸序列不是细菌多核苷酸序列，填料或填充多核苷酸序列不是编码蛋白质或肽的序列，填料或填充多核苷酸序列是不同于任意以下项的序列：异源多核苷酸序列、AAV反向末端重复(ITR)序列、表达调控元件、复制起点、选择性标记或多腺嘌呤(聚A)序列。
在多个另外的具体方面，填料或填充多核苷酸序列是与异源多核苷酸序列相关或无关的内含子序列。在具体的方面，内含子序列被定位在异源多核苷酸序列内。在其他具体的方面，内含子序列与异源多核苷酸序列相关，因为内含子是在基因组DNA内，例如在编码蛋白质的基因组DNA内，该蛋白质也是由异源多核苷酸序列编码的。
本发明的重组AAV载体以及AAV-Rh74和相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体如衣壳变体(例如，RHM4-1)颗粒包括(衣壳化、包装)重组AAV载体基因组，其可被包含在细胞内。在这样的实施方式中，细胞可包括辅助细胞，辅助细胞裂解以产生病毒(AAV)颗粒(例如，AAV-Rh74载体或相关的AAV载体，例如AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1))或靶细胞，其中希望表达异源多核苷酸序列。
本发明的重组AAV载体以及AAV-Rh74载体和相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体，例如RHM4-1)颗粒包括(衣壳化、包装)重组AAV载体基因组，其可被包括在药物组合物内。这样的组合物用于向受试者施用包括(衣壳化、包装)重组载体(例如，AAV)基因组的重组载体(例如，AAV)和病毒颗粒例如AAV-Rh74载体和相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体，例如RHM4-1)。
本发明的重组AAV载体以及AAV-Rh74载体和相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体，例如RHM4-1)颗粒包括(衣壳化、包装)重组AAV载体基因组，其可用在多个方法和用途中。因此，提供了用于将异源多核苷酸序列递送或转移到生物体或细胞例如哺乳动物或哺乳动物细胞中的方法和用途。
在一个实施方式中，一种方法或用途包括在适于将异源多核苷酸序列递送或传送到哺乳动物或哺乳动物细胞中的条件下向哺乳动物或哺乳动物细胞施用腺相关病毒(AAV)载体，该载体包括异源多核苷酸序列(例如，通过AAV-Rh74载体或相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体，例如RHM4-1))颗粒，其包括(衣壳化、包装)载体基因组。在一个方面，所述方法或用途允许将异源多核苷酸传送/递送到哺乳动物和/或细胞中。在另一个方面，所述方法允许将异源多核苷酸传送/递送到哺乳动物和/或细胞中，并随后转录异源多核苷酸，从而形成转录物。在进一步的方面，所述方法允许将异源多核苷酸传送/递送到细胞中，随后转录以形成转录物并随后翻译以形成基因产物(蛋白质)。特别是，例如，在后两个方面，异源多核苷酸序列可操作地连接在表达调控元件上，从而赋予异源多核苷酸序列转录，并任选地随后翻译转录物。
在另外的实施方式中，一种方法或用途是用于将异源多核苷酸序列递送或传送到受试者(例如，哺乳动物)或受试者(例如，哺乳动物)细胞内，并包括向受试者(例如哺乳动物)或受试者(例如，哺乳动物)细胞施用病毒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1))颗粒，许多这样的病毒(例如，AAV)颗粒，或这样的病毒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74衣壳变体(例如RHM4-1))颗粒或许多这样的病毒(例如，AAV)颗粒的药物组合物，从而将异源多核苷酸序列递送或转移到受试者(例如，哺乳动物)或受试者(例如，哺乳动物)细胞中。在另一个实施方式中，一种方法或用途是用于治疗缺乏或需要蛋白质表达或功能、或需要降低内源性蛋白质(例如，不希望有的、异常或失调的蛋白质)的表达或功能的受试者(例如，哺乳动物)，其包括提供病毒(例如，AAV-Rh74和相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体，例如RHM4-1))颗粒，许多这样的病毒(例如，AAV)颗粒或病毒(例如，AAV-Rh74和相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1))颗粒或许多这样的病毒(例如，AAV)颗粒的药物组合物；以及向受试者(例如，哺乳动物)施用病毒(例如，AAV-Rh74和相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体，例如RHM4-1))颗粒，许多这样的病毒(例如，AAV)颗粒或病毒(例如，AAV-Rh74和相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1))颗粒或许多这样的病毒(例如，AAV)颗粒的药物组合物，其中所述异源多核苷酸序列在哺乳动物中表达，或其中所述异源多核苷酸序列编码抑制性序列或降低受试者(例如，哺乳动物)中内源性蛋白(例如，不希望有的、异常或失调的蛋白质)的表达或功能的蛋白质。
用于施用或递送的方法和用途包括与受试者相容的任意模式。在具体的实施方式中，病毒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1))颗粒或许多这样的病毒(例如，AAV)颗粒(例如，AAV-Rh74载体或相关的AAV载体例如AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1))通过静脉内、动脉内、肌内、皮下、口服、通过插管、经由导管、经皮、颅内、经吸入、腔内或经粘膜施用或递送。
受试者包括哺乳动物，例如人类和非人类(例如，灵长类动物)。在具体的实施方式中，受试者将受益于或需要异源多核苷酸序列的表达。
根据本发明，提供了产生包括(衣壳化、包装)重组载体(例如，AAV)的重组载体(例如，AAV)质粒和病毒(例如，AAV-Rh74和相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1))颗粒的方法。在一个实施方式中，一种产生重组病毒或AAV颗粒的方法包括将重组载体(例如，AAV)质粒引入到包装辅助细胞中以产生生产性病毒(例如，AAV-Rh74和相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体，例如RHM4-1))感染；并在产生重组病毒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV，例如AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1))颗粒的条件下培养辅助细胞。在另一个实施方式中，一种产生具有减少量的重组病毒(例如，AAV-Rh74和相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体，例如RHM4-1))颗粒的重组病毒或AAV颗粒的方法，其中重组病毒载体包括污染性核酸，该方法包括将重组载体(例如，AAV)质粒引入到包装辅助细胞中；并且在产生重组病毒(例如，AAV-Rh74和相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1))颗粒的条件下培养辅助细胞，其中与包含在其中填料或填充多核苷酸序列不存在于重组病毒载体的条件下产生的污染性核酸的病毒(例如，AAV-Rh74和相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1))颗粒的数量相比较而言，所产生的所述重组病毒(例如，AAV-Rh74和相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1))颗粒具有的带有包含污染性核酸的重组载体基因组的病毒(例如，AAV-Rh74和相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1))颗粒的数量减少。在具体的方面，所述污染性核酸是细菌核酸；或不是异源多核苷酸序列的序列，或ITR、启动子、增强子、复制起点、多腺嘌呤序列或选择性标记。
辅助细胞包括哺乳动物细胞。在具体的实施方式中，辅助细胞提供辅助(例如，AAV)功能以将异源多核苷酸序列包装到病毒颗粒(例如，AAV颗粒例如AAV-Rh74和相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1))中。在具体的方面，辅助细胞提供AAV Rep和/或Cap蛋白(例如Rep78和/或Rep68蛋白)；辅助细胞被稳定地或瞬时地转染编码一个或更多个Rep和/或Cap蛋白序列的多核苷酸；辅助细胞被稳定地或瞬时转染编码一个或更多个序列的Rep78和/或Rep68蛋白多核苷酸。
本发明的重组载体(例如，AAV)质粒可基于任意菌株或血清型，其包括不同血清型的杂合体或嵌合体。本发明的重组病毒(例如，AAV)颗粒通常基于AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74及相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1))，而且包括具有不同血清型的杂合体或嵌合体。代表性的AAV血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和RH10血清型。因此，本发明的包括载体基因组的重组病毒(例如，AAV)颗粒可包括来自不同血清型的衣壳蛋白、血清型的混合物或者不同血清型的杂合体或嵌合体，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10血清型的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白。此外，本发明的重组载体(例如，AAV)、序列、质粒、载体基因组可包括来自任意一种血清型的元件、血清型混合物或不同血清型的杂合体或嵌合体。在多个实施方式中，重组AAV载体包括Cap、Rep和/或ITR序列，其衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh74或Rh10血清型，或任意上述AAV血清型的混合物、杂合体或嵌合体。
附图说明
图1示出了通过尾静脉注射在肝特异性启动子的控制下表达FIX转基因的AAV载体的C57BL/6小鼠(n＝5/组)的人因子IX(FIX)血浆水平。每只小鼠的载体剂量为2510个载体基因组。在基因转移后第1、2和4周通过ELISA测定FIX转基因产物(FIX蛋白)血浆水平。AAV-Rh74赋予最高水平的FIX转基因表达。
图2示出了在按每千克(kg)体重递送312载体基因组后B型血友病狗中犬FIX血浆水平。通过隐静脉静脉内(IV)输注AAV载体并通过ELISA监测FIX水平。通过肝特异性启动子启动治疗性FIX转基因的表达。在B型血友病狗中AAV8和AAV-Rh74载体表现大致相等并均优于AAV6。
图3示出了AAV-Rh74 VP1、VP2和VP3氨基酸序列以及对于VP1而言的多核苷酸(DNA)序列(SEQ ID NO:1-4)。
图4示出了将表达人因子IX(FIX)的AAV8和AAVrh74载体(在肝特异性启动子的控制下)施用给恒河猴，非人灵长类动物，并在动物中表达FIX。相比于注射相同剂量的其他组动物而言，接收AAVrh74-FIX载体(朝右边缘的最后两个杆)的动物表达更高水平的FIX转基因。
图5示出了相比于Rh74和AAV8衣壳化的AAV人因子IX表达载体而言，施用通过所指示的AAV(Rh74变体，例如RHM4-1变体)衣壳化的AAV人因子IX表达载体的动物的人血浆因子IX表达水平。
图6示出了将表达人因子IX的AAV8和AAV-Rh74变体RHM4-1载体(在肝特异性启动子的控制下)施用给食蟹猴，非人类灵长类动物，并在动物中表达FIX。
具体实施方式
本发明至少部分地基于表明腺相关病毒(AAV)血清型AAV-Rh74和相关的AAV变体例如AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6)对肝细胞具有高取向的数据，所述肝细胞是肝脏的细胞。因为多核苷酸的载体(例如基因，抑制性核酸等)转移/递送到细胞中，所以AAV-Rh74和相关的AAV变体例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6)可被用于在静脉内施用后提供在肝脏的表达治疗水平。此外，AAV-Rh74载体和相关的AAV变体例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6)介导的基因转移/递送产生的蛋白质表达水平显著高于其他几种血清型(参见例如图1、2、4、5和6)。特别是，AAV-Rh74载体和相关的AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1)靶基因用于递送到肝脏中，其效率与在B型血友病狗和/或在小鼠和/或猕猴中的肝转导金标准至少相当并且通常更优(AAV8)。因此，AAV-Rh74载体和相关的AAV变体例如AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1)可被用于转移/递送异源多核苷酸，例如用于提供所希望的或治疗益处的蛋白质的编码序列(基因)，以及减少或抑制不期望有的或有缺陷(例如，病理的)基因表达的抑制性(例如，反义)核酸，从而治疗多种疾病。例如，重组载体(例如，AAV)基因组可被包装或衣壳化在AAV-Rh74载体或相关的AAV变体例如AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6)内以将异源多核苷酸转移/递送到细胞中。
如本文所述，腺相关病毒(AAV)血清型AAV-Rh74和相关的AAV变体例如AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6)提供用于将多核苷酸序列递送到离体细胞、细胞外和细胞内的装置。这样的多核苷酸序列可编码蛋白质，使得内部被递送有该多核苷酸的细胞表达所编码的蛋白质。例如，重组AAV载体可包括编码所希望有的蛋白质或肽的异源多核苷酸，或当转录时包含抑制性序列(例如，RNA)例如靶向用于抑制表达的基因的序列的异源多核苷酸。因此，向受试者(例如，哺乳动物)递送或施用载体不仅向受试者提供编码蛋白质和肽的异源多核苷酸，而且提供靶向用于抑制受试者中的表达或功能的基因的抑制性核酸。
因此，根据本发明，提供了AAV-Rh74载体和相关的AAV载体变体例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6)，其包括(衣壳化或包装)载体基因组，该基因组包括编码肽和蛋白质的多核苷酸序列，以及直接或当转录时包括靶向用于抑制表达或功能的基因的抑制性核酸的多核苷酸序列。
