TW202405182A - 生產重組ａａｖ顆粒之方法 - Google Patents

Abstract

本文報導一種生產重組 AAV 顆粒之方法，其包含以下步驟：使用灌流來繁殖哺乳動物細胞直到至少獲得第一預定細胞密度；藉由加入新鮮培養基來稀釋經繁殖的細胞之等分試樣以獲得具有第二預定細胞密度的生產細胞溶液；培養該生產細胞溶液 1 至 36 小時；用編碼該重組 AAV 顆粒的一種或多種核酸直接轉染經培養的生產細胞溶液中的該等細胞；以及培養經轉染的生產細胞溶液 24 至 144 小時，從而生產重組 AAV 顆粒。

Description

生產重組　AAV　顆粒之方法

本發明處於基因治療的領域。更精確而言，本文報導一種生產重組 AAV 顆粒的方法，其中在轉染並瞬時生產重組 AAV 顆粒 (其在不進行灌流的情況下進行) 之前已使用灌流培養細胞。

基因治療廣義上係指治療性投予基因物質以修飾活細胞的基因表現，因而改變其生物學特性。經過數十年的研究，基因治療已進入市場，並預期將變得越來越重要。一般來說，基因療法可分為活體內或離體方法。

目前，大多數活體內療法依賴於使用重組腺相關病毒 (rAAV) 載體進行 DNA 遞送。AAV 是一種小的、天然存在的、非致病性小病毒，其由無套膜之二十面體殼體組成。其包含大約 4.7 kb 之單股 DNA 基因體。野生型 AAV 載體的基因體攜帶兩種基因 rep 及 cap，其側翼是反向末端重複 (ITR)。ITR 對於順式病毒複製及包裝是必需的。rep 基因編碼四種不同的蛋白質，其表現係由兩個可選擇的啟動子 P5 及 P19 所驅動。此外，經由交替剪接產生不同的形式。Rep 蛋白具有多重功能，諸如，例如，DNA 結合、核酸內切酶及解旋酶活性。其在基因調控、位點特異性整合、切除、複製及包裝中發揮作用。cap 基因編碼三個殼體蛋白及一個組裝活化蛋白。藉由使用選擇性剪接及選擇性起始密碼子用法而達成差異表現這些蛋白質，且由位於 rep 基因之編碼區的單一啟動子 P40 驅動表現。

在經工程化之治療性 rAAV 載體中，病毒基因被轉基因表現卡匣替換，該表現卡匣之側翼仍接病毒 ITR，但在所選啟動子之控制下編碼所關注基因。與野生型病毒不同，經工程化 rAAV 載體不經歷位點特異性整合於宿主基因體中，而主要在轉導細胞核中維持游離基因體。

AAV 本身不具有複製能力，但需要輔助基因的功能。此在自然界中由共感染之輔助病毒所提供，諸如，例如腺病毒或單純皰疹病毒。例如，已知五個腺病毒基因，即 E1A、E1B、E2A、E4 及 VA 對 AAV 複製為必要者。與其他編碼蛋白質之輔助基因相比，VA 是一種小 RNA 基因。

為生產 rAAV 載體，將攜帶 ITR 側翼之轉基因的 DNA 導入至包裝宿主細胞株，其亦包含 rep 及 cap 基因以及所需之輔助基因。有許多方法可將這三組 DNA 元件導入至細胞中以及許多方法將其組合到不同 DNA 質體上 (參見，例如，Robert, M.A.等人，Biotechnol. J. 12 (2017) 1600193)。

已廣泛地使用兩種一般生產方法。在三重轉染方法中，包含 rep/cap 的質體及包含 rAAV 轉基因的質體與攜帶所需之腺病毒輔助基因的腺病毒輔助質體瞬時共轉染。該方法可使用 CHO 或 HEK 細胞進行。或者，可將 rep/cap 及病毒輔助基因體合在一個更大的質體上 (雙轉染方法)。第二種方法包括用兩個桿狀病毒感染昆蟲細胞 (Sf9)，一者攜帶 rAAV 基因體而另一者攜帶 rep 及 cap。在該系統中，桿狀病毒質體本身提供輔助功能。同樣地，單純皰疹病毒係與 HEK293 細胞或 BHK 細胞合併使用。最近 Mietzsch 等人 (Hum. Gene Ther. 25 (2014) 212-222; Hum. Gene Ther. Methods 28 (2017) 15-22) 將 rep 及 cap 穩定地整合到經工程化 Sf9 細胞的基因體中。對於這些細胞，攜帶 rAAV 轉基因的單桿狀病毒足以產生 rAAV 載體。Clark 等人 (Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1329-1341) 產生具有將 rep/cap 基因 及 rAAV 轉基因整合至其基因體中的 HeLa 細胞株。經由野生型腺病毒轉染細胞誘導 rAAV 載體的產生，並產生 rAAV 載體及腺病毒的混合原液。

據報導，灌流培養適用於典型的重組蛋白生產 (參見 Woodgate, J.N.，「Biopharmaceutical Processing: Development, Design and Implementation of Manufacturing Processes」(2018)，第 755-768 頁)。對於此類典型重組蛋白生產中的哺乳動物細胞株，細胞培養平均需要在 10 天與 14 天之間的時間以獲得穩定的重組蛋白產物，其中生產生物反應器為規模為 1000 L、100 L、10 L 及 1 L 的一長串種子生物反應器的末端，該等種子生物反應器產生足夠數量的起始細胞，該等起始細胞用於接種生產生物反應器。在達到中期指數增長之前，將細胞不斷地用新細胞培養基稀釋。這確保細胞能夠保持指數增長，因為它們不暴露於營養限制性環境 (例如，其中生長相關胺基酸受到限制) 或有毒環境 (例如，其中代謝副產物諸如乳酸鹽及氨積累至高含量)。

Yang, W.C.等人 (Biotechnol. Prog.30 (2014) 616-625) 藉由使用高細胞密度種子培養物 (400*10^5 個細胞/mL) 以便以高得多的濃度 (標準 100*10^5 個細胞/mL) 接種生產生物反應器，展示了對用於後續標準饋料批次方法的交替切向流 (ATF) 灌流種子培養的概念驗證。他們用兩種表現單株抗體的 CHO 細胞株完成該研究，並表明兩者皆於 12 天而非 17 天內達到其典型的 5 g/L 產物效價，因此在保持 (並且對於一種細胞株改進) 產物品質型態的同時將生產能力提高 30%。

US 6,566,118 報導用於生產高效價、實質上純化的重組腺相關病毒 (AAV) 製劑 (可用為基因遞送之載體) 之方法及組成物。

WO 2020/154607 報導生產腺相關病毒 (AAV) 之方法，該等方法包含在種子培養物中培養 AAV 生產細胞株，然後進行 AAV 生產培養。

本文報導一種使用哺乳動物細胞生產重組 AAV 顆粒的方法，其中該等哺乳動物細胞 i) 在 AAV 顆粒生產之前已在灌流培養中繁殖， ii) 繁殖後已被稀釋/分流至較低之細胞密度，並 iii) 在不進行灌流的情況下經生產重組 AAV 顆粒所需的核酸轉染後進行培養。

本發明至少部分地基於以下發現：較佳係在實際重組 AAV 顆粒生產之前，甚至在經用於生產重組 AAV 顆粒的核酸轉染之前，在灌流培養中繁殖意欲用於生產重組 AAV 顆粒的哺乳動物細胞至少一段時間，此後但在經重組 AAV 顆粒生產所需的核酸轉染之前分流細胞/用新鮮培養基稀釋。

已經發現，藉由使用如本發明進行繁殖的哺乳動物細胞來生產重組 AAV 顆粒，生產培養中的存活細胞密度高於其中當從相同的接種細胞密度開始時使用僅經由饋料批次繁殖的細胞的生產培養。細胞甚至在轉染後短期內進一步繁殖，亦即轉染後細胞密度增加。不受該理論的束縛，認為這是衍生自使用 N-1 灌流的方法的細胞具有更好的代謝條件的結果。因此，細胞可更好地抵抗由轉染產生的緊迫，從而得到更高的重組 AAV 顆粒產量。

在一個態樣中，一種生產重組 AAV 顆粒之方法包括下列步驟：a) 使用灌流來繁殖哺乳動物細胞直到至少獲得/達到第一預定細胞密度；b) 藉由加入新鮮培養基來稀釋在步驟 a) 中所獲得的細胞中的等分試樣/一部分以獲得具有第二預定細胞密度的生產細胞溶液；c) 培養該生產細胞溶液 1 至 36 小時；d) 用編碼該重組 AAV 顆粒的一種或多種核酸直接轉染在步驟 c) 中所獲得的經培養的生產細胞溶液中的該等細胞；e) 培養在步驟 d) 中所獲得的經轉染的生產細胞溶液 24 至 96 小時，從而生產重組 AAV 顆粒。

本發明涵蓋以下獨立態樣及從屬實施例： 1.  一種生產重組 AAV 顆粒之方法，其包含下列步驟： a) 使用灌流來繁殖哺乳動物細胞直到至少 獲得/達到第一預定細胞密度； b) 藉由加入未使用/新鮮培養基來稀釋在步驟 a) 中所獲得的細胞中的等分試樣/一部分以獲得具有第二預定細胞密度的生產細胞溶液； c) 培養該生產細胞溶液 1 至 36 小時； d) 用編碼該重組 AAV 顆粒的一種或多種核酸直接轉染在步驟 c) 中所獲得的經培養的生產細胞溶液中的該等細胞； e) 培養在步驟 d) 中所獲得的經轉染的生產細胞溶液 20 至 240 小時，從而生產重組 AAV 顆粒。 2.  如態樣 1 之方法，其中該第一預定細胞密度為至少 80*10^5 個細胞/mL。 3.  如態樣 1 及實施例 2 之方法，其中該第一預定細胞密度為至少 100*10^5 個細胞/mL。 4.  如態樣 1 或實施例 2 至 3 中任一項之方法，其中該哺乳動物細胞為 CHO 細胞或 HEK 細胞或人羊水細胞。 5.  如態樣 1 或實施例 2 至 4 中任一項之方法，其中該哺乳動物細胞為 CHO-K1 或 HEK293 細胞。 6.  如態樣 1 或實施例 2 至 5 中任一項之方法，其中該一種或多種核酸包含 i) 轉基因，其在 5'- 至 3'-方向包含： α) 第一 ITR 序列； β) 啟動子； γ) 編碼治療分子的核酸序列； δ) 多腺苷酸化訊號序列； ε) 第二 ITR 序列； ii) rep 開讀框； iii) cap 開讀框；以及 iv) 腺病毒 E1A、E1B、E2A、E4orf6 及 VA RNA 開讀框。 7.  如態樣 1 或實施例 2 至 6 中任一項之方法，其中在步驟 b) 中加入 4 倍至 6 倍體積之新鮮培養基之等分試樣。 8.  如態樣 1 或實施例 2 至 7 中任一項之方法，其中在步驟 b) 中加入約 5 倍體積之新鮮培養基之等分試樣。 9.  如態樣 1 或實施例 2 至 8 中任一項之方法，其中該第二預定細胞密度在 10*10^5 個細胞/mL 與 30*10^5 個細胞/mL 之間。 10.如態樣 1 或實施例 2 至 9 中任一項之方法，其中該第二預定細胞密度為約 20*10^5 個細胞/mL。 11.如態樣 1 或實施例 2 至 10 中任一項之方法，其中在步驟 c) 中之該培養為 16 至 30 小時。 12.如態樣 1 或實施例 2 至 11 中任一項之方法，其中該培養為 20 至 28 小時。 13.如態樣 1 或實施例 2 至 12 中任一項之方法，其中該培養為約 24 小時。 14.如態樣 1 或實施例 2 至 13 中任一項之方法，其中在步驟 e) 中之該培養為批式培養。 15.如態樣 1 或實施例 2 至 14 中任一項之方法，其中在步驟 e) 中之該培養為約 24 至 144 小時。 16.如態樣 1 或實施例 2 至 15 中任一項之方法，其中在步驟 e) 中之該培養為約 48 至 120 小時。 17.如態樣 1 或實施例 2 至 16 中任一項之方法，其中該培養為約 60 至 96 小時。 18.如態樣 1 或實施例 2 至 17 中任一項之方法，其中該培養為約 72 小時。 19.如態樣 1 或實施例 2 至 18 中任一項之方法，其中步驟 e) 沒有進料 (feeding)。 20.如態樣 1 或實施例 2 至 19 中任一項之方法，其中該方法進一步包含以下步驟： f) 從步驟 e) 之經培養的溶液中收穫該等細胞； g) 裂解在步驟 f) 中所獲得的該等細胞； h) 將 AAV 顆粒從在步驟 g) 中所獲得的經裂解的細胞中分離； i) 視情況純化該等 AAV 顆粒。 21.如態樣 1 或實施例 2 至 20 中任一項之方法，其中在步驟 c) 之後的細胞密度為 35 至 40*10^5 個細胞/ml。 22.如態樣 1 或實施例 2 至 21 中任一項之方法，其中在步驟 c) 之後且在步驟 d) 之前進行下列步驟 cd)： cd) 加入額外的約 20% 初始培養體積的新鮮培養基。 23.如態樣 1 或實施例 2 至 22 中任一項之方法，其中該轉染係藉由添加呈 PEI 複合核酸及游離 PEI 之混合物之一種或多種核酸。 24.如態樣 1 或實施例 2 至 23 中任一項之方法，其中該轉染係在 5 mM 丙戊酸之最終濃度的存在下。 25.哺乳動物細胞用於生產重組 AAV 顆粒之用途，其中該哺乳動物細胞在經所有 AAV 顆粒編碼核酸轉染之前已使用灌流繁殖。 26.用如態樣 1 或實施例 2 至 24 中任一項之方法所獲得的哺乳動物細胞用於生產重組 AAV 顆粒之用途。

除所描繪和要求保護的各種實施例之外，本文所揭示之主題還涉及具有本文所揭示和要求保護的特徵的其他組合的其他實施例。因此，本文所呈現之特定特徵可在本文所揭示之標的範圍內以其他方式彼此組合，使得本文所揭示之主題包括本文所揭示之特徵的任何合適的組合。出於說明和描述的目的，已經提供了本文所揭示之主題的特定實施例的前述描述。其並非旨在窮舉或將本文所揭示之標的限制為所揭示的那些實施例。

定義

用於進行本發明的有用方法和技術描述於例如 Ausubel, F.M.(ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997); Glover, N.D., 及 Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985), Oxford University Press; Freshney, R.I.(ed.), Animal Cell Culture – a practical approach, IRL Press Limited (1986)；Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992)；Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987)；Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998)；Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y.(1987)。

使用重組 DNA 技術能產生核酸衍生物。此類衍生物可例如在個別或數個核苷酸位置藉由取代、改變、交換、缺失或插入而修飾。修飾或衍生化可例如藉由定點誘變的方式進行。此類修飾可容易地由熟習此項技術者進行 (參見例如 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA；Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization – a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England)。

亦必須注意，除非上下文另有明確規定，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」、「一種」及「該」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「一個細胞」包括複數個此類細胞及熟習此項技術者已知之其等效物，諸如此類。同樣，術語「一」 (或「一種」)、「一個或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。亦應注意，術語「包含」、「包括」及「具有」可互換使用。

去氧核糖核酸包含編碼股及非編碼股。本文所用之術語「5’」及「3’」是指編碼股上的位置。

術語「3' 側翼序列」表示位於核苷酸序列 3' 端 (下游；下方) 處的序列。

術語「5' 側翼序列」表示位於核苷酸序列 5' 端 (上游，上方) 處的序列。

亦必須注意，除非上下文另有明確規定，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」、「一種」及「該」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「一個細胞」包括複數個此類細胞及熟習此項技術者已知之其等效物，諸如此類。同樣，術語「一」 (或「一種」)、「一個或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。亦應注意，術語「包含」、「包括」及「具有」可互換使用。

術語「AAV 輔助功能」表示 AAV 衍生的編碼序列 (蛋白質)，其可經表現以提供 AAV 基因產物及 AAV 顆粒，而 AAV 顆粒另一方面以反式作用於生產 AAV 複製及包裝。因此，AAV 輔助功能包括 AAV 開讀框 (ORF)，其包括 rep 及 cap 及其他例如某些 AAV 血清型的 AAP。rep 基因表現產物已被證明具有許多功能，其中包括：識別、結合及切口 DNA 複製之 AAV 起始點；DNA解旋酶活性；及調節來自 AAV (或其他異源性) 啟動子的轉錄。cap 基因表現產物 (殼體) 提供必要的包裝功能。AAV 輔助功能用於補充 AAV 載體基因體中缺失之反式 AAV 功能。

術語「約」表示其後接著之數值 +/-20% 的範圍。在某些實施例中，術語約表示其後數值之 +/- 10% 的範圍。在某些實施例中，術語約表示其後數值之 +/- 5 % 的範圍。

術語「批式培養」係其中所有用於細胞培養的組分 (包括細胞及所有培養營養素) 皆在培養過程開始時供應至培養生物反應器中的培養。

如本文所用，術語「包含」、「包括」、「具有 (having、has)」、「可」、「含有」及其變體意欲為不排除其他行為或結構之可能性之開放式連接詞 (open-ended transitional phrase)、術語、或字。  術語「包含」亦包括術語「由…組成」。本揭露亦涵蓋「包含」本文所呈現之實施例或元件、「由其組成」及「基本上由其組成」之本文所呈現之實施例或元件，無論是否明確陳述。

本文中的術語「培養」係指在細胞被轉染及生產 AAV 顆粒的條件下將細胞維持在培養基中的步驟。

術語「空殼體」及「空顆粒」是指具有 AAV 蛋白殼但其全部或部分地缺乏編碼蛋白質或被轉錄成側翼為 AAV ITR 之所關注轉錄物之核酸的 AAV 顆粒，即載體。因此，空殼體不會將編碼蛋白質之核酸或被轉錄成所關注轉錄物的核酸轉移到宿主細胞中。

術語「內源」表示在細胞內天然發生的；由細胞天然地產生；同樣地，「內源基因座/細胞內源基因座」是細胞中天然存在的基因座。

如本文所用，術語「外源」是指核苷酸序列並非源自特定細胞，而是藉由 DNA 遞送方法導入該細胞中，例如經由病毒載體之轉染、電穿孔或轉導方法。因此，外源核苷酸序列是人工序列，其中人工性可能起源於例如不同起源之子序列的組合 (例如，具有 SV40 啟動子之重組酶辨識序列與綠色螢光蛋白之編碼序列是人工核酸) 或起源於序列之部件的缺失 (例如，僅編碼膜結合受體之細胞外域之序列或 cDNA) 或核酸鹼基之突變。術語「內源」是指源自細胞的核苷酸序列。「外源」核苷酸序列可具有在鹼基組成上相同的「內源」對應物，但是其中序列 (例如經由重組 DNA 技術)被導入細胞中而成為「外源」序列。

如本文所用之術語「饋料批次細胞培養」係指如下批式培養：首先將細胞及培養基供應至培養生物反應器中，且在培養過程期間連續或不連續地將額外的培養營養素供給至培養物中，在培養結束之前進行或不進行定期的細胞及/或產物收穫。

「分離的」組合物是指已從其自然環境之一種或多種組分中分離出來的抗體。在一些實施例中，將組合物純化至大於 95 % 或 99 % 的純度，係藉由 (例如) 電泳 (例如 SDS-PAGE、等電位聚焦 (IEF)、毛細管電泳、CE-SDS) 或層析 (例如粒徑篩析層析或離子交換或反相 HPLC) 所測定。對於例如抗體純度之審查評估方法，參見，例如，Flatman, S. 等人，J. Chrom.B 848 (2007) 79-87。

「分離的」核酸是指已從其自然環境之一種或多種組分中分離出來的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。

「分離的」多肽或抗體是指已從其自然環境之一種或多種組分中分離出來的多肽分子或抗體分子。

術語「包含外源核苷酸序列之哺乳動物細胞」涵蓋已被導入一種或多種外源核酸的細胞，包括此類細胞的子代。這些細胞可作為進一步基因修飾的起點。因此，術語「包含外源核苷酸序列之哺乳動物細胞」涵蓋包含整合至該乳動物細胞基因體之基因座內單一位點之外源核苷酸序列的細胞，其中該外源核苷酸序列包含位於至少一個第一選擇標記之側翼的至少第一重組識別位點及第二重組識別位點 (這些重組識別位點為不同)。在某些實施例中，包含外源核苷酸序列之哺乳動物細胞為包含整合至該宿主細胞基因體之基因座內單一位點處之外源核苷酸序列的細胞，其中該外源核苷酸序列包含位於至少一個第一選擇標記之側翼的第一重組識別序列及第二重組識別位點，以及位於該第一重組識別序列與該第二重組識別序列之間的第三重組識別序列，且所有重組識別序列皆不相同。

「包含外源核苷酸序列之哺乳動物細胞」與「重組細胞」皆為「轉染細胞」。此術語包括原代轉染細胞及從其衍生的子代，而與繼代次數無關。例如，子代在核酸含量上可與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。涵蓋與原始轉染之細胞具有相同功能或生物活性的突變子代。

「編碼 AAV 包裝蛋白之核酸」通常是指一種或多種核酸分子，其包括提供自 AAV 載體中缺失之 AAV 功能的核苷酸序列，其係用於產生轉導潛能之重組 AAV 顆粒。編碼 AAV 包裝蛋白之核酸通常用於提供表現 AAV rep 及/或 cap 基因，以補充 AAV 複製所需之缺失的 AAV 功能；然而，核酸構建體缺乏 AAV ITR，既無法複製亦無法自行包裝。編碼 AAV 包裝蛋白之核酸可為質體、噬菌體、轉座子、黏接質體、病毒或顆粒的形式。已描述許多核酸構建體，例如常用的質體 pAAV/Ad 及 pIM29+45，其編碼 rep 及 cap 基因兩者之表現產物。參見，例如，Samulski 等人 (1989) J. Virol。 63:3822-3828；及 McCarty 等人 (1991) J. Virol. 65:2936-2945。已經描述許多編碼 rep 及/或 cap 基因表現產物的質體 (例如，US 5,139,941 及US 6,376,237)。這些編碼 AAV 包裝蛋白之核酸中的任一者皆可包含根據本發明之 DNA 元件或核酸。

