JP2022541915A - 生物製造のための合成遺伝子要素 - Google Patents

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Abstract

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の改善された産生のための組換え構築物、細胞、及び手段が記載される。構築物及び細胞を使用して組換えＡＡＶを産生する方法も記載される。

Description

（関連出願の参照）
本出願は、２０１９年７月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／８７７，５０８号、２０１９年７月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／８７７，５１６号、２０１９年７月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／８７７，５２４号、２０１９年７月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／８７７，５３２号、２０１９年７月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／８７７，５４０号、２０１９年７月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／８７７，５５１号、２０１９年７月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／８７７，５６１号、及び２０１９年７月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／８７７，５７７号の利益を主張するものであり、それらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ファイル名「１４６２０－１９２－２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ」及び２０２０年７月１６日の作成日で、１５２，４０３バイトのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
アデノ随伴ウイルス（Adeno-Associated Virus、ＡＡＶ）は、末端に２つの逆位末端反復配列（inverted terminal repeat、ＩＴＲ）を有する直鎖状一本鎖ＤＮＡ（single-stranded DNA、ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する。ＩＴＲには、２つのウイルス遺伝子、ｒｅｐ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、複製）及びｃａｐ（ｃａｐｓｉｄ、キャプシド）が隣接し、これらは、それぞれ、非構造タンパク質及び構造タンパク質をコードする。ｒｅｐ遺伝子は、２つのプロモータ及び選択的スプライシングの使用を通して、４つの調節タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードする。より具体的には、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８は、Ｐ５プロモータから転写され、Ｒｅｐ４０及びＲｅｐ５２は、Ｐ１９プロモータから転写される（これは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８リーディングフレーム内に埋め込まれている）。Ｐ５及びＰ１９プロモータは、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子によって活性化され、アデノウイルスＥ１遺伝子を使用して形質転換されたＨＥＫ２９３などの細胞において活性である。これらのＲｅｐタンパク質は、ＡＡＶゲノム複製に関与している。ｃａｐ遺伝子は、選択的スプライシング及び翻訳の開始を通して、３つのキャプシドタンパク質、ＶＰ１（ｖｉｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １、ビリオンタンパク質１）、ＶＰ２、及びＶＰ３を生じさせ、これらは、集合してウイルスの球形に近いタンパク質シェルになる。ＡＡＶウイルスは、ポリメラーゼをコードしないため、ゲノム複製のための細胞ポリメラーゼに依存する。
ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子が、細胞に安定して組み込まれ得るか、又は細胞内に維持され得、後に高密度培養物中でＡＡＶを産生するために誘導され得る場合、哺乳動物細胞内のＡＡＶの大規模産生が可能であり得る。しかしながら、Ｒｅｐタンパク質の発現は、宿主細胞に対して細胞傷害性又は細胞増殖抑制性であり得、ＨＥＫ２９３細胞などのアデノウイルスＥ１遺伝子を発現するものなどのｒｅｐ遺伝子が発現される宿主において、安定した細胞株を開発することを困難にする。ＡＡＶは、２つのプロモータ及び交互スプライシングの使用から生じる重複するリーディングフレームで４つのＲｅｐタンパク質をコードするため、ｒｅｐ遺伝子発現を制御するための誘導性プロモータの使用は、容易ではない。
４つのＲｅｐタンパク質の細胞傷害性又は細胞増殖抑制性の性質は、天然のｒｅｐ／ｃａｐプロモータを使用して高力価のＡＡＶを産生することができる安定した細胞株の開発を妨げている（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１３２９－１３４１、Ｃｈａｄｅｕｆ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｇｅｎｅ ｍｅｄ．２：２６０－２６８）。いくつかのグループが、Ｒｅｐ発現を組換えで調節しようと試みている。Ｙａｎｇは、Ｐ５プロモータをマウスメタロチオネインプロモータで置き換えた。ＨＥＫ２９３における安定したクローンが金属誘導性ｒｅｐ７８発現を示したが、ｒｅｐ５０及びｒｅｐ４２発現（内部Ｐ１９プロモータによって駆動される）は、低レベルでのみ検出され、細胞の成長速度は、実質的に低下した（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６８：４８４７－４８５６）。Ｏｇａｓａｗａｒａは、Ｐ５プロモータを、Ｃｒｅリコンビナーゼによって活性化され得るｌｏｘＰ隣接スタッファを含有する遍在性プロモータで置き換えた。ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、又はｃａｐ遺伝子のいずれも、アデノウイルス－Ｃｒｅに感染した安定したクローンにおいて誘導されず、これは、構成的なｒｅｐ５２／ｒｅｐ４０発現も細胞にとって有害であったことを示唆した（Ｏｇａｓａｗａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：２４７７－２４８０）。
調節されたｒｅｐ発現のための別のアプローチは、Ｘｉａｏ及び共同研究者によって記載されている。（Ｑｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１３０１５－１３０２７、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：６１３－６２４）。Ｘｉａｏは、４つ全てのＲｅｐタンパク質が共有するコード領域内のｒｅｐ遺伝子に、人工イントロンを挿入し、イントロンに、ポリ（Ａ）配列を含有するｌｏｘＰ隣接停止カセットを単独で、又はピューロマイシン耐性遺伝子であるｐｕｒｏと組み合わせて挿入した。全てのＲｅｐタンパク質の発現が阻害され、ＨＥＫ２９３細胞内の安定した細胞株が生成されることを可能にする。細胞へのＣｒｅリコンビナーゼの送達（アデノウイルス感染による）は、ｌｏｘＰ部位を組み換えることによって停止カセットを切除し、完全長プレｍＲＮＡが転写されることを可能にする。次いで、残りのイントロン配列がＲＮＡスプライシングによって正確に除去され、４つ全てのＲｅｐタンパク質のコード配列を回復させ、したがって、組み込まれたＩＴＲ隣接導入遺伝子からのＡＡＶの産生を開始する。しかしながら、Ｃｒｅリコンビナーゼは、２つの同一のｌｏｘＰ部位を認識するため、ｌｏｘＰ部位は、組換え後に同一のままであり、したがって、Ｃｒｅが結合反応及び切除反応の両方を触媒するため、追加の組換えが可能であり得る。
ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、アデノウイルスＥ１（初期領域１）遺伝子も発現する細胞内でのみ発現される。いくつかの安定したｒｅｐ／ｃａｐ細胞株は、ＨｅＬａ（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒａｐ．６：１３２９－１３４１、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４８４７－４８５６、Ｇａｏ ｅｔ．Ａｌ（１９９８）Ｈｕ，Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．９：２３５３－２３６２）、Ａ５４９（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．５：６４４－６５９）、及びＶｅｒｏ（Ｂｅａｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）１０ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，Ｍａｙ３０－Ｊｕｎｅ ３，２００７）を含む、Ｅ１遺伝子を発現しない宿主内で構築されている。これらの細胞株に対する最大の欠点は、Ｅ１インタクトな（通常、複製可能な）アデノウイルスがＡＡＶ産生に必要であり、これが、ＡＡＶウイルス調製物の汚染物質として、安全性リスクの増加をもたらし得ることである。
ヘルパー機能を提供し、ヒト細胞に組換え導入遺伝子及び／又はＡＡＶ遺伝子を送達するための、ヘルペス（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０：８６１－７０、Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０：７９６－８０６）、ワクシニアウイルス（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖｅｌ．７：１４６－１５５）、及びアデノウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍ ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：２０７９－２０８７、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２３５３－２３６２．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：２９３－２９９）を含む、いくつかの異なるウイルスを使用する、ＡＡＶ産生系が記載されている。これらのアプローチは、いくつかの異なるウイルス（及び場合によっては、組換え宿主細胞株）の産生を必要とする。ＡＡＶは、バキュロウイルスを使用して昆虫細胞でも産生されている（Ｍｉｅｔｚｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２５：２１２－２２、Ａｓｌａｎｉｄｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０６：５０５９－５０６４、Ｃｅｃｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：１０２１－１０３０）。昆虫細胞対ヒト細胞内で産生されたＡＡＶが機能的に同等であるかどうかは、依然として未解決の問題である。
組換え構築物及び細胞を用いたＡＡＶの産生の改善が必要とされている。
一態様では、４つのＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を有する、修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐ遺伝子と、４つのＲｅｐタンパク質によって共有されるｒｅｐ遺伝子のコード配列に挿入された人工イントロンと、を含む、非自然発生の核酸分子が本明細書に提供され、人工イントロンは、人工イントロンの５’スプライス部位の下流及び分岐部位の上流に挿入された停止カセットを含み、停止カセットは、５’から３’の順序で、（ａ）配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、好ましくは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位と、（ｂ）スプライスアクセプタと、（ｃ）ターミネータと、（ｄ）配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、好ましくは、配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位と、を含む。
一実施形態では、スプライスアクセプタは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ターミネータは、ポリアデニル化シグナルを含む。一実施形態では、ターミネータは、配列番号１９のヌクレオチド配列を更に含む。
一実施形態では、停止カセットは、選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセットを含む。
一実施形態では、人工イントロンは、５’から３’の順序で、配列番号１４のヌクレオチド配列、停止カセット、及び配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ１～ＡＡＶ８のうちの１つのｒｅｐ遺伝子、又はそのハイブリッドを含む。一実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１９０～２２０２を有するヒトＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子を含む。一実施形態では、人工イントロンは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号９９６～１９０５の間に挿入されている。一実施形態では、人工イントロンは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１０５２、１０６１、１７１２、１９０６、１０２２、１１１２、１４７５、１５１４、１７００、１７４２、１７８４、又は１３４０、好ましくはヌクレオチド番号１０５２のすぐ下流に挿入されている。
一態様では、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む非自然発生の核酸分子が本明細書に提供され、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、５’から３’の順序で、（ａ）配列番号５５のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分と、（ｂ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、（ｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、５’イントロン断片、（ｉｉ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、（１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、（２）配列番号１７のヌクレオチド配列を有するスプライスアクセプタ、（３）配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、（４）配列番号１９のヌクレオチド配列を有するターミネータ、及び（５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに（ｉｉｉ）配列番号１５のヌクレオチド配列を有する３’イントロン断片、を含む、人工イントロンと、（ｃ）配列番号５６のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分と、を含む。
一態様では、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む非自然発生の核酸分子が本明細書に提供され、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、５’から３’の順序で、（ａ）配列番号７３のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分と、（ｂ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、（ｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列を有する５’イントロン断片、（ｉｉ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、（１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、（２）配列番号１７のヌクレオチド配列を有するスプライスアクセプタ、（３）配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、（４）配列番号１９のヌクレオチド配列を有するターミネータ、及び（５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに（ｉｉｉ）配列番号６６のヌクレオチド配列を有する３’イントロン断片、を含む、人工イントロンと、（ｃ）配列番号５６のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分と、を含む。一実施形態では、停止カセットは、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、非自然発生の核酸分子は、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を更に含む。一実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１～ＡＡＶ９及びＡＡＶＤＪのうちの１つのｃａｐ遺伝子、又はそのハイブリッドを含む。一実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３０５７９．１のヌクレオチド配列を有するヒトＡＡＶ９のｃａｐ遺伝子を含む。一実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ポリアデニル化シグナル、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号４４１１～４４６６を有するＡＡＶ２のポリアデニル化シグナルと、エンハンサ、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１９０～３１３を有するＡＡＶ２ ｒｅｐ Ｐ５プロモータと、を更に含み、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサは、両方ともｃａｐ遺伝子のコード配列の下流にある。一実施形態では、非自然発生の核酸分子は、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子の下流の一対のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する導入遺伝子を更に含む。
一実施形態では、非自然発生の核酸分子は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の上流に第１のインシュレータ、及び任意選択的に、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子の下流に第２のインシュレータをなお更に含み、好ましくは、第１のインシュレータ及び第２のインシュレータは、独立して、（ａ）配列番号２４のヌクレオチド配列を有するヒト抗リプレッサ要素４０、（ｂ）配列番号２５のヌクレオチド配列を有するマウス抗リプレッサ要素４０、（ｃ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７４９．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０４、（ｄ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５０．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０６、（ｅ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５１．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０７、（ｆ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５２．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素１２、（ｇ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５３．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素１３、（ｈ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５４．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素３５、（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５５．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素３６、（ｊ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５７．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素５２、（ｋ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５８．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素５３、及び（ｌ）２つ又は３つ以上のコピーにおいてＡＹ０４０８３５．１のヌクレオチド配列を有するグロビン遺伝子座からのニワトリＨＳ４インシュレータからなる群から選択され、より好ましくは、第１のインシュレータ及び第２のインシュレータは、それぞれ、配列番号２４及び配列番号２５のヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、非自然発生の核酸分子は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の上流に第１のインシュレータを含み、導入遺伝子の上流及び下流にそれぞれ、第１のスペーサ配列及び第２のスペーサ配列を更に含み、第１のスペーサ配列及び第２のスペーサ配列は、独立して、（ａ）配列番号６７のヌクレオチド配列及び（ｂ）配列番号６８のヌクレオチド配列からなる群から選択される。一実施形態では、ＩＴＲは、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、導入遺伝子は、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、コード配列は、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、好ましくは、プロモータは、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、ポリアデニル化シグナルは、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する。
一態様では、非自然発生の核酸分子が本明細書に提供され、非自然発生の核酸分子は、５’から３’の順序で、（Ａ）第１のインシュレータであって、好ましくは、配列番号２４のヌクレオチド配列を有する、第１のインシュレータ、（Ｂ）修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であって、５’から３’の順序で、（ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分であって、好ましくは、配列番号５５のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分、（ｉｉ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、（ａ）５’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、５’イントロン断片、（ｂ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、（１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、（２）スプライスアクセプタであって、好ましくは、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、スプライスアクセプタ、（３）選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、（４）ターミネータであって、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列を有する、ターミネータ、及び（５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに（ｃ）３’イントロン断片であって、好ましくは配列番号１５のヌクレオチド配列を有する、３’イントロン断片、を含む、人工イントロン、（ｉｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分であって、好ましくは、配列番号５６のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分、を含む、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子と、（Ｃ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子であって、好ましくは、配列番号５７のヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と、（Ｄ）一対のＡＡＶ ＩＴＲが隣接する導入遺伝子であって、好ましくは、ＡＡＶ ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、より好ましくは、プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、導入遺伝子と、（Ｅ）第２のインシュレータであって、好ましくは、配列番号２５のヌクレオチド配列を有する、第２のインシュレータと、を含む。
一態様では、非自然発生の核酸分子が本明細書に提供され、非自然発生の核酸分子は、５’から３’の順序で、（Ａ）第１のインシュレータであって、好ましくは、配列番号２４のヌクレオチド配列を有する、第１のインシュレータ、（Ｂ）修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であって、５’から３’の順序で、（ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分であって、好ましくは、配列番号７３のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分、（ｉｉ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、（ａ）５’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、５’イントロン断片、（ｂ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、（１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、（２）スプライスアクセプタであって、好ましくは、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、スプライスアクセプタ、（３）選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、（４）ターミネータであって、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列を有する、ターミネータ、及び（５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに（ｃ）３’イントロン断片であって、好ましくは配列番号６６のヌクレオチド配列を有する、３’イントロン断片、を含む、人工イントロン、（ｉｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分であって、好ましくは、配列番号５６のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分、を含む、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子と、（Ｃ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と、（Ｄ）（１）一対のＡＡＶ ＩＴＲであって、好ましくは、ＡＡＶ ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、より好ましくは、プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、一対のＡＡＶ ＩＴＲ、及び（２）一対のスペーサ配列であって、好ましくは、スペーサ配列が、配列番号６７及び配列番号６８のヌクレオチド配列を有する、一対のスペーサ配列、が隣接する、導入遺伝子と、を含む。
