CN116406425A - 用于va rna转录的核酸构建体 - Google Patents

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Abstract

本文报道一种新颖腺病毒VA RNA核酸，其中已经移除野生型2型聚合酶III启动子，并且已经加入U6‑snRNA启动子或可诱导启动子。

Description

用于VA RNA转录的核酸构建体
技术领域
本文报道新型DNA构建体及其使用方法。使用根据新型DNA构建体，腺病毒VA RNA可在AAV颗粒产生细胞株中转录。新型VA RNA核酸包含可操作地连接至外源启动子的VARNA核酸。
背景技术
基因疗法广义上是指治疗性施用基因物质以修饰活细胞的基因表达，并且从而改变其生物学特性。经过数十年的研究，基因疗法已经进入市场，并预期将变得越来越重要。一般来说，基因疗法可分为活体内或离体方法。
目前，大多数活体内疗法依赖于使用重组腺相关病毒(rAAV)载体进行DNA递送。AAV是小的、天然存在的、非致病性细小病毒，其由无套膜的二十面体衣壳组成。该AAV包含大约4.7kb的单股DNA基因体。野生型AAV载体的基因体携带两个基因rep和cap，其侧翼为反向末端重复(ITR)。ITR对于顺式病毒复制和包装是必需的。rep基因编码四种不同的蛋白质，其表达由两个可选择的启动子P5和P19驱动。此外，通过选择性剪接产生不同的形式。Rep蛋白具有多重功能，诸如，例如，DNA结合、核酸内切酶和解旋酶活性。该蛋白在基因调控、位点特异性整合、切除、复制和包装中发挥作用。cap基因编码三个衣壳蛋白和一个组装活化蛋白。通过使用选择性剪接和选择性起始密码子用法而实现差异表达这些蛋白质，且由位于rep基因的编码区的单个启动子P40驱动表达。
在经工程化的治疗性rAAV载体中，用转基因表达盒替换病毒基因，该转基因表达盒保持侧翼为病毒ITR，但在所选择的启动子的控制下编码感兴趣的基因。与野生型病毒不同，经工程化rAAV载体不会被位点特异性整合在宿主基因体中，主要在转导细胞核中维持游离基因体。
AAV本身不具有复制能力，但需要辅助基因的功能。这些在自然界中由共感染的辅助病毒提供，诸如，例如腺病毒或单纯疱疹病毒。例如，已知五种腺病毒基因(即E1A、E1B、E2A、E4及VA)对AAV复制是必需的。与其他编码蛋白质的辅助基因相比，VA是一种小RNA基因。
为产生rAAV载体，将携带侧翼为ITR的转基因的DNA引入至包装宿主细胞株，其也包含rep和cap基因以及所需的辅助基因。有许多将这三组DNA元件引入细胞中的方式以及将它们组合在不同DNA质粒上的方式(参见，例如，Robert,M.A.等人，Biotechnol.J.12(2017)1600193)。
已经广泛地使用两种一般产生方法。在三重转染方法中，将携带E2A、E4和VA的腺病毒辅助质粒(pHELPER)、包含rep/cap的质粒与包含rAAV-转基因的质粒瞬时地共转染已经表达腺病毒E1A和E1B的HEK293细胞。另选地，可将rep/cap和病毒辅助基因体合在一个更大的质粒上(双转染方法)。第二种方法包括用两个杆状病毒感染昆虫细胞(Sf9)，一者携带rAAV基因体而另一者携带rep和cap。在该系统中，由杆状病毒载体本身提供辅助功能。同样地，单纯疱疹病毒与HEK293细胞或BHK细胞合并使用。最近，Mietzsch等人(Hum.GeneTher.25(2014)212-222；Hum.Gene Ther.Methods 28(2017)15-22)将rep和cap稳定地整合到经工程化Sf9细胞的基因体中。对于这些细胞，携带rAAV转基因的单杆状病毒足以产生rAAV载体。Clark等人(Hum.Gene Ther.6(1995)1329-1341)产生具有将rep/cap基因和rAAV转基因整合至其基因体中的HeLa细胞株。通过野生型腺病毒转染细胞，诱导rAAV载体产生，并产生rAAV载体和腺病毒的混合原液。
目前为止，尚未描述将辅助基因稳定地整合到其基因体中的哺乳动物细胞株。rep以及病毒辅助基因的表达对细胞具有毒性且需要充分控制(参见，例如，Qiao,C.等人，J.Virol.76(2002)1904-1913)。
对于rep基因，此类控制通过将内含子引入至rep基因来实现，该内含子含有侧翼为LoxP位点的多腺苷酸化位点。在重组腺病毒的帮助下引入Cre重组酶之后，移除多腺苷酸化位点并剪接掉内含子(参见，例如，Yuan,Z.等人，Hum.Gene Ther.22(2011)613-624；Qiao,C.等人，如上所述)。
WO 97/9441(EP 0 850 313 B1)报道一种产生重组腺相关病毒(AAV)的方法，该方法包括以下步骤：(1)培养包含细胞的组合物，该细胞已经被以下瞬时地转染：(a)包含编码AAV rep和cap蛋白的核酸的AAV辅助质粒；(b)包含必需的腺病毒辅助基因的腺病毒辅助质粒，存在于该质粒中的必需的腺病毒辅助基因选自由E1A、E1B、E2A、E4、E4ORF6、E4ORF6/7、VA RNA及它们的组合所组成的组；以及(c)包含第一和第二AAV反向末端重复(ITR)的AAV质粒，其中该第一和第二AAV ITR的侧翼为编码感兴趣的多肽的DNA，该DNA可操作地连接至启动子DNA；在没有腺病毒颗粒的情况下；及(2)纯化由此产生的重组AAV。
WO 2001/36615(EP 1 230 354 B1)报道包含至少一种核酸的永久性羊水细胞株，该核酸使腺病毒E1A和E1B区域的基因产物进行表达。
WO 2004/29219报道用于在细胞和生物体中控制shRNA构建体的时间和空间表达的载体和方法。此类载体可为反转录病毒载体，诸如慢病毒载体。在优选的实施例中，shRNA的表达由RNA聚合酶III启动子调节；已知此类启动子产生有效静默。虽然基本上可使用任何的polIII启动子，但理想的实例包括人类U6 snRNA启动子、小鼠U6 snRNA启动子、人类及小鼠H1 RNA启动子及人类tRNA-val启动子。
Ventura,A.等人报道来自转基因的Cre-lox调节的条件性RNA干扰(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)10380-10385)。作者已经生成两种用于条件性的Cre-lox调节的RNA干扰的慢病毒载体。一种载体允许条件性活化，而另一种允许短发夹RNA(shRNA)表达的条件性不活化。前者基于一种经由包括LoxP位点和TATA盒之间的杂合体以修改小鼠U6启动子的策略。
Kawabe,Y.等人报道一种使用重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于产生抗体的基因整合系统(Cytotechnol.64(2012)267-279)。侧翼为野生型和突变型LoxP位点的交换盒被整合到CHO细胞的染色体中，以建立受体创始细胞。然后，制备供体质粒，该供体质粒包括侧翼为一对相容的LoxP位点的标记-抗体表达盒，且也包含在选择标记的表达盒与抗体的表达盒之间的内部未配对的LoxP位点。将供体质粒和Cre重组酶表达质粒共转染到创始CHO细胞中，以在CHO基因体中产生RMCE，使抗体基因产生位点特异性整合，恢复原始野生型LoxP位点并产生不再参与RMCE的无活性的双突变LoxP位点。重复RMCE过程以增加整合基因的拷贝数，从而在每个步骤中切除并移除存在于细胞中的选择标记的表达盒。
US 2013/58871报道通过使用两个以头对头位置定向的突变LoxP位点(Lox66和Lox71)产生Cre重组酶介导的可转换反转质粒。当存在Cre重组酶时，侧翼为两个突变LoxP位点的基因被反向，形成一个LoxP和一个双突变LoxP位点。因为双突变的LoxP位点对Cre重组酶的亲和力非常低，因此有利的一步反转几乎为不可逆，允许基因根据需要稳定地切换成“开”和“关”。在不存在Cre重组酶的情况下，通过消除包含伪TATA盒和夹接基因两侧的起始密码子的序列，使表达的泄漏最小化。
Crawford,Y.等人(Biotechnol.Prog.29(2013)1307-1315)报道使用组合的phiC31整合酶和CRE-Lox技术，从有限基因体筛选中快速鉴定出用于靶向细胞株开发的可靠宿主。
WO 2016/57800报道可操作地连接至Cre重组酶的TGG或DRG启动子和可操作地连接至抑制性RNA的LOX-终止-LOX可诱导RNA聚合酶III启动子。在活体内，作者发现在远端(3')LoxP位点中，中央间隔子位置4的单T到C突变完全地抑制两种条件性小鼠模型中的重组反应。
WO 2019/126634报道适合用于表达重组蛋白的靶向整合(TI)宿主细胞，以及产生和使用该TI宿主细胞的方法。
发明内容
本文报道包含腺病毒VA RNA的新型脱氧核糖核酸及其使用方法。根据本发明的新型脱氧核糖核酸可用于产生重组腺相关病毒颗粒。
因此，本发明的一个方面是腺病毒VA RNA核酸。在本文报道的腺病毒VA RNA核酸中，VA RNA编码序列在其5'-端可操作地连接至2型变体聚合酶III启动子或3型聚合酶III启动子或其变异体，诸如，例如，U6-snRNA启动子或聚合酶II启动子。
在根据本发明的腺病毒VA RNA核酸中，VA RNA编码序列在其5'-端可操作地连接至U6-snRNA启动子。
在根据本发明的腺病毒VA RNA核酸中，VA RNA编码序列在其5'-端可操作地连接至可诱导启动子。
在一个优选的实施例中，腺病毒VA RNA编码序列具有SEQ ID NO:38的序列。
在所有方面和实施例的一个实施例中，腺病毒VA RNA核酸包含位于启动子3'的精确转录起始位点。在一个实施例中，精确转录起始位点在5'-至3'-的方向上包含：包含转录起始位点(TSS)的腺病毒VA RNAI基因的至少六个5'-端核苷酸(以防止绕过随后的聚合酶III(pol III)终止子)，以及功能性聚合酶III终止子(以防止从组成型活性上游启动子转录)。
在所有方面和实施例的一个实施例中，腺病毒VA RNA核酸在其3'-端包含聚合酶III终止子。
在所有方面和实施例的一个实施例中，腺病毒VA RNA核酸的所有元件以可操作连接的形式排列。
在所有方面和实施例的一个实施例中，腺病毒VA RNA核酸是功能性的。
不受理论的束缚，假设可用根据本发明的核酸实现对腺病毒VA RNA转录的改善控制，并且从而实现AAV颗粒产生。
本发明的另一方面是用于rAAV颗粒产生的包装细胞(株)，其中rep/cap基因以及腺病毒辅助基因(稳定地)整合到基因体中，且其中腺病毒VA RNA核酸包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸。
在该方面的一个优选的实施例中，包含ITR和转基因的rAAV质粒也被整合到包装细胞的基因体中。从而将包装细胞株转变为rAAV载体和颗粒产生细胞株。同样地，在某些实施例中，瞬时地引入rAAV质粒/基因体。
在重组之后，产生细胞株的细胞在遗传上是一致的，并以正确的化学计量表达复制和包装rAAV所需的所有基因(与此相反，在三重或双重转染方法中，一些细胞可接受次最佳的剂量的一个或其他质粒)。因此，不受此理论的束缚，与瞬时包装或产生细胞相比，稳定的rAAV载体/颗粒包装或产生细胞可导致更高的产品质量。
本发明的一个独立方面是一种DNA(分子)，其包含
-根据本发明的腺病毒VA RNA核酸，
-第一DNA元件，
-任选地，第二DNA元件，
-任选地，第三DNA元件，以及
-任选地，rep或/和cap开放阅读框。
在此方面的一个从属实施例中
-第一DNA元件包含E1A开放阅读框和E1B开放阅读框；以及
-第二DNA元件(如果存在)包含E2A开放阅读框和E4或E4orf6开放阅读框，
或反之亦然。
本发明的一个独立方面是一种包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)的哺乳动物细胞或昆虫细胞。
本发明的一个独立方面是一种产生重组腺相关病毒(rAAV)载体或颗粒的方法，该方法包括以下步骤：
-培养/繁殖根据本发明的细胞(在适合细胞分裂的条件下)，以及
-从细胞或培养基中回收rAAV载体或颗粒。
本发明的另一个独立方面是根据本发明的用于产生重组腺相关病毒载体或颗粒的腺病毒VA RNA核酸或DNA(分子)。
本发明的一个独立方面是腺病毒VA RNA核酸，其中野生型2型聚合酶III启动子已经被去活化/删除/移除，并且已经加入U6-snRNA启动子。在一个实施例中，进一步加入精确转录起始位点。
本发明的一个独立方面是一种生成/用于产生重组腺相关病毒(rAAV)载体或颗粒的方法，其中该方法包括：
-生成/提供哺乳动物悬浮生长细胞，其包含稳定地整合到其基因体中或以瞬时存在
-居于两个AAV ITR之间的转基因表达盒；
-编码腺病毒E1A、E1B、E2A、E4或E4orf6蛋白和根据本发明的腺病毒VA RNA核酸的开放阅读框；
-编码腺相关Rep/Cap蛋白的开放阅读框；
-繁殖/培养哺乳动物细胞(在允许细胞分裂的条件下)；以及
-从细胞或培养基分离rAAV载体或颗粒，并且从而产生rAAV载体或颗粒。
具体实施方式
本文报道新型核酸和DNA元件以及其使用方法。根据本发明的核酸可用于重组产生AAV颗粒。本发明使用启动子和编码序列的特意排列，以提供新型腺病毒VA RNA核酸。
定义
用于进行本发明的有用方法和技术描述于例如Ausubel,F.M.(ed.),CurrentProtocols in Molecular Biology,Volumes I to III(1997)；Glover,N.D.,and Hames,B.D.,ed.,DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II(1985),OxfordUniversity Press；Freshney,R.I.(ed.),Animal Cell Culture–a practical approach,IRL Press Limited(1986)；Watson,J.D.,et al.,Recombinant DNA,Second Edition,CHSL Press(1992)；Winnacker,E.L.,From Genes to Clones；N.Y.,VCH Publishers(1987)；Celis,J.,ed.,Cell Biology,Second Edition,Academic Press(1998)；Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,secondedition,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)。
使用重组DNA技术能够产生核酸衍生物。此类衍生物可例如在个别或数个核苷酸位置通过取代、改变、交换、缺失或插入而修饰。修饰或衍生化可例如通过定点诱变的方式进行。此类修饰可容易地由本领域技术人员进行(参见，例如，Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,USA；Hames,B.D.,and Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization–apractical approach(1985)IRL Press,Oxford,England)。
脱氧核糖核酸包含编码股及非编码股。术语“5'-”和“3'-”在本文中使用时指编码股上的位置。
术语“3'-侧翼序列”表示位于核苷酸序列3'-端(下游；下方)的序列。
术语“5'-侧翼序列”表示位于核苷酸序列5'-端(上游、上方)的序列。
也必须注意，除非上下文另有明确规定，否则如本文中及所附权利要求中所使用，单数形式“一”、“一种”及“该”包括多个提及物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞及本领域技术人员已知的其等效物，诸如此类。同样，术语“一”(或“一种”)、“一个或多个”及“至少一个”在本文中可互换使用。也应注意，术语“包含”、“包括”及“具有”可互换使用。
术语“AAV辅助功能”表示AAV衍生的编码序列(蛋白质)，其可经表达以提供AAV基因产物和AAV颗粒，而AAV颗粒另一方面以反式作用于产生性AAV复制和包装。因此，AAV辅助功能包括AAV开放阅读框(ORF)，其包括rep和cap及其他诸如某些AAV血清型的AAP。rep基因表达产物已经被证明具有许多功能，其中包括：识别、结合及切口DNA复制的AAV起始点；DNA解旋酶活性；以及调节来自AAV(或其他异源性)启动子的转录。cap基因表达产物(衣壳)提供必需的包装功能。AAV辅助功能用于补充AAV载体基因体中缺失的反式AAV功能。
术语“约”表示其后接着的数值+/-20％的范围。在一个实施例中，术语约表示其后数值的+/-10％的范围。在一个实施例中，术语约表示其后数值的+/-5％的范围。
术语“包含”也包括术语“由…组成”。
术语“空衣壳”和“空颗粒”是指具有AAV蛋白壳但其全部或部分地缺乏编码蛋白质或转录成侧翼为AAV ITR的感兴趣的转录物的核酸的AAV颗粒，即载体。因此，空衣壳不会将编码蛋白质的核酸或被转录成感兴趣的转录物的核酸转移到宿主细胞中。
术语“内源”表示在细胞内天然发生的；由细胞天然地产生；同样地，“内源基因座/细胞内源基因座”是细胞中天然存在的基因座。
如本文所用，术语“外源”是指核苷酸序列并非源自特定细胞，而是通过DNA递送方法引入该细胞中，例如通过病毒载体的转染、电穿孔或转导方法。因此，外源核苷酸序列是人工序列，其中人造物可源自例如不同来源的子序列的组合(例如重组酶识别序列与SV40启动子和绿色荧光蛋白的编码序列的组合为一种人工的核酸)，或部分序列的缺失(例如仅编码膜结合受体或cDNA的细胞外域的序列)或核碱基的突变。术语“内源”是指源自细胞的核苷酸序列。“外源”核苷酸序列可具有在碱基组成上相同的“内源”对应物，但是其中序列(例如经由重组DNA技术)被引入细胞中而成为“外源”序列。
如本文所用，术语“侧翼”表示位于第二核苷酸序列的5'或3'末端或两端的第一核苷酸序列。侧翼核苷酸序列可与第二核苷酸序列相邻或相距给定的距离。除实际需要外，侧翼核苷酸序列的长度无具体限制。例如，侧翼序列可包含几个碱基对或几千个碱基对。术语“侧翼核苷酸序列”表示在待插入序列(＝靶序列)之前或之后的核酸序列片段。
术语“基因座”表示基因在染色体上的位置，即基因在基因体中的位置，即基因位置。
“分离的”组合物是指已经从其自然环境的一种或多种组分中分离出来的抗体。在一些实施例中，将组合物纯化至大于95％或99％的纯度，通过(例如)电泳(例如，SDS-PAGE、等电位聚焦(IEF)、毛细管电泳、CE-SDS)或色谱(例如，尺寸排阻色谱或离子交换或反相HPLC)所测定。对于例如抗体纯度的审查评估方法，参见，例如，Flatman,S.等人，J.Chrom.B848(2007)79-87。
“分离的”核酸是指已经从其自然环境的一种或多种组分中分离出来的核酸分子。分离的核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但是核酸分子存在于染色体外或与自然染色体位置不同的染色体位置。
“分离的”多肽或抗体是指已经从其自然环境的一种或多种组分中分离出来的多肽分子或抗体分子。
“整合位点”表示其中被/已经被插入外源核苷酸序列的细胞基因体中的核酸序列。在某些实施例中，整合位点位于细胞基因体中两个相邻的核苷酸之间。在某些实施例中，整合位点包括一段核苷酸。在某些实施例中，整合位点位于哺乳动物细胞基因体的特定位点。在某些实施例中，整合位点在哺乳动物细胞的内源基因中。
术语“LoxP位点”表示长度为34bp的核苷酸序列，其由末端的两个回文13bp序列(反向重复)(分别为ATAACTTCGTATA(SEQ ID NO:01)和TATACGAAGTTAT(SEQ ID NO:02))和中央8bp核心(非对称)间隔子序列组成。间隔子序列决定LoxP位点的方向。根据两个LoxP位点彼此的相对方向和位置，介入的DNA被切除(LoxP位点朝向相同方向)，或者被反向(LoxP位点朝向相反方向)。术语“夹接(floxed)”表示位于两个LoxP位点之间的DNA序列。如果有两个夹接序列(即基因体中的靶夹接序列和供体核酸中的夹接序列)，则两者序列可相互交换。这称为“重组酶介导的盒交换”。
示例性的LoxP位点在下表中示出：
名称 核心序列 SEQ ID NO:
LoxP ATGTATGC 03
L3 AAGTCTCC 04
L2(反向) GCATACAT 05
LoxFas TACCTTTC 06
Lox511 ATGTATAC 07
Lox5171 ATGTGTAC 08
Lox2272 AAGTATCC 09
Loxm2 AGAAACCA 10
Loxm3 TAATACCA 11
Loxm7 AGATAGAA 12
术语“包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞”涵盖已经被引入一种或多种外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。这些细胞可作为进一步基因修饰的起点。因此，术语“包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞”涵盖包含整合至该乳动物细胞基因体的基因座内单个位点的外源核苷酸序列的细胞，其中该外源核苷酸序列包含侧翼为至少一个第一选择标记的至少第一重组识别位点和第二重组识别位点(这些重组识别位点是不同的)。在某些实施例中，包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞为包含整合至所述宿主细胞基因体的基因座内单个位点处的外源核苷酸序列的细胞，其中该外源核苷酸序列包含侧翼为至少一个第一选择标记的第一重组识别序列和第二重组识别位点，以及位于该第一重组识别序列与该第二重组识别序列之间的第三重组识别序列，且所有重组识别序列都不相同。
“包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞”与“重组细胞”都为“转染细胞”。该术语包括原代转染细胞及从其衍生的子代，而与继代次数无关。例如，子代在核酸含量上可与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。包含与原始转染的细胞具有相同功能或生物活性的突变子代。
“编码AAV包装蛋白的核酸”通常是指一种或多种核酸分子，其包括提供从AAV载体中缺失的AAV功能的核苷酸序列，其用于产生转导感受态的重组AAV颗粒。编码AAV包装蛋白的核酸通常用于提供表达AAV rep和/或cap基因，以补充AAV复制所需的缺失的AAV功能；然而，核酸构建体缺乏AAV ITR，既无法复制也无法自行包装。编码AAV包装蛋白的核酸可为质粒、噬菌体、转座子、黏接质粒、病毒或颗粒的形式。已经描述许多核酸构建体，例如常用的质粒pAAV/Ad和pIM29+45，其编码rep和cap基因表达产物两者(参见，例如，Samulski等人(1989)J.Virol.63:3822-3828；以及McCarty等人(1991)J.Virol.65:2936-2945)。已经描述许多编码rep和/或cap基因表达产物的质粒(例如，US 5,139,941和US 6,376,237)。这些编码AAV包装蛋白的核酸中的任一者均可包含根据本发明的DNA元件或核酸。
术语“编码辅助蛋白的核酸”通常是指一个或多个核酸分子，其包括编码提供腺病毒辅助功能的蛋白的核苷酸序列。可将具有编码辅助蛋白的核酸的质粒转染到合适的细胞中，其中该质粒然后能够支持在该细胞中产生AAV颗粒。这些编码辅助蛋白的核酸中的任一者均可包含根据本发明的DNA元件或核酸。该术语明确排除传染性病毒颗粒，因其存在于自然界中，例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒颗粒。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指两个或更多个组分的并置，其中组分处于使其能够以预期方式起作用的关系。例如，如果启动子和/或增强子起到调节编码序列/开放阅读框/基因的转录的作用，则该启动子和/或该增强子可操作地连接至该编码序列/开放阅读框/基因。在某些实施例中，“可操作地连接”的DNA序列为连续的。在某些实施例中，例如，当需要连接两个蛋白编码区(例如分泌前导子和多肽)时，序列为连续的且在相同的读框中。在某些实施例中，可操作地连接的启动子位于编码序列/开放阅读框/基因的上游，且可与其相邻。在某些实施例中，例如，关于调节编码序列/开放阅读框/基因的表达的增强子序列，虽然两种组分不相邻，但可为可操作地连接。如果增强子增加编码序列/开放阅读框/基因的转录，则增强子可操作地连接至该编码序列/开放阅读框/基因。可操作地连接的增强子可位于编码序列/开放阅读框/基因的上游、内部或下游，且可位于距该编码序列/开放阅读框/基因的启动子相当远的距离。
术语“包装蛋白”是指非AAV衍生的病毒和/或细胞功能，AAV其复制依赖这些功能。因此，该术语涵盖AAV复制所需的蛋白质和RNA，包括参与AAV基因转录的活化、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物合成和AAV衣壳组装的部分。基于病毒的辅助功能可源自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(单纯疱疹病毒I型除外)和牛痘病毒。
如本文所用，“AAV包装蛋白”是指AAV衍生的序列，其以反式作用于产生性AAV复制。因此，AAV包装蛋白由主要的AAV开放阅读框(ORF)、rep和cap编码。rep蛋白已经被证明具有许多功能，其中包括：识别、结合及切口DNA复制的AAV起始点；DNA解旋酶活性；以及调节来自AAV(或其他异源性)启动子的转录。cap(衣壳)蛋白提供必需的包装功能。本文所述的AAV包装蛋白用于补充AAV载体中缺失的反式AAV功能。
“质粒”是一种核酸或多核苷酸形式，其通常具有用于表达(例如，转录、复制等)或繁殖(复制)质粒的附加元件。本文所用的质粒也可用于参考此类核酸或多核苷酸序列。因此，在所有方面中，本发明的组合物和方法适用于核酸、多核苷酸以及质粒，例如用于产生产生病毒(例如，AAV)载体的细胞，以产生病毒(例如，AAV)颗粒，以产生包含病毒(例如，AAV)颗粒等的细胞培养基。
本文所使用的术语“重组细胞”表示最终遗传修饰之后的细胞，例如感兴趣的AAV颗粒且其可用于以任何规模产生感兴趣的AAV颗粒的细胞。例如，“包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞”已经进行重组酶介导的盒式交换(RMCE)，从而将用于感兴趣的多肽的编码序列引入宿主细胞的基因体中，即为“重组细胞”。尽管细胞仍能进行进一步的RMCE反应，但其并不旨在进行。
“重组AAV载体”源自病毒(例如AAV)的野生型基因体，通过使用分子生物学方法从病毒(例如AAV)中移除野生型基因体，将其以非天然核酸(例如被转录成转录物或编码蛋白质的核酸)替换。通常，对于AAV，野生型AAV基因体的一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留在重组AAV载体中。“重组”AAV载体与野生型病毒AAV基因体不同，因为病毒基因体的全部或部分已经被相对于病毒基因体核酸的非天然(即异源)序列所替换。因此，将并入非天然序列的病毒载体(例如，AAV)定义为“重组”载体，其在AAV的情况下可称为“rAAV载体”。
重组载体(例如，AAV)序列可经包装，在本文中称为“颗粒”，其用于随后在离体、体外或活体内感染细胞(转导)。当重组载体序列被囊装或包装到AAV颗粒中时，该颗粒也可称为“rAAV”。此类颗粒包括囊装或包装载体基因体的蛋白质。具体实例包括病毒套膜蛋白，在AAV的情况下，包括衣壳蛋白，诸如AAV VP1、VP2和VP3。