術語「編碼輔助蛋白之核酸」通常是指一個或多個核酸分子，其包括編碼提供腺病毒輔助功能之蛋白及/或 RNA 分子的核苷酸序列。可將具有編碼輔助蛋白之核酸的質體轉染到合適的細胞中，其中該質體然後能夠支持在該細胞中產生 AAV 顆粒。這些編碼輔助蛋白之核酸中的任一者皆可包含根據本發明之 DNA 元件或核酸。該術語明確排除傳染性病毒顆粒，因其存在於自然界中，例如腺病毒、皰疹病毒或牛痘病毒顆粒。

如本文所用，術語「可操作地連接」係指兩個或更多個組分的並置，其中組分處於使其能夠以預期方式起作用的關係。例如，如果啟動子及/或增強子起到調節編碼序列/開讀框/基因之轉錄的作用，則該啟動子及/或該增強子可操作地連接至該編碼序列/開讀框/基因。在某些實施例中，「可操作地連接」的 DNA 序列為連續的。在某些實施例中，例如，當需要連接兩個蛋白編碼區 (例如分泌前導子及多肽) 時，序列為連續的且在相同的讀框中。在某些實施例中，可操作地連接的啟動子位於編碼序列/開讀框/基因的上游，且可與其相鄰。在某些實施例中，例如，關於調節編碼序列/開讀框/基因之表現的增強子序列，雖然兩種組分不相鄰，但可為可操作地連接。如果增強子增加編碼序列/開讀框/基因的轉錄，則增強子可操作地連接至該編碼序列/開讀框/基因。可操作地連接的增強子可位於編碼序列/開讀框/基因的上游、內部或下游，且可位於距該編碼序列/開讀框/基因之啟動子相當遠的距離。

術語「包裝蛋白」是指非 AAV 衍生之病毒及/或細胞功能，AAV 其複製依賴這些功能。因此，該術語涵蓋 AAV 複製所需的蛋白質及 RNA，包括參與 AAV 基因轉錄之活化、階段特異性 AAV mRNA 剪接、AAV DNA 複製、Cap 表現產物合成及 AAV 殼體組裝之部分。基於病毒的輔助功能可源自任何已知的輔助病毒，例如腺病毒、皰疹病毒 (單純皰疹病毒 I 型除外) 及牛痘病毒。

如本文所用，「AAV包裝蛋白」是指 AAV 衍生的序列，其在反式中用於生產性 AAV 複製具有功能。因此，AAV 包裝蛋白由主要的 AAV 開讀框 (ORF)、rep 及 cap 所編碼。rep 蛋白已被證明具有許多功能，其中包括：識別、結合及切口 DNA 複製之 AAV 起始點；DNA解旋酶活性；及調節來自 AAV (或其他異源性) 啟動子的轉錄。cap (殼體) 蛋白提供必要的包裝功能。本文所述之 AAV 包裝蛋白用於補充 AAV 載體中缺失之反式 AAV 功能。

如本文所用，「灌流」或「灌流培養」有時亦稱為連續培養，其係 如下培養：藉由例如過濾、囊封、錨定至微載體等將細胞限制於培養物中，且在培養生物反應器中連續、逐步或間歇性地引入 (或該等方式之任何組合) 及去除培養基。

術語「繁殖」及「預培養」在本文中可互換使用，並且係指增加細胞培養物中細胞數量的步驟，從用等分試樣之細胞接種新鮮培養基開始，並維持培養條件以進行細胞生長 (在一個較佳之實施例中，以指數方式生長)，並分裂直至達到所需之細胞密度 (亦即，第一預定細胞密度)。一般而言，細胞可使用不同的方法諸如批式培養、饋料批次培養或灌流培養進行繁殖。術語「繁殖」包括在繁殖期間分流細胞，亦即藉由去除含有細胞的培養基之等分試樣並將其替換為/加入新鮮培養基之等分試樣來減少細胞數量 (細胞密度)。

如本文所用，術語「蛋白質化合物」表示包含至少一種多肽的異源多聚體分子，其已在哺乳動物細胞中以功能形式產生。例示性蛋白質化合物為腺相關病毒顆粒 (AAV 顆粒)，其包含由殼體多肽及單股 DNA 分子形成的殼體，其為非多肽組分。

如本文所用，術語「重組細胞」表示最終基因修飾後的細胞，例如，舉例而言，表現所關注多肽或生產 rAAV 顆粒，並可用於以任何規模生產該所關注多肽或 rAAV 顆粒的細胞。例如，「包含外源核苷酸序列的哺乳動物細胞」已進行重組酶介導的盒式交換 (RMCE)，從而將用於所關注多肽的編碼序列導入宿主細胞的基因體中，即為「重組細胞」。儘管細胞仍能進行進一步的 RMCE 反應，但其並不欲進行。

「重組 AAV 載體」源自病毒 (例如 AAV) 的野生型基因體，經由使用分子生物學方法從病毒 (例如 AAV) 中移除野生型基因體，將其以非天然核酸 (例如轉錄成轉錄物或編碼蛋白質的核酸) 替代。通常，對於 AAV，野生型 AAV 基因體的一個或兩個反向末端重複 (ITR) 序列保留在重組 AAV 載體中。「重組」AAV 載體與野生型病毒 AAV 基因體不同，因為病毒基因體的全部或部分已被相對於病毒基因體核酸之非天然 (即異源) 序列所替換。因此，將併入非天然序列之病毒載體 (例如，AAV) 定義為「重組」載體，其在 AAV 的情況下可稱為「rAAV 載體」。

重組載體 (例如，AAV) 序列可經包裝，在本文中稱為「顆粒」，其用於隨後在離體、活體外或活體內感染細胞 (轉導)。當重組載體序列被囊裝或包裝到 AAV 顆粒中時，該顆粒亦可稱為「rAAV」。此類顆粒包括囊裝或包裝載體基因體的蛋白質。具體實例包括病毒套膜蛋白，在 AAV 的情況下，包括殼體蛋白，例如 AAV VP1、VP2 及 VP3。

如本文所使用，術語「選擇標記」表示一種基因，其允許攜帶該基因的細胞在對應的選擇劑的存在下被特異性地選擇或排除。例如，但並非限制性地，選擇標記可允許以選擇標記基因轉化的宿主細胞在各別的選擇劑存在下 (選擇性培養條件) 被明確選擇；未轉化的宿主細胞將不能在選擇性培養條件下生長或存活。選擇標記可為陽性、陰性或雙功能選擇標記。陽性選擇標記可選擇帶有標記的細胞，而陰性選擇標記則可以選擇性排除帶有標記的細胞。選擇標記可導致藥物抗性或補償宿主細胞中之代謝或分解代謝缺陷。在原核細胞中，可使用導致對氨芐青黴素、四環素、卡那黴素或氯黴素抗性的基因。在真核細胞中用作選擇標記的抗性基因包括但不限於胺基糖苷磷酸轉移酶 (APH) (例如，潮黴素磷酸轉移酶 (HYG)、新黴素和 G418 APH)、二氫葉酸還原酶 (DHFR)、胸苷激酶 (TK)、谷胺酰胺合成酶 (GS)、天冬酰胺合成酶、色胺酸合成酶 (吲哚)、組胺醇脫氫酶 (組胺醇 D) 以及編碼對嘌呤黴素、殺稻瘟素、博萊黴素、腐草黴素、氯黴素、Zeocin 和黴酚酸的抗性的基因。更多標記基因描述於 WO 92/08796 和 WO 94/28143 中。

除了在對應的選擇劑存在下促進選擇外，選擇標記另可為通常不存在於細胞中的分子，例如綠色螢光蛋白 (GFP)、增強型 GFP (eGFP)、合成 GFP、黃色螢光蛋白 (YFP)、增強型 YFP (eYFP)、青色螢光蛋白 (CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed-monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean 及 T-Sapphire。表現此類分子的細胞可與不攜帶此基因的細胞區別，例如分別藉由檢測或不存在編碼的多肽所發出的螢光。

如本文所用，術語「血清型」是基於不同血清學之 AAV 殼體的區別。血清學獨特性是根據抗體對一個 AAV 與另一個 AAV 之間缺乏交叉反應性所判定。此種交叉反應性之差異通常是由於殼體蛋白序列/抗原決定基之差異 (例如，由於 AAV 血清型之 VP1、VP2 及/或 VP3 序列差異)。雖然包括殼體變異體之 AAV 變異體可能在血清學上與參考 AAV 或其他 AAV 血清型沒有差異，但與參考或其他 AAV 血清型相比，其有至少一個核苷酸或胺基酸殘基不同。

在傳統定義下，血清型代表所關注病毒已針對所有存在及特徵血清型之特異性血清進行中和活性測試，且未發現中和所關注病毒的抗體。隨著發現更多天然病毒分離株及/或產生殼體突變體，與目前存在之任何血清型可能存在或不存在血清學差異。因此，在新病毒 (例如 AAV) 不具血清學差異的情況下，此種新病毒 (例如 AAV) 為相應血清型的亞組或變異體。在許多情況下，尚未對具有殼體序列修飾之突變病毒進行中和活性的血清學測試以判定其是否屬於根據傳統血清型定義的另一種血清型。因此，為方便及避免重複，術語「血清型」泛指血清學上不同的病毒 (例如 AAV) 以及血清學上不明顯的病毒 (例如 AAV) ，其可為在亞組內或給定血清型的變異體。

術語「轉導」及「轉染」是指將分子如核酸 (病毒載體、質體) 導入至細胞中。當外源核酸已被導入至細胞膜內時，則細胞已被「轉導」或「轉染」。因此，「轉導細胞」是「核酸」或「多核苷酸」已被導入其中的細胞，或其已導入外源核酸的子代。在特定實施例中，「轉導」細胞 (例如，在哺乳動物中，諸如細胞或組織或器官細胞) 在併入外源分子例如核酸 (例如轉基因) 後，具有基因變化。「轉導」細胞可繁殖且轉錄導入之核酸及/或表現蛋白質。

在「轉導」或「轉染」細胞中，核酸 (病毒載體、質體) 可或可不整合到基因體核酸中。如果導入之核酸整合到受體細胞或生物體的核酸 (基因體 DNA) 中，則其可在該細胞或生物體中穩定地維持，並進一步遞送給受體細胞或生物體之子代細胞或生物體或由其遺傳。最後，導入的核酸可存在於受體細胞或宿主生物體中之染色體外或僅暫態地存在。有許多已知的技術，參見例如 Graham 等人，(1973) Virology, 52:456; Sambrook 等人，(1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York；Davis 等人，(1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier；及 Chu 等人，(1981) Gene 13:197。此類技術可用於將一種或多種外源 DNA 部分導入到合適的宿主細胞。

如本文所用，術語「轉基因」方便地指所欲或已被導入到細胞或生物體的核酸。轉基因包括任何核酸，例如被轉錄成轉錄物或其編碼多肽或蛋白質的基因。

「載體」是指重組質體序列的一部分，最終直接的或以單股或 RNA 的形式包裝或囊裝，以形成病毒 (例如 AAV) 顆粒。在重組質體用於構建或製備重組病毒顆粒的情況下，病毒顆粒不包括未對應該重組質體之載體序列的「質體」部分。重組質體之此非載體部分被稱為「質體骨架」，其對質體的選殖及擴增很重要，其為繁殖及重組病毒生產所需的過程，但本身並不包裝或囊裝到病毒 (例如，AAV) 顆粒中。因此，「載體」是指被病毒顆粒 (例如，AAV) 包裝或囊裝的核酸。

重組細胞株生成

一般而言，對於有效及大規模生產所關注蛋白質化合物 (例如對於 rAAV 顆粒或治療性多肽)，需表現且如果可能亦分泌該蛋白質化合物的細胞。此種細胞被稱為「重組細胞」或「重組生產細胞」。

在第一步中，將編碼所關注該蛋白質化合物之所需核酸序列轉染合適的宿主細胞。可能需要轉染額外的輔助多肽。

為表現編碼序列 (即開讀框)，需額外的調控元件，諸如啟動子及多腺苷酸化訊號 (序列)。因此，開讀框可操作地連接至該額外的轉錄調控元件。此可經由將其整合到所謂的表現卡匣中來達成。表現卡匣在哺乳動物細胞中具有功能而所需的最小調控元件為在該哺乳動物細胞中具有功能的啟動子，其位於開讀框的上游 (即 5')，以及在該哺乳動物細胞中具有功能的多腺苷酸化訊號序列，其位於開讀框的下游 (即 3')。此外，終止子序列可能存在於多腺苷酸化訊號 (序列) 的 3' 端。為達到表現，啟動子、開讀框/編碼區及多腺苷酸化訊號序列須以可操作地連接的形式排列。

同樣地，被轉錄成非蛋白質編碼 RNA 的核酸稱為「RNA 基因」。對於 RNA 基因的表現，亦需要額外的調控元件，諸如啟動子及轉錄終止訊號或多腺苷酸化訊號 (序列)。這些元件的性質及定位取決於所欲驅動表現 RNA 基因的 RNA 聚合酶。因此，RNA 基因通常亦被整合到表現卡匣中。

如果所關注蛋白質化合物為 AAV 顆粒 (它由不同的 (單體) 多肽及單股 DNA 分子組成，且亦需要其他輔助因子來生產及囊裝)，則需要許多表現卡匣，其包含之開讀框/編碼序列是不同的。在此種情況下，至少需要用於所需輔助功能以及VA RNA 之每個轉基因的表現卡匣，形成AAV 載體之殼體的不同多肽。因此，每個輔助 E1A、E1B、E2A、E4orf6、VA RNA、rep 及 cap 基因都需要單獨的表現卡匣。

如前幾段所述，所關注蛋白質化合物越複雜或所需之額外輔助多肽及/或 RNA 的數量分別越多，則所需之不同表現卡匣的數量就越多。本質上隨著表現卡匣的數量增加，整合到宿主細胞基因體中的核酸的大小也會增加。然而，可轉移之核酸大小實際上有上限，其為約 15 kbps (千鹼基對) 之範圍。超過這個限度，處理及加工效率將大幅降低。此問題可藉由使用兩個或多個分開之核酸來解決。因此，不同的表現卡匣被分配給不同的核酸，由此每個核酸僅包含一些表現卡匣。

重組細胞

一般而言，對於有效及大規模生產所關注蛋白質化合物 (例如對於 rAAV 顆粒或治療性多肽)，需表現且如果可能亦分泌該蛋白質化合物的細胞。此種細胞被稱為「重組細胞」或「重組生產細胞」。

為產生「重組生產細胞」，將編碼所關注蛋白質化合物之所需核酸序列轉染合適的宿主細胞。可能需要轉染額外的輔助多肽。

為產生穩定的重組生產細胞，接下來是第二步，其中選擇穩定表現所關注蛋白質化合物的單個細胞。此可例如基於共表現選擇標記的來達成，該選擇標記已與編碼所關注蛋白質化合物之核酸序列共轉染，或者為蛋白質化合物本身之表現。

為表現編碼序列 (即開讀框)，需額外的調控元件，諸如啟動子及多腺苷酸化訊號 (序列)。因此，開讀框可操作地連接至該額外的轉錄調控元件。此可經由將其整合到所謂的表現卡匣中來達成。表現卡匣在哺乳動物細胞中具有功能而所需的最小調控元件為在該哺乳動物細胞中具有功能的啟動子，其位於開讀框的上游 (即 5')，以及在該哺乳動物細胞中具有功能的多腺苷酸化訊號序列，其位於開讀框的下游 (即 3')。此外，終止子序列可能存在於多腺苷酸化訊號 (序列) 的 3' 端。為達到表現，啟動子、開讀框/編碼區及多腺苷酸化訊號序列須以可操作地連接的形式排列。

同樣地，被轉錄成非蛋白質編碼 RNA 的核酸稱為「RNA 基因」。對於 RNA 基因的表現，亦需要額外的調控元件，諸如啟動子及轉錄終止訊號或多腺苷酸化訊號 (序列)。這些元件的性質及定位取決於所欲驅動表現 RNA 基因的 RNA 聚合酶。因此，RNA 基因通常亦被整合到表現卡匣中。

如果所關注蛋白質化合物為 AAV 顆粒 (它由不同的 (單體) 殼體多肽及單股 DNA 分子構成，且亦需要其他腺病毒輔助功能來生產及囊裝)，則需要許多表現卡匣，其包含之開讀框/編碼序列是不同的。在此種情況下，至少需要用於所需輔助功能以及VA RNA 之每個轉基因的表現卡匣，形成AAV 載體之殼體的不同多肽。因此，每個輔助 E1A、E1B、E2A、E4orf6、VA RNA、rep 及 cap 基因都需要單獨的表現卡匣。

如前幾段所述，所關注蛋白質化合物越複雜或所需之額外輔助多肽及/或 RNA 的數量分別越多，則所需之不同表現卡匣的數量就越多。固有地與表現卡匣之數量有關，亦與核酸之總尺寸有關。然而，可轉移之核酸大小實際上有上限，其為約 15 kbps (千鹼基對) 之範圍。超過這個限度，處理及加工效率將大幅降低。此問題可藉由使用兩個或多個分開之質體來解決。因此，不同的表現卡匣被分配給不同的質體，由此每個質體僅包含一些表現卡匣。

對於穩定的細胞株開發，可使用攜帶所關注蛋白質化合物之表現卡匣之核酸的隨機整合 (RI)。通常，經由使用 RI，核酸或其片段會隨機整合到宿主細胞的基因體中。

或者，對於 RI，靶向整合 (TI) 可用於 CLD。在 TI CLD 中，一種或多種包含不同表現卡匣的核酸被導入至宿主細胞基因體中的預定基因座。

在 TI 中，同源重組或重組酶介導的卡匣交換反應 (RMCE) 可用於將包含對應表現卡匣之核酸 (a) 整合到 TI 宿主細胞基因體中的特定基因座中。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，每個表現卡匣自 5' 到 3' 方向包含啟動子、開讀框/編碼序列或 RNA 基因及多腺苷酸化訊號序列及/或終止子序列。在某些實施例中，開讀框編碼多肽，且表現卡匣包含具有或不具有額外終止子序列的多腺苷酸化訊號序列。在某些實施例中，表現卡匣包含 RNA 基因，啟動子為第 2 型 Pol III 啟動子且存在多腺苷酸化訊號序列或 polyU 終止子。參見，例如，Song 等人，Biochemical and Biophysical Research Communications 323 (2004) 573–578。在某些實施例中，表現卡匣包含RNA 基因，啟動子為第 2 型 Pol III 啟動子及 polyU 終止子序列。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，開讀框編碼多肽，啟動子為具有或不具有內含子 A 的人類 CMV 啟動子，多腺苷酸化訊號序列為 bGH (牛生長激素) polyA 訊號序列且終止子為 hGT (人類胃泌素終止子)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，啟動子為具有內含子A的人類 CMV 啟動子，多腺苷酸化訊號序列為 bGH 多腺苷酸化訊號序列且終止子為 hGT，除了 RNA 基因之表現卡匣及選擇標記之表現卡匣，其中對於選擇標記，啟動子為 SV40 啟動子，且多腺苷酸化訊號序列為 SV40 多腺苷酸化訊號序列，且不存在終止子，且其中對於 RNA 基因，啟動子為野生型第 2 型聚合酶 III 啟動子且終止子為聚合酶 II 或 III 終止子。

須指出，在某些實施例中，本發明不涵蓋包含腺病毒基因功能 E1A 及 E1B 之核酸序列及伴隨地 SV40 大 T 抗原或艾司坦-巴爾病毒 (EBV) 核抗原 1 (EBNA-1) 之核酸序列的永久性人類細胞株。

腺相關病毒 (AAV)

對於 AAV 及腺病毒或皰疹病毒輔助功能的一般回顧，參見 Berns and Bohensky, Advances in Virus Research, Academic Press., 32 (1987) 243-306。AAV 的基因體係在 Srivastava 等人，J. Virol.，45 (1983) 555-564 中描述。在 US 4,797,368 中，描述針對構建重組 AAV 載體的設計考慮 (亦參見 WO 93/24641)。描述 AAV 載體的其他參考文獻為 West 等人，Virol. 160 (1987) 38-47；Kotin，Hum. Gene Ther. 5 (1994) 793-801；及 Muzyczka，J. Clin. Invest. 94 (1994) 1351。在 US 5,173,414；Lebkowski 等人，Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 3988-3996；Tratschin 等人，Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 3251-3260；Tratschin 等人，Mol. Cell. Biol., 4 (1994) 2072-2081；Hermonat 及 Muzyczka，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6466-6470；Samulski 等人，J. Virol. 63 (1989) 3822-3828 中，描述重組 AAV 載體的構建。

腺相關病毒 (AAV) 是一種複製缺陷型小病毒。其只能在細胞中複製，其中某些病毒功能由共同感染之輔助病毒提供，諸如腺病毒、皰疹病毒以及在某些情況下，痘病毒例如牛痘。儘管如此，只要存在適當的輔助病毒功能，AAV 幾乎可在任何人類、猿類或囓齒動物來源之細胞株中複製。

如果不存在輔助病毒基因，AAV 會在其宿主細胞中建立潛伏期。其基因體整合到 19 號染色體 [(Chr) 19 (q13.4)] 中的特定位點，其稱為腺相關病毒整合位點 1 (AAVS1)。對於特定的血清型 (例如 AAV-2)，已發現其他整合位點，例如，舉例而言，在染色體 5 [(Chr) 5 (p13.3)] 上，稱為 AAVS2，以及在染色體 3 [(Chr) 3 (p24.3)] 上，稱為 AAVS3。

AAV 係歸類成不同的血清型。這些已根據參數進行分配，例如紅血球凝集、致腫瘤性及 DNA 序列同源性。目前為止，已鑑別出 10 多種不同的血清型及一百多種對應於不同 AAV 演化枝的序列。

殼體蛋白的類型及對稱性決定相應 AAV 的組織向性。例如，AAV-2、AAV-4 及 AAV-5 對視網膜具特異性，AAV-2、AAV-5、AAV-8、AAV-9 及 AAVrh-10 對腦具特異性，AAV-1、AAV-2 、AAV-6、AAV-8 及 AAV-9 對心臟組織具特異性，AAV-1、AAV-2、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9 及 AAV-10 對肝臟具特異性，AAV-1、AAV-2、AAV-5 及 AAV-9 對肺具特異性。

