KR20200110376A - 21-하이드록실라제 결핍을 위한 아데노-관련 바이러스 유전자 요법 - Google Patents

21-하이드록실라제 결핍을 위한 아데노-관련 바이러스 유전자 요법 Download PDF

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Abstract

본 명세서에는 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터 및 21OH 결핍을 치료하기 위한 관련 용도가 개시된다.

Description

21-하이드록실라제 결핍을 위한 아데노-관련 바이러스 유전자 요법
본 출원은 2018년 3월 8일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/640,311호 및 2018년 1월 17일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/618,307호의 우선권 및 이익을 주장한다. 이들 기초 출원의 내용은 각각 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
전자 제출된 텍스트 파일의 설명
전자적으로 함께 제출된 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 편입된다. 서열 목록의 컴퓨터 판독가능한 형식의 카피(파일명: 21OH_001_02WO_SeqList_ST25.txt, 기록 일자: 2019년 1월 13일, 파일 크기 18,056 바이트).
발명의 분야
본 개시내용은 일반적으로 유전자요법 분야에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터 및 입자를 개시한다. rAAV 벡터 및 입자는 21OH 결핍을 치료하는데 사용될 수 있다.
21-하이드록실라제(21OH)는 스테로이드 호르몬인 알도스테론과 코티솔의 생합성에 관련이 있는 CYP21A2 유전자에 의해 암호화된 사이토크롬 P450 효소이다. 이러한 합성은 부신피질에서 일어난다. 기능성 CYP21A2 유전자 및 밀접 결합된 비기능성 CYP21A1P 의사유전자 간의 높은 재조합율은 높은 빈도의 선천적 부신과다형성(congenital adrenal hyperplasia: CAH) 및 점돌연변이보다 유전자 변환에 의해 유도되는 독특한 유전적 특징을 초래한다. CYP21A2의 결함은 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 유발하며, 이는 i) 외부 생식기의 태아 남성화를 갖고, 글루코코르티코이드 및 미네랄코르티코이드 생성이 적거나 없으며, 상당한 과량의 안드로겐을 갖는 CAH("고전적" 21OHD)를 초래하거나 또는 ii) 태아 남성화가 없고 코티솔 및 알도스테론 결핍이 없지만 안드로겐 생성이 증가하는 온화한 형태의 질환("비고전적" 21OHD)을 초래한다.
수십 년의 치료 전략 후에, 중증 형태의 21OHD의 관리는 임상적으로 여전히 문제로 남아 있다. 외인성 스테로이드로 환자를 치료할 수는 있지만, 영아 및 성인 환자는 부신이 일상적인 감염, 외상 또는 강렬한 운동과 같은 신체 스트레스에 반응할 수 없는 부신 위기가 위험한 상태로 남아 있다. 부신 위기는 치료법을 준수하는 잘 교육받은 환자에서도 심각한 쇼크와 사망으로 빠르게 이어질 수 있다. 문헌[Hahner et al., J Clin Endocrinol Metab, Feb; 100(2): 407-416(2015)] 참조. 또한, 성장, 성별 및 성적 특질과 관련된 결과는 유의미하다. 여성 환자의 경우, 초과 생리학적 글루코코르티코이드 용량을 사용하여 부신 안드로겐 생성을 억제하는 데에는 고유의 어려움이 있다. 결과적으로, 안드로겐 대 글루코코르티코이드 과량의 교대 사이클은 단신, 비만, 소아기 동안 반복된 생식기 수술, 사춘기 변화 및 만성적인 남성화로 이어질 수 있다. 고안드로겐증은 다모증, 남성 근육 발달, 확대된 음핵 크기 및 성기능 장애를 통해 고전적 및 비고전적 형태의 질병에 걸린 여성 환자들에게 주된 미용 부담을 남긴다. 문헌[Gastaud et al., J Clin Endocrinol Metab, 92(4), 1391-1396(2007)] 참조. 남성 환자는 단신 및 조기 남성화의 위험이 있다. 치료 실패는 심지어 일부 환자에서 양측 부신절제술을 초래할 수도 있다(Gmyrek et al., Pediatrics, 109: E28(2002); Bruining et al., J Clin Endocrinol Metab, 86: 482-484(2001)).
21OHD의 지속적인 교정을 가능하게 하는 치료법은 여전히 필요하다.
본 발명은 적어도 하나의 AAV 역말단 반복체(inverted terminal repeat: ITR) 및 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 결합된 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(recombinant adeno-associated virus: rAAV) 벡터를 포함한다.
특정 경우에, rAAV 벡터는 인간 21OH 단백질인 21OH 단백질을 암호화한다. 몇몇 실시형태에서, 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 인간 21OH(CYP21A2) cDNA를 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화한다.
rAAV 벡터는 적어도 하나의 AAV 역말단 반복체(ITR) 및 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 결합된 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있고, 이때 프로모터는 숙주 세포(예컨대, 부신 세포 또는 부신 피질 세포) 중에서 21OH 단백질의 발현을 유도한다. 적합한 프로모터의 비제한적 예는 사이토메갈로바이러스/β-액틴 혼성(hybrid) 프로모터, PGK 프로모터 또는 부신 피질 세포에서의 발현에 특이적인 프로모터를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 사이토메갈로바이러스/β-액틴 혼성 프로모터는 CAG, CB6 또는 CBA 프로모터이다. 몇몇 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 48 또는 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 서열로 이루어진다.
몇몇 양상에서, rAAV 벡터는 적어도 하나의 ITR 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 혈청형 ITR이다.
특정 경우에, 본 발명의 rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 혈청형이다.
본 발명은 또한 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 결합된 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터로서, rAAV 벡터가 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74의 AAV에서 유래하는 적어도 하나의 AAV 역말단 반복체(ITR)를 포함하고; 프로모터는 사이토메갈로바이러스/β-액틴 혼성 프로모터, PGK 프로모터 또는 부신피질 세포에서의 발현에 특이적인 프로모터인, rAAV 벡터를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 사이토메갈로바이러스/β-액틴 혼성 프로모터는 CAG, CB6 또는 CBA 프로모터이다.
몇몇 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자를 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 유래의 적어도 하나의 캡시드 단백질을 더 포함한다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 rAAV 벡터 또는 rAAV 입자, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 또한, 본 발명은 rAAV 입자를 생산하는 방법으로서, (a) 본 명세서에 기술된 rAAV 벡터; (b) AAV rep를 암호화하는 핵산 분자; (c) 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 분자; 및 (d) rAAV 입자를 패키징하기에 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 고려한다.
특정 경우에, 본 발명은 21-하이드록실라제(21OH)의 발현을 필요로 하는 대상체 중에서 21OH를 발현시키는 방법으로서, 대상체에게 적어도 하나의 AAV 역말단 반복체(ITR) 및 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 암호화하며 프로모터에 작동 가능하게 결합된 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자, 또는 rAAV 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 치료적 유효량으로 투여함으로써 대상체에서 21OH를 발현시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 몇몇 경우에, 21OH는 대상체의 부신 피질, 부신 수질, 부신 줄기 세포, 부신 전구 세포, 간 또는 난소에서 발현될 수 있다.
본 발명은 또한 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 적어도 하나의 AAV 역말단 반복체(ITR) 및 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 암호화하며 프로모터에 작동 가능하게 결합된 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자, 또는 rAAV 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여함으로써 대상체 중의 21OHD를 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이 방법은 투여하는 단계 전에 21OHD를 가진 대상체를 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
몇몇 경우에, rAAV 벡터, rAAV 입자 또는 rAAV 벡터 또는 rAAV 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에게 정맥내로, 개방 수술 또는 복강경을 통해 부신으로의 직접 주사에 의해, 또는 카테터화를 통해 부신 동맥으로의 주사에 의해 대상체에게 투여된다. 부신으로의 직접 주사는 부신 피질로의 직접 주사일 수 있다.
본 발명의 방법 또는 조성물에 의해 치료되는 대상체는 Prader 단계 IV 또는 V 형의 21OHD를 앓고 있을 수 있다. 몇몇 경우에, 대상체는 선천적 부신과다형성(CAH)을 앓고 있다.
본 발명은 또한 21-하이드록실라제 결핍을 치료하기 위한 약제의 제조에서의, 적어도 하나의 AAV 역말단 반복체(ITR) 및 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 결합된 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 벡터 또는 벡터를 포함하는 rAAV 입자의 용도를 고찰한다.
도 1a 내지 도 1c는 '대조군' 마우스로 고려된 Cyp21 +/- 및 Cyp21 +/+(흰색, n=21)에 비해 CYP21 벡터(회색, n=16) 또는 모의 벡터(검은 색, n=9)를 주사한 Cyp21 -/- 마우스에서의 체중 및 소변의 프로게스테론의 발전을 보여준다. 도 1a는 모의 벡터를 주사한 Cyp21 -/- 마우스가 항상 대조군 마우스보다 작게 유지되었음을 보여주는 막대 그래프이다(P<0.001). CYP21 벡터를 주사한 마우스는 주사 후 5 및 10주(P<0.001) 및 주사 후 15주(P<0.01)에 실질적으로 체중이 회복되었다. 도 1b는 모의 벡터(왼쪽) 또는 CYP21 벡터(중간)가 주사된 Cyp21 -/- 마우스 및 벡터 주사 전 및 사멸 시점에 대조군 마우스(오른쪽)의 사진을 도시한 것이다. 도 1c는 모의 벡터가 주사된 Cyp21 -/- 마우스가 항상 대조군 마우스(P<0.001)보다 소변의 프로게스테론 농도가 훨씬 높다는 것을 보여주는 막대 그래프이다. CYP21 벡터를 이용한 유전자 요법은 소변의 프로게스테론의 주된 감소를 유도하였다. 하지만, 교정은 완성되지 않았다. 프로게스테론 수준은 대조군 마우스와 비교하여 CYP21 처리된 Cyp21 -/- 마우스에서 대략 2배 높게 유지되었다(주사 후 5주에 P<0.001, 주사 후 10 주에 유의미하지 않음 및 주사 후 15주에 P<0.05). 데이터는 평균±s.e.m.으로 제시된다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 2A 내지 도 2F는 CYP21 벡터(회색, n = 14) 또는 모의 벡터(검은 색, n = 13)를 주사한 Cyp21 -/- 마우스에서의 운동 및 스트레스 반응의 연구 결과를 대조군(흰색, n = 19)과 비교하여 나타낸 막대 그래프이다. 도 2A는 CYP21 벡터 또는 모의 벡터가 주사된 Cyp21 -/- 마우스 및 대조용 마우스가 로타로드에 의해 평가된 바와 같이 비슷한 운동 성능을 가졌음을 보여준다. 도 2B는 모의 벡터를 주사한 Cyp21 -/- 마우스가 대조군 마우스보다 꼬리 현수(tail suspension) 시험에서 더욱 부동성이었음을 보여준다(대조군 및 모의 벡터 마우스 간에 P = 0.21). CYP21 벡터에 의해 처리된 Cyp21 -/- 마우스는 시험에 대해 정상 반응을 회복하였다(대조군과 CYP21 벡터 마우스 사이의 P<0.05). 도 2C 내지 도 2F는 십자형 높은 미로(elevated plus-maze) 시험에서 CYP21 벡터가 주사된 Cyp21 -/- 마우스 및 대조군 마우스와 비교하여, 모의 벡터를 주사한 Cyp21 -/- 마우스가 더 적은 거리를 이동하였고(대조군과 모의 벡터 마우스 간에 P<0.001)(도 2C), 개방형 암에서 더 적은 소비 시간(대조군과 모의 벡터 마우스 간에 유의미하지 않음)(도 2D), 더 적은 머리 침액(head-dipping)(대조군 및 모의 벡터 마우스 간에 P<0.05)(도 2E)과 앞다리 들기(rearing) 움직임(대조군 및 모의 벡터 마우스 간에 P<0.01)(도 2F)을 수행하였음을 보여준다. 모든 십자형 높은 미로 파라미터들에 있어서 대조군 및 CYP21 벡터 간에 차이는 유의적이지 않았다. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로서 제시된다. * P<0.05, *** P<0.001.
도 3a 및 도 3b는 CYP21 벡터(회색, n = 11) 또는 모의 벡터(검은 색, n = 8)가 주사된 Cyp21 -/- 마우스의 부신 및 신장에서의 유전자 발현 연구의 결과를 대조군 마우스(흰색, n = 16)와 비교하여 나타내는 막대 그래프이다. 도 3a는 ACTH 수용체(Mc2r), 단백질 키나제 A 조절 서브유닛(Prkar2a), 스테로이드생성 인자(Steroidogenic factor) 1(SF-1)(P<0.01), 스테로이드생성 급성 조절 단백질(Star) 및 스테로이드생성 효소 Cyp17a1 및 Cyp11b2(P<0.05)에 대한 mRNA 함량이 모의 벡터에 대비하여 CYP21-주사된 마우스의 부신에서 감소하였음을 보여준다. SF-1, Star, Hsd3b1(P<0.05), Prkar1a, Cyp11b1(P<0.01), Mc2r, Prkar2a 및 Cyp11b2(P<0.001)에 대해서는 mRNA 함량이 대조군에 비해 CYP21-주사된 마우스에서 낮은 수준이지만 증가된 상태를 유지하였고, Prkarca, Prkarcb, Cyp11a1 및 Cyp17a1에 대해서는 변화가 없었다. 도 3b는 Renin mRNA 함량이 모의 벡터 대비 CYP21-주사된 마우스의 신장에서는 감소하였지만(P<0.001), CYP21-주사된 마우스를 대조군과 비교했을 때에는 증가된 채 유지되었다(P<0.001). 데이터는 Tbp에 대해 정규화하였고, 평균 ± s.e.m.으로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 4A 및 도 4B는 pCYP21(n = 3, 회색) 또는 pLuc(n = 3, 검은 색)에 의해 형질감염된 Y1 세포에서 21-하이드록실라제 발현 및 프로게스테론 농도의 분석 결과를 보여준다. 도 4A는 pCYP21에 의해 형질감염된 Y1 세포가 pLuc에 의해 형질감염된 Y1 세포와 대조적으로 웨스턴 블롯에 의해 평가된 바와 같이 21-하이드록실라제를 발현하였음을 보여준다. 도 4B는 pCYP21에 의해 형질감염된 Y1 세포가 pLuc에 의해 형질감염된 Y1 세포보다 상청액 중에 더 낮은 프로게스테론 농도를 갖고 있음을 보여준다(P = 0.10). 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타내었다.
도 5A 및 도 5B는 AAVrh10의 정맥내 주사가 부신피질에서 돌연변이유전자 발현을 초래한다는 것을 보여준다. 도 5A는 대조군 마우스에서 정맥내 주사 후 부신에서의 AAVrh10의 GFP 형광 패턴을 보여주는 이미지이다. 도 5B는 대조군 및 CYP21 벡터로 처리된 Cyp21 -/- 마우스의 부신에서 마우스 및 인간 21-하이드록실라제 발현을 보여주는 면역블롯이다.
도 6은 대조군 마우스 및 모의 벡터 또는 CYP21 벡터가 주사된 Cyp21 -/- 마우스의 부신 동결절편(cryosection)을 조직학적 분석한 이미지를 보여준다. 상부, 스케일 막대 = 500 ㎛; 하부, 스케일 막대 = 200 ㎛.
도 7은 모의 벡터 또는 CYP21 벡터가 주사된 Cyp21 -/- 마우스 및 대조군 마우스의 부신에서의 알도스테론 합성효소 발현의 이미지를 보여준다.
도 8A 및 도 8B는 AAVrh10-CAG-GFP가 정맥내로 주사된 대조군 마우스의 말초 기관 중의 GFP 발현의 이미지를 보여준다. 도 8A는 심장을 나타낸다. 도 8B는 간을 나타낸다.
도 9는 좌측 부신에 ssAAV5-PGK-GFP가 주사된 비-인간 영장류 1번(NHP01)의 부신에 대한 GFP 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 우측 부신(주사되지 않음) 및 좌측 부신(주사됨)에서의 VGC 수가 표시된다. 별표는 실시예 1 내지 6에서 Cyp21 -/- 마우스를 치료하는데 효과적인 VGC를 나타낸다.
도 10은 ssAAV5-PGK-GFP가 주사된 비-인간 영장류 1번(NHP01)의 좌측 부신의 GFP 면역형광 이미지를 나타낸다.
도 11은 ssAAV5-PGK-GFP가 주사된 비-인간 영장류 1번(NHP01)의 좌측 부신의 전체 슬라이스의 GFP 면역형광 이미지를 나타낸다.
도 12는 우측 부신에 ssAAV5-PGK-CYP21HA가 주사된 비-인간 영장류 1번 (NHP01)의 부신에 대한 CYP21HA 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 우측(주사됨) 및 좌측(주사되지 않음) 부신에서의 VGC 카운트가 표시된다. 별표는 실시예 1 내지 6에서 Cyp21 -/- 마우스를 치료하는데 효과적인 VGC를 나타낸다.
도 13은 ssAAV5-PGK-CYP21HA가 주사된 비-인간 영장류 1번(NHP01)의 우측 부신의 HA 면역형광 이미지를 나타낸다.
도 14는 우측 부신에 ssAAV5-PGK-CYP21HA가 주사된 비-인간 영장류 2번(NHP02)의 부신에 대한 CYP21HA 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 우측(주사됨) 및 좌측(주사되지 않음) 부신에서의 VGC 카운트가 표시된다. 별표는 실시예 1 내지 6에서 Cyp21 -/- 마우스를 치료하는데 효과적인 VGC를 나타낸다. 이 동물은 우측 부신에서 3회 주사로 4.5×1011 vg를 투여받았다. 이 값은 NHP01에 투여된 것보다 6.6배 낮았다.
도 15는 ssAAV5-PGK-CYP21HA가 주사된 비-인간 영장류 2번(NHP02)의 우측 부신에서의 HA 면역형광 이미지를 도시한 것이다. 이 동물은 우측 부신에서 3회 주사로 4.5×1011 vg를 투여받았다. 이 값은 NHP01에 투여된 것보다 6.6배 낮았다.
도 16은 우측 부신에 ssAAV5-PGK-CYP21HA가 주사된 비-인간 영장류 4 번(NHP04)의 부신에 대한 CYP21HA 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 우측(주사됨) 및 좌측(주사되지 않음) 부신에서의 VGC 카운트가 표시된다. 별표는 실시예 1 내지 6에서 Cyp21 -/- 마우스를 치료하는데 효과적인 VGC를 나타낸다.
도 17은 우측 부신에 ssAAV5-PGK-CYP21HA를 주사한 후, 비-인간 영장류 4번(NHP04)의 우측 부신의 세부 절개물의 개략도 및 사진을 나타낸다.
도 18은 우측 부신에 ssAAV5-PGK-CYP21HA가 주사된 비-인간 영장류 4번(NHP04)으로부터의 작은 조각으로 절단된 부신에서 공간 분포된 CYP21HA 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값의 개략도를 보여준다. 추정 주사 부위는 검은 화살표로 표시된다.
도 19는 수술 종료(ES) 시 및 안락사(Eu) 후 NHP01 및 NHP02의 간에서 ssAAV5-PGK-CYP21HA에 대한 평균 CYP21HA 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 도 19는 또한 ssAAV5-PGK-CYP21HA를 주사한 NHP01, NHP02 및 NHP04의 간의 HA 면역형광 이미지를 보여준다.
