KR20230159837A - 21-하이드록실라제 결핍에 대한 유전자 요법 - Google Patents

21-하이드록실라제 결핍에 대한 유전자 요법 Download PDF

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Abstract

21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터 및 21OH 결핍을 치료하기 위한 관련 용도가 본 명세서에 개시된다.

Description

21-하이드록실라제 결핍에 대한 유전자 요법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 3월 19일에 출원된 미국 가출원 제63/163,634호를 우선권으로 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 설명
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 형식 사본(파일명: ADRE_002_01WO_SL, 기록 날짜: 2022년 3월 17일, 파일 크기: 28.5 킬로바이트).
기술 분야
본 개시내용은 일반적으로 유전자 요법의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터 및 입자를 기술한다. rAAV 벡터 및 입자는 21OH 결핍을 치료하는 데 사용될 수 있다.
21-하이드록실라제(21OH)는 스테로이드 호르몬 알도스테론 및 코티솔의 생합성에 관여하는 CYP21A2 유전자에 의해 인코딩되는 시토크롬 P450 효소이다. 이러한 합성은 부신 피질에서 일어난다. 기능성 CYP21A2 유전자와 밀접하게 연결된 비-기능성 CYP21A1P 유사유전자 사이의 높은 재조합 비율은 점 돌연변이보다는 유전자 전환에 의해 구동되는, 선천성 부신 과형성(congenital adrenal hypoplasia: CAH) 및 이의 특이한 유전학의 비교적 높은 발생률을 초래한다. CYP21A2의 결함은 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 야기하며, 이는 i) 여성 외부 생식기의 태아 남성화를 갖는 CAH, 낮은 글루코코르티코이드 및 미네랄로코르티코이드 생산 또는 이의 부재, 및 과량의 안드로겐("고전적인" 21OHD) 또는 ii) 안드로겐의 생산 증가를 제외하고 남성화가 없고 임상적으로 의미 있는 코티솔 및 알도스테론 결핍이 없는 더 경증 형태의 질환("비-고전적인" 21OHD)을 초래한다.
수십 년의 치료 전략 후에, 중증 형태의 21OHD의 관리는 임상적으로 문제가 되고 있다. 환자는 외인성 스테로이드로 치료될 수 있지만, 유아 및 성인 환자는 부신 위기(부신이 일상적인 감염, 외상 또는 격렬한 운동과 같은 신체 스트레스에 반응할 수 없음)의 위험이 있다. 부신 위기는 치료에 순응하는 잘 교육된 환자에서도 심각한 쇼크 및 사망으로 빠르게 이어질 수 있다(문헌[Hahner et al., J Clin Endocrinol Metab, Feb;100(2): 407-416 (2015)] 참조). 또한, 성장, 성별, 및 성기능(sexuality)와 관련된 상당한 결과가 있다. 여성 환자에서, 초-생리학적 글루코코르티코이드 용량을 사용하여 부신 안드로겐 생산을 억제하는 것은 본질적으로 어렵다. 결과적으로, 안드로겐 대 글루코코르티코이드 과잉의 교대 사이클은 저신장, 비만, 아동기 동안 반복된 생식기 수술, 사춘기의 변화 및 만성 남성화를 유발할 수 있다. 안드로겐과다증은 다모증, 남성 근육 발달, 확대된 음핵 크기 및 성 장애를 통해 고전적 및 비고전적 형태의 질환에 걸린 여성 환자에게 주요 미용적 부담으로 남아 있다(문헌[Gastaud et al., J Clin Endocrinol Metab, 92(4), 1391-1396 (2007)] 참조). 남성 환자는 저신장 및 조기 남성화의 위험이 있다. 치료 실패는 심지어 일부 환자에서 양측 부신절제술로 이어질 수 있다(Gmyrek et al., Pediatrics, 109: E28 (2002); Bruining et al., J Clin Endocrinol Metab, 86: 482-484 (2001)).
21OHD의 지속적인 교정을 가능하게 하는 요법은 여전히 필요하다.
본 개시내용은 호르몬 불균형, 및 특히, 21-하이드로일라제(21OH) 결핍(21OHD), 예컨대, 선천성 부신 과형성(CAH)의 치료에 사용하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 명세서에 제공된 방법은 21OH 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터의 투여를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하되, 여기서 rAAV 벡터는 (i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및 (ii) 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되며; 치료적 유효량은 약 1012개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg) 내지 약 1014개 vg/kg의 범위이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 21OH의 발현을 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 21OH 결핍(21OHD)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 여성이고, 프라더 단계 결정(Prader staging)에 의해 모호한 생식기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 선천성 부신 과형성(CAH)을 갖는다. 일부 실시형태에서, CAH는 고전적 CAH이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터의 투여는 대상체에서 21OH의 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 21OH는 대상체의 부신 피질, 부신 수질, 부신 줄기 세포, 부신 전구 세포, 간 또는 난소에서 발현된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 코티솔 및/또는 알도스테론을 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 코티솔 결핍 및/또는 알도스테론 결핍을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 과량의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌, 안드로스텐디온(A4) 및/또는 11-케토스테로이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 혈액 및/또는 소변에서 과량의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌, 안드로스텐디온(A4) 및/또는 11-케토스테로이드를 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 21-하이드록실라제(21OH) 발현을 필요로 하는 대상체에서 이를 발현시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, rAAV 벡터는 (i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및 (ii) 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되며; 치료적 유효량은 약 1012개 vg/kg 내지 약 1014개 vg/kg의 범위이고, 이에 의해서 대상체에서 21OH를 발현한다.
일부 실시형태에서, 21OH는 대상체의 부신 피질, 부신 수질, 부신 줄기 세포, 부신 전구 세포, 간 또는 난소에서 발현된다.
도 1a는 치료되지 않은 대조군 마우스와 비교하여, 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 명시된 용량의 AAV5로 치료된 마우스에서 시간 경과에 따른 체중 증가의 증가를 도시한다. 도 1b는 모델 마우스(삼각형) 또는 비인간 영장류(NHP, 사각형)의 부신에서 검출된 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 AAV5의 바이러스 게놈의 용량-의존적 증가를 도시한다. 도 1c는 모델 마우스(삼각형) 또는 비인간 영장류(NHP)의 부신에서 내인성 21-OH의 백분율로 표현된, 생성된 인간 21-OH의 양을 도시한다.
도 2는 21-OHD로 인한 고전적 CAH를 갖는 성인에서의 1/2상, 최초의 인간-내, 공개-라벨, 용량-증가 연구의 타임라인을 도시한다.
도 3은 1/2상 임상 연구에서 잠재적인 용량 증량 및 확장에 대한 타임라인을 도시한다.
도 4는 5'에서 3'으로의 하기 요소를 포함하는, BBP-631의 활성 성분인 AAV-hCYP21-Opt 벡터의 설계를 도시한다: AAV 5' ITR, AAV 패키징 신호(Ψ), 사이토메갈로바이러스 인핸서, 스플라이스 공여자를 갖는 표준(canonical) Kozak 서열 및 스플라이스 수용자를 갖는 토끼 β-글로빈 인트론을 포함하는 닭 β-액틴 프로모터, 코돈 최적화된 인간 21-하이드록실라제(21-OH) cDNA, 토끼 β-글로빈 polyA 신호, 및 AAV 3' ITR.
본 개시내용은 21-하이드록실라제(21OH)를 발현하도록 조작되고 선천성 부신 과형성(CAH)을 포함하는 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 치료하는 데 사용될 수 있는 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 21-OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터의 투여를 포함하는, 치료, 21OH의 발현, 및/또는 호르몬 조절 방법, 및 이에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
CAH에 대한 임상 관리에 대한 현재의 접근법은 원발성 부신 기능 부전을 해결하고 종종 초생리학적 용량의 글루코코르티코이드를 필요로 하는 부신 안드로겐을 정규화하기 위해 외인성 글루코코르티코이드(및 필요한 경우 미네랄로코르티코이드)로 치료하는 것이다. 글루코코르티코이드의 초생리학적 용량은 종종 부신 안드로겐의 수준을 적절히 제어하기 위해 필요하기 때문에, CAH에서 평생 글루코코르티코이드 대체는 전체 수명 감소, 심혈관 질환, 대사 질환, 골 질환 및 저신장을 포함하는 상당한 이환율과 관련이 있다. 또한, 염-소모성 표현형을 갖는 고전적 CAH 환자에서, 평생 미네랄로코르티코이드 대체가 또한 필요하다.
안드로스텐디온(A4) 이외에, 다른 부신 호르몬, 특히 17-OHP가 종종 관리를 가이드하는데도 사용된다. 임상 관리 패러다임이 간단해 보일 수 있지만, 임상의는 CAH를 갖는 어린이 및 성인 둘 다에서 유지 글루코코르티코이드 투여량을 조정하는데 있어서 매우 어려운 균형 작용에 직면한다. 예를 들어, 임상의는 특히 성장 잠재력 및 최종 성인 신장(height)을 보존하기 위해 가장 낮고 안전한 가능한 유지 용량의 글루코코르티코이드로 어린이를 치료하려고 시도한다. 더 높은 초생리학적 용량의 글루코코르티코이드 대체 요법은 안드로겐과다증과 관련된 증상으로부터 어린이 및 성인 환자 둘 다를 보호하는 데 도움이 될 수 있지만, 또한 무수한 장기간의 대사, 골격, 및 심혈관 후유증의 위험을 수반한다. CAH 환자는 유아기부터 외인성 글루코코르티코이드 및/또는 미네랄로코르티코이드를 복용하고 있기 때문에, 현재의 치료 접근법은 환자 및 간병인에게 높은 치료 부담을 주며, 현재의 치료 표준을 따르지 않는 경향이 있다.
감소된 전체 수명, 심혈관 질환, 대사 질환, 골 질환 및 저신장을 포함하는 질환 및 현재의 치료 표준과 관련된 실질적인 이환율이 존재한다. 또한, 부신 위기는 심각한 쇼크 및 사망으로 빠르게 이어질 수 있고, 글루코코르티코이드의 스트레스 투여에 관한 상당한 환자 및 간병인 교육을 필요로 한다. 평생 질환 부담은 5배 더 높은 모든 원인 사망률을 포함하여 현재 표준의 치료에 대한 고전적인 CAH 환자들 사이에서 여전히 높다. 따라서, 장기 초생리학적 글루코코르티코이드에 대한 필요성을 없애고 내인성 코티솔 생산을 회복시킬 가능성을 갖는 대체 요법은 모든 고전적인 CAH 환자에게 매우 바람직하다.
본 개시내용은 21-하이드록실라제(21OH)를 발현하도록 조작되고 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 치료하는 데 사용될 수 있는 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터, 이러한 벡터를 포함하는 rAAV 입자, 및 치료를 필요로 하는 대상체에서 21OHD를 치료하기 위해 이러한 벡터 및 입자를 사용하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 글루코코르티코이드 및 미네랄로코르티코이드 합성을 위한 내인성 및 생리학적 경로를 제공함으로써 부신피질 세포 기능을 회복시킨다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 질환 관리를 위해 외인성 글루코코르티코이드(예를 들어, 하이드로코르티손) 및/또는 미네랄로코르티코이드에 대한 의존성을 감소시키고, 이에 의해 과도한 글루코코르티코이드 대체 또는 과도한 수준의 혈청 안드로겐으로부터의 부작용을 유의하게 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 높은 수준의 전구체, 예컨대, 17-OHP 및 안드로겐, 예컨대, 안드로스텐디온(A4) 및 11-옥소 또는 11-케토 스테롤(예를 들어, 11-케토-테스토스테론)과 관련된 CAH의 적어도 하나의 증상 또는 임상적 특성을 완화시킨다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 21-OHD와 관련된 안드로겐과다증을 완화시킨다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 생명을 위협하는 부신 위기의 위험을 감소시킨다.
본 명세서에서 사용된 섹션 제목은 단지 조직화 목적을 위한 것이고, 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 특허, 특허 출원, 기사, 서적, 및 논문을 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 명세서에 인용된 모든 문서 또는 문서의 일부는 임의의 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참조로서 명백하게 포함된다. 포함된 문서 또는 문서의 일부 중 하나 이상이 출원에서 그 용어의 정의와 모순되는 용어를 정의하는 경우, 본 출원에 나타나는 정의가 우선한다. 그러나, 본 명세서에 인용된 임의의 참고문헌, 논문, 간행물, 특허, 특허 공개문, 및 특허 출원의 언급은 이들이 유효한 선행 기술을 구성하거나 전 세계 모든 국가의 일반적인 일반 지식의 일부를 형성하는, 지식 또는 임의의 형태의 제안으로서 고려되지 않고, 고려되어서는 안된다.
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 명시하지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값 및, 적절한 경우, 이의 분율(예를 들어, 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 숫자 또는 수치 바로 앞에 올 때 용어 "약"은 숫자 또는 수치가 숫자 또는 수치의 + 또는 - 10%의 범위임을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 단수 용어는 달리 명시하지 않는 한 열거된 성분 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 다, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "및/또는"은 대안들 중 하나 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하다(include)" 및 "포함하다(comprise)"는 동의어로 사용된다.
재조합 AAV 벡터 및 입자
일 양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 세포에 21-하이드록실라제(21OH) 핵산 서열을 전달하기 위한 바이러스 벡터를 제공한다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR) 및 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(이종성 폴리뉴클레오타이드로도 지칭됨)을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터에 관한 것이며, 여기서 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "작동 가능한 연결" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 성분이 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 기술된 성분의 물리적 또는 기능적 병치를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결된 발현 조절 요소(예컨대, 프로모터 또는 인핸서)의 예에서, 관계는 조절 요소가 핵산의 발현을 조절하도록 하는 것이다. 더욱 상세하게는, 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 2개의 DNA 서열은 2개의 DNA가 DNA 서열 중 적어도 하나가 다른 서열에 대해 생리학적 효과를 발휘할 수 있는 관계로 배열됨(시스 또는 트랜스)을 의미한다. "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 핵산 서열이 인접하거나, 실질적으로 인접하고, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 데 필요한 경우, 인접하고 리딩 프레임 내에 있음을 의미할 수 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 인간 21OH 단백질인 21OH 단백질을 발현한다. CYP21A2 유전자는 21OH 단백질을 인코딩한다. 본 명세서에서 사용되는 21OH는 21OH 단백질 또는 상기 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 rAAV 벡터에 의해 발현되는 21OH 단백질은 천연(예를 들어, 야생형) 21OH 단백질이다. 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 21OH 단백질 또는 폴리펩타이드는 자연 발생 21OH 단백질에서와 같이 전장 천연 서열 뿐만 아니라, 부분서열, 변형된 형태 또는 변이체가 천연 전장 21OH 단백질의 어느 정도의 기능성을 보유하는 한 기능적 부분서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체를 포함한다. 본 개시내용의 방법 및 용도에서, rAAV 벡터에서 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 21OH 단백질 및 폴리펩타이드는 결함이 있거나, 발현이 불충분하거나, 또는 치료된 대상체에서 결핍된 내인성 21OH 단백질과 동일할 수 있지만, 반드시 동일할 필요는 없다.
일부 실시형태에서, 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 이종성 서열)은 야생형 CYP21 유전자 서열이다. 일부 실시형태에서, 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 이종성 서열)은 야생형 CYP21 유전자 서열과 관련하여 코돈-최적화되었다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 21OH-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 코돈-최적화된 서열이고, 서열번호 50을 포함하거나 이로 이루어진다(표 1 참조). 일부 실시형태에서, 21OH-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 50과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다.
코돈 최적화는 인코딩된 단백질의 동일한 아미노산 서열을 유지하면서 뉴클레오타이드 서열이 변경될 수 있도록 유전자 코드의 중복성을 이용한다. 일부 실시형태에서, 코돈 최적화는 인코딩된 단백질의 발현의 증가 또는 감소를 용이하게 하기 위해 수행된다. 이는 뉴클레오타이드 서열에서 코돈 사용을 특정 세포 타입의 것에 맞춰 조정함으로써, 따라서 세포 타입에서 특정 tRNA의 상대적 존재비의 편향에 상응하는 세포 코돈 편향을 이용함으로써 달성된다. 상응하는 tRNA의 상대적 존재비와 일치하게 맞춤화되도록 뉴클레오타이드 서열에서 코돈을 변경함으로써, 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 역으로, 특정 세포 타입에서 상응하는 tRNA가 드문 것으로 알려진 코돈을 선택함으로써 발현을 감소시키는 것이 가능하다.
일부 실시형태에서, 21OH 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열은 야생형 cDNA 서열보다 더 안정하여, 비-AAV 뉴클레오타이드 서열이 유전자 요법을 통해 전사 기구로 도입되는 경우 대안적으로 스플라이싱된 변이체 또는 절단된 단백질의 생성을 회피한다.
일부 실시형태에서, 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 이종성 서열)은 서열번호 1의 아미노산 서열을 인코딩한다(표 1 참조). 다른 실시형태에서, 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 이종성 서열)은 헤마글루티닌(HA) 태그를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 연결된 인간 21OH cDNA이다. 특정 경우에, 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 이종성 서열)은 태그, 예를 들어, 헤마글루티닌(HA), UA, cMyc, 또는 임의의 적합한 태그를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된다. "CYPHA"는 HA 태그를 인코딩하는 서열에 융합된 21OH 트랜스진(transgene)을 지칭할 수 있다.
