JP2020526190A - Aavベクターのカラム精製方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
例示的な第1のカラム、カチオン交換又は親和性
1.1. カチオン、Poros50 HS(又はThermoFisherからのPoros XS)。前提条件、平衡化、ロード材料、洗浄及び溶出
1.1.1. 例示的な緩衝液のリスト
1.1.1.1. 緩衝液、pH、導電性
a) 前提条件:注射用水
b) 3×希釈緩衝液:60mMリン酸Na、pH7.3
c) 平衡緩衝液:20mMリン酸Na、pH7.3、100mM NaCl
d) 洗浄緩衝液1及び3:20mMリン酸Na、pH7.3、100mM NaCl
e) 洗浄緩衝液2:20mMリン酸Na、pH7.3、100mM NaCl、界面活性剤(5mM)、例えばサルコシル
f) 溶出緩衝液:20mMリン酸Na、pH7.3、300mM NaCl(300mMを超えることができる、例えば300〜400、例えば400mM NaCl)。
g) 溶出緩衝液の体積(例えば、所定であるピーク前体積の後の溶出物を捕集する)又はO.D.A280の増大、例えば、ベースラインO.D.A280の1mAuの増大のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
h) カラムストリッピング溶液:高塩、例えば、1M NaCl
i) 殺菌溶液:1M NaCl、1N NaOH
j) 貯蔵溶液:約22.5%エタノール(例えば18〜22.5%)
1.1.2. 例示的なカラム準備
1.1.2.1. 前提条件ダウンフロー(4CV)WFI
1.1.2.2. 平衡化ダウンフロー(4CV)平衡緩衝液
1.1.3. 例示的な精製
1.1.3.1. ロード材料ダウンフロー(25CV)試料
1.1.3.2. 洗浄1ダウンフロー(4CV)洗浄1の緩衝液
1.1.3.3. 洗浄2ダウンフロー(6CV)洗浄2の緩衝液
1.1.3.4. 洗浄3ダウンフロー(8CV)洗浄3の緩衝液
1.1.4. 規模により決定される例示的なブロック(洗浄)体積(複数可)、カラムサイズ
1.1.5. 結合容量:2.5〜3×ローディング(Poros50 HS)、UF(限外濾過)/DF(透析濾過)あり又はなし。
1.1.6. 例示的な流速:150cm/h〜300cm/h
1.1.7. ロード容量:10L以上
1.1.8. 予想される回収:60〜90%
1.2. 親和性、AVB−セファロースHP
1.2.1. 緩衝液のリスト
1.2.1.1. 緩衝液(pH、導電性)各ブロック体積
1.2.1.2. 例示的な緩衝液/溶液
a) 平衡緩衝液:20mMトリス、pH8.0、250mM NaCl
b) 溶出緩衝液:10mM 酢酸Na、pH2.5、250mM NaCl
c) 中和緩衝液:1MトリスCl、pH10.5
d) 消毒溶液:PAB(120mMリン酸、167mM酢酸、2.2%ベンジルアルコール)
e) 貯蔵溶液:約22.5%エタノール(18〜22.5%)
1.2.2. 例示的な流速:約150cm/h以上
1.2.3. 予想される回収:70〜90%(AAVビリオンカプシド)、15〜70%(ベクターゲノム)
例示的な第2のカラム、アニオン交換又はサイズ排除
1.3. アニオン、Poros 50HQ(ThermoFisherからのPoros XQ)。前提条件、平衡化、ロード材料、洗浄及び溶出:二重機能のために使用される(さらなる精製及び空/中実ベクター比制御)
1.3.1. 例示的な緩衝液のリスト
1.3.1.1. 緩衝液、pH、導電性、各ブロック体積
a) 前提条件:注射用水
b) 3×(又は4×)希釈緩衝液:約60mM(又は約80mM)トリス、pH8.5(例えば、希釈後、ローディング材料は10〜50mMトリスの範囲であり、pH8.0〜8.5、100mM NaCl)
c) 平衡緩衝液(及び洗浄1の緩衝液):20mMトリス、pH8.5、100mM NaCl
d) 洗浄2の緩衝液(AAVの空のカプシド除去のため):20mMトリス、pH8.5、115mM NaCl
e) 溶出緩衝液:20mMトリス、pH8.5、NaCl≧120mM、例えば、200mM NaCl
f) カラムストリッピング緩衝液:1M NaCl
g) 消毒溶液:1N NaOH
h) 貯蔵溶液:約22.5%エタノール(例えば18〜22.5%)
1.3.2. 例示的な分カラム準備
1.3.2.1. 前提条件ダウンフロー(5CV)WFI
1.3.2.2. 平衡化ダウンフロー(4CV)平衡緩衝液
1.3.3. 例示的な精製
1.3.3.1. ロード材料ダウンフロー(50CV)CEX溶出物及び希釈物
1.3.3.2. 洗浄1ダウンフロー(5CV)平衡緩衝液
1.3.3.3. 溶出1(空のカプシド除去)ダウンフロー(3CV)溶出緩衝液1
1.3.3.4. 溶出2(中実AAVベクター回収)ダウンフロー(3CV)溶出緩衝液2
1.3.4. 例示的な流速:150cm/h〜300cm/h
1.4. サイズ排除、SEC(例えば、Superdex 200分取規格 GE healthcareから)、任意選択
1.4.1. 例示的な緩衝液のリスト
1.4.1.1. 緩衝液、pH、導電性、各ブロック体積
a) 前提条件:注射用水
b) 平衡洗浄及び溶出緩衝液:10mMリン酸Na、pH7.2、150〜300mM NaCl(より高いNaCl、例えば、300mMがAAVベクター(vg)の回収を改善するはずである。
c) 溶出緩衝液の体積(例えば、所定であるピーク前体積の後の溶出物を捕集する)又はO.D.A280の増大、例えば、ベースラインO.D.A280の1mAuの増大のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
d) 消毒溶液:0.5N NaOH