도 20은 ssAAV5-PGK-GFP를 정맥내 투여한 야생형 마우스의 부신에 대한 GFP 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 별표는 실시예 1 내지 6에서 Cyp21 -/- 마우스를 치료하는데 효과적인 VGC를 나타낸다. 도 20은 또한 ssAAV5-PGK-GFP로 정맥내 처리된 야생형 마우스의 부신의 면역형광 이미지를 보여준다.
도 21은 ssAAV5-PGK-CYP21HA를 정맥내 투여한 야생형 마우스의 부신에 대한 CYP21HA 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 별표는 실시예 1 내지 6에서 Cyp21 -/- 마우스를 치료하는데 효과적인 VGC를 나타낸다.
도 22는 좌측 부신에 ssAAV6-CAG-GFP를 주사한 비-인간 영장류 2번(NHP02)의 부신에 대한 GFP 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 우측(주사되지 않음) 및 좌측(주사됨) 부신 모두의 VGC 계수가 표시된다. 별표는 실시예 1 내지 6에서 Cyp21 -/- 마우스를 치료하는데 효과적인 VGC를 나타낸다.
도 23은 ssAAV6-CAG-GFP가 주사된 비-인간 영장류 2번(NHP02)의 좌측 부신의 GFP 면역형광 이미지를 보여준다.
도 24는 ssAAV6-CAG-GFP가 주사된 비-인간 영장류 2번(NHP02)의 좌측 부신에서 선택된 양성 GFP 면역형광 이미지를 보여준다. "OBJX20"은 x20 배율을 지칭한다.
도 25는 ssAAV6-CAG-GFP가 주사된 NHP02의 좌측 부신의 GFP 면역형광 이미지를 보여준다. 이 도면은 부신의 조각을 따라 불균형적인 면역형광 신호의 분포를 보여준다.
도 26은 좌측 부신에 ssAAV6-CAG-GFP를 주사한 비-인간 영장류 4번(NHP04)의 부신에 대한 GFP 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 우측(주사되지 않음) 및 좌측(주사됨) 부신 모두의 VGC 계수가 표시된다. 별표는 실시예 1 내지 6에서 Cyp21 -/- 마우스를 치료하는데 효과적인 VGC를 나타낸다.
도 27은 좌측 부신에 ssAAV6-CAG-GFP를 주사한 후 비-인간 영장류 4번(NHP04)의 좌측 부신의 세부 절개물의 개략도 및 사진을 나타낸다.
도 28은 좌측 부신에 ssAAV6-CAG-GFP를 주사한 비-인간 영장류 4번(NHP04)으로부터의 작은 조각으로 절단된 2개의 부신에서 공간적으로 분포된 GFP VGC 측정값을 나타낸다.
도 29는 수술 종료(ES) 시 및 안락사(Eu) 후, ssAAV6-CAG-GFP가 주사된 NHP02 및 NHP04의 간에서의 평균 GFP 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 도 29는 또한 좌측 부신에 ssAAV6-CAG-GFP가 주사된 NHP04의 간을 촬영한 GFP 면역형광 이미지를 나타낸다.
도 30은 좌측 부신에 ssAAV6-CAG-GFP가 주사된 NHP04의 간을 촬영한 또 다른 GFP 면역형광 이미지를 나타낸다.
도 31은 ssAAV6-CAG-GFP를 정맥내 투여한 야생형 마우스의 부신에 대한 GFP 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 도 31은 또한 ssAAV6-CAG-GFP에 의해 정맥내 처리된 야생형 마우스의 부신의 GFP 면역형광 이미지도 나타낸다.
도 32는 IP(복강내) 또는 IH(간내) 주사에 의해 ssAAV6-CAG-GFP에 의해 처리된 야생형 마우스 부신의 GFP 면역형광 이미지를 보여준다.
도 33은 좌측 부신에 ssAAV1-CB6-GFP를 주사한 비-인간 영장류 3번(NHP03)의 부신에 대한 GFP 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 우측(주사되지 않음) 및 좌측(주사됨) 부신 모두에서의 VGC 계수가 표시된다. 별표는 실시예 1 내지 6에서 Cyp21 -/- 마우스를 치료하는데 효과적인 VGC를 나타낸다.
도 34는 ssAAV1-CB6-GFP가 주사된 비-인간 영장류 3번(NHP03)의 좌측 부신의 GFP 면역형광 이미지를 나타낸다.
도 35는 수술 종료(ES) 시 및 안락사(Eu) 후, NHP03의 간에서 ssAAV1-CB6-GFP에 대한 평균 GFP 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 도 35는 또한 좌측 부신에 ssAAV1-CB6-GFP가 주사된 NHP03의 간에 대한 GFP 면역형광 이미지를 나타낸다.
도 36은 ssAAV1-CB6-GFP가 정맥내 투여된 야생형 마우스의 부신에 대한 GFP 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 도 36은 또한 ssAAV1-CB6-GFP로 정맥 내 처리된 야생형 마우스의 부신에 대한 GFP 면역형광 이미지를 나타낸다.
도 37은 우측 부신에 ssAAV1-PGK-CYP21HA가 주사된 비-인간 영장류 3번(NHP03)의 부신에 대한 CYP21HA 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 우측(주사됨) 및 좌측(주사되지 않음) 부신 모두에서의 VGC 계수가 표시된다. 별표는 실시예 1 내지 6에서 Cyp21 -/- 마우스를 치료하는데 효과적인 VGC를 나타낸다.
도 38은 ssAAV1-PGK-CYP21HA가 주사된 비-인간 영장류 3번(NHP03)의 우측 부신의 HA 면역형광 이미지를 나타낸다. 우측 부신에 2회 주사로서 2.2×1012이 동물에게 투여되었다.
도 39는 수술 종료(ES) 시 및 안락사(Eu) 후, 우측 부신에 ssAAV1-PGK-CYP21HA가 주사된 NHP03의 간에 대한 CYP21HA 평균 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다. 도 39는 또한 우측 부신에 ssAAV1-PGK-CYP21HA가 주사된 NHP03의 간에 대한 HA 면역형광 이미지를 나타낸다.
도 40은 1×1014 vg/㎏ ssAAV1-PGK-CYP21HA가 정맥내 투여된 야생형 마우스의 부신에 대한 CYP21HA 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 나타낸다.
도 41A 및 도 41B는 다양한 시점에서 NHP01, NHP02, NHP03 및 NHP04에서의 GFP(도 41A) 및 hCYP21HA(도 41B)의 혈액 VGC 측정값을 정리한 선 그래프를 나타낸다. 도 41C는 부신 내 주사된 용량의 함수로서 수술 종료 시의 혈액 VGC를 정리한 그래프를 나타낸다. vg = 바이러스 게놈. "H+1"은 주사 후 1 시간을 나타낸다. "D+1", "D+7", "D+14" 및 "D+21"은 각각 주사 후 1 일, 7 일, 14 일 및 21 일을 나타낸다.
도 42는 ssAAV10-CAG-CYP21HA로 처리되거나 rAAV로 처리되지 않은 7개월령 Cyp21 -/- 마우스의 델타(변화) 체중을 나타내는 그래프를 도시한다. 체중은 t0(주사) 및 w15(치료 후 15주)에 측정하였다.
도 43은 처리 15주 후 ssAAV10-CAG-CYP21HA로 처리된 7개월령 Cyp21 -/- 마우스의 부신의 HA-FITC 면역형광 이미지를 나타낸다. "TF"는 "처리된 암컷"을 지칭한다. "TM"은 "처리된 수컷"을 지칭한다. 이 도면은 이미지를 생성하는데 사용된 마우스의 식별 번호를 포함한다.
도 44는 처리 후 15주째 ssAAV10-CAG-CYP21HA로 처리된 7개월령 Cyp21 -/- 마우스의 부신의 CYP21-CY3 면역형광 이미지를 나타낸다. "TF"는 "처리된 암컷"을 지칭한다. "TM"은 "처리된 수컷"을 지칭한다. 이 도면은 이미지를 생성하는데 사용된 마우스의 식별 번호를 포함한다.
도 45는 처리 후 15주째 ssAAV10-CAG-CYP21HA에 의해 처리된 7개월령의 Cyp21 -/- 마우스, 처리되지 않은 Cyp21 -/- 마우스 및 Cyp21 야생형(+/+) 또는 Cyp21 이형접합(+/-) 마우스에서의 CYP21 발현을 웨스턴 블롯한 이미지를 나타낸다. CYP21은 항-CYP21 항체(CorGen)에 의해 검출되었다. 이 도면은 데이터 생성에 사용된 마우스의 식별 번호를 포함한다.
도 46a 및 도 46b는 ssAAV10-CAG-CYP21HA로 처리된 7개월령의 Cyp21 -/- 마우스(도 46a) 및 처리되지 않은 Cyp21 -/- 마우스(도 46b)에서 15주에 걸친 소변 프로게스테론 수준(ng/mg 크레아티닌)의 측정값을 나타낸다. 도 46c는 ssAAV10-CAG-CYP21HA에 의해 처리된 7개월령의 야생형 마우스 및 처리되지 않은 야생형 마우스에서 15주에 걸친 소변 프로게스테론 수준(ng/mg 크레아티닌)의 측정값을 나타낸다. 도면들은 데이터를 생성하는데 사용된 마우스의 식별 번호를 포함한다.
도 47은 ssAAV10-CAG-CYP21HA에 의해 처리되거나 rAAV로 처리되지 않은 2 내지 3개월령 Cyp21 -/- 마우스의 델타(변화) 체중을 나타내는 그래프를 도시한다. 체중은 t0(주사) 및 w15(처리 후 15주)에 측정하였다.
도 48은 ssAAV10-CAG-CYP21HA가 정맥내 투여된 특정 2 내지 3개월령 Cyp21 -/- 마우스의 부신에 대한 처리 후 18주째의 바이러스 게놈 카피(VGC) 측정값을 가진 표를 나타낸다. 표는 또한 rAAV의 주사 시점(Prog W0)에 각 마우스에서 측정된 상응하는 소변 프로게스테론 수준(ng/mg 크레아티닌), 최저 프로게스테론 수준(최저 Prog) 및 처리 후 15주째의 프로게스테론 수준(Prog W15)을 포함한다. 도 48은 또한 처리된 마우스의 부신에서 CYP21HA 발현의 상응하는 면역형광 이미지를 나타낸다. "TF"는 "처리된 암컷"을 지칭한다. "TM"은 "처리된 수컷"을 지칭한다. 이 도면은 이미지와 데이터를 생성하는 데 사용된 마우스의 식별 번호를 포함한다.
도 49a 및 도 49b는 ssAAV10-CAG-CYP21HA에 의해 처리된 2 내지 3개월령의 Cyp21 -/- 마우스(도 49a) 및 처리되지 않은 Cyp21 -/- 마우스(도 49b)에서 15주에 걸친 소변 프로게스테론 수준(ng/mg 크레아티닌)의 측정값을 나타낸다. 이 도면들은 데이터를 생성하는데 사용된 마우스의 식별 번호를 포함한다.
도 50은 ssAAV10-CAG-CYP21HA에 의해 처리된 2 내지 3개월령의 Cyp21 -/- 마우스의 부신에 대한 처리 후 1주째 CYP21HA 면역형광 이미지를 나타낸다. 이 도면은 이미지를 생성하는데 사용된 마우스의 식별 번호를 포함한다.
도 51은 ssAAV10-CAG-CYP21HA에 의해 처리된 2 내지 3개월령의 Cyp21 -/- 마우스의 부신에 대한 처리 후 3주째 CYP21HA 면역형광 이미지를 나타낸다. 이 도면은 이미지를 생성하는데 사용된 마우스의 식별 번호를 포함한다.
도 52a 내지 도 52c는 체중이 2.65㎏인 28개월령의 암컷인 비-인간 영장류 5번(NHP05)에 AAV1-CAG-hCYP21HA를 부신내 투여 후 얻은 결과를 나타낸다. 동물은 rAAV를 투여하기 약 2개월 전에 AAV1, AAV5 및 AAV6에 대한 중화 항체에 대해 음성으로 선별되었다. 동물은 rAAV를 투여하기 약 2 주 전에 AAV1 및 AAV5에 대한 중화 항체에 대해 음성으로 선별되었고, AAV6(1/5)에 대해 양성으로 선별되었다. 도 52a는 부신의 상이한 구역에서 CYP21HA 벡터 게놈 카피(VGC) 측정값에 대한 공간 분포의 개략도를 나타낸다(좌측 및 중심). 도 52a는 또한 각 간엽에 대한 VGC 측정값을 나타낸다(우측). 도 52b는 하우스키핑(housekeeping) 유전자(ARN) 측정값에 대비한 VGC(좌측) 및 mRNA의 분포를 나타낸다. 도 52c는 벡터의 넓은 발현을 나타내는 CYP21HA 양성 세포 염색(녹색)을 갖는 우측 부신의 저 배율(좌측) 및 고 배율(우측)에서의 CYP21HA 면역형광 이미지를 나타낸다. "RA"는 우측 부신을 나타낸다. "LA"는 좌측 부신을 나타낸다.
도 53a 내지 도 53c는 무게가 2.35㎏인 28개월령 암컷인 비-인간 영장류 8번(NHP08)에 AAV1-CAG-hCYP21HA를 정맥내 투여한 후 얻은 결과를 나타낸다. 동물은 rAAV를 투여하기 약 2개월 전에는 AAV1, AAV5 및 AAV6에 대한 중화 항체에 대해 음성으로 선별되었다. 동물은 rAAV를 투여하기 약 2주 전에는 AAV1 및 AAV6에 대한 중화 항체에 대해 음성으로 선별되었고, AAV5(1/5)에 대해 양성으로 선별되었다. 도 53a는 부신의 상이한 구역에서 CYP21HA 벡터 게놈 카피(VGC) 측정값에 대한 공간 분포의 개략도를 나타낸다(좌측 및 중심). 도 53a는 또한 각 간엽에 대한 VGC 측정값을 나타낸다(우측). 도 53b는 하우스키핑 유전자(ARN) 측정값에 대한 VGC(좌측) 및 mRNA의 분포를 나타낸다. 도 53c는 벡터의 낮은 발현을 나타내는 CYP21HA 양성 세포 염색(녹색)을 갖는 우측 부신의 저배율(좌측) 및 고배율(우측)에서의 CYP21HA 면역형광 이미지를 나타낸다. "RA"는 우측 부신을 나타낸다. "LA"는 좌측 부신을 나타낸다.
도 54a 내지 도 54c는 체중이 2.8㎏ 인 28개월령의 암컷인 비-인간 영장류 6번(NHP06)에 AAV5-CAG-hCYP21HA를 부신내 투여한 후 얻은 결과를 나타낸다. 동물은 rAAV를 투여하기 약 2개월 전에 AAV5 및 AAV6에 대한 중화 항체에 대해 음성으로 선별되었고 AAV1(1/5)에 대해 양성으로 선별되었다. 동물은 rAAV를 투여하기 약 2 주 전에 AAV1 및 AAV5에 대한 중화 항체에 대해 음성으로 선별되었고, AAV6(1/5)에 대해 양성으로 선별되었다. 도 54a는 부신의 상이한 구역에서 CYP21HA 벡터 게놈 카피(VGC) 측정값에 대한 공간 분포의 개략도를 나타낸다(좌측 및 중심). 도 54a는 또한 각 간엽에 대한 VGC 측정값을 나타낸다(우측). 도 54b는 하우스키핑 유전자(ARN) 측정값에 대한 VGC(좌측) 및 mRNA의 분포를 나타낸다. 도 54c는 벡터의 넓은 발현을 나타내는 CYP21HA 양성 세포 염색(녹색)을 갖는 우측 부신의 저배율(큰 이미지) 및 고배율(작은 이미지)에서의 CYP21HA 면역형광 이미지를 나타낸다. "RA"는 우측 부신을 나타낸다. "LA"는 좌측 부신을 나타낸다.
도 55a 내지 도 55c는 체중이 2.5 ㎏인 28개월령의 암컷인 비-인간 영장류 9번(NHP09)에 대한 AAV5-CAG-hCYP21HA의 정맥 내 투여 후 얻은 결과를 나타낸다. 동물은 rAAV를 투여하기 약 2개월 전에 AAV1, AAV5 및 AAV6에 대한 중화 항체에 대해 음성으로 선별되었다. 동물은 rAAV를 투여하기 약 2 주 전에 AAV1, AAV5 및 AAV6에 대한 중화 항체에 대해 음성으로 선별되었다. 도 55a는 부신의 상이한 구역에서의 CYP21HA 벡터 게놈 카피(VGC) 측정에 대한 공간 분포의 개략도를 나타낸다(좌측 및 중심). 도 55a는 또한 각 간엽에 대한 VGC 측정값을 나타낸다(우측). 도 55b는 하우스키핑 유전자(ARN) 측정값에 대한 VGC(좌측) 및 mRNA의 분포를 나타낸다. 도 55c는 벡터의 넓은 발현을 나타내는 CYP21HA 양성 세포 염색(녹색)을 갖는 우측 부신의 저배율(중앙) 및 고배율(왼쪽 및 오른쪽)에서의 CYP21HA 면역형광 이미지를 나타낸다. "RA"는 우측 부신을 나타낸다. "LA"는 좌측 부신을 나타낸다.
도 56a 내지 도 56c는 체중이 2.85㎏인 28개월령의 암컷인 비-인간 영장류 7번(NHP07)에 AAV6-CAG-hCYP21HA의 부신내 투여 후 얻은 결과를 나타낸다. 동물은 rAAV를 투여하기 약 2개월 전에 AAV1, AAV5 및 AAV6에 대한 중화 항체에 대해 음성으로 선별되었다. 동물은 rAAV를 투여하기 약 2 주 전에 AAV1(1/5), AAV5(1/5) 및 AAV6(1/5)에 대한 중화 항체에 대해 양성으로 선별되었다. 도 56a는 부신의 상이한 구역에서 CYP21HA 벡터 게놈 카피(VGC) 측정값에 대한 공간 분포의 개략도를 나타낸다(좌측 및 중심). 도 56a는 또한 각 간엽에 대한 VGC 측정값을 나타낸다(우측). 도 56a는 또한 각 간엽에 대한 VGC 측정값을 나타낸다(우측). 도 56b는 하우스키핑 유전자(ARN) 측정값에 상대적인 VGC(좌측) 및 mRNA의 분포를 나타낸다. 도 56c는 벡터의 넓은 발현을 나타내는 CYP21HA 양성 세포 염색(녹색)을 갖는 우측 부신의 저배율(좌측) 및 고배율(우측)에서의 CYP21HA 면역형광 이미지를 나타낸다. "RA"는 우측 부신을 지칭한다. "LA"는 좌측 부신을 지칭한다.