“重组识别位点”(RRS)是由重组酶识别的核苷酸序列，并且对于重组酶介导的重组事件是必需且充分的。RRS可用于定义核苷酸序列中发生重组事件的位置。
如本文所使用，术语“选择标记”表示一种基因，其允许携带该基因的细胞在对应的选择剂的存在下被特异性地选择或排除。例如，但并非限制性地，选择标记可允许以选择标记基因转化的宿主细胞在各别的选择剂存在下(选择性培养条件)被明确选择；未转化的宿主细胞将不能在选择性培养条件下生长或存活。选择标记可为阳性、阴性或双功能选择标记。阳性选择标记可选择带有标记的细胞，而阴性选择标记则可以选择性排除带有标记的细胞。选择标记可导致药物抗性或补偿宿主细胞中的代谢或分解代谢缺陷。在原核细胞中，可使用导致对氨芐青霉素、四环素、卡那霉素或氯霉素抗性的基因。在真核细胞中用作选择标记的抗性基因包括但不限于：针对氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如，潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418 APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色胺酸合成酶(吲哚)、组胺醇脱氢酶(组胺醇D)的基因以及编码对嘌呤霉素、杀稻瘟素、博莱霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因。更多标记基因在WO 92/08796和WO 94/28143中描述。
除了在对应的选择剂存在下促进选择之外，选择标记另选地可为通常不存在于细胞中的分子，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(eGFP)、合成GFP、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型YFP(eYFP)、青色荧光蛋白(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed-monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire。表达此类分子的细胞可与不携带此基因的细胞区别，例如分别通过检测或不存在编码的多肽所发出的荧光。
如本文所用，术语“血清型”是基于不同血清学的AAV衣壳的区别。血清学独特性是基于抗体对一个AAV与另一个AAV之间相比缺乏交叉反应性来确定的。此类交叉反应性的差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定基的差异(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。虽然包括衣壳变异体的AAV变异体可能在血清学上与参考AAV或其他AAV血清型没有差异，但与参考或其他AAV血清型相比，其有至少一个核苷酸或氨基酸残基不同。
在传统定义下，血清型代表感兴趣的病毒已经针对所有存在及特征血清型的特异性血清进行中和活性测试，且未发现中和感兴趣的病毒的抗体。随着发现更多天然病毒分离株和/或产生衣壳突变体，与目前存在的任何血清型可能存在或不存在血清学差异。因此，在新病毒(例如AAV)不具血清学差异的情况下，此类新病毒(例如AAV)为相应血清型的亚组或变异体。在许多情况下，尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒进行中和活性的血清学测试以确定其是否属于根据传统血清型定义的另一种血清型。因此，为方便及避免重复，术语“血清型”泛指血清学上不同的病毒(例如AAV)以及血清学上不明显的病毒(例如AAV)，其可为在亚组内或给定血清型的变异体。
术语“转导”及“转染”是指将分子如核酸(病毒载体、质粒)引入至细胞中。当外源核酸已经被引入至细胞膜内时，则细胞已经被“转导”或“转染”。因此，“转导细胞”是“核酸”或“多核苷酸”已经被引入其中的细胞，或其已经引入外源核酸的子代。在特定实施例中，“转导”细胞(例如，在哺乳动物中，诸如细胞或组织或器官细胞)在并入外源分子例如核酸(例如转基因)之后，具有基因变化。“转导”细胞可繁殖且转录引入的核酸和/或表达蛋白质。
在“转导”或“转染”细胞中，核酸(病毒载体、质粒)可或可不整合到基因体核酸中。如果引入的核酸整合到受体细胞或生物体的核酸(基因体DNA)中，则其可在该细胞或生物体中稳定地维持，并进一步递送给受体细胞或生物体的子代细胞或生物体或由其遗传。最后，引入的核酸可存在于受体细胞或宿主生物体中的染色体外或仅瞬时地存在。有许多已知的技术，参见，例如，Graham等人，(1973)Virology,52:456；Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning,alaboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,NewYork；Davis等人，(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；及Chu等人，(1981)Gene 13:197。此类技术可用于将一种或多种外源DNA部分引入到合适的宿主细胞。
如本文所用，术语“转基因”方便地指旨在或已经被引入到细胞或生物体的核酸。转基因包括任何核酸，例如被转录成转录物或其编码多肽或蛋白质的基因。
“载体”是指重组质粒序列的一部分，最终直接的或以单股或RNA的形式包装或囊装，以形成病毒(例如AAV)颗粒。在重组质粒用于构建或制备重组病毒颗粒的情况下，病毒颗粒不包括未对应于重组质粒的载体序列的“质粒”部分。此类重组质粒的非载体部分被称为“质粒骨架”，其对质粒的克隆和扩增是重要的，其为繁殖和重组病毒产生所需的过程，但本身并未被包装或囊装到病毒(例如，AAV)颗粒中。因此，“载体”是指被病毒颗粒(例如，AAV)包装或囊装的核酸。
重组细胞株生成
通常，对于有效及大规模产生感兴趣的蛋白质化合物(例如对于rAAV颗粒或治疗性多肽)，需要稳定表达且如果可能也分泌该蛋白质化合物的细胞。此类细胞称为“重组细胞”或“重组产生细胞”。产生此类重组细胞的过程称为“细胞株开发”(CLD)。
在第一步中，将编码感兴趣的蛋白质化合物的所需核酸序列转染合适的宿主细胞。可能需要转染额外的辅助多肽。在第二步中，选择稳定表达感兴趣的蛋白质化合物的细胞。这可例如基于共表达选择标记的来实现，该选择标记已经与编码感兴趣的蛋白质化合物的核酸序列共转染，或者为蛋白质化合物本身的表达。
为表达编码序列(即开放阅读框)，需额外的调控元件，诸如启动子和多腺苷酸化信号(序列)。因此，开放阅读框可操作地连接至额外的转录调控元件。这可通过将其整合到所谓的表达盒中来实现。表达盒在哺乳动物细胞中是功能性的而所需的最小调控元件为：位于开放阅读框的上游(即5')的在该哺乳动物细胞中是功能性的启动子，以及位于开放阅读框的下游(即3')的在该哺乳动物细胞中是功能性的多腺苷酸化信号(序列)。此外，终止子序列可能存在于多腺苷酸化信号(序列)的3'端。对于表达，启动子、开放阅读框/编码区及多腺苷酸化信号序列须以可操作地连接的形式排列。
同样地，被转录成非蛋白质编码RNA的核酸称为“RNA基因”。对于RNA基因的表达，也需要额外的调控元件，诸如启动子和转录终止信号或多腺苷酸化信号(序列)。这些元件的性质及定位取决于旨在驱动表达RNA基因的RNA聚合酶。因此，RNA基因通常也被整合到表达盒中。
如果感兴趣的蛋白质化合物是由不同(单体)多肽组成的异源多聚体多肽，则不仅需要单个表达盒，且需要每个不同多肽的一个表达盒，即开放阅读框/编码序列，以及RNA基因(如果存在)。这些表达盒至少在含有的开放阅读框/编码序列方面不同，但在启动子和/或多腺苷酸化信号序列方面也可能不同。
例如，如果感兴趣的蛋白质化合物为全长抗体(其包含两个轻链拷贝及两个重链拷贝的异源多聚体多肽)，则需要两种不同的表达盒，一种用于轻链而一种用于重链。例如，如果全长抗体为双特异性抗体(即，包含特异性结合至两种不同抗原的两种不同结合位点的抗体)，则每条轻链以及每条重链也彼此不同。因此，双特异性全长抗体由四种不同的多肽组成，因此需要包含编码四种不同多肽的四种不同开放阅读框的四种表达盒。
如果感兴趣的蛋白质化合物为AAV颗粒(它由不同的(单体)多肽及单股DNA分子组成，且也需要其他辅助因子来产生及囊装)，则需要许多表达盒，其包含的开放阅读框/编码序列是不同的。在此类情况下，至少需要用于所需辅助功能以及VA RNA的每个转基因的表达盒，形成AAV载体的衣壳的不同多肽。因此，每个辅助E1A、E1B、E2A、E4orf6、VA RNA、rep和cap基因都需要单独的表达盒。
如先前几段所述，感兴趣的蛋白质化合物越复杂或所需的额外辅助多肽和/或RNA的数量分别越多，则所需的不同表达盒的数量就越多。本质上随着表达盒的数量增加，整合到宿主细胞基因体中的核酸的大小也会增加。然而，可转移的核酸大小实际上有上限，其为约15kbps(千碱基对)的范围。超过这个限度，处理及加工效率将大幅降低。此问题可通过使用两个或多个分开的核酸来解决。因此，不同的表达盒被分配给不同的核酸，由此每个核酸仅包含一些表达盒。
对于细胞株开发，可使用携带感兴趣的蛋白质化合物的表达盒的核酸的随机整合(RI)。通常，通过使用RI，核酸或其片段会随机整合到宿主细胞的基因体中。
另选地，对于RI，靶向整合(TI)可用于CLD。在TI CLD中，一种或多种包含不同表达盒的核酸被引入至宿主细胞基因体中的预定基因座。
在TI中，同源重组或重组酶介导的盒交换反应(RMCE)可用于将包含对应表达盒的核酸整合到TI宿主细胞的基因体的特定基因座中。
在某些实施例中，提供一种将单个脱氧核糖核酸靶向整合到(宿主)哺乳动物细胞的基因体中的方法(即一种用于产生重组哺乳动物细胞的方法)，该细胞随后包含编码蛋白质化合物的核酸且随后产生该蛋白质化合物，该方法包括以下步骤：
a)提供哺乳动物细胞，其包含整合在该哺乳动物细胞基因体的基因座内的给定(任选地，单个)位点的外源核苷酸序列，其中该外源核苷酸序列包含侧翼为至少一个第一选择标记的第一重组序列和第二重组序列，其中所有重组序列均不相同或/和不兼容的(即，其不会造成交叉交换反应)；
b)将a)中提供的包含两种不同重组序列和一到八种表达盒的脱氧核糖核酸引入至该哺乳动物细胞，其中
该脱氧核糖核酸在5'-至3'-的方向上包含，
-第一重组序列，
-一到八个表达盒，其中一种表达盒编码一个第二选择标记，以及
-第二重组序列，
其中该脱氧核糖核酸的该第一重组序列和该第二重组序列与整合的外源核苷酸序列上的该第一重组序列和该第二重组序列相匹配；
c)任选地在步骤b)中获得的该哺乳动物细胞中引入或活化对该第一重组序列和第二重组序列功能性的重组酶(使介于该第一重组序列与第二重组序列之间的该外源核苷酸序列的部分与介于该第一重组序列与第二重组序列之间的该脱氧核糖核酸酸的部分进行交换，从而将后者整合到该哺乳动物细胞的基因体中)；
d)任选地选择表达该第二选择标记并产生由引入的脱氧核糖核酸所编码的该蛋白质化合物的细胞，
从而产生包含编码蛋白质化合物的核酸并产生该蛋白质化合物的重组哺乳动物细胞。
在某些实施例中，提供一种将两种脱氧核糖核酸同时靶向整合到(宿主)哺乳动物细胞的基因体中的方法(即一种用于产生重组哺乳动物细胞的方法)，该细胞包含编码蛋白质化合物的核酸且其任选地表达该蛋白质化合物，该方法包括以下步骤：
a)提供哺乳动物细胞，其包含整合在该哺乳动物细胞基因体的基因座内的给定(任选地，单个)位点的外源核苷酸序列，其中该外源核苷酸序列包含侧翼为至少一个第一选择标记的第一重组序列和第二重组序列，以及位于该第一重组序列与该第二重组序列之间的第三重组序列，且所有重组序列均不相同或/和不兼容的(即，其不会造成交叉交换反应)；
b)将a)中提供的包含三种不同重组序列和一到八种表达盒的脱氧核糖核酸引入至该细胞，其中
该第一脱氧核糖核酸在5'-至3'-的方向上包含，
-第一重组序列，
-一种或多种(在一个优选的实施例中，多达四种)表达盒，
-编码一种第二选择标记的表达盒的5'-末端部分，以及
-第三重组序列的第一拷贝，
并且
该第二脱氧核糖核酸在5'-至3'-的方向上包含
-该第三重组序列的第二拷贝，
-编码该第二选择标记的表达盒的3'-末端部分，
-一种或多种(在一个优选的实施例中，多达四种)表达盒，并且
-第二重组序列，
其中该第一脱氧核糖核酸和第二脱氧核糖核酸的该第一重组序列至第三重组序列与整合的外源核苷酸序列上的该第一重组序列至第三重组序列相匹配，
其中编码该第二选择标记的表达盒的5'-末端部分和3'-末端部分一起形成该第二选择标记的功能性表达盒；
c)任选地在步骤b)中获得的该哺乳动物细胞中引入或活化对该第一重组序列、第二重组序列和第三重组序列是功能性的重组酶(使介于该第一重组序列与第三重组序列之间的该外源核苷酸序列的部分及介于该第三重组序列与第二重组序列之间的部分与介于该第一重组序列与第三重组序列及该第三重组序列与第二重组序列之间的该脱氧核糖核酸酸的部分进行交换，从而将后者整合到该哺乳动物细胞的基因体中)；
d)任选地选择表达该第二选择标记并任选地产生由引入的脱氧核糖核酸所编码的该蛋白质产物的细胞，
从而产生包含编码该蛋白质化合物的核酸的重组哺乳动物细胞。
为增加选择压力，第一选择标记为负选择标记，诸如，例如在一个实施例中，为来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶(使细胞对胸苷类似物敏感，诸如5-碘-2'-氟-2'-脱氧-1-β-D-阿拉伯-呋喃糖尿嘧啶(FIAU)或更昔洛韦(ganciclovir))或来自白喉棒状杆菌的白喉毒素片段A(通过抑制蛋白质合成引起毒性；例如通过白喉毒素A片段基因的由磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)所驱动的表达)。在交换引入的脱氧核糖核酸期间，移除负选择标记。这允许区分出正确的靶向整合和不正确的随机整合。
在所有方面和实施例的一个实施例中，每个表达盒在5'-至-3'的方向上包含启动子、开放阅读框/编码序列或RNA基因和多腺苷酸化信号序列和/或终止子序列。在一个实施例中，开放阅读框编码多肽，且表达盒包含具有或不具有额外终止子序列的多腺苷酸化信号序列。在一个实施例中，表达盒包含RNA基因，启动子为polII启动子且存在多腺苷酸化信号序列或polyU终止子。参见，例如，Song等人，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 323(2004)573–578。在一个实施例中，表达盒包含RNA核酸，启动子为polIII启动子及polyU终止子序列。
在所有方面和实施例的一个实施例中，开放阅读框编码多肽，启动子为具有或不具有内含子A的人类CMV启动子，多腺苷酸化信号序列为bGH(牛生长激素)polyA信号序列且终止子为hGT(人类胃泌素终止子)。
在所有方面和实施例的一个实施例中，启动子为具有内含子A的人类CMV启动子，多腺苷酸化信号序列为bGH多腺苷酸化信号序列且终止子为hGT，除了RNA核酸的表达盒和选择标记的表达盒，其中对于选择标记，启动子为SV40启动子，且多腺苷酸化信号序列为SV40多腺苷酸化信号序列，且不存在终止子，且其中对于RNA核酸，启动子为变体2型聚合酶III启动子或3型聚合酶III启动子(诸如U6-snRNA启动子)且终止子为聚合酶II或III终止子。
在所有先前方面及实施例中的一个实施例中，人类CMV启动子具有SEQ ID NO:13的序列。在一个实施例中，人类CMV启动子具有SEQ ID NO:14的序列。在一个实施例中，人类CMV启动子具有SEQ ID NO:15的序列。
在所有先前方面及实施例中的一个实施例中，BGH多腺苷酸化信号序列为SEQ IDNO:16。
在所有先前方面及实施例中的一个实施例中，hGT具有SEQ ID NO:17的序列。
在所有先前方面及实施例中的一个实施例中，SV40启动子具有SEQ ID NO:18的序列。
在所有先前方面及实施例中的一个实施例中，SV40多腺苷酸化信号序列为SEQ IDNO:19。
须指出，本发明不涵盖包含腺病毒基因功能E1A和E1B的核酸序列以及SV40大T抗原或艾司坦-巴尔病毒(EBV)核抗原1(EBNA-1)的核酸序列的永久性人类细胞株。
同源重组
在某些实施例中，靶向整合由同源重组介导。
通过同源重组的靶向整合为本领域的成熟技术。例如，30多年以来，同源重组已经被用于以位点特异性方式在鼠胚胎干细胞中引入特定的基因修饰(Doetschman,T.等人，Nature 330(1987)576-578；Thomas,K.R.和Capecchi,M.R.，Cell 51(1987)503-512；Thompson,S.等人，Cell 56(1989)313-321；Zijlstra,M.等人，Nature 342(1989)435-438；Bouabe,H.和Okkenhaug,K.，Meth.Mol.Biol.1064(2013)315-336)。
在使用同源重组进行靶向整合的情况下，重组序列为与外源核酸序列同源的序列，并且称为“同源臂”。在这种情况下，引入宿主细胞的脱氧核糖核酸包含作为第一重组序列的与外源核酸序列(即安放位点)的5'(上游)序列同源的序列，和作为第二重组序列的与外源核酸序列的3'(下游)序列同源的序列。通常，靶向整合频率随着同源臂的长度和同基因性而增加。理想情况下，同源臂源自从对应宿主细胞所制备的基因体DNA。
核酸酶
在某些实施例中，靶向整合是通过位点特异性核酸酶介导的同源重组。
在一个实施例中，位点特异性核酸酶选自锌指核酸酶(ZFN)、类转录活化因子效应核酸酶(TALEN)和常间回文重复序列丛集(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9核酸酶(Cas9)系统。
核酸酶编码基因通过质粒DNA、病毒载体或活体外转录的mRNA递送到细胞中。可通过电穿孔或基于阳离子脂质的试剂进行质粒DNA或mRNA的转染。整合酶缺陷型慢病毒载体可用于将核酸酶递送到抗转染细胞类型中。AAV载体也可用于核酸酶递送。
重组酶
重组系统，诸如Cre/LoxP或Flp/FRT，可用于交换不同核酸分子之间的部分核酸序列，从核酸分子中切除核酸片段，或在核酸分子内部的反转。使用单个开/关事件，重组酶作用的结果可是永久性，其可持续一段给定但有限的时间，且其可对特定的细胞类型或组织进行调整。
Flp重组酶
Flp/FRT位点特异性重组系统涉及通过重组酶翻转酶(Flp)对翻转酶识别靶(FRT)位点之间的序列进行重组。翻转酶源自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。Flp的序列可例如从UniProt P03870获取。34bp FRT位点具有GAAGTTCCTATTCtctagaaaGAATAGGAACTTC(SEQ ID NO:20；中心间隔子为小写字母)的序列，其中Flp重组酶与侧翼为8bp中央间隔子序列的GAAGTTCCTATTC(顺向SEQ ID NO:21；逆向SEQ ID NO:22)的反向13bp重复结合。
示例性FRT位点在下表中示出(参见Branda和Dymecki，Dev.Cell 6(2004)7-28)：
名称 间隔子序列 SEQ ID NO:
野生型 TCTAGAAA 23
F3 TTCAAATA 24
F5 TTCAAAAG 25
Cre重组酶
Cre/LoxP位点特异性重组体系已经广泛用于许多生物学实验系统中。Cre重组酶是一种38kDa位点特异性DNA重组酶，其可识别34bp LoxP序列。Cre重组酶源自噬菌体P1，且属于酪胺酸家族位点特异性重组酶。Cre重组酶可以介导LoxP序列之间的分子内和分子间重组。标准LoxP序列由侧翼为两个13bp的反向重复的8bp非回文间隔子组成。Cre重组酶与13bp重复结合，从而介导8bp间隔子序列内的重组。Cre-LoxP介导的重组高效发生，且无需其他宿主因子。如果将两个LoxP序列以相同的方向置于同一核苷酸序列上，则Cre重组酶介导的重组将切除位于两个LoxP序列之间的-DNA序列，使其成为共价闭合环。如果两个LoxP序列位于同一核苷酸序列的彼此反向/互逆方向位置上，则Cre重组酶介导的重组将反转位于两个LoxP序列之间的DNA序列的方向。如果两个LoxP序列位于两个不同DNA分子上，且如果一个DNA分子是环状，则Cre重组酶介导的重组将导致环状DNA序列的整合。
Cre重组酶可用任何已知的方法引入细胞或在细胞内活化。例如，使用基于脂质粒的基因递送(WO 93/24640；Mannino和Gould-Fogerite，BioTechniques6(1988)682-691；US5,279,833；WO 91/06309；Feigner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(9871)7413-7414)，或病毒载体，诸如乳头状瘤病毒、反转录病毒及腺相关病毒载体(例如，Berns等人，Ann.NYAcad.Sci.772(1995)95-104；Ali等人，Gene Ther.1(1994)367-384；Haddada等人，Curr.Top.Microbiol.Immunol.199(1995)297-306；Buchscher等人，J.Virol.66(1992)2731-2739；Johann等人，J.Virol.66(1992)1635-1640；Sommerfelt等人，Virol.176(1990)58-59；Wilson等人，J.Virol.63(1989)2374-2378；Miller等人，J.Virol.65(1991)2220-2224；WO 94/26877；Rosenburg和Fauci，Fundamental Immunology,Third Edition Paul(ed.)Raven Press,Ltd.,New York(1993)及其中的参考文献；West等人，Virology 160(1987)38-47；US 4,797,368；WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy 5(1994)793-801；Muzyczka,J.Clin.Invest.94(1994)1351；US 5,173,414；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.5(1985)3251-3260；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.4(1984)2072-2081；Hermonat and Muzyczka,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6466-6470；Samulski等人，J.Virol.63(1989)3822-3828)。
例如，Li,X.等人(PLOS ONE 7(2012)e50063)和Scammell,E.等人(J.Neurosci.23(2003)5762–5770)已经描述了表达Cre重组酶的血清型2的重组AAV载体。使用此类rAAV-Cre可诱导靶LoxP位点的非常完整的重组。对于基于rAAV载体的递送，也参见Muzyczka，Curr.Top.Microbiol.Immunol.158(1992)97-129；US 4,797,368；WO 91/18088；Samulski，Current Opinion in Genetic and Development 3(1993)74-80。
例如，可使用Cre重组酶表达质粒。
例如，可使用Cre重组酶编码mRNA。
许多功能性LoxP位点为已知的，诸如，例如，Lox511、Lox66、Lox11、Lox76、Lox75、Lox43、Lox44(参见，例如，Hoess,R.等人，Nucl.Acids Res.14(1986)2287-2300；Albert,H.等人，Plant J.7(1995)649-659)。
例如，如果使用Cre重组酶，则要交换的序列由基因体中以及供体核酸中两个LoxP位点的位置来定义。这些LoxP位点被Cre重组酶识别。不需要其他要件，即无需ATP等。
Cre/LoxP系统在不同的细胞类型中运行，如哺乳动物、植物、细菌及酵母菌。
使用重组酶的靶向整合
在某些实施例中，靶向整合是通过重组酶介导的盒交换反应(RMCE)进行的。
RMCE为一种酵素性过程，其中基因体中整合位点处的序列被交换成供体核酸。任何重组酶均可用于该过程，诸如Cre重组酶、Flp重组酶、Bxb1整合酶、pSR1重组酶或
Figure BDA0004171824500000241
整合酶。
一种特定的TI方法为双重组酶介导的盒交换(双RMCE)。
双RMCE是产生重组哺乳动物细胞的方法，该细胞包含编码感兴趣的蛋白质化合物的脱氧核糖核酸，通过重组酶介导将两种核酸序列引入至宿主细胞基因体的单个基因座。整合之后，两个核酸序列彼此可操作地连接。
例如，但并非限制性地，整合的外源核苷酸序列(即TI安放位点)可包含两个重组识别位点(RRS)，而(供体)核酸序列包含与整合的外源核苷酸序列上的RRS相匹配的两个RRS。此类单质粒RMCE策略允许通过在一对RRS之间的相应序列中并入适当数量的表达盒以引入多个开放阅读框。
例如，但并非限制性地，整合的外源核苷酸序列(即，TI安放点)可包含三个重组识别位点(RRS)，例如其排列方式为第三RRS(“RRS3”)存在于第一RRS(“RRS1”)与第二RRS(“RRS2”)之间，而第一(供体)核酸包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和第三RRS相匹配，并且第二(供体)核酸包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第三RRS和第二RRS相匹配。此类双RMCE策略允许通过在每对RRS之间的相应序列中并入适当数量的表达盒以引入多个基因。
此外，双质粒RMCE中需要两个选择标记。一个选择标记表达盒被分割成两部分。第一(前)核酸可含有启动子，之后为转译起始密码子和RRS3序列。第二(后)核酸对应地包含与选择标记编码序列的N端融合的RRS3序列，减去转译起始密码子(例如ATG)。可能需要在RRS3位点与选择标记编码序列之间插入额外的核苷酸，以确保融合基因的框转译，即，可操作的连接。只有当两个核酸(前和后)都被正确地插入时，才会组装选择标记的完整表达盒，因此使细胞对各自的选择剂产生抗性。
单个载体及双载体RMCE均通过使存在于供体DNA上的DNA序列与整合位点所在的哺乳动物细胞基因体上的DNA序列精确交换，允许将一个或多个供体DNA分子整合到哺乳动物细胞基因体的预定位点中。这些DNA序列的特征在于两个异源特异性RRS，侧翼为i)至少一个选择标记或如在某些双质粒RMCE中的“分割选择标记”；和/或ii)至少一个感兴趣的外源基因。
RMCE参与在靶基因体基因座内两个异源特异性RRS与供体DNA分子之间的重组酶催化的双重重组交换事件。双RMCE被设计成将来自前和后核酸的DNA序列副本引入哺乳动物细胞基因体的预定基因座。RMCE过程可用多个DNA序列重复。
在某些实施例中，靶向整合通过双RMCE实现，其中两种不同的DNA序列都整合到适合TI的哺乳动物细胞的基因体的预定位点中，该两个不同的DNA序列各包含至少一个表达盒，该表达盒编码感兴趣的蛋白化合物的一部分和/或至少一个选择标记或其部分，侧翼为两个异源特异性RRS。在某些实施例中，靶向整合通过多重RMCE实现，其中来自多个核酸的DNA序列均整合到适合TI的哺乳动物细胞的基因体的预定位点中，该多个核酸编码各包含至少一个表达盒，该表达盒编码感兴趣的蛋白化合物的一部分和/或至少一个选择标记或其部分，侧翼为两个异源特异性RRS。在某些实施例中，选择标记可被部分地在第一核酸(前)上编码，并被部分地在第二核酸(后)上编码，使得只有通过双RMCE正确整合核酸两者才能表达选择标记。
