KR20240021231A - Aav 벡터 컬럼 정제 방법 - Google Patents
Aav 벡터 컬럼 정제 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240021231A KR20240021231A KR1020247000822A KR20247000822A KR20240021231A KR 20240021231 A KR20240021231 A KR 20240021231A KR 1020247000822 A KR1020247000822 A KR 1020247000822A KR 20247000822 A KR20247000822 A KR 20247000822A KR 20240021231 A KR20240021231 A KR 20240021231A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- particles
- column
- raav
- chromatography medium
- total
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 161
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 title description 26
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 665
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 112
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 claims description 224
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 174
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 claims description 163
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 137
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 98
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 97
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 87
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 82
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 69
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 65
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 64
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 60
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 56
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 50
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 49
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 49
- -1 Ba(II) Chemical compound 0.000 claims description 47
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 42
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 33
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 33
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 32
- CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide/propylene oxide copolymer Chemical compound CCCOC(C)COCCO CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 claims description 31
- 229940044519 poloxamer 188 Drugs 0.000 claims description 31
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 30
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 27
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 27
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 26
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 26
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 26
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 claims description 22
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 22
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 22
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 21
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 21
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 21
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 20
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 19
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 18
- 229920013806 TRITON CG-110 Polymers 0.000 claims description 18
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 18
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 18
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 18
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 18
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 18
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 18
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 claims description 18
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 18
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 18
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 17
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 16
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 15
- 239000012606 POROS 50 HQ resin Substances 0.000 claims description 14
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 13
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 claims description 12
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 claims description 12
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 claims description 12
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 claims description 12
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 claims description 12
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 claims description 12
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 claims description 12
- 241000649045 Adeno-associated virus 10 Species 0.000 claims description 12
- 241000649046 Adeno-associated virus 11 Species 0.000 claims description 12
- 241000649047 Adeno-associated virus 12 Species 0.000 claims description 12
- 241000958487 Adeno-associated virus 3B Species 0.000 claims description 12
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 12
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 claims description 11
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 10
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 10
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 9
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 150000001879 copper Chemical class 0.000 claims description 8
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 8
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 6
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 6
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 4
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 2
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 claims 1
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 48
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 48
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 47
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 42
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 35
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 32
- 230000006870 function Effects 0.000 description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 23
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 17
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 16
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 15
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 12
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 11
- 238000002086 displacement chromatography Methods 0.000 description 11
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 7
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 7
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 6
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 6
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical class 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDZOASGQNOPSCU-WDSKDSINSA-N Argininosuccinic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC\N=C(/N)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O KDZOASGQNOPSCU-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 3
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 3
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 3
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 3
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 3
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 3
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 3
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 3
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 description 3
- 102100031176 Retinoid isomerohydrolase Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 3
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 3
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 3
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 3
- 229920000155 polyglutamine Polymers 0.000 description 3
- 108010040003 polyglutamine Proteins 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010054126 retinoid isomerohydrolase Proteins 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 3
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 2
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 2
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 102000015225 Connective Tissue Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010039419 Connective Tissue Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 2
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102100037156 Gap junction beta-2 protein Human genes 0.000 description 2
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 108010086800 Glucose-6-Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000003638 Glucose-6-Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 2
- 208000032003 Glycogen storage disease due to glucose-6-phosphatase deficiency Diseases 0.000 description 2
- 206010018464 Glycogen storage disease type I Diseases 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102100033448 Lysosomal alpha-glucosidase Human genes 0.000 description 2
- 102000007981 Ornithine carbamoyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 101710198224 Ornithine carbamoyltransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 2
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 2
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- 208000009415 Spinocerebellar Ataxias Diseases 0.000 description 2
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 2
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039203 Tripeptidyl-Peptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100034197 Tripeptidyl-peptidase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 2
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 201000004541 glycogen storage disease I Diseases 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 2
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 208000030761 polycystic kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000012609 strong anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- XFNJVJPLKCPIBV-UHFFFAOYSA-N trimethylenediamine Chemical compound NCCCN XFNJVJPLKCPIBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 239000012610 weak anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- PVOAHINGSUIXLS-UHFFFAOYSA-N 1-Methylpiperazine Chemical compound CN1CCNCC1 PVOAHINGSUIXLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046716 3-Methyl-2-Oxobutanoate Dehydrogenase (Lipoamide) Proteins 0.000 description 1
- 101150079978 AGRN gene Proteins 0.000 description 1
- 101150091481 ATP7 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 1
- 208000004804 Adenomatous Polyps Diseases 0.000 description 1
- 108010024878 Adenovirus E1A Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010087905 Adenovirus E1B Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010057856 Adenovirus E2 Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100040026 Agrin Human genes 0.000 description 1
- 108700019743 Agrin Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 102000009840 Angiopoietins Human genes 0.000 description 1
- 108010009906 Angiopoietins Proteins 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004452 Arginase Human genes 0.000 description 1
- 108700024123 Arginases Proteins 0.000 description 1
- 102100020999 Argininosuccinate synthase Human genes 0.000 description 1
- 102000007372 Ataxin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010032963 Ataxin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010078286 Ataxins Proteins 0.000 description 1
- 102000014461 Ataxins Human genes 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 208000001593 Bernard-Soulier syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101710124976 Beta-hexosaminidase A Proteins 0.000 description 1
- 102100022548 Beta-hexosaminidase subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010068597 Bulbospinal muscular atrophy congenital Diseases 0.000 description 1
- 201000007120 C1 inhibitor deficiency Diseases 0.000 description 1
- 101100029886 Caenorhabditis elegans lov-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010008025 Cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 1
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 201000011297 Citrullinemia Diseases 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000006992 Color Vision Defects Diseases 0.000 description 1
- 108700040183 Complement C1 Inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102000055157 Complement C1 Inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 208000028702 Congenital thrombocyte disease Diseases 0.000 description 1
- 108010069156 Connexin 26 Proteins 0.000 description 1
- 108091004554 Copper Transport Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000020856 Copper Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010022637 Copper-Transporting ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102100027587 Copper-transporting ATPase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100027591 Copper-transporting ATPase 2 Human genes 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000003849 Cytochrome P450 Human genes 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000003844 DNA helicases Human genes 0.000 description 1
- 108090000133 DNA helicases Proteins 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- 108010033174 Deoxycytidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100029588 Deoxycytidine kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000024720 Fabry Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 1
- 102100023364 Ganglioside GM2 activator Human genes 0.000 description 1
- 101710201362 Ganglioside GM2 activator Proteins 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037326 Gaucher disease type 1 Diseases 0.000 description 1
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010015451 Glutaryl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100028603 Glutaryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102000004327 Glycine dehydrogenase (decarboxylating) Human genes 0.000 description 1
- 108090000826 Glycine dehydrogenase (decarboxylating) Proteins 0.000 description 1
- 108010001483 Glycogen Synthase Proteins 0.000 description 1
- 208000032007 Glycogen storage disease due to acid maltase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010053185 Glycogen storage disease type II Diseases 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 101710191387 Guanylate cyclase 2D Proteins 0.000 description 1
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019468 Hemiplegia Diseases 0.000 description 1
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002972 Hepatolenticular Degeneration Diseases 0.000 description 1
- 206010019860 Hereditary angioedema Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010000540 Hexosaminidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002268 Hexosaminidases Human genes 0.000 description 1
- 101000784014 Homo sapiens Argininosuccinate synthase Proteins 0.000 description 1
- 101001045440 Homo sapiens Beta-hexosaminidase subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000936280 Homo sapiens Copper-transporting ATPase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000954092 Homo sapiens Gap junction beta-2 protein Proteins 0.000 description 1
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 108010056651 Hydroxymethylbilane synthase Proteins 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000001019 Inborn Errors Metabolism Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 description 1
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108010013792 Isovaleryl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100025392 Isovaleryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 208000027747 Kennedy disease Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 108010085747 Methylmalonyl-CoA Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000019010 Methylmalonyl-CoA Mutase Human genes 0.000 description 1
- 108010051862 Methylmalonyl-CoA mutase Proteins 0.000 description 1
- 101710169105 Minor spike protein Proteins 0.000 description 1
- 102000014962 Monocyte Chemoattractant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010064136 Monocyte Chemoattractant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100030626 Myosin-binding protein H Human genes 0.000 description 1
- 101710139548 Myosin-binding protein H Proteins 0.000 description 1
- 108010006140 N-sulfoglucosamine sulfohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102100027661 N-sulphoglucosamine sulphohydrolase Human genes 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010074223 Netrin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009065 Netrin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100021584 Neurturin Human genes 0.000 description 1
- 108010015406 Neurturin Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000004132 Ornithine aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000691 Ornithine aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010069013 Phenylalanine Hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100038223 Phenylalanine-4-hydroxylase Human genes 0.000 description 1
- 102000014750 Phosphorylase Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010064071 Phosphorylase Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 208000013544 Platelet disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034391 Porphobilinogen deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010035004 Prephenate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 208000032319 Primary lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 101710088575 Rab escort protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710108890 Rab proteins geranylgeranyltransferase component A 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100022881 Rab proteins geranylgeranyltransferase component A 1 Human genes 0.000 description 1
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 description 1
- 201000007737 Retinal degeneration Diseases 0.000 description 1
- 101150097162 SERPING1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 108010019965 Spectrin Proteins 0.000 description 1
- 102000005890 Spectrin Human genes 0.000 description 1
- 102000011971 Sphingomyelin Phosphodiesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010061312 Sphingomyelin Phosphodiesterase Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 102000005262 Sulfatase Human genes 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022292 Tay-Sachs disease Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100022356 Tyrosine-protein kinase Mer Human genes 0.000 description 1
- 102100038413 UDP-N-acetylglucosamine-dolichyl-phosphate N-acetylglucosaminephosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010024501 UDPacetylglucosamine-dolichyl-phosphate acetylglucosamine-1-phosphate transferase Proteins 0.000 description 1
- 101150013568 US16 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010046298 Upper motor neurone lesion Diseases 0.000 description 1
- 208000014769 Usher Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 108091034131 VA RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 208000018839 Wilson disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 208000006269 X-Linked Bulbo-Spinal Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000000761 achromatopsia Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 108700019030 adenovirus E4orf6 Proteins 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012615 aggregate Substances 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004562 autosomal dominant cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 1
- 208000031514 autosomal recessive nonsyndromic hearing loss 1A Diseases 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 108010018804 c-Mer Tyrosine Kinase Proteins 0.000 description 1
- 229940009550 c1 esterase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000016617 citrullinemia type I Diseases 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 201000007254 color blindness Diseases 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N cystathionine Chemical compound OC(=O)C(N)CCSCC(N)C(O)=O ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012938 design process Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 108060002566 ephrin Proteins 0.000 description 1
- 102000012803 ephrin Human genes 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 201000004502 glycogen storage disease II Diseases 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 1
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 1
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000016245 inborn errors of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000015978 inherited metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000010901 lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 1
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- CRVGTESFCCXCTH-UHFFFAOYSA-N methyl diethanolamine Chemical compound OCCN(C)CCO CRVGTESFCCXCTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 1
- 108010081726 netrin-2 Proteins 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 description 1
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 208000004521 platelet storage pool deficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000008417 spastic hemiplegia Diseases 0.000 description 1
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 201000003624 spinocerebellar ataxia type 1 Diseases 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 108060007951 sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001875 tumorinhibitory effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/363—Anion-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
- B01D15/422—Displacement mode
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
rAAV 입자를 정제하는 방법, 특히 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자 양자 모두를 포함하는 rAAV 제제로부터 전체 rAAV 입자를 정제하는 방법이 본원에 개시되었다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 6월 11일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/209,680호 및 2022년 6월 9일에 출원된 63/366,094호에 대한 우선권을 주장하며, 그 개시 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
기술분야
본 출원은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 정제하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 출원은 전체(full) rAAV 입자 및 비-전체(non-full) rAAV 입자 양자 모두를 포함하는 제제로부터 전체 rAAV 입자를 정제하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
유전자 전달은 후천성 및 유전성 질환의 치료에 유망한 방법이다. 아데노-관련 바이러스(AAV)-기반 시스템을 포함하는 유전자 전달 목적을 위한 다수의 바이러스-기반 시스템이 기술되었다.
AAV는 데펜도바이러스(Dependovirus) 속에 속하는 헬퍼-의존성 DNA 파보바이러스이다. AAV는 증식성 감염을 발생시키기 위해, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 백시니아와 같은 헬퍼 바이러스 기능을 필요로 한다.
AAV는 넓은 숙주 범위를 가지며, 적합한 헬퍼 바이러스의 존재 하에 임의의 종으로부터의 세포에서 복제될 수 있다. AAV는 임의의 인간 또는 동물 질환과 관련이 없었고, 통합시 숙주 세포의 생물학적 특성에 악영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
AAV 벡터는 AAV 유전체의 내부 부분을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키고, 관심 있는 이종성 핵산 서열을 역전된 말단 반복부(inverted terminal repeats: ITR) 사이에 삽입시킴에 의해, 관심 있는 이종성 핵산 서열(예를 들어, 치료용 단백질, 안티센스 분자와 같은 핵산, 리보자임, miRNA 등을 인코딩하는 선택된 유전자)을 지니도록 조작될 수 있다. ITR은 그러한 벡터에서 기능을 유지하여 관심 있는 이종성 핵산 서열을 함유하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV)의 복제 및 패키징을 허용한다. 이종성 핵산 서열은 또한 전형적으로 환자의 표적 세포에서 핵산의 발현을 유도할 수 있는 프로모터 서열에 연결된다. 종결 신호, 예를 들어, 폴리아데닐화 부위가 또한 벡터에 포함될 수 있다. rAAV 유전체 DNA는 정20면체 대칭(icosahedral symmetry)으로 배열된 3개의 캡시드 단백질(VP1, VP2 및 VP3)의 혼합물을 포함하는 단백질 쉘인 바이러스 캡시드에 패키징되어 있다.
재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV)는 다수의 그룹에 의한 여러 초기 단계 임상 시험에서 탁월한 치료 가능성을 보여주었다. 승인을 향한 이 새로운 부류의 생물학적 제품의 개발은 벡터 설계 및 제조 공정 파라미터가 임상 등급 벡터의 불순물 프로파일에 어떻게 영향을 미치는지를 더 잘 이해하는 것을 포함하는, 벡터 특성화 및 품질 관리 방법의 개선을 포함할 것이다.
rAAV 제조와 관련된 과제 중 하나는 완전한(complete) 유전 물질을 포함하지 않는 "비-전체" rAAV 입자의 형성이다. 본원에 사용된 바와 같이, 비-전체 rAAV 입자는 "빈(empty)" 입자 및 "부분(partial)" 입자를 포함하는 다양한 입자 또는 변이체를 의미한다. 본원에서의 "부분" 입자는 일부 유전 물질을 포함하지만, 전체 입자와 같이 완전한 유전 물질을 포함하지 않는 rAAV 입자를 의미한다. rAAV-매개 유전자 발현의 임상적 안전성과 유효성에 대한 비-전체 입자(빈 입자 및 부분 입자를 포함)의 영향에 대한 의문으로 인해 전체 입자로부터 이러한 종을 제거하거나 분리하기 위한 정제 공정의 개발이 필요하다. 이러한 유형의 rAAV 입자 사이의 구조적 유사성을 고려할 때, 비-전체 AAV 입자 및 전체 AAV 입자를 효율적으로 분리시키기 위한 강력하고 확장 가능한 정제 공정의 개발은 어려운 과제로 남아 있다. rAAV 입자는 rAAV의 싱글 스트랜드 DNA 유전체의 존재 및 길이에 따라 다르다. 비-전체 입자로부터 전체 rAAV 입자를 분리하기 위해 다양한 기술들이 개발되었다. 그러나, 이러한 기술들은 종종 낮은 순도 및/또는 낮은 수율로 설계된 전체 rAAV 입자를 제공한다.
따라서, 빈 입자 또는 부분 입자로부터의 정제를 포함하여, 비-전체 입자로부터 전체 rAAV 입자를 높은 순도 및/또는 높은 수율로 정제하기 위한 신규한 시스템 및 방법의 개발이 여전히 필요하다.
발명의 간략한 요약
본 출원은 컬럼 크로마토그래피 기술을 사용하여, 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자(빈 입자 및/또는 부분 입자를 포함할 수 있음)를 포함하는 rAAV 제제로부터 전체 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 정제하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.
하나의 일반적인 측면에서, 본 출원은 전체 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(a). 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자를 포함하는 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(b). 로딩 완충액 중의 rAAV 제제를 크로마토그래피 매질을 포함하는 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 전체 rAAV 입자는 비-전체 입자 보다 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 결합 친화도를 가지는, 단계; 및
(c). 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 정제된 제제를 수득하는 단계;
를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 빈 입자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 부분 입자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 빈 입자와 부분 입자 양자 모두를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 크로마토그래피 매질에 결합하지 않고 컬럼을 통해 흐른다.
일부 실시 형태에서, 부분 입자는 크로마토그래피 매질에 결합하지 않고 컬럼을 통해 흐른다.
일부 실시 형태에서, 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 빈 rAAV 입자의 양이 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 크로마토그래피 매질에 결합된 빈 입자가 컬럼으로부터 로드 통과액(flowthrough) 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 한다.
일부 실시 형태에서, 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 rAAV 입자의 양이 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 크로마토그래피 매질에 결합된 빈 입자가 컬럼으로부터 로드 통과액 내로 부분 rAAV 입자 및 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 한다.
일부 실시 형태에서, 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 rAAV 입자의 양이 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 크로마토그래피 매질에 결합된 빈 입자 및 부분 입자가 컬럼으로부터 로드 통과액 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 한다.
일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 매질이 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 매질이다.
일부 실시 형태에서, 컬럼 크로마토그래피 매질이 Poros 50 HQ, Poros 50 D, Poros 50 PI, Capto ImpRes Q, 및 Poros XQ로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 Poros XQ이다.
일부 실시 형태에서, 컬럼 크로마토그래피 매질이 모놀리식 예컨대 CIMmultus™ QA 모놀리식 컬럼이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 트리스(Tris), 비스-트리스(Bis-tris), 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 염의 음이온 성분은 결정적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 6-10, 바람직하게는 8-9의 pH를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 염의 음이온 성분은 결정적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 약 6-10, 바람직하게는 8-9의 pH를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 정제된 전체 rAAV 입자의 수율이 70% 이상(no less than), 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이다.
일부 실시 형태에서, 정제된 제제에는 비-전체 입자가 실질적으로 없다. 다른 실시 형태에서, 정제된 제제는 rAAV 제제의 비율 보다 전체 rAAV 입자 대 비-전체 입자의 증가된 비율을 포함한다. 바람직하게는, 정제된 제제 중의 전체 rAAV 입자 대 비-전체 입자의 비율은 9:1 이상, 예컨대 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1 또는 50:1 또는 이들 사이의 임의의 비율이고, 더욱 바람직하게는 49:1 이상이다.
일부 실시 형태에서, 전체 rAAV 입자가 폴리펩티드를 인코딩하는 전이유전자(transgene), 또는 siRNA, 안티센스 분자, miRNA, 리보자임 및 shRNA로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산을 포함한다.
일부 실시 형태에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형으로부터 유래된 캡시드를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, rAAV 입자는 이온 교환 크로마토그래피 매질에 결합할 수 있는 조작된 캡시드로부터 유래된 캡시드를 포함한다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 출원은 전체 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(a). 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자를 포함하는 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(b). 로딩 완충액 중의 rAAV 제제의 제1 배치(batch)를 제1 크로마토그래피 매질을 포함하는 제1 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 전체 rAAV 입자는 비-전체 입자 보다 제1 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 결합 친화도를 가지며, 제1 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 제1 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 제1 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자가 제1 컬럼으로부터 제1 로드 통과액 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 하는, 단계;
(c). 제1 로드 통과액을 제2 크로마토그래피 매질을 포함하는 제2 컬럼에 로딩하여, 부분적으로 로딩된(즉, 완전히 포화되지 않음) 제2 컬럼을 수득하는 단계로서, 바람직하게는, 제2 크로마토그래피 매질은 제1 크로마토그래피 매질과 동일한 유형인, 단계;
(d). 선택적으로, 제1 컬럼을 세척 완충액으로 세척하여, 세척된 제1 컬럼을 수득하는 단계;
(e). 단계 (c) 이후 또는 세척 단계 (d)가 수행되는 경우 세척 단계 (d) 이후에 제2 컬럼을 바이패싱(bypassing)하고, 제1 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 제1 컬럼 및 용리된 제1 컬럼으로부터 제1 용출액을 수득하는 단계로서, 여기서 제1 용출액은 전체 rAAV 입자 대 비-전체 rAAV 입자의 증가된 비율을 포함하는, 단계;
(f). 로딩 완충액 중의 rAAV 제제의 제2 배치를 부분적으로 로딩된 제2 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 제2 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 제2 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 제2 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자가 제2 컬럼으로부터 제2 로드 통과액 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 하는, 단계;
(g). 제2 로드 통과액을 용리된 제1 컬럼에 로딩하여, 부분적으로 로딩된 제1 컬럼을 수득하는 단계;
(h). 선택적으로, 제2 컬럼을 세척 완충액으로 세척하여, 세척된 제2 컬럼을 수득하는 단계;
(i). 단계 (g) 이후 또는 세척 단계 (h)가 수행되는 경우 세척 단계 (h) 이후에 제1 컬럼을 바이패싱하고, 제2 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 제2 용출액 및 용리된 제2 컬럼을 수득하는 단계로서, 여기서 제2 용출액은 전체 rAAV 입자 대 비-전체 rAAV 입자의 증가된 비율을 포함하는, 단계; 및
(j). 제1 용출액 및 제2 용출액을 합쳐서(combining) 정제된 제제를 생산하는 단계;
를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 빈 입자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 부분 입자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 빈 입자와 부분 입자 양자 모두를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자가 빈 입자와 부분 입자 양자 모두를 포함하는 경우, 단계 (i) 중의 제2 용출액은 전체 및 부분 rAAV 입자 대 빈 rAAV 입자의 증가된 비율을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 2개 이상의 컬럼이 사용될 수 있으며, 2개가 최소이다. 3개 컬럼 셋업에서, 전체 입자는 제1 컬럼에서 풍부화되고, 부분 입자가 있는 경우 제2 컬럼에서 풍부화되고, 빈 입자는 제3 컬럼에서 풍부화된다. 일부 실시 형태에서, 불순물 또는 응집체가 제제 중에 존재하는 경우, 불순물 또는 응집체는 전체 입자 보다 더 큰 친화도로 제1 컬럼에 결합할 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 전체 입자는 후속 컬럼(들)에서 풍부화될 것이다.
일부 실시 형태에서, 제1 크로마토그래피 매질 및/또는 제2 크로마토그래피 매질이 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 매질이다.
일부 실시 형태에서, 제2 컬럼은 제1 통과액을 로딩한 후 부분적으로 로딩된다.
일부 실시 형태에서, 단계 (b) 내지 단계 (i)는 하나 이상의 사이클로 수행된다.
일부 실시 형태에서, 용리된 컬럼은 다음 로딩 사이클 전 사이클 전체에 걸쳐 일관된 컬럼 결합 능력을 유지하는데 유익하거나 필요한 후속 단계를 거칠 수 있다. 예를 들어, 이러한 단계에는 컬럼 제거, 컬럼 세척 및/또는 컬럼 소독, 및/또는 컬럼 재-평형화 등이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시 형태에서, 제1 또는 제2 컬럼 크로마토그래피 매질이 Poros 50 HQ, Poros 50 D, Poros 50 PI, Capto ImpRes Q, 및 Poros XQ로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 Poros XQ이다.
일부 실시 형태에서, 컬럼 크로마토그래피 매질이 모놀리식 예컨대 CIMmultus™ QA 모놀리식 컬럼이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 염의 음이온 성분은 결정적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 6-10, 바람직하게는 8-9의 pH를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머(poloxamer) 188, 폴리소르베이트(polysorbate) 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤(Triton) X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 염의 음이온 성분은 결정적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 약 6-10, 바람직하게는 8-9의 pH를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
일부 실시 형태에서, 정제된 전체 rAAV 입자의 수율이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이다.