도 57a 내지 도 57c는 체중이 2.35㎏인 28개월령의 암컷인 비-인간 영장류 10번(NHP10)에 AAV6-CAG-hCYP21HA를 정맥내 투여한 후 얻은 결과를 나타낸다. 동물은 rAAV를 투여하기 약 2개월 전에 AAV1, AAV5 및 AAV6에 대한 중화 항체에 대해 음성으로 선별되었다. 동물은 rAAV를 투여하기 약 2 주 전에 AAV5 및 AAV6에 대한 중화 항체에 대해 음성으로 선별되었고 AAV1(1/5)에 대해 양성으로 선별되었다. 도 57a는 부신의 상이한 구역에서 CYP21HA 벡터 게놈 카피(VGC) 측정값에 대한 공간 분포의 개략도를 나타낸다(좌측 및 중심). 도 57a는 또한 각 간엽에 대한 VGC 측정값을 나타낸다(우측). 도 57b는 하우스키핑 유전자(ARN) 측정값에 상대적인 VGC(좌측) 및 mRNA의 분포를 나타낸다. 도 57c는 벡터의 최소 발현을 나타내는 CYP21HA 양성 세포 염색(녹색)을 갖는 우측 부신의 저배율(좌측) 및 고배율(우측)에서의 CYP21HA 면역형광 이미지를 나타낸다. "RA"는 우측 부신을 지칭한다. "LA"는 좌측 부신을 지칭한다.
도 58은 부신내 투여된 rAAV 벡터를 갖는 비-인간 영장류(NHP)로부터의 데이터를 정리한 표이다. 나열된 데이터에는 우측 부신(RA) 또는 좌측 부신(LA)으로의 주사, 벡터 정체성(identity) 및 킬로그램 당 용량(㎏) 및 각각 투약된 부신에서 측정된 결과적으로 수득되는 벡터 게놈 카피(VGC)를 포함한다.
도 59는 AAV6-CAG-GFP로 처리된 비-인간 영장류 2번(NHP02)의 좌측 부신의 GFP 면역형광 이미지를 나타낸다.
도 60은 벡터의 부신내 주사 후 좌측 부신에서 AAV6-CAG-GFP의 GFP 면역형광 이미지를 나타낸다. 부신에 적용된 용량은 6.0×1011 vg였다. 저배율(상부 패널) 및 고배율(하부 패널)은 GFP-양성 세포의 넓은 분포를 보여준다. 하부 우측에는 단세포에서 GFP의 세포질 국재화를 나타내는 부신 피질의 작은 절편에 대한 고배율 20배(OBJX20) 확대도이다. 핵은 DAPI에 의해 청색으로 염색된다.
도 61은 표시된 rAAV 혈청형의 부신 내(IA) 또는 정맥 내(IV) 투여 후 비인간 영장류(NHP)의 간에서의 CYP21HA 면역 형광 이미지를 나타낸다. 흰색 화살표는 CYP21HA 발현 세포(녹색)를 나타낸다.
도 62는 야생형(WT) 인간 CYP21 돌연변이유전자, 코돈-최적화된(CO) 인간 CYP21 돌연변이유전자, 또는 야생형 시노몰구스(cynomolgus) CYP21 돌연변이유전자를 함유하는 재조합 혈청형 AAV5 벡터에 의해 처리된 비-인간 영장류(NHP)에 대한 용량 및 처리 그룹을 정리한 것이다. 모든 벡터는 CBA 프로모터 및 Kozak 서열을 포함하였다. 인간 CYP21 돌연변이유전자를 함유하는 벡터는 탈표적화를 위한 miR-122 miRNA 결합 부위를 더 포함하였다. 야생형 인간 CYP21 돌연변이유전자를 함유하는 벡터는 "AAV5-CBA-Kozak-hCYP21-miR122"로 지칭된다. 코돈-최적화된 인간 CYP21 돌연변이유전자를 함유하는 벡터는 "AAV5-CBA-Kozak-COhCYP21-miR122"로 지칭된다. 야생형 시노몰구스 CYP21 돌연변이유전자를 함유하는 벡터는 "AAV5-CBA-Kozak-cynoCYP21"로 지칭된다.
도 63은 도 62 및 실시예 13에 기술된 각각의 비-인간 영장류(NHP) 처리 군에 대한 CYP21 벡터 게놈 카피(VGC) 측정값, mRNA 측정값 및 Sal-인간 대 Sal-시노몰구스 펩타이드 비율을 나타내는 표이다. VGC 및 mRNA 행의 경우, 각 행의 상부 숫자는 평균이고, 2개의 하부 숫자는 평균에 대한 범위이다. 펩타이드 비율은 정확한 단백질 대 단백질 비율로서 간주되어서는 안된다. "hmRNA"는 인간 CYP21 mRNA를 지칭한다. "시노 mRNA"는 시노몰구스 CYP21 mRNA를 지칭한다. 지수 숫자에 대한 숫자 형식은 다음 예와 같이 해석한다:"1.28.10-2"는 "1.28×10-2"를 의미한다.
본 발명은 21-하이드록실라제(21OH)를 발현하도록 유전자조작되고 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)을 치료하는데 사용될 수 있는 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터에 관한 것이다. 몇몇 양상에서, 본 발명은 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터, 벡터를 포함하는 rAAV 입자 및 21OHD 치료를 필요로 하는 대상체에서 21OHD를 치료하는데 벡터 및 입자를 사용하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용되는 섹션의 제목은 오로지 구성의 목적이지, 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 특허, 특허 출원, 기사, 서적 및 논문을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 명세서에 인용된 모든 문서 또는 문서의 일부는 모든 목적을 위하여 그 전문이 명백히 참고 인용된 것이다. 인용된 하나 이상의 문서 또는 문서의 일부가 본 출원의 용어의 정의와 모순되는 용어를 정의하는 경우에는 본 출원에서 나타나는 정의를 따른다. 그러나, 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌, 기사, 출판, 특허, 특허 공개 및 특허 출원에 대한 언급은 이들이 유효한 선행 기술을 구성하거나 또는 세계 어느 나라에서나 일반적인 상식의 일부를 형성한다는 임의의 암시 형태인 것으로서 간주되지 않아야 한다.
본 명세서에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우에는 이들의 분율(예를 들어, 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "약"은 숫자 또는 수 앞에 바로 있을 때 숫자 또는 수 범위의 플러스 또는 마이너스 10% 범위임을 의미한다. 본 명세서에 사용된 단수 용어들은 달리 표시되지 않는 한 열거된 성분의 "하나 이상"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안예들 중 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"이라는 용어는 대안예들 중 하나 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 용어 "포함하다" 및 "함유하다"는 동의어로 사용된다.
재조합 AAV 벡터 및 입자
일 양상에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 세포에 21-하이드록실라제(21OH) 핵산 서열을 전달하기 위한 바이러스 벡터를 제공한다. 즉, 일 실시형태로서, 본 발명은 적어도 하나의 AAV 역말단 반복체(ITR) 및 프로모터에 작동하게 결합되어 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(이종 폴리뉴클레오타이드라고도 지칭됨)을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "작동 가능한 결합" 또는 "작동 가능하게 결합된"은 의도된 방식으로 기능하도록 설명된 바와 같은 성분들의 물리적 또는 기능적 병치(juxtaposition)를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능한 결합에 있는 발현 조절 요소(예컨대, 프로모터 및 인핸서(enhancer))의 예에서, 관계는 조절 요소가 핵산의 발현을 조절하도록 하는 것이다. 더 구체적으로, 예컨대 작동 가능하게 결합된 2개의 DNA 서열은 DNA 서열 중 적어도 하나가 다른 서열에 대해 생리학적 효과를 발휘할 수 있는 관계로 배열(시스 또는 트랜스)된 것을 의미한다. "작동 가능하게 결합된"은 결합되는 핵산 서열들이 근접하거나 실질적으로 근접하는 것을 의미하고, 2개의 단백질 암호 영역을 연결하는데 필요하다면 근접하고 리딩 프레임(reading frame)에 존재한다.
몇몇 실시형태에서, rAAV 벡터는 인간 21OH 단백질인 21OH 단백질을 발현한다. CYP21A2 유전자는 21OH 단백질을 암호화한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 21OH는 21OH 단백질 또는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 몇몇 경우에, 본 명세서에 기술된 rAAV 벡터에 의해 발현된 21OH 단백질은 천연(예컨대, 야생형) 21OH 단백질이다. 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 21OH 단백질 또는 폴리펩타이드는 천연 발생의 21OH 단백질과 같이 전체 길이의 천연 서열, 뿐만 아니라 천연 전체 길이의 21OH 단백질의 기능성을 어느 정도 유지하는 한, 기능성 부분서열(subsequence), 수식된 형태(modified form) 또는 서열 변형체(variant)를 포함한다. 본 발명의 방법 및 용도에 있어서, rAAV에 있는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 21OH 단백질 및 폴리펩타이드는 처리된 대상체에서 결함이 있거나, 발현이 불충분하거나 결손성인 내인성 21OH 단백질과 동일할 수 있지만, 반드시 동일할 필요는 없다.
몇몇 실시형태에서, 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 이종 서열)은 야생형 CYP21 유전자 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 이종 서열)은 야생형 CYP21 유전자 서열에 대해 코돈 최적화되었다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 21OH 암호화 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화된 서열이며, 서열번호 50을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
코돈 최적화는 암호화된 단백질의 동일한 아미노산 서열을 유지하면서 뉴클레오타이드 서열이 변경될 수 있도록 하는 유전자 코드의 중복성(redundancy)을 이용한다. 몇몇 실시형태에서, 코돈 최적화는 암호화된 단백질의 발현 증가 또는 감소를 도모하기 위해 수행된다. 이것은 뉴클레오타이드 서열의 코돈 용법을 특정 세포 유형의 것으로 맞춤제작하여 세포 유형에서 특정 tRNA의 상대적 풍부도의 편중에 상응하는 세포의 코돈 편중을 이용하여 수행한다. 상응하는 tRNA의 상대적 풍부도에 부합하도록 맞춤제작하기 위하여 뉴클레오타이드 서열의 코돈을 변경함으로써 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 이와 반대로, 상응하는 tRNA가 특정 세포 유형에서는 드문 것으로 알려져 있는 코돈을 선택함으로써 발현을 감소시키는 것이 가능하다.
몇몇 실시형태에서, 21OH 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 야생형 cDNA 서열보다 더 안정하여, 비-AAV 뉴클레오타이드 서열이 유전자 요법을 통해 전사 기구 내로 도입되는 경우 대신 결찰된 변형체 또는 절두 단백질의 생성을 피할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 이종 서열)은 서열번호 1의 아미노산 서열(표 10 참조)을 암호화한다. 다른 실시형태에서, 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화한다. 몇몇 실시형태에서, 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 이종 서열)은 적혈구응집소(HA) 태그를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된 인간 21OH cDNA이다. 특정 경우에, 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 이종 서열)은 태그, 예컨대 적혈구응집소(HA), UA, cMyc, 또는 임의의 적합한 태그를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 결합된다. "CYPHA"는 HA 태그를 암호화하는 서열에 융합된 21OH 돌연변이유전자(transgene)를 의미할 수 있다.
용어 "동일성", "상동성" 및 이의 문법적 변형들은 "정렬된" 서열인 경우 2 이상의 언급된 실체들이 동일한 것임을 의미한다. 즉, 예시적으로 2개의 폴리펩타이드 서열이 동일한 경우, 적어도 언급된 영역 또는 부분 내에서 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열이 동일한 경우, 적어도 언급된 영역 또는 부분 내에서 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 동일성은 서열의 한정된 지역(영역 또는 도메인)에 걸쳐 있을 수 있다. 동일성의 "지역(area)" 또는 "영역"은 동일한 2 이상의 언급된 실체들의 부분을 지칭한다. 즉, 2개의 단백질 또는 핵산 서열이 하나 이상의 서열 지역 또는 영역에 걸쳐 동일한 경우, 서열들은 그 영역 내에서 동일성을 공유한다. "정렬된" 서열은 참조 서열과 비교했을 때 누락 또는 추가 염기 또는 아미노산(갭)에 대한 교정을 종종 함유하는 복수의 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질(아미노산) 서열을 의미한다.
동일성은 전체 서열 길이 또는 서열의 일부에 걸쳐 전개될 수 있다. 특별한 양상에서, 동일성 퍼센트를 공유하는 서열의 길이는 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 인접한 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산, 예컨대 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 등의 인접 아미노산이다. 또 다른 특별한 양상에서, 동일성을 공유한 서열의 길이는 20 개 이상의 인접 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산, 예컨대 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 개 등의 인접 아미노산이다. 또 다른 특별한 양상에서, 동일성을 공유한 서열의 길이는 35 개 이상의 인접 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산, 예컨대 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 개 등의 인접 아미노산이다. 또 다른 특별한 양상에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 50 개 이상의 인접 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산, 예컨대 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-100, 100-110 개 등의 인접 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산이다.
용어 "상동성인" 또는 "상동성"은 2 이상의 언급된 실체들이 주어진 영역 또는 부분에 걸쳐 적어도 부분적인 동일성을 공유한다는 것을 의미한다. 상동성 또는 동일성의 "지역, 영역 또는 도메인"은 2 이상의 언급된 실체들의 부분이 상동성을 공유하거나 동일성이라는 것을 의미한다. 즉, 2개의 서열이 하나 이상의 서열 영역에 걸쳐 동일한 경우, 이 서열들은 영역에서 동일성을 공유한다. "실질적인 상동성"은 분자가 참조 분자의 하나 이상의 구조 또는 기능(예컨대, 생물학적 기능 또는 활성)의 적어도 부분적인 구조 또는 기능, 또는 상동성을 공유하는 참조 분자의 관련/해당 영역 또는 부분을 갖거나 또는 갖는 것으로 예측될 정도로 구조적 또는 기능적으로 보존된 것을 의미한다.
두 서열 사이의 동일성(상동성)의 정도는 컴퓨터 프로그램과 수학적 알고리즘을 사용하여 확인할 수 있다. 서열 동일성(상동성) 퍼센트를 계산하는 알고리즘은 일반적으로 비교 영역 또는 지역에 걸쳐 서열 갭 및 불일치를 설명한다. 예를 들어, BLAST(예를 들어, BLAST 2.0) 검색 알고리즘(예컨대, NCBI를 통해 공개적으로 입수 가능한 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403(1990)] 참조)은 다음과 같은 예시적인 검색 파라미터를 갖는다: 불일치 -2; 갭 오픈 5; 갭 확장 2. 폴리펩타이드 서열 비교를 위해, BLASTP 알고리즘은 전형적으로 PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 또는 BLOSUM 50과 같은 스코어링 매트릭스와 함께 사용된다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3) 및 SSEARCH 서열 비교 프로그램도 동일성 정도를 정량화하는데 사용된다(Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185(2000); 및 Smith et al., J. Mol Biol. 147:195(1981)). Delaunay-기반 토폴로지 맵핑을 사용하여 단백질 구조 유사성을 정량화하기 위한 프로그램도 개발되었다(Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320(2003)).
본 명세서에 기재된 rAAV 벡터 게놈 서열을 포함하는 벡터 게놈 서열은 하나 이상의 "발현 조절 요소"를 포함할 수 있다. 전형적으로, 발현 조절 요소는 작동 가능하게 결합된 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 미치는 핵산 서열이다. 벡터 내에 존재하는 프로모터 및 인핸서와 같은 본 명세서에 제시된 발현 조절 요소를 포함하는 조절 요소는 적절한 이종 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 21OH 유전자) 전사 및/또는 해독(예를 들어, 인트론을 위한 프로모터, 인핸서, 스플라이싱 신호, mRNA를 프레임내 해독하도록 하는 유전자의 정확한 리딩 프레임의 유지 등)을 용이하게 하기 위해 포함된다. 발현 조절 요소는 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱과 같은 효율적인 RNA 처리 신호 및 폴리아데닐화(polyA) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 해독 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 필요한 경우, 암호화된 생성물(예를 들어, 21OH)의 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 rAAV 벡터 게놈 서열은 Kozak 서열(예를 들어, RNA Kozak 서열로 전사 된 DNA 서열)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 rAAV 벡터 게놈 서열은 21OH 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 Kozak 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA Kozak 서열은 ACCAUGG(서열 번호 44), GCCGCCACCAUGG(서열 번호 45), CCACCAUG(서열 번호 46) 또는 CCACCAUGG(서열 번호 47)를 포함하거나, 서열로 구성된다.
발현 조절은 전사, 해독, 스플라이싱, 메시지 안정성 등의 수준에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 전사를 조절하는 발현 조절 요소는 전사된 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단(즉, "상류) 근처에 병치된다. 발현 조절 요소는 또한 전사된 서열의 3' 말단(즉, "하류") 또는 전사체 내(예를 들어, 인트론)에 위치할 수도 있다. 발현 조절 요소는 전사된 서열로부터 멀리 떨어진 거리(예를 들어, 21OH를 발현하는 뉴클레오타이드 서열로부터 100 내지 500, 500 내지 1000, 2000 내지 5000, 5000 내지 10,000 또는 그 이상의 뉴클레오타이드), 심지어 상당한 거리에 위치할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 폴리뉴클레오타이드 길이 제한으로 인해, AAV 벡터의 경우, 발현 조절 요소는 전형적으로 21OH를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로부터 1 내지 1000개의 뉴클레오타이드 내에 있을 것이다.
기능적으로, 21OH를 암호화하는 작동 가능하게 결합된 뉴클레오타이드 서열의 발현은 요소(예컨대, 프로모터)가 뉴클레오타이드 서열의 전사 및 적절한 경우 전사체의 해독을 조절하도록 하는 요소에 의해 적어도 부분적으로 조절될 수 있다. 발현 조절 요소의 구체적인 예는 프로모터이며, 이는 일반적으로 전사된 서열의 5'에 위치한다. 발현 조절 요소의 다른 예는 인핸서이며, 이는 전사된 서열의 5', 전사된 서열의 3', 또는 전사된 서열 내에 위치할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "프로모터"는 재조합 생성물(예를 들어, 21OH)을 암호화하는 핵산 서열(예를 들어, 이종 폴리뉴클레오타이드)에 인접 위치한 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 프로모터는 전형적으로 인접 서열, 예를 들어, 이종 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 결합된다. 프로모터는 전형적으로 프로모터가 존재하지 않을 때 발현되는 양과 비교하여 이종 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된 양을 증가시킨다.
