JP2021511020A - ２１−ヒドロキシラーゼ欠損症のためのアデノ随伴ウイルス遺伝子療法 - Google Patents

Abstract

２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）タンパク質を発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターおよび２１ＯＨ欠損症を治療するための関連する使用が本明細書に開示される。本発明は、少なくとも１つのＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）および２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）タンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、ｒＡＡＶベクターを包含する。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１８年３月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６４０，３１１号、および２０１８年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／６１８，３０７号に対する優先権および利益を主張する。これらの各出願の内容は参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。

電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は参照することにより全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピューターで読取り可能な形式のコピー（ファイル名：２１ＯＨ＿００１＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１９年１月１３日、ファイルサイズ１８，０５６バイト）。

本開示は、概しては遺伝子療法の分野に関する。特に、本開示は、２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）タンパク質を発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターおよび粒子を記載する。ｒＡＡＶベクターおよび粒子は、２１ＯＨ欠損症を治療するために使用されてもよい。

２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）は、ＣＹＰ２１Ａ２遺伝子によりコードされるシトクロムＰ４５０酵素であり、ステロイドホルモンアルドステロンおよびコルチゾールの生合成に関与する。これらの合成は副腎皮質において起こる。機能的なＣＹＰ２１Ａ２遺伝子と密接に関連した非機能的なＣＹＰ２１Ａ１Ｐ偽遺伝子との間の高率の組換えは、点突然変異ではなく遺伝子変換により推進される、先天性副腎過形成症（ＣＡＨ）およびその異常な遺伝学の高い発生率を結果としてもたらす。ＣＹＰ２１Ａ２の欠陥は２１−ヒドロキシラーゼ欠損症（２１ＯＨＤ）を引き起こし、２１ＯＨＤは、ｉ）外部生殖器の胎児男性化、グルココルチコイドおよびミネラロコルチコイド産生が低いもしくは存在しないこと、ならびに大過剰のアンドロゲンを伴うＣＡＨ（「古典的」２１ＯＨＤ）またはｉｉ）胎児男性化を伴わず、コルチゾールおよびアルドステロン欠損を伴わないが、アンドロゲンの産生が増加したより軽度の形態の疾患（「非古典的」２１ＯＨＤ）のいずれかに繋がる。

数十年の治療戦略の後、重篤な形態の２１ＯＨＤの管理は依然として臨床的に困難なままである。外因性ステロイドを用いて患者を治療することができるが、乳児および成人患者は依然として、副腎不全のリスク、すなわち、日常的な感染、外傷、または激しい労作などの身体ストレスに対して副腎が応答できないリスクがある。副腎不全は、療法を遵守している教養のある患者においてさえ重篤なショックおよび死に急速に繋がり得る。Ｈａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ、Ｆｅｂ；１００（２）：４０７〜４１６（２０１５）を参照。さらに、成長、ジェンダー、およびセクシャリティーに関する顕著な結果がある。女性患者において、生理学的用量より高いグルココルチコイド用量を使用して副腎のアンドロゲン産生を抑制することに本来的な困難がある。結果として、グルココルチコイド過剰に対するアンドロゲンの交互のサイクルは、低身長、肥満症、小児期の間の繰返しの生殖器手術、思春期における変化および慢性男性化に繋がることがある。アンドロゲン過剰症は依然として、多毛症、男性的な筋肉発生、肥大した陰核サイズおよび性的不全を通じて古典的および非古典的な形態の疾患を罹患した女性患者にとって大きな美容的負担となっている。Ｇａｓｔａｕｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ、９２（４）、１３９１〜１３９６（２００７）を参照。男性患者は、低身長および早期男性化のリスクがある。治療の失敗は、一部の患者において両側副腎摘除に繋がることさえある（Ｇｍｙｒｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１０９：Ｅ２８（２００２）；Ｂｒｕｉｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ、８６：４８２〜４８４（２００１））。
２１ＯＨＤの持続的矯正を可能とする療法の必要性が依然として存在する。

Ｈａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ、Ｆｅｂ；１００（２）：４０７〜４１６（２０１５） Ｇａｓｔａｕｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ、９２（４）、１３９１〜１３９６（２００７） Ｇｍｙｒｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１０９：Ｅ２８（２００２） Ｂｒｕｉｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ、８６：４８２〜４８４（２００１）

本発明は、少なくとも１つのＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）および２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）タンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、ｒＡＡＶベクターを包含する。

ある特定の場合には、ｒＡＡＶベクターは、ヒト２１ＯＨタンパク質である２１ＯＨタンパク質をコードする。一部の実施形態では、２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列は、ヒト２１ＯＨ（ＣＹＰ２１Ａ２）ｃＤＮＡを含むまたはからなる。ある特定の実施形態では、２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列は、配列番号：１のアミノ酸配列または配列番号：１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする。

ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）および２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）タンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含む核酸分子を含んでもよく、非ＡＡＶヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結されており、プロモーターは宿主細胞（例えば、副腎細胞または副腎皮質細胞）中での２１ＯＨタンパク質の発現を指令する。好適なプロモーターの非限定的な例としては、サイトメガロウイルス／β−アクチンハイブリッドプロモーター、ＰＧＫプロモーターまたは発現が副腎皮質細胞において特異的なプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、サイトメガロウイルス／β−アクチンハイブリッドプロモーターは、ＣＡＧ、ＣＢ６またはＣＢＡプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４８または配列番号：４９のヌクレオチド配列を含むまたはからなる。

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは少なくとも１つのＩＴＲ配列を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０またはｒｈ７４血清型ＩＴＲである。

ある特定の場合には、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０またはｒｈ７４血清型である。

本発明はさらに、２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）タンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されており、ｒＡＡＶベクターが少なくとも１つのＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）を含み、ＩＴＲが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０またはｒｈ７４のＡＡＶからのものであり、かつ、プロモーターが、サイトメガロウイルス／β−アクチンハイブリッドプロモーター、ＰＧＫプロモーターまたは発現が副腎皮質細胞において特異的なプロモーターである、ｒＡＡＶベクターを提供する。一部の実施形態では、サイトメガロウイルス／β−アクチンハイブリッドプロモーターは、ＣＡＧ、ＣＢ６またはＣＢＡプロモーターである。

一部の態様では、本発明は、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を包含する。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０またはｒｈ７４からの少なくとも１つのキャプシドタンパク質をさらに含む。

本発明はまた、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を包含する。さらに、本発明は、ｒＡＡＶ粒子を製造する方法であって、（ａ）本明細書に記載のｒＡＡＶベクター、（ｂ）ＡＡＶ ｒｅｐをコードする核酸分子、（ｃ）少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸分子および（ｄ）ｒＡＡＶ粒子をパッケージングするための充分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む、方法を想定する。

ある特定の場合には、本発明は、それを必要とする対象において２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）を発現させる方法であって、対象に治療有効量の、少なくとも１つのＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）および２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）タンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子であって、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、ｒＡＡＶ粒子、またはそのようなｒＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を投与し、それにより、対象において２１ＯＨを発現させることを含む、方法を提供する。一部の場合には、２１ＯＨは、対象の副腎皮質、副腎髄質、副腎幹細胞、副腎前駆細胞、肝臓または卵巣中で発現されてもよい。

本発明はさらに、２１−ヒドロキシラーゼ欠損症（２１ＯＨＤ）を有する対象を治療する方法であって、対象に治療有効量の、少なくとも１つのＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）および２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）タンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子であって、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、ｒＡＡＶ粒子、またはそのようなｒＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を投与し、それにより、対象において２１ＯＨＤを治療することを含む、方法を提供する。この方法は、投与するステップの前に２１ＯＨＤを有する対象を選択することをさらに含んでもよい。

一部の場合には、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子またはそのようなｒＡＡＶベクターもしくはｒＡＡＶ粒子を含む医薬組成物は、静脈内に、直視下手術もしくは腹腔鏡検査法を介して副腎への直接注射によりまたはカテーテル法を介して副腎動脈への注射により対象に投与される。副腎への直接注射は副腎皮質への直接注射であってもよい。

本発明の方法または組成物により治療される対象は、プラダーのステージＩＶまたはＶの形態の２１ＯＨＤを罹患していてもよい。一部の場合には、対象は、先天性副腎過形成症（ＣＡＨ）を罹患している。

本発明はまた、２１−ヒドロキシラーゼ欠損症を治療するための医薬の製造における、少なくとも１つのＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）および２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）タンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むｒＡＡＶベクターまたはそのようなベクターを含むｒＡＡＶ粒子の使用であって、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、使用を想定する。