일부 실시 형태에서, 정제된 제제에는 비-전체 입자가 실질적으로 없다. 다른 실시 형태에서, 정제된 제제는 rAAV 제제의 비율 보다 전체 rAAV 입자 대 비-전체 입자의 증가된 비율을 포함한다. 바람직하게는, 정제된 제제 중의 전체 입자 대 비-전체 입자의 비율은 9:1 이상, 예컨대 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1 또는 50:1 또는 이들 사이의 임의의 비율이고, 더욱 바람직하게는 49:1 이상이다.
일부 실시 형태에서, 전체 rAAV 입자가 폴리펩티드를 인코딩하는 전이유전자, 단백질을 인코딩하거나 관심 있는 전사체로 전사되는 핵산, 또는 siRNA, 안티센스 분자, miRNA 리보자임 및 shRNA로 구성되는 군으로부터 선택된, 핵산을 포함한다.
일부 실시 형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, Rh8, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, LK03, RHM4-1, DJ, DJ8, NP59, Anc-80 및 이들의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 AAV로부터 유래된 캡시드를 포함하며, 문헌 [Pulicherla et al., Mol. Ther., 19(6) 1070-1078 (2011)](특히 AAV9.47을 포함하는 AAV9 변이체를 기재함), 미국 특허 번호 7,906,111호(특히 AAV9(hu14) 기재함), 10,532,111호(특히 NP59를 기재함), 10,738,087호(특히 Anc-80을 기재함), 9,169,299호("LK03"을 기재함), 9,840,719호("RHM4-1"을 기재함), 7,749,492호, 7,588,772호("DJ" 및 "DJ8"을 기재함), 9,587,282호 및 특허 출원 WO2012/145601호, WO2013/158879호, WO2015/013313호, WO2018/156654호, US2013/0059732호에 설명된 AAV 캡시드의 변이체를 포함하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 출원은 전체 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(a). 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자를 포함하는 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(b). 로딩 완충액 중의 rAAV 제제를 크로마토그래피 매질을 포함하는 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 로딩 완충액은 CaCl2를 포함하고, 전체 rAAV 입자는 크로마토그래피 매질에 결합하는, 단계; 및
(c). 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 정제된 제제를 수득하는 단계로서, 여기서 용리 완충액이 선택적으로 CaCl2를 포함하는 단계;
를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 매질이 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 매질이다.
일부 실시 형태에서, 컬럼 크로마토그래피 매질이 Poros 50 HQ, Poros 50 D, Poros 50 PI, Capto ImpRes Q, 및 Poros XQ로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 Poros XQ이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 양이온의 염을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 양이온의 염을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 약 0-10 mM CaCl2, 바람직하게는 0.1-2.5 mM CaCl2을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0.1-20 mM CaCl2, 바람직하게는 5-10 mM CaCl2을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 약 0-100 mM LiCl, 바람직하게는 0-75 mM LiCl을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0-200 mM LiCl, 바람직하게는 0-150 mM LiCl을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 약 0-10 mM CuCl2, 바람직하게는 0.1-3 mM CuCl2을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0-10 mM CuCl2, 바람직하게는 0-3 mM CuCl2을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 NaCl 및/또는 MgCl2을 더 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 약 6-10, 바람직하게는 8-9의 pH를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 NaCl 및/또는 MgCl2를 더 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 약 6-10, 바람직하게는 8-9의 pH를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 정제된 전체 rAAV 입자의 수율이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이다.
일부 실시 형태에서, 정제된 제제에는 비-전체 입자가 실질적으로 없다. 다른 실시 형태에서, 정제된 제제는 rAAV 제제의 비율 보다 전체 rAAV 입자 대 비-전체 입자의 증가된 비율을 포함한다. 바람직하게는, 정제된 제제 중의 전체 입자 대 비-전체 입자의 비율은 9:1 이상, 예컨대 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1 또는 50:1 또는 이들 사이의 임의의 비율이고, 더욱 바람직하게는 49:1 이상이다.
일부 실시 형태에서, 전체 rAAV 입자가 폴리펩티드를 인코딩하는 전이유전자, 또는 siRNA, 안티센스 분자, miRNA, 리보자임 및 shRNA로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산을 포함한다.
일부 실시 형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, Rh8, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, LK03, RHM4-1, DJ, DJ8, NP59, Anc-80 및 이들의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된 AAV로부터 유래되며, 문헌 [Pulicherla et al., Mol. Ther., 19(6) 1070-1078 (2011)](특히 AAV9.47을 포함하는 AAV9 변이체를 기재함), 미국 특허 번호 7,906,111호(특히 AAV9(hu14) 기재함), 10,532,111호(특히 NP59를 기재함), 10,738,087호(특히 Anc-80을 기재함), 9,169,299호("LK03"을 기재함), 9,840,719호("RHM4-1"을 기재함), 7,749,492호, 7,588,772호("DJ" 및 "DJ8"을 기재함), 9,587,282호 및 특허 출원 WO2012/145601호, WO2013/158879호, WO2015/013313호, WO2018/156654호, US2013/0059732호에 설명된 AAV 캡시드의 변이체를 포함하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
하나의 일반적인 측면에서, 본 출원은 부분 rAAV 입자를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(a). 빈 입자 및 부분 입자를 포함하는 비-전체 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(b). 로딩 완충액 중의 비-전체 rAAV 제제를 크로마토그래피 매질을 포함하는 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 부분 rAAV 입자는 빈 입자 보다 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 결합 친화도를 가지는, 단계; 및
(c). 크로마토그래피 매질에 결합된 부분 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 정제된 제제를 수득하는 단계;
를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 컬럼에 적용된 부분 rAAV 입자 및 빈 rAAV 입자의 양이 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 크로마토그래피 매질에 결합된 빈 입자가 컬럼으로부터 로드 통과액 내로 부분 rAAV 입자에 의해 치환되도록 한다.
일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 매질이 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 매질이다.
일부 실시 형태에서, 컬럼 크로마토그래피 매질이 Poros 50 HQ, Poros 50 D, Poros 50 PI, Capto ImpRes Q, 및 Poros XQ로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 Poros XQ이다.
일부 실시 형태에서, 컬럼 크로마토그래피 매질이 모놀리식 예컨대 CIMmultus™ QA 모놀리식 컬럼이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 염의 음이온 성분은 결정적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 6-10, 바람직하게는 8-9의 pH를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 염의 음이온 성분은 결정적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 약 6-10, 바람직하게는 8-9의 pH를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
일부 실시 형태에서, 정제된 제제에는 빈 입자가 실질적으로 없다. 다른 실시 형태에서, 정제된 제제는 rAAV 제제의 비율 보다 부분 rAAV 입자 대 빈 입자의 증가된 비율을 포함한다. 바람직하게는, 정제된 제제 중의 부분 rAAV 입자 대 빈 입자의 비율은 9:1 이상, 예컨대 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1 또는 50:1 또는 이들 사이의 임의의 비율이고, 더욱 바람직하게는 49:1 이상이다.
일부 실시 형태에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형으로부터 유래된 캡시드를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, rAAV 입자는 이온 교환 크로마토그래피 매질에 결합할 수 있는 조작된 캡시드로부터 유래된 캡시드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, Rh8, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, LK03, RHM4-1, DJ, DJ8, NP59, Anc-80 및 이들의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된 AAV로부터 유래되며, 문헌 [Pulicherla et al., Mol. Ther., 19(6) 1070-1078 (2011)](특히 AAV9.47을 포함하는 AAV9 변이체를 기재함), 미국 특허 번호 7,906,111호(특히 AAV9(hu14) 기재함), 10,532,111호(특히 NP59를 기재함), 10,738,087호(특히 Anc-80을 기재함), 9,169,299호("LK03"을 기재함), 9,840,719호("RHM4-1"을 기재함), 7,749,492호, 7,588,772호("DJ" 및 "DJ8"을 기재함), 9,587,282호 및 특허 출원 WO2012/145601호, WO2013/158879호, WO2015/013313호, WO2018/156654호, US2013/0059732호에 설명된 AAV 캡시드의 변이체를 포함하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
하나의 일반적인 측면에서, 본 출원은 빈 rAAV 입자를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(a). 빈 rAAV 입자, 및 전체 rAAV 입자 및 부분 rAAV 입자 중 적어도 하나를 포함하는 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(b). 로딩 완충액 중의 rAAV 제제를 크로마토그래피 매질을 포함하는 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 빈 rAAV 입자는 전체 입자 또는 부분 입자 보다 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 결합 친화도를 가지며, 컬럼에 적용된 빈 rAAV 입자 및 전체 입자 및 부분 입자 중 적어도 하나의 양은 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 입자 및 부분 입자 중 적어도 하나가 컬럼으로부터 통과액 내로 빈 rAAV 입자에 의해 치환되도록 하는, 단계; 및
(c). 크로마토그래피 매질에 결합된 빈 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 정제된 제제를 수득하는 단계;
를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 컬럼에 적용된 빈 입자 및 전체 입자 및 부분 입자 중 적어도 하나의 양은 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 입자 및 부분 입자 중 적어도 하나가 컬럼으로부터 로드 통과액 내로 빈 rAAV 입자에 의해 치환되도록 한다.
일부 실시 형태에서, rAAV 제제는 전체 입자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, rAAV 제제는 부분 입자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, rAAV 제제는 전체 입자 및 부분 입자 양자 모두를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 매질이 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 매질이다.
일부 실시 형태에서, 컬럼 크로마토그래피 매질이 Poros 50 HQ, Poros 50 D, Poros 50 PI, Capto ImpRes Q, 및 Poros XQ로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 Poros XQ이다.
일부 실시 형태에서, 컬럼 크로마토그래피 매질이 모놀리식 예컨대 CIMmultus™ QA 모놀리식 컬럼이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 염의 음이온 성분은 결정적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 6-10, 바람직하게는 8-9의 pH를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 염의 음이온 성분은 결정적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 약 6-10, 바람직하게는 8-9의 pH를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
일부 실시 형태에서, 정제된 제제에는 빈 입자가 실질적으로 없다. 다른 실시 형태에서, 정제된 제제는 rAAV 제제의 비율 보다 부분 rAAV 입자 대 빈 입자의 증가된 비율을 포함한다. 바람직하게는, 정제된 제제 중의 부분 rAAV 입자 대 빈 입자의 비율은 3:1 이상, 예컨대 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7:1 또는 7.5:1 또는 이들 사이의 임의의 비율이고, 더욱 바람직하게는 4:1 이상이다.
일부 실시 형태에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형으로부터 유래된 캡시드를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, rAAV 입자는 이온 교환 크로마토그래피 매질에 결합할 수 있는 조작된 캡시드로부터 유래된 캡시드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, Rh8, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, LK03, RHM4-1, DJ, DJ8, NP59, Anc-80 및 이들의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된 AAV로부터 유래되며, 문헌 [Pulicherla et al., Mol. Ther., 19(6) 1070-1078 (2011)](특히 AAV9.47을 포함하는 AAV9 변이체를 기재함), 미국 특허 번호 7,906,111호(특히 AAV9(hu14) 기재함), 10,532,111호(특히 NP59를 기재함), 10,738,087호(특히 Anc-80을 기재함), 9,169,299호("LK03"을 기재함), 9,840,719호("RHM4-1"을 기재함), 7,749,492호, 7,588,772호("DJ" 및 "DJ8"을 기재함), 9,587,282호 및 특허 출원 WO2012/145601호, WO2013/158879호, WO2015/013313호, WO2018/156654호, US2013/0059732호에 설명된 AAV 캡시드의 변이체를 포함하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명의 하나 이상의 실시 형태의 세부 사항은 하기의 설명에서 설명된다. 다른 특징들과 이점들은 하기의 상세한 설명과 첨부된 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도면의 여러 도에 대한 간략한 설명
본 발명의 하기의 상세한 설명 뿐만 아니라 전술한 요약은 첨부된 도면과 함께 읽을 경우, 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타낸 정확한 실시 형태에 한정되지 않는다는 것을 이해해야만 한다.
도 1a-도 1c는 3개의 다른 pH 값에서 Poros 50 HQ 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리를 나타낸다: pH 8.0(도 1a), pH 8.6(도 1b) 및 pH 9.25(도 1c).
도 2a-도 2d는 다른 완충액으로 다른 pH 값에서 Poros 50 D 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리를 나타낸다: pH 8.6 및 50 mM 트리스(도 2a), pH 8.6 및 25 mM 트리스(도 2b), pH 8.0 및 25 mM 트리스(도 2c), 및 pH 9.25 및 25 mM 트리스(도 1d).
도 3a-도 3e는 다른 결합 강도로 다른 pH 값에서 Poros 50 PI 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리를 나타낸다: NaCl이 없는 pH 8.0(도 3a), NaCl이 없는 pH 8.6(도 3b), pH 8.6 및 30 mM NaCl(도 3c), NaCl이 없는 pH 9.2(도 4c), 및 pH 9.2 및 30 mM NaCl(도 3e).
도 4a-도 4c는 다른 완충액으로 다른 pH 값에서 Capto ImpRes Q 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리를 나타낸다: pH 8.0 및 NaCl이 없는 50 mM 트리스(도 4a), pH 8.6 및 NaCl이 없는 25 mM 트리스(도 4b), 및 pH 9.0 및 NaCl이 없는 25 mM 트리스(도 4c).
도 5는 Poros XQ 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리가 pH 8 및 pH 9.25과 비교하여 pH 8.75에서 가장 우수하다는 것을 나타낸다.
도 6은 Poros XQ 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리에 대한 결합 염의 효과(1.6, 5 및 6.8 mS/cm)를 나타낸다.
도 7은 Poros XQ 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리에 대한 유속의 영향을 나타낸다.
도 8a는 낮은 로딩을 갖는 샘플의 HPLC 분석을 나타내고, 도 8b는 파과(breakthrough) 로딩을 갖는 샘플의 HPLC 분석을 나타낸다.
도 9a-도 9d는 파과 조건 하에서 염과의 결합 강도의 효과를 나타낸다: 45 mM NaCl (도 9a), 60 mM NaCl (도 9b), 75 mM NaCl (도 9c), 및 90 mM NaCl (도 9d).
도 10a-도 10d는 염과의 다른 결합 강도에 대한 단계 용리를 나타낸다: 60 mM NaCl (도 10a), 75 mM NaCl (도 10b), 90 mM NaCl (도 10c), 및 120 mM NaCl (도 10d).
도 11a-도 11b는 60mM NaCl을 포함하는 50mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상의 로딩된 샘플을 나타낸다. 선형 구배를 사용하여 300mM NaCl 50mM 트리스 pH 8.5 완충액으로 용리를 수행했다. 더 많은 샘플을 도 11a 보다 도 11b의 컬럼 상에 로딩하였다. 이 도들은 치환 크로마토그래피가 비-전체 입자로부터 전체 rAAV 입자를 분리시키는 것을 나타낸다. 도 11b는 더 많은 샘플이 로드될 경우 치환이 더 두드러져, ＞90% 수율로 산물의 순도를 거의 100%까지 증가시킨다.
도 12는 10 mM MgCl2를 포함하는 50mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상의 로딩된 샘플을 나타낸다. 300mM NaCl 50mM 트리스 pH 8.5 완충액으로 용리를 수행했다. 도 12는 10 mM의 고농도에서 로드 샘플에서 MgCl2를 사용하면 로딩 동안 비-전체 입자를 제거한다는 것을 나타낸다.
도 13은 2.5 mM CaCl2를 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상의 로딩된 샘플을 나타낸다. 300 mM NaCl 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액으로 용리를 수행했다. 도 13은 로딩 동안에 CaCl2의 첨가가 로딩 동안에 비-전체 입자를 제거한다는 것을 나타낸다. 도 12의 공정과 비교하여, 이 공정은 전체 입자와 비-전체 입자 사이의 전도도 차이가 더 크기 때문에(＞ 4 mS/cm) 이 공정이 더욱 강력하다.
도 14a-도 14b는 1 내지 1.5 mM CaCl2 + 2.5 mM MgCl2 + 20 mM NaCl을 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상의 로딩된 샘플을 나타낸다. 10 mM CaCl2, 2.5 mM MgCl2 20 mM NaCl 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액을 사용하여 용리를 수행했다. 이 도면들은 CaCl2 농도에 대한 강력함을 나타낸다. 도 14a는 1.5 mM CaCl2를 로딩한 반면, 도 14b는 1 mM CaCl2를 로딩하였다. 이 공정은 CaCl2 농도가 50% 변화하고 다른 첨가제가 존재하는 경우에도 전체 입자 손실 없이 비-전체 입자를 100% 제거하였다. CaCl2 구배를 사용한 용리 시에, 전체 입자는 5 mM의 CaCl2가 적용될 때까지 용리되지 않았으며, 이것은 비-전체 수집물과 전체 수집물 사이에 4 mM CaCl2의 강력한 차이를 나타낸다. 도 14c-도 14d는 도 14b와 동일한 조건을 나타내지만, 도 14d에 도시된 약물 물질에 대한 분석 초-원심분리(AUC) 분석을 사용하였다.
도 15는 50 mM 트리스 pH 8.5 중의 PXQ 수지에 로딩된 샘플에 대한 크로마토그램을 나타낸다. 컬럼을 1 mM CaCl2 + 2.5 mM MgCl2를 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액으로 세척했다. 이 도면은 CaCl2가 샘플 로드에 첨가되지 않은 경우, 비-전체 입자로부터 전체 입자의 정제에서 수율과 순도가 양자 모두 손상되었음을 나타낸다. 또한, 세척을 통해 컬럼에 결합된 비-전체 입자를 모두 제거하기가 어려웠다. 또한, CaCl2 농도가 증가된 후속적인 용리에서 결합된 비-전체 입자는 수지 상에서 안정하지 않았고, 새로운 불순물을 생성하여, 차례로 최종 순도를 손상시켰다.
도 16은 비-전체 입자로부터 전체 rAAV 입자의 분리를 위한 순환 치환 크로마토그래피의 구현 방식을 나타낸다.
도 17은 58 mM LiCl을 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상에 로딩된 샘플에 대한 크로마토그램을 나타낸다. 컬럼을 50 mM 트리스 pH 8.5 + 120 mM LiCl 완충액으로 용리하였다. 이 조건에서 비-전체 용리와 전체 용리의 전도도 차이는 0.2 mS/cm이었다.
도 18은 적어도 로딩 완충액, 바람직하게는 세척 및 용리 완충액 중의 첨가제를 사용하여 비-전체 입자로부터 전체 rAAV 입자를 분리하기 위한 순환 치환 크로마토그래피의 구현 방식을 나타낸다.
도 19a-도 19b는 샘플 로딩 동안 비-전체 입자를 제거하고, 구배 또는 단계 용리로 pH가 감소하면서 전체 입자를 회수하는 것을 나타낸다. 로딩 샘플 완충액은 pH 8.5에서 50 mM 트리스, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 20 mM NaCl이다. 20mM 비스 트리스-30mM 아세테이트, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 pH 6.0를 사용하여 pH 구배가 감소하는 용리를 도 19a에 나타냈다. 20 mM 비스 트리스-30 mM 아세테이트, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 pH 7.0 및 pH 6.0을 사용한 pH 단계의 용리를 도 19b에 나타냈다.
도 20a-도 20b는 샘플 로드 내로 (NH4)2SO4를 첨가하는 것이 로딩 동안에 비-전체 입자의 통과를 일으키는 것을 나타낸다(도 20b). 샘플을 0.0002% 폴록사머 188, 20mM NaCl, 20 mM (NH4)2SO4 및 2.0 mM MgCl2가 포함된 100 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상에 로딩하였다. 용리 완충액은 0.0002% 폴록사머 188 및 300mM NaCl이 포함된 50mM 트리스 pH 8.5 완충액이다. (NH4)2SO4가 없는 경우(삽입 그림 참조), 7 mS/cm의 동일한 완충액 전도도에서 샘플을 로딩하는 동안 비-전체 입자는 제거되지 않았다(도 20a).
도 21은 샘플 로드 내로 (NH4)2SO4를 첨가하는 경우, 모놀리식 컬럼에 샘플을 로딩하는 동안 비-전체 입자의 통과를 일으키는 것을 나타낸다. 샘플은 0.0002% 폴록사머 188, 20mM NaCl, 20 mM (NH4)2SO4 및 2.0 mM MgCl2을 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 BIA 1.3 μm 모놀리식 컬럼 상에 로딩하였다. 용리 완충액은 0.0002% 폴록사머 188 및 200 mM NaCl를 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액이다.
도 22a-도 22b는 샘플 로드 내로 CuCl2를 첨가하는 경우, 샘플 로딩 동안 비-전체 입자의 통과를 일으키는 것을 나타낸다. 샘플은 0.0002% 폴록사머 188, 20 mM NaCl, 15 mM (NH4)2SO4 및 2.0 mM MgCl2 및 1.5 mM CuCl2를 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 컬럼 상에 로딩하였다. 용리 완충액은 0.0002% 폴록사머 188 및 2 mM MgCl2를 포함하는 180 mM 인산나트륨 pH 7.2 완충액이다. 도 22c-도 22e는 샘플 로드 내로 CuCl2를 첨가하는 경우 분석 규모에서 비-전체(가장 왼쪽 피크) 입자와 전체(왼쪽에서 두번째 피크) 입자 사이의 분해능이 증가한다는 것을 나타낸다. 또한, CuCl2를 첨가하는 경우, 일부 산물의 변이체가 크게 감소하는 것을 유발한다(두번째 피크 이후의 피크들). 이것은 로딩 중에 CuCl2를 첨가하는 경우 로딩 중에 비-전체 입자가 제거된다는 것을 나타낸다. 도 22f는 Cu(II)가 다른 이온 중에서 비-전체 피크와 전체 피크들 사이에서 분해능을 가장 높게 증가시킨다는 것을 나타낸다. 샘플은 50 mM 트리스 pH 8.5 중에 있으며 0.5-2 mM의 특정 이온들이 포함되어 있다.
도 23a-도 23e는 CuCl2 비-전체 입자의 첨가는 로딩 중에 제거될 수 있고, 부분 입자와 전체 입자 사이에서 일부 분해능이 달성될 수 있음을 나타낸다. rAAV 제제를 0.0002% 폴록사머 188, 20mM NaCl, 15 mM NH4SO4, 2.0 mM MgCl2 및 1.5 mM CuCl2가 포함된 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상에 로딩하였다. 결합된 입자를 0.0002% 폴록사머 188 및 2종의 다른 양의 NaCl을 포함하는 50 mM 아세트산나트륨 pH 6.0 완충액을 사용하여 단계적으로 용리하였다. 용리 피크 1은 50mM NaCl로 수득되고, 용리 피크 2는 200mM NaCl로 수득된다(도 23a-도 23b). 도 23c-도 23e는 분석용 초-원심분리기를 사용한 용출액 피크의 침강 계수 분포를 나타낸다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 피크 1에는 부분 입자(40.1%)와 전체 입자(49.3%)가 양자 모두 포함되어 있는 반면, 피크 2에는 주로 전체 입자(69.8%)가 풍부화되었고, 부분 입자 비율(15.5%)이 더 낮았고, 비-전체 입자(15.5%)가 제거되었다.