假型分型 (Pseudotyping) 表示一種包含 AAV 基因體在各種血清型之間交叉包裝的方法，即基因體以不同來源的殼體蛋白包裝。

野生型 AAV 基因體的大小約為 4.7 kb。AAV 基因體亦包含名為 rep 及 cap 的兩個重疊基因，其包含多個開讀框 (參見，例如，Srivastava 等人，J. Viral.，45 (1983) 555-564；Hermonat 等人，J. Viral.51 (1984) 329-339；Tratschin 等人，J. Virol., 51 (1984) 611-619)。Rep 蛋白編碼開讀框提供四種不同大小的蛋白，稱為 Rep78、Rep68、Rep52 及 Rep40。這些蛋白涉及 AAV 的複製、修復及整合。Cap 蛋白編碼開讀框提供四種蛋白質，其為 VP1、VP2、VP3 及 AAP。VP1、VP2 及 VP3 為 AAV 顆粒之蛋白質殼體的一部分。組合之 rep 及 cap 開讀框在其 5' 及 3' 末端的側翼為所謂的反向末端重複 (ITR)。針對複製，除 Rep 及 Cap 蛋白外，AAV 亦需要基因 E1A、E1B、E4orf6、E2A 及 VA 之產物或另一種輔助病毒之對應因子。

例如，在血清型 2 (AAV-2) 的 AAV 的情況下，每個 ITR 的長度為 145 個核苷酸，且位於約 4470 個核苷酸之編碼序列區的側翼。ITR 的 145 個核苷酸中，有 125 個核苷酸具有回文序列且可形成 T 形髮夾結構。此種結構在病毒複製過程中具有引子的功能。剩餘之 20 個未配對的核苷酸以 D 序列表示。

AAV 基因體包含三個用於表現 rep 及 cap 基因的轉錄啟動子 P5、P19 及 P40 (Laughlin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 5567-5571)。

ITR 序列必須與編碼區以順式存在。ITR 提供具功能之複製起點 (ori)、整合到標靶細胞之基因體所需的訊號，以及自宿主細胞染色體或重組質體中之有效切除及修復。ITR 進一步包含類複製起始元件，例如 Rep 蛋白結合位點 (RBS) 及末端解析位點 (TRS)。已發現 ITR 本身可具有 AAV 載體中轉錄啟動子的功能 (Flotte 等人，J. Biol. Chem. 268 (1993) 3781-3790；Flotte 等人，Proc. Natl. Acad . Sci. USA 93 (1993) 10163-10167)。

對於複製及殼體化病毒單股 DNA 基因體，分別需要 rep 及 cap 基因產物的反式結構。

rep 基因座包含兩個內部啟動子，稱為 P5 及 P19。其包含四種蛋白質的開讀框。啟動子 P5 係可操作地連接至提供編碼 Rep 蛋白 Rep78 (阻滯細胞週期的染色質切口酶) 之非經剪接 4.2 kb mRNA 及編碼 Rep 蛋白 Rep68 (位點特異性核酸內切酶) 之經剪接 3.9 kb mRNA 的核酸序列。啟動子 P19 係可操作地連接至提供編碼 Rep 蛋白 Rep52 之非經剪接 mRNA 及編碼 Rep 蛋白 Rep40 之經剪接 3.3kb mRNA (用於積累及包裝的 DNA 解旋酶) 的核酸序列。

兩個較大的 Rep 蛋白 Rep78 及 Rep68 對 AAV 雙股 DNA 複製為必要，而較小的 Rep 蛋白 Rep52 及 Rep40 似對子代、單股 DNA 積累為必要 (Chejanovsky & Carter, Virology 173 (1989) 120-128)。

較大的 Rep 蛋白 Rep68 及 Rep78 可特異性地結合至 AAV ITR 的髮夾構型。其表現出確定的酶活性，其為解決 AAV 末端複製所需。表現 Rep78 或 Rep68 足以形成感染性顆粒 (Holscher, C. 等人，J. Virol. 68 (1994) 7169-7177 及 69 (1995) 6880-6885)。

認定所有 Rep 蛋白 (主要為 Rep78 及 Rep68) 都表現出調節活性，例如 AAV 基因之誘導及抑制以及對細胞生長的抑制作用 (Tratschin 等人，Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 2884-2894；Labow 等人，Mol. Cell. Biol., 7 (1987) 1320-1325；Khleif 等人，Virology, 181 (1991) 738-741)。

重組過表現 Rep78 造成具減少之細胞生長的表型，係由於誘導 DNA 損傷。由此宿主細胞在 S 期阻滯，從而促進病毒的潛伏感染 (Berthet, C. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 13634-13639)。

Tratschin 等人報導，P5 啟動子受到 Rep78 或 Rep68 的負自動調節 (Tratschin 等人，Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 2884-2894)。由於表現 Rep 蛋白的毒性作用，在 AAV 穩定整合後，已報導某些細胞僅具非常低的表現 (參見，例如 Mendelson 等人，Virol. 166 (1988) 154-165)。

cap 基因座包含一個啟動子，稱為 P40。啟動子 P40 係可操作地連接至提供 2.6 kb mRNA 的核酸序列，該 mRNA 經由選擇性剪接及使用選擇性起始密碼子而編碼 Cap 蛋白 VP1 (87 kDa，非經剪接 mRNA 轉錄物)、VP2 (72 kDa，來自經剪接 mRNA 轉錄物) 及 VP3 (61 kDa，來自替代的起始密碼子)。VP1 到 VP3 構成病毒殼體的構建塊。殼體具有與細胞表面受體結合並允許病毒在細胞內運輸的功能。VP3 約佔病毒顆粒蛋白總量的 90%。儘管如此，所有三種蛋白質對於生產有效之殼體皆為必要。

據報導，將所有三種殼體蛋白 VP1 到 VP3 不活化可防止積累單股子代 AAV DNA。VP1 胺基末端之突變 (「Lip-陰性」或「Inf-陰性」) 仍允許將單股 DNA 組裝成病毒顆粒，從而大幅度降低感染效價。

AAP 開讀框編碼組裝活化蛋白 (AAP)。其大小約為 22 kDa，可將天然 VP 蛋白運輸到核仁區進行殼體組裝。此開讀框位於 VP3 蛋白編碼序列的上游。

在單一 AAV 顆粒中，僅包含一個單股 DNA 分子。其可能為「正」股或「負」股。含有 DNA 分子的 AAV 病毒顆粒具有感染性。在經感染的細胞內，親代感染單股被轉變為雙股，該雙股隨後被擴增。擴增產生出大量雙股 DNA 分子，其中單股被置換並包裝成殼體。

腺相關病毒 (AAV) 載體可轉導分裂細胞及休眠細胞。可假設使用 AAV 載體導入標靶細胞的轉基因將長期表現。使用 AAV 載體的一個缺點是可導入細胞的轉基因大小有限制。

病毒載體 (例如小病毒顆粒，其包括 AAV 血清型及其變異體) 提供一種將核酸以離體、活體外及活體內遞送到細胞中的方式，這些載體編碼蛋白質而使細胞表現所編碼的蛋白質。AAV 係作為基因治療載體的病毒，因其可穿透細胞並導入核酸/基因物質而使核酸/基因物質可在細胞中穩定地維持。此外，例如，這些病毒可將核酸/基因物質導入至特定位點。由於 AAV 與人類之致病性疾病無關，因此 AAV 載體能夠將異源多核苷酸序列 (例如治療蛋白質及藥劑) 遞送至人類病患，而不會引起實質性之 AAV 發病機制或疾病。

可使用的病毒載體包括但不限於多種血清型 (例如 AAV-1 至 AAV-12，及其他) 之腺相關病毒 (AAV) 顆粒及雜合/嵌合 AAV 顆粒。

AAV 顆粒可作為有效遞送基因的載體。此種顆粒具有許多適用於此類應用的所欲特徵，包括對分裂細胞及非分裂細胞的向性。早期臨床經驗亦證實這些載體並無持續的毒性，且引起很小的免疫反應很小或檢測不到免疫反應。已知 AAV 在活體內及活體外經由受體介導的胞吞作用或胞吞轉送作用感染各種細胞類型。這些載體系統已在人類中進行測試，該等載體標靶至視網膜上皮、肝臟、骨骼肌、氣管、大腦、關節及造血幹細胞。

重組 AAV 顆粒通常不包括與發病機制相關的病毒基因。此種載體通常具有一個或多個全部或部分缺失的野生型 AAV 基因 (例如 rep 及/或 cap 基因)，但保留至少一個功能側翼 ITR 序列，此為修復、複製及將重組載體包裝成 AAV 顆粒所必需。例如，僅包括載體的必要部分，例如分別為 ITR 及 LTR 元件。因此，AAV 載體基因體包括複製及包裝所需的順式序列 (例如，功能 ITR 序列)。

重組 AAV 載體及其方法及用途包括任何病毒株或血清型。作為非限制性實例，重組 AAV 載體可基於任何 AAV 基因體，諸如，舉例而言，AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV 2i8、AAV rh74 或 AAV 7m8。此種載體可基於相同或者彼此不同的病毒株或血清型 (或亞群或變異體)。作為非限制性實例，基於一種血清型基因體的重組AAV 載體可與包裝載體的一種或多種殼體蛋白相同。此外，重組 AAV 載體基因體可基於與包裝載體之一種或多種 AAV 殼體蛋白不同的 AAV (例如 AAV2 ) 血清型基因體。例如，AAV 載體基因體可基於 AAV2，而三種殼體蛋白中的至少一種可為例如 AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV rh74、AAV 7m8 或其變異體。AAV 變異體包括 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV rh74 及 AAV 7m8 殼體的變異體及嵌合體。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，腺相關病毒 (AAV) 載體包括 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV rh74 及 AAV 7m8，及其變異體 (例如，殼體變異體，例如胺基酸插入、加入、取代及缺失)，例如，如 WO 2013/158879、WO 2015/013313 及 US 2013/0059732 (揭露 LK01、LK02、LK03 等) 中所述。

AAV 及 AAV 變異體 (例如殼體變異體) 血清型 (例如，VP1、VP2 及/或 VP3 序列) 可與其他 AAV 血清型不同或並未不同，其他AAV 血清型包括例如 AAV1-AAV12 (例如，與任何 AAV1-AAV12 之血清型之 VP1、VP2 及/或 VP3 的序列不同)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，與參考血清型相關之 AAV 顆粒具有多核苷酸、多肽或其子序列，該多核苷酸、多肽或其子序列包括或由以下所組成：與一個或多個 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV rh74 或 AAV 7m8 (例如，諸如 ITR，或 VP1、VP2 及/或 VP3 序列) 具有至少 80% 或更多 (例如，85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5% 等) 同一性的序列。

本發明之組成物、方法及用途包括 AAV 序列 (多肽和核苷酸) 及其子序列，該子序列相較於參考 AAV 血清型 (例如 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV rh74 或 AAV 7m8) 展現低於 100% 的序列同一性，但不同於已知的 AAV 基因或蛋白質 (諸如 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV rh74 或 AAV 7m8、基因或蛋白質等)。在所有態樣及實施例的某些實施例中，AAV 多肽或其子序列包括或由以下所組成：與任何參考 AAV 序列或其子序列 (諸如 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV rh74 或 AAV 7m8 (例如，VP1、VP2 及/或 VP3 殼體或 ITR)) 具至少 75% 或更多 (例如 80%、85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5% 等、高達 100%) 同一性的序列。在某些實施例中，AAV 變異體具有 1 個、2 個、3 個、4 個、5 個、5-10 個、10-15 個、15-20 個或更多個胺基酸取代。

可使用本發明所屬領域技術中具有通常知識者已知的重組技術構建重組 AAV 顆粒 (包括 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-2i8、AAV rh74 或 AAV 7m8，以及變異體、相關、混合及嵌合序列)，使該 AAV 顆粒包括側翼為一個或多個功能 AAV ITR 序列的一個或多個核酸序列 (轉基因)。

可將重組顆粒 (例如，rAAV 顆粒) 併入醫藥組成物中。此種醫藥組成物尤其可用於以活體內或離體向個體投予及遞送。在某些實施例中，醫藥組成物含有醫藥上可接受之載劑或賦形劑。此種類賦形劑包括本身不誘導對接受該組合物的個體有害之免疫反應的任何藥劑，且其投予不產生過度毒性。

US 5,998,205、US 6,228,646、US 6,093,699、US 6,100,242、WO 94/17810 及 WO 94/23744 描述用於產生腺病毒載體的方案；其全部內容經由引用併入本文。

重組 AAV 顆粒 (rAAV 顆粒)

本領域已知用於產生 rAAV 顆粒的不同方法。例如，使用 AAV 質體及 AAV 輔助序列進行轉染並與一種 AAV 輔助病毒 (例如腺病毒、皰疹病毒或牛痘病毒) 共感染，或使用重組 AAV 質體、AAV 輔助質體及輔助功能質體進行轉染。產生 rAAV 顆粒的非限制性方法描述於例如 US 6,001,650、US 6,004,797、WO 2017/096039 及 WO 2018/226887。在生產重組 rAAV 顆粒 (即在細胞培養系統中產生顆粒) 後，可從宿主細胞及細胞培養上清液中獲得 rAAV 顆粒並進行純化。

為產生重組 AAV 顆粒，需在單一哺乳動物細胞中表現 Rep 和 Cap 蛋白、輔助蛋白 E1A、E1B、E2A 及 E4orf6 以及腺病毒 VA RNA。可使用任何啟動子 (尤其是 CMV IE 啟動子) 表現輔助蛋白 E1A、E1B、E2A 及 E4orf6，如 Matsushita 等人所示 (Gene Ther. 5 (1998) 938-945)。因此，可使用任何啟動子。

通常，為生產重組 AAV 顆粒，將不同的互補質體共轉染到宿主細胞中。質體之一者包含夾在兩個順式作用 AAV ITR 之間的轉基因。子代重組基因體之複製及後續包裝所需之缺少的 AAV 元件 (即 Rep 及 Cap 蛋白的開讀框) 以反式包含在第二質體中。過表現 Rep 蛋白造成抑制細胞生長的作用 (Li, J. 等人，J. Virol. 71 (1997) 5236-5243)。此外，AAV 複製需要包含輔助病毒基因的第三質體，即來自腺病毒的 E1、E4orf6、E2A 及 VA。

為減少所需質體的數量，Rep、Cap 及腺病毒輔助基因可組合在單一質體上。

或者，宿主細胞可已穩定表現 E1 基因產物。此種細胞為 HEK293 細胞。標示為 293 的人類胚胎腎殖株是在 1977 年經由將腺病毒 DNA 整合到人類胚胎腎細胞 (HEK 細胞) 中所產生的 (Graham, F.L. 等人，J. Gen. Virol. 36 (1977) 59-74)。HEK293 細胞株包含腺病毒血清型 5 基因體之鹼基對 1 至 4344。此涵蓋 E1A 及 E1B 基因以及腺病毒包裝訊號 (Louis, N. 等人，Virology 233 (1997) 423-429)。

當使用 HEK293 細胞時，缺少的 E2A、E4orf6 及 VA 基因可經由與腺病毒共感染或經由與 E2A、E4orf6 及 VA 表現質體共轉染來導入 (參見，例如Samulski, R.J. 等人，J. Virol. 63 (1989) 3822-3828; Allen, J.M. 等人，J. Virol. 71 (1997) 6816-6822；Tamayose, K. 等人，Hum. Gene Ther. 7 (1996) 507-513；Flotte, T.R. 等人，Gene Ther. 2 (1995) 29-37；Conway, J.E. 等人，J. Virol. 71 (1997) 8780-8789；Chiorini, J.A. 等人，Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1531-1541；Ferrari, F.K. 等人，J. Virol. 70 (1996) 3227-3234；Salvetti, A. 等人，Hum. Gene Ther. 9 (1998) 695-706；Xiao, X. 等人，J. Virol. 72 (1998) 2224-2232；Grimm, D. 等人，Hum. Gene Ther. 9 (1998) 2745-2760；Zhang, X. 等人，Hum. Gene Ther. 10 (1999) 2527-2537)。或者，可使用腺病毒/AAV 或單純皰疹病毒/AAV 雜合載體 (參見，例如 Conway, J.E. 等人，J. Virol. 71 (1997) 8780-8789；Johnston, K.M. 等人，Hum. Gene Ther. 8 (1997) 359-370：Thrasher, A.J. 等人，Gene Ther. 2 (1995) 481-485；Fisher, J.K. 等人，Hum. Gene Ther. 7 (1996) 2079-2087；Johnston, K.M. 等人，Hum. Gene Ther. 8 (1997) 359-370)。

因此，在經整合並表現 rep 基因之細胞株傾向緩慢生長或以非常低的量表現 Rep 蛋白。

為限制轉基因對特定組織的活性 (即限制整合位點)，可將轉基因可操作地連接至可誘導或組織特異性啟動子 (參見，例如，Yang，Y. 等人， Hum. Gene.6 (1995) 1203-1213)。

rAAV 顆粒生產的一個主要困難是 rAAV 載體的低效包裝，導致效價低。包裝一直很困難的數個原因包括 若存在野生型 AAV 基因體，進行較佳之殼體化； 由於與 rep 基因產物相關的抑制作用，難以產生足夠的補充功能，例如由野生型 rep 及 cap 基因所提供的功能； 質體構建體的共轉染效率有限。

所有這些皆基於 Rep 蛋白的生物學特性。尤其是 Rep 蛋白之抑制 (細胞抑制及細胞毒性) 特性以及逆轉培養細胞永生化表型之能力是問題所在。此外，當使用廣泛使用的 AAV P5 啟動子時，Rep 蛋白會下調其自身的表現 (參見，例如 Tratschin 等人，Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 2884-2894)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，rAAV 顆粒源自選自由以下所組成之群組的 AAV：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、Rh74 及 7m8。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，rAAV 顆粒包含與 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、Rh74 或 7m8 殼體序列具有 70% 或更高序列同一性的殼體序列。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，rAAV 顆粒包含與 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9 或 AAV10 ITR 序列具有 70% 或更高序列同一性的 ITR 序列。

E1A 、 E1B 、 E2 及 E4

E1A 及 E1B (開讀框) 之編碼序列可源自人類腺病毒，諸如，舉例而言，特別是人類腺病毒血清型 2 或血清型 5。人類 Ad5 (腺病毒血清型 5) 的示例性序列在 GenBank 條目 X02996、AC_000008 中找到，而人類 Ad2 的示例性序列在 GenBank 條目 AC_000007 中找到。核苷酸 505 至 3522 包含編碼人類腺病毒血清型 5 之 E1A 及 E1B 的核酸序列。EP 1 230 354 中所報導的質體 pSTK146 以及 WO 2007/056994 中所報導的質體 pGS119 及 pGS122 亦可作為 E1A 及 E1B 開讀框的來源。

E1A 為腺病毒 DNA 進入細胞核後所表現的第一個病毒輔助基因。E1A 基因編碼 12S 及 13S 蛋白，其係基於相同之 E1A mRNA 的選擇性剪接。表現 12S 及 13S 蛋白使活化其他病毒功能 E1B、E2、E3 及 E4。此外，表現 12S 及 13S 蛋白迫使細胞進入細胞週期的 S 期。如果只表現 E1A 衍生的蛋白質，細胞將會死亡 (細胞凋亡)。

E1B 為第二個表現的病毒輔助基因。其被 E1A 衍生的蛋白質 12S 及 13S 活化。E1B 基因衍生之 mRNA 可以兩種不同的方式剪接，產生第一個 55 kDa 轉錄物及第二個 19 kDa 轉錄物。E1B 55 kDa 蛋白參與調節細胞週期、防止在感染晚期之細胞 mRNA 的運輸以及防止 E1A 誘導的細胞凋亡。E1B 19 kDa 蛋白參與防止 E1A 誘導的細胞凋亡。

E2 基因編碼不同的蛋白質。E2A 轉錄物編碼單股結合蛋白 (SSBP)，其為 AAV 複製所必要者。

E4 基因亦編碼數種蛋白質。E4 基因衍生的 34 kDa 蛋白 (E4orf6) 與 E1B 55 kDa 蛋白一起阻止細胞 mRNA 在細胞質中的積累，亦促進病毒 RNA 自細胞核運輸到細胞質中。

腺病毒 VA RNA 基因

病毒相關 RNA (VA RNA) 為調節轉譯之腺病毒 (Ad) 的非編碼 RNA。腺病毒基因體包含兩個獨立的拷貝：VAI (VA RNAI) 及 VAII (VA RNAII)。兩者均由 RNA 聚合酶 III 轉錄 (參見，例如 Machitani, M. 等人，J. Contr.Rel.154 (2011) 285-289)，該 RNA 聚合酶 III 來自 2 型聚合酶 III 啟動子。對於重組生產，腺病毒 VA RNA 基因可由任何啟動子驅動。

Ma, Y. 及 Mathews, M.B. 使用系統發育方法研究腺病毒相關 RNA 的結構、功能及進化(J. Virol. 70 (1996) 5083-5099)。他們根據 47 種已知人類腺病毒血清型，提供其比對及共有 VA RNA 序列。該揭露在此經由引用整體併入本申請案。

VA RNA、VAI 及 VAII 係由 157-160 個核苷酸 (nt) 所組成。

根據血清型，腺病毒含有一個或兩個 VA RNA 基因。咸認為 VA RNAI 係主要的前病毒，而 VA RNAII 可部分地彌補 VA RNAI 之缺失 (Vachon, V.K. 及 Conn, G.L.，Virus Res. 212 (2016) 39-52)。

雖然 VA RNA 非必要，但其經由克服細胞抗病毒機制在有效的病毒生長中仍扮演重要角色。亦即，雖然 VA RNA 對於病毒生長非必要，但在載體生成的起始步驟中，VA RNA 缺失之腺病毒無法生長，其中每個細胞僅存在數個病毒基因體拷貝，可能是因為未充分地表現阻斷細胞抗病毒機制之 VA RNA 以外的病毒基因 (參見 Maekawa, A. 等人，Nature Sci. Rep.3 (2013) 1136)。