용어 "동일성", "상동성", 및 이들의 문법적 변형은, 이들이 "정렬된" 서열일 때, 2개 이상의 언급된 실체가 동일함을 의미한다. 따라서, 예로서, 2개의 폴리펩타이드 서열이 동일할 때, 이들은 적어도 언급된 영역 또는 부분 내에서 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열이 동일한 경우, 이들은 적어도 언급된 영역 또는 부분 내에서 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 동일성은 서열의 정의된 구역(영역 또는 도메인)에 걸쳐 있을 수 있다. 동일성의 "구역" 또는 "영역"은 동일한 2개 이상의 언급된 실체의 일부를 지칭한다. 따라서, 2개의 단백질 또는 핵산 서열이 하나 이상의 서열 구역 또는 영역에 걸쳐 동일한 경우, 이들은 그러한 영역 내에서 동일성을 공유한다. "정렬된" 서열은 종종 기준 서열과 비교하여 누락되거나 추가의 염기 또는 아미노산(갭)에 대한 보정을 포함하는 다수의 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질(아미노산) 서열을 지칭한다.
동일성은 전체 서열 길이 또는 서열의 일부에 걸쳐 연장될 수 있다. 특정 양태에서, 퍼센트 동일성을 공유하는 서열의 길이는 2, 3, 4, 5개 이상의 인접한 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산, 예를 들어, 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 인접한 아미노산이다. 추가 특정 양태에서, 서열 공유 동일성의 길이는 20개 이상의 인접한 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산, 예를 들어, 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상의 인접한 아미노산이다. 추가의 특정 양태에서, 서열 공유 동일성의 길이는 35개 이상의 인접한 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산, 예를 들어, 적어도 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 인접한 아미노산이다. 추가의 특정 양태에서, 서열 공유 동일성의 길이는 50개 이상의 인접한 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산, 예를 들어, 적어도 50 내지 55, 55 내지 60, 60 내지 65, 65 내지 70, 70 내지 75, 75 내지 80, 80 내지 85, 85 내지 90, 90 내지 95, 95 내지 100, 100 내지 110개, 또는 그 초과의 인접한 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산이다.
용어 "상동성(homologous)" 또는 "상동성(homology)"은 2개 이상의 참조된 개체가 주어진 영역 또는 부분에 대해 적어도 부분적인 동일성을 공유함을 의미한다. 상동성 또는 동일성의 "구역", "영역", 또는 "도메인"은 2개 이상의 언급된 실체의 일부가 상동성을 공유하거나 동일함을 의미한다. 따라서, 2개의 서열이 하나 이상의 서열 영역에 걸쳐 동일한 경우, 이들은 이러한 영역에서 동일성을 공유한다. "실질적인 상동성"은 분자가 참조 분자, 또는 상동성을 공유하는 참조 분자의 관련/대응 영역 또는 부분의 구조 또는 기능(예를 들어, 생물학적 기능 또는 활성) 중 하나 이상의 적어도 부분적인 구조 또는 기능을 갖거나 가질 것으로 예측되도록 구조적으로 또는 기능적으로 보존됨을 의미한다.
2개의 서열 사이의 동일성(상동성)의 정도는 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리즘을 사용하여 확인할 수 있다. 백분율 동일성은 디폴트 파라미터를 사용하여 www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo에서 이용 가능한 정렬 프로그램 Clustal Omega를 사용하여 계산될 수 있다(문헌[Sievers et al., "Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega." (2011 October 11) Molecular systems biology 7:539] 참조). 서열에 대한 동일성을 계산할 목적으로, 태그와 같은 확장은 포함되지 않는다.
본 명세서에 기재된 rAAV 벡터 게놈 서열을 포함하는 벡터 게놈 서열은 하나 이상의 "발현 조절 요소"를 포함할 수 있다. 통상적으로, 발현 조절 요소는 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 미치는 핵산 서열이다. 벡터 내에 존재하는 프로모터 및 인핸서와 같은 본 명세서에 기재된 발현 조절 요소를 포함하는 조절 요소는 적절한 이종성 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 21OH 유전자) 전사 및/또는 번역(예를 들어, 인트론을 위한 프로모터, 인핸서, 스플라이싱 신호, mRNA의 프레임내 번역을 가능하게 하는 유전자의 정확한 리딩 프레임의 유지 등)을 용이하게 하기 위해 포함된다. 발현 조절 요소는 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화(polyA) 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 일부 경우에, 인코딩된 생성물의 분비를 향상시키는 서열(예를 들어, 21OH)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터 게놈 서열은 공통 서열, 예컨대, Kozak 서열(예를 들어, RNA Kozak 서열로 전사된 DNA 서열)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터 게놈 서열은 21OH 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 Kozak 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA Kozak 서열은 ACCAUGG(서열번호 44), GCCGCCACCAUGG(서열번호 45), CCACCAUG(서열번호 46) 또는 CCACCAUGG(서열번호 47)를 포함하거나 이로 이루어진다.
발현 조절은 전사, 번역, 스플라이싱, 메시지 안정성 등의 수준에서 수행될 수 있다. 통상적으로, 전사를 조절하는 발현 조절 요소는 전사된 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단 근처(즉, "상류")에 병치된다. 발현 조절 요소는 또한 전사된 서열의 3' 말단(즉, "하류")에 또는 전사체 내에(예를 들어, 인트론에서) 위치할 수 있다. 발현 조절 요소는 전사된 서열로부터 멀리 떨어진 거리(예를 들어, 21OH를 발현하는 뉴클레오타이드 서열로부터 100 내지 500, 500 내지 1000, 2000 내지 5000, 5000 내지 10,000, 또는 그 초과의 뉴클레오타이드)에서, 심지어 상당한 거리에 위치할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 폴리뉴클레오타이드 길이 제한으로 인해, AAV 벡터의 경우, 이러한 발현 조절 요소는 통상적으로 21OH를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로부터 1 내지 1000개의 뉴클레오타이드 내에 있을 것이다.
기능적으로, 21OH를 인코딩하는 작동 가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현은 요소가 뉴클레오타이드 서열의 전사 및 적절한 경우 전사체의 번역을 조절하도록 요소(예를 들어, 프로모터)에 의해 적어도 부분적으로 조절 가능하다. 발현 조절 요소의 특정 예는 일반적으로 전사된 서열의 5'에 위치하는 프로모터이다. 발현 조절 요소의 또 다른 예는 전사된 서열의 5'에, 전사된 서열의 3'에, 또는 전사된 서열 내에 위치할 수 있는 인핸서이다.
본 명세서에서 사용되는 "프로모터"는 재조합 생성물(예를 들어, 21OH)을 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오타이드)에 인접하여 위치하는 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 프로모터는 통상적으로 인접한 서열, 예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된다. 프로모터는 통상적으로 프로모터가 존재하지 않을 때 발현되는 양과 비교하여 이종성 폴리뉴클레오타이드로부터 발현되는 양을 증가시킨다.
본 명세서에서 사용되는 "인핸서"는 21OH를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 인접하여 위치하는 서열을 지칭할 수 있다. 인핸서 요소는 통상적으로 프로모터 요소 또는 기능의 상류에 위치하지만 DNA 서열(예를 들어, 21OH를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열)의 하류 또는 그 내에 위치할 수 있다. 따라서, 인핸서 요소는 예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오타이드의 상류 또는 하류에 100개의 염기쌍, 200개의 염기쌍, 또는 300개 이상의 염기쌍에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 통상적으로 프로모터 요소에 의해 제공되는 증가된 발현 수준 이상으로 이종성 폴리뉴클레오타이드의 발현을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 발현 조절 요소는 많은 상이한 세포 타입에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도할 수 있는 유비쿼터스, 구성적, 또는 무차별성(promiscuous) 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 이러한 요소는 사이토메갈로바이러스/β-액틴 하이브리드(예를 들어, CAG, CB6 또는 CBA) 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터 및/또는 인핸서 서열, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus: RSV) 프로모터 및/또는 인핸서 서열 및 다양한 포유동물 세포 타입에서 활성인 다른 바이러스 프로모터 및/또는 인핸서, 또는 자연에 존재하지 않는 합성 요소(예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조), SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, EF1 프로모터(Invitrogen), CBA 프로모터와 커플링된 직전 초기 CMV 인핸서(Beltran et al., Gene Therapy, 17(9): 1162-1174 (2010)), 및 CBh 프로모터(Gray et al., Hum Gene Ther, 22(9): 1143-1153 (2011))를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 rAAV는 CMV 인핸서의 일부, 닭 베타-액틴 프로모터의 일부, 및 UBC 인핸서의 일부를 함유하는 합성 CASI 프로모터를 포함한다(예를 들어, WO 2012/115980호 참조). 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 서열번호 2, 또는 서열번호 2와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 CAG 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 서열번호 3, 또는 서열번호 3과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 PGK 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 서열번호 48, 또는 서열번호 48과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 CB6 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 서열번호 49, 또는 서열번호 49와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 CBA 프로모터 서열을 포함한다. 프로모터 서열의 비제한적인 예는 표 1을 참조한다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 가능하게 하고, 외인성으로 공급된 화합물, 온도와 같은 환경 요인, 또는 특정 생리학적 상태, 급성기, 세포의 특정 분화 상태의 존재에 의해, 또는 세포 복제 시에만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 Invitrogen 및 Clontech를 비제한적으로 포함하는 다양한 상업적 공급원으로부터 이용 가능하다. 많은 다른 시스템이 기술되었고 사용 가능하다. 외인성으로 공급된 화합물에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템; 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억제성 시스템, 테트라사이클린-유도성 시스템, RU486-유도성 시스템 및 라파마이신-유도성 시스템을 포함한다. 엄격하게 조절되고 21OH 발현이 의도되는 특정 표적 세포 타입에 특이적인 임의의 타입의 유도성 프로모터가 사용될 수 있다.
발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터)는 본 명세서에서 "조직-특이적 발현 조절 요소/프로모터"로 지칭되는 특정 조직 또는 세포 타입에서 활성인 것들을 포함한다. 조직-특이적 발현 조절 요소는 통상적으로 특정 세포 또는 조직(예를 들어, 부신, 부신 피질, 간, 뇌, 중추 신경계, 척수, 눈, 망막, 뼈, 근육, 폐, 췌장, 심장, 신장 세포 등)에서 활성이다. 발현 조절 요소는 통상적으로 이러한 세포, 조직 또는 기관에서 활성인데, 이는 이들이 특정 세포, 조직 또는 기관 타입에 고유한 전사 활성제 단백질, 또는 전사의 다른 조절자에 의해 인식되기 때문이다. 따라서, 일부 경우에, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 숙주 세포(예를 들어, 부신 세포)에서 21OH 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시하는 프로모터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 부신 세포는 부신 피질 세포이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 부신 피질 세포 또는 부신 수질 세포에서의 발현에 특이적인 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 대상체의 부신(예를 들어, 부신 피질 또는 부신 수질), 간 또는 난소에서의 발현에 특이적인 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 부신 줄기 세포(예를 들어, 부신피질 줄기 세포) 또는 부신 전구 세포에서의 발현에 특이적인 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터에 유용한 조절 서열은 또한 인트론을 함유하며, 이러한 인트론은 프로모터/인핸서 서열과 21OH 유전자 사이에 선택적으로 위치한다. 일부 실시형태에서, 인트론 서열은 SV-40으로부터 유래되고, SD-SA로 지칭되는 100 bp 미니-인트론 스플라이스 공여자/스플라이스 수용자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 전사후 조절 요소를 포함한다. 전사후 조절 요소의 한 가지 예는 우드척 간염 바이러스 전사후 요소(WPRE)이다(예를 들어, 문헌[Wang and Verma, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96: 3906-3910 (1999)] 참조). 특정 실시형태에서, 전사후 조절 요소는 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HBVPRE) 또는 RNA 수송 요소(RTE)이다. 일부 실시형태에서, WPRE 또는 HBVPRE 서열은 미국 특허 제6,136,597호 또는 미국 특허 제6,287,814호에 개시된 임의의 WPRE 또는 HBVPRE 서열이다. 일부 실시형태에서, WPRE 서열은 하기를 포함하거나 이로 이루어진다:
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일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 polyA 신호를 포함한다. PolyA 신호는 SV-40, 인간 및 소를 비제한적으로 포함하는 많은 적합한 종으로부터 유래될 수 있다.
rAAV 벡터에 포함될 수 있는 또 다른 유용한 조절 성분은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)이다. IRES 서열, 또는 다른 적합한 시스템은 단일 유전자 전사체로부터 하나 초과의 폴리펩타이드를 생산하는 데 사용될 수 있다. IRES(또는 다른 적합한 서열)는 하나 초과의 폴리펩타이드 사슬을 함유하는 단백질을 생산하거나 동일한 세포로부터 또는 동일한 세포 내에서 2개의 상이한 단백질을 발현시키는 데 사용된다. 예시적인 IRES는 폴리오바이러스 내부 리보솜 진입 서열이다. IRES는 rAAV 벡터에서 21OH 트랜스진에 대해 5' 또는 3'에 위치할 수 있다. 다른 실시형태에서, rAAV 벡터는 단일 프로모터로부터 다수의 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 2A 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
재조합 "벡터" 또는 "rAAV 벡터"는 바이러스로부터 야생형 게놈을 제거하고 이를 비-천연 핵산, 예컨대, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 21OH를 발현하는 치료 유전자 발현 카세트)로 대체하기 위한 분자 방법을 사용함으로써 AAV와 같은 바이러스의 야생형 게놈으로부터 유래된다. 통상적으로, AAV의 경우, 야생형 AAV 게놈의 하나 또는 둘 다의 역 말단 반복부(ITR) 서열이 AAV 벡터에 보유된다. rAAV 벡터는 바이러스 게놈과 구별될 수 있는데, 이는 바이러스 게놈의 전부(또는 일부)가 바이러스 게놈 핵산과 관련하여 비-천연 서열로 대체되었기 때문이다. 따라서, 이종성 폴리뉴클레오타이드와 같은 비-천연 서열의 도입은 바이러스 벡터를 "재조합" 벡터로 정의하며, 이는 AAV의 경우에 "rAAV 벡터"로 지칭될 수 있다. 21OH를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 벡터는 또한 "CYP21 벡터" 또는 "21OH 벡터"로 지칭될 수 있다. 문맥으로부터 명백한 바와 같이, "벡터"는 단리된 재조합 뉴클레오타이드 서열, 또는 재조합 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 AAV 입자 또는 비리온을 지칭할 수 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 miRNA(microRNA)에 대한 임의의 결합 부위를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 21OH 단백질의 발현이 요망되지 않는(즉, 탈표적화) 세포에서 발현되는 miRNA에 대한 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 miR-122에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 21OH-인코딩 서열에 대한 miR-122의 결합은 간 세포에서 이러한 서열의 발현을 감소시킬 수 있으며, 여기서 miR-122는 매우 우세하다(Thakral and Ghoshal, Curr Gene Ther. 2015; 15(2): 142-150).
rAAV 핵산 서열은 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 후속 감염(형질전환)을 위해 바이러스(본 명세서에서 "입자" 또는 "비리온"으로도 지칭됨)에 패키징될 수 있다. 재조합 벡터 서열이 AAV 입자로 캡시드화되거나 패키징되는 경우, 입자는 "rAAV"로 지칭될 수 있다. 이러한 입자 또는 비리온은 통상적으로 벡터 게놈을 캡슐화하거나 패키징하는 단백질을 포함할 것이다. 특정 예는 바이러스 외피 단백질, 및 AAV의 경우 캡시드 단백질을 포함한다.
본 명세서에 기재된 rAAV 벡터 및 입자의 AAV 성분은 다양한 AAV 혈청형으로부터 선택될 수 있다. 특정 경우에, rAAV 벡터는 rh10, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 또는 rh74 혈청형으로부터의 AAV 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 AAV 성분은 AAV 혈청형으로부터 다양한 기술을 사용하여 용이하게 단리될 수 있다. 이러한 AAV는 학술적, 상업적 또는 공개적 출처(예를 들어, American Type Culture Collection, 버지니아 머내서스 소재)로부터 단리되거나 수득될 수 있다. 대안적으로, AAV 서열은 문헌 또는 데이터베이스, 예를 들어, GenBank™, PubMed 등에서 입수 가능한 것과 같은 공개된 서열을 참조하여 합성 또는 다른 적합한 수단을 통해 수득될 수 있다.
특정 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용함되는 미국 특허 제7,906,111호 또는 미국 특허 제7,629,322호에 개시된 바와 같은 AAV 핵산 서열 또는 AAV 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용함되는 미국 특허 제7,282,199호, 제9,587,250호 또는 제9,677,089호에 개시된 바와 같은 AAV 혈청형 AAV8 또는 이의 변이체로부터의 AAV 핵산 서열 또는 AAV 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 제7,198,951호에 개시된 바와 같은 AAV 혈청형 AAV9 또는 이의 변이체로부터의 AAV 핵산 서열 또는 AAV 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 제9,840,719호에 개시된 바와 같은 AAV 혈청형 rh74 또는 이의 변이체로부터의 AAV 핵산 서열 또는 AAV 단백질을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 적어도 하나의 AAV ITR 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV 벡터는 2개의 ITR 서열을 포함하며, 이 ITR 서열은 동일하거나 상이한 AAV 혈청형일 수 있다. 특정 경우에, AAV ITR은 rh10, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh74, 및 다른 AAV 혈청형을 비제한적으로 포함하는 임의의 AAV 혈청형 중에서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 rAAV 벡터는 1 또는 2개의 AAV2 ITR의 서열을 포함하는 게놈을 포함한다.