본 명세서에 사용된 "인핸서"는 21OH를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 인접 위치한 서열을 지칭할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소의 상류에 위치하지만 기능하며 DNA 서열(예를 들어, 21OH를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열)의 하류 또는 내부에 위치할 수 있다. 따라서, 인핸서 요소는 이종 폴리뉴클레오타이드의 100 개 염기쌍, 200 개 염기쌍, 또는 300 개 염기쌍 이상의 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소에 의해 제공되는 증가된 발현 수준 이상으로 이종 폴리뉴클레오타이드의 발현을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 발현 조절 요소는 많은 상이한 세포 유형에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도할 수 있는 편재적, 구성적 또는 무차별적인 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 이러한 요소로는 사이토메갈로바이러스/β-액틴 혼성체(예를 들어, CAG, CB6 또는 CBA) 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터 및/또는 인핸서 서열, Rous 육종 바이러스(RSV) 프로모터 및/또는 인핸서 서열 및 다양한 포유동물 세포 유형에서 활성인 다른 바이러스 프로모터 및/또는 인핸서, 또는 자연에 존재하지 않는 합성 요소(예컨대, Boshart et al, Cell, 41: 521-530(1985)), SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, EF1 프로모터(Invitrogen), CBA 프로모터와 커플링된 즉시 초기 CMV 인핸서(Beltran et al., Gene Therapy, 17(9): 1162-1174(2010)) 및 CBh 프로모터(Gray et al., Hum Gene Ther, 22(9): 1143-1153(2011))를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 양상에서, 본 발명의 rAAV는 CMV 인핸서의 일부, 닭 베타-액틴 프로모터의 일부 및 UBC 인핸서의 일부를 함유하는 합성 CASI 프로모터를 포함한다. 예를 들어, WO 2012/115980 참조. 몇몇 실시형태에서, rAAV 벡터는 서열번호 2를 포함하거나 또는 서열번호 2와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 CAG 프로모터 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, rAAV 벡터는 서열번호 3을 포함하거나 또는 서열번호 3과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 PGK 프로모터 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, rAAV 벡터는 서열 번호 48을 포함하거나 또는 서열번호 48과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 CB6 프로모터 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, rAAV 벡터는 서열번호 49를 포함하거나, 서열번호 49와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 CBA 프로모터 서열을 포함한다. 프로모터 서열의 비제한적 예는 표 10을 참조한다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고 외인적으로 공급된 화합물, 온도와 같은 환경적 요인 또는 특정 생리학적 상태, 급성기, 세포의 특정 분화 상태의 존재, 또는 복제 세포에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 Invitrogen 및 Clontech를 포함하여, 이에 제한되지 않는 다양한 시판 공급사로부터 입수 가능하다. 많은 다른 시스템들이 기술되어 있으며 당업자에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 외인성 공급 화합물에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양(sheep) 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방암 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템; 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린 억제 시스템, 테트라사이클린 유도 시스템, RU486 유도 시스템 및 라파마이신 유도 시스템을 포함한다. 엄격하게 조절되고 21OH 발현이 필요한 특정 표적 세포 유형에 특이적인 유도성 프로모터는 모든 종류가 사용될 수 있다.
발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터)는 본 명세서에서 "조직-특이적 발현 조절 요소/프로모터"로 지칭되는 특정 조직 또는 세포 유형에서 활성인 것을 포함한다. 조직-특이적 발현 조절 요소는 전형적으로 특정 세포 또는 조직(예를 들어, 부신, 부신 피질, 간, 뇌, 중추 신경계, 척수, 눈, 망막, 뼈, 근육, 폐, 췌장, 심장, 신장 세포 등)에서 활성적이다. 이들 세포, 조직 또는 기관에서 발현 조절 요소는 전형적으로 활성적인데, 그 이유는 요소들이 특정 세포, 조직 또는 기관 유형에 고유한 전사 활성인자 단백질 또는 다른 전사 조절인자에 의해 인식되기 때문이다. 따라서, 일부 경우에, 본 발명의 rAAV 벡터는 숙주 세포(예를 들어, 부신 세포)에서 21OH 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도하는 프로모터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 부신 세포는 부신 피질 세포이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 rAAV 벡터는 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 부신 피질 세포 또는 부신 수질 세포에서 발현에 특이적인 프로모터에 작동 가능하게 결합되어 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 rAAV 벡터는 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 대상체의 부신(예컨대, 부신 피질 또는 부신 수질), 간 또는 난소에서 발현에 특이적인 프로모터에 작동 가능하게 결합되어 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 rAAV 벡터는 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 부신 줄기 세포(예를 들어, 부신피질 줄기 세포) 또는 부신 전구 세포에서 발현에 특이적인 프로모터에 작동 가능하게 결합되어 있다.
본 발명의 rAAV 벡터에 유용한 조절 서열은 추가로 프로모터/인핸서 서열과 21OH 유전자 사이에 바람직하게 위치한 인트론을 함유할 수 있다. 하나의 바람직한 인트론 서열은 SV-40으로부터 유래되며, SD-SA로 지칭되는 100 bp 미니-인트론 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체이다. 일 양상에서, rAAV 벡터는 전사후 조절 요소를 포함한다. 전사후 조절 요소의 일 예는 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사후 요소(WPRE)이다(예를 들어, 문헌[Wang and Verma, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:3906-3910(1999)] 참조). 특정 실시형태에서, 전사후 조절 요소는 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HBVPRE) 또는 RNA 수송 요소(RTE)이다. 일부 실시형태에서, WPRE 또는 HBVPRE 서열은 미국 특허 제6,136,597호 또는 미국 특허 제6,287,814호에 개시된 WPRE 또는 HBVPRE 서열 중 어느 하나이다. 일부 실시형태에서, WPRE 서열은 하기를 포함하거나 하기로 구성된다:
Figure pct00001
.
일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 폴리A 신호를 포함한다. 폴리A 신호는 SV-40, 인간 및 소를 비롯한 많은 적합한 종으로부터 유래될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
rAAV 벡터에 포함될 수 있는 다른 유용한 조절 성분은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)이다. IRES 서열 또는 다른 적합한 시스템을 단일 유전자 전사체로부터 하나보다 많은 폴리펩타이드를 생성하는데 사용될 수 있다. IRES(또는 다른 적합한 서열)는 하나보다 많은 폴리펩타이드 사슬을 함유하는 단백질을 생성하거나, 또는 동일한 세포로부터 또는 동일한 세포 내에서 2개의 상이한 단백질을 발현시키는데 사용된다. 예시적인 IRES는 폴리오바이러스 내부 리보솜 진입 서열이다. IRES는 rAAV 벡터에서 21OH 돌연변이유전자에 대해 5' 또는 3'에 위치할 수 있다. 다른 실시형태에서, rAAV 벡터는 단일 프로모터로부터 복수의 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 2A 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
재조합 "벡터" 또는 "rAAV 벡터"는 분자 방법을 사용하여 바이러스로부터 야생형 게놈을 제거하고 이를 비천연 핵산, 예를 들어, 이종 폴리뉴클레오타이드 서열(예컨대, 21OH를 발현하는 치료 유전자 발현 카세트)로 대체함으로써 AAV와 같은 바이러스의 야생형 게놈으로부터 유래된다. 전형적으로, AAV의 경우, 야생형 AAV 게놈의 하나 또는 둘 모두의 역말단 반복체(ITR) 서열이 AAV 벡터에 유지된다. rAAV 벡터는 바이러스 게놈 모두(또는 일부)가 바이러스 게놈 핵산에 대해 비천연 서열로 대체되었기 때문에 바이러스 게놈과 구별될 수 있다. 따라서, 이종 폴리뉴클레오타이드와 같은 비천연 서열의 혼입은 바이러스 벡터를 "재조합" 벡터로 정의하며, AAV의 경우 "rAAV 벡터"로 지칭될 수 있다. 21OH를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 벡터는 또한 "CYP21 벡터" 또는 "21OH 벡터"로 지칭될 수 있다. 문맥으로부터 명백한 경우, "벡터"는 단리된 재조합 뉴클레오타이드 서열 또는 재조합 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 AAV 입자 또는 비리온을 지칭할 수도 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 miRNA(마이크로RNA)에 대한 임의의 결합 부위를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 21OH 단백질의 발현이 필요하지 않은 세포에서 발현되는 miRNA에 대한 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 결합 부위를 포함한다(즉, 탈표적화). 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 miR-122에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 21OH-암호화 서열에 대한 miR-122의 결합은 miR-122가 널리 퍼져 있는 간 세포에서 서열의 발현을 감소시킬 수 있다(Thakral and Ghoshal, Curr Gene Ther. 2015; 15(2): 142-150).
rAAV 핵산 서열은 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 후속 감염(형질 전환)을 위해 바이러스("입자" 또는 "바이러스"로 본 명세서에 지칭되기도 함) 내로 패키징될 수 있다. 재조합 벡터 서열이 AAV 입자로 캡슐화되거나 패키징되는 경우, 입자는 "rAAV"로 지칭될 수 있다. 이러한 입자 또는 비리온은 전형적으로 벡터 게놈을 캡슐화하거나 패키지하는 단백질을 포함할 것이다. 특별한 예는 바이러스 외피 단백질 및 AAV의 경우 캡시드 단백질을 포함한다.
본 명세서에 기재된 rAAV 벡터 및 입자의 AAV 성분은 다양한 AAV 혈청형으로부터 선택될 수 있다. 특정 경우에, rAAV 벡터는 rh10, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 rh74 혈청형으로부터의 AAV 핵산 서열을 포함할 수 있다. AAV 성분은 AAV 혈청형으로부터 본 기술분야의 기술자에게 이용가능한 기술을 사용하여 용이하게 단리될 수 있다. 이러한 AAV는 학술적, 상업적 또는 공공 출처(예컨대, 버지니아주 매너서스에 소재하는 American Type Culture Collection)에서 단리되거나 수득할 수 있다. 대안적으로, AAV 서열은 문헌 또는 GenBank™, PubMed 등과 같은 데이터베이스에서 이용가능한 것과 같은 공개된 서열을 참조하여 합성 또는 다른 적합한 수단을 통해 수득할 수도 있다.
특정 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 편입되는 미국 특허 제7,906,111호 또는 미국 특허 제7,629,322호에 개시된 바와 같은 AAV 핵산 서열 또는 AAV 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 편입되는 미국 특허 제7,282,199호, 미국 특허 제9,587,250호 또는 미국 특허 제9,677,089호에 개시된 바와 같은 AAV 혈청형 AAV8 또는 이의 변형체로부터의 AAV 핵산 서열 또는 AAV 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 편입되는 미국 특허 제7,198,951호에 개시된 바와 같은 AAV 혈청형 AAV9 또는 이의 변형체로부터의 AAV 핵산 서열 또는 AAV 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 편입되는 미국 특허 제9,840,719호에 개시된 바와 같은 AAV 혈청형 rh74 또는 이의 변형체로부터의 AAV 핵산 서열 또는 AAV 단백질을 포함한다.
일부 양상에서, 본 발명의 rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV ITR 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV 벡터는 2개의 ITR 서열을 포함한다. 특정 경우에, AAV ITR은 rh10, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh74 또는 다른 AAV 혈청형을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 AAV 혈청형 중에서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 rAAV 벡터는 1 또는 2개의 AAV2 ITR의 서열을 포함하는 게놈을 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자를 추가로 제공한다. 따라서, 일부 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 AAV ITR 및 21OH 단백질을 암호화하는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열(이종 폴리뉴클레오타이드라고도 지칭됨)을 포함하고, 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 결합되어 있는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 입자에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 rh10, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 rh74 또는 다른 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 캡시드 단백질을 포함한다.
일 실시형태에서, rAAV 벡터는 인간 21OH cDNA, AAV2로부터의 ITR, 및 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 유전자로부터의 인핸서, 닭 β-액틴 유전자로부터의 프로모터, 스플라이스 공여체 및 인트론, 및 토끼 β-글로빈 유전자로부터의 스플라이스 수용체로 이루어지는 CAG 프로모터를 포함하는 rh10 AAV 벡터이다. 추가 실시형태에서, rAAV 벡터는 서열번호 1을 포함하는 21OH 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 2를 포함하거나 이로 구성된 CAG 프로모터를 포함한다. 일 실시형태에서, rAAV 벡터는 인간 21OH cDNA, AAV2로부터의 ITR 및 PGK 프로모터를 포함하는 rh10 AAV 벡터이다. 다른 실시형태에서, rAAV 벡터는 서열번호 1을 포함하는 21OH 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 3을 포함하거나 이로 구성된 PGK 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV1 캡시드 및 인간 21OH cDNA, CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터 및 선택적으로 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 실시예 9에 기재된 ssAAV1-PGK-CYP21HA 벡터이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV1-CAG-CYP21, AAV1-PGK-CYP21, AAV1-CBA-CYP21, 또는 AAV1-CB6-CYP21 벡터이다. 다른 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV5 캡시드 및 인간 21OH cDNA, CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터 및 선택적으로 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 실시예 7에 기재된 ssAAV5-PGK-CYP21HA 벡터이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV5-CAG-CYP21, AAV5-PGK-CYP21, AAV5-CBA-CYP21 또는 AAV5-CB6-CYP21 벡터이다. 또 다른 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 인간 21OH cDNA, CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터 및 선택적으로 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는 AAV6 벡터이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV6-CAG-CYP21, AAV6-PGK-CYP21, AAV6-CBA-CYP21 또는 AAV6-CB6-CYP21 바이러스이다. 추가 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV8 캡시드 및 인간 21OH cDNA, CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터 및 선택적으로 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV8-CAG-CYP21, AAV8-PGK-CYP21, AAV8-CBA-CYP21 또는 AAV8-CB6-CYP21 바이러스이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 인간 21OH cDNA, CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터 및 선택적으로 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는 AAV9 벡터이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV9-CAG-CYP21, AAV9-PGK-CYP21, AAV9-CBA-CYP21 또는 AAV9-CB6-CYP21 벡터이다. 추가 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV10 캡시드 및 인간 21OH cDNA, CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터 및 선택적으로 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV10-CAG-CYP21, AAV10-PGK-CYP21, AAV10-CBA-CYP21 또는 AAV10-CB6-CYP21 바이러스이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 rh10 AAV 캡시드 및 인간 21OH cDNA, CAG, PGK, CBA 또는 CB6 프로모터 및 선택적으로 1 또는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 실시예 1에 기재된 AAVrh10-CAG-CYP21A2-HA 바이러스이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAVrh10-CAG-CYP21, AAVrh10-PGK-CYP21, AAVrh10-CBA-CYP21 또는 AAVrh10-CB6-CYP21 벡터이다. 이들 실시형태 중 임의의 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 2, 3, 48 또는 49를 포함하거나, 이 서열로 이루어질 수 있거나, 또는 서열번호 2, 3, 48 또는 49와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이 서열로 이루어질 수 있다. 상기 실시형태 중 임의의 실시형태에서, rAAV 벡터는 Kozak 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, Kozak 서열은 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46 또는 서열번호 47을 포함하거나 이 서열로 전사될 수 있다. 이들 실시형태 중 임의의 실시형태에서, rAAV 벡터는 HBVPRE 서열 또는 WPRE 서열(예를 들어, 서열번호 51)을 더 포함할 수있다.
일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 CBA 프로모터의 제어하에 인간 21OH를 암호화하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, Kozak 서열을 포함하며 추가로 miR-122 결합 서열을 포함하거나 포함하지 않는 AAV5 혈청형 벡터 또는 입자이다. 일 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 실시예 13에 기재된 AAV5-CBA-Kozak-COhCYP21-miR122 벡터이다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터 또는 입자는 AAV5-CBA-Kozak-hCYP21, AAV5-CBA-Kozak-hCYP21-miR122 또는 AAV5-CBA-Kozak-COhCYP21 벡터이다. 이들 실시형태 중 임의의 실시형태에서, 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 50을 포함할 수 있고 Kozak 서열은 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46 또는 서열번호 47을 포함하거나 이 서열들로 전사될 수 있다. 이들 실시형태 중 임의의 실시형태에서, rAAV 벡터는 HBVPRE 서열 또는 WPRE 서열(예를 들어, 서열 번호 51)을 더 포함할 수 있다.
rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 vp1, vp2, vp3 및 초가변 영역을 포함하는 캡 단백질, rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40을 포함하는 rep 단백질, 및 이들 단백질을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 이들 AAV 성분은 다양한 벡터 시스템 및 숙주 세포에서 쉽게 이용될 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 사용될 수 있거나, 다른 AAV 혈청형 서열 또는 성분과 조합으로 또는 비-AAV 바이러스 서열의 요소들과 조합으로 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 인공 AAV 혈청형은 비-천연 발생의 캡시드 단백질을 갖는 AAV를 제한 없이 포함한다. 이러한 인공 캡시드는 선택된 AAV 서열(예를 들어, vp1 캡시드 단백질의 단편)을 다른 선택된 AAV 혈청형, 동일한 AAV 혈청형의 비-인접 부분, 비-AAV 바이러스 근원 또는 비-바이러스 근원으로부터 수득할 수 있는 이종 서열과 조합으로 사용하여 임의의 적합한 기술에 의해 생성될 수 있다. 인공 AAV 혈청형은 의사형 AAV, 키메라성 AAV 캡시드, 재조합 AAV 캡시드 또는 "인간화된" AAV 캡시드일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 하나의 AAV의 캡시드가 이종 캡시드 단백질에 의해 대체된 의사형 벡터가 본 발명에 유용하다. 일 실시형태에서, AAV는 AAV2/5이다. 다른 실시형태에서, AAV는 AAV2/8이다. 예를 들어, Mussolino et al., Gene Therapy, 18(7): 637-645(2011); Rabinowitz et al., J Virol, 76(2): 791-801(2002) 참조.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 유용한 벡터는 최소한 선택된 AAV 혈청형 캡시드를 암호화하는 서열 또는 이의 단편을 함유한다. 일부 실시형태에서, 유용한 벡터는 최소한 선택된 AAV 혈청형 rep 단백질을 암호화하는 서열 또는 이의 단편을 함유한다. 선택적으로, 이러한 벡터는 AAV 캡 및 rep 단백질을 둘 다 함유할 수 있다. AAV rep 및 캡이 모두 제공된 벡터에서, AAV rep 및 AAV 캡 서열은 모두 하나의 혈청형인 것일 수 있다. 대안적으로, rep 서열은 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래되고 캡 서열은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래되는 벡터가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, rep 및 cap 서열은 별도의 공급원(예를 들어, 별도의 벡터, 또는 숙주 세포 및 벡터)으로부터 발현된다. 다른 실시형태에서, rep 서열은 상이한 AAV 혈청형의 캡 서열에 프레임대로 융합되어 키메라성 AAV 벡터, 예컨대 전문이 본 명세서에 참조에 의해 편입되는 미국 특허 제7,282,199gh에 기재된 AAV2/8을 형성한다.
적합한 rAAV는 본 명세서에 정의된 바와 같은 AAV 혈청형 캡시드 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열; 기능성 rep 유전자; 최소한 AAV 역말단 반복체(ITR) 및 21OH(CYP21A2) 핵산 서열로 구성된 핵산 분자; 및 AAV 캡시드 단백질 내로 핵산 분자의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 숙주 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 일부 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 rAAV 벡터 또는 rAAV 입자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. AAV 캡시드에 rAAV 벡터를 패키징하기 위해 숙주 세포에 존재해야 하는 성분은 숙주 세포에 트랜스(trans)로 제공될 수 있다. 대안적으로, 임의의 하나 이상의 필요한 성분(예를 들어, 벡터, rep 서열, 캡 서열 및/또는 헬퍼 기능)은 본 기술분야의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 하나 이상의 필요한 성분을 함유하도록 조작된 안정한 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 가장 적합하게는, 이러한 안정한 숙주 세포는 유도성 프로모터의 제어 하에 필요한 성분(들)을 함유할 것이다. 그러나, 필요한 성분(들)은 구성적 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 적합한 유도성 및 구성적 프로모터의 예는 비-AAV 뉴클레오타이드 서열, 즉 21OH과 사용하기에 적합한 조절 요소들에 대한 상기 논의에서 본 명세서에 제공되어 있다. 또 다른 대안으로, 선택된 안정한 숙주 세포는 구성적 프로모터의 제어 하에 선택된 성분(들) 및 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어 하에 다른 선택된 성분(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 293 세포(구성적 프로모터의 제어 하에 E1 헬퍼 기능을 함유함)로부터 유래되지만 유도성 프로모터의 제어 하에 rep 및/또는 캡 단백질을 함유하는 안정한 숙주 세포가 생성될 수있다. 또 다른 안정한 숙주 세포는 당업자에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 rAAV를 생성하는데 필요한 rAAV 벡터, rep 서열, 캡 서열 및 헬퍼 기능은 운반된 서열을 전달하는 임의의 유전자 요소의 형태로 패키징 숙주 세포에 전달될 수 있다. 선택된 유전자 요소는 본 명세서에 기술된 것을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 본 발명의 임의의 실시형태를 구성하는데 사용된 방법은 핵산 조작에 숙련된 자에게 공지되어 있으며 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY] 참조. 이와 마찬가지로, rAAV 입자를 생성하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 전문이 참조에 의해 편입되는, 문헌[Fisher et al., J. Virol., 70: 520-532 (1993)] 및 미국 특허 제5,478,745호를 참조한다.