図１Ａ〜図１Ｃは、「対照」マウス（白、ｎ＝２１）と考えられるＣｙｐ２１^＋／−およびＣｙｐ２１^＋／＋と比較してＣＹＰ２１ベクター（灰色、ｎ＝１６）または偽ベクター（黒、ｎ＝９）を注射したＣｙｐ２１^−／−マウスにおける体重および尿中プロゲステロンの進展を示す。図１Ａは、偽ベクターを注射したＣｙｐ２１^−／−マウスは全ての時点において対照マウスより小さいままであったことを示す棒グラフである（Ｐ＜０．００１）。ＣＹＰ２１ベクターを注射したマウスは、注射の５および１０週後（Ｐ＜０．００１）ならびに注射の１５週後（Ｐ＜０．０１）に体重の大幅な回復を有した。図１Ｂは、ベクター注射の前および殺傷の時点における偽ベクター（左）またはＣＹＰ２１ベクター（中）を注射したＣｙｐ２１^−／−マウスおよび対照マウス（右）の写真を示す。図１Ｃは、偽ベクターを注射したＣｙｐ２１^−／−マウスは全ての時点において対照マウスよりはるかに高い尿中プロゲステロン濃度を有したことを示す棒グラフである（Ｐ＜０．００１）。ＣＹＰ２１ベクターを用いる遺伝子療法は、尿中プロゲステロンの大きな減少を誘導した。しかしながら、矯正は完全ではなかった。プロゲステロンレベルは、対照マウスと比較してＣＹＰ２１処置Ｃｙｐ２１^−／−マウスにおいて約２倍高いままであった（注射の５週後にＰ＜０．００１、注射の１０週後に有意でない、および注射の１５週後にＰ＜０．０５）。データを平均±ｓ．ｅ．ｍ．として提示する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 同上。 同上。 図２Ａ〜図２Ｆは、対照（白、ｎ＝１９）と比較してＣＹＰ２１ベクター（灰色、ｎ＝１４）または偽ベクター（黒、ｎ＝１３）を注射したＣｙｐ２１^−／−マウスにおける移動運動およびストレス応答の研究の結果を示す棒グラフである。図２Ａは、ＣＹＰ２１または偽ベクターを注射したＣｙｐ２１^−／−マウスおよび対照マウスは、ロータロッドにより評価される同等の移動運動成績を有したことを示す。図２Ｂは、偽ベクターを注射したＣｙｐ２１^−／−マウスは、尾懸垂試験において対照マウスより動かなかったことを示す（対照マウスと偽ベクターマウスとの間でＰ＝０．２１）。ＣＹＰ２１ベクターを用いて処置したＣｙｐ２１^−／−マウスは、試験に対する正常な応答を回復した（対照マウスとＣＹＰ２１ベクターマウスとの間でＰ＜０．０５）。図２Ｃ〜２Ｆは、偽ベクターを注射したＣｙｐ２１^−／−マウスは、高架式十字迷路試験においてＣＹＰ２１ベクターを注射したＣｙｐ２１^−／−マウスおよび対照マウスと比較して、より短い距離を移動し（対照マウスと偽ベクターマウスとの間でＰ＜０．００１）（図２Ｃ）、オープンアームにおいてより短い時間を過ごし（対照マウスと偽ベクターマウスとの間で有意でない）（図２Ｄ）、より少ないヘッドディッピング（対照マウスと偽ベクターマウスとの間でＰ＜０．０５）（図２Ｅ）および立ち上がり運動（対照マウスと偽ベクターマウスとの間でＰ＜０．０１）（図２Ｆ）を行ったことを示す。差異は、全ての高架式十字迷路パラメーターについて対照とＣＹＰ２１ベクターとの間で有意でなかった。データを平均±ｓ．ｅ．ｍ．として提示する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図３Ａおよび図３Ｂは、対照マウス（白、ｎ＝１６）と比較してＣＹＰ２１ベクター（灰色、ｎ＝１１）または偽ベクター（黒、ｎ＝８）を注射したＣｙｐ２１^−／−マウスの副腎および腎臓における遺伝子発現の研究の結果を示す棒グラフである。図３Ａは、ｍＲＮＡ含量は、ＡＣＴＨ受容体（Ｍｃ２ｒ）、プロテインキナーゼＡ調節サブユニット（Ｐｒｋａｒ２ａ）、ステロイド産生因子１（ＳＦ−１）（Ｐ＜０．０１）、ステロイド産生急性調節タンパク質（Ｓｔａｒ）ならびにステロイド産生酵素Ｃｙｐ１７ａ１およびＣｙｐ１１ｂ２（Ｐ＜０．０５）について偽ベクターに対してＣＹＰ２１注射マウスの副腎において減少したことを示す。対照と比較してＣＹＰ２１注射マウスにおけるｍＲＮＡ含量は増加したままであったが、ＳＦ−１、Ｓｔａｒ、Ｈｓｄ３ｂ１（Ｐ＜０．０５）、Ｐｒｋａｒ１ａ、Ｃｙｐ１１ｂ１（Ｐ＜０．０１）、Ｍｃ２ｒ、Ｐｒｋａｒ２ａおよびＣｙｐ１１ｂ２（Ｐ＜０．００１）についてより低いレベルの増加であり、Ｐｒｋａｒｃａ、Ｐｒｋａｒｃｂ、Ｃｙｐ１１ａ１およびＣｙｐ１７ａ１について変化しなかった。図３Ｂは、Ｒｅｎｉｎ ｍＲＮＡ含量は偽ベクターに対してＣＹＰ２１注射マウスの腎臓において減少したが（Ｐ＜０．００１）、ＣＹＰ２１注射マウスを対照と比較した場合には増加したままであった（Ｐ＜０．００１）ことを示す。データをＴｂｐに対して正規化し、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として提示する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 同上。 同上。 同上。 図４Ａおよび図４Ｂは、ｐＣＹＰ２１（ｎ＝３、灰色）またはｐＬｕｃ（ｎ＝３、黒）をトランスフェクトしたＹ１細胞における２１−ヒドロキシラーゼ発現およびプロゲステロン濃度の解析の結果を示す。図４Ａは、ｐＣＹＰ２１をトランスフェクトしたＹ１細胞は、ｐＬｕｃをトランスフェクトしたＹ１細胞とは対照的にウエスタンブロットによる評価で２１−ヒドロキシラーゼを発現したことを示す。図４Ｂは、ｐＣＹＰ２１をトランスフェクトしたＹ１細胞は、ｐＬｕｃをトランスフェクトしたＹ１細胞より低い上清中のプロゲステロン濃度を有したことを示す（Ｐ＝０．１０）。データを平均±ｓ．ｅ．ｍ．として提示する。 図５Ａおよび図５Ｂは、ＡＡＶｒｈ１０の静脈注射は副腎皮質における導入遺伝子の発現を結果としてもたらすことを示す。図５Ａは、対照マウスにおける静脈注射後の副腎におけるＡＡＶｒｈ１０のＧＦＰ蛍光パターンを示す画像である。図５Ｂは、対照およびＣＹＰ２１ベクターを用いて処置したＣｙｐ２１^−／−マウスの副腎におけるマウスおよびヒト２１−ヒドロキシラーゼ発現を示すイムノブロットである。 図６は、対照マウスおよび偽ベクターまたはＣＹＰ２１ベクターを注射したＣｙｐ２１^−／−マウスの副腎凍結切片の組織学的解析の画像を示す。上、スケールバー＝５００μｍ；下、スケールバー＝２００μｍ。 図７は、対照マウスおよび偽ベクターまたはＣＹＰ２１ベクターを注射したＣｙｐ２１^−／−マウスの副腎におけるアルドステロン合成酵素発現の画像を示す。 図８Ａおよび図８Ｂは、ＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＧＦＰを静脈注射した対照マウスの末梢臓器におけるＧＦＰ発現の画像を示す。図８Ａは心臓を示す。図８Ｂは肝臓を示す。 図９は、左副腎にｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＧＦＰを注射した非ヒト霊長動物番号１（ＮＨＰ０１）の副腎についてのＧＦＰウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。右（非注射）副腎および左（注射）副腎の両方におけるＶＧＣ数を示す。アステリスクは、実施例１〜６においてＣｙｐ２１^−／−マウスの治療に効果的であったＶＧＣを指し示す。 図１０は、ｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＧＦＰを注射した非ヒト霊長動物番号１（ＮＨＰ０１）の左副腎のＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。 図１１は、ｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＧＦＰを注射した非ヒト霊長動物番号１（ＮＨＰ０１）の左副腎の切片全体のＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。 図１２は、右副腎にｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射した非ヒト霊長動物番号１（ＮＨＰ０１）の副腎についてのＣＹＰ２１ＨＡウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。右（注射）副腎および左（非注射）副腎の両方におけるＶＧＣ数を示す。アステリスクは、実施例１〜６においてＣｙｐ２１^−／−マウスの治療に効果的であったＶＧＣを指し示す。 図１３は、ｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射した非ヒト霊長動物番号１（ＮＨＰ０１）の右副腎のＨＡ免疫蛍光画像を示す。 図１４は、右副腎にｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射した非ヒト霊長動物番号２（ＮＨＰ０２）の副腎についてのＣＹＰ２１ＨＡウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。右（注射）副腎および左（非注射）副腎の両方におけるＶＧＣ数を示す。アステリスクは、実施例１〜６においてＣｙｐ２１^−／−マウスの治療に効果的であったＶＧＣを指し示す。この動物に右副腎における３回の注射として４．５×１０^１１ｖｇを投与した。この値はＮＨＰ０１への投与より６．６倍低かった。 図１５は、ｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射した非ヒト霊長動物番号２（ＮＨＰ０２）の右副腎におけるＨＡ免疫蛍光画像を示す。この動物に右副腎における３回の注射として４．５×１０^１１ｖｇを投与した。この値はＮＨＰ０１への投与より６．６倍低かった。 図１６は、右副腎にｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射した非ヒト霊長動物番号４（ＮＨＰ０４）の副腎についてのＣＹＰ２１ＨＡウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。右（注射）副腎および左（非注射）副腎の両方におけるＶＧＣ数を示す。アステリスクは、実施例１〜６においてＣｙｐ２１^−／−マウスの治療に効果的であったＶＧＣを指し示す。 図１７は、右副腎におけるｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡの注射後の非ヒト霊長動物番号４（ＮＨＰ０４）の右副腎の解剖の詳細の構成図および写真を示す。 図１８は、右副腎にｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射した非ヒト霊長動物番号４（ＮＨＰ０４）からの小片に切断した副腎におけるＣＹＰ２１ＨＡウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値の空間分布の構成図を示す。推定上の注射部位を黒矢印として指し示す。 図１９は、手術の終了時（ＥＳ）および安楽死後（Ｅｕ）のＮＨＰ０１およびＮＨＰ０２の肝臓におけるｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡについての平均ＣＹＰ２１ＨＡウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。図１９はまた、ｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射したＮＨＰ０１、ＮＨＰ０２およびＮＨＰ０４の肝臓のＨＡ免疫蛍光画像を示す。 図２０は、ｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＧＦＰを静脈内に投与した野生型マウスの副腎についてのＧＦＰウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。アステリスクは、実施例１〜６においてＣｙｐ２１^−／−マウスの治療に効果的であったＶＧＣを指し示す。図２０はまた、静脈内にｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＧＦＰを用いて処置した野生型マウスの副腎の免疫蛍光画像を示す。 図２１は、ｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを静脈内に投与した野生型マウスの副腎についてのＣＹＰ２１ＨＡウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。アステリスクは、実施例１〜６においてＣｙｐ２１^−／−マウスの治療に効果的であったＶＧＣを指し示す。 図２２は、左副腎にｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを注射した非ヒト霊長動物番号２（ＮＨＰ０２）の副腎についてのＧＦＰウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。右（非注射）副腎および左（注射）副腎の両方におけるＶＧＣ数を示す。アステリスクは、実施例１〜６においてＣｙｐ２１^−／−マウスの治療に効果的であったＶＧＣを指し示す。 図２３は、ｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを注射した非ヒト霊長動物番号２（ＮＨＰ０２）の左副腎のＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。 図２４は、ｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを注射した非ヒト霊長動物番号２（ＮＨＰ０２）の左副腎における選択された陽性ＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。「ＯＢＪＸ２０」は×２０の倍率を指す。 図２５は、ｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを注射したＮＨＰ０２の左副腎のＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。この図は、副腎の小片にわたる免疫蛍光シグナルの不均一な分布を示す。 図２６は、左副腎にｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを注射した非ヒト霊長動物番号４（ＮＨＰ０４）の副腎についてのＧＦＰウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。右（非注射）副腎および左（注射）副腎の両方におけるＶＧＣ数を示す。アステリスクは、実施例１〜６においてＣｙｐ２１^−／−マウスの治療に効果的であったＶＧＣを指し示す。 図２７は、左副腎におけるｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰの注射後の非ヒト霊長動物番号４（ＮＨＰ０４）の左副腎の解剖の詳細の構成図および写真を示す。 図２８は、左副腎にｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを注射した非ヒト霊長動物番号４（ＮＨＰ０４）からの小片に切断した２つの副腎におけるＧＦＰ ＶＧＣ測定値の空間分布の分布を示す。 図２９は、手術の終了時（ＥＳ）および安楽死後（Ｅｕ）のｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを注射したＮＨＰ０２およびＮＨＰ０４の肝臓における平均ＧＦＰウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。図２９はまた、左副腎にｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを注射したＮＨＰ０４の肝臓のＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。 図３０は、左副腎にｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを注射したＮＨＰ０４の別の肝臓のＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。 図３１は、ｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを静脈内に投与した野生型マウスの副腎についてのＧＦＰウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。図３１はまた、静脈内にｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを用いて処置した野生型マウスの副腎のＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。 図３２は、ＩＰ（腹腔内）注射またはＩＨ（肝臓内）注射のいずれかによりｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを用いて処置した野生型マウス副腎のＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。 図３３は、左副腎にｓｓＡＡＶ１−ＣＢ６−ＧＦＰを注射した非ヒト霊長動物番号３（ＮＨＰ０３）の副腎についてのＧＦＰウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。右（非注射）副腎および左（注射）副腎の両方におけるＶＧＣ数を示す。アステリスクは、実施例１〜６においてＣｙｐ２１^−／−マウスの治療に効果的であったＶＧＣを指し示す。 図３４は、ｓｓＡＡＶ１−ＣＢ６−ＧＦＰを注射した非ヒト霊長動物番号３（ＮＨＰ０３）の左副腎のＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。 図３５は、手術の終了時（ＥＳ）および安楽死後（Ｅｕ）のＮＨＰ０３の肝臓におけるｓｓＡＡＶ１−ＣＢ６−ＧＦＰについての平均ＧＦＰウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。図３５はまた、左副腎にｓｓＡＡＶ１−ＣＢ６−ＧＦＰを注射したＮＨＰ０３の肝臓のＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。 図３６は、ｓｓＡＡＶ１−ＣＢ６−ＧＦＰを静脈内に投与した野生型マウスの副腎についてのＧＦＰウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。図３６はまた、静脈内にｓｓＡＡＶ１−ＣＢ６−ＧＦＰを用いて処置した野生型マウスの副腎のＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。 図３７は、右副腎にｓｓＡＡＶ１−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射した非ヒト霊長動物番号３（ＮＨＰ０３）の副腎についてのＣＹＰ２１ＨＡウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。右（注射）副腎および左（非注射）副腎の両方におけるＶＧＣ数を示す。アステリスクは、実施例１〜６においてＣｙｐ２１^−／−マウスの治療に効果的であったＶＧＣを指し示す。 図３８は、ｓｓＡＡＶ１−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射した非ヒト霊長動物番号３（ＮＨＰ０３）の右副腎のＨＡ免疫蛍光画像を示す。動物に右副腎への２回の注射として２．２×１０^１２を投与した。 図３９は、手術の終了時（ＥＳ）および安楽死後（Ｅｕ）の右副腎にｓｓＡＡＶ１−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射したＮＨＰ０３の肝臓におけるＣＹＰ２１ＨＡ平均ウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。図３９はまた、右副腎にｓｓＡＡＶ１−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射したＮＨＰ０３の肝臓のＨＡ免疫蛍光画像を示す。 図４０は、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇのｓｓＡＡＶ１−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを静脈内に投与した野生型マウスの副腎についてのＣＹＰ２１ＨＡウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を示す。 図４１Ａおよび図４１Ｂは、様々な時点でのＮＨＰ０１、ＮＨＰ０２、ＮＨＰ０３およびＮＨＰ０４におけるＧＦＰ（図４１Ａ）およびｈＣＹＰ２１ＨＡ（図４１Ｂ）の血液ＶＧＣの測定値を要約する線グラフを示す。図４１Ｃは、副腎内注射用量の関数として手術の終了時における血液ＶＧＣを要約するグラフを示す。ｖｇ＝ウイルスゲノム。「Ｈ＋１」は注射の１時間後を表す。「Ｄ＋１」、「Ｄ＋７」、「Ｄ＋１４」および「Ｄ＋２１」はそれぞれ、注射の１日後、７日後、１４日後および２１日後を表す。 図４２は、ｓｓＡＡＶ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを用いて処置したまたはｒＡＡＶを用いて非処置の７か月齢Ｃｙｐ２１^−／−マウスのデルタ体重（体重の変化）を示すグラフを示す。体重をｔ０（注射）およびｗ１５（処置の１５週後）において測定した。 図４３は、ｓｓＡＡＶ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを用いて処置した７か月齢Ｃｙｐ２１^−／−マウスの副腎の処置の１５週後におけるＨＡ−ＦＩＴＣ免疫蛍光画像を示す。「ＴＦ」は「処置した雌」を指す。「ＴＭ」は「処置した雄」を指す。図は、画像を生成するために使用したマウスの識別番号を含む。 図４４は、ｓｓＡＡＶ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを用いて処置した７か月齢Ｃｙｐ２１^−／−マウスの副腎の処置の１５週後におけるＣＹＰ２１−ＣＹ３免疫蛍光画像を示す。「ＴＦ」は「処置した雌」を指す。「ＴＭ」は「処置した雄」を指す。図は、画像を生成するために使用したマウスの識別番号を含む。 図４５は、ｓｓＡＡＶ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを用いて処置した７か月齢Ｃｙｐ２１^−／−マウスの処置の１５週後、非処置Ｃｙｐ２１^−／−マウスおよびＣｙｐ２１野生型（＋／＋）またはＣｙｐ２１ヘテロ接合（＋／−）マウスにおけるＣＹＰ２１発現のウエスタンブロットの画像を示す。ＣＹＰ２１を抗ＣＹＰ２１抗体（ＣｏｒＧｅｎ）を用いて検出した。図は、データを生成するために使用したマウスの識別番号を含む。 図４６Ａおよび図４６Ｂは、ｓｓＡＡＶ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを用いて処置した７か月齢Ｃｙｐ２１^−／−マウス（図４６Ａ）および非処置Ｃｙｐ２１^−／−マウス（図４６Ｂ）における１５週にわたる尿中プロゲステロンレベル（ｎｇ／ｍｇクレアチニン）の測定値を示す。図４６Ｃは、ｓｓＡＡＶ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを用いて処置した７か月齢野生型マウスおよび非処置野生型マウスにおける１５週にわたる尿中プロゲステロンレベル（ｎｇ／ｍｇクレアチニン）の測定値を示す。図は、データを生成するために使用したマウスの識別番号を含む。 同上。 同上。 図４７は、ｓｓＡＡＶ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを用いて処置したまたはｒＡＡＶを用いて非処置の２〜３か月齢Ｃｙｐ２１^−／−マウスのデルタ体重（体重の変化）を示すグラフを示す。体重をｔ０（注射）およびｗ１５（処置の１５週後）において測定した。 図４８は、ｓｓＡＡＶ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを静脈内に投与した特定の２〜３か月齢Ｃｙｐ２１^−／−マウスの副腎についての処置の１８週後におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値を含む表を示す。表はまた、ｒＡＡＶの注射の時点（Ｐｒｏｇ Ｗ０）での各マウスにおける対応する尿中プロゲステロンレベル（ｎｇ／ｍｇクレアチニン）、最低プロゲステロンレベル（最低Ｐｒｏｇ）および処置の１５週後のプロゲステロンレベル（Ｐｒｏｇ Ｗ１５）を含む。図４８はまた、処置マウスの副腎におけるＣＹＰ２１ＨＡ発現の対応する免疫蛍光画像を示す。「ＴＦ」は「処置した雌」を指す。「ＴＭ」は「処置した雄」を指す。図は、画像を生成するために使用したマウスの識別番号を含むおよびデータ。 図４９Ａおよび図４９Ｂは、ｓｓＡＡＶ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを用いて処置した２〜３か月齢Ｃｙｐ２１^−／−マウス（図４９Ａ）および非処置Ｃｙｐ２１^−／−マウス（図４９Ｂ）における１５週にわたる尿中プロゲステロンレベル（ｎｇ／ｍｇクレアチニン）の測定値を示す。図は、データを生成するために使用したマウスの識別番号を含む。 同上。 図５０は、ｓｓＡＡＶ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを用いて処置した２〜３か月齢Ｃｙｐ２１^−／−マウスの副腎の処置の１週後におけるＣＹＰ２１ＨＡ免疫蛍光画像を示す。図は、画像を生成するために使用したマウスの識別番号を含む。 図５１は、ｓｓＡＡＶ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを用いて処置した２〜３か月齢Ｃｙｐ２１^−／−マウスの副腎の処置の３週後におけるＣＹＰ２１ＨＡ免疫蛍光画像を示す。図は、画像を生成するために使用したマウスの識別番号を含む。 図５２Ａ〜図５２Ｃは、２．６５ｋｇの体重の２８か月齢の雌である非ヒト霊長動物番号５（ＮＨＰ０５）へのＡＡＶ１−ＣＡＧ−ｈＣＹＰ２１ＨＡの副腎内投与後に得られた結果を示す。ｒＡＡＶ投与の約２か月前にＡＡＶ１、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６の中和抗体について陰性であるとしてスクリーニングした動物。ｒＡＡＶ投与の約２週間前にＡＡＶ１およびＡＡＶ５の中和抗体について陰性であるとしてスクリーニングし、かつＡＡＶ６（１／５）の中和抗体について陽性であるとしてスクリーニングした動物。図５２Ａは、副腎の異なる区分におけるＣＹＰ２１ＨＡベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値についての空間分布の構成図を示す（左および中央）。図５２Ａはまた、各肝葉についてのＶＧＣ測定値を示す（右）。図５２Ｂは、ＶＧＣ（左）およびハウスキーピング遺伝子（ＡＲＮ）測定値と比べたｍＲＮＡの分布を示す。図５２Ｃは、ＣＹＰ２１ＨＡ陽性細胞染色（緑）を用いた右副腎の低（左）および高（右）倍率でのＣＹＰ２１ＨＡ免疫蛍光画像を示し、ベクターの広い発現を指し示す。「ＲＡ」は右副腎を表す。「ＬＡ」は左副腎を表す。 同上。 同上。 図５３Ａ〜図５３Ｃは、２．３５ｋｇの体重の２８か月齢の雌である非ヒト霊長動物番号８（ＮＨＰ０８）へのＡＡＶ１−ＣＡＧ−ｈＣＹＰ２１ＨＡの静脈内投与後に得られた結果を示す。ｒＡＡＶ投与の約２か月前にＡＡＶ１、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６の中和抗体について陰性であるとしてスクリーニングした動物。ｒＡＡＶ投与の約２週間前にＡＡＶ１およびＡＡＶ６の中和抗体について陰性であるとしてスクリーニングし、かつＡＡＶ５（１／５）の中和抗体について陽性であるとしてスクリーニングした動物。図５３Ａは、副腎の異なる区分におけるＣＹＰ２１ＨＡベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値についての空間分布の構成図を示す（左および中央）。図５３Ａはまた、各肝葉についてのＶＧＣ測定値を示す（右）。図５３Ｂは、ＶＧＣ（左）およびハウスキーピング遺伝子（ＡＲＮ）測定値と比べたｍＲＮＡの分布を示す。図５３Ｃは、ＣＹＰ２１ＨＡ陽性細胞染色（緑）を用いた右副腎の低（左）および高（右）倍率でのＣＹＰ２１ＨＡ免疫蛍光画像を示し、ベクターの低い発現を指し示す。「ＲＡ」は右副腎を表す。「ＬＡ」は左副腎を表す。 同上。 同上。 図５４Ａ〜図５４Ｃは、２．８ｋｇの体重の２８か月齢の雌である非ヒト霊長動物番号６（ＮＨＰ０６）へのＡＡＶ５−ＣＡＧ−ｈＣＹＰ２１ＨＡの副腎内投与後に得られた結果を示す。ｒＡＡＶ投与の約２か月前にＡＡＶ５およびＡＡＶ６の中和抗体について陰性であるとしてスクリーニングし、かつＡＡＶ１（１／５）の中和抗体について陽性であるとしてスクリーニングした動物。ｒＡＡＶ投与の約２週間前にＡＡＶ１およびＡＡＶ５の中和抗体について陰性であるとしてスクリーニングし、かつＡＡＶ６（１／５）の中和抗体について陽性であるとしてスクリーニングした動物。図５４Ａは、副腎の異なる区分におけるＣＹＰ２１ＨＡベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値についての空間分布の構成図を示す（左および中央）。図５４Ａはまた、各肝葉についてのＶＧＣ測定値を示す（右）。図５４Ｂは、ＶＧＣ（左）およびハウスキーピング遺伝子（ＡＲＮ）測定値と比べたｍＲＮＡの分布を示す。図５４Ｃは、ＣＹＰ２１ＨＡ陽性細胞染色（緑）を用いた右副腎の低（大きい画像）および高（小さい画像）倍率でのＣＹＰ２１ＨＡ免疫蛍光画像を示し、ベクターの広い発現を指し示す。「ＲＡ」は右副腎を表す。「ＬＡ」は左副腎を表す。 同上。 同上。 図５５Ａ〜図５５Ｃは、２．５ｋｇの体重の２８か月齢の雌である非ヒト霊長動物番号９（ＮＨＰ０９）へのＡＡＶ５−ＣＡＧ−ｈＣＹＰ２１ＨＡの静脈内投与後に得られた結果を示す。ｒＡＡＶ投与の約２か月前にＡＡＶ１、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６の中和抗体について陰性であるとしてスクリーニングした動物。ｒＡＡＶ投与の約２週間前にＡＡＶ１、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６の中和抗体について陰性であるとしてスクリーニングした動物。図５５Ａは、副腎の異なる区分におけるＣＹＰ２１ＨＡベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値についての空間分布の構成図を示す（左および中央）。図５５Ａはまた、各肝葉についてのＶＧＣ測定値を示す（右）。図５５Ｂは、ＶＧＣ（左）およびハウスキーピング遺伝子（ＡＲＮ）測定値と比べたｍＲＮＡの分布を示す。図５５Ｃは、ＣＹＰ２１ＨＡ陽性細胞染色（緑）を用いた右副腎の低（中央）および高（左および右）倍率でのＣＹＰ２１ＨＡ免疫蛍光画像を示し、ベクターの広い発現を指し示す。「ＲＡ」は右副腎を表す。「ＬＡ」は左副腎を表す。 同上。 同上。 図５６Ａ〜図５６Ｃは、２．８５ｋｇの体重の２８か月齢の雌である非ヒト霊長動物番号７（ＮＨＰ０７）へのＡＡＶ６−ＣＡＧ−ｈＣＹＰ２１ＨＡの副腎内投与後に得られた結果を示す。ｒＡＡＶ投与の約２か月前にＡＡＶ１、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６の中和抗体について陰性であるとしてスクリーニングした動物。ｒＡＡＶ投与の約２週間前にＡＡＶ１（１／５）、ＡＡＶ５（１／５）およびＡＡＶ６（１／５）の中和抗体について陽性であるとしてスクリーニングした動物。図５６Ａは、副腎の異なる区分におけるＣＹＰ２１ＨＡベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値についての空間分布の構成図を示す（左および中央）。図５６Ａはまた、各肝葉についてのＶＧＣ測定値を示す（右）。図５６Ａはまた、各肝葉についてのＶＧＣ測定値を示す（右）。図５６Ｂは、ＶＧＣ（左）およびハウスキーピング遺伝子（ＡＲＮ）測定値と比べたｍＲＮＡの分布を示す。図５６Ｃは、ＣＹＰ２１ＨＡ陽性細胞染色（緑）を用いた右副腎の低（左）および高（右）倍率でのＣＹＰ２１ＨＡ免疫蛍光画像を示し、ベクターの広い発現を指し示す。「ＲＡ」は右副腎を表す。「ＬＡ」は左副腎を表す。 同上。 同上。 図５７Ａ〜図５７Ｃは、２．３５ｋｇの体重の２８か月齢の雌である非ヒト霊長動物番号１０（ＮＨＰ１０）へのＡＡＶ６−ＣＡＧ−ｈＣＹＰ２１ＨＡの静脈内投与後に得られた結果を示す。ｒＡＡＶ投与の約２か月前にＡＡＶ１、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６の中和抗体について陰性であるとしてスクリーニングした動物。ｒＡＡＶ投与の約２週間前にＡＡＶ５およびＡＡＶ６の中和抗体について陰性であるとしてスクリーニングし、かつＡＡＶ１（１／５）の中和抗体について陽性であるとしてスクリーニングした動物。図５７Ａは、副腎の異なる区分におけるＣＹＰ２１ＨＡベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値についての空間分布の構成図を示す（左および中央）。図５７Ａはまた、各肝葉についてのＶＧＣ測定値を示す（右）。図５７Ｂは、ＶＧＣ（左）およびハウスキーピング遺伝子（ＡＲＮ）測定値と比べたｍＲＮＡの分布を示す。図５７Ｃは、ＣＹＰ２１ＨＡ陽性細胞染色（緑）を用いた右副腎の低（左）および高（右）倍率でのＣＹＰ２１ＨＡ免疫蛍光画像を示し、ベクターの最小の発現を指し示す。「ＲＡ」は右副腎を表す。「ＬＡ」は左副腎を表す。 同上。 同上。 図５８は、ｒＡＡＶベクターを副腎内投与した非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）からのデータを要約する表である。列記したデータは、右副腎（ＲＡ）または左副腎（ＬＡ）への注射、ベクター識別記号および用量／キログラム（ｋｇ）およびそれぞれの投与された副腎において測定された結果として得られたベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）を含む。 図５９は、ＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを用いて処置した非ヒト霊長動物番号２（ＮＨＰ０２）の左副腎のＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。 図６０は、ベクターの副腎内注射後の左副腎におけるＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰのＧＦＰ免疫蛍光画像を示す。腺に適用された用量は６．０×１０^１１ｖｇであった。ＧＦＰ陽性細胞の広範な分布を示す低（上パネル）および高（下パネル）倍率。右下は、副腎皮質の小セグメントのハイパワー拡大×２０（ＯＢＪＸ２０）図であり、単一細胞中のＧＦＰの細胞質局在性を示す。核は、ＤＡＰＩを用いて青色に染色されている。 図６１は、指し示されるｒＡＡＶ血清型の副腎内（ＩＡ）または静脈内（ＩＶ）投与後の非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）の肝臓のＣＹＰ２１ＨＡ免疫蛍光画像を示す。白矢印はＣＹＰ２１ＨＡ発現細胞（緑）を指し示す。 図６２は、野生型（ＷＴ）ヒトＣＹＰ２１導入遺伝子、コドン最適化（ＣＯ）ヒトＣＹＰ２１導入遺伝子、または野生型カニクイザルＣＹＰ２１導入遺伝子のいずれかを含有する組換え血清型ＡＡＶ５ベクターを用いて処置した非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）についての投与および処置群を要約する。全てのベクターは、ＣＢＡプロモーターおよびＫｏｚａｋ配列を含んだ。ヒトＣＹＰ２１導入遺伝子を含有するベクターは、脱標的化（ｄｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）用のｍｉＲ−１２２ ｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含んだ。野生型ヒトＣＹＰ２１導入遺伝子を含有するベクターを「ＡＡＶ５−ＣＢＡ−Ｋｏｚａｋ−ｈＣＹＰ２１−ｍｉＲ１２２」と称する。コドン最適化ヒトＣＹＰ２１導入遺伝子を含有するベクターを「ＡＡＶ５−ＣＢＡ−Ｋｏｚａｋ−ＣＯｈＣＹＰ２１−ｍｉＲ１２２」と称する。野生型カニクイザルＣＹＰ２１導入遺伝子を含有するベクターを「ＡＡＶ５−ＣＢＡ−Ｋｏｚａｋ−ＣｙｎｏＣＹＰ２１」と称する。 図６３は、図６２および実施例１３に記載の各非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）処置群についてのＣＹＰ２１ベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値、ｍＲＮＡ測定値およびＳａｌヒト対Ｓａｌカニクイザルペプチド比を示す表である。ＶＧＣおよびｍＲＮＡの行について、各行の上の数は平均であり、２つの下の数は平均についての範囲である。ペプチド比は、正確なタンパク質対タンパク質比と解釈されるべきではない。「ｈ ｍＲＮＡ」はヒトＣＹＰ２１ ｍＲＮＡを指す。「カニクイザルｍＲＮＡ」はカニクイザルＣＹＰ２１ ｍＲＮＡを指す。指数についての数値形式は、以下の例に示すように解釈される：「１．２８．１０^−２」は「１．２８×１０^−２」を指す。