e) 貯蔵溶液:22.5%エタノール(例えば18〜22.5%)
1.4.2. 例示的な分カラム準備
1.4.2.1. 前提条件ダウンフロー(2CV)WFI
1.4.2.2. 平衡化ダウンフロー(2CV)平衡緩衝液(PBS300)
1.4.3. 例示的な精製
1.4.3.1. ロード材料ダウンフロー(0.05CV)
1.4.3.2. 溶出ダウンフロー(1.5CV)平衡緩衝液(dPBS)
1.4.4. 例示的なローディング容量:カラム体積の≦5%
1.4.5. 例示的な流速:45cm/h
1.4.6. 溶出緩衝液の体積又はO.D.A280のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
例示的な第3のカラム、サイズ排除又はアニオン交換。第3のカラムは、任意選択であり、親和性カラム(例えば、AVB−セファロースHP)が第1のカラムである場合には必要とされないこともある。使用される第3のカラムは使用される第2のカラムにも基づく(SEC>HQ、又はHQ>SEC等)。
1.5. サイズ排除、SEC(例えば、Superdex 200分取規格 GE healthcareから)、任意選択
1.5.1. 例示的な緩衝液リスト
1.5.1.1. 緩衝液、pH、導電性、各ブロック体積
a) 前提条件:注射用水
b) 平衡及びランニング緩衝液:10mM Na−P、pH7.2、150〜300mM NaCl(より高いNaCl、例えば、300mMがAAVベクター(vg)の回収を改善するはずである。
c) 溶出緩衝液の体積(例えば、所定であるピーク前体積の後の溶出物を捕集する)又はO.D.A280の増大、例えば、ベースラインO.D.A280の1mAuの増大のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
d) 消毒溶液:0.5N NaOH
e) 貯蔵溶液:22.5%エタノール
1.5.2. 例示的なカラム準備
1.5.2.1. 前提条件ダウンフロー(2CV)WFI
1.5.2.2. 平衡化ダウンフロー(2CV)平衡緩衝液(PBS300)
1.5.3. 例示的な精製
1.5.3.1. ロード材料ダウンフロー(0.05CV)
1.5.3.2. 溶出ダウンフロー(1.5CV)平衡緩衝液(dPBS)
1.5.4. 例示的なローディング容量:カラム体積の≦5%
1.5.5. 例示的な流速:45cm/h
1.5.6. 溶出緩衝液の体積又はO.D.A280のいずれかに基づいて溶出物を捕集する。
1.6. 二重機能(さらなるrAAV精製及び空/中実rAAVベクター比制御)のための、アニオン、Poros 50HQ(ThermoFisherからのPoros XQ)。前提条件、平衡化、ロード材料、洗浄及び溶出
1.6.1. 例示的な緩衝液のリスト
1.6.1.1. 緩衝液、pH、導電性、各ブロック体積
a) 前提条件:注射用水
b) 3×(又は4×)希釈緩衝液:60mM(又は80mM)トリス、pH8.5(例えば、希釈後、ローディング材料は、10〜50mMトリスの範囲であり、pH8.0〜8.5、100mM NaCl)
c) 平衡緩衝液(及び洗浄1の緩衝液):20mMトリス、pH8.5、100mM NaCl
d) 洗浄2の緩衝液(AAVの空のカプシド除去のため):20mMトリス、pH8.5、115mM NaCl
e) 溶出緩衝液:20mMトリス、pH8.5、NaCl≧120mM、例えば、200mM NaCl
f) カラムストリッピング緩衝液:1M NaCl
g) 消毒溶液:1N NaOH
h) 貯蔵溶液:22.5%エタノール(例えば18〜22.5%)
1.6.2. 例示的なカラム準備
1.6.2.1. 前提条件ダウンフロー(5CV)WFI
1.6.2.2. 平衡化ダウンフロー(4CV)平衡緩衝液
1.6.3. 例示的な精製
1.6.3.1. ロード材料ダウンフロー(50CV)CEX溶出物及び希釈物
1.6.3.2. 洗浄1ダウンフロー(5CV)平衡緩衝液
1.6.3.3. 溶出1(空のカプシド除去)ダウンフロー(3CV)溶出緩衝液1
1.6.3.4. 溶出2(中実AAVベクター回収)ダウンフロー(3CV)溶出緩衝液2
1.6.4. 例示的な流速:150cm/h〜300cm/h
カラム精製の前の例示的な細胞溶解及び調製。
1. 細胞溶解、化学的又は物理的
1.1 例示的な化学的溶解方法
1.6.5. トリトンX−100又は等価な非イオン性界面活性剤
i. 最終濃度、0.1%〜1%
ii. インキュベーション時間、1時間まで
iii. インペラーの撹拌速度は、典型的には約400〜600rpm(以上)である
iv. インキュベーション温度は約25〜37℃(例えば、37℃)である
1.6.6. ベンゾナーゼ
i. 最終濃度、≧50U/mL、例えば、100U/mL
ii. 処理は、界面活性剤と同時又は逐次的であることができる。
iii. MgCl2濃度は1.0〜5.0mM(例えば、2mM)である
1.1.3. 濾過ステップ中又は後にAAVベクターを回収するために役立つ追加の塩
II. NaClの最終濃度は、200〜400mM(例えば、300mM)である
III. NaCl、NaClに対する他の塩等価物も使用することができる
1.7. 例示的な物理的溶解方法(微小流動化、均質化等)
1.7.1. 作業条件(より大きい体積にスケールアップすることができる10Lの付着細胞の培養に基づく)
i. 圧≦約5,000psi
ii. 温度、約18〜25℃
1.7.2. 前処理済み及び追跡緩衝液
i. 緩衝液、pH、導電性
全て第1のカラムローディング条件に依存する;大部分の場合、DF緩衝液は、同じか又は第1のカラムで平衡化のために使用された等価の緩衝液である。HSが第1のカラムである場合、PBSは共通の緩衝液であり得る)