Maekawa, A. 等人 (Nature Sci. Rep.3 (2013) 1136) 報導缺乏病毒相關 RNA 基因之腺病毒載體的高效生產，該腺病毒載體干擾細胞 RNAi 機制，其中組成型地表現及高度表現翻轉酶重組酶之經感染 HEK293 細胞經由 FLP 重組酶介導切除 VA RNA 基因座，以獲得 VA RNA 缺失之腺病毒。

人類腺病毒 2 VA RNAI 對應於 GenBank 條目 AC_000007 序列的核苷酸 10586-10810。人類腺病毒 5 VA RNAI 對應於 GenBank 條目 AC_000008 序列的核苷酸 10579-10820。

生產 rAAV 顆粒之方法

Carter 等人已經表明可刪除野生型 AAV 基因體中的整個 rep 及 cap 開讀框並以轉基因替換 (Carter, B. J.，「Handbook of Parvoviruses」，P. Tijssen 主編，CRC Press，pp. 155-168 (1990))。此外，據報導，須維持 ITR 以保留複製、修復、包裝及將轉基因整合到標靶細胞之基因體中的功能。

當包含相應病毒輔助基因之細胞被 AAV 載體轉導時，或者反之亦然，當包含整合之 AAV 前病毒的細胞以合適之輔助病毒轉導時，AAV 前病毒被活化並再次進入裂解感染週期 (Clark, K.R. 等人，Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1329-1341；Samulski, R.J., Curr. Opin. Genet. Dev.3 (1993) 74-80)。

生產細胞含有 rep 及 cap 基因序列，以及側接有在經由藥物選擇所保留的一個或多個質體上的 ITR 序列的轉基因卡匣。這些細胞株中 rAAV 顆粒之生產通常發生在它們經感染所需之輔助功能之後。因此，將細胞用具有複製能力的 AdV (通為是野生型 Ad5) 或包含相應輔助基因的質體感染，以提供輔助病毒蛋白並啟動 rAAV 顆粒生產。包裝細胞株不同於生產細胞株，因為其僅含有 rep 及 cap 基因。

本發明之態樣為用核酸 (例如，質體) 轉導細胞之方法，該等核酸包含生產重組 AAV 顆粒所需之所有元件，其中轉染前的細胞已使用灌流繁殖 (至少一段時間)。因此，由於質體編碼病毒包裝蛋白和/或輔助蛋白，細胞可生產重組病毒顆粒，其包括編碼所關注蛋白質的核酸或包含轉錄成所關注轉錄物的序列。

本發明提供病毒 (例如，AAV) 顆粒生產平台，該平台包括藉由使用如本發明之方法的特徵，該特徵與目前「工業標準」的病毒 (例如，AAV) 顆粒生產過程不同。

更一般地，用 DNA 轉染或轉導以重組生產 AAV 顆粒的細胞可稱為「重組細胞」。此種細胞例如可為酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，並且其已被作為編碼包裝蛋白 (例如 AAV 包裝蛋白) 之核酸 (質體)、編碼輔助蛋白之核酸 (質體)、編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物之核酸 (質體) (亦即置於兩個 AAV ITR 之間的轉基因)。該術語包括已經轉導或經轉染之原始細胞的子代。應當理解，由於自然、偶然或特意之突變，單一親代細胞的子代在形態學或基因體或總核酸互補方面不一定與原始親代完全相同。

許多適用於維持細胞存活率或提供細胞生長及/或增殖的細胞生長培養基為可商購獲得的。此類培養基的實例包括無血清真核生長培養基，例如用於維持存活率或提供哺乳動物 (例如人類) 細胞生長的培養基。非限制性實例包括 Ham's F12 或 F12K培養基 (Sigma-Aldrich)、FreeStyle (FS) F17培養基 (Thermo-Fisher Scientific)、MEM、DMEM、RPMI-1640 (Thermo-Fisher Scientific) 及其混合物。此類培養基可補充有維生素及/或微量礦物質及/或鹽及/或胺基酸，諸如哺乳動物 (例如人類) 細胞的必需胺基酸。

輔助蛋白質體可為質體、噬菌體、轉座子或黏接質體的形式。特別是，已證明輔助功能不需完全互補腺病毒基因。例如，已證明無法進行 DNA 複製及合成晚期基因的腺病毒突變體允許 AAV 複製。Ito 等人，J. Gen. Virol. 9 (1970) 243；Ishibashi 等人，Virology 45 (1971) 317。

已顯示 E2B 及 E3 區域內的突變體支持 AAV 複製，代表 E2B 及 E3 區域可能未涉及提供輔助功能。Carter 等人，Virology 126 (1983) 505。然而，在 E1 區具缺陷或具有缺失之 E4 區的腺病毒則無法支持 AAV 複製。因此，對於腺病毒輔助蛋白，AAV 複製可能直接地或間接地需要 E1A 及 E4 區域 (參見，例如，Laughlin 等人，J. Virol. 41 (1982) 868；Janik 等人，Proc. Natl . Acad. Sci. USA 78 (1981) 1925；Carter 等人，Virology 126 (1983) 505)。其他經表徵的腺病毒突變體包括：E1B (Laughlin 等人，(1982)，同上；Janik 等人 (1981)，同上；Ostrove 等人，Virology 104 (1980) 502)；E2A (Handa 等人，J. Gen. Virol. 29 (1975) 239；Strauss 等人，J. Virol. 17 (1976) 140；Myers 等人，J. Virol. 35 (1980) 665；Jay 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) 2927；Myers 等人，J. Biol. Chem. 256 (1981) 567)；E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990))；E3 (Carter 等人，(1983)，同上)；及 E4 (Carter 等人，(1983)，同上；Carter (1995))。

針對 E1B 中具有突變之腺病毒提供之輔助蛋白的研究報導稱，生產 AAV 顆粒需要 E1B 55 kDa 蛋白，但不需要 E1B 19 kDa。此外，WO 97/17458 及 Matshushita 等人 (Gene Therapy 5 (1998) 938-945) 描述編碼各種腺病毒基因的輔助功能質體。輔助質體的實例包含腺病毒 VA RNA 編碼區、腺病毒 E4orf6 編碼區、腺病毒 E2A 72 kDa 編碼區、腺病毒 E1A 編碼區及缺乏完整 E1B 55 kDa 編碼區的腺病毒 E1B 區 (參見，例如，WO 01/83797)。

因此，本文提供一種使用如本發明之方法在轉染及病毒顆粒生產之前進行哺乳動物細胞繁殖來生產重組 AAV 載體或包含該等重組 AAV 載體之 AAV 顆粒之方法，該 AAV 載體包含編碼蛋白質之核酸或被轉錄成所關注轉錄物的核酸。

為此目的，將三種質體共轉染到如本發明之用灌流繁殖的哺乳動物細胞中。轉基因質體 (pTransgen) 編碼在 AAV ITR 之間選殖的表現卡匣，而藉由共轉染第二包裝質體 (pRep/Cap) 以反式提供 rep 及 cap 基因以確保 AAV 複製及包裝。第三質體，亦稱為輔助質體 (pHelper)，含有最少的輔助病毒因子 (通常為腺病毒 E2A、EV 及 VA 基因)，但缺乏 AAV ITR。

本發明之一個態樣為一種生產重組 AAV 載體或包含該重組 AAV 載體之 AAV 顆粒的方法，該 AAV 載體包含編碼蛋白質之核酸或被轉錄成所關注轉錄物的核酸，該方法包含以下步驟： (i) 提供包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的一種或多種質體； (ii) 提供包含核酸的質體，該核酸編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物； (iii) 將使用如本發明之方法所獲得的一種或多種哺乳動物或昆蟲細胞與所提供之質體接觸； (iv) 進一步加入轉染試劑，並視情況地培育質體/轉染試劑/細胞混合物；或提供物理方式 (例如電流) 將核酸導入至細胞； (v) 培養轉染細胞； (vi) 從培養細胞中收穫培養細胞及/或培養基，以產生細胞及/或培養基收穫物；及 (vii) 裂解細胞並視情況從細胞及/或培養基收穫裂解物中分離重組 AAV 載體或 AAV 顆粒； 從而生產包含編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物之核酸的重組 AAV 載體或 AAV 顆粒。

本發明之一個態樣為一種生產重組 AAV 載體或包含該重組 AAV 載體之 AAV 顆粒的方法，該 AAV 載體包含編碼蛋白質之核酸或被轉錄成所關注轉錄物的核酸，該方法包含以下步驟： (i) 提供包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的一種或多種質體； (ii) 提供包含核酸的質體，該核酸編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物； (iii) 或者 (a) 藉由將使用如本發明之方法所獲得的一種或多種哺乳動物細胞與 (i) 提供的質體接觸，產生穩定的轉染細胞；進一步加入轉染試劑並視情況孵育質體/轉染試劑/細胞混合物或提供物理方式諸如電流，以將核酸引入細胞中；選擇第一穩定轉染細胞；將選定的第一穩定轉染細胞與 (ii) 提供的質體接觸；並且進一步加入轉染試劑並視情況孵育質體/轉染試劑/細胞混合物；或提供物理方式諸如電流，以將核酸引入細胞中；或 (b) 藉由將使用如本發明之方法所獲得的一種或多種哺乳動物或昆蟲細胞與 (i) 及 (ii) 提供的質體接觸，產生經瞬時轉染之細胞；並且進一步加入轉染試劑並視情況孵育質體/轉染試劑/細胞混合物；或提供物理方式諸如電流，以將核酸引入細胞中； (iv) 培養 (iii) 的轉染細胞； (v) 從培養細胞中收穫培養細胞及/或培養基，以產生細胞及/或培養基收穫物；及 (vi) 裂解細胞並視情況從細胞及/或培養基收穫裂解物中分離重組 AAV 載體或 AAV 顆粒； 從而生產包含編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物之核酸的重組 AAV 載體或 AAV 顆粒。

本發明之一個態樣為一種生產重組 AAV 載體或包含該重組 AAV 載體之 AAV 顆粒的方法，該 AAV 載體包含編碼蛋白質之核酸或被轉錄成所關注轉錄物的核酸，該方法包含以下步驟： (i) 提供包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的哺乳動物或昆蟲細胞； (ii) 提供包含核酸的質體，該核酸編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物； (iii) 或者 (a) 藉由將使用如本發明之方法所獲得的一種或多種哺乳動物或昆蟲細胞與 (i) 提供的質體接觸，產生穩定的轉染細胞；進一步加入轉染試劑並視情況孵育質體/轉染試劑/細胞混合物或提供物理方式諸如電流，以將核酸引入細胞中；選擇第一穩定轉染細胞；將選定的第一穩定轉染細胞與 (ii) 提供的質體接觸；並且進一步加入轉染試劑並視情況孵育質體/轉染試劑/細胞混合物；或提供物理方式諸如電流，以將核酸引入細胞中；或 (b) 藉由將使用如本發明之方法所獲得的一種或多種哺乳動物或昆蟲細胞與 (i) 及 (ii) 提供的質體接觸，產生經瞬時轉染之細胞；並且進一步加入轉染試劑並視情況孵育質體/轉染試劑/細胞混合物；或提供物理方式諸如電流，以將核酸引入細胞中； (iv) 培養 (iii) 的轉染細胞； (v) 從培養細胞中收穫培養細胞及/或培養基，以產生細胞及/或培養基收穫物；及 (vi) 裂解細胞並視情況從細胞及/或培養基收穫物中分離及/或純化的重組 AAV 載體或 AAV 顆粒； 從而生產包含編碼所關注蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物之核酸的重組 AAV 載體或 AAV 顆粒。

可藉由多種方式將核酸 (質體) 引入細胞中。

本領域已報導將 DNA 轉移到哺乳動物細胞中的多種方法。這些方法在根據本發明之方法中都是有用的。在所有態樣及實施例的某些實施例中，使用電穿孔、核轉染或顯微注射進行核酸轉移/轉染。在所有態樣及實施例的某些實施例中，使用無機物質 (例如，舉例而言，磷酸鈣/DNA 共沉澱)、陽離子聚合物 (例如，舉例而言，聚乙烯亞胺、DEAE-葡聚醣) 或陽離子脂質 (脂質體) 進行核酸轉移/轉染。磷酸鈣及聚乙烯亞胺為用於大規模核酸轉移的最常用轉染試劑 (參見，例如 Baldi 等人，Biotechnol. Lett.29 (2007) 677-684)，其中聚乙烯亞胺為較佳。

在無血清的懸浮培養物中生長並使用 PEI 作為轉染試劑改善轉染條件的效率及重現性，允許使用搖瓶、波動或攪拌罐生物反應器即時放大 AAV 生產。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，核酸 (質體) 以組成物的形式提供，該組成物與聚乙烯亞胺 (PEI) 組合，視情況地與細胞組合。在某些實施例中，組合物包括質體/PEI 混合物，其具有複數個組分：(a) 一個或多個包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的質體；(b) 包含編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物之核酸的質體；及 (c) 聚乙烯亞胺 (PEI) 溶液。在某些實施例中，質體的莫耳比範圍為約 1:0.01 至約 1:100，或莫耳比範圍為約 100: 1 至約 1:0.01，且組分 (a)、(b) 及 (c) 視情況地培育質體約 10 秒至約 4 小時的時間。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，組合物進一步包含細胞。在某些實施例中，細胞與組分 (a)、(b) 及/或 (c) 的質體/PEI 混合物接觸。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，組合物視情況地與細胞組合，該組合物進一步包含游離 PEI。在某些實施例中，細胞與游離 PEI 接觸。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，細胞已與組分 (a)、(b) 及/或 (c) 的混合物接觸至少約 4 小時，或約 4 小時至約 140 小時，或約 4 小時至約 96 小時。在一個較佳的實施例中，細胞已經與組分 (a)、(b) 及/或 (c) 及視情況之游離 PEI 的混合物接觸至少約 4 小時。

該組成物亦可以包含另外的質體或/及細胞。此種質體及細胞可與游離的 PEI 接觸。在某些實施例中，質體及/或細胞已與游離 PEI 接觸至少約 4 小時，或約 4 小時至約 140 小時，或約 4 小時至約 96 小時。

本發明亦提供生產轉染細胞之方法。該方法包括以下步驟：提供一種或多種質體；提供包含聚乙烯亞胺 (PEI) 的溶液；以及將質體與 PEI 溶液混合以產生質體/PEI 混合物。在某些實施例中，將此種混合物培育約 10 秒至約 4 小時範圍內的一段時間。在此類方法中，將細胞接著與質體/PEI 混合物接觸以產生質體/PEI 細胞培養物；然後加入游離 PEI 至產生之質體/PEI 細胞培養物中，以產生游離 PEI/質體/PEI 細胞培養物；然後將產生的游離 PEI/質體/PEI 細胞培養物培養至少約 4 小時，從而產生轉染細胞。在某些實施例中，質體包含以下一者或多者或全部：rep 開讀框；cap 開讀框；E1A、E1B、E2 及 E4orf6 開讀框；及編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物之核酸。

進一步提供生產轉染細胞 (其產生重組 AAV 載體或 AAV 顆粒) 之方法，該方法包括：提供一個或多個質體，該質體包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸；提供包含編碼蛋白質或轉錄成所關注轉錄物之核酸的質體；提供包含聚乙烯亞胺 (PEI) 的溶液；將上述質體與 PEI 溶液混合，其中質體的莫耳比範圍為約 1:0.01 至約 1:100，或莫耳比範圍為約 100:1 至約 1:0.01，以產生質體/PEI 混合物 (且視情況地將質體/PEI 混合物培育約 10 秒至約 4 小時範圍內的一段時間)；將哺乳動物細胞與質體/PEI 混合物接觸，以產生質體/PEI 細胞培養物；向產生之質體/PEI 細胞培養物中加入游離 PEI 以產生游離 PEI/質體/PEI 細胞培養物；及將游離 PEI/質體/PEI 細胞培養物培育至少約 4 小時，從而產生轉染細胞，該轉染細胞產生包含編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物之核酸的重組 AAV 載體或顆粒，其中哺乳動物細胞已使用如本發明之方法獲得。

另外提供生產包含編碼蛋白質的核酸或被轉錄成所關注轉錄物之重組 AAV 載體或 AAV 顆粒之方法，該方法包括：提供一個或多個包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的質體；提供包含編碼所關注蛋白質或轉錄成所關注轉錄物之核酸的質體；提供包含聚乙烯亞胺 (PEI) 的溶液；將上述質體與 PEI 溶液混合，其中質體的莫耳比範圍為約 1:0.01 至約 1:100，或莫耳比範圍為約 100:1 至約 1:0.01，以產生質體/PEI 混合物 (且視情況地將質體/PEI 混合物培育約 10 秒至約 4 小時範圍內的一段時間)；將哺乳動物細胞與所述產生之質體/PEI 混合物接觸以產生質體/PEI 細胞培養物；向所述產生之質體/PEI 細胞培養物中加入游離 PEI 以產生游離 PEI/質體/PEI 細胞培養物；將產生之質體/PEI 細胞培養物或游離 PEI/質體/PEI 細胞培養物培育至少約 4 小時以產生轉染細胞；從所產生之轉染細胞中收穫所產生之轉染細胞及/或培養基，以產生細胞及/或培養基收穫物；裂解細胞並視情況從細胞及/或培養基收穫裂解物中分離重組 AAV 載體或顆粒，其中哺乳動物細胞已使用如本發明之方法獲得；從而產生包含編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物之核酸的重組 AAV 載體或顆粒。

使用如本發明之方法生產重組 AAV 載體或 AAV 顆粒之方法可包括一個或多個另外的步驟或特徵。示例性步驟或特徵包括但不限於收穫所產生的培養哺乳動物細胞及/或從所產生的培養細胞收穫培養基以產生細胞及/或培養基收穫物的步驟。額外的示例性步驟或特徵包括但不限於裂解所收穫的細胞並視情況從細胞及/或培養基收穫裂解物中分離重組 AAV 載體或 AAV 顆粒；其中轉染前的哺乳動物細胞已使用如本發明之方法獲得；從而產生包含編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物之核酸的重組 AAV 載體或 AAV 顆粒。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，在不同時間點將 PEI 加入至質體及/或細胞。在某些實施例中，在質體/PEI 混合物與細胞接觸之前、同時或之後，將游離 PEI 加入至細胞。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，當細胞與質體/PEI 混合物接觸及/或與游離 PEI 接觸時，細胞具有特定密度及/或細胞生長階段及/或存活率。在一個較佳的實施例中，當細胞與質體/PEI 混合物接觸及/或當細胞與游離 PEI 接觸時，細胞的密度範圍為約 1*10^5 細胞/mL 至約 1*10^8 細胞/mL。在某些實施例中，當細胞與質體/PEI 混合物或與游離 PEI 接觸時，細胞的存活率為約 60% 或大於 60%，或其中當細胞與質體/PEI 混合物接觸時，細胞處於對數生長期，或當細胞與質體/PEI 混合物或與游離 PEI 接觸時，細胞的存活率為約 90% 或大於 90%，或者其中當細胞與質體/PEI 混合物或與游離 PEI 接觸時，細胞處於對數生長期。

除 PEI 以外，丙戊酸 (VPA) 可用於改善轉染效率。VPA 為分支短鏈脂肪酸，並抑制組蛋白脫乙醯酶活性。由於該原因，它通常作為重組蛋白生產的增強劑加入至哺乳動物細胞培養物中。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，所編碼之 AAV 包裝蛋白包括 AAV rep 及/或 AAV cap。在所有態樣及實施例的某些實施例中，此種 AAV 包裝蛋白包括任何 AAV 血清型的 AAV rep 及/或 AAV cap 蛋白。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，所編碼之輔助蛋白包括腺病毒 E1A 及 E1B、腺病毒 E2 及/或 E4、VA RNA 及/或非 AAV 輔助蛋白。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，使用特定量或比例之核酸 (質體)。在某些實施例中，包含編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物之核酸的質體及包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的一個或多個質體的總量係在每 mL 細胞約 0.1 μg 至約 15 μg 的範圍內。在某些實施例中，包含編碼蛋白質或轉錄成所關注轉錄物之核酸的質體與包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸及/或編碼輔助蛋白之核酸的一個或多個質體的莫耳比，係在約 1:5 至約 1:1 的範圍內，或在約 1:1 至約 5:1 的範圍內。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，第一質體包含編碼 AAV 包裝蛋白的核酸，且第二質體包含編碼輔助蛋白的核酸。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，包含編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物之核酸的質體、與包含編碼 AAV 包裝蛋白之核酸的第一質體、與包含編碼輔助蛋白之核酸的第二質體在共轉染中，莫耳比係在約 1-5: 1: 1，或 1: 1-5: 1，或 1: 1: 1-5的範圍內。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，細胞為真核細胞。在某些實施例中，真核細胞為哺乳動物細胞。在一個較佳實施例中，細胞為 HEK293 細胞或 CHO 細胞。

可使用培養真核細胞的常用條件進行培養，即約 37℃、95% 濕度及 8 vol.-% CO ₂。可在含血清或無血清培養基中進行貼附培養或懸浮培養。懸浮培養可在任何發酵容器中進行，諸如，舉例而言，在攪拌釜反應器、波反應器、搖動反應器、振動器容器或旋轉容器或所謂的滾瓶中進行。可分別以高通量形式及篩選進行轉染，例如在 96 或 384 孔形式中進行。

根據本發明之方法包括任何血清型的 AAV 顆粒或其變異體。在所有態樣及實施例的某些實施例中，重組 AAV 顆粒包含以下中的任一者：AAV 血清型 1-12、AAV VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白，或經修飾或變體 AAV VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白，或野生型 AAV VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白。在所有態樣及實施例的某些實施例中，AAV 顆粒包含 AAV 血清型或 AAV 假型，其中 AAV 假型包括不同於 ITR 血清型的 AAV 殼體血清型。