本発明は、２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）を発現するように操作されており、かつ２１−ヒドロキシラーゼ欠損症（２１ＯＨＤ）を治療するために使用することができる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。一部の態様では、本発明は、２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、そのようなベクターを含むｒＡＡＶ粒子ならびにそれを必要とする対象において２１ＯＨＤを治療するためにそのようなベクターおよび粒子を使用する方法を提供する。

本明細書において使用されるセクションの見出しは、文書編成上の目的のものに過ぎず、記載される主題を限定するものとして解されるべきではない。特許、特許出願、論文、書籍、および専門書が挙げられるがそれに限定されない本明細書において参照される全ての文献、または文献の部分は、参照することにより全体があらゆる目的のために本明細書に明示的に組み込まれる。組み込まれる文献または文献の部分のうちの１つまたは複数が本出願における用語の定義と矛盾する用語を定義する場合、本出願に現れる定義が優先される。しかしながら、本明細書において参照されるあらゆる参考文献、論文、刊行物、特許、特許出願公開、および特許出願の言及は、それらが世界の任意の国において有効な先行技術を構成することまたは技術常識の部分を形成することの承認、または任意の形態の示唆ではなく、かつそのように解釈されるべきではない。

本明細書において、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比範囲、または整数範囲は、他に指し示さなければ、記載される範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むことが理解されるべきである。「約」という用語は、数または数値の直前にある場合、数または数値はプラスまたはマイナス１０％の範囲に及ぶことを意味する。本明細書において使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は、他に指し示さなければ、列記された要素の「１つまたは複数」を指すことが理解されるべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢の１つ、両方、またはその任意の組合せのいずれかを意味することが理解されるべきである。「および／または」という用語は、選択肢の１つ、または両方のいずれかを意味することが理解されるべきである。本明細書において使用される場合、「含む」（ｉｎｃｌｕｄｅ）および「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語は同義に使用される。

組換えＡＡＶベクターおよび粒子
一態様では、本発明は、処置を必要とする細胞への２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）核酸配列の送達用のウイルスベクターを提供する。したがって、一実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）および２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列（異種ポリヌクレオチドとも称される）を含む核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、ｒＡＡＶベクターに関する。本明細書において使用される場合、「作動可能な連結」または「作動可能に連結された」という用語は、そのように記載される成分がそれらの意図される方式で機能することを可能とするようなそれらの成分の物理的または機能的並置を指す。ポリヌクレオチドとの作動可能な連結における発現制御エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）の例において、関係性は、制御エレメントが核酸の発現をモジュレ―トするようなものである。より詳細には、例えば、作動可能に連結された２つのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の少なくとも１つが他の配列に対して生理学的効果を発揮できるような関係性で２つのＤＮＡが並んでいること（シスまたはトランス）を意味する。「作動可能に連結された」は、連結されている核酸配列が、連続し、または実質的に連続し、および、２つのタンパク質コーディング領域を連結するために必要な場合には連続し、かつリーディングフレームが揃っていることを意味することができる。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ヒト２１ＯＨタンパク質である２１ＯＨタンパク質を発現する。ＣＹＰ２１Ａ２遺伝子は２１ＯＨタンパク質をコードする。本明細書において使用される場合、２１ＯＨは、２１ＯＨタンパク質または前記タンパク質をコードする核酸配列を指すことができる。一部の場合には、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターにより発現される２１ＯＨタンパク質は天然（例えば、野生型）２１ＯＨタンパク質である。ヌクレオチド配列によりコードされる２１ＯＨタンパク質またはポリペプチドとしては、天然に存在する２１ＯＨタンパク質と同様の全長天然配列が挙げられる他に、機能的部分配列、改変形態または配列変種が天然の全長２１ＯＨタンパク質のある程度の機能性を保持する限り、これらの部分配列、改変形態または変種が挙げられる。本発明の方法および使用において、ｒＡＡＶベクター中のヌクレオチド配列によりコードされる２１ＯＨタンパク質およびポリペプチドは、その必要はないが、欠陥のある、または治療される対象においてその発現が不充分、もしくは欠損している内因性２１ＯＨタンパク質と同一であり得る。

一部の実施形態では、２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列（例えば、異種配列）は野生型ＣＹＰ２１遺伝子配列である。一部の実施形態では、２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列（例えば、異種配列）は、野生型ＣＹＰ２１遺伝子配列に関してコドン最適化されている。一部の実施形態では、本発明の２１ＯＨコーディングヌクレオチド配列はコドン最適化配列であり、かつ配列番号：５０を含むまたはからなる。

コドン最適化は、コードされるタンパク質の同じアミノ酸配列を維持しながらヌクレオチド配列が変化することを可能とするために遺伝コードにおける冗長性を利用する。一部の実施形態では、コドン最適化は、コードされるタンパク質の発現の増加または減少を促進するために実行される。これは、ヌクレオチド配列中のコドン用法を特定の細胞種のものに適応させ、それにより、細胞種における特定のｔＲＮＡの相対量におけるバイアスに対応する細胞のコドンバイアスの利点を用いることによりもたらされる。対応するｔＲＮＡの相対量にマッチするように適合させるようにヌクレオチド配列中のコドンを変化させることにより、発現を増加させることが可能である。反対に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞種において希少であることが既知であるコドンを選択することにより発現を減少させることが可能である。

一部の実施形態では、２１ＯＨタンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、野生型ｃＤＮＡ配列より安定であり、それにより、非ＡＡＶヌクレオチド配列が遺伝子療法を通じて転写機構に導入される場合に選択的にスプライシングされた変種または切断されたタンパク質を生成することが回避される。

一部の実施形態では、２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列（例えば、異種配列）は、配列番号：１のアミノ酸配列をコードする（表１０を参照）。他の実施形態では、２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列は、配列番号：１に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列（例えば、異種配列）は、任意選択的にヘマグルチニン（ＨＡ）タグをコードするヌクレオチド配列に連結された、ヒト２１ＯＨ ｃＤＮＡである。ある特定の場合には、２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列（例えば、異種配列）は、タグ、例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＵＡ、ｃＭｙｃ、または任意の好適なタグをコードするヌクレオチド配列に連結されている。「ＣＹＰＨＡ」は、ＨＡタグをコードする配列に融合した２１ＯＨ導入遺伝子を指すことができる。

「同一性」、「相同性」という用語およびその文法的変形は、２つまたはより多くの参照される実体が、それらが「アライメントされた」配列である場合に同じであることを意味する。したがって、例として、２つのポリペプチド配列が同一である場合、それらは、少なくとも参照される領域または部分内において、同じアミノ酸配列を有する。２つのポリヌクレオチド配列が同一である場合、それらは、少なくとも参照される領域または部分内において、同じポリヌクレオチド配列を有する。同一性は、配列の定義された区画（領域またはドメイン）にわたるものであり得る。同一性の「区画」または「領域」は、同じである２つまたはより多くの参照される実体の部分を指す。したがって、２つのタンパク質または核酸配列が１つまたは複数の配列区画または領域にわたり同一である場合、それらはその領域内において同一性を共有する。「アライメントされた」配列は、多くの場合に参照配列と比較して欠失したまたは追加の塩基またはアミノ酸（ギャップ）のための訂正を含有する、複数のポリヌクレオチドまたはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。

同一性は、配列の全長または配列の部分にわたるものであり得る。特定の態様では、同一性パーセントを共有する配列の長さは、２、３、４、５またはより多くの連続するポリヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などの連続するアミノ酸である。追加の特定の態様では、同一性を共有する配列の長さは、２０またはより多くの連続するポリヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５などの連続するアミノ酸である。さらなる特定の態様では、同一性を共有する配列の長さは、３５またはより多くの連続するポリヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０などの連続するアミノ酸である。いっそうさらなる特定の態様では、同一性を共有する配列の長さは、５０またはより多くの連続するポリヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１１０などの連続するポリヌクレオチドまたはアミノ酸である。

「相同的」または「相同性」という用語は、２つまたはより多くの参照される実体が所与の領域または部分にわたり少なくとも部分的な同一性を共有することを意味する。相同性または同一性の「区画、領域またはドメイン」は、２つまたはより多くの参照される実体の部分が相同性を共有しまたは同じであることを意味する。したがって、２つの配列が１つまたは複数の配列領域にわたり同一である場合、それらはこれらの領域において同一性を共有する。「実質的な相同性」は、分子が、参照分子、またはそれが相同性を共有する参照分子の関連／対応する領域もしくは部分の構造または機能（例えば、生物学的機能または活性）のうちの１つまたは複数の少なくとも部分的な構造または機能を有するまたは有すると予測されるように構造的または機能的に保存されていることを意味する。

２つの配列間の同一性（相同性）の程度は、コンピュータープログラムおよび数学的アルゴリズムを使用して確認することができる。配列同一性パーセント（相同性）を算出するそのようなアルゴリズムは、概しては、比較の領域または区画にわたる配列のギャップおよびミスマッチを考慮する。例えば、ＢＬＡＳＴ（例えば、ＢＬＡＳＴ ２．０）検索アルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）を参照；ＮＣＢＩを通じて公開されている）は、以下の通りの例示的な検索パラメーターを有する：ミスマッチ−２；ギャップオープン５；ギャップエクステンション２。ポリペプチド配列の比較のために、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、典型的には、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ ２５０、ＢＬＯＳＵＭ ６２またはＢＬＯＳＵＭ ５０などのスコアリングマトリックスと組み合わせて使用される。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）ならびにＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムもまた、同一性の程度を定量化するために使用される（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１３２：１８５（２０００）；およびＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５（１９８１））。Ｄｅｌａｕｎａｙベースのトポロジカルマッピングを使用するタンパク質の構造的類似性を定量化するためのプログラムもまた開発されている（Ｂｏｓｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３０４：３２０（２００３））。

本明細書に記載のｒＡＡＶベクターゲノム配列といったベクターゲノム配列は、１つまたは複数の「発現制御エレメント」を含み得る。典型的には、発現制御エレメントは、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす核酸配列である。ベクター内に存在する、プロモーターおよびエンハンサーなどの、本明細書に記載の発現制御エレメントといった制御エレメントは、適切な異種ポリヌクレオチド（例えば、２１ＯＨ遺伝子）の転写および／または翻訳を促進するために含まれる（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン用のスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレームの翻訳を可能とするための遺伝子の正しいリーディングフレームの維持など）。発現制御エレメントとしては、適切な転写開始、終了、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増進する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増進する配列；および所望の場合、コードされる生成物（例えば、２１ＯＨ）の分泌を増進する配列が挙げられる。一部の実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターゲノム配列はＫｏｚａｋ配列（例えば、ＲＮＡ Ｋｏｚａｋ配列に転写されるＤＮＡ配列）を含む。一部の実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターゲノム配列は、２１ＯＨタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流のＫｏｚａｋ配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ Ｋｏｚａｋ配列は、ＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号：４４）、ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号：４５）、ＣＣＡＣＣＡＵＧ（配列番号：４６）またはＣＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号：４７）を含むまたはからなる。