일 양상에서, 본 발명은 rAAV 입자를 생성하는 방법으로서, 해당 방법은 (a) 본 명세서에 기술된 바와 같은 21OH를 발현하는 rAAV 벡터 게놈을 포함하거나 이로 구성된 핵산 분자; (b) AAV rep를 암호화하는 핵산 분자; (c) 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및 (d) rAAV 벡터 게놈을 rAAV 입자로 패키징하기에 충분한 헬퍼 기능을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 rAAV 입자는 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 정제될 수있다. 일 실시형태에서, rAAV 바이러스는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제 될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제2018/0163183 A1호를 참조한다.
재조합 AAV 벡터 및 입자의 용도
본 발명은 21OH의 결핍 또는 기능장애를 특징으로 하는 장애 또는 질환이 있는 대상체에게 치료상의 이익을 제공하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 21OH를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV의 방법 및 용도를 포함한다. 일부 양상에서, 방법은 본 명세서에 기재된 치료적 유효량의 rAAV를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 대상체에서 21OH의 결핍 또는 기능장애를 특징으로 하는 상기 장애 또는 상기 질환을 치료하는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 본 발명은, 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여 대상체에서 21OH를 발현시키는 단계를 포함하는, 21OH를 필요로 하는 대상체에서 21OH를 발현시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여 대상체에서 21OH의 발현을 증가시키는 단계를 포함하는, 21OH를 필요로 하는 대상체에서 21OH의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 rAAV는 대상체의 부신(예를 들어, 부신 피질 또는 부신 수질), 간 또는 난소에서 21OH의 발현을 유발하거나 21OH의 발현을 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 rAAV는 대상체의 부신 줄기 세포(예를 들어, 부신피질 줄기 세포) 또는 부신 전구 세포에서 21OH의 발현을 유발하거나 21OH의 발현을 증가시킨다.
본 발명은 21-하이드록실라제 결핍(21OHD)이 있는 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하여 대상체의 21OHD를 치료하는 투여 단계를 포함하는, 21OHD가 있는 대상체를 치료하는 방법을 고려한다. 치료 방법은 투여 단계 전에 21OHD가 있는 대상체를 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체가 질환의 하나 이상의 증상을 갖지 않더라도 대상체는 21OHD(예를 들어, 유전자 또는 생리학적 시험에 의해)를 갖는 것으로 선별되고 식별되거나 진단될 수 있다. 다른 실시형태에서, 대상체는 21OHD의 하나 이상의 증상을 갖는다. 특정 실시형태에서, 대상체는 CYP21A2 유전자에 돌연변이를 갖는다. 일 실시형태에서, 대상체는 CYP21A2 유전자에 기능 상실 돌연변이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 대상체는 기능적 CYP21A2 유전자 및 밀접하게 연관된 비-기능성 CYP21A1P 의사유전자 사이에 유전자 변환 또는 재조합에 의해 야기된 CYP21A2 유전자에 결함을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 21OHD(또는 CAH)를 갖는 대상체에서 21OHD(또는 선천성 부신과다형성증, CAH)의 증상의 진행을 치료, 감소, 개선, 지연시키거나 또는 증상을 예방하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 21OHD(또는 CAH) 증상의 비제한적 예에는 생식기 및 근육 질량 남성화, 유아기의 염 소모 및 탈수, 성기능 장애(고전적 형태) 및 다모증, 여드름 및 생식능력 저하(고전적 및 비고전적 형태)가 포함된다. 남성 환자에서 21OHD(또는 CAH) 증상의 비제한적 예에는 단신 및 조기 남성화를 포함한다. Prader 분류 시스템은 인체 생식기의 남성화 정도를 측정하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 치료되는 대상체는 21OHD(또는 CAH)의 Prader 단계 IV 또는 V형을 앓고 있는 대상체이다.
본 명세서에 기재된 임의의 치료 방법에서, 21OH를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 상기 rAAV 입자를 부신 피질 맥관 구조 내로 또는 부신 피질 자체에 도입시키는 임의의 수단에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 21OH를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에게 정맥내로; 개복 수술(open surgery) 또는 복강경 검사를 통해 부신으로의 직접 주사에 의해; 카테터화를 통해 부신 동맥으로의 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 부신으로의 직접 주사는 부신 피질로의 직접 주사이다.
특정 양상에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 21OH를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 선천성 부신과다형성(CAH)을 앓고 있는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 21OH의 결핍은 종종 부신에 영향을 미치는 유전적 장애 군(family)인 CAH를 초래한다. CAH는 대상체에 중증 또는 경미한 형태로 존재할 수 있다. 고전적인 CAH라고 불리는 중증 형태는 대개 신생아 또는 유아기에 검출된다. 비고전적 CAH(NCAH 또는 NCCAH) 또는 후기 발병 CAH라고 불리는 경미한 형태는 유아기부터 성인기에 이르기까지 언제든지 증상을 유발시킬 수 있다(예컨대, Kurtoglu et al., J Clin Res Pediatr Endocrinol, 9(1): 1-7(2017)). 본 발명의 rAAV는 고전적 CAH 또는 비고전적 CAH를 갖는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 고전적인 CAH를 가진 대상체는 외부 생식기의 태아 남성화, 글루코코르티코이드 및 미네랄코르티코이드의 생성이 낮거나 없음을 겪을 수 있고 과량의 안드로겐을 생성할 수 있다. 비-고전적 CAH를 가진 대상체는 태아 남성화 없이, 그리고 코티솔 및 알도스테론 결핍 없이 안드로겐의 생성 증가를 겪을 수 있다.
코티솔은 부신에 의해 생성된 스테로이드이다. 코티솔은 신체적 및 정서적 스트레스에 반응하고 적절한 에너지 공급 및 혈당 수준을 유지하기 위해 신체에서 사용된다. 부신은 뇌의 기저부에 있는 작은 완두콩 크기의 샘인 뇌하수체에 의해 조절된다. 건강한 개인에서 뇌하수체는 혈류에 코티솔이 충분하지 않으면 부신피질 자극 호르몬(ACTH)을 방출한다. ACTH는 부신을 자극하여 더 많은 코티솔을 생성한다. 그러나, CAH를 가진 사람들은 전구체 17-하이드록시프로게스테론(17-OHP)을 코티솔로 변환시키는데 필요한 21OH를 불충분한 양으로 갖는다. 결과적으로, 뇌하수체는 코티솔의 필요를 계속 감지하고 더 많은 ACTH를 방출한다. 이것은 부신에서 과량의 안드로겐(남성화 스테로이드 호르몬)으로 변환되는 17-OHP의 과잉을 초래한다. 이와 같이, 대상체는 영향을 받는 스테로이드 호르몬의 증가된 혈행 수준을 결정함으로써 CAH로 진단될 수 있다. 21OHD에 대한 신생아 선별은 일반적으로 17-OHP 측정을 사용하여 달성된다. 또한, CAH를 갖는 대상체는 17-OHP의 혈행 수준을 추적함으로써 모니터링될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 영향을 받는 스테로이드 호르몬의 혈행 수준은 본 명세서에 기재된 바와 같은 21OH를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 rAAV 입자 또는 상기 입자를 포함하는 약제학적 조성물에 의한 치료 전, 치료 동안 및/또는 치료 후에 CAH를 갖는 대상체에서 측정될 수 있다. 대상체에서 17-OHP의 혈행 수준은 대상체를 진단하고, 대상체를 본 명세서에 기재된 rAAV 입자 또는 약제학적 조성물로 치료를 시작할 지 또는 계속할 지에 대한 결정을 알아내는데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 대상체는 인간, 비인간 영장류, 돼지, 말, 소, 개, 고양이, 토끼, 기니아 피그, 햄스터, 마우스 또는 래트일 수 있다. 대상체는 인간 여성 또는 인간 남성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 유아이다. 특정 경우에, 대상체는 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월 또는 약 1 세인 인간 유아이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 3개월 미만, 6개월 미만, 9개월 미만, 1세 미만 또는 18개월 미만의 인간 유아일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "필요로 하는 환자" 또는 "필요로 하는 대상체"는 21OH를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 또는 본 명세서에 제공된 rAAV를 포함하는 조성물에 의한 치료 또는 개선으로 처리될 수 있는 질환, 장애 또는 병태의 위험이 있거나 이를 앓고 있는 환자 또는 대상체를 지칭한다. 필요로 하는 환자 또는 대상체는, 예를 들어, 21OHD와 같은 21OH의 기능장애와 관련된 질환으로 진단된 환자 또는 대상체일 수 있다. 대상체는 21OH 유전자 또는 단백질에 돌연변이 또는 기능장애를 가질 수 있다. "대상체" 및 "환자"는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 장애, 예컨대 21OHD 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 지속기간을 감소시키거나 개선시키거나, 장애의 진행을 방지하거나, 장애의 퇴행을 유발하거나, 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 재발, 발달, 개시 또는 진행을 방지하거나, 장애를 검출하거나, 또는 다른 치료법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)의 예방 또는 치료 효과(들)를 증진 또는 향상시키기에 충분한 약학적 제제, 예를 들어, rAAV의 양을 지칭한다. rAAV의 유효량은 예를 들어, 21OH의 발현을 증가시키고/시키거나 21OHD와 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다.
본 발명은 또한 21OH의 기능장애 또는 결핍을 특징으로 하는 장애 또는 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 명세서에 기재된 약학적 제제(예를 들어, rAAV 또는 rAAV를 포함하는 약제학적 조성물)의 용도를 고려한다. 또한, 본 발명은 대상체에서 21OH의 기능장애 또는 결핍을 특징으로 하는 장애 또는 질환을 치료하기 위해 사용되는 본 명세서에 기재된 약학적 제제(예를 들어, rAAV 또는 rAAV를 포함하는 약제학적 조성물)의 용도를 포함한다.
약제학적 조성물 및 투여 경로
본 발명의 rAAV 벡터 또는 입자는 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 rAAV 벡터 또는 rAAV 입자(예를 들어, 21OH를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 입자) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 명세서에 사용된 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 본 기술분야에 공지된 경로를 사용하여 투여 시 일반적으로 알레르기 또는 다른 심각한 부작용을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 동물, 특히 인간에서 사용하기 위해 미국 연방 또는 미국 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 등재된 분자 실체 및 조성물은 "약제학적으로 허용 가능한"인 것으로 간주된다. 본 명세서에 사용된 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 약제학적 투여에 적합한 임의의 용매 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 담체는 본 명세서에 참조에 의해 편입되는 본 기술 분야의 표준 참고 서적인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]의 최신판에 기재되어 있다. 이러한 담체 또는 희석제의 일부 예는 물, 식염수, 완충 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 5% 인간 혈청 알부민 및 pH를 적절한 생리학적 수준으로 유지시키기 위한 다른 완충액, 예를 들어, HEPES를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 약제학적 활성 물질(예를 들어, 재조합 바이러스 입자)을 위한 매질 및 제제의 사용은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제는 활성 화합물과 비적합성인 경우를 제외하고, 본 조성물에 사용되는 것이 고려된다. 보충 활성 화합물이 조성물에 혼입될 수도 있다.
본 명세서 전체에서, "vg"는 "바이러스 게놈" 또는 "벡터 게놈"을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 개시된 rAAV의 투여에 사용될 수 있는 약제학적 조성물 및 전달 시스템의 예는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; Remington's Pharmaceutical Sciences(1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms(1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations(2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Md.; 및 Poznansky et al., Drug Delivery Systems(1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화될 수 있다. 투여 경로의 예는 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내 투여 또는 주사를 포함한다. 주사는 개복 수술 또는 복강경 검사를 통한 부신에 직접 주사, 또는 카테터화를 통한 부신 동맥에 주사를 포함할 수 있다. 비경구(예를 들어, 정맥내 또는 주사를 통해) 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 주사 용수, 식염수, 고정 유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액, 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장력 조정용 제제. pH는 염산 또는 수산화 나트륨과 같은 산 또는 염기로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이엘에 동봉될 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL®(BASF, 미국 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사성이 존재할 정도로 유체여야 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대비하여 보존적이어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사성 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 활성 화합물을 필요한 양으로 적당한 용매 중에, 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 성분들의 조합과 함께 혼입한 후 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 이전의 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 바람직한 추가 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
주사를 위해, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 액체일 수 있다. 예시적인 생리학적 허용성 담체는 발열원이 없는 멸균수 및 발열원이 없는 멸균 포스페이트 완충 식염수를 포함한다. 이와 같은 공지된 다양한 담체는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 편입된 미국 특허 제7,629,322호에 제공되어 있다. 일 실시형태에서, 담체는 등장성 염화나트륨 용액이다. 다른 실시형태에서, 담체는 평형 염 용액이다. 일 실시형태에서, 담체는 TWEEN®(폴리소르베이트)을 포함한다. rAAV를 장기간 보관해야 하는 경우, 글리세롤 또는 TWEEN®(폴리소르베이트) 20의 존재하에 동결될 수 있다.
투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 조제하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용된 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하고; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성제(예를 들어, rAAV)를 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 사양은 활성제(예를 들어, rAAV)의 고유한 특성 및 달성될 특정 치료 효과 및 개체의 치료를 위해 활성제(예컨대, rAAV)를 배합하는 기술에 내재하는 제한에 의해 좌우되고 직접적으로 의존적이다. 단위 투여 형태는 예를 들어, 앰플 및 바이알 내에 있을 수 있으며, 이는 액체 조성물 또는 냉동건조 또는 동결건조된 상태의 조성물을 포함할 수 있고; 멸균 액체 담체는, 예를 들어, 생체내 투여 또는 전달 전에 첨가 될 수 있다. 개별 단위 투여 형태는 다회 용량 키트 또는 용기에 포함될 수 있다. 재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 서열, 플라스미드, 벡터 게놈, 재조합 바이러스 입자(예를 들어, rAAV), 및 이의 약제학적 조성물은 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단회 또는 다회 단위 투여 형태로 포장될 수 있다.
조성물은 치료될 지역의 크기, 사용된 바이러스 역가, 투여 경로 및 방법의 원하는 효과에 따라, 범위 내의 모든 수를 포함하여 약 50㎕ 내지 약 1㎖의 부피로 전달될 수 있다. 일 실시형태에서, 부피는 약 50㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 70㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 100㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 125㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 150㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 175㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 200㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 250㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 300㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 450㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 500㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 600㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 750㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 850㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 1000㎕이다.
일부 실시형태에서, 프로모터 서열의 제어하에 원하는 돌연변이유전자(예를 들어, 21OH)를 암호화하는 핵산 서열을 운반하는 rAAV의 유효 농도는 밀리리터당 약 108 내지 약 1013 벡터 게놈(vg/㎖)의 범위이다. 예를 들어, rAAV 감염성 단위는 문헌[McLaughlin et al., J. Virol., 62: 1963(1988)]에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 농도는 약 1.5×109 vg/㎖ 내지 약 1.5×1012 vg/㎖이다. 일부 실시형태에서, 농도는 약 1.5×109 vg/㎖ 내지 약 1.5×1011 vg/㎖이다. 일 실시형태에서, 유효 농도는 약 1.5×1010 vg/㎖이다. 다른 실시형태에서, 유효 농도는 약 1.5×1011 vg/㎖이다. 다른 실시형태에서, 유효 농도는 약 2.8×1011 vg/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 유효 농도는 약 1.5×1012 vg/㎖이다. 추가의 실시형태에서, 유효 농도는 약 1.5×1013 vg/㎖이다. 일부 실시형태에서, 독성 또는 불리한 면역 반응과 같은 바람직하지 않은 효과의 위험을 감소시키기 위해서는 최저 유효 농도의 바이러스가 사용되는 것이 바람직하다. 이들 범위의 또 다른 투여량은 치료 중인 대상체(예를 들어, 인간)의 신체 상태, 대상체의 연령, 특별한 21OH 결핍 장애 및 장애가 진행성인 경우 발달된 정도를 고려하여 주치의에 의해 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 21OH를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 대상체의 약 1011 내지 약 1014 vg/㎏ 체중 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 21OH를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터 또는 rAAV 입자는 약 1.5×1012 vg/㎏ 또는 3×1012 vg/㎏의 용량으로 대상체에게 투여된다.
21OH를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터 또는 rAAV 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 투여 지침서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수있다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명될 것이며, 이는 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1: 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터 및 입자의 구축 및 생산, 및 시험관내 세포의 처리
인간 21-하이드록실라제(CYP21A2) cDNA를 헤마글루티닌(HA) 태그에 융합시키고 pAAV2-CAG 플라스미드에 서브클로닝하여 AAV2로부터의 바이러스 역말단 반복체 및 사이토메갈로바이러스/β-액틴 혼성체(CAG) 프로모터를 포함하는 pAAV2-CAG-CYP21A2-HA 플라스미드를 생성하였다. CAG 프로모터는 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 유전자로부터의 인핸서, 닭 β-액틴 유전자로부터의 프로모터, 스플라이스(splice) 공여체 및 인트론, 및 토끼 β-글로빈 유전자로부터의 스플라이스 수용체로 구성되었다. 모의 플라스미드는 모의 벡터를 생성하는데 사용된 CAG 프로모터 하에 β-갈락토시다제 cDNA의 비암호 서열을 이용하여 구축하였다. AAVrh10-CAG-CYP21A2-HA("CYP21") 및 모의 벡터는 낭트 대학 병원의 Vector Core에서 이미 설명된 바와 같이 생성하였다. 예컨대, 문헌[Gao, G.P. and Sena-Esteves, M. (2012). Introducing Genes into Mammalian Cells: Viral Vectors. In Molecular Cloning, Vol 2: A Laboratory Manual (M.R. Green and J. Sambrook eds.) pp. 1209-1313. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Rabinowitz et al., J Virol, 76(2):791-801 (2002)] 참조. AAVrh10-CAG-CYP21A2-HA 바이러스는 AAV2 ITR 서열을 갖는 게놈을 함유하고 rh10 캡시드 단백질을 암호화한다.
2.5% 태내 소 혈청, 15% 말 혈청, 1% 글루타민, 페니실린-스트렙토마이신 1%가 보충된 Ham의 F10 배지를 이용하여 마우스 Y1 부신피질 종양 세포를 유지시켰다. 세포는 FuGENE HD(Promega, 프랑스 샤흐보니에흐-레-방 소재)를 사용하여 pAAV2-CAG-CYP21A2-HA("pCYP21") 또는 pAAV2-CAG-루시퍼라제("pLuc")로 형질감염시켰다. 형질 감염 48시간 후에 상청액 및 세포를 수확하였다.