对于单RMCE及双RMCE，如上所述的将供体核酸靶向整合到受体/靶细胞基因体中的方法以及将两种供体核酸同时靶向整合到受体/靶细胞基因体中的方法包含引入/活化重组酶的额外步骤。
因此，在一个实施例中，重组序列为重组识别序列，且方法进一步包括以下步骤：
c)引入或活化
i)或者同时地引入b)的脱氧核糖核酸；或
ii)此后依序地
重组酶，
其中该重组酶识别第一脱氧核糖核酸和第二脱氧核糖核酸的重组识别序列；(并且任选地，其中一个或多个重组酶进行重组酶介导的盒交换)。
在某些实施例中，RRS选自由以下项组成的组：LoxP序列、L3序列、2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、F3序列、F5序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、
Figure BDA0004171824500000261
attP序列、和
Figure BDA0004171824500000262
attB序列。如果必须存在多个RRS，则在选择不同RRS的情况下，每个序列的选择取决于另一个。
在某些实施例中，RRS可由Cre重组酶识别。在某些实施例中，RRS可由Flp重组酶识别。在某些实施例中，RRS可由Bxb1整合酶识别。在某些实施例中，RRS可由
Figure BDA0004171824500000263
整合酶识别。在某些实施例中，RRS可由pSR1重组酶识别。
在某些实施例中，当RRS为LoxP位点时，细胞需要Cre重组酶进行重组。
在某些实施例中，当RRS为FRT位点时，细胞需要Flp重组酶进行重组。
在某些实施例中，当RRS为Bxb1 attP位点或Bxb1 attB位点时，细胞需要Bxb1整合酶进行重组。
在某些实施例中，当RRS为
Figure BDA0004171824500000271
attP位点或/>
Figure BDA0004171824500000272
attB位点时，细胞需要/>
Figure BDA0004171824500000273
整合酶进行重组。
在某些实施例中，当RRS为鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的pSR1重组酶的识别位点时，细胞需要pSR1重组酶进行重组。
重组酶编码基因可通过病毒载体或mRNA递送到细胞中作为DNA。可通过电穿孔或基于阳离子脂质的试剂进行DNA或mRNA的转染。整合酶缺陷型慢病毒载体可用于将重组酶递送到抗转染细胞类型中。AAV载体也可用于重组酶递送。重组酶蛋白也可通过非囊泡的方式引入。
在所有方面和实施例的一个实施例中，将重组酶作为mRNA引入至细胞中。
在所有方面和实施例的一个实施例中，将重组酶作为DNA引入至宿主细胞中。在一个实施例中，DNA为包含在表达盒中的重组酶编码序列。
在所有方面和实施例的一个实施例中，重组酶为Cre重组酶且将Cre重组酶作为Cre重组酶编码mRNA引入至细胞中，该mRNA编码具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的多肽。
在所有方面和实施例的一个实施例中，Cre重组酶mRNA编码包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的多肽且进一步在其N-或C-端或两者处包含核定位序列。在一个实施例中，Cre重组酶mRNA编码具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的多肽且进一步在其N-或C-端或两者处彼此独立地包含一个到五个核定位序列。
在所有方面和实施例的一个实施例中，Cre重组酶编码mRNA包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列或其具有不同密码子用法的变异体。在所有方面和实施例的一个实施例中，Cre重组酶编码mRNA包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列或其具有不同密码子用法的变异体，且进一步在其5'-或3'-端或两者处包含进一步编码核定位序列的核酸。在所有方面和实施例的一个实施例中，Cre重组酶编码mRNA包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列或其具有不同密码子用法的变异体，且进一步在其5'-或3'-端或两者处独立地包含一个到五个编码核定位序列的核酸。
在某些实施例中，LoxP序列为野生型LoxP序列。在某些实施例中，LoxP序列为突变型LoxP序列。已经开发出突变型LoxP序列以提高Cre重组酶所介导的整合或置换的效率。在某些实施例中，突变型LoxP序列选自由以下项组成的组：L3序列、2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列和Lox66序列。例如，Lox71序列在左侧13bp重复序列中具有5bp的突变。Lox66序列在右侧13bp重复序列中具有5bp的突变。野生型和突变型LoxP序列均可介导Cre重组酶依赖性重组。
术语“相匹配RRS”表示两个相匹配RRS之间发生重组。在某些实施例中，两个匹配RRS相同。在某些实施例中，两个RRS均为野生型LoxP序列。在某些实施例中，两个RRS均为突变型LoxP序列。在某些实施例中，两个RRS均为野生型FRT序列。在某些实施例中，两个RRS均为突变型FRT序列。在某些实施例中，两个匹配RRS为不同序列，但是可通过相同的重组酶进行识别。在某些实施例中，第一相匹配RRS为Lox71序列，且第二相匹配RRS为Lox66序列。在某些实施例中，第一匹配RRS为Bxb1 attP序列，且第二匹配RRS为Bxb1 attB序列。在某些实施例中，第一匹配RRS为
Figure BDA0004171824500000281
attB序列，且第二匹配RRS为/>
Figure BDA0004171824500000282
attB序列。
在所有方面和实施例的一个实施例中，双RMCE中的重组识别位点为L3、2L和LoxFas。在一个实施例中，L3包含作为间隔子序列的SEQ ID NO:04的序列，2L包含作为间隔子序列的SEQ ID NO:05的序列且LoxFas包含作为间隔子序列的具有SEQ ID NO:06的序列。在一个实施例中，第一重组识别位点为L3，第二重组识别位点为2L，且第三重组识别位点为LoxFas。
在所有方面和实施例的一个实施例中，编码选择标记的表达盒部分地位于第三重组识别序列的5'且部分地位于3'，其中位于表达盒的5'部分包含启动子和转录起始密码子，且位于表达盒的3’部分包含不具转录起始密码子的编码序列和polyA信号序列。
在所有方面和实施例的一个实施例中，编码选择标记的位于表达盒的5'部分包含可操作地连接至转译起始密码子的启动子序列，由此启动子序列的上游侧翼(即下游定位)为第二、第三或第四表达盒，表达盒和起始密码子的下游侧翼(即上游定位)为第三重组识别序列；且编码选择标记的位于表达盒的3'部分包含核酸，该核酸编码缺乏转录起始密码子的选择标记，其上游侧翼为第三重组识别序列且下游侧翼为polyA信号序列，且之后是分别为第三、第四或第五表达盒。
任何已知或未来的包含如本文所述的外源核酸(“安放位点”)而适用于靶向整合的哺乳动物细胞均可用于本发明。
在所有方面和实施例的一个优选的实施例中，包含整合在哺乳动物细胞基因体的基因座内的单个位点的外源核苷酸序列的哺乳动物细胞为仓鼠细胞或人类细胞，在一个实施例中是CHO细胞。
适用于本发明的包含整合在其基因体基因座内单个位点的外源核苷酸序列的示例性哺乳动物细胞为CHO细胞或HEK293细胞，或具有安放位点(＝整合在哺乳动物细胞基因体基因座内的单个位点外源性核苷酸序列)的Per.C6细胞，该安放位点包含三个用于Cre重组酶介导的盒交换的异源特异性LoxP位点。在一个实施例中，这些异源特异性LoxP位点为L3、LoxFas和2L(参见，例如，Lanza等人，Biotechnol.J.7(2012)898-908；Wong等人，Nucleic Acids Res.33(2005)e147)，其中L3和2L的侧翼分别为5'端和3'端的安放位点，或反之亦然，而LoxFas位于L3和2L位点之间。在所有方面和实施例的某些实施例中，安放位点还包含双顺反子单元，经由IRES将选择标记的表达与绿色荧光蛋白(GFP)的表达连接起来，允许通过正选择稳定安放位点，以及在转染和Cre重组酶介导的重组(负选择)之后选择不存在的位点。示例性的GFP具有SEQ ID NO:28的序列。
先前段所述的安放点的此类配置允许同时整合两个核酸，该两个核酸包含在不同的质粒中，具有L3和LoxFas位点的所谓前核酸和包含LoxFas和2L位点的后核酸。不同于安放位点的选择标记基因的功能元件可分布在两个核酸之间：启动子和转录起始密码子位于前核酸上，而编码区和poly A信号位于后核酸上。只有正确的Cre重组酶介导的两个所述核酸的整合才能诱导针对所对应的选择剂的抗性。
一般而言，适用于TI的哺乳动物细胞为包含整合在其基因体的基因座内的外源核苷酸序列的哺乳动物细胞，其中该外源核苷酸序列包含侧翼为一个第一选择标记的第一重组识别位点和第二重组识别位点，以及位于该第一重组识别位点与该第二重组识别位点之间的第三重组识别位点，且所有重组识别位点均不相同。该外源核苷酸序列称为“安放位点”。
本文所公开的主题使用适用于TI外源核苷酸序列的哺乳动物细胞。在某些实施例中，适用于TI的哺乳宿主细胞包含整合在哺乳动物细胞基因体中的整合位点的外源核苷酸序列。此类适用于TI的哺乳动物细胞也可称为“TI宿主细胞”。
在所有方面和实施例的某些实施例中，适用于TI的哺乳动物细胞为包含安放位点的仓鼠细胞、人类细胞、大鼠细胞或小鼠细胞。在某些实施例中，适用于TI的哺乳动物细胞为包含对应安放位点的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO K1细胞、CHO K1SV细胞、CHO DG44细胞、CHO DUKXB-11细胞、CHO K1S细胞、CHO K1M细胞、人类细胞、HEK293细胞或Per.C6细胞。
在所有方面和实施例的某些实施例中，适用于TI的哺乳动物细胞包含整合的外源核苷酸序列，其中外源核苷酸序列包含一个或多个重组识别位点(RRS)。在某些实施例中，外源核苷酸序列包含至少两个RRS。RRS可被重组酶识别，例如Cre重组酶、Flp重组酶、Bxb1整合酶或
Figure BDA0004171824500000301
整合酶。RRS可选自由以下项组成的组：LoxP位点、L3位点、2L位点、LoxFas位点、Lox511位点、Lox2272位点、Lox2372位点、Lox5171位点、Loxm2位点、Lox71位点、Lox66位点、FRT位点、F3位点、F5位点、Bxb1 attP位点、Bxb1 attB位点、/>
Figure BDA0004171824500000302
attP位点和/>
Figure BDA0004171824500000303
attB位点。
在所有方面和实施例的一个优选的实施例中，选择标记彼此独立地选自由以下项组成的组：氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如，潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色胺酸合成酶(吲哚)、组胺醇脱氢酶(组胺醇D)以及编码对嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博莱霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因。选择标记也可为选自由以下项组成的组的荧光蛋白：绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(eGFP)、合成GFP、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型YFP(eYFP)、青色荧光蛋白(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed-单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald6、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire。
外源核苷酸序列为不源自特定细胞但可通过DNA递送方法(例如通过转染、转导、电穿孔或转形方法)引入至所述细胞中的核苷酸序列。在所有方面和实施例的某些实施例中，适用于TI的哺乳动物细胞包含整合在哺乳动物细胞基因体中更多整合位点的至少一种外源核苷酸序列。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在哺乳动物细胞的基因体的特定基因座中的整合位点。
在所有方面和实施例的某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含一个或多个重组识别位点(RRS)，其中RRS可由重组酶进行识别。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少两个RRS。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含三个RRS，其中第三RRS位于第一RRS和第二RRS之间。在某些实施例中，第一RRS和第二RRS相同，并且第三RRS不同于第一或第二RRS。在某些实施例中，所有三个RRS均不同。在某些实施例中，RRS彼此独立地选自由以下项组成的组：LoxP位点、L3位点、2L位点、LoxFas位点、Lox511位点、Lox2272位点、Lox2372位点、Lox5171位点、Loxm2位点、Lox71位点、Lox66位点、FRT位点、F3位点、F5位点、Bxb1 attP位点、Bxb1 attB位点、
Figure BDA0004171824500000311
attP位点和/>
Figure BDA0004171824500000312
attB位点。
在所有方面和实施例的某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少一个选择标记。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含第一RRS、第二RSS和第三RRS，以及至少一个选择标记。在某些实施例中，选择标记位于第一RRS和第二RRS之间。在某些实施例中，两个RRS侧翼为至少一个选择标记，即第一RRS位于5'(上游)，且第二RRS位于选择标记的3'(下游)。在某些实施例中，第一RRS与选择标记的5'端相邻，并且第二RRS与选择标记的3'端相邻。
在所有方面和实施例的某些实施例中，选择标记位于第一RRS与第二RRS之间，并且这两个侧翼RRS不同。在某些实施例中，第一侧翼RRS为L3序列，且第二侧翼RRS为2L序列。在某些实施例中，L3序列位于选择标记的5'，且2L序列位于选择标记的3'。
在所有方面和实施例的某些实施例中，第一侧翼RRS为具有野生型反向重复的LoxP序列，且第二侧翼RRS为具有一个突变反向重复的LoxP序列。在某些实施例中，第一侧翼RRS为具有第一突变反向重复的LoxP序列，且第二侧翼RRS为具有与第一突变反向重复相同或不同的第二突变反向重复的LoxP序列。在某些实施例中，第一侧翼RRS为具有野生型反向重复的LoxP序列，且第三侧翼RRS为具有一个突变反向重复的LoxP序列。在某些实施例中，第二侧翼RRS为具有野生型反向重复的LoxP序列，且第三RRS为具有一个突变反向重复的LoxP序列。在某些实施例中，第一侧翼RRS为具有第一突变反向重复的LoxP序列，且第三RRS为具有第二突变反向重复的LoxP序列。在所有方面和实施例的某些实施例中，第二侧翼RRS为具有第一突变反向重复的LoxP序列，且第三RRS为具有第二突变反向重复的LoxP序列。
在所有方面和实施例的某些实施例中，第一侧翼RRS为野生型FRT序列，且第二侧翼RRS为突变型FRT序列。在所有方面和实施例的某些实施例中，第一侧翼RRS为第一野生型FRT序列，且第二侧翼RRS为第二突变型FRT序列。
在所有方面和实施例的某些实施例中，第一侧翼RRS为Bxb1 attP序列，且第二侧翼RRS为Bxb1 attB序列。
在所有方面和实施例的某些实施例中，第一侧翼RRS为
Figure BDA0004171824500000322
attP序列，且第二侧翼RRS为/>
Figure BDA0004171824500000321
attB序列。
在所有方面和实施例的某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含第一选择标记和第二选择标记，其侧翼为两个RRS，其中第一选择标记与第二选择标记不同。在某些实施例中，两个选择标记均相互独立地选自由以下项组成的组：麸酰胺合成酶选择标记、胸苷激酶选择标记、HYG选择标记及嘌呤霉素抗性选择标记。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含胸苷激酶选择标记和HYG选择标记。在某些实施例中，第一选择标记选自由以下项组成的组：氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如，潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、麸酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺酸合成酶、色胺酸合成酶(吲哚)、组胺醇脱氢酶(组胺醇D)以及编码对嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博莱霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin或霉酚酸的抗性的基因，且第二选择标记选自由以下项组成的组：GFP、eGFP、合成GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire荧光蛋白。在某些实施例中，第一选择标记为麸酰胺合成酶选择标记，且第二选择标记为GFP荧光蛋白。在某些实施例中，侧翼为两个选择标记的两个RRS不同。
在某些实施例中，选择标记可操作地连接至启动子序列。在某些实施例中，选择标记可操作地连接至SV40启动子。在某些实施例中，选择标记可操作地连接至人类巨细胞病毒(CMV)启动子。
用于引入供体脱氧核糖核酸的独立方法可基于引入的第二选择标记来选择出成功转染的细胞。
须指出，当根据本发明的DNA元件、DNA分子或VA RNA核酸与重组酶介导的盒交换反应组合使用时，不同的重组酶用于RMCE和RMCI。
例如，Cre/LoxP系统用于重组酶介导的盒交换反应(RMCE)，而Flp/FRT系统用于根据本发明的DNA元件、DNA分子或VA RNA中的重组酶介导的盒反转(RMCI)。同样地，Cre/FRT系统用于重组酶介导的盒交换反应(RMCE)，而Cre/LoxP系统用于根据本发明的DNA元件、DNA分子或VA RNA中的重组酶介导的盒反转(RMCI)。
腺相关病毒载体
对于AAV和腺病毒或疱疹病毒辅助功能的一般回顾，参见Berns and Bohensky,Advances in Virus Research,Academic Press.,32(1987)243-306。AAV的基因体在Srivastava等人，J.Virol.，45(1983)555-564中描述。在US4,797,368中，描述针对构建重组AAV载体的设计考虑(也参见WO 93/24641)。描述AAV载体的其他参考文献为West等人，Virol.160(1987)38-47；Kotin，Hum.Gene Ther.5(1994)793-801；以及Muzyczka，J.Clin.Invest.94(1994)1351。在US 5,173,414；Lebkowski等人，Mol.Cell.Biol.8(1988)3988-3996；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.5(1985)3251-3260；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.,4(1994)2072-2081；Hermonat和Muzyczka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6466-6470；Samulski等人，J.Virol.63(1989)3822-3828中，描述重组AAV载体的构建。
腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷型细小病毒。该病毒只能在细胞中复制，其中某些病毒功能由共同感染的辅助病毒提供，诸如腺病毒、疱疹病毒以及在某些情况下，痘病毒诸如牛痘。尽管如此，只要存在适当的辅助病毒功能，AAV几乎可在任何人类、猿类或啮齿动物来源的细胞株中复制。
如果不存在辅助病毒基因，AAV会在其宿主细胞中建立潜伏期。其基因体整合到19号染色体[(Chr)19(q13.4)]中的特定位点，该位点称为腺相关病毒整合位点1(AAVS1)。对于特定的血清型(诸如AAV-2)，已经发现其他整合位点，诸如，例如，在染色体5[(Chr)5(p13.3)]上，称为AAVS2，并且在染色体3[(Chr)3(p24.3)]上，称为AAVS3。
AAV被归类成不同的血清型。这些已经根据参数进行分配，诸如红血球凝集、致肿瘤性及DNA序列同源性。目前为止，已经鉴别出10多种不同的血清型和一百多种对应于不同AAV演化枝的序列。
衣壳蛋白的类型和对称性决定相应AAV的组织向性。例如，AAV-2、AAV-4及AAV-5对视网膜具特异性，AAV-2、AAV-5、AAV-8、AAV-9和AAVrh-10对脑具特异性，AAV-1、AAV-2、AAV-6、AAV-8和AAV-9对心脏组织具特异性，AAV-1、AAV-2、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9和AAV-10对肝脏具特异性，AAV-1、AAV-2、AAV-5和AAV-9对肺具特异性。
假型分型(Pseudotyping)表示一种包含AAV基因体在各种血清型之间交叉包装的方法，即基因体以不同来源的衣壳蛋白包装。
野生型AAV基因体的大小约为4.7kb。AAV基因体还包含名为rep和cap的两个重迭基因，其包含多个开放阅读框(参见，例如，Srivastava等人，J.Viral.，45(1983)555-564；Hermonat等人，J.Viral.51(1984)329-339；Tratschin等人，J.Virol.,51(1984)611-619)。Rep蛋白编码开放阅读框提供四种不同大小的蛋白，称为Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。这些蛋白涉及AAV的复制、修复及整合。Cap蛋白编码开放阅读框提供四种蛋白质，其为VP1、VP2、VP3和AAP。VP1、VP2和VP3为AAV颗粒的蛋白质衣壳的一部分。组合的rep和cap开放阅读框在其5'和3'末端的侧翼为所谓反向末端重复(ITR)。针对复制，除Rep和Cap蛋白外，AAV也需要基因E1A、E1B、E4orf6、E2A和VA的产物或另一种辅助病毒的对应因子。
例如，在血清型2(AAV-2)的AAV的情况下，每个ITR的长度为145个核苷酸，且侧翼为约4470个核苷酸的编码序列区。ITR的145个核苷酸中，有125个核苷酸具有回文序列且可形成T形发夹结构。该结构在病毒复制过程中具有引子的功能。剩余的20个未配对的核苷酸以D序列表示。
AAV基因体包含三个用于表达rep和cap基因的转录启动子P5、P19和P40(Laughlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)5567-5571)。
ITR序列必须与编码区以顺式存在。ITR提供具功能的复制起点(ori)、整合到靶细胞的基因体所需的信号，以及从宿主细胞染色体或重组质粒的有效切除和修复。ITR还包含类复制起始元件，诸如Rep蛋白结合位点(RBS)和末端解析位点(TRS)。已经发现ITR本身可具有AAV载体中转录启动子的功能(Flotte等人，J.Biol.Chem.268(1993)3781-3790；Flotte等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1993)10163-10167)。
对于复制和衣壳化病毒单股DNA基因体，分别需要rep和cap基因产物的反式结构。
rep基因座包含两个内部启动子，称为P5和P19。其包含四种蛋白质的开放阅读框。启动子P5可操作地连接至提供编码Rep蛋白Rep78(阻滞细胞周期的染色质切口酶)的非经剪接4.2kb mRNA和编码Rep蛋白Rep68(位点特异性核酸内切酶)的经剪接3.9kb mRNA的核酸序列。启动子P19可操作地连接至提供编码Rep蛋白Rep52的非经剪接mRNA和编码Rep蛋白Rep40的经剪接3.3kb mRNA(用于积累和包装的DNA解旋酶)的核酸序列。
两个较大的Rep蛋白Rep78和Rep68对AAV双股DNA复制是必需的，而较小的Rep蛋白Rep52和Rep40似乎对子代、单股DNA积累是必需的(Chejanovsky&Carter,Virology 173(1989)120-128)。
较大的Rep蛋白Rep68和Rep78可特异性地结合至AAV ITR的发夹构型。其表达出确定的酶活性，该酶活性是解决AAV末端复制所需的。表达Rep78或Rep68足以形成感染性颗粒(Holscher,C.等人，J.Virol.68(1994)7169-7177及69(1995)6880-6885)。
认定所有Rep蛋白(主要为Rep78和Rep68)都表达出调节活性，诸如AAV基因的诱导和抑制以及对细胞生长的抑制作用(Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.6(1986)2884-2894；Labow等人，Mol.Cell.Biol.，7(1987)1320-1325；Khleif等人，Virology，181(1991)738-741)。
重组过表达Rep78造成由于诱导DNA损伤具有减少的细胞生长的表型。由此宿主细胞在S期阻滞，从而促进病毒的潜伏感染(Berthet,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)13634-13639)。
Tratschin等人报道，P5启动子受到Rep78或Rep68的负自动调节(Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.6(1986)2884-2894)。由于表达Rep蛋白的毒性作用，在AAV稳定整合之后，已经报道某些细胞仅具有非常低的表达(参见，例如，Mendelson等人，Virol.166(1988)154-165)。