発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性などのレベルにおいて実行され得る。典型的には、転写をモジュレ―トする発現制御エレメントは、転写されるポリヌクレオチドの５’末端（すなわち、「上流」）の近くに並置される。発現制御エレメントはまた、転写される配列の３’末端（すなわち、「下流」）または転写物内（例えば、イントロン中）に位置し得る。発現制御エレメントは、転写される配列から離れた距離（例えば、２１ＯＨを発現するヌクレオチド配列から１００〜５００、５００〜１０００、２０００〜５０００、５０００〜１０，０００またはより多くのヌクレオチド）において位置することができ、かなりの距離においてさえ位置することができる。それにもかかわらず、ＡＡＶベクターのためのポリヌクレオチドの長さの制限により、そのような発現制御エレメントは、典型的には、２１ＯＨをコードするヌクレオチド配列から１〜１０００ヌクレオチド内にある。

機能的に、２１ＯＨをコードする作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現は、エレメントがヌクレオチド配列の転写、および適宜、転写物の翻訳をモジュレ―トするようにエレメント（例えば、プロモーター）により少なくとも部分的に制御可能である。発現制御エレメントの特定の例はプロモーターであり、これは通常、転写される配列の５’に位置する。発現制御エレメントの別の例はエンハンサーであり、これは転写される配列の５’、転写される配列の３’、または転写される配列内に位置し得る。

本明細書において使用される「プロモーター」は、組換え生成物（例えば、２１ＯＨ）をコードする核酸配列（例えば、異種ポリヌクレオチド）に隣接して位置する核酸配列を指すことができる。プロモーターは、典型的には、隣接配列、例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。プロモーターは、典型的には、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して異種ポリヌクレオチドから発現される量を増加させる。

本明細書において使用される「エンハンサー」は、２１ＯＨをコードするヌクレオチド配列に隣接して位置する配列を指すことができる。エンハンサーエレメントは、典型的には、プロモーターエレメントの上流に位置するが、ＤＮＡ配列（例えば、２１ＯＨをコードするヌクレオチド配列）の下流または該配列内において機能し、かつ位置することもできる。それゆえ、エンハンサーエレメントは、異種ポリヌクレオチドの１００塩基対、２００塩基対、または３００またはより多くの塩基対だけ上流または下流に位置し得る。エンハンサーエレメントは、典型的には、プロモーターエレメントにより付与される増加した発現のレベルより高くまで異種ポリヌクレオチドの発現を増加させる。

一部の実施形態では、発現制御エレメントは、多くの異なる細胞種においてポリヌクレオチドの発現を推進することができる遍在的な、構成的なまたは乱雑な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。そのようなエレメントとしては、サイトメガロウイルス／β−アクチンハイブリッド（例えば、ＣＡＧ、ＣＢ６もしくはＣＢＡ）プロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーターおよび／もしくはエンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターおよび／もしくはエンハンサー配列ならびに様々な哺乳動物細胞種において活性の他のウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、または天然に存在しない合成エレメント（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ、Ｃｅｌｌ、４１：５２１〜５３０（１９８５）を参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ １プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＢＡプロモーターと連結された最初期ＣＭＶエンハンサー（Ｂｅｌｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１７（９）：１１６２〜１１７４（２０１０））、およびＣＢｈプロモーター（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２２（９）：１１４３〜１１５３（２０１１））が挙げられるがそれに限定されない。ある特定の態様では、本発明のｒＡＡＶは、ＣＭＶエンハンサーの部分、ニワトリベータアクチンプロモーターの部分、およびＵＢＣエンハンサーの部分を含有する合成ＣＡＳＩプロモーターを含む。例えば、ＷＯ２０１２／１１５９８０を参照。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号：２または配列番号：２に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含むＣＡＧプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号：３または配列番号：３に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含むＰＧＫプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号：４８または配列番号：４８に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含むＣＢ６プロモーター配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号：４９または配列番号：４９に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含むＣＢＡプロモーター配列を含む。プロモーター配列の非限定的な例について表１０を参照。

誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能とし、外因的に供給される化合物、温度などの環境要因、または特定の生理学的状態の存在、急性期、細胞の特定の分化状態により、または複製細胞においてのみ、調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導性システムは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＣｌｏｎｔｅｃｈが挙げられるがそれに限定されない様々な商用供給元から入手可能である。多くの他のシステムが記載されており、当業者により容易に選択され得る。外因的に供給される化合物により調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ｓｈｅｅｐ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム；エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制性システム、テトラサイクリン誘導性システム、ＲＵ４８６誘導性システムおよびラパマイシン誘導性システムが挙げられる。緊密に調節され、かつ２１ＯＨ発現が所望される特定の標的細胞種に特異的な任意の種類の誘導性プロモーターが使用されてもよい。

発現制御エレメント（例えば、プロモーター）としては、本明細書において「組織特異的発現制御エレメント／プロモーター」と称される、特定の組織または細胞種において活性のものが挙げられる。組織特異的発現制御エレメントは、典型的には、特定の細胞または組織（例えば、副腎、副腎皮質、肝臓、脳、中枢神経系、脊髄、目、網膜、骨、筋肉、肺、膵臓、心臓、腎臓細胞など）において活性である。発現制御エレメントは、典型的には、特定の細胞、組織または臓器種に特有の、転写活性化因子タンパク質、または転写の他の調節因子により認識されるので、これらの細胞、組織または臓器において活性である。したがって、一部の場合には、本発明のｒＡＡＶベクターは、宿主細胞（例えば、副腎細胞）中での２１ＯＨをコードするヌクレオチド配列タンパク質の発現を指令するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、副腎細胞は副腎皮質細胞である。一部の実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターは、２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列は、副腎皮質細胞または副腎髄質細胞において発現が特異的なプロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターは、２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列は、対象の副腎（例えば、副腎皮質もしくは副腎髄質）、肝臓または卵巣において発現が特異的なプロモーターに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターは、２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含み、非ＡＡＶヌクレオチド配列は、副腎幹細胞（例えば、副腎皮質幹細胞）または副腎前駆細胞において発現が特異的なプロモーターに作動可能に連結されている。

本発明のｒＡＡＶベクターにおいて有用な調節配列はまた、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と２１ＯＨ遺伝子との間に位置する、イントロンを含有してもよい。１つの望ましいイントロン配列はＳＶ−４０に由来し、ＳＤ−ＳＡと称される１００ｂｐのミニイントロンスプライスドナー／スプライスアクセプターである。一態様では、ｒＡＡＶベクターは転写後調節エレメントを含む。転写後調節エレメントの一例はウッドチャック肝炎ウイルス転写後エレメント（ＷＰＲＥ）である。（例えば、ＷａｎｇおよびＶｅｒｍａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、９６：３９０６〜３９１０（１９９９）を参照）。ある特定の実施形態では、転写後調節エレメントは、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＢＶＰＲＥ）またはＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）である。一部の実施形態では、ＷＰＲＥまたはＨＢＶＰＲＥ配列は、ＵＳ６，１３６，５９７またはＵＳ６，２８７，８１４に開示されるＷＰＲＥまたはＨＢＶＰＲＥ配列のいずれかである。一部の実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、

を含むまたはからなる。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはポリＡシグナルを含む。ポリＡシグナルは、ＳＶ−４０、ヒトおよびウシが挙げられるがそれに限定されない多くの好適な種に由来してもよい。

ｒＡＡＶベクター中に含まれてもよい別の有用な調節成分は内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列、または他の好適なシステムは、単一の遺伝子転写物から１つより多くのポリペプチドを製造するために使用されてもよい。ＩＲＥＳ（または他の好適な配列）は、１つより多くのポリペプチド鎖を含有するタンパク質を製造するためまたは同じ細胞からもしくは同じ細胞内で２つの異なるタンパク質を発現するために使用される。例示的なＩＲＥＳはポリオウイルス内部リボソーム進入配列である。ＩＲＥＳは、ｒＡＡＶベクター中の２１ＯＨ導入遺伝子の５’または３’に位置してもよい。他の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、単一のプロモーターからの複数のポリペプチドの発現を可能とする２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。

組換え「ベクター」または「ｒＡＡＶベクター」は、ウイルスから野生型ゲノムを除去し、それを異種ポリヌクレオチド配列（例えば、２１ＯＨを発現する治療遺伝子発現カセット）などの非天然の核酸で置換する分子的方法を使用することによりＡＡＶなどのウイルスの野生型ゲノムに由来する。典型的には、ＡＡＶについて、野生型ＡＡＶゲノムの１つまたは両方の逆末端反復配列（ＩＴＲ）配列はＡＡＶベクター中に保持される。ウイルスゲノムの全て（または部分）がウイルスゲノム核酸に関して非天然配列で置換されているので、ｒＡＡＶベクターはウイルスゲノムから区別され得る。異種ポリヌクレオチドなどの非天然配列の組込みは、したがって、「組換え」ベクターとしてウイルスベクターを定義し、ＡＡＶの場合、「ｒＡＡＶベクター」と称され得る。２１ＯＨをコードする核酸分子を含むｒＡＡＶベクターはまた、「ＣＹＰ２１ベクター」または「２１ＯＨベクター」と称されることがある。文脈から明らかなように、「ベクター」は、単離された組換えヌクレオチド配列または組換えヌクレオチド配列を含むＡＡＶ粒子もしくはビリオンを指すことがある。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）のためのいかなる結合部位も含まない。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、２１ＯＨタンパク質の発現が所望されない（すなわち、脱標的化）細胞において発現されるｍｉＲＮＡのための１、２、３、４、５またはより多くの結合部位を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ｍｉＲ−１２２のための１つまたは複数の結合部位を含む。２１ＯＨコーディング配列へのｍｉＲ−１２２の結合は、ｍｉＲ−１２２が非常に多く存在する肝細胞においてこの配列の発現を低減することがある（ＴｈａｋｒａｌおよびＧｈｏｓｈａｌ、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１５；１５（２）：１４２〜１５０）。

ｒＡＡＶ核酸配列は、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの、細胞のその後の感染（形質転換）のためにウイルス（本明細書において「粒子」または「ビリオン」と称されることもある）中にパッケージングされ得る。組換えベクター配列がＡＡＶ粒子にキャプシド化またはパッケージングされる場合、粒子は「ｒＡＡＶ」と称され得る。そのような粒子またはビリオンは、典型的には、ベクターゲノムをキャプシド化またはパッケージングするタンパク質を含む。特定の例としては、ウイルスエンベロープタンパク質、およびＡＡＶの場合、キャプシドタンパク質が挙げられる。

本明細書に記載のｒＡＡＶベクターおよび粒子のＡＡＶ成分は、様々なＡＡＶ血清型から選択されてもよい。ある特定の場合には、ｒＡＡＶベクターは、ｒｈ１０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはｒｈ７４血清型からのＡＡＶ核酸配列を含んでもよい。これらのＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用してＡＡＶ血清型から容易に単離され得る。そのようなＡＡＶは、単離され得るか、または学問的な、商用の、もしくは公的な供給元（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得られ得る。代替的に、ＡＡＶ配列は、文献中、または、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）、もしくはＰｕｂＭｅｄなどのデータベース中で入手可能なものなどの公開された配列を参照することにより合成または他の好適な手段を通じて得られ得る。

ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、ＵＳ７，９０６，１１１またはＵＳ７，６２９，３２２（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるようなＡＡＶ核酸配列またはＡＡＶタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、ＵＳ７，２８２，１９９、ＵＳ９，５８７，２５０またはＵＳ９，６７７，０８９（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるような、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ８またはその変種からのＡＡＶ核酸配列またはＡＡＶタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、ＵＳ７，１９８，９５１（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるような、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ９またはその変種からのＡＡＶ核酸配列またはＡＡＶタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、ＵＳ９，８４０，７１９（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるような、ＡＡＶ血清型ｒｈ７４またはその変種からのＡＡＶ核酸配列またはＡＡＶタンパク質を含む。

一部の態様では、本発明のｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、２つのＩＴＲ配列を含む。ある特定の場合には、ＡＡＶ ＩＴＲは、ｒｈ１０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ７４または他のＡＡＶ血清型が挙げられるがそれに限定されない任意のＡＡＶ血清型から選択されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、１つまたは２つのＡＡＶ２ ＩＴＲの配列を含むゲノムを含む。

本発明はさらに、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。したがって、一部の態様では、本発明は、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲおよび２１ＯＨタンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列（異種ポリヌクレオチドとも称される）を含む核酸分子を含むｒＡＡＶ粒子であって、非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、ｒＡＡＶ粒子に関する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ｒｈ１０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはｒｈ７４または他のＡＡＶ血清型からの少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含む。

一実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ヒト２１ＯＨ ｃＤＮＡ、ＡＡＶ２からのＩＴＲ、ならびにサイトメガロウイルス最初期遺伝子からのエンハンサー、ニワトリβ−アクチン遺伝子からのプロモーター、スプライスドナーおよびイントロンからなるＣＡＧプロモーター、ならびにウサギβ−グロビン遺伝子からのスプライスアクセプターを含むｒｈ１０ ＡＡＶベクターである。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号：１を含む２１ＯＨタンパク質をコードする核酸配列および配列番号：２を含むまたはからなるＣＡＧプロモーターを含む。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ヒト２１ＯＨ ｃＤＮＡ、ＡＡＶ２からのＩＴＲ、およびＰＧＫプロモーターを含むｒｈ１０ ＡＡＶベクターである。別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号：１を含む２１ＯＨタンパク質をコードする核酸配列および配列番号：３を含むまたはからなるＰＧＫプロモーターを含む。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ１キャプシドならびにヒト２１ＯＨ ｃＤＮＡ、ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＣＢＡまたはＣＢ６プロモーターおよび、任意選択的に、１つまたは２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む核酸分子を含む。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、実施例９に記載のｓｓＡＡＶ１−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ１−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶ１−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶ１−ＣＢＡ−ＣＹＰ２１またはＡＡＶ１−ＣＢ６−ＣＹＰ２１ベクターである。他の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ５キャプシドならびにヒト２１ＯＨ ｃＤＮＡ、ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＣＢＡまたはＣＢ６プロモーターおよび、任意選択的に、１つまたは２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む核酸分子を含む。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、実施例７に記載のｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ５−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶ５−ＣＢＡ−ＣＹＰ２１またはＡＡＶ５−ＣＢ６−ＣＹＰ２１ベクターである。さらに他の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ヒト２１ＯＨ ｃＤＮＡ、ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＣＢＡまたはＣＢ６プロモーターおよび、任意選択的に、１つまたは２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含むＡＡＶ６ベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶ６−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶ６−ＣＢＡ−ＣＹＰ２１またはＡＡＶ６−ＣＢ６−ＣＹＰ２１ウイルスである。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ８キャプシドならびにヒト２１ＯＨ ｃＤＮＡ、ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＣＢＡまたはＣＢ６プロモーターおよび、任意選択的に、１つまたは２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む核酸分子を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶ８−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶ８−ＣＢＡ−ＣＹＰ２１またはＡＡＶ８−ＣＢ６−ＣＹＰ２１ウイルスである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ヒト２１ＯＨ ｃＤＮＡ、ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＣＢＡまたはＣＢ６プロモーターおよび、任意選択的に、１つまたは２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含むＡＡＶ９ベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶ９−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶ９−ＣＢＡ−ＣＹＰ２１またはＡＡＶ９−ＣＢ６−ＣＹＰ２１ベクターである。追加の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ１０キャプシドならびにヒト２１ＯＨ ｃＤＮＡ、ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＣＢＡまたはＣＢ６プロモーターおよび、任意選択的に、１つまたは２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む核酸分子を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶ１０−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶ１０−ＣＢＡ−ＣＹＰ２１またはＡＡＶ１０−ＣＢ６−ＣＹＰ２１ウイルスである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ｒｈ１０ ＡＡＶキャプシドならびにヒト２１ＯＨ ｃＤＮＡ、ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＣＢＡまたはＣＢ６プロモーターおよび、任意選択的に、１つまたは２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む核酸分子を含む。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、実施例１に記載のＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１Ａ２−ＨＡウイルスである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶｒｈ１０−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１、ＡＡＶｒｈ１０−ＣＢＡ−ＣＹＰ２１またはＡＡＶｒｈ１０−ＣＢ６−ＣＹＰ２１ベクターである。これらの任意の実施形態では、プロモーターは、配列番号：２、３、４８もしくは４９または配列番号：２、３、４８もしくは４９に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含むまたはからなるものであってもよい。これらの任意の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、Ｋｏｚａｋ配列を含んでもよい。一部の実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６または配列番号：４７を含むまたはそれに転写されるものであってもよい。これらの任意の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＨＢＶＰＲＥ配列またはＷＰＲＥ配列（例えば、配列番号：５１）をさらに含んでもよい。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、Ｋｏｚａｋ配列を含みかつさらにｍｉＲ−１２２結合配列を含むまたは含まない、ＣＢＡプロモーターの制御下のヒト２１ＯＨをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含むＡＡＶ５血清型ベクターまたは粒子である。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、実施例１３に記載のＡＡＶ５−ＣＢＡ−Ｋｏｚａｋ−ＣＯｈＣＹＰ２１−ｍｉＲ１２２ベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたは粒子は、ＡＡＶ５−ＣＢＡ−Ｋｏｚａｋ−ｈＣＹＰ２１、ＡＡＶ５−ＣＢＡ−Ｋｏｚａｋ−ｈＣＹＰ２１−ｍｉＲ１２２またはＡＡＶ５−ＣＢＡ−Ｋｏｚａｋ−ＣＯｈＣＹＰ２１ベクターである。これらの任意の実施形態では、コドン最適化ヌクレオチド配列は配列番号：５０を含んでもよく、かつ、Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６または配列番号：４７を含むまたはそれに転写されるものであってもよい。これらの任意の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＨＢＶＰＲＥ配列またはＷＰＲＥ配列（例えば、配列番号：５１）をさらに含んでもよい。

ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３および超可変領域といったｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０といったｒｅｐタンパク質、ならびにこれらのタンパク質をコードする配列を含んでもよい。これらのＡＡＶ成分は、様々なベクターシステムおよび宿主細胞において容易に利用され得る。そのような成分は、単独で、他のＡＡＶ血清型配列もしくは成分と組み合わせて、または非ＡＡＶウイルス配列からのエレメントと組み合わせて使用されてもよい。本明細書において使用される場合、人工的なＡＡＶ血清型としては、天然に存在しないキャプシドタンパク質を有するＡＡＶが挙げられるがそれに限定されない。そのような人工的なキャプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１キャプシドタンパク質の断片）を、異なる選択されたＡＡＶ血清型、同じＡＡＶ血清型の非連続部分、非ＡＡＶウイルス供給源、または非ウイルス供給源から得られ得る異種配列と組み合わせて使用して任意の好適な技術により生成されてもよい。人工的なＡＡＶ血清型は、シュードタイプＡＡＶ、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド、または「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであってもよいがそれに限定されない。１つのＡＡＶのキャプシドが異種キャプシドタンパク質で置換されたシュードタイプベクターは本発明において有用である。一実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ２／５である。別の実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ２／８である。例えば、Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１８（７）：６３７〜６４５（２０１１）；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７６（２）：７９１〜８０１（２００２）を参照。

一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法において有用なベクターは、最小で、選択されたＡＡＶ血清型キャプシド、またはその断片をコードする配列を含有する。一部の実施形態では、有用なベクターは、最小で、選択されたＡＡＶ血清型ｒｅｐタンパク質、またはその断片をコードする配列を含有する。任意選択的に、そのようなベクターは、ＡＡＶ ｃａｐタンパク質およびｒｅｐタンパク質の両方を含有してもよい。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐの両方を備えたベクターにおいて、ＡＡＶ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ ｃａｐ配列の両方は１つの血清型のものであり得る。代替的に、ｒｅｐ配列が１つのＡＡＶ血清型からのものであり、かつｃａｐ配列が異なるＡＡＶ血清型からのものであるベクターが使用されてもよい。一実施形態では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、別々の供給源（例えば、別々のベクター、または宿主細胞およびベクター）から発現される。別の実施形態では、これらのｒｅｐ配列は、異なるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合して、ＵＳ７，２８２，１９９（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）に記載のＡＡＶ２／８などのキメラＡＡＶベクターを形成している。

好適なｒＡＡＶは、本明細書に定義されるような、ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質、またはその断片をコードする核酸配列；機能的なｒｅｐ遺伝子；最小で、ＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）および２１ＯＨ（ＣＹＰ２１Ａ２）核酸配列から構成される核酸分子；ならびにＡＡＶキャプシドタンパク質への核酸分子のパッケージングを可能とする充分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することにより生成され得る。一部の態様では、本発明は、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子を含む宿主細胞を提供する。ＡＡＶキャプシド中にｒＡＡＶベクターをパッケージングするために宿主細胞中に存在することが必要とされる成分は、トランスで宿主細胞に提供されてもよい。代替的に、必要とされる成分（例えば、ベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）の任意の１つまたは複数は、当業者に公知の方法を使用して必要とされる成分の１つまたは複数を含有するように操作された安定な宿主細胞により提供されてもよい。最も好適には、そのような安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下の必要とされる成分を含有する。しかしながら、必要とされる成分は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。好適な誘導性および構成的プロモーターの例は、非ＡＡＶヌクレオチド配列、すなわち２１ＯＨと共に使用するために好適な調節エレメントの上記の議論において、本明細書において提供される。さらに別の代替では、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下の選択された成分および１つまたは複数の誘導性プロモーターの制御下の他の選択された成分を含有してもよい。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下のＥ１ヘルパー機能を含有する）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下のｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞が生成されてもよい。また他の安定な宿主細胞は、当業者により生成され得る。

本発明のｒＡＡＶを製造するために必要とされるｒＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、その中に含まれる配列を移入する任意の遺伝子エレメントの形態でパッケージング宿主細胞に送達されてもよい。選択された遺伝子エレメントは、本明細書に記載の方法といった任意の好適な方法により送達されてもよい。本発明の任意の実施形態を構築するために使用される方法は、核酸マニピュレーションの技術を有する者に公知であり、遺伝子操作、組換え操作および合成技術が挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙを参照。同様に、ｒＡＡＶ粒子を生成する方法は周知である。例えば、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０〜５３２（１９９３）およびＵＳ５，４７８，７４５（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）を参照。

一態様では、本発明は、ｒＡＡＶ粒子を製造する方法であって、（ａ）本明細書に記載されるような２１ＯＨを発現するｒＡＡＶベクターゲノムを含むまたはからなる核酸分子、（ｂ）ＡＡＶ ｒｅｐをコードする核酸分子、（ｃ）少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸分子および（ｄ）ｒＡＡＶ粒子にｒＡＡＶベクターゲノムをパッケージングするための充分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。

本発明のｒＡＡＶ粒子は、当該技術分野において公知の任意の方法により精製されてもよい。一実施形態では、ｒＡＡＶウイルスは、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製されてもよい。例えば、ＵＳ２０１８／０１６３１８３ Ａ１を参照。

組換えＡＡＶベクターおよび粒子の使用
本発明は、２１ＯＨの欠損または機能不良により特徴付けられる障害または疾患を有する対象に治療的利益を提供するための本明細書に記載されるような２１ＯＨをコードする核酸分子を含むｒＡＡＶの方法および使用を包含する。一部の態様では、方法は、必要とする対象に治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶを投与し、それにより、対象において２１ＯＨの欠損または機能不良により特徴付けられる前記障害または前記疾患を治療することを含む。

一部の場合には、本発明は、それを必要とする対象において２１ＯＨを発現させる方法であって、対象に治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または前記粒子を含む医薬組成物を投与し、それにより、対象において２１ＯＨを発現させることを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において２１ＯＨの発現を増加させる方法であって、対象に治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または前記粒子を含む医薬組成物を投与し、それにより、対象において２１ＯＨの発現を増加させることを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶは、対象の副腎（例えば、副腎皮質もしくは副腎髄質）、肝臓または卵巣において２１ＯＨの発現を引き起こしまたは２１ＯＨの発現を増加させる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶは、対象の副腎幹細胞（例えば、副腎皮質幹細胞）または副腎前駆細胞において２１ＯＨの発現を引き起こしまたは２１ＯＨの発現を増加させる。

本発明は、２１−ヒドロキシラーゼ欠損症（２１ＯＨＤ）を有する対象を治療する方法であって、対象に治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または前記粒子を含む医薬組成物を投与し、それにより、対象において２１ＯＨＤを治療することを含む、方法を想定する。治療方法は、投与するステップの前に２１ＯＨＤを有する対象を選択することをさらに含んでもよい。一部の実施形態では、対象は、疾患の１つまたは複数の症状を有しないとしても、（例えば、遺伝子検査または生理学的検査により）２１ＯＨＤを有するとしてスクリーニングされかつ同定または診断されてもよい。他の実施形態では、対象は、２１ＯＨＤの１つまたは複数の症状を有する。ある特定の実施形態では、対象は、ＣＹＰ２１Ａ２遺伝子中に突然変異を有する。一実施形態では、対象は、ＣＹＰ２１Ａ２遺伝子中に機能欠失型突然変異を有する。ある特定の実施形態では、対象は、機能的なＣＹＰ２１Ａ２遺伝子と密接に関連した非機能的なＣＹＰ２１Ａ１Ｐ偽遺伝子との間の遺伝子変換または組換えにより引き起こされるＣＹＰ２１Ａ２遺伝子における欠陥を有する。

一部の実施形態では、本発明は、２１ＯＨＤ（または先天性副腎過形成症、ＣＡＨ）を有する対象において２１ＯＨＤ（またはＣＡＨ）の症状を治療し、低減し、改善し、その進行を緩慢化させまたは該症状を予防する方法であって、対象に治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または前記粒子を含む医薬組成物を投与し、それにより、対象において２１ＯＨＤの症状を治療し、低減し、改善し、その進行を緩慢化させまたは該症状を予防することを含む、方法を提供する。２１ＯＨＤ（またはＣＡＨ）の症状の非限定的な例としては、生殖器および筋肉量の男性化、乳児期の塩喪失および脱水、性的不全（古典的形態）および多毛症、ざ瘡、ならびに生殖力の減少（古典的および非古典的形態）が挙げられる。男性患者において、２１ＯＨＤ（またはＣＡＨ）の症状の非限定的な例としては、低身長および早期男性化が挙げられる。ヒト身体の性器の男性化の程度を測定するためにプラダー分類システムが使用される。一部の実施形態では、本発明の方法により治療される対象は、プラダーのステージＩＶまたはＶの形態の２１ＯＨＤ（またはＣＡＨ）を罹患している。

本明細書に記載の任意の治療方法において、２１ＯＨをコードする核酸分子を含むｒＡＡＶ粒子または前記粒子を含む医薬組成物は、副腎皮質の脈管系または副腎皮質自体に前記ｒＡＡＶ粒子を導入する任意の手段により対象に投与されてもよい。一部の実施形態では、２１ＯＨをコードする核酸分子を含むｒＡＡＶ粒子または前記粒子を含む医薬組成物は、静脈内に、直視下手術もしくは腹腔鏡検査法を介して副腎への直接注射により、カテーテル法を介して副腎動脈への注射により対象に投与されてもよい。一部の実施形態では、副腎への直接注射は副腎皮質への直接注射である。

ある特定の態様では、本明細書に記載されるような２１ＯＨをコードする核酸分子を含むｒＡＡＶ粒子または前記粒子を含む医薬組成物は、先天性副腎過形成症（ＣＡＨ）を患う対象を治療するために使用されてもよい。２１ＯＨの欠損は、多くの場合、副腎に影響する遺伝性障害のファミリーであるＣＡＨに繋がる。ＣＡＨは、重篤なまたは軽度の形態において対象に存在し得る。古典的ＣＡＨと呼ばれる重篤な形態は、通常、新生児期または早期小児期において検出される。非古典的ＣＡＨ（ＮＣＡＨもしくはＮＣＣＡＨ）または遅発発症ＣＡＨと呼ばれるより軽度の形態は、乳児期から成人期までの任意の時点において症状を引き起こすことがある（例えば、Ｋｕｒｔｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、９（１）：１〜７（２０１７）を参照）。本発明のｒＡＡＶは、古典的ＣＡＨまたは非古典的ＣＡＨを有する対象を治療するために使用されてもよい。古典的ＣＡＨを有する対象は、外部生殖器の胎児男性化、低いまたは欠如したグルココルチコイド産生およびミネラロコルチコイド産生を経験することがあり、かつ大過剰のアンドロゲンを産生することがある。非古典的ＣＡＨを有する対象は、胎児男性化ならびにコルチゾールおよびアルドステロンの欠陥を有することなくアンドロゲンの増加した産生を経験することがある。

コルチゾールは、副腎により産生されるステロイドである。コルチゾールは、身体的および情動ストレスに応答するため、ならびに充分なエネルギー供給および血糖レベルを維持するために身体中で使用される。副腎は、脳の基部にある小さいエンドウ豆サイズの腺である下垂体により制御される。健常個体において、下垂体は、血流中に存在するコルチゾールが不充分な時に副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）を放出する。ＡＣＴＨは副腎を刺激してより多くのコルチゾールを産生させる。しかしながら、ＣＡＨを有する者は、前駆体１７−ヒドロキシプロゲステロン（１７−ＯＨＰ）をコルチゾールに変換するために必要とされる２１ＯＨを不充分な量で有する。結果として、下垂体は、コルチゾールの必要性を感じ続け、より多くのＡＣＴＨを放出する。これは１７−ＯＨＰの過多に繋がり、それが次に、副腎において過剰なアンドロゲン（男性化ステロイドホルモン）に変換される。そのため、対象は、影響されるステロイドホルモンの増加した循環レベルを決定することによりＣＡＨを有すると診断され得る。２１ＯＨＤの新生児スクリーニングは、典型的には、１７−ＯＨＰ測定を使用して達成される。さらに、ＣＡＨを有する対象は、１７−ＯＨＰの循環レベルを追跡することによりモニターされてもよい。したがって、一部の実施形態では、影響されるステロイドホルモンの循環レベルが、本明細書に記載されるような２１ＯＨをコードする核酸分子を含むｒＡＡＶ粒子または前記粒子を含む医薬組成物を用いる治療の前、間および／または後にＣＡＨを有する対象において測定されてもよい。対象における１７−ＯＨＰの循環レベルは、対象の診断のためおよび本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または医薬組成物を用いる対象の治療を開始または継続すべきかどうかについての決定を知らせるために使用されてもよい。

ある特定の実施形態では、対象は、ヒト、非ヒト霊長動物、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、マウスまたはラットであってもよい。対象は、ヒト女性またはヒト男性であってもよい。一部の実施形態では、対象はヒト乳児である。ある特定の場合には、対象は、約１か月齢、約２か月齢、約３か月齢、約４か月齢、約５か月齢、約６か月齢、約７か月齢、約８か月齢、約９か月齢、約１０か月齢、約１１か月齢または約１歳のヒト乳児である。一部の実施形態では、対象は、３か月齢未満、６か月齢未満、９か月齢未満、１歳未満または１８か月齢未満のヒト乳児であってもよい。

本明細書において使用される場合、「必要とする患者」または「必要とする対象」という用語は、本明細書において提供される２１ＯＨをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶまたはそのようなｒＡＡＶを含む組成物を用いる治療または改善に適する疾患、障害または状態のリスクがある、またはそれを患う患者または対象を指す。必要とする患者または対象は、例えば、２１ＯＨＤなどの２１ＯＨの機能不良と関連付けられる疾患を有すると診断された患者または対象であってもよい。対象は、２１ＯＨ遺伝子またはタンパク質において突然変異または機能不良を有してもよい。「対象」および「患者」は本明細書において交換可能に使用される。

本明細書において使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、障害、例えば、２１ＯＨＤ、もしくはその１つもしくは複数の症状の重篤度および／もしくは継続期間を低減しもしくは改善するため、障害の進行を予防するため、障害の退化を引き起こすため、障害と関連付けられる１つもしくは複数の症状の再発、発生、発症もしくは進行を予防するため、障害を検出するため、または別の療法（例えば、予防もしくは治療剤）の予防もしくは治療効果を増進しもしくは向上させるために充分な医薬物質、例えば、ｒＡＡＶの量を指す。有効量のｒＡＡＶは、例えば、２１ＯＨの発現を増加させ、かつ／または２１ＯＨＤと関連付けられる症状の１つもしくは複数をある程度まで緩和することができる。

本発明はさらに、対象において２１ＯＨの機能不良または欠損により特徴付けられる障害または疾患を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載の医薬物質（例えば、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶを含む医薬組成物）の使用を想定する。本発明はまた、対象において２１ＯＨの機能不良または欠損により特徴付けられる障害または疾患を治療するための、本明細書に記載の医薬物質（例えば、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶを含む医薬組成物）の使用を含む。

医薬組成物および投与経路
本発明のｒＡＡＶベクターまたは粒子は、投与のために好適な医薬組成物中に組み込まれ得る。一態様では、本発明は、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子（例えば、２１ＯＨをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ粒子）および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、当該技術分野において周知の経路を使用して投与された場合に概してアレルギー性または他の重篤な有害反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。動物、およびより詳細にはヒトにおいて使用するために米国連邦政府もしくは米国州政府の規制機関により承認されたまたは米国薬局方もしくは他の一般に認識される薬局方に列記された分子実体および組成物は、「薬学的に許容される」ものであると考えられる。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合性の、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。好適な担体は、当該分野における標準的な参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。そのような担体または希釈剤の一部の例としては、水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、５％のヒト血清アルブミンおよび適切な生理学的レベルにｐＨを維持するための他の緩衝液、例えば、ＨＥＰＥＳが挙げられるがそれに限定されない。薬学的に活性の物質（例えば、組換えウイルス粒子）のためのそのような媒体および剤の使用は当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体または剤が活性化合物と不適合な場合を除いて、組成物におけるその使用が想定される。補助活性化合物もまた組成物中に組み込まれ得る。

本明細書の全体を通じて、「ｖｇ」は「ウイルスゲノム」または「ベクターゲノム」を指すことができる。

本明細書に開示されるｒＡＡＶの投与のために使用され得る医薬組成物および送達システムの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （２００３） ２０ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９９０） １８ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ （１９９６） １２ｔｈ ｅｄ．、Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ、Ｎ．Ｊ．；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ （１９９３）、Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、Ｐａ．；ＡｎｓｅｌおよびＳｔｏｋｌｏｓａ ａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ （２００１） １１ｔｈ ｅｄ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．；ならびにＰｏｚｎａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （１９８０）、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．、ｐｐ．２５３〜３１５において見出すことができる。

本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように配合されてもよい。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈内投与、または注射が挙げられる。注射は、直視下手術もしくは腹腔鏡検査法を介する副腎への直接注射またはカテーテル法を介する副腎動脈への注射を含んでもよい。非経口（例えば、静脈内または注射を介する）適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：無菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および張度の調整用の剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチック製の複数用量バイアル中に封入され得る。

注射での使用のために好適な医薬組成物としては、無菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌注射溶液または分散液の即席調製用の無菌粉末が挙げられる。静脈内投与のために好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合に、組成物は無菌でなければならず、かつ、容易な注射針通過可能性が存在する程度まで流体であるべきである。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその好適な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによりもたらされ得る。

無菌注射溶液は、必要に応じて、上記に列記される成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒中に必要とされる量の活性化合物を組み込んだ後、濾過滅菌を行うことにより調製され得る。概して、分散液は、基本的な分散媒体および上記に列記したものからの必要とされる他の成分を含有する無菌のビヒクル中に活性化合物を組み込むことにより調製される。無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、調製の方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末をその以前に無菌濾過された溶液からもたらす。