一態様では、上記の非自然発生の核酸分子を含むベクターが本明細書に提供され、好ましくは、ベクターは、プラスミドであり、より好ましくは、プラスミドは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。
一態様では、上記の非自然発生の核酸分子を含むベクターが本明細書に提供され、好ましくは、ベクターは、プラスミドであり、より好ましくは、プラスミドは、配列番号７０のヌクレオチド配列を含む。
一態様では、上記の非自然発生の核酸分子を作製する方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、上記の非自然発生の核酸分子を含むベクターを作製する方法が本明細書に提供され、好ましくは、ベクターは、プラスミドであり、より好ましくは、プラスミドは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、上記の非自然発生の核酸分子を含むベクターを作製する方法が本明細書に提供され、好ましくは、ベクターは、プラスミドであり、より好ましくは、プラスミドは、配列番号７０のヌクレオチド配列を含む。
一態様では、４つのＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を有する、修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐ遺伝子と、４つのＲｅｐタンパク質によって共有されるｒｅｐ遺伝子のコード配列に挿入された人工イントロンと、を含む、非自然発生の核酸分子を含む細胞が本明細書に提供され、人工イントロンは、人工イントロンの５’スプライス部位の下流及び分岐部位の上流に挿入された停止カセットを含み、停止カセットは、５’から３’の順序で、（ａ）配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、好ましくは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位と、（ｂ）スプライスアクセプタと、（ｃ）ターミネータと、（ｄ）配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、好ましくは、配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位と、を含む。
一実施形態では、スプライスアクセプタは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ターミネータは、ポリアデニル化シグナルを含む。一実施形態では、ターミネータは、配列番号１９のヌクレオチド配列を更に含む。
一実施形態では、停止カセットは、選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセットを含む。
一実施形態では、人工イントロンは、５’から３’の順序で、配列番号１４のヌクレオチド配列、停止カセット、及び配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、人工イントロンは、５’から３’の順序で、配列番号１４のヌクレオチド配列、停止カセット、及び配列番号６６のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ１～ＡＡＶ８のうちの１つのｒｅｐ遺伝子、又はそのハイブリッドを含む。一実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１９０～２２０２を有するヒトＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子を含む。一実施形態では、人工イントロンは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号９９６～１９０５の間に挿入されている。一実施形態では、人工イントロンは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１０５２、１０６１、１７１２、１９０６、１０２２、１１１２、１４７５、１５１４、１７００、１７４２、１７８４、又は１３４０、好ましくはヌクレオチド番号１０５２のすぐ下流に挿入されている。
一態様では、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む、非自然発生の核酸分子を含む細胞が本明細書に提供され、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、５’から３’の順序で、（ａ）配列番号５５のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分と、（ｂ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、（ｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列を有する５’イントロン断片、（ｉｉ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、（１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、（２）配列番号１７のヌクレオチド配列を有するスプライスアクセプタ、（３）配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、（４）配列番号１９のヌクレオチド配列を有するターミネータ、及び（５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに（ｉｉｉ）配列番号１５のヌクレオチド配列を有する３’イントロン断片、を含む、人工イントロンと、（ｃ）配列番号５６のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分と、を含む。
一態様では、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む、非自然発生の核酸分子を含む細胞が本明細書に提供され、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、５’から３’の順序で、（ａ）配列番号７３のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分と、（ｂ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、（ｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列を有する５’イントロン断片、（ｉｉ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、（１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、（２）配列番号１７のヌクレオチド配列を有するスプライスアクセプタ、（３）配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、（４）配列番号１９のヌクレオチド配列を有するターミネータ、及び（５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに（ｉｉｉ）配列番号６６のヌクレオチド配列を有する３’イントロン断片、を含む、人工イントロンと、（ｃ）配列番号５６のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分と、を含む。
一実施形態では、停止カセットは、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、上記の細胞は、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を更に含む。一実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１～ＡＡＶ９及びＡＡＶＤＪのうちの１つのｃａｐ遺伝子、又はそのハイブリッドを含む。一実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３０５７９．１のヌクレオチド配列を有するヒトＡＡＶ９のｃａｐ遺伝子を含む。一実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９のハイブリッドのｃａｐ遺伝子を含む。
一実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ポリアデニル化シグナル、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号４４１１～４４６６を有するＡＡＶ２のポリアデニル化シグナルと、エンハンサ、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１９０～３１３を有するＡＡＶ２ ｒｅｐ Ｐ５プロモータと、を更に含み、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサは両方、ｃａｐ遺伝子のコード配列の下流にある。
一実施形態では、ｃａｐ遺伝子を含む細胞は、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子の下流の一対のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する導入遺伝子を更に含む。一実施形態では、細胞は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の上流に第１のインシュレータ、及び任意選択的に、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子の下流に第２のインシュレータを更に含み、好ましくは、第１のインシュレータ及び第２のインシュレータは、独立して、（ａ）配列番号２４のヌクレオチド配列を有するヒト抗リプレッサ要素４０、（ｂ）配列番号２５のヌクレオチド配列を有するマウス抗リプレッサ要素４０、（ｃ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７４９．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０４、（ｄ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５０．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０６、（ｅ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５１．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０７、（ｆ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５２．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素１２、（ｇ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５３．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素１３、（ｈ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５４．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素３５、（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５５．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素３６、（ｊ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５７．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素５２、（ｋ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５８．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素５３、及び（ｌ）２つ又は３つ以上のコピーにおいてＡＹ０４０８３５．１のヌクレオチド配列を有するグロビン遺伝子座からのニワトリＨＳ４インシュレータからなる群から選択され、より好ましくは、第１のインシュレータ及び第２のインシュレータは、それぞれ、配列番号２４及び配列番号２５のヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、細胞は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の上流に第１のインシュレータを含み、導入遺伝子の上流及び下流にそれぞれ、第１のスペーサ配列及び第２のスペーサ配列を更に含み、第１のスペーサ配列及び第２のスペーサ配列は、独立して、（ａ）配列番号６７のヌクレオチド配列及び（ｂ）配列番号６８のヌクレオチド配列からなる群から選択される。
一実施形態では、ＩＴＲは、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、導入遺伝子は、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、コード配列は、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、好ましくは、プロモータは、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、ポリアデニル化シグナルは、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する。
一態様では、非自然発生の核酸分子を含む細胞が本明細書に提供され、非自然発生の核酸分子は、５’から３’の順序で、（Ａ）第１のインシュレータであって、好ましくは、配列番号２４のヌクレオチド配列を有する、第１のインシュレータ、（Ｂ）修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であって、５’から３’の順序で、（ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分であって、好ましくは、配列番号５５のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分、（ｉｉ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、（ａ）５’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、５’イントロン断片、（ｂ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、（１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、（２）スプライスアクセプタであって、好ましくは、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、スプライスアクセプタ、（３）選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、（４）ターミネータであって、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列を有する、ターミネータ、及び（５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに（ｃ）３’イントロン断片であって、好ましくは配列番号１５のヌクレオチド配列を有する、３’イントロン断片、を含む、人工イントロン、（ｉｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分であって、好ましくは、配列番号５６のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分、を含む、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子と、（Ｃ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子であって、好ましくは、配列番号５７のヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と、（Ｄ）一対のＡＡＶ ＩＴＲが隣接する導入遺伝子であって、好ましくは、ＡＡＶ ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、より好ましくは、プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、導入遺伝子と、（Ｅ）第２のインシュレータであって、好ましくは、配列番号２５のヌクレオチド配列を有する、第２のインシュレータと、を含む。
一態様では、非自然発生の核酸分子を含む細胞が本明細書に提供され、非自然発生の核酸分子は、５’から３’の順序で、（Ａ）第１のインシュレータであって、好ましくは、配列番号２４のヌクレオチド配列を有する、第１のインシュレータ、（Ｂ）修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であって、５’から３’の順序で、（ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分であって、好ましくは、配列番号７３のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分、（ｉｉ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、（ａ）５’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、５’イントロン断片、（ｂ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、（１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、（２）スプライスアクセプタであって、好ましくは、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、スプライスアクセプタ、（３）選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、（４）ターミネータであって、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列を有する、ターミネータ、及び（５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに（ｃ）３’イントロン断片であって、好ましくは配列番号６６のヌクレオチド配列を有する、３’イントロン断片、を含む、人工イントロン、（ｉｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分であって、好ましくは、配列番号５６のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分、を含む、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子と、（Ｃ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と、（Ｄ）（ｉ）一対のＡＡＶ ＩＴＲであって、好ましくは、ＡＡＶ ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、より好ましくは、プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、一対のＡＡＶ ＩＴＲ、及び（ｉｉ）一対のスペーサ配列であって、好ましくは、スペーサ配列が、配列番号６７及び配列番号６８のヌクレオチド配列を有する、一対のスペーサ配列、が隣接する、導入遺伝子と、を含む。
一実施形態では、非自然発生の核酸分子は、配列番号１２のヌクレオチド配列を有し、エピソーム性である。別の実施形態では、非自然発生の核酸分子は、配列番号７０のヌクレオチド配列を有し、エピソーム性である。
一実施形態では、細胞は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼをコードする、核酸分子を更に含み、好ましくは、核酸は、配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、細胞は、配列番号２のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼをコードする、組換えΔＥ１／ΔＥ３アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ウイルスを含む。
一実施形態では、細胞は、アデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を更に含み、好ましくは、細胞は、９１１細胞、ｐＴＧ６５５９細胞、ＧＨ３２９細胞、Ｎ５２．Ｅ６細胞、ＨｅＬａ－Ｅ１細胞、ＵＲ細胞、ＶＬＩ－２９３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。
一態様では、導入遺伝子を含む組換えＡＡＶを産生する方法が本明細書に提供され、方法は、（Ａ）第１の宿主細胞を得ることであって、第１の宿主細胞が、（ｉ）修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であって、５’から３’の順序で、（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分であって、好ましくは、配列番号５５のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分、（ｂ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、（１）５’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、５’イントロン断片、（２）停止カセットであって、５’から３’の順序で、（ａａ）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、（ｂｂ）スプライスアクセプタであって、好ましくは、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、スプライスアクセプタ、（ｃｃ）選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、（ｄｄ）ターミネータであって、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列を有する、ターミネータ、及び（ｅｅ）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに（３）３’イントロン断片であって、好ましくは配列番号１５のヌクレオチド配列を有する、３’イントロン断片、を含む、人工イントロン、（ｃ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分であって、好ましくは、配列番号５６のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分、を含む、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、（ｉｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子であって、好ましくは、配列番号５７のヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、並びに（ｉｉｉ）一対のＡＡＶ ＩＴＲが隣接する導入遺伝子であって、好ましくは、ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、より好ましくは、プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、導入遺伝子、を含む、第１の宿主細胞を得ることと、（Ｂ）第１の宿主細胞を、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するリコンビナーゼをコードするリコンビナーゼ遺伝子を含む組換えアデノウイルスに感染させて、リコンビナーゼ遺伝子を更に含有する第２の宿主細胞を得ることと、（Ｃ）導入遺伝子を含む組換えＡＡＶが産生される条件下で、第２の宿主細胞を成長させることと、（Ｄ）任意選択的に、組換えＡＡＶを採取することと、を含む。
一態様では、導入遺伝子を含む組換えＡＡＶを産生する方法が本明細書に提供され、方法は、（Ａ）第１の宿主細胞を得ることであって、第１の宿主細胞が、（ｉ）修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であって、５’から３’の順序で、（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分であって、好ましくは、配列番号７３のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分、（ｂ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、（１）５’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、５’イントロン断片、（２）停止カセットであって、５’から３’の順序で、（ａａ）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、（ｂｂ）スプライスアクセプタであって、好ましくは、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、スプライスアクセプタ、（ｃｃ）選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、（ｄｄ）ターミネータであって、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列を有する、ターミネータ、及び（ｅｅ）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに（３）３’イントロン断片であって、好ましくは配列番号６６のヌクレオチド配列を有する、３’イントロン断片、を含む、人工イントロン、（ｃ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分であって、好ましくは、配列番号６６のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分、を含む、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、（ｉｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、並びに（ｉｉｉ）（ａ）一対のＡＡＶ ＩＴＲであって、好ましくは、ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、より好ましくは、プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、一対のＡＡＶ ＩＴＲ、及び（ｂ）一対のスペーサ配列であって、好ましくは、スペーサ配列が、配列番号６７及び配列番号６８のヌクレオチド配列を有する、一対のスペーサ配列、が隣接する、導入遺伝子、を含む、第１の宿主細胞を得ることと、（Ｂ）第１の宿主細胞を、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するリコンビナーゼをコードするリコンビナーゼ遺伝子を含む組換えアデノウイルスに感染させて、リコンビナーゼ遺伝子を更に含有する第２の宿主細胞を得ることと、（Ｃ）導入遺伝子を含む組換えＡＡＶが産生される条件下で、第２の宿主細胞を成長させることと、（Ｄ）任意選択的に、組換えＡＡＶを採取することと、を含む。