cap基因座包含一个启动子，称为P40。启动子P40可操作地连接至提供2.6kb mRNA的核酸序列，该mRNA通过选择性剪接及使用选择性起始密码子而编码Cap蛋白VP1(87kDa，非经剪接mRNA转录物)、VP2(72kDa，来自经剪接mRNA转录物)和VP3(61kDa，来自替代的起始密码子)。VP1到VP3构成病毒衣壳的构建块。衣壳具有与细胞表面受体结合并允许病毒在细胞内运输的功能。VP3约占病毒颗粒蛋白总量的90％。尽管如此，所有三种蛋白质对于产生有效的衣壳均为必需的。
据报道，将所有三种衣壳蛋白VP1到VP3不活化可防止积累单股子代AAV DNA。VP1氨基末端的突变(“Lip-阴性”或“Inf-阴性”)仍允许将单股DNA组装成病毒颗粒，从而大幅度降低感染效价。
AAP开放阅读框编码组装活化蛋白(AAP)。该组装活化蛋白大小约为22kDa，可将天然VP蛋白运输到核仁区进行衣壳组装。该开放阅读框位于VP3蛋白编码序列的上游。
在单个AAV颗粒中，仅包含一个单股DNA分子。该单股DNA分子可能为“正”股或“负”股。含有DNA分子的AAV病毒颗粒具有感染性。在经感染的细胞内，亲代感染单股被转变为双股，该双股随后被扩增。扩增产生出大量双股DNA分子，其中单股被置换并包装成衣壳。
腺相关病毒(AAV)载体可转导分裂细胞及休眠细胞。可假设使用AAV载体引入靶细胞的转基因将长期表达。使用AAV载体的一个缺点是可引入细胞的转基因大小有限制。
Carter等人已经表明可删除整个rep和cap开放阅读框并以转基因替换(Carter,B.J.，″Handbook of Parvoviruses″，由P.Tijssen，CRC Press,pp.155-168(1990))。此外，据报道，须维持ITR以保留复制、修复、包装以及将转基因整合到靶细胞的基因体中的功能。
当包含相应病毒辅助基因的细胞被AAV载体转导时，或者反之亦然，当包含整合的AAV前病毒的细胞以合适的辅助病毒转导时，AAV前病毒被活化并再次进入裂解感染周期(Clark,K.R.等人，Hum.Gene Ther.6(1995)1329-1341；Samulski,R.J.,Curr.Opin.Genet.Dev.3(1993)74-80)。
E1A为腺病毒DNA进入细胞核之后所表达的第一个病毒辅助基因。E1A基因编码12S和13S蛋白，这些蛋白基于相同的E1A mRNA的选择性剪接。表达12S和13S蛋白导致其他病毒功能E1B、E2、E3和E4的活化。此外，表达12S和13S蛋白迫使细胞进入细胞周期的S期。如果只表达E1A衍生的蛋白质，细胞将会死亡(细胞凋亡)。
E1B为第二个表达的病毒辅助基因。该E1B被E1A衍生的蛋白质12S和13S活化。E1B基因衍生的mRNA可以两种不同的方式剪接，产生第一个55kDa转录物和第二个19kDa转录物。E1B 55kDa蛋白参与调节细胞周期、防止在感染晚期的细胞mRNA的运输以及防止E1A诱导的细胞凋亡。E1B 19kDa蛋白参与防止E1A诱导的细胞凋亡。
E2基因编码不同的蛋白质。E2A转录物编码单股结合蛋白(SSBP)，其对AAV复制是必需的。
E4基因也编码数种蛋白质。E4基因衍生的34kDa蛋白(E4orf6)与E1B55kDa蛋白一起防止细胞mRNA在细胞质中的积累，也促进病毒RNA自细胞核运输到细胞质中。
通常，为产生重组AAV颗粒，将不同的互补质粒共转染到宿主细胞中。质粒中的一种质粒包含夹在两个顺式作用AAV ITR之间的转基因。子代重组基因体的复制和后续包装所需的缺少的AAV元件(即Rep和Cap蛋白的开放阅读框)以反式包含在第二质粒中。过表达Rep蛋白造成抑制细胞生长的作用(Li,J.等人，J.Virol.71(1997)5236-5243)。此外，AAV复制需要包含辅助病毒基因的第三质粒，即来自腺病毒的E1、E4orf6、E2A和VA。
为减少所需质粒的数量，Rep、Cap和腺病毒辅助基因可组合在单个质粒上。
另选地，宿主细胞可能已经稳定表达E1基因产物。此类细胞为HEK293细胞。标示为293的人类胚胎肾殖株是在1977年通过将腺病毒DNA整合到人类胚胎肾细胞(HEK细胞)中来产生的(Graham,F.L.等人，J.Gen.Virol.36(1977)59-74)。HEK293细胞株包含腺病毒血清型5基因体的碱基对1至4344。这涵盖E1A和E1B基因以及腺病毒包装信号(Louis,N.等人，Virology233(1997)423-429)。
当使用HEK293细胞时，缺少的E2A、E4orf6和VA基因可通过与腺病毒共感染或通过与E2A、E4orf6和VA表达质粒共转染来引入(参见，例如，Samulski,R.J.等人，J.Virol.63(1989)3822-3828；Allen,J.M.等人，J.Virol.71(1997)6816-6822；Tamayose,K.等人，Hum.Gene Ther.7(1996)507-513；Flotte,T.R.等人，Gene Ther.2(1995)29-37；Conway,J.E.等人，J.Virol.71(1997)8780-8789；Chiorini,J.A.等人，Hum.Gene Ther.6(1995)1531-1541；Ferrari,F.K.等人，J.Virol.70(1996)3227-3234；Salvetti,A.等人，Hum.GeneTher.9(1998)695-706；Xiao,X.等人，J.Virol.72(1998)2224-2232；Grimm,D.等人，Hum.Gene Ther.9(1998)2745-2760；Zhang,X.等人，Hum.Gene Ther.10(1999)2527-2537)。另选地，可使用腺病毒/AAV或单纯疱疹病毒/AAV杂合载体(参见，例如，Conway,J.E.等人，J.Virol.71(1997)8780-8789；Johnston,K.M.等人，Hum.Gene Ther.8(1997)359-370：Thrasher,A.J.等人，Gene Ther.2(1995)481-485；Fisher,J.K.等人，Hum.Gene Ther.7(1996)2079-2087；Johnston,K.M.等人，Hum.Gene Ther.8(1997)359-370)。
因此，其中rep基因被整合并表达的细胞株倾向缓慢生长或以非常低的量表达Rep蛋白。
一个重大安全议题为复制感受态腺病毒(RCA)对rAAV颗粒制剂的污染。当整合到宿主细胞中的载体基因体和腺病毒DNA在病毒复制期间通过同源重组进行重组时，产生RCA(Lochmueller,H.等人，Hum.Gene Ther.5(1994)1485-1491；Hehir K.M.等人，J.Virol.70(1996)8459-8467)。因此，HEK 293细胞不适用于产生用于药物应用的腺病毒载体。
为限制转基因对特定组织的活性(即限制整合位点)，可将转基因可操作地连接至可诱导或组织特异性启动子(参见，例如，Yang，Y.等人，Hum.Gene.6(1995)1203-1213)。
直至现在，在rAAV颗粒产生中的主要困难在于rAAV载体的低效包装，导致效价低。包装一直很困难的数个原因包括
-如果存在野生型AAV基因体，进行优选的衣壳化；
-由于与rep基因产物相关的抑制作用，难以产生足够的补充功能，诸如由野生型rep和cap基因所提供的功能；
-质粒构建体的共转染效率有限。
所有这些问题都是基于Rep蛋白的生物学特性。尤其是Rep蛋白的抑制(细胞抑制及细胞毒性)特性以及逆转培养细胞永生化表型的能力是问题所在。此外，当使用广泛使用的AAV P5启动子时，Rep蛋白会下调其自身的表达(参见，例如，Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.6(1986)2884-2894)。
根据本发明的示例性化合物和组合物
本文报道新型核酸及其使用方法。根据本发明的新型核酸可用于产生重组腺相关病毒颗粒。
因此，本发明的一个方面是新型腺病毒VA RNA核酸。在根据本发明的VA RNA核酸中，VA RNA编码序列在其5'-端包含(或在其5'-端连接至)变体2型聚合酶III启动子，或3型聚合酶III启动子，或变体3型聚合酶III启动子，诸如在一个优选的实施例中，为U6-snRNA启动子，或聚合酶II启动子。在某些实施例中，VA RNA核酸还包含位于启动子的3'和VA RNA编码序列的5'的精确转录起始位点。在某些实施例中，VA RNA核酸在其3'-端还包含聚合酶III终止子。在某些实施例中，精确转录起始位点在5'-至3'-的方向上包含：包含转录起始位点(TSS)的腺病毒VA RNAI基因的至少六个5'-端核苷酸(以防止绕过随后的聚合酶III(pol III)终止子)，以及功能性聚合酶III终止子(以防止从组成型活性上游启动子转录)。在所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的腺病毒VA RNA核酸中/的所有元件以可操作连接的形式排列。
为了进一步增加根据本发明的腺病毒VA RNA核酸的有利效果，采用的启动子也可以选择为可活化的，尤其是在聚合酶II启动子的情况下。因此，只有通过进一步的特异性启动子活化才能开启VA RNA编码序列的转录。此一方面改进控制对VA RNA编码序列的转录，另一方面改进控制再次关闭转录的可能性。通过根据本发明的腺病毒VA RNA核酸与可诱导启动子的组合，可进一步强化单独使用时可诱导启动子的潜在泄漏。可诱导系统在本领域是已知的，诸如Tet-on/off系统。
本文所公开的主题不仅提供适用于产生重组哺乳动物rAAV包装或产生细胞株的核酸的方法，任选地具有VA RNA的诱导性转录，并且也提供稳定大规模产生rAAV颗粒的方法。同样地，可获得具有高产率rAAV颗粒的重组稳定哺乳动物rAAV产生细胞。
因此，在所有方面和实施例的某些实施例中，启动子为可诱导启动子。在某些实施例中，可诱导启动子选自由以下组成的组的可诱导启动子：四环素控制的启动子、cumate控制的启动子、FKBP12-mTOR控制的启动子、雷帕霉素控制的启动子、FKCsA控制的启动子、脱落酸控制的启动子、他莫昔芬控制的启动子和核糖开关控制的启动子(FKCsA＝FK506及环孢菌素A的异源二聚体)。
关于可诱导启动子的回顾，参见，例如，Kallunki,T.等人，Cells 8(2019)796。
在所有方面和实施例的某些实施例中，启动子为抑制性启动子。在某些实施例中，抑制性启动子选自包含以下的组的抑制性启动子：四环素控制的启动子、GAL4/UAS控制的启动子和LexA/lexAop控制的启动子。
重组AAV颗粒
为产生重组AAV颗粒，需要在单个哺乳动物细胞中表达Rep和Cap蛋白、辅助蛋白E1A、E1B、E2A和E4orf6，以及腺病毒VA RNA。可使用任何启动子(尤其是CMV IE启动子)表达辅助蛋白E1A、E1B、E2A和E4orf6，如Matsushita等人(Gene Ther.5(1998)938-945)所示。因此，在下文中可使用任何启动子。
根据本发明的包含E1A、E1B、E2A、E4orf6开放阅读框的DNA
本发明的一个独立方面是一种DNA(分子)，该DNA包含
-根据本发明的腺病毒VA RNA核酸，
-第一DNA元件，
并且
-任选地，rep或/和cap开放阅读框。
在一个从属实施例中
-第一DNA元件包含E1A开放阅读框和E1B开放阅读框；或
-第一DNA元件包含E2A开放阅读框和E4或E4orf6开放阅读框；或
-第一DNA元件包含Rep蛋白开放阅读框和Cap蛋白开放阅读框。
本发明的一个独立方面是一种包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)的哺乳动物细胞或昆虫细胞。
本发明的一个独立方面是一种产生重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，该方法包括以下步骤：
-培养/繁殖根据本发明的细胞(在适合细胞分裂的条件下)，以及
-从细胞或培养基中回收rAAV颗粒。
因此，本发明的一个独立方面是用于产生重组腺相关病毒颗粒的本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(分子)。
本发明的一个独立方面是一种生成/用于产生重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，该方法包括：
-提供哺乳动物悬浮生长细胞，该哺乳动物悬浮生长细胞包含稳定整合的或瞬时存在的-居于两个AAV ITR之间的转基因表达盒；
-编码腺病毒E1A、E1B、E2A、E4或E4orf6蛋白和根据本发明的腺病毒VA RNA核酸的开放阅读框；
-编码腺相关Rep和Cap蛋白的开放阅读框；
-繁殖/培养哺乳动物细胞(在适合细胞分裂的条件下)；以及
-从细胞或培养基中分离rAAV颗粒，从而产生该rAAV颗粒。
在所有方面和实施例的某些实施例中，每个开放阅读框位于表达盒内，即，可操作地连接至启动子及多腺苷酸化信号序列和/或转录终止元件。
在所有方面和实施例的某些实施例中，E1A和E1B(开放阅读框)的编码序列源自人类腺病毒，诸如，例如，特别是人类腺病毒血清型2或5。人类Ad5(腺病毒血清型5)的示例性序列可在GenBank条目X02996中找到，而人类Ad2的示例性序列可在GenBank条目AC_000007中找到。在所有方面和实施例的某些实施例中，核苷酸505至3522包含编码人类腺病毒血清型5的E1A和E1B的核酸序列。EP 1 230 354 B1中所报道的质粒pSTK146以及WO 2007/056994中所报道的质粒pGS119和pGS122也可作为E1A和E1B开放阅读框的来源。
根据本发明的包含Rep和Cap开放阅读框的DNA
除了P5启动子之外，驱动rep和cap开放阅读框表达的启动子位于Rep多肽编码序列内。
本发明的一个独立方面是一种DNA(分子)，该DNA包含
-根据本发明的腺病毒VA RNA核酸，
-第一DNA元件，
并且
-任选地，E1A、E1B、E2、E4和E4orf6开放阅读框中的一个或多个开放阅读框或全部开放阅读框。
在所有方面和实施例的某些实施例中，第一DNA元件包含rep开放阅读框或/和cap开放阅读框。
在所有方面和实施例的某些实施例中，第一DNA元件包含一个、两个、三个或四个不同的Rep蛋白编码开放阅读框。
在所有方面和实施例的某些实施例中，第一DNA元件包含：包含编码序列的一个rep开放阅读框，该编码序列仅编码Rep78蛋白或仅编码Rep68蛋白，但不能同时编码两者，其中内部P40启动子已经去活化且剪接供体以及受体位点已经被移除。
在所有方面和实施例的某些实施例中，rep开放阅读框在其5'-端可操作地连接至腺相关病毒启动子P5或其功能片段或其变异体。
在所有方面和实施例的某些实施例中，第一DNA元件包含两个rep开放阅读框，其中第一rep开放阅读框包含编码序列，该编码序列仅编码Rep78蛋白或仅编码Rep68蛋白，但不能同时编码两者，其中内部P40启动子已经被去活化，且剪接供体以及受体位点已经被移除，且第二rep开放阅读框包含编码Rep52/Rep40蛋白的编码序列。
在所有方面和实施例的某些实施例中，第一DNA元件包含两个rep开放阅读框，其中第一rep开放阅读框包含编码序列，该编码序列仅编码Rep78蛋白或仅编码Rep68蛋白，但不能同时编码两者，其中内部P40启动子已经被去活化，且剪接供体以及受体位点已经被移除，第二rep开放阅读框包含编码Rep52蛋白的编码序列。
在所有方面和实施例的某些实施例中，第一DNA元件包含两个rep开放阅读框，其中第一rep开放阅读框包含编码序列，该编码序列仅编码Rep78蛋白或仅编码Rep68蛋白，但不能同时编码两者，其中内部P40启动子已经被去活化，且剪接供体以及受体位点已经被移除，第二rep开放阅读框包含编码Rep52/Rep40蛋白和Cap蛋白的编码序列，包括常见的多腺苷酸化信号。
在所有方面和实施例的某些实施例中，第一rep开放阅读框在其5'-端可操作地连接至腺相关病毒启动子P5或其功能片段或其变异体。
在所有方面和实施例的某些实施例中，第二rep开放阅读框在其5'-端可操作地连接至腺相关病毒启动子P19或其功能片段或其变异体。
本发明的一个独立方面是一种包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)的哺乳动物细胞或昆虫细胞。
本发明的一个独立方面是一种产生重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，该方法包括以下步骤：
-培养/繁殖根据本发明的细胞(在适合细胞分裂的条件下)，以及
-从细胞或培养基中回收rAAV颗粒。
因此，本发明的一个独立方面是用于产生重组腺相关病毒颗粒的本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(分子)。
本发明的一个方面是一种生成/用于产生重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，该方法包括：
-提供哺乳动物悬浮生长细胞，该哺乳动物悬浮生长细胞包含稳定整合的或瞬时存在的-居于两个AAV ITR之间的转基因表达盒；
-编码腺病毒E1A、E1B、E2A、E4或E4orf6蛋白和根据本发明的腺病毒VA RNA核酸的开放阅读框；
-编码腺相关Rep/Cap蛋白的开放阅读框；
-繁殖/培养哺乳动物细胞(在适合细胞分裂的条件下)；以及
-从细胞或培养基中分离rAAV颗粒，从而产生该rAAV颗粒。
在所有方面和实施例的某些实施例中，每个开放阅读框位于表达盒内，即，可操作地连接至启动子及多腺苷酸化信号序列和/或转录终止元件。
根据本发明的腺病毒VA RNA核酸
VA RNA基因由2型聚合酶III启动子驱动，该启动子包含两个基因内元件A盒和B盒。Snouwaert等人(Nucl.Acids Res.15(1987)8293-8303)鉴定完全地消除启动子活性的VA RNAI B盒的突变体。这些突变不太可能影响VA RNAI与PKR的结合和相关功能(Clark,K.R.等人，Hum.Gene Ther.6(1995)1329-1341)。
本发明人已经发现，为了能够严格控制VA RNA转录，使VA RNA基因的野生型2型聚合酶III启动子去活化并将其替换为不同的启动子(诸如，例如，3型聚合酶III启动子，诸如在一个优选的实施例中，为U6-snRNA启动子，或聚合酶II启动子或可诱导启动子)是有利的。
因此，根据本发明的一个方面是在3型聚合酶III启动子控制下的AAV腺病毒VARNA编码序列。在一个优选的实施例中，3型聚合酶III启动子为人类U6-snRNA启动子。
因此，根据本发明的一个方面是在聚合酶II启动子控制下的AAV腺病毒VA RNA编码序列。
3型聚合酶III启动子包含两个称为近端序列元件(PSE)及TATA盒的基因外元件。关于该方面，3型聚合酶III启动子类似于驱动蛋白基因表达的聚合酶II启动子。两个元件之间以及元件与转录起始位点(TSS)之间的间距要求非常严格并且且距离相当短。人类U6启动子的PSE从位置-66到-47并且TATA盒从-29到-23。通常，转录从G开始，或者次优选地从位于这些距离的+3与-3窗口内的A核苷酸开始(Goomer和Kunkel，1992)。
根据本发明的腺病毒VA RNA核酸尤其能够实现严格的转录控制。在某些实施例中，VA RNA核酸转录由3型聚合酶III启动子(例如，人类U6-snRNA启动子或聚合酶II启动子或可诱导启动子)驱动。
本发明的具体方面如图2所示。
在所有方面和实施例的某些实施例中，驱动根据本发明的腺病毒VA RNA的转录的启动子为人类U6启动子。在一些实施例中，启动子具有SEQ ID NO:42的序列。
在所有方面和实施例的某些实施例中，驱动根据本发明的转录性腺病毒VA RNA的启动子为鼠U6启动子。在一些实施例中，启动子具有SEQ ID NO:43的序列。
在所有方面和实施例的某些实施例中，驱动根据本发明的腺病毒VA RNA的转录的启动子为人类H1 pRNA启动子。在一些实施例中，启动子具有SEQ ID NO:44的序列。
在所有方面和实施例的某些实施例中，驱动根据本发明的腺病毒VA RNA的转录的启动子为人类tRNA val启动子。在一些实施例中，启动子具有SEQ ID NO:44的序列。
在所有方面和实施例的某些实施例中，精确转录起始位点被引入至根据本发明的腺病毒VA RNA的非编码(即调节)元件中。
病毒相关RNA(VA RNA)为调节转译的腺病毒(Ad)的非编码RNA。腺病毒基因体包含两个独立的拷贝：VAI(VA RNAI)和VAII(VA RNAII)。两者均由RNA聚合酶III转录(参见，例如，Machitani,M.等人，J.Contr.Rel.154(2011)285-289)。
Ma,Y.和Mathews,M.B.使用系统发育方法研究腺病毒相关RNA的结构、功能和进化(J.Virol.70(1996)5083-5099)。他们基于47种已知人类腺病毒血清型，提供其比对以及共有VA RNA序列。所述公开全部内容在此以引用的方式并入本申请。
VA RNA、VAI和VAII由157-160个核苷酸(nt)组成。
根据血清型，腺病毒含有一个或两个VA RNA基因。认为VA RNAI是主要的前病毒，而VA RNAII可部分地弥补VA RNAI的缺失(Vachon,V.K.和Conn,G.L.，Virus Res.212(2016)39-52)。
虽然VA RNA不是必需的，但其通过克服细胞抗病毒机制在有效的病毒生长中仍扮演重要角色。也即，虽然VA RNA对于病毒生长不是必需的，但在载体生成的起始步骤中，VARNA缺失的腺病毒无法生长，其中每个细胞仅存在数个病毒基因体拷贝，可能是因为未充分地表达阻断细胞抗病毒机制的VA RNA之外的病毒基因(参见Maekawa,A.等人，NatureSci.Rep.3(2013)1136)。
已经由在实验上定义组成RNA聚合酶III的内部控制区(或启动子)的A盒和B盒以用于腺病毒血清型2(Ad 2)VA RNAI。这些盒是非常保守的。所有VA RNA在相似位置均具有该等两个盒。B盒同源性非常高。位于B盒上游34到40nt的A盒在一些VA RNA中的同源性稍低。相互互补的四核苷酸CCGG(SEQ ID NO:29)与(U/C)CCGG(SEQ ID NO:30)的对形成VARNA的顶茎的一部分，在VA RNA序列中是非常保守的。第一CCGG是固定的，该第一CCGG包含B盒的前两个碱基。除了一个VA RNA基因，所有VA RNA基因具有在5'半部分与tRNA转录起始元件(分别为RRYNNARYGG(SEQ ID NO:31)和GWTCRANNC(SEQ ID NO:32)的A盒和B盒共通序列)同源的序列。VA RNAII基因中的A盒同源性通常比VA RNAI基因中的A盒同源性弱，此与A盒对VA RNA转录的重要性不如B盒的发现一致。VA RNA编码序列的末端是T残基串，侧翼为核苷酸C和G，T残基串为典型的聚合酶III终止位点。胸苷的数量从最少4个到多于10个不等，且在T富集串的两侧至少缺乏3个A残基的核苷酸(Ad 12和Ad18除外，其在非常长的T串的中间具有A残基)(Ma,Y.和Mathews,M.B.,J.Virol.70(1996)5083-5099)。
已经发现VA RNAI和VA RNAII的B盒序列对于内部聚合酶III启动子的活性是必需的。
Maekawa,A.等人(Nature Sci.Rep.3(2013)1136)报道缺乏病毒相关RNA基因的腺病毒载体的高效产生，该腺病毒载体干扰细胞RNAi机制，其中组成型地表达和高度表达翻转酶重组酶的经感染HEK293细胞通过FLP重组酶介导切除VA RNA基因座，以获得VA RNA缺失的腺病毒。
SEQ ID NO:33示出人类腺病毒2VA RNAI(GenBank条目AC_000007的核苷酸10586-10810)序列；SEQ ID NO:34示出G58T/G59T/C68A(连续残基编号)序列。SEQ ID NO:34也为本发明的方面。人类腺病毒5VA RNAI(GenBank条目AC_000008的核苷酸10579-10820)序列在SEQ ID NO:35中示出；其组合的人类腺病毒5VA RNAI和VA RNAII在SEQ ID NO:36中示出。
Hahn,S.(Nat.Struct.Mol.Biol.11(2004)394-403)和Revyakin,A.等人(Gen.Devel.26(2012)1691-1702)报道RNA聚合酶II转录机制的结构和机制，而Nikitina,T.V.和Tishchenko,L.I.(Mol.Biol.39(2005)161-172)回顾RNA聚合酶III转录机制。这些摘述如下。
转录，即DNA模板上的RNA合成，由DNA依赖性RNA聚合酶执行(Pols，[EC2.7.7.6])。除了RNA聚合酶之外，也涉及称为通用转录因子(GTF)的其他因子。这些一般转录因子对识别启动子序列、对调节因子的反应以及转录过程中聚合酶活性所需的构象变化是必需的。
核心启动子(指定非调节或基础转录所需的最小DNA序列)用于将Pol定位在称为预启动复合体(PIC)的状态中。在该状态下，Pol和GTF都与启动子结合，但未处于开始转录的活性构象。
真核细胞包含三个Pol，分别表示为I、II和III，其具不同的次单元组合物。
由特定的Pol所转录的基因被相应地分配到I、II或III类。
Pol I转录前rRNA的基因。除了U6 snRNA之外，Pol II转录所有蛋白编码基因和snRNA基因。Pol III转录5S rRNA、tRNA、U6 snRNA、7SK RNA、7SL RNA的基因；Alu重复；某些病毒基因；以及小稳定非转译RNA的基因。
不同类的基因具不同结构的启动子，启动子决定参与形成PIC的基本(一般)转录因子及Pol。
RNA聚合酶II(Pol II)负责使基因信息从DNA流向真核细胞中的信息使RNA(mRNA)。研究已经鉴别出GTF：TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH，GTF与Pol II在启动子位点一起组装到PIC中，并以基础活性量直接转录起始。进一步调节转录活性取决于DNA模板中的顺式控制元件，这些顺式控制元件被共活化子所辅助的序列特异性活化子/抑制子所识别。
在Pol II核心启动子中所发现的序列元件包括TATA元件(TATA结合蛋白(TBP)结合位点)、BRE(TFIIB识别元件)、Inr(启动子元件)和DPE(下游启动子元件)。大多数启动子包含一个或多个这些元件，但没有一个元件对启动子功能是绝对必需的。启动子元件为转录机制次单元的结合位点，且用于将转录机制不对称地定位在启动子上以引导单方向转录。
TBP的核心结构域由两个不完美的重复组成以形成分子，该分子与8bp TATA元件上的DNA结合。在含有TATA的启动子上，形成该蛋白质-DNA复合体是组装转录机制的第一步。类TATA序列位于转录起始位点上游约30bp处。
RNA聚合酶III(Pol III)在所有真核Pol中具有最复杂的结构：该酶由17个次单元所组成，次单位范围从～10kDa至～160kDa，且总分子量为600-680kDa。
由Pol III所转录的III类基因包含三个结构不同的启动子，其大多具有基因内位置。Pol III转录机制的一般转录因子为TFIIIA、TFIIIB、TFIIIC和小核RNA活化蛋白复合物(SNAPc)。
在III类基因(1型、2型、3型)的不同启动子上组装PIC需要一个或多个A盒、B盒和C盒；内部控制区(ICR)；TATA盒；远程(DSE)和近端(PSE)序列元件。1型基因在位置+57处包含A盒并且在位置+90处包含C盒，该等位置相对于+1处的转录起始点。2型基因包含A盒和B盒。3型基因在位置-250处包含DSE、在位置-60处包含PSE以及在位置-27处包含TATA框，该等位置相对于+1处的转录起始点。可存在A盒，但并不是必需的。
Pol III在所有三种类型的启动子上的募集及转录起始都需要转录因子IIIB(TFIIIB)的作用，且募集和转录起始受到高度调控。TFIIIB结合位点为TATA盒周围+/-8nt。此外，所有三种聚合酶需要TBP(Han,Y.等人，Cell.Discover.4(2018)40)。