提供或包括 AAV 載體或顆粒之根據本發明的方法亦可包括其他元件。此種元件的實例包括但不限於：內含子、表現控制元件、一種或多種腺相關病毒 (AAV) 反向末端重複 (ITR) 及/或填充物/填充多核苷酸序列。此種元件可位於編碼蛋白質或被轉錄成關注轉錄物的核酸內或側翼，或表現控制元件可操作地連接至核酸，該核酸編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物，或 AAV ITR 可位於核酸之 5'- 或 3'- 末端的側翼，該核酸編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物，或填充多核苷酸序列可位於核酸之 5'- 或 3'- 末端的側翼，該核酸編碼蛋白質或被轉錄成所關注轉錄物。

表現控制元件包括組成型或可調節控制元件，諸如組織特異性表現控制元件或啟動子。

ITR 可為 AAV2 或 AAV6 或 AAV8 或 AAV9 血清型中的任一者，或其組合。AAV 顆粒可包括與 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV10、AAV11、AAV-2i8、AAV rh74 或 AAV 7m8 VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白具有 75% 或更多序列同一性的任何 VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白，或包含選自以下之任何經修飾或變異體 VP1、VP2 及/或 VP3 殼體蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV10、AAV11、AAV-2i8、AAV rh74 及 AAV-7m8 AAV 血清型。

在產生如本文所述之重組病毒 (例如，AAV) 顆粒之後，如果需要，可使用各種習用方法從宿主細胞中純化及/或分離病毒 (例如，rAAV) 顆粒。此類方法包括管柱層析、CsCl 梯度、碘克沙醇 (iodixanol) 梯度等。

例如，可使用複數個管柱純化步驟，例如在陰離子交換管柱、親和性管柱及/或陽離子交換管柱上的純化。(參見，例如 WO 02/12455 及 US 2003/0207439)。或者或此外，可使用碘克沙醇或 CsCl 梯度步驟 (參見，例如 US 2012/0135515；及 US 2013/0072548)。此外，如果使用感染性病毒來表現包裝及/或輔助蛋白，則可使用各種方法將殘留病毒去活化。例如，可經由加熱到約 60℃ 的溫度例如 20 分鐘或更長時間將腺病毒去活化。此種處理有效地去活化輔助病毒，因為 AAV 是熱穩定的，而輔助腺病毒是熱不穩定的。

rAAV 載體生產及純化系統的目標是達成以最大限度降低/控制生產相關所產生雜質的策略，諸如蛋白質、核酸及載體相關雜質，包括野生型/假野生型 AAV 物種 (wtAAV) 及 AAV 囊裝之殘留 DNA 雜質。

考量 rAAV 顆粒僅占生物質的小部分，rAAV 顆粒需純化到一定程度之純度才能用作臨床人類基因治療產品 (參見，例如 Smith P.H. 等人，Mo.Therapy 7 (2003) 8348；Chadeuf G. 等人，Mo.Therapy 12 (2005) 744；來自 CHMP 基因治療專家小組會議報告，歐洲藥品管理局 EMEA/CHMP 2005, 183989/2004)。

作為起始步驟，通常為收獲產生 rAAV 顆粒的培養細胞，視情況地與收穫培養的細胞培養上清液 (培養基) 結合，其中已培養上清液中之產生 rAAV 顆粒的細胞 (懸浮或貼附)。可按原樣使用、適當使用、裂解或濃縮使用收穫之細胞及視情況的細胞培養上清液。此外，如果使用感染以表現輔助功能，則可將殘留的輔助病毒去活化。例如，可經由加熱到約 60℃ 的溫度例如 20 分鐘或更長時間將腺病毒去活化，這僅去活化輔助病毒，因為 AAV 是熱穩定的，而輔助腺病毒是熱不穩定的。

經由破壞細胞 (例如經由化學或物理方式，諸如清潔劑、微流化及/或均質化) 來裂解收穫物的細胞及/或上清液，以釋放 rAAV 顆粒。在細胞裂解過程中同時或隨後在細胞裂解之後，加入核酸酶 (例如 benzonase) 以降解汙染 DNA。通常，將所得裂解物澄清以移除細胞碎片 (例如經由過濾或離心)，以得到澄清之細胞裂解液。在一個特定的實例中，將裂解物以微米孔徑的過濾器 (例如 0.1-10.0 µm 孔徑的過濾器，例如 0.45 µm 及/或孔徑 0.2 µm 的過濾器) 過濾，以產生澄清的裂解物。

裂解物 (視情況澄清裂解物) 含有 AAV 顆粒 (包括 rAAV 載體及空殼體) 及生產/程序相關雜質，例如來自宿主細胞的可溶細胞組分，這些組分尤其可包括細胞蛋白質、脂質及/或核酸及細胞培養基組分。然後將視情況澄清裂解物進行純化步驟，使用層析從雜質中純化 AAV 顆粒 (包含 rAAV 載體)。在第一層析步驟之前，可用合適的緩衝液稀釋或濃縮澄清裂解物。

在細胞裂解、視情況澄清及視情況稀釋或濃縮之後，可使用複數個後續及順序層析步驟來純化 rAAV 顆粒。

例如，在下游處理期間，從完整殼體中去除空殼體係基於它們在陰離子交換層析中的不同等電點 (pI)。所有血清型的平均 pI 計算值對於完整殼體為 5.9，對於空殼體為 6.3 (Venkatakrishnan, B. 等人，J. Virol. 87 (2013) 4974-4984)。

第一層析步驟可為陽離子交換層析或陰離子交換層析。若第一層析步驟為陽離子交換層析，則第二層析步驟可為陰離子交換層析或粒徑篩析層析 (SEC)。因此，在所有態樣及實施例的某些實施例中，純化 rAAV 顆粒係經由陽離子交換層析，然後是經由陰離子交換層析純化。

或者，若第一層析步驟為陽離子交換層析，則第二層析步驟可為粒徑篩析層析 (SEC)。因此，在所有態樣及實施例的某些實施例中，rAAV 顆粒純化經由陽離子交換層析，然後經由粒徑篩析層析 (SEC) 純化。

或者，第一層析步驟可為親和力層析。若第一層析步驟為親和力層析，則第二層層析步驟可為陰離子交換層析。因此，在所有態樣及實施例的某些實施例中，經由親和力層析純化 rAAV 顆粒，然後經由陰離子交換層析純化。

視情況地，可將第三層析加入到前述層析步驟中。通常，視情況的第三層析步驟係在陽離子交換、陰離子交換、粒徑篩析或親和力層析之後。

因此，在所有態樣及實施例的某些實施例中，經由陽離子交換層析純化rAAV 顆粒，然後經由陰離子交換層析純化，然後經由粒徑篩析層析 (SEC) 純化。

此外，在所有態樣及實施例的某些實施例中，經由陽離子交換層析進一步純化 rAAV 顆粒，然後經由粒徑篩析層析 (SEC) 純化，然後經由陰離子交換層析純化。

在所有態樣及實施例的更進一步的實施例中，經由親和力層析純化rAAV 顆粒，然後經由陰離子交換層析純化，然後經由粒徑篩析層析 (SEC) 純化。

在所有態樣及實施例的更進一步的實施例中，經由親和力層析純化 rAAV 顆粒，然後經由粒徑篩析層析 (SEC) 純化，然後經由陰離子交換層析純化。

陽離子交換層析的作用是將 AAV 顆粒與存在於澄清裂解物及/或親和力或粒徑篩析層析之管柱洗脫液中的細胞及其他組分分離。能以廣 pH 範圍結合 rAAV 顆粒之強力陽離子交換樹脂的實例包括但不限於任何基於磺酸之樹脂，如存在磺酸鹽官能基團 (包括經芳基及烷基取代之磺酸鹽) 之樹脂，例如磺丙基或磺乙基樹脂。代表性基質包括但不限於 POROS HS、POROS HS 50、POROS XS、POROS SP 及 POROS S (強力陽離子交換劑可自 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 獲得)。其他實例包括 Capto S、Capto S ImpAct、Capto S ImpRes (強力陽離子交換劑可自 GE Healthcare, Marlborough, MA, USA 獲得)，而商業 DOWEX®、AMBERLITE® 及 AMBERLYST® 系列樹脂可自 Aldrich Chemical Company (Milliwaukee, WI, USA) 獲得。弱陽離子交換樹脂包括但不限於任何基於羧酸的樹脂。例示性陽離子交換樹脂包括羧甲基 (CM)、磷 (基於磷酸官能基團)、甲基磺酸 (S) 及磺丙基 (SP) 樹脂。

陰離子交換層析的作用是將 AAV 顆粒與存在於澄清裂解物及/或來自親和力或陽離子交換或粒徑篩析層析之管柱洗脫液中的蛋白質、細胞及其他組分分離。陰離子交換層析亦可用於減少並由此控制洗脫液中空殼體的量。例如，可用包含適當濃度 (例如，約 100-125 mM，例如 110-115 mM) 之 NaCl 溶液洗滌其上結合 rAAV 顆粒的陰離子交換管柱，且可在沒有顯著洗脫 rAAV 顆粒的流動中洗脫一部分空殼體。隨後，可使用包含更高濃度 (例如，約 130-300 mM NaCl) 之 NaCl 溶液洗脫與陰離子交換管柱結合的 rAAV 顆粒，從而產生管柱洗脫液，該管柱洗脫液具有減少量或耗竭量之空殼體且成比例增加量之 rAAV 顆粒，該 rAAV 顆粒包含 rAAV 載體。

例示性陰離子交換樹脂包括但不限於基於聚胺樹脂及其他樹脂的陰離子交換樹脂。強力陰離子交換樹脂的實例包括通常基於季銨化氮原子的陰離子交換樹脂，包括但不限於季銨鹽樹脂，例如三烷基芐基銨樹脂。合適的交換層析材料包括但不限於 MACRO PREP Q (強力陰離子交換劑可自 BioRad, Hercules, CA, USA 獲得)；UNOSPHERE Q (強力陰離子交換劑可自 BioRad, Hercules, CA, USA 獲得)；POROS 50HQ (強力陰離子交換劑可自 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)；POROS XQ (強力陰離子交換劑可自 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 獲得)；POROS SOD (弱陰離子交換劑可自 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 獲得)；POROS 50PI (弱陰離子交換劑可自 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 獲得)；Capto Q、Capto XQ、Capto Q ImpRes 及 SOURCE 30Q (強力陰離子交換劑可自GE healthcare, Marlborough, MA, USA 獲得)；DEAE SEPHAROSE (弱陰離子交換劑可自 Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA 獲得)；Q SEPHAROSE (強力陰離子交換劑可自 Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA 獲得)。另外的例示性陰離子交換樹脂包括胺基乙基 (AE)、二乙基胺基乙基 (DEAE)、二乙基胺基丙基 (DEPE) 及季胺基乙基 (QAE)。

用於治療人類疾病之重組 AAV 顆粒的純化製造方法應達成以下目標：1) 一致的顆粒純度、效力及安全性；2) 製造方法的可擴展性；3) 可接受的製造成本。

WO 2019/006390 報導純化重組 AAV 顆粒的例示性方法。

下方概述純化重組腺相關病毒顆粒 (rAAV 顆粒) 及可擴展到大規模的生產方法。例如，針對 5 升、10 升、10-20 升、20-50 升、50-100 升、100-200 升或更多升體積的懸浮培養物。重組腺相關病毒顆粒純化及生產方法適用於各種 AAV 血清型/殼體變異體。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，純化 rAAV 顆粒包含以下步驟： a) 收穫包含 rAAV 顆粒之哺乳動物細胞及/或細胞培養上清液以產生收穫物； b) 視情況地濃縮在步驟 (a) 中產生的收穫物以產生濃縮收穫物； c) 裂解在步驟 (a) 中產生的收穫物或裂解在步驟 (b) 中產生的濃縮收穫物以產生裂解物； d) 處理在步驟 (c) 中產生的裂解物以減少裂解物中的污染核酸，從而產生核酸減少的裂解物； e) 視情況地過濾在步驟 (d) 中產生的核酸減少的裂解物，以產生澄清裂解物，且視情況地稀釋澄清裂解物以產生經稀釋之澄清裂解物； f) 將步驟 (d) 的核酸減少的裂解物、步驟 (e) 的澄清裂解物或步驟 (e) 中產生的經稀釋之澄清裂解物經受陽離子交換管柱層析，以產生包含 rAAV 顆粒的管柱洗脫液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地稀釋管柱洗脫液，以產生經稀釋之管柱洗脫液； g) 將在步驟 (f) 中產生的管柱洗脫液或經稀釋之管柱洗脫液經受陰離子交換層析，以產生包含 rAAV 顆粒的第二管柱洗脫液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或生產/程序相關雜質分離，並視情況地濃縮第二管柱洗脫液，以產生經濃縮之第二管柱洗脫液； h) 將在步驟 (g) 中產生的第二管柱洗脫液或經濃縮之第二管柱洗脫液經受粒徑篩析管柱層析 (SEC)，以產生包含 rAAV 顆粒的第三管柱洗脫液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或生產/程序相關雜質分離，並視情況地濃縮第三管柱洗脫液，以產生經濃縮之第三管柱洗脫液；及 i) 過濾在步驟 (h) 中產生的第三管柱洗脫液或經濃縮之第三管柱洗脫液，從而產生純化的 rAAV 顆粒； 其中轉染/生產前的哺乳動物細胞已使用如本發明之方法獲得。

在某些實施例中，保持步驟 (a) 至 (f) 並與以下步驟組合： g) 將在步驟 (f) 中產生的管柱洗脫液或經濃縮之管柱洗脫液經受粒徑篩析管柱層析 (SEC)，以產生包含 rAAV 顆粒的第二管柱洗脫液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地稀釋第二管柱洗脫液，以產生經濃縮之第二管柱洗脫液； h) 將第二管柱洗脫液或在步驟 (g) 中產生的經稀釋之第二管柱洗脫液經受陰離子交換層析，以產生包含 rAAV 顆粒的第三管柱洗脫液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質生產/程序相關雜質分離，並視情況地稀釋第三管柱洗脫液，以產生經稀釋之第三管柱洗脫液；及 i) 過濾在步驟 (h) 中產生的第三管柱洗脫液或經濃縮之第三管柱洗脫液，從而產生純化的 rAAV 顆粒。

在某些實施例中，保持步驟 (a) 至 (g) 並與以下步驟組合： h) 過濾在步驟 (g) 中產生的第二管柱洗脫液或經濃縮之第二管柱洗脫液，從而產生純化的 rAAV 顆粒。

在實施例中，保持步驟 (a) 至 (e) 並與以下步驟組合： f) 將在步驟 (d) 中的核酸減少的裂解物或在步驟 (e) 中產生的澄清裂解物或經稀釋之澄清裂解物經受 AAV 親和力管柱層析，以產生包含 rAAV 顆粒的管柱洗脫液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地濃縮管柱洗脫液，以產生經濃縮之管柱洗脫液； g) 將在步驟 (f) 中產生的管柱洗脫液或經濃縮之管柱洗脫液經受粒徑篩析管柱層析 (SEC)，以產生包含 rAAV 顆粒的第二管柱洗脫液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地稀釋第二管柱洗脫液，以產生經稀釋之第二管柱洗脫液； h) 視情況地將在步驟 (g) 中產生的第二管柱洗脫液或經稀釋之第二管柱洗脫液經受陰離子交換層析，以產生包含 rAAV 顆粒的第三管柱洗脫液，從而將 rAAV 顆粒與蛋白質雜質或其他的生產/程序相關雜質分離，並視情況地稀釋第三管柱洗脫液，以產生經稀釋之第三管柱洗脫液；及 i) 過濾在步驟 (g) 中產生的第二管柱洗脫液或經稀釋之第二管柱洗脫液，或過濾在步驟 (h) 中產生的第三管柱洗脫液或經濃縮之第三管柱洗脫液，從而產生純化的 rAAV 顆粒。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (b) 及/或步驟 (f) 及/或步驟 (g) 及/或步驟 (h) 的濃縮係經由超濾/滲濾，例如經由切向流過濾 (TFF)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (b) 的濃縮將收穫的細胞及細胞培養上清液的體積減少約 2-20 倍。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (f) 及/或步驟 (g) 及/或步驟 (h)的濃縮將管柱洗脫液的體積減少約 5-20 倍。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (a) 中產生的收穫物或步驟 (b) 中產生的濃縮收穫物的裂解係經由物理或化學方式。物理方式的非限制性實例包括微流化及均質化。化學方式的非限制性實例包括清潔劑。清潔劑包括非離子清潔劑及離子清潔劑。非離子清潔劑的非限制性實例包括 Triton X-100。清潔劑濃度的非限制性實例為約 0.1% 及 1.0% (v/v) 或 (w/v) 之間 (包括端值)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (d) 包括用核酸酶處理從而減少汙染核酸。核酸酶的非限制性實例包括 benzonase。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，經由過濾器來過濾步驟 (e) 的澄清裂解物或稀釋澄清裂解物。過濾器的非限制性實例為孔徑介於約 0.1 至 10.0 微米之間 (包括端值) 的過濾器。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (e) 之稀釋澄清裂解物係使用緩衝磷酸鹽、乙酸鹽或 Tris 水溶液。溶液 pH 的非限制性實例為介於約 pH 4.0 與 pH 7.4 之間 (包括端值)。Tris 溶液 pH 的非限制性實例為大於 pH 7.5，例如介於約 pH 8.0 與 pH 9.0 之間 (包括端值)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (f) 之稀釋管柱洗脫液或步驟 (g) 之稀釋第二管柱洗脫液係使用緩衝磷酸鹽、乙酸鹽或 Tris 水溶液。溶液 pH 的非限制性實例為介於約 pH 4.0 與 pH 7.4 之間 (包括端值)。Tris 溶液 pH 的非限制性實例為大於 pH 7.5，例如介於約 pH 8.0 與 pH 9.0 之間 (包括端值)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，將步驟 (i) 產生的 rAAV 顆粒與界面活性劑一起調配，以產生 rAAV 顆粒調配物。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (f)、(g) 及/或 (h) 的陰離子交換管柱層析包含聚乙二醇 (PEG) 調製之管柱層析。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，在 rAAV 顆粒從管柱洗脫之前，用 PEG 溶液洗滌步驟 (g) 及/或 (h) 的陰離子交換管柱層析。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，PEG 具有約 1,000 g/mol 至 80,000 g/mol 之範圍內 (包括端值) 的平均分子量。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，PEG 的濃度為約 4% 至約 10% (w/v) (包括端值)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，在 rAAV 顆粒從管柱洗脫之前，用界面活性劑水溶液洗滌步驟 (g) 及/或 (h) 的陰離子交換管柱。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，在rAAV 顆粒從管柱洗脫之前，用界面活性劑溶液洗滌步驟 (f) 的陽離子交換管柱。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，PEG 溶液及/或界面活性劑溶液包含含水性 Tris-HCl/NaCl 緩衝液、水性磷酸鹽/NaCl 緩衝液或水性醋酸鹽/NaCl 緩衝液。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，緩衝液或溶液中的 NaCl 濃度係介於約 20-300 mM NaCl 之間 (包括端值) 或介於約 50-250 mM NaCl (包括端值) 之間的範圍內。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，界面活性劑包含陽離子界面活性劑或陰離子界面活性劑。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，界面活性劑包含十二碳鏈界面活性劑。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，界面活性劑包含十二烷基三甲基氯化銨 (DTAC) 或十二烷基肌胺酸鈉 (Sarkosyl)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，以水性 Tris-HCl/NaCl 緩衝液自步驟 (f)、(g) 及/或 (h) 的陰離子交換管柱洗脫出 rAAV 顆粒。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，Tris-HCl/NaCl 緩衝液包含100-400 mM NaCl (包括端值)，視情況地為具有約 pH 7.5 至約 pH 9.0 (包括端值) 之範圍內的 pH。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，用水性 Tris-HCl/NaCl 緩衝液洗滌步驟 (f)、(g)及/或 (h) 的陰離子交換管柱。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，水性 Tris-HCl/NaCl 緩衝液中的 NaCl 濃度係在約 75-125 mM 的範圍內 (包括端值)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，水性 Tris-HCl/NaCl 緩衝液具有約 pH 7.5 至約 pH 9.0 的pH (包括端值)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，洗滌一次或多次步驟 (f)、(g) 及/或 (h) 的陰離子交換管柱，以減少第二管柱洗脫液或第三管柱洗脫液中空殼體的量。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，陰離子交換管柱之洗滌在 rAAV 顆粒洗脫之前及/或在 rAAV 顆粒洗脫時自管柱中移除空殼體，從而減少在第二管柱洗脫液或第三管柱洗脫液中空殼體的量。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，陰離子交換管柱之洗滌在 rAAV 顆粒洗脫之前及/或在 rAAV 顆粒洗脫時自管柱中移除總空殼體的量至少約 50%，從而減少在第二管柱洗脫液或第三管柱洗脫液中空殼體的量約 50%。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，水性 Tris-HCl/NaCl 緩衝液中的 NaCl 濃度係在約 110-120 mM 的範圍內 (包括端值)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，洗脫之 rAAV 顆粒及空殼體的比率及/或量係由洗滌緩衝液控制。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，自步驟 (f) 之陽離子交換管柱之水性磷酸鹽/NaCl 緩衝液或水性乙酸鹽/NaCl 緩衝液中，洗脫出 rAAV 顆粒。緩衝液中之非限制性 NaCl 濃度為約 125-500 mM NaCl 的範圍內 (包括端值)。緩衝液之 pH 的非限制性實例為約 pH 5.5 至約 pH 7.5 之間 (包括端值)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (f)、(g) 及/或 (h) 的陰離子交換管柱包含季銨官能基團，例如季銨化聚乙烯亞胺。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (g) 及/或(h) 的粒徑篩析管柱 (SEC) 具有約 10,000 g/mol 至約 600,000 g/mol 的分離/分餾範圍 (分子量) (包括端值)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，步驟 (f) 的陽離子交換管柱包含磺酸或官能團例如磺丙基。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，AAV 親和力管柱包含結合至 AAV 殼體蛋白的蛋白質或配體。蛋白質的非限制性實例包括結合至 AAV 殼體蛋白的抗體。更具體的非限制性實例包括結合至 AAV 殼體蛋白的單股駱馬 (駱駝科) 抗體。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，方法排除氯化銫梯度超速離心的步驟。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，從步驟 (a) 中產生的收穫物或步驟 (b) 中產生的濃縮收穫物中，本方法回收大約 50-90％ 的總 rAAV 顆粒。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，相較於經由單一 AAV 親和力管柱純化產生或純化的 rAAV 顆粒，本方法產生的 rAAV 顆粒具有較高的純度。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，實質上同時進行步驟 (c) 及 (d)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，在步驟 (c) 之後但在步驟 (f) 之前，將 NaCl 濃度調整至約 100-400 mM NaCl 的範圍內 (包括端值) 或至約 140-300 mM NaCl 的範圍內 (包括端值)。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，細胞為懸浮生長或貼附生長細胞。