一実施形態では、第１の宿主細胞は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の上流に第１のインシュレータ、及び任意選択的に、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子の下流に第２のインシュレータを更に含み、好ましくは、第１のインシュレータ及び第２のインシュレータは、独立して、（ａ）配列番号２４のヌクレオチド配列を有するヒト抗リプレッサ要素４０、（ｂ）配列番号２５のヌクレオチド配列を有するマウス抗リプレッサ要素４０、（ｃ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７４９．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０４、（ｄ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５０．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０６、（ｅ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５１．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０７、（ｆ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５２．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素１２、（ｇ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５３．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素１３、（ｈ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５４．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素３５、（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５５．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素３６、（ｊ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５７．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素５２、（ｋ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５８．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素５３、及び（ｌ）２つ又は３つ以上のコピーにおいてＡＹ０４０８３５．１のヌクレオチド配列を有するグロビン遺伝子座からのニワトリＨＳ４インシュレータからなる群から選択され、より好ましくは、第１のインシュレータ及び第２のインシュレータは、それぞれ、配列番号２４及び配列番号２５のヌクレオチド配列を有する。
一実施形態では、第１の宿主細胞は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の上流に第１のインシュレータを含み、導入遺伝子の上流及び下流にそれぞれ、第１のスペーサ配列及び第２のスペーサ配列を更に含み、第１のスペーサ配列及び第２のスペーサ配列は、独立して、（ａ）配列番号６７のヌクレオチド配列及び（ｂ）配列番号６８のヌクレオチド配列からなる群から選択される。
一実施形態では、第１の宿主細胞は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子、第１のインシュレータ、及び第２のインシュレータを含む、１つ又は２つ以上の核酸分子を細胞に導入することによって得られる。一実施形態では、第１の宿主細胞は、５’から３’の順序で、第１のインシュレータ、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子、第１のインシュレータ、及び第２のインシュレータを含む核酸分子、好ましくは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むプラスミドを、細胞に導入することによって得られる。
一実施形態では、第１の宿主細胞は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子、第１のインシュレータ、第１のスペーサ配列、及び第２のスペーサ配列を含む、１つ又は２つ以上の核酸分子を細胞に導入することによって得られる。一実施形態では、第１の宿主細胞は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子、第１のインシュレータ、第１のスペーサ配列、及び第２のスペーサシーケンサを含む、１つ又は２つ以上の核酸分子、好ましくは、配列番号７０のヌクレオチド配列を含むプラスミドを細胞に導入することによって得られる。
一実施形態では、組換えアデノウイルスは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む組換えΔＥ１／ΔＥ３アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ウイルスである。
一実施形態では、宿主細胞は、アデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を含み、好ましくは、宿主細胞は、９１１細胞、ｐＴＧ６５５９細胞、ＧＨ３２９細胞、Ｎ５２．Ｅ６細胞、ＨｅＬａ－Ｅ１細胞、ＵＲ細胞、ＶＬＩ－２９３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。
一実施形態では、第２の宿主細胞を成長させるための条件は、２－アミノプリンで第２の細胞を培養することを含む。一実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１．２５ｍＭ未満である。一実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１μＭ～約１．２５ｍＭである。一実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１０μＭ～約１．２５ｍＭである。一実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１００μＭ～約１．２５ｍＭである。一実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１．２５ｍＭである。
一実施形態では、２－アミノプリンで第２の細胞を培養することは、組換えアデノウイルスによる第１の宿主細胞の感染の約２４時間後に開始される。
一態様では、上記のようにリコンビナーゼをコードする核酸分子を含む細胞と、２－アミノプリンとを含む組成物が本明細書に提供される。一実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１．２５ｍＭ未満である。一実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１μＭ～約１．２５ｍＭである。一実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１０μＭ～約１．２５ｍＭである。一実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１００μＭ～約１．２５ｍＭである。一実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１．２５ｍＭである。
一態様では、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、非自然発生の核酸分子が本明細書に提供される。一実施形態では、非自然発生の核酸分子は、配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも有する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一態様では、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、非自然発生の核酸分子を含むベクターが本明細書に提供される。
一態様では、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、非自然発生の核酸分子を含むベクターが本明細書に提供される。
一実施形態では、ベクターは、プロモータ、好ましくは、セリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたサイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）プロモータを更に含む。
一実施形態では、ベクターは、セリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、シミアンウイルス４０（simian virus 40、ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルなどのポリアデニル化シグナルを更に含む。
一実施形態では、ベクターは、ＤＮＡプラスミドである。一実施形態では、ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである。
一実施形態では、ベクターは、ＣＭＶプロモータの制御下で、配列番号２のアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、組換えΔＥ１／ΔＥ３アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ウイルスであり、ヌクレオチド配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＮＣ＿００１６６９．１、ｎｔ２５５０～２７７４）に更に作動可能に連結されている。
一態様では、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、非自然発生の核酸分子を含む細胞が本明細書に提供される。一実施形態では、細胞は、配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一態様では、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、非自然発生の核酸分子を含むベクターを含む細胞が本明細書に提供される。別の態様では、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、非自然発生の核酸分子を含むベクターを含む細胞が本明細書に提供される。
一実施形態では、細胞は、プロモータ、好ましくは、セリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータを更に含む。
一実施形態では、細胞は、セリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルなどのポリアデニル化シグナルを更に含む。
一実施形態では、ベクターは、ＤＮＡプラスミドである。一実施形態では、ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである。
一実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、ＣＭＶプロモータの制御下で、配列番号２のアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、組換えΔＥ１／ΔＥ３アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ウイルスを含み、ヌクレオチド配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＮＣ＿００１６６９．１、ｎｔ２５５０～２７７４）に更に作動可能に連結されている。
一実施形態では、細胞は、アデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を含み、好ましくは、細胞は、９１１細胞、ｐＴＧ６５５９細胞、ＧＨ３２９細胞、Ｎ５２．Ｅ６細胞、ＨｅＬａ－Ｅ１細胞、ＵＲ細胞、ＶＬＩ－２９３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。
一態様では、細胞内で部位特異的組換えを実施する方法が本明細書に提供され、方法は、（ａ）配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、好ましくは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、及び配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、好ましくは、配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位を有する核酸分子を含む、細胞を得ることと、（ｂ）配列番号２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するセリンリコンビナーゼをコードする非自然発生の核酸分子を、細胞に導入することと、（ｃ）セリンリコンビナーゼが、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の部位特異的組換えを触媒することを可能にする条件下で、細胞を成長させることと、を含む。
一態様では、細胞内で部位特異的組換えを実施するプロセスによって産生される生成物が本明細書に提供され、プロセスは、（ａ）配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、好ましくは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、及び配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、好ましくは、配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位を有する核酸分子を含む、細胞を得ることと、（ｂ）配列番号２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するセリンリコンビナーゼをコードする非自然発生の核酸分子を、細胞に導入することと、（ｃ）セリンリコンビナーゼが、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の部位特異的組換えを触媒することを可能にする条件下で、細胞を成長させることと、を含む。
一態様では、細胞から生成物を得るためのプロセスが本明細書に提供され、プロセスは、（ａ）配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、好ましくは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、及び配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、好ましくは、配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位を有する核酸分子を含む、細胞を得ることと、（ｂ）配列番号２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するセリンリコンビナーゼをコードする非自然発生の核酸分子を、細胞に導入することと、（ｃ）セリンリコンビナーゼが、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の部位特異的組換えを触媒することを可能にする条件下で、細胞を成長させることと、（ｄ）細胞から生成物を産生及び回収することと、を含む。
一態様では、非自然発生の系が本明細書に提供され、非自然発生の系は、ＡＡＶ媒介組換えのための手段を含み、手段は、任意選択的に、トランスジェニック要素を含む。一態様では、非自然発生の系を移すための手段が本明細書に提供され、手段は、ＡＡＶ媒介組換えのための手段を含み、手段は、任意選択的に、トランスジェニック要素を含む。
一態様では、非自然発生の系が本明細書に提供され、非自然発生の系は、ＡＡＶ媒介組換えのための手段を含む、系を組み換えるための組換え手段を含み、手段は、任意選択的に、トランスジェニック要素を含み、組換え手段は、触媒中に少なくとも１つのセリン残基を使用することを含む。一態様では、非自然発生の系を移すための手段が本明細書に提供され、手段は、ＡＡＶ媒介組換えのための手段を含む、系を組み換えるための組換え手段を含み、手段は、任意選択的に、トランスジェニック要素を含み、組換え手段は、触媒中に少なくとも１つのセリン残基を使用することを含む。
一態様では、分子を製造するための手段が本明細書に提供され、分子を製造するための手段は、上記の手段のうちのいずれかを含み、複製することが可能である。
一態様では、ＡＡＶ媒介部位特異的組換えのためのプロセスが本明細書に提供され、プロセスは、（ａ）ＡＡＶ媒介組換えのための手段を含む細胞を得る機能を実行するための工程であって、手段が、任意選択的に、トランスジェニック要素を含む、工程と、（ｂ）触媒中に少なくとも１つのセリン残基を使用する部位特異的組換えを可能にする条件下で、細胞を成長させる機能を実行するための工程と、を含む。一実施形態では、プロセスは、生成物を得ることを含み、任意選択的に、生成物は、治療用生成物である。
本発明の他の態様、特徴、及び利点は、発明の詳細な説明、並びにその好ましい実施形態及び添付の特許請求の範囲を含む以下の開示より明らかとなろう。
上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
５３５個のアミノ酸の長さを有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ株ＣＣＭＡ－５６０（配列番号２、Ｓｂｊｃｔ）のゲノム、配列ＩＤ：ＷＰ＿０２９７０８０８９．１において同定された推定セリンリコンビナーゼと、ＳＰＢｅｔａｃ２インテグラーゼタンパク質（配列番号１、クエリ）とのアライメント統計及び配列アライメントを示す。２つのタンパク質は、アミノ酸１～５２９の範囲のタンパク質レベルで６４％の配列同一性を有する。この推定セリンリコンビナーゼは、本明細書においてＳＲ２１（セリンリコンビナーゼ２１）と呼ばれる。 挿入前遺伝子座を表す株の同定：５６８０９３個のヌクレオチドの長さを有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ株Ｆａｉｒｖｉｅｗ ｃｏｎｔｉｇ５６＿１（Ｓｂｊｃｔ）の全ゲノムショットガン配列、配列ＩＤ：ＮＺ＿ＪＦＢＹ０１００００１８．１のヌクレオチド４６４３５２～４６４８３９と、ＣＣＭＡ－５６０ ＤＮＡ配列（クエリ）とのアライメント統計及び配列アライメントを示す。 ＳＲ２１リコンビナーゼａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位を示す。ａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位は、中央ジヌクレオチド組換え交差部位（下線付き）の周囲の二回転対称から構成される。半分の部位が番号付けされている。以前の研究（Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：８３４１－８３５６）から外挿する亜鉛リボンドメイン（zinc ribbon domain、ＺＤ）及びリコンビナーゼドメイン（recombinase domain、ＲＤ）によって結合されると予測される配列のアライメントを示すために、スペースをａｔｔＢ配列に導入した。ＺＤ又はＲＤドメインのうちの３つ又は４つにおいて同一である残基は、太字である。２つの交互のａｔｔＢ配列（配列番号８）及び（配列番号９）に対するａｔｔＰ（配列番号７）アライメントを示す。 レポータ遺伝子のリコンビナーゼ活性化を示す。プラスミドＰ４１は、２つのレポータ遺伝子転写物をコードする。ＥＦ１αプロモータによって駆動される最初のものは、構成的に活性であり、自己切断Ｆ２Ａペプチドリンカーによって連結された緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein、ＧＦＰ）とレニラルシフェラーゼとの間の融合タンパク質をコードする。ＣＭＶによって駆動される第２の転写物は、ＳＲ２１リコンビナーゼａｔｔＢ部位（配列番号９）、続いて、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドリンカーによって連結されたｍＣｈｅｒｒｙ及びホタルルシフェラーゼをコードする逆位融合タンパク質コード領域、並びにＳＲ２１ ａｔｔＰ部位を含む。ルシフェラーゼもｍＣｈｅｒｒｙも、プロモータに対して反対の配向にあるため、発現されない。ＳＲ２１リコンビナーゼが発現する場合、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ配列は組み換えられ、これは、レポータ遺伝子の逆位並びにホタルルシフェラーゼ及びｍＣｈｅｒｒｙの発現をもたらす。 本出願の一実施形態に従って産生された精製組換えＡＡＶ試料中のＡＡＶキャプシドタンパク質を示す。プラスミドＰ４３９で安定してトランスフェクトし、２０ ＭＯＩ（Ａ）及び４０ ＭＯＩ（Ｂ）においてＨｙｐｅｒｆｌａｓｋ容器内で成長及び感染させた細胞から試料を精製し、ＰＡＧＥ及び銀染色に供した。 本出願の一実施形態に従った、内部に停止カセットが挿入された人工イントロンを有するｒｅｐ／ｃａｐ発現カセットを示す。 本出願の一実施形態に従ったベクター（プラスミドＰ４３９）を示す。 ＲＴ－ＰＣＲによってＰ４３９で同定されたＲＮＡスプライス部位の位置及び配列を示す。上の図面は、停止カセット切除後のＲＥＰ遺伝子の構造を表す。ＲＥＰの５’及び３’半分は、ベータ－アクチンイントロン（配列番号１４）の上流半分、ＳＲ２１ＡｔｔＬ要素（配列番号３５）、及びベータ－アクチンイントロンの下流半分（配列番号１５）によって分離される。（２）ベータ－アクチンスプライスドナー（配列番号７１）と、（３）ベータ－アクチンスプライスアクセプタ（配列番号７２）との間のスプライシングを実線によって示す。（１）５’ＲＥＰ配列中の上流スプライスドナー（配列番号６４）と、（３）３’ベータ－アクチンアクセプタ（配列番号７２）との間のスプライシングを点線で示す。スプライスドナー及びアクセプタの配列を下に示す。小文字の配列は、イントロン配列を示す。 本出願の一実施形態に従ったベクター（プラスミドＰ６００）を示す。
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によってあたかもその全体が本明細書に記載されているように組み込まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの同等物を認識するか、又は確認することができよう。かかる均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上必要としない限り、用語「含む（comprise）」並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形は、指定の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。本明細書で使用するとき、用語「含む（comprising）」は、用語「含有する（containing）」又は「含む（including）」に置き換えることができ、又はときに本明細書で使用するとき、用語「有する（having）」に置き換えることもできる。
本明細書で使用するとき、「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲の要素において指定されていない任意の要素、工程、又は成分を除外する。本明細書で使用するとき、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程は除外しない。本出願の態様又は実施形態に関連して本明細書で使用するとき、本開示の範囲を変化させるために、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」、及び「有する」という上記用語のいずれかを、用語「からなる」又は「から本質的になる」に置き換えることができる。
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の接続的な用語「及び／又は」は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用するとき、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。
特に断らない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」なる語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲は、０．９ｍｇ／ｍＬ～１１ｍｇ／ｍＬを含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
アミノ酸配列に関して使用するとき、「配列同一性パーセント（％）」又は「同一性％」又は「％同一」という語句は、アミノ酸配列の全長を構成するアミノ酸残基の数と比較した、２つ又は３つ以上のアラインされたアミノ酸配列の同一のアミノ酸の一致数（「ヒット」）を記載する。２つ又は３つ以上の配列についてアライメントを使用した他の用語において、配列が、当該技術分野で既知の配列比較アルゴリズムを使用して測定した場合の、又は手動でアライン及び目視検査したときの、最大一致性について比較及びアラインされたとき、同じであるアミノ酸残基のパーセンテージ（例えば、アミノ酸配列の全長にわたって９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性）が決定され得る。したがって、配列同一性を決定するために比較される配列は、アミノ酸の置換、付加、又は欠失によって異なり得る。タンパク質配列をアラインするための好適なプログラムは、当業者に既知である。タンパク質配列の配列同一性のパーセンテージは、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＦＡＳＴＡ、又はＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて、例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定され得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。
本明細書で使用するとき、「非自然発生の」核酸又はポリペプチドは、自然界で発生しない核酸又はポリペプチドを指す。「非自然発生の」核酸又はポリペプチドは、実験室及び／又は製造現場で合成、処理、製造、及び／又は他の方法で操作され得る。場合によっては、非自然発生の核酸又はポリペプチドは、処理前に自然発生の核酸又はポリペプチド中に存在しなかった特性を示すように処理、加工、又は操作される自然発生の核酸又はポリペプチドを含み得る。本明細書で使用するとき、「非自然発生の」核酸又はポリペプチドは、それが発見された天然源から単離又は分離された核酸又はポリペプチドであり得、それが天然源において関連した配列への共有結合を欠いている。「非自然発生の」核酸又はポリペプチドは、組換えで、又は化学合成などの他の方法を介して作製され得る。
本明細書で使用するとき、「ハイブリッド」という用語は、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子に関連して使用される場合、異なる血清型キャプシドの一部分と組み合わせた１つの血清型キャプシドの部分を含むｃａｐ遺伝子を意味するよう意図される。この用語はまた、自然発生のＡＡＶ血清型配列が１つ又は２つ以上の非自然発生の変異を含有する、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子バリアントを含む。
本明細書で使用するとき、「スペーサ配列」という用語は、他の遺伝子要素の分離を除いて、明らかな機能を有しない非コード化ヌクレオチドの領域を意味するよう意図される。
本明細書で使用するとき、「作動可能に連結された」という用語は、連結又は並列を指し、そのように記載される構成成分は、それらがそれらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある。例えば、プロモータは、それがコード配列の転写に影響を与える場合、又は対象となるアミノ酸配列に作動可能に連結されたシグナル配列が、膜上で対象となるアミノ酸配列を分泌する若しくは移動させることが可能である場合、コード配列に作動可能に連結されている。