표 1. 침강 계수 분포
도 24a-도 24g는 rAAV 입자 변이체의 풍부화를 위한 3-컬럼 치환 크로마토그래피 방법의 사용을 나타낸다. rAAV 제제는 직렬로 연결된 3개의 PXQ 컬럼 상에 로드되었다. 로딩 완충액은 50 mM 트리스 pH 8.5, 75 mM NaCl 및 2 mM MgCl2이다. 3개의 컬럼을 0.0002% 폴록사머 188 및 2 mM MgCl2를 포함하는 200 mM NaCl 50 mM 트리스 완충액 pH 8.5를 사용하여 순차적으로 용리하였다(분취 크로마토그램에 대한 도 24a-도 24b). 수집된 분획은 IEX 컬럼 상에서 UPLC를 사용하여 분석되었다. 도 24c-도 24d에서 나타낸 바와 같이, 빈 입자는 컬럼을 통해 흐르고, 대부분의 빈 입자는 로딩 중에 제거되었다. 또한, 분석 IEX 크로마토그램은 제1 컬럼이 가장 강한 결합 입자(가장 높은 머무름 시간; 도 24e)로 풍부화되어 있는 반면, 제2 컬럼 및 제3 컬럼은 각각 두번째로 강한 결합 입자와 가장 약한 결합 입자로 풍부화되어 있음을 나타낸다(도 24f-도 24g). 제1 컬럼 및 제2 컬럼 용리는 풍부화된 전체 입자를 갖는다. 이것은 3개 컬럼 셋업에서 다른 입자 변이체를 풍부화시키기 위한 치환 크로마토그래피의 사용을 나타낸다.
도 25a-도 25b는 전체 입자의 풍부화를 위한 2-컬럼 치환 크로마토그래피 방법의 사용을 나타낸다. rAAV 제제는 직렬로 연결된 2개의 PXQ 컬럼 상에 로드되었다. 로딩 완충액은 50 mM 트리스 pH 8.5, 10 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2 및 1 mM CaCl2이다. 용리는 50 mM 트리스 pH 8.5, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2 및 0.0002% 폴록사머 188를 포함하는 컬럼 1과 컬럼 2로부터 순차적으로 수행되었다(분취 크로마토그램에 대한 도 25a-도 25b). 수집된 분획을 UPLC를 사용하여 분석하였다. 도 25c에 나타낸 바와 같이, 로딩 중에 빈 입자가 흘러 나왔다. rAAV 제제 중의 불순물은 전체 입자 보다 더 높은 친화도로 PXQ 수지에 결합되었다. 결과적으로, 이러한 불순물은 컬럼 2 상에 로드된 제제에서 감소했으며, 전체 입자는 컬럼 2에 결합에 대해 가장 큰 친화도를 갖는 종이었다. 용리 시에, 컬럼 2 용출액은 전체 입자가 더 풍부화되었다. 따라서, 컬럼 2 용리 피크는 도 25d(UPLC 분석)에 나타낸 바와 같이 컬럼 1 보다 전체 입자의 더 양호한 풍부화를 나타낸다.
도 26a-도 26d는 부분 입자 및 전체 입자의 풍부화를 위한 3-컬럼 치환 크로마토그래피 방법의 사용을 나타낸다. rAAV 제제는 직렬로 연결된 3개의 PXQ 컬럼 상에 로드되었다. 로딩 완충액은 50 mM 트리스 pH 8.5, 20 mM NaCl, 15 mM 황산암모늄, 2 mM MgCl2 및 1.5 mM CuCl2이다. 용리는 50 mM 트리스 pH 8.5, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2 및 0.0002% 폴록사머 188를 포함하는 컬럼 1, 2 및 3으로부터 순차적으로 수행되었다(분취 크로마토그램에 대한 도 26a-도 26b). 도 26c-도 26d는 분석 이온 교환 크로마토그래피 및 분석 초-원심분리(AUC)에 의한 통과액 및 용출액의 특징을 나타낸다. 로딩 중에 빈 입자가 흘러 나왔다(도 26c). 컬럼 1로부터의 1차 용출액 피크는 전체 입자를 풍부화되게 하였고, 컬럼 3으로부터의 1차 용출액 피크는 부분 입자를 풍부화되게 한 반면, 컬럼 2는 부분 입자와 전체 입자를 양자 모두 포함하였다(도 26d).
본 발명의 하기의 상세한 설명 뿐만 아니라 전술한 요약은 첨부된 도면과 함께 읽을 경우, 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타낸 정확한 실시 형태에 한정되지 않는다는 것을 이해해야만 한다.
도 1a-도 1c는 3개의 다른 pH 값에서 Poros 50 HQ 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리를 나타낸다: pH 8.0(도 1a), pH 8.6(도 1b) 및 pH 9.25(도 1c).
도 2a-도 2d는 다른 완충액으로 다른 pH 값에서 Poros 50 D 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리를 나타낸다: pH 8.6 및 50 mM 트리스(도 2a), pH 8.6 및 25 mM 트리스(도 2b), pH 8.0 및 25 mM 트리스(도 2c), 및 pH 9.25 및 25 mM 트리스(도 1d).
도 3a-도 3e는 다른 결합 강도로 다른 pH 값에서 Poros 50 PI 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리를 나타낸다: NaCl이 없는 pH 8.0(도 3a), NaCl이 없는 pH 8.6(도 3b), pH 8.6 및 30 mM NaCl(도 3c), NaCl이 없는 pH 9.2(도 4c), 및 pH 9.2 및 30 mM NaCl(도 3e).
도 4a-도 4c는 다른 완충액으로 다른 pH 값에서 Capto ImpRes Q 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리를 나타낸다: pH 8.0 및 NaCl이 없는 50 mM 트리스(도 4a), pH 8.6 및 NaCl이 없는 25 mM 트리스(도 4b), 및 pH 9.0 및 NaCl이 없는 25 mM 트리스(도 4c).
도 5는 Poros XQ 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리가 pH 8 및 pH 9.25과 비교하여 pH 8.75에서 가장 우수하다는 것을 나타낸다.
도 6은 Poros XQ 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리에 대한 결합 염의 효과(1.6, 5 및 6.8 mS/cm)를 나타낸다.
도 7은 Poros XQ 수지 상의 전체 rAAV 입자와 비-전체 입자의 분리에 대한 유속의 영향을 나타낸다.
도 8a는 낮은 로딩을 갖는 샘플의 HPLC 분석을 나타내고, 도 8b는 파과(breakthrough) 로딩을 갖는 샘플의 HPLC 분석을 나타낸다.
도 9a-도 9d는 파과 조건 하에서 염과의 결합 강도의 효과를 나타낸다: 45 mM NaCl (도 9a), 60 mM NaCl (도 9b), 75 mM NaCl (도 9c), 및 90 mM NaCl (도 9d).
도 10a-도 10d는 염과의 다른 결합 강도에 대한 단계 용리를 나타낸다: 60 mM NaCl (도 10a), 75 mM NaCl (도 10b), 90 mM NaCl (도 10c), 및 120 mM NaCl (도 10d).
도 11a-도 11b는 60mM NaCl을 포함하는 50mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상의 로딩된 샘플을 나타낸다. 선형 구배를 사용하여 300mM NaCl 50mM 트리스 pH 8.5 완충액으로 용리를 수행했다. 더 많은 샘플을 도 11a 보다 도 11b의 컬럼 상에 로딩하였다. 이 도들은 치환 크로마토그래피가 비-전체 입자로부터 전체 rAAV 입자를 분리시키는 것을 나타낸다. 도 11b는 더 많은 샘플이 로드될 경우 치환이 더 두드러져, ＞90% 수율로 산물의 순도를 거의 100%까지 증가시킨다.
도 12는 10 mM MgCl2를 포함하는 50mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상의 로딩된 샘플을 나타낸다. 300mM NaCl 50mM 트리스 pH 8.5 완충액으로 용리를 수행했다. 도 12는 10 mM의 고농도에서 로드 샘플에서 MgCl2를 사용하면 로딩 동안 비-전체 입자를 제거한다는 것을 나타낸다.
도 13은 2.5 mM CaCl2를 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상의 로딩된 샘플을 나타낸다. 300 mM NaCl 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액으로 용리를 수행했다. 도 13은 로딩 동안에 CaCl2의 첨가가 로딩 동안에 비-전체 입자를 제거한다는 것을 나타낸다. 도 12의 공정과 비교하여, 이 공정은 전체 입자와 비-전체 입자 사이의 전도도 차이가 더 크기 때문에(＞ 4 mS/cm) 이 공정이 더욱 강력하다.
도 14a-도 14b는 1 내지 1.5 mM CaCl2 + 2.5 mM MgCl2 + 20 mM NaCl을 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상의 로딩된 샘플을 나타낸다. 10 mM CaCl2, 2.5 mM MgCl2 20 mM NaCl 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액을 사용하여 용리를 수행했다. 이 도면들은 CaCl2 농도에 대한 강력함을 나타낸다. 도 14a는 1.5 mM CaCl2를 로딩한 반면, 도 14b는 1 mM CaCl2를 로딩하였다. 이 공정은 CaCl2 농도가 50% 변화하고 다른 첨가제가 존재하는 경우에도 전체 입자 손실 없이 비-전체 입자를 100% 제거하였다. CaCl2 구배를 사용한 용리 시에, 전체 입자는 5 mM의 CaCl2가 적용될 때까지 용리되지 않았으며, 이것은 비-전체 수집물과 전체 수집물 사이에 4 mM CaCl2의 강력한 차이를 나타낸다. 도 14c-도 14d는 도 14b와 동일한 조건을 나타내지만, 도 14d에 도시된 약물 물질에 대한 분석 초-원심분리(AUC) 분석을 사용하였다.
도 15는 50 mM 트리스 pH 8.5 중의 PXQ 수지에 로딩된 샘플에 대한 크로마토그램을 나타낸다. 컬럼을 1 mM CaCl2 + 2.5 mM MgCl2를 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액으로 세척했다. 이 도면은 CaCl2가 샘플 로드에 첨가되지 않은 경우, 비-전체 입자로부터 전체 입자의 정제에서 수율과 순도가 양자 모두 손상되었음을 나타낸다. 또한, 세척을 통해 컬럼에 결합된 비-전체 입자를 모두 제거하기가 어려웠다. 또한, CaCl2 농도가 증가된 후속적인 용리에서 결합된 비-전체 입자는 수지 상에서 안정하지 않았고, 새로운 불순물을 생성하여, 차례로 최종 순도를 손상시켰다.
도 16은 비-전체 입자로부터 전체 rAAV 입자의 분리를 위한 순환 치환 크로마토그래피의 구현 방식을 나타낸다.
도 17은 58 mM LiCl을 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상에 로딩된 샘플에 대한 크로마토그램을 나타낸다. 컬럼을 50 mM 트리스 pH 8.5 + 120 mM LiCl 완충액으로 용리하였다. 이 조건에서 비-전체 용리와 전체 용리의 전도도 차이는 0.2 mS/cm이었다.
도 18은 적어도 로딩 완충액, 바람직하게는 세척 및 용리 완충액 중의 첨가제를 사용하여 비-전체 입자로부터 전체 rAAV 입자를 분리하기 위한 순환 치환 크로마토그래피의 구현 방식을 나타낸다.
도 19a-도 19b는 샘플 로딩 동안 비-전체 입자를 제거하고, 구배 또는 단계 용리로 pH가 감소하면서 전체 입자를 회수하는 것을 나타낸다. 로딩 샘플 완충액은 pH 8.5에서 50 mM 트리스, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 20 mM NaCl이다. 20mM 비스 트리스-30mM 아세테이트, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 pH 6.0를 사용하여 pH 구배가 감소하는 용리를 도 19a에 나타냈다. 20 mM 비스 트리스-30 mM 아세테이트, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 pH 7.0 및 pH 6.0을 사용한 pH 단계의 용리를 도 19b에 나타냈다.
도 20a-도 20b는 샘플 로드 내로 (NH4)2SO4를 첨가하는 것이 로딩 동안에 비-전체 입자의 통과를 일으키는 것을 나타낸다(도 20b). 샘플을 0.0002% 폴록사머 188, 20mM NaCl, 20 mM (NH4)2SO4 및 2.0 mM MgCl2가 포함된 100 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상에 로딩하였다. 용리 완충액은 0.0002% 폴록사머 188 및 300mM NaCl이 포함된 50mM 트리스 pH 8.5 완충액이다. (NH4)2SO4가 없는 경우(삽입 그림 참조), 7 mS/cm의 동일한 완충액 전도도에서 샘플을 로딩하는 동안 비-전체 입자는 제거되지 않았다(도 20a).
도 21은 샘플 로드 내로 (NH4)2SO4를 첨가하는 경우, 모놀리식 컬럼에 샘플을 로딩하는 동안 비-전체 입자의 통과를 일으키는 것을 나타낸다. 샘플은 0.0002% 폴록사머 188, 20mM NaCl, 20 mM (NH4)2SO4 및 2.0 mM MgCl2을 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 BIA 1.3 μm 모놀리식 컬럼 상에 로딩하였다. 용리 완충액은 0.0002% 폴록사머 188 및 200 mM NaCl를 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액이다.
도 22a-도 22b는 샘플 로드 내로 CuCl2를 첨가하는 경우, 샘플 로딩 동안 비-전체 입자의 통과를 일으키는 것을 나타낸다. 샘플은 0.0002% 폴록사머 188, 20 mM NaCl, 15 mM (NH4)2SO4 및 2.0 mM MgCl2 및 1.5 mM CuCl2를 포함하는 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 컬럼 상에 로딩하였다. 용리 완충액은 0.0002% 폴록사머 188 및 2 mM MgCl2를 포함하는 180 mM 인산나트륨 pH 7.2 완충액이다. 도 22c-도 22e는 샘플 로드 내로 CuCl2를 첨가하는 경우 분석 규모에서 비-전체(가장 왼쪽 피크) 입자와 전체(왼쪽에서 두번째 피크) 입자 사이의 분해능이 증가한다는 것을 나타낸다. 또한, CuCl2를 첨가하는 경우, 일부 산물의 변이체가 크게 감소하는 것을 유발한다(두번째 피크 이후의 피크들). 이것은 로딩 중에 CuCl2를 첨가하는 경우 로딩 중에 비-전체 입자가 제거된다는 것을 나타낸다. 도 22f는 Cu(II)가 다른 이온 중에서 비-전체 피크와 전체 피크들 사이에서 분해능을 가장 높게 증가시킨다는 것을 나타낸다. 샘플은 50 mM 트리스 pH 8.5 중에 있으며 0.5-2 mM의 특정 이온들이 포함되어 있다.
도 23a-도 23e는 CuCl2 비-전체 입자의 첨가는 로딩 중에 제거될 수 있고, 부분 입자와 전체 입자 사이에서 일부 분해능이 달성될 수 있음을 나타낸다. rAAV 제제를 0.0002% 폴록사머 188, 20mM NaCl, 15 mM NH4SO4, 2.0 mM MgCl2 및 1.5 mM CuCl2가 포함된 50 mM 트리스 pH 8.5 완충액 중의 PXQ 수지 상에 로딩하였다. 결합된 입자를 0.0002% 폴록사머 188 및 2종의 다른 양의 NaCl을 포함하는 50 mM 아세트산나트륨 pH 6.0 완충액을 사용하여 단계적으로 용리하였다. 용리 피크 1은 50mM NaCl로 수득되고, 용리 피크 2는 200mM NaCl로 수득된다(도 23a-도 23b). 도 23c-도 23e는 분석용 초-원심분리기를 사용한 용출액 피크의 침강 계수 분포를 나타낸다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 피크 1에는 부분 입자(40.1%)와 전체 입자(49.3%)가 양자 모두 포함되어 있는 반면, 피크 2에는 주로 전체 입자(69.8%)가 풍부화되었고, 부분 입자 비율(15.5%)이 더 낮았고, 비-전체 입자(15.5%)가 제거되었다.
표 1. 침강 계수 분포
도 24a-도 24g는 rAAV 입자 변이체의 풍부화를 위한 3-컬럼 치환 크로마토그래피 방법의 사용을 나타낸다. rAAV 제제는 직렬로 연결된 3개의 PXQ 컬럼 상에 로드되었다. 로딩 완충액은 50 mM 트리스 pH 8.5, 75 mM NaCl 및 2 mM MgCl2이다. 3개의 컬럼을 0.0002% 폴록사머 188 및 2 mM MgCl2를 포함하는 200 mM NaCl 50 mM 트리스 완충액 pH 8.5를 사용하여 순차적으로 용리하였다(분취 크로마토그램에 대한 도 24a-도 24b). 수집된 분획은 IEX 컬럼 상에서 UPLC를 사용하여 분석되었다. 도 24c-도 24d에서 나타낸 바와 같이, 빈 입자는 컬럼을 통해 흐르고, 대부분의 빈 입자는 로딩 중에 제거되었다. 또한, 분석 IEX 크로마토그램은 제1 컬럼이 가장 강한 결합 입자(가장 높은 머무름 시간; 도 24e)로 풍부화되어 있는 반면, 제2 컬럼 및 제3 컬럼은 각각 두번째로 강한 결합 입자와 가장 약한 결합 입자로 풍부화되어 있음을 나타낸다(도 24f-도 24g). 제1 컬럼 및 제2 컬럼 용리는 풍부화된 전체 입자를 갖는다. 이것은 3개 컬럼 셋업에서 다른 입자 변이체를 풍부화시키기 위한 치환 크로마토그래피의 사용을 나타낸다.
도 25a-도 25b는 전체 입자의 풍부화를 위한 2-컬럼 치환 크로마토그래피 방법의 사용을 나타낸다. rAAV 제제는 직렬로 연결된 2개의 PXQ 컬럼 상에 로드되었다. 로딩 완충액은 50 mM 트리스 pH 8.5, 10 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2 및 1 mM CaCl2이다. 용리는 50 mM 트리스 pH 8.5, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2 및 0.0002% 폴록사머 188를 포함하는 컬럼 1과 컬럼 2로부터 순차적으로 수행되었다(분취 크로마토그램에 대한 도 25a-도 25b). 수집된 분획을 UPLC를 사용하여 분석하였다. 도 25c에 나타낸 바와 같이, 로딩 중에 빈 입자가 흘러 나왔다. rAAV 제제 중의 불순물은 전체 입자 보다 더 높은 친화도로 PXQ 수지에 결합되었다. 결과적으로, 이러한 불순물은 컬럼 2 상에 로드된 제제에서 감소했으며, 전체 입자는 컬럼 2에 결합에 대해 가장 큰 친화도를 갖는 종이었다. 용리 시에, 컬럼 2 용출액은 전체 입자가 더 풍부화되었다. 따라서, 컬럼 2 용리 피크는 도 25d(UPLC 분석)에 나타낸 바와 같이 컬럼 1 보다 전체 입자의 더 양호한 풍부화를 나타낸다.
도 26a-도 26d는 부분 입자 및 전체 입자의 풍부화를 위한 3-컬럼 치환 크로마토그래피 방법의 사용을 나타낸다. rAAV 제제는 직렬로 연결된 3개의 PXQ 컬럼 상에 로드되었다. 로딩 완충액은 50 mM 트리스 pH 8.5, 20 mM NaCl, 15 mM 황산암모늄, 2 mM MgCl2 및 1.5 mM CuCl2이다. 용리는 50 mM 트리스 pH 8.5, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2 및 0.0002% 폴록사머 188를 포함하는 컬럼 1, 2 및 3으로부터 순차적으로 수행되었다(분취 크로마토그램에 대한 도 26a-도 26b). 도 26c-도 26d는 분석 이온 교환 크로마토그래피 및 분석 초-원심분리(AUC)에 의한 통과액 및 용출액의 특징을 나타낸다. 로딩 중에 빈 입자가 흘러 나왔다(도 26c). 컬럼 1로부터의 1차 용출액 피크는 전체 입자를 풍부화되게 하였고, 컬럼 3으로부터의 1차 용출액 피크는 부분 입자를 풍부화되게 한 반면, 컬럼 2는 부분 입자와 전체 입자를 양자 모두 포함하였다(도 26d).
발명의 상세한 설명
다양한 간행물, 기사 및 특허가 배경 기술 및 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되거나 기재되었다. 이들 참고문헌 각각은 그의 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다. 본 명세서에 포함된 문서, 행위, 물질, 장치, 물품 등에 대한 논의는 본 발명에 대한 맥락을 제공하기 위한 목적이다. 이러한 논의는 이들 사항 중 일부 또는 전부가 개시되거나 청구된 임의의 발명에 관하여 선행 기술의 일부를 구성한다는 것을 인정하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본원에서 사용된 특정 용어는 본 명세서에 설명된 의미를 갖는다. 본원에서 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 간행물은 본원에서 완전히 설명된 것처럼 참조로서 포함된다. 본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같은, 단수 형태 "a," "an," 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 언급을 포함한다는 점을 유의해야 한다.
문맥상 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 후속되는 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "∼들을 포함하다(comprise)"와 "∼을 포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 명시된 정수(integer) 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하나, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제를 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는(containing)" 또는 "포함하는(including)"으로 치환될 수 있거나, 때때로 본원에서 사용되는 경우 용어 "갖는"으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 경우, "구성되는"은 청구 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 본원에서 사용되는 경우, "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 본 출원의 측면 또는 실시 형태의 맥락에서 본원에서 사용될 때마다 "포함하는", "함유하는", "포함하는" 및 "갖는"의 임의의 상기 언급된 용어들은 본 발명의 개시의 범위를 변경하기 위해 용어 "구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는"으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 숫자와 함께 사용되는 경우, 용어 "약"은 ±10% 이내의 임의의 숫자, 예를 들어 참조 수치의 ±5%, 또는 ±1%를 지칭한다. 예를 들어, 약 pH 5.0은 4.5-5.5 범위의 임의의 pH를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 다수의 언급된 요소 사이의 결합 용어 "및/또는"은 개별 및 조합된 옵션을 양자 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 요소가 "및/또는"에 의해 결합되는 경우, 첫번째 옵션은 두번째 요소가 없는 첫번째 요소의 적용가능성을 나타낸다. 두번째 옵션은 첫번째 요소가 없는 두번째 요소의 적용가능성을 나타낸다. 세번째 옵션은 첫번째 및 두번째 요소 모두의 적용가능성을 나타낸다. 이들 옵션 중 임의의 하나가 상기 의미에 해당하는 것으로 이해되며, 따라서 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"의 요구사항을 충족한다. 하나 초과의 옵션의 동시 적용가능성이 또한 상기 의미에 해당하는 것으로 이해되며, 따라서 용어 "및/또는"의 요구사항을 충족한다.
용어 "벡터"는 핵산 분자의 임의의 소형 담체, 예컨대, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드(cosmid), 염색체, 바이러스, 비리온 또는 핵산의 삽입 또는 혼입에 의해 조작될 수 있는 비히클을 지칭한다. 벡터는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입/전달하고, 삽입된 폴리뉴클레오티드를 세포에서 전사 또는 번역하기 위해, 유전자 조작(즉, "클로닝 벡터")에 사용될 수 있다. "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현에 필요한 조절 영역을 갖는 유전자 또는 핵산 서열을 함유하는 벡터이다. 벡터 핵산 서열은 일반적으로 적어도 세포에서 증식을 위한 복제 기점 및 선택적으로 추가 요소, 예컨대, 이종성 핵산 서열, 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 인트론, 역전된 말단 반복부(ITR), 임의의 선택 가능한 마커, 폴리아데닐화 신호를 함유한다.
용어 "아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터" 또는 "AAV 벡터"는 AAV 혈청형, 예컨대 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, Rh8, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, LK03, RHM4-1, DJ, DJ8, NP59, Anc-80 및 이들의 변이체를 포함하나 이에 한정되지 않는 아데노-관련 바이러스 혈청형으로부터 유래된 벡터를 의미하여, 문헌 [Pulicherla et al., Mol. Ther., 19(6) 1070-1078 (2011)](특히 AAV9.47을 포함하는 AAV9 변이체를 기재함), 미국 특허 번호 7,906,111호(특히 AAV9(hu14) 기재함), 10,532,111호(특히 NP59를 기재함), 10,738,087호(특히 Anc-80을 기재함), 9,169,299호("LK03"을 기재함), 9,840,719호("RHM4-1"을 기재함), 7,749,492호, 7,588,772호("DJ" 및 "DJ8"을 기재함), 9,587,282호 및 특허 출원 WO2012/145601호, WO2013/158879호, WO2015/013313호, WO2018/156654호, US2013/0059732호에 설명된 AAV 캡시드의 변이체를 포함하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다. 또한, AAV 벡터에는 조직 친화성, 안정성 및 형질도입 효율을 위해 조작된 AAV가 포함된다. AAV 벡터는 전체 또는 부분적으로 결실된 하나 이상의 AAV 야생형 유전자, 바람직하게는 복제(rep) 및 캡시드(cap) 유전자를 가질 수 있지만, 기능적 측접 ITR 서열을 보유한다. AAV 비리온의 구조, 복제 및 패키징에는 기능적 ITR 서열이 필요하다. 따라서, AAV 벡터는 적어도 바이러스의 복제 및 패키징(예를 들어, 기능적 ITR)을 위해 필요한 서열을 시스로(in cis) 포함하도록 본원에서 정의된다. ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열일 필요는 없으며, 서열이 기능적 구조, 복제 및 패키징을 제공하는 한, 예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다.