ベンゾナーゼ処理のために、pH及び導電性の両方がベンゾナーゼの加工条件の範囲内であるべきである(例えば、約pH6.5〜8.5、導電性>15mS/cm)。DNA消化のための典型的なベンゾナーゼ量は100〜200U/mLである。2mM MgCl2が適当な消化のために加えられるべきである。
ii. 体積:前処理済み体積は系の残留液体積より大きい必要がある(ほとんどの場合、残留液体積の3倍)。
:追跡体積は試料体積の5〜10%である。
2. タンジェンシャルフロー濾過(TFF、別称UF/DF)、任意選択
2.1. 中空繊維カートリッジを備えるTFF
2.1.1. 10L細胞培養の場合
i. TFFは、細胞溶解前に実行される。
ii. 10Lのためには、GE中空繊維カートリッジUFP−100−C−9A(1.2m2)などのフィルター
iii. 容量。予備データは20Lが同じUFP−100−C−9A中空繊維カートリッジで作動するはずであることを示す。
iv. 細胞溶解前又は細胞溶解後のTFF。細胞溶解前のTFR
v. 最大圧。TMP。細胞溶解前の場合≧5psig(細胞溶解後の場合5〜10psi)
vi. 前処理又は追跡のための緩衝液。(カチオンHSの場合)第1のカラムとして、20mMリン酸緩衝液、pH7〜7.5/100〜150mM NaClが妥当な緩衝液であり、(アニオンHQ)の場合、第1のカラムとして、20mMトリス、pH7.5〜8.5/100〜150mM NaClが適当な緩衝液である。
2.1.2. SECカラム前、精製されたAAVベクターの中間体を濃縮するための限外濾過の場合
i. アニオン交換(Poros 50 HQ)溶出物をSECカラム体積の約5%に濃縮するためのTFF
ii. 材料:Poros 50HQ溶出物0.75カラム体積
iii. 配置:中空繊維UFP−C−100−4MA(10Lの出発体積の場合)
iv. フラッシング体積(残留液体積):約45mL
v. 平衡緩衝液:PBS300(10mM Na−P、pH7.2/300mM NaCl)
vi. 消毒緩衝液:1N NaOH
vii. 付着細胞培養と同じ条件が適用可能。
viii. TFFは、細胞溶解前でも細胞溶解後でも実施することができる。
2.1.3. 最終製剤化及び分子量の小さい可能な不純物の除去のためのTFF
i. 材料:Poros50 HQ溶出物(又はSECベクターピーク)
ii. 配置:中空繊維UFP−C−100−4MA(10Lの出発体積の場合)
iii. フラッシング体積(残留液体積):約45mL
iv. 平衡緩衝液:PBS180(10mM Na−P、pH7.3/180mM NaCl)
v. 透析濾過緩衝液:PBS180(10mM Na−P、pH7.3/180mM NaCl)
vi. 消毒緩衝液:1N NaOH
vii. 標的濃度:1.0E+13vg/mL
viii. 透析濾過:UF標的体積の12倍の体積(5.0E12vg/mL)
2.2. 渦巻き型膜モジュール又は平坦なプレートモジュールのいずれかを備える交互タンジェンシャルフロー(ATF)又はTFFが中空繊維カートリッジを備えるTFFの代替物である
3. 清澄化及び濾過
3.1. デプスフィルター
i. フィルター選択肢は、Clarisolve 20MS(0.5〜20μM)、Sartoclear DLシリーズ(10〜1μM)又はMillistak C0HC若しくはD0HC(0.65〜8μM)を含む
ii. 容量は1L/25cm2であり得る。
iii. 最大流速、約250mL/分/25cm2(10mL/分/cm2)
iv. 最大作業圧 約32psig
v. 調整緩衝液 約PBS300が適当であり得る
vi. 濾過ステップの数(1又は2、粗次に精密フィルター):可能性として単一ステップ:粗フィルター
3.2. Millipore SHC(0.5/0.2μM)又はSartopore 2(0.45/0.2μM、Sartorius)
i. 容量 約500mL/500cm2(0.2%トリトンX−100が少し役立つ、10〜20%増大)
ii. 最大流速 約1000mL/分/500cm2(2mL/分/cm2)
iii. 最大作業圧 約35psig
iv. 調整緩衝液ための例はPBS300である
v. 最終ステップ 容量は限定され得る(約55maxi Sartopore 2(1.8m2)が必要とされる);これが第2の濾過ステップである場合、容量は増大され得る
3.3. 例示的な10L規模の付着細胞培養の場合
i. Sartopore 2 MaxiCaps(1.2m2)が10L培養体積のために使用され得る
ii. この同じフィルターを20L培養体積で使用することができる。
iii. 前処理及び追跡緩衝液の導電性は、AAVベクターと膜との間の可能な相互作用を防止するために約15〜30mS/cmであり得る。
1.0 500〜600mlのrAAV回収物体積のために開発されたプロセスに基づく1.2L及びより大きい体積のrAAVベクター製造のための望ましい開発基準
1.1 1.2Lバイオリアクター懸濁培養から回収されたrAAVベクター(例えばLK03−FVIII)
1.2 1.2Lバイオリアクター懸濁培養からのrAAVベクターの精製
2.0 1.2Lバイオリアクター懸濁培養からのrAAVベクターの回収物(例えばLK03−FVIII)
2.1 プロセス流れ図
2.1.1 以下は、rAAVベクターの下流プロセスの回収部分についての例示的なプロセス流れ図である。
2.2 プロセスの流れの説明
2.2.1 以下は、rAAVベクターの下流プロセスの回収部分についての例示的なプロセスの流れの説明である:
2.3 回収作業プロセスの開発研究中に変化したパラメーター
2.3.1 以下のパラメーターが、rAAVベクターの下流プロセスの回収部分の開発について評価される:
本明細書で開示されるように、溶解方法、カラム数及びカラムのタイプは、種々の順序で選択して使用することができる。
4.0 1.2Lバイオリアクター懸濁培養のためのクロマトグラフィープロセス