실시예 1 내지 6 및 관련 도면은 문헌[Perdomini et al., Gene Therapy, 24 (5): 275-281(2017)]에도 기재되어 있다.
실시예 2: 뮤린 모델에서 21-하이드록실라제 결핍의 일반적인 설명 및 동물 치료 절차
21-하이드록실라제 결핍(21OHD)의 마우스 모델은 21OH 활성이 없는 H-2aw18 마우스(Cyp21 -/-)에 의해 제공된다. 유전적 결함은 활성 Cyp21a1 유전자와 의사유전자(pseudogene) 사이의 불균등한 교차에 의해 유발되어, Cyp21a1의 부분 결실을 포함하는 혼성체 Cyp21a1-Cyp21a2-p 유전자를 초래한다(Riepe et al., Endocrinology 2005; 146: 2563-2574). Cyp21 -/- 마우스는 비정상적인 시상하부-뇌하수체-부신 피드백, 부신 수질 및 피질의 구조 및 기능의 변경을 갖는 것으로 알려져 있다(Tajima et al., Endocrinology 1999; 140: 3354-3362; Bornstein et al., FASEB J 1999; 13: 1185-1194). 글루코코르티코이드 투여 없이, 마우스 모델에서 Cyp21a1 유전자의 결실은 치명적인 것으로 알려져 있다. Cyp21 -/- 마우스는 어미와 새끼에게 초기 글루코코르티코이드 투여에도 불구하고 극히 영향을 받기 쉽다. 신생아 기간 동안 생존한 성체 Cyp21 -/- 마우스에는 취약함이 규칙으로 남아 있다(Tajima et al., Endocrinology 1999; 140: 3354-3362).
이종접합성 마우스를 사육하여 돌연변이에 대해 동종접합성인 마우스를 생성시켰다. 동종접합(Cyp21 -/- ) 마우스, 이형접합 새끼(Cyp21 +/- ) 및 야생형 새끼(Cyp21 +/+ )를 실험 및 분석에 사용하였다. 마우스의 유전자형은 꼬리 생검으로부터의 게놈 DNA를 이용한 PCR-기반 분석을 사용하여 확인하였다. 모든 어미는 임신 20 일부터 출생후 7 일까지 5㎍의 덱사메타손 주사를 받았다. 새끼는 14 일까지 2 일마다 코르티코스테론(5 ㎍/일)과 플루드로코르티손(0.025 ㎍/일)으로 처리하였다. 이 연령 후, 마우스는 12시간의 명암 사이클을 갖고 정규 설치류 식이 펠릿과 물을 임의로 자유롭게 이용할 수 있는 온도 및 습도 조절된 동물 시설에서 유지시켰다. 모든 실험에는 수컷 및 암컷 마우스를 모두 사용하였다. 모든 동물 절차 및 실험은 지역 윤리위원회(CEA의 윤리위원회, CEtEA)와 프랑스 국가교육고등교육연구부(20150401 1101 8958(APAF1S#410).01)의 승인을 받았으며, 실험실 동물의 관리 및 사용 안내서(미국 국립보건원)에 따라 수행하였다.
실시예 3: 실험 방법
동물 절차
생체분포 연구를 위해, 성체 대조군 마우스를 아이소플루란(3%)으로 마취하고, AAVrh10-CAG-GFP를 체중 1g당 2×1010 벡터 게놈 용량으로 안와후방 주사에 의해 정맥내 투여하였다. 처리 3주 후, 마우스에 펜토바르비탈을 복강내 주사하고, 저온 식염수를 관류시켰다.
유전자요법 연구를 위해, Cyp21 -/- 마우스는 체중 1g 당 2×1010 벡터 게놈의 용량으로 CYP21 벡터를 제공받았다. Cyp21 -/- , Cyp21 +/- 및 Cyp21 +/+ 마우스 새끼에게는 모의 벡터를 체중 1 그램 당 2×1010 벡터 게놈의 용량으로 주사하였다.
오전 9시에서 11시 사이에 소변을 수집하였다(방광 마사지 후). 소변이 분변이나 동물 케이지의 다른 물질에 의해 오염되지 않도록 주의를 기울였다. 모든 샘플을 분취하고 -20℃에서 즉시 동결시켰다.
처리 18주 후, 마우스에 펜토바르비탈을 복강내 주사하고 저온 식염수 용액으로 관류시켰다. 심장내 천자에 의해 혈액을 수집하였다. 생화학 및 분자 분석을위한 조직 샘플은 액체 질소에서 즉시 동결시켰다. 조직학적 분석을 위해, 조직을 PFA 4%에 후고정시켰고, 수크로스에서 동결방지하고 OCT(Thermo Fisher Diagnostics, 프랑스 아스니에흐-슈흐-쎈느 소재)에 매립하고 드라이아이스에서 냉각된 이소펜탄에서 스냅 동결시켰다.
조직병리학
조직화학 분석을 위해, 10㎛ 동결절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.
면역형광 및 이미지 획득
AAVrh10-CAG-GFP 벡터의 발현은 GFP 검출을 통해 녹색 형광에 의해 평가하였다. 현미경분석은 Nikon Eclipse TI 도립현미경(프랑스 셩빠니-슈흐-마흔느 소재)에서 수행하였다.
벡터 카피 수(VCN) 결정
DNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 DNeasy Blood & Tissue 키트(Qiagen, 프랑스 쿠르타뵈프 소재)를 사용하여 상이한 조직으로부터 추출하였다. 각 조직에 대한 이배체 세포당 벡터 게놈의 양은 표준 조건을 사용하여 Plantinum Quantitative PCR SuperMix-UDG(Thermo Fisher Scientific, 프랑스 쿠르타뵈프 소재)로 qPCR에 의해 결정되었다. 프라이머는 CYP21A2 돌연변이유전자(정방향 5'-ACAGTCATCATTCCGAACCTCCA-3'(서열번호 4), 역방향 5'-AAGGCCAGAGCTCTGGAGTTCTT-3'(서열번호 5)) 및 숙주 게놈의 마우스 뇌 유래 신경영양성 인자(정방향 5'-TGCTGGATGAGGACCAGAAGGTT-3'(서열번호 6), 역방향 5'-AGGAGGCTCCAAAGGCACTTGA-3'(서열번호 7))에 대하여 표적화되었다. 증폭은 Light Cycler 480(Roche Diagnostics, 프랑스 멜렁 소재)을 사용하여 수행하였다.
정량적 실시간 PCR
총 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 Precellys24 균질화기(Ozyme, 프랑스 셍껑땅 엉 이블린 소재) 및 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 스냅 냉동된 조직으로부터 추출하였고 DNAse I(Promega)로 처리하였다. cDNA는 SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 역전사에 의해 생성하였다. 정량적 RT-PCR은 표 1에 기재된 프라이머를 가지고 Plantinum Quantitative PCR SuperMix-UDG(Thermo Fisher Scientific) 및 Light Cycler 480(Roche Biosciences)을 사용하여 수행하였다. 마우스 TATA 박스 결합 단백질(Tbp)을 암호화하는 유전자는 내부 표준물질로서 사용하였다. 미가공 데이터는 각각의 유전자형에 대한 피질 세포의 양에 따라 정규화하였다.
Figure pct00002
면역블롯 분석
조직 또는 Y1 세포의 추출물을 용해 완충액(Promega)에서 균질화시켰다. 총 단백질 추출물(5㎍)을 nupage 4-12% Bis-Tris Gels NP0323BOX(ThermoFisher Scientific)에서 분석하였다. 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 5% 탈지유로 차단한 후, 다음 1차 항체와 함께 항온처리하였다: 인간 및 마우스 단백질을 검출하는 21-하이드록실라제에 대한 폴리클로널 항체(Corgen, 대만 타이베이 소재), GAPDH에 대한 항체(Abcam, 영국 케임브리지 소재; Ab9484, 1:3000). 퍼옥시다제에 커플링된 이차 항체 항-마우스 IgG(GE Healthcare, 프랑스 벨리지빌라쿠블레 소재)는 1:3000으로 희석하였고 Clarity Western ECL Substrate(Bio-rad, 프랑스 마흔느-라-꼬께뜨 소재)와의 반응을 검출하는데 사용하였다.
호르몬 분석
Y1 상청액 및 마우스 소변에서의 프로게스테론 농도는 상업적 프로게스테론 EIA(Arbor Assays, 미시간주 앤아버 소재)를 사용하여 측정하였다. 크레아티닌 농도 (소변 크레아티닌 검출 키트; 아버 분석법)를 사용하여 소변의 프로게스테론 농도를 정규화하였다.
행동 분석
유전자요법 치료 15주 후에 시험을 수행하였다.
꼬리 현수 시험. 생쥐는 근처의 표면으로 탈출하거나 붙잡을 수 없도록 테이프를 이용하여 꼬리를 매달았다. 행동은 EthoVision XT 10.5(Noldus Information Technology B.V. 네덜란드 바헤닝언 소재) 비디오 추적 및 분석 소프트웨어로 추적하였다. 호흡에 필요한 움직임을 제외한 모든 움직임의 부재로 정의되는 부동 기간은 6분 동안 측정되었다.
고가 십자 미로. 2개의 개방형 암(arm)과 2개의 밀폐형 암으로 구성된 장치는 100 lux의 강도를 갖는 오버 헤드 램프에 의해 간접적으로 조명을 받게 하였다. 시험을 위해, 마우스를 개별적으로 중앙 정사각형 상에 놓고 6분 동안 미로를 자유롭게 탐험하도록 하였다. 그들의 행동은 비디오 추적 소프트웨어 EthoVision 10.5(Noldus Information Technology B.V.)로 기록 및 분석하였다. 행동 시험 후 장비를 10% 에탄올 용액으로 청소하였다. 평가된 파라미터는 개방형 암 또는 밀폐형 암에서 소비한 시간, 머리 침액 횟수, 앞다리 들기 횟수 및 총 이동 거리였다.
로타로드. 운동 균형 및 조화는 가속 로타로드 장치(Ugo Basile, 이탈리아 제모니오 소재)를 사용하여 결정하였다. 동물 훈련은 분당 4 회전(r.p.m.)으로 2 분을 1회 시도로 구성하였다. 그 다음, 로드 속도를 4 rpm에서 40 rpm으로 증가시키면서 5분간 3회 연속 실험으로 시험하였다. 실험마다 마우스를 45분 동안 회복시켰다. 실험은 마우스가 로드에서 떨어질 때까지 지속하였다. 떨어질 때까지의 잠복기를 기록하였다. 이 순서는 3일간 연속해서 반복하였다. 행동 시험 후 장비는 10% 에탄올 용액으로 청소하였다.
통계
그룹 간의 비교는 Mann-Whitney 시험으로 수행하였다. GraphPad Prism(GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 라호이아 소재) 소프트웨어를 사용하였다.
실시예 4 : Cyp21 -/- 마우스의 물리적 및 생화학적 표현형
Cyp21 -/- 마우스는 12% 만이 신생아 기간 동안 생존하였다. 따라서, 성인기 동안 마우스를 연구하였다. 어미 및 새끼의 글루코르티코이드 치료에도 불구하고, 이들 Cyp21 -/- 생존자는 대조군 또는 이종접합성 마우스와 비교하여 더 가볍고 연약 하였다(도 1a 및 도 1b). Cyp21 +/- 마우스와 Cyp21 +/+ 마우스는 연구 동안 체중의 비슷한 진화를 가졌으므로, 이들 데이터를 비교용 '대조군' 그룹으로 수집하였다. 로타로드로 시험한 Cyp21 -/- 마우스의 운동 활성은 정상이었다(도 2A). 예상치 못하게, Cyp21 -/- 마우스는 꼬리 현수 시험 동안 행동 절망 및 고가 십자-미로 시험에서 성능 저하와 같은 불안 및 우울증 유사 행동의 특색을 나타내었다(도 2B 내지 도 2F).
Cyp21 -/- 마우스의 부신은 대조군 마우스의 부신보다 2.1배 더 컸다. 부신의 구성은 대상구역(zonation) 및 결절(nodule)의 교란으로 엉성하게 조직되었다. 부신 피질의 세포 수는 정상이었지만 이종 핵을 갖는 불규칙한 형태 및 비대를 나타내었다(도 6).
21-하이드록실라제의 주요 기질인 프로게스테론은 Cyp21 -/- 마우스의 소변에서 상승되었다(정상의 44 배)(도 1c).
염 손실(salt loss)은 기술적 제약으로 인해 정확하게 측정할 수는 없었지만, 레닌의 발현은 Cyp21 -/- 마우스의 신장에서 160배 증가하였고(도 3b), 이는 동물을 특징 짓는 미네랄코르티코이드 기능의 상실과 관련된 만성 염 손실에 대한 급격한 신장 반응을 나타낸다. 따라서, 알도스테론 신타제(Cyp11b2)의 발현은 사구층(zona glomerulosa)(도 3a)에 위치한 Cyp21 -/- 마우스의 부신에서 40배 증가한 것으로 나타났으며, 이는 면역형광 분석에 의해 확인되었다(도 7). Mc2r, PKA 서브유닛(Prkar1a, Prkar2a, Prkarca, Prkarcb) 및 SF-1 유전자의 발현은 대조군 마우스와 비교하여 Cyp21 -/- 마우스의 부신에서 증가되었다. Star, Cyp11a1, Hsd3b1 및 Cyp11b1의 발현 또한 상당히 증가되었다(도 3a). 정상인 성체 마우스 부신에서 발현되지 않는 Cyp17a1은 Cyp21 -/- 마우스에서 약간 발현되었다(도 3a).
실시예 5: 부신 세포에서 CYP21 발현 및 기능
Y1 세포주는 스테로이드를 11/8,20a-다이하이드록시프로게스테론으로 대사하지만 21-하이드록실화된 스테로이드 생성물을 생성하지 않는다(Parker et al., Proc Natl Acad Sci USA 1985; 82: 7860-7864). 시험관내에서, pCYP21 플라스미드에 의해 형질감염된 Y1 세포는 21OH 단백질을 발현하였고(도 4A), 비기능적 pLuc 플라스미드에 의해 형질감염된 Y1 세포보다 상청액에서 더 낮은 프로게스테론 농도를 나타내었다(도 4B). pCYP21에 의한 세포의 형질감염은 21OH 발현을 초래 하였다. 이는 형질감염된 세포 배양물의 상청액에서 프로게스테론 농도를 감소시켰고, 이는 형질도입된 21OH가 프로게스테론의 대사를 증가시켰음을 나타낸다. 이는 CAG 프로모터가 21OH 유전자 발현을 기능성 수준까지 허용하였음을 암시하였다.
녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 AAVrh10을 체중 g당 2×1010 벡터 게놈에 의한 대조군 마우스의 정맥내 주사 후, 부신 피질의 망상대 및 속상대에서 광범위한 GFP 발현이 관찰되었다(도 5A). GFP를 발현한 세포의 비율은 대략 39%였다. 심장 및 간도 GFP를 발현한(도 8) 반면, 신장, 생식선 및 뇌는 GFP를 발현하지 않았다.
AAVrh10-CAG-CYP21A2-HA( "CYP21") 벡터 또는 AAVrh10-null(모의) 벡터를 체중 그램 당 2×1010 벡터 게놈으로 성체 Cyp21 -/- 또는 대조군 마우스에게 정맥내 주사하였다. 치료 18주 후, 피질 및 수질을 포함한 전체 부신 조직에서 세포 수 당 벡터 카피의 평균 수(VCN)는 0.13 ± 0.09였다. 인간 21-하이드록실라제는 대조군 마우스에서 내인성 21OH 수준보다 낮은 수준으로 Cyp21 -/- 마우스의 부신에서 검출되었다(도 5B). 21-하이드록실라제 효소는 Cyp21 -/- 마우스의 엉성하게 조직된 속상대의 다수의 세포에서 발현되었다. 간에서 VCN은 거의 검출되지 않았고 CYP21 발현은 전혀 검출되지 않았다. 발현은 심장에서 약했고 신장, 생식선 및 뇌에서는 검출되지 않았다(표 2).
Figure pct00003
Cyp21 -/- 새끼의 안와후방 정맥에 AAVrh10 벡터를 주사하려고 시도는 새끼의 연약함 및 조작에 대한 반응으로 어미의 살해 위험으로 인한 실질적인 이유때문에 수행하지 않았다.
실시예 6: CYP21 벡터의 효과
기능성 CYP21 벡터로 처리된 Cyp21 -/- 마우스는 모의 벡터가 주사된 Cyp21 -/- 마우스와 비교했을 때 체질량의 조기 및 지속적인 증가(도 1a) 및 개선된 신체적 외관(도 1b)을 보여주었다. CYP21 벡터의 주사 후 5주 이내에 프로게스테론 수준은 42% 감소하였고, 그 후 연구 15주까지 Cyp21 -/- 마우스(도 1c)에서 거의 정상으로 유지되었다. CYP21 벡터로 처리된 Cyp21 -/- 마우스는 꼬리 현수 시험에 대해 정상 반응을 회복하였고 고가 십자 미로 시험에서 개선된 성능을 나타내었다(도 2B 내지 도 2F).
CYP21 벡터 처리는 부신 형태의 변경을 교정하지는 못하였다(도 6).
CYP21-주사된 마우스는 21-하이드록실라제 활성의 회복 후 발현 수준이 14배 감소하였으므로 신장에서의 레닌 발현의 주요 교정을 보여주었다(도 3b). 이것은 처리된 동물이 염을 보유할 수 있도록 하는 개선된 미네랄코르티코이드 기능을 반영하였다.
Cyp21 -/- 마우스의 CYP21 벡터 처리는 과발현된 Mc2r, Prkar2a, Sf1, Star, Cyp17a1 및 Cyp11b2 유전자의 발현을 거의 정상 수준으로 감소시켰다(도 3a). Prkar1a, Prkaca, Prkacb, Hsd3b 및 Cyp11b1 유전자 발현에는 유의미한 변화가 관찰되지 않았다(도 3a).
따라서, 생체 내에서 전체 부신 조직에 존재하는 평균 VCN의 측정값은 제한적이었만 피질의 스테로이드생성 활성의 대부분을 회복시키기에는 충분하였다. 이는 소변에서 프로게스테론이 거의 정상 수치로 감소한 것으로 나타났으며, 이것은 동일한 동물에서 15주에 걸쳐 연구되었고, 이는 CYP21 벡터 처리의 지속적인 효과를 보여준다(도 1c).
CYP21 벡터 처리 전에 발생하는 만성 염 손실은 신장에서 급증된 레닌 유전자 발현에 의해 반영되었으며, 이는 CYP21 벡터 처리에 의해 감소되었다(도 3b). 따라서, CYP21 벡터-처리된 Cyp21 -/- 마우스는 체중이 증가하였고 전반적인 외관이 개선되었다(도 1a 및 1B).