용어 "AAV 비리온"은 AAV 캡시드 단백질 코트와 관련된 선형의, 싱글-스트랜드 핵산 유전체를 포함하는 야생형(wt) AAV 바이러스 입자와 같은 바이러스 입자를 지칭한다.
재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV 벡터)는 아데노-관련 바이러스부터 유래된다. AAV 벡터는 핵산/유전 물질이 세포 내에서 유지될 수 있도록 핵산/유전 물질을 세포 내로 도입할 수 있기 때문에 유전자 치료 벡터로서 유용하다. AAV는 인간의 병원성 질병과 관련되지 않기 때문에, rAAV 벡터는 실질적인 AAV 병인 또는 질환을 유발하지 않고 인간 환자에게 이종성 핵산 서열(예를 들어, 치료용 단백질 및 제제)을 전달할 수 있다.
벡터, 예컨대, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터의 수식어, 뿐만 아니라 재조합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 같은 서열의 수식어로서, 용어 "재조합"은 조성물이 일반적으로 자연에서 발생하지 않는 방식으로 조작(즉, 공학처리)되었음을 의미한다. rAAV 벡터의 예로는 야생형 AAV 유전체에 정상적으로 존재하지 않는 핵산이 바이러스 유전체 내에 삽입된 경우일 것이다. 예를 들어, 치료용 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 핵산(예를 들어, 유전자)이, 유전자가 AAV 유전체 내에 정상적으로 결합되어 있는 5', 3' 및/또는 인트론 영역을 갖거나 갖지 않는 벡터 내로 클로닝되는 경우일 것이다. 용어 "재조합"이 AAV 벡터, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드와 같은 서열과 관련하여 항상 사용되는 것은 아니지만, AAV 벡터를 포함하는 재조합 형태, 폴리뉴클레오티드 등은 임의의 그러한 생략에도 불구하고 명시적으로 포함된다.
rAAV 벡터는 AAV 유전체로부터 야생형 유전체를 제거하기 위해 분자 방법을 사용함에 의해, 그리고 치료용 단백질 또는 관심 있는 핵산 분자를 인코딩하는 핵산과 같은 비-천연(이종성) 핵산으로 치환함에 의해, AAV와 같은 바이러스의 야생형 유전체로부터 유래된다. 전형적으로, AAV의 경우, 하나 또는 둘 모두의 AAV 유전체의 역전된 말단 반복부(ITR) 서열이 rAAV 벡터에서 보유된다. rAAV 유전체는, 예컨대, 치료용 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 이종성 핵산을 갖는 AAV 유전체 핵산에 대해 AAV 유전체의 전부 또는 일부가 비-천연 서열로 치환되었기 때문에 AAV 유전체와 구별된다. 따라서, 비-천연 서열의 혼입은 AAV를 "재조합" AAV 벡터로서 정의하며, 이는 "rAAV 벡터"로서 지칭될 수 있다. 재조합 AAV 벡터 서열은 패키징될 수 있고, 생체 외, 시험관 내 또는 생체 내에서 세포의 후속 감염(형질도입)을 위한 "입자"로서 본원에서 지칭된다.
용어 "재조합 AAV 비리온", "rAAV 비리온", "AAV 벡터 입자", "전체 rAAV 캡시드", "전체 rAAV 입자", "전체 캡시드" 및 "전체 입자"는 본원에 사용된 바와 같이, 각각은 AAV ITR에 의해 한쪽 또는 양쪽에 측접한 관심 있는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 캡슐화하는 AAV 단백질 쉘을 포함하는 감염성 복제 결함 바이러스를 의미한다. 전체 rAAV 입자는 AAV 벡터, AAV 헬퍼 기능 및 부속 기능을 지정하는 서열이 도입된 적합한 숙주 세포에서 생산된다. 이러한 방식으로, 숙주 세포는 후속적인 유전자 전달을 위해 AAV 벡터(관심 있는 재조합 뉴클레오티드 서열 함유)를 감염성 재조합 비리온 입자로 패키징하는데 필요한 AAV 폴리펩티드를 인코딩할 수 있게 된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비-전체 캡시드" 및 "비-전체 입자,"는 각각 AAV 입자 쉘을 포함하지만, AAV ITR에 의해 한쪽 또는 양쪽에 측접한 이종성 핵산 서열을 포함하는 완전한 핵산 분자가 결여된 AAV 입자 또는 비리온을 지칭한다. 이러한 비-전체 입자는 완전한 이종성 핵산 서열을 숙주 세포 또는 유기체 내의 세포로 전달하지 않는다. 이러한 비-전체 입자에는 불완전한 유전 물질의 길이나 양이 다른 변이체가 포함된다. 분석 방법(예를 들어, UPLC 및 AUC)에 의해 유전 물질이 있는 것으로 감지될 만큼 유전 물질이 충분하지 않거나 전혀 없는 비-전체 입자를 "빈" 입자라고 지칭한다. 일부 유전 물질을 갖고 있지만 전체 입자 보다 적은 것으로 분석 방법으로 검출할 수 있을 만큼 충분한 유전 물질을 갖는 비-전체 입자를 "부분" 입자라고 지칭한다. 불완전한 유전 물질은 무손상이거나 단편화되어 있을 수 있다.
전체 입자 대 비-전체 입자, 또는 비-전체 입자 대 전체 입자의 비율을 결정하는 것을 포함하는, 당업계에 알려진 임의의 분석 방법을 사용하여 전체 입자 및 비-전체 입자를 정량화할 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 물리적 역가 계산; A260 및 A280 흡광도; 분석 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어 UPLC); 다각도 광 산란; 분석용 초원심분리(AUC); 극저온 전자 현미경(Cryo-EM); 또는 전하 검출 질량 분석법(CDMS)일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 정량적 평가를 예시하기 위해, 여러가지 다른 방법인 UPLC, A260 및 A280 흡광도 및 AUC가 본 개시에 나와 있다.
벡터 "유전체"는 rAAV 입자를 형성하기 위해 궁극적으로 패키징되거나 캡시드화되는 재조합 서열의 부분을 지칭한다. 재조합 플라스미드가 재조합 AAV 벡터를 작제 또는 제조하는데 사용되는 경우, AAV 벡터 유전체는 재조합 플라스미드의 벡터 유전체 서열에 상응하지 않는 "플라스미드"의 부분을 포함하지 않는다. 재조합 플라스미드의 이러한 비 벡터 유전체 부분은 증식 및 재조합 바이러스 생산에 필요한 과정인 플라스미드의 클로닝 및 증폭에 중요하지만, 자체적으로 rAAV 입자로 패키징되거나 캡시드화되지 않는 "플라스미드 백본"으로 지칭된다. 따라서, 벡터 "유전체"는 rAAV에 의해 패키징되거나 캡시드화된 핵산을 지칭한다.
용어 "AAV 헬퍼 기능"은 AAV 유전자 생성물 및 차례로 증식성 AAV 복제 및 패키징을 위해 트랜스로 기능하는 AAV 벡터를 제공하기 위해 발현될 수 있는 AAV-유래된 코딩 서열(단백질)을 지칭한다. 따라서, AAV 헬퍼 기능은 rep 및 cap을 포함하는 AAV 열린 해독틀(ORF) 및 특정 AAV 혈청형에 대한 조립-활성 단백질(assembly-activating protein: AAP)과 같은 다른 것들을 포함한다. Rep 발현 생성물은 특히 AAV의 DNA 복제의 기점의 인지, 결합 및 니킹(nicking); DNA 헬리카제 활성; 및 AAV(또는 다른 이종성) 프로모터로부터의 전사의 조절을 포함하는 많은 기능을 갖는 것으로 밝혀졌다. Cap 발현 생성물(캡시드)은 필요한 패키징 기능을 제공한다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 벡터 유전체에서 누락된 AAV 기능을 트랜스로 보완하는데 사용된다.
용어 "AAV 헬퍼 작제물"은 일반적으로, 예를 들어, 대상체에 대한 유전자 요법에 의해, 관심 있는 핵산 서열의 전달을 위해 형질도입 AAV 벡터를 생산하는데 사용되는 AAV 벡터로부터 결실된 AAV 기능을 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열을 지칭한다. AAV 헬퍼 작제물은 일반적으로 AAV 벡터 복제에 필요한 누락된 AAV 기능을 보충하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 일시적인 발현을 제공하기 위해 이용된다. 헬퍼 작제물은 일반적으로 AAV ITR이 결여되어 있으며, 자신이 복제되거나 패키징될 수 없다. AAV 헬퍼 작제물은 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스, 또는 비리온의 형태로 존재할 수 있다. 양자 모두의 Rep 및 Cap 발현 생성물을 인코딩하는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45와 같은 다수의 AAV 헬퍼 작제물이 기술되어 있다(예를 들어, 문헌 [Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; 및 McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945)] 참조). Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 인코딩하는 다수의 다른 벡터가 기재되어 있다(예를 들어, U.S. 특허 번호 5,139,941호 및 6,376,237호 참조).
용어 "부속 기능"은 AAV가 복제에 의존성인 비-AAV 유래된 바이러스 및/또는 세포 기능을 지칭한다. 상기 용어는 AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, Cap 발현 생성물의 합성 및 AAV 캡시드 패키징과 관련된 모이어티를 포함하는 AAV 복제에 필요한 단백질 및 RNA를 포함한다. 바이러스-기반 부속 기능은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스, 예컨대, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(단순 헤르페스 바이러스 타입-1이 아님) 및 백시니아 바이러스로부터 유래될 수 있다.
"부속 기능 벡터"는 일반적으로 부속 기능을 제공하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 그러한 서열은 부속 기능 벡터 상에 존재할 수 있고, 적합한 숙주 세포 내로 트랜스펙션될 수 있다. 부속 기능 벡터는 숙주 세포에서 rAAV 비리온 생산을 지원할 수 있다. 부속 기능 벡터는 플라스미드, 파지, 트랜스포존 또는 코스미드의 형태로 존재할 수 있다. 또한, 아데노바이러스 유전자의 완전한-보체는 부속 기능에 필요하지 않다. 예를 들어, DNA 복제 및 후기 유전자 합성이 불가능한 아데노바이러스 돌연변이체는 AAV 복제에 허용된다고 보고되어 있다(Ito et al., (1970) J. Gen. Virol. 9:243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45:317). 유사하게, E2B 및 E3 영역 내의 돌연변이체는 AAV 복제를 지지하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 E2B 및 E3 영역이 아마도 부속 기능을 제공하는데 관련되지 않음을 나타낸다(Carter et al., (1983) Virology 126:505). E1 영역에 결함이 있거나, 결실된 E4 영역을 갖는 아데노바이러스는 AAV 복제를 지지할 수 없다. 따라서, E1 A 및 E4 영역은 AAV 복제를 위해 직접적 또는 간접적으로 필요할 것으로 보인다(Laughlin et al., (1982) J. Virol. 41:868; Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter et al., (1983) Virology 126:505). 다른 특성화된 아데노바이러스 돌연변이체는 다음을 포함한다: E1B(Laughlin et al. (1982), supra; Janik et al. (1981), supra; Ostrove et al., (1980) Virology 104:502); E2A (Handa et al., (1975) J. Gen. Virol. 29:239; Strauss et al., (1976) J. Virol. 17:140; Myers et al., (1980) J. Virol. 35:665; Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers et al., (1981) J. Biol. Chem. 256:567); E2B(Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3(Carter et al. (1983), supra); 및 E4(Carter et al.(1983), supra; Carter (1995)). E1B 코딩 영역에 돌연변이를 갖는 아데노바이러스가 제공하는 부속 기능의 연구는 상반된 결과를 가져 왔지만, E1B55k는 AAV 비리온 생산에 필요할 수 있는 반면, EIB 19k는 그렇지 않다(Samulski et al., (1988) J. Virol. 62:206-210). 또한, 국제 공개 공보 WO 97/17458호 및 문헌 [Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938-945]은 다양한 아데노바이러스 유전자를 인코딩하는 부속 기능 벡터를 기재하고 있다. 예시적인 부속 기능 벡터는 아데노바이러스 VA RNA 코딩 영역, 아데노바이러스 E4 ORF6 코딩 영역, 아데노바이러스 E2A 72 kD 코딩 영역, 아데노바이러스 E1A 코딩 영역, 및 무손상 E1B55k 코딩 영역이 결여된 아데노바이러스 E1B 영역을 포함한다. 그러한 부속 기능 벡터는, 예를 들어, 국제 공개 공보 WO 01/83797호에 기술되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혈청형"은 다른 AAV 혈청형으로부터 혈청학적으로 별개인 캡시드를 갖는 AAV를 지칭하는데 사용되는 차이이다. 혈청학적 특수성은 다른 AAV에 비해 한 AAV에 대한 항체 간의 교차-반응성의 결여에 기초하여 결정된다. 교차-반응성의 차이는 일반적으로 캡시드 단백질 서열/항원성 결정인자(예를 들어, AAV 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열 차이 때문)의 차이 때문이다.
기존의 정의에서, 혈청형은 관심 있는 바이러스가 중화 활성을 위해 기존의 모든 및 특성화된 혈청형에 특이적인 혈청에 대해 검사를 받았고 관심 있는 바이러스를 중화시키는 항체는 발견되지 않았음을 의미한다. 더 많은 자연 발생 바이러스 분리물이 발견되고/되거나 캡시드 돌연변이체가 생성됨에 따라, 현재 존재하는 혈청형 중 임의의 것과 혈청학적 차이가 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 따라서, 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)가 혈청학적 차이를 갖지 않는 경우, 이 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)는 상응하는 혈청형의 서브그룹 또는 변이체일 것이다. 많은 경우에, 중화 활성에 대한 혈청학 검사는 혈청형의 전통적인 정의에 따라 다른 혈청형을 갖는지를 결정하기 위해 캡시드 서열 변형을 갖는 돌연변이 바이러스에 대해 여전히 수행되어야 한다. 따라서, 편의상 그리고 반복을 피하기 위해, 용어 "혈청형"은 혈청학적으로 별개인 바이러스(예를 들어, AAV) 뿐만 아니라 주어진 혈청형의 서브그룹 또는 변이체 내에 있을 수 있는 혈청학적으로 별개가 아닌 바이러스(예를 들어, AAV) 양자 모두를 광범위하게 지칭한다.
rAAV 벡터는 임의의 바이러스 균주 또는 혈청형을 포함한다. 비제한적인 예로서, rAAV 플라스미드 또는 벡터 유전체 또는 입자(캡시드)는, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, Rh8, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, LK03, RHM4-1, DJ, DJ8, NP59, Anc-80 및 이들의 변이체와 같은 임의의 AAV 혈청형에 기반할 수 있고, 문헌 [Pulicherla et al., Mol. Ther., 19(6) 1070-1078 (2011)](특히 AAV9.47을 포함하는 AAV9 변이체를 기재함), 미국 특허 번호 7,906,111호(특히 AAV9(hu14) 기재함), 10,532,111호(특히 NP59를 기재함), 10,738,087호(특히 Anc-80을 기재함), 9,169,299호("LK03"을 기재함), 9,840,719호("RHM4-1"을 기재함), 7,749,492호, 7,588,772호("DJ" 및 "DJ8"을 기재함), 9,587,282호 및 특허 출원 WO2012/145601호, WO2013/158879호, WO2015/013313호, WO2018/156654호, US2013/0059732호에 설명된 AAV 캡시드의 변이체를 포함하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다. 그의 서열 정보를 포함하는 모든 전술한 AAV의 기재는 그 전체 내용이 참조로서 포함된다. 그러한 벡터는 동일한 균주 또는 혈청형(또는 서브그룹 또는 변이체)에 기반할 수 있거나, 서로 상이할 수 있다. 비제한적인 예로서, 한 혈청형 유전체에 기반한 rAAV 플라스미드 또는 벡터 유전체 또는 입자(캡시드)는 벡터를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 동일할 수 있다. 또한, rAAV 플라스미드 또는 벡터 유전체는 벡터 유전체를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 별개인 AAV(예를 들어, AAV2) 혈청형 유전체에 기반할 수 있고, 이 경우에 3개의 캡시드 단백질 중 적어도 하나는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, Rh8, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, LK03, RHM4-1, DJ, DJ8, NP59, Anc-80 및 이들의 변이체일 수 있고, 문헌 [Pulicherla et al., Mol. Ther., 19(6) 1070-1078 (2011)](특히 AAV9.47을 포함하는 AAV9 변이체를 기재함), 미국 특허 번호 7,906,111호(특히 AAV9(hu14) 기재함), 10,532,111호(특히 NP59를 기재함), 10,738,087호(특히 Anc-80을 기재함), 9,169,299호("LK03"을 기재함), 9,840,719호("RHM4-1"을 기재함), 7,749,492호, 7,588,772호("DJ" 및 "DJ8"을 기재함), 9,587,282호 및 특허 출원 WO2012/145601호, WO2013/158879호, WO2015/013313호, WO2018/156654호, US2013/0059732호에 설명된 AAV 캡시드의 변이체를 포함하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다. 따라서, rAAV 벡터는 특정 혈청형 뿐만 아니라 혼합된 혈청형에 특징적인 유전자/단백질 서열과 동일한 유전자/단백질 서열을 포함한다. 다양한 실시 형태는 캡시드가 이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 결합할 수 있는 경우, 임의의 공급원으로부터 임의의 rAAV 또는 AAV 캡시드에 적용 가능하다.
다양한 예시적인 실시 형태에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, Rh8, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, LK03, RHM4-1, DJ, DJ8, NP59, Anc-80 및 이들의 변이체의 캡시드 단백질과 적어도 70% 이상(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등) 동일한 캡시드 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 문헌 [Pulicherla et al., Mol. Ther., 19(6) 1070-1078 (2011)](특히 AAV9.47을 포함하는 AAV9 변이체를 기재함), 미국 특허 번호 7,906,111호(특히 AAV9(hu14) 기재함), 10,532,111호(특히 NP59를 기재함), 10,738,087호(특히 Anc-80을 기재함), 9,169,299호("LK03"을 기재함), 9,840,719호("RHM4-1"을 기재함), 7,749,492호, 7,588,772호("DJ" 및 "DJ8"을 기재함), 9,587,282호 및 특허 출원 WO2012/145601호, WO2013/158879호, WO2015/013313호, WO2018/156654호, US2013/0059732호에 설명된 AAV 캡시드의 변이체를 포함하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다. 다양한 예시적인 실시 형태에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 ITR(들)의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, Rh8, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, LK03, RHM4-1, DJ, DJ8, NP59, Anc-80 및 이들의 변이체와 적어도 70% 이상(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등) 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 문헌 [Pulicherla et al., Mol. Ther., 19(6) 1070-1078 (2011)](특히 AAV9.47을 포함하는 AAV9 변이체를 기재함), 미국 특허 번호 7,906,111호(특히 AAV9(hu14) 기재함), 10,532,111호(특히 NP59를 기재함), 10,738,087호(특히 Anc-80을 기재함), 9,169,299호("LK03"을 기재함), 9,840,719호("RHM4-1"을 기재함), 7,749,492호, 7,588,772호("DJ" 및 "DJ8"을 기재함), 9,587,282호 및 특허 출원 WO2012/145601호, WO2013/158879호, WO2015/013313호, WO2018/156654호, US2013/0059732호에 설명된 AAV 캡시드의 변이체를 포함하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
rAAV, 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, Rh8, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, LK03, RHM4-1, DJ, DJ8, NP59, Anc-80 및 이들의 변이체는, 문헌 [Pulicherla et al., Mol. Ther., 19(6) 1070-1078 (2011)](특히 AAV9.47을 포함하는 AAV9 변이체를 기재함), 미국 특허 번호 7,906,111호(특히 AAV9(hu14) 기재함), 10,532,111호(특히 NP59를 기재함), 10,738,087호(특히 Anc-80을 기재함), 9,169,299호("LK03"을 기재함), 9,840,719호("RHM4-1"을 기재함), 7,749,492호, 7,588,772호("DJ" 및 "DJ8"을 기재함), 9,587,282호 및 특허 출원 WO2012/145601호, WO2013/158879호, WO2015/013313호, WO2018/156654호, US2013/0059732호에 설명된 AAV 캡시드의 변이체를 포함하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되고, 및 변이체, 하이브리드 및 키메라 서열은, 하나 이상의 기능적 AAV ITR 서열에 측접한 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(전이유전자)을 포함하기 위해 당업자에게 공지된 재조합 기술을 이용하여 작제될 수 있다. 그러한 벡터는 전체 또는 부분적으로 결실된 야생형 AAV 유전자 중 하나 이상을 갖지만, 구제, 복제, 및 rAAV 벡터 입자로의 재조합 벡터의 패키징에 필요한 적어도 하나의 기능적 측접 ITR 서열(들)을 보유한다. 따라서, rAAV 벡터 유전체는 복제 및 패키징(예를 들어, 기능성 ITR 서열)을 위해 필요한 서열을 시스로 포함할 것이다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 모든 형태의 핵산, 올리고뉴클레오티드를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 핵산은 유전체 DNA, cDNA 및 안티센스 DNA, 및 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA tRNA 및 억제성 DNA 또는 RNA(RNAi, 예를 들어, 작거나 짧은 헤어핀 (sh)RNA, 마이크로RNA(miRNA), 작거나 짧은 간섭 (si)RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 또는 안티센스 RNA)를 포함한다. 핵산은 자연 발생, 합성, 및 의도적으로 변형되거나 변경된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 핵산은 단일, 이중, 또는 삼중, 선형 또는 원형일 수 있고, 임의의 길이일 수 있다. 핵산을 논의할 때, 특정 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 구조는 5'에서 3' 방향으로 서열을 제공하는 규정에 따라 본원에 기술될 수 있다.
"이종성" 핵산 서열은 세포로의 폴리뉴클레오티드의 벡터 매개 이동/전달을 목적으로 AAV 플라스미드 또는 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이종성 핵산 서열은 AAV 핵산과 별개이며, 즉, AAV 핵산에 대해 비-천연이다. 일단 세포 내로 이동/전달되면, 벡터 내에 포함된 이종성 핵산 서열은 발현될 수 있다(예를 들어, 전사되고, 적절한 경우 번역됨). 대안적으로, 벡터 내에 함유된 세포의 이동/전달된 이종성 폴리뉴클레오티드는 발현될 필요가 없다.
"핵산 서열"에 의해 인코딩된 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 자연 발생 단백질과 마찬가지로 전장 천연 서열을 포함함은 물론, 하위서열, 변형된 형태 또는 변이체가 천연 전장 단백질의 어느 정도의 기능을 보유하는 한 기능적 하위서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체를 포함한다. 핵산 서열에 의해 인코딩되는 그러한 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드는 결함이 있거나, 그의 발현이 불충분하거나, 또는 처리된 포유 동물에서 결핍인 내인성 단백질과 동일할 수 있지만 반드시 동일할 필요는 없다.
"전이유전자"는 본원에서 세포 또는 유기체에 도입하고자 하거나 도입된 핵산(예를 들어, 이종성)을 편리하게 지칭하는데 사용된다. 전이유전자는 임의의 핵산, 예컨대, 치료용 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 이종성 핵산을 포함한다.