注射のために、薬学的に許容される担体は液体であり得る。例示的な生理学的に許容される担体としては、無菌の発熱物質非含有水および無菌の発熱物質非含有リン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。様々なそのような公知の担体は、ＵＳ７，６２９，３２２（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）において提供される。一実施形態では、担体は等張性塩化ナトリウム溶液である。別の実施形態では、担体は平衡塩溶液である。一実施形態では、担体はＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリソルベート）を含む。ｒＡＡＶが長期間貯蔵される場合、それはグリセロールまたはＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリソルベート）２０の存在下で凍結されてもよい。

投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与単位形態において非経口組成物を配合することが特に有利である。本明細書において使用される投与単位形態は、治療される対象のための単位投与量として適した物理的に別々の単位であって、各単位が、必要とされる薬学的担体と共に所望の治療効果を生じさせるために算出された予め決定された量の活性剤（例えば、ｒＡＡＶ）を含有するものを指す。本発明の投与単位形態のための仕様は、活性剤（例えば、ｒＡＡＶ）の特有の特徴および達成すべき特定の治療効果、および個体の治療のためのそのような活性剤（例えば、ｒＡＡＶ）の調合の技術分野における本来的な制限により定められ、かつこれらに直接的に依存する。単位投与形態は、例えば、アンプルおよびバイアル内にあってもよく、アンプルおよびバイアルは、液体組成物、またはフリーズドライもしくは凍結乾燥状態の組成物を含んでもよく、例えば、無菌液体担体がｉｎ ｖｉｖｏでの投与または送達の前に加えられ得る。個々の単位投与形態は、複数用量のキットまたは容器中に含まれ得る。組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）配列、プラスミド、ベクターゲノム、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ）、およびその医薬組成物は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために単一または複数の単位投与形態に包装され得る。

組成物は、治療される区画のサイズ、使用されるウイルス価、投与経路、および方法の所望の効果に依存して、範囲内の全ての数を含めて、約５０μＬ〜約１ｍＬの体積において送達されてもよい。一実施形態では、体積は約５０μＬである。別の実施形態では、体積は約７０μＬである。別の実施形態では、体積は約１００μＬである。別の実施形態では、体積は約１２５μＬである。別の実施形態では、体積は約１５０μＬである。別の実施形態では、体積は約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、体積は約２００μＬである。別の実施形態では、体積は約２５０μＬである。別の実施形態では、体積は約３００μＬである。別の実施形態では、体積は約４５０μＬである。別の実施形態では、体積は約５００μＬである。別の実施形態では、体積は約６００μＬである。別の実施形態では、体積は約７５０μＬである。別の実施形態では、体積は約８５０μＬである。別の実施形態では、体積は約１０００μＬである。

一部の実施形態では、プロモーター配列の制御下の所望の導入遺伝子（例えば、２１ＯＨ）をコードする核酸配列を有するｒＡＡＶの有効濃度は、約１０^８〜約１０^１３ベクターゲノム／ミリリットル（ｖｇ／ｍＬ）の範囲内である。例えば、ｒＡＡＶ感染単位は、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３（１９８８）に記載されるように測定されてもよい。一部の実施形態では、濃度は約１．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ〜約１．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、濃度は約１．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ〜約１．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬである。一実施形態では、有効濃度は約１．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬである。別の実施形態では、有効濃度は約１．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬである。別の実施形態では、有効濃度は約２．８×１０^１１ｖｇ／ｍＬである。さらに別の実施形態では、有効濃度は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬである。さらなる実施形態では、有効濃度は約１．５×１０^１３ｖｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、毒性または有害な免疫応答などの望ましくない効果のリスクを低減するために最低有効濃度のウイルスが利用されることが望ましい。治療されている対象（例えば、ヒト）の身体状態、対象の年齢、特定の２１ＯＨ欠損障害および進行性の場合に障害が進行した程度を考慮して、これらの範囲内のまた他の投与量が主治医により選択されてもよい。

一部の実施形態では、２１ＯＨをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０^１１〜約１０^１４ｖｇの範囲内の用量において対象に投与される。一部の実施形態では、２１ＯＨをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子は、約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇまたは３×１０^１２ｖｇ／ｋｇの用量において対象に投与される。

２１ＯＨをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子を含む医薬組成物は、投与のための指示と共に容器、パック、またはディスペンサー中に含まれ得る。

本発明を以下の実施例においてさらに記載するが、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。

実施例１：組換えアデノ随伴ウイルスベクターおよび粒子の構築および製造ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の処理
ヒト２１−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２１Ａ２）ｃＤＮＡをヘマグルチニン（ＨＡ）タグに融合し、ｐＡＡＶ２−ＣＡＧプラスミドにサブクローニングして、ＡＡＶ２からのウイルス逆末端反復配列およびサイトメガロウイルス／β−アクチンハイブリッド（ＣＡＧ）プロモーターを含むｐＡＡＶ２−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１Ａ２−ＨＡプラスミドを製造した。ＣＡＧプロモーターは、サイトメガロウイルス最初期遺伝子からのエンハンサー、ニワトリβ−アクチン遺伝子からのプロモーター、スプライスドナーおよびイントロン、ならびにウサギβ−グロビン遺伝子からのスプライスアクセプターからなるものであった。偽ベクターを生成するために使用したＣＡＧプロモーター下のβ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡの非コーディング配列を用いて偽プラスミドを構築した。ＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１Ａ２−ＨＡ（「ＣＹＰ２１」）および偽ベクターをＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＮａｎｔｅｓのＶｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにおいて以前に記載された通りに製造した。例えば、Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．、およびＳｅｎａ−Ｅｓｔｅｖｅｓ，Ｍ．（２０１２）．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ： Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ ２： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｍ．Ｒ．ＧｒｅｅｎおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｄｓ．） ｐｐ．１２０９〜１３１３．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６（２）：７９１〜８０１（２００２）を参照。ＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１Ａ２−ＨＡウイルスは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を有するゲノムを含有し、ｒｈ１０キャプシドタンパク質をコードする。

２．５％のウシ胎児血清、１５％のウマ血清、１％のグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎ）、ペニシリン−ストレプトマイシン１％を添加したＨａｍ Ｆ１０培地を用いてマウスＹ１副腎皮質腫瘍細胞を維持した。ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ ｌｅｓ Ｂａｉｎｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して細胞にｐＡＡＶ２−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１Ａ２−ＨＡ（「ｐＣＹＰ２１」）またはｐＡＡＶ２−ＣＡＧ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（「ｐＬｕｃ」）をトランスフェクトした。上清および細胞をトランスフェクションの４８ｈ後に回収した。

実施例１〜６および関連する図はまた、Ｐｅｒｄｏｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２４（５）：２７５〜２８１（２０１７）に記載されている。

実施例２：マウスモデルにおける２１−ヒドロキシラーゼ欠損症の概要および動物の処置手順
２１−ヒドロキシラーゼ欠損症（２１ＯＨＤ）のマウスモデルは、２１ＯＨ活性を欠いたＨ−２^ａｗ１８マウス（Ｃｙｐ２１^−／−）により提供される。遺伝的欠陥は、活性のＣｙｐ２１ａ１遺伝子と偽遺伝子との不均等な乗換えにより引き起こされて、Ｃｙｐ２１ａ１の部分欠失を含むハイブリッドＣｙｐ２１ａ１−Ｃｙｐ２１ａ２−ｐ遺伝子を結果としてもたらす（Ｒｉｅｐｅ ｅｔ ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２００５；１４６：２５６３〜２５７４）。Ｃｙｐ２１^−／−マウスは、異常な視床下部−下垂体−副腎フィードバック、副腎髄質および皮質の構造および機能の変化を有することが公知である（Ｔａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９９９；１４０：３３５４〜３３６２；Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ １９９９；１３：１１８５〜１１９４）。グルココルチコイドを投与しない場合、このマウスモデルにおけるＣｙｐ２１ａ１遺伝子の欠失は致死的であることが公知である。Ｃｙｐ２１^−／−マウスは、母親および子への早期のグルココルチコイド投与にもかかわらず極めて脆弱なままである。虚弱は、新生期を生き延びた成体Ｃｙｐ２１^−／−マウスにおいて原則のままである（Ｔａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９９９；１４０：３３５４〜３３６２）。

ヘテロ接合マウスを交配して、突然変異についてホモ接合のマウスを生成した。ホモ接合（Ｃｙｐ２１^−／−）マウス、ヘテロ接合（Ｃｙｐ２１^＋／−）および野生型（Ｃｙｐ２１^＋／＋）同腹子を実験および解析のために使用した。尾生検からのゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲベースのアッセイを使用してマウスの遺伝子型を確認した。全ての雌親に妊娠２０日目から新生児の生後７日目まで５μｇのデキサメタゾンの注射を与えた。子を１４日目まで２日毎にコルチコステロン（１日当たり５μｇ）およびフルドロコルチゾン（１日当たり０．０２５μｇ）を用いて処置した。この齢の後、１２ｈの明暗サイクル、随意の通常の齧歯動物ペレット食および水への自由なアクセスと共に温度および湿度を制御した動物施設中でマウスを維持した。雄マウスおよび雌マウスの両方を全ての実験において使用した。全ての動物手順および実験は、当地の倫理委員会（Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ＣＥＡ、ＣＥｔＥＡ）およびＦｒｅｎｃｈ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５０４０１ １１０１ ８９５８（ＡＰＡＦ１Ｓ＃４１０）．０１）により承認され、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）にしたがって行った。

実施例３：実験方法
動物手順

体内分布研究のために、イソフルラン（３％）を用いて成体対照マウスを麻酔して、体重１グラム当たり２×１０^１０ベクターゲノムの用量のＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＧＦＰの後眼窩注射による静脈内投与を可能とした。処置の３週後、マウスの腹腔内にペントバルビタールを注射し、冷却した生理食塩水溶液を用いて灌流させた。

遺伝子療法の研究のために、Ｃｙｐ２１^−／−マウスに体重１グラム当たり２×１０^１０ベクターゲノムの用量のＣＹＰ２１ベクターを与えた。Ｃｙｐ２１^−／−、Ｃｙｐ２１^＋／−およびＣｙｐ２１^＋／＋マウス同腹子に体重１グラム当たり２×１０^１０ベクターゲノムの用量の偽ベクターを注射した。

９：００〜１１：００ａｍに尿を収集した（膀胱マッサージ後）。尿が糞便または動物ケージからの他の材料で汚染されないことを確実にするように注意した。全ての試料をアリコート化し、直ちに−２０℃で凍結した。

処置の１８週後、マウスの腹腔内にペントバルビタールを注射し、冷却した生理食塩水溶液を用いて灌流させた。心臓内穿刺により血液を収集した。生化学および分子解析用の組織試料を液体窒素中で直ちに凍結した。組織学的解析のために、組織を４％のＰＦＡ中に後固定し、スクロース中で凍結保護し、ＯＣＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ ｓｕｒ Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）中に包埋し、ドライアイス中で冷却したイソペンタン中でスナップ冷却した。

病理組織診断
組織化学分析のために、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて１０μｍの凍結切片を染色した。

免疫蛍光および画像取得
緑色蛍光によるＧＦＰ検出を通じてＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＧＦＰベクターの発現を評価した。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＩ倒立顕微鏡（Ｃｈａｍｐｉｇｎｙ ｓｕｒ Ｍａｒｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）上で顕微鏡解析を行った。

ベクターコピー数（ＶＣＮ）の決定
製造者のプロトコールにしたがってＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して異なる組織からＤＮＡを抽出した。標準的な条件を使用してＰｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いるｑＰＣＲにより各組織について二倍体細胞当たりのベクターゲノムの量を決定した。ＣＹＰ２１Ａ２導入遺伝子（フォワード５’−ＡＣＡＧＴＣＡＴＣＡＴＴＣＣＧＡＡＣＣＴＣＣＡ−３’（配列番号：４）、リバース５’−ＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＧＴＴＣＴＴ−３’（配列番号：５））および宿主ゲノムのマウス脳由来神経栄養因子（フォワード５’−ＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＴＴ−３’（配列番号：６）、リバース５’−ＡＧＧＡＧＧＣＴＣＣＡＡＡＧＧＣＡＣＴＴＧＡ−３’（配列番号：７））に対してプライマーを標的化した。Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して増幅を行った。

定量的リアルタイムＰＣＲ
製造者のプロトコールにしたがってＰｒｅｃｅｌｌｙｓ２４ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｏｚｙｍｅ、Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ−ｅｎ−Ｙｖｅｌｉｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）およびＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してスナップ冷却した組織からトータルＲＮＡを抽出し、ＤＮＡｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて処理した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写によりｃＤＮＡを生成した。表１に記載のプライマーを用いてＰｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。マウスＴＡＴＡボックス結合タンパク質（Ｔｂｐ）をコードする遺伝子を内部標準として使用した。各遺伝子型について皮質細胞の量にしたがって未加工データを正規化した。
表１．プライマーペア

イムノブロット解析
組織またはＹ１細胞の抽出物を溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でホモジナイズした。総タンパク質抽出物（５μｇ）をｎｕｐａｇｅ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ ＮＰ０３２３ＢＯＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で分析した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、５％の脱脂乳を用いてブロッキングした後、以下の一次抗体：ヒトおよびマウスタンパク質を検出する２１−ヒドロキシラーゼに対するポリクローナル抗体（Ｃｏｒｇｅｎ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）、ＧＡＰＤＨに対する抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ；Ａｂ９４８４、１：３０００）とインキュベートした。ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ）に連結させた二次抗体抗マウスＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｖｅｌｉｚｙ Ｖｉｌｌａｃｏｕｂｌａｙ、Ｆｒａｎｃｅ）を１：３０００に希釈し、Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｍａｒｎｅｓ ｌａ Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いる反応の検出のために使用した。

ホルモンアッセイ
商用のプロゲステロンＥＩＡ（Ａｒｂｏｒ Ａｓｓａｙｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）を使用してＹ１上清およびマウス尿中のプロゲステロン濃度を測定した。クレアチニン濃度（Ｕｒｉｎａｒｙ Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ａｒｂｏｒ Ａｓｓａｙｓ）を使用して尿中プロゲステロン濃度を正規化した。

行動解析

遺伝子療法処置の１５週後に試験を行った。

尾懸垂試験。マウスを、逃げることも近くの表面を持つこともできないような姿勢でテープを用いて尾により懸垂させた。ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ ＸＴ １０．５（Ｎｏｌｄｕｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂ．Ｖ．、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）ビデオ追跡および解析ソフトウェアを用いて行動を追跡した。呼吸のために必要とされる運動を除いて全ての運動の非存在により定義される静止の継続期間を６分間測定した。

高架式十字迷路。２つの開いたアームおよび２つの閉じたアームからなる装置を１００ルクスの強度でオーバーヘッドランプにより間接的に照明した。試験のために、マウスを個々に中央の正方形に置き、迷路を６分間自由に探索させた。行動を記録し、ビデオ追跡ソフトウェアＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ １０．５（Ｎｏｌｄｕｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂ．Ｖ．）により解析した。行動試験後、１０％のエタノール溶液を用いて機器を洗浄した。評価したパラメーターは、オープンアームまたはクローズドアームにおいて過ごした時間、ヘッドディッピングの回数、立ち上がりの回数および総移動距離であった。

ロータロッド。加速ロータロッド装置（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、Ｇｅｍｏｎｉｏ、Ｉｔａｌｙ）を使用して運動の均衡および協調を決定した。動物の訓練は、４回転／分（ｒ．ｐ．ｍ．）での２分の１回のトライアルからなるものであった。動物を次に、４ｒ．ｐ．ｍ．から４０ｒ．ｐ．ｍ．へとロッドの速度を増加させて５分の３回の連続するトライアルにおいて試験した。トライアルの間にマウスを４５分間回復させた。マウスがロッドから落下するまでトライアルを続けた。落下までの潜時を記録した。このシーケンスを連続する３日繰り返した。行動試験後、１０％のエタノール溶液を用いて機器を洗浄した。

統計

マン−ホイットニー検定を用いて群間の比較を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）ソフトウェアを使用した。

実施例４：Ｃｙｐ２１ ^−／− マウスの身体的および生化学的表現型
１２％のＣｙｐ２１^−／−マウスのみが新生期を生き延びた。マウスを成体期の間に試験した。雌親および子のグルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）処置にもかかわらず、それらのＣｙｐ２１^−／−生存マウスは、対照またはヘテロ接合マウスと比較してより軽くかつ虚弱に成長した（図１Ａおよび図１Ｂ）。Ｃｙｐ２１^＋／−マウスおよびＣｙｐ２１^＋／＋マウスは研究の間に体重の同等の進展を有したので、それらのデータを比較用の「対照」群としてプールした。ロータロッドを用いて試験したＣｙｐ２１^−／−マウス自発運動活動性は正常であった（図２Ａ）。予想外なことに、Ｃｙｐ２１^−／−マウスは、尾懸垂試験の間の行動的絶望および高架式十字迷路試験における成績の低下などの不安およびうつ病様行動の形質を示した（図２Ｂ〜２Ｆ）。

Ｃｙｐ２１^−／−マウスの副腎は、対照マウスの副腎より２．１倍大きかった。副腎の構造は組織化不良であり、帯状分布および節の乱れを有した。副腎皮質の細胞は正常な数であったが、不均質な核を有して肥大および不規則な形状を示した（図６）。