본 개시내용은 본 명세서에 기재된 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자를 추가로 제공한다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 AAV ITR 및 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(또한 이종성 폴리뉴클레오타이드로도 지칭됨)을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 입자에 관한 것이며, 여기서 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 rh10, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh74, 및 다른 AAV 혈청형으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 캡시드 단백질을 포함한다.
일 실시형태에서, rAAV 벡터는 인간 21OH cDNA, AAV2로부터의 ITR, 및 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 유전자로부터의 인핸서, 프로모터, 닭 β-액틴 유전자로부터의 스플라이스 공여자 및 인트론, 및 토끼 β-글로빈 유전자로부터의 스플라이스 수용자로 이루어진 CAG 프로모터를 포함하는 rh10 AAV 벡터이다. 추가 실시형태에서, rAAV 벡터는 서열번호 1을 포함하는 21OH 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 및 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어진 CAG 프로모터를 포함한다. 일 실시형태에서, rAAV 벡터는 인간 21OH cDNA, AAV2로부터의 ITR, 및 PGK 프로모터를 포함하는 rh10 AAV 벡터이다. 또 다른 실시형태에서, rAAV 벡터는 서열번호 1을 포함하는 21OH 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 및 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어진 PGK 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV1 캡시드 및 인간 21OH cDNA를 포함하는 핵산 분자; CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터; 및 선택적으로 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV2 ITR 서열을 갖는 게놈을 함유하고 AAV1 캡시드 단백질을 인코딩하는 ssAAV1-PGK-CYP21HA 벡터이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV1-CAG-CYP21, AAV1-PGK-CYP21, AAV1-CBA-CYP21 또는 AAV1-CB6-CYP21 벡터이다. 다른 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV5 캡시드 및 인간 21OH cDNA를 포함하는 핵산 분자; CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터; 및 선택적으로, 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV2 ITR 서열을 갖는 게놈을 함유하고 AAV5 캡시드 단백질을 인코딩하는 ssAAV5-PGK-CYP21HA 벡터이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV5-CAG-CYP21, AAV5-PGK-CYP21, AAV5-CBA-CYP21 또는 AAV5-CB6-CYP21 벡터이다. 또 다른 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 인간 21OH cDNA; CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터; 및 선택적으로, 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는 AAV6 벡터이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV6-CAG-CYP21, AAV6-PGK-CYP21, AAV6-CBA-CYP21 또는 AAV6-CB6-CYP21 바이러스이다. 추가 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 인간 21OH cDNA; CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터; 및 선택적으로, 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는 핵산 분자 및 AAV8 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV8-CAG-CYP21, AAV8-PGK-CYP21, AAV8-CBA-CYP21 또는 AAV8-CB6-CYP21 바이러스이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 인간 21OH cDNA; CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터; 및 선택적으로, 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는 AAV9 벡터이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV9-CAG-CYP21, AAV9-PGK-CYP21, AAV9-CBA-CYP21 또는 AAV9-CB6-CYP21 벡터이다. 추가 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 인간 21OH cDNA; CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터; 및 선택적으로, 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는 핵산 분자 및 AAV10 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV10-CAG-CYP21, AAV10-PGK-CYP21, AAV10-CBA-CYP21 또는 AAV10-CB6-CYP21 바이러스이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 인간 21OH cDNA; CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터; 및 선택적으로, 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는 핵산 분자 및 rh10 AAV 캡시드를 포함한다.
일 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV2 ITR 서열을 갖는 게놈을 함유하고 rh10 캡시드 단백질을 인코딩하는 AAVrh10-CAG-CYP21A2-HA 바이러스이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAVrh10-CAG-CYP21, AAVrh10-PGK-CYP21, AAVrh10-CBA-CYP21 또는 AAVrh10-CB6-CYP21 벡터이다. 임의의 이러한 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 48, 또는 서열번호 49, 또는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 48, 또는 서열번호 49와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이로 이루어질 수 있다. 임의의 이러한 실시형태에서, rAAV 벡터는 Kozak 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, Kozak 서열은 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 또는 서열번호 47을 포함하거나 이로 전사될 수 있다. 임의의 이러한 실시형태에서, rAAV 벡터는 HBVPRE 서열 또는 WPRE 서열(예를 들어, 서열번호 51)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 Kozak 서열을 포함하고 추가로 miR-122 결합 서열의 유무에 관계없이, CBA 프로모터의 조절 하에 인간 21OH를 인코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 AAV5 혈청형 벡터 또는 입자이다. 일 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 탈표적화를 위한 CBA 프로모터, Kozak 서열 및 miR-122 miRNA 결합 부위를 포함하는 AAV5-CBA-Kozak-COhCYP21-miR122 벡터(Thakral and Ghoshal, Curr Gene Ther. 2015; 15(2): 142-150), 및 코돈-최적화된(CO) 인간 CYP21 트랜스진(서열번호 50)이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV5-CBA-Kozak-hCYP21, AAV5-CBA-Kozak-hCYP21-miR122, 또는 AAV5-CBA-Kozak-COhCYP21 벡터이다. 임의의 이러한 실시형태에서, 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 50을 포함할 수 있으며, Kozak 서열은 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 또는 서열번호 47을 포함하거나 이로 전사될 수 있다. 임의의 이러한 실시형태에서, rAAV 벡터는 HBVPRE 서열 또는 WPRE 서열(예를 들어, 서열번호 51)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 캡시드("Cap") 단백질(예를 들어, vp1, vp2, vp3 및 초가변 영역 포함), 바이러스 복제("Rep") 단백질(예를 들어, rep 78, rep 68, rep 52, 또는 rep 40), 및/또는 하나 이상의 이러한 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다. 이러한 AAV 성분은 다양한 벡터 시스템 및 숙주 세포에서 용이하게 이용될 수 있다. 이러한 성분은 단독으로, 다른 AAV 혈청형 서열 또는 성분과 조합하여, 또는 비-AAV 바이러스 서열로부터의 요소와 조합하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 인공 AAV 혈청형은 비-천연 발생 캡시드 단백질을 갖는 AAV를 비제한적으로 포함한다. 이러한 인공 캡시드는 선택된 AAV 서열(예를 들어, vp1 캡시드 단백질의 단편)을 상이한 선택된 AAV 혈청형, 동일한 AAV 혈청형의 비-인접한 부분으로부터, 비-AAV 바이러스 공급원으로부터, 또는 비-바이러스 공급원으로부터 수득될 수 있는 이종성 서열과 조합하여 사용하여 임의의 적합한 기술에 의해 생성될 수 있다. 인공 AAV 혈청형은 비제한적으로 슈도타입화된 AAV, 키메라 AAV 캡시드, 재조합 AAV 캡시드, 또는 "인간화된" AAV 캡시드일 수 있다. 하나의 AAV의 캡시드가 이종성 캡시드 단백질로 대체된 슈도타입화된 벡터가 본 개시에 유용하다. 일 실시형태에서, AAV는 AAV2/5이다. 또 다른 실시형태에서, AAV는 AAV2/8이다(예를 들어, 문헌[Mussolino et al., Gene Therapy, 18(7): 637-645 (2011); Rabinowitz et al., J Virol, 76(2): 791-801 (2002)] 참조).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 유용한 벡터는 최소한, 선택된 AAV 혈청형 캡시드를 인코딩하는 서열, 또는 이의 단편을 함유한다. 일부 실시형태에서, 유용한 벡터는 최소한, 선택된 AAV 혈청형 rep 단백질을 인코딩하는 서열 또는 이의 단편을 함유한다. 선택적으로, 이러한 벡터는 AAV cap 및 rep 단백질 둘 다를 함유할 수 있다. AAV rep 및 cap 둘 다가 제공되는 벡터에서, AAV rep 및 AAV cap 서열 둘 다는 하나의 혈청형일 수 있다. 대안적으로, rep 서열이 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래하고 cap 서열이 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된 벡터가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, rep 및 cap 서열은 별도의 공급원(예를 들어, 별도의 벡터, 또는 숙주 세포 및 벡터)으로부터 발현된다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 rep 서열은, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 제7,282,199호에 기재된 AAV2/8과 같은 키메라 AAV 벡터를 형성하기 위해 상이한 AAV 혈청형의 cap 서열에 프레임내 융합된다.
적합한 rAAV는 본 명세서에 정의된 바와 같은 AAV 혈청형 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 단편; 기능성 rep 유전자; 최소한, AAV 역 말단 반복부(ITR) 및 21OH(CYP21A2) 핵산 서열로 구성된 핵산 분자; 및 핵산 분자의 AAV 캡시드 단백질로의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 숙주 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 rAAV 벡터 또는 rAAV 입자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. AAV 캡시드에 rAAV 벡터를 패키징하기 위해 숙주 세포에 존재하는데 필요한 성분은 트랜스로 숙주 세포에 제공될 수 있다. 대안적으로, 요구되는 성분(예를 들어, 벡터, rep 서열, cap 서열 및/또는 헬퍼 기능) 중 임의의 하나 이상은 다양한 방법을 이용하여 요구되는 성분 중 하나 이상을 함유하도록 조작된 안정한 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 가장 적합하게는, 이러한 안정한 숙주 세포는 유도성 프로모터의 조절 하에 필요한 성분(들)을 함유할 것이다. 그러나, 필요한 성분(들)은 구성적 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다. 적합한 유도성 및 구성적 프로모터의 예는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열, 즉, 21OH와 함께 사용하기에 적합한 조절 요소의 상기 논의에서 본 명세서에 제공된다. 또 다른 대안에서, 선택된 안정한 숙주 세포는 구성적 프로모터의 조절 하에 있는 선택된 성분(들) 및 하나 이상의 유도성 프로모터의 조절 하에 있는 다른 선택된 성분(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 293개의 세포(구성적 프로모터의 조절 하에 E1 헬퍼 기능을 함유함)로부터 유래되지만, 유도성 프로모터의 조절 하에 rep 및/또는 cap 단백질을 함유하는 안정한 숙주 세포가 생성될 수 있다. 또 다른 안정한 숙주 세포가 생성될 수 있다.
본 개시내용의 rAAV를 생산하는데 필요한 rAAV 벡터, rep 서열, cap 서열, 및 헬퍼 기능은 그 위에 운반되는 서열을 전달하는 임의의 유전 요소의 형태로 패키징 숙주 세포에 전달될 수 있다. 선택된 유전 요소는 본 명세서에 기재된 것을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. rAAV 입자를 생성하는 것을 포함하는 본 개시내용의 임의의 실시형태를 구성하는 데 사용되는 방법은 핵산 조작의 당업자에게 공지되어 있고, 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기술을 포함한다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;Fisher et al, J. Virol., 70:520-532 (1993)]; 및 미국 특허 제5,478,745호 참조, 이들 각각은, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용함됨).
일 양태에서, 본 개시내용은 rAAV 입자를 생산하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 21OH를 발현하는 rAAV 벡터 게놈을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 분자; (b) AAV rep를 인코딩하는 핵산 분자; (c) 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 분자; 및 (d) rAAV 벡터 게놈을 rAAV 입자에 패키징하기 위한 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 rAAV 입자는 다양한 방법에 의해 정제될 수 있다. 일 실시형태에서, rAAV 바이러스는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2018/0163183 A1호 참조). 본 명세서에 개시된 AAV 벡터 및 입자의 작제 및 특성규명에 관한 추가 세부사항은 국제 특허 공개 WO 2019/143803호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 인간 CYP21A2 트랜스진에 대한 발현 카세트를 함유하는 비-복제, 재조합 AAV 혈청형 5(AAV5) 벡터를 포함하는 조성물은 도 4에 도시된 AAV-hCYP21-Opt 벡터 디자인을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV5 입자에 패키징되는 트랜스진의 서열은 5'에서 3'으로 열거된 하기 요소로 구성되는 단일 가닥 DNA이다: AAV 5' 역 말단 반복부(ITR), AAV 패키징 신호(Ψ), 사이토메갈로바이러스 인핸서, 스플라이스 공여자를 갖는 표준 Kozak 서열 및 스플라이스 수용자를 갖는 토끼 β-글로빈 인트론을 포함하는 닭 β-액틴 프로모터, 서열번호 50의 코돈 최적화된 인간 21-하이드록실라제(21-OH) cDNA, 토끼 β-글로빈 polyA 신호, 및 AAV 3' 역 말단 반복부 ITR.
일부 실시형태에서, rAAV 벡터의 발현 카세트는 서열번호 52의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터의 발현 카세트는 서열번호 53의 핵산 서열을 포함하는 5' ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터의 발현 카세트는 서열번호 54의 핵산 서열을 포함하는 CMVIE 인핸서를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터의 발현 카세트는 서열번호 55의 핵산 서열을 포함하는 CBA 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터의 발현 카세트는 서열번호 56의 핵산 서열을 포함하는 인트론을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터의 발현 카세트는 서열번호 57의 핵산 서열을 포함하는 코돈 최적화된 hCYP21을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터의 발현 카세트는 서열번호 58의 핵산 서열을 포함하는 베타-글로빈 polyA를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터의 발현 카세트는 서열번호 59의 핵산 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다.
약제학적 조성물
본 개시내용의 rAAV 벡터 또는 입자는 투여에 적합한 약제학적 조성물에 도입될 수 있다. 일 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 rAAV 벡터 또는 rAAV 입자(예를 들어, 21OH를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 입자) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 확립된 경로를 사용하여 투여될 때 일반적으로 알레르기 또는 다른 심각한 부작용을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 미국 연방 또는 미국 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 동물, 및 더욱 구체적으로 인간에서 사용하기 위해 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 분자 실체 및 조성물은 "약제학적으로 허용 가능한" 것으로 간주된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 약제학적 투여와 양립 가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 담체는 해당 분야의 표준 참조 텍스트인 Remington's Pharmaceutical Sciences의 가장 최근 판에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 이러한 담체 또는 희석제의 일부 예는 물, 염수, 완충된 염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 5% 인간 혈청 알부민 및 적절한 생리학적 수준으로 pH를 유지하기 위한 다른 완충제, 예를 들어, HEPES를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 임의의 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 조성물에서의 이들의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 도입될 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐, "vg"는 "바이러스 게놈" 또는 "벡터 게놈"을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 개시된 rAAV의 투여에 사용될 수 있는 약제학적 조성물 및 전달 시스템의 예는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Md.; 및 Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315]에서 확인될 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립 가능하도록 제형화될 수 있다. 투여 경로의 예는 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내 투여, 또는 주사를 포함한다. 주사는 개복 수술 또는 복강경 검사를 통한 부신으로의 직접 주사 또는 카테터 삽입을 통한 부신 동맥 또는 부신 정맥으로의 주사를 포함할 수 있다. 비경구(예를 들어, 정맥내 또는 주사를 통한) 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 주사용 물, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제, 및 장성 조절용 제제, 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 염산 또는 수산화나트륨와 같은 산 또는 염기로 조정될 수 있다. 비경구 제조물은 앰풀, 일회용 시린지 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이알에 동봉될 수 있다.
주사용 사용에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우), 또는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, Cremophor EL®(BASF, 뉴저지 파시패니 소재) 또는 포스페이트 완충된 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사 능력이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어, 당, 다가알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 도입시킨 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 도입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 활성 성분과 이의 사전 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가 성분의 분말을 생성하는, 진공 건조 및 동결-건조이다.
주사를 위해, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 액체일 수 있다. 예시적인 생리학적으로 허용되는 담체는 멸균, 발열원-비함유 물 및 멸균, 발열원-비함유, 포스페이트 완충된 염수를 포함한다. 다양한 이러한 공지된 담체는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용함되는 미국 특허 제7,629,322호에 제공되어 있다. 일 실시형태에서, 담체는 등장성 염화나트륨 용액이다. 또 다른 실시형태에서, 담체는 평형염 용액이다. 일 실시형태에서, 담체는 TWEEN®(폴리소르베이트)을 포함한다. rAAV가 장기간 저장되는 경우, 이는 예를 들어, 글리세롤 또는 TWEEN®(폴리소르베이트) 20의 존재 하에 동결될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 공동으로 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성제(예를 들어, rAAV)를 함유한다. 본 개시내용의 투여 단위 형태에 대한 사양은 활성제(예를 들어, rAAV)의 독특한 특성 및 달성되는 특정 치료 효과, 및 개체의 치료를 위한 활성제(예를 들어, rAAV)와 같은 화합물의 당 분야에 고유한 제한에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존한다. 단위 투여 형태는 예를 들어, 액체 조성물, 또는 냉동-건조된 또는 동결건조된 상태의 조성물을 포함할 수 있는 앰플 및 바이알 내에 존재할 수 있으며; 멸균 액체 담체는 예를 들어, 생체내 투여 또는 전달 전에 첨가될 수 있다. 개별 단위 투여 형태는 다중-용량 키트 또는 용기에 포함될 수 있다. 재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 서열, 플라스미드, 벡터 게놈, 재조합 바이러스 입자(예를 들어, rAAV), 및 이의 약제학적 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단일 또는 다중 단위 투여 형태로 패키징될 수 있다.