本出願の読者を助けるため、明細書の記載は、様々な段落若しくはセクションに分けられているか、又は本出願の様々な実施形態に向けられている。これらの分離は、段落又はセクション又は実施形態の実体を別の段落又はセクション又は実施形態の実体から切り離すものとみなされるべきではない。反対に、当業者であれば、本明細書の記載が広範な用途を有し、想到され得る様々な段落、パラグラフ、及び文章の全ての組み合わせを包含することを理解するであろう。任意の実施形態の考察は、単なる例示であることを意味するものであり、特許請求の範囲を含む本開示の範囲がこれらの実施例に限定されることを示唆することを意図するものではない。例えば、本明細書に記載の用途（例えば、プラスミドＤＮＡ又はウイルスベクター）の非自然発生の核酸又は組換えベクターの実施形態は、特定の順序で配置された、特定のプロモータ配列、エンハンサ又は調節配列、イントロン、ＡＡＶ Ｒｅｐ及び／又はＣａｐのコード配列、ポリアデニル化シグナル配列などが挙げられるがこれらに限定されない、特定の構成成分を含有し得るが、当業者は、本明細書に開示される概念が、本出願の核酸又はベクターで使用され得る他の順序で配置された他の構成成分に等しく適用され得ることを理解するであろう。本出願は、特定の組み合わせが明示的に記載されているかどうかにかかわらず、本出願の核酸又はベクターで使用され得る任意の配列を有する任意の組み合わせにおける適用可能な構成成分のいずれかの使用を企図する。
本明細書で使用するとき、「ベクター」は、遺伝物質を細胞に運ぶために使用される核酸分子であり、そこで複製及び／又は発現され得る。本開示を考慮して当業者に知られている任意のベクターが使用され得る。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、コスミド、並びに人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡプラスミドである。当業者は、本開示を考慮して、標準的な組換え技術を通して、本出願のベクターを構築することができる。
本出願のベクターは、発現ベクターであり得る。本明細書で使用するとき、「発現ベクター」という用語は、転写可能であるＲＮＡをコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物を指す。発現ベクターとしては、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターなどの、組換えタンパク質を発現させるためのベクター、及びＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターなどの、対象の体内に核酸を送達させて対象の組織で発現させるためのベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクター設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベルなどの要素に依存し得ることが、当業者によって理解されるであろう。
本出願のいくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。非ウイルスベクターの例としては、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、非ウイルスベクターは、ＤＮＡプラスミドである。「ＤＮＡプラスミドベクター」、「プラスミドＤＮＡ」、又は「プラスミドＤＮＡベクター」と互換的に使用される「ＤＮＡプラスミド」は、好適な宿主細胞内で自律複製が可能である二本鎖かつ概して環状のＤＮＡ配列を指す。コードされたポリヌクレオチドの発現に使用されるＤＮＡプラスミドは、典型的には、複製起点、多重クローニング部位、及び例えば、抗生物質耐性遺伝子であり得る選択可能なマーカーを含む。使用され得る好適なＤＮＡプラスミドの例としては、周知の発現系で使用するための市販の発現ベクター（原核細胞系及び真核細胞系の両方を含む）、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるタンパク質の産生及び／又は発現に使用され得るｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株における産生及び／又は発現に使用され得るｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、昆虫細胞内の産生及び／又は発現に使用され得るＭＡＸＢＡＣ（登録商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、哺乳動物細胞内の高レベルの構成的タンパク質発現に使用され得るｐｃＤＮＡ（商標）又はｐｃＤＮＡ３（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、並びにほとんどの哺乳動物細胞内の対象となるタンパク質の高レベル一過性発現に使用され得るｐＶＡＸ又はｐＶＡＸ－１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。任意の市販のＤＮＡプラスミドの骨格は、宿主細胞内のタンパク質発現を最適化するように、例えば、日常的な技術及び容易に入手可能な出発物質を使用することによって、特定の要素（例えば、複製起点及び／若しくは抗生物質耐性カセット）の配向を逆転させるように、プラスミドに内因性のプロモータ（例えば、抗生物質耐性カセット中のプロモータ）を置き換えるように、並びに／又は転写されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子のコード配列）を置き換えるように修飾され得る。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい）。
好ましくは、ＤＮＡプラスミドは、哺乳動物宿主細胞内のタンパク質発現に好適な発現ベクターである。哺乳動物宿主細胞内のタンパク質発現に好適な発現ベクターとしては、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡＴＭ、ｐｃＤＮＡ３ＴＭ、ｐＶＡＸ、ｐＶＡＸ－１、ＡＤＶＡＸ、ＮＴＣ８４５４などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ベクターは、ｐＵＣの複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子（配列番号３０）を含有するｐＵＣ５７に基づくことができる。それは、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモータ（配列番号２６）、ピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼコード領域（配列番号２７）、及びウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化シグナル（配列番号２８）から構築された、哺乳動物ピューロマイシン耐性遺伝子カセットを更に含むことができる。ベクターはまた、エプスタインバーウイルス（Epstein Barr Virus、ＥＢＶ）ＯｒｉＰ複製起点断片（配列番号２９）を含むことができ、これは、ＥＢＶの「二回転対称」領域及び「反復配列のファミリー」領域の複合体を表す。
本出願のベクターはまた、ウイルスベクターであり得る。一般に、ウイルスベクターは、非感染性の状態にされているが、なおもウイルスプロモータ及び導入遺伝子を含有し、したがって、ウイルスプロモータを通した導入遺伝子の翻訳を可能にする、修飾ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡを担持する遺伝子操作されたウイルスである。ウイルスベクターは、頻繁に感染性配列を欠くため、それらは、大規模トランスフェクションのためのヘルパーウイルス又はパッケージングラインを必要とする。使用され得るウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、腸溶性ウイルスベクター、ベネズエラ馬脳炎ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターはまた、非ウイルスベクターであり得る。
好ましくは、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、例えば、組換えアデノウイルスベクターである。本明細書で使用するとき、「組換えアデノウイルスベクター（recombinant adenovirus vector）」、及び「組換えアデノウイルスベクター（recombinant adenoviral vector）」、及び「組換えアデノウイルス粒子」という用語は、互換的に使用され、対象となるポリヌクレオチドを真核細胞に挿入し、ポリヌクレオチドがその後に発現されるように設計された、遺伝子操作されたアデノウイルスを指す。本発明のウイルスベクターとして使用され得るアデノウイルスの例としては、血清型Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４８、Ａｄ４９、Ａｄ５０、Ａｄ５２（例えば、ＲｈＡｄ５２）、及びＰａｎ９（ＡｄＣ６８としても既知）を有するか、又はそれらに由来するものが挙げられ、これらのベクターは、例えば、ヒト、チンパンジー（例えば、ＣｈＡｄ１、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ２１、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２３、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２５、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ２７．１、ＣｈＡｄ２８．１、ＣｈＡｄ２９、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１．１、ＣｈＡｄ３２、ＣｈＡｄ３３、ＣｈＡｄ３４、ＣｈＡｄ３５．１、ＣｈＡｄ３６、ＣｈＡｄ３７．２、ＣｈＡｄ３９、ＣｈＡｄ４０．１、ＣｈＡｄ４１．１、ＣｈＡｄ４２．１、ＣｈＡｄ４３、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ４５、ＣｈＡｄ４６、ＣｈＡｄ４８、ＣｈＡｄ４９、ＣｈＡｄ４９、ＣｈＡｄ５０、ＣｈＡｄ６７、若しくはＳＡ７Ｐ）、又はアカゲザルアデノウイルス（例えば、ｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２、若しくはｒｈＡｄ５３）に由来し得る。例えば、組換えアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ、若しくはＡｄＨｕ）、あるいはシミアアデノウイルス、例えば、チンパンジー若しくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、若しくはＳＡｄＶ）、又はアカゲザルアデノウイルス（ｒｈＡｄ）に由来し得る。
好ましくは、アデノウイルスベクターは、組換えヒトアデノウイルスベクター、例えば、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６、４、３５、７、４８などのいずれか１つである。本出願に有用な組換えウイルスベクターは、本開示を考慮して当該技術分野で既知の方法を使用して調製され得る。例えば、遺伝暗号の縮重を考慮して、同じポリペプチドをコードするいくつかの核酸配列が設計され得る。対象となるタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞（例えば、細菌又は哺乳動物細胞）における適切な発現を確実にするために、任意選択的にコドン最適化され得る。コドン最適化は、当該技術分野で広く適用されている技術であり、コドン最適化ポリヌクレオチドを得るための方法は、本開示を考慮して当業者に周知であろう。
非自然発生の核酸分子又はベクターは、１つ又は２つ以上の発現カセットを含み得る。「発現カセット」は、ＲＮＡ及びタンパク質を作製するために細胞機構を方向付ける核酸分子又はベクターの一部である。発現カセットは、プロモータ配列、オープンリーディングフレーム、３’非翻訳領域（untranslated region、ＵＴＲ）を含み得、任意選択的にポリアデニル化シグナルを含む。オープンリーディングフレーム（open reading frame、ＯＲＦ）は、開始コドンから停止コドンに、対象となるタンパク質（例えば、対象となるＲｅｐ、Ｃａｐ、リコンビナーゼ、又は組換えタンパク質）のコード配列を含有するリーディングフレームである。発現カセットの調節要素は、対象となるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。
本出願の非自然発生の核酸分子又はベクターは、様々な調節配列を含有し得る。本明細書で使用するとき、「調節配列」という用語は、宿主細胞又は生物への、核酸又はその誘導体のうちの１つ（即ち、ｍＲＮＡ）の複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、安定性、及び／又は輸送を含む、核酸分子の機能的調節を可能にするか、それに寄与するか、又はそれを調整する任意の配列を指す。調節要素としては、プロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化シグナル、翻訳停止コドン、リボソーム結合要素、転写ターミネータ、選択マーカー、複製起点などが挙げられるが、これらに限定されない。
非自然発生の核酸分子又はベクターは、対象となるタンパク質の発現を制御するために、好ましくは発現カセット内にプロモータ配列を含み得る。「プロモータ」という用語は、その従来の意味で使用され、作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するヌクレオチド配列を指す。プロモータは、それが転写するヌクレオチド配列の近くの同じ鎖上に位置する。プロモータは、構成的、誘導性、又は抑制性であり得る。プロモータは、自然発生又は合成であり得る。プロモータは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む源に由来し得る。プロモータは、相同プロモータ（即ち、ベクターと同じ遺伝子源に由来）又は異種プロモータ（即ち、異なるベクター若しくは遺伝子源に由来）であり得る。例えば、用いられるベクターがＤＮＡプラスミドである場合、プロモータは、プラスミドに内因性（相同）であり得るか、又は他の源由来（異種）であり得る。好ましくは、プロモータは、発現カセット内の対象となるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に位置する。
使用され得る実施例のプロモータとしては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（mouse mammary tumor virus、ＭＭＴＶ）プロモータ、ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus、ＨＩＶ）プロモータ、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（bovine immunodeficiency virus、ＢＩＶ）の長い末端反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）プロモータ、モロニーウイルスプロモータ、トリ白血病ウイルス（avian leukosis virus、ＡＬＶ）プロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、例えば、ＣＭＶ即時初期プロモータ（CMV immediate early、ＣＭＶ－ＩＥ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ、又はラウス肉腫ウイルス（Rous sarcoma virus、ＲＳＶ）プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。プロモータはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモータであり得る。プロモータはまた、天然又は合成の、筋肉又は皮膚特異的プロモータなどの組織特異的プロモータであり得る。好ましくは、プロモータは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ（ｎｔ－６７２～＋１５）、ＥＦ１－アルファプロモータ、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモータ（配列番号２６）などの強い真核細胞プロモータである。
非自然発生の核酸分子又はベクターは、発現された転写物を安定化し、ＲＮＡ転写物の核外輸送を増強し、かつ／又は転写－翻訳カップリングを改善する追加のポリヌクレオチド配列を含み得る。そのような配列の例としては、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサ配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは、典型的には、ベクターの発現カセット内の対象となるタンパク質（例えば、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、リコンビナーゼ）のコード配列の下流に位置する。エンハンサ配列は、転写因子によって結合されたときに関連する遺伝子の転写を増強する調節ＤＮＡ配列である。エンハンサ配列は、好ましくは、プロモータ配列の下流にあり、ベクターの発現カセット内のコード配列の下流又は上流にあり得る。
本開示を考慮して当業者に既知の任意のポリアデニル化シグナルが使用され得る。例えば、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（例えば、配列番号６０）、ＡＡＶ２ポリアデニル化シグナル（ｂｐ４４１１～４４６６、ＮＣ＿００１４０１．２）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子からのポリアデニル化シグナル（配列番号２３）、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、又はヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。好ましくは、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル（配列番号２８）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号４４１１～４４６６を有するＡＡＶ２のポリアデニル化シグナル、又はＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６０）である。
本開示を考慮して当業者に既知の任意のエンハンサ配列が使用され得る。例えば、エンハンサ配列は、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、又はＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、若しくはＥＢＶからのものなどのウイルスエンハンサであり得る。特定のエンハンサの例としては、ウッドチャックＨＢＶ転写後調節要素（Woodchuck HBV Post-transcriptional regulatory element、ＷＰＲＥ）、ヒトアポリポタンパク質Ａ１前駆体（apolipoprotein A1、ＡｐｏＡＩ）に由来するイントロン／エクソン配列、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １、ＨＴＬＶ－１）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）の非翻訳Ｒ－Ｕ５ドメイン、スプライシングエンハンサ、合成ウサギβ－グロビンイントロン、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、エンハンサ配列は、ＡＡＶのＰ５プロモータを含む。Ｐ５プロモータは、ｒｅｐ遺伝子のコード配列内のシス作用性Ｒｅｐ依存性要素（cis-acting Rep-dependent element、ＣＡＲＥ）の一部である。ＣＡＲＥは、ｃｉｓで存在する場合、複製及びキャプシド形成を増大することが示された。ＣＡＲＥはまた、いくつかのＡＡＶ産生細胞株におけるような、染色体に組み込まれたｒｅｐ遺伝子の増幅に重要である（ＡＡＶ ＩＴＲが存在しない場合）。理論によって束縛されることを望まないが、ｃａｐコード配列の下流に配置されたＰ５プロモータが、潜在的に、Ｃａｐ発現、したがってＡＡＶ収率を増加させるためのエンハンサとして作用すること、及びＰ５プロモータが、染色体に組み込まれた遺伝子を増幅するためのエンハンサ活性も提供することが考えられる。
非自然発生の核酸分子又はベクター、例えば、ＤＮＡプラスミドはまた、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択及び維持のための細菌の複製起点及び抗生物質耐性発現カセットを含み得る。複製起点（origin of replication、ＯＲＩ）は、複製が開始される配列であり、プラスミドが細胞内で再生及び生存することを可能にする。本出願での使用に好適なＯＲＩの例としては、ＣｏｌＥ１、ｐＭＢ１、ｐＵＣ、ｐＳＣ１０１、Ｒ６Ｋ、及び１５Ａ、好ましくは、ｐＵＣが挙げられるが、これらに限定されない。
細菌細胞における選択及び維持のためのベクターは、典型的には、抗生物質耐性遺伝子に作動可能に連結されたプロモータ配列を含む。好ましくは、抗生物質耐性遺伝子に作動可能に連結されたプロモータ配列は、対象となるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータ配列とは異なる。抗生物質耐性遺伝子はコドン最適化され得、抗生物質耐性遺伝子の配列組成は、通常、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉコドン使用に調整される。カナマイシン耐性遺伝子（kanamycin resistance gene、Ｋａｎｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（ampicillin resistance gene、Ａｍｐｒ）、及びテトラサイクリン耐性遺伝子（tetracycline resistance gene、Ｔｅｔｒ）、並びにクロラムフェニコール、ブレオマイシン、スペクチノマイシン、カルベニシリンなどに対する耐性を付与する遺伝子などが挙げられるがこれらに限定されない、本開示を考慮して当業者に既知の任意の抗生物質耐性遺伝子が使用され得る。
哺乳動物細胞における選択及び維持のためのベクターは、典型的には、選択可能なマーカーを付与するタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを含む。好ましくは、遺伝子は、ポリアデニル化シグナルを更に含む。例えば、哺乳動物ピューロマイシン耐性遺伝子カセットは、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモータ（配列番号２６）、ピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼコード領域（配列番号２７）、及びウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化シグナル（配列番号２８）を含むことができる。
ヒト細胞における組換えＡＡＶの製造は、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）及びキャプシド（ｃａｐ）遺伝子、アデノウイルス遺伝子、並びにＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する発現カセットからなるＡＡＶパッケージング可能な導入遺伝子の発現を必要とする。３つ全ての構成成分が、ＡＡＶ産生のために別々のプラスミド上の細胞に送達され得るが、既存のトランスフェクション方法は、大規模培養物に拡大することが困難である。これらの要素のうちのいくつかを宿主細胞株に組み込むことは、ＡＡＶ産生をより効率的にすることができるが、ＡＡＶ及びアデノウイルス遺伝子のうちのいくつかは、細胞増殖抑制性又は細胞傷害性であり、このアプローチを制限する。
本出願は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及びパッケージング可能な導入遺伝子が、好適な宿主細胞に維持され、かつ／又は組み込まれ、かつ増殖され得るように、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を可逆的に不活性化するための非自然発生の核酸分子、ベクター、細胞、及び方法を記載する。リコンビナーゼを発現する組換えアデノウイルスによるこれらの細胞の感染は、ｒｅｐ遺伝子を再活性化し、ＡＡＶ複製及びパッケージングを誘導する。Ｘｉａｏ及び共同研究者によって記載されるアプローチ（Ｑｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１３０１５－１３０２７、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：６１３－６２４）（これは、２つの同一のｌｏｘＰ部位を認識するチロシンリコンビナーゼであるＣｒｅを使用し、結合反応及び切除反応の両方を触媒する）とは異なり、本発明は、このアプローチの発明者によって新たに特徴付けられたセリンリコンビナーゼであるセリンリコンビナーゼ２１（ＳＲ２１）を使用する。Ｃｒｅとは異なり、ＳＲ２１は、異なる配列を有するａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位を認識する。ＳＲ２１によって触媒された結合反応後、ａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位は、組み換えられ、更なる組換えが可能ではないように破壊される。したがって、本出願の方法は、Ｃｒｅによって触媒されるものよりも効率的であり得る。本出願の特定の実施形態は、異なる人工イントロン、エンハンサ、インシュレータなどに挿入された異なる停止カセットなどの追加の特徴を含み、これらは、従来技術におけるアプローチを更に改善する。本出願の可逆的不活性化／再活性化系は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子がパッケージング細胞成長中に厳密に制御されて、したがって宿主細胞に対するＲｅｐタンパク質の細胞増殖抑制性／細胞傷害性の効果を回避することを可能にする。これはまた、ベクターの産生中のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の強い誘導及びＡＡＶベクターの高い収率をもたらす。
セリンリコンビナーゼ
大きいセリンリコンビナーゼファミリーのメンバー（ＳＲ２１など）によって触媒される部位特異的組換えは、相同組換えのための細胞機構を必要としない。典型的には、これは、部位を認識し、ＤＮＡを破壊及び結合する特殊なリコンビナーゼを必要とする。アミノ酸配列相同性及び機構的関連性に基づいて、ほとんどの部位特異的リコンビナーゼは、２つのファミリー：チロシンリコンビナーゼファミリー又はセリンリコンビナーゼファミリーのうちの１つに分類される。それらの名前は、それらがＤＮＡを攻撃するために使用し、かつ鎖交換中にそれに共有結合するようになる保存された求核性アミノ酸残基に由来する。
セリンリコンビナーゼは、「付着部位」として既知の別々の組換え認識部位：ａｔｔＰ、「付着ファージ」及びａｔｔＢ、「付着細菌」染色体に結合し、それを組み換える。ａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位は、中央ジヌクレオチド組換え交差部位の周囲の二回転対称から構成される。ａｔｔＰ部位及びａｔｔＢ部位の左半分及び右半分は、亜鉛リボン（ＺＤ）及びリコンビナーゼ（ＲＤ）ドメインによって、リコンビナーゼモノマーによって結合されている（Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：８３４１－８３５６）。
以下の実施例により詳細に記載されるように、本明細書において「セリンリコンビナーゼ２１」又は「ＳＲ２１」と称されるセリンリコンビナーゼは、本発明において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ株ＣＣＭＡ－５６０のゲノムで新たに同定された。ＳＲ２１によって認識されたａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位もまた、本発明において特徴付けられた。
１つの一般的な態様では、本出願は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、非自然発生の核酸分子に関する。好ましくは、非自然発生の核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、非自然発生の核酸分子は、配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも有する少なくとも８５％、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、本出願は、非自然発生の核酸を含むベクターに関する。ベクターは、対象となる細胞、例えば、細菌細胞又は哺乳動物細胞内でセリンリコンビナーゼを発現する発現ベクターであり得る。一実施形態では、ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ又は本明細書に記載の、若しくは当該技術分野で既知の任意の他の好適なプロモータの制御下で、哺乳動物細胞においてセリンリコンビナーゼを発現する。特定の実施形態では、ベクターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルなどのポリアデニル化シグナル又は本明細書に記載の、若しくは当該技術分野で既知の任意の他の好適なポリアデニル化シグナルを更に含むことができる。