重组“载体”或“AAV载体”通过以下措施衍生自病毒例如AAV的野生型基因组：使用分子学方法从病毒(例如，AAV)除去野生型基因组，并用非天然核酸例如异源多核苷酸序列(例如，治疗性基因表达盒)替代。通常，对于AAV而言，野生型AAV基因组的一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留在AAV载体中。重组病毒载体(例如，AAV)与病毒(例如，AAV)基因组分开，因为病毒基因组的全部或一部分已被替代为非天然序列，相对于该病毒(例如，AAV)基因组核酸例如异源多核苷酸序列而言。因此，掺入非天然序列例如异源多核苷酸将病毒载体(例如，AAV)定义为“重组”载体，其中在AAV的情况下可称为“rAAV载体”。
重组载体(例如，AAV)序列可被包装在病毒(在此也称为“颗粒”或“病毒体”)中以用于随后离体、细胞外或细胞内感染(转化)细胞。当重组载体序列被衣壳化或包装在AAV颗粒中时，该颗粒可被称为“rAAV”。这样的颗粒或病毒体将通常包括衣壳化或包装载体基因组的蛋白质。具体的示例包括病毒包膜蛋白，并且在AAV的情况下，为AAV衣壳蛋白。
在具体的实施方式中，重组载体(例如，AAV)是细小病毒载体。细小病毒是具有单链DNA基因组的小病毒。“腺相关病毒”(AAV)是细小病毒家族。
包括AAV的细小病毒是用作基因治疗载体的病毒，因为它们可穿透细胞并引入核酸/遗传物质，使得核酸/遗传物质可稳定地保持在细胞中。此外，这些病毒可将核酸/遗传物质引入到特定位点，例如，例如19号染色体上的特定位点。因为AAV与人类致病疾病无关，所以AAV载体能够将异源多核苷酸序列(例如，治疗性蛋白质和试剂)递送给人类患者而不造成实质性AAV发病或疾病。
AAV-Rh74和相关的AAV变体例如AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1)血清型(例如，VP1、VP2和/或VP3序列)可以与其他AAV血清型不同或可以相同，其他AAV血清型包括例如AAV1-AAV11或Rh10(例如，与任意AAV1-AAV11或Rh10血清型的VP1、VP2和/或VP3序列不同)。如本文所用的，术语“血清型”是用于指与其他AAV血清型具有血清学差异的具有衣壳的AAV的区分特征。基于一种AAV与另一种AAV相比较而言抗体之间缺乏交叉反应性来测定血清学特征。这样的交叉反应性差异通常由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)引起的。尽管包括衣壳变体的AAV-Rh74变体的可能性与Rh74或其他AAV无血清学差异，但是与Rh74或其他AAV相比较而言它们相差至少一个核苷酸或氨基酸残基。
传统定义上，血清型意指已测试了目的病毒针对对用于中和活性的所有现有的和表征的血清型具有特异性的血清并且已经发现无抗体中和目的病毒。随着越来越多的天然存在的病毒分离物的发现和/或衣壳突变体的产生，任意现有的血清型可能具有或可能无血清学差异。因此，在新病毒(例如，AAV)无血清学差异的情况下，该新病毒(例如AAV)将是相应血清型的亚组或变体。在许多情况下，用于中和活性的血清学测试尚未对突变病毒进行衣壳序列修饰以确定它们根据血清型的传统定义是否为另一血清型。因此，为了方便起见并为了避免重复，术语“血清型”广义地是指血清学差异的病毒(例如，AAV)以及可以在亚组或指定的血清型的变体内的血清学无差异的病毒(例如，AAV)二者。
重组载体(例如，AAV)质粒及其方法和用途包括任意病毒株或血清型。作为非限制性示例，重组载体(例如，AAV)质粒可基于任意AAV基因组，例如AAV-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-rh74、-rh10或AAV-2i8，例如。这样的载体可基于相同的菌株或血清型(或亚组或变体)，或可以彼此不同。作为非限制性示例，基于一种血清型基因组的重组载体(例如，AAV)质粒可以与包装载体的一种或更多种衣壳蛋白相同。此外，重组载体(例如，AAV)质粒可以基于与包装载体的一种或更多种衣壳蛋白不同的AAV(例如AAV2)血清型基因组，在此情况下，三种衣壳蛋白中的至少一种可以是AAV-Rh74或相关的AAV变体例如AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体，例如RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6)，例如。
AAV-Rh74的基因/蛋白序列与特征为AAV-Rh74(参见例如，图3的VP1、VP2、VP3)的序列的相同。如本文所使用的“与AAV-Rh74相关的AAV载体”及其语法变体是指一种或更多种AAV蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3序列)，其序列与包含AAV-Rh74的一种或更多种多核苷酸或多肽序列基本上具有同一性。因此，与AAV-Rh74相关的这样的AAV载体可具有与AAV-Rh74不同的一个或更多个序列，但与一个或更多个基因可显示出显著的序列同一性和/或具有AAV-Rh74的一种或更多种功能特性(例如，比如细胞/组织嗜性)。例如，AAV-Rh74相关的AAV变体RHM4-1具有不同于Rh74衣壳的含有四个氨基酸的衣壳。示例性的AAV-Rh74和相关的AAV变体例如AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74变体(例如衣壳变体，例如RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6)序列包括例如本文图3中所述的VP1、VP2和/或VP3。在一个非限制性的示例性实施方式中，与AAV-Rh74相关的AAV载体具有其多核苷酸、多肽或子序列，该多核苷酸、多肽或子序列包括与图3中所述的序列的一个或更多个AAV-Rh74 VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更多(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)相同的序列或由该序列组成。
根据本发明，方法和用途包括AAV-Rh74序列(多肽和核苷酸)和其子序列，该AAV-Rh74序列(多肽和核苷酸)和其子序列表现出与参比Rh74 AAV基因或蛋白质序列(例如，图3中所述的VP1、VP2和/或VP3)具有小于100％序列同一性，但是与已知的AAV基因或蛋白质例如AV1-AAV11、AAV-RH10、基因或蛋白质等不同并且不具有同一性。在一个实施方式中，AAV-Rh74多肽或其子序列包括与任意参比AAV-Rh74序列或其子序列(例如，图3中所述的VP1、VP2和/或VP3序列)具有至少80％或更多同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的序列或由该序列组成。在具体的方面，AAV-Rh74相关的变体具有在AAV-Rh74(例如，衣壳变体RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6)中所述的四个氨基酸替代基中的一个、两个、三个或四个。
重组载体(例如，AAV)包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、RH10、Rh74或AAV-2i8和变体、相关的、混合和嵌合序列，可以使用本领域技术人员已知的重组技术构建，以包括一个或更多个异源多核苷酸序列(转基因)，旁侧为一个或更多个功能AAV ITR序列。这样的载体可具有野生型AAV基因的被全部或部分删除的一个或更多个，例如，rep和/或cap基因，但保留至少一个功能旁侧ITR序列，是将重组载体救援、复制和包装到AAV载体颗粒中所必需的。因此，AAV载体基因组将包括顺式复制和包装所需的序列(例如功能性ITR序列)。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文可互换使用，是指包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)在内的所有形式的核酸、寡核苷酸。多核苷酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA，和剪接或未剪接的mRNA、rRNA tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如，小的或短的发夹(sh)RNA、微RNA(miRNA)、小的或短的干扰RNA(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。多核苷酸包括天然存在的、合成的和有意改变或修饰的多核苷酸以及类似物和衍生物。多核苷酸可以是单链、双链或三链、线性或环状的，并且可以是任意长度。在讨论多核苷酸时，根据提供沿5’至3’方向的序列的惯例，本文可以描述特定多核苷酸的序列或结构。
“异源”多核苷酸是指为了将多核苷酸经载体介导转移/递送到细胞中的目的插入到载体(例如，AAV)中的多核苷酸。异源多核苷酸通常不同于载体(例如，AAV)核酸，也就是说，相对于病毒(例如，AAV)核酸而言是非天然的。一旦转移/递送到细胞中，那么包含在病毒体内的异源多核苷酸就可表达(例如，如果合适的话，转录并翻译)。或者，包含在病毒体内的被传送/递送到细胞中的异源多核苷酸不需要表达。虽然术语“异源”在本文中并不总是参比多核苷酸使用，但甚至在没有修饰词“异源”的情况下提及的多核苷酸意指即使省略“异源”也包括异源多核苷酸。
由“多核苷酸序列”编码的“多肽”、“蛋白质”和“肽”包括全长天然序列，和天然存在的蛋白质以及功能子序列、修饰形式或序列变体，只要所述子序列、修饰形式或变体保留天然全长蛋白的一定程度的功能性即可。在本发明的方法和用途中，由多核苷酸序列编码的这样的多肽、蛋白质和肽可以是但不必需与治疗的哺乳动物中有缺陷的或表达不足或缺乏的内源蛋白质相同。
本发明的腺相关病毒(AAV)血清型AAV-Rh74和相关的AAV变体例如AAV-Rh74变体(例如，衣壳变体例如RHM4-1、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6)可用于稳定或瞬时地将多核苷酸导入/递送到细胞及其后代中。本文所用的术语“转基因”方便地是指已被导入细胞或生物体内的这样的异源多核苷酸。转基因包括任意多核苷酸，例如编码多肽或蛋白质的基因，转录成抑制性多核苷酸的多核苷酸，或者不转录的多核苷酸(例如，缺乏表达调控元件，例如驱动转录的启动子)。
例如，在具有转基因的细胞中，所述转基因已由载体例如AAV导入/转移，“转化”细胞。术语“转化”和“转染”是指将分子例如多核苷酸导入细胞或宿主生物中。
其中已导入有转基因的细胞被称为“转化细胞”或“转化体”。因此，“转化”或“转染”的细胞(例如，在哺乳动物中，例如细胞或组织或器官细胞)，意指在将外源分子例如多核苷酸或蛋白质(例如，转基因)导入到细胞中之后细胞中的遗传改变。因此，例如，“转染”或“转化”的细胞是其中或者其后代中已导入外源分子的细胞。一种或更多种细胞可被传代并且所导入的蛋白质被表达或核酸被转录。对于基因治疗的用途和方法而言，转化细胞可在受试者中。
所导入的多核苷酸可以或可以不被整合到受体细胞或生物体的核酸内。如果所导入的多核苷酸被整合到受体细胞或生物体的核酸(基因组DNA)内，其可稳定地保持在该细胞或生物体中，并进一步传代到或遗传给受体细胞或生物体的传代细胞或生物体。最后，所导入的核酸可仅短暂地存在于受体细胞或宿主生物体中。
可被转化的细胞包括任意组织或器官类型、任意来源(例如，中胚层、外胚层或内胚层)的细胞。细胞的非限制性示例包括肝(例如，肝细胞、肝窦内皮细胞)，胰腺(例如，胰岛β细胞)，肺，中枢或外周神经系统，例如脑(例如，神经、神经胶质或室管膜细胞)或脊柱，肾，眼(例如，视网膜、细胞组分)，脾，皮肤，胸腺，睾丸，肺，膈肌，心脏(心肌)，肌肉或腰肌，或内脏(例如内分泌)，脂肪组织(白色、褐色或米色)，肌肉(例如，成纤维细胞)，滑膜细胞，软骨细胞，破骨细胞，上皮细胞，内皮细胞，唾液腺细胞，内耳神经细胞或造血的(例如，血液或淋巴)细胞。其他的示例包括干细胞，例如发育或分化为肝脏的亚全能性(pluripotent)或多能(multipotent)祖细胞(例如，肝细胞、肝窦内皮细胞)，胰腺(例如，胰岛β细胞)，肺，中枢或外周神经系统，例如脑(例如，神经、神经胶质或室管膜细胞)或脊椎，肾，眼(视网膜，细胞组分)，脾，皮肤，胸腺，睾丸，肺，膈肌，心脏(心脏)，肌肉或腰肌，或内脏(如内分泌)，脂肪组织(白色，棕色或米色)，肌肉(例如，成纤维细胞)，滑膜细胞，软骨细胞，破骨细胞，上皮细胞，内皮细胞，唾液腺细胞，内耳神经细胞或造血的(例如，血液或淋巴)细胞。
在一个实施方式中，“治疗分子”是可减轻或减少由细胞或受试者中蛋白质缺乏或缺陷所造成的症状的肽或蛋白质。或者，通过转基因编码的“治疗”肽或蛋白质是赋予受试者益处的一种，例如，以纠正遗传缺陷、纠正基因(表达或功能)缺陷或抗癌作用。
用于根据本发明的编码基因产物(例如，治疗性蛋白质)的异源多核苷酸的具体的非限制性示例包括但不限于：包括或编码CFTR(囊性纤维化跨膜调节蛋白)的基因、包括功能获得型凝血因子(gain of function blood coagulation factors)的凝血(凝固)因子(因子XIII、因子IX、因子X、因子VIII、凝血因子VIIa、蛋白C等)、抗体、视网膜色素上皮细胞特异性65kDa蛋白(RPE65)、促红细胞生成素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、β-珠蛋白、α-珠蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶(ADA)、金属转运体(ATP7A或ATP7)、磺酰胺酶、参与溶酶体贮积症(ARSA)的酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、β-25葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体氨基己糖苷酶、支链酮酸脱氢酶、激素、生长因子(例如，胰岛素样生长因子1和2、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和-4、脑源性神经营养因子、神经胶质源生长因子、转化生长因子α和β，等等)、细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、白介素-2、白介素-4，白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、自杀基因产物(例如，单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶、肿瘤坏死因子等)、药物抗性蛋白(例如，提供对癌症治疗中使用的药物的抗性)、肿瘤抑制蛋白(例如，p53、Rb、Wt-1、NF1、希佩尔林道(VHL)、腺瘤性结肠息肉病(APC))、具有免疫调节特性的肽、致耐受性或免疫原性肽或蛋白质Tregitopes[de Groot等人，Blood 2008年10月15日；112(8)：3303]，或hCDR1[Sharabi等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2006年6月6日；103(23):8810-5]、胰岛素、葡萄糖激酶、鸟苷酸环化酶2D(LCA-GUCY2D)、Rab护卫蛋白1(无脉络膜)、LCA 5(LCA-Lebercilin)、鸟氨酸酮酸转氨酶(回旋形萎缩)、Retinoschisin 1(X连锁视网膜劈裂症)、USH1C(亚瑟综合征1C)、X连锁视网膜色素变性GTP酶(XLRP)、MERTK(RP的AR形式：色素性视网膜炎)、DFNB1(连接蛋白26耳聋)、ACHM 2、3和4(色盲)、PKD-1或PKD-2(多囊肾病)、TPP1、CLN2、溶酶体贮积病的基因缺陷病因(例如，硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、NPC1、VPC2、鞘脂激活蛋白等)、用于基因组编辑的一个或更多个锌指核酸酶或用作用于基因组编辑的修复模板的供体序列。