２１−ヒドロキシラーゼの主な基質であるプロゲステロンは、Ｃｙｐ２１^−／−マウスの尿において上昇していた（正常の４４倍）（図１Ｃ）。

塩喪失は技術的制約に起因して精密に測定できなかったが、Ｒｅｎｉｎの発現はＣｙｐ２１^−／−マウスの腎臓において１６０倍増加し（図３Ｂ）、これらの動物を特徴付けるミネラロコルチコイド機能の喪失と関連付けられる慢性の塩喪失に対する劇的な腎臓応答を指し示した。すなわち、アルドステロン合成酵素（Ｃｙｐ１１ｂ２）の発現は、球状帯中に位置するＣｙｐ２１^−／−マウスの副腎において４０倍の増加を示し（図３Ａ）、これは免疫蛍光解析により確認された（図７）。Ｍｃ２ｒ、ＰＫＡサブユニット（Ｐｒｋａｒ１ａ、Ｐｒｋａｒ２ａ、Ｐｒｋａｒｃａ、Ｐｒｋａｒｃｂ）およびＳＦ−１遺伝子の発現は、対照マウスと比較してＣｙｐ２１^−／−マウスの副腎において増加した。Ｓｔａｒ、Ｃｙｐ１１ａ１、Ｈｓｄ３ｂ１およびＣｙｐ１１ｂ１の発現もまた有意に増加した（図３Ａ）。正常な成体マウスの副腎において発現されないＣｙｐ１７ａ１がＣｙｐ２１^−／−マウスにおいてわずかに発現された（図３Ａ）。

実施例５：副腎細胞におけるＣＹＰ２１の発現および機能
Ｙ１細胞株はステロイドを１１／８，２０ａ−ジヒドロキシプロゲステロンに代謝するが、２１−ヒドロキシル化ステロイド生成物を産生しない（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８５；８２：７８６０〜７８６４）。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ｐＣＹＰ２１プラスミドをトランスフェクトしたＹ１細胞は２１ＯＨタンパク質を発現し（図４Ａ）、非機能的なｐＬｕｃプラスミドをトランスフェクトしたＹ１細胞より低い上清中のプロゲステロン濃度を示した（図４Ｂ）。これらの細胞へのｐＣＹＰ２１のトランスフェクションは２１ＯＨの発現を結果としてもたらした。これは、トランスフェクトした細胞培養物において上清中のプロゲステロン濃度の減少を結果としてもたらし、形質導入された２１ＯＨがプロゲステロンの代謝を増加させたことを指し示す。これは、ＣＡＧプロモーターは機能的なレベルまでの２１ＯＨ遺伝子の発現を可能とすることを含意していた。

体重１グラム当たり２×１０^１０ベクターゲノムを用いた対照マウスへの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶｒｈ１０の静脈注射後、広範なＧＦＰ発現が副腎皮質の網状帯および束状帯において観察された（図５Ａ）。ＧＦＰを発現する細胞の割合は約３９％であった。心臓および肝臓もまたＧＦＰを発現したが（図８）、腎臓、性腺および脳はＧＦＰを発現しなかった。

体重１グラム当たり２×１０^１０ベクターゲノムのＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１Ａ２−ＨＡ（「ＣＹＰ２１」）ベクターまたはＡＡＶｒｈ１０−ｎｕｌｌ（偽）ベクターを成体Ｃｙｐ２１^−／−または対照マウスの静脈内に注射した。処置の１８週後、細胞数当たりのベクターコピー（ＶＣＮ）の平均数は、皮質および髄質を含む全副腎組織において０．１３±０．０９であった。ヒト２１−ヒドロキシラーゼは、対照マウスにおいて内因性２１ＯＨレベルより低いレベルでＣｙｐ２１^−／−マウスの副腎において検出された（図５Ｂ）。２１−ヒドロキシラーゼ酵素は、Ｃｙｐ２１^−／−マウスの組織化不良な束状帯中の多数の細胞において発現された。肝臓においてＶＣＮはほとんど検出されず、ＣＹＰ２１の発現は検出されなかった。発現は心臓において弱く、腎臓、性腺および脳において検出されなかった（表２）。
表２．ＣＹＰ２１ベクターを用いて処置したＣｙｐ２１^−／−マウスの末梢臓器における細胞当たりのＣＹＰ２１ベクターコピー数（ＶＣＮ）およびＣＹＰ２１ ｍＲＮＡ含量（ｎ＝１６）。

子の脆弱性およびマニピュレーションに応答した母親による殺傷のリスクによる実際的な理由からＣｙｐ２１^−／−子の後眼窩静脈にＡＡＶｒｈ１０ベクターを注射する試みは行わなかった。

実施例６：ＣＹＰ２１ベクターの効果
機能的なＣＹＰ２１ベクターを用いて処置したＣｙｐ２１^−／−マウスは、偽ベクターを注射したＣｙｐ２１^−／−マウスと比較した場合に、体重の早期かつ持続的な増加（図１Ａ）および身体的外見の向上を示した（図１Ｂ）。ＣＹＰ２１ベクターの注射後５週以内に、Ｃｙｐ２１^−／−マウスにおいてプロゲステロンレベルは４２％減少した後、研究の１５週まで正常に近いままであった（図１Ｃ）。ＣＹＰ２１ベクターを用いて処置したＣｙｐ２１^−／−マウスは尾懸垂試験に対する正常な反応を回復し、高架式十字迷路試験における成績の向上を示した（図２Ｂ〜２Ｆ）。

ＣＹＰ２１ベクター処置は、副腎形態の変化を矯正しなかった（図６）。

ＣＹＰ２１注射マウスは、腎臓においてｒｅｎｉｎ発現の大きな矯正を示し（図３Ｂ）、発現のレベルは２１−ヒドロキシラーゼ活性の回復後に１４倍減少した。これは、処置された動物が塩を保持することを可能とするミネラロコルチコイド機能の向上を反映した。

Ｃｙｐ２１^−／−マウスのＣＹＰ２１ベクター処置は、過剰発現されたＭｃ２ｒ、Ｐｒｋａｒ２ａ、Ｓｆ１、Ｓｔａｒ、Ｃｙｐ１７ａ１およびＣｙｐ１１ｂ２遺伝子の発現を正常に近いレベルまで減少させた（図３Ａ）。Ｐｒｋａｒ１ａ、Ｐｒｋａｃａ、Ｐｒｋａｃｂ、Ｈｓｄ３ｂおよびＣｙｐ１１ｂ１遺伝子の発現において有意な変化は観察されなかった（図３Ａ）。

したがって、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、全副腎組織中に存在する平均ＶＣＮの測定値は限られたものであったが、皮質のステロイド産生活性の大部分を回復させるために充分であった。これは、同じ動物において１５週にわたり研究した、正常に近い値への尿中のプロゲステロンの減少により示され、ＣＹＰ２１ベクター処置の持続的効果を示す（図１Ｃ）。

ＣＹＰ２１ベクター処置の前に起こった慢性の塩喪失を反映して、腎臓におけるＲｅｎｉｎ遺伝子の発現の劇的な増加が起こり、これはＣＹＰ２１ベクター処置により減少した（図３Ｂ）。したがって、ＣＹＰ２１ベクターで処置したＣｙｐ２１^−／−マウスは体重を増加させ、全般的外見を向上させた（図１Ａおよび図１Ｂ）。

Ｃｙｐ２１^−／−マウスへのＣＹＰ２１ベクターの投与は、以前に増加したプロゲステロン産生の正常の近くまでの変化に繋がり、これは、１５週間のＣＹＰ２１ベクター処置における最後の解析において依然として機能していた２１−ヒドロキシラーゼ活性の大きくかつ持続的な回復を反映した。

ストレスへの乏しい応答はＣｙｐ２１^−／−マウスの新たに報告された形質であり、これは副腎皮質による適切なグルココルチコイド応答の非存在に起因し得る。うつ病様形質の発生における視床下部−下垂体−副腎アクシスの顕著な役割が、グルココルチコイドもしくはコルチコトロピン放出ホルモンに対する遺伝学的に変化した受容体（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １９９８；２０：１０９３〜１１０２；Ｒｉｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００５；２５：６２４３〜６２５０；Ｂａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２０００；２４：４１０〜４１４）または副腎形成不全（Ｂｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００；９７：１４４８８〜１４４９３）を有するマウスにおいていくつかの研究により示されている。実際、これらのマウスモデルの全ては、独特のうつ病様の特徴およびストレス応答の調節異常を示す。理論によって縛れるものではないが、Ｃｙｐ２１^−／−マウスにおける観察によれば、若齢期の間の副腎による充分なグルココルチコイド分泌の欠如が、ストレス応答を永続的に変化させた可能性がある（Ｓａｐｏｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ ２０００；２１：５５〜８９）。これらのうつ病様の形質は、副腎皮質における２１ＯＨ活性を回復させるＡＡＶｒｈ１０ベクターを用いて処置したＣｙｐ２１^−／−マウスにおいて後退した（図２）。

Ｃｙｐ２１^−／−マウスは、両副腎の肥大、構造の崩壊（図６）ならびにステロイド産生酵素およびＡＣＴＨ依存性シグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子の発現の大きな変化を有した（図３Ａ）。副腎成長に対するＡＣＴＨの栄養的効果を考慮すると、副腎細胞の形態および遺伝子発現の大きな変化は、ＡＣＴＨの慢性的な上昇に起因した可能性がある。Ｃｙｐ２１^−／−子へのグルココルチコイドの早期投与は、少数のマウスが生後生き延びることを可能としたが、これらの変化を回避させるには不充分であった。これは、グルココルチコイド処置はコルチコトロピンの分泌に対して部分的にのみ抑制効果を有したことを示唆する。Ｃｙｐ２１^−／−マウスの副腎皮質にＡＡＶｒｈ１０ベクターにより形質導入された２１ＯＨは、代償的なステロイド産生酵素およびＡＣＴＨ依存性タンパク質の発現の大部分を矯正した。慢性の塩喪失をマッチする試みにおいてＣｙｐ２１^−／−マウスにおいて４０倍とかなり増加した、副腎皮質におけるアルドステロン合成酵素遺伝子および腎臓におけるｒｅｎｉｎ遺伝子の発現の増加は共に、ＣＹＰ２１ベクターで処置した動物において大きな減少を示した。

副腎機能に対するＣＹＰ２１ベクター処置の際立った効果は、形質導入されたＣＹＰ２１を発現する副腎皮質細胞の約３９％においてのみ起こったことは注目に値する。これは、細胞の一部分のみの機能的な回復は副腎のステロイド産生能力を実質的に矯正できること、および治療的利益を得るために全副腎皮質において２１ＯＨを発現させることは必要でないことを示唆する。限られた割合の細胞数におけるこの発現はまた、プロゲステロン産生の短時間の（Ｔａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９９；６：１８９８〜１９０３）または部分的な（Ｍａｃａｐａｇａｌ ｅｔ ａｌ．、Ａｂｓｔｒａｃｔ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ’ｓ ８４ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、２００２、ｐｐ１〜５０３；Ｎａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒ Ｊ ２０１６；６３：８９７〜９０４）矯正を可能とする以前の研究において観察された。対照的に、ＡＡＶｒｈ１０ベクターにより媒介される遺伝子療法のアプローチは、２１−ヒドロキシラーゼ発現の他の臓器へのあるとしても限られた広がりと共に、Ｃｙｐ２１^−／−マウスにおいて持続的な有効性を示した。

実施例７：ＡＡＶ５−ＰＧＫ ｒＡＡＶを用いた研究
ｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡベクターおよびｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＧＦＰベクターを製造した。これらのベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を有するゲノムを含有し、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質をコードする。表３に示すように、野生型マウス（Ｂ６）の静脈内（ｉ．ｖ．）および副腎内注射を介して３匹の非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））にこれらのｒＡＡＶを投与した。
表３．ＡＡＶ５−ＰＧＫ ｒＡＡＶの投与

ｒＡＡＶを用いて処置した動物について処置の３週後にＧＦＰおよびＣＹＰ２１ＨＡベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）値を決定した（表４；図９、図１２、図１４、図１６〜２１および図４１）。ＶＧＣは、ＮＨＰ０１について７〜９個の副腎切片、ＮＨＰ０２について８個の切片、ＮＨＰ０４について６０個の副腎キューブ、およびマウスでは副腎全体において算出した。製造者のプロトコールにしたがってＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して副腎（マウス）または副腎切片／キューブ（ＮＨＰ）からＤＮＡを抽出した。標準的な条件を使用してＰｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いるｑＰＣＲにより各試料について二倍体細胞当たりのベクターゲノムの量を決定した。ヒトＣＹＰ２１Ａ２導入遺伝子（フォワード５’−ＡＡＡＴＴＣＧＧＧＣＣＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧ−３’（配列番号：３８）、リバース５’−ＡＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＧＴＣＣＴＣ−３’（配列番号：３９））、宿主ゲノムのマカクアルブミン（フォワード５’− ＣＴＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＣＴＴ−３’（配列番号：４０）、リバース５’− ＣＴＴＴＧＧＣＡＴＡＧＣＡＴＴＣＡＴＧＡＧＧＡＴ−３’（配列番号：４１））、および宿主ゲノムのマウス脳由来神経栄養因子（フォワード５’−ＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＴＴ−３’（配列番号：４２）、リバース５’−ＡＧＧＡＧＧＣＴＣＣＡＡＡＧＧＣＡＣＴＴＧＡ−３’（配列番号：４３））に対してプライマーを標的化した。Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して増幅を行った。ヒトおよびマカクｃＤＮＡ配列のアライメント後に保存度がより低い断片においてヒト特異的なＣＹＰ２１Ａ２プライマーを設計した。マカク内因性ＣＹＰ２１ゲノムＤＮＡと比較してヒトフォワードプライマー上の突然変異は１つのみであるが、ハイブリダイゼーションはヒトＣＹＰ２１に特異的である。

ＧＦＰおよびＨＡの発現もまた処置の３週後に免疫蛍光（ＩＦ）により可視化した（図１０、図１１、図１３、図１５、図１９および図２０）。
表４．ＡＡＶ５−ＰＧＫ ｒＡＡＶの効果

左副腎にｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＧＦＰを注射した非ヒト霊長動物番号１（ＮＨＰ０１)の肝臓におけるＧＦＰ ＶＧＣは手術の終了時に２６であった。安楽死時の同じ動物のＧＦＰ ＶＧＣは０．４であった。肝臓の免疫蛍光はこの動物においてＧＦＰのいかなる発現も示さなかった。

いずれも右副腎にｓｓＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射した非ヒト霊長動物番号１（ＮＨＰ０１）、番号２（ＮＨＰ０２）および番号４（ＮＨＰ０４）の肝臓におけるＣＹＰ２１ＨＡ ＶＧＣは手術の終了時にそれぞれ１１、５および２７であった。安楽死時の同じ動物のＣＹＰ２１ＨＡ ＶＧＣはそれぞれ０．３、０．１および２であった。肝臓の免疫蛍光はこれらの動物においてＣＹＰ２１ＨＡの発現をほとんど示さなかった（図１９）。

ＮＨＰにおいて、ＡＡＶ５キャプシドは、ＧＦＰコピーの良好な形質導入（ＶＧＣ １．２、表４）、注射した副腎において多くのＣＹＰ２１ＨＡコピー（１．９〜９８、表４）、注射していない副腎において良好な数のＣＹＰ２１ＨＡコピー（０．０４〜２．３）、および肝臓において少数のコピーを可能とした。同じ注射用量について、多くのＣＹＰ２１ＨＡコピーがＧＦＰコピーと比較して計数された。ＧＦＰ発現（ＩＦ）は、注射した副腎においてまばらであった（図１０および図１１）。注射した副腎において一部のＣＹＰ２１ＨＡ発現（ＩＦ）を可視化した（図１３および図１５）。

野生型マウスにおいて、ＡＡＶ５キャプシドは、ｖｇ用量に比例しているらしいＧＦＰコピーの良好な静脈内形質導入（ＶＧＣ ０．２〜１６．６、表４）、およびＣＹＰ２１ＨＡの良好な形質導入（ＶＧＣ ０１２〜１７．６、表４）を可能とした。ＧＦＰ発現（ＩＦ）は野生型マウスの副腎において弱かった（図２０）。ＣＹＰ２１ＨＡ発現（ＩＦ）は抗体の技術的問題のため解釈不可能であった。

実施例８：ＡＡＶ６−ＣＡＧ ｒＡＡＶを用いた研究
ｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰベクターを製造した。このベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を有するゲノムを含有し、ＡＡＶ６キャプシドタンパク質をコードする。表５に示すように、野生型マウス（Ｂ６）の静脈内（ｉ．ｖ．）および副腎内注射を介して２匹の非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）（カニクイザル）にこのｒＡＡＶを投与した。
表５．ＡＡＶ６−ＣＡＧ ｒＡＡＶの投与

ｒＡＡＶを用いて処置した動物について処置の３週後にＧＦＰベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）値を決定した（表６；図２２、図２６〜２９、図３１および図４１）。ＧＦＰ発現もまた処置の３週後に免疫蛍光（ＩＦ）により可視化した（図２３〜２５および図２９〜３２）。
表６．ＡＡＶ６−ＣＡＧ ｒＡＡＶの効果

左副腎にｓｓＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰを注射した非ヒト霊長動物番号２（ＮＨＰ０２）および番号４（ＮＨＰ０４）の肝臓におけるＧＦＰ ＶＧＣは手術の終了時にそれぞれ１０．３および１０であった。安楽死時の同じ動物のＧＦＰ ＶＧＣはそれぞれ０．８および３．５であった。肝臓の免疫蛍光はこれらの動物においてＧＦＰの発現をほとんど示さなかった（図２９および図３０）。

ＮＨＰにおいて、ＡＡＶ６キャプシドは、注射した副腎において少数のＧＦＰコピー（ＶＧＣ ０．０８〜０．８４、表６）、および肝臓において少数のコピーに繋がった。ＧＦＰ発現（ＩＦ）は、注射した副腎においてまばらであった（図２３〜２５）。

野生型マウスにおいて、ＡＡＶ６キャプシドは、ＧＦＰコピーの優れた静脈内形質導入を可能とした（ＶＧＣ ６２．４、表６）。ＧＦＰ発現（ＩＦ）は、静脈注射（図３１）、腹腔内注射（図３２）および肝臓内注射（図３２）後の野生型マウスの副腎において優れていた。