一実施形態では、ベクターは、配列番号１０のヌクレオチド配列を有するプラスミドＰ１７５などのＤＮＡプラスミドである。
別の実施形態では、ベクターは、組換えアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
一実施形態では、ベクターは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組換えΔＥ１／ΔＥ３アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ウイルスであり、コード配列は、哺乳動物細胞内で機能的なプロモータの制御下にある。好ましくは、プロモータは、ＣＭＶプロモータである。より好ましくは、組換えＡｄ５ベクターは、５’から３’の順序で、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＣＭＶプロモータを含み、これは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＮＣ＿００１６６９．１、ｎｔ２５５０～２７７４）に作動可能に連結されている。一実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、細菌翻訳開始コドン「ＴＴＧ」が「ＡＴＧ」によって置き換えられ、３つの点変異が配列番号３内の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を破壊するために導入されたことを除いて、配列番号３と同じである。これらの制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、Ｘｂａ Ｉ部位（ＴＣＴＡＧＡ）、Ｓａｃ Ｉ部位（ＧＡＧＣＴＣ）、ＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）である。
本開示を考慮して当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、本出願のセリンリコンビナーゼをコードするベクターが作製され得る。
以下の実施例により詳細に記載されるように、本出願のセリンリコンビナーゼのａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位が、本発明において同定される。特定の実施形態では、本出願のセリンリコンビナーゼは、配列番号７のヌクレオチド配列を含むａｔｔＰ部位又はそのバリアントを含む。特定の実施形態では、本出願のセリンリコンビナーゼは、配列番号７と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を含むａｔｔＰ部位を認識する。
特定の実施形態では、本出願のセリンリコンビナーゼは、配列番号８若しくは配列番号９のヌクレオチド配列を含むａｔｔＢ部位、又はそのバリアントを含む。特定の実施形態では、本出願のセリンリコンビナーゼは、配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を含むａｔｔＢ部位を認識する。
一実施形態では、本出願は、細胞内で部位特異的組換えを実施する方法に関する。本方法は、
１）配列番号７と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、及び配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位を有する、核酸分子を含む細胞を得ることと、
２）配列番号２に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するセリンリコンビナーゼをコードする非自然発生の核酸分子を、細胞に導入することと、
３）セリンリコンビナーゼが、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の部位特異的組換えを触媒することを可能にする条件下で、細胞を成長させることと、を含む。
好ましい実施形態では、本出願は、細胞内で部位特異的組換えを実施する方法に関する。本方法は、
１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、及び配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位を有する、核酸分子を含む細胞を得ることと、
２）配列番号２のアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードする非自然発生の核酸分子を、細胞に導入することと、
３）セリンリコンビナーゼが、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の部位特異的組換えを触媒することを可能にする条件下で、細胞を成長させることと、を含む。
組換えＡＡＶの産生のための構築物、細胞、及び方法
以下の実施例に示されるように、新たに同定された本出願のセリンリコンビナーゼを使用して、組換えＡＡＶの産生を改善することができる。
修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子構築物
１つの一般的な態様では、本出願は、修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐ遺伝子を含む非自然発生の核酸分子に関し、修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐ遺伝子は、４つのＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子と、４つのＲｅｐタンパク質によって共有されるｒｅｐ遺伝子のコード配列に挿入された人工イントロンと、を有する。人工イントロンは、人工イントロンの５’スプライス部位の下流及び分岐部位の上流に挿入された停止カセットを含み、停止カセットは、５’から３’の順序で、（ｉ）配列番号７と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位と、（ｉｉ）スプライスアクセプタと、（ｉｉｉ）ターミネータと、（ｉｖ）配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位と、を含む。好ましくは、ａｔｔＰ部位は、配列番号７のヌクレオチド配列を有し、ａｔｔＢ部位は、配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有する。
本明細書で使用するとき、「イントロン」は、ＲＮＡスプライシングによって除去可能であるヌクレオチドの配列として広く定義される。「ＲＮＡスプライシング」は、成熟ｍＲＮＡを形成するためのプレｍＲＮＡからのイントロンの切除を意味する。本明細書で使用するとき、「人工イントロン」は、遺伝子の自然発生のイントロンではないが、それにもかかわらずＲＮＡスプライシングによって除去可能であるヌクレオチドの配列を指す。例えば、「人工イントロン」は、挿入された停止カセットを有する自然発生のイントロンであり得る。
人工イントロンを含むイントロンは、５’スプライス部位又は接合部、スプライスアクセプタ又は分岐点、並びに３’スプライス部位又はスプライス接合部を含有する。「５’スプライス部位」又は「５’スプライス接合部」という用語は、接合部が、遺伝子又は核酸断片の５’断片の３’末端とイントロンの５’末端との間にあり、ＲＮＡスプライシングに必要とされるイントロンの５’末端にコンセンサス配列を含む、エクソン－イントロン接合部の位置を意味する。「スプライスアクセプタ」又は「分岐点」という用語は、ＲＮＡスプライシング中の最初のエステル交換反応中に投げ縄構造を形成するのに役立つ、３’スプライス部位から約２０～５０ｂｐに位置するヌクレオチド、通常はアデノシンを指す。「３’スプライス部位」又は「３’スプライス接合部」という用語は、接合部が、遺伝子又は核酸断片の３’断片の５’末端とイントロンの３’末端との間にあり、ＲＮＡスプライシングに必要とされるイントロンの３’末端にコンセンサス配列も含む、エクソン－イントロン接合部の位置を意味する。「コンセンサス配列」という用語は、ＲＮＡスプライシングに必要とされる５’又は３’スプライス接合部のいずれかの中にある／又はそれに隣接しているヌクレオチドを意味し、これらの配列は通常、不変であるか又は高度に保存されているかのいずれかである。
多数のｍＲＮＡの分析により、特定のヌクレオチドが典型的なイントロン及びスプライス接合部で保存されていることが明らかになった。例えば、イントロンのほぼ不変の塩基は、５’－ＧＵ及び３’－ＡＧである。これらの５’及び３’保存領域に隣接する特定の塩基は、多くの場合、異常な（非ランダムな）頻度で見られる。分岐点アデノシン、通常、３’スプライス部位から２０～５０個の塩基も保存されている。例えば、エクソンとの関連でイントロンの一般的なコンセンサスを示すＧａｏ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６：２２５７－２２６７の図４を参照されたく、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ（２００８）の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、４０～５０，０００個の塩基の長さの範囲であり得るイントロンの中央領域は、概して、スプライシングが生じるのに不要である。イントロンは、スプライセオソームによる投げ縄構造としてＲＮＡ又はプレｍＲＮＡから除去される。エクソンのスプライシングは、２つの連続的なエステル交換反応を介して進行する。
発現配列へのイントロンの挿入は、当該技術分野で既知の任意の方法によって達成され得る。隣接するエクソンの状況、並びに使用される実際のイントロン配列は、新しい「イントロン」が効果的にスプライシングで切り出されるかどうかにおいて役割を果たす。本発明に好適なイントロンは、インシリコで複合配列を作製し、オンラインスプライス予測プログラムを使用して、効率的なＲＮＡスプライシングについて十分高いスコアを与えるｒｅｐ遺伝子配列及びイントロン配列の組み合わせを見つけることによって試験され得る。ゲノム又は合成配列中のイントロンのいずれも、本開示を考慮して、本発明の構築物で使用するために試験及び最適化され得る。
Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０の４つ全てのｒｅｐオープンリーディングフレームの発現を破壊するために、人工イントロンは、好ましくは、４つのＲｅｐタンパク質によって共有されるｒｅｐ遺伝子のコード配列に挿入されている。したがって、特定の実施形態では、４つの全てのＯＲＦを破壊するために、人工イントロンが、ＡＡＶ２のヌクレオチド９９６及び最大１９０５（ＮＣ＿００１４０１．２）又は別のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子内の対応する位置の後に挿入されている。しかし、停止カセットが人工イントロンに挿入されたときに作用するために、イントロンが可能な限りはるか上流でｒｅｐ遺伝子に挿入されていることが好ましい。
更に、イントロン挿入部位のすぐ上流及び下流のエクソンの状況は、可能な挿入部位として作用するもの、例えば、上で考察されたエクソンに関連したイントロンの一般的なコンセンサスを定義するために重要である。一実施形態では、コンセンサス配列ＣＡＧ＾Ｇ（式中、＾は、挿入が行われる場所を示す）は、以下のようなＡＡＶ２におけるｒｅｐ遺伝子の関連領域内で生じ、番号は、挿入前のＡＡＶの最後のヌクレオチドを示す：１０５２、１０６１、１７１２、及び１９０６。別の実施形態では、コンセンサス配列ＡＡＧ＾Ｇは、ＡＡＶ２の位置１０２２（Ｑｉａｏによって使用される）、１１１２、１４７５、１５１４、１７００、１７４２、及び１７８４で生じる。ＡＡＧ＾Ａなどの他のコンセンサス部位は、例えば、ＡＡＶ２のヌクレオチド１３４０で生じる。好ましい挿入部位もまた、本開示を考慮して、他のＡＡＶのｒｅｐ遺伝子で同定され得る。
本発明に有用な人工イントロンは、ゲノムライブラリなどの任意の源に由来し得る。イントロンは、以下に記載されるように、プライマーを使用してヒトＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）によって得られ得る。細胞におけるＲＮＡスプライシングが可能な任意のイントロンが、本発明の方法で使用され得る。以下の実施例では、イントロンは、ヒトβ－アクチン遺伝子のイントロンである。
本出願の実施形態によれば、人工イントロンを介したＲＮＡスプライシングに加えて、Ｒｅｐタンパク質の発現も、人工イントロンに挿入された停止カセットを介したＤＮＡスプライシングによって調節される。停止カセットは、本発明によって特徴付けられるものなど、セリンリコンビナーゼによって特異的に認識されたａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位が隣接する転写ターミネータを含む。一実施形態では、ターミネータは、１つ又は２つ以上のポリアデニル化シグナルを含む。別の実施形態では、ターミネータは、好ましくは配列番号１９のヌクレオチド配列を有する、自己切断ＲＮＡモチーフをコードするポリアデニル化シグナルの下流のヒトβ－グロビン遺伝子からの配列などの、効率的な転写終結のための別の配列を含む。それ自体のＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムなどの他のターミネータも、本発明で使用され得る。ベータグロビン要素に取って代わる他のリボザイムの使用については、Ｗｅｓｔ（２００８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ２９：６００－６１０を、リボザイムの設計の説明については、Ｋｈａｒｍａ（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４：ｅ３９を参照されたく、両方の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、停止カセットは、選択可能なマーカーをコードする遺伝子を更に含む。一実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子は、哺乳動物プロモータ（例えば、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１）及び細菌（例えば、Ｌａｃ ｚｙａ）プロモータ、続いてＳＶ４０からのものなどのポリアデニル化シグナルによって駆動される、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット（ｎｅｏ）（配列番号１８）を含む。この遺伝子は、哺乳動物細胞及び細菌細胞において、それぞれ、ネオマイシン及びカナマイシンに対する耐性を付与する。理論によって束縛されることを望まないが、細胞株の発生のために選択可能なマーカーを提供することに加えて、選択可能なマーカー遺伝子は、ｒｅｐ遺伝子の転写を更に遮断して、それによって修飾ｒｅｐ遺伝子を含有する宿主細胞の安定性を高めることができると考えられている。本発明で使用され得る他の選択可能なマーカー遺伝子としては、抗生物質選択遺伝子（ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブレオマイシン）、代謝遺伝子（例えば、グルタミンシンターゼ若しくはヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase、ＨＰＲＴ））、ｍＣｈｅｒｒｙなどの視覚マーカー、ベータ－グラクトシダーゼなどの酵素、分泌アルカリホスファターゼ、又は任意の他の好適なマーカー遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、停止カセットは、停止カセットが一次ｍＲＮＡ転写物からスプライシングで切り出されることを防止するために、スプライスアクセプタを含む。スプライスアクセプタがスキップされないという条件で、任意の自然発生のスプライスアクセプタ部位又は合成配列が使用され得る。本出願の実施形態によれば、スプライスアクセプタは、コンセンサス（ｙＴｎＡｙｎｎ）（式中、ｙは、Ｃ又はＴであり、ｎは、任意のヌクレオチドである）に一致する分岐点配列、ポリピリミジントラクト（４～２４ｎｔ）、「ＡＧ」ジヌクレオチド、及び２０～８０ｂｐの真核細胞遺伝子エクソン配列（又はイントロン配列の隣に配置されたときにエクソンのように作用する合成配列）を含有する。配列は、０．４以上の信頼度スコアで、ＮｅｔＧｅｎｅ２スプライス予測ソフトウェア（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／、Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．，Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．，ａｎｄ Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｓ．：Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｍＲＮＡ Ｄｏｎｏｒ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９１，２２０，４９－６５）によって（又は同様のスプライス予測ソフトウェアを用いて）、スプライスアクセプタ部位として認識されるべきであり、１．０により近いスコアがより良好である。一実施形態では、スプライスアクセプタは、配列番号１７のヌクレオチド配列（（ＮＣ＿００００８６．７、マウスＨＰＲＴ遺伝子からのヌクレオチド５３００１９９８～５３００２１３８、及びヒトアグーチシグナル伝達タンパク質からの２９ｎｔ領域（ＮＣ＿００００２０．１１、ヌクレオチド３４２６２７６５～３４２６２７９３）を含む。
本出願の実施形態によれば、停止カセットは、人工イントロンの５’スプライスドナー部位の下流及びスプライスアクセプタ「分岐点」の上流に挿入されている。停止カセットは、挿入が部位の機能を損傷しないという条件で、２つの部位間の任意の位置に挿入され得る。一実施形態では、停止カセットは、２つの部位の中央に挿入されている。以下の実施例に記載の１つの例示的な実施形態では、停止カセットは、５’イントロン断片が、配列番号１４のヌクレオチド配列を有し、３’イントロン断片が、配列番号１５のヌクレオチド配列を有するように、ヒトβ－アクチン遺伝子のイントロンに挿入されている。
本明細書に提供されるように、いくつかの実施形態では、３’イントロン断片は、ＲＥＰ／ＣＡＰ遺伝子をＡＡＶにパッケージングするには大きすぎるものにするスペーサ配列を含み得る。例えば、ＡＡＶパッケージング限界は、約５．０ｋｂである。したがって、ＲＥＰ／ＣＡＰ遺伝子を約５．０ｋｂを超えるものにするスペーサ配列は、本明細書に提供される本開示に従って生成され得る。いくつかの実施形態では、スペーサ配列は、３’イントロン断片に挿入された２ｋｂランダムスペーサである。したがって、以下の実施例に記載の例示的な実施形態では、停止カセットは、５’イントロン断片が、配列番号１４のヌクレオチド配列を有し、３’イントロン断片が、配列番号６６のヌクレオチド配列を有するように、ヒトβ－アクチン遺伝子のイントロンに挿入されている。しかしながら、スペーサ配列は、２ｋｂである必要はなく、約５．０ｋｂよりも大きいＲＥＰ／ＣＡＰ遺伝子をもたらす任意の長さであり得ることが理解される。
任意のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子が、本発明の修飾ｒｅｐ遺伝子に含まれ得る。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ１～ＡＡＶ８のうちの１つのｒｅｐ遺伝子、又はそのハイブリッドを含むことができる。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能であり、様々なＡＡＶ遺伝子について以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を有する：ＡＡＶ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７．１；ＡＡＶ２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２；ＡＡＶ３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１７２９．１；ＡＡＶ４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９．１；ＡＡＶ５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００６１５２．１；ＡＡＶ６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２８７０４．１；ＡＡＶ７、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００６２６０．１；及びＡＡＶ８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００６２６１．１。
以下の実施例では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１９０～２２０２を有するヒトＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子が使用される。
いくつかの実施形態では、ｒｅｐ遺伝子における潜在的スプライス部位の修飾が、この部位でのスプライシングを排除するために行われ得る。例えば、ＤＮＡ配列が変異しているが、変異がコードされたアミノ酸を変化させない、ＤＮＡ配列の同義変異が行われ得る。
修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を有する構築物
別の一般的な態様では、本出願は、本出願の修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、又はそのハイブリッドを含む、非自然発生の核酸分子に関する。好ましくは、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の下流にある。
一実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたポリアデニル化シグナルを更に含む。以下の実施例に記載の例示的な実施形態では、ＡＡＶ２ポリアデニル化シグナル（ｂｐ４４１１～４４６６、ＮＣ＿００１４０１．２）が、ＡＡＶ９ ｃａｐコード配列の下流に含まれる。
別の実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、エンハンサを更に含む。以下の実施例では、ＡＡＶ２ ｒｅｐ Ｐ５プロモータ（ｂｐ１９０～３１３、ＮＣ＿００１４０１．２）が、ＡＡＶ２ポリアデニル化シグナルの下流に含まれる。
特定の実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の３つ全てをコードする。
他の実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、キャプシドタンパク質の３つ未満をコードする。例えば、ＡＡＶ血清型１～５は、ＶＰ２なしで細胞を成功裏にパッケージングし、細胞内で複製し、かつ細胞を形質導入することが報告された（Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００５ Ａｕｇ；７９（１５）：９９３３－９９４４）。したがって、一実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１～ＡＡＶ５のいずれか、又はそのハイブリッドのＶＰ１及びＶＰ３をコードするが、ＶＰ２はコードしない。
任意のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が本発明で使用され得る。例えば、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１～ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＤＪのうちの１つのｃａｐ遺伝子、又はそのハイブリッドを含むことができる。一実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９バリアントである。ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。ＡＡＶ１～ＡＡＶ８ゲノムについて、上記のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を参照されたい。ＡＡＶ９ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３０５７９．１を有し、ＡＡＶＤＪは、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質アクセッション番号３Ｊ１Ｑ＿Ａを有する。
以下の実施例に記載される一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３０５７９．１のヌクレオチド配列を有するヒトＡＡＶ９のｃａｐオープンリーディングフレームが使用される。
修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び導入遺伝子を有する構築物
別の一般的な態様では、本出願は、本出願の修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及びＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する導入遺伝子を含む、非自然発生の核酸分子に関する。
ＩＴＲは、ＡＡＶの生物学において重要なシス活性配列である。ＩＴＲの重要な役割は、ＡＡＶ ＤＮＡ複製にある。ＩＴＲはまた、ＡＡＶ複製におけるその役割に加えて、ＡＡＶゲノムパッケージング、転写、非許容条件下での負の調節、及び部位特異的組み込みにとって必須である。
一実施形態では、１３０ｂｐ ＩＴＲは、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲに由来する配列番号２０のヌクレオチド配列（ヌクレオチド４５３５～４６６４、ＮＣ＿００１４０１．２）を含み、導入遺伝子に隣接するために使用される。別の実施形態では、より短い変異ＩＴＲが使用される。例えば、より短い遺伝子について、ＩＴＲは、より短くなるように変異しており、遺伝子は、二本鎖形態に折り畳まれて、発現を増加させ、かつ感染後の発現を加速させることができる。ＭｃＣａｒｔｙ ２００８ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００８；１６（１０）：１６４８－５６を参照されたい。
別の実施形態では、導入遺伝子は、プロモータ、好ましくは、哺乳動物細胞内で機能するプロモータを含む。以下に記載の実施例では、ヒトＥＦ１－アルファプロモータ（エクソン１、イントロン１、及びエクソン２の一部を含む）（配列番号２１）が、導入遺伝子に含まれる。
別の実施形態では、導入遺伝子は、ポリアデニル化シグナルを含む。以下に記載の実施例では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子からのポリアデニル化シグナル（配列番号２３）が、導入遺伝子に含まれる。
更に別の実施形態では、非自然発生の核酸分子は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及びＩＴＲが隣接する導入遺伝子に隣接する一対のインシュレータを含む。別の実施形態では、非自然発生の核酸分子は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及びＩＴＲが隣接する導入遺伝子の上流に単一のインシュレータを含む。一実施形態では、インシュレータは、遺伝子発現のクロマチン関連抑制を遮断するゲノム要素を含む（Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：５５４－５５８、Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：８２２）。