此外，用于根据本发明的编码基因产物(例如，治疗性蛋白质)的异源多核苷酸的具体的非限制性示例包括可用于治疗疾病或病症的那些，该疾病或病症包括但不限于囊性纤维化(和肺的其他疾病)、A型血友病、B型血友病、地中海贫血、贫血和其他血液疾病、艾滋病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫症和其他神经病症、癌症、糖尿病、肌营养不良(例如，Duchenne型、Becker型)、高雪氏病、胡尔勒氏病、腺苷脱氨酶缺乏症、糖原贮积病和其他代谢缺陷、视网膜变性疾病(和眼睛的其他疾病)和实体器官(例如，脑、肝、肾、心脏)的疾病。
编码基因产物的所有哺乳动物和非哺乳动物形式的多核苷酸(包括非限制性基因和蛋白质)被明确地包括，其或者是已知的或者是未知的。因此，本发明包括来自非哺乳动物、人类以外的哺乳动物和人类的基因和蛋白质，这些基因和蛋白质以与本文所述的人类基因和蛋白质基本上相似的方式发挥作用。非哺乳动物基因的非限制性示例是Fok核酸酶结构域，其是来源细菌的。哺乳动物非人FIX序列的非限制性示例描述在Yoshitake etal.,1985,supra；Kurachi et al.,1995,supra；Jallat et al.,1990,supra；Kurachi etal.,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6461-6464；Jaye et al.,1983,Nucl.AcidsRes.11:2325-2335；Anson et al.,1984,EMBO J.3:1053-1060；Wu et al.,1990,Gene 86:275-278；Evans et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86:10095(1989),Blood 74:207-212；Pendurthi et al.,1992,Thromb.Res.65:177-186；Sakar et al.,1990,Genomics 1990,6:133-143；和Katayama et al.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4990-4994中。
如本文所述，异源多核苷酸序列(转基因)包括抑制性和反义核酸序列。抑制性、反义、siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微RNA)、shRNA(小发夹RNA)、RNAi和反义寡核苷酸可调节靶基因的表达。这样的分子包括能抑制涉及调解疾病过程从而降低、抑制或减轻疾病的一个或更多个症状的靶基因的表达的那些。
反义包括单键、双键或三链多核苷酸和肽核酸(PNA)，其结合RNA转录物或DNA(例如，基因组DNA)。衍生自靶基因的转录起始位点(例如从起始位点-10至10位之间)的寡核苷酸是另一个具体的示例。三链形成反义可结合双链DNA，从而抑制该基因的转录。“RNAi干扰”是使用单链或双链RNA序列以抑制基因表达(参见例如，Kennerdell等人，Cell 95:1017(1998)和Fire等人，Nature,391:806(1998))。根据本发明的方法和用途，来自靶基因编码区的双链RNA序列因此可用于抑制或阻止基因表达/转录。可基于编码靶基因序列(例如，亨廷顿或HTT)的核酸例如编码哺乳动物和人类HTT的核酸来产生反义和RNAi。例如，单链或双链核酸(例如，RNA)可靶向HTT转录物(例如，mRNA)。
“siRNA”是指涉及用于序列特异性转录后基因沉默或基因敲除的RNA干扰过程的治疗分子。siRNA与靶基因的同源mRNA的序列具有同源性。小干扰RNA(siRNA)可以在体外合成或者通过核糖核酸酶III切割较长的dsRNA产生并且是序列特异性mRNA降解的调节剂。可以使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪化学合成本发明的siRNA或其他这样的核酸。SiRNA可作为两个独立的互补RNA分子或作为带有两个互补区的单个RNA分子合成。合成的RNA分子或合成试剂的供应商包括Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)、Proligo(Hamburg,Germany)、Dharmacon Research(Lafayette,Colo.,USA)、Pierce Chemical(part of Perbio Science,Rockford,Ill.,USA)、Glen Research(Sterling,Va.,USA)、ChemGenes(Ashland,Mass.,USA)和Cruachem(Glasgow,UK)。用于抑制靶基因的mRNA的特异性siRNA构建体的长度可以是介于15-50个核苷酸之间，并且更典型地长度为约20-30个核苷酸。可使用本领域技术人员已知的常规方法将这样的核酸分子容易地导入本文公开的病毒载体中。
根据本发明可以用抑制性核酸序列靶向的基因(例如，基因组DNA)或致病基因的转录物(例如，RNA或mRNA)的具体的非限制性示例中包括但不限于：与多核苷酸重复疾病相关的基因例如亨廷顿(HTT)基因、与齿状核红核苍白球路易体萎缩相关的基因(例如，肌萎缩蛋白1、ATN1)；脊髓延髓性肌萎缩中X染色体上的雄激素受体、人Ataxin-1、-2、-3和-7、由(CACNA1A)编码的Cav2.1P/Q-电压依赖性钙通道、TATA结合蛋白、Ataxin 8反链(也被称为ATXN8OS)、丝氨酸/苏氨酸-蛋白磷酸酶2A55kDa调节亚基Bβ异形体脊髓小脑性共济失调(1、2、3、6、7、8、12、17型)、脆性X综合征中的FMR1(脆性X智力低下1)、脆性X相关的震颤/共济失调综合征中的FMR1(脆性X智力低下1)、脆性XE精神发育迟滞中的FMR1(脆性X智力低下2)或AF4/FMR2家族成员2；强直性肌营养不良中的肌强直-蛋白激酶(MT-PK)；弗里德里希共济失调中的Frataxin；肌萎缩性侧索硬化中的超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的突变体；涉及帕金森氏病和/或阿尔茨海默氏病的发病机制的基因；载脂蛋白B(APOB)和前蛋白转化酶枯草溶菌素/可馨型9(PCSK9)、高胆固醇血症；HIV感染中的HIV Tat、转录基因的人类免疫缺陷病毒反式激活因子；HIV感染中的HIV TAR、HIV TAR、人类免疫缺陷病毒反式激活反应元件基因；HIV感染中的C-C趋化因子受体(CCR5)；劳斯肉瘤病毒(RSV)感染中的劳斯肉瘤病毒(RSV)核衣壳蛋白、丙型肝炎病毒感染中的肝特异性微RNA(miR-122)；P53、急性肾损伤或移植肾功能延迟移植或肾损伤急性肾功能衰竭；复发提前或转移性实体瘤的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2、LMP2也被称为蛋白酶体β亚基-9型(9HRDF)、转移性黑色素瘤；LMP7，其也被称为蛋白酶亚基β型8(8HRDF)、转移性黑素瘤；MECL1，其也被称为蛋白酶亚基β型10(HRDF10)，转移性黑素瘤；实体瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；实体瘤中的驱动蛋白纺锤体蛋白、慢性髓性白血病中的细胞凋亡抑制B细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；实体瘤中的核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)；实体瘤中的弗林蛋白酶；肝肿瘤中的Polo样激酶1(PLK1)、丙型肝炎感染中的甘油二酯酰基转移酶1(DGAT1)、家族性腺瘤性息肉病中的β-链蛋白；β2肾上腺素受体，青光眼；糖尿病性黄斑水肿(DME)或年龄相关性黄斑变性中的RTP801/Redd1，也被称为DNA损伤诱导转录蛋白4；年龄相关性黄斑变性或脉络膜新生血管中的血管内皮生长因子受体I(VEGFR1)，非动脉缺血性视神经病变中的胱天蛋白酶2；先天性厚甲中的角蛋白6A N17K突变蛋白；流感感染中的A型流感病毒基因/基因序列；严重急性呼吸道症候群(SARS)感染中的SARS冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道合胞病毒感染中的呼吸道合胞病毒基因组/基因序列；埃博拉病毒感染中的纤维病毒埃博拉病毒基因组/基因序列；乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染中的乙型肝炎和丙型肝炎病毒基因组/基因序列；单纯疱疹病毒(HSV)感染中的HSV基因组/基因序列，柯萨奇病毒B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；原发性肌张力障碍中的基因(等位基因特异性沉默)样扭转蛋白A(TOR1A)的致病性等位基因沉默，pan-I类和HLA等位基因特异性移植；常染色体显性遗传性色素性视网膜炎(adRP)中的突变体视紫红质基因(RHO)。
多核苷酸、多肽和其子序列包括改性和变体形式。如本文所用的术语“修饰”或“变体”及其语法变体意指多核苷酸、多肽或其子序列衍生自参比序列。因此，修饰和变体序列可具有与参比序列基本上相同的、大于或小于参比序列的活性或功能，但至少保留参比序列的局部活性或功能。
因此，本发明还包括天然和非天然存在的变体。这样的变体包括AAV-Rh74变体，例如AAV-Rh74衣壳变体。这样的AAV-Rh74衣壳变体的具体示例包括RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3、RHM15-4、RHM15-5、RHM15-6和RHM4-1(参见例如图5)。
这样的变体还包括功能变体的增加和减少，例如，野生型人FIX DNA序列，其中蛋白质变体或突变体保留活性，或者是治疗有效的，或者与本发明的方法和用途中的非变体人FIX的治疗活性相当或甚至更强。在一个具体的示例中，IV型胶原用于捕获FIX，意味着当导入到哺乳动物的肌肉组织中时，一些FIX不可用于参与凝血，因为它保留在肌肉组织中的间隙空间内。导致蛋白具有降低的IV型胶原结合的FIX的序列中的突变(例如，功能丧失)是用于本发明的方法的突变体，例如用于治疗血友病。这样的突变人FIX基因的示例编码人FIX蛋白，其中氨基酸丙氨酸替代从成熟蛋白质开始的第五个氨基酸位置中的赖氨酸。
修饰的非限制性示例包括一个或更多个核苷酸或氨基酸替代(例如，1-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-100或更多个核苷酸或残基)，例如精氨酸替代赖氨酸残基(例如，一个或更多个精氨酸替代如在RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6中任一个中所述的赖氨酸)、参比序列的增加(例如，插入或1-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-100或更多个核苷酸或残基)和缺失(例如，子序列或片段)。在具体的实施方式中，修饰或变体序列保留未经修饰的序列的至少一部分功能或活性。这样的修饰形式和变体可具有小于、等于或大于参比序列的功能或活性，但是具有该功能或活性的至少一部分，例如，如本文所述。
变体可具有一个或更多个非保守或保守氨基酸序列差异或修饰，或两者兼而有之。“保守替代”是一个氨基酸被生物学、化学或结构上相似的残基替代。生物学相似意指替代不破坏生物活性。结构相似意指氨基酸具有长度类似的侧链，例如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸或相似的大小。化学相似意指残基具有相同的电荷或均为亲水性的或疏水性的。具体的示例包括一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸替代另一个，或一个极性残基替代另一个，例如精氨酸替代赖氨酸(例如，RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6)，谷氨酸替代天冬氨酸或谷氨酰胺替代天冬酰胺，丝氨酸替代苏氨酸等等。保守替代的具体示例包括疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸替代另一个，极性残基替代另一个，例如精氨酸替代赖氨酸，谷氨酸替代天冬氨酸，或谷氨酰胺替代天冬酰胺等等。例如，保守氨基酸替代通常包括以下组内的替代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。“保守替代”还包括使用替代的氨基酸替代未经替代的母体氨基酸。
因此，本发明包括基因和蛋白质变体(例如，编码本文所述的蛋白质的多核苷酸的)，其保留一种或更多种生物活性(例如，凝血功能等)。蛋白质或多肽的这样的变体包括蛋白质或多肽，其已经或可使用重组DNA技术进行修饰，使得蛋白质或多肽具有改变的或其他的特性，例如，变体赋予血浆中提高的蛋白质稳定性或提高的蛋白质活性。变体可不同于参比序列，例如天然存在的多核苷酸、蛋白质或肽。