Cyp21 -/- 마우스에 CYP21 벡터의 투여는 이전에 증가된 프로게스테론 생산을 거의 정상화시켰고, 이는 15주째 CYP21 벡터 처리에서 마지막 분석 시에 여전히 기능하고 있는 21-하이드록실라제 활성의 주요한 지속적인 회복을 반영한다.
스트레스에 대한 부족한 반응은 부신 피질에 의한 적절한 글루코코르티코이드 반응의 부재로 인한 것일 수 있는 Cyp21 -/- 마우스의 새로 보고된 특색이다. 우울증 유사 특색의 발달에 대한 시상하부-뇌하수체-부신 축의 현저한 역할은 글루코코르티코이드 또는 코르티코트로핀-방출 호르몬에 대한 수용체를 유전자적으로 변형시킨 마우스에서 여러 연구에 의해 밝혀져 있다(Smith et al., Neuron 1998; 20: 1093-1102; Ridder et al., J Neurosci 2005; 25: 6243-6250; Bale et al., Nat Genet 2000; 24: 410-414) 또는 부신 저형성증(Bland et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 14488-14493). 실제로, 이들 마우스 모델은 모두 독특한 우울증-유사 특징 및 스트레스 반응의 조절이상을 나타낸다. Cyp21 -/- 마우스에서의 관찰에 따르면, 그리고 이론에 국한됨이 없이, 초기 생애 동안 부신에 의한 적절한 글루코 코르티코이드 분비의 결여는 스트레스 반응을 지속적으로 변화시킬 수 있을 가능성이 있다(Sapolsky et al., Endocr Rev 2000; 21: 55-89). 이러한 우울증-유사 특색은 부신 피질에서 21OH 활성을 회복시킨 AAVrh10 벡터(도 2)로 처리된 Cyp21 -/- 마우스에서 역전되었다.
Cyp21 -/- 마우스는 부신 비대, 구성의 붕괴(도 6) 및 스테로이드생성 효소 및 ACTH-의존성 신호전달 단백질을 암호하는 유전자 발현의 주요 변화를 모두 가졌다(도 3a). 부신 성장에 대한 ACTH의 영양 효과를 고려할 때 부신 세포 형태 및 유전자 발현의 총체적 변화는 만성적으로 상승된 ACTH에 기인하였을 가능성이 있다. Cyp21 -/- 새끼에 글루코코르티코이드의 조기 투여는, 몇몇 마우스가 출생 후 시간에 생존하도록 허용하였지만 변화들을 피하기에는 충분하지 않았다. 이는 글루코코르티코이드 처리가 코르티코트로핀 분비에 부분적인 억제 효과만이 있었음을 암시한다. Cyp21 -/- 마우스의 부신 피질 내로 AAVrh10 벡터에 의해 형질도입된 21OH는 보상적인 스테로이드생성 효소 및 ACTH-의존성 단백질 발현의 대부분을 교정하였다. 만성 염 손실을 맞추기 위한 시도로서 Cyp21 -/- 마우스의 40 배를 상당히 증가시킨 부신 피질에서 알도스테론 합성효소 유전자 및 신장에서 레닌 유전자의 발현 증가는 둘 다 CYP21 벡터-처리된 동물에서 주요 감소를 나타내었다.
부신 기능에 대한 CYP21 벡터 처리의 두드러진 효과는 형질도입된 CYP21을 발현하는 약 39%의 부신피질 세포에 의해서만 발생하였다는 것이 주목할 만하다. 이것은 단지 일부 세포의 기능적 회복이 부신의 스테로이드생성 능력을 실질적으로 교정할 수 있으며, 치료 상의 이익을 얻기 위해 부신 피질 전체에서 21OH를 발현시킬 필요가 없음을 시사한다. 제한된 비율의 세포 수에서의 이러한 발현은 또한 프로게스테론 생성의 순간적인 교정(Tajima et al., Gene Therapy 1999; 6: 1898-1903) 또는 부분적인 교정을 허용한 종래의 연구들(Macapagal et al., Abstract the Endocrine Society's 84th Annual Meeting, San Francisco, 2002, pp 1-503; Naiki et al., Endocr J 2016; 63: 897-904)에서도 관찰되었다. 이와 반대로, AAVrh10 벡터에 의해 매개된 유전자요법 접근법은 Cyp21 -/- 마우스에서 지속적인 효능을, 만약 있다면 제한적인, 다른 기관으로의 21-하이드록실라제 발현의 확산과 함께 나타내었다.
실시예 7: AAV5-PGK rAAV를 사용한 연구
ssAAV5-PGK-CYP21HA 벡터 및 ssAAV5-PGK-GFP 벡터가 생성되었다. 이들 벡터는 AAV2 ITR 서열을 갖는 게놈을 함유하고 AAV5 캡시드 단백질을 암호화한다. 이들 rAAV는 표 3에 나타낸 바와 같이 야생형 마우스(B6)에게 정맥내(i.v.)로, 그리고 3마리의 비인간 영장류(NHP)(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))에게 부신내 주사를 통해 투여하였다.
Figure pct00004
GFP 및 CYP21HA 벡터 게놈 카피(VGC) 값은 처리 후 3주째에 rAAV로 처리된 동물(표 4; 도 9, 도 12, 도 14, 도 16 내지 도 21 및 도 41)에 대해 측정하였다. VGC는 NHP01의 경우 7 내지 9개의 부신 슬라이스, NHP02의 경우 8개의 슬라이스, NHP04의 경우 60개의 부신 큐브, 및 마우스의 전체 부신에서 계산하였다. DNA는 QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen, 프랑스 쿠르타뵈프 소재)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 부신(마우스) 또는 부신 슬라이스/큐브(NHP)로부터 추출하였다. 각 샘플에 대한 이배체 세포 당 벡터 게놈의 양은 표준 조건을 사용하여 Plantinum Quantitative PCR SuperMix-UDG(Thermo Fisher Scientific, 프랑스 쿠르타뵈프)로 qPCR에 의해 결정하였다. 프라이머는 인간 CYP21A2 돌연변이유전자(정방향 5'-AAATTCGGGCCCATCTACAGG-3'(서열번호 38), 역방향 5'-ATGGCTTCCTCAATGGTCCTC-3'(서열번호 39)), 숙주 게놈의 마카카 알부민(정방향 5'-CTGTCATGCTGCTGCTGAGACTT-3'(서열번호 40), 역방향 5'-CTTTGGCATAGCATTCATGAGGAT-3'(서열번호 41)) 및 숙주 게놈의 마우스 뇌 유래 신경영양 인자(정방향 5'-TGCTGGATGAGGACCAGAAGGTT-3'(서열번호 42), 역방향 5'-AGGAGGCTCCAAAGGCACTTGA-3'(서열번호 43))에 대하여 표적화하였다. 증폭은 Light Cycler 480(Roche Diagnostics, 프랑스 멜렁 소재)을 사용하여 수행하였다. 인간 특이적 CYP21A2 프라이머는 인간 및 마카카 cDNA 서열의 정렬 후 덜 보존된 단편에서 설계하였다. 인간 정방향 프라이머에는 마카카 내인성 CYP21 게놈 DNA와 비교하여 오직 하나의 돌연변이만 있지만, 혼성화는 인간 CYP21에 특이 적이다.
GFP 및 HA 발현은 또한 처리 후 3주째에 면역형광(IF)(도 10, 11, 13, 15, 19 및 20)에 의해 가시화되었다.
Figure pct00005
좌측 부신에 ssAAV5-PGK-GFP가 주사된 비-인간 영장류 1번(NHP01)의 간에서 GFP VGC는 수술 종료시 26이었다. 안락사 시에 동일한 동물에 대한 GFP VGC는 0.4였다. 간의 면역형광은 이 동물에서 GFP의 어떤 발현도 나타내지 않았다.
ssAAV5-PGK-CYP21HA가 모두 우측 부신에 주사된 비-인간 영장류 1번(NHP01), 2번(NHP02) 및 4번(NHP04)의 간에서 CYP21HA VGC는 수술 종료시에 각각 11, 5 및 27이었다. 동일한 동물에 대한 안락사 시의 CYP21HA VGC는 각각 0.3, 0.1 및 2였다. 간에서의 면역형광은 이들 동물에서 CYP21HA의 발현을 거의 나타내지 않았다(도 19).
NHP에서, AAV5 캡시드는 GFP 카피의 양호한 형질도입(VGC 1.2, 표 4), 주사된 부신에서 많은 CYP21HA 카피(1.9-98, 표 4), 주사되지 않은 부신에서 양호한 수의 CYP21HA 카피(0.04-2.3)를 허용하였고, 간에서의 카피는 거의 없었다. 동일한 주사 용량의 경우, GFP 카피에 비해 많은 CYP21HP 카피가 계수되었다. GFP 발현(IF)은 주사된 부신에서 균일하지 않았다(도 10 및 도 11). 몇몇 CYP21HA 발현(IF)은 주사된 부신에서 가시화되었다(도 13 및 도 15).
야생형 마우스에서, AAV5 캡시드는 vg 용량(VGC 0.2-16.6, 표 4)에 비례하는 것으로 보이는 GFP 카피의 양호한 정맥내 형질도입 및 CYP21HA(VGC 0.12-17.6, 표 4)의 양호한 형질도입을 허용하였다. 야생형 마우스의 부신에서 GFP 발현(IF)은 약했다(도 20). CYP21HA 발현(IF)은 기술적 항체 문제로 인해 해석될 수 없었다.
실시예 8: AAV6-CAG rAAV를 사용한 연구
ssAAV6-CAG-GFP 벡터를 생산하였다. 이 벡터는 AAV2 ITR 서열을 갖는 게놈을 함유하고 AAV6 캡시드 단백질을 암호화한다. 이 rAAV를 표 5에 나타낸 바와 같이 야생형 마우스(B6)에게 정맥내(i.v.)로, 2마리의 비-인간 영장류(NHP)(마카카 파시쿨라리스)에게 부신내 주사를 통해 투여하였다.
Figure pct00006
처리 후 3주째에 rAAV(표 6; 도 22, 도 26 내지 도 29, 도 31 및 도 41)로 처리된 동물에 대해 GFP 벡터 게놈 카피(VGC) 값을 결정하였다. GFP 발현은 또한 처리 후 3주째 면역형광(IF)(도 23 내지 도 25 및 도 29 내지 도 32)에 의해 가시화하였다.
Figure pct00007
좌측 부신에 ssAAV6-CAG-GFP가 주사된 비-인간 영장류 2번(NHP02) 및 4 번(NHP04)의 간에서의 GFP VGC는 수술 종료시 각각 10.3 및 10이었다. 동일한 동물에 대한 안락사 시의 GFP VGC는 각각 0.8 및 3.5이었다. 간에서의 면역형광은 이들 동물에서 GFP가 거의 발현되지 않았음을 나타내었다(도 29 및 도 30).
NHP에서, AAV6 캡시드는 주사된 부신에서 GFP 카피를 거의 유도하지 않았고(VkGC 0.08-0.84, 표 6), 간에서도 카피가 거의 없었다. GFP 발현(IF)은 주사 된 부신에서 고르지 않았다(도 23 내지 도 25).
야생형 마우스에서, AAV6 캡시드는 GFP 카피의 우수한 정맥내 형질도입을 허용하였다(VGC 62.4, 표 6). GFP 발현(IF)은 정맥내 주사(도 31), 복강내 주사(도 32) 및 간내 주사(도 32) 후 야생형 마우스의 부신에서 우수하였다.
실시예 9: AAV1-CB6 및 AAV1-PGK rAAV에 대한 연구
ssAAV1-CB6-GFP 벡터 및 ssAAV1-PGK-CYP21HA 벡터를 생성하였다. 이들 벡터는 AAV2 ITR 서열을 갖는 게놈을 함유하고 AAV1 캡시드 단백질을 암호화한다. 이들 rAAV를 표 7에 나타낸 바와 같이 야생형 마우스(B6)에게 정맥내(i.v.)로, 하나의 비-인간 영장류(NHP)(마카카 파시쿨라리스)에게는 부신내 주사를 통해 투여하였다.
Figure pct00008
GFP 또는 CYP21HA 벡터 게놈 카피(VGC) 값은 처리 후 3주째 rAAV로 처리된 동물(표 8; 도 33, 도 35 내지 도 37 및 도 39 내지 도 41)에서 결정되었다. GFP 및 HA 발현은 또한 처리 후 3주째에 면역형광(IF)(도 34 내지 도 36, 도 38 및 도 39)에 의해 가시화되었다.
Figure pct00009
좌측 부신에 ssAAV1-CB6-GFP를 주사한 비-인간 영장류 3번(NHP03)의 간에서 GFP VGC는 수술 종료시 0.02, 안락사 시에 0.9였다. 간의 면역형광은 동물에서 GFP의 발현을 전혀 나타내지 않았다(도 35).
우측 부신에 ssAAV1-PGK-CYP21HA를 주사한 비-인간 영장류 3번(NHP03)의 간에서 CYP21HA VGC는 수술 종료시 1.5, 안락사 시에 2.9였다. 간의 면역형광은 동물에서 CYP21HA의 발현을 전혀 나타내지 않았다(도 39).
NHP에서, AAV1 캡시드는 주사된 부신에서 GFP 카피(VGC 0.56, 표 8)를 거의 유도하지 않았고, CYP21HA 카피(VGC 1.05, 표 8)도 거의 없었지만, 놀랍게도 주사되지 않은 부신에서 CYP21HA VGC는 0.48이었다. 매우 적은 수의 부신 세포가 GFP 발현(IF)(도 34) 또는 CYP21HA 발현(도 38)에 대해 양성이었다.
야생형 마우스에서, AAV1 캡시드는 GFP 카피(VGC 81, 표 8)의 우수한 정맥내 형질도입 및 탁월한 GFP 발현(IF)을 허용하였다(도 36). 야생형 마우스에서, AAV1 캡시드는 CYP21HA 카피의 우수한 정맥내 형질도입을 허용하였다(VGC 220, 표 8).
실시예 10: 마우스 생식선에서 rAAV 발현 측정
GAV 또는 CYP21HA VGC는 AAV6-CAG-GFP, AAV1-CB6-GFP 또는 AAV5-PGK-CYPHA의 투여 3주 후 마우스 생식선 및 부신에서 측정하였다. 결과는 표 9에 제시된다. 생식선은 사용된 벡터에 따라 부신보다 유의미하지만 훨씬 낮은 VGC 함량을 나타내었다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 11: AAVrh10-CAG rAAV를 사용한 연구
ssAAVrh10-CAG-CYP21HA 벡터를 생산하였다. 이 벡터는 AAV2 ITR 서열을 갖는 게놈을 함유하고 AAV rh10 캡시드 단백질을 암호화한다. 이 rAAV 벡터를 Cyp21 -/- 마우스에게 정맥내(i.v.) 투여하였다.
첫 번째 실험에서, 7개월된 마우스를 연구하였다. 10마리 마우스(암컷 4마리, 수컷 6마리)에게 ssAAVrh10-CAG-CYP21HA를 2×1010 vg/g체중으로 주사하였다. 수컷 6마리 중 2마리는 처리 3주째 사망했다. 마우스 4마리는 벡터로 처리하지 않았다.
처리 15주째, 마우스에서 다양한 파라미터를 측정하였다. 처리 시간과 처리 후 15주 사이의 체중 변화를 처리된 동물과 처리되지 않은 동물에서 결정하였다(도 42). rAAV 벡터로 처리된 동물에 대해 CYP21HA 벡터 게놈 카피(VGC) 값을 측정하였다(표 11). 부신에서의 HA 발현 및 CYP21 발현은 면역형광(IF)에 의해 가시화하였다(도 43 및 44). 웨스턴 블롯으로 CYP21 발현을 가시화하였다(도 45). 항-CYP21 항체(CorGen)를 IF 및 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 소변의 프로게스테론(ng/mg 크레아티닌)은 처리된 Cyp21 -/- 마우스 및 처리되지 않은 Cyp21 -/- 마우스에서 15주 동안 측정하였다(도 46a-46B). 소변의 프로게스테론(ng/mg 크레아티닌)은 또한 15주 동안 처리 및 처리되지 않은 야생형 마우스에서도 측정하였다(도 46c). 데이터는 처리된 마우스에서 프로게스테론 수준이 야생형 마우스의 수준에 훨씬 더 가까운 수준으로 복귀한다는 것을 보여줌으로써 CYP21 유전자요법 생성물의 치료 효과를 입증해준다.
7개월령에 ssAAVrh10-CAG-CYP21HA를 주사한 후 15주째, Cyp21 -/- 마우스는 효과적인 VGC 값을 나타내었고 강한 CYP21HA IF 신호를 나타내었으며 CYP21 단백질을 발현하였고, 체중이 개선되었다.
Figure pct00013
두 번째 실험에서는 2 내지 3개월된 마우스를 연구하였다. 17마리 마우스(암컷 9마리, 수컷 8마리)에게 ssAAVrh10-CAG-CYP21HA를 2×1010 vg/g체중 또는 1×1010 vg/g체중으로 주사하였다. 7마리의 마우스는 벡터로 처리하지 않았다.
처리 후 15 내지 18주째 마우스에서 다양한 파라미터를 측정하였다. 처리 시간과 처리 후 15주 사이의 체중 변화를 처리된 동물과 처리되지 않은 동물에 대해 결정하였다(도 47). 치료 18 주후 rAAV로 처리된 동물에 대해 CYP21HA 벡터 게놈 카피(VGC)값을 측정하였다(도 48). 부신에서의 HA 발현은 면역형광(IF)에 의해 가시화되었다(도 48, 도 50 및 도 51). 소변 프로게스테론(ng/mg 크레아티닌)은 15주 동안 13마리의 처리된 동물 및 처리되지 않은 모든 동물에서 측정하였다(도 49a 내지 도 49b 및 표 12).
Figure pct00014
2 내지 3개월령 Cyp21 -/- 마우스의 처리 후 15주째에, 소변 프로게스테론 수준은 처리된 마우스 13마리 중 4마리에서 절반이었고, 처리된 마우스 13마리 중 6마리에서 약 8로 나눈 값이었다. 치료 결과(예를 들어, 프로게스테론 수준, 체중, 스테로이드생성 mRNA 및 스트레스에 대한 반응)는 15주째 낮은 지속적인 VGC 수준(<0.5)에 의해서 명백하게 나타났다.
실시예 12: AAV1, AAV5 및 AAV6 rAAV 벡터를 비교한 연구
본 발명자들은 인간 야생형 CYP21 돌연변이유전자(hCYP21) 또는 GFP를 비-인간 영장류(NHP)(마카카 파시쿨라리스)에 전달하는 데 있어서 AAV1, AAV5 또는 AAV6 혈청형을 갖는 재조합 벡터의 효능을 비교하였다. 처리들과 선택된 결과들은 표 13에 요약하였다. 벡터에 사용된 프로모터는 CAG, PGK 또는 CB6이었다. hCYP21 돌연변이유전자는 적혈구응집소(HA) 태그에 융합시켰다. 비-인간 영장류 식별자는 "NHP ID"라고 표시된 열에 제공된다. 투여 경로는 부신내(IA) 주사 또는 정맥내 주사(IV)였다. "주사된 부신" 열은 우측 부신 또는 좌측 부신에 주사되었는지를 나타낸다. 몇몇 경우에, 벡터는 IA 주사로부터 혈행으로 이탈하였고, 주사되지 않은 부신으로 형질도입되었다. 표 13은 또한 벡터의 주사 용량을 제공한다. 기관을 해부하고 처리한 후 벡터 게놈 카피(VGC) 측정을 수행하였다. 기관을 해부하고 처리한 후 CYP21 또는 GFP의 mRNA 수준을 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)에 의해 측정하였다. mRNA 값은 GAPDH에 대한 hCYP21의 발현이다. HA 또는 GFP 발현은 또한 면역형광(IF)에 의해서도 가시화되었다. 발현 수준은 "IF"라고 표시된 열에 제공된다.