本明細書に記載されるものなどの任意の好適なインシュレータが本発明で使用され得る。一実施形態では、インシュレータは、配列番号２４のヌクレオチド配列を有するヒト抗リプレッサ要素４０である。別の実施形態では、インシュレータは、配列番号２５のヌクレオチド配列を有するマウス抗リプレッサ要素４０である。別の実施形態では、別の実施形態では、インシュレータは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７４９．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０４である。別の実施形態では、インシュレータは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５０．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ０６である。別の実施形態では、インシュレータは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５１．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ０７である。別の実施形態では、インシュレータは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５２．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ１２である。別の実施形態では、インシュレータは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５３．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ１３である。別の実施形態では、インシュレータは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５４．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ３５である。別の実施形態では、インシュレータは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５５．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ３６である。別の実施形態では、インシュレータは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５７．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ５２である。別の実施形態では、インシュレータは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５８．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ５３である。別の実施形態では、インシュレータは、２つ又は３つ以上のコピーにおいてＡＹ０４０８３５．１のヌクレオチド配列を有するグロビン遺伝子座からのニワトリＨＳ４インシュレータである。
一対のインシュレータを含む非自然発生の核酸分子は、対象となる遺伝子セグメントに隣接する対として、同じ又は異なるインシュレータを有することができる。好ましくは、異なるインシュレータは、対象となる遺伝子セグメントに隣接する対として使用される。以下の実施例に記載の１つの例示的な実施形態では、ヒト抗リプレッサ要素４０（ＡＹ１９０７５６．１、配列番号２４）及びマウス抗リプレッサ要素４０（配列番号２５）が、インシュレータとして使用される。以下の実施例に記載の別の例示的な実施形態では、ヒト抗リプレッサ要素４０（ＡＹ１９０７５６．１、配列番号２４）が、インシュレータとして使用される。
本明細書に提供されるように、本開示の構築物はまた、他のベクター構成成分をミスパッケージングするリスクを低下させるために、ＡＡＶ導入遺伝子の両側にスペーサ配列を含み得る。一実施形態では、非自然発生の核酸分子は、導入遺伝子の上流及び下流にそれぞれ、第１及び第２のスペーサ配列を含む。特定の実施形態では、スペーサ配列は、２ｋｂスペーサ配列である。特定の実施形態では、非自然発生の核酸分子は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の上流に第１のインシュレータを含み、導入遺伝子の上流及び下流にそれぞれ、第１及び第２のスペーサ配列を更に含み、第１のインシュレータ及び第２のスペーサ配列は、独立して、（ａ）配列番号６７のヌクレオチド配列及び（ｂ）配列番号６８のヌクレオチド配列からなる群から選択される。
組換えＡＡＶの産生のための細胞及び方法
本出願の修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子からのＲｅｐタンパク質の発現は、ＤＮＡスプライシング及びＲＮＡスプライシングの機構の両方による厳密な制御下にあり、したがって、修飾ｒｅｐ遺伝子を含有する安定した宿主細胞がバイオリアクタにおいて生成され、多数まで成長することを可能にする。ＡＡＶ産生について、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及びＩＴＲが隣接する導入遺伝子を含有する安定した宿主細胞は、最初に多数まで成長し、次いで、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子におけるａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位を認識するセリンリコンビナーゼを発現する複製欠損性アデノウイルスに感染する。セリンリコンビナーゼによって触媒されたａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の部位特異的組換え部位は、停止カセットをスプライシングで切り出し、機能的イントロンによって分離された５’及び３’コード配列の両方を含むプレｍＲＮＡの産生をもたらす。次いで、イントロンは、遍在性細胞機構（スプライセオソーム）によって切除され、４つのＲｅｐタンパク質をコードするｍＲＮＡをもたらし、高力価でのＡＶＶの産生を可能にする。
修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及びＩＴＲが隣接する導入遺伝子を含有する安定した宿主細胞は、遺伝子をコードする１つ又は２つ以上の核酸分子で細胞を形質導入することによって得られ得る。一実施形態では、安定した宿主細胞は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする第１の核酸分子で細胞を形質導入して、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む第１の宿主細胞を得ること、及びＩＴＲが隣接する導入遺伝子をコードする第２の核酸分子で第１の宿主細胞を更に形質導入することによって得られる。一実施形態では、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、第１の宿主細胞の染色体に安定して組み込まれる。別の実施形態では、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、第１の宿主細胞内でエピソーム性のままである。ＩＴＲが隣接する導入遺伝子はまた、宿主細胞に安定して組み込まれ得るか、又はエピソーム性のままであり得る。
別の実施形態では、安定した宿主細胞は、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及びＩＴＲが隣接する導入遺伝子をコードする核酸分子で細胞を形質導入することによって得られる。修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及びＩＴＲが隣接する導入遺伝子は、宿主細胞に安定して組み込まれ得るか、又はエピソーム性のままであり得る。
安定した宿主細胞は、セリンリコンビナーゼを発現するアデノウイルスに感染する前に、高い細胞密度まで成長することができる。
本開示を考慮して、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、本出願のセリンリコンビナーゼを発現する複製欠損性アデノウイルスが安定した宿主細胞に導入される。一実施形態では、複製欠損性アデノウイルスは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、好ましくは、配列番号２と１００％同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、組換えΔＥ１／ΔＥ３アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ウイルスである。例えば、アデノウイルスは、配列番号３と少なくとも８５％同一、好ましくは、配列番号３と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。
本明細書に開示されるように、本開示はまた、本明細書に記載の細胞を２アミノプリン（２－ＡＰ）と接触させることによって、ＡＡＶ産生を増加させるための方法及び組成物を含む。アデノウイルスのライフサイクルの後期段階では、ウイルスは、宿主タンパク質合成を阻害する。これは、部分的に、ｃａｐ開始複合体ｅＩＦ４ＦからＭｎｋ１キナーゼを移動させ、ｅＩＦ４Ｅの脱リン酸化及びｃａｐ依存性ｍＲＮＡ翻訳の阻害をもたらす、後期アデノウイルス１００－キロダルトン（ｋＤａ）タンパク質の作用に起因する（例えば、Ｃｕｅｓｔａ（２００４），Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：７７０７－７７１６を参照されたい）。アデノウイルス後期遺伝子転写物は、リボソームシャンティングと呼ばれる機構による翻訳を促進する、それらの５’末端における三分節リーダ配列を含む（例えば、Ｙｕｅｈ（２０００）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １４：４１４－４２１を参照されたい）。ＡＡＶ産生細胞株との関連で、ｃａｐ依存的翻訳の阻害は、ＡＡＶ ＲＥＰ及びＣＡＰ遺伝子の発現、並びにＡＡＶ複製及びパッケージングに必要な初期アデノウイルスタンパク質を遮断すると予測される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は、アデノウイルスインデューサを使用してＡＡＶ産生細胞株の効率を高めるために、宿主タンパク質翻訳停止を遮断する化学物質と共に培養される。
特定の実施形態では、宿主タンパク質翻訳停止を遮断する化学物質は、２－アミノプリン（２－ＡＰ）である。２－ＡＰは、アデノウイルスによって誘導される宿主タンパク質合成の停止を遮断することが示されている（例えば、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：２５４４－２５５５、Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：７１１５－７１１９を参照されたい）。２－ＡＰを用いたＡＡＶ産生細胞の処理は、通常は後期感染によって分解されるサイトケラチンネットワークの回復を含む、感染の細胞変性効果を低減することが可能であった（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：２５４４－２５５５）。２－ＡＰは、ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲ（真核生物翻訳開始因子２アルファキナーゼ２（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２ ａｌｐｈａ ｋｉｎａｓｅ ２）、ＥＩＦ２ＡＫ２としても既知）を含む、インビトロでのキナーゼの数を阻害するが（ＤｅＢｅｎｅｄｅｔｔｉ（１９８３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅ，２５８：１４５５６－１４５６２）、細胞内のＰＫＲ活性化及びアデノウイルス感染後に生じるｅＩＦ－２αのリン酸化を遮断することはできなかった（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：７１１５－７１１９）。２－ＡＰは、ｍＲＮＡレベルを上昇させることなく、初期アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＤＢＰ）レベルを１０～２０倍上昇させ（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：７１１５－７１１９）、ｃａｐ依存的翻訳に対する効果と一致している。
したがって、いくつかの実施形態では、導入遺伝子を含む組換えＡＡＶを産生する方法は、本開示の細胞を２－アミノプリンと共に培養することを含む。いくつかの実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１０ｍＭ未満である。いくつかの実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約５ｍＭ未満である。いくつかの実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約２．２５ｍＭ未満である。いくつかの実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１．２５ｍＭ未満である。いくつかの実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１μＭ～約１．２５ｍＭである。いくつかの実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１０μＭ～約１．２５ｍＭである。いくつかの実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１００μＭ～約１．２５ｍＭである。いくつかの実施形態では、２－アミノプリン濃度は、約１．２５ｍＭである。
特定の実施形態では、本開示の細胞は、組換えアデノウイルスによる感染の約２４時間後に２－アミノプリンと接触する。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、組換えアデノウイルスによる感染の約２０時間後に２－アミノプリンと接触する。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、組換えアデノウイルスによる感染の約１２時間後に２－アミノプリンと接触する。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、組換えアデノウイルスによる感染の約３０時間後に２－アミノプリンと接触する。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、組換えアデノウイルスによる感染の約３６時間後に２－アミノプリンと接触する。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、組換えアデノウイルスによる感染の約４８時間後に２－アミノプリンと接触する。
本出願の以下の実施例は、本出願の本質を更に説明するためのものである。当業者は、広い発明概念から逸脱することなく前述の実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
材料
細胞：ＨＥＫ２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ、カタログ番号ＣＲＬ－１５７３）；ＰＥＡＫ－ｒａｐｉｄ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ、カタログ番号ＣＲＬ２８２８）。
組織培養培地及び試薬：ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；カタログ番号３１９８５－０６２）；ＤＭＥＭ、高グルコース（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０５６９－０１０）；ＤＭＥＭ、フェノールレッドなし（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号Ａ１４４３０－０１）；Ｈｙｃｌｏｎｅ透析ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号ＳＨ３００７９．０３）；９６ウェルＴＣプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ；カタログ番号３５９６）；６ウェル組織培養プレート、透明（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３５１６）；培養プレート９６、乳白色（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；カタログ番号６００５６８０）；ＴｒｙｐＬＥセレクト細胞解離試薬（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１２５６３－０１１）；ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、カルシウムなし、マグネシウムなし、Ｄ－ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１４１９０－１４４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）５０ｍｇ／ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０１３１－０２７）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｎｉｇｅｒ由来のピューロマイシン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ９６２０）；Ｔ１５０組織培養フラスコ１５０ｍｍ２（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号ＣＬＳ４３０８２５）；ＧｌｕｔａＭａｘ １００ｘ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号３５０５０－０６１）；非組織培養処理６ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５１１４６）；Ｈｙｐｅｒｆｌａｓｋ Ｍ容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号１００３０）；ＤＭＥＭ中の２．５％ ＣｌｏｎａＣｅｌｌメチルセルロース（Ｌ－グルタミンなしで、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、及び重炭酸ナトリウムを含有する）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ、カタログ番号０３８９９－ＤＩ）。
トランスフェクション試薬：Ｆｕｇｅｎｅ－ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ、カタログ番号Ｅ２３１１）；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ｌ３０００００８）；デオキシヌクレオチド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ番号Ｄ７２９５－２ＭＬ）。
チューブ：１５ｍＬコニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３００５３）；１．５ｍＬスクリューキャップチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ ＡＧ ＆ Ｃｏ．、ＫＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号７２．６９２．００５）。
精製キット及びアッセイ試薬：Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号２７１０６）；ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ（商標）＋ＴＥ－１０００カラム（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ ＣＡ、カタログ番号６３６０７９）；Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ、カタログ番号Ｅ２９４０）；銀染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒカタログ番号２４６００）；Ｐｈａｓｅ－ｍａｋｅｒチューブを伴うＴｒｉｚｏｌ Ｐｌｕｓ ＲＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ３３２５４）；ＤＮＡ－Ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＡＭ１９０６）；Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、カタログ番号７４０６０９．５）。
酵素：Ｓｐｅ Ｉ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、カタログ番号（Ｒ３１３３Ｓ）；ウシ膵臓由来のＤＮＡｓｅ ＩグレードＩＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１０１０４１５９００１）；ＮＥＸＴ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｑ５ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０５４４５Ｓ）。
緩衝液及び化学物質：ＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）緩衝液（１×緩衝液構成成分：５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸塩、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ７．９、２５℃で）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｂ７２０４Ｓ）；Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｅ１０１４－２５Ｋ）；１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１０×ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ｎ８０８０００６）；デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ６７５０－２５ｇ）；１Ｍ ＴＲＩＳ－ＨＣＬ ＰＨ８．５（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｔ１０８５）；１０×ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ｎ８０８０００６）［１００ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．３（２５℃で）；５００ｍＭのＫＣｌ；１５ｍＭのＭｇＣｌ２；オートクレーブ処理、脱イオン化、限外濾過された水中の０．０１％ゼラチン］；１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号２４０４０－０３２）；剪断サケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＡＭ９６８０）；ウイルス希釈緩衝液（Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、ＶＤＢ）［１×ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ、２μｇ／ｍＬの剪断サケ精子ＤＮＡ、及び０．０５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８）；β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ３１４８）；アデノウイルス製剤緩衝液（１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、７５ｍＭのＮａＣｌ、５％スクロース、０．０２％ポリソルベート８０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのヒスチジン、０．５％ ＥｔＯＨ）；２－アミノプリン、ＤＭＥＭ＋２％ ＦＢＳ中で１００ｍＭに溶解した硝酸塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ２３８０）。
ＲＴ－ＰＣＲ試薬：ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒカタログ番号１８８０８０－０５１）；Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９４Ｓ）；臭化エチジウムを伴う１％ ＴＡＥ Ｍｉｎｉ ＲｅａｄｙＡｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ－ＲＡＤ、カタログ番号１６１３０１６）；Ｄａｒｋ Ｒｅａｄｅｒ Ｂｌｕｅ Ｌｉｇｈｔ Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ（Ｃｌａｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｄｏｌｏｒｅｓ，ＣＯ、カタログ番号ＤＲ４６Ｂ）
デジタル液滴ＰＣＲ：２×ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号１８６－３０２６）；ＤＧ３２ ＡｕｔｏＤＧ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号１８６４１０８）；Ａｕｔｏ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ Ｏｉｌ ｉｎ ＰＢＳ（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号１８６４１１０）；液滴リーダオイル（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号１８６３００４）；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｗｉｎ．ｔｅｃ ９６－Ｗｅｌｌ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅｓ（カタログ番号９５１０２０３４６）；Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号１８６－４１０１）；ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号１８６－４００３）；Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ｗｉｔｈ Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄカタログ番号１８５－１１９７）。
ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ ｑＰＣＲアッセイ：これらのアッセイの２０倍ストックは、順方向及び逆方向ＰＣＲプライマー（１８μＭ）と、蛍光消光剤ＺＥＮ及びＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １（３ＩＡＢｋＦＱ）並びにＦＡＭ又はＨＥＸのいずれかの蛍光レポータ色素を含有する５’ヌクレアーゼプローブ（５μＭ）とからなる。アッセイは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡによって合成された。ｑＰＣＲアッセイのためのプライマー及びプローブ配列は、以下のとおりである。
ｍＣｈｅｒｒｙ：プライマー１（配列番号３６、５’－ＣＴＧＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＴＧＴＡＧＴＣ－３’）；プライマー２（配列番号３７、５’－ＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡ－３’）；プローブ（配列番号３８、５’－ＦＡＭ－ＴＴＧＧＡＣＡＴＣ－ＺＥＮ－ＡＣＣＴＣＣＣＡＣＡＡＣＧＡＧ－３ＩＡＢｋＦＱ－３’）；
アデノウイルスエクソン２（Ａｄ５Ｅ２）：プライマー１（配列番号３９、５’－ＧＧＧＴＧＡＴＧＣＡＧＴＡＧＡＡＧＧＴＡＡＧ－３’）；プライマー２（配列番号４０、５’－ＡＴＧＡＡＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＡＴＧ－３’）；プローブ（配列番号４１、５’－ＨＥＸ－ＴＣ ＴＴＧＴＴＣＣ－Ｚｅｎ－ＣＡＧＣＧＧＴＣＣＣＡＴＣ－３ＩＡＢｋＦＱ－３’）；
Ｐ５（ＡＡＶのＰ５プロモータ領域）：プライマー１（配列番号４２、５’－ＧＴＧＧＴＣＡＣＧＣＴＧＧＧＴＡＴＴＴＡ－３’）；プライマー２（配列番号４３、５’－ＧＧＧＡＣＣＴＴＡＡＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＧＴ－３’）；プローブ（配列番号４４、５’－ＦＡＭ－ＴＴＴＧＡＡＧＣＧ－ＺＥＮ－ＧＧＡＧＧＴＴＴＧＡＡＣＧＣ－３１ＡＢｋＦＱ－３’）；