在核苷酸序列水平，天然和非天然存在的变体基因与参比基因将通常具有至少约50％同一性，更通常约70％同一性，甚至更通常约80％同一性(90％或更高同一性)。在氨基酸序列水平，天然和非天然存在的变体蛋白质与参比蛋白质将通常具有至少约70％同一性，更通常约80％同一性，甚至更通常约90％或更高同一性，虽然非同一性的大部分区域允许在非保守区(例如，小于70％同一性，例如小于60％、50％或甚至40％)。在其他实施方式中，所述序列与参比序列具有至少60％、70％、75％或更高同一性(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)。在多核苷酸、多肽或蛋白质中引入核苷酸和氨基酸变化的步骤是本领域技术人员已知的(参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2007))。
术语“同一性”、“同源性”及其语法变体意指当两个或更多个参比实体是“对准的”序列时它们是相同的。因此，举例而言，当两个多肽序列相同时，它们至少在参比区域或一部分内具有相同的氨基酸序列。当两个多核苷酸序列相同时，它们至少在参比区域或一部分内具有相同的多核苷酸序列。同一性可以是在序列的限定区域(区域或结构域)上。同一性“区”或“区域”是指两个或更多个参比实体的相同的一部分。因此，当两个蛋白质或核酸序列在一个或更多个序列区或区域上相同时，它们在该区域内共享同一性。“对准的”序列是指多个多核苷酸或蛋白质(氨基酸)序列，相比于参比序列通常具有用于缺失或添加的碱基或氨基酸(间隙)的校正。
同一性可以在整个序列长度或序列的一部分上延伸。在具体的方面，共享百分比同一性的序列的长度为2、3、4、5或更多个连接的多核苷酸或氨基酸，例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等等连接的氨基酸。在另外的具体方面，共享同一性的序列的长度为20个或更多个连接的多核苷酸或氨基酸，例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35等等个连接的氨基酸。在进一步的具体方面，共享同一性的序列的长度为35或更多个连接的核苷酸或氨基酸，例如，35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、45、47、48、49、50等等个连接的氨基酸。在进一步的具体方面，共享同一性的序列的长度为50个或更多个连接的多核苷酸或氨基酸，例如，50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-110等等个连接的多核苷酸或氨基酸。
术语“同源”或“同源性”意指两个或更多个参比实体在给定的区域或部分上共享至少部分同一性。同源性或同一性的“区、区域或结构域”意指两个或更多个参比实体的一部分共享同源性或者是相同的。因此，当两个序列在一个或更多个序列区域上相同时，它们在这些区域共享同一性。“实质性同源性”意指分子是结构或功能上保守的，使得其具有或被预测具有参比分子或参比分子的与其共享同源性的相关的/相应的区域或一部分的一个或更多个结构或功能的至少部分结构或功能(例如，生物功能或活性)。
两个序列之间的同一性(同源性)程度可以使用计算机程序和数学算法确定。计算百分比序列同一性(同源性)的这样的算法通常导致序列间隙并在比对区或区域上错配。例如，BLAST(例如，BLAST 2.0)搜索算法(参见例如，Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403(1990)，公众可通过NCBI获得)具有如下示例性搜索参数：错配-2；间隙口5；间隙延伸2。对于多肽序列比对而言，BLASTP算法通常与评分矩阵组合使用，例如PAM100、PAM 250、BLOSUM62或BLOSUM 50。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)和SSEARCH序列比对程序也用于定量同一性程度(Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)；Pearson,Methods MolBiol.132:185(2000)；和Smith等人，J.Mol.Biol.147:195(1981))。还已开发了使用基于Delaunay的拓扑映射定量蛋白结构相似性的程序(Bostick等人，Biochem Biophys ResCommun.304:320(2003))。
多核苷酸包括添加和插入例如异源结构域。添加(例如，异源结构域)可以是任意类型分子与组合物共价或非共价连接。通常，添加和插入(例如，异源结构域)赋予互补或不同的功能或活性。
添加和插入包括嵌合和融合序列，其是具有通常不存在于与所述序列共价连接的参比天然(野生型)序列中的一种或更多种分子的多核苷酸序列或蛋白质。术语“融合”或“嵌合”及其语法变体当用于提及分子时意指所述分子的一部分或部分包含与所述分子不同(异源)的不同实体，因为它们通常不一起存在于自然界中。也就是说，例如，融合或嵌合的一部分包括或由不一起存在于自然界中并且结构不同的一部分组成。
术语“载体”是指质粒、病毒(例如，AAV载体)、粘粒或可以通过插入或导入多核苷酸来操纵的其他载体。这样的载体可用于基因操纵(即“克隆载体”)，以将多核苷酸导入/转移到细胞中，并在细胞中转录或翻译所插入的多核苷酸。载体核酸序列通常含有用于在细胞中传代的至少复制起点和任选的其他元件，例如异源多核苷酸序列、表达调控元件(例如，启动子、增强子)、选择性标记(例如，抗生素抗性)、多腺嘌呤序列。
如本文所使用的作为病毒载体的修饰语(例如重组AAV载体)以及作为序列的修饰语(例如重组多核苷酸和多肽)的术语“重组”意指所述组合物(例如，AAV或序列)以已被通常不存在于自然界中的方式处理过(即，经工程改造的)。重组载体(例如AAV载体)的具体示例将是其中通常不存在于野生型病毒(例如，AAV)基因组中的多核苷酸插入病毒基因组的情况。例如，重组多核苷酸的示例将是其中编码蛋白质的异源多核苷酸(例如，基因)被克隆到载体中，具有或没有5’、3’和/或内含子区，基因通常关联于病毒(例如，AAV)基因组中。虽然术语“重组”在本文中并不总是参照病毒载体(例如AAV载体以及例如多核苷酸和多肽等序列)使用，但是尽管有任意这样的省略，重组形式的AAV以及包括多核苷酸和多肽的序列仍明确地被包括。
重组载体“基因组”(例如，AAV载体基因组)可被衣壳化或包装到病毒(在此也称为“颗粒”或“病毒体”)中，用于随后离体、体外或体内感染(转导或转化)细胞。当重组AAV载体基因组被衣壳化或包装在AAV颗粒中时，该颗粒可被称为“rAAV”。这样的颗粒或病毒体将通常包括衣壳化或包装载体基因组的蛋白质。具体示例包括病毒衣壳和包膜蛋白，并且在AAV的情况下为AAV衣壳蛋白质。
对于重组质粒而言，载体“基因组”是指最终包装或衣壳化以形成病毒颗粒的重组质粒序列部分。在重组质粒被用于构建或制造重组载体的情况下，所述载体基因组不包括不对应于重组质粒的载体基因组序列的“质粒”的一部分。该重组质粒的非载体基因组部分被称为“质粒骨架”，其对于质粒的克隆和扩增(传代和重组病毒生产所需要的方法)是重要的，但本身不包装或衣壳化到病毒(例如，AAV)颗粒中。
因此，载体“基因组”是指由病毒(例如，AAV)包装或衣壳化的载体质粒的一部分，并且其含有异源多核苷酸序列。重组质粒的非载体基因组部分包括对于质粒克隆和扩增重要但是其本身不由病毒(例如，AAV)包装或衣壳化的骨架。
病毒载体衍生自或基于包含病毒基因组的一个或更多个核酸元件。具体的病毒载体包括细小病毒载体，例如腺相关病毒(AAV)载体。
重组载体序列通过插入或导入多核苷酸来操纵。如本文所公开的载体质粒通常包含用于在细胞中传代的至少复制起点和一个或更多个表达调控元件。
包括AAV载体的载体序列可包括一个或更多个“表达调控元件”。通常，表达调控元件是影响可操作地连接的多核苷酸的表达的核酸序列。包括存在于载体中的调控元件(该调控元件包括如本文所述的表达调控元件，例如启动子和增强子)以促进适当的异源多核苷酸转录以及如果合适的话促进翻译(例如，启动子、增强子、内含子的剪接信号、维持基因的正确的阅读框架以允许框内翻译mRNA和终止密码子等)。这些元件通常顺式作用但也可以反式作用。
表达调控可以在转录、翻译、剪接、信息稳定性等水平来实施。通常，调节转录的表达调控元件并列靠近所转录的多核苷酸的5’末端(即“上游”)。表达调控元件也可位于所转录的序列的3’末端(即，“下游”)或转录物内(例如，在内含子中)。表达调控元件可位于远离所转录的序列的距离(例如，远离所述多核苷酸100至500、500至1000、2000至5000、5000至10,000或更多个核苷酸)处，甚至在相当远的距离处。然而，由于多核苷酸长度的限制，对于AAV载体而言，这样的表达调控元件将通常在远离多核苷酸的1至1000个核苷酸内。
在功能上，可操作地连接的异源多核苷酸的表达至少部分地可由所述元件(例如，启动子)调控，使得所述元件调节多核苷酸的转录以及适当时调节转录物的翻译。表达调控元件的具体示例是启动子，其通常位于转录序列的5’端。表达调控元件的另一个示例是增强子，其可位于所转录的序列的5’、3’端或所转录的序列内。
如本文所用的“启动子”可以指位于与编码重组产物的多核苷酸序列相邻处的DNA序列。启动子通常可操作地连接在相邻的序列例如异源多核苷酸上。与在不存在启动子的情况下所表达的量相比较而言，启动子通常增加异源多核苷酸所表达的量。
如本文所用的“增强子”可以指与异源多核苷酸相邻的序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游，但是可发挥功能并且可位于DNA序列(例如，异源多核苷酸)的下游或之内。因此，增强子元件可位于异源多核苷酸上游或下游的100个碱基对、200个碱基对或300或更多个碱基对处。增强子元件通常增加异源多核苷酸的表达至高于由启动子元件所赋予的增加的表达。
表达调控元件(例如，启动子)包括在特定组织或细胞类型中具有活性的那些，本文中称为“组织特异性表达调控元件/启动子”。组织特异性表达调控元件通常在特定细胞或组织(例如，肝、脑、中枢神经系统、脊髓、眼、视网膜、骨骼、肌肉、肺、胰、心脏、肾细胞等)中具有活性。表达调控元件通常在这些细胞、组织或器官中具有活性，因为它们被转录激活蛋白或是特定细胞、组织或器官类型所特有的其他转录调节剂识别。
例如，如果希望在骨骼肌中表达时，可使用在肌肉中是活性的启动子。这些包括从编码骨骼肌α-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、抗肌萎缩蛋白、肌肉肌酸激酶以及具有高于天然存在的启动子的活性的合成肌肉启动子(参见例如Li,et al.,Nat.Biotech.17:241-245(1999))。对肝脏具有组织特异性的启动子的示例是白蛋白，Miyatake,et al.J.Virol.,71:5124-32(1997)；乙肝病毒核心启动子，Sandig,et al.,Gene Ther.3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot,et al.,Hum.Gene.Ther.,7:1503-14(1996)，骨(骨钙素，Stein,et al.,Mol.Biol.Rep.,24:185-96(1997)；骨唾液蛋白，Chen,et al.,J.BoneMiner.Res.11:654-64(1996))，淋巴细胞(CD2，Hansal,et al.,J.Immunol.,161:1063-8(1998)；重链免疫球蛋白；T细胞受体链)，神经元(神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子，Andersen,et al.,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993)；神经丝轻链基因，Piccioli,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991)；神经元特异性vgf基因，Piccioli,etal.,Neuron,15:373-84(1995)]等等。
表达调控元件还包括普遍存在的或混杂的启动子/增强子，其能够驱动多核苷酸在许多不同的细胞类型中表达。这样的元件包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子/增强子序列、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子/增强子序列和在多种哺乳动物细胞类型中具有活性的其他病毒启动子/增强子，或自然界中不存在的合成元件(参见例如，Boshart etal,Cell,41:521-530(1985))，SV40启动子，二氢叶酸还原酶启动子，细胞质β肌动蛋白启动子和磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。
表达调控元件还可赋予以可调节的方式进行表达，即信号或刺激增加或减少可操作地连接的异源多核苷酸的表达。响应于信号或刺激增加可操作地连接的多核苷酸的表达的调控元件也称为“诱导型元件”(即，被信号诱导)。具体的示例包括但不限于激素(例如，类固醇)诱导型启动子。响应于信号或刺激减少可操作地连接的多核苷酸的表达的调控元件被称为“阻遏型元件”(即，信号减少表达，使得当信号消失或不存在时表达增加)。通常，由这样的元件赋予的增加或减少的量与所存在的信号或刺激的量成正比；信号或刺激的量越大，表达的增加或减少越大。具体的非限制性示例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子；类固醇激素-诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MTV)启动子；T7聚合酶启动子系统(WO98/10088)；四环素阻遏系统(Gossen,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))；四环素诱导系统(Gossen,et al.,Science.268:1766-1769(1995)；还参见Harvey,et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.2:512-518(1998))；RU486诱导系统(Wang,et al.,Nat.Biotech.15:239-243(1997)和Wang,et al.,Gene Ther.4:432-441(1997)]；和雷帕霉素-诱导型系统(Magari,et al.,J.Clin.Invest.100:2865-2872(1997)；Rivera,et al.,Nat.Medicine.2:1028-1032(1996))。可用在这种情况下的其他调节调控元件是由特定的生理状态(例如温度、急性期)调节的那些。
表达调控元件还包括用于异源多核苷酸的一个或更多个天然元件。当希望异源多核苷酸的表达应模拟天然表达时可使用天然调控元件(例如，启动子)。当异源多核苷酸的表达是时间上或发育上调节的，或以组织特异性的方式或响应于特定的转录刺激时可使用天然元件。也可使用其他的天然表达调控元件例如内含子、多腺苷酸化位点或Kozak共有序列。