21OH를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터 또는 rAAV 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 투여 설명서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 5.0×1013개 vg/mL(3.0×1013 내지 7.0×1013개 vg/mL)의 표적 농도의 본 명세서에 개시된 비-복제, 재조합 AAV5 벡터의 단일-용량, 보존제-비함유, 멸균, 유백색, 무색 용액, IV 주사제이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 10mM 인산나트륨, 180mM 염화나트륨, 0.005% w/v 폴록사머 188 및 주사용수를 함유한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 2.5mL의 공칭 충전 부피로 5mL Crystal Zenith®(CZ, 사이클릭 올레핀 폴리머) 바이알에 충전되고, 60℃ 이하에서 저장된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 rAAV 벡터, 또는 이를 포함하는 입자를 포함하는 키트를 제공하며, 여기서 rAAV 벡터는 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR) 및 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 치료적 유효량은 약 1012개 vg/kg 내지 약 1014개 vg/kg의 범위이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 약 1.5×1013개 vg/kg이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 약 3×1013개 vg/kg이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 약 6×1013개 vg/kg이다. 일부 실시형태에서, 키트는 rAAV 벡터를 대상체에게 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 rAAV 벡터를 정맥내로, 개복 수술 또는 복강경 검사를 통한 부신으로의 직접 주사에 의해, 또는 대상체에 카테터 삽입을 통한 부신 동맥 또는 부신 정맥으로의 주사에 의해 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 rAAV 벡터, 또는 이를 포함하는 입자를 포함하는 단위 용량을 제공하며, 여기서 rAAV 벡터는 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR) 및 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하며, 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되며; 치료적 유효량은 약 1012개 vg/kg 내지 약 1014개 vg/kg의 범위이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 약 1.5×1013개 vg/kg이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 약 3×1013개 vg/kg이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 약 6×1013개 vg/kg이다. 일부 실시형태에서, 단위 용량은 액체 제형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단위 용량은 정맥내로, 개복 수술 또는 복강경을 통한 부신으로의 직접 주사에 의해, 또는 카테터 삽입을 통한 부신 동맥 또는 부신 정맥으로의 주사에 의해 대상체에게 투여되도록 구성된다.
상기 양태의 일부 실시형태에서, 21OH 단백질은 인간 21OH 단백질이다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 인간 21OH(CYP21A2) cDNA를 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 50을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, 21OH 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 인코딩한다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, 프로모터는 숙주 세포에서 21OH 단백질의 발현을 지시한다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 부신 세포 또는 부신 피질 세포이다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, 프로모터는 사이토메갈로바이러스/β-액틴 하이브리드 프로모터, PGK 프로모터, 또는 부신 피질 세포에서의 발현에 특이적인 프로모터이다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, 사이토메갈로바이러스/β-액틴 하이브리드 프로모터는 CAG, CB6, 또는 CBA 프로모터이다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 48, 또는 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 혈청형 ITR이다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 혈청형이다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV5 혈청형이다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 Kozak 서열을 추가로 포함한다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 miR-122 결합 부위를 추가로 포함한다.
재조합 AAV 벡터 및 입자를 사용하는 방법
본 개시내용은 예컨대, 치료를 필요로 하는 대상체의 치료에서 AAV(예를 들어, 재조합 AAV) 벡터의 사용을 포함하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 제공된 방법은, 예를 들어, 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 rAAV 또는 조성물 중 어느 하나를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 대상체는 인간, 비인간 영장류, 돼지, 말, 소, 개, 고양이, 토끼, 기니피그, 햄스터, 마우스, 또는 래트이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 인간 대상체는 인간 여성 또는 인간 남성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 이전에 호르몬 요법 프로그램을 받은 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 유아이다. 특정 경우에, 대상체는 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 또는 약 1세의 인간 유아이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 3개월 미만, 6개월 미만, 9개월 미만, 1세 미만, 또는 18개월 미만의 인간 유아이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "필요로 하는 환자" 또는 "필요로 하는 대상체"는 21OH를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 또는 본 명세서에 제공된 이러한 rAAV를 포함하는 조성물로 치료 또는 개선할 수 있는 질환, 장애 또는 병태의 위험이 있거나 이를 앓고 있는 환자 또는 대상체이다. 이를 필요로 하는 환자 또는 대상체는 예를 들어, CAH와 같은, 21OHD와 같은 21OH의 기능장애와 관련된 질환으로 진단된 환자 또는 대상체일 수 있다. 대상체는 21OH 유전자 또는 단백질에 돌연변이 또는 기능장애를 가질 수 있다. "대상체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 장애, 예를 들어, 21OHD의 중증도 및/또는 지속기간 또는 이의 하나 이상의 증상을 감소시키거나 개선하거나 장애의 진행을 예방하거나 장애의 퇴행을 유발하거나 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 재발, 발달, 발병 또는 진행을 예방하거나 장애를 검출하거나 다른 치료법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)의 치료 효과(들)를 향상 또는 개선시키기에 충분한 약제학적 제제, 예를 들어, rAAV의 양을 지칭한다. rAAV의 유효량은, 예를 들어, 21OH의 발현을 증가시키고/시키거나 21OHD와 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있다.
본 개시내용은 21OH의 결핍 또는 기능장애를 특징으로 하는 장애 또는 질환을 갖는 대상체에게 치료적 이점을 제공하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 21OH를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는, rAAV의 방법 및 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 rAAV 또는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해서 대상체에서 21OH의 결핍 또는 기능장애를 특징으로 하는 상기 장애 또는 상기 질환을 치료한다.
일부 경우에, 본 개시내용은 21OH의 발현을 필요로 하는 대상체에서 이를 발현시키는 방법을 제공하되, 해당 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 rAAV 입자 또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해서 대상체에서 21OH를 발현시킨다다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 21OH의 발현 증가를 필요로 하는 대상체에서 이의 발현을 증가시키는 방법을 제공하되, 해당 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해서 대상체에서 21OH의 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 대상체의 부신(예를 들어, 부신 피질 또는 부신 수질), 간 또는 난소에서 21OH의 발현을 초래하거나 21OH의 발현을 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 대상체의 부신 줄기 세포(예를 들어, 부신피질 줄기 세포) 또는 부신 전구 세포에서 21OH의 발현을 초래하거나 21OH의 발현을 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 대상체의 간 또는 난소에서 21OH의 발현을 초래하거나 21OH의 발현을 증가시킨다.
본 개시내용은 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하여 대상체에서 21OHD를 치료하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 코티솔 및/또는 알도스테론의 수준 증가를 필요로 하는 대상체에서 코티솔 및/또는 알도스테론의 수준을 증가시키는 방법을 제공하되, 해당 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 rAAV 입자 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해서 대상체에서 코티솔 및/또는 알도스테론의 수준을 증가시킨다다. 본 개시내용은 프로게스테론, 17-OHP, 레닌 및/또는 안드로스텐디온(A4)의 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 이의 수준을 감소시키는 방법을 제공하되, 해당 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 rAAV 입자 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해서 대상체에서 프로게스테론, 17-OHP, 레닌 및/또는 안드로스텐디온(A4)의 수준을 감소시킨다.
본 개시내용은 21OHD(또는 CAH)를 갖는 대상체에서 21OHD(또는 선천성 부신 과형성, CAH)의 증상을 치료하거나, 감소시키거나, 개선시키거나, 이의 진행을 늦추거나, 예방하는 방법을 더 제공하되, 해당 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해서 대상체에서 21OHD의 증상을 치료하거나, 감소시키거나, 개선시키거나, 이의 진행을 늦추거나, 예방한다. 21OHD(또는 CAH)의 증상의 비제한적인 예는 생식기 및 근육량 남성화, 유아기의 염 소모 및 탈수, 성기능 장애(고전적 형태) 및 다모증, 여드름, 및 생식력 감소(고전적 및 비고전적 형태)를 포함한다. 남성 환자에서, 21OHD(또는 CAH)의 증상의 비제한적인 예는 저신장 및 조기 남성화를 포함한다. 프라더 분류 시스템은 인체 생식기의 남성화 정도를 측정하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 치료되는 대상체(예를 들어, 여성 대상체)는 프라더 단계결정에 의해 모호한 생식기를 갖는다(예를 들어, 대상체는 21OHD(또는 CAH)의 프라더 단계 IV 또는 V 형태로 영향을 받음).
일부 실시형태에서, 대상체는 21OH의 발현을 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 21OH 결핍(21OHD)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 여성 대상체)는 프라더 단계결정에 의해 모호한 생식기를 갖는다(예를 들어, 대상체는 21OHD(또는 CAH)의 프라더 단계 IV 또는 V 형태로 영향을 받음). 일부 실시형태에서, 대상체는 선천성 부신 과형성(CAH)을 갖는다. 일부 실시형태에서, CAH는 고전적 CAH이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 코티솔 및/또는 알도스테론을 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 코티솔 결핍 및/또는 알도스테론 결핍을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 과량의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌, 및/또는 안드로스텐디온(A4)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 혈액 및/또는 소변에서 과량의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌, 및/또는 안드로스텐디온(A4)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 대상체는 17-OHP의 약 5 초과 내지 약 10배의 ULN(정상 상한)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 ULN 초과의 안드로스텐디온(A4) 값을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 ULN 초과의 11-옥소 또는 11-케토 스테롤(예를 들어, 11-케토테스토스테론) 값을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 1일 약 30 밀리그램(mg/일)의 하이드로코르티손의 총 1일 용량으로 유일한 글루코코르티코이드 유지 요법으로서 경구 하이드로코르티손의 안정적인 요법을 받고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 약 10 mg/일 내지 약 50 mg/일의 하이드로코르티손의 총 1일 용량으로 유일한 글루코코르티코이드 유지 요법으로서 경구 하이드로코르티손의 안정적인 요법을 받고 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 투여하는 단계 전에 21OHD를 갖는 대상체를 선택하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환의 하나 이상의 증상을 갖지 않더라도 (예를 들어, 유전적 또는 생리학적 시험에 의해) 스크리닝되고 21OHD를 갖는 것으로 확인되거나 진단될 수 있다. 다른 실시형태에서, 대상체는 21OHD의 하나 이상의 증상을 갖는다. 특정 실시형태에서, 대상체는 CYP21A2 유전자에 돌연변이를 갖는다. 일 실시형태에서, 대상체는 CYP21A2 유전자에 기능 상실 돌연변이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 대상체는 기능성 CYP21A2 유전자와 밀접하게 연결된 비-기능성 CYP21A1P 유사유전자 사이의 유전자 전환 또는 재조합에 의해 유발된 CYP21A2 유전자에 결함을 갖는다.
일부 실시형태에서, rAAV 또는 조성물의 투여 전과 비교하여, 본 명세서에 개시된 rAAV 또는 조성물의 투여 후 대상체에서 더 높은 수준의 코티솔 및/또는 알도스테론이 존재한다. 일부 실시형태에서, rAAV 또는 조성물이 투여되지 않은 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대조군 대상체와 비교하여, 본 명세서에 개시된 rAAV 또는 조성물의 투여 후 대상체에서 더 높은 수준의 코티솔 및/또는 알도스테론이 존재한다. 일부 실시형태에서, rAAV 또는 조성물의 투여 전과 비교하여, 본 명세서에 개시된 rAAV 또는 조성물의 투여 후 대상체에서 더 낮은 수준의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌 및/또는 안드로스텐디온(A4)이 존재한다. 일부 실시형태에서, rAAV 또는 조성물이 투여되지 않은 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대조군 대상체와 비교하여, 본 명세서에 개시된 rAAV 또는 조성물의 투여 후 대상체에서 더 낮은 수준의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌 및/또는 안드로스텐디온(A4)이 존재한다.
본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 간독성제(예를 들어, 케타민, 할로겐화 마취제)는 본 명세서에 개시된 rAAV 또는 조성물과 조합하여 대상체에게 투여되지 않는다. 본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 간독성제는 본 명세서에 개시된 rAAV 또는 조성물을 수용한 후 적어도 12주 동안 투여되지 않는다. 본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 아세트아미노펜(및 다른 유사한 약물)은 본 명세서에 개시된 rAAV 또는 조성물과 조합하여 대상체에게 투여되지 않는다. 본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 자몽 주스를 포함하는 CYP3A 또는 CYP3A4 경로를 통해 타크롤리무스 대사를 저해하거나 유도하는 물질은 본 명세서에 개시된 rAAV 또는 조성물과 조합하여 대상체에게 투여되지 않는다.
투여 방식
본 명세서에 기재된 임의의 치료 방법에서, 21OH를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 상기 rAAV 입자를 부신 피질 혈관계 또는 부신 피질 자체에 도입하는 임의의 수단에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 21OH를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에게 전신 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 21OH를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에게 정맥내; 개복 수술 또는 복강경검사를 통한 부신으로의 직접 주사에 의해; 카테터 삽입을 통한 부신 동맥 또는 부신 정맥으로의 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 부신으로의 직접 주사는 부신 피질로의 직접 주사이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 21OH를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 선천성 부신 과형성(CAH)을 앓고 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 21OH의 결핍은 종종 부신에 영향을 미치는 유전성 장애 패밀리인 CAH로 이어진다. CAH는 중증 또는 경증의 형태로 대상체에 존재할 수 있다. 고전적 CAH 또는 고전적 CAH로 불리는 중증 형태는 일반적으로 신생아기 또는 유아기에 검출된다. 비-고전적 CAH(NCAH 또는 NCCAH) 또는 후기-발병 CAH로 불리는 더 경증 형태는 유아기부터 성인기까지 언제든지 증상을 유발할 수 있다(예를 들어, 문헌[ et al., J Clin Res Pediatr Endocrinol, 9(1): 1-7 (2017)] 참조). 본 개시내용의 rAAV는 고전적 CAH 또는 비-고전적 CAH를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 고전적 CAH를 갖는 대상체는 외부 생식기의 태아 남성화, 글루코코르티코이드 및 미네랄로코르티코이드 생산이 낮거나 없음, 및/또는 다량의 안드로겐 생산을 경험할 수 있다. 비-고전적 CAH를 갖는 대상체는 태아 남성화 및 코티솔 및 알도스테론 결핍 없이 안드로겐의 생산 증가를 경험할 수 있다.
코티솔은 부신에서 생산되는 스테로이드이다. 코티솔은 신체에서 신체적 및 정서적 스트레스에 반응하고 적절한 에너지 공급 및 혈당 수준을 유지하는 데 사용된다. 부신은 뇌 기저에 있는 작은 완두콩 크기의 샘인 뇌하수체에 의해 조절된다. 건강한 개인에서, 혈류에 존재하는 코티솔이 불충분할 때 뇌하수체는 부신피질 자극 호르몬(ACTH)을 방출한다. ACTH는 부신을 자극하여 더 많은 코티솔을 생산한다. 그러나, CAH를 갖는 것들은 전구체 17-하이드록시프로게스테론(17-OHP)을 코티솔로 전환시키는 데 필요한 불충분한 양의 21OH를 갖는다. 결과적으로, 뇌하수체는 코티솔의 필요성을 계속 감지하고 더 많은 ACTH를 방출한다. 이는 17-OHP의 과잉을 초래하고, 이는 이후 부신에서 과잉 안드로겐(남성화 스테로이드 호르몬)으로 전환된다. 이와 같이, 대상체는 영향을 받은 스테로이드 호르몬의 증가된 순환 수준을 결정함으로써 CAH로 진단될 수 있다. 21OHD에 대한 신생아 스크리닝은 통상적으로 17-OHP 측정을 사용하여 달성된다. 또한, CAH를 갖는 대상체는 17-OHP의 순환 수준을 추적함으로써 모니터링될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 영향을 받은 스테로이드 호르몬의 순환 수준은 본 명세서에 기재된 바와 같은 21OH를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물로 치료 동안 및/또는 후에, CAH를 갖는 대상체에서 측정될 수 있다. 대상체에서 17-OHP의 순환 수준은 대상체를 진단하고 본 명세서에 기재된 rAAV 입자 또는 약제학적 조성물로 대상체의 치료를 시작하거나 계속할지 여부에 대한 결정을 알리기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 하기 효과 중 하나 이상을 갖는다: (1) 생리학적 내인성 코티솔 생합성을 회복시켜 초생리학적 GC 요법의 후유증을 감소시킴으로써 외인성 글루코코르티코이드(GC)에 대한 의존도를 감소시키거나 제거하고; (2) 외인성 GC 투여량의 증가 없이 21-OHD와 관련된 안드로겐과다증을 감소시켜, 안드로겐과다증의 후유증을 또한 감소시키고; (3) 내인성 코티솔 및/또는 알도스테론 생합성의 회복에 의해 관련된 생명을 위협하는 부신 위기의 위험을 감소시키고; (4) 초생리학적 GC 및/또는 미네랄로코르티코이드(MC) 대체 요법의 일일 투여와 관련된 환자 부담 및 비순응을 감소시킴. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 CAH에서 부신 호르몬 결핍을 경감시키고, 이에 의해 질환의 근본적인 병리생물학을 개선하는데 도움이 된다.
본 개시내용은 대상체에서 21OH의 기능장애 또는 결핍을 특징으로 하는 장애 또는 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 기재된 약제학적 제제(예를 들어, rAAV 또는 rAAV를 포함하는 약제학적 조성물)의 용도를 고려한다. 본 개시내용은 또한 대상체에서 21OH의 기능장애 또는 결핍을 특징으로 하는 장애 또는 질환을 치료하기 위한 본 명세서에 기재된 약제학적 제제(예를 들어, rAAV 또는 rAAV를 포함하는 약제학적 조성물)의 용도를 포함한다.