在所有態樣及實施例的某些實施例中，細胞為哺乳動物細胞。非限制實例包括 HEK 細胞，諸如 HEK-293 細胞及 CHO 細胞，例如 CHO-K1 細胞。

用於判定含有轉基因之 rAAV 顆粒的感染滴度方法為本領域所習知 (參見，例如 Zhen 等人，Hum. Gene Ther. 15 (2004) 709)。用於測定具包裝轉基因之空殼體及 rAAV 顆粒的方法為習知 (參見，例如 Grimm 等人，Gene Therapy 6 (1999) 1322-1330；Sommer 等人，Malec.7 (2003) 122-128)。

為判定降解/變性殼體的存在或數量，可對純化的 rAAV 顆粒進行 SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，該凝膠電泳由能夠分離三種殼體蛋白之的任何凝膠 (例如梯度凝膠) 所組成，然後運行凝膠直到樣品分離，並將凝膠轉印到尼龍膜或硝酸纖維素膜上。然後將抗 AAV 殼體抗體作為結合至變性殼體蛋白的初級抗體 (參見，例如 Wobus 等人，J. Viral.74 (2000) 9281-9293)。結合至初級抗體的二級抗體包含檢測初級抗體的方式。使用半定量檢測初級抗體與二級抗體之間的結合以判定殼體的數量。另一種方法是使用具 SEC 管柱的分析級 HPLC 或分析級超速離心機。

灌流

由於灌流生物反應器中培養基的連續交換，提供了經由進料連續供給營養素及經由滲透物連續去除廢物兩者。因此，可克服在饋料批次製程中觀察到的對細胞生長及生存力產生負面影響的廢物積累。此外，連續培養基更新提供了更穩定的細胞環境，其有利於細胞生長、健康、代謝及產物品質 (Chotteau, V.，「Perfusion Processes」，收錄於 Animal Cell Culture，M. Al-Rubeai (主編) Cham: Springer International Publishing，2015，第 407-443 頁；Karst, D. J. 等人，Curr. Opin. Biotechnol. 53 (2018) 76-84；Walther, J. 等人，Biotechnol. J.，14 (2019) e1700733)。

在病毒載體生產之背景下，越來越多的研究重點關注灌流技術，以進一步提高生產產量、改善滿空比 (F/E) 並降低病毒載體生產成本。灌流模式已被驗證係在 HEK293 細胞中生產腺病毒、反轉錄病毒、慢病毒及 AAV 載體的有利策略 (Ghani, K. 等人，Biotechnol. Bioeng. 95 (2006) 653-660；Henry, O. 等人，J. Process Cont.17 (2007) 241-251；Henry, O. 等人，Biotechnol. Bioeng. 86 (2004) 765-774；Ansorge, S. 等人，J. Gene Med. 11 (2009) 868-876；Merten, O. W., J. Gene Med. 6 (2004) S105-S124；Benskey, M.J. 等人，Hum. Gene Ther. Meth. 27 (2016) 32-45；Coronel, J. 等人，Gen. Engin.Biotechnol. News 41 (2021) S23-S23)。

對於病毒載體生產中的灌流，與典型的重組蛋白生物技術生產相比，最重要的目標不再是達到盡可能高的細胞密度及維持長生產階段以提高體積生產力。相反，細胞需要維持在 2 x 10^6 個細胞/mL 左右以實現高效轉染。由於廣泛描述的細胞密度效應 (CDE)，細胞密度越高則越難轉染 (Petiot, E. 等人，Vaccine 33 (2015) 5974-5981；Le Ru, A. 等人，Vaccine 28 (2010) 3661-3671；Bernal, V. 等人，Biotechnol. Bioeng. 104 (2009) 162-180)。在較高的細胞密度下轉染時，轉染效率及生產力皆降低 (Lavado-García, J. 等人，Front. Bioeng. Biotechnol. 8 (2020) Article 617)。

利用連續灌流不斷更新培養基，同時將大部分細胞保持在指數生長期以實現高效轉染 (Henry, O. 等人，Biotechnol. Bioeng. 86 (2004) 765-774；Cortin, V. 等人，Biotechnol. Prog.20 (2004) 858-863)。因此，病毒載體之生產達到某個有限的製程跨度，並可快速收穫釋放至培養基中的病毒載體。

灌流速率描述灌流製程中培養基更新的速率，並且通常表示為每天每個生物反應器工作體積所添加的培養基的體積 (vvd)。文獻中已描述了不同的灌流速率控制策略，包括基於細胞密度、主要受質或副產物濃度的策略。

當灌流製程中的培養基更新標準化為細胞密度時，其表示為細胞特異性灌流速率。如 Dowd 等人所述，基於 CSPR 的灌流控制直接將灌流速率與細胞密度聯繫起來 (Cytotechnol.42 (2003) 35-45)。較低的 CSPR 意味著可用一定量的培養基維持更多細胞。因此，藉由在製程期間保持 CSPR 恆定，可確保細胞在培養物中具有一致的微環境。

為增強製程的經濟潛力，應使體積灌流速率最小化。但是，必須考慮到，若 CSPR 低於下限，則細胞生長不良、生存力下降、產物降解或特定生產力下降可能影響生產或使得無法生產。因此，必須在製程開發期間將最佳 CSPR 調節至接近最小 CSPR (Konstantinov, K. 等人，Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 101 (2006) 75-98；Bielser, J.M. 等人，Biotechnol. Prog.36 (2020) e3026)。

接種系列

習用的接種系列通常從解凍少量冷凍細胞 (諸如，舉例而言，1 mL 來自工作細胞庫的凍存小瓶) 開始。接著，將細胞培養物擴展至更大的培養系統中。為此，在具有增加的體積的搖瓶、旋轉式培養瓶及攪拌罐生物反應器中培養細胞。生產生物反應器通常稱為 N 階段，而生產階段之前的生物反應器按遞減順序命名為 N-1、N-2、N-3。

高密度細胞庫及一次性系統的使用藉由減少接種系列的持續時間及潛在的污染來改善操作成功率。這使得能夠簡化並減少接種系列，從而降低製程複雜性、縮短操作時間並提高產量。

介電譜

介電譜，亦稱為電容測量或射頻阻抗，是一種主要用於在線監測存活細胞密度或活細胞體積的方法。該工具的測量原理係基於活細胞具有完整的不導電細胞膜的特徵。這使得它們能夠儲存電荷，使水性離子懸浮液中的活細胞在被引入射頻範圍 (0.1 至 10 MHz) 的周期性交變電場時表現得像小電容器。

細胞內及細胞外離子的運動受到細胞膜 (用作絕緣物理障壁) 的限制。這導致極化，亦即細胞兩極跨膜的電荷分離。此極化的大小係藉由電容 Δ𝐶 來測量，以皮法拉 (pF) 為單位。

因此，藉由測量懸浮液的電容，可估計其存活細胞密度 (J. P. Carvell 及 J. E. Dowd，Cytotechnol.50 (2006) 35-48； Justice, C. 等人，Biotechnol. Adv. 29 (2011) 391-401；Cole, H.E. 等人，Processes 3 (2015) 384-405)。

對於大多數細胞，此 S 形曲線以臨界頻率 𝑓𝑐 為中心在 0.5 MHz 與 3 MHz 之間。臨界頻率為電容下降完成一半時的頻率 (Cannizzaro, C. 等人，Biotechnol. Bioeng. 84 (2003) 597-610)。通常，介電譜在接近該頻率的頻率下進行，因為此處電容與細胞大小無關 (Justice, C.，同上)。

容量隨著細胞體積分數的增加而增加，因為存在更多的極化膜，其繼而提供更高的實測電容。一般而言，電容不僅取決於 VCD，亦取決於細胞類型、細胞大小及細胞的生理狀態。

對於 VCD 預測，需要數學模型以將電容訊號與離線生物量資料關聯起來：將電容 Δ𝐶 乘以細胞常數 K (以 1/cm 為單位給出)，以獲得絕對介電常數 𝜀 (以 pF/cm 為單位)： 𝜀 = Δ𝐶 * 𝐾                                                 (1)

用於控制灌流製程 (其中灌流進料基於來自在線電容探針的活細胞濃度自動調節) 的生物電容值已在若干研究中得到證明 (Carvell 及 Dowd，同上；Cannizzaro, C. 等人，同上)。此外，介電譜正成為監測病毒載體生產製程的相關工具，因為它提供了有關細胞生理狀態的關鍵資訊 (Pais, D. A. M. 等人，Processes 8 (2020) 1456；Escandell, J.M. 等人，Curr. Opin. Biotechnol. 74 (2022) 271-277)。

如本發明之方法的實施例

將重組 AAV 顆粒的生產方法放大至 100 L、500 L 或甚至 1,000 L 對細胞擴增以及質體轉染兩者皆提出了重大挑戰。

實現高殼體效價係重組 AAV 顆粒生產的目標。因此，產生大量細胞團引起空殼體之產生不適合實現這一目標。

因此，生產病毒載體的灌流製程的重點并非達到高細胞密度，而是藉由確保不斷更換培養基來減輕營養素限制。

多種細胞截留裝置可用於病毒載體製造方法中的細胞截留。最常用的是交替切向流過濾 (ATF)、切向流過濾 (TFF)、濾聲器及基於膜的內部截留系統。

ATF 技術使用經由單個端口連接至生物反應器的中空纖維模塊。使用隔膜泵，將細胞懸液泵送透過中空纖維模塊 (細胞截留於其中)，並收穫含有所關注產物的透明上清液。接著，為減少膜污染，將流向逆轉，並將剩餘細胞懸液沖回生物反應器中。隔膜泵產生快速低剪切流，確保細胞快速返回生物反應器。最近，Coronel 等人已經表明，可應用 ATF 系統灌流以增加 rAAV 顆粒生產 (Gen. Engin.Biotechnol. News 41 (2021) S23-S23)。

然而，在如本發明之方法的一個具體實施例中，灌流并非藉由 ATF 完成。

更詳言之，TFF 技術使用與 ATF 可比較之中空纖維繫統，但使用低剪切循環泵而非隔膜泵及兩個生物反應器端口。一個端口從生物反應器中抽取液體，另一個端口使液體從外部細胞截留裝置返回生物反應器。不同的 TFF 系統可商購獲得 (Cytiva 的 Xcellerex APS™、Repligen 的 KML100™ 或 Merck 的 Cellicon™) 以用於此應用。

基於懸浮液的細胞培養為貼壁培養的重要步驟以提供可擴展性。然而，與貼壁細胞相比，單位體積細胞密度一般而言較低。因此，必須在單位體積達到高細胞密度以接近貼壁培養物中的轉染效率。此外，在整個全接種系列及生產方法中需要始終良好的細胞生長及生存力以確保高生產力。隨著生產量的增加，這變得更加困難，例如，關於充足的氣體輸入、高效混合及營養素供給。因此，細胞需要適應不斷變化的環境。再者，培養參數的每一次變化皆觸發細胞的內部控制機制並活化反應，這可能導致細胞及產物產量降低或副產物形成增加。

此外，關於轉染過程，在放大期間經常發生轉染效率的下降。

為改善重組 AAV 顆粒的生產，有必要改善接種系列，以便防止受質耗竭及廢物大量積累。

這係藉由確保轉染前細胞的最佳生理狀態來達到。從而能夠實現高轉染效率。這已藉由將生產生物反應器中廢培養基的比例從約 40% 降至約 20% 來達到。因此，存在較低濃度的抑制性廢物，同時提高了營養素的濃度。這使得在 N-製程開始時將細胞生長速率從約 0.3/d 改善至約 1.0/d。此外，可藉由省略一個生物反應器來簡化接種系列。從而降低製程複雜性。此外，藉由使用基於在線存活細胞密度 (VCD) 測量 (例如使用介電譜) 的自動灌流，並應用細胞特異性灌流速率 (CSPR)，所需之灌流培養基可減少約三分之一。

此外，藉由使用如本發明之方法，可更精確地控制主發酵罐 (亦即生產生物反應器) 中轉染時的細胞密度。從而可減小或甚至防止所謂的細胞密度效應 (亦即轉染時細胞密度的超越量)，其導致 AAV 生產中的生產產量較低。

本發明至少部分地基於以下發現：對於 AAV 顆粒的生產，較佳係宿主細胞在轉染之前已經繁殖，從而使用灌流生產 AAV 顆粒。更詳言之，已經發現較佳係使用灌流在預培養物中繁殖哺乳動物細胞進行 AAV 顆粒的重組生產。本發明的優點在於，在轉染前使用灌流繁殖的哺乳動物細胞以較高的生長速率及較高的有絲分裂活性維持生長，並在轉染後 (亦即在生產培養期間) 顯示出較高的生存力。因此，雖然具有相同的接種細胞密度，但與其中使用在轉染前僅使用分批或饋料批次方法培養的哺乳動物細胞所進行的培養相比，可達到更高的效價。

本發明至少部分地基於以下發現：對於從低細胞密度開始在細胞培養物中生產 AAV 顆粒，較佳係在用轉基因編碼核酸轉染前藉由灌流繁殖哺乳動物細胞並稀釋繁殖的哺乳動物細胞。

已經發現，在不使用灌流的情況下，營養素過度減少，並且廢物在預培養期間中積累的量使得所獲得的細胞受到嚴重影響，並且由於培養期間細胞生長受影響而不再適合隨後的 AAV 顆粒生產。

在以下實例中，參數 (諸如細胞株、AAV 血清型、培養基、轉染試劑) 以及製程參數 (諸如溫度、pH 及 pO2) 保持恆定或高度相似，以便直接比較用不同製程所獲得的結果。因此，所觀察到的改善直接由培養條件 (亦即用於在轉染前繁殖細胞的進料) 的差異引起。

在比較例中，重組 AAV 顆粒的生產係以 100 L 規模進行。

將主發酵罐設定為用 20*10^5 個細胞/mL 的細胞密度及 60 L 的起始體積接種，必須在 N-1 階段發酵後達到 1.2*10^11 個細胞的目標。在 N-1 階段使用 25 L 的工作體積，N-1 中所需的最終密度為至少 48*10^5 個細胞/mL。由於已知細胞幾乎每天翻倍並且為了增加安全裕量，用 8*10^5 個細胞/mL 進行 N-1 的接種，以達到大約 60*10^5 個細胞/mL 的最終密度。N-2 階段發酵根據同樣的考量用 5*10^5 個細胞/mL 接種，三天後達到約 40*10^5 個細胞/mL。選擇接種系列中的 pH 值以支持高細胞生長，同時限制葡萄糖消耗及有毒廢物之積累。在主發酵罐中，略微增加 pH 值以增加 AAV 產量及其向培養基中的釋放。

然而，隨著細胞生長及生存力接著在 N-2 階段劣化，N-1 階段的 25 L 搖床出現重大問題。再者，細胞在轉移至主發酵罐後未恢復，因為它們已經損傷過多。這意味著可能無法進行轉染，因為高效轉染需要非常高的生存力。

在 N-1 階段觀察到比 N-2 階段更差的細胞生長。在 N-2 階段，細胞在三天的生長期間從 4*10^5 個細胞/mL 增長至幾乎 40*10^5 個細胞/mL。然而，在接下來的 N-1 階段，細胞從 7.8*10^5 個細胞/mL 開始，在同一時間跨度內僅達到 28.6*10^5 個細胞/mL。

在 N-2 階段，0.79/d 的高增長率在 N-1 階段的第一天後開始下降並急劇下降，三天後僅達到 0.47/d。同時，在 N-2 階段一直保持在高位準的生存力在 N-1 階段從 97.5% 逐漸下降至 92.4%。將細胞懸液轉移至主發酵罐後，細胞沒有恢復。相反，在計劃的轉染之前，生存力從 94% 繼續下降至 86.9%。因此，無法進行轉染。四天後，生存力繼續下降至 70%，增長率亦下降，其於製程結束時下降至 0.14/d。

在 N-2 發酵罐末端無限制。再者，在轉移至 N-1 發酵罐時加入新鮮培養基，使受質濃度增加回其初始值。然而，在製程結束時，在 N-1 階段出現葡萄糖限制，濃度為 0.4 g/L。不受該理論的束縛，細胞生長不佳的另一個原因可能是廢物的大量產生及積累。在 N-2 期間，已積累大量乳酸鹽及銨。這導致 N-1 階段的起始濃度已高於 N-2 階段的起始濃度。因此，在 N-2 階段結束時達到幾乎 5 g/L 乳酸鹽及 52 mg/L 銨。

由於 N-1 末端的 VCD 較低，必須將整個發酵體積轉移至主發酵罐中，並將起始體積減少至 50 L 而非 60 L，以達到所需的接種密度 20*10^5 個細胞/mL。

這可以從圖 1 中看出。藍色 = N-2，饋料批次；綠色 = N-1，饋料批次；紅色 = 生產階段。細胞在培養中生長不充分，導致 AAV 生產轉染效率低。

現已發現，在如本發明之方法生產 AAV 顆粒之前在哺乳動物細胞的繁殖中使用灌流引起改善，與灌流為非受控灌流亦或受控灌流無關。

在如本發明的第一實例中，在 N-1 階段使用灌流，設定固定的灌流速率。灌流速率每天增加一次，從 0.21 vvd (第 1 天) 經 0.42 vvd (第 2 天) 增加至 0.63 vvd (第 3 天)。因此，在本實例中，灌流期間總共向細胞培養物輸送 29.1 L 或 1.16 倍生物反應器體積的培養基。

然而，需要調整通氣控制，因為 pO2 值波動劇烈並在接種後直接下降至幾乎 0%。為改善進入發酵罐中的氧氣輸入，在 3.5 小時後增加搖動速率，並在 25.5 小時後進一步增加。此處使用的 O2 控制器為比例-積分-導數 (PID) 控制器。其基本工作原理為：讀取感測器，計算預期設定點 (SP) 與實測製程值 (PV) 之間的差異，然後藉由設定期望的致動器輸出來應用校正。此輸出係藉由計算比例、積分及導數響應並將這三個分量加和來計算。為減少控制器超調，在 6.5 小時後關閉積分項。此後僅使用比例及導數增益。26.5 小時後，將通氣速率從 500 mL/min 增加至 1000 mL/min。

與不進行灌流的比較 N-1 製程相比，細胞顯示出更高的細胞生長，從 10.9*10^5 個細胞/mL 的起始 VCD 增加至高達 92.3*10^5 個細胞/mL 的 VCD。因此，與不進行灌流的比較第一運行相比，使用僅提高至 1.4 倍的接種密度，達到 3.2 倍的細胞密度。在整個運行過程中，生存力在接種一天後保持在高位準，最低為 96.9%，這與不進行灌流時生存力的急劇下降形成鮮明對比。開始時生長速率非常高，為 1.05/d，但在該製程期間下降，三天後降至 0.76/d。因此，生長速率在開始時及結束時分別為不進行灌流的比較 N-1 發酵中的生長速率的 1.3 倍及 1.6 倍。因此，不僅絕對生長速率增加，而且進行灌流的製程中生長速率的下降亦減少。

在主發酵中接種後 1.5 小時的遲滯期後細胞恢復生長。

N-2 和 N-1 階段的細胞生長極好，N-2 階段的最終 VCD 為 44*10^5 個細胞/mL。在 N-1 階段，由於灌流，達到 92*10^5 個細胞/mL 的更高 VCD。再者，生存力始終保持在 97% 以上的高位準，N-2 階段的最終生長速率 0.64/d 及 N-1 階段的最終生長速率 0.77/d 確認接種系列中良好的細胞增殖。此生長在主發酵罐開始時繼續，生長速率為 0.80/d，其意味著細胞懸液從 N-1 階段成功轉移至 N 階段生物反應器中。

如所預期的，在第 1 天轉染細胞培養物後生長速率下降，在第 4 天收穫前直接下降至 0.12/d 的最終值。亦應注意，主要發酵係以 26.77*10^5 個細胞/mL 而非 20*10^5 個細胞/mL 的細胞密度接種。因此，加入培養基前的細胞密度為 52*10^5 個細胞/mL，高於期望的 36*10^5 個細胞/mL。

不同培養體積 (規模) 下非受控灌流結果如圖 2 所示。藍色 = N-2，規模為 10 L 的饋料批次；綠色 = N-1，規模為 25 L 的非受控灌流；紅色 = 規模為 100 L 的生產階段。灌流速率每天從 0.21 vvd 改變為 0.42 vvd，再改變為 0.63 vvd。這導致所繁殖的細胞的持續生長及高生存力。成功完成血清型 8 的 AAV 顆粒的生產。

然而，儘管藉由灌流補充營養素，但葡萄糖及麩醯胺酸之濃度與不進行灌流的製程一樣下降。因此，在發酵結束時發生受質限制。不受該理論的束縛，這可以藉由用灌流達到顯著更高的細胞密度，更多細胞亦消耗更高的絕對受質量的事實來解釋。這意味著所應用的灌流速率不足以供給足夠的營養素以在快速生長的細胞培養物中保持濃度恆定。因此，調整灌流速率以減少或甚至消除受質之耗竭。因此，採用存活細胞密度受控 (VCD 受控) 之灌流。

因此，如實例部分所概述計算灌流速率。利用來自如本發明之第一實例的 0.764/d 的平均比生長速率來計劃 VCD。N-1 發酵的目標是在 25 L 工作體積下達到大約 60*10^5 個細胞/mL 的最終 VCD，以便為主發酵罐的接種提供充足的細胞。因此，可減少 N-1 發酵的工作體積，同時仍以更高的細胞密度達到所需之細胞數。若工作體積減少至 10 L，則需要至少 120*10^5 個細胞/mL 的最終細胞密度。根據來自第一灌流運行的 0.764 的生長速率，將需要 15*10^5 個細胞/mL 的接種密度以達到 150*10^5 個細胞/mL 的最終細胞密度。使用工作體積為 1 L 的縮小模型。