如本文所用的术语“可操作的连接”或“可操作地连接的”是指组件的物理或功能并置以便描述允许它们以所期望的方式发挥功能。在与多核苷酸可操作地连接的表达调控元件的示例中，该关系使得调控元件调节核酸的表达。更具体地，例如，可操作地连接的两个DNA序列意指以使至少一个DNA序列能对其他序列发挥生理作用这样的关系(顺式或反式)布置两个DNA。
包括AAV载体的载体还可包括其他核酸元件。这些元件包括但不限于一个或更多个拷贝的AAV ITR序列、启动子/增强子元件、转录终止信号、位于多核苷酸序列旁侧的5’端或3’端非翻译区(例如，多腺苷酸化序列)、或者内含子I的全部或一部分。这样的元件还任选地包括转录终止信号。转录终止信号的具体的非限制性示例是SV40转录终止信号。
如本文中所公开的，AAV载体通常接受具有限定大小范围的DNA插入物，通常为约4kb至约5.2kb，或略大。因此，对于较短的序列而言，将填料或填充物引入到插入片段中以调节长度至接近或处于将AAV载体包装到病毒颗粒中可接受的病毒基因组序列的正常大小。在多个实施方式中，填料/填充核酸序列是核酸的非翻译(非蛋白质编码)区段。在AAV载体的具体实施方式中，异源多核苷酸序列的长度小于4.7kb并且填料或填充多核苷酸序列具有一定的长度使得当与异源多核苷酸序列组合(例如，插入载体中)时具有介于约3.0-5.5Kb或约4.0-5.0Kb或约4.3-4.8Kb之间的总长度。
内含子还可用作填料或填充多核苷酸序列以达到包装到病毒颗粒中的AAV载体的长度。用作填料或填充多核苷酸序列的内含子和内含子片段(例如FIX的内含子I的一部分)也可增加表达。例如，与在不存在内含子元件的表达相比较而言引入内含子元件可增加表达(Kurachi et al.,1995,supra)。
内含子的用途并不限于引入FIX内含子I序列，而且还包括其他内含子，这些内含子可与相同的基因(例如，在异源多核苷酸编码FIX的情况下，内含子衍生自FIX基因组序列中存在的内含子)相关或与完全不同的基因或其他DNA序列相关。因此，核酸的其他非翻译(非蛋白编码)区域，例如存在于来自同源(相关)基因(异源多核苷酸序列编码由基因组序列编码相同蛋白的所有或一部分)和非同源(不相关)基因(异源多核苷酸序列编码与由基因组序列编码的蛋白质不同的蛋白质)的基因组序列中的内含子也可以用作根据本发明的填料或填充多核苷酸序列。
如本文所用的“内含子I的一部分”意指核苷酸长度为约0.1kb至约1.7kb的内含子I的区域，该区域增加FIX的表达，通常当与不存在内含子I的一部分的情况下的FIX表达相比较时在质粒或病毒载体模板上增加约1.5倍或更多倍。更具体的部分是内含子1的1.3kb的部分。
如本文所使用的术语“寡核苷酸”是指被定义为包括两种或更多种通常多于三种的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的核酸分子的序列、引物和探针。寡核苷酸的确切大小将取决于多种因素和具体的应用以及寡核苷酸的使用，但是寡核苷酸的长度通常为约5-50个核苷酸。
如本文所用的术语“引物”是指DNA寡核苷酸，其是单链或双链的，或衍生自生物系统，由限制酶消化产生，或合成产生，当置于适当的环境中时，能功能上用作模板依赖性核酸合成的引发剂。当与合适的核酸模板，核酸的合适的核苷三磷酸前体，聚合酶，合适的辅因子和条件(例如合适的温度和pH)存在时，引物可通过聚合酶或类似的活性作用通过添加核苷酸在其3’末端延伸，以产生引物延伸产物。引物的长度可根据应用的具体条件和要求而变化。例如，在诊断应用中，寡核苷酸引物的长度通常为15-30或更多个核苷酸。引物必须与所希望的模板具有足够的互补性，以引发所希望的延伸产物的合成，也就是说，以在用于通过聚合酶或类似的酶引发合成的适当并置的位置足以提供引物的3’羟基部分的方式使所希望的模板链退火。引物序列代表所希望的模板的精确互补不是必需的。例如，非互补的核苷酸序列可连接在另外互补的引物的5’末端。可替代地，非互补碱基可穿插在寡核苷酸引物序列内，只要引物序列与所希望的模板链的序列具有足够的互补性以在功能上提供用于合成延伸产物的模板-引物复合物即可。
聚合酶链反应(PCR)已在美国专利No.4683195、4800195和4965188中进行了描述。
短语“特异性杂交”是指充分互补的序列的两个单链核酸分子之间允许在本领域通常使用的预定条件下杂交的关联(有时称为“基本上互补的”)。特别是，该术语是指具有基本上互补的序列的两个核苷酸序列的杂交，基本上排除与其他单链非互补的核酸序列的杂交。
“选择性标记基因”是指当表达时赋予转化细胞上的选择性表型例如抗生素抗性(例如，卡那霉素)的基因。“报告”基因是提供可检测信号的基因。报告基因的非限制性示例是荧光素酶基因。
包括修饰形式的多核苷酸和多肽可通过细胞表达或体外翻译和化学合成技术使用多种标准克隆、重组DNA技术进行。多核苷酸的纯度可通过测序、凝胶电泳等等来测定。例如，核酸可使用杂交或基于计算机的数据库筛选技术进行分离。这样的技术包括但不限于：(1)使基因组DNA或cDNA文库与探针杂交来检测同源核苷酸序列；(2)抗体筛选以检测具有共享结构特征的多肽，例如使用表达文库进行；(3)使用能够退火至目的核酸序列上的引物在基因组DNA或cDNA上的聚合酶链反应(PCR)；(4)用于相关序列的序列数据库的计算机搜索；以及(5)消减核酸文库的差异筛选。
也可由技术人员通过化学合成使用方法，例如自动合成装置(参见例如，AppliedBiosystems,Foster City,CA)制备包括修饰形式的多核苷酸和多肽。可使用化学方法(参见例如，Caruthers(1980).Nucleic Acids Res.Symp.Ser.215；Horn(1980)；和Banga,A.K.,Therapeutic Peptides and Proteins,Formulation,Processing and Delivery Systems(1995)Technomic Publishing Co.,Lancaster,PA)整体或部分合成肽。肽合成可以使用多种固相技术(参见例如Roberge Science 269:202(1995)；Merrifield,MethodsEnzymol.289:3(1997))进行，并且可例如按照制造商的说明使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)实现自动合成。
术语“分离的”当用作组合物的修饰语时意指该组合物是通过人工制成的或者完全或至少从它们的天然存在的体内环境分离的。通常，所分离的组合物基本上不含在自然界中与它们通常相关的一种或更多种材料，例如，一种或更多种蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜。术语“分离的”不排除通过人工产生的组合，例如，包装或衣壳化载体基因组和药物制剂的重组载体(例如，AAV)序列，或病毒颗粒(例如，AAV载体Rh74载体或相关的AAV载体，例如AAV-Rh74变体，例如衣壳变体(例如，RHM4-1))。术语“分离的”也不排除该组合物的可替代的物理形式，例如杂合体/嵌合体、多聚体/低聚体、修饰(例如，磷酸化、糖基化、脂化)或衍生的形式，或通过手工产生的在宿主细胞中表达的形式。
本发明的方法和用途提供了用于将异源多核苷酸(转基因)递送(转导)到广泛的宿主细胞(包括分化和未分化的细胞)中的方法。本发明的重组载体(例如，AAV)序列、质粒、载体基因组、重组病毒颗粒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV，例如AAV-Rh74变体，例如衣壳变体(例如，RHM4-1))、方法、用途和药物制剂另外在向有需要的受试者施用蛋白质、肽或核酸的方法(用作治疗方法)中是有用的。在这种方式中，所述蛋白质、肽或核酸因此可在受试者体内产生。受试者可受益于或需要所述蛋白质、肽或核酸，因为受试者缺乏所述蛋白质、肽或核酸，或者由于受试者中所述蛋白质、肽或核酸的产生可赋予一些治疗效果，作为治疗或其他方法。可替代地，可能期望抑制或减少涉及疾病过程中的靶基因，例如用于神经变性疾病、癌症或动脉粥样硬化的治疗，例如以达到治疗效果。
通常，重组载体(例如，AAV)序列、质粒、载体基因组、重组病毒颗粒(例如，AAV-Rh74或相关AAV，例如AAV-Rh74变体，例如衣壳变体(例如，RHM4-1))、方法和用途可用于递送具有生物效应的任意异源多核苷酸(转基因)来治疗或改善与不足或不希望有的基因表达相关的任意病症相关的一个或更多个症状。重组载体(例如，AAV)序列、质粒、载体基因组、重组病毒颗粒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV，例如AAV-Rh74变体，例如衣壳变体(例如，RHM4-1))颗粒、方法和用途可用于提供对多种疾病状态的治疗。
有许多其中缺陷基因已知并已被克隆的遗传性疾病。通常，上述疾病状态分为两类：缺乏状态，通常为缺乏酶，其通常以隐性方式遗传，和不平衡的状态，其至少有时涉及调节或结构蛋白，其以显性方式遗传。对于缺乏状态的疾病，基因转移可用于携带正常基因到影响组织中以用于替代治疗，以及以使用反义突变创建用于疾病的动物模型。对于不平衡的疾病状态，基因转移可用于在模型系统中创建疾病状态，这可能随后用于努力抵抗疾病状态。因此，重组载体(例如，AAV)序列、质粒、载体基因组、重组病毒颗粒(例如，AAV-Rh74载体或相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))、方法和用途允许遗传性疾病的治疗。如本文所使用的疾病状态是通过部分或全部纠正导致疾病或使之更严重的不足或不平衡进行处理的。使用核酸序列的位点特异性整合以引起突变或纠正缺陷也是可能的。
示例性的疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(和肺的其他疾病)、A型血友病、B型血友病、地中海贫血、贫血和其他血液凝固疾病、AID、阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫症和其他神经病症、癌症、糖尿病、肌营养不良(例如，Duchenne型、Becker型)、高歇氏病、胡尔勒氏病、腺苷脱氨酶缺乏症、糖原贮积病和其他代谢缺陷、蓬佩病、充血性心脏衰竭、视网膜变性疾病(无脉络膜、勒伯尔先天性黑蒙以及眼睛的其他疾病)、实体器官(例如，脑、肝、肾、心脏)的疾病等等。
根据本发明，提供了包括本发明的重组载体(例如，AAV)、载体基因组、重组病毒颗粒(例如，AAV-Rh74载体或相关的AAV载体，例如AAV-Rh74变体，例如衣壳变体(例如，RHM4-1))和本发明的病毒颗粒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))包括载体基因组的治疗方法和用途。本发明的方法和用途广泛适用于通过导入编码蛋白质的基因或者增加或刺激基因表达或功能(例如基因添加或替代)进行治疗的疾病。本发明的方法和用途也广泛地适用于通过减少或降低基因的表达或功能例如基因敲除或减少基因表达(基因敲除)进行治疗的疾病。
根据本发明可治疗的疾病的非限制性的具体示例包括本文所述的那些以及肺病(例如囊性纤维化)、血液凝固或出血疾病(例如A型血友病、B型血友病，含有或不含抑制剂)、地中海贫血、血液疾病(例如贫血)、艾滋病、帕金森氏病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、癫痫症、溶酶体贮积病、铜或铁蓄积病(例如，威尔森氏或门克斯病)溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、神经学或神经变性疾病、癌症、1型或2型糖尿病、高雪氏病、胡尔勒氏病、腺苷脱氨酶缺乏症、代谢缺陷(例如，糖原贮积病)、视网膜变性疾病(例如RPE65缺乏或缺陷、无脉络膜和眼睛的其他疾病)和实体器官(例如，脑、肝、肾、心脏)的疾病。
此外，本发明的重组载体(例如，AAV)、载体基因组、重组病毒颗粒(例如，AAV-Rh74载体或相关的AAV载体，例如AAV-Rh74变体，例如衣壳变体(例如，RHM4-1))、方法和用途可用于递送编码单克隆抗体或其片段的核酸，以提供有益的生物效应，从而治疗或改善与癌症、感染性疾病和自身免疫疾病(例如类风湿关节炎)相关的症状。
在一个实施方式中，本发明的方法或用途包括：(a)提供包括载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1))，所述载体基因组包含异源多核苷酸序列(和任选的填料/填充多核苷酸序列)，其中所述异源多核苷酸序列可操作地连接在赋予所述多核苷酸序列转录的表达调控元件上；和(b)向哺乳动物施用一定量的病毒颗粒，使得所述异源多核苷酸在哺乳动物中表达。
在另一个实施方式中，本发明的方法或用途包括通过以下措施将异源多核苷酸序列递送或转移到哺乳动物或哺乳动物细胞中：施用包括载体基因组的病毒(例如，AAV)颗粒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))或多种病毒(例如，AAV)颗粒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))，所述载体基因组包含异源多核苷酸序列(和任选的填料/填充多核苷酸序列)至哺乳动物或哺乳动物细胞，从而将异源多核苷酸序列递送或转移到哺乳动物或哺乳动物细胞中。
在进一步的实施方式中，用于治疗蛋白质表达或功能缺陷的有需要的哺乳动物的本发明的方法或用途包括提供病毒(例如，AAV)颗粒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))或多种病毒(例如，AAV)颗粒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))，其包括载体基因组，所述载体基因组包含异源多核苷酸序列(和任选的填料/填充多核苷酸序列)；和向哺乳动物施用病毒颗粒或多种病毒颗粒，其中所述异源多核苷酸序列编码在哺乳动物中表达的蛋白质，或其中所述异源多核苷酸序列编码降低哺乳动物中内源蛋白的表达的抑制性序列或蛋白质。
在本文公开的本发明方法和用途的具体方面，异源多核苷酸的表达编码对哺乳动物(例如，人)提供治疗益处的蛋白质或抑制性核酸。在进一步具体的方面，填料/填充多核苷酸序列包含在载体序列中，使得与异源多核苷酸序列的组合长度具有介于约3.0-5.5Kb、或约4.0-5.0Kb、或约4.3-4.8Kb之间的总长度。
本发明的方法和用途包括治疗方法，这导致任意治疗或有益效果。在本发明的多个方法和用途中，进一步包括抑制、降低或减少由所述疾病引起或与其相关的一个或更多个不良事件(例如，物理的)症状、紊乱、病症、疾病或并发症，例如减少凝血时间、减少补充凝血因子蛋白的施用剂量。
因此，治疗或有益的治疗效果是向特定受试者提供的任意客观或主观的可测量或可检测的改善或益处。治疗或有益作用可以但不必是所有或任意具体的不良症状、病症、疾病或疾病并发症的完全消除。因此，当在短或长的持续时间(几小时、几天、几周、几月等)内存在渐进的改善或部分减轻不良症状、病症、疾病或疾病引起的或与疾病相关的并发症，或抑制、减少、降低、遏制、预防、限制或控制一个或更多个不良症状、病症、疾病或疾病引起的或与疾病相关的并发症的恶化或进展时，达到令人满意的临床终点。