4.1 rAAVベクター(例えばLK03−FVIII)クロマトグラフィープロセスの開発研究中に変化したパラメーター
4.1.1 以下の選択肢が、rAAVベクターの下流プロセスのクロマトグラフィー部分のために開発される:
4.2 例示的な非限定的カラム精製順序(A〜E):
A) 第1のカラム、カチオン(Poros 50HS)→第2のカラム、アニオン(例えば、Poros 50HQ)
B) 第1のカラム、カチオン(Poros 50HS)→第2のカラム、アニオン(例えば、Poros 50HQ)→第3のカラム、サイズ排除(例えば、Superdex 200PG)、
C) 第1のカラム、カチオン(Poros 50HS)→第2のカラム、サイズ排除(例えば、Superdex 200PG)→第3のカラム、アニオン(例えば、Poros 50HQ)
D) 第1のカラム、親和性(AVBセファロースHP)→第2のカラム、アニオン(例えば、Poros 50HQ)→第3のカラム(任意選択)、サイズ排除(例えば、Superdex 200PG)
E) 第1のカラム、親和性(AVBセファロースHP)→第2のカラム、サイズ排除(例えば、Superdex 200PG)→第3のカラム(任意選択)、アニオン(例えば、Poros 50HQ)
代表的なAAVカプシド(VP1)タンパク質。
AAV−SPK VP1カプシド(配列番号1)
1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLD
61 KGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ
121AKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDS
181ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV
241ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ
301RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA
361 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFED
421VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNW
481LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSS
541GVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNS
601QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADP
661PTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTE
721 GTYSEPRPIGTRYLTRNL
AAV−LK03 VP1カプシド(配列番号2)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
[0001]本特許出願は、2017年6月30日出願の米国特許出願第62/527,633号;2017年7月12日出願の米国特許出願第62/531,744号;及び2017年10月4日出願の米国特許出願第62/567,905号の利益を主張する。前述の出願の全内容は、本文、表、図面及び配列の全てを含めて参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (67)
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して、前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で前記核酸が減少した溶解物、ステップ(e)で清澄化された溶解物、又はステップ(e)で製造された希釈され清澄化された溶解物を、カチオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を希釈して、希釈されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記希釈されたカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記濃縮された第2のカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物又は前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。 - 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で前記核酸が減少した溶解物、ステップ(e)で清澄化された溶解物、又はステップ(e)で製造された希釈され清澄化された溶解物を、カチオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を濃縮して、濃縮されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記濃縮されたカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を希釈して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記希釈された第2のカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を希釈して、希釈された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物又は前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。 - 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で前記核酸が減少した溶解物、ステップ(e)で清澄化された溶解物、又はステップ(e)で製造された希釈され清澄化された溶解物を、カチオン交換カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を希釈して、希釈されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記希釈されたカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記濃縮された第2のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。 - 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって:
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で核酸が減少した前記溶解物、又はステップ(e)で製造された清澄化された溶解物若しくは希釈され清澄化された溶解物を、AAV親和性カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を希釈して、希釈されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記希釈されたカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)任意選択でステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記濃縮された第2のカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を濃縮して、濃縮された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物若しくは前記希釈された第2のカラム溶出物を濾過するか、又はステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物若しくは前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。 - 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター粒子を精製するための方法であって、
(a)rAAVベクター粒子を含む細胞及び/又は細胞培養上清を回収して、回収物を製造するステップと、
(b)任意選択でステップ(a)で製造された前記回収物を濃縮して、濃縮された回収物を製造するステップと、
(c)ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物を溶解して、溶解物を製造するステップと、
(d)ステップ(c)で製造された前記溶解物を処理して前記溶解物中の混入核酸を減少させ、それにより核酸が減少した溶解物を製造するステップと、
(e)任意選択でステップ(d)で製造された前記核酸が減少した溶解物を濾過して、清澄化された溶解物を製造し、任意選択で前記清澄化された溶解物を希釈して、希釈され清澄化された溶解物を製造するステップと、
(f)ステップ(d)で前記核酸が減少した溶解物、又はステップ(e)で製造された清澄化された溶解物若しくは希釈され清澄化された溶解物を、AAV親和性カラムクロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成されるカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記カラム溶出物を濃縮して、濃縮されたカラム溶出物を製造するステップと、
(g)ステップ(f)で製造された前記カラム溶出物又は前記濃縮されたカラム溶出物を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(SEC)に供して、rAAVベクター粒子で構成される第2のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第2のカラム溶出物を希釈して、希釈された第2のカラム溶出物を製造するステップと、
(h)任意選択でステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物又は前記希釈された第2のカラム溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーに供して、rAAVベクター粒子で構成される第3のカラム溶出物を製造し、それによりrAAVベクター粒子を、タンパク質不純物又は他の製造/プロセスに関連する不純物から分離し、任意選択で前記第3のカラム溶出物を希釈して、希釈された第3のカラム溶出物を製造するステップと、
(i)ステップ(g)で製造された前記第2のカラム溶出物若しくは前記希釈された第2のカラム溶出物を濾過するか、又はステップ(h)で製造された前記第3のカラム溶出物若しくは前記濃縮された第3のカラム溶出物を濾過して、それにより精製されたrAAVベクター粒子を製造するステップと