도 52a 내지 도 52c, 도 53a 내지 도 53c, 도 54a 내지 도 54c, 도 55a 내지 도 55c, 도 56a 내지 도 56c 및 도 57a 내지 도 57c는 부신 및 간에서의 CYP21HA 벡터 게놈 카피(VGC) 측정 공간 분포의 개략도, VGC의 산점도 및 표 13에 나타낸 바와 같이 처리된 선택된 NHP의 CYP21 mRNA 측정 분포 및 CYP21HA 면역형광 이미지를 나타낸다. 도 59-61은 AAV1, AAV5 또는 AAV6 벡터에 의해 처리된 NHP의 부신의 면역형광 이미지를 나타낸다. 벡터를 발현하는 세포는 녹색이며 화살표로 표시된다.
이들 연구의 결과는 3가지 혈청형 모두 부신 발현을 달성하고, AAV5 혈청 형은 NHP에서 우수한 부신 발현을 달성한다는 것을 시사한다.
실시예 13: 야생형 CYP21 돌연변이유전자 및 코돈-최적화된 CYP21 돌연변이유전자의 효능 비교
야생형(WT) 인간 CYP21 돌연변이유전자 또는 코돈-최적화된(CO) 인간 CYP21 돌연변이유전자(서열번호 50)를 함유하는 재조합 혈청형 AAV5 벡터를 제조하였다. 이들 rAAV 벡터 각각은 CBA 프로모터, Kozak 서열 및 탈표적화를 위한 miR-122 miRNA 결합 부위(Thakral and Ghoshal, Curr Gene Ther. 2015; 15(2): 142-150)를 포함하였다. 야생형 돌연변이유전자를 함유하는 벡터는 AAV5-CBA-Kozak-hCYP21-miR122로 지칭된다. 코돈-최적화된 돌연변이유전자를 함유하는 벡터는 AAV5-CBA-Kozak-COhCYP21-miR122로 지칭된다. 야생형 시노몰구스 CYP21 돌연변이유전자(AAV5-CBA-Kozak-cynoCYP21)를 함유하는 대조군 AAV5 벡터를 생산하였다.
비-인간 영장류(NHP)(마카카 파시쿨라리스)는 도 62에 도시된 용량의 벡터로 처리하였다. 벡터 제제를 NHP에 10분 동안 정맥내(IV)로 투여하였다. 처리 1.5개월 후에 NHP를 안락사시켰다.
각 치료군에 대한 CYP21 벡터 게놈 카피(VGC) 측정 및 mRNA 측정은 도 63에 도시된다. mRNA 수준은 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)에 의해 측정하였다. mRNA 값은도 63에 나타낸 바와 같이 2개의 mRNA의 상대적인 발현을 나타낸다. 시노몰구스-특이적 프라이머를 사용하여 시노몰구스 CYP21 mRNA의 양을 측정하였다. 도 63의 VGC 및 mRNA 열에서, 각 열의 상부 숫자는 평균이고, 2개의 하부 숫자는 평균의 범위이다. 도 63은 또한 평균 Sal-인간 대 Sal-시노몰구스 펩타이드 비율을 나타낸다.
본 연구의 결과는 AAV5-CBA-hCYP21 벡터의 정맥내 전달 후 NHP의 부신에서 WT 및 CO 인간 CYP21 돌연변이유전자의 비슷한 발현을 시사한다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
SEQUENCE LISTING <110> Adrenas Therapeutics, Inc. <120> ADENO-ASSOCIATED VIRUS GENE THERAPY FOR 21-HYDROXYLASE DEFICIENCY <130> IPA200767-US <140> PCT/US2019/013991 <141> 2019-01-17 <150> US 62/640,311 <151> 2018-03-08 <150> US 62/618,307 <151> 2018-01-17 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 495 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Ala 1 5 10 15 Arg Leu Leu Trp Asn Trp Trp Lys Leu Arg Ser Leu His Leu Pro Pro 20 25 30 Leu Ala Pro Gly Phe Leu His Leu Leu Gln Pro Asp Leu Pro Ile Tyr 35 40 45 Leu Leu Gly Leu Thr Gln Lys Phe Gly Pro Ile Tyr Arg Leu His Leu 50 55 60 Gly Leu Gln Asp Val Val Val Leu Asn Ser Lys Arg Thr Ile Glu Glu 65 70 75 80 Ala Met Val Lys Lys Trp Ala Asp Phe Ala Gly Arg Pro Glu Pro Leu 85 90 95 Thr Tyr Lys Leu Val Ser Arg Asn Tyr Pro Asp Leu Ser Leu Gly Asp 100 105 110 Tyr Ser Leu Leu Trp Lys Ala His Lys Lys Leu Thr Arg Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Leu Gly Ile Arg Asp Ser Met Glu Pro Val Val Glu Gln Leu Thr 130 135 140 Gln Glu Phe Cys Glu Arg Met Arg Ala Gln Pro Gly Thr Pro Val Ala 145 150 155 160 Ile Glu Glu Glu Phe Ser Leu Leu Thr Cys Ser Ile Ile Cys Tyr Leu 165 170 175 Thr Phe Gly Asp Lys Ile Lys Asp Asp Asn Leu Met Pro Ala Tyr Tyr 180 185 190 Lys Cys Ile Gln Glu Val Leu Lys Thr Trp Ser His Trp Ser Ile Gln 195 200 205 Ile Val Asp Val Ile Pro Phe Leu Arg Phe Phe Pro Asn Pro Gly Leu 210 215 220 Arg Arg Leu Lys Gln Ala Ile Glu Lys Arg Asp His Ile Val Glu Met 225 230 235 240 Gln Leu Arg Gln His Lys Glu Ser Leu Val Ala Gly Gln Trp Arg Asp 245 250 255 Met Met Asp Tyr Met Leu Gln Gly Val Ala Gln Pro Ser Met Glu Glu 260 265 270 Gly Ser Gly Gln Leu Leu Glu Gly His Val His Met Ala Ala Val Asp 275 280 285 Leu Leu Ile Gly Gly Thr Glu Thr Thr Ala Asn Thr Leu Ser Trp Ala 290 295 300 Val Val Phe Leu Leu His His Pro Glu Ile Gln Gln Arg Leu Gln Glu 305 310 315 320 Glu Leu Asp His Glu Leu Gly Pro Gly Ala Ser Ser Ser Arg Val Pro 325 330 335 Tyr Lys Asp Arg Ala Arg Leu Pro Leu Leu Asn Ala Thr Ile Ala Glu 340 345 350 Val Leu Arg Leu Arg Pro Val Val Pro Leu Ala Leu Pro His Arg Thr 355 360 365 Thr Arg Pro Ser Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Ile Pro Glu Gly Thr Val 370 375 380 Ile Ile Pro Asn Leu Gln Gly Ala His Leu Asp Glu Thr Val Trp Glu 385 390 395 400 Arg Pro His Glu Phe Trp Pro Asp Arg Phe Leu Glu Pro Gly Lys Asn 405 410 415 Ser Arg Ala Leu Ala Phe Gly Cys Gly Ala Arg Val Cys Leu Gly Glu 420 425 430 Pro Leu Ala Arg Leu Glu Leu Phe Val Val Leu Thr Arg Leu Leu Gln 435 440 445 Ala Phe Thr Leu Leu Pro Ser Gly Asp Ala Leu Pro Ser Leu Gln Pro 450 455 460 Leu Pro His Cys Ser Val Ile Leu Lys Met Gln Pro Phe Gln Val Arg 465 470 475 480 Leu Gln Pro Arg Gly Met Gly Ala His Ser Pro Gly Gln Ser Gln 485 490 495 <210> 2 <211> 584 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> CAG promoter <400> 2 gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 60 tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 120 aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 180 caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 240 acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 300 ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 360 ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 420 ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 480 gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 540 ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcg 584 <210> 3 <211> 399 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> PGK promoter <400> 3 ccggtaggcg ccaaccggct ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc 60 ccctagtcag gaagttcccc cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg 120 aagtagcacg tctcactagt ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg 180 taggcctttg gggcagcggc caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc 240 tgggaagggg tgggtccggg ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc 300 gaaggtcctc cggaggcccg gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt 360 tctcctcttc ctcatctccg ggcctttcga cctgcagcc 399 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP21A2 transgene primer <400> 4 acagtcatca ttccgaacct cca 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP21A2 transgene primer <400> 5 aaggccagag ctctggagtt ctt 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse brain-derived neurotrophic factor primer <400> 6 tgctggatga ggaccagaag gtt 23 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse brain-derived neurotrophic factor primer <400> 7 aggaggctcc aaaggcactt ga 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mc2r primer <400> 8 tttctcagtc atcttgccga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mc2r primer <400> 9 atgctcctct ccttggcttt 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prkar1a primer <400> 10 gcattccttc gggaatactt t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prkar1a primer <400> 11 ccctcgagtc agtacggatg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prkar2a primer <400> 12 gagtgactcg gactcggaag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prkar2a primer <400> 13 cctcctcttc ttcatcaggg 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prkarca primer <400> 14 aagaagggca gcgagcag 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prkarca primer <400> 15 attctgagaa ggggtctccc 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prkarcb primer <400> 16 caagaaaggc agcgaagtg 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prkarcb primer <400> 17 tcctcaagcc cagcattact 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sf1 primer <400> 18 gccaggagtt cgtctgtctc 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sf1 primer <400> 19 tttcctgggc gtcctttac 19 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Star primer <400> 20 gggcatactc aacaaccagg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Star primer <400> 21 gaaacacctt gcccacatct 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyp11a1 primer <400> 22 caggccaaca ttaccgagat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyp11a1 primer <400> 23 ccttcaagtt gtgtgccatc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsd3b1 primer <400> 24 gttgtcatcc acactgctgc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hsd3b1 primer <400> 25 caggcctcca ataggttctg 20 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyp11b1 primer <400> 26 atggactttc agtccagtgt gttc 24 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyp11b1 primer <400> 27 gccgctcccc aaaaagaa 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyp17a1 primer <400> 28 gaagtgctcg tgaagaaggg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyp17a1 primer <400> 29 ctactatccg caaaggcgac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyp11b2 primer <400> 30 gagacgtggt gtgttcttgc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyp11b2 primer <400> 31 tcccttgcta ccatgtccac 20 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP21 primer <400> 32 acagtcatca ttccgaacct cca 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP21 primer <400> 33 aaggccagag ctctggagtt ctt 23 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Renin primer <400> 34 ctctgggcac tcttgttgct 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Renin primer <400> 35 agaaggcatt ttcttgagcg 20 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tbp primer <400> 36 cccttgtacc cttcaccaat gac 23 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tbp primer <400> 37 tcacggtaga tacaatattt tgaagctg 28 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 aaattcgggc ccatctacag g 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 atggcttcct caatggtcct c 21 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 40 ctgtcatgct gctgctgaga ctt 23 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 41 ctttggcata gcattcatga ggat 24 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 42 tgctggatga ggaccagaag gtt 23 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 43 aggaggctcc aaaggcactt ga 22 <210> 44 <211> 7 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Kozak sequence <400> 44 accaugg 7 <210> 45 <211> 13 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Kozak sequence <400> 45 gccgccacca ugg 13 <210> 46 <211> 8 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Kozak sequence <400> 46 ccaccaug 8 <210> 47 <211> 9 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Kozak sequence <400> 47 ccaccaugg 9 <210> 48 <211> 260 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> CB6 Promoter <400> 48 ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat 60 ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 120 ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 180 gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 240 aaagcgaagc gcgcggcggg 260 <210> 49 <211> 282 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> CBA Promoter <400> 49 tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc 60 caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg 120 gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag 180 gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc 240 ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gg 282 <210> 50 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon Optimized CYP21a2 gene sequence <400> 50 atgctgctgc tggggctgct gctgctgctg cctctgctgg ctggggctcg actgctgtgg 60 aactggtgga aactgcggtc cctgcacctg ccacctctgg caccaggctt cctgcacctg 120 ctgcagccag acctgcccat ctacctgctg ggcctgaccc agaagtttgg ccctatctat 180 aggctgcacc tgggcctgca ggacgtggtg gtgctgaact ctaagcgcac catcgaggag 240 gccatggtga agaagtgggc agatttcgca ggccggccag agccactgac atacaagctg 300 gtgagcagaa attatcctga cctgtccctg ggcgattact ctctgctgtg gaaggcccac 360 aagaagctga caaggagcgc cctgctgctg ggcatccgcg actccatgga gccagtggtg 420 gagcagctga cccaggagtt ttgcgagagg atgagggcac agcctggaac accagtggcc 480 atcgaggagg agttcagcct gctgacctgc tccatcatct gttatctgac atttggcgat 540 aagatcaagg acgataacct gatgccagcc tactataagt gtatccagga ggtgctgaag 600 acctggagcc actggagcat ccagatcgtg gacgtgatcc ccttcctgag gttctttcct 660 aatccaggcc tgcggagact gaagcaggcc atcgagaaga gggatcacat cgtggagatg 720 cagctgaggc agcacaagga gtccctggtg gcaggacagt ggagggacat gatggattac 780 atgctgcagg gagtggcaca gccatctatg gaggagggaa gcggacagct gctggaggga 840 cacgtgcaca tggcagcagt ggatctgctg atcggaggaa ccgagacaac agccaacaca 900 ctgagctggg ccgtggtgtt tctgctgcac caccctgaga tccagcagcg gctgcaggag 960 gagctggacc acgagctggg acctggagca agctcctcta gagtgccata caaggatcgg 1020 gccagactgc ccctgctgaa tgccaccatc gccgaggtgc tgaggctgcg ccccgtggtg 1080 cctctggccc tgcctcacag gaccacaaga ccaagctcca tctccggcta tgacatccca 1140 gagggcaccg tgatcatccc aaacctgcag ggagcacacc tggacgagac agtgtgggag 1200 cggccacacg agttctggcc cgatagattt ctggagcctg gcaagaacag ccgggccctg 1260 gccttcggct gcggagcccg ggtgtgcctg ggcgagccac tggccaggct ggagctgttc 1320 gtggtgctga cccgcctgct gcaggccttt acactgctgc cctccggcga tgccctgcct 1380 tctctgcagc cactgcctca ctgctccgtg atcctgaaga tgcagccctt tcaggtccgc 1440 ctgcagccaa gggggatggg ggcacatagt ccagggcagt ctcagtaa 1488 <210> 51 <211> 592 <212> DNA <213> Marmota monax <400> 51 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg atattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt 120 acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tccgtcaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg 300 atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg 360 ctgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420 gcctgtgttg ccaactggat cctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggctctc 480 aatccagcgg acctcccttc ccgaggcctt ctgccggttc tgcggcctct cccgcgtctt 540 cgctttcggc ctccgacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg 592

Claims (28)

  1. 재조합 아데노-관련 바이러스(recombinant adeno-associated virus: rAAV) 벡터로서,
    적어도 하나의 AAV 역말단 반복체(inverted terminal repeat: ITR) 및 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 결합된 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는, rAAV 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 21OH 단백질은 인간 21OH 단백질인, rAAV 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 21OH 단백질을 암호화하는 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 상기 인간 21OH(CYP21A2) cDNA를 포함하거나, 상기 인간 21OH(CYP21A2) cDNA로 이루어지는 것인, rAAV 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 21OH 단백질을 암호화하는 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 상기 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것인, rAAV 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 21OH 단백질을 암호화하는 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 50을 포함하거나, 서열번호 50으로 이루어지는 것인, rAAV 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 21OH 단백질을 암호화하는 상기 비-AAV 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는, rAAV 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 숙주 세포에서 상기 21OH 단백질의 발현을 유도하는, rAAV 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 숙주 세포는 부신 세포 또는 부신 피질 세포인, rAAV 벡터.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스/β-액틴 혼성(hybrid) 프로모터, PGK 프로모터 또는 부신 피질 세포에서의 발현에 특이적인 프로모터인, rAAV 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 사이토메갈로바이러스/β-액틴 혼성 프로모터는 CAG, CB6 또는 CBA 프로모터인, rAAV 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 48 또는 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 상기 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것인, rAAV 벡터.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 혈청형 ITR인, rAAV 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 혈청형인, rAAV 벡터.
  14. 21-하이드록실라제(21OH) 단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 결합된 비-AAV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터로서,
    상기 rAAV 벡터는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74의 AAV에서 유래하는 적어도 하나의 AAV 역말단 반복체(ITR)를 포함하고;
    상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스/β-액틴 혼성 프로모터, PGK 프로모터 또는 부신피질 세포에서의 발현에 특이적인 프로모터인, rAAV 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 상기 사이토메갈로바이러스/β-액틴 혼성 프로모터는 CAG, CB6 또는 CBA 프로모터인, rAAV 벡터.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 포함하는, rAAV 입자.
  17. 제16항에 있어서, AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 또는 rh74 유래의 적어도 하나의 캡시드 단백질을 더 포함하는, rAAV 벡터.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터 또는 제16항 또는 제17항의 rAAV 입자, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  19. rAAV 입자를 생산하는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터; (b) AAV rep를 암호화하는 핵산 분자; (c) 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 분자; 및 (d) 상기 rAAV 입자를 패키징하기에 충분한 헬퍼 기능
    을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 21-하이드록실라제(21OH)의 발현을 필요로 하는 대상체에서 21OH를 발현하는 방법으로서,
    치료적 유효량의 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 rAAV 백터, 제16항 또는 제17항의 rAAV 입자, 또는 제18항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 21OH를 발현시키는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 21OH는 상기 대상체의 부신 피질, 부신 수질, 부신 줄기 세포, 부신 선조 세포, 간 또는 난소에서 발현되는, 방법.
  22. 21-하이드록실라제 결핍증(21-hydroxylase deficiency: 21OHD)을 가진 대상체를 치료하는 방법으로서,
    치료적 유효량의 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터, 제16항 또는 제17항의 rAAV 입자, 또는 제18항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 21OHD를 치료하는 투여 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 투여 단계 전에 21OHD를 가진 대상체를 선택하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터, 상기 rAAV 입자 또는 상기 약제학적 조성물은, 정맥내로, 개복 수술(open surgery) 또는 복강경을 통해 부신으로의 직접 주사에 의해, 또는 카테터화를 통해 부신 동맥으로의 주사에 의해 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 부신으로의 직접 주사는 상기 부신 피질로의 직접 주사인, 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 Prader 단계 IV 또는 V형의 21OHD를 앓고 있는, 방법.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 선천적 부신과다형성(congenital adrenal hyperplasia: CAH)을 앓고 있는, 방법.
  28. 21-하이드록실라제 결핍증을 치료하기 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터, 또는 제16항 또는 제17항의 rAAV 입자의 용도.
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