本发明的包括载体基因组的组合物，例如载体基因组、重组病毒颗粒(例如，AAV-Rh74载体或相关的AAV载体，例如AAV-Rh74变体，例如衣壳变体(例如，RHM4-1))，方法和用途可以以足够的或有效的量施用给有需要的受试者。“有效的量”或“足够的量”是指一定的量，该量使得以单剂量或多剂量、单独或与一种或更多种其他组合物(治疗剂例如药物)、治疗、方案或治疗方案剂相组合向受试者提供任意持续时间(长期或短期)的可检测的响应，预期的或希望的结果或益处，或任意可测量或可检测的程度或任意持续时间(例如，几分钟、几小时、几天、几月、几年或治愈的)。
载体基因组或病毒颗粒(例如，AAV，例如AAV-Rh74载体或相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))剂量以达到治疗效果，例如每千克体重的载体基因组的剂量(vg/kg)将根据一些因素的不同而变化，这些因素包括但不限于：施用途径、达到治疗效果所需的异源多核苷酸的表达水平、所治疗的特异性疾病、对所述病毒载体的宿主免疫应答、对异源多核苷酸或表达产物(蛋白质)的宿主免疫应答以及所表达的蛋白质的稳定性。本领域技术人员基于上述因素以及其他因素可容易地确定病毒体的剂量范围以治疗具有特定疾病或病症的患者。通常，受试者的每千克体重的剂量范围将为至少1×108或更多，例如，1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013或1×1014或更多载体基因组(vg/kg)以达到治疗效果。
使用血友病作为示例，通常，相信为了达到治疗效果，凝血因子浓度需要大于正常个体中存在的因子浓度的1％，以改变严重疾病表型至中度。严重表型的特点在于关节损伤和危及生命的出血。为了将中度疾病表型转换成温和程度，认为凝血因子浓度需要大于正常的5％。相对于治疗这样的血友病受试者而言，典型的剂量是至少1×1010载体基因组(vg)每千克(vg/kg)受试者体重，或约1×1010至1×1011vg/kg受试者体重，或约1×1011至1×1012vg/kg受试者体重，或约1×1012至1×1013vg/kg受试者体重，以达到所希望的治疗效果。
对于治疗(例如，改善或提供治疗益处或改善)而言，“有效的量”或“足够的量”的剂量通常是有效的以提供对一个、更多个或所有不良症状、后果或疾病的并发症、一个或更多个不良症状、病症、疾病、病因或例如由疾病引起或与疾病相关的并发症的响应至可测量的程度，尽管降低、减少、抑制、禁止、限制或控制疾病的进展或恶化是令人满意的结果。
有效量或足够量可以但不必在单次施用中提供，可能需要多次施用，并且可以但不必单独或与另一种组合物(例如，药剂)、治疗、方案或治疗方案组合施用。例如，所述量可以根据受试者的需要、治疗疾病的类型、状态和严重程度或治疗副作用(如果有的话)的指示按比例增加。此外，如果单剂量或多剂量给予而没有第二组合物(例如，另一种药物或药剂)、治疗、方案或治疗方案时，有效量或足够量不必是有效的或足够的，因为可包括高于并超出这些剂量或其他的组合物(例如，药物或药剂)、治疗，方案或治疗方案的其他的剂量、量或持续时间以被认为在给定的受试者中有效或足够。认为有效的量也包括导致另一种治疗剂、治疗方案或方案的使用减少的量，例如用于治疗凝血障碍(例如，A或B型血友病)的重组凝血因子蛋白的施用。
有效量或足够量不必对每一个和每一位治疗的受试者均有效，也不必对给定的组或群中大多数治疗的受试者有效。有效量或足够量意指对特定的受试者而不是一组或普通人群有效或足够。因为对于这样的方法是典型的，一些受试者将对给定的治疗方法或用途表现出更大的响应或更小的响应或无响应。因此，合适的量将取决于所治疗的病症、所希望的治疗效果以及个体受试者(例如，受试者、性别、年龄等内的生物利用度)。
术语“改善”意指可检测或可测量地改善受试者中的疾病或其症状或潜在的细胞反应。可检测或可测量的改善包括主观或客观降低、减少、抑制、禁止、限制或控制疾病或由疾病引起或与所述疾病相关的并发症的发生、频率、严重程度、进展或持续时间，或者改善疾病的症状或潜在的原因或结果，或者逆转疾病。
因此，成功的治疗结果可导致降低、减少、抑制、禁止、限制、控制或预防受试者中疾病或疾病的一个或更多个不良症状或潜在原因或后果的发生、频率、严重程度、进展或持续时间的“治疗效果”或“益处”。因此，影响疾病的一个或更多个潜在原因或不良症状的治疗方法和用途被认为是有益的。减少或降低恶化(例如稳定)疾病或其不良症状也是成功的治疗结果。
因此，治疗益处或改善不必是疾病，或与该疾病相关的任一个、大多数或所有的不良症状、并发症、后果或潜在原因的完全消除。因此，当在短的或长的持续时间(几小时、几天、几周、几月等)内受试者的疾病存在渐进的改善，或该疾病的部分减少、降低、抑制、禁止、限制、控制或预防该疾病的发生、频率、严重程度、进展或持续时间，或抑制或逆转该疾病(例如，稳定一个或更多个症状或并发症)时达到令人满意的终点。方法或用途的有效性，例如对疾病提供潜在的治疗益处或改善的治疗，可以通过多种方法来确定。
本发明的方法和用途可与具有所希望的治疗的、有利的、加成的、协同的或互补的活性或效果的任意化合物、药剂、药物、治疗或其他治疗方案或方案相组合。示例性的组合组合物和治疗包括第二活性剂，例如生物制剂(蛋白质)、药剂和药物。这样的生物制剂(蛋白质)、药剂、药物、治疗和疗法可以在本发明的任意其他方法或用途例如治疗受试者的血液凝固疾病的治疗方法之前、基本上同时或之后施用或进行。
所述化合物、药剂、药物、治疗或其他治疗方案或方案可作为组合组合物施用或分开施用，例如同时或串联或顺序(之前或之后)递送或施用本发明的载体基因组或病毒(例如，AAV-Rh74载体或相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))。因此，本发明提供了组合，其中本发明的方法或用途与本文所述或本领域技术人员已知的任意化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗协议、过程、治疗法或组合物相组合。所述化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗协议、过程、治疗法或组合物可以在向受试者施用本发明的载体基因组或病毒(例如，AAV-Rh74载体或相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))之前、基本上同时或之后施用。因此，组合的实施方式的具体的非限制性示例包括上述的或其他化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗协议、过程、治疗法或组合物。
此外，本发明的方法和用途还尤其包括导致减少对另一种化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗协议、过程或治疗法的需要或使用的方法和用途。例如，对于凝血疾病而言，如果在指定的受试者中较不频繁的或降低的剂量或消除施用重组凝血因子蛋白以补充受试者中不足的或有缺陷的(异常的或突变的)内源性凝血因子时，本发明的方法或用途具有治疗益处。因此，根据本发明，提供了减少需要或使用另一种治疗或疗法的方法和用途。
本发明可用在动物中，包括兽医医疗应用。因此，合适的受试者包括哺乳动物例如人以及非人哺乳动物。术语“受试者”是指动物，通常是哺乳动物，例如人、非人灵长类动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、驯养动物(狗和猫)、农场动物(家禽，例如鸡、鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。人类受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成年受试者。受试者包括凝血疾病的动物疾病模型，例如小鼠和其他动物模型和本领域技术人员已知的其他模型。
如本文所述，在蛋白质的量不足或在功能基因产物(蛋白质)缺乏的情况下载体和包括这样的载体的病毒颗粒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))可用于向受试者提供蛋白，或向产生可导致疾病的异常的、部分功能的或无功能的基因产物(蛋白质)的受试者提供抑制性核酸或蛋白质。因此，适用于治疗的受试者包括具有或处于产生不足量的或缺乏功能基因产物(蛋白质)或产生可导致疾病的异常的、部分功能的或无功能的基因产物(蛋白质)的风险的那些。根据本发明适用于治疗的受试者还包括具有或处于产生导致疾病的异常的或有缺陷的(突变的)基因产物(蛋白质)的风险的那些，使得降低异常的或有缺陷的(突变的)基因产物(蛋白质)的量、表达或功能将导致治疗疾病或减轻一个或更多个症状或改善疾病。因此，目标受试者包括具有这样的缺陷的受试者，不管该疾病的类型、定时或发作程度、进展、严重程度、频率或症状的类型或持续时间。
“预防”及其语法变体意指在疾病之前进行与受试者接触、向其施用或体内递送的方法。向受试者施用或体内递送可在由所述疾病引起的或与之相关的不良症状、病症、并发症等的发展之前进行。例如，筛选(例如，遗传性)可用于识别这样的受试者作为本发明的方法和用途的候选者，但是受试者可能不表现该疾病。因此，这样的受试者包括筛查功能基因产物(蛋白质)的量不足或缺乏为阳性，或产生可导致疾病的异常的、部分功能的或无功能的基因产物(蛋白质)的那些；以及筛查导致疾病的异常的或有缺陷的(突变的)基因产物(蛋白质)为阳性的受试者，即使这样的受试者未表现出该疾病的症状。
本发明的方法和用途包括全身、区域或局部或通过任意途径递送和施用，例如通过注射、输注、经口(例如，摄入或吸入)或局部(例如，经皮)递送和施用。这样的递送和施用包括经由静脉内、肌内、腹膜内、皮内、皮下、腔内、颅内、透皮(局部)、肠胃外，例如粘膜或直肠等方式。示例性的施用和递送途径包括静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)、动脉内、肌内、肠胃外、皮下、胸膜内、局部、经皮、皮内、透皮、肠胃外例如经粘膜、颅内、脊柱内、口服(消化道)、粘膜、呼吸、鼻内、气管插管、肺内、肺内滴注、口腔、舌下、血管内、鞘内、腔内、离子电渗、眼内、眼、光学、腺内、器官内、淋巴管内。
剂量可变化并取决于治疗是预防性的还是治疗性的，类型，发作，进展，严重程度，频率，持续时间或直接治疗疾病的可能性，所需的临床终点，先前或同时治疗，受试者的一般健康状况、年龄、性别、种族或免疫能力和本领域技术人员将理解的其他因素。剂量、数量、频率或持续时间可以按比例增加或减少，由任意不良副作用、并发症或治疗或疗法和受试者的状态的其他风险因素所指示。本领域技术人员将了解的是可能影响提供足够用于提供治疗性或预防性益处的量所需的剂量和定时的因素。
如本文所公开的本发明的方法和用途可在受试者已被确定为具有靶向治疗的疾病、具有疾病的一种或更多种症状或已被筛查并如本文所述被确定为阳性即使受试者不具有疾病的一种或更多种症状之后1-2、2-4、4-12、12-24或24-72小时内实施。当然，本发明的方法和用途可在受试者已被确定为具有靶向治疗的疾病、具有疾病的一种或更多种症状或已被筛查并如本文所述被确定为阳性之后1-7、7-14、14-21、21-48天或更多天、数月或数年实施。
重组载体(例如，AAV，例如AAV-Rh74载体或相关的AAV载体，例如AAV-Rh74变体，例如衣壳变体(例如，RHM4-1))、序列、质粒、载体基因组、重组病毒颗粒(例如AAV，例如AAV-Rh74载体或相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))和其他组合物、药剂、药物、生物制剂(蛋白质)可被掺入到药物组合物，例如，药学上可接受的载体或赋形剂中。这样的药物组合物尤其可用于体内或离体施用和递送到受试者。
如本文所用的术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”意指生物学上可接受的制剂、气体、液体或固体或其混合物，其适于一种或更多种施用、体内递送或接触途径。“药学上可接受的”或“生理上可接受的”组合物不是生物学上的或换言之不希望有的副作用的材料，例如，该材料可施用给受试者，而不会导致大量的不希望有的生物作用的材料。因此，这样的药物组合物可用于例如向受试者施用病毒载体或病毒颗粒(例如，AAV-Rh74或相关的AAV例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))或经转化的细胞。
这样的组合物包括与药物施用或体内接触或递送相容的溶剂(水性或非水性的)、溶液(水性或非水性的)、乳剂(例如，水包油或油包水)、混悬液、糖浆、酏剂、分散体和混悬介质、包衣剂、等渗剂和吸收促进或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和混悬液可包括混悬剂和增稠剂。这样的药学上可接受的载体包括片剂(包衣的或未包衣的)、胶囊(硬或软的)、微珠、粉末、颗粒和晶体。补充的活性化合物(例如，防腐剂、抗菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)也可以掺入到组合物中。
药物组合物可配制成与如本文所述或本领域技术人员已知的特定施用或递送途径相容。因此，药物组合物包括适用于通过多种途径施用的载体、稀释剂或赋形剂。
适用于肠胃外施用的组合物包括活性化合物的水性和非水性溶液、混悬液或乳液，其中制剂通常是无菌的并且可以是与预期接受者的血液等渗的。非限制性说明性示例包括水，盐水，葡萄糖，果糖，乙醇，动物、植物或合成的油。
对于经粘膜或经皮施用(例如，局部接触)而言，渗透剂可包括在药物组合物中。渗透剂是本领域中已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。对于透皮施用而言，活性成分可配制成本领域中通常已知的气雾剂、喷雾剂、软膏、油膏、凝胶剂或者霜剂。对于接触皮肤而言，药物组合物通常包括软膏、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油。可使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇类、透皮促进剂及其组合。
助溶剂和佐剂可被添加到制剂中。助溶剂的非限制性示例包括羟基或其他极性基团，例如，醇，例如异丙醇；二醇，例如丙二醇，聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇醚；甘油；聚氧乙烯醇和聚氧乙烯脂肪酸酯。佐剂包括例如表面活性剂，例如大豆卵磷脂和油酸；脱水山梨醇酯例如山梨醇三油酸酯；和聚乙烯吡咯烷酮。