を含む方法。 - ステップ(b)及び/又はステップ(f)及び/又はステップ(g)及び/又はステップ(h)の前記濃縮が、限外濾過/透析濾過により、任意選択でタンジェンシャルフロー濾過(TFF)による、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)の前記濃縮が、前記回収された細胞及び細胞培養上清の体積を約2〜20分の1に減少させる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)及び/又はステップ(g)及び/又はステップ(h)の前記濃縮が、前記カラム溶出物の体積を約5〜20分の1に減少させる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(a)で製造された回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物の前記溶解が、物理的又は化学的手段による、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記物理的手段が、微小流動化又は均質化を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記化学的手段が、洗浄剤、任意選択で非イオン性洗浄剤、例えば、トリトンX−100を、任意選択で両端を含めて約0.1〜1.0%の間の濃度で含む、請求項9に記載の方法。
- ステップ(d)が、ヌクレアーゼで処理して、それにより混入核酸を減少させることを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼがベンゾナーゼを含む、請求項12に記載の方法。
- ステップ(e)の前記清澄化された溶解物又は前記希釈され清澄化された溶解物の前記濾過が、両端を含めて約0.1〜10.0ミクロンの間の細孔直径を有するフィルターによる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)の前記清澄化された溶解物の前記希釈が、リン酸緩衝水溶液、酢酸塩緩衝水溶液又はトリス緩衝水溶液による、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)の前記カラム溶出物又はステップ(g)の前記第2のカラム溶出物の前記希釈が、リン酸緩衝水溶液、酢酸塩緩衝水溶液又はトリス緩衝水溶液による、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リン酸緩衝水溶液又は酢酸塩緩衝水溶液が、両端を含めて約4.0〜7.4の間のpHを有する、請求項15又は16に記載の方法。
- 前記トリス緩衝水溶液が、7.5を超える、任意選択で両端を含めて約8.0〜9.0の間のpHを有する、請求項15又は16に記載の方法。
- ステップ(i)から生じた前記rAAVベクター粒子が、界面活性剤を用いて製剤化されて、AAVベクター製剤が製造される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムクロマトグラフィーが、ポリエチレングリコール(PEG)調整カラムクロマトグラフィーを含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムクロマトグラフィーが、前記rAAVベクター粒子の前記カラムからの溶出の前に、前記カラムをPEG溶液で洗浄することを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記PEGが、両端を含めて約1,000〜80,000g/molの範囲の平均分子量を有する、請求項20又は21に記載の方法。
- 前記PEGが、両端を含めて約4%〜約10%の濃度である、請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、前記rAAVベクター粒子の前記カラムからの溶出の前に、前記カラムを界面活性剤水溶液で洗浄することを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)の前記カチオン交換カラムが、前記rAAVベクター粒子の前記カラムからの溶出の前に、前記カラムを界面活性剤溶液で洗浄することを含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PEG溶液及び/又は前記界面活性剤溶液が、トリスCl/NaCl緩衝水溶液、リン酸/NaCl緩衝水溶液、又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液を含む、請求項21〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記NaCl緩衝液が、両端を含めて約20〜300mMの間のNaCl、又は両端を含めて約50〜250mMの間のNaClの範囲を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、カチオン又はアニオン界面活性剤を含む、請求項24〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、炭素12個の鎖を有する界面活性剤を含む、請求項24〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド(DTAC)又はサルコシルを含む、請求項24〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVベクター粒子が、ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムから、トリスCl/NaCl緩衝水溶液で溶出される、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トリスCl/NaCl緩衝液が、両端を含めて100〜400mM NaClを含み、任意選択で両端を含めて約7.5〜約9.0の範囲のpHである、請求項31に記載の方法。
- ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、トリスCl/NaCl緩衝水溶液で洗浄される、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トリスCl/NaCl緩衝水溶液中の前記NaClが、両端を含めて約75〜125mM NaClの範囲である、請求項33に記載の方法。
- 前記トリスCl/NaCl緩衝水溶液が、両端を含めて約7.5〜約9.0のpHである、請求項31〜33のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、1回又は複数回洗浄されて、第2の又は第3のカラム溶出物中のAAVの空のカプシドの量を減少させる、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アニオン交換カラムの洗浄が、カラムから、rAAV除去の前に、及び/又はrAAVの代わりに、AAVの空のカプシドを除去して、それにより第2の又は第3のカラム溶出物中のAAVの空のカプシドの量を減少させる、請求項33又は36に記載の方法。
- 前記アニオン交換カラムの洗浄が、カラムから、rAAV除去の前に、及び/又はrAAVの代わりに、全AAVの空のカプシドの少なくとも約50%を除去して、それにより第2の又は第3のカラム溶出物中のAAVの空のカプシドの量を約50%減少させる、請求項33又は36に記載の方法。
- 前記トリスCl/NaCl緩衝水溶液中の前記NaClが、両端を含めて約110〜120mM NaClの範囲である、請求項33、又は36〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶出されたrAAVベクター粒子及びAAVの空のカプシドの比及び/又は量が、前記洗浄緩衝液により制御される、請求項33〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVベクター粒子が、ステップ(f)の前記カチオン交換カラムからリン酸/NaCl緩衝水溶液又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液に溶出される、請求項1〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リン酸/NaCl緩衝液又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液が、両端を含めて約125〜500mM NaClの範囲である、請求項41に記載の方法。
- 前記リン酸/NaCl緩衝液又は酢酸塩/NaCl緩衝水溶液が、両端を含めて約5.5〜約7.5の範囲のpHを有する、請求項41に記載の方法。
- ステップ(f)、(g)及び/又は(h)の前記アニオン交換カラムが、四級化されたポリエチレンイミンなどの第四級アンモニウム官能基を含む、請求項1〜43のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(g)及び/又は(h)の前記サイズ排除カラム(SEC)が、両端を含めて約10,000〜約600,000の分離/分画範囲(分子量)を有する、請求項1〜44のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)の前記カチオン交換カラムが、スルホン酸又はスルホプロピルなどの官能基を含む、請求項1〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV親和性カラムが、AAVのカプシドタンパク質に結合するタンパク質又はリガンドを含む、請求項3〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、AAVのカプシドタンパク質に結合する抗体を含む、請求項47に記載の方法。
- AAVのカプシドタンパク質に結合する前記抗体が、ラマ(ラクダ科の動物)の単鎖抗体を含む、請求項48に記載の方法。
- 塩化セシウム勾配超遠心分離のステップが除外される、請求項1〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVベクター粒子が、siRNA、アンチセンス分子、miRNA、リボザイム及びshRNAからなる群から選択される核酸をコードする導入遺伝子を含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVベクター粒子が、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン(GH)、副甲状腺ホルモン(PTH)、成長ホルモン放出因子(GRF)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン(hCG)、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、エリスロポエチン(EPO)、結合組織成長因子(CTGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、上皮成長因子(EGF)、トランスフォーミング成長因子α(TGFα)、血小板由来成長因子(PDGF)、インスリン様成長因子I及びII(IGF−I及びIGF−II)、TGFβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質(BMP)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィンNT−3及びNT4/5、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン、アグリン