ＡＡＶ ＲＥＰ遺伝子：プライマー１（配列番号４５、５’－ＧＴＣＣＧＴＧＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＡＴＴ－３’）；プライマー２（配列番号４６、５’－ＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧ－３’）；プローブ（配列番号４７、５’－ＦＡＭ－ＴＣＴＧＡＴＧＣＴ－ＺＥＮ－ＧＴＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡ－３ＩＡＢｋＦＱ－３’）；
ＡＡＶ９ ＣＡＰ遺伝子：プライマー１（配列番号４８、５’－ＣＣＧＧＧＴＣＣＡＡＧＧＴＡＴＴＴＧＴＡＡ－３’）；プライマー２（配列番号４９、５’－ＣＴＣＡＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＴＣＡＡＣ－３’）；プローブ（配列番号５０、５’－ＦＡＭ－ＡＣＡＴＣＡＡＧＡ－ＺＥＮ－ＣＡＡＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＴ－３ＩＡＢｋＦＱ－３’）；及び
ベータラクタマーゼ（アンピシリン耐性）遺伝子：プライマー１（配列番号５１、５’－ＣＣＡＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＡ－３’）；プライマー２（配列番号５２、５’－ＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧ－３’）；プローブ（配列番号５３、５’－ＦＡＭ－ＴＧＣＡＣＧＡＧＴ－ＺＥＮ－ＧＧＧＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＴ－３ＩＡＢｋＦＱ－３’）。
ＰＡＧＥ電気泳動：４×ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＮＰ０００７）；１×ＭＯＰＳ泳動緩衝液中の４～１２％ビス－トリスＰＡＧＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＮＰ０３２２ＰＫ２）；２０×ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＮＰ０００１）。
ＡＡＶ精製緩衝液及び供給品：０．２μｍのＰＥＳ膜フィルター（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号５６７－００２０）；ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶＸ樹脂で予め充填された０．５×５ｃｍ ＰＯＲＯＳ ＧｏＰｕｒｅクロマトグラフィカラム（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ３６６５２）；Ａｍｉｃｏｎ １５ １００ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａカタログ番号ＵＦＣ９１００２４）；ＣＩＭ ＱＡ Ｄｉｓｋ ０．３４ｍＬ容積（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｓｌｏｖｅｎｉａ）；緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、４００ｍＭのＮａＣｌ）；緩衝液Ｂ（２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、４０ｍＭのＮａＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）；緩衝液Ｃ（２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．５、４００ｍＭのＮａＣｌ）；緩衝液Ｄ（１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）；緩衝液Ｅ（２０ｍＭのＢＴＰ、ｐＨ１０．０、０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、１０ｍＭのＮａＣｌ）；緩衝液Ｆ（２０ｍＭのビス－トリスプロパンｐＨ１０．０、０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、４００ｍＭのＮａＣｌ）；ビス－トリスプロパン（Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｏｐａｎｅ、ＢＴＰ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｂ４６７９）。
他の機器：ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）；ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＥｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルリーダＭｏｄｅｌ ２１０４（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。
ＳＲ２１リコンビナーゼの同定及び組換え発現
クエリとして、ＳＰＢｅｔａ ｃ２インテグラーゼタンパク質（クエリ、配列番号１）を有するＮＣＢＩでの非冗長タンパク質データベースのＢＬＡＳＴ検索を使用して、推定セリンリコンビナーゼ（Ｓｂｊｃｔ、配列番号２）を、タンパク質レベルで６４％の配列同一性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ株ＣＣＭＡ－５６０のゲノムにおいて同定した（図１）。推定セリンリコンビナーゼ又はインテグラーゼは、推定プロファージ挿入の一部である。このリコンビナーゼをＳＲ２１（セリンリコンビナーゼ２１）と命名した。ＳＲ２１をコードするＤＮＡ配列を配列番号３に示す。
プロファージ挿入を含有しないＣＣＭＡ－５６０に密接に関連する細菌株（「Ｆａｉｒｖｉｅｗ」株）は、クエリ（配列番号５８）として、リコンビナーゼコード領域の３’末端及びそれ以降からのＣＣＭＡ－５６０ ＤＮＡ配列を使用したＮＣＢＩでの配列データベースのＢＬＡＳＴ検索によって同定された（図２）。ＣＣＭＡ－５６０における推定プロファージ挿入部位の上流及び下流配列に対応するＦａｉｒｖｉｅｗ株のＤＮＡ配列は、本明細書では「挿入前配列」と称され、配列番号４に示される。この配列（配列番号４）を、ＣＣＭＡ－５６０株のゲノム配列をＢＬＡＳＴするためのクエリとして使用することによって、９４ｋｂ上流に他のプロファージ－宿主ＤＮＡ接合部が同定された。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ株ＣＣＭＡ－５６０の右及び左プロプロファージ－宿主ＤＮＡ接合部の配列は、それぞれ、配列番号５及び配列番号６に示される。
中央同一領域（「ＡＣＴＧＡＣＡＡＡＧＣＧＧＴ」）の上流の配列（配列番号５４）を交換し、中央ジヌクレオチド及び二回転対称を最大化したａｔｔ部位境界：ａｔｔＰ（配列番号７）；ａｔｔＢ－ＣＣＭＡ－５６０（配列番号８）を選ぶことによって、ＳＲ２１リコンビナーゼａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列を、それぞれ、宿主ＤＮＡ接合部（配列番号５）及び（配列番号６）から再構成した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓのＦａｉｒｖｉｅｗ株の宿主ＤＮＡ接合部（配列番号４）に由来するａｔｔＢ配列（配列番号９）は、株ＣＣＭＡ－５６０（配列番号８）からの再構成されたａｔｔＢ配列に対して２つのミスマッチを含有する。図３は、これら２つの交互のａｔｔＢ配列とのａｔｔＰのアラインメントを示し、二回転対称の位置を強調する。
哺乳動物細胞におけるリコンビナーゼ活性の測定
ＣＭＶプロモータ、続いてＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの制御下で、哺乳動物細胞内でＳＲ２１リコンビナーゼを発現させるために、ベクター（Ｐ１７５）（配列番号１０）を遺伝子合成（ＧＥＮＥＷＩＺ、Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）によって構築した。ＳＲ２１リコンビナーゼオープンリーディングフレームは、細菌翻訳開始コドン「ＴＴＧ」が「ＡＴＧ」によって置き換えられ、３つの点変異が制限エンドヌクレアーゼ認識部位を破壊するために導入されたことを除いて、配列番号３と同じである。オープンリーディングフレームにおけるこれらの変化は、コードされたＳＲ２１リコンビナーゼアミノ酸配列におけるいかなる変化ももたらさない。
リコンビナーゼレポータプラスミド（Ｐ４１）もまた、遺伝子合成（ＧＥＮＥＷＩＺ、Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）によって構築した（配列番号１１；図４）。それは、ＥＦ１αプロモータによって駆動される、構成的に発現された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）－自己切断Ｆ２Ａ－レニラルシフェラーゼ（Renilla luciferase、ｒＬＵＣ）融合タンパク質をコードする。それはまた、ＣＭＶプロモータに対してアンチセンス配向のＳＲ２１ ａｔｔＰ（配列番号７）及びａｔｔＢ（配列番号９）シグナルが隣接する、リコンビナーゼ活性化－ｍＣｈｅｒｒｙ－自己切断Ｐ２Ａ－ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase、ｆＬＵＣ）レポータ遺伝子をコードする。ＳＲ２１リコンビナーゼがａｔｔＰ及びａｔｔＢシグナルを組み換えると、コード領域は、センス配向に反転し、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ｆＬＵＣタンパク質が発現される（図４を参照されたい）。
ヒト細胞内のＳＲ２１リコンビナーゼ活性を測定するために、７５，０００個のＨＥＫ２９３細胞を、１００μＬの高グルコースＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清中の９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに播種した。リコンビナーゼレポータプラスミド（Ｐ０４１）±ＳＲ２１リコンビナーゼ発現プラスミド（Ｐ１７５）＋デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ量を正規化するため）を、表１に示すように、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中のＦｕｇｅｎｅ－ＨＤトランスフェクション試薬と、室温で１５分間複合体化し、播種された細胞の３連ウェルにトランスフェクトした。プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。
Figure 2022541915000002
ホタルルシフェラーゼ（ｆＬＵＣ）及びレニラルシフェラーゼ（ｒＬＵＣ）を、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＤｕａｌ Ｇｌｏアッセイキットを使用して、トランスフェクトされたウェルにおいて順次アッセイした。培地を組織培養プレートのトランスフェクトされたウェルから除去し、１００μＬのＤＭＥＭ培地（フェノールレッドなし）及びＤｕａｌ Ｇｌｏルシフェラーゼ＋ｆＬＵＣ基質の１：１の混合物を添加した。プレートを室温で１０分間インキュベートした。溶解物を乳白色９６ウェルプレートに移した。ｆＬＵＣ活性を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルリーダを使用して測定した。次に、１ウェル当たり５０μＬのＳｔｏｐ－ａｎｄ－Ｇｌｏ緩衝液＋レニラ基質を添加し、プレートを穏やかに振盪しながら１０分間インキュベートした。レニラルシフェラーゼシグナルを、同じＥｎｖｉｓｉｏｎリーダで読み取った。
結果：リコンビナーゼレポータは、リコンビナーゼ発現プラスミドと同時トランスフェクトされた場合に、代わりにデオキシヌクレオチドで同時トランスフェクトされた場合よりも１５３５倍多いホタルルシフェラーゼを産生した（表２）。この差は、レニラルシフェラーゼ（ｒＬＵＣ）活性が、レポータ単独のトランスフェクションにおいて５倍高かったため、異なるトランスフェクション効率によって説明されない。このデータは、ＳＲ２１リコンビナーゼがヒト細胞において非常に活性であり、この結果が３つの独立した実験を表すことを実証している。
Figure 2022541915000003
ＲＥＰ／ＣＡＰ＋導入遺伝子プラスミドの構築
ＡＡＶ複製（ＲＥＰ）及びキャプシド（ＣＡＰ）遺伝子が、細胞に安定して組み込まれ得、後に高密度培養物中でＡＡＶを産生するために誘導され得る場合、哺乳動物細胞内のＡＡＶの大規模産生が可能であり得る。しかしながら、ＲＥＰタンパク質の発現は、毒性であり得、ＨＥＫ２９３細胞などのアデノウイルスＥ１遺伝子を発現するものなどのＲＥＰ遺伝子が発現される宿主において、安定した細胞株を開発することを困難にする。野生型ＡＡＶは、２つのプロモータ及び交互スプライシングの使用から生じる、重複するリーディングフレームで４つのＲＥＰタンパク質をコードする。したがって、ＲＥＰ発現を制御するための誘導性プロモータの使用は、容易ではない。以前の研究は、人工イントロン内のＲＥＰコード領域に挿入された「停止カセット」が、安定した細胞株がＨＥＫ２９３細胞内で生成されることを可能にしたことを実証した（Ｑｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１３０１５、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２２：６１３－６２４）。アデノウイルス感染によって送達されたＣｒｅリコンビナーゼを使用した停止カセットの切除は、ＲＥＰ発現を回復し、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子のＡＡＶ複製を開始した。この例では、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子を含有したプラスミド中のＲＥＰ／ＣＡＰ発現カセットとの関連で、リコンビナーゼ活性化ＲＥＰ遺伝子の改善されたバージョンが構成された。
ＡＡＶ２ ＲＥＰ遺伝子（ヒトＡＡＶ２のｂｐ１９０～２２０２、ＮＣ＿００１４０１．２）、続いてＡＡＶ９ ＣＡＰオープンリーディングフレーム（ＡＹ５３０５７９．１）、ＡＡＶ２ポリアデニル化シグナル（ｂｐ４４１１～４４６６、ＮＣ＿００１４０１．２）、及びＡＡＶ２ ＲＥＰ Ｐ５プロモータの第２のコピー（ｂｐ１９０～３１３、ＮＣ＿００１４０１．２）を使用して、ＡＡＶ ＲＥＰ／ＣＡＰ９発現カセット（配列番号１３）を構築した。
スプライス部位予測ソフトウェア（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／のＮｅｔＧｅｎｅ２；Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．，Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．，ａｎｄ Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｓ．：Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｍＲＮＡ Ｄｏｎｏｒ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９１，２２０，４９－６５）を使用して、ヒトβ－アクチン遺伝子からのイントロンをＲＥＰコード領域に挿入するための好適な位置を選んだ。４つ全てのＲＥＰ転写物に共通する領域において、ＡＡＶ２（ＮＣ＿００１４０１．２）のヌクレオチド番号１０５２の下流にイントロンを挿入した。イントロン及び挿入位置の両方が、Ｑｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１３０１５）によって使用されたものとは異なる。その後、このβ－アクチンイントロンの上流半分と下流半分と（それぞれ、配列番号１４と１５）の間に、停止カセット（以下）を挿入した。
停止カセット
転写停止カセット（配列番号１６）は、以下の要素から構成された。
・ＳＲ２１ ａｔｔＰ（配列番号７）
・強いスプライスアクセプタ（配列番号１７）（ＮＣ＿００００８６．７、マウスＨＰＲＴ遺伝子からのヌクレオチド５３００１９９８～５３００２１３８、及びヒトアグーチシグナル伝達タンパク質からの２９ｎｔ領域（ＮＣ＿００００２０．１１、ヌクレオチド３４２６２７６５～３４２６２７９３）。これは、停止カセットが一次ｍＲＮＡ転写物からスプライシングで切り出されることを防止するために含まれた。
・ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット（配列番号１８）は、哺乳動物プロモータ（マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１）及び細菌（Ｌａｃ ｚｙａ）プロモータ、続いてＳＶ４０からのポリアデニル化シグナルによって駆動された。この遺伝子は、哺乳動物細胞及び細菌細胞において、それぞれ、ネオマイシン及びカナマイシンに対する耐性を付与する。
・効率的な転写終結に重要である自己切断ＲＮＡモチーフをコードするポリアデニル化シグナルの下流のヒトβ－グロビン遺伝子からの配列（Ｔｅｉｘｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：５２６－３０；配列番号１９）。
・ＳＲ２１ ａｔｔＢ（配列番号８）。
ＡＡＶ導入遺伝子
ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する導入遺伝子を、ＡＡＶ ＲＥＰ／ＣＡＰ領域の下流のＰ４３９ベクター（配列番号１２）にコードした。１３０ｂｐ ＩＴＲ（配列番号２０）は、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲ（ヌクレオチド４５３５～４６６４、ＮＣ＿００１４０１．２）に由来し、ＨＰＲＴ－Ｅ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子の上流及び導入遺伝子の逆方向３’に挿入した。
導入遺伝子は、ヒトＥＦ１－アルファプロモータ（エクソン１、イントロン１、及びエクソン２の一部を含む）（配列番号２１）、ｍＣｈｅｒｒｙ－自己スプライシングＥ２Ａリンカー－ヒトＨＰＲＴ融合遺伝子をコードする配列（配列番号２２）、及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子からのポリアデニル化シグナル（配列番号２３）からなった。
インシュレータ
ＲＥＰ／ＣＡＰ及びＩＴＲ－導入遺伝子要素には、遺伝子発現のクロマチン関連抑制を遮断するゲノム要素（Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：５５４－５５８、Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：８２２）：ヒト抗リプレッサ要素４０（ＡＹ１９０７５６．１、配列番号２４）及びマウス抗リプレッサ要素４０（配列番号２５）が隣接した。
プラスミド骨格
プラスミド骨格は、以下の要素を含有する。
・ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモータ（配列番号２６）、ピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼコード領域（配列番号２７）、及びウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化シグナル（配列番号２８）から構築された、哺乳動物ピューロマイシン耐性遺伝子カセット。
・エプスタインバーウイルス（Epstein Barr Virus、ＥＢＶ）ＯｒｉＰ複製起点断片（配列番号２９）（これは、ＥＢＶの「二回転対称」領域及び「反復配列のファミリー」領域の複合体を表す）。
・プラスミド複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子をコードするｐＵＣ５７ベクター配列（配列番号３０）。
完全プラスミドＰ４３９の配列は、配列番号１２に示される。
ＳＲ２１リコンビナーゼによる停止カセット除去の試験効率
停止カセットがヒト細胞内でＳＲ２１リコンビナーゼによって正確に除去され得るかどうかを試験するために、ベクターＰ４３９（配列番号１２）及びＳＲ２１リコンビナーゼ発現ベクターＰ１７５（配列番号１０）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を使用して、製造業者の指示に従ってＰＥＡＫ－Ｒａｐｉｄ細胞に同時トランスフェクトし、５％ ＣＯ２中３７℃において３日間、ＤＭＥＭ及び１０％ ＦＢＳを含有する培地中で培養した。培地を除去し、細胞をＤ－ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、３７℃で５分間ＴｒｙｐＬＥとインキュベートした。細胞を滅菌マイクロフュージチューブに移し、遠心分離によってペレット化し、１ｍＬのＤ－ＰＢＳで１回洗浄し、再びペレット化した。細菌からプラスミドを単離するために設計されたＱｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用したアルカリ溶解によって、エピソームプラスミドを回収した。
組み換えられていないプラスミドＤＮＡを破壊するために、回収されたＤＮＡのアリコートを、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ中の酵素Ｓｐｅ Ｉ－ＨＦで、３７℃において１時間及び８０℃において２０分消化した。回収されたＤＮＡを、以下のサイクル条件を用いて、ＮＥＸＴ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｑ５ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、プライマーＰ３４９Ｆ３（配列番号３２）及びＰ３４９Ｒ９（配列番号３３）を用いたＰＣＲ増幅に供した：９８℃１分；３５ｘ（９８℃１０秒、７２℃１０秒）；５分７２℃。１％アガロースゲル上の電気泳動に供したときに、予測サイズの単一ＰＣＲ生成物が観察された。ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ（商標）ＴＥ－１０００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィによって、ＰＣＲ生成物を精製した。ＰＣＲ生成物を、ＰＣＲに使用した同じプライマー（ＧｅｎｅＷｉｚ）を使用して配列決定した。得られた配列（配列番号３４）は、停止カセットが、ａｔｔＰ（配列番号７）及びａｔｔＢ（配列番号８）配列を組み換え、ａｔｔＬ組換え配列（配列番号３５）を産生することによって、ＳＲ２１リコンビナーゼによってプラスミドＰ４３９から正確に除去されたことを実証した。
ＳＲ２１リコンビナーゼを発現する組換えアデノウイルス血清型５の構築
組換えΔＥ１／ΔＥ３アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ウイルスを、Ｅ３領域を欠く修飾コスミド（ｐＷＥ／Ａｄ５．ＡｆｌＩＩ－ｒＩＴＲｓｐ．ΔＥ３、米国特許出願公開第６３４０５９５（Ｂ１）号）が使用されたことを除いて、Ｅ１欠失ベクターの産生について以前に記載されているように（Ｈａｖｅｎｇａ ｅｔ ａ．（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７５：３３３５－３３４２）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞における相同組換え手順（Ｆａｌｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１９０９－１９１７）によって、Ｂａｔａｖｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で生成した。このコスミド、並びに１～４５４のＡｄ５配列（左ＩＴＲ及びパッケージングシグナル）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータを含有する導入遺伝子発現のためのカセット（ｎｔ－６７２～＋１５）、ＳＲ２１リコンビナーゼコード領域、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル（ＮＣ＿００１６６９．１、ｎｔ２５５０～２７７４）、及びｎｔ３５１１～６０９５）の範囲の第２のＡｄ５配列を含有する、プラスミドＰ３２１（配列番号３１）との、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の共発現。ＰＥＲ．Ｃ６細胞内のＰ３２１ Ａｄ５配列（ｎｔ３５１１～６０９５）とコスミドｐＷＥ／Ａｄ５．ＡｆｌＩＩ－ｒＩＴＲｓｐ．ΔＥ３との間の相同組換えは、組換えアデノウイルスを産生する。精製ウイルスストックを、２段階ＣｓＣｌ勾配バンド手順によって得て、単離されたウイルスストックを、アデノウイルス製剤緩衝液（１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、７５ｍＭのＮａＣｌ、５％スクロース、０．０２％ポリソルベート８０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのヒスチジン、０．５％ ＥｔＯＨ）に透析した。
安定した細胞株の生成
プラスミドＰ４３９（配列番号１２）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を使用して、製造業者の指示に従って、付着ＰＥＡＫ－ＲＡＰＩＤ細胞にトランスフェクトし、３７℃において、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋０．０５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ中のＴ２５フラスコで培養した。２４時間後、細胞をＴｒｙｐＬＥで処理し、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋０．０５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ＋０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含むＴ７５フラスコに移した。細胞を、同じ培地に２週間連続で毎週１：１０に分割した。トランスフェクションの３週間後に、細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋０．０５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ＋５．０μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む培地に、３週間毎週１：１０に分割した。
ＤＭＥＭ＋３０％ ＦＢＳ＋１×ＧｌｕｔａＭａｘ＋５μｇ／ｍＬのピューロマイシン＋０．０５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ中の１％ ＣｌｏｎａＣｅｌｌメチルセルロースに、細胞を希釈し、非組織培養処理６ウェルプレートに播種し、３７℃で３週間培養することによって、単細胞クローンを産生した。ピペッターを使用して、クローンをメチルセルロースプレートから、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋０．０５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ＋５．０μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む９６ウェルＴＣ処理プレートに移した。クローンを、標準的な方法によって同じ培地で増殖した。
クローンのスクリーニング
ＡＡＶ産生についてクローンをスクリーニングするために、細胞を、１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ中の９６ウェルプレートに２連で播種し、３７℃で一晩インキュベートした。ＳＲ２１アデノウイルスを無血清ＤＭＥＭ中で１ｍＬ当たり１Ｅ８ウイルスゲノムに希釈した。播種された細胞からの培地を１００μＬの希釈アデノウイルスで置き換え、プレートを３７℃で４日間インキュベートした。１０μＬの以下の混合物を添加することによって細胞を溶解した：ＰＢＳ＋１０単位の５％Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ中の５％デオキシコール酸塩。プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞破片をペレット化し、上清中のＡＡＶウイルスをデジタル液滴ＰＣＲ（digital droplet PCR、ｄｄＰＣＲ）によって定量化した。
デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）