本发明的适用于载体基因组、病毒颗粒(例如，AAV-Rh74载体或相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))的药物组合物和递送系统以及方法和用途是本领域中已知的(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2003)20th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA；Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA；The MerckIndex(1996)12th ed.,Merck Publishing Group,Whitehouse,NJ；Pharmaceutical Principles ofSolid Dosage Forms(1993),Technonic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,Pa.；Ansel and Stoklosa,Pharmaceutical Calculations(2001)11th ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD；和Poznansky et al.,Drug Delivery Systems(1980),R.L.Juliano,ed.,Oxford,N.Y.,pp.253-315)。
如本文所用的“单位剂量形式”是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位；各单位含有任选地与药用载体(赋形剂、稀释剂、载体或填充剂)相关的预定量，当以一个或更多个剂量施用时，其被计算以产生所希望的作用(例如，预防或治疗作用)。单位剂量形式可以在例如安瓿和小瓶中，其可包含液体组合物，或冷冻干燥或冻干状态的组合物；无菌液体载体，例如，可在施用或递送在体内之前加入。单个单位剂量形式可包括在多剂量试剂盒或容器中。重组载体(例如，AAV)序列、质粒、载体基因组、重组病毒颗粒(例如，AAV-Rh74载体或相关的AAV载体例如AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1))及其药物组合物可包装在单个或多个单位剂量形式中，以便于剂量的施用和均匀性。
本发明提供了包括包装材料和其中的一种或更多种组分的试剂盒。试剂盒通常包括标签或包装插页，其包括组分的描述或其中组分的体外、体内或离体使用的说明书。试剂盒可包含这样的组分的集合，例如，载体(例如，AAV)基因组或病毒颗粒(例如，AAV-Rh74载体或相关的AAV载体例如AAV-Rh74变体例如衣壳变体(例如，RHM4-1))和任选的第二活性剂，例如另一种化合物、药剂、药物或组合物。
试剂盒是指容纳试剂盒的一种或更多种组分的物理结构。包装材料可保持组分无菌，并且可由通常用于这种目的的材料(例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等等)制成。
标签或插页可包括：标识其中的一种或更多种组分，剂量的量，包括作用机制的活性成分的临床药理学，药代动力学和药效学的信息。标签或插页可包括标识生产商、批号、生产地点和日期、有效期的信息。标签或插页可包括标识生产商、批号、生产地点和日期的信息。标签或插页可包括可使用该试剂盒组分的疾病的信息。标签或插页可包括临床医生或受试者使用方法、用途或治疗协议或治疗方案中的一种或更多种试剂盒组分的说明书。说明书可包括剂量、频率或持续时间，和用于实施本文所述的任意方法、用途、治疗协议或预防或治疗方案的说明书。
标签或插页可包括有关组分可提供的任意益处例如预防或治疗益处的信息。标签或插页可包括有关潜在的不良副作用、并发症或反应的信息，例如警告受试者或临床医师关于将不适合使用特定组合物的情况。当受试者已经、将要或目前正在服用会与组合物不相容的一种或更多种其他药物或受试者已经、将要或目前正在接受将与组合物不相容的另一种治疗协议或治疗方案时也可能发生不良副作用或并发症，因此，说明书可包括关于这些不兼容性的信息。
标签或插页包括“印刷品”，例如纸或纸板，或单独的或固定到组分、试剂盒或包装材料(例如，箱子)上，或连接在包含试剂盒组分的安瓿、管或小瓶上。标签或插页可另外包括计算机可读介质，例如条形码打印的标签，磁盘，光盘，例如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3，磁带或电存储介质例如RAM和ROM或这些的混合体例如磁/光存储介质，闪存介质或存储器类型卡。
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管类似于或等同于本文所述的方法和材料可用于实施或测试本发明，但是本文中描述了合适的方法和材料。
本文引用的所有申请、公开，专利和其它参考文献、GenBank登录和ATCC引文均通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。
本文公开的所有特征可以任意组合形式相组合。本说明书中公开的每个特征均可被起到相同的、等效的或类似的作用的替代特征所替代。因此，除非另外明确声明，否则所公开的特征(例如，重组载体(例如，AAV)序列、质粒、载体基因组或重组病毒颗粒(例如，AAV-Rh74载体或相关的AAV载体例如AAV-Rh74衣壳变体(例如，RHM4-1))是等同或类似特征的类型的示例。
如本文所使用的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一个多核苷酸”包括多个这样的多核苷酸，提及“一个载体”包括多个这样的载体，以及提及“一个病毒”或“颗粒”包括多个这样的病毒粒子/颗粒。
如本文所用的所有数值或数值范围包括该范围内的整数和该范围内的值或整数的分数，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，提及至少80％的同一性，包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％等以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％等、82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％的同一性等，并依此类推。
提及具有多于(大于)或小于的整数包括分别大于或小于参考数的任意数。因此，例如，提及小于1000，包括999、998、997等等，直到下降到数字一(1)；并且小于100，包括99、98、97等等，直到下降到数字一(1)。
如本文所用的所有数值或范围包括值的分数和该范围内的整数以及该范围内的整数的分数，除非上下文清楚地另外指明。因此，举例而言，提及数值范围例如百分比范围例如1-10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等等。因此，提及1-50的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等等，高达并包括50以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等等、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等等。
提及一系列范围包括组合该系列内的不同范围边界的值的范围。因此，举例而言，提及一系列的范围11-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5500-6000、6000-7000、7000-8000、8000-9000包括范围10-50、50-100、100-1000、1000-3000、2000-4000等等。
本文中通常使用肯定的语言公开本发明来描述许多实施方式和方面。本发明还具体地包括其中特定的主题被全部或部分排除的实施方式，其例如物质或材料、方法步骤和条件、协议或程序。例如，在某些实施方式中或本发明的方面，材料和/或方法步骤被排除在外。因此，虽然本发明通常不在本文中表述关于本发明不包括的内容，但是本发明中未明确地排除的方面被公开在本发明中。
已经描述了本发明的许多实施方式。尽管如此，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，下述示例旨在说明但不限制本发明要求保护的范围。
示例
示例1
该示例包括多种材料和方法的描述。
小鼠：雄性C57BL/6J(WT)小鼠，8-10周龄，每个实验组n＝5。狗是北卡罗莱纳州大学教堂山分校的HB狗菌落，其携带FIX基因中的错义突变(Evans等人，Proc Natl Acad SciUSA 86:10095(1989))。
AAV载体构建体：在ApoE-AAV肝特异性启动子的控制下使用表达人FIX的构建体进行小鼠的体内研究。狗的研究采用几乎相同的启动子和犬FIX转基因。
基因转移方法：所有载体均静脉内递送。在小鼠中经尾静脉施用(每只小鼠施用200微升的体积，载体在PBS中稀释)。在狗中，载体经隐静脉递送。
FIX表达测定：ELISA用于测定FIX水平。在小鼠中，人FIX ELISA抗体对(捕获和第二)来自Affinity Biologicals。在狗中，使用也来自Affinity Biologicals的抗体对，如Haurigot等人所述(Mol Ther 18:1318(2010))。
统计学分析：用非配对双尾t检验进行统计学分析。p值<0.05被认为是统计学显著的。
AAV抗体测量：使用Manno等人(Nat Med 12:342(2006))和Mingozzi等人(Nat Med13:419(2007))描述的体外中和测定法以用于抗体测量。简而言之，在测定中使用两种AAV载体构建体，在CMV启动子(ssAAV-lacZ)的控制下表达β-半乳糖苷酶的单链载体，或在鸡β-肌动蛋白启动子(CBA)的控制下表达海肾报告基因的自身互补载体AAV-Rh74-CBA-海肾。为了增加AAV载体的体外转导效率，使用2V6.11细胞(ATCC)，其在诱导型启动子的控制下表达腺病毒基因E4。将细胞以1.25×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并将1:1000稀释的松甾酮A(Invitrogen)加入到培养基中以诱导E4表达。在测定的当天，将热灭活测试的血清的一系列半对数稀释液与含有病毒的培养基相混合。对于ssAAV-lacZ载体而言，对于AAV2而言测定中所用的病毒浓度为约1×1010个vg/ml，并且对于AAV5、6或8而言为约5.5×1010个vg/ml。对于scAAV-Luc载体而言，测定中的病毒浓度低介于约50至约150倍之间。报告转基因的剩余活性用比色测定法(ssAAV-lacZ)或光度计(scAAV-Luc)测量。
使用捕获法测量抗AAV衣壳总IgG或免疫球蛋白(Ig)亚类；用5×1010个病毒颗/ml的AAV空衣壳包被ELISA板。在室温下用在PBS中的2％BSA、0.05％吐温20封闭板2小时，并将一系列样品稀释液加载到孔中并在4℃下孵育过夜。将生物素缀合的抗人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM抗体(Sigma)用作检测抗体；加入链霉亲和素-HRP用于底物检测。利用一系列纯化的人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM(Sigma)的稀释液制成的标准曲线测定免疫球蛋白浓度。
AAV生产：用于载体生产的方法详细描述在Ayuso等人的(Gene Ther 17:503(2010))中。
示例2
该示例包括人FIX基因转移动物(小鼠)研究和基因转移之后FIX表达的描述。
经尾静脉向C57BL/6小鼠(每组n＝5)注射带有在肝特异性启动子的控制下的因子IX(FIX)基因的AAV载体(每只小鼠2.510个载体基因组)。在基因转移之后第1周、第2周和第4周通过ELISA测定小鼠中人FIX基因产物(蛋白质)的血浆水平，并且如图1所示。AAV-Rh74示出了动物中转基因表达的最高水平。
示例3
该示例包括证明血友病狗中治疗水平的有效的AAV-Rh74介导的FIX递送的动物研究和数据的描述。
简而言之，通过隐静脉向B型血友病狗静脉内(IV)输注3×1012个载体基因组/kg体重。由肝特异性启动子驱动治疗性FIX转基因的表达。载体和FIX水平通过ELISA监测。狗的FIX血浆水平显示在图2中。AAV-Rh74和AAV8在B型血友病狗中大致相等地进行，并且二者均优于AAV6。
示例4
该示例包括显示人中抗AAV中和抗体(NAb)存在的研究的描述。
表1中的数据显示利用体外测定法测量的人中抗AAV中和抗体(NAb)。具有小于或等于1:1的NAb滴度的受试者被定义为天然或低滴度抗AAV抗体，并适用于AAV血清型的基因转移(以灰色突出显示)。滴度为1:1至1:3之间的患者被认为是AAV-允许的，只要将空衣壳用作诱饵即可。滴度高于1:3的样品被视为在全身注射之后不允许AAV转导并以浅灰色填充。AAV-Rh74相比于AAV-2和AAV-8而言表现出最低的抗AAV Nab流行率。
表1
示例5
该示例包括显示包括AAV-Rh74的不同AAV血清型的生产量的数据的描述。
表2中的数据显示不同AAV血清型的生产量。报告是滚瓶中病毒的批量大小、总的载体产量和每瓶的产量。所有的血清型用相同的表达盒包装。AAV-Rh74的产量与所评估的其他血清型即AAV-8、AAV-dj和AAV-2的相当或更大。
表2
示例6
该示例包括显示施用给恒河猴的AAVrh74载体在肝特异性启动子的控制下表达人因子IX(FIX)的数据的描述，该施用导致动物中FIX的生产量水平比施用相同量的AAV8载体的高。
简而言之，向动物施用剂量为2×1012个载体基因组(vg)/kg体重的AAV8或AAVrh74。将载体配制在盐水中或在载体和空AAV衣壳(以EC表示)的混合物中。
图4是平均值(第2至8周)和标准误差的直方图或通过特异性检测恒河猴血浆中的人FIX的ELISA测得的人FIX的平均值。接受AAVrh74-FIX载体的动物显示在朝右边的最后两个条中。数据表明接受AAVrh74载体的动物(朝右边的最后两个条)相比于注射相同剂量的其他组的动物(黑色和灰色条)而言表达更高水平的FIX转基因。使用不成对的双尾t检验(two-tailed student t test)比较平均水平。
接受AAV-RHM4-1-FIX的动物之一产生针对人因子IX转基因产物的抗体，这是在利用人FIX载体处理的约20％的猕猴中发生的充分证实的现象。RHM4-1处理的第二只动物表达的FIX水平相比于AAV8处理的猕猴而言高约2倍。
示例7
该示例包括几种Rh74衣壳变体的描述。
简而言之，将多个替代导入到Rh74衣壳序列以产生Rh74衣壳变体。每个位置上的不同的Rh74衣壳变体和替代的氨基酸如下：
表3：VP1衣壳中的变体氨基酸替代和所指示的位置
RHM4-1变体在Rh74 VP1衣壳的第195、199、201和202氨基酸位分别具有丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸和天冬酰胺替代。所述RHM4-1变体VP1衣壳氨基酸序列(其具有替代的残基a、v、p和n，以下划线和粗体表示)如下(SEQ ID NO:5)：