전이유전자를 갖는 세포에서, 전이유전자는 플라스미드 또는 AAV 벡터, 세포의 "형질도입" 또는 "트랜스펙션"에 의해 도입/전달되었다. 용어 "형질도입" 및 "트랜스펙션"은 핵산과 같은 분자를 숙주 세포(예를 들어, HEK293) 또는 유기체의 세포에 도입하는 것을 지칭한다. 전이유전자는 수용자 세포의 유전체 핵산에 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 도입된 핵산이 수용자 세포 또는 유기체의 핵산(유전체 DNA)에 통합되는 경우, 이는 그 세포 또는 유기체에 안정하게 유지될 수 있고 추가로 수용자 세포 또는 유기체의 세포의 자손 세포 또는 유기체에 전달되거나 유전될 수 있다.
"숙주 세포"는, 예를 들어, AAV 벡터 플라스미드, AAV 헬퍼 작제물, 부속 기능 벡터, 또는 다른 전달 DNA의 수용체로서 사용될 수 있거나 사용된 미생물, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 나타낸다. 상기 용어는 트랜스펙션된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 트랜스펙션된 세포를 지칭한다. 단일 부모 세포의 자손은 자연적, 우발적, 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래 부모와 형태 또는 유전체 또는 전체 DNA 보체에서 반드시 완전히 동일하지는 않을 수 있는 것으로 이해된다. 예시적인 숙주 세포는 HEK293과 같은 인간 배아 신장(HEK) 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "치료용 단백질"은 세포 또는 대상체에서 단백질의 불충분한 양, 부재 또는 결함에서 초래된 증상을 경감시키거나 감소시킬 수 있는 펩티드 또는 단백질이다. 전이유전자에 의해 인코딩된 "치료용" 단백질은, 예를 들어, 유전적 결함을 교정하고, 유전자(발현 또는 기능) 결핍 등을 교정하기 위해, 대상체에 이익을 줄 수 있다.
본 발명에 따른 유용한 유전자 생성물(예를 들어, 치료용 단백질)을 인코딩하는 이종성 핵산의 비제한적인 예는 "지혈" 또는 혈액 응고 장애, 예컨대, 혈우병 A, 억제 항체를 갖는 혈우병 A 환자, 혈우병 B, 응고 인자 VII, VIII, IX 및 X, XI, V, XII, II, 폰 빌레브란트 인자의 결핍, 복합 FV/FVIII 결핍, 지중해빈혈, 비타민 K 에폭사이드 환원효소 CI 결핍, 감마-카르복실라제 결핍; 빈혈, 외상과 관련된 출혈, 상해, 혈전증, 저혈소판증, 뇌졸중, 응고병증, 파종 혈관내 응고(DIC); 헤파린, 저분자량 헤파린, 펜타사카라이드, 와파린, 소분자 항혈전제(즉, FXa 억제제)와 관련된 과-항응고; 및 혈소판 장애, 예컨대, 베르나르 술리에 증후군(Bernard Soulier syndrome), 글랜즈먼 혈소판무력증(Glanzman thromblastemia) 및 저장풀 결핍증을 비제한적으로 포함하는 질병 또는 장애의 치료에 이용될 수 있는 것들을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 질병 또는 장애는 중추신경계(CNS)에 영향을 미치거나 그에서 유래한다. 특정 실시 형태에서, 질병은 신경퇴행성 질환이다. 특정 실시 형태에서, CNS 또는 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 헌팅턴병, ALS, 유전성 경직성 편마비, 원발성 측삭 경화증, 척수성 근위축증, 케네디병, 폴리글루타민 반복 질환 또는 파킨슨병이다. 특정 실시 형태에서, CNS 또는 신경퇴행성 질환은 폴리글루타민 반복 질환이다. 특정 실시 형태에서, 폴리글루타민 반복 질환은 척수소뇌 운동실조증(SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7 또는 SCA17)이다.
특정 실시 형태에서, 이종성 핵산은 폼페병 치료를 위한 GAA(산성 알파-글루코시다제); 윌슨병 치료를 위한 ATP7B(구리 수송 ATPase2); 파브리병 치료를 위한 알파 갈락토시다제; 시트룰린혈증 1형 치료를 위한 ASS1(아르기노숙신산염 신타아제); 고셔병 1형 치료를 위한 베타-글루코세레브로시다아제; 테이새크스병 치료를 위한 베타-헥소사미니다아제 A; C1 억제제 결핍 유형 I 및 유형 II로도 알려진 유전성 혈관성 부종(HAE)의 치료를 위한 SERPING1(C1 프로테아제 억제제 또는 C1 에스테라아제 억제제); 글리코겐 축적 질환 I형(GSDI) 치료를 위한 글루코스-6-포스파타제로 구성되는 군으로부터 선택된 단백질을 인코딩한다.
특정 실시 형태에서, 이종성 핵산은 CFTR(낭포성 섬유증 막횡단 조절인자 단백질), 혈액 응고(응고: clotting) 인자(인자 XIII, 인자 IX, 인자 VIII, 인자 X, 인자 VII, 인자 VIIa, 단백질 C 등) 기능 증가 혈액 응고 인자, 항체, 망막 색소 상피-특정 65 kDa 단백질(RPE65), 에리스로포이에틴, LDL 수용체, 지질단백질 리파아제, 오르니틴 트랜스카바밀라제, β-글로빈, α-글로빈, 스펙트린, α-항트립신, 아데노신 데아미나제(ADA), 금속 수송체(ATP7A 또는 ATP7), 설파미다아제, 리소좀 축적 질환(ARSA) 관련 효소, 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전이효소, β-25 글루코세레브로시다아제, 스핑고미엘리나제, 리소좀 헥소사미니다제, 분지-사슬 케토산 탈수소효소, 호르몬, 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 1 또는 2, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 신경 영양 인자 -3 및 -4, 뇌-유래 신경 영양 인자, 신경교 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 α 및 β, 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 인터루킨 12, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 림프톡신, 자살 유전자 산물, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 디프테리아 독소, 시토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나아제, 종양 괴사 인자, 약물 저항성 단백질, 종양 억제 단백질(예를 들어, p53, Rb, Wt-1, NF1, Von Hippel-Lindau(VHL), 대장 선종 용종(APC)), 면역 조절 특성이 있는 펩티드, 관용원성 또는 면역원성 펩티드 또는 단백질 트레지톱(Tregitope) 또는 hCDR1, 인슐린, 글루코키나아제, 구아닐레이트 시클라아제 2D(LCA-GUCY2D), Rab 에스코트 단백질 1(맥락막결손증), LCA 5(LCA-레베르실린(Lebercilin)), 오르니틴 케토산 아미노전이효소(망막 위축), 레티노시신 1(X-연관 망막 분리증), USH1C(어셔 증후군 1C), X-연관 색소성 망막염 GTPase(XLRP), MERTK(RP의 AR 형태: 색소성 망막염), DFNB1(코넥신 26 난청), ACHM 2, 3 및 4(색맹), PKD-1 또는 PKD-2(다낭성 신장 질환), TPP1, CLN2, 설파타제, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 트랜스퍼라아제, 카텝신 A, GM2-AP, NPC1, VPC2, 스핑고지질 활성화 단백질, 유전자 편집을 위한 하나 이상의 징크 핑거 뉴클레아제, 또는 유전자 편집을 위한 복구 템플릿으로 사용되는 하나 이상의 공여자 서열을 인코딩한다.
핵산 분자, 클로닝 발현 벡터와 같은 벡터(예를 들어, 벡터 유전체) 및 플라스미드는 재조합 DNA 기술 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 정보의 이용 가능성은 다양한 수단에 의해 핵산 분자의 제조를 가능하게 한다. 예를 들어, 벡터 및 플라스미드를 포함하는 인자 IX(FIX)를 인코딩하는 이종성 핵산은 다양한 표준 클로닝, 재조합 DNA 기술을 이용하여, 세포 발현 또는 시험관 내 번역 및 화학 합성 기술을 통해 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 순도는 시퀀싱, 겔 전기영동 등에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 하이브리드화 또는 컴퓨터-기반 데이터베이스 스크리닝 기술을 사용하여 핵산을 분리할 수 있다. 그러한 기술은 비제한적으로 (1) 상동성 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위해 유전체 DNA 또는 cDNA 라이브러리와 프로브의 하이브리드화; (2) 공유된 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 검출하기 위한, 예를 들어, 발현 라이브러리를 사용한 항체 스크리닝; (3) 관심 있는 핵산 서열에 어닐링할 수 있는 프라이머를 사용한 유전체 DNA 또는 cDNA에 대한 중합효소 연쇄 반응(PCR); (4) 관련 서열에 대한 서열 데이터베이스의 컴퓨터 검색; 및 (5) 감산된 핵산 라이브러리의 차별적 스크리닝을 포함한다.
rAAV 비리온을 생성하기 위해 당업계에 공지된 방법: 예를 들어, 한 AAV 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 또는 백시니아 바이러스)에 의한 동시감염과 함께 AAV 벡터 및 AAV 헬퍼 서열을 이용한 트랜스펙션 또는 재조합 AAV 벡터, AAV 헬퍼 벡터, 및 부속 기능 벡터에 의한 트랜스펙션. rAAV 비리온을 생성하기 위한 비제한적인 방법은, 예를 들어, U.S. 특허 번호 6,001,650호 및 6,004,797호, 국제 출원 PCT/US16/64414(WO 2017/096039호로서 공개됨) 및 U.S. 가특허 출원 번호 62/516,432호 및 62/531,626호에 기술되어 있다. 재조합 rAAV 벡터 생산(즉, 세포 배양 시스템에서의 벡터 생성) 이후, rAAV 비리온은 숙주 세포 및 세포 배양 상청액으로부터 수득되고, 본원에 기재된 대로 정제될 수 있다.
전체 rAAV 입자의 정제 방법
하나의 일반적인 측면에서, 본 출원은 전체 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(a). 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자를 포함하는 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(b). 로딩 완충액 중의 rAAV 제제를 크로마토그래피 매질을 포함하는 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 전체 rAAV 입자는 비-전체 입자 보다 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 결합 친화도를 가지는, 단계; 및
(c). 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 전체 rAAV 입자 대 비-전체 입자의 증가된 비율을 포함하는 정제된 제제를 수득하는 단계;
를 포함한다.
본 출원의 실시 형태에 따르면, rAAV 제제는 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자(빈 입자 및 부분 입자를 포함) 및 이들의 변이체를 포함하는 임의의 혼합물일 수 있다. rAAV 제제는 또한 추가 분리를 위해 다양한 비-전체 입자(예를 들어 빈 입자 및 부분 입자)의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, rAAV 제제는 세포 용해물, 가공된 세포 용해물, 상청액 또는 사전에 정제된 제제일 수 있다. 적용 방법에 유용한 rAAV 제제는 본 개시의 관점에서 당업계에 공지된 임의의 rAAV 수집 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물은 세포를 파괴하거나 용해시키고 원심분리, 미세유동화 및/또는 심층 여과에 의해 세포 잔해를 제거함으로써 수득할 수 있다. 세포 용해물은 직접 사용될 수 있거나 적용 방법에 사용되기 전에 추가로 가공되거나 저장될 수 있다.
전형적으로, 세포 용해물은 여과 및 원심분리와 같이 세포 잔해를 제거하여 정화되어, 정화된 세포 용해물을 제공한다. 용해물(선택적으로 정화됨)은 전체 rAAV 입자, 비-전체 입자 및 기타 rAAV 벡터 생산/공정 관련 불순물, 예컨대, 그 중에서도 세포 단백질, 지질 및/또는 핵산 및 세포 배양 배지 성분을 포함할 수 있는 숙주 세포로부터의 가용성 세포 성분이다. 선택적으로 정화된 용해물은 추가 정제 단계를 거쳐 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 불순물과 관련된 다른 공정으로 제거할 수 있다. 얻어진 처리된 용해물은 적용 방법으로 사용되기 전에 적절한 완충액으로 희석되거나 풍부화될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 빈 입자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 부분 입자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 빈 입자와 부분 입자 양자 모두를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 매질이 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 매질이다. 본 방법에 사용되는 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 강한 음이온 교환 수지 또는 약한 음이온 교환 수지일 수 있다. 바람직하게는, 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 음이온 교환 리간드 예컨대 독점적인 4차 아민, 4차화된 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌이민, 또는 디메틸아미노프로필인 음이온 교환 리간드를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 약한 음이온 교환 수지(예를 들어, Poros 50 D, Poros 50 PI) 또는 강한 음이온 교환 수지(예를 들어, Poros XQ, Poros 50 HQ)로부터 선택된다. 음이온 교환 크로마토그래피 매질의 다른 예로는 DEAE 세파로오스 FF, Q-세파로오스(HP 및 FF), Q 세파로오스 FF(낮은 치환 및 높은 치환도), 캡토(Capto) Q, Q XP, 소스(Source) 30 Q 및 15 Q, 프락토겔(Fractogel) DEAE 및 MPHQ가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 음이온 교환 크로마토그래피 매질의 다른 예로는 모놀리식 예컨대 CIMmultus™ QA 모놀리식 컬럼이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 매질이 이온 교환 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 매질이다.
일부 실시 형태에서, 컬럼 크로마토그래피 매질이 Poros 50 HQ, Poros 50 D, Poros 50 PI, Capto ImpRes Q, 및 Poros XQ로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 Poros XQ이다.
일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 매질이 모놀리식 예컨대 CIMmultus™ QA 모놀리식 컬럼이다.
일부 실시 형태에서, 다중 크로마토그래피 매질이 사용된다.
일부 실시 형태에서, 다중 크로마토그래피 매질이 사용되는 경우, 매질은 동일하다.
일부 실시 형태에서, 이온 교환 크로마토그래피 매질은 친화성 크로마토그래피 매질 예컨대 AVB SepharoseTM High Performance (GE Healthcare, Marlborough, MA), 또는 크기 배제 크로마토그래피 예컨대 Superdex 200 (GE Healthcare)와 함께 사용된다(이전 또는 후속을 의미함).
일부 실시 형태에서, rAAV 제제를 단계 (b)에서 크로마토그래피 매질을 포함하는 컬럼에 로딩 완충액 중에 로딩하는 경우, 전체 rAAV 입자만이 크로마토그래피 매질에 결합하는 반면, 비-전체 입자는 크로마토그래피 매질에 결합하지 않고, 컬럼을 통해 흐른다. 일부 실시 형태에서, 컬럼으로부터 통과액은 빈 입자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 컬럼으로부터 통과액은 부분 입자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 컬럼으로부터 통과액은 전체 rAAV 입자 및 빈 입자 양자 모두를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 컬럼으로부터 통과액은 전체 rAAV 입자 및 부분 입자 양자 모두를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 컬럼으로부터 통과액은 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자(빈 입자 및 부분 입자를 포함) 양자 모두를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 rAAV 제제가 단계 (b)에서 크로마토그래피 매질을 포함하는 컬럼에 적용되는 경우, 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자(부분과 같은 변이체를 포함) 양자 모두가 크로마토그래피 매질에 결합하지만, 그러나 전체 rAAV 입자는 비-전체 입자 보다 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 결합 친화도를 가지며; 컬럼에 적용되는 전체 입자 및 비-전체 입자의 양이 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자가 컬럼으로부터 로드 통과액 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 한다. 컬럼으로부터 로드 통과액은 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자 양자 모두를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 일부 비-전체 입자(예를 들어 빈 입자 및/또는 부분 입자)는 크로마토그래피 매질에 결합하며, 이것은 용리 완충액을 사용하여 전체 rAAV 입자를 용리하기 전에 세척 완충액에 의해 용리될 수 있다.
이론에 얽매이기를 바라지는 않지만, 전체 입자 및 비-전체 AAV 입자의 분리는 치환 현상으로 인해 로딩 중에 발생하는 것으로 여겨진다. 입자의 혼합물을 포함하는 rAAV 제제가 우선 컬럼에 적용되는 경우, 모든 입자가 컬럼 상의 이용 가능한 위치에 결합한다. 이용 가능한 위치가 컬럼 입구 쪽으로 점유됨에 따라, 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 친화도를 갖는, 전체 rAAV 입자는 크로마토그래피 매질에 대한 더 낮은 친화도를 갖는, 결합된 비-전체 입자를 치환시키고, 전체 입자는 컬럼의 상단 부분에서 풍부화된다. 이 과정에서 비-전체 입자는 크로마토그래피 매질 다운스트림에 결합된다. 더 많은 혼합물이 컬럼에 적용되면, 더 많은 전체 rAAV 입자가 크로마토그래피 매질 업스트림에 결합할 것이며, 결합된 비-전체 입자를 치환하고 비-전체 입자를 더욱 다운스트림으로 밀어낸다. 특정 실시 형태에서, 샘플 로딩이 완료된 후, 전체 rAAV의 양과 비교하여 비-전체 입자가 없거나 비-전체 입자의 감소된 양이 크로마토그래피 매질에 결합된다. 전체 입자에 의해 비-전체 입자가 치환되는 것은 크로마토그래피 매질에 대한 서로 다른 친화도의 결과이기 때문에, 친화도의 대비를 증가시키면 분리가 향상될 수 있다. 크로마토그래피 매질에 결합하는 입자의 친화도는 rAAV 입자, 수지 및 환경(완충 조건(염 및 pH) 포함)과 관련된 요인에 의해 결정된다. 유사하게, 이 추론은 비-전체 rAAV 입자가 부분 입자를 포함하는 경우, 부분 입자에 적용된다. 비-전체 입자 집단의 변이체로서, 부분 입자는 다른 비-전체 입자, 특히 빈 입자 보다 더 높은 친화도로 크로마토그래피 매질에 결합할 수 있지만, 전체 입자 보다 낮은 친화도로 전체 입자 및 부분 입자 양자 모두를 다른 비-전체 입자로 치환할 수 있다. 다른 비-전체 입자에 더하여, 크로마토그래피 매질에 대한 전체 입자 및 부분 입자의 친화도의 대비를 향상시키는 경우, 전체 입자로부터 부분 입자의 분리를 더욱 향상시킬 수 있다. 또한 유사하게, 비-전체 rAAV 입자가 빈 입자를 포함하는 경우, 개시된 방법은 전체 입자 및 다른 비-전체 입자로부터 빈 입자의 분리를 향상시키는데 사용할 수 있다.
치환의 이점은 컬럼 크로마토그래피 매질의 결합 능력 수준을 초과하는, 컬럼에서 파과가 일단 발생하면 실현된다. 크로마토그래피 매질 수지가 국부적으로 포화 상태를 넘어 진행됨에 따라, 전체 입자와 비-전체 입자 사이의 경쟁이 발생하여 들어오는 전체 입자에 의해 결합된 비-전체 입자의 치환이 유발된다.
치환의 이점은 크로마토그래피 매질에 대한 서로 다른 친화도를 기반으로, 번역 후 변형, 또는 단편 또는 집합체를 사용하는, 다른 rAAV 불순물 및 산물 변이체, 예컨대 절두된(truncated) 전이유전자를 갖는 부분적으로 채워진 캡시드, 빈, 부분 또는 전체 캡시드 변이체의 분리에 유사하게 적용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자가 빈 입자와 부분 입자 양자 모두를 포함하는 경우, 모든 비-전체 입자는 컬럼 상의 이용 가능한 위치에 결합된다. 이용 가능한 위치가 점유됨에 따라, 빈 입자 보다 크로마토그래피 매질에 대한 상대적으로 높은 친화도를 갖는 부분 입자가 결합된 빈 입자를 치환한다.
크로마토그래피 매질 예컨대 음이온 교환 수지는 다양한 조건 예컨대 pH, 및 완충액 부피 하에서 다양한 완충액을 사용하여 평형화, 세척 및 용리될 수 있다. 다음은 특정의 비제한적인 예시를 설명하기 위한 것이지만, 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다.
음이온 교환 크로마토그래피는 제조 업체의 사양에 따라 표준 완충액을 사용하여 평형화할 수 있다. 평형화 이후, 샘플을 로드하였다. 후속적으로, 크로마토그래피 매질은 적어도 1회 이상, 예를 들어 컬럼 부피의 2-10배로 세척되었다. 크로마토그래피 매질로부터의 용리는 2-20 컬럼 부피에 대하여 고염 완충액을 통해 이루어진다.
본 출원의 실시 형태에 따르면, 음이온 교환 크로마토그래피를 위한 세척 및 용리를 위한 평형 완충액 및 용액은 약 pH 6.0 내지 pH 12의 pH에서 적합하다. 또한, 음이온 교환 컬럼을 위한 세척 및 용리를 위한 적절한 평형 완충액 및 용액은 일반적으로 본질적으로 양이온성 또는 양성이온성이다. 이러한 완충액은 제한 없이 하기 완충액 제제를 함유한 완충액을 포함한다: N-메틸피페라진; 피페라진; 비스-트리스; 비스-트리스 프로판; 트리에탄올아민; 트리스; 트리스 아세테이트; N-메틸디에탄올아민; 1,3-디아미노프로판; 에탄올아민; 아세트산, 등. 샘플을 용리하기 위해, 개시 완충액의 이온 강도는 염, 예컨대 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 황산염, 포름산염 또는 아세테이트를 사용하여 증가시킨다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 20-50 mM 농도, 예컨대 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 100 mM 또는 이들 사이의 임의의 농도에서 선택된 완충액을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 로딩 완충액은 20-50 mM 트리스를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 예를 들어, 로딩 완충액은 NaCl, MgCl2, 및 CaCl2으로 구성되는 군으로부터 선택된 다중 염을 포함할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 로딩 완충액은 NaCl, MgCl2, CuCl2 , LiCl, 및 CaCl2를 포함한다. 염에 대한 음이온 성분은 결정적이지 않으며, 특정 음이온은 바람직하지 않다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함하는 경우, 전체 rAAV 입자 만이 크로마토그래피 매질에 결합하는 반면, 비-전체 입자는 크로마토그래피 매질에 결합하지 않고 컬럼을 통해 흐른다. 바람직한 실시 형태에서, 로딩 완충액은 적어도 CaCl2를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 10-100 mM 나트륨 염, 예컨대 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 나트륨 염의 농도는 약 20-60 mM 사이, 예컨대 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 0-20 mM 마그네슘 염, 예컨대 0, 5, 10, 15, 20 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 마그네슘 염의 농도는 약 1-10 mM 사이, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 0-100 mM 리튬 염, 예컨대 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 리튬 염의 농도는 약 0-75 mM 사이, 예컨대 0, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 0-10 mM 칼슘 염, 예컨대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 칼슘 염의 농도는 약 0.1-2.5 mM 사이, 예컨대 0.1, 0.5, 1.0. 1.5, 2.0, 2.5 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 0-5 mM 구리 염, 예컨대 0, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 구리 염의 농도는 약 0.1-2.5 mM 사이, 예컨대 0.1, 0.5, 1.0. 1.5, 2.0, 2.5 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 5-100 mM 암모늄 염, 예컨대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 암모늄 염의 농도는 약 10-50 mM 사이, 예컨대 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 약 7-10의 pH, 예컨대 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 또는 이들 사이의 임의의 pH, 바람직하게는 약 8-9의 pH를 갖는다.
특정 실시 형태에서, 로딩 완충액은 바람직하게는 트리스 중의, 더욱 바람직하게는 20-50 mM 트리스 중의, 약 20-60 mM NaCl, 1-5 mM MgCl2, 0.1-2.5 mM CaCl2를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 로딩 완충액은 바람직하게는 트리스 중의, 더욱 바람직하게는 20-100 mM 트리스 중의, 약 20-60 mM NaCl, 10-30 mM (NH4)2SO4 1-5 mM MgCl2, 0.1-2.5 mM CuCl2를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
로딩 단계 (b) 이후, 로딩 완충액 중의 rAAV 제제를 크로마토그래피 매질을 포함하는 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 전체 rAAV 입자는 비-전체 입자 보다 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 결합 친화도를 가지며, 전체 rAAV 입자는 크로마토그래피 매질에 결합한다. 컬럼은 용리 전에 세척 완충액으로 선택적으로 세척될 수 있다. 예를 들어, 세척 완충액은 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자를 제거하기 위해, 로딩 조건과 비교하여 용리를 위한 증가된 염 농도 및/또는 증가된 pH를 가질 수 있다.