ｄｄＰＣＲ定量化は、Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ２３：１１５－１２５によって記載される方法に基づいた。２μＬの溶解物を、３７℃で１時間、サーマルサイクラ内の９６ウェルプレートで、１×ＰＣＲ緩衝液＋２０ｍＭのトリスｐＨ８．５＋８単位のＤＮＡｓｅ Ｉを含有する２０μＬの反応物中でＤＮＡｓｅ消化した。２μＬのＤＮＡｓｅ消化試料を９８μＬのウイルス希釈緩衝液（ＶＤＢ）で希釈し、２μＬのこの希釈物を、１×ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ＋１×ＰＣＲプライマー／ｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子のためのプローブ（材料セクションを参照されたい）を含有するｄｄＰＣＲ反応物に添加した。ｄｄＰＣＲ液滴を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ自動化液滴メーカーを使用して形成した。ＰＣＲサイクルは、以下のとおりであった：９５℃１０分；４２ｘ（９４℃３０秒、６０℃１分、７２℃１５秒、３つ全てが１秒当たり２℃のサイクル時間）；９８℃１０分；４℃保持。ＦＡＭ蛍光を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ液滴リーダで、製造業者の指示に従って検出した。ＦＡＭ－蛍光陽性液滴として検出されるような最高のＤＮＡｓｅ耐性粒子を産生したクローンを、増殖及び更なるスクリーニングに供した。
クローンのスクリーニング－第２のアッセイ
スクリーニングされるクローンの１．２５Ｅ６細胞を、３ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ中の６ウェルプレートの単一ウェルに播種し、３７℃で２日間インキュベートした。成長培地を、５Ｅ８ Ａｄ５－ＳＲ２１ウイルス粒子を含有する３ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳで置き換えた。プレートを３７℃に戻して３日間インキュベートした。細胞及び培地を１５ｍＬチューブに移し、３回の凍結融解サイクル（ドライアイス／３７℃インキュベーション）に供し、続いて３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞破片をペレット化した。２μＬの各試料を、上記のｍＣｈｅｒｒｙアッセイを用いたＤＮＡｓｅ消化及びｄｄＰＣＲ定量化に供した。Ｐ４３９Ｃ４細胞は、Ａｄ５－ＳＲ２１ウイルスによる感染時にほとんどのＡＡＶを産生し、更なる特性評価のために選択された（表３）。
Figure 2022541915000004
時間経過実験
２つの異なる成長温度での培養培地中のＡＡＶ産生及び分泌の動態を決定するために、新たな実験を行った。２ｍＬの非酵素的解離溶液を、Ｔ１５０フラスコ中のＰ４３９－Ｃ４細胞のＰＢＳ洗浄単層に添加し、フラスコを３７℃で５分間インキュベートした。フラスコを８ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳで洗浄し、細胞を５０ｍＬの遠心チューブに移した。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットをＤＭＥＭ＋２％ ＦＢＳ中に再懸濁した。細胞を同じ培地で１ｍＬ当たり１．２５Ｅ６細胞に希釈した。４ｍＬの細胞を４つの６ウェルプレートの各ウェルに播種した。ＤＭＥＭ＋２％ ＦＢＳ中の１ｍＬ（２Ｅ８ｖｐ）のＡｄ５－ＣＭＶ－ＳＲ２１アデノウイルスをウェルに添加した。２つのプレートを３７℃でインキュベートし、２つのプレートを５％ ＣＯ２で３２℃においてインキュベートした。８日間の各日、細胞スクレーパを使用して、細胞及び培地を回収して、付着細胞を取り除き、試料を１５ｍＬのコニカルチューブに移した。チューブを３０００ｒｐｍで５分間回転させ、アリコートを１．５ｍＬのスクリューキャップチューブに移し、ｄｄＰＣＲアッセイまで－２０℃で凍結させた。
試料を、上記のように２連でＤＮＡｓｅ処理し、各ＤＮＡｓｅ処理試料に対してＶＤＢで３つの段階希釈を行った。試料を、１×ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ＋１×ｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＡＭアッセイ＋１×Ａｄ５Ｅ２－ＨＥＸアッセイ（材料セクションを参照されたい）を含有するｄｄＰＣＲ反応物中で定量化した。ｄｄＰＣＲを上記のように実施した。
結果：
細胞培養培地中のアデノウイルス及びＡＡＶは、８日間の時間経過にわたって増加した（表４）。アデノウイルス複製は、３２℃でより遅くなり、おそらく遅延アデノウイルス細胞変性効果の結果として、より高いＡＡＶ産生をもたらした。３２℃でのＡＡＶ産生は、細胞当たり１４，０００ゲノムコピーを超えた。
Figure 2022541915000005
Ｈｙｐｅｒｆｌａｓｋ培養物
８．３Ｅ０７ Ｐ４３９Ｃ４細胞を、５５０ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン、＋５０．０μｇ／ｍＬのＧ４１８中の２つのＨｙｐｅｒｆｌａｓｋ Ｍ容器に播種し、３７℃で３日間インキュベートした。３日間の成長後の密度は、フラスコ当たり３．６Ｅ８細胞であると推定された。５５０ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ中にウイルスを希釈し、ハイパーフラスコ中の培地を希釈ウイルスで置き換えることによって、フラスコを４０ ＭＯＩ（１．４Ｅ１０ ｖｐ）又は２０ ＭＯＩ（７．２Ｅ０９ ｖｐ）に感染させた。細胞を５％ ＣＯ２において３２℃で７日間インキュベートした。上清を７日後に感染から採取し、０．２μｍのＰＥＳ膜フィルターを通過させることによって浄化した。
ＡＡＶＸ精製
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣシステムに取り付けられた、１ｍＬの総容積までＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶＸ樹脂で予め充填された、０．５×５ｃｍ ＰＯＲＯＳ ＧｏＰｕｒｅクロマトグラフィカラムを、３ｍＬ／分の流速で１０カラム容積（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ、ＣＶ）緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、４００ｍＭのＮａＣｌ）を用いて平衡化した。ウイルス懸濁液を４．５ｍＬ／分の流速で充填し、続いて１０ｍＬの緩衝液Ａを充填して、非結合試料を洗い流した。５ｍＬの低塩ベンゾナーゼ緩衝液、緩衝液Ｂ（２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、４０ｍのＭＮａＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）でカラムを平衡化し、次いで、２５０単位／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅを含有する１５ｍＬの緩衝液Ｂでカラムを充填することによって、オンカラムＤＮＡ消化を実施した。次いで、カラムを室温で３０分間インキュベートし、続いて、緩衝液Ａで１５ＣＶを洗浄した。ウイルスを１５ＣＶ緩衝液Ａ（２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．５、４００ｍＭのＮａＣｌ）を用いて０．５ｍＬ画分で溶出し、２５μＬの５００ｍＭビス－トリスプロパン、ｐＨ１０．０で直ちに中和した。単一ピーク溶出が観察された。曲線下の全ての画分をプールし、３ラウンドの緩衝液添加／遠心分離を使用して、Ａｍｉｃｏｎ １５ １００ｋＤａ ＭＷＣＯ（カタログ番号ＵＦＣ９１００２４、Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、濃縮し、緩衝液Ｄ（１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）に緩衝液交換した。緩衝液交換及び濃縮された親和性クロマトグラフィ生成物を、アニオン交換クロマトグラフィに供して、空のキャプシドからＡＡＶを更に精製した。
陰イオン交換クロマトグラフィ
親和性クロマトグラフィ生成物（ウイルス懸濁液）を、緩衝液Ｅ（２０ｍＭのＢＴＰ、ｐＨ１０．０、０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、１０ｍＭのＮａＣｌ）中で４５ｍＬに希釈し、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２ｍＬ／分の流速において、ＣＩＭ ＱＡ Ｄｉｓｋ（ＢＩＡ分離、０．３４ｍＬ容量）に充填した。カラムを、１０ＣＶの滅菌濾過緩衝液Ｅ（２０ｍＭのＢＴＰ、ｐＨ１０．０、０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、１０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。ウイルスを、１００％緩衝液Ｅから１００％緩衝液Ｆ（２０ｍＭのビス－トリスプロパン、ｐＨ１０．０、０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、４００ｍＭのＮａＣｌ）の６０ＣＶ勾配で溶出し、０．５ｍＬの画分を採取した。曲線下の全ての画分をプールし、２０００×ｇで５分間の遠心分離によって、Ａｍｉｃｏｎ １５ １００ｋＤａ ＭＷＣＯ（カタログ番号ＵＦＣ９１００２４、Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して濃縮し、緩衝液Ｄ（１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）に緩衝液交換した。
タンパク質の可視化
２μＬの濃縮溶出液を、５％ β－メルカプトエタノールで補充したＮｕＰａｇｅ ＬＤＳ試料緩衝液（４×）中で熱変性させ（１０分間９５℃）、１×ＭＯＰＳ泳動緩衝液中の４～１２％ビス－トリスＰＡＧＥゲル上で電気泳動させた。ゲルを、製造業者の指示に従って銀染色に供した。
ｄｄＰＣＲ
ウイルス濃度を、上記のｍＣｈｅｒｒｙアッセイを使用したデジタル液滴ＰＣＲによって測定した。
結果
Ｈｙｐｅｒｆｌａｓｋ容器内のＰ４３９Ｃ４細胞の感染及び成長は、２０及び４０ ＭＯＩに感染したときに、それぞれ、１．９Ｅ１３及び７．０Ｅ１３ゲノムコピー（genome copy、ＧＣ）を産生した。これは、２０及び４０ ＭＯＩ感染について、それぞれ、細胞当たり５．２Ｅ４及び１．９Ｅ５ＧＣに対応する。ウイルス試料の純度を、ＰＡＧＥ電気泳動及び銀染色を通して調べた。３つのＡＡＶ９キャプシドアイソフォーム（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）について予想されるサイズに対応する３つのバンドのみが目に見えた（図５）。キャプシドタンパク質（ＶＰ１（８７ｋＤａ）、ＶＰ２（７２ｋＤａ）、及びＶＰ３（６２ｋＤａ）は、他の組換えＡＡＶベクターについて以前に報告されているように、約１：１：１０の予想される化学量論で存在する（Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ（２００８）Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．２１：５８３－５９３）。
ミスパッケージングされたＤＮＡのレベルの測定
産生中に使用される、ＡＡＶ ＲＥＰ又はＣＡＰ遺伝子をコードする配列及びプラスミドベクターに由来する原核生物配列は、ＡＡＶ粒子に非特異的にパッケージングされ、遺伝子療法に使用される場合に潜在的な安全性リスクを示す可能性がある（例えば、Ｓｃｈｎｏｄｔ ａｎｄ Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２０１７；２８（３）：１０１－１０８を参照されたい）。リスクは、相同組換えを介した複製可能なＡＡＶの生成を含み、キャプシド遺伝子発現は、細胞傷害性Ｔリンパ球反応、炎症反応及び／又は遺伝子サイレンシングをもたらす原核生物配列の免疫系認識を引き起こす。それぞれ、２％、０．４％～１．０％、及び１．３％～６．３％のキャプシド形成されたｒｅｐ、ｃａｐ、及び原核生物配列が、三重トランスフェクションによって、又は産生細胞株から産生された精製組換えＡＡＶ調製物で報告されている（Ｎｏｎｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：７７６－７８１、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １６：Ｓ１０５、Ｃｈａｕｄｅｕｆ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ １２：７４４－７５３）。
上記の産生系と関連するミスパッケージングのレベルを決定するために、トランスフェクトされたベクターにおける（ＩＴＲが隣接する導入遺伝子の外側の）４つの配列の存在量をｄｄＰＣＲによって決定した：ａ）Ｐ５プロモータ、ｂ）ＡＡＶ ＲＥＰ遺伝子、ｃ）ＡＡＶ９ ＣＡＰ遺伝子、及びｄ）ベータ－ラクタマーゼ（アンピシリン耐性）遺伝子。前述の２０及び４０ ＭＯＩハイパーフラスコ培養物からの精製ウイルス調製物を、３連でＤＮＡｓｅ消化し、ＶＤＢ中で段階希釈し、ｄｄＰＣＲに供した。これらの配列を含有するウイルス粒子の濃度を、ｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子を含有するＡＡＶ粒子のパーセンテージとして表した（表５）。０．０４％の最高のキャプシド形成率は、ウイルスＡ調製物中のＰ５プロモータのものであった（感染している組換えアデノウイルスの２０ ＭＯＩで産生された）。しかしながら、ＡＡＶ収率がはるかに高かった調製物Ｂ（４０ ＭＯＩ）におけるＰ５キャプシド形成率は、わずか０．００７％であった。ＲＥＰ、ＣＡＰ、及びアンピシリン遺伝子配列は、同じ又はそれ未満であった。ＣＡＰレベルは０．００７％～０．００９％であり、これは、血友病Ｂ遺伝子療法試験のために産生された組換えＡＡＶ２の４つの臨床ロットについて以前に報告された、０．０１６％～０．０２１％のｃａｐキャプシド形成率よりも低かった（Ｈａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１４４－１５２）。したがって、組換えＡＡＶを産生及び精製するための本明細書に記載の方法は、臨床遺伝子治療プログラムに必要とされ得るものと一致して、非常に低い割合のミスパッケージングされたＤＮＡをもたらす。
Figure 2022541915000006
ｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子含有粒子と比較した、４つのプローブについてのＤＮＡｓｅ耐性粒子の平均パーセンテージ±標準偏差を、２つのＡＡＶベクター調製物の分析に関して示す。
停止カセット切除後のＲＥＰ遺伝子のＲＮＡシスティングのＲＴ－ＰＣＲ分析
停止カセットが切除されたときに、構築物Ｐ４３９のＲＥＰ遺伝子に挿入されたイントロンが正確にスプライシングされるかどうかを決定するために、ＲＴ－ＰＣＲ実験を行った。
ＰＥＡＫ－ＲＡＰＩＤ細胞内のＰ４３９の安定したプールからの１０００万個の細胞を遠心分離によってペレット化し、１５ｍＬのＤＭＥＭ＋２％ ＦＢＳ＋１Ｅ９ Ａｄ５－ＣＭＶ－ＳＲ２１ウイルス粒子中に再懸濁した。細胞をＴ７５フラスコに播種し、３７℃で４８時間インキュベートした。細胞を、細胞スクレーパを使用して分離した。培地及び細胞を１５ｍＬの遠心チューブに移し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細胞をペレット化した。Ｐｈａｓｅ－ｍａｋｅｒチューブを伴うＴｒｉｚｏｌ Ｐｌｕｓ ＲＮＡ精製キットを使用して、細胞ペレットからＲＮＡを精製した。
いかなる汚染ＤＮＡも除去するために、３１μｇのＲＮＡを、１×消化緩衝液中のＤＮＡ－Ｆｒｅｅキットからの１μＬのＤＮＡｓｅで、３７℃において３０分間処理した。５μＬのＤＮＡｓｅ不活性化スラリーを添加し、試料を２分間のインキュベーション中に数回反転させた。ＲＮＡ試料を１０，０００×ｇで５分間遠心分離し、ＲＮＡを新しい滅菌チューブに移した。
ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで逆転写した。８０μｇのＲＮＡ、１μＬの５０μＭオリゴ－ＤＴ、及び１μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰＳを滅菌チューブ内で混合し、６５℃で５分間及び氷上で２分間インキュベートした。１０μＬの２×混合物（２×ＲＴ緩衝液、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのジチオトレイトール、０．５μＬのＲＮＡｓｅ－ｏｕｔ、及び０．５μＬの逆転写酵素）を添加した。逆転写酵素を水で置き換えたことを除いて、模擬ＲＴ反応物は同一であった。反応物を５０℃で５０分間、及び氷上で２分間インキュベートした。１μＬのＲＮＡｓｅ Ｈを添加し、試料を３７℃で２０分間インキュベートした。
５０μＬのＰＣＲ反応は、１μＬの逆転写ＲＮＡ、２５μＬのＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、及び０．５μＭの２つのプライマーを含有した。反応を以下のように熱サイクルに供した：
９８℃１分；（９８℃１０秒、６９℃１０秒、７２℃３６秒）の３５サイクル；５分７２℃。
５μＬの反応物を、１×ＴＡＥ緩衝液及び臭化エチジウム中の１％アガロースゲル上で分解した。Ｄａｒｋ Ｒｅａｄｅｒトランスルミネータ上の青色光照明下でバンドを可視化した。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎゲル及びＰＣＲクリーンアップキットを使用して、切除されたバンドからＤＮＡを回収した。ＤＮＡを、サイクル配列決定及び色素ターミネータ化学を使用して、ＰＣＲプライマーを用いて、ＧｅｎｅＷｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）で配列決定した。
結果：
模擬ＲＴテンプレートからのＰＣＲ反応は、検出可能な生成物を産生せず、ゲノムＤＮＡがＲＮＡ試料から排除されていたことを示した。プライマーＡＡＶＲＴ－Ｆ１（配列番号６２）及びＰ３４９Ｒ９（配列番号６３）を使用したＰＣＲは、停止カセットがＰ４３９から切除された後に、スプライシングされた転写物に由来する同様の蛍光強度の２つのＰＣＲ生成物を産生した。１つの生成物は、操作されたベータ－アクチンスプライスドナー及びアクセプタ部位（それぞれ、配列番号１４及び配列番号１５、図８）におけるスプライシングから生じた。第２の生成物は、５’ＲＥＰ遺伝子（配列番号６４）中のドナー部位と下流のベータ－アクチンアクセプタとの間のスプライシングから生じる（図８）。このスプライシング事象は、野生型ＡＡＶ２に対してＲＥＰコード配列の６４ｂｐを除去し、フレームシフトを作り、短縮ＲＥＰタンパク質を産生すると予測される。これは、この上流のスプライスドナー部位を変異させることにより、活性ＲＥＰタンパク質の存在量を増加させ、ＡＡＶ産生をより効率的にすることができることを示唆している。
ＡＡＶ構築物の更新：Ｐ６００（配列番号７０）
プラスミドＰ４３９（配列番号１２）にいくつかの変更を行い、構築物Ｐ６００（配列番号７０）を得た。最初に、停止カセットの上流のＲＥＰ遺伝子のスプライスドナー部位を変異させた。簡潔に述べると、５’ＲＥＰ配列（配列番号６４）で同定されたスプライスドナー部位のヌクレオチドＧＴを、ＡＴ（配列番号６５）に変異させた。この変異は、ＲＥＰタンパク質配列を変化させることなく、この部位におけるスプライシングを排除することが予測される。
ＲＥＰ／ＣＡＰ遺伝子が停止カセットの切除後にＡＡＶキャプシドにパッケージングされ得る可能性を低減するために、２ｋｂのランダム配列（配列番号６６）を設計し、ａｔｔＢ配列の下流及びアクチンスプライスアクセプタの上流に挿入して、操作されたイントロンのサイズを増加させた。潜在的なスプライス部位を、ＮｅｔＧｅｎｅ ２ソフトウェア（上記で引用）を使用して同定し、除去した。この挿入は、４．３ｋｂ～６．４ｋｂにＲＥＰ／ＣＡＰ遺伝子のサイズを増加させ、これは、５．０ｋｂのＡＡＶパッケージング限界を十分に上回る。
ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する配列も、ゲノムからの導入遺伝子レスキュー中に増幅され得、ＡＡＶキャプシドにミスパッケージングされ得るという仮説に基づいて（例えば、Ｓｃｈｎｏｄｔ ａｎｄ Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２０１７；２８（３）：１０１～１０８を参照されたい）、２つのランダムな２ｋｂ非コードスペーサ要素は、導入遺伝子に隣接して、ミスパッケージングされたＤＮＡの潜在的な影響を減少させるような設計であった。１つの要素（配列番号６７）を、左ＡＡＶ ＩＴＲの上流に挿入し、第２（配列番号６８）の置き換えられたマウス抗リプレッサ要素４０（配列番号２５）を、右ＡＡＶ ＩＴＲの下流に挿入した。
加えて、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９バリアントであった（例えば、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１８；２９（３）：２８５－２９８を参照されたい）。
最後に、Ｐ４３９のＩＴＲが隣接する導入遺伝子のコード配列を、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＩＲＥＳ－ＳＥＡＰ（分泌アルカリホスファターゼ）タンパク質をコードする配列番号６９によって置き換えた。
得られた構築物Ｐ６００の完全な配列を配列番号７０に開示し、プラスミドの例示を図９に示す。
安定したプールにおけるＰ６００からのＡＡＶ産生
構築物Ｐ６００を、Ｐｅａｋ－ＲＡＰＩＤ細胞にトランスフェクトし、本質的に上記のＰ４３９細胞について記載されるように、０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いた選択を通して、安定したプールを生成した。細胞を、ＡＡＶ産生をアッセイする前に６週間１：１０で継代した。
２．５Ｅ６ Ｐ６００－ＰＥＡＫ－Ｒａｐｉｄ ｐ６細胞を、５ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ中の３つのＴ２５フラスコに播種し、３７℃で３日間インキュベートした。感染日の細胞密度を、細胞をＴｒｙｐＬＥで回収し、トリパンブルー排除を使用してカウントしたフラスコのうちの１つにおいて、６．６Ｅ６生存細胞であると決定した。２つの残りのフラスコ中の培地を、２．６Ｅ８ Ａｄ５－ＣＭＶ－ＳＲ２１ウイルス粒子を含有する１１ｍＬのＤＭＥＭ＋２％ ＦＢＳで置き換えた。フラスコを３２℃で２４時間インキュベートした。ＤＭＥＭ＋２％ ＦＢＳ中の１．２５ｍＭの２－アミノプリン１ｍＬを、１つのフラスコに添加した。１ｍＬのＤＭＥＭ＋２％ ＦＢＳを他のフラスコに添加し、両方のフラスコを３２℃で更に７日間インキュベートした。培地をフラスコから回収し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞及び破片をペレット化した。２μＬの各試料上清を、上記のｍＣｈｅｒｒｙアッセイを使用したＤＮＡｓｅ消化及びｄｄＰＣＲ定量化に供した。
ＡＡＶ産生レベルを表６に示す。Ｐ６００の安定したプールは、Ａｄ５－ＣＭＶ－ＳＲ２１による感染時にＡＡＶを産生する際に活性である。ＡＡＶウイルス産生は、ＣＡＰ依存性ｍＲＮＡ翻訳のアデノウイルス誘導性阻害を遮断すると報告された薬物である、２－アミノプリンの存在下で２．５倍増加した（例えば、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：２５４４－２５５５、及びＨｕａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：７１１５－７１１９を参照されたい）。感染の１～２時間後の１０ｍＭの２－ＡＰ処理が、アデノウイルス感染の細胞変性効果を遮断し、少なくとも３日間は非毒性であったことが報告されているが（例えば、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：２５４４－２５５５、及びＨｕａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：７１１５－７１１９を参照されたい）、我々のＡＡＶ産生細胞系においてＡＡＶ産生に対して抑制性であるために、１．２５ｍＭを超える濃度及び２４時間よりも早い添加を見出した。これらのデータは、後期アデノウイルス遺伝子プログラム、特にｃａｐ依存性ｍＲＮＡ翻訳の停止を阻害することが、産生細胞株におけるＡＡＶ産生を増加させるための有用な戦略であることを示唆している。
Figure 2022541915000007
ヒト細胞における組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造は、ＡＡＶ複製（ＲＥＰ）及びキャプシド（ＣＡＰ）遺伝子、アデノウイルス遺伝子、並びにＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する発現カセットからなるＡＡＶパッケージング可能な導入遺伝子の発現を必要とする。３つ全ての構成成分が、ＡＡＶ産生のために別々のプラスミド上の細胞に送達され得るが、既存のトランスフェクション方法は、大規模培養物に拡大することが困難である。これらの要素のうちのいくつかを宿主細胞株に組み込むことは、ＡＡＶ産生をより効率的にすることができるが、ＡＡＶ及びアデノウイルス遺伝子のうちのいくつかは、細胞増殖抑制性又は細胞傷害性であり、このアプローチを制限する。本発明は、ＡＡＶ ＲＥＰ、ＣＡＰ、及びパッケージング可能な導入遺伝子が好適な宿主細胞に組み込まれ、増殖することができるように、ＡＡＶ ＲＥＰ遺伝子を可逆的に不活性化する方式を記載する。リコンビナーゼを発現する複製欠損性組換えアデノウイルス（例えば、ΔＥ１／ΔＥ３）によるこれらの細胞の感染は、ＲＥＰ遺伝子を再活性化し、ＡＡＶ複製及びパッケージングを誘導する。

Claims (106)

  1. ４つのＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を有する、修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐ遺伝子と、前記４つのＲｅｐタンパク質によって共有される前記ｒｅｐ遺伝子のコード配列に挿入された人工イントロンと、を含む、非自然発生の核酸分子であって、前記人工イントロンが、前記人工イントロンの５’スプライス部位の下流及び分岐部位の上流に挿入された停止カセットを含み、前記停止カセットが、５’から３’の順序で、
    （ａ）配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、好ましくは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位と、
    （ｂ）スプライスアクセプタと、
    （ｃ）ターミネータと、
    （ｄ）配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、好ましくは、配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位と、を含む、非自然発生の核酸分子。
  2. 前記スプライスアクセプタが、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の非自然発生の核酸分子。
  3. 前記ターミネータが、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項１又は２に記載の非自然発生の核酸分子。
  4. 前記ターミネータが、配列番号１９のヌクレオチド配列を更に含む、請求項３に記載の非自然発生の核酸分子。
  5. 前記停止カセットが、選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセットを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の非自然発生の核酸分子。
  6. 前記人工イントロンが、５’から３’の順序で、配列番号１４のヌクレオチド配列、前記停止カセット、及び配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の非自然発生の核酸分子。
  7. 前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子が、ＡＡＶ１～ＡＡＶ８のうちの１つのｒｅｐ遺伝子、又はそのハイブリッドを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の非自然発生の核酸分子。
  8. 前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子が、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１９０～２２０２を有するヒトＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子を含む、請求項７に記載の非自然発生の核酸分子。
  9. 前記人工イントロンが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号９９６～１９０５の間に挿入されている、請求項８に記載の非自然発生の核酸分子。
  10. 前記人工イントロンが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１０５２、