투여량
조성물은 치료될 구역의 크기, 사용되는 바이러스 역가, 투여 경로, 및 방법의 요망되는 효과에 따라, 그러한 범위 내의 모든 숫자를 포함하는 약 50 마이크로리터(μL) 내지 약 1 밀리미터(mL)의 부피로 전달될 수 있다. 일 실시형태에서, 부피는 약 50μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 70μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 100μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 125μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 150μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 175μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 200μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 250μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 300μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 450μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 500μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 600μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 750μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 850μL이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 1000μL이다.
일부 실시형태에서, 프로모터 서열의 조절 하에 특정 트랜스진(예를 들어, 21OH)을 인코딩하는 핵산 서열을 보유하는 rAAV의 유효 농도는 밀리리터 당 약 108 내지 약 1013개의 벡터 게놈(vg/mL)의 범위이다. 예를 들어, rAAV 감염 단위는 문헌[McLaughlin et al, J. Virol., 62:1963 (1988)]에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 농도는 약 1.5×109개 vg/mL 내지 약 1.5×1012개 vg/mL이다. 일부 실시형태에서, 농도는 약 1.5×109개 vg/mL 내지 약 1.5×1011개 vg/mL이다. 일 실시형태에서, 유효 농도는 약 1.5×1010개 vg/mL이다. 또 다른 실시형태에서, 유효 농도는 약 1.5×1011개 vg/mL이다. 또 다른 실시형태에서, 유효 농도는 약 2.8×1011개 vg/mL이다. 또 다른 실시형태에서, 유효 농도는 약 1.5×1012개 vg/mL이다. 추가 실시형태에서, 유효 농도는 약 1.5×1013개 vg/mL이다. 일부 실시형태에서, 농도는 약 1013개 vg/mL 내지 약 7.0×1013개 vg/mL, 예를 들어, 약 2×1013개 vg/mL, 약 3×1013개 vg/mL, 약 4×1013개 vg/mL, 약 5×1013개 vg/mL, 약 6×1013개 vg/mL, 약 7×1013개 vg/mL의 범위이고, 이들 사이에 있는 모든 값 및 하위범위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 농도는 약 5×1013개 vg/mL이다.
일부 실시형태에서, 가장 낮은 유효 농도의 바이러스는 독성 또는 유해한 면역 반응과 같은 바람직하지 않은 효과의 위험을 감소시키기 위해 이용된다. 이러한 범위의 또 다른 투여량은 치료되는 대상체(예를 들어, 인간)의 신체 상태, 대상체의 연령, 특정 21OH 결핍 장애 및 진행성인 경우 장애가 발달되는 정도를 고려하여 주치의에 의해 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 21OH를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 약 1011 내지 약 1014개 vg/kg 대상체의 체중, 예컨대, 약 1012개 vg/kg 내지 약 1014개 vg/kg 대상체의 체중 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 21OH를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 약 1.5×1013개 vg/kg, 3×1013개 vg/kg, 또는 6×1013개 vg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 이들 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함하여 약 1012개 vg/kg 내지 약 1014개 vg/kg, 예를 들어, 약 5×1012개 vg/kg, 약 1013개 vg/kg, 또는 약 5×1013개 vg/kg의 범위이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 약 1013개 vg/kg 내지 약 1014개 vg/kg, 예를 들어, 약 1.5×1013개 vg/kg, 2×1013개 vg/kg, 2.5×1013개 vg/kg, 3×1013 vg/kg, 3.5×1013개 vg/kg, 4×1013개 vg/kg, 4.5×1013개 vg/kg, 5×1013개 vg/kg, 5.5×1013개 vg/kg, 6×1013개 vg/kg, 6.5×1013개 vg/kg, 7×1013개 vg/kg, 7.5×1013개 vg/kg, 8×1013개 vg/kg, 8.5×1013개 vg/kg, 9×1013개 vg/kg, 또는 9.5×1013개 vg/kg의 범위이고, 이들 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 약 1.5×1013개 vg/kg이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 약 3×1013개 vg/kg이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 약 6×1013개 vg/kg이다.
일부 실시형태에서, 대상체에는 본 명세서에 개시된 rAAV 벡터, rAAV 입자, 또는 조성물의 단일 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 본 명세서에 개시된 rAAV 벡터, rAAV 입자, 또는 조성물의 1회 초과 용량, 예를 들어, 2, 3, 4 또는 5회 용량이 투여된다.
본 명세서에 개시된 조성물은 임의의 빈도로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 대상체에게 1일 1회 또는 1일 1회 초과 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 대상체에게 1일 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 매일, 격일로, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 또는 6일마다 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 매주, 격주 또는 3주마다 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개월마다 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 매년 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 또는 20년마다 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 대상체의 평생 동안 1회 대상체에게 투여될 수 있다.
면역억제제와의 조합
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법 중 어느 하나는 치료적 유효량의 면역억제제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 rAAV 또는 조성물, 및 치료적 유효량의 면역억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 rAAV 또는 조성물, 및 치료적 유효량의 면역억제제를 투여하는 치료 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 면역억제제는 rAAV 벡터의 투여 전, 투여와 동시에, 그리고/또는 투여 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역억제제는 rAAV 벡터의 투여 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역억제제는 rAAV 벡터의 투여 적어도 12시간 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역억제제는 rAAV 벡터의 투여 약 2일 전에 투여된다.
일부 실시형태에서, 면역억제제는 비-글루코코르티코이드 면역억제제이다. 일부 실시형태에서, 면역억제제는 칼시뉴린의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 면역억제제는 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, 에베롤리무스, 조타롤리무스, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 면역억제제는 타크롤리무스이다. 면역억제제의 다른 비제한적인 예는 알킬화제, 예컨대, 질소 머스타드(사이클로포스파마이드), 나이트로소우레아, 백금 화합물, 엽산 유사체, 예컨대, 메토트렉세이트, 퓨린 유사체, 예컨대, 아자티오프린 및 메르캅토퓨린, 피리미딘 유사체, 예컨대, 플루오로우라실, 단백질 합성 억제제, 세포독성 항체, 예컨대, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, T 림프구를 저해하는 다클론성 항체, IL-2 수용체-지정된 단클론성 항체, 예컨대, 바실릭시맙 또는 다클리주맙, 항-CD3 단클론성 항체, 예컨대, 뮤로모나브, 오피오이드, TNF- 알파 결합 단백질, 예컨대, 인플릭시맙, 에타너셉트, 또는 아달리무맙, 마이코페놀레이트, 핀골리모드 및 미리오신을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역억제제는 경구 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역억제제의 치료적 유효량은 약 0.005 밀리그램/킬로그램(mg/kg) 내지 약 0.1 mg/kg, 예를 들어, 약 0.01 mg/kg, 약 0.015, 약 0.02, 약 0.025, 약 0.03, 약 0.035, 약 0.04, 약 0.045, 약 0.05, 약 0.06, 약 0.07, 약 0.08, 약 0.09, 또는 약 0.1 mg/kg 범위이고, 이들 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역억제제의 치료적 유효량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg의 범위이다. 일부 실시형태에서, 면역억제제의 치료적 유효량은 약 0.025 mg/kg이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 면역억제제는 1일 2회 투여된다.
일부 실시형태에서, 방법은 치료적 유효량의 스테로이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 미네랄로코르티코이드이다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 글루코코르티코이드이다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 하이드로코르티손이다. 일부 실시형태에서, 스테로이드는 rAAV 벡터의 투여 전, 투여와 동시에 그리고/또는 투여 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터의 투여 전에 대상체에게 투여되는 치료적 유효량의 스테로이드는 rAAV의 투여 후 대상체에게 투여되는 치료적 유효량의 스테로이드보다 높다.
실시예
실시예 1: 마우스에서 선천성 부신 과형성(CAH) 증상의 구조
21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 AAV 벡터의 작제는 국제 특허 공개 WO 2019/143803호에 기재된 바와 같이 수행되었으며, 이는 모든 목적을 위해 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
H-2aw18(Cyp21 -/- ) 마우스는 CAH의 임상 상태의 주요 병태생리학적 특징을 모방하는 21-OHD로 인한 인간 CAH의 유일한 동물 모델이며, 즉, 글루코코르티코이드(GC) 및 미네랄로코르티코이드(MC) 결핍으로 인해 출생후 사망률로 이어지는 성장 장애를 나타낸다. CBA 프로모터(본 명세서에서 "BBP-631"로도 지칭됨)의 조절 하에 서열번호 50의 코돈-최적화된 인간 CYP21A2 트랜스진을 함유하는 AAV 혈청형 5(AAV5) 벡터를 적어도 10주 동안 치료되지 않은 Cyp21 -/- 마우스와 비교하여 15주령 Cyp21 -/- 마우스 및 질환 표현형에 투여하였다. 마우스 GAPDH에 대해 표준화된 인간 CYP21A2 트랜스진 및 mRNA의 벡터 게놈 복사체(VGC)를 부신 및 다른 기관에서 측정하였다. GAPDH에 대해 표준화된 인간 21-OH에 특이적인 펩타이드 및 내인성 뮤린 21-OH 펩타이드를 검출하기 위해 맞춤형 나노-LCMSMS 프로테오믹스를 사용하여 부신 21-OH 단백질 발현을 평가하였다.
결과는 인간 CYP21A2 유전자의 기능적 복사체를 포함하는 AAV5의 투여가 하기를 수반하는 Cyp21 -/- 마우스의 조기 및 지속적인 질환 구조를 초래하였음을 보여주었다: (i) 모든 10주에 걸쳐 소변 프로게스테론 수준의 감소, 프로게스테론의 21-하이드록실화의 회복과 일치함; (ii) 신장에서 레닌 발현의 감소, 이는 MC 기능의 개선을 시사함; 및 (iii) 부신에서 벡터 게놈, 인간 CYP21A2 mRNA, 및 인간 21-OH 단백질의 용량-의존적 검출. 치료된 마우스는 부신 VGC, 트랜스진 mRNA 수준, 및 인간 21-OH 단백질 발현과 상관관계가 있는 용량 의존적 체중 증가를 입증하였다. 마우스의 부신에서 벡터 게놈의 용량-의존적 체중 증가 및 용량-의존적 검출은 각각 도 1a 및 도 1b에 도시되어 있다.
결론적으로, CBA 프로모터의 조절 하에 코돈-최적화된 인간 CYP21A2 트랜스진을 함유하는 AAV 혈청형 5(AAV5) 벡터를 갖는 Cyp21 -/- 마우스의 유전자 요법은 분자 수준에서 및 질환 표현형의 교정에 대해 강력하고 용량-의존적이었다.
WT 마우스에서, GLP 준수 독성학 연구는 4주, 12주 및 24주에 안전성(임상 관찰, 병리학, 혈액학, 임상 화학, 조직병리학, 및 면역 반응) 및 생체분포를 평가하였다. 벡터 게놈 및 트랜스진 발현을 부신 및 다른 조직에서 검출하였다. 시험된 임의의 용량에서 BBP-631의 단일 IV 투여 후 임의의 연구 시점에 WT C57BL/6 마우스에서 시험-물품 관련 독성이 관찰되지 않았다. 이러한 연구는 BBP-631이 3.0×1014개 vg/kg의 무독성량(NOAEL)으로 잘 용인되고, 부신에서 지속적인 트랜스진 전이 및 발현을 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 2: 비-인간 영장류(NHP)에서 21-OH의 발현
21-하이드록실라제(21OH) 단백질(BBP-631)을 인코딩하는 AAV 벡터의 1 용량이 투여된 NHP의 부신에서 인간 21-OH 단백질의 지속적인 용량-의존적 발현은 도 1b 및 도 1c에 도시되어 있다. NHP에서 내인성 21-OH의 백분율로 표현되는 생산된 인간 21-OH의 양은 고전적인 CAH를 갖는 사람들에서 임상적으로 의미있는 질환 영향에 대한 가능성을 시사한다(도 1c). 마우스 및 NHP에서 생물학적 활성 용량의 확인은 CB6 프로모터의 조절 하에 코돈-최적화된 인간 CYP21A2 트랜스진을 함유하는 개시된 AAV 혈청형 5(AAV5) 벡터를 이용한 1/2상 임상 연구에서의 출발 용량을 뒷받침한다.
2 내지 2.5년령 NHP(시노몰구스 마카크(cynomolgus macaque))에서 생체분포 및 안전성 연구를 수행하였다. 인간 CYP21A2 유전자의 기능적 복사체를 포함하는 AAV5의 IV 투여 후, 임상 관찰, 체중 또는 기관 중량, 소변검사, 혈액학, 혈청 화학, 전체 병리학, 조직병리학(흉부 척수 포함), 면역조직화학(CD4-림프구 침윤 없음), 또는 모든 용량에 걸쳐 항-약물 반응(AAV5 캡시드 또는 인간 21-OH에 대한 세포 매개 면역 반응)에 대해 유해한 안전성 신호가 보이지 않았다. 용량-의존적 바이러스 게놈 복사체(VGC) 및 안정한 mRNA 전사체 발현을 24주 동안 부신에서 검출하였다. 프로테오믹 방법은 내인성 21-OH 수준의 9 내지 24%까지 인간 21-OH 단백질의 용량-의존적이고 지속적인 발현을 나타내었다. 전반적으로, 결과는 인간 CYP21A2 유전자의 기능적 복사체를 포함하는 AAV5의 전달이 적어도 24주의 기간 동안 NHP의 부신에서 지속적인 발현으로 잘 용인된다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 1/2상 임상 연구
개요
인간의 공개-라벨, 용량-증가 연구에서 최초의 1/2상 연구를 21개의 하이드록실라제 결핍(21개의 OHD)으로 인해 고전적 선천성 부신 과형성(CAH)(단순 남성화 또는 염-소모성, 그룹 1) 또는 고전적 염-소모성 CAH(그룹 2)로 진단되고 치료 후 52주 동안 모니터링되는 최대 25명의 성인 참가자에게 투여된 CB6 프로모터(본 명세서에서 "BBP-631"로도 지칭됨)의 조절 하에 코돈-최적화된 인간 CYP21A2 트랜스진을 함유한 AAV 혈청형 5(AAV5) 벡터의 안전성, 내약성 및 효능을 평가하도록 설계하였다. BBP-631 치료를 받은 모든 참가자는 안전성 및 효능에 대해 추가 4년 동안 추적될 것이다. 전체적으로, 모든 참가자는 BBP-631로의 치료일로부터 적어도 5년 동안 추적될 것이다. 도 2는 연구에 대한 타임라인을 도시한다.
BBP-631은 용적 주입 펌프를 통해 1회, 단일 IV 주입으로서 희석되지 않은 상태로 투여될 것이다. BBP-631 활성 물질은 인간 CYP21A2 트랜스진에 대한 발현 카세트를 함유하는 비-복제, 재조합 AAV 혈청형 5(AAV5) 벡터이다. AAV-hCYP21-Opt 벡터 설계는 도 4에 도시되어 있다. rAAV5 입자로 패키징되는 트랜스진의 서열은 5'에서 3'으로 열거된 하기 요소를 포함하는 단일 가닥 DNA이다: AAV 5' 역 말단 반복부(ITR), AAV 패키징 신호(Ψ), 사이토메갈로바이러스 인핸서, 스플라이스 공여자를 갖는 표준 Kozak 서열 및 스플라이스 수용자를 갖는 토끼 β-글로빈 인트론을 포함하는 닭 β-액틴 프로모터, 코돈 최적화된 인간 21-하이드록실라제(21-OH) cDNA, 토끼 β-글로빈 polyA 신호, 및 AAV 3' 역 말단 반복부(ITR). CAG로 명명된 이러한 최적화된 프로모터 설계는 숙주 조직에서 트랜스진의 발현을 최대화하기 위한 것이다.
BBP-631 약물 생성물(DP)은 5.0×1013개 vg/mL(3.0×1013 내지 7.0×1013개 vg/mL)의 표적 농도의 비-복제 재조합 AAV5 벡터의 단일-용량, 보존제-비함유, 멸균, 유백색, 무색 용액, IV 주사제이다. BBP-631 DP 용액은 10mM 인산나트륨, 180mM 염화나트륨, 0.005% w/v 폴록사머 188 및 주사용수를 함유한다. BBP-631 DP를 2.5mL의 공칭 충전 부피로 5mL Crystal Zenith®(CZ, 사이클릭 올레핀 폴리머) 바이알에 충전하고, -60℃ 이하에서 저장하였다.