该RHM4-1变种VP1衣壳核酸序列(编码以下划线和粗体表示的a，v，p和n的密码子)如下(SEQ ID NO：11)。
RHM15-1、15-2、15-3、15-4、1-5和15-6变体也在Rh74VP1衣壳的第195、199、201和202氨基酸位分别具有丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸和天冬酰胺替代。此外，这些变体在多个位置上具有多个赖氨酸的精氨酸替代。
该RHM15-1变种VP1衣壳氨基酸序列如下(SEQ ID NO:6)：
该RHM15-1变种VP1衣壳核酸序列如下(SEQ ID NO:12)：
该RHM15-2变种VP1衣壳氨基酸序列如下(SEQ ID NO:7)：
该RHM15-2变种VP1衣壳核酸序列如下(SEQ ID NO:13)：
该RHM15-3/RHM15-5变种VP1衣壳氨基酸序列如下(SEQ ID NO:8)：
该RHM15-3/RHM15-5变种VP1衣壳核酸序列如下(SEQ ID NO:14)：
该RHM15-4变种VP1衣壳氨基酸序列如下(SEQ ID NO:9)：
该RHM15-4变种VP1衣壳核酸序列如下(SEQ ID NO:15)：
该RHM15-6变种VP1衣壳氨基酸序列如下(SEQ ID NO:10)：
该RHM15-6变种VP1衣壳核酸序列如下(SEQ ID NO:16)：
示例8
该示例包括相比于Rh74和AAV8使用Rh74衣壳变体的人因子IX表达研究的描述。
简而言之，Rh74衣壳变体被用于包装AAV人因子IX表达载体，AAV颗粒用于感染小鼠，并检测动物(血浆)中的因子IX的表达水平。衣壳变体在指定的位置上具有下述的氨基酸替代：
表4
图5示出了2周后经处理的动物中血浆人因子IX的表达水平。如图所示，由RHM4-1变体衣壳衣壳化的AAV人因子IX表达载体提供最高水平的表达，并且相比于Rh74衣壳化的AAV人因子IX表达载体和AAV8衣壳化的AAV人因子IX表达载体产生的表达而言显著更高。
示例9
该示例包括显示施用给食蟹猴的AAVrh74变体RHM4-1载体在肝特异性启动子的控制下表达人因子IX(FIX)的数据的描述，该施用导致动物中FIX的生产量水平比施用相同量的AAV8载体的更高。
对食蟹猴的中和AAV抗体进行预筛选，并且选择处理前滴度<1:1的动物以确保转导成功。然后向猴子输注剂量为3×1012个vg/kg的表达人因子IX转基因的AAV8或AAV-Rh74变体RHM4-1载体。在整个研究期间每周通过ELISA测定非人类灵长类中的人FIX转基因产物(蛋白质)血浆水平并在图6中示出。
接受AAV-RHM4-1-FIX的动物之一产生针对人因子IX转基因产物的抗体，这是在利用人FIX载体处理的约20％的猕猴中发生的充分证实的现象，这是由于人和猕猴蛋白质之间的小的氨基酸差异造成的。利用RHM4-1处理的一只动物的表达减少是由于响应于人转基因的抗体发展导致的。RHM4-1处理的第二只动物表达的FIX水平相比于经AAV8处理的猕猴而言高约2倍。

Claims (76)

1.一种包括AAV衣壳序列的重组AAV颗粒，其中所述AAV颗粒衣壳化包括编码因子IX蛋白的异源多核苷酸序列的载体基因组，并且其中所述AAV衣壳序列包括如SEQ ID NO:5所示的VP1衣壳序列。
2.根据权利要求1所述的重组AAV颗粒，其中所述载体基因组还包含赋予编码因子IX蛋白的所述异源多核苷酸序列转录的表达调控元件。
3.根据权利要求2所述的重组AAV颗粒，其中所述表达调控元件包括组成型或调节型调控元件。
4.根据权利要求2所述的重组AAV颗粒，其中所述表达调控元件包括组织特异性表达调控元件或启动子。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组AAV颗粒，其中，反向末端重复(ITR)序列位于编码因子IX蛋白的所述异源多核苷酸序列的5’或3’末端的旁侧。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的重组AAV颗粒，其中，所述载体基因组还包括填料多核苷酸序列或填充多核苷酸序列。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的重组AAV颗粒，其中，所述异源多核苷酸序列还包括人因子IX内含子I中的至少一部分。
8.根据权利要求5所述的重组AAV颗粒，其中，所述异源多核苷酸序列还包括人因子IX内含子I中的至少一部分。
9.根据权利要求6所述的重组AAV颗粒，其中，所述异源多核苷酸序列还包括人因子IX内含子I中的至少一部分。
10.一种包括AAV衣壳的重组AAV颗粒，所述AAV衣壳将包括异源多核苷酸序列的载体基因组衣壳化，其中所述AAV衣壳包括含有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的蛋白质，其中所述异源多核苷酸序列编码人因子IX蛋白，且其中所述载体基因组还包括肝特异性启动子或增强子，并且AAV反向末端重复位于所述异源多核苷酸序列的5’或3’末端的旁侧。
11.根据权利要求10所述的重组AAV颗粒，其中，所述异源多核苷酸序列还包括人因子IX内含子I中的至少一部分。
12.根据权利要求10或11所述的重组AAV颗粒，其中所述载体基因组还包括填料多核苷酸序列或填充多核苷酸序列。
13.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-12中任一项所述的重组AAV颗粒。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的重组AAV颗粒在制备用于将编码因子IX蛋白的异源多核苷酸序列递送或传送到哺乳动物或哺乳动物细胞中的药物中的用途，其中所述递送或传送包括向所述哺乳动物或所述哺乳动物细胞施用所述重组AAV颗粒，从而将编码因子IX蛋白的所述异源多核苷酸序列递送或传送到所述哺乳动物或所述哺乳动物细胞中。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的重组AAV颗粒在制备用于治疗因子IX蛋白表达或功能缺陷的哺乳动物的药物中的用途，其中所述治疗包括：向所述哺乳动物施用一定量的所述的重组AAV颗粒，其中所述因子IX蛋白在所述哺乳动物中表达。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所施用的所述重组AAV颗粒的量足以给所述哺乳动物提供治疗效果。
17.根据权利要求15所述的用途，其中所述哺乳动物是人，并且所述治疗效果治疗B型血友病。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述治疗效果将严重B型血友病疾病表型改变为中度或轻度B型血友病疾病表型。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的用途，其中所述重组AAV颗粒以至少1×1010载体基因组(vg)每千克(vg/kg)哺乳动物的体重的剂量施用，或以1×1010至1×1011vg/kg哺乳动物体重的剂量施用，或以1×1011至1×1012vg/kg哺乳动物体重的剂量施用，或以1×1012至1×1013vg/kg哺乳动物体重的剂量施用。
20.根据权利要求15-18中任一项所述的用途，其中，所述因子IX蛋白在所述哺乳动物的细胞、组织或器官中表达。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述细胞包括肝细胞、亚全能性干细胞或多能干细胞。
22.根据权利要求15-18中任一项所述的用途，其中所述重组AAV颗粒经肠胃外、静脉内、动脉内、肌内、皮下、通过插管、通过导管、或腔内施用。
23.根据权利要求15-18中任一项所述的用途，其中所述治疗还包括施用空衣壳AAV。
24.根据权利要求15或16所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
25.根据权利要求15-18中任一项所述的用途，其中所述重组AAV颗粒被药物组合物包括。
26.根据权利要求19所述的用途，其中所述重组AAV颗粒被药物组合物包括。
27.根据权利要求20所述的用途，其中所述重组AAV颗粒被药物组合物包括。
28.根据权利要求21所述的用途，其中所述重组AAV颗粒被药物组合物包括。
29.根据权利要求22所述的用途，其中所述重组AAV颗粒被药物组合物包括。
30.根据权利要求23所述的用途，其中所述重组AAV颗粒被药物组合物包括。
31.根据权利要求24所述的用途，其中所述重组AAV颗粒被药物组合物包括。
32.根据权利要求25所述的用途，其中所述药物组合物还包括空衣壳AAV。
33.根据权利要求26所述的用途，其中所述药物组合物还包括空衣壳AAV。
34.根据权利要求27所述的用途，其中所述药物组合物还包括空衣壳AAV。
35.根据权利要求28所述的用途，其中所述药物组合物还包括空衣壳AAV。
36.根据权利要求29所述的用途，其中所述药物组合物还包括空衣壳AAV。
37.根据权利要求30所述的用途，其中所述药物组合物还包括空衣壳AAV。
38.根据权利要求31所述的用途，其中所述药物组合物还包括空衣壳AAV。
39.一种包括衣壳和被其衣壳化的载体基因组的重组AAV颗粒，其中所述衣壳包括具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的VP1衣壳蛋白，并且所述载体基因组以5’至3’的顺序包括：
(a)第一AAV反向末端重复序列，
(b)肝特异性增强子或启动子，
(c)可操作地连接至所述肝特异性增强子或启动子的编码人因子IX蛋白的异源多核苷酸序列，其任选包括内含子，
(d)多聚腺苷酸序列；以及
(e)第二AAV反向末端重复序列。
40.根据权利要求39所述的重组AAV颗粒，其中所述内含子在存在时包含来自人因子IX基因的至少一部分内含子I。
41.根据权利要求39所述的重组AAV颗粒，其中所述内含子在存在时具有的长度为0.1kb至1.7kb。
42.根据权利要求40所述的重组AAV颗粒，其中所述内含子在存在时具有的长度为0.1kb至1.7kb。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的重组AAV颗粒，其中所述肝特异性增强子或启动子是ApoE-hAAT增强子或启动子。
44.根据权利要求39-42中任一项所述的重组AAV颗粒，其中5’和3’非翻译区位于所述多核苷酸序列的旁侧。
45.根据权利要求43所述的重组AAV颗粒，其中5’和3’非翻译区位于所述多核苷酸序列的旁侧。
46.根据权利要求39-42中任一项所述的重组AAV颗粒，其中所述因子IX蛋白是比野生型人因子IX活性更强的变体。
47.根据权利要求43所述的重组AAV颗粒，其中所述因子IX蛋白是比野生型人因子IX活性更强的变体。
48.根据权利要求44所述的重组AAV颗粒，其中所述因子IX蛋白是比野生型人因子IX活性更强的变体。
49.根据权利要求45所述的重组AAV颗粒，其中所述因子IX蛋白是比野生型人因子IX活性更强的变体。
50.根据权利要求39-42中任一项所述的重组AAV颗粒，其中所述人因子IX蛋白变体是天然存在的。
51.根据权利要求43所述的重组AAV颗粒，其中所述人因子IX蛋白变体是天然存在的。
52.根据权利要求44所述的重组AAV颗粒，其中所述人因子IX蛋白变体是天然存在的。
53.根据权利要求45所述的重组AAV颗粒，其中所述人因子IX蛋白变体是天然存在的。
54.根据权利要求46所述的重组AAV颗粒，其中所述人因子IX蛋白变体是天然存在的。
55.根据权利要求47所述的重组AAV颗粒，其中所述人因子IX蛋白变体是天然存在的。
56.根据权利要求48所述的重组AAV颗粒，其中所述人因子IX蛋白变体是天然存在的。
57.根据权利要求49所述的重组AAV颗粒，其中所述人因子IX蛋白变体是天然存在的。
58.根据权利要求39-42中任一项所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
59.根据权利要求43所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
60.根据权利要求44所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
61.根据权利要求45所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
62.根据权利要求46所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
63.根据权利要求47所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
64.根据权利要求48所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
65.根据权利要求49所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
66.根据权利要求50所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
67.根据权利要求51所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
68.根据权利要求52所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
69.根据权利要求53所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
70.根据权利要求54所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
71.根据权利要求55所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
72.根据权利要求56所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
73.根据权利要求57所述的重组AAV颗粒，其中所述第一AAV反向末端重复序列和所述第二AAV反向末端重复序列是来自AAV2。
74.一种药物组合物，其包括根据权利要求39-73中任一项所述的重组AAV颗粒和药学上可接受的载体。
75.根据权利要求39-73中任一项所述的重组AAV颗粒在制备用于治疗B型血友病的药物中的用途。
76.一种重组AAV颗粒，其通过培养使用包含根据权利要求1-12或40-73中任一项所述的载体基因组的重组质粒转染的细胞制备得到，其中所述细胞表达辅助功能蛋白和Rep和Cap蛋白。
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