根據預測的 VCD 判定細胞特異性受質消耗。將葡萄糖及麩醯胺酸的細胞特異性消耗速率 (分別為 7.50*10^-10 g/細胞/d 及 1.20*10^-10 g/細胞/d) 計算為在不進行灌流的 10 L 搖床中使用 HEK293 細胞的前兩個製程的平均值。然後利用這些值判定為該細胞特異性消耗提供充足受質所需的灌流速率。由於保持麩醯胺酸濃度恆定所需的灌流速率低於保持葡萄糖濃度恆定所需的灌流速率，因此使用保持葡萄糖濃度恆定所需的灌流速率。灌流速率每天增加一次。為避免臨時培養基供給中斷或製程可變性所造成的營養素限制，在一天結束時使用預測的 VCD 計算每個日速率。

所計劃的 VCD 僅略高於製程結束時實際測量的 VCD。判定的生長速率為 0.673/d，為預測值的 0.9 倍。這導致 2.9 天後最終細胞密度為 128*10^5 個細胞/mL。在該製程期間中，使用每日測量的受質濃度及 VCD 手動重新調節灌流速率。接著所得灌流速率與基於製程條件的灌流速率非常吻合。總體而言，灌流需要 2.36 L 培養基，對應於 2.36 倍生物反應器體積。

在最後一個製程部分，VCD 在具有受控灌流速率的運行中增加更多，達到最終值 128*10^5 個細胞/mL，而非第一灌流運行中的 92.3*10^5 個細胞/mL。此趨勢亦反映在生長速率上。在第一灌流製程中，生長速率在該製程期間下降，尤其是在 2.2 天與 2.9 天之間從 0.90/d 下降至 0.77/d。在具有受控灌流速率的製程中，生長速率總體較低，平均值為 0.67/d，但保持相對穩定，甚至在快要結束時有所增加。

生存力亦顯示在第一灌流製程結束時略有下降，而在具有受控灌流速率的灌流製程中保持恆定或在快要結束時略有增加。

具有經調整之灌流速率的受控灌流製程防止培養結束時葡萄糖及麩醯胺酸的限制。然而，受質濃度無法保持恆定，乳酸鹽及麩胺酸鹽濃度與第一灌流製程中相似或略高。

1 l 規模下的存活細胞密度受控 (VCD 受控) 灌流的結果如圖 3 所示 (受控灌流)。使用基於細胞密度測量及細胞生長的計算的細胞特異性消耗速率來計算灌流速率。未觀察到受質限制。為達到 80 至 100*10^5 個細胞/mL 的目標細胞密度，3 天後完成細胞分裂。

使用來自先前灌流製程的生長速率預測 VCD，進一步改善了如本發明之方法。VCD 預測為後續判定灌流速率提供了必要的基礎。藉由受控灌流，不可能保持受質濃度恆定，但可以避免受質限制。這使得獲得始終良好的細胞生長及生存力，直至到該製程結束時具有恆定的生長速率。與第一灌流製程相比，受控灌流製程使用兩倍之多的灌流介質。

100 l 規模下的 VCD 受控灌流的結果如圖 4 所示。綠色 = N-1，受控灌流；紅色 = 生產階段。成功完成了亞型 2 變異體 7m8 的 AAV 顆粒的生產。

將 N-1 生物反應器的發酵罐體積增加至 15 L，以達到足夠高的細胞密度用於主發酵罐的接種。然而，三天後需要大約 13*10^5 個細胞/mL 的接種 VCD 以達到 100*10^5 個細胞/mL 的目標密度，從而導致需要相對高體積的預培養。因此，N-1 製程運行更長的時間段，在本實例中為六天。然而，這將需要 1.6*10^5 個細胞/mL 的非常低的接種 VCD。此類低接種 VCD 難以精確設定，因為細胞聚集可能導致測量不准確。即使由此導致的微小偏差亦可能導致最終 VCD 過低或培養基消耗量過高，因為培養基消耗量隨 VCD 呈指數增加。此問題的解決方案係用更高、易於調節的 VCD 進行接種，並在製程中間分離細胞培養物，以盡可能準確地達到所需的最終 VCD。因此，接下來的灌流製程係用 5*10^5 個細胞/mL，第 3 天分裂至 13*10^5 個細胞/mL，使得六天後最終 VCD 達到大約 100*10^5 個細胞/mL。

三天後，將細胞培養物從 55.4*10^5 個細胞/mL 分流為 10.5*10^5 個細胞/mL，導致最終 VCD 為 97.4*10^5 個細胞/ml。判定分流後第一生長期的平均生長速率為 0.77/天，第二生長期的平均生長速率為 0.78/天。這與根據前兩個灌流製程所預測的平均生長速率 0.72/d 密切相關。接種後即刻的生存力為 96%。

在整個製程中總共加入 3.3 倍生物反應器體積的灌流培養基。在第一生長階段期間未發生受質限制，受質濃度仍然高於先前的灌流製程中的濃度。然而，與第一 1 L 灌流製程中的 17.4*10^5 個細胞/mL 相比，接種 VCD 較低，達到 5.8*10^5 個細胞/mL。

雖然 N-1 發酵罐的這一新設置未縮短接種系列的總體持續時間，但由於 N-1 階段的接種密度較低，因此其允許移除 N-2 發酵罐。

使用電容探針生成的介電常數訊號重複該過程，以控制灌流速率 (包括在第 3 天繁殖後分裂)。這得到如本發明之方法的具有自動灌流控制的製程。證明在離線測量的 VCD 與在線測量的介電常數之間具有線性相關性。所發現的存活細胞密度與介電常數的相關性使得能夠更經濟地控制灌流製程，導致灌流培養基減少約 30% (從 3.3 倍反應器體積減少到 2.2 倍反應器體積)。介電常數受控灌流製程的細胞密度曲線如圖 5 所示 (N-1，介電常數受控灌流，10 L 規模)。對於該示例性製程，所應用的細胞特異性灌流速率為 107 pL/細胞/天。在其他實例中，已應用 101 pL/細胞/天的 CSPR。

使用在線生物量感測器重複該製程，以控制灌流速率 (包括在第 3 天繁殖後分裂)。成功完成包含編碼治療性 Fab 的轉基因的 2 亞型變異體 7m8 的 AAV 顆粒之生產。生物量感測器受控灌流製程的細胞密度曲線如圖 6 所示。綠色 = N-1，生物量感測器受控灌流；紅色 = 生產階段。

圖 7 示出兩對 VCD 受控灌流與生物感測器受控灌流的存活細胞密度：紅色 (VCD) 與紫色 (生物感測器)；藍色 (VCD) 與綠色 (生物量感測器)。

圖 8 示出在不同生產規模的培養中所獲得的活密度，該等培養接種在 N-1 階段進行灌流 (亦即如本發明) 及在 N-1 階段不進行灌流所獲得的細胞接種。紅色曲線對應於接種來自不進行灌流的 N-1 培養的細胞的生產規模培養，綠色曲線 (標記為「1」、「2」、「3」、「4」) 對應於接種來自如本發明進行灌流的 N-1 培養的細胞的生產規模培養。可以看出，在接種 N-1 階段灌流繁殖的細胞的培養中所獲得的存活細胞密度較高，引起較高的 AAV 顆粒產量 (在培養開始後 24 小時轉染)。

圖 9 示出生產規模培養 N 階段細胞的生存力取決於用於接種 N 階段的細胞在 N-1 階段的培養。紅色曲線對應於接種獲自批次 N-1 培養的細胞的生產培養物。綠色曲線 (表示為「1」、「2」、「3」及「4」) 對應於接種獲自如本發明之 N-1 灌流培養的細胞的生產規模培養。可以看出，由 N-1 灌流得到的細胞在開始後 24 小時後生長得更好並且對轉染有更好的反應，亦即維持更高的生存力。這些細胞仍然進一步生長並不斷產生 rAAV 顆粒。

圖 10 示出在進行及不進行灌流的 N-1 階段培養後，N 階段 ＞ 10 L 的生物反應器系統中生產培養物中的殼體效價。紅色曲線 (「5」、「6」) 對應於批次 N-1 之後的生產培養物。綠色曲線 (「1」、「2」、「3」及「4」) 對應於進行灌流的 N-1 階段之後的生產規模培養物。對於紅色曲線，批式培養 N-1 在同一生物反應器中執行 (因此，N 規模培養第 0 天對應於圖中的第 4 天)。對於可比較之生物反應器系統，使用在 N-1 階段灌流培養的細胞進行接種時，提高殼體效價的效應顯著。

因此，如本發明之方法達到更高的最終細胞密度以及殼體效價。當使用灌流繁殖細胞時，波動範圍亦減小。不受該理論的束縛，認為使用灌流繁殖的細胞對轉染期間的緊迫具有更高的耐受性，恢復更快，維持更高的存活細胞密度並且仍在增長 (儘管緩慢)。 ***

本文提及的所有參考文獻均經由引用併入本文。 ***

提供以下實例、序列和附圖以幫助理解本發明，其真正的範圍在所附申請專利範圍中闡明。應當理解的是，在不脫離本發明之精神的前提下，可以對所提出的步驟進行修改。

實例

一般技術

1) 重組 DNA 技術

使用如下所述之標準方法操作 DNA：Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1989)。  根據製造商的說明使用分子生物試劑。

2) DNA 及蛋白質序列分析及序列資料管理

使用 EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite) 套裝軟體、Invitrogen’s Vector NTI 及 Geneious prime，以創建、定位、分析、註解及說明序列。

3) 基因及寡核苷酸合成

由 Geneart GmbH (Regensburg, Germany) 化學合成製備所需的基因片段。將合成的基因片段選殖到大腸桿菌質體中用以繁殖/擴增。藉由 DNA 定序證實次選殖基因片段的 DNA 序列。或者，藉由對化學合成的寡核苷酸進行黏合或經由 PCR，以組裝短的合成 DNA 片段。由 metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany) 製備各自的寡核苷酸。

4) 試劑

若無另外說明，所有商業化學品、抗體及套組均按照製造商的方案使用。

5) 選殖

一般

使用 R 位點之選殖取決於所關注基因 (GOI) 旁邊的 DNA 序列，該序列等於位於以下片段中的序列。類似地，經由重疊相同序列並隨後由 DNA 連接酶連接組裝 DNA 中的切口，則可組裝片段。因此，有必要選殖單基因，特別是含有正確 R 位點之初步質體。在成功選殖這些初步質體後，經由直接在 R 位點旁邊切割之酶的限制消化，將側翼為 R 位點的所關注基因切掉。最後一步是在一個步驟中組裝所有 DNA 片段。更詳言之，5'-核酸外切酶移除重疊區 (R-位點) 的 5'- 端。之後，可進行 R 位點的黏合，且 DNA 聚合酶延伸 3' 端以填補序列中的空位。最後，DNA 連接酶連接核苷酸之間的缺口。加入含有不同酶 (如核酸外切酶、DNA 聚合酶及連接酶) 的組裝主混合物，並隨後在 50℃ 下培育反應混合物，可將單個片段組裝成一個質體。之後，用質體轉染潛能大腸桿菌細胞。

對於一些質體，使用經由限制酶的選殖策略。藉由選擇合適的限制內切酶，可將所關注所欲基因切下，然後經由連接將其插入至不同的質體中。因此，較佳為使用並以巧妙的方式選擇在多重選殖位點 (MCS) 切割的酶，以便可在正確的陣列中進行片段的連接。如果質體及片段之前用相同的限制酶切割，則片段及質體的黏性端會完美地接合在一起，隨後可經由 DNA 連接酶連接。連接後，用新生成的質體轉染潛能大腸桿菌細胞。

經由限制消化進行選殖

對於使用限制內切酶消化質體，將下表所示的組分吸取至冰上。

表：限制消化反應混合物

組分	ng (設定點)	µL
純化之 DNA CutSmart 緩衝液 (10x) 限制酶 PCR 級水	tbd	tbd 5 1 加至 50
總		50

如果在一次消化中使用更多酶，則使用每種酶 1 µL，並經由加入較多 PCR 級水或較少 PCR 級水來調整體積。選擇所有酶的前提為其符合可與來自 New England Biolabs 之 CutSmart 緩衝液一起使用 (100% 活性) 的資格，且具有相同的培育溫度 (均為 37℃)。

使用熱混合器或熱循環儀進行培育，允許在恆溫 (37℃) 下培育樣品。在培育過程中，不攪動樣品。培育時間設置為 60 分鐘。然後將樣品直接與加載染料混合，並加載到瓊脂糖電泳凝膠上或儲存在 4℃/冰上以備進一步使用。

製備用於凝膠電泳的 1% 瓊脂糖凝膠。因此，將 1.5 g 多用途瓊脂糖稱重到 125 錐形搖瓶中，並注入 150 mL TAE 緩衝液。混合物在微波爐中加熱直至瓊脂糖完全溶解。將 0.5 µg/mL 溴化乙錠加入至瓊脂糖溶液中。然後將凝膠澆注至模具中。瓊脂糖凝固後，將模具放入電泳室，並用 TAE 緩衝液填入電泳室。然後裝載樣品。在第一槽中 (從左邊起算)，加載合適的 DNA 分子量標記物，接著加載樣本。凝膠在 ＜130 V 下運行約 60 分鐘。電泳後，從電泳室中取出凝膠並在 UV 成像儀中進行分析。

切割出標靶條帶並轉移到 1.5 mL Eppendorf 試管中。使用來自 Qiagen 的 QIAquick Gel Extraction Kit 並根據製造商的說明，進行凝膠的純化。將 DNA 片段儲存於 -20℃ 以備進一步使用。

用於連接的片段以 1:2、1:3 或 1:5 的莫耳比吸取在一起，以用於插入質體，莫耳比具體取決於插入片段及質體片段之長度及其之間的相互關係。如果應插入質體的片段很短，則使用 1:5 的比例。如果插入物較長，則使用相較於質體的較少量。每次連接使用 50 ng 量之質體，並使用 NEBioCalculator 計算特定的插入量。使用來自 NEB 的 T4 DNA ligation kit 連接。下表出示連接混合物的實例。

表：連接反應混合物

組分	ng (設定點)	濃度 [ng/µL]	µL
T4 DNA 連接酶緩衝液 (10x) 質體 DNA (4000 bp) 插入 DNA (2000 bp) 無核酸酶水 T4 連接酶			2
50	50	1
125	20	6.25
		9.75
		1
總			20

自混合 DNA 及水開始，加入緩衝液，最後加入酶，所有組分都在冰上吸取。經由上下吸取輕微地混合反應液，短暫微量離心，然後在室溫下培育 10 分鐘。培育後，T4 連接酶在 65℃ 下加熱去活化 10 分鐘。樣品在冰上冷卻。在最後一步，將 2 µL 連接質體轉形 10-β 潛能大腸桿菌細胞 (見下方內容)。

轉化 10-β 潛能大腸桿菌細胞

將用於轉形之 10-β 潛能大腸桿菌細胞在冰上解凍。之後，將 2 µL 質體 DNA 直接吸取至細胞懸液中。輕彈試管並置於冰上 30 分鐘。此後，將細胞放入 42℃ 的熱塊中並精確熱休克 30 秒。緊接著，將細胞在冰上急冷 2 分鐘。將 950 µL 的 NEB 10-β Outgrowth Medium 加入至細胞懸液中。將細胞在 37℃ 下振盪培育一小時。然後，將 50-100 µL 吸取至預熱 (37℃) 的 LB-Amp 瓊脂平盤上，並以一次性抹刀塗抹。將平盤在 37℃ 下培育隔夜。只有成功併入質體並攜帶安比西林抗性基因的細菌才能在這些平盤上生長。第二天挑取單一菌落，在 LB-Amp 培養基中培養，用於後續的質體製備。

細菌培養

在 LB 培養基 (Luria Bertani 之縮寫) 中培養大腸桿菌，該培養基中攙入 1 mL/L 100 mg/mL 安比西林，導致安比西林濃度為 0.1 mg/mL。對於不同的質體製備量，以單一細菌菌落接種以下量。

表：大腸桿菌培養體積

數量質體製備	體積 LB-Amp 培養基 [mL]	培育時間 [h]
Mini-Prep 96 孔 (EpMotion)	1.5	23
Mini-Prep 15 mL 管	3.6	23
Maxi-Prep	200	16

對於 Mini-Prep，96 孔 2 mL 深孔盤，每孔填充 1.5 mL LB-Amp 培養基。挑取菌落並將牙籤塞入培養基中。當挑取所有菌落後，用黏性透氣膜將平盤密封。將平盤在 37℃ 培養箱中以 200 rpm 的振盪速率培養 23 小時。

對於 Mini-Preps，在 15 mL 試管 (帶有通氣蓋) 中裝入 3.6 mL LB-Amp 培養基並同樣接種細菌菌落。在培育期間，牙籤並未被移除而是留在管中。與 96 孔盤一樣，試管在 37℃、200 rpm 下培育 23 小時。

對於 Maxi-Prep，將 200 mL LB-Amp 培養基裝入高壓滅菌的 1 L Erlenmeyer 燒瓶中，並接種已儲存大約 5 小時的 1 mL 細菌日培養物。錐形瓶以紙塞密閉並在 37℃、200 rpm 下培育 16 小時。

質體製備

對於 Mini-Prep，將 50 µL 細菌懸液轉移到 1 mL 深孔盤中。之後，將細菌細胞在板中以 3000 rpm、4℃ 離心 5 分鐘。移除上清液，將帶有細菌沉澱物的平盤置於 EpMotion 中。約 90 分鐘後完成運行，並可從 EpMotion 中取出溶析的質體 DNA 以供進一步使用。

對於 Mini-Prep，將 15 mL 試管從培養箱中取出，並將 3.6 mL 細菌培養物分流至兩個 2 mL Eppendorf 試管中。在室溫下，在台式微量離心機中以 6,800xg 將管離心 3 分鐘。之後，根據製造商的說明使用 Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit 進行 Mini-Prep。以 Nanodrop 測量質體 DNA 濃度。

根據製造商的說明使用 Macherey-Nagel NucleoBond® Xtra Maxi EF Kit 進行 Maxi-Prep。以 Nanodrop 測量 DNA 濃度。

乙醇沉澱

將一定體積的 DNA 溶液與 2.5 倍體積的 100% 乙醇混合。混合物在 -20℃ 下培育 10 分鐘。然後將 DNA 在 14,000 rpm，4℃ 下離心 30 分鐘。小心地移除上清液並以 70% 乙醇洗滌沉澱物。再次將管在 14,000 rpm，4℃ 下離心 5 分鐘。藉由吸取小心地移除上清液並乾燥沉澱物。當乙醇蒸發後，加入適量之無內毒素水。給予 DNA 時間在 4℃ 下再溶於水中隔夜。取一小部分等分樣品並以 Nanodrop 裝置測量 DNA 濃度。

表現卡匣組成

對於表現開讀框，使用至少包含以下功能元件的轉錄單元： - 啓動子， - 如果需要，則包含包括訊號序列的相應開讀框的核酸， - 多腺苷酸化訊號序列。

除了包含要表現的所需基因的表現單元/表現盒外，基本/標準哺乳動物表現質體還包含 - 來自質體 pUC18 的複製起點，其允許此質體在大腸桿菌中複製，及 - β-內醯胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予安比西林抗性。

6) 細胞培養技術

使用標準細胞培養技術，如敘述於 Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc。

HEK293 系統中的暫態轉染

根據製造商的說明，使用 HEK293 系統 (Invitrogen) 藉由瞬時轉染相應的質體產生用於生產重組 AAV 顆粒的細胞。簡言之，將相應質體及 293fectin™ 或 fectin (Invitrogen) 的混合物轉染至在無血清 FreeStyle™ 293 表現培養基 (Invitrogen) 中之搖瓶或攪拌發酵瓶中懸浮生長的 HEK293 細胞 (Invitrogen)。對於 2 L 搖瓶 (Corning)，將 HEK293 細胞以 1*10 ⁶細胞/mL 的密度接種在 600 mL 中，並在 120 rpm、8% CO ₂下培育。第二天，將約 42 mL 混合物轉染約 1.5*10 ⁶細胞/mL 的細胞密度的細胞，該混合物為 A) 20 mL Opti-MEM (Invitrogen) 與 600 µg 總質體 DNA (1 µg/mL) 及 B) 20 mL Opti-MEM + 1.2 mL 293 fectin 或 fectin (2 µL/mL)。根據葡萄糖消耗量，在發酵過程中加入葡萄糖溶液。

7) 監測及分析方法

介電譜

BioStat® RM 20/50 Rocker 中的介電譜係使用預安裝的一次性活生物量感測器 BioPAT® ViaMass 進行。在開始發酵前，先用低 (0 pF/cm, 0 mS/cm) 及高 (100 pF/cm, 40 mS/cm) 訊號模擬器進行訊號測試，然後將探針連接至袋的相關端口。

對於 HyClone® 生物反應器，使用 Incyte 系統。將 IncyteArc 220 探針插入探針組件鞘中，高壓滅菌，然後安裝到生物反應器中。

接種前，按照製造商的說明將介電常數探針調零至培養基。對於 IncyteArc 220，將 ArcAir 應用程式用於調零。兩種系統皆測量電容，其作為以 pF/cm 為單位的介電常數 ε 進行計算。介電常數與 VCV 或 VCD 線性相關，因此能夠實時估計存活細胞密度。

細胞培養物分析

使用 Cedex® HiRes 分析儀測量 VCD、生存力、平均細胞直徑以及聚集速率。它是一種全自動、基於影像的細胞分析儀，結合使用台盼藍排除法及高分辨率影像掃描儀。

為判定上述細胞參數，經由注射器模塊及歧管閥吸取預定體積的細胞懸液樣品，並與所需量的 0.2% 台盼藍溶液混合。具有非完整細胞膜的細胞係藉由染料擴散到細胞內部而被染成藍色。在完整細胞中，染料無法進入。將染色的細胞懸液經由毛細管及歧管閥轉移至流動室。經過固定的沉降時間後，使用掃描儀拍攝數字影像。將流動室的掃描影像分成較小的影像進行評估，並使用相關計算機上的分析軟體進行分析。