关于三种类型的Pol III基因，Oler,A.J.等人(Nat.Struct.Mol.Biol.17(2010)620-628)基于1)顺式调控元件的存在和位置，以及2)对特定基本或辅助转录因子的要求，概述将Pol III引导至靶基因所需的因子以及人类中的Pol III基因的三种“类型”。简而言之，5S rRNA为唯一需要TFIIIA的1型基因。1型和2型基因都需要TFIIIC，TFIIIC为一种基本因子和靶向复合体，其识别2型基因内A盒和B盒元件，但不识别1型基因。TFIIIB复合体包含识别TATA/启动子和启动Pol III所需的TBP。2型和3型基因利用TFIIIB的选择性组装：BRF1(TFIIIB相关因子1)用于2型基因，并且BRF2(TFIIIB相关因子2)用于3型基因。3型基因缺乏内A盒或内B盒，且不依赖于TFIIIC，而是依赖上游PSE和DSE以及特定因子(OCT1、SNAPc等)进行靶向。尤其，3型Pol III启动子的结构类似于Pol II基因，其利用上游调控元件而非基因内元件。
在某些实施例中，根据本发明的腺病毒VA RNA核酸在其5'-端(在启动子不存在下)从5'-至3'-的方向上或在启动子与VA RNA编码序列之间(在启动子存在下)包含
-腺病毒VA RNAI基因的至少六个5'-端核苷酸，其包含转录起始位点(TSS)(以防止绕过随后的聚合酶III(poly III)终止子)；
-功能性聚合酶III终止子(以防止VA RNA从组成型活性上游启动子转录)，以及
-腺病毒VA RNAI序列。
在所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的腺病毒VA RNA核酸还包含可操作地连接至其5'-端的聚合酶启动子。在某些实施例中，启动子是2型聚合酶III启动子或其变异体，或3型聚合酶III启动子或其变异体，或聚合酶II启动子或其变异体或可诱导启动子。在所有方面和实施例的一个优选的实施例中，启动子为人类U6-snRNA启动子。
在本发明的所有方面及实施例中，所述元件可操作地彼此连接。
在所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的腺病毒VA RNA核酸包含SEQID NO:37的全部或部分野生型腺病毒VA RNAI序列：
Figure BDA0004171824500000501
在所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的腺病毒VA RNA核酸包含具有SEQ ID NO:38的突变G58T、G59T和C68A(序列编号)的全部或部分野生型腺病毒VA RNAI序列：
Figure BDA0004171824500000502
图1示出包含上述序列的比对。
在某些实施例中，根据本发明的腺病毒VA RNA核酸在5'-至3'-的方向上包含以下序列：
(1)2型聚合酶III启动子或其变异体，或3型聚合酶III启动子或其变异体，在一个优选的实施例中，为人类U6-snRNA启动子，或聚合酶II启动子，或可诱导启动子；以及
(2)gggcactctt ccgtggtctg gtggataaat tcgcaagggt atcatggcggacgaccggggttcgaacccc ggatccggcc gtccgccgtg atccatgcgg ttaccgcccgcgtgtcgaacccaggtgtgc gacgtcagac aacgggggag cgctcctttt ggcttccttccaggcgcggcggctgctgcg ctagcttttt t(SEQ ID NO:37)。
在一个优选的实施例中，根据本发明的腺病毒VA RNA核酸包含aaggtcgggcaggaagaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac aaggctgttagagagataattagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagtaataatttcttgggtagtttg cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct taccgtaacttgaaagtatt tcgatttcttggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa caccgggcac tcttccgtggtctggtggat aaattcgcaagggtatcatg gcggacgacc ggggttcgaa ccccggatcc ggccgtccgccgtgatccat gcggttaccgcccgcgtgtc gaacccaggt gtgcgacgtc agacaacggg ggagcgctccttttggcttc cttccaggcgcggcggctgc tgcgctagct ttttt(SEQ ID NO:39；图2)的序列。
包含根据本发明的核酸和DNA的示例性用途及方法
根据本发明的腺病毒VA RNA核酸和DNA(元件)可用于产生重组AAV载体及包含其的重组AAV颗粒。
本领域已知用于产生rAAV颗粒的不同方法。例如，使用AAV载体和AAV辅助序列转染与一种AAV辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)进行共感染，或用重组AAV质粒、AAV辅助质粒和辅助功能质粒进行转染。产生rAAV颗粒的非限制性方法描述于例如US 6,001,650、US 6,004,797、WO 2017/096039和WO 2018/226887。在产生重组rAAV颗粒(即在细胞培养系统中产生颗粒)之后，可从宿主细胞和细胞培养上清液中获得rAAV颗粒并进行纯化。
本发明的方面为使用根据本发明的分子诸如核酸(例如，质粒)转导细胞并产生相应基因产物的方法。此外，当用序列(诸如编码病毒包装蛋白和/或辅助蛋白的质粒)转导此类细胞时，可产生重组病毒颗粒，该颗粒包含编码感兴趣的蛋白质的核酸或包含被转录成感兴趣的转录物的序列，其中至少一者包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)，其进而以高产率产生重组病毒颗粒。
本发明提供病毒(例如，AAV)颗粒产生平台，该平台包括通过使用根据本发明的核酸或DNA(元件)的特征，该特征与目前“工业标准”的病毒(例如，AAV)颗粒产生过程不同。
在讨论核酸(质粒)时，可根据提供在5'至3'的方向上的序列的习惯，描述本文中的特定多核苷酸的序列或结构。
更一般地，用根据本发明的VA RNA核酸或DNA(元件)转染或转导的此类细胞可称为“重组细胞”。此类细胞例如可为酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，其已经被作为编码包装蛋白(例如AAV包装蛋白)的核酸(质粒)、编码辅助蛋白的核酸(质粒)、编码蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸(质粒)(即置于两个AAV ITR之间的转基因，或其他转移核酸(质粒))的受体，其中至少一者包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)。该术语包括已经转导或转染的原始细胞的子代。应当理解，由于自然、偶然或特意的突变，单个亲代细胞的子代在形态学或基因体或总核酸互补方面不一定与原始亲代完全相同。
许多适用于维持细胞存活率或提供细胞生长和/或增殖的细胞生长培养基为可商购获得或可轻易地产生。此类培养基的实例包括无血清真核生长培养基，诸如用于维持存活率或提供哺乳动物(例如人类)细胞生长的培养基。非限制性实例包括Ham's F12或F12K培养基(Sigma-Aldrich)、FreeStyle(FS)F17培养基(Thermo-Fisher Scientific)、MEM、DMEM、RPMI-1640(Thermo-Fisher Scientific)以及它们的混合物。此类培养基可加入维生素和/或微量矿物质和/或盐和/或氨基酸，诸如哺乳动物(例如人类)细胞的必需氨基酸。
提供辅助蛋白可以质粒、噬菌体、转座子或黏接质粒的形式。具体地，已经证明辅助功能不需完全互补腺病毒基因。例如，已经证明无法进行DNA复制和合成晚期基因的腺病毒突变体允许AAV复制。Ito等人，J.Gen.Virol.9(1970)243；Ishibashi等人，Virology 45(1971)317。
已经示出E2B和E3区域内的突变体支持AAV复制，代表E2B和E3区域可能未涉及提供辅助功能。Carter等人，Virology 126(1983)505。然而，在E1区是有缺陷的或具有缺失的E4区的腺病毒则无法支持AAV复制。因此，对于腺病毒辅助蛋白，AAV复制可能直接地或间接地需要E1A和E4区域(参见，例如，Laughlin等人，J.Virol.41(1982)868；Janik等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981)1925；Carter等人，Virology 126(1983)505)。其他经表征的腺病毒突变体包括：E1B(Laughlin等人，(1982)，同上；Janik等人(1981)，同上；Ostrove等人，Virology 104(1980)502)；E2A(Handa等人，J.Gen.Virol.29(1975)239；Strauss等人，J.Virol.17(1976)140；Myers等人，J.Virol.35(1980)665；Jay等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981)2927；Myers等人，J.Biol.Chem.256(1981)567)；E2B(Carter,Adeno-Associated Virus Helper Functions,in I CRC Handbook ofParvoviruses(P.Tijssen ed.,1990))；E3(Carter等人，(1983)，同上)；以及E4(Carter等人，(1983)，同上；Carter(1995))。
在E1B中具有突变的腺病毒所提供的辅助蛋白的研究报告称，E1B 55kDa蛋白是AAV颗粒产生所必需的，而E1B 19kDa蛋白则不是必需的。此外，WO 97/17458和Matshushita等人(Gene Therapy 5(1998)938-945)描述编码各种腺病毒基因的辅助功能质粒。辅助质粒的实例包含腺病毒VA RNA编码区、腺病毒E4 ORF6编码区、腺病毒E2A 72kDa编码区、腺病毒E1A编码区和缺乏完整E1B 55kDa编码区的腺病毒E1B区(参见，例如，WO 01/83797)。
因此，本文提供一种使用根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)产生重组AAV载体或包含所述重组AAV载体的AAV颗粒的方法，该AAV载体包含编码蛋白质的核酸或被转录成感兴趣的转录物的核酸。
本发明的一个方面为一种产生重组AAV载体或包含所述重组AAV载体的AAV颗粒的方法，该AAV载体包含编码蛋白质的核酸或被转录成感兴趣的转录物的核酸，该方法包括以下步骤：
(i)提供一个或多个包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的质粒，其中至少一者包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)；
(ii)提供包含核酸的质粒，该核酸编码感兴趣的蛋白质或被转录成感兴趣的转录物；
(iii)将一个或多个哺乳动物细胞与所提供的质粒接触；
(iv)进一步加入转染试剂，并任选地培育质粒/转染试剂/细胞混合物；或提供物理方式(诸如电流)将核酸引入至细胞；
(v)培养转染细胞并在培养过程中的某个时间点/培养时间诱导RMCI；
(vi)从培养细胞中收获培养细胞和/或培养基，以产生细胞和/或培养基收获物；以及
(vii)从细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体或AAV颗粒，从而产生包含编码感兴趣的蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体或AAV颗粒。
本发明的一个方面为一种产生重组AAV载体或包含所述重组AAV载体的AAV颗粒的方法，该AAV载体包含编码蛋白质的核酸或被转录成感兴趣的转录物的核酸，该方法包括以下步骤：
(i)提供一个或多个包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的质粒，其中至少一者包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)；
(ii)提供包含核酸的质粒，该核酸编码感兴趣的蛋白质或被转录成感兴趣的转录物；
(iii)将一个或多个哺乳动物细胞与(i)的所提供质粒接触；
(iv)进一步加入转染试剂，并任选地培育质粒/转染试剂/细胞混合物；或提供物理方式(诸如电流)将核酸引入至细胞；
(v)选择稳定转染的细胞；
(vi)将(v)中选择的细胞与(ii)的所提供质粒接触；
(vii)进一步加入转染试剂，并任选地培育质粒/转染试剂/细胞混合物；或提供物理方式(诸如电流)将核酸引入至细胞；
(viii)培养(viii)的转染细胞并在培养过程中的某个时间点/培养时间诱导RMCI；
(ix)从培养细胞中收获培养细胞和/或培养基，以产生细胞和/或培养基收获物；以及
(x)从细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体或AAV颗粒，从而产生包含编码感兴趣的蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体或AAV颗粒。
本发明的一个方面为一种产生重组AAV载体或包含所述重组AAV载体的AAV颗粒的方法，该AAV载体包含编码蛋白质的核酸或被转录成感兴趣的转录物的核酸，该方法包括以下步骤：
(i)提供包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的哺乳动物细胞，其中至少一者包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)；
(ii)提供包含核酸的质粒，该核酸编码感兴趣的蛋白质或被转录成感兴趣的转录物；
(iii)将(i)的细胞与(ii)的所提供质粒接触；
(iv)进一步加入转染试剂，并任选地培育质粒/转染试剂/细胞混合物；或提供物理方式(诸如电流)将核酸引入至细胞；
(v)选择稳定转染的细胞；
(vi)培养(v)的稳定转染细胞并在培养过程中的某个时间点/培养时间诱导RMCI；
(vii)从培养细胞中收获培养细胞和/或培养基，以产生细胞和/或培养基收获物；以及
(viii)从细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体或AAV颗粒，从而产生包含编码感兴趣的蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体或AAV颗粒。
可以多种方式将包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)的核酸引入至细胞中。
本领域已经报道将DNA转移到哺乳动物细胞中的多种方法。这些方法在根据本发明的方法中都是有用的。在所有方面和实施例的某些实施例中，使用电穿孔、核转染或显微注射进行核酸转移/转染。在所有方面和实施例的某些实施例中，使用无机物质(诸如，例如，磷酸钙/DNA共沉淀)、阳离子聚合物(诸如，例如，聚乙烯亚胺、DEAE-葡聚醣)或阳离子脂质(脂质粒)进行核酸转移/转染。磷酸钙及聚乙烯亚胺为用于大规模核酸转移的最常用转染试剂(参见，例如，Baldi等人，Biotechnol.Lett.29(2007)677-684)，其中聚乙烯亚胺为优选的。
在所有方面和实施例的某些实施例中，包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)的核酸以与聚乙烯亚胺(PEI)的组合的组合物形式提供，任选地与细胞组合。在某些实施例中，组合物包括质粒/PEI混合物，其具有多个组分：(a)一个或多个包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的质粒，其中至少一者包含本发明的腺病毒VARNA核酸或DNA(元件)；(b)包含编码蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；以及(c)聚乙烯亚胺(PEI)溶液。在某些实施例中，质粒的摩尔比范围为约1:0.01至约1:100，或摩尔比范围为约100:1至约1:0.01，且组分(a)、(b)和(c)任选地培育质粒约10秒至约4小时的时间。
在所有方面和实施例的某些实施例中，组合物还包含细胞。在某些实施例中，细胞与组分(a)、(b)和/或(c)的质粒/PEI混合物接触。
在所有方面和实施例的某些实施例中，组合物任选地与细胞组合，该组合物还包含游离PEI。在某些实施例中，细胞与游离PEI接触。
在所有方面和实施例的某些实施例中，细胞已经与组分(a)、(b)和/或(c)的混合物接触至少约4小时，或约4小时至约140小时，或约4小时至约96小时。在一个优选的实施例中，细胞已经与组分(a)、(b)和/或(c)及任选的游离PEI的混合物接触至少约4小时。
除了包含根据本发明的腺病毒VA RNA或DNA(元件)的核酸之外，组合物可包含另外的质粒。此类质粒和细胞可与游离PEI接触。在某些实施例中，质粒和/或细胞已经与游离PEI接触至少约4小时，或约4小时至约140小时，或约4小时至约96小时。
本发明也提供使用包含本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)的核酸来产生转染细胞的方法。该方法包括以下步骤：提供包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)和任选的一个或多个额外质粒的核酸；提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；以及将核酸和任选的质粒与PEI溶液混合，以产生核酸/质粒/PEI混合物。在某些实施例中，将此类混合物培育约10秒至约4小时范围内的一段时间。在此类方法中，然后使细胞与核酸/质粒/PEI混合物接触以产生核酸/质粒/PEI细胞培养物；然后将游离PEI加入到产生的核酸/质粒/PEI细胞培养物中以产生游离PEI/核酸/质粒/PEI细胞培养物；然后将产生的游离PEI/核酸/质粒/PEI细胞培养物培养至少约4小时，从而产生转染细胞。在某些实施例中，质粒包含编码蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸。
进一步提供用于产生转染细胞(其产生重组AAV载体或AAV颗粒)的方法，该方法包括：提供一个或多个质粒，该质粒包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸，其中其至少一个质粒包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)；提供包含编码蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；将上述质粒与PEI溶液混合，其中质粒的摩尔比范围为约1:0.01至约1:100，或摩尔比范围为约100:1至约1:0.01，以产生质粒/PEI混合物(且任选地将质粒/PEI混合物培育约10秒至约4小时范围内的一段时间)；将细胞与质粒/PEI混合物接触，以产生质粒/PEI细胞培养物；将游离PEI加入到产生的质粒/PEI细胞培养物中以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；以及将游离PEI/质粒/PEI细胞培养物培育至少约4小时，从而产生转染细胞，该转染细胞产生包含编码蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体或颗粒。
另外提供用于产生包含编码蛋白质的核酸或被转录成感兴趣的转录物的重组AAV载体或AAV颗粒的方法，该方法包括：提供一个或多个包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的质粒，其中至少一个质粒包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)；提供包含编码感兴趣的蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；将上述质粒与PEI溶液混合，其中质粒的摩尔比范围为约1:0.01至约1:100，或摩尔比范围为约100:1至约1:0.01，以产生质粒/PEI混合物(且任选地将质粒/PEI混合物培育约10秒至约4小时范围内的一段时间)；将细胞与所述产生的质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；将游离PEI加入到所述产生的质粒/PEI细胞培养物中以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；将产生的质粒/PEI细胞培养物或游离PEI/质粒/PEI细胞培养物培育至少约4小时以产生转染细胞；从产生的转染细胞中收获产生的转染细胞和/或培养基，以产生细胞和/或培养基收获物；及从产生的细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体或颗粒，从而产生包含编码蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体或颗粒。
使用根据本发明的腺病毒VA RNA或DNA(元件)产生重组AAV载体或AAV颗粒的方法可包括一个或多个另外的步骤或特征。示例性步骤或特征包括但不限于收获所产生的培养细胞和/或从所产生的培养细胞收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物的步骤。另外的示例性步骤或特征包括但不限于从细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体或AAV颗粒，从而产生包含编码蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体或AAV颗粒。
在所有方面和实施例的某些实施例中，在不同时间点将PEI加入到质粒和/或细胞。在某些实施例中，在质粒/PEI混合物与细胞接触之前、同时或之后，将游离PEI加入到细胞。
在所有方面和实施例的某些实施例中，当细胞与质粒/PEI混合物接触和/或与游离PEI接触时，细胞具有特定密度和/或细胞生长阶段和/或存活率。在一个优选的实施例中，当细胞与质粒/PEI混合物接触和/或当细胞与游离PEI接触时，细胞的密度范围为约1x10E5细胞/mL至约1x10E8细胞/mL。在某些实施例中，当细胞与质粒/PEI混合物或与游离PEI接触时，细胞的存活率为约60％或大于60％，或其中当细胞与质粒/PEI混合物接触时，细胞处于对数生长期，或当细胞与质粒/PEI混合物或与游离PEI接触时，细胞的存活率为约90％或大于90％，或者其中当细胞与质粒/PEI混合物或与游离PEI接触时，细胞处于对数生长期。
在所有方面和实施例的某些实施例中，所编码的AAV包装蛋白包括AAV rep和/或AAV cap。在所有方面和实施例的某些实施例中，此类AAV包装蛋白包括任何AAV血清型的AAV rep和/或AAV cap蛋白。
在所有方面和实施例的某些实施例中，所编码的辅助蛋白包括腺病毒E2和/或E4，和/或非AAV辅助蛋白。
在所有方面和实施例的某些实施例中，使用特定量或比例的核酸(质粒)。在某些实施例中，包含编码蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒和包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一个或多个质粒的总量，其中至少一个质粒包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)，在每mL细胞约0.1μg至约15μg的范围内。在某些实施例中，包含编码蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒与包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一个或多个质粒的摩尔比，其中至少一个质粒包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)，在约1:5至约1:1的范围内，或在约1:1至约5:1的范围内。
质粒可包括不同或相同质粒上的核酸。在所有方面和实施例的某些实施例中，第一质粒包含编码AAV包装蛋白的核酸，且第二质粒包含编码辅助蛋白的核酸。这些核酸中的至少一种核酸还包含根据本发明的腺病毒VA RNA核酸或DNA(元件)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，包含编码蛋白质或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒、与包含编码AAV包装蛋白的核酸的第一质粒、与包含编码辅助蛋白的核酸的第二质粒在共转染中，摩尔比在约1-5:1:1，或1:1-5:1，或1:1:1-5的范围内。
在所有方面和实施例的某些实施例中，细胞为真核细胞。在某些实施例中，真核细胞为哺乳动物细胞。在一个优选的实施例中，细胞为HEK293细胞或CHO细胞。
可使用培养真核细胞的常用条件进行培养，即约37℃、95％湿度和8vol.-％CO2。可在含血清或无血清培养基中执行贴附培养或悬浮培养。悬浮培养可在任何发酵容器中执行，诸如在搅拌釜反应器、波反应器、振动器容器或旋转容器或在所谓的滚瓶中执行。可分别以高通量形式和筛选执行转染，例如在96或384孔形式中执行。
根据本发明的方法包括任何血清型的AAV颗粒或其变异体。在所有方面和实施例的某些实施例中，重组AAV颗粒包含以下项中的任一者：AAV血清型1-12、AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，或经修饰或变体AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，或野生型AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。在所有方面和实施例的某些实施例中，AAV颗粒包含AAV血清型或AAV假型，其中AAV假型包括不同于ITR血清型的AAV衣壳血清型。
提供或包括AAV载体或颗粒的根据本发明的方法也可包括其他元件。此类元件的实例包括但不限于：内含子、表达控制元件、一种或多种腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)和/或填充物/填充多核苷酸序列。此类元件可位于编码蛋白质或被转录成关注转录物的核酸内或侧翼，或表达控制元件可操作地连接至核酸，该核酸编码蛋白质或被转录成感兴趣的转录物，或AAV ITR的侧翼可为核酸的5'-或3'-末端，该核酸编码蛋白质或被转录成感兴趣的转录物，或填充多核苷酸序列的侧翼可为核酸的5'-或3'-末端，该核酸编码蛋白质或被转录成感兴趣的转录物。