実施例９：ＡＡＶ１−ＣＢ６およびＡＡＶ１−ＰＧＫ ｒＡＡＶを用いた研究
ｓｓＡＡＶ１−ＣＢ６−ＧＦＰベクターおよびｓｓＡＡＶ１−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡベクターを製造した。これらのベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を有するゲノムを含有し、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質をコードする。表７に示すように、野生型マウス（Ｂ６）の静脈内（ｉ．ｖ．）および副腎内注射を介して１匹の非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）（カニクイザル）にこれらのｒＡＡＶを投与した。
表７．ＡＡＶ１ ｒＡＡＶの投与

ｒＡＡＶを用いて処置した動物について処置の３週後にＧＦＰまたはＣＹＰ２１ＨＡベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）値を決定した（表８；図３３、図３５〜３７および図３９〜４１）。ＧＦＰおよびＨＡ発現もまた処置の３週後に免疫蛍光（ＩＦ）により可視化した（図３４〜３６、図３８および図３９）。
表８．ＡＡＶ１ ｒＡＡＶの効果

左副腎にｓｓＡＡＶ１−ＣＢ６−ＧＦＰを注射した非ヒト霊長動物番号３（ＮＨＰ０３）の肝臓におけるＧＦＰ ＶＧＣは手術の終了時に０．０２、安楽死時に０．９であった。肝臓の免疫蛍光はこの動物においてＧＦＰのいかなる発現も示さなかった（図３５）。

右副腎にｓｓＡＡＶ１−ＰＧＫ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射した非ヒト霊長動物番号３（ＮＨＰ０３）の肝臓におけるＣＹＰ２１ＨＡ ＶＧＣは手術の終了時に１．５、安楽死時に２．９であった。肝臓の免疫蛍光はこの動物においてＣＹＰ２１ＨＡのいかなる発現も示さなかった（図３９）。

ＮＨＰにおいて、ＡＡＶ１キャプシドは、注射した副腎において少数のＧＦＰコピー（ＶＧＣ ０．５６、表８）、および少数のＣＹＰ２１ＨＡコピー（ＶＧＣ １．０５、表８）に繋がったが、驚くべきことに注射していない副腎において０．４８のＣＹＰ２１ＨＡ ＶＧＣに繋がった。非常に少数の副腎細胞がＧＦＰ発現（ＩＦ）（図３４）またはＣＹＰ２１ＨＡ発現（図３８）について陽性であった。

野生型マウスにおいて、ＡＡＶ１キャプシドは、ＧＦＰコピーの優れた静脈内形質導入（ＶＧＣ ８１、表８）および優れたＧＦＰ発現（ＩＦ）（図３６）を可能とした。野生型マウスにおいて、ＡＡＶ１キャプシドは、ＣＹＰ２１ＨＡコピーの優れた静脈内形質導入を可能とした（ＶＧＣ ２２０、表８）。

実施例１０：マウス性腺におけるｒＡＡＶ発現の測定
ＡＡＶ６−ＣＡＧ−ＧＦＰ、ＡＡＶ１−ＣＢ６−ＧＦＰまたはＡＡＶ５−ＰＧＫ−ＣＹＰＨＡの投与の３週後にマウス性腺および副腎においてＧＦＰまたはＣＹＰ２１ＨＡ ＶＧＣを測定した。結果を表９に示す。性腺は、使用したベクターに依存して、有意であるが副腎よりはるかに低いＶＧＣ含量を示した。
表９．ｒＡＡＶの投与後のマウス性腺および副腎におけるＶＧＣ

表１０．２１ＯＨ（ＣＹＰ２１Ａ２）およびプロモーター配列の非限定的な例

実施例１１：ＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ ｒＡＡＶを用いた研究
ｓｓＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡベクターを製造した。このベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を有するゲノムを含有し、ＡＡＶ ｒｈ１０キャプシドタンパク質をコードする。このｒＡＡＶベクターをＣｙｐ２１^−／−マウスの静脈内（ｉ．ｖ．）に投与した。

第１の実験において、７か月齢のマウスを研究した。１０匹のマウス（４匹の雌、６匹の雄）に２×１０^１０ｖｇ／ｇ体重においてｓｓＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射した。６匹の雄のうち２匹は処置の３週後に死亡した。４匹のマウスはベクターで非処置とした。

処置の１５週後にマウスにおいて様々なパラメーターを測定した。処置時と処置の１５週後との間の体重の変化を処置動物および非処置動物について決定した（図４２）。ｒＡＡＶベクターを用いて処置した動物についてＣＹＰ２１ＨＡベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）値を決定した（表１１）。副腎におけるＨＡ発現およびＣＹＰ２１発現もまた免疫蛍光（ＩＦ）により可視化した（図４３および図４４）。ＣＹＰ２１発現をウエスタンブロットにより可視化した（図４５）。抗ＣＹＰ２１抗体（ＣｏｒＧｅｎ）をＩＦおよびウエスタンブロットアッセイにおいて使用した。１５週の経過にわたり処置および非処置Ｃｙｐ２１^{−／ −}マウスにおいて尿中プロゲステロン（ｎｇ／ｍｇクレアチニン）を測定した（図４６Ａ〜４６Ｂ）。１５週の経過にわたり処置および非処置野生型マウスにおいても尿中プロゲステロン（ｎｇ／ｍｇクレアチニン）を測定した（図４６Ｃ）。データは、処置マウスにおけるプロゲステロンレベルが野生型マウスにおけるレベルにはるかにより近いレベルまで戻ることを示すことによりＣＹＰ２１遺伝子療法生成物の治療効果を実証する。

７か月齢時のｓｓＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡの注射の１５週後に、Ｃｙｐ２１^−／−マウスは、効果的なＶＧＣ値を示し、強いＣＹＰ２１ＨＡ ＩＦシグナルを示し、ＣＹＰ２１タンパク質を発現し、かつ体重を向上させた。
表１１．ｓｓＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡの注射の１５週後の７か月齢Ｃｙｐ２１^−／−マウスの副腎におけるＣＹＰ２１ ＶＧＣ

第２の実験において、２〜３か月齢のマウスを研究した。１７匹のマウス（９匹の雌、８匹の雄）に２×１０^１０ｖｇ／ｇ体重または１×１０^１０ｖｇ／ｇ体重においてｓｓＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを注射した。７匹のマウスはベクターで非処置とした。

処置の１５〜１８週後にマウスにおいて様々なパラメーターを測定した。処置時と処置の１５週後との間の体重の変化を処置動物および非処置動物について決定した（図４７）。ｒＡＡＶを用いて処置した動物について処置の１８週後にＣＹＰ２１ＨＡベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）値を決定した（図４８）。副腎におけるＨＡ発現を免疫蛍光（ＩＦ）により可視化した（図４８、図５０および図５１）。１５週の経過にわたり１３匹の処置動物および全ての非処置動物において尿中プロゲステロン（ｎｇ／ｍｇクレアチニン）を測定した（図４９Ａ〜４９Ｂおよび表１２）。
表１２．２×１０^１０ｖｇ／ｇ体重または１×１０^１０ｖｇ／ｇ体重においてｓｓＡＡＶｒｈ１０−ＣＡＧ−ＣＹＰ２１ＨＡを用いて処置した２〜３か月齢Ｃｙｐ２１^−／−マウスにおける尿中プロゲステロンレベル

２〜３か月齢Ｃｙｐ２１^−／−マウスの処置の１５週後に、尿中プロゲステロンレベルは、４／１３の処置マウスにおいて半分となり、６／１３の処置マウスにおいて約１／８となった。治療結果（例えば、プロゲステロンレベル、体重、ステロイド生成ｍＲＮＡおよびストレスへの応答）は、低い持続性のＶＧＣレベル（＜０．５）でさえ１５週時に明らかであった。

実施例１２：ＡＡＶ１、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６ ｒＡＡＶベクターを比較する研究
非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）（カニクイザル）へのヒト野生型ＣＹＰ２１導入遺伝子（ｈＣＹＰ２１）またはＧＦＰの送達におけるＡＡＶ１、ＡＡＶ５またはＡＡＶ６血清型を有する組換えベクターの有効性を比較した。処置および選択した結果を表１３に要約する。ベクターにおいて使用したプロモーターはＣＡＧ、ＰＧＫまたはＣＢ６であった。ｈＣＹＰ２１導入遺伝子をヘマグルチニン（ＨＡ）タグに融合させた。非ヒト霊長動物識別記号を「ＮＨＰ ＩＤ」とラベルした列に提供する。投与経路は副腎内（ＩＡ）注射または静脈注射（ＩＶ）であった。「注射した腺」の列は、右副腎または左副腎のいずれに注射したかを指し示す。一部の場合には、ベクターは、ＩＡ注射から循環中に逃れ、注射していない腺に形質導入した。表１３はまた、ベクターについての注射した用量を提供する。ベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値は、臓器を解剖および加工した後に行った。臓器を解剖および加工した後に定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によりＣＹＰ２１またはＧＦＰのｍＲＮＡレベルを測定した。ｍＲＮＡ値は、ＧＡＰＤＨと比べたｈＣＹＰ２１の発現である。ＨＡまたはＧＦＰ発現をまた、免疫蛍光（ＩＦ）により可視化した。発現のレベルを「ＩＦ」とラベルした列に提供する。

図５２Ａ〜５２Ｃ、図５３Ａ〜５３Ｃ、図５４Ａ〜５４Ｃ、図５５Ａ〜５５Ｃ、図５６Ａ〜５６Ｃおよび図５７Ａ〜５７Ｃは、表１３に示すように、副腎および肝臓におけるＣＹＰ２１ＨＡベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）測定の空間分布の構成図、ＶＧＣおよびＣＹＰ２１ ｍＲＮＡ測定の分布の散布図ならびに処置した選択されたＮＨＰのＣＹＰ２１ＨＡ免疫蛍光画像を示す。図５９〜図６１は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５またはＡＡＶ６ベクターを用いて処置したＮＨＰの副腎の免疫蛍光画像を示す。ベクターを発現する細胞を緑色とし、矢印により指し示す。

これらの研究の結果は、３つ全ての血清型は副腎での発現を達成し、ＡＡＶ５血清型はＮＨＰにおいて優れた副腎での発現を達成することを示唆する。

実施例１３：野生型ＣＹＰ２１導入遺伝子およびコドン最適化ＣＹＰ２１導入遺伝子の有効性の比較
野生型（ＷＴ）ヒトＣＹＰ２１導入遺伝子またはコドン最適化（ＣＯ）ヒトＣＹＰ２１導入遺伝子（配列番号：５０）のいずれかを含有する組換え血清型ＡＡＶ５ベクターを製造した。これらの各ｒＡＡＶベクターは、ＣＢＡプロモーター、Ｋｏｚａｋ配列および脱標的化のためのｍｉＲ−１２２ ｍｉＲＮＡ結合部位（ＴｈａｋｒａｌおよびＧｈｏｓｈａｌ、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１５；１５（２）：１４２〜１５０）を含んでいた。野生型導入遺伝子を含有するベクターをＡＡＶ５−ＣＢＡ−Ｋｏｚａｋ−ｈＣＹＰ２１−ｍｉＲ１２２と称する。コドン最適化導入遺伝子を含有するベクターをＡＡＶ５−ＣＢＡ−Ｋｏｚａｋ−ＣＯｈＣＹＰ２１−ｍｉＲ１２２と称する。野生型カニクイザルＣＹＰ２１導入遺伝子を含有する対照ＡＡＶ５ベクターを製造した（ＡＡＶ５−ＣＢＡ−Ｋｏｚａｋ−ＣｙｎｏＣＹＰ２１）。

図６２に示す用量においてベクターを用いて非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）（カニクイザル）を処置した。ベクター調製物を１０分間ＮＨＰの静脈内（ＩＶ）に投与した。ＮＨＰを処置の１．５か月後に安楽死させた。

各処置群についてのＣＹＰ２１ベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）測定値およびｍＲＮＡ測定値を図６３に示す。ｍＲＮＡレベルを定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により測定した。ｍＲＮＡ値は、図６３に指し示すように、２つのｍＲＮＡの相対発現を示す。カニクイザル特異的プライマーを使用してカニクイザルＣＹＰ２１ ｍＲＮＡの量を測定した。図６３におけるＶＧＣおよびｍＲＮＡの行について、各行の上の数は平均であり、２つの下の数は平均についての範囲である。図６３はまた、平均Ｓａｌヒト対Ｓａｌカニクイザルペプチド比を示す。

この研究の結果は、ＡＡＶ５−ＣＢＡ−ｈＣＹＰ２１ベクターの静脈内送達後のＮＨＰの副腎におけるＷＴおよびＣＯヒトＣＹＰ２１導入遺伝子の同等の発現を示唆する。
表１３．ヒトＣＹＰ２１またはＧＦＰを発現するｒＡＡＶベクターの非ヒト霊長動物への投与の効果

Claims (28)

1. 少なくとも１つのＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）および２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）タンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、ｒＡＡＶベクター。
2. 前記２１ＯＨタンパク質がヒト２１ＯＨタンパク質である、請求項１に記載のｒＡＡＶベクター。
3. ２１ＯＨタンパク質をコードする前記非ＡＡＶヌクレオチド配列がヒト２１ＯＨ（ＣＹＰ２１Ａ２）ｃＤＮＡを含むまたはからなる、請求項１に記載のｒＡＡＶベクター。
4. ２１ＯＨタンパク質をコードする前記非ＡＡＶヌクレオチド配列がコドン最適化ヌクレオチド配列を含むまたはからなる、請求項３に記載のｒＡＡＶベクター。
5. ２１ＯＨタンパク質をコードする前記非ＡＡＶヌクレオチド配列が配列番号：５０を含むまたはからなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
6. ２１ＯＨタンパク質をコードする前記非ＡＡＶヌクレオチド配列が、配列番号：１のアミノ酸配列または配列番号：１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
7. 前記プロモーターが宿主細胞中での前記２１ＯＨタンパク質の発現を指令する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
8. 前記宿主細胞が副腎細胞または副腎皮質細胞である、請求項７に記載のｒＡＡＶベクター。
9. 前記プロモーターが、サイトメガロウイルス／β−アクチンハイブリッドプロモーター、ＰＧＫプロモーターまたは発現が副腎皮質細胞において特異的なプロモーターである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
10. 前記サイトメガロウイルス／β−アクチンハイブリッドプロモーターが、ＣＡＧ、ＣＢ６またはＣＢＡプロモーターである、請求項９に記載のｒＡＡＶベクター。
11. 前記プロモーターが、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４８または配列番号：４９のヌクレオチド配列を含むまたはからなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
12. 前記ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０またはｒｈ７４血清型ＩＴＲである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
13. 前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０またはｒｈ７４血清型である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
14. ２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）タンパク質をコードする非ＡＡＶヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、前記非ＡＡＶヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されており、
    前記ｒＡＡＶベクターが少なくとも１つのＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）を含み、前記ＩＴＲが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０またはｒｈ７４のＡＡＶからのものであり、かつ
    前記プロモーターが、サイトメガロウイルス／β−アクチンハイブリッドプロモーター、ＰＧＫプロモーターまたは発現が副腎皮質細胞において特異的なプロモーターである、
    ｒＡＡＶベクター。
15. 前記サイトメガロウイルス／β−アクチンハイブリッドプロモーターが、ＣＡＧ、ＣＢ６またはＣＢＡプロモーターである、請求項１４に記載のｒＡＡＶベクター。
16. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子。
17. ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０またはｒｈ７４からの少なくとも１つのキャプシドタンパク質をさらに含む、請求項１６に記載のｒＡＡＶ粒子。
18. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターまたは請求項１６もしくは１７に記載のｒＡＡＶ粒子、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。
19. ｒＡＡＶ粒子を製造する方法であって、（ａ）請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター、（ｂ）ＡＡＶ ｒｅｐをコードする核酸分子、（ｃ）少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸分子および（ｄ）前記ｒＡＡＶ粒子をパッケージングするための充分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む、方法。
20. それを必要とする対象において２１−ヒドロキシラーゼ（２１ＯＨ）を発現させる方法であって、前記対象に治療有効量の、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター、請求項１６もしくは１７に記載のｒＡＡＶ粒子または請求項１８に記載の医薬組成物を投与し、それにより、前記対象において２１ＯＨを発現させることを含む、方法。
21. 前記２１ＯＨが、前記対象の副腎皮質、副腎髄質、副腎幹細胞、副腎前駆細胞、肝臓または卵巣中で発現される、請求項２０に記載の方法。
22. ２１−ヒドロキシラーゼ欠損症（２１ＯＨＤ）を有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター、請求項１６もしくは１７に記載のｒＡＡＶ粒子または請求項１８に記載の医薬組成物を投与し、それにより、前記対象において２１ＯＨＤを治療することを含む、方法。
23. 前記投与するステップの前に２１ＯＨＤを有する対象を選択することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ｒＡＡＶベクター、前記ｒＡＡＶ粒子または前記医薬組成物が、静脈内に、直視下手術もしくは腹腔鏡検査法を介して副腎への直接注射によりまたはカテーテル法を介して副腎動脈への注射により前記対象に投与される、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 副腎への前記直接注射が副腎皮質への直接注射である、請求項２４に記載の方法。
26. 前記対象が、プラダーのステージＩＶまたはＶの形態の２１ＯＨＤを罹患している、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記対象が、先天性副腎過形成症（ＣＡＨ）を罹患している、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. ２１−ヒドロキシラーゼ欠損症を治療するための医薬の製造における、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターまたは請求項１６もしくは１７に記載のｒＡＡＶ粒子の使用。

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