스크리닝 기간
모든 참가자에 대해, 스크리닝 기간은 첫 번째 스크리닝 평가 시점에 시작될 것이다. 스크리닝 기간은 BBP-631로의 치료(0일) 전 최대 42일일 것이다. 적격성은 안전성 및 스크리닝 실험실 샘플의 평가 및 17-OHP, 안드로스텐디온(A4), 부신피질자극 호르몬(ACTH), 및 코티솔의 역치 수준에 의해 결정될 것이다. 17-OHP 변동성을 측정하기 위해, 17-OHP의 적어도 3회의 평가가 수행될 것이고, 적어도 5일만큼 분리될 것이다. 17-OHP 평가 시점에, 간 기능을 평가하기 위해 샘플이 또한 수집될 것이다. 스크리닝 기간 동안, 참가자는 이들의 정상적으로 예정된 경구 하이드로코르티손 및 적용 가능한 경우 CAH에 대한 미네랄로코르티코이드 치료를 계속할 것이다. 달리 명시하지 않는 한, 스크리닝 샘플은 참가자가 첫 번째 정상적으로 예정된 경구 하이드로코르티손 및, 적용 가능한 경우, 미네랄로코르티코이드 치료를 받기 전 아침에 수집된다. 17-OHP 및 안드로스텐디온(A4)의 수준 이외에, 코티솔, 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 축, 시상하부-뇌하수체-성선(HPG) 축과 관련된 호르몬, 다른 생리적 또는 조절 기능, 레닌 및 알도스테론, 및 스테로이드 호르몬 패널을 포함하는 다른 호르몬 수준이 평가될 것이다. 적절한 경우, 샘플은 면역검정, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS), 또는 둘 다의 방법에 의해 분석될 것이다. 모든 호르몬 수준의 측정은 중앙 실험실에서 수행될 것이다.
기준선, 치료, 및 추적 관찰 기간
기준선, 치료, 및 추적 관찰 기간의 총 지속기간은 대략 52주로 계획된다.
기준선(BBP-631로의 치료 전): 입원환자(-4일 내지 0일)
다른 내인성 호르몬의 기준선 수준, 삶의 질(QOL), 골격 및 신체 조성 평가 및 골 교체율, 다모증, 배란, 및 고환 기능 및 고환 부신 휴지기 종양(TART) 부피의 바이오마커가 평가될 것이다. 달리 명시하지 않는 한, 기준선 측정을 확립하기 위해 평가는 0일(투여)에 가능한 한 가깝게 수행되도록 예정될 것이다. 적절한 경우, 샘플은 면역검정, LC-MS/MS, 또는 둘 다의 방법에 의해 분석될 것이다. 모든 호르몬 수준의 측정은 중앙 실험실에서 수행될 것이다.
-3일에, 참가자는 코티솔 제거, ACTH, 17-OHP, 및 안드로스텐디온(A4) 수준의 평가를 위해 일련의 혈액 샘플을 수용할 것이다. 경구 하이드로코르티손 및 적용 가능한 경우, 미네랄로코르티코이드 치료는 -3일에 정상적으로 예정된 아침 용량 후 보류될 것이다.
-2일 아침에 그리고 그들의 정상적으로 예정된 용량의 하이드로코르티손 및, 적용 가능한 경우, 미네랄로코르티코이드를 수용하기 전에, 참가자는 HPA 축 및 레닌-알도스테론 축을 포함하지만 이로 제한되지 않는 호르몬 프로파일에 대해 샘플을 수용할 것이다. 이러한 샘플은 17-OHP, 안드로스텐디온(A4), 및 내인성 ACTH를 포함하지만 이로 제한되지 않는 대부분의 호르몬에 대한 기준선 평가로 작용할 것이다. 그 후, 참가자는 내인성 아침 코티솔 및 17-OHP 수준의 ACTH-자극 시험을 완료한 다음, 정상적으로 예정된 아침 용량의 하이드로코르티손 및 적용 가능한 경우, 미네랄코르티코이드만을 수용할 것이다. -2일 저녁에, 코티솔, 17-OHP, 안드로스텐디온(A4) 및 ACTH를 포함하지만 이로 제한되지 않는 HPA 축 호르몬의 수준을 측정하기 위해 24시간 기간에 걸쳐 2시간마다 샘플을 수득함으로써 참가자의 일일 호르몬 프로파일이 확립될 것이다.
-2일 아침에, 참가자는 BBP-631 투여 후 잠재적인 면역 반응을 예방하거나 약화시키기 위해 타크롤리무스로 예방적 면역억제 요법을 시작할 것이다. 이러한 타크롤리무스 요법은 0.025 mg/kg의 시작 용량으로 1일 2회 경구 투여될 것이고, 5 내지 8 ng/mL의 표적 최저 수준을 가질 것이다. 최저 수준은 선택된 혈액 화학 분석물과 동시에 측정될 것이다.
-1일 저녁에, 24-시간 일일 호르몬 프로파일 샘플 수집 기간의 완료 후, 참가자는 그들의 정상적으로 예정된 용량의 하이드로코르티손 및, 적용 가능한 경우, 미네랄로코르티코이드를 재개할 것이다.
기준선: BBP-631로의 치료(0일)
0일에, BBP-631 및 타크롤리무스 투여 전에, 타크롤리무스 최저 수준이 측정될 것이고, 참가자는 또한 주입 반응을 방지하기 위해 예방적 항히스타민제, 예컨대, 디펜하이드라민(IV), 하이드록시진(IM), 및 클로르페니라민(IV)을 수용할 것이다. BBP-631은 정맥내(IV) 주입으로 투여되고, 참가자의 정기적으로 예정된 아침 하이드로코르티손 용량 2 내지 6시간 후에 시작될 것이다. 참가자는 BBP-631의 단일 투여만을 수용할 것이다.
추적 관찰
실험실, 면역원성, 및 벡터 배출을 포함하는 안전성은 지속적으로 평가될 것이다. 용량 증량 및 확장에 대한 결정을 위해 안전성 및 효능 데이터가 평가될 것이다. 타크롤리무스 최저 수준은 예방적 면역억제를 유지하는 스케줄에 따라, 그리고 의학적으로 필요한 경우 간 기능 평가를 포함하는 반응성 면역억제 계획의 일부로서 측정될 것이다.
BBP-631에 의한 치료의 효능 및 내구성은 입원환자 및 외래환자(재택) 환경 둘 다에서 수득된 샘플을 통해 평가될 것이다. HPA 축, HPG 축, 다른 생리학적 또는 조절 기능, 레닌 및 알도스테론, 및 스테로이드 호르몬 패널과 관련된 내인성 호르몬의 평가를 위해 샘플이 수집될 것이다. 달리 명시하지 않는 한, 샘플은 참가자가 그들의 정상적으로 예정된 아침 용량의 하이드로코르티손 및 적용 가능한 경우 미네랄로코르티코이드를 복용하기 전 아침에 수집될 것이다. 샘플은 또한 아침 외인성 ACTH 자극 전후에 수집될 것이다. 참가자는 코티솔 제거율, ACTH, 17-OHP, 및 안드로스텐디온(A4) 수준의 평가를 위해 일련의 혈액 샘플을 채혈할 것이다. 11-옥소/11-케토 스테롤, 예컨대, 11-케토테스토스테론을 포함하는 추가 마커가 또한 평가될 수 있다. 적절한 경우, 샘플은 면역검정, LC-MS/MS, 또는 둘 다의 방법에 의해 분석될 것이다.
QOL 평가는 약식(36) 건강 설문조사(SF-36), 세계보건기구 삶의 질 100 약칭(WHOQOL-BREF), 및 애디슨 질환-특이적 삶의 질 설문지(AddiQOL)를 통해 측정될 것이다. 골격 및 신체 조성은 DEXA 및 골 교체율의 바이오마커를 통해 평가될 것이다. 여성에서 다모증은 다양한 신체 영역에서 변형된 페리만-갤웨이 척도 및/또는 자가-보고된 제모 빈도를 통해 평가될 것이다. 여성의 경우, 배란 주기가 모니터링될 것이다. 남성에서, 테스토스테론(성 호르몬 결합 글로불린-조정된) 수준이 측정되고, TART의 존재가 초음파로 모니터링되고, 고환 기능이 정자 수, 운동성, 및 형태를 통해 평가될 것이다.
하이드로코르티손 및 미네랄로코르티코이드 치료 테이퍼링
하이드로코르티손 치료의 테이퍼링(tapering)은 조사자의 재량에 추가하여 이용 가능한 임상 및 실험실 데이터에 의해 뒷받침되는 바와 같이 BBP-631로 치료한 후 언제든지 개시될 수 있다.
하기 테이퍼링 순서는 참가자의 HPA-축 호르몬 수준에 반응하여 하이드로코르티손 용량 조정을 위한 일반적인 지침으로 사용될 것이다: (1) 17-OHP 수준 ≤ 1200 ng/dL, 또는 안드로스텐디온(A4) 수준 ≤ 정상인 경우, 하이드로코르티손 용량을 최대 25%만큼 감소시킴(15 mg의 최소 총 일일 용량까지). (2) 면역검정을 통해 ACTH-자극된 코티솔 > 14 μg/dL인 경우, 하이드로코르티손 치료를 중단함(또는 15 mg 총 일일 용량 미만으로 감소 고려). 그렇지 않으면, 하이드로코르티손 치료는 15 mg/일의 최소 용량으로 유지될 것이고, ACTH-자극된 코티솔이 면역검정을 통해 14 μg/dL 초과가 아닌 한 추가 감소는 일어나지 않을 것이다.
참가자가 임의의 하이드로코르티손 테이퍼(또는 중단)를 견디고 있는지 확인하기 위해, 아침 17-OHP, 안드로스테네디온(A4), 코티솔, 및 ACTH 및, 선택적으로, 11-케토테스토스테론의 실험실 측정은 테이퍼를 개시한지 2주 이내에 수득될 것이다. 테이퍼에 대한 임상 상태 및 내성에 대해 문의하기 위해 테이퍼를 시작한 후 적어도 2주 동안 매주 현장에서 참가자로의 추적 관찰이 추가될 것이다.
부신 기능 부전의 징후 및 증상은 면밀히 모니터링될 것이다. 징후 및 증상이 임상적으로 명백해지면, 임상 실험실 결과 및/또는 참가자의 임상 상태의 경향에 기초하여, 하이드로코르티손 용량을 증가시킬지 또는 회복시킬지 여부가 결정될 것이다.
미네랄로코르티코이드를 복용하는 참가자의 경우, 테이퍼링은 연구자의 재량에 따라 6주 평가 후에만 허용된다. 하기 테이퍼링 순서는 참가자의 호르몬 수준 및 임상적 제시에 반응하여 연구자의 재량에 따라 미네랄로코르티코이드 치료 용량 조정을 위한 일반적인 지침으로 사용될 것이다: (1) 혈장-레닌 활성 < 정상인 경우 미네랄로코르티코이드 치료를 50%만큼 감소시킴; (2) 미네랄로코르티코이드 과잉의 징후 또는 증상(예를 들어, 혈압의 상당한 증가)이 있는 경우, 상담 시 미네랄로코르티코이드 치료를 감소시키고; ACTH 자극 동안 최고 혈장 알도스테론 농도가 ≥ 9 ng/dL인 경우에만 미네랄로코르티코이드 치료의 중단을 고려함.
미네랄로코르티코이드 투여의 테이퍼링 시, 미네랄로코르티코이드 결핍의 징후 및 증상이 면밀히 모니터링될 것이다. 연구 동안, 부신 기능 부전의 징후 및 증상이 임상적으로 명백해지면 미네랄로코르티코이드 치료가 증가되거나 재개될 수 있다.
장기 추적 관찰 기간
이러한 연구를 완료하는 즉시, 동의를 제공한 후, 참가자는 별도의 장기 추적 관찰 연구를 시작하고 BBP-631 치료의 안전성 및 효능의 지속적인 평가를 위해 추가 4년 동안 적절한 간격으로 추적 관찰될 것이다. 전체적으로, 모든 참가자는 BBP-631로의 치료일로부터 적어도 5년 동안 추적 관찰될 것이다.
용량 증량 및 등록 확장 도식
모든 용량 수준은 BBP-631의 안전성 및 내약성에 의해 결정될 증량 및 확장 도식 하에 조사를 위해 계획된다. 참가자는 용량 수준 3보다 높은 용량으로 치료되지 않을 것이다(도 3 참조).
용량 증량 단계 동안, 그룹 1(즉, 고전적인 CAH 및 하이드로코르티손 용량 ≤ 30 mg/일)로부터의 적어도 3명(및 최대 6명)의 참가자는 그룹 1로부터의 총 적어도 9명(및 최대 18명)의 참가자에 대해 BBP-631을 수용하기 위해 각 용량 수준에서 등록될 것이다. 용량 증량은 BBP-631의 내약성을 기초로 하여 계속될 것이다. 용량 확장은 HPA-축 호르몬에 대한 BBP-631의 효과와 관련된 그룹 1 참가자로부터의 이용 가능한 데이터 및 내약성에 의해 결정될 것이다.
각각의 BBP-631 용량 수준에서 센티넬(sentinel) 참가자는 적어도 1개의 대립유전자에 대해 비-널(non-null) CYP21A2 돌연변이를 갖는 참가자일 것이며, 따라서 면역학적 물질에서 교차-반응성으로부터 검출될 수 있는 교란 신호의 가능성을 감소시킨다. 각 용량 수준의 비-센티넬 참가자는 임의의 유전자형 배제 없이 등록될 것이다. 제1 참가자가 시작 용량(용량 수준 1)으로 BBP-631을 수용한 후, 제2 참가자의 치료는 적어도 투여-후 28일일째 방문을 통해 제1 참가자의 안전성 데이터의 검토 후에만 일어날 것이다. 연구가 진행됨에 따라, 적어도 투여 후 28일째 방문을 통해 모든 참가자에 대한 누적 안전성 데이터의 검토 후 후속 참가자의 치료가 허용될 것이다.
증량 전 및 용량 코호트에서 제2 참가자에게 투여하기 전에 모든 참가자의 누적 투여 후 안전성 데이터의 적어도 4주의 검토가 필요하다. 추가 용량 증량을 위해 동일한 알고리즘이 따를 것이며, 용량 수준 3까지만 진행될 것이다.
안전성 모니터링
면역원성 모니터링 및 반응성 면역조절 계획
각 참가자는 BBP-631의 투여로부터 5주차에 안전성 평가 완료까지 주 1회, 이후 연구 종료까지 3주마다 항체의 발달 및 캡시드 및 트랜스진 생성물에 대한 T 세포 반응성에 대해 치료 후 모니터링될 것이다.
예방적 타크롤리무스 요법은 4주 동안 유지될 것이며, 그 후 대략 2주의 기간에 걸쳐 테이퍼링될 것이다. 트랜스아미나제 수준이 연구 동안 임의의 시점에 ≥ 2×정상 범위의 상한(ULN)으로 또는 연구자의 견해에서 임상적으로 관련 있는 수준으로 증가하는 경우, 타크롤리무스 투여는 다시 시작되거나(최저 수준을 표적으로 함), 증가될 것이다. 또한, 고용량 프레드니손(또는, 연구자의 재량에 따라, 하이드로코르티손)이 시작되고, 트랜스아미나제 수준이 정상화될 때, 기준선 글루코코르티코이드 용량 수준으로 3주 기간에 걸쳐 빠르게 테이퍼링될 것이다. 동시에, 간 기능 시험(LFT)은 LFT 수준이 ULN 이하로 돌아올 때까지 매주 또는 더 자주 모니터링될 것이다. 이러한 모니터링 기간 동안, 타크롤리무스 및 프레드니손 투여량은 관찰된 LFT 수준에 반응하여 조정될 수 있다. 참가자가 LFT가 정상화되어 4주 동안 글루코코르티코이드를 중단한 경우, 타크롤리무스 테이퍼링이 재개될 수 있다. 필요한 경우, 타크롤리무스 표적 최저 수준의 증가 또는 다른 면역조절제의 투여를 포함하는 치료 계획이 시작될 수 있다.
기타 고려 사항
임의의 간독성제(예를 들어, 케타민, 할로겐화 마취제)는 BBP-631을 수용한 후 적어도 12주 동안 금지된다. 참가자는 동일한 기간 동안 아세트아미노펜(및 다른 유사한 약물)을 복용하지 않도록 조언될 것이다. 참가자는 자몽 주스를 포함하여 CYP3A 또는 CYP3A4 경로를 통해 타크롤리무스 대사를 저해하거나 유도하는 물질을 피해야 한다.
주간 호르몬 프로파일(17-OHP 및 A4 포함), 코티솔 제거율, ACTH-자극 시험, 레닌 및 알도스테론, 및 다른 탐색 호르몬의 상세한 평가를 갖는 기준선(5일의 평가 기간, 예컨대 5일 입원)이 시행될 것이다.
환자 집단에 대한 주요 적격성 기준은 다음을 포함한다. 환자는 CAH 진단을 갖는다: 그룹 1: 잘 문서화된 CAH 이력 데이터(즉, 병력, 종단 실험실 값, 및 약물 이력)를 포함하는, 임상 및 유전적 증거를 기초로 하여 어린 시절 이후 전통적 CAH(남성화 또는 염-소모)의 진단, 또는 그룹 2: 잘 문서화된 CAH 이력 데이터(즉, 병력, 종적 실험실 값, 및 약물 이력)를 포함하는, 임상 및 유전적 증거에 기초하여 어린 시절부터 고전적인 염-소모성 CAH의 진단. 환자는 초기 스크리닝 방문에서 역치 17-OHP 수준을 충족한다: 그룹 1: 17-OHP 수준 ≥ 10×ULN(정상의 상한치) 내지 < 40×ULN, 또는 그룹 2: 17-OHP 수준 ≥ 5×ULN 내지 < 40×ULN. 환자는 ULN 초과의 안드로스텐디온(A4) 값을 갖는다. 환자는 하기 총 일일 용량에서 유일한 글루코코르티코이드 유지 요법으로서 경구 하이드로코르티손의 안정적인 요법을 받고 있다: 그룹 1: 스크리닝 전 3개월 동안 CAH의 치료를 위해 30 mg/일 이하의 하이드로코르티손, 또는 그룹 2: 스크리닝 전 3개월 동안 CAH의 치료를 위해 30 mg/일 초과의 하이드로코르티손. 환자가 이미 미네랄로코르티코이드 작용제 요법을 받고 있는 경우, 환자는 스크리닝 전 3개월 동안 미네랄로코르티코이드 작용제 요법(예를 들어, 플루드로코르티손)을 필요로 하고 이러한 미네랄로코르티코이드 작용제의 안정적인 용량에 대한 기록된 이력을 갖는다.