이어서, 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 입자는 예를 들어 로딩 조건과 비교하여 용리를 위해 증가된 염 농도 및/또는 조정된 pH를 사용하여 더 순수한 형태로 용리된다. pH를 조정하는 경우 전체 입자 및 비-전체 입자의 분리가 향상될 수 있다. 바람직하게는, 전체 입자의 용리는 pH를 변경하지 않고, 염 구배만으로도 달성된다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 용리 완충액은 선택된 완충액을 약 20-70 mM의 농도, 예컨대 20 mM, 30mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도에서 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 용리 완충액은 40-60 mM 트리스를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 예를 들어, 용리 완충액은 하나 이상의 염을 포함할 수 있고, 바람직하게는 NaCl, MgCl2, LiCl, CuCl2 및 CaCl2으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 염의 음이온 성분은 결정적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0-1000 mM NaCl, 예컨대 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, NaCl의 농도는 약 20-300 mM 사이, 예컨대 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0-30 mM MgCl2, 예컨대 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, MgCl2의 농도는 약 2-15 mM 사이, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0-200 mM LiCl, 예컨대 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, LiCl의 농도는 약 0-150 mM 사이, 예컨대 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0.1-20 mM CaCl2, 예컨대 0.1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, CaCl2의 농도는 약 5-10 mM 사이, 예컨대 5, 6, 7, 8, 9, 10 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0-10 mM CuCl2, 예컨대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, CuCl2의 농도는 약 0-3 mM 사이, 예컨대 0, 1, 2, 3 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 5-100 mM (NH4)2SO4, 예컨대 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, (NH4)2SO4의 농도는 약 10-50 mM 사이, 예컨대 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 약 6-10의 pH, 예컨대 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 또는 이들 사이의 임의의 pH, 바람직하게는 약 7-9의 pH를 갖는다.
특정 실시 형태에서, 용리 완충액은 바람직하게는 트리스 중의, 더욱 바람직하게는 40-60 mM 트리스 중의, 약 20-150 mM NaCl을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 출원은 전체 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(a). 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자를 포함하는 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(b). 로딩 완충액 중의 rAAV 제제의 제1 배치를 제1 크로마토그래피 매질을 포함하는 제1 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 전체 rAAV 입자는 비-전체 입자 보다 제1 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 결합 친화도를 가지며, 제1 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 제1 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 제1 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자가 제1 컬럼으로부터 제1 로드 통과액 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 하는, 단계;
(c). 제1 로드 통과액을 제2 크로마토그래피 매질을 포함하는 제2 컬럼에 로딩하여, 로딩되거나 또는 부분적으로 로딩된 제2 컬럼 및 제2 컬럼으로부터 제1 로드 통과액을 수득하는 단계로서, 여기서, 제2 크로마토그래피 매질은 제1 크로마토그래피 매질과 동일하거나 또는 동일한 유형인, 단계;
(d). 선택적으로, 제1 컬럼을 세척 완충액으로 세척하여, 세척된 제1 컬럼을 수득하는 단계;
(e). 단계 (c) 이후 또는 세척 단계 (d)가 수행되는 경우 세척 단계 (d) 이후에 제2 컬럼을 바이패싱하고, 제1 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 제1 컬럼 및 용리된 제1 컬럼으로부터 제1 용출액을 수득하는 단계로서, 여기서 제1 용출액은 전체 rAAV 입자 대 비-전체 rAAV 입자의 증가된 비율을 포함하는, 단계;
(f). 선택적으로, 제1 컬럼 통과액 이후에 제2 컬럼이 포화(즉, 로딩)되지 않은 경우, 로딩 완충액 중의 rAAV 제제의 제2 배치를 부분적으로 로딩된 제2 컬럼에 적용하는 단계로서, 여기서 제2 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 제2 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 제2 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자가 제2 컬럼으로부터 제2 로드 통과액 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 하는, 단계;
(g). 단계 (f)가 수행되는 경우, 제2 컬럼으로부터 제2 로드 통과액을 단계 (d)와 단계 (e) 사이에 세척된 제1 컬럼에 로딩하여, 제2 로딩된 제1 컬럼을 수득하고, 선택적으로 단계 (e)에서 용리를 계속하기 전에 제2 로딩된 제1 컬럼을 세척하는 단계;
(h). 선택적으로, 제2 컬럼을 세척 완충액으로 세척하여, 세척된 제2 컬럼을 수득하는 단계;
(i). 단계 (g) 이후 또는 세척 단계 (h)가 수행되는 경우 세척 단계 (h) 이후에 제1 컬럼을 바이패싱하고, 제2 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 제2 용출액 및 용리된 제2 컬럼을 수득하는 단계로서, 여기서 제2 용출액은 전체 rAAV 입자 대 비-전체 rAAV 입자의 증가된 비율을 포함하는, 단계; 및
(j). 제1 용출액 및 제2 용출액을 합쳐서 전체 rAAV 입자의 정제된 제제를 생산하는 단계;
를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 빈 입자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 부분 입자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 빈 입자와 부분 입자 양자 모두를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 제1 크로마토그래피 매질 및/또는 제2 크로마토그래피 매질이 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 매질이다.
일부 실시 형태에서, 2-컬럼 정제 공정은 도 12에 나타낸 바와 같이 구현 방식에 따라 셋업되고 작동된다. 2-컬럼 공정의 단계 (a) 및 단계 (b)는 1-컬럼 치환 크로마토그래피 공정의 처음 두 단계와 유사하다. 이들 두 단계 후에, 전체 rAAV 입자는 제1 크로마토그래피 매질에 결합하고, 제1 컬럼으로부터 제1 로드 통과액은 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자를 양자 모두 포함한다.
단계 (f)에서, 로딩 완충액 중의 rAAV 제제의 제2 배치는 단계 (c)에서 부분적으로 로딩된 제2 컬럼에 적용된다. rAAV 제제의 제2 배치의 양은 제1 배치와 동일하거나 제1 배치와 다를 수 있다. 바람직하게는, 제2 배치의 양은 제1 배치와 동일하다.
본 출원의 실시 형태에 따르면, 단계 (f)에서 제2 컬럼에 적용되는 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 제1 로드 통과액의 양 및 rAAV 제제의 제2 배치로부터의 양을 포함하고, 제2 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과한다. 제2 배치를 부분적으로 로딩된 제2 컬럼에 로딩하는 동안, 제2 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자는 제2 컬럼으로부터 제2 로드 통과액으로 전체 rAAV 입자에 의해 치환된다.
후속 단계 (g)에서, 제2 컬럼으로부터 제2 로드 통과액은 사전에 세척되거나 용리된 제1 컬럼에 로딩된다. 그런 다음 제1 컬럼은 단계 (g) 이후에 부분적으로 로딩되고, 제2 컬럼으로부터 제2 로드 통과액 내의 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 이 시점에서 제1 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하지 않는다.
단계 (b) 내지 단계 (i)는 rAAV 제제의 양에 따라 하나의 사이클 또는 그 이상의 사이클로 수행될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "하나의 사이클"은 단계 (b)부터 단계 (i)까지의 단계가 순차적으로 한 번 수행되는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "그 이상의 사이클"은 단계 (b)부터 단계 (i)까지 한 번 이상 순차적으로 수행되는 단계를 의미한다.
단계 (b) 내지 단계 (i)가 더 많은 사이클로 수행되는 경우, 반복된 단계 (b)에서의 "제1 배치"는 rAAV 제제의 사이클 번호인 새로운 "제1 배치"를 의미하며, 반복된 단계 (f)에서의 "제2 배치"는 동일한 사이클에서 rAAV 제제의 새로운 "제2 배치"를 의미한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자가 빈 입자 및 부분 입자 양자 모두를 포함하는 경우, 단계 (i)의 제2 용출액은 전체 및 부분 rAAV 입자 대 빈 rAAV 입자의 증가된 비율을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 다중 사이클이 수행되는 경우, 용리된 컬럼은 다음 로딩 사이클 전 사이클 전체에 걸쳐 일관된 컬럼 결합 능력을 유지하는데 유익하거나 필요한 후속 단계를 거칠 수 있다. 예를 들어, 이러한 단계에는 컬럼 제거, 컬럼 세척 및/또는 컬럼 소독, 및/또는 컬럼 재-평형화 등이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 로딩 완충액이 약 20-50 mM의 농도, 예컨대 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도에서 선택된 완충액을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 로딩 완충액은 20-50 mM 트리스를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 0-200mM의 범위로 포함한다. 염에 대한 음이온 성분은 결정 요인이 아니며 특정 음이온이 바람직하지 않다. 예를 들어, 로딩 완충액은 하나 이상의 염을 포함할 수 있고, 바람직하게는 NaCl, MgCl2, LiCl, CuCl2, 및 CaCl2로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 10-100 mM 나트륨 염, 예컨대 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 나트륨 염의 농도는 약 20-60 mM 사이, 예컨대 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 0-20 mM 마그네슘 염, 예컨대 0, 5, 10, 15, 20 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 마그네슘 염의 농도는 약 1-10 mM 사이, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 0-100 mM 리튬 염, 예컨대 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 리튬 염의 농도는 약 0-75 mM 사이, 예컨대 0, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 0-10 mM 칼슘 염, 예컨대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 칼슘 염의 농도는 약 0.1-2.5 mM 사이, 예컨대 0.1, 0.5, 1.0. 1.5, 2.0, 2.5 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 0-5 mM 구리 염, 예컨대 0, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 구리 염의 농도는 약 0.1-2.5 mM 사이, 예컨대 0.1, 0.5, 1.0. 1.5, 2.0, 2.5 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 5-100 mM 암모늄 염, 예컨대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 암모늄 염의 농도는 약 10-50 mM 사이, 예컨대 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 6-10의 pH, 예컨대 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 또는 이들 사이의 임의의 pH, 바람직하게는 약 8-9의 pH를 갖는다.
특정 실시 형태에서, 로딩 완충액은 바람직하게는 트리스 중의, 더욱 바람직하게는 20-50 mM 트리스 중의, 약 20-60 mM NaCl, 1-5 mM MgCl2, 0.1-2.5 mM CaCl2을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 로딩 완충액은 바람직하게는 트리스 중의, 더욱 바람직하게는 20-50 mM 트리스 중의, 0.00005-0.01% 폴록사머 188를 포함하고, 더욱 바람직하게는 0.0002-0.001% 폴록사머 188를 포함하는, 약 20-60 mM NaCl, 5-30mM (NH4)2SO4 , 1-5 mM MgCl2, 0.1-3 mM CuCl2을 포함한다.
로딩 단계 후, 전체 입자는 크로마토그래피 매질에 결합되고, 비-전체 입자는 통과액에서 컬럼으로 나온다. 컬럼은 용리 전에 적합한 세척 완충액으로 선택적으로 세척될 수 있다. 예를 들어, 세척 완충액은 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자를 제거하기 위해, 로딩 조건과 비교하여 용리를 위한 증가된 염 농도 및/또는 증가된 pH를 가질 수 있다.
이어서, 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 입자는 예를 들어 로딩 조건과 비교하여 증가된 염 농도 및/또는 용리를 위해 조정된 pH를 사용하여 더 순수한 형태로 후속적으로 용리된다. pH를 조정하면 분리가 강화될 수 있다. 바람직하게는, 전체 입자의 용리는 pH를 변경하지 않고, 염 구배만으로도 달성된다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 로딩 완충액은 선택된 완충액을 약 20-70 mM의 농도, 예컨대 20 mM, 30mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도에서 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 로딩 완충액은 40-60 mM 트리스를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 예를 들어, 용리 완충액은 하나 이상의 염을 포함할 수 있고, 바람직하게는 NaCl, MgCl2, LiCl, CuCl2 및 CaCl2으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 염의 음이온 성분은 결정적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 예를 들어, 로딩 완충액은 하나 이상의 염을 포함할 수 있고, 바람직하게는 NaCl, MgCl2, LiCl, CuCl2, 및 CaCl2로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0-1000 mM 나트륨 염, 예컨대 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 나트륨 염의 농도는 약 20-300 mM 사이, 예컨대 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0-30 mM 마그네슘 염, 예컨대 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 마그네슘 염의 농도는 약 2-15 mM 사이, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0-200 mM 리튬 염, 예컨대 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 리튬 염의 농도는 약 0-150 mM 사이, 예컨대 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0.1-20 mM 칼슘 염, 예컨대 0.1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 칼슘 염의 농도는 약 5-10 mM 사이, 예컨대 5, 6, 7, 8, 9, 10 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0-5 mM 구리 염, 예컨대 0, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 구리 염의 농도는 약 0.1-2.5 mM 사이, 예컨대 0.1, 0.5, 1.0. 1.5, 2.0, 2.5 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 5-100 mM 암모늄 염, 예컨대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 암모늄 염의 농도는 약 10-50 mM 사이, 예컨대 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 약 6-10의 pH, 예컨대 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 또는 이들 사이의 임의의 pH, 바람직하게는 약 8-9의 pH를 갖는다.
특정 실시 형태에서, 용리 완충액은 바람직하게는 트리스 중의, 더욱 바람직하게는 40-60 mM 트리스 중의, 약 20-150 mM NaCl을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 전체 rAAV 입자의 정제를 위해, 2개 이상의 컬럼, 예컨대 3개의 컬럼을 사용한다. 특히, 이 방법은 단계 (g) 내지 단계 (j)를 포함하지 않지만, 다음을 추가로 포함한다:
(k). 단계 (f) 후에, 제2 컬럼으로부터 제2 로드 통과액을 제3 크로마토그래피 매질을 포함하는 제3 컬럼에 로딩하여, 로딩되거나 또는 부분적으로 로딩된 제3 컬럼을 수득하는 단계로서, 바람직하게는 제3 크로마토그래피 매질은 제1 크로마토그래피 매질과 동일한 유형인, 단계;
(l). 선택적으로, 제2 컬럼을 세척 완충액으로 세척하여, 세척된 제2 컬럼을 수득하는 단계;
(m). 단계 (k) 이후 또는 세척 단계 (l)이 수행되는 경우 세척 단계 (l) 이후에 제1 컬럼을 바이패싱하고, 제2 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 제2 용출액 및 용리된 제2 컬럼을 수득하는 단계로서, 여기서 제2 용출액은 전체 rAAV 입자 대 비-전체 rAAV 입자의 증가된 비율을 포함하는, 단계;
(n). 선택적으로, 제2 컬럼 통과액 이후에 제3 컬럼이 포화(즉, 로딩)되지 않은 경우, 로딩 완충액 중의 rAAV 제제의 제3 배치를 부분적으로 로딩된 제3 컬럼에 적용할 수 있는 단계로서, 여기서 제3 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 제3 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 제3 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자가 제3 컬럼으로부터 제3 로드 통과액 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 하는, 단계;
(o). 단계 (n)이 수행되는 경우, 제3 컬럼으로부터 제3 로드 통과액을 단계 (d)와 단계 (e) 사이에 세척된 제1 컬럼에 로딩하여, 제2 로딩된 제1 컬럼을 수득하고, 선택적으로 단계 (e)에서 용리를 계속하기 전에 제2 로딩된 제1 컬럼을 세척하는 단계;
(p). 선택적으로, 제3 컬럼을 세척 완충액으로 세척하여, 세척된 제3 컬럼을 수득하는 단계;
(q). 제1 컬럼 및 제2 컬럼을 바이패싱하고, 제3 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 제3 용출액 및 용리된 제3 컬럼을 수득하는 단계로서, 여기서 제3 용출액은 전체 rAAV 입자 대 비-전체 rAAV 입자의 증가된 비율을 포함하는, 단계; 및
(r). 제1 용출액, 제2 용출액, 및 제3 용출액을 합쳐서 전체 rAAV 입자의 정제된 제제를 생산하는 단계.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자가 빈 입자와 부분 입자 양자 모두를 포함하는 경우, 전체 입자는 제1 컬럼에서 풍부화되고, 부분 입자는 제2 컬럼에서 풍부화되고, 빈 입자는 제3 컬럼에서 풍부화된다.
본 발명자들이 아는 한, 비-전체 rAAV 입자로부터 전체 rAAV 입자를 정제하기 위한 치환 크로마토그래피 방법은 존재하지 않는다. 전체 입자를 정제하는 기존 정제 방법, 예컨대 일반 음이온 교환 크로마토그래피에 비해, 적용 공정 이후 전체 입자의 순도가 크게 향상되었다. 일부 실시 형태에서, 정제된 제제에는 비-전체 입자가 실질적으로 없고, 보다 구체적으로는, 빈 입자 및/또는 부분 입자가 실질적으로 없다. 다른 실시 형태에서, 정제된 제제는 rAAV 제제 보다 전체 rAAV 입자 대 비-전체 입자의 증가된 비율을 포함한다. 바람직하게는, 정제된 제제 중의 전체 rAAV 입자 대 비-전체 입자의 비율은 9:1 이상, 예컨대 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1 또는 50:1, 또는 이들 사이의 임의의 비율 이상이고, 더욱 바람직하게는 49:1 이상이다.
본 출원의 실시 형태에 따르면, 정제된 제제 내에 전체 rAAV 입자 대 비-전체 입자의 비율은 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 수에 의해 계산될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 비율은 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 몰 농도에 기초한 보정 곡선으로부터 도출된다. 일부 실시 형태에서, 비율은 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 수를 기준으로 계산된다.
일부 실시 형태에서, 정제된 전체 rAAV 입자 내에 전체 입자 대 비-전체 입자의 비율은 9:1 이상, 바람직하게는 49:1 이상이다.
본 출원의 치환 크로마토그래피 방법은 정제된 전체 입자의 높은 수율/회수율도 또한 달성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 정제된 전체 rAAV 입자의 수율이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "수율"은 초기 rAAV 제제 중의 전체 rAAV 입자에 대한 정제된 제제 중의 전체 rAAV 입자의 백분율 또는 비율을 의미한다. 수율을 계산하는 방법은 여러 가지가 있다. 수율을 계산하는 한 가지 방법은 백분율(%) = (정제된 제제 중의 전체 rAAV 입자의 양) / (초기 rAAV 제제 중의 전체 rAAV 입자의 양)에 100을 곱하는 것이다. 백분율을 계산하는 또 다른 방법은 정제된 제제 중의 전이유전자 사본 수를 초기 제제 중의 전이유전자의 사본 수로 나누고 100을 곱하는 것이다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 출원은 전체 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(a). 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자를 포함하는 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(b). 로딩 완충액 중의 rAAV 제제를 크로마토그래피 매질을 포함하는 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 로딩 완충액은 CaCl2를 포함하고, 전체 rAAV 입자는 크로마토그래피 매질에 결합하는, 단계; 및
(c). 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 정제된 제제를 수득하는 단계로서, 여기서 용리 완충액이 CaCl2를 선택적으로 포함하는 단계;
를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 크로마토그래피 매질이 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 매질이다.
일부 실시 형태에서, 컬럼 크로마토그래피 매질이 Poros HQ, Poros PD, 폴리에틸렌이민 (PI), Capto ImpRes Q, 및 Poros XQ로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 Poros XQ이다.
일부 실시 형태에서, 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하지 않는다.
일부 실시 형태에서, 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 제1 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자가 제1 컬럼으로부터 제1 로드 통과액 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 빈 입자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 부분 입자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 비-전체 입자는 빈 입자 및 부분 입자 양자 모두를 포함한다.
본 출원의 실시 형태에 따르면, 로딩 완충액 중의 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +으로 구성되는 군으로부터 선택된 양이온 염의 첨가는 크로마토그래피 매질에 대한 친화도 차이를 증가시킬 수 있어, 더 많은 전체 rAAV 입자가 크로마토그래피 매질에 결합하는 반면, 더 적은 비-전체 입자가 크로마토그래피 매질에 결합하도록 한다. 따라서, 컬럼으로부터 로드 통과액에는 전체 입자가 덜 포함되어, 이에 따라 전체 입자의 회수율이 증가한다. 주어진 염의 음이온 성분은 결정적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 0-10 mM 칼슘 염, 예컨대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 칼슘 염의 농도는 약 0.1-2.5 mM 사이, 예컨대 0.1, 0.5, 1.0. 1.5, 2.0, 2.5 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 0-100 mM 리튬 염, 예컨대 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 리튬 염의 농도는 약 0-75 mM 사이, 예컨대 0, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 20-50 mM 농도, 예컨대 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도에서 선택된 완충액을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 로딩 완충액은 20-50 mM 트리스를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 나트륨 염 및/또는 마그네슘 염을 더 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 로딩 완충액은 나트륨 염과 마그네슘 염을 양자 모두 더 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 10-100 mM 나트륨 염, 예컨대 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 나트륨 염의 농도는 약 20-60 mM 사이, 예컨대 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 0-20 mM 마그네슘 염, 예컨대 0, 5, 10, 15, 20 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 마그네슘 염의 농도는 약 1-10 mM 사이, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 약 6-10의 pH, 예컨대 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 또는 이들 사이의 임의의 pH, 바람직하게는 약 8-9의 pH를 갖는다.
특정 실시 형태에서, 로딩 완충액은 바람직하게는 트리스 중의, 더욱 바람직하게는 20-50 mM 트리스 중의, 약 20-60 mM NaCl, 1-5 mM MgCl2, 0.1-2.5 mM CaCl2을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 로딩 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
로딩 단계 후, 전체 입자는 크로마토그래피 매질에 결합되고, 비-전체 입자는 통과액에서 컬럼을 빠져나간다. 컬럼은 적합한 세척 완충액으로 선택적으로 세척될 수 있다. 예를 들어, 세척 완충액은 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자를 제거하기 위해, 로딩 조건과 비교하여 용리를 위한 증가된 염 농도 및/또는 증가된 pH를 가질 수 있다.
이어서, 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 입자는 예를 들어 로딩 조건과 비교하여 증가된 염 농도 및/또는 용리를 위해 조정된 pH를 사용하여 더 순수한 형태로 후속적으로 용리된다. pH를 조정하면 전체 입자 및 비-전체 rAAV 입자의 분리를 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 전체 입자의 용리는 pH를 증가시키지 않고, 염 구배만으로도 달성된다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 예를 들어, 용리 완충액은 하나 이상의 염을 포함할 수 있고, 바람직하게는 NaCl, MgCl2, LiCl, CuCl2 및 CaCl2으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 염의 음이온 성분은 결정적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함한다. 예를 들어, 로딩 완충액은 하나 이상의 염을 포함할 수 있고, 바람직하게는 NaCl, MgCl2, LiCl, CuCl2 및 CaCl2로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0.1-20 mM 칼슘 염, 예컨대 0.1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 칼슘 염의 농도는 약 5-10 mM 사이, 예컨대 5, 6, 7, 8, 9, 10 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액이 약 0-200 mM 리튬 염, 예컨대 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 리튬 염의 농도는 약 0-150 mM 사이, 예컨대 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 로딩 완충액은 선택된 완충액을 약 20-70 mM 농도, 예컨대 20 mM, 30mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도에서 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 로딩 완충액은 40-60 mM 트리스를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제가 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 나트륨 염 및/또는 마그네슘 염을 더 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 로딩 완충액은 나트륨 염과 마그네슘 염을 양자 모두 더 포함한다. 염의 음이온 성분은 결정적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 약 0-1000 mM 나트륨 염, 예컨대 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 나트륨 염의 농도는 약 20-150 mM 사이, 예컨대 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 약 0-30 mM 마그네슘 염, 예컨대 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 마그네슘 염의 농도는 약 2-15 mM 사이, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 mM, 또는 이들 사이의 임의의 농도이다.