、ネトリン−1及びネトリン−2、肝細胞成長因子(HGF)、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子生成物をコードする導入遺伝子を含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVベクター粒子が、トロンボポエチン(TPO)、インターロイキン(IL1〜IL−17)、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Fasリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、flk−2/flt3リガンド、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、T細胞受容体、キメラT細胞受容体、単鎖T細胞受容体、クラスI及びクラスIIのMHC分子からなる群から選択される遺伝子生成物をコードする導入遺伝子を含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVベクター粒子が、カルバモイルシンテターゼI、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−1アンチトリプシン、グルコース−6−ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第V因子、第VIII因子、第IX因子、シスタチオンベータ−シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−coAデヒドロゲナーゼ、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、グルタリルCoAデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、RPE65、H−タンパク質、T−タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子(CFTR)配列、及びジストロフィンcDNA配列からなる群から選択される先天性代謝異常の修正に有用なタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVベクター粒子が、第VIII因子又は第IX因子をコードする導入遺伝子を含む、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)で製造された前記回収物又はステップ(b)で製造された前記濃縮された回収物から全rAAVベクター粒子の約50〜90%を回収する、請求項1〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 1回のAAV親和性カラム精製により製造又は精製されたrAAVベクター粒子よりも高い純度を有するrAAVベクター粒子を製造する、請求項1〜56のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)及び(d)が、実質的に同時に実施される、請求項1〜57のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)の後であるがステップ(f)の前に、NaClが、両端を含めて約100〜400mM NaClの範囲、又は両端を含めて約140〜300mM NaClの範囲であるように調節される、請求項1〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVベクター粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10及びRh74からなる群から選択されるAAVから誘導される、請求項1〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVベクター粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、Rh74、配列番号1又は配列番号2のカプシド配列と70%以上の同一性を有するカプシド配列を含む、請求項1〜60のいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVベクター粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、又はRh74のITR配列と70%以上の同一性を有するITR配列を含む、請求項1〜61のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、懸濁又は付着の細胞を含む、請求項1〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳動物の細胞を含む、請求項1〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、HEK−293細胞を含む、請求項1〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 実施例1〜3のいずれかに記載の、任意の1つ又は複数のカラム、条件、濃度、モル濃度、体積、容量、流速、圧、材料、温度、pH、又はステップによって実施される、請求項1〜65のいずれか一項に記載の方法。
- カラム精製の前の前記細胞溶解及び/又は調製が、実施例4に記載の任意の1つ又は複数の条件、濃度、モル濃度、体積、容量、流速、圧、材料、温度、pH、又はステップによって実施される、請求項1〜66のいずれか一項に記載の方法。
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