투여량
3개의 용량 수준의 BBP-631이 연구에서 사용될 것이다: (i) 용량 수준 1: 1.5×1013개 vg/kg 체중; (ii) 용량 수준 2: 3.0×1013개 vg/kg 체중, 및 (iii) 용량 수준 3: 6.0×1013개 vg/kg 체중. 각각의 치료-적격 참가자는 연구 0일에 IV 주입에 의해 투여되는 단일 용량의 BBP-631을 수용할 것이다. 주입 기간은 참가자의 체중에 따라 계산되는 치료 부피에 의존할 것이다.
안전성 및 효능 분석
최적 용량은 하기에 기반하여 선택될 것이다: (i) 부작용(AE), 임상 실험실 측정(화학, 혈액학, 소변검사); (ii) 내인성 코티솔(질량 분석 및 면역검정 둘 다를 통해 측정된 ACTH 자극 전-후), 17-OHP, A4, 및 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 및 시상하부-뇌하수체-생식선(HPG) 축과 관련된 다른 호르몬의 수준; (iii) 레닌 및 알도스테론의 수준; (iv) 하이드로코르티손(HC) 및 미네랄로코르티코이드(MC) 약물 사용의 변화; 및 (v) 호르몬 불균형의 신체적 및 생리학적 영향을 측정하는 삶의 질 평가.
신체 검사 결과의 임상적으로 유의한 변화는 AE로서 보고될 것이다. 고전적인 CAH를 갖는 성인 참가자에서 BBP-631의 안전성 및 내약성을 평가하기 위해, 임상 실험실 평가(임상 화학, 응고, 혈액학, 및 소변검사)가 수집될 것이다. 실험실 및 활력 징후, 12-리드 ECG, 및 신체 검사 소견이 수집될 것이다. 향후 연구를 위해 BBP-631의 최적 용량 또는 용량 범위를 선택하기 위해, 안전성 및 내약성 평가, 및 호르몬 및 다른 효능 평가가 수행될 것이다.
하기 안전성 및 효능 평가는 하기에 열거된 바와 같이 평가될 것이다:
넘버링된 실시형태
실시형태 1. 방법으로서,
대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV 벡터는,
(i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
(ii) 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열
을 포함하고; 그리고 상기 치료적 유효량은 약 1012개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg) 내지 약 1014개 vg/kg의 범위인, 방법.
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 상기 대상체는 21OH의 발현을 필요로 하는, 방법.
실시형태 3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 상기 대상체는 21OH 결핍(21OHD)을 갖는, 방법.
실시형태 4. 제3에 있어서, 상기 대상체는 21OHD의 프라더 단계(Prader stage) IV 또는 V 형태를 갖는, 방법.
실시형태 5. 실시형태 3 또는 4에 있어서, 상기 대상체는 선천성 부신 과형성(congenital adrenal hypoplasia: CAH)을 갖는, 방법.
실시형태 6. 실시형태 5에 있어서, 상기 CAH는 고전적 CAH인, 방법.
실시형태 7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV 벡터의 투여가 상기 대상체에서 21OH의 발현을 초래하는, 방법.
실시형태 8. 실시형태 7에 있어서, 상기 21OH는 상기 대상체의 부신 피질, 부신 수질, 부신 줄기 세포, 부신 전구 세포, 간 또는 난소에서 발현되는, 방법.
실시형태 9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 코티솔 및/또는 알도스테론을 필요로 하는, 방법.
실시형태 10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 코티솔 결핍 및/또는 알도스테론 결핍을 갖는, 방법.
실시형태 11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 과량의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌, 및/또는 안드로스텐디온(A4)을 갖는, 방법.
실시형태 12. 실시형태 11에 있어서, 상기 대상체는 혈액 및/또는 소변에서 과량의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌, 및/또는 안드로스텐디온(A4)을 갖는, 방법.
실시형태 13. 21-하이드록실라제(21OH)의 발현을 필요로 하는 대상체에서 이를 발현시키는 방법으로서,
상기 대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV 벡터는,
(i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
(ii) 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열
을 포함하고; 그리고
상기 치료적 유효량은 약 1012개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg) 내지 약 1014개 vg/kg의 범위이고, 이에 의해서 상기 대상체에서 21OH를 발현시키는, 방법.
실시형태 14. 실시형태 13에 있어서, 상기 21OH는 상기 대상체의 부신 피질, 부신 수질, 부신 줄기 세포, 부신 전구 세포, 간 또는 난소에서 발현되는, 방법.
실시형태 15. 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV 벡터는,
(i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
(ii) 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 그리고 상기 치료적 유효량은 약 1012개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg) 내지 약 1014개 vg/kg의 범위이고, 이에 의해서 상기 대상체에서 21OHD를 치료하는, 방법.
실시형태 16. 코티솔 및/또는 알도스테론의 수준 증가를 필요로 하는 대상체에서 코티솔 및/또는 알도스테론의 수준을 증가시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV 벡터는,
(i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
(ii) 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 그리고 상기 치료적 유효량은 약 1012개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg) 내지 약 1014개 vg/kg의 범위이고, 이에 의해서 상기 대상체에서 코티솔 및/또는 알도스테론의 수준을 증가시키는, 방법.
실시형태 17. 프로게스테론, 17-OHP, 레닌 및/또는 안드로스텐디온(A4)의 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV 벡터는,
(i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
(ii) 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 그리고 상기 치료적 유효량은 약 1012개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg) 내지 약 1014개 vg/kg의 범위이고, 이에 의해서 프로게스테론, 17-OHP, 레닌 및/또는 안드로스텐디온(A4)의 수준을 감소시키는, 방법.
실시형태 18. 실시형태 13 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)의 프라더 단계 IV 또는 V 형태를 갖는, 방법.
실시형태 19. 실시형태 13 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 선천성 부신 과형성(CAH)을 갖는, 방법.
실시형태 20. 실시형태 19에 있어서, 상기 CAH는 고전적 CAH인, 방법.
실시형태 21. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료적 유효량은 약 1013개 vg/kg 내지 약 1014개 vg/kg의 범위인, 방법.
실시형태 22. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료적 유효량은 약 1.5×1013개 vg/kg인, 방법.
실시형태 23. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료적 유효량은 약 3×1013개 vg/kg인, 방법.
실시형태 24. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료적 유효량은 약 6×1013개 vg/kg인, 방법.
실시형태 25. 실시형태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여하는 단계 전에 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대상체를 선택하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 26. 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV 벡터는 상기 대상체에게 정맥내로, 개복 수술 또는 복강경 검사를 통한 부신으로의 직접 주사에 의해, 또는 카테터 삽입을 통한 부신 동맥 또는 부신 정맥으로의 주사에 의해 투여되는, 방법.
실시형태 27. 실시형태 26에 있어서, 상기 부신으로의 직접 주사는 상기 부신 피질로의 직접 주사인, 방법.
실시형태 28. 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV 벡터는 정맥내(IV) 주입에 의해 투여되는, 방법.
실시형태 29. 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 21OH 단백질은 인간 21OH 단백질인, 방법.
실시형태 30. 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 21OH 단백질을 인코딩하는 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열이 인간 21OH(CYP21A2) cDNA를 포함하거나 이로 이루어진, 방법.
실시형태 31. 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 21OH 단백질을 인코딩하는 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열이 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 방법.
실시형태 32. 실시형태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 21OH 단백질을 인코딩하는 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 50을 포함하거나 이로 이루어진, 방법.
실시형태 33. 실시형태 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 21OH 단백질을 인코딩하는 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는, 방법.
실시형태 34. 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터가 숙주 세포에서 상기 21OH 단백질의 발현을 지시하는, 방법.
실시형태 35. 실시형태 34에 있어서, 상기 숙주 세포가 부신 세포 또는 부신 피질 세포인, 방법.
실시형태 36. 실시형태 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스/β-액틴 하이브리드 프로모터, PGK 프로모터, 또는 부신 피질 세포에서의 발현에 특이적인 프로모터인, 방법.
실시형태 37. 실시형태 36에 있어서, 상기 사이토메갈로바이러스/β-액틴 하이브리드 프로모터가 CAG, CB6, 또는 CBA 프로모터인, 방법.
실시형태 38. 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 48, 또는 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 방법.
실시형태 39. 실시형태 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 혈청형 ITR인, 방법.
실시형태 40. 실시형태 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 혈청형인, 방법.
실시형태 41. 실시형태 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV가 AAV5 혈청형인, 방법.
실시형태 42. 실시형태 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 분자가 Kozak 서열을 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 43. 실시형태 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 분자가 miR-122 결합 부위를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 44. 방법으로서, 대상체에게 약 1012개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg) 내지 약 1014개 vg/kg의 재조합 아데노-관련 바이러스 5(rAAV5) 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV5 벡터는, 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자, 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 부신 세포 또는 부신 피질 세포에서 상기 21OH 단백질의 발현을 지시하는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 45. 실시형태 44에 있어서, 약 1013개 vg/kg 내지 약 1014개 vg/kg의 상기 rAAV5 벡터가 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
실시형태 46. 실시형태 45에 있어서, 약 1.5×1013개 vg/kg의 상기 rAAV5 벡터가 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
실시형태 47. 실시형태 45에 있어서, 약 3×1013개 vg/kg의 상기 rAAV5 벡터가 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
실시형태 48. 실시형태 45에 있어서, 약 6×1013개 vg/kg의 상기 rAAV5 벡터가 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
실시형태 49. 실시형태 45 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV5 벡터가 상기 대상체에게 정맥내 투여되는, 방법.
실시형태 50. 실시형태 44 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는, 방법.
실시형태 51. 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 약 1.5×1013개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg)의 재조합 아데노-관련 바이러스 5(rAAV5) 벡터를 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV5 벡터는, 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 부신 세포 또는 부신 피질 세포에서 상기 21OH 단백질의 발현을 지시하는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이에 의해서 상기 대상체에서 21OHD를 치료하는, 방법.
실시형태 52. 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 약 3×1013개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg)의 재조합 아데노-관련 바이러스 5(rAAV5) 벡터를 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV5 벡터는, 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 은 부신 세포 또는 부신 피질 세포에서 21OH 단백질의 발현을 지시하는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이에 의해서 상기 대상체에서 21OHD를 치료하는, 방법.
실시형태 53. 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 약 6×1013개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg)의 재조합 아데노-관련 바이러스 5(rAAV5) 벡터를 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV5 벡터는,
(i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
(ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 부신 세포 또는 부신 피질 세포에서 21OH 단백질의 발현을 지시하는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이에 의해서 상기 대상체에서 21OHD를 치료하는, 방법.
실시형태 54. 실시형태 44 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스/β-액틴 하이브리드 프로모터, PGK 프로모터, 또는 부신 피질 세포에서의 발현에 특이적인 프로모터인, 방법.
실시형태 55. 실시형태 54에 있어서, 상기 사이토메갈로바이러스/β-액틴 하이브리드 프로모터가 CAG, CB6, 또는 CBA 프로모터인, 방법.
실시형태 56. 실시형태 44 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 48, 또는 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 방법.
실시형태 57. 실시형태 44 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 혈청형 ITR인, 방법.
실시형태 58. 실시형태 44 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 분자가 Kozak 서열을 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 59. 실시형태 44 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 분자가 miR-122 결합 부위를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 60. 실시형태 44 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)의 프라더 단계 IV 또는 V 형태를 갖는, 방법.
실시형태 61. 실시형태 44 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 선천성 부신 과형성(CAH)을 갖는, 방법.
실시형태 62. 실시형태 61에 있어서, 상기 CAH는 고전적 CAH인, 방법.
실시형태 63. 실시형태 1 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 치료적 유효량의 면역억제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 64. 방법으로서, 대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스 5(rAAV5) 벡터 및 치료적 유효량의 면역억제제를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV5는, 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR) 및 서열번호 1의아미노산 서열을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 부신 세포 또는 부신 피질 세포에서 상기 21OH 단백질의 발현을 지시하는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 방법.
실시형태 65. 실시형태 64에 있어서, 상기 대상체는 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는, 방법.
실시형태 66. 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스 5(rAAV5) 벡터 및 치료적 유효량의 면역억제제를 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV5는, 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR) 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 부신 세포 또는 부신 피질 세포에서 상기 21OH 단백질의 발현을 지시하는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하고, 이에 의해서 상기 대상체에서 21OHD를 치료하는, 방법.
실시형태 67. 실시형태 63 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역억제제는 상기 rAAV 벡터의 투여 전, 투여와 동시에, 그리고/또는 투여 후에 투여되는, 방법.
실시형태 68. 실시형태 67에 있어서, 상기 면역억제제는 상기 rAAV 벡터의 투여 전에 투여되는, 방법.
실시형태 69. 실시형태 68에 있어서, 상기 면역억제제는 상기 rAAV 벡터의 투여 적어도 12시간 전에 투여되는, 방법.
실시형태 70. 실시형태 69에 있어서, 상기 면역억제제는 상기 rAAV 벡터의 투여 약 2일 전에 투여되는, 방법.
실시형태 71. 실시형태 63 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역억제제는 비-글루코코르티코이드 면역억제제인, 방법.
실시형태 72. 실시형태 63 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역억제제는 칼시뉴린의 저해제인, 방법.
실시형태 73. 실시형태 63 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역억제제는 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, 에베롤리무스, 조타롤리무스, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
실시형태 74. 실시형태 73에 있어서, 상기 면역억제제는 타크롤리무스인, 방법.
실시형태 75. 실시형태 63 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역억제제는 경구 투여되는, 방법.
실시형태 76. 실시형태 63 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역억제제의 치료적 유효량이 약 0.01 밀리그램/킬로그램(mg/kg) 내지 약 0.05 mg/kg의 범위인, 방법.
실시형태 77. 실시형태 76에 있어서, 상기 면역억제제의 치료적 유효량이 약 0.025 mg/kg인, 방법.
실시형태 78. 실시형태 63 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료적 유효량의 면역억제제가 1일 2회 투여되는, 방법.
실시형태 79. 실시형태 1 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에게 치료적 유효량의 스테로이드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 80. 실시형태 79에 있어서, 상기 스테로이드는 미네랄로코르티코이드인, 방법.
실시형태 81. 79에 있어서, 상기 스테로이드는 글루코코르티코이드인, 방법.
실시형태 82. 실시형태 79에 있어서, 상기 스테로이드는 하이드로코르티손인, 방법.
실시형태 83. 실시형태 79 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 상기 스테로이드는 상기 rAAV 벡터의 투여 전, 투여와 동시에 그리고/또는 투여 후에 투여되는, 방법.
실시형태 84. 실시형태 83에 있어서, 상기 rAAV 벡터의 투여 전에 상기 대상체에게 투여된 스테로이드의 치료적 유효량이 상기 rAAV의 투여 후 상기 대상체에게 투여된 스테로이드의 치료적 유효량보다 더 많은, 방법.
실시형태 85. 실시형태 1 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV의 투여 전과 비교하여 상기 rAAV의 투여 후 상기 대상체에서 더 높은 수준의 코티솔 및/또는 알도스테론이 존재하는, 방법
실시형태 86. 실시형태 1 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV가 투여되지 않은 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대조군 대상체와 비교하여, 상기 rAAV의 투여 후 상기 대상체에서 더 높은 수준의 코티솔 및/또는 알도스테론이 존재하는, 방법.
실시형태 87. 실시형태 1 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV의 투여 전과 비교하여, 상기 rAAV의 투여 후 대상체에서 더 낮은 수준의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌 및/또는 안드로스텐디온(A4)가 존재하는, 방법.
실시형태 88. 실시형태 1 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV가 투여되지 않은 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대조군 대상체와 비교하여, 상기 rAAV의 투여 후 대상체에서 더 낮은 수준의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌 및/또는 안드로스텐디온(A4)가 존재하는, 방법.
실시형태 89. 실시형태 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV 벡터는 서열번호 52의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 방법.