일부 실시 형태에서, 용리 완충액은 약 6-10의 pH, 예컨대 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 또는 이들 사이의 임의의 pH, 바람직하게는 약 8-9의 pH를 갖는다.
특정 실시 형태에서, 용리 완충액은 바람직하게는 트리스 중의, 더욱 바람직하게는 40-60 mM 트리스 중의, 약 20-150 mM NaCl을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 정제된 제제는 비-전체 입자가 실질적으로 없다. 다른 실시 형태에서, 정제된 제제는 rAAV 제제 보다 전체 rAAV 입자 대 비-전체 입자의 증가된 비율을 포함한다. 바람직하게는, 정제된 제제 중의 전체 rAAV 입자 대 비-전체 입자의 비율은 9:1 이상, 예컨대 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1 또는 50:1, 또는 이들 사이의 임의의 비율이고, 더욱 바람직하게는 49:1 이상이다.
본 출원의 실시 형태에 따르면, 정제된 제제 중의 전체 rAAV 입자 대 비-전체 입자의 비율은 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 수에 의해 계산될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 비율은 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 몰 농도에 기초한 보정 곡선으로부터 도출된다. 일부 실시 형태에서, 비율은 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 수를 기준으로 계산된다.
일부 실시 형태에서, 정제된 전체 rAAV 입자 중의 전체 입자 대 비-전체 입자의 비율은 9:1 이상, 바람직하게는 49:1 이상이다.
일부 실시 형태에서, 정제된 전체 rAAV 입자의 수율이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "수율"은 초기 rAAV 제제 중의 전체 rAAV 입자에 대한 정제된 제제 중의 전체 rAAV 입자의 백분율을 의미한다. 예를 들어, 백분율로서, 수율 (%) = (정제된 제제 중의 전체 rAAV 입자의 양) / (초기 rAAV 제제 중의 전체 rAAV 입자의 양)이다.
하기 실시 형태들은 전술한 일반적인 측면들을 포함하여, 본원에 개시된 일반적인 측면 각각에 적용된다.
일부 실시 형태에서, 전체 rAAV 입자가 폴리펩티드를 인코딩하는 전이유전자, 단백질을 인코딩하거나 관심 있는 전사체로 전사되는 핵산, 또는 siRNA, 안티센스 분자, miRNA 리보자임 및 shRNA로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산을 포함한다.
본원에 개시된 다양한 실시 형태는 캡시드의 공급원 또는 혈청형에 관계없이 이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 결합할 수 있는 임의의 rAAV 또는 AAV 캡시드, 입자, 불순물 또는 응집체에 적용 가능하다. 본 개시의 방법은 이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 결합할 수 있는 임의의 AAV 또는 rAAV 캡시드에 적용 가능하기 때문에, 캡시드는 임의의 공급원, 예를 들어 인간, 조류, 소, 개, 말, 영장류, 비영장류, 양 또는 그로부터 유래된 것 일 수 있다.
일부 실시 형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, Rh8, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, LK03, RHM4-1, DJ, DJ8, NP59, Anc-80 및 이들의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 AAV로부터 유래되며, 문헌 [Pulicherla et al., Mol. Ther., 19(6) 1070-1078 (2011)](특히 AAV9.47을 포함하는 AAV9 변이체를 기재함), 미국 특허 번호 7,906,111호(특히 AAV9(hu14) 기재함), 10,532,111호(특히 NP59를 기재함), 10,738,087호(특히 Anc-80을 기재함), 9,169,299호("LK03"을 기재함), 9,840,719호("RHM4-1"을 기재함), 7,749,492호, 7,588,772호("DJ" 및 "DJ8"을 기재함), 9,587,282호 및 특허 출원 WO2012/145601호, WO2013/158879호, WO2015/013313호, WO2018/156654호, US2013/0059732호에 설명된 AAV 캡시드의 변이체를 포함하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되고, 펩티드 변형이 있는 AAV 캡시드, 예컨대 세포 표적화 펩티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 전체 rAAV 입자는 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬 (GH), 부갑상선 호르몬 (PTH), 성장 호르몬 방출 인자 (GRF), 여포 자극 호르몬 (FSH), 황체 형성 호르몬 (LH), 인간 융모성 생식샘 자극 호르몬 (hCG), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 안지오포이에틴, 안지오스타틴, 과립구 집락 자극 인자 (GCSF), 에리스로포이에틴 (EPO), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 염기성 섬유모 세포 성장인자 (bFGF), 산성 섬유모 세포 성장인자(aFGF), 표피 성장 인자 (EGF), 형질 전환 성장 인자 a (TGFa), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II (IGF-I 및 IGF-II), TGFp, 액티빈, 인히빈, 골형성 단백질 (BMP), 신경 성장 인자 (NGF), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 신경영양 인자 NT-3 및 NT4/5, 섬모 신경 영양인자 (CNTF), 신경교 세포주 유래 신경 영양 인자(GDNF), 뉴투린, 아그린, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자(HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지호그 및 티로신 히드록시아제로 구성되는 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 인코딩하는 전이유전자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 전체 rAAV 입자는 트롬보포이에틴 (TPO), 인터루킨 (IL1 내지 IL-17), 단핵구 화학유인 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β, 및 γ, 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 구성되는 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 인코딩하는 전이유전자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 전체 rAAV 입자는 카르바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기노숙시네이트 합성 효소, 아르기노숙시네이트 분해 효소, 아르기나아제, 푸마릴아세트아세테이트 가수분해효소, 페닐알라닌 수산화효소, 알파-1 항트립신, 글루코오스-6-포스파타아제, 포르포빌리노겐 데아미나아제, 제V 인자, 제VIII 인자, 제IX 인자, 시스타티온 베타-합성효소, 분지형 사슬 케토산 탈탄산효소, 알부민, 이소발레릴-coA 탈수소효소, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타아제, 글루타릴 CoA 탈수소효소, 인슐린, 베타-글루코시다아제, 피루브산 카복실화효소, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나아제, 글리신 탈탄산효소, RPE65, H-단백질, T-단백질, 섬유증 막횡단 조절인자(CFTR) 서열 및 디스트로핀 cDNA 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 선천적 대사 오류의 교정에 유용한 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 전체 rAAV 입자는 제VIII 인자 및 제IX 인자를 인코딩하는 전이유전자를 포함한다.
본 출원의 실시 형태에 따른 방법에 의해 정제될 관심 있는 전체 rAAV 입자는 숙주 세포에 의해 생산될 수 있다. 초기 단계로서, 일반적으로 rAAV 비리온을 생산하는 숙주 세포는 선택적으로 rAAV 비리온을 생산하는 숙주 세포(현탁액 또는 부착체)가 배양된 세포 배양 상층액(배지)을 수확하는 것과 조합하여 수확할 수 있다. 본원의 방법에서, 수확된 세포 및 선택적으로 세포 배양 상층액은 적절하게 그대로 사용되거나 또는 농축될 수 있다. 또한, 부속 기능을 발현하기 위해 감염을 사용하는 경우, 잔류 헬퍼 바이러스가 비활성화될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 대략 60℃의 온도로 예를 들어 20분 이상 가열함으로써 불활성화될 수 있는데, 이것은 AAV가 열에 안정하고 헬퍼 아데노바이러스는 열에 불안정하기 때문에 헬퍼 바이러스만을 불활성화시킨다.
세포 및/또는 수확물의 상청액은 예를 들어, 화학적 또는 물리적 수단에 의해, 예컨대 세제, 미세유동화 및/또는 균질화로 세포를 파괴하여 rAAV 입자를 방출함으로써 용해된다. 세포 용해 동안 동시에 또는 세포 용해 이후에 후속적으로 뉴클레아제, 예컨대 벤조나아제를 첨가하여 오염된 DNA를 분해할 수 있다. 전형적으로, 생성된 용해물은 세포 잔해를 제거하기 위해 예컨대 여과, 원심분리로 정화되어, 정화된 세포 용해물을 제공한다. 특정 예시에서, 용해물은 마이크론 직경의 기공 크기 필터(예컨대 0.1-10.0μm 기공 크기 필터, 예를 들어 0.45μm 및/또는 기공 크기 0.2μm 필터)로 여과되어 정화된 용해물을 생산한다.
용해물(선택적으로 정화됨)은 AAV 입자(전체 rAAV 입자 및 AAV 비-전체 입자) 및 AAV 벡터 생산/공정 관련 불순물, 예컨대, 그 중에서도 세포 단백질, 지질 및/또는 핵산 및 세포 배양 배지 성분을 포함할 수 있는 숙주 세포로부터의 가용성 세포 성분이다. 선택적으로 정화된 용해물은 크로마토그래피를 사용하여 불순물로부터 전체 AAV 입자를 정제하기 위한 추가 정제 단계를 거친다. 정화된 용해물은 본 출원의 크로마토그래피 방법 전에 적절한 완충액으로 희석하거나 풍부화할 수 있다.
실시예
실시예 1. 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 분리를 위한 수지 스크리닝
본 실시예에서는, 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 분리를 위한 최상의 수지를 확인하기 위해 다양한 수지들을 스크리닝하였다.
방법 및 재료
샘플은 비-전체 입자 및 전체 RHM4-1 rAAV 입자를 2.4:1의 비율(즉, 70% 불순물/30% 생성물)로 함유하였다. 컬럼 크기는 0.353mL(3mm x 50mm)이었다. 수지 스크리닝은 펄스 로딩(결합 능력의 10%) 및 1분의 체류 시간을 사용하여 수행되었다. 스크리닝 동안, 3개의 pH 값(8.0, 8.6, 9.25)과 염과의 3개의 결합 강도(6.8, 5, 및 1.6 mS/cm)를 테스트했다. 로딩 완충액은 50mM 트리스 또는 25mM 트리스였다. 컬럼으로부터 통과액 유출물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하여, 전체 입자 및 비-전체 입자의 분리를 측정하였다.
결과
Poros 50 HQ 수지 (Thermo Scientific;POROS™ - (Waltham, MA)) : 이 수지는 4차화 폴리에틸렌이민 작용기 일부 약한 음이온 교환(AEX) 작용기를 기반으로 한다. 도 1a-도 1c에 도시된 바와 같이, Poros 50 HQ 수지 상의 전체 입자 및 비-전체 입자의 분리는 50mM 트리스 및 30mM NaCl 하에서 3개의 pH 값 모두에서 크게 다르지 않은 반면, pH 8.6에서의 분리는 다른 2개의 pH 값에 비해 약간 더 나았다.
Poros 50 D 수지 : 이 수지는 디메틸아미노프로필 작용기를 기반으로 한다. 도 2a-도 2d에 도시된 바와 같이, Poros 50 D 수지에 대한 rAAV 입자의 결합은 스크리닝 조건 하에서 적었고, pH가 증가함에 따라 감소하였다. 도면에는 다양한 로딩 완충액이 사용되었다: pH 8.6 및 50 mM 트리스 (도 2a), pH 8.6 및 25 mM 트리스 (도 2b), pH 8.0 및 25 mM 트리스 (도 2c), 및 pH 9.25 및 25 mM 트리스 (도 2d).
Poros 50 PI 수지 : 이 수지는 폴리에틸렌이민 작용기를 기반으로 한다. 도 3a-도 3e에 도시된 바와 같이, Poros 50 PI 수지에 대한 rAAV 입자의 결합은 pH가 증가함에 따라 감소하였다. 또한 NaCl을 첨가하면 분리능이 약간만 향상되는 것으로 나타났다. 도면은 다양한 pH 및 염 농도에서 Poros 50 PI 수지를 평가하였다: NaCl이 없는 pH 8.0(도 3a), NaCl이 없는 pH 8.6(도 3b), pH 8.6 및 30mM NaCl(도 3c), NaCl이 없는 pH 9.2(도 4c), 및 pH 9.2 및 30 mM NaCl(도 3e).
Capto ImpRes Q 수지 : 이 수지는 이온성 기의 리간드를 갖는 Capto™ (Cytiva Life Sciences - Marlborough, MA) 아가로오스계 매트릭스를 사용한다. 도4a-도 4c에 도시된 바와 같이, Capto ImpRes Q 수지에 대한 rAAV 입자의 결합은 pH가 증가함에 따라 증가하였다. 그러나, 스크리닝 조건 하에서 Capto ImpRes Q 수지의 전체 입자 및 비-전체 입자의 분리는 적었다. 도면은 다양한 완충액들을 사용하여 다양한 pH 값에서 Capto ImpRes Q 수지를 평가하였다: NaCl이 없는 pH 8.0 및 50nm 트리스(도 4a), NaCl이 없는 pH 8.6 및 25mM 트리스(도 4b), 및 NaCl이 없는pH 9.0 및 30mM 트리스(도 4c).
Poros XQ 수지 : 이 수지는 독점적인 4차 아민 작용기를 기반으로 한다. 스크리닝을 통해 Poros XQ 수지가 전체 입자 및 비-전체 입자를 분리하는데 가장 적합한 것으로 입증되었다. 도 5에 도시된 바와 같이, 다른 pH 값(pH 8 및 9.25)에 비해 pH 8.75에서 가장 분리가 잘 되었다. 도 6에 도시된 바와 같이, 결합 염도 또한 분리에 영향을 미쳤다. 또한, 도 7에 도시된 바와 같이, pH 8.75에서 수행한 경우 서로 다른 유속(84cm/h, 150cm/h 및 300cm/h) 하에서 분리가 유사하였다.
실시예 2. Poros XQ 수지를 이용한 치환 크로마토그래피의 최적화
본 실시예에서는, Poros XQ 수지 상의 전체 RHM4-1 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 치환 크로마토그래피 분리를 위한 최적의 조건을 확인하기 위해 다양한 조건을 스크리닝하였다.
도 8a는 샘플이 pH 8.6의 30 mM 트리스에 로딩되고 로딩량이 낮을 경우, 유출물의 HPLC 분석에서 2개의 생성물 피크가 있음을 나타내었다. 2개의 피크 중에서, 비-전체 입자 대 전체 입자(E/F)는 피크 P1에서 9.9인 반면, 피크 P2에서는 E/F의 비율이 0.8이었다. 이것은 Poros XQ 수지에 결합된 비-전체 입자의 친화도가 수지에 결합한 전체 입자의 친화도 보다 약하여, 이에 따라 비-전체 입자가 전체 입자 보다 먼저 용리되었음을 나타내었다.
그에 반해서, 샘플을 결합 능력을 초과하는 양으로 로딩한 경우, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 통과액 (FT)에서의 E/F 비율이 파과에서 2.4이었다. 도 8b는 로드에 30mM NaCl을 첨가하는 것이 치환을 촉진시키는데 충분하지 않았음을 입증하였다. 따라서, 통과액의 E/F 비율은 로드의 E/F 비율과 동일하다.
그 다음으로, 치환 컬럼 크로마토그래피 하에서 비-전체 입자 및 전체 입자의 더 우수한 분리를 위한 최적의 염 농도를 확인하기 위해 다양한 염 농도에서의 다양한 결합 강도를 스크리닝하였다. 도 9a 및 도 9b에 도시된 바와 같이, 로딩 완충액 중의 NaCl 농도를 각각 45 mM에서 60 mM로 증가시키면, 통과액에서의 E/F 비율이 3.4에서 229로 증가하였는데, 이것은 더 높은 염 농도에서, 전체 입자에 의한 비-전체 입자의 더 큰 치환을 나타낸다. 동시에, 생성물 피크 P2의 순도는 E/F=1로부터 E/F=0.7로 향상되었다.
그러나, 염 농도를 75mM 및 90mM로 더 증가시키는 경우, 치환이 더 이상 향상되지 않았으며, 이것은 도 9c 및 도 9d에 각각 도시된 바와 같이, 수지에 대한 샘플의 전체 친화도가 감소했기 때문이다. 따라서, 도 9a-도 9d는 비-전체 입자 및 전체 입자의 결합 친화도 차이가 가장 두드러지는, 중간 결합 강도에서 최적의 치환이 발생했음을 나타낸다. 보다 일반적으로, 결과는 염 농도에 따라 조정 가능한 결합 강도가 비-전체 입자의 치환을 촉진하는 핸들로서 사용될 수 있으며, 이로 인해 분해능이 향상될 수 있음을 나타낸다.
또한, 용리 완충액 중의 염의 범위를 측정하기 위해 단계 용리 조건도 또한 테스트하였다. 테스트에 사용된 로딩 완충액은 50 mM 트리스 pH 8.5 및 30mM NaCl이 포함되어있다. 도 10a-도 10d에 도시된 바와 같이, 단계 용리는 각각 60mM, 75mM, 90mM 및 120mM 농도의 NaCl을 사용하여 테스트된 모든 용리 완충액에 대해 작동하였다.
이 실시예에서는 추가 치환도 또한 연구되었다. 도 11a-도 11b에 도시된 바와 같이, 파과 로드를 초과하여 더 많은 샘플이 로딩되는 경우, 추가의 치환이 발생하였으며, 여기서 컬럼의 바닥 부분에 결합된 비-전체 입자도 또한 전체 입자에 의해 치환되어 통과액으로 빠져나갔다. 도 11b는 정제된 제제 중의 rAAV의 순도가 추가 치환으로 인해 거의 100%로 향상되었음을 나타낸다. 또한, 추가 치환 크로마토그래피를 통해 90% 이상의 높은 수율로 정제된 전체 입자를 또한 얻을 수 있었다.
실시예 3. 샘플 로드 및 세척 완충액 중의 첨가제로서 CaCl
2
의 사용
Poros XQ 수지를 사용하여 전체 RHM4-1 rAAV 입자 및 비-전체 입자를 분리하는 연구에서, 치환 크로마토그래피 정제에서 생성물 손실이 나타났다. 예를 들어, 파과 수행에서, 로딩 완충액이 pH 8.5에서 50mM 트리스/60mM NaCl인 경우, 회수 수율은 단일 컬럼 공정에 대해서는 89.81%, 제안된 2-컬럼 공정에 대해서는 74.92%이었다. 손실은 주로 통과액에 전체 입자가 존재하기 때문에 발생하는 것으로 보여진다. 샘플 로드 또는 세척 완충액 중에 첨가제를 첨가하여 분해능을 개선시키고, 통과액에서 전체 rAAV 입자의 양을 감소시켜, 이에 따라 회수율을 증가시키기 위해 연구되었다.
샘플 로드 중에 MgCl2를 첨가하는 것은 먼저 도 12에 도시된 바와 같이 테스트되었다. MgCl2는 분해능을 향상시키기 위한 첨가제로 사용될 수 있다. 그러나 후속 세척 단계에서는 컬럼에 결합된 비-전체 입자를 세척하기 위해 MgCl2의 농도를 높여야 했다. 샘플 로드 중에 MgCl2를 첨가하는 것은 비결합 조건에서도 확고하지 않은 것으로 나타났는데, 그 이유는 로드 완충액과 용리 완충액 사이의 전도도 차이가 단지 약 1 mS/cm에 불과했기 때문이다.
다른 첨가제도 또한 테스트되었다. CaCl2는 Poros XQ 수지 상의 정제에 대하여 최상의 통과액을 제공하는 첨가제로서 확인되었다. 도 13에 도시된 바와 같이, CaCl2를 첨가하면 비-전체 입자 및 전체 rAAV 입자의 분리가 향상되었다. 또한, CaCl2를 사용하면, 로드 완충액과 용리 완충액 사이의 전도도 차이가 예를 들어, 약 4mS/cm로 확고해졌다.
또한, CaCl2가 샘플 로드에 첨가되지 않은 경우, 비-전체 입자로부터 전체 rAAV 입자의 정제에서 수율과 생성물 순도가 양자 모두 손상되는 것으로 나타났다. 도 15에 도시된 바와 같이, 샘플 로드에 NaCl 이외의 첨가물을 사용하지 않고, 세척 완충액에 1 mM CaCl2 및 2.5 mM MgCl2가 포함되어 있는 경우, 컬럼에 결합된 모든 비-전체 입자를 세척을 통해 제거하기가 어려웠다. 더욱이, CaCl2 농도가 증가된 후속적인 용리 동안에(도 15), 결합된 비-전체 입자는 수지 상에서 불안정한 것으로 나타났고, 결과적으로 생성물 순도에 영향을 미치는 신규한 불순물을 생성하였다.
따라서, 본 발명자들은 놀랍게도 샘플 로드, 바람직하게는 또한 세척 완충액 및 용리 완충액 중에 CaCl2를 첨가하는 것이, 최적의 분리 및 향상된 수율을 초래한다는 것을 발견하였다.
실시예 4. 샘플 로드 및 세척 완충액 중의 첨가제로서 LiCl의 사용
염화리튬은 Poros XQ 수지 상의 정제를 위해 테스트된 또 다른 첨가제이다. 도 17에 도시된 바와 같이, LiCl의 첨가는 비-전체 입자 및 전체 RHM4-1 rAAV 입자의 분리를 향상시켰다. 또한, LiCl을 사용한 경우, 로드 완충액과 용리 완충액 사이의 전도도 차이가 약 0.2 mS/cm로 나타났다.
실시예 5. 샘플 로드 및 세척 완충액에 CaCl
2
를 첨가한 치환 크로마토그래피의 분리 및 수율에서의 향상된 개선
실시예 3 및 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 로딩 완충액 중의, 선택적으로 세척 완충액 및 용리 완충액 중의, CaCl2와 같은 첨가제의 사용으로부터 비-전체 입자 및 전체 RHM4-1 rAAV 입자의 향상된 분리가 실시예 2에 나타낸 치환 크로마토그래피 방법과 함께 또한 사용될 수 있다. 도 18에 도시된 바와 같이, 합쳐진 이러한 방법은 비-전체 입자 이상으로 전체 rAAV 입자의 최적 분리 및 수율을 제공할 것이다.
실시예 6. 첨가제를 사용한 분리 및 pH 감소에서의 향상된 개선.
실시예 3 및 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 로딩 완충액 중의, 선택적으로 세척 완충액 및 용리 완충액 중의, CaCl2와 같은 첨가제의 사용으로부터 비-전체 입자 및 전체 RHM4-1 rAAV 입자의 향상된 분리가 도 19에 도시된 바와 같이 구배 또는 단계 용리와 함께 pH를 감소시킴으로써 향상될 수 있다.
실시예 7. 첨가제 (NH
4
)
2
SO
4
를 사용한 분리에서의 향상된 개선.
PXQ 수지 상의 빈 RHM4-1 rAAV 입자 및 전체 RHM4-1 rAAV 입자의 향상된 분리는 도 20a-도 20b에 도시된 바와 같이 로딩 완충액 중의 첨가제로서 (NH4)2SO4를 사용함으로써 달성될 수 있다.
실시예 8. 첨가제 (NH
4
)
2
SO
4
를 사용한 분리에서의 향상된 개선.
BIA 모놀리식 수지 상의 빈 RHM4-1 rAAV 입자 및 전체 RHM4-1 rAAV 입자의 향상된 분리는 도 21에 도시된 바와 같이 로딩 완충액 중의 첨가제로서 (NH4)2SO4를 사용함으로써 달성될 수 있다.
실시예 9. 첨가제 CuCl
2
를 사용한 분리에서의 향상된 개선.
PXQ 수지 상의 빈 RHM4-1 rAAV 입자 및 전체 RHM4-1 rAAV 입자의 향상된 분리는 도 22a-도 22e에 도시된 바와 같이 로딩 완충액 중의 첨가제로서 CuCl2를 사용함으로써 달성될 수 있다.
실시예 10. CuCl
2
를 사용한 부분 입자의 분리에서 그리고 더 낮은 pH 및 증가된 염을 사용한 용리에서의 향상된 개선.
로딩 완충액 중의, CuCl2와 같은 첨가제의 사용으로부터 빈 LK03 rAAV 입자, 부분 LK03 rAAV 입자, 및 전체 LK03 rAAV 입자의 향상된 분리가 도 23a-도 23e에 도시된 바와 같이 증가한 염으로 구배 또는 단계 용리와 함께 더 낮은 pH에서의 용리에 의해 향상될 수 있다.