表达控制元件包括组成型或可调节控制元件，诸如组织特异性表达控制元件或启动子(例如提供在肝脏中的表达)。
ITR可为以下任一者：AAV2或AAV6或AAV8或AAV9血清型，或它们的组合。AAV颗粒可包括与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV10、AAV11、AAV-2i8或AAV rh74 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白具有75％或更多序列同一性的任何VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，或包含选自以下的任何经修饰或变体VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV10、AAV11、AAV-2i8和AAV-rh74 AAV血清型。
在产生如本文所述的重组病毒(例如，AAV)颗粒之后，如果需要，可使用各种常规方法从宿主细胞纯化和/或分离病毒(例如，rAAV)颗粒。此类方法包括柱色谱、CsCl梯度等。例如，可使用多个柱纯化步骤，诸如在阴离子交换柱、亲和性柱和/或阳离子交换柱上的纯化。(参见，例如，WO 02/12455及US 2003/0207439)。另选地或除此之外，可使用CsCl梯度步骤(参见，例如，US 2012/0135515；以及US 2013/0072548)。此外，如果使用感染性病毒来表达包装和/或辅助蛋白，则可使用各种方法将残留病毒去活化。例如，可通过加热到约60℃的温度例如20分钟或更长时间将腺病毒去活化。该处理有效地去活化辅助病毒，因为AAV是热稳定的，而辅助腺病毒是热不稳定的。
重组AAV载体以及其方法和用途包括任何病毒株或血清型。作为非限制性实例，重组AAV载体可基于任何AAV基因体，诸如，例如，AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV 2i8或AAV rh74。此类载体可基于相同或者彼此不同的病毒株或血清型(或亚群或变异体)。作为非限制性实例，基于一种血清型基因体的重组AAV载体可与包装载体的一种或多种衣壳蛋白相同。此外，重组AAV载体基因体可基于与包装载体的一种或多种AAV衣壳蛋白不同的AAV(例如AAV2)血清型基因体。例如，AAV载体基因体可基于AAV2，而三种衣壳蛋白中的至少一种可为例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8，或AAV rh74或它们的变异体。AAV变异体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8和AAV rh74衣壳的变异体和嵌合体。
在所有方面和实施例的某些实施例中，腺相关病毒(AAV)载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8和AAV rh74，以及它们的变异体(例如，衣壳变异体，诸如氨基酸插入、加入、取代及缺失)，例如，如WO 2013/158879、WO 2015/013313和US 2013/0059732(公开LK01、LK02、LK03等)。
AAV和AAV变异体(例如，衣壳变异体)血清型(例如，VP1、VP2和/或VP3序列)可与其他AAV血清型不同或并未不同，其他AAV血清型包括例如AAV1-AAV12(例如，与任何AAV1-AAV12血清型的VP1、VP2和/或VP3的序列不同)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，与参考血清型相关的AAV颗粒具有多核苷酸、多肽或其子序列，该多核苷酸、多肽或其子序列包括或由以下组成：与一个或多个AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8或AAV rh74(例如，诸如ITR，或VP1、VP2和/或VP3序列)具有至少80％或更多(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)同一性的序列。
本发明的组合物、方法及用途包括AAV序列(多肽和核苷酸)及其子序列，该子序列相较于参考AAV血清型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8或AAV rh74)展现低于100％的序列同一性，但不同于已知的AAV基因或蛋白质(诸如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8或AAV rh74、基因或蛋白质等)。在所有方面和实施例的某些实施例中，AAV多肽或其子序列包括或由以下项组成：与任何参考AAV序列或其子序列(诸如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8或AAV rh74(例如，VP1、VP2和/或VP3衣壳或ITR))具至少75％或更多(例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等、高达100％)同一性的序列。在某些方面，AAV变异体具有1个、2个、3个、4个、5个、5-10个、10-15个、15-20个或更多个氨基酸取代。
可使用本领域技术人员已知的重组技术构建重组AAV颗粒(包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8或AAV rh74，以及变异体、相关、混合及嵌合序列)，使该AAV颗粒包括侧翼为一个或多个功能AAV ITR序列的一个或多个核酸序列(转基因)。
可将重组颗粒(例如，rAAV颗粒)并入医药组成物中。此类医药组成物尤其可用于以活体内或离体向个体施用及递送。在某些实施例中，医药组成物含有医药上可接受的载体或赋形剂。此类赋形剂包括本身不诱导对接受组合物的个体有害的免疫反应的任何药剂，且其施用不产生过度毒性。
US 5,998,205、US 6,228,646、US 6,093,699、US 6,100,242、WO 94/17810和WO94/23744描述用于产生腺病毒载体的方案；其全部内容以引用的方式并入本文。
尽管对人类具有致病性，但rAAV载体产生及纯化系统的目标是实现以最大限度降低/控制生成产生相关杂质的策略，诸如蛋白质、核酸及载体相关杂质，包括野生型/假野生型型AAV物种(wtAAV)和AAV囊装的残留DNA杂质。
考虑rAAV颗粒仅占生物质的小部分，rAAV颗粒需纯化到一定程度的纯度才能用作临床人类基因疗法产品(参见，例如，Smith P.H.等人，Mo.Therapy7(2003)8348；ChadeufG.等人，Mo.Therapy 12(2005)744；来自CHMP基因疗法专家小组会议报告，欧洲药品管理局EMEA/CHMP 2005,183989/2004)。
作为起始步骤，通常为收获产生rAAV颗粒的培养细胞，任选地与收获培养的细胞培养上清液(培养基)结合，在上清液中已经培养产生rAAV颗粒的细胞(悬浮或贴附)。可按原样使用、适当使用或浓缩使用收获的细胞及任选地细胞培养上清液。此外，如果使用感染以表达辅助功能，则可将残留的辅助病毒去活化。例如，可通过加热到约60℃的温度例如20分钟或更长时间将腺病毒去活化，这仅去活化辅助病毒，因为AAV是热稳定的，而辅助腺病毒是热不稳定的。
通过破坏细胞(例如通过化学或物理方式，诸如清洁剂、微流化和/或均质化)来裂解收获物的细胞和/或上清液，以释放rAAV颗粒。在细胞裂解过程中同时或随后在细胞裂解之后，加入核酸酶(例如benzonase)以降解污染DNA。通常，将所得裂解物澄清以移除细胞碎片(例如通过过滤或离心)，以得到澄清的细胞裂解液。在一个特定的实例中，将裂解物以微米孔径的过滤器(诸如0.1-10.0μm孔径的过滤器，例如0.45μm和/或孔径0.2μm的过滤器)过滤，以产生澄清的裂解物。
裂解物(任选地澄清裂解物)含有AAV颗粒(包括rAAV载体以及空衣壳)和产生/过程相关杂质，诸如来自宿主细胞的可溶细胞组分，这些组分尤其可包括细胞蛋白质、脂质和/或核酸和细胞培养基组分。然后将任选地澄清裂解物进行纯化步骤，使用色谱从杂质中纯化AAV颗粒(包含rAAV载体)。在第一色谱步骤之前，可用合适的缓冲液稀释或浓缩澄清裂解物。
在细胞裂解、任选澄清及任选稀释或浓缩之后，可使用多个后续且顺序色谱步骤来纯化rAAV颗粒。
第一色谱步骤可为阳离子交换色谱或阴离子交换色谱。如果第一色谱步骤为阳离子交换色谱，则第二色谱步骤可为阴离子交换色谱或尺寸排阻色谱(SEC)。因此，在所有方面和实施例的某些实施例中，rAAV颗粒经由阳离子交换色谱纯化，然后经由阴离子交换色谱纯化。
另选地，如果第一色谱步骤为阳离子交换色谱，则第二色谱步骤可为尺寸排阻色谱(SEC)。因此，在所有方面和实施例的某些实施例中，rAAV颗粒经由阳离子交换色谱纯化，然后经由尺寸排阻色谱(SEC)纯化。
另选地，第一色谱步骤可为亲和力色谱。如果第一色谱步骤为亲和力色谱，则第二层色谱步骤可为阴离子交换色谱。因此，在所有方面和实施例的某些实施例中，rAAV颗粒经由亲和力色谱纯化，然后经由阴离子交换色谱纯化。
任选地，可将第三色谱加入到前述色谱步骤中。通常，任选的第三色谱步骤系在阳离子交换、阴离子交换、尺寸排阻或亲和力色谱之后。
因此，在所有方面和实施例的某些实施例中，rAAV颗粒经由阳离子交换色谱纯化，然后经由阴离子交换色谱纯化，然后经由尺寸排阻色谱(SEC)纯化。
此外，在所有方面和实施例的某些实施例中，rAAV颗粒经由阳离子交换色谱进一步纯化，然后经由尺寸排阻色谱(SEC)纯化，然后经由阴离子交换色谱纯化。
在所有方面和实施例的更进一步的实施例中，rAAV颗粒经由亲和力色谱纯化，然后经由阴离子交换色谱纯化，然后经由尺寸排阻色谱(SEC)纯化。
在所有方面和实施例的更进一步的实施例中，rAAV颗粒经由亲和力色谱纯化，然后经由尺寸排阻色谱(SEC)纯化，然后经由阴离子交换色谱纯化。
阳离子交换色谱的作用是将AAV颗粒与存在于澄清裂解物和/或亲和力或尺寸排阻色谱的柱洗脱液中的细胞及其他组分分离。能以广pH范围结合rAAV颗粒的强力阳离子交换树脂的实例包括但不限于任何基于磺酸的树脂，如存在磺酸盐官能基团(包括经芳基及烷基取代的磺酸盐)的树脂，诸如磺丙基或磺乙基树脂。代表性基质包括但不限于POROSHS、POROS HS 50、POROSXS、POROS SP和POROS S(强力阳离子交换剂可自Thermo FisherScientific,Inc.,Waltham,MA,USA获得)。其他实例包括Capto S、Capto S ImpAct、CaptoS ImpRes(强力阳离子交换剂可获自GE Healthcare，Marlborough,MA,USA)以及可获自Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI,USA)的商业
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系列树脂。弱阳离子交换树脂包括但不限于任何基于羧酸的树脂。示例性阳离子交换树脂包括羧甲基(CM)、磷(基于磷酸官能基团)、甲基磺酸(S)和磺丙基(SP)树脂。
阴离子交换色谱的作用是将AAV颗粒与存在于澄清裂解物和/或来自亲和力或阳离子交换或尺寸排阻色谱的柱洗脱液中的蛋白质、细胞及其他组分分离。阴离子交换色谱也可用于减少并由此控制洗脱液中空衣壳的量。例如，可用包含适当浓度(例如，约100-125mM，诸如110-115mM)的NaCl溶液洗涤其上结合rAAV颗粒的阴离子交换柱，且可在没有显著洗脱rAAV颗粒的流动中洗脱一部分空衣壳。随后，可使用包含更高浓度(例如，约130-300mM NaCl)的NaCl溶液洗脱与阴离子交换柱结合的rAAV颗粒，从而产生柱洗脱液，该柱洗脱液具有减少量或耗竭量的空衣壳且成比例增加量的rAAV颗粒，该rAAV颗粒包含rAAV载体。
示例性阴离子交换树脂包括但不限于基于聚胺树脂及其他树脂的阴离子交换树脂。强力阴离子交换树脂的实例包括通常基于季铵化氮原子的阴离子交换树脂，包括但不限于季铵盐树脂，例如三烷基芐基铵树脂。合适的交换色谱材料包括但不限于MACRO PREPQ(强力阴离子交换剂可自BioRad,Hercules,CA,USA获得)；UNOSPHERE Q(强力阴离子交换剂可自BioRad,Hercules,CA,USA获得)；POROS 50HQ(强力阴离子交换剂可自AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA)；POROS XQ(强力阴离子交换剂可自AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA获得)；POROS SOD(弱阴离子交换剂可自AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA获得)；POROS 50PI(弱阴离子交换剂可自AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA获得)；Capto Q、Capto XQ、Capto Q ImpRes和SOURCE30Q(强力阴离子交换剂可自GE healthcare,Marlborough,MA,USA获得)；DEAE SEPHAROSE(弱阴离子交换剂可自Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA获得)；Q SEPHAROSE(强力阴离子交换剂可自Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA获得)。另外的示例性阴离子交换树脂包括氨基乙基(AE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、二乙基氨基丙基(DEPE)和季氨基乙基(QAE)。
用于治疗人类疾病的重组AAV颗粒的纯化制造方法应实现以下目标：1)一致的颗粒纯度、效力和安全性；2)制造方法的可扩展性；3)可接受的制造成本。
WO 2019/006390报道纯化重组AAV颗粒的示例性方法。
下文概述纯化重组腺相关病毒颗粒(rAAV颗粒)和可扩展到大规模的产生方法。例如，针对5升、10升、10-20升、20-50升、50-100升、100-200升或更多升体积的悬浮培养物。重组腺相关病毒颗粒纯化和产生方法适用于各种AAV血清型/衣壳变异体。
在所有方面和实施例的某些实施例中，纯化rAAV颗粒包括以下步骤：
(a)收获包含rAAV颗粒的细胞和/或细胞培养上清液以产生收获物；
(b)任选地浓缩步骤(a)中产生的收获物以产生浓缩收获物；
(c)裂解步骤(a)中产生的收获物或裂解步骤(b)中产生的浓缩收获物以产生裂解物；
(d)处理步骤(c)中产生的裂解物以减少裂解物中的污染核酸，从而产生核酸减少的裂解物；
(e)任选地过滤在步骤(d)中产生的核酸减少的裂解物，以产生澄清裂解物，且任选地稀释澄清裂解物以产生稀释澄清裂解物；
(f)将步骤(d)的核酸减少的裂解物、步骤(e)的澄清裂解物或步骤(e)中产生的稀释澄清裂解物进行阳离子交换柱色谱，以产生包含rAAV颗粒的柱洗脱液，从而将rAAV颗粒与蛋白质杂质或其他的产生/过程相关杂质分离，并任选地稀释柱洗脱液，以产生稀释柱洗脱液；
(g)将步骤(f)中产生的柱洗脱液或稀释柱洗脱液进行阴离子交换色谱，以产生包含rAAV颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV颗粒与蛋白质杂质或产生/过程相关杂质分离，并任选地浓缩第二柱洗脱液，以产生浓缩第二柱洗脱液；
(h)将步骤(g)中产生的第二柱洗脱液或浓缩第二柱洗脱液进行尺寸排阻
色谱(SEC)，以产生包含rAAV颗粒的第三柱洗脱液，从而将rAAV颗粒与蛋白质杂质或产生/过程相关杂质分离，并任选地浓缩第三柱洗脱液，以产生浓缩第三柱洗脱液；以及
(i)过滤在步骤(h)中产生的第三柱洗脱液或浓缩第三柱洗脱液，从而产生纯化的rAAV颗粒。
在一个实施例中，保留步骤(a)至(f)并结合以下步骤：
(g)将步骤(f)中产生的柱洗脱液或浓缩柱洗脱液进行尺寸排阻色谱(SEC)，以产生包含rAAV颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV颗粒与蛋白质杂质或其他的产生/过程相关杂质分离，并任选地稀释第二柱洗脱液，以产生浓缩第二柱洗脱液；
(h)将第二柱洗脱液或在步骤(g)中产生的稀释第二柱洗脱液进行阴离子
交换色谱，以产生包含rAAV颗粒的第三柱洗脱液，从而将rAAV颗粒与蛋白质杂质产生/过程相关杂质分离，并任选地稀释第三柱洗脱液，以产生稀释第三柱洗脱液；以及
(i)过滤在步骤(h)中产生的第三柱洗脱液或浓缩第三柱洗脱液，从而产生纯化的rAAV颗粒。
在一个实施例中，保留步骤(a)至(g)并结合以下步骤：
(h)过滤在步骤(g)中产生的第二柱洗脱液或浓缩第二柱洗脱液，从而产生纯化rAAV颗粒。
在实施例中，保留步骤(a)至(e)并与以下步骤组合：
(f)将步骤(d)中的核酸减少的裂解物或步骤(e)中产生的澄清裂解物或稀释澄清裂解物进行AAV亲和力柱色谱，以产生包含rAAV颗粒的柱洗脱液，从而将rAAV颗粒与蛋白质杂质或其他的产生/过程相关杂质分离，并任选地浓缩柱洗脱液，以产生浓缩柱洗脱液；
(g)将步骤(f)中产生的柱洗脱液或浓缩柱洗脱液进行尺寸排阻色谱(SEC)，以产生包含rAAV颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV颗粒与蛋白质杂质或其他的产生/过程相关杂质分离，并任选地稀释第二柱洗脱液，以产生稀释第二柱洗脱液；
(h)任选地将步骤(g)中产生的第二柱洗脱液或稀释第二柱洗脱液进行阴离子交换色谱，以产生包含rAAV颗粒的第三柱洗脱液，从而将rAAV颗粒与蛋白质杂质或其他的产生/过程相关杂质分离，并任选地稀释第三柱洗脱液，以产生稀释第三柱洗脱液；及
(i)过滤在步骤(g)中产生的第二柱洗脱液或稀释第二柱洗脱液，或过滤在步骤(h)中产生的第三柱洗脱液或浓缩第三柱洗脱液，从而产生纯化的rAAV颗粒。
在所有方面和实施例的某些实施例中，步骤(b)和/或步骤(f)和/或步骤(g)和/或步骤(h)的浓缩系经由超滤/渗滤，诸如通过切向流过滤(TFF)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，步骤(b)的浓缩将收获的细胞及细胞培养上清液的体积减少约2-20倍。
在所有方面和实施例的某些实施例中，步骤(f)和/或步骤(g)和/或步骤(h)的浓缩将柱洗脱液的体积减少约5-20倍。
在所有方面和实施例的某些实施例中，步骤(a)中产生的收获物或步骤(b)中产生的浓缩收获物通过物理或化学方式来裂解。物理方式的非限制性实例包括微流化及均质化。化学方式的非限制性实例包括清洁剂。清洁剂包括非离子清洁剂及离子清洁剂。非离子清洁剂的非限制性实例包括Triton X-100。清洁剂浓度的非限制性实例为约0.1％与1.0％(v/v)或(w/v)之间(包括端值)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，步骤(d)包括用核酸酶处理，从而减少污染核酸。核酸酶的非限制性实例包括benzonase。
在所有方面和实施例的某些实施例中，经由过滤器来过滤步骤(e)的澄清裂解物或稀释澄清裂解物。过滤器的非限制性实例为孔径介于约0.1至10.0微米之间(包括端值)的过滤器。
在所有方面和实施例的某些实施例中，使用缓冲磷酸盐、乙酸盐或Tris水溶液来稀释步骤(e)的稀释澄清裂解物。溶液pH的非限制性实例为在约pH4.0至pH 7.4之间(包括端值)。Tris溶液pH的非限制性实例为大于pH 7.5，诸如介于约pH 8.0至pH 9.0之间(包括端值)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，使用缓冲磷酸盐、乙酸盐或Tris水溶液来稀释步骤(f)的柱洗脱液或步骤(g)的第二柱洗脱液。溶液pH的非限制性实例为在约pH 4.0至pH 7.4之间(包括端值)。Tris溶液pH的非限制性实例为大于pH 7.5，诸如介于约pH 8.0至pH 9.0之间(包括端值)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，将步骤(i)产生的rAAV颗粒与界面活性剂一起配制，以产生rAAV颗粒配制剂。
在所有方面和实施例的某些实施例中，步骤(f)、(g)和/或(h)的阴离子交换柱色谱包含聚乙二醇(PEG)调制的柱色谱。
在所有方面和实施例的某些实施例中，在rAAV颗粒从柱洗脱之前，用PEG溶液洗涤步骤(g)和/或(h)的阴离子交换柱色谱。在所有方面和实施例的某些实施例中，PEG具有约1,000g/mol至80,000g/mol的范围内(包括端值)的平均分子量。在所有方面和实施例的某些实施例中，PEG的浓度为约4％至约10％(w/v)(包括端值)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，在rAAV颗粒从柱洗脱之前，用界面活性剂水溶液洗涤步骤(g)和/或(h)的阴离子交换柱。
在所有方面和实施例的某些实施例中，在rAAV颗粒从柱洗脱之前，用界面活性剂溶液洗涤步骤(f)的阳离子交换柱。
在所有方面和实施例的某些实施例中，PEG溶液和/或界面活性剂溶液包含含水性Tris-HCl/NaCl缓冲液、水性磷酸盐/NaCl缓冲液或水性醋酸盐/NaCl缓冲液。
在所有方面和实施例的某些实施例中，缓冲液或溶液中的NaCl浓度为在约20-300mM NaCl之间(包括端值)或在约50-250mM NaCl(包括端值)之间的范围内。
在所有方面和实施例的某些实施例中，界面活性剂包含阳离子界面活性剂或阴离子界面活性剂。
在所有方面和实施例的某些实施例中，界面活性剂包含十二碳链界面活性剂。
在所有方面和实施例的某些实施例中，界面活性剂包含十二烷基三甲基氯化铵(DTAC)或十二烷基肌胺酸钠(Sarkosyl)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，以水性Tris-HCl/NaCl缓冲液从步骤(f)、(g)和/或(h)的阴离子交换柱洗脱出rAAV颗粒。
在所有方面和实施例的某些实施例中，Tris-HCl/NaCl缓冲液包含100-400mMNaCl(包括端值)，任选地为具有约pH 7.5至约pH 9.0(包括端值)的范围内的pH。
在所有方面和实施例的某些实施例中，用水性Tris-HCl/NaCl缓冲液洗涤步骤(f)、(g)和/或(h)的阴离子交换柱。
在所有方面和实施例的某些实施例中，水性Tris-HCl/NaCl缓冲液中的NaCl浓度在约75-125mM的范围内(包括端值)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，水性Tris-HCl/NaCl缓冲液具有约pH 7.5至约pH 9.0的pH(包括端值)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，洗涤一次或多次步骤(f)、(g)和/或(h)的阴离子交换柱，以减少第二柱洗脱液或第三柱洗脱液中空衣壳的量。
在所有方面和实施例的某些实施例中，阴离子交换柱的洗涤在rAAV颗粒洗脱之前和/或在rAAV颗粒洗脱时从柱中移除空衣壳，从而减少在第二柱洗脱液或第三柱洗脱液中空衣壳的量。
在所有方面和实施例的某些实施例中，阴离子交换柱的洗涤在rAAV颗粒洗脱之前和/或在rAAV颗粒洗脱时从柱中移除总空衣壳的量至少约50％，从而减少在第二柱洗脱液或第三柱洗脱液中空衣壳的量约50％。
在所有方面和实施例的某些实施例中，水溶液Tris-HCl/NaCl缓冲液中的NaCl浓度在约110-120mM的范围内(包括端值)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，洗脱的rAAV颗粒和空衣壳的比率和/或量由洗涤缓冲液控制。
在所有方面和实施例的某些实施例中，在水性磷酸盐/NaCl缓冲液或水性乙酸盐/NaCl缓冲液中从步骤(f)的阳离子交换柱洗脱出rAAV颗粒。缓冲液中的非限制性NaCl浓度为在约125-500mM NaCl的范围内(包括端值)。缓冲液的pH的非限制性实例为在约pH 5.5至约pH 7.5之间(包括端值)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，步骤(f)、(g)和/或(h)的阴离子交换柱包含季铵官能基团，诸如季铵化聚乙烯亚胺。
在所有方面和实施例的某些实施例中，步骤(g)和/或(h)的尺寸排阻柱(SEC)具有约10,000g/mol至约600,000g/mol的分离/分馏范围(分子量)(包括端值)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，步骤(f)的阳离子交换柱包含磺酸或官能团，诸如磺丙基。
在所有方面和实施例的某些实施例中，AAV亲和力柱包含结合至AAV衣壳蛋白的蛋白质或配体。蛋白质的非限制性实例包括结合至AAV衣壳蛋白的抗体。更具体的非限制性实例包括结合至AAV衣壳蛋白的单股骆马(骆驼科)抗体。
在所有方面和实施例的某些实施例中，方法排除氯化铯梯度超速离心的步骤。
在所有方面和实施例的某些实施例中，从步骤(a)中产生的收获物或步骤(b)中产生的浓缩收获物中，本方法回收大约50-90％的总rAAV颗粒。
在所有方面和实施例的某些实施例中，与通过单个AAV亲和力柱纯化产生或纯化的rAAV颗粒相比，本方法产生的rAAV颗粒具有较高的纯度。
在所有方面和实施例的某些实施例中，实质上同时进行步骤(c)和(d)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，在步骤(c)之后但在步骤(f)之前，将NaCl浓度调整至约100-400mM NaCl的范围内(包括端值)或至约140-300mM NaCl的范围内(包括端值)。
在所有方面和实施例的某些实施例中，rAAV颗粒源自选自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10和Rh74所组成的组的AAV。
在所有方面和实施例的某些实施例中，rAAV颗粒包含与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh 10、Rh74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76衣壳序列具有70％或更高序列同一性的衣壳序列。
在所有方面和实施例的某些实施例中，rAAV颗粒包含与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh 10或Rh74ITR序列具有70％或更高序列同一性的ITR序列。
在所有方面和实施例的某些实施例中，细胞为悬浮生长或贴附生长细胞。
在所有方面和实施例的某些实施例中，细胞为哺乳动物细胞。非限制实例包括HEK细胞，诸如HEK-293细胞及CHO细胞，诸如CHO-K1细胞。
用于确定含有转基因的rAAV颗粒的感染滴度方法为本领域已知的(参见，例如，Zhen等人，Hum.Gene Ther.15(2004)709)。用于测定具包装转基因的空衣壳和rAAV颗粒的方法为已知的(参见，例如，Grimm等人，Gene Therapy 6(1999)1322-1330；Sommer等人，Malec.7(2003)122-128)。
为确定降解/变性衣壳的存在或数量，可对纯化的rAAV颗粒进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，该凝胶电泳由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶(例如梯度凝胶)所组成，然后运行凝胶直到样本分离，并将凝胶转印到尼龙膜或硝酸纤维素膜上。然后将抗AAV衣壳抗体作为结合至变性衣壳蛋白的初级抗体(参见，例如，Wobus等人，J.Viral.74(2000)9281-9293)。结合至初级抗体的二级抗体包含检测初级抗体的方式。使用半定量检测初级抗体与二级抗体之间的结合以确定衣壳的数量。另一种方法是使用具有SEC柱的分析级HPLC或分析级超速离心机。
***
除所描绘和要求保护的各种实施例之外，本文所公开的主题还涉及具有本文所公开和要求保护的特征的其他组合的其他实施例。因此，本文所呈现的特定特征可在本文所公开的主题范围内以其他方式彼此组合，使得本文所公开的主题包括本文所公开的特征的任何合适的组合。出于说明和描述的目的，已经提供了本文所公开的主题的特定实施例的前述描述。其并非旨在穷举或将本文所公开的主题限制为所公开的那些实施例。
本文提及的所有参考文献均通过引用的方式并入本文。
***
提供以下实例、序列和附图以帮助理解本发明，其真正的范围在所附申请权利要求书中阐明。应当理解的是，在不脱离本发明的精神的前提下，可以对所提出的步骤进行修改。
附图说明
图1腺病毒VA RNA与腺病毒VA RNA G58T/G59T/C68A变异体的比对。
图2本发明的实施例的方案，其中人类U6启动子可操作地连接至腺病毒VA RNAI序列。
实例
一般技术
1)重组DNA技术
使用如下所述的标准方法操作DNA：Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y,(1989)。根据制造商的说明使用分子生物试剂。
2)DNA和蛋白质序列分析以及序列数据管理
使用EMBOSS(European Molecular Biology Open Software Suite)软件包、Invitrogen's Vector NTI和Geneious prime来创建、定位、分析、批注及说明序列。
3)基因和寡核苷酸合成
由Geneart GmbH(Regensburg,Germany)化学合成制备所需的基因片段。将合成的基因片段克隆到大肠杆菌质粒中以用于繁殖/扩增。通过DNA定序证实次克隆基因片段的DNA序列。另选地，通过对化学合成的寡核苷酸进行黏合或经由PCR来组装短的合成DNA片段。由metabion GmbH(Planegg-Martinsried,Germany)制备各自的寡核苷酸。
4)试剂
如果无另外说明，所有商业化学品、抗体及试剂盒均按照制造商的方案使用。
5)TI宿主细胞株的培养
将TI CHO宿主细胞培养于37℃，湿度为85％且CO2为5％的加湿培养箱。该细胞在含有300μg/ml潮霉素B和4μg/ml第二选择标记的专属DMEM/F12培养基中培养。每3天或4天以0.3x10E6细胞/ml的浓度分样细胞，总体积为30ml。使用125ml无挡板锥形震荡瓶培养。在150rpm下以5cm的振荡幅度振荡细胞。以Cedex HiRes Cell Counter(Roche)确定细胞计数。将细胞保持在培养中直到其达到60日龄。
6)克隆
一般
使用R位点的克隆取决于感兴趣的基因(GOI)旁边的DNA序列，该序列等于位于以下片段中的序列。类似地，通过重迭相同序列并随后由DNA连接酶连接组装DNA中的切口，则可组装片段。因此，有必要克隆单个基因，特别是含有正确R位点的初步质粒。在成功克隆这些初步质粒之后，经由通过直接在R位点旁边切割的酶的限制消化，将侧翼为R位点的感兴趣的基因切掉。最后一步是在一个步骤中组装所有DNA片段。更详细地，5'-核酸外切酶移除重迭区(R-位点)的5'-端。在这之后，可进行R位点的黏合，且DNA聚合酶延伸3'端以填补序列中的空位。最后，DNA连接酶连接核苷酸之间的缺口。加入含有不同酶(如核酸外切酶、DNA聚合酶及连接酶)的组装主混合物，并随后在50℃下培育反应混合物，可将单个片段组装成一个质粒。在这之后，用质粒转染感受态大肠杆菌细胞。
对于一些质粒，使用经由限制酶的克隆策略。通过选择合适的限制内切酶，可将感兴趣的所欲基因切除，然后经由连接将其插入至不同的质粒中。因此，优选的为使用并以巧妙的方式选择在多重克隆位点(MCS)切割的酶，以便可在正确的数组中进行片段的连接。如果质粒和片段先前用相同的限制酶切割，则片段和质粒的黏性端会完美地接合在一起，随后可通过DNA连接酶连接。在连接之后，用新生成的质粒转染感受态大肠杆菌细胞。
经由限制消化进行克隆
对于使用限制内切酶消化质粒，将以下组分移液至冰上：
表：限制消化反应混合物
Figure BDA0004171824500000751
如果在一次消化中使用更多酶，则使用每种酶1μl，并通过加入较多PCR级水或较少PCR级水来调整体积。选择所有酶的前提为其符合可与来自New England Biolabs的CutSmart缓冲液一起使用(100％活性)的资格，且具有相同的培育温度(均为37℃)。
使用热混合器或热循环仪进行培育，允许在恒温(37℃)下培育样本。在培育过程中，不搅动样本。培育时间设置为60分钟。然后将样本直接与加载染料混合，并加载到琼脂糖电泳凝胶上或储存在4℃/冰上以备进一步使用。
制备用于凝胶电泳的1％琼脂糖凝胶。因此，将1.5g多用途琼脂糖称重到125锥形摇瓶中，并注入150ml TAE缓冲液。混合物在微波炉中加热直至琼脂糖完全溶解。将0.5μg/ml溴化乙锭加入到琼脂糖溶液中。然后将凝胶浇注至模具中。在琼脂糖凝固之后，将模具放入电泳室，并用TAE缓冲液填入电泳室。然后加载样本。在第一槽中(从左边起算)，加载合适的DNA分子量标记物，接着加载样本。凝胶在<130V下运行约60分钟。在电泳之后，从电泳室中取出凝胶并在UV成像仪中进行分析。
切割出靶条带并转移到1.5ml Eppendorf中。使用来自Qiagen的QIAquick GelExtraction Kit并根据制造商的说明，进行凝胶的纯化。将DNA片段储存于-20℃以备进一步使用。
用于连接的片段以1:2、1:3或1:5的摩尔比移液在一起，以用于插入质粒，摩尔比具体取决于插入片段和质粒片段的长度以及它们之间的相互关系。如果应插入质粒的片段很短，则使用1:5的比例。如果插入物较长，则相对于质粒使用较少量。每次连接使用50ng量的质粒，并使用NEBioCalculator计算特定的插入量。使用来自NEB的T4 DNA ligation kit连接。下表示出连接混合物的实例。
表：连接反应混合物
Figure BDA0004171824500000761
以混合DNA和水开始，加入缓冲液，最后加入酶，所有组分都在冰上进行移液。通过上下移液轻微地混合反应液，短暂微量离心，然后在室温下培育10分钟。在培育之后，T4连接酶在65℃下加热去活化10分钟。样本在冰上冷却。在最后一步中，利用2μl连接质粒转化10-β感受态大肠杆菌细胞(见下)。
转化10-β感受态大肠杆菌细胞
将用于转形的10-β感受态大肠杆菌细胞在冰上解冻。在这之后，将2μl质粒DNA直接移液至细胞悬浮液中。轻弹管并置于冰上30分钟。此后，将细胞放入42℃的热块中并精确热休克30秒。紧接着，将细胞在冰上急冷2分钟。将950μl的NEB 10-βOutgrowth Medium加入到细胞悬浮液中。将细胞在37℃下振荡培育一小时。然后，将50-100μl移液至预热(37℃)的LB-Amp琼脂板上，并以一次性抹刀涂抹。将板在37℃下培育过夜。只有成功并入质粒并携带安比西林抗性基因的细菌才能在这些板上生长。第二天挑取单个菌落，在LB-Amp培养基中培养，以用于后续的质粒制备。
细菌培养
在LB培养基(简称Luria Bertani)中培养大肠杆菌，该培养基中搀入1ml/L100mg/ml安比西林，使安比西林浓度为0.1mg/ml。对于不同的质粒制备量，以单个细菌菌落接种以下量。
表：大肠杆菌培养体积
数量质粒制备 体积LB-Amp培养基[ml] 培育时间[h]
Mini-Prep 96孔(EpMotion) 1.5 23
Mini-Prep 15ml管 3.6 23
Maxi-Prep 200 16
对于Mini-Prep，96孔2ml深孔板的每孔注入1.5ml LB-Amp培养基。挑取菌落并将牙签塞入培养基中。当挑取所有菌落之后，用黏性透气膜将板密封。将板在37℃培养箱中以200rpm的振荡速率培养23小时。
对于Mini-Preps，在15ml管(带有通风盖)中装入3.6ml LB-Amp培养基并同样接种细菌菌落。在培育期间，牙签并未被移除而是留在管中。与96孔板一样，管在37℃、200rpm下培育23小时。
对于Maxi-Prep，将200ml LB-Amp培养基装入高压灭菌的1LErlenmeyer烧瓶中，并接种大约为5小时龄的1ml细菌日培养物。锥形瓶以纸塞密闭并在37℃、200rpm下培育16小时。
质粒制备
对于Mini-Prep，将50μl细菌悬浮液转移到1ml深孔板中。之后，将细菌细胞在板中以3000rpm、4℃离心5分钟。移除上清液，将带有细菌沉淀物的板置于EpMotion中。约90分钟之后完成运行，并可从EpMotion中取出溶析的质粒DNA以供进一步使用。
对于Mini-Prep，自培养箱中取出15ml管，并将3.6ml细菌培养物分样至两个2mlEppendorf管。在室温下，在台式微量离心机中以6,800xg将管离心3分钟。在这之后，根据制造商的说明利用Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit执行Mini-Prep。利用Nanodrop测量质粒DNA浓度。
根据制造商的说明使用Macherey-Nagel
Figure BDA0004171824500000771
Xtra Maxi EF Kit执行Maxi-Prep。利用Nanodrop测量DNA浓度。
乙醇沉淀
将一定体积的DNA溶液与2.5倍体积的100％乙醇混合。混合物在-20℃下培育10分钟。然后将DNA在14,000rpm，4℃下离心30分钟。小心地移除上清液并用70％乙醇洗涤沉淀物。再次将管在14,000rpm、4℃下离心5分钟。通过移液小心地移除上清液并干燥沉淀物。当乙醇蒸发之后，加入适量的无内毒素水。给予DNA时间在4℃下再溶于水中隔夜。取一小部分等分样本并利用Nanodrop装置测量DNA浓度。
表达盒组成
对于表达开放阅读框，使用包含以下功能元件的转录单元：
-来自包括内含子A的人类巨细胞病毒的直接早期增强子和启动子，
-人类重链免疫球蛋白5'-非转译区(5'UTR)，
-如果需要，则包含包括信号序列的相应开放阅读框的核酸，
-牛生长激素多腺苷酸化序列(BGH pA)，以及
-任选地，人类胃泌素终止子(hGT)。
除了包含要表达的所需基因的表达单元/表达盒之外，基本/标准哺乳动物表达质粒还包含
-来自质粒pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，以及
-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予安比西林抗性。
细胞培养技术
使用标准细胞培养技术，如Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(eds.),John Wiley&Sons,Inc中的Current Protocols中所述。
HEK293系统中的瞬时转染
通过使用HEK293系统(Invitrogen)根据制造商的说明利用相应质粒(见下文实例1至4)瞬时转染，以产生包含根据本发明的DNA元件的细胞。简而言之，将相应质粒和293fectinTM或fectin(Invitrogen)的混合物转染至在无血清FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen)中的摇瓶或搅拌发酵瓶中悬浮生长的HEK293细胞(Invitrogen)。对于2L摇瓶(Corning)，HEK293细胞以1*106细胞/mL的密度接种在600mL中，并在120rpm、8％ CO2下培育。第二天，将约42mL混合物转染约1.5*106细胞/mL的细胞密度的细胞，该混合物为A)20mLOpti-MEM(Invitrogen)与600μg总质粒DNA(1μg/mL)以及B)20ml Opti-MEM+1.2mL293fectin或fectin(2μL/mL)。根据葡萄糖消耗量，在发酵过程期间加入葡萄糖溶液。
SDS-PAGE
LDS样本缓冲液，四倍浓缩液(4x)：4g甘油、0.682g TRIS碱、0.666gTRIS盐酸盐、0.8g LDS(十二烷基硫酸锂)、0.006g EDTA(乙二胺四酸)、0.75ml的1％重量百分比(w/w)Serva Blue G250水溶液、0.75ml的1％重量百分比(w/w)酚红溶液，加水使总体积为10毫升。
将培养液中的细胞裂解。此后，将溶液离心以移除细胞碎片。将澄清上清液与1/4体积(v/v)的4xLDS样本缓冲液和1/10体积(v/v)的0.5M 1,4-二硫苏糖醇(DTT)混合。然后将样本在70℃下培育10分钟，通过SDS-PAGE分离蛋白质。根据制造商的说明，使用
Figure BDA0004171824500000791
Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen公司)。具体地，使用10％
Figure BDA0004171824500000792
Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和/>
Figure BDA0004171824500000793
MOPS电泳缓冲液。
蛋白质印迹法
转移缓冲液：39mM甘胺酸、48mM TRIS盐酸盐、0.04％重量(w/w)的SDS和20％体积(v/v)的甲醇
在SDS-PAGE之后，根据Burnette的“半干印迹法”(Burnette,W.N.，Anal.Biochem.112(1981)195-203)将分离的多肽电泳转移至硝酸纤维素滤膜(孔径：0.45μm)。
实例1
通过根据本发明的人类U6启动子产生用于腺病毒VA RNAI转录的DNA
DNA片段在5'-至3'-的方向上包含人类U6启动子序列(TATA与转录起始位点之间的距离以及U6启动子的核苷酸序列保持不变；SEQ ID NO:42)且包括聚合酶III终止子序列(SEQ ID NO:33)的腺病毒血清型2(Ad2)VA RNAI基因(GenBank AC_000007)是化学合成的。
该片段与携带嘌呤霉素选择标记的质粒骨架连接，产生出用于稳定转染哺乳动物细胞的质粒。
图2示出该DNA片段中元件的顺序和取向。
实例2
稳定整合
将适合悬浮生长的CHO-K1细胞置于50mL化学成分确定的培养基中，于37℃及5-7vol.-％CO2的一次性通风125mL摇瓶中繁殖。培养物以140-180rpm/min的固定搅拌速度摇晃，且每3-4天用新鲜培养基稀释至2-3x105细胞/mL的密度。使用Cedex HiRes细胞计数器(Roche Innovates AG,Bielefeld,Germany)测定培养物的密度和存活率。
为稳定整合实例1的核酸，将悬浮生长的CHO-K1细胞以4x 105细胞/mL的密度接种在新鲜的化学成分确定的培养基中。第二天，根据制造商的方案，使用Nucleofector Kit V(Lonza，Switzerland)，利用Nucleofector装置执行转染。用30μg线性化质粒DNA转染3x107细胞。在转染之后，将细胞接种在不含选择剂的30ml新鲜的化学成分确定的培养基中。
转染两天之后，将细胞接种到含有作为选择剂的1至10μg/mL嘌呤霉素的384孔板中，每孔接种300至500个细胞。在三周之后，通过使用NYONE Plate成像仪(SYNENTECHGmbH，Elmshorn，Germany)的成像来鉴别细胞菌落。将菌落转移到96孔板，并通过PCR分析整合。含有核酸的细胞株在含有嘌呤霉素的化学成分确定的培养基中进一步扩增，且在扩增之后冷冻保存。
实例 3
AAV 颗粒产生
为产生重组AAV颗粒，将根据实例2所获得的3x 107细胞用总量为30μg的核酸转染，该核酸由质粒DNA组成，提供重组AAV基因体(转基因，例如侧翼为AAV ITR的GFP基因)和尚未整合到细胞基因体中的辅助基因和/或rep/cap基因的表达盒。
转染前一天，将细胞以4x 105细胞/mL的密度接种至新鲜培养基中。第二天，根据制造商的方案，使用Nucleofector Kit V(Lonza，Switzerland)，利用Nucleofector装置执行转染。
另选地，质粒依序稳定地整合到宿主细胞的基因体中，然后是rep/cap基因。
从细胞培养上清液或总细胞裂解物中收集AAV颗粒，并通过ELISA、定量PCR和转导靶细胞进行分析。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司 (F. Hoffmann-La Roche AG)
<120> 用于 VA RNA 转录的核酸构建体
<130> P36313
<150> EP20202010.3
<151> 2020-10-15
<160> 45
<170> PatentIn 第 3.5 版
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> 噬菌体 P1
<400> 1
ataacttcgt ata 13
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> 噬菌体 P1
<400> 2
tatacgaagt tat 13
<210> 3
<211> 8
<212> DNA
<213> 噬菌体 P1
<400> 3
atgtatgc 8
<210> 4
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L3 间隔子序列
<400> 4
aagtctcc 8
<210> 5
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L2 反向间隔子序列
<400> 5
gcatacat 8
<210> 6
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LoxFas 间隔子序列
<400> 6
tacctttc 8
<210> 7
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lox511 间隔子序列
<400> 7
atgtatac 8
<210> 8
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lox5171 间隔子序列
<400> 8
atgtgtac 8
<210> 9
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lox2272 间隔子序列
<400> 9
aagtatcc 8
<210> 10
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Loxm2 间隔子序列
<400> 10
agaaacca 8
<210> 11
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Loxm3 间隔子序列
<400> 11
taatacca 8
<210> 12
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Loxm7 间隔子序列
<400> 12
agatagaa 8
<210> 13
<211> 608
<212> DNA
<213> 人类巨细胞病毒
<400> 13
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattagc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctccg tttagtgaac 600
gtcagatc 608
<210> 14
<211> 696
<212> DNA
<213> 人类巨细胞病毒
<400> 14
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattagc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctccg tttagtgaac 600
gtcagatcta gctctgggag aggagcccag cactagaagt cggcggtgtt tccattcggt 660
gatcagcact gaacacagag gaagcttgcc gccacc 696
<210> 15
<211> 2125
<212> DNA
<213> 人类巨细胞病毒
<400> 15
ctgcagtgaa taataaaatg tgtgtttgtc cgaaatacgc gttttgagat ttctgtcgcc 60
gactaaattc atgtcgcgcg atagtggtgt ttatcgccga tagagatggc gatattggaa 120
aaatcgatat ttgaaaatat ggcatattga aaatgtcgcc gatgtgagtt tctgtgtaac 180
tgatatcgcc atttttccaa aagtgatttt tgggcatacg cgatatctgg cgatagcgct 240
tatatcgttt acgggggatg gcgatagacg actttggtga cttgggcgat tctgtgtgtc 300
gcaaatatcg cagtttcgat ataggtgaca gacgatatga ggctatatcg ccgatagagg 360
cgacatcaag ctggcacatg gccaatgcat atcgatctat acattgaatc aatattggcc 420
attagccata ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca 480
tacgttgtat ccatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc 540
atgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 600
tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 660
gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat 720
agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt 780
acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc 840
cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta 900
cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg 960
atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt 1020
gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac 1080
gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa 1140
ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga 1200
ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc gtgccaagag 1260
tgacgtaagt accgcctata gagtctatag gcccaccccc ttggcttctt atgcatgcta 1320
tactgttttt ggcttggggt ctatacaccc ccgcttcctc atgttatagg tgatggtata 1380
gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata 1440
ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tctctttatt ggctatatgc 1500
caatacactg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtctcat 1560
ttattattta caaattcaca tatacaacac caccgtcccc agtgcccgca gtttttatta 1620
aacataacgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc 1680
cggtagcggc ggagcttcta catccgagcc ctgctcccat gcctccagcg actcatggtc 1740
gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca cgatgcccac 1800
caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1860
ggagcgggct tgcaccgctg acgcatttgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1920
aggcagctga gttgttgtgt tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1980
aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 2040
taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 2100
ttgacacggt ttaaacgccg ccacc 2125
<210> 16
<211> 218
<212> DNA
<213> 欧洲牛
<400> 16
ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg 60
tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag 120
gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga 180
caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatgg 218
<210> 17
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
caggataata tatggtaggg ttcatagcca gagtaacctt tttttttaat ttttatttta 60
ttttattttt gag 73
<210> 18
<211> 288
<212> DNA
<213> 猿猴病毒 40