根據估計的總細胞密度 (TCD)，在分析之前需要根據下表使用 PBS 稀釋過程樣品，以使其處於系統的工作濃度範圍內 (0.1 至 50 10^5 個細胞/mL)。

表：根據估計的總細胞密度，用 Cedex® HiRes 分析儀進行測量所需的稀釋度。

總細胞密度 [10^5 個細胞/mL]	稀釋
0 – 50	無 (1:1)
51 – 100	1:2
101 – 200	1:5
201 – 500	1:10
＞ 500	1:20

除典型的細胞參數之外，Cedex® HiRes 分析儀亦提供有關聚集體及形態學參數的資訊。有關細胞聚集的資訊與這項工作相關，因為所使用的細胞株易於聚集，其可能降低轉染成功率 (Girard 等人，P., Cytotechnol.38 (2002) 15-21)。Cedex® HiRes 軟體判定與至少一個其他細胞聚集在一起的細胞，並將聚集率作為聚集體中發現的細胞相對於總細胞計數的百分比來計算。

使用 Cedex® HiRes 分析儀進行多次測量的相對標準差為 5%。然而，由於超出測量範圍時產生額外的稀釋誤差，因此根據內部規範，可假定相對標準差為 6%。

除直接測量的細胞參數之外，亦計算活細胞體積 (VCV)，因為需要該參數與來自電容探針的介電常數訊號相關聯。對於活細胞體積的計算，假定細胞形狀為球形。使用 Cedex® HiRes 分析儀所測量的以細胞/mL 為單位的 VCD 及以 μm 為單位的細胞平均直徑 (d)，根據方程式 (14) 判定 VCV，以 mm3/mL 為單位： (14)

實例 1 – 參考實例

不進行灌流的 rAAV 顆粒生產的基本製程

rAAV 顆粒的生產始於用解凍後的冷凍細胞等分試樣接種 125 mL 搖瓶。每三至四天，對細胞培養物進行傳代並增加體積。在達到用於 N-2 生物反應器接種的足夠體積 (亦即細胞密度) 後，將預培養物以約 5*10^5 個細胞/mL 的接種密度轉移至 10 L 波混合生物反應器中，並培養三天。接著，在達到大約 40*10^5 個細胞/mL 的細胞密度後，將細胞培養物進一步以約 8*10^5 個細胞/mL 的接種密度轉移至 25 L 波混合生物反應器中。在兩個波混合生物反應器中，僅加入鹼。之後，使用細胞懸液接種主發酵罐，起始體積為 60 L 且目標接種密度為 20*10^5 個細胞/mL。24 小時後，加入基於實際培養體積的額外體積的 20% 新鮮培養基。然後將細胞用相應的質體轉染。總共四天後，生產過程終止，並藉由加入裂解緩衝液、核酸酶及鹼性溶液開始裂解。接著，將經裂解的細胞溶液轉移至收穫罐中並過濾，以收穫 rAAV 顆粒。

實例 2

Biostat® RM 搖床操作

小規模實驗以及 N-2 和 N-1 種子系列發酵係於 Biostat® RM 搖床中進行，該搖床包含波混合台式生物反應器及 Biostat® B 控制塔。這些生物反應器利用搖動混合技術，並與一次性 Flexsafe® RM 袋一起使用。對於 10 L 規模的 N-2 發酵，使用 Biostat® CultiBag RM 50。使用 Biostat® RM 20/50 basic 進行 15 L 或 25 L 規模的 N-1 發酵及 1 L 小規模灌流實驗。兩者皆具有可更換的袋支架，以容納總體積為 1 至 50 L 的袋。搖動平台包含集成的本地控制器、空氣與 CO2 混合模塊及測力器。

在 RM 袋中產生的波經由兩種機制 (亦即藉由破碎波的表面通氣及空氣夾帶) 確保透過氣-液界面進行有效的氣體交換。為充分通氣，用於壓縮空氣、O2、N2 及 CO2 的四個不同氣體管線配備流量計，並使用了四個質量流量控制器。集成的壓力感測器持續測量袋內的壓力並設定通氣以達到輕微超壓。Flexsafe® RM 袋配備進氣及排氣過濾器。

將使用電阻加熱的兩個加熱元件直接集成到袋支架中，並可單獨控制。對於小規模實驗，僅使用左側加熱電路，並將 1 L 袋放在袋支架的左側。袋支架中的 Pt100 電阻溫度計測量袋溫。由於 Biostat® RM 的加熱在排氣過濾器上產生輕微冷凝，因此過濾器加熱器可保持過濾器乾燥並防止其堵塞。將護罩用作安全蓋，前面具有一個開口用於袋處理。它可以保護所連接的袋在操作期間免受機械影響，並減少熱量損失。

Flexsafe® RM 袋配備一次性光化學 pH 及 pO2 探針，並在需要時配備活生物量探針 (BioPAT® ViaMass)。pH 控制器調節碳酸鈉及 CO2 氣流之加入。此外，袋具有帶 C-Flex 管及 Luer 或 MPC 連接器的自由端口，用於加入培養基、接種物及鹼。將帶有 Luer 隔膜的浸入管用於取樣。

對於灌流實驗，使用帶有集成 1.2 μm 灌流膜的特殊的袋。將膜固定在袋的底部，形成用於去除無細胞培養基的區室。將膜的表面用由此產生的波的每一次搖動沖洗，其確保低污染及長培養時間。使用 Biostat® B 控制塔上的蠕動泵進行培養基加入及滲透物去除。將培養基袋置於秤上以實現重量控制。

實例 3

100 L 一次性生物反應器 HyClone® 操作

以生產 rAAV 顆粒為目的的主要發酵係於總工作體積為 100 L 的一次性生物反應器 HyClone® 攪拌罐中進行。該攪拌罐包括不銹鋼發酵容器、一次性 BioProcess® 容器 (BPC)、帶有 DCU 的操作站、溫度控制單元以及帶有六個秤及蠕動泵的培養基站。反應器配備用於溫度控制的雙層夾套及縱向觀察玻璃。溫度控制係藉由溫度控制單元進行。使用傾斜的 3 葉片葉輪進行攪拌。

通氣係經由具有環形分佈器及開口管的浸沒式通氣管進行。BPC 在底部配備兩個進氣過濾器，在頂部配備兩個排氣過濾器及通氣過濾器加熱器。除 BPC 頂部的排氣口之外，具有用於頂空通氣的入口、壓力感測器以及若干用於加入消泡劑、鹼及進料的自由端口。BPC 在袋的下三分之一處封閉有兩個側向端口水準儀。下部端口水準儀包含一個用於溫度探針的端口及四個 AseptiQuik® 連接器探針端口，其用於安裝 pH、pO2 及電容探針。使用內置汲取管進行取樣。在這些連接器上方，BPC 具有帶有 C-Flex 管的自由端口，用於新鮮培養基的加入及轉染。為進行收穫，BPC 底部具有排洩管線。

將具有鹼及不同進料的袋放置於培養基站的吊秤上，以實現重量控制。pH 控制器調節鹼加入。根據需要加入消泡劑。

實例 4

預培養及接種

預培養係於具有發酵培養基的搖瓶中進行。每三到四天將細胞分裂為 5*10^5 個細胞/mL，直到它們達到大約 40 至 60*10^5 個細胞/mL 的細胞密度，同時將培養體積增加至接種所需的量。在此期間，將搖瓶在 37℃、85% 濕度、5% CO2 條件下振搖孵育。

對於 HyClone® 生物反應器中的 100 L 發酵，將細胞在 N-2 和 N-1 Biostat® RM 搖床中進一步培養，然後將其用於接種主發酵罐。

Biostat® RM Rocker 以及 HyClone® 生物反應器中的發酵接種程序具有可比性。首先，根據當前及目標初始 VCD 判定接種體積。使用低泵速將預培養物泵入生物反應器中以防止產生過度剪切應力。

對於接種 100 L HyClone® 生物反應器所需的大預培養物體積，使用靜水壓差將細胞輕輕並快速轉移至發酵罐中。

實例 5

轉染程序

接種後 24 小時，以 36*10^5 個細胞/mL 的目標 VCD 進行三重轉染。

轉染前，直接將 20% (v/v) 的初始培養物體積作為新鮮培養基加入至生物反應器中。製備轉染試劑 (PEI MAX®)，將其與質體混合並注滿發酵培養基。混合後，將溶液轉移至 10 L FLEXBOY® 袋中進行孵育。在孵育期結束時，將裝有轉染複合物的袋中的內容物轉移至生物反應器中。接著，依次將游離 PEI 溶液及 VPA 溶液泵入生物反應器中以達到 5 mM VPA 的最終濃度。

實例 6

灌流生物反應器操作

定義 pH 設定點並將死帶設定為 0.02 pH 單位。對於 pH 控制，使用雙側控制迴路，其中分別應用 CO2 噴射或加入 1 M 碳酸鈉溶液 (在下文中稱為鹼) 以降低或增加 pH。

1) 灌流製程的手動操作 – 每日更換

使用基於先前製程中剩餘的培養基量的固定灌流速率。逐漸增加灌流速率，每天一次。

2) 灌流製程的手動操作 – 基於細胞特異性速率

使用固定灌流速率，其適應於細胞特異性受質消耗。

基於先前的培養判定細胞特異性受質消耗速率，並乘以預測的 VCD 以計算細胞所需的受質量。

用特定生長速率預測 VCD

VCD 係用上述第一灌流培養中計算的整個製程時間的平均比生長速率來預測。平均比生長速率係藉由繪製 VCD 的自然對數與製程時間 t的關係並插入線性擬合來判定，斜率的絕對值為根據以下方程式的比生長速率 μ(Zhang, X. 等人，「1.21 - Modes of Culture/Animal Cells」，收錄於：Comprehensive Biotechnology (第二版)，M. Moo-Young (主編) Burlington：Academic Press，2011，pp. 285-302)： (2)

這引起簡化，因為比生長速率可在整個製程中波動。然而，由於灌流製程通常允許非常穩定的細胞生長，因此可使用平均生長速率預測 VCD。因此，可藉由使用方程式 (3) 預測下一次灌流實驗的 VCD 過程： 𝑉𝐶𝐷(𝑡) = 𝑉𝐶𝐷 _初始 ∗ 𝑒 ^{𝜇 ∗ 𝑡}(3)

細胞特異性消耗速率的計算

同時，細胞特異性消耗速率係根據先前的 N-2 發酵計算，因為除細胞代謝外未加入或去除受質，由此簡化了計算。再者，可使用受質濃度而非其絕對重量來計算消耗速率，因為發酵罐重量保持恆定。細胞特異性消耗速率定義為單位時間內單個細胞消耗受質的量，通常以 pg/細胞/d 為單位。計算涉及存活細胞密度 (IVCD) 的積分，將其理解為細胞培養物的生產能力，以細胞*d/mL為單位 (參見 Zhang，同上)。因此，細胞特異性消耗速率 q _消耗 係根據方程式 (4)，藉由在發酵結束 c _t 及開始 c _{t- 1}時取受質濃度的差異並將其除以相關聯的 IVCD 的差異來判定： (4)。

IVCD 定義為 (5)

接下來，藉由將預測的 VCD 與判定的消耗速率相乘來預測絕對消耗速率 𝑞 _{消耗 , 𝑎𝑏𝑠}，以 g/L/d 為單位。 (6)

灌流速率的判定

由此，灌流速率 𝑝𝑣𝑣𝑑 (以 vvd 為單位) 可使用方程式 (7)，藉由將絕對消耗速率 𝑞 _{消耗 , 𝑎𝑏𝑠}(以 g/L/d 為單位) 除以培養基中受質的濃度 𝑐 _培養基 (以 g/L 為單位) 來獲得。 (7)

再者，藉由使用最大預測 VCD 計算每個每日速率來使用最大灌流速率，以允許受質消耗的波動。為能夠比較不同的灌流製程，亦根據 Bausch 等人 (Biotechnol. J. 14 (2019) 1700721) 所述計算細胞特異性灌流速率 𝐶𝑆𝑃𝑅 (以 pL/細胞/d 為單位)。因此，將灌流速率 𝑝𝑣𝑣𝑑 (以 vvd 為單位) 除以 VCD： (8)

在工作體積為 1 L 的 Flexsafe® RM 袋中建立縮小模型。儘管在相同的條件下，但該模型為物理上小得多的版本。如下所述，基於台盼藍排阻細胞計數及受質和代謝物濃度的判定，藉由手動每日取樣以進一步調整灌流速率。若 VCD 高於預期或受質濃度下降地過多，則調整灌流速率。此外，藉由使用特異性生長速率及細胞特異性受質消耗速率的平均值而非個體值進行進一步計算，用每個實驗對預測的 VCD 及受質消耗的計算進行精化。

用電容探針進行灌流自動化

為實現灌流速率的自動化，建立基於來自在線電容探針的活細胞濃度的穩健的自動灌流速率控制系統。該系統在完全閉環中運行，使得無需採集樣本以獲得製程資訊。在控制算法中，指定 CSPR，並使用變速控制泵經由計算及實施，將電容探針的介電常數訊號轉換為灌流速率。

為此，將探針的介電常數輸出訊號轉換為在線 VCD。因此，判定離線測量的 VCD 與介電常數訊號之間的相關性。為判定相關因子 𝑐 _{𝑉𝐶𝐷 , 𝑃𝑒𝑟𝑚}，繪製 VCD 與介電常數 𝜀 的關係圖，並根據方程式 (9) 插入線性趨勢線： (9)

為基於當前介電常數訊號及先前判定的 CSPR 判定補充所需進料培養基體積所需的泵輸出，預測 VCD 並使用上述方程式計算所需的灌流速率 𝑝𝑣𝑣𝑑。灌流速率 𝑝𝑣𝑣𝑑 與所需的泵輸出 𝑝𝑢𝑚𝑝 _出 (以 % 表示) 之間的相關性係用先前灌流實驗的資料確定。相關聯的相關因子𝑐 _{泵 , 𝑝𝑣𝑣𝑑}係藉由使用以下方程式插入線性擬合來判定： (10)

使用該相關係數 𝑐 _{泵 , 𝑝𝑣𝑣𝑑}，泵輸出係根據所需之灌流速率 𝑝𝑣𝑣𝑑 判定。為經由介電常數訊號 𝜀 實現泵的自動控制，使用方程式 (11) 計算自動化因子𝑓 _{𝑎𝑢𝑡𝑜}，並將其輸入生物反應器的控制軟體中： (11)

這允許藉由將自動化因子與介電常數訊號相乘來設定泵輸出。除用於灌流進料的控制迴路外，亦使用另一個控制迴路用於基於生物反應器重量去除滲透物。該迴路為觸發無細胞滲透液流出以進行收穫的控制迴路。由於生物反應器被放置在秤上，因此滲透泵經組態為一旦生物反應器重量大於接種後的初始重量即開始去除培養基，直至重量再次處於起點。

為評定 VCD 預測的準確度，判定平均絕對百分比誤差 (MAPE)。該指標為評定預測模型總體性能的量度。如方程式 (12) 中所述，以 % 表示的 MAPE 係藉由標準化至實際值 (將其除以資料點數量 𝑛) 的預測值 𝑥𝑝𝑟𝑒𝑑 與實際值 𝑥𝑖 的偏差之和來判定。 (12)

實例 7

細胞生長及代謝的評估

比生長速率 𝜇 表示細胞的動態行為，並提供有關細胞生長的資訊，從而間接地提供細胞培養物的健康狀況。它是比較不同製程的良好基礎 (A. K. Srivastava 及 S. Gupta，「2.38 - Fed-Batch Fermentation – Design Strategies」，收錄於：Comprehensive Biotechnology (第二版)，M. Moo-Young (主編) Burlington：Academic Press，2011，pp. 515-526)。整個發酵過程的生長速率係藉由將對數 VCD 與接種 VCD (𝑉𝐶𝐷 ₀) 之間的差異除以相應的時間差來判定 (Zhang, X. 等人，「1.21 - Modes of Culture/Animal Cells」，收錄於：Comprehensive Biotechnology (第二版)，M. Moo-Young (主編) Burlington：Academic Press，2011，pp. 285-302)。 (15)

因此，製程中的最後生長速率亦對應於整個製程時間內的平均生長速率。對於使用細胞培養物分流的發酵，在分流後直接將 𝑉𝐶𝐷 ₀設定為 VCD。

細胞特異性形成及消耗速率在沒有進料/灌流的情況下可根據方程式 (4) 來判定，在灌流製程中則使用以下方程式 (16) 來判定： (16) 其中 (17) 及 (18) 其中縮寫如下：

雖然代謝物生產速率為正，但受質消耗速率為負，因為受質從培養基中被移除，因此在培養基中的量減少。

圖 1存活細胞密度：饋料批次，N-2 (藍色)；饋料批次，N-1 (綠色)；生產階段，N 階段 (紅色) 培養。 圖 2存活細胞密度：N-2，饋料批次，10 L 規模，N-2 (藍色)；非受控灌流，25 L 規模，N-1 (綠色)；生產階段，100 L 規模，N 階段 (紅色) 培養。 圖 31 L 規模下 N-1 階段受控灌流培養的存活細胞密度。 圖 4100 l 規模下 VCD 受控灌流的存活細胞密度：綠色 = N-1，受控灌流；紅色 = N，生產階段培養。 圖 5介電常數受控灌流製程的存活細胞密度；N-1，介電常數受控灌流培養 。 圖 6包含編碼治療性 Fab 的轉基因的 2 亞型變異體 7m8 的 AAV 顆粒之生產。生物量感測器受控灌流製程的存活細胞密度，N-1 (綠色)；生產階段，N 階段 (紅色) 培養。 圖 7VCD 受控灌流及生物感測器受控灌流培養的存活細胞密度：紅色 (VCD) 與紫色 (生物感測器)；藍色 (VCD) 與綠色 (生物量感測器)。 圖 8在不同生產規模的培養中獲得的活密度，該培養接種在 N-1 階段進行灌流 (亦即如本發明之) 及在 N-1 階段不進行灌流所獲得的細胞；紅色曲線對應於用不進行灌流的 N-1 階段的生產規模培養，綠色曲線 (標記為「1」、「2」、「3」、「4」) 對應於使用如本發明進行灌流的 N-1 培養的生產規模培養。 圖 9生產規模培養 N 階段細胞的生存力取決於用於接種 N 階段的細胞在 N-1 階段的培養。紅色曲線對應於接種獲自批次 N-1 培養的細胞的生產培養物。綠色曲線 (表示為「1」、「2」、「3」及「4」) 對應於接種獲自如本發明之 N-1 灌流培養的細胞的生產規模培養。 圖 10在進行及不進行灌流的 N-1 階段培養後，N 階段 ＞ 10 L 的生物反應器系統中生產培養物中的殼體效價。紅色曲線 (「5」、「6」) 對應於批次 N-1 之後的生產培養物。綠色曲線 (「1」、「2」、「3」及「4」) 對應於進行灌流的 N-1 階段之後的生產培養物。對於紅色曲線，批式培養 N-1 在同一生物反應器中執行 (因此，N 規模培養第 0 天對應於圖中的第 4 天)

Claims (14)

1. 一種生產重組 AAV 顆粒之方法，其包含下列步驟： a) 使用灌流來繁殖哺乳動物細胞直到至少達到第一預定細胞密度； b) 藉由加入新鮮培養基來稀釋在步驟 a) 中所獲得的細胞中的一部分以獲得具有第二預定細胞密度的生產細胞溶液； c) 培養該生產細胞溶液 1 至 36 小時； d) 用編碼該重組 AAV 顆粒的一種或多種核酸直接轉染在步驟 c) 中所獲得的經培養的生產細胞溶液中的該等細胞； e) 培養在步驟 d) 中所獲得的經轉染的生產細胞溶液 24 至 144 小時； 從而生產重組 AAV 顆粒。
2. 如請求項 1 之方法，其中該第一預定細胞密度為至少 80*10^5 個細胞/mL。
3. 如請求項 1 至 2 中任一項之方法，其中該哺乳動物細胞為 CHO-K1 或 HEK293 細胞。
4. 如請求項 1 至 3 中任一項之方法，其中該一種或多種核酸包含 i) 轉基因，其在 5'- 至 3'-方向包含 α) 第一 ITR 序列； β) 啟動子； γ) 編碼治療分子的核酸序列； δ) 多腺苷酸化訊號序列； ε) 第二 ITR 序列； ii) rep 開讀框； iii) cap 開讀框；以及 iv) 腺病毒 E1A、E1B、E2A、E4orf6 及 VA RNA 開讀框。
5. 如請求項 1 至 4 中任一項之方法，其中在步驟 b) 中加入 4 倍至 6 倍體積之新鮮培養基之等分試樣。
6. 如請求項 1 至 5 中任一項之方法，其中該第二預定細胞密度為約 20*10^5 個細胞/mL。
7. 如請求項 1 至 6 中任一項之方法，其中在步驟 c) 中之該培養為約 24 小時。
8. 如請求項 1 至 7 中任一項之方法，其中在步驟 e) 中之該培養為約 72 小時。
9. 如請求項 1 至 8 中任一項之方法，其中步驟 e) 沒有進料 (feeding)。
10. 如請求項 1 至 9 中任一項之方法，其中該方法進一步包含以下步驟： f) 從步驟 e) 之經培養的溶液中收穫該等細胞； g) 裂解在步驟 f) 中所獲得的該等細胞； h) 將 AAV 顆粒從在步驟 g) 中所獲得的經裂解的細胞中分離； i) 視情況純化該等 AAV 顆粒。
11. 如請求項 1 至 10 中任一項之方法，其中在步驟 c) 之後的細胞密度為 35 至 40*10^5 個細胞/ml。
12. 如請求項 1 至 11 中任一項之方法，其中在步驟 c) 之後且在步驟 d) 之前進行下列步驟 cd)： cd) 加入額外的約 20% 培養體積的新鮮培養基。
13. 如請求項 1 至 12 中任一項之方法，其中該轉染係藉由添加呈 PEI 複合核酸及游離 PEI 之混合物之一種或多種核酸。
14. 如請求項 1 至 13 中任一項之方法，其中該轉染係在 5 mM 丙戊酸之最終濃度的存在下。

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