실시예 11. 다중 컬럼을 사용한 부분 입자의 분리에서의 향상된 개선.
2개의 컬럼을 사용하여 관찰된 빈 LK03 rAAV 입자, 부분 LK03 rAAV 입자 및 전체 LK03 rAAV 입자의 향상된 분리는 도 24-도 26에 도시된 바와 같이, 적어도 3개의 컬럼을 사용하여 향상될 수 있다. 이 방법은 도 25에 나타낸 것처럼 전체 입자 보다 컬럼에 대한 더 강한 친화도를 갖는 불순물 및 응집체를 제거하는데 사용될 수 있다. 이 2개의 컬럼 셋업에서, 제2 컬럼은, 제1 컬럼에 결합된 전체 입자보다 컬럼에 대한 더 강한 친화도를 갖는 응집체와 불순물로서 전체 입자로 풍부화된다. 다중 컬럼 셋업에서, 제1 컬럼은 가장 강한 결합 입자(가장 높은 머무름 시간)로 풍부화되는 반면, 후속 컬럼은 그 다음으로 강한 결합 입자로 풍부화된다. 표적 rAAV 입자 또는 불순물이 가장 큰 친화도를 갖는 컬럼을 결정할 때, 원하는 rAAV 입자 또는 불순물을 정제하기 위하여 상기 개시된 방법을 사용할 수 있다. 이 실시예는 다중 컬럼 셋업에 대한 다양한 입자 변이체를 풍부화하기 위해 개시된 방법의 사용을 추가로 나타내었다.
본원에 기재된 실시예 및 실시 형태는 단지 예시를 위한 것이며, 광의의 발명의 개념을 벗어나지 않고 상기에 기재된 실시 형태에 대한 변경이 이루어질 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들어, 본 발명의 개념은 빈 입자로부터 부분 입자를 분리하거나, 또는 도 25에 도시된 바와 같이, 전체 입자 보다 수지에 대한 친화도가 더 강한 불순물을 분리하여, 제1 컬럼과는 대조적으로 전체 입자를 갖는 제2 컬럼을 풍부화시키는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 실시 형태에 한정되지 않으며, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 것으로서 본 발명의 사상 및 범위 내에서 변형을 포함하도록 의도된다는 것이 이해된다.
Claims (74)
- 전체(full) 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은
(a). 전체 rAAV 입자 및 비-전체(non-full) rAAV 입자를 포함하는 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(b). 로딩 완충액 중의 rAAV 제제를 크로마토그래피 매질을 포함하는 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 전체 rAAV 입자는 비-전체 입자 보다 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 결합 친화도를 가지며, 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 크로마토그래피 매질의 결합 능력(binding capacity)을 초과하여, 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자가 컬럼으로부터 통과액(flowthrough) 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환(displaced)되도록 하는, 단계; 및
(c). 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 정제된 제제를 수득하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 청구항 1에 있어서,
여기서 크로마토그래피 매질이 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 매질인, 방법. - 청구항 2에 있어서,
여기서 컬럼 크로마토그래피 매질이 Poros 50 HQ, Poros 50 D, Poros 50 PI, Capto ImpRes Q, CIMmultus™ QA 모놀리식 컬럼(Monolithic Column) 및 Poros XQ로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 Poros XQ인, 방법. - 전체 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은
(a). 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자를 포함하는 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(b). 로딩 완충액 중의 rAAV 제제의 제1 배치(batch)를 제1 크로마토그래피 매질을 포함하는 제1 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 전체 rAAV 입자는 비-전체 입자 보다 제1 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 결합 친화도를 가지며, 제1 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 제1 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 제1 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자가 제1 컬럼으로부터 제1 로드 통과액 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 하는, 단계;
(c). 제1 로드 통과액을 제2 크로마토그래피 매질을 포함하는 제2 컬럼에 로딩하여, 로딩되거나 또는 부분적으로 로딩된 제2 컬럼을 수득하는 단계로서, 여기서, 제2 크로마토그래피 매질은 제1 크로마토그래피 매질과 동일한 유형인, 단계;
(d). 선택적으로, 제1 컬럼을 세척 완충액으로 세척하여, 세척된 제1 컬럼을 수득하는 단계;
(e). 제1 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 제1 컬럼 및 용리된 제1 컬럼으로부터 제1 용출액(first eluate)을 수득하는 단계로서, 여기서, 제1 용출액은 전체 rAAV 입자 대 비-전체 rAAV 입자의 증가된 비율을 포함하는, 단계;
(f). 선택적으로, 로딩 완충액 중의 rAAV 제제의 제2 배치를 적어도 부분적으로 로딩된 제2 컬럼에 적용하는 단계로서, 여기서 제2 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 제2 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 제2 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자가 제2 컬럼으로부터 제2 로드 통과액 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 하는, 단계;
(g). 선택적으로, 제2 컬럼으로부터 제2 로드 통과액을 단계 (e) 이후에 용리된 제1 컬럼에 로딩하여, 제2 로딩된 제1 컬럼을 수득하고, 선택적으로 단계 (e)에서 용리를 계속하기 전에 제2 로딩된 제1 컬럼을 세척하는 단계;
(h). 선택적으로, 제2 컬럼을 세척 완충액으로 세척하여, 세척된 제2 컬럼을 수득하는 단계;
(i). 제2 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 제2 용출액 및 용리된 제2 컬럼을 수득하는 단계로서, 여기서, 제2 용출액은 전체 rAAV 입자 대 비-전체 rAAV 입자의 증가된 비율을 포함하는, 단계; 및
(j). 제1 용출액 및 제2 용출액을 합쳐서(combining) 전체 rAAV 입자의 정제된 제제를 생산하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 청구항 4에 있어서,
여기서 제1 크로마토그래피 매질 및/또는 제2 크로마토그래피 매질이 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 매질인, 방법. - 청구항 4 또는 청구항 5에 있어서,
여기서 단계 (b) 내지 단계 (i)는 하나 이상의 사이클로 수행되는, 방법. - 청구항 4 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 제2 컬럼이 단계 (c) 이후에 부분적으로 로딩되는, 방법. - 청구항 4 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 제1 컬럼 크로마토그래피 매질이 Poros 50 HQ, Poros 50 D, Poros 50 PI, Capto ImpRes Q, CIMmultus™ QA 모놀리식 컬럼 및 Poros XQ로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 Poros XQ인, 방법. - 전체 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은
(a). 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자를 포함하는 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(b). 로딩 완충액 중의 rAAV 제제의 제1 배치를 제1 크로마토그래피 매질을 포함하는 제1 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 전체 rAAV 입자는 비-전체 입자 보다 제1 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 결합 친화도를 가지며, 제1 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 제1 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 제1 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자가 제1 컬럼으로부터 제1 로드 통과액 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 하는, 단계;
(c). 제1 로드 통과액을 제2 크로마토그래피 매질을 포함하는 제2 컬럼에 로딩하여, 로딩되거나 또는 부분적으로 로딩된 제2 컬럼을 수득하는 단계로서, 여기서, 제2 크로마토그래피 매질은 제1 크로마토그래피 매질과 동일한 유형인, 단계;
(d). 선택적으로, 제1 컬럼을 세척 완충액으로 세척하여, 세척된 제1 컬럼을 수득하는 단계;
(e). 제1 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 제1 컬럼 및 용리된 제1 컬럼으로부터 제1 용출액을 수득하는 단계로서, 여기서, 제1 용출액은 전체 rAAV 입자 대 비-전체 rAAV 입자의 증가된 비율을 포함하는, 단계;
(f). 선택적으로, 로딩 완충액 중의 rAAV 제제의 제2 배치를 적어도 부분적으로 로딩된 제2 컬럼에 적용하는 단계로서, 여기서 제2 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 제2 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 제2 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자가 제2 컬럼으로부터 제2 로드 통과액 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 하는, 단계;
(g). 제2 컬럼으로부터 제2 로드 통과액을 제3 크로마토그래피 매질을 포함하는 제3 컬럼에 로딩하여, 로딩되거나 또는 부분적으로 로딩된 제3 컬럼을 수득하는 단계로서, 바람직하게는, 제3 크로마토그래피 매질은 제1 크로마토그래피 매질과 동일한 유형인, 단계;
(h). 선택적으로, 제2 컬럼을 세척 완충액으로 세척하여, 세척된 제2 컬럼을 수득하는 단계;
(i). 단계 (k) 이후 또는 세척 단계 (l)이 수행되는 경우 세척 단계 (l) 이후에, 제1 컬럼을 바이패싱(bypassing)하고, 제2 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 제2 용출액 및 용리된 제2 컬럼을 수득하는 단계로서, 여기서 제2 용출액은 전체 rAAV 입자 대 비-전체 rAAV 입자의 증가된 비율을 포함하는, 단계;
(j). 선택적으로, 제3 컬럼이 제2 컬럼 통과액 이후에 포화(즉, 로딩)되지 않은 경우, 로딩 완충액 중의 rAAV 제제의 제3 배치가 부분적으로 로딩된 제3 컬럼에 적용될 수 있으며, 여기서 제3 컬럼에 적용된 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자의 양이 제3 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 제3 크로마토그래피 매질에 결합된 비-전체 입자가 제3 컬럼으로부터 제3 로드 통과액 내로 전체 rAAV 입자에 의해 치환되도록 하는, 단계;
(k). 단계 (n)이 수행되는 경우, 제3 컬럼으로부터 제3 로드 통과액을 단계 (d)와 단계 (e) 사이에 세척된 제1 컬럼에 로딩하여, 제2 로딩된 제1 컬럼을 수득하고, 선택적으로 단계 (e)에서 용리를 계속하기 전에 제2 로딩된 제1 컬럼을 세척하는 단계;
(l). 선택적으로, 제3 컬럼을 세척 완충액으로 세척하여, 세척된 제3 컬럼을 수득하는 단계;
(m). 제1 컬럼 및 제2 컬럼을 바이패싱하고, 제3 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 제3 용출액 및 용리된 제3 컬럼을 수득하는 단계로서, 여기서 제3 용출액은 전체 rAAV 입자 대 비-전체 rAAV 입자의 증가된 비율을 포함하는, 단계; 및
(n). 제1 용출액, 제2 용출액, 및 제3 용출액을 합쳐서 전체 rAAV 입자의 정제된 제제를 생산하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 청구항 9에 있어서,
여기서 제1 크로마토그래피 매질 및/또는 제2 크로마토그래피 매질 및/또는 제3 크로마토그래피 매질이 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 매질인, 방법. - 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
여기서 단계 (b) 내지 단계 (m)은 하나 이상의 사이클로 수행되는, 방법. - 청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 제2 컬럼이 단계 (c) 이후에 부분적으로 로딩되는, 방법. - 청구항 9 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 제3 컬럼이 단계 (g) 이후에 부분적으로 로딩되는, 방법. - 청구항 9 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 제1 컬럼 크로마토그래피 매질이 Poros 50 HQ, Poros 50 D, Poros 50 PI, Capto ImpRes Q, CIMmultus™ QA 모놀리식 컬럼 및 Poros XQ로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 Poros XQ인, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 비-전체 입자가 빈(empty) 입자 및/또는 부분(partial) 입자를 포함하고, 바람직하게는 빈 입자와 부분 입자 양자 모두를 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 트리스(Tris), 비스-트리스(Bis-tris), 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 약 10-100 mM의 나트륨 염, 바람직하게는 20-60 mM NaCl을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 약 0-20 mM의 마그네슘 염, 바람직하게는 1-10 mM MgCl2을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 약 0-10 mM의 칼슘 염, 바람직하게는 0.1-2.5 mM CaCl2을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 약 0-100 mM의 리튬 염, 바람직하게는 0-75 mM LiCl을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 약 0-5 mM의 구리 염, 바람직하게는 0.1-2.5 mM CuCl2을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 약 5-100 mM의 암모늄 염, 바람직하게는 10-50 mM (NH4)2SO4를 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 약 20-60 mM NaCl, 20-50 mM 트리스, 1-5 mM MgCl2, 0-75 mM LiCl, 0-10 mM CuCl2 및/또는 0.1-2.5 mM CaCl2을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
로딩 완충액이 바람직하게는 트리스 중의, 더욱 바람직하게는 20-100 mM 트리스 중의, 약 20-60 mM NaCl, 10-30 mM (NH4)2SO4 1-5 mM MgCl2, 0.1-2.5 mM CuCl2를 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액은 약 6-10의 pH를 갖는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 폴록사머(poloxamer) 188, 폴리소르베이트(polysorbate) 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤(Triton) X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는, 방법. - 청구항 27에 있어서,
여기서 로딩 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%인, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 약 0-1000 mM NaCl, 바람직하게는 20-300 mM NaCl을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 약 0-30 mM MgCl2, 바람직하게는 2-15 mM MgCl2을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 약 0-200 mM LiCl, 바람직하게는 0-150 mM LiCl을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 약 0.1-20 mM CaCl2, 바람직하게는 5-10 mM CaCl2을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 약 0-10 mM CuCl2, 바람직하게는 0-3 mM CuCl2을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 약 5-100 mM의 암모늄 염, 바람직하게는 10-50 mM (NH4)2SO4을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 36 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 바람직하게는 트리스 완충액 중의, 약 20-200 mM NaCl을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 37 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는, 방법. - 청구항 38에 있어서,
여기서 용리 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%인, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 39 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액은 약 6-10, 바람직하게는 8-9의 pH를 갖는, 방법. - 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
여기서 rAAV 제제 중의 불순물(impurities)이 전체 rAAV 입자 보다 더 큰 친화도로 제1 컬럼에 결합하는, 방법. - 전체 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은
(a). 전체 rAAV 입자 및 비-전체 입자를 포함하는 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(b). 로딩 완충액 중의 rAAV 제제를 크로마토그래피 매질을 포함하는 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 로딩 완충액은 CaCl2를 포함하고, 전체 rAAV 입자는 크로마토그래피 매질에 결합하는, 단계; 및
(c). 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 정제된 제제를 수득하는 단계로서, 여기서 용리 완충액이 CaCl2를 포함하는, 단계;
를 포함하는, 방법. - 청구항 42에 있어서,
여기서 크로마토그래피 매질이 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 매질인, 방법. - 청구항 43에 있어서,
여기서 컬럼 크로마토그래피 매질이 Poros 50 HQ, Poros 50 D, Poros 50 PI, Capto ImpRes Q, CIMmultus™ QA 모놀리식 컬럼, 및 Poros XQ로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 Poros XQ인, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 44 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 약 0-10 mM CaCl2, 바람직하게는 0.1-2.5 mM CaCl2을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 약 10-100 mM NaCl, 바람직하게는 20-60 mM NaCl을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 약 0-20 mM MgCl2, 바람직하게는 1-10 mM MgCl2을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 약 0-100 mM LiCl, 바람직하게는 0-75 mM LiCl을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 약 0-5 mM의 구리 염, 바람직하게는 0.1-2.5 mM CuCl2을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 약 5-100 mM의 암모늄 염, 바람직하게는 10-50 mM (NH4)2SO4을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 51 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 바람직하게는 20-50 mM 트리스 중의, 약 20-60 mM NaCl, 1-5 mM MgCl2, 0-75 mM LiCl, 0.1-2.5 mM CaCl2를 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 바람직하게는 트리스 중의, 더욱 바람직하게는 20-100 mM 트리스 중의, 약 20-60 mM NaCl, 10-30 mM (NH4)2SO4 1-5 mM MgCl2, 0.1-2.5 mM CuCl2를 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 54 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액이 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는, 방법. - 청구항 55에 있어서,
여기서 로딩 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%인, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 56 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 로딩 완충액은 약 6-10, 바람직하게는 8-9의 pH를 갖는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 57 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 K(I), Li(I), Ca(II), Mg(II), Cu(II), Ba(II), Co(II), Ni(II), Mn(II), Zn(II), Cd(II), Pb(II), Fe(III), Fe(II), Na(I), 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온의 염을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 58 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 약 0.1-20 mM CaCl2, 바람직하게는 5-10 mM CaCl2을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 58 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 약 0-1000 mM NaCl, 바람직하게는 20-300 mM NaCl을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 58 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 약 0-30 mM MgCl2, 바람직하게는 2-15 mM MgCl2을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 58 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 약 0-200 mM LiCl, 바람직하게는 0-150 mM LiCl을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 62 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 트리스 아세테이트, 에탄올아민, 및 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충액을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 63 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이, 바람직하게는 40-60 mM 트리스 완충액 중의, 약 20-200 mM NaCl을 포함하는, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 64 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액이 폴록사머 188, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, NP-40, 트리톤 X-100, 및 트리톤 CG-110로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는, 방법. - 청구항 65에 있어서,
여기서 용리 완충액 중의 계면활성제의 농도가 0.0001% 내지 0.1%인, 방법. - 청구항 42 내지 청구항 66 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 용리 완충액은 약 6-10, 바람직하게는 8-9의 pH를 갖는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 67 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 정제된 전체 rAAV 입자의 수율이 70% 이상(no less than), 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 68 중 어느 한 항에 있어서,
정제된 제제 중의 전체 rAAV 입자 대 비-전체 입자의 비율이 9:1 이상, 바람직하게는 49:1 이상인, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 69 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 비-전체 입자가 빈 입자 및/또는 부분 입자를 포함하고, 바람직하게는 빈 입자와 부분 입자 양자 모두를 포함하는, 방법. - 부분 rAAV 입자를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은
(d). 빈 입자 및 부분 입자를 포함하는 비-전체 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(e). 로딩 완충액 중의 비-전체 rAAV 제제를 크로마토그래피 매질을 포함하는 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 부분 rAAV 입자는 빈 입자 보다 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 결합 친화도를 가지는, 단계; 및
(f). 크로마토그래피 매질에 결합된 부분 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 정제된 제제를 수득하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 71 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 전체 rAAV 입자가 폴리펩티드를 인코딩하는(encodes) 전이유전자(transgene), 또는 siRNA, 안티센스 분자, miRNA, 리보자임 및 shRNA로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산을 포함하는, 방법. - 빈 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은
(a). 빈 rAAV 입자, 및 전체 rAAV 입자 및 부분 rAAV 입자 중 적어도 하나를 포함하는 rAAV 제제를 제공하는 단계;
(b). 로딩 완충액 중의 rAAV 제제를 크로마토그래피 매질을 포함하는 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서 빈 rAAV 입자는 전체 입자 또는 부분 입자 보다 크로마토그래피 매질에 대한 더 높은 결합 친화도를 가지며, 컬럼에 적용된 빈 rAAV 입자 및 전체 입자 및 부분 입자 중 적어도 하나의 양이 크로마토그래피 매질의 결합 능력을 초과하여, 크로마토그래피 매질에 결합된 전체 입자 및 부분 입자 중 적어도 하나가 컬럼으로부터 통과액 내로 빈 rAAV 입자에 의해 치환되도록 하는, 단계; 및
(c). 크로마토그래피 매질에 결합된 빈 rAAV 입자를 용리 완충액으로 용리시켜, 정제된 제제를 수득하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 73 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 rAAV 입자가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, Rh8, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, LK03, RHM4-1, DJ, DJ8, NP59, Anc-80, 및 이들의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 AAV로부터 유래된 캡시드를 포함하는, 방법.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163209680P | 2021-06-11 | 2021-06-11 | |
| US63/209,680 | 2021-06-11 | ||
| US202263366094P | 2022-06-09 | 2022-06-09 | |
| US63/366,094 | 2022-06-09 | ||
| PCT/US2022/072859 WO2022261663A1 (en) | 2021-06-11 | 2022-06-10 | Aav vector column purification methods |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240021231A true KR20240021231A (ko) | 2024-02-16 |
Family
ID=84426294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020247000822A KR20240021231A (ko) | 2021-06-11 | 2022-06-10 | Aav 벡터 컬럼 정제 방법 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240271159A1 (ko) |
| EP (1) | EP4351755A1 (ko) |
| JP (1) | JP2024525142A (ko) |
| KR (1) | KR20240021231A (ko) |
| AU (1) | AU2022289035A1 (ko) |
| BR (1) | BR112023025999A2 (ko) |
| CA (1) | CA3221540A1 (ko) |
| CO (1) | CO2023018191A2 (ko) |
| IL (1) | IL309070A (ko) |
| MX (1) | MX2023014809A (ko) |
| PE (1) | PE20240359A1 (ko) |
| WO (1) | WO2022261663A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024036251A1 (en) * | 2022-08-12 | 2024-02-15 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | Novel anion-exchange chromatography methods for separation of empty from full recombinant adeno-associated virus particles |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE490307T1 (de) * | 2003-05-21 | 2010-12-15 | Genzyme Corp | Verfahren zur herstellung von präparationen rekombinanter aav-virionen, die weitgehend frei von leeren capsiden sind |
| US20210079422A1 (en) * | 2017-06-30 | 2021-03-18 | Spark Therapeutics, Inc. | Aav vector column purification methods |
-
2022
- 2022-06-10 MX MX2023014809A patent/MX2023014809A/es unknown
- 2022-06-10 IL IL309070A patent/IL309070A/en unknown
- 2022-06-10 BR BR112023025999A patent/BR112023025999A2/pt unknown
- 2022-06-10 EP EP22821261.9A patent/EP4351755A1/en active Pending
- 2022-06-10 US US18/568,530 patent/US20240271159A1/en active Pending
- 2022-06-10 CA CA3221540A patent/CA3221540A1/en active Pending
- 2022-06-10 AU AU2022289035A patent/AU2022289035A1/en active Pending
- 2022-06-10 JP JP2023576326A patent/JP2024525142A/ja active Pending
- 2022-06-10 KR KR1020247000822A patent/KR20240021231A/ko unknown
- 2022-06-10 PE PE2023003271A patent/PE20240359A1/es unknown
- 2022-06-10 WO PCT/US2022/072859 patent/WO2022261663A1/en active Application Filing
-
2023
- 2023-12-21 CO CONC2023/0018191A patent/CO2023018191A2/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20240271159A1 (en) | 2024-08-15 |
| AU2022289035A1 (en) | 2024-01-04 |
| CA3221540A1 (en) | 2022-12-15 |
| CO2023018191A2 (es) | 2024-01-25 |
| JP2024525142A (ja) | 2024-07-10 |
| BR112023025999A2 (pt) | 2024-02-27 |
| MX2023014809A (es) | 2024-01-29 |
| PE20240359A1 (es) | 2024-02-27 |
| WO2022261663A1 (en) | 2022-12-15 |
| IL309070A (en) | 2024-02-01 |
| EP4351755A1 (en) | 2024-04-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102669561B1 (ko) | Aav 벡터 컬럼 정제 방법 | |
| JP7364306B2 (ja) | カラムに基づく高度にスケーラブルなｒＡＡＶの製造プロセス | |
| ES2934848T3 (es) | Método de purificación escalable para AAV8 | |
| CN109563496B (zh) | 用于重组蛋白和/或病毒载体生产的细胞系 | |
| JP6868572B2 (ja) | アフィニティー精製工程を含む組換えアデノ随伴ウイルス粒子の精製 | |
| JP6837009B2 (ja) | 多段階陰イオン交換クロマトグラフィーによる組換えアデノ随伴ウイルス粒子の精製 | |
| IL301963A (en) | Scalable High Recovery Methods for High-Throughput Recombinant Adeno-Associated Viral Vector Production and Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors Made So | |
| JP2023525119A (ja) | アデノ随伴ウイルス粒子またはアデノウイルスを精製するための方法および組成物 | |
| Hejmowski et al. | Novel anion exchange membrane chromatography method for the separation of empty and full adeno‐associated virus | |
| US20240271159A1 (en) | Aav vector column purification methods | |
| Belova et al. | Approaches to purification and concentration of rAAV vectors for gene therapy | |
| CN117794629A (zh) | Aav载体的柱纯化方法 | |
| RU2772876C2 (ru) | Колоночные способы очистки вектора на основе aav | |
| WO2024079655A1 (en) | Chromatography methods for purification of aav capsids |