<400> 18
agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 60
tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 120
ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 180
aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 240
gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcg 288
<210> 19
<211> 129
<212> DNA
<213> 猿猴病毒 40
<400> 19
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcacc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 120
tcatgtctg 129
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 酿酒酵母菌
<400> 20
gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34
<210> 21
<211> 13
<212> DNA
<213> 酿酒酵母菌
<400> 21
gaagttccta ttc 13
<210> 22
<211> 13
<212> DNA
<213> 酿酒酵母菌
<400> 22
gaataggaac ttc 13
<210> 23
<211> 8
<212> DNA
<213> 酿酒酵母菌
<400> 23
tctagaaa 8
<210> 24
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F3 位点间隔子序列
<400> 24
ttcaaata 8
<210> 25
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F5 位点间隔子序列
<400> 25
ttcaaaag 8
<210> 26
<211> 343
<212> PRT
<213> 噬菌体 P1
<400> 26
Met Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val
1 5 10 15
Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg
20 25 30
Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val
35 40 45
Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe
50 55 60
Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala
65 70 75 80
Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn
85 90 95
Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala
100 105 110
Val Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala Gly
115 120 125
Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln
130 135 140
Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp Ile Arg Asn
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Ile Ala Glu
165 170 175
Ile Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg
180 185 190
Met Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly
195 200 205
Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp
210 215 220
Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys
225 230 235 240
Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu
245 250 255
Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr His Arg Leu Ile
260 265 270
Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly
275 280 285
His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val
290 295 300
Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn Ile
305 310 315 320
Val Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val
325 330 335
Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp
340
<210> 27
<211> 1029
<212> RNA
<213> 噬菌体 P1
<400> 27
augagcaacc ugcugaccgu gcaccagaac cugcccgccc ugcccgugga cgccaccagc 60
gacgagguga ggaagaaccu gauggacaug uucagggaca ggcaggccuu cagcgagcac 120
accuggaaga ugcugcugag cgugugcagg agcugggccg ccuggugcaa gcugaacaac 180
aggaaguggu uccccgccga gcccgaggac gugagggacu accugcugua ccugcaggcc 240
aggggccugg ccgugaagac cauccagcag caccugggcc agcugaacau gcugcacagg 300
aggagcggcc ugcccaggcc cagcgacagc aacgccguga gccuggugau gaggaggauc 360
aggaaggaga acguggacgc cggcgagagg gccaagcagg cccuggccuu cgagaggacc 420
gacuucgacc aggugaggag ccugauggag aacagcgaca ggugccagga caucaggaac 480
cuggccuucc ugggcaucgc cuacaacacc cugcugagga ucgccgagau cgccaggauc 540
agggugaagg acaucagcag gaccgacggc ggcaggaugc ugauccacau cggcaggacc 600
aagacccugg ugagcaccgc cggcguggag aaggcccuga gccugggcgu gaccaagcug 660
guggagaggu ggaucagcgu gagcggcgug gccgacgacc ccaacaacua ccuguucugc 720
agggugagga agaacggcgu ggccgccccc agcgccacca gccagcugag caccagggcc 780
cuggagggca ucuucgaggc cacccacagg cugaucuacg gcgccaagga cgacagcggc 840
cagagguacc uggccuggag cggccacagc gccagggugg gcgccgccag ggacauggcc 900
agggccggcg ugagcauccc cgagaucaug caggccggcg gcuggaccaa cgugaacauc 960
gugaugaacu acaucaggaa ccuggacagc gagaccggcg ccauggugag gcugcuggag 1020
gacggcgac 1029
<210> 28
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 绿色荧光蛋白编码核酸
<400> 28
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780
tccaccggat ctagatga 798
<210> 29
<211> 4
<212> RNA
<213> 人类腺病毒 2 型
<400> 29
ccgg 4
<210> 30
<211> 5
<212> RNA
<213> 人类腺病毒 2 型
<400> 30
yccgg 5
<210> 31
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VA RNA A 盒共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n 为 a、c、g 或 u
<400> 31
rrynnarygg 10
<210> 32
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VA RNA B 盒共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> n 为 a、c、g 或 u
<400> 32
gwucrannc 9
<210> 33
<211> 225
<212> DNA
<213> 人类腺病毒 2 型
<400> 33
cgtgcaaaag gagagcctgt aagcgggcac tcttccgtgg tctggtggat aaattcgcaa 60
gggtatcatg gcggacgacc ggggttcgaa ccccggatcc ggccgtccgc cgtgatccat 120
gcggttaccg cccgcgtgtc gaacccaggt gtgcgacgtc agacaacggg ggagcgctcc 180
ttttggcttc cttccaggcg cggcggctgc tgcgctagct ttttt 225
<210> 34
<211> 225
<212> DNA
<213> 人类腺病毒 2 型
<400> 34
cgtgcaaaag gagagcctgt aagcgggcac tcttccgtgg tctggtggat aaattcgcaa 60
gggtatcatg gcggacgacc gttgttcgaa caccggatcc ggccgtccgc cgtgatccat 120
gcggttaccg cccgcgtgtc gaacccaggt gtgcgacgtc agacaacggg ggagcgctcc 180
ttttggcttc cttccaggcg cggcggctgc tgcgctagct ttttt 225
<210> 35
<211> 242
<212> DNA
<213> 人类腺病毒 5 型
<400> 35
tcgttgacgc tctagaccgt gcaaaaggag agcctgtaag cgggcactct tccgtggtct 60
ggtggataaa ttcgcaaggg tatcatggcg gacgaccggg gttcgagccc cgtatccggc 120
cgtccgccgt gatccatgcg gttaccgccc gcgtgtcgaa cccaggtgtg cgacgtcaga 180
caacggggga gtgctccttt tggcttcctt ccaggcgcgg cggctgctgc gctagctttt 240
tt 242
<210> 36
<211> 466
<212> DNA
<213> 人类腺病毒 5 型
<400> 36
tcgttgacgc tctagaccgt gcaaaaggag agcctgtaag cgggcactct tccgtggtct 60
ggtggataaa ttcgcaaggg tatcatggcg gacgaccggg gttcgagccc cgtatccggc 120
cgtccgccgt gatccatgcg gttaccgccc gcgtgtcgaa cccaggtgtg cgacgtcaga 180
caacggggga gtgctccttt tggcttcctt ccaggcgcgg cggctgctgc gctagctttt 240
ttggccactg gccgcgcgca gcgtaagcgg ttaggctgga aagcgaaagc attaagtggc 300
tcgctccctg tagccggagg gttattttcc aagggttgag tcgcgggacc cccggttcga 360
gtctcggacc ggccggactg cggcgaacgg gggtttgcct ccccgtcatg caagaccccg 420
cttgcaaatt cctccggaaa cagggacgag cccctttttt gctttt 466
<210> 37
<211> 201
<212> DNA
<213> 腺相关病毒 2
<400> 37
gggcactctt ccgtggtctg gtggataaat tcgcaagggt atcatggcgg acgaccgggg 60
ttcgaacccc ggatccggcc gtccgccgtg atccatgcgg ttaccgcccg cgtgtcgaac 120
ccaggtgtgc gacgtcagac aacgggggag cgctcctttt ggcttccttc caggcgcggc 180
ggctgctgcg ctagcttttt t 201
<210> 38
<211> 201
<212> DNA
<213> 腺相关病毒 2
<400> 38
gggcactctt ccgtggtctg gtggataaat tcgcaagggt atcatggcgg acgaccgttg 60
ttcgaacacc ggatccggcc gtccgccgtg atccatgcgg ttaccgcccg cgtgtcgaac 120
ccaggtgtgc gacgtcagac aacgggggag cgctcctttt ggcttccttc caggcgcggc 180
ggctgctgcg ctagcttttt t 201
<210> 39
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 填充序列
<400> 39
aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac 60
aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa 120
aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt 180
aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat 240
atcttgtgga aaggacgaaa caccgggcac tcttccgtgg tctggtggat aaattcgcaa 300
gggtatcatg gcggacgacc ggggttcgaa ccccggatcc ggccgtccgc cgtgatccat 360
gcggttaccg cccgcgtgtc gaacccaggt gtgcgacgtc agacaacggg ggagcgctcc 420
ttttggcttc cttccaggcg cggcggctgc tgcgctagct ttttt 465
<210> 40
<211> 738
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VP1 衣壳
<400> 40
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145 150 155 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165 170 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro
180 185 190
Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly
195 200 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210 215 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225 230 235 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245 250 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp
260 265 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275 280 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
290 295 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn
305 310 315 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325 330 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
340 345 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
355 360 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
370 375 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
385 390 395 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr
405 410 415
Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
420 425 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
435 440 445
Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu
450 455 460
Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp
465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser
485 490 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His
500 505 510
Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr
515 520 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met
530 535 540
Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val
545 550 555 560
Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
565 570 575
Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala
580 585 590
Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
595 600 605
Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
610 615 620
Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
625 630 635 640
Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
645 650 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe
660 665 670
Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
675 680 685
Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
690 695 700
Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu
705 710 715 720
Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
725 730 735
Asn Leu
<210> 41
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VP1 衣壳
<400> 41
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr
435 440 445
Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln
565 570 575
Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr
580 585 590
Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val
705 710 715 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725 730 735
<210> 42
<211> 264
<212> DNA
<213> 智人
<400> 42
aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac 60
aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa 120
aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt 180
aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat 240
atcttgtgga aaggacgaaa cacc 264
<210> 43
<211> 313
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 43
atccgacgcc gccatctcta ggcccgcgcc ggccccctcg cacagacttg tgggagaagc 60
tcggctactc ccctgccccg gttaatttgc atataatatt tcctagtaac tatagaggct 120
taatgtgcga taaaagacag ataatctgtt ctttttaata ctagctacat tttacatgat 180
aggcttggat ttctataaga gatacaaata ctaaattatt attttaaaaa acagcacaaa 240
aggaaactca ccctaactgt aaagtaattg tgtgttttga gactataaat atcccttgga 300
gaaaagcctt gtt 313
<210> 44
<211> 215
<212> DNA
<213> 智人
<400> 44
gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60
cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120
tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180
gatttgggaa tcgtataaga actgtatgag accac 215
<210> 45
<211> 190
<212> DNA
<213> 智人
<400> 45
agctctagct tgaattggtg ccactgttcg gcatcgttgt gtttcgatct ctacaatttc 60
gttacggtag cctctccagc tctagcctag ctatttgcat gtcgctatgt gttctgggaa 120
atcaccataa acgtgaaatg tctttggatt tgggaatctt ataagttctg tatgagacca 180
ctctttccca 190

Claims (5)

1.一种腺病毒VA RNA核酸，其在5'-至3'-方向上包含
-人类U6 RNA启动子，以及
-SEQ ID NO:38的腺病毒VA RNA编码序列。
2.一种腺病毒VA RNA核酸，其在5'-至3'-方向上包含
-可诱导启动子，以及
-SEQ ID NO:38的腺病毒VA RNA编码序列。
3.一种DNA，其包含
-根据权利要求1或2中任一项所述的腺病毒VA RNA核酸，以及
-DNA元件，所述DNA元件包含
-E1A开放阅读框和E1B开放阅读框；或
-E2A开放阅读框和E4或E4orf6开放阅读框；或
-rep开放阅读框和cap开放阅读框。
4.一种哺乳动物或昆虫细胞，其包含根据权利要求1至2中任一项所述的腺病毒VA RNA核酸或根据权利要求3所述的DNA。
5.一种用于产生重组腺相关病毒颗粒的方法，其包括：
-提供哺乳动物悬浮生长细胞，所述哺乳动物悬浮生长细胞包含
-居于两个AAV ITR之间的转基因表达盒；
-编码腺病毒E1A、E1B、E2A、E4或E4orf6蛋白的开放阅读框；
-根据权利要求1至2中任一项所述的腺病毒VA RNA核酸；
-编码腺相关Rep/Cap蛋白的开放阅读框；
-培养所述哺乳动物细胞；以及
-从所述细胞或培养基分离rAAV颗粒，并且从而产生所述rAAV颗粒。
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