SEQUENCE LISTING <110> Adrenas Therapeutics, Inc. <120> GENE THERAPIES FOR 21-HYDROXYLASE DEFICIENCY <130> ADRE-002/01WO 334912-2014 <150> US 63/163,634 <151> 2021-03-19 <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 495 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Ala 1 5 10 15 Arg Leu Leu Trp Asn Trp Trp Lys Leu Arg Ser Leu His Leu Pro Pro 20 25 30 Leu Ala Pro Gly Phe Leu His Leu Leu Gln Pro Asp Leu Pro Ile Tyr 35 40 45 Leu Leu Gly Leu Thr Gln Lys Phe Gly Pro Ile Tyr Arg Leu His Leu 50 55 60 Gly Leu Gln Asp Val Val Val Leu Asn Ser Lys Arg Thr Ile Glu Glu 65 70 75 80 Ala Met Val Lys Lys Trp Ala Asp Phe Ala Gly Arg Pro Glu Pro Leu 85 90 95 Thr Tyr Lys Leu Val Ser Arg Asn Tyr Pro Asp Leu Ser Leu Gly Asp 100 105 110 Tyr Ser Leu Leu Trp Lys Ala His Lys Lys Leu Thr Arg Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Leu Gly Ile Arg Asp Ser Met Glu Pro Val Val Glu Gln Leu Thr 130 135 140 Gln Glu Phe Cys Glu Arg Met Arg Ala Gln Pro Gly Thr Pro Val Ala 145 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gaccacaaga ccaagctcca tctccggcta tgacatccca 1140 gagggcaccg tgatcatccc aaacctgcag ggagcacacc tggacgagac agtgtgggag 1200 cggccacacg agttctggcc cgatagattt ctggagcctg gcaagaacag ccgggccctg 1260 gccttcggct gcggagcccg ggtgtgcctg ggcgagccac tggccaggct ggagctgttc 1320 gtggtgctga cccgcctgct gcaggccttt acactgctgc cctccggcga tgccctgcct 1380 tctctgcagc cactgcctca ctgctccgtg atcctgaaga tgcagccctt tcaggtccgc 1440 ctgcagccaa gggggatggg ggcacatagt ccagggcagt ctcagtaa 1488 <210> 51 <211> 592 <212> DNA <213> Marmota monax <400> 51 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg atattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt 120 acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tccgtcaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg 300 atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg 360 ctgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420 gcctgtgttg ccaactggat cctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggctctc 480 aatccagcgg acctcccttc ccgaggcctt ctgccggttc tgcggcctct cccgcgtctt 540 cgctttcggc ctccgacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg 592 <210> 52 <211> 3901 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression cassette <220> <221> misc_feature <222> (1)..(130) <223> 5' ITR <220> <221> misc_feature <222> (261)..(642) <223> CMVIE Enhancer <220> <221> misc_feature <222> (648)..(925) <223> CBA Promoter <220> <221> misc_feature <222> (926)..(1942) <223> Intron <220> <221> misc_feature <222> (2003)..(3490) <223> hCYP21 Opt <220> <221> misc_feature <222> (3624)..(3679) <223> B-globin PolyA <220> <221> misc_feature <222> (3772)..(3901) <223> 3' ITR <400> 52 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt 60 gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg 180 cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 240 ctccatcact aggggttcct ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc 300 aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt 360 aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta 420 tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 480 gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 540 cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt 600 tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc 660 cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 720 tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg 780 cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa 840 tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta 900 taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgcgc tgccttcgcc ccgtgccccg 960 ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac tcccacaggt 1020 gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct 1080 tgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct tgaggggctc cgggagggcc ctttgtgcgg 1140 ggggagcggc tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggctc 1200 cgcgctgccc ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcag 1260 tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg tgcggggggg gctgcgaggg 1320 gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg tgggcgcgtc 1380 ggtcgggctg caaccccccc tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc 1440 gggtgcgggg ctccgtacgg ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg 1500 gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg 1560 gcgcggcggc ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct 1620 tttatggtaa tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct gtgcggagcc 1680 gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc ggggcgaagc ggtgcggcgc 1740 cggcaggaag gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct 1800 ccctctccag cctcggggct gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag 1860 ggcggggttc ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta 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tggcaggaca 2760 gtggagggac atgatggatt acatgctgca gggagtggca cagccatcta tggaggaggg 2820 aagcggacag ctgctggagg gacacgtgca catggcagca gtggatctgc tgatcggagg 2880 aaccgagaca acagccaaca cactgagctg ggccgtggtg tttctgctgc accaccctga 2940 gatccagcag cggctgcagg aggagctgga ccacgagctg ggacctggag caagctcctc 3000 tagagtgcca tacaaggatc gggccagact gcccctgctg aatgccacca tcgccgaggt 3060 gctgaggctg cgccccgtgg tgcctctggc cctgcctcac aggaccacaa gaccaagctc 3120 catctccggc tatgacatcc cagagggcac cgtgatcatc ccaaacctgc agggagcaca 3180 cctggacgag acagtgtggg agcggccaca cgagttctgg cccgatagat ttctggagcc 3240 tggcaagaac agccgggccc tggccttcgg ctgcggagcc cgggtgtgcc tgggcgagcc 3300 actggccagg ctggagctgt tcgtggtgct gacccgcctg ctgcaggcct ttacactgct 3360 gccctccggc gatgccctgc cttctctgca gccactgcct cactgctccg tgatcctgaa 3420 gatgcagccc tttcaggtcc gcctgcagcc aagggggatg ggggcacata gtccagggca 3480 gtctcagtaa acgcgtggta cctctagagt cgacccgggc ggcctcgagg acggggtgaa 3540 ctacgcctga ggatccgatc tttttccctc tgccaaaaat tatggggaca 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gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 55 <211> 278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBA Promoter <400> 55 tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60 ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120 ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 180 cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 240 ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcg 278 <210> 56 <211> 1017 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Intron <400> 56 ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 60 ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 120 ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 180 agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc 240 gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc 300 tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg 360 ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg 420 tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac 480 ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt 540 ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg 600 gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc 660 ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg 720 cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc 780 ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag 840 ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg 900 cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg 960 accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacag 1017 <210> 57 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCYP21 Opt <400> 57 atgctgctgc tggggctgct gctgctgctg cctctgctgg ctggggctcg actgctgtgg 60 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ccgtggtgtt tctgctgcac caccctgaga tccagcagcg gctgcaggag 960 gagctggacc acgagctggg acctggagca agctcctcta gagtgccata caaggatcgg 1020 gccagactgc ccctgctgaa tgccaccatc gccgaggtgc tgaggctgcg ccccgtggtg 1080 cctctggccc tgcctcacag gaccacaaga ccaagctcca tctccggcta tgacatccca 1140 gagggcaccg tgatcatccc aaacctgcag ggagcacacc tggacgagac agtgtgggag 1200 cggccacacg agttctggcc cgatagattt ctggagcctg gcaagaacag ccgggccctg 1260 gccttcggct gcggagcccg ggtgtgcctg ggcgagccac tggccaggct ggagctgttc 1320 gtggtgctga cccgcctgct gcaggccttt acactgctgc cctccggcga tgccctgcct 1380 tctctgcagc cactgcctca ctgctccgtg atcctgaaga tgcagccctt tcaggtccgc 1440 ctgcagccaa gggggatggg ggcacatagt ccagggcagt ctcagtaa 1488 <210> 58 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-globin PolyA <400> 58 aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctca 56 <210> 59 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' ITR <400> 59 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag 130

Claims (89)

  1. 방법으로서,
    대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV 벡터는,
    (i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
    (ii) 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하고; 그리고 상기 치료적 유효량은 약 1012개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg) 내지 약 1014개 vg/kg의 범위인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 21OH의 발현을 필요로 하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체는 21OH 결핍(21OHD)을 갖는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 대상체는 21OHD의 프라더 단계(Prader stage) IV 또는 V 형태를 갖는, 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 대상체는 선천성 부신 과형성(congenital adrenal hypoplasia: CAH)을 갖는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CAH는 고전적 CAH인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터의 투여가 상기 대상체에서 21OH의 발현을 초래하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 21OH는 상기 대상체의 부신 피질, 부신 수질, 부신 줄기 세포, 부신 전구 세포, 간 또는 난소에서 발현되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 코티솔 및/또는 알도스테론을 필요로 하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 코티솔 결핍 및/또는 알도스테론 결핍을 갖는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 과량의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌, 및/또는 안드로스텐디온(A4)을 갖는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 대상체는 혈액 및/또는 소변에서 과량의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌, 및/또는 안드로스텐디온(A4)을 갖는, 방법.
  13. 21-하이드록실라제(21OH)의 발현을 필요로 하는 대상체에서 21-하이드록실라제(21OH)를 발현시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV 벡터는,
    (i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
    (ii) 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하고; 그리고
    상기 치료적 유효량은 약 1012개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg) 내지 약 1014개 vg/kg의 범위이고,
    이에 의해서 상기 대상체에서 21OH를 발현시키는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 21OH는 상기 대상체의 부신 피질, 부신 수질, 부신 줄기 세포, 부신 전구 세포, 간 또는 난소에서 발현되는, 방법.
  15. 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV 벡터는,
    (i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
    (ii) 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하고; 그리고
    상기 치료적 유효량은 약 1012개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg) 내지 약 1014개 vg/kg의 범위이고,
    이에 의해서 상기 대상체에서 21OHD를 치료하는, 방법.
  16. 코티솔 및/또는 알도스테론의 수준 증가를 필요로 하는 대상체에서 코티솔 및/또는 알도스테론의 수준을 증가시키는 방법으로서,
    상기 대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV 벡터는,
    (i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
    (ii) 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하고; 그리고
    상기 치료적 유효량은 약 1012개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg) 내지 약 1014개 vg/kg의 범위이고,
    이에 의해서 상기 대상체에서 코티솔 및/또는 알도스테론의 수준을 증가시키는, 방법.
  17. 프로게스테론, 17-OHP, 레닌 및/또는 안드로스텐디온(A4)의 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 감소시키는 방법으로서,
    상기 대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV 벡터는,
    (i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
    (ii) 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하고; 그리고
    상기 치료적 유효량은 약 1012개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg) 내지 약 1014개 vg/kg의 범위이고,
    이에 의해서 프로게스테론, 17-OHP, 레닌 및/또는 안드로스텐디온(A4)의 수준을 감소시키는, 방법.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)의 프라더 단계 IV 또는 V 형태를 갖는, 방법.
  19. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 선천성 부신 과형성(CAH)을 갖는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 CAH는 고전적 CAH인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 약 1013개 vg/kg 내지 약 1014개 vg/kg의 범위인, 방법.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 약 1.5×1013개 vg/kg인, 방법.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 약 3×1013개 vg/kg인, 방법.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 약 6×1013개 vg/kg인, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계 전에 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대상체를 선택하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터는 상기 대상체에게 정맥내로, 개복 수술 또는 복강경 검사를 통한 부신으로의 직접 주사에 의해, 또는 카테터 삽입을 통한 부신 동맥 또는 부신 정맥으로의 주사에 의해 투여되는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 부신으로의 직접 주사는 상기 부신 피질로의 직접 주사인, 방법.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터는 정맥내(IV) 주입에 의해 투여되는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 21OH 단백질은 인간 21OH 단백질인, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 21OH 단백질을 인코딩하는 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열이 인간 21OH(CYP21A2) cDNA를 포함하거나 이로 이루어진, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 21OH 단백질을 인코딩하는 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열이 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 21OH 단백질을 인코딩하는 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 50을 포함하거나 이로 이루어진, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 21OH 단백질을 인코딩하는 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 숙주 세포에서 상기 21OH 단백질의 발현을 지시하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 숙주 세포가 부신 세포 또는 부신 피질 세포인, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스/β-액틴 하이브리드 프로모터, PGK 프로모터, 또는 부신 피질 세포에서의 발현에 특이적인 프로모터인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 사이토메갈로바이러스/β-액틴 하이브리드 프로모터가 CAG, CB6, 또는 CBA 프로모터인, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 48, 또는 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 혈청형 ITR인, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 혈청형인, 방법.
  41. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 AAV5 혈청형인, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 Kozak 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 miR-122 결합 부위를 추가로 포함하는, 방법.
  44. 방법으로서,
    대상체에게 약 1012개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg) 내지 약 1014개 vg/kg의 재조합 아데노-관련 바이러스 5(rAAV5) 벡터를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV5 벡터는,
    (i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자, 및
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 부신 세포 또는 부신 피질 세포에서 상기 21OH 단백질의 발현을 지시하는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 약 1013개 vg/kg 내지 약 1014개 vg/kg의 상기 rAAV5 벡터가 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 약 1.5×1013개 vg/kg의 상기 rAAV5 벡터가 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 약 3×1013개 vg/kg의 상기 rAAV5 벡터가 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  48. 제45항에 있어서, 약 6×1013개 vg/kg의 상기 rAAV5 벡터가 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV5 벡터가 상기 대상체에게 정맥내 투여되는, 방법.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는, 방법.
  51. 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 약 1.5×1013개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg)의 재조합 아데노-관련 바이러스 5(rAAV5) 벡터를 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV5 벡터는,
    (i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 부신 세포 또는 부신 피질 세포에서 상기 21OH 단백질의 발현을 지시하는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하고, 이에 의해서 상기 대상체에서 21OHD를 치료하는, 방법.
  52. 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 약 3×1013개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg)의 재조합 아데노-관련 바이러스 5(rAAV5) 벡터를 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV5 벡터는,
    (i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 은 부신 세포 또는 부신 피질 세포에서 21OH 단백질의 발현을 지시하는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하고, 이에 의해서 상기 대상체에서 21OHD를 치료하는, 방법.
  53. 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 약 6×1013개 벡터 게놈/킬로그램(vg/kg)의 재조합 아데노-관련 바이러스 5(rAAV5) 벡터를 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV5 벡터는,
    (i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산 분자 및
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 부신 세포 또는 부신 피질 세포에서 21OH 단백질의 발현을 지시하는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하고, 이에 의해서 상기 대상체에서 21OHD를 치료하는, 방법.
  54. 제44항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스/β-액틴 하이브리드 프로모터, PGK 프로모터, 또는 부신 피질 세포에서의 발현에 특이적인 프로모터인, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 사이토메갈로바이러스/β-액틴 하이브리드 프로모터가 CAG, CB6, 또는 CBA 프로모터인, 방법.
  56. 제44항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 48, 또는 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 방법.
  57. 제44항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 혈청형 ITR인, 방법.
  58. 제44항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 Kozak 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제44항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 miR-122 결합 부위를 추가로 포함하는, 방법.
  60. 제44항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)의 프라더 단계 IV 또는 V 형태를 갖는, 방법.
  61. 제44항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 선천성 부신 과형성(CAH)을 갖는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 CAH는 고전적 CAH인, 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 유효량의 면역억제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  64. 방법으로서,
    대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스 5(rAAV5) 벡터 및 치료적 유효량의 면역억제제를 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 rAAV5는,
    (i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR) 및
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 부신 세포 또는 부신 피질 세포에서 상기 21OH 단백질의 발현을 지시하는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 대상체는 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는, 방법.
  66. 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 치료적 유효량의 재조합 아데노-관련 바이러스 5(rAAV5) 벡터 및 치료적 유효량의 면역억제제를 정맥내 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 rAAV5는,
    (i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR) 및
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열로서, 부신 세포 또는 부신 피질 세포에서 상기 21OH 단백질의 발현을 지시하는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하는 핵산 분자를 포함하고,
    이에 의해서 상기 대상체에서 21OHD를 치료하는, 방법.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역억제제는 상기 rAAV 벡터의 투여 전, 투여와 동시에, 그리고/또는 투여 후에 투여되는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 면역억제제는 상기 rAAV 벡터의 투여 전에 투여되는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 면역억제제는 상기 rAAV 벡터의 투여 적어도 12시간 전에 투여되는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 면역억제제는 상기 rAAV 벡터의 투여 약 2일 전에 투여되는, 방법.
  71. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역억제제는 비-글루코코르티코이드 면역억제제인, 방법.
  72. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역억제제는 칼시뉴린의 저해제인, 방법.
  73. 제63항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역억제제는 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, 에베롤리무스, 조타롤리무스, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 면역억제제는 타크롤리무스인, 방법.
  75. 제63항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역억제제는 경구 투여되는, 방법.
  76. 제63항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역억제제의 치료적 유효량이 약 0.01 밀리그램/킬로그램(mg/kg) 내지 약 0.05 mg/kg의 범위인, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 면역억제제의 치료적 유효량이 약 0.025 mg/kg인, 방법.
  78. 제63항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료적 유효량의 면역억제제가 1일 2회 투여되는, 방법.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 치료적 유효량의 스테로이드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 스테로이드는 미네랄로코르티코이드인, 방법.
  81. 제79항에 있어서, 상기 스테로이드는 글루코코르티코이드인, 방법.
  82. 제79항에 있어서, 상기 스테로이드는 하이드로코르티손인, 방법.
  83. 제79항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스테로이드는 상기 rAAV 벡터의 투여 전, 투여와 동시에 그리고/또는 투여 후에 투여되는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 rAAV 벡터의 투여 전에 상기 대상체에게 투여된 스테로이드의 치료적 유효량이 상기 rAAV의 투여 후 상기 대상체에게 투여된 스테로이드의 치료적 유효량보다 더 많은, 방법.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV의 투여 전과 비교하여 상기 rAAV의 투여 후 상기 대상체에서 더 높은 수준의 코티솔 및/또는 알도스테론이 존재하는, 방법.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 투여되지 않은 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대조군 대상체와 비교하여, 상기 rAAV의 투여 후 상기 대상체에서 더 높은 수준의 코티솔 및/또는 알도스테론이 존재하는, 방법.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV의 투여 전과 비교하여, 상기 rAAV의 투여 후 대상체에서 더 낮은 수준의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌, 안드로스텐디온(A4) 및/또는 11-케토 스테로이드가 존재하는, 방법.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 투여되지 않은 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 갖는 대조군 대상체와 비교하여, 상기 rAAV의 투여 후 대상체에서 더 낮은 수준의 프로게스테론, 17-OHP, 레닌, 안드로스텐디온(A4) 및/또는 11-케토 스테로이드가 존재하는, 방법.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터는 서열번호 52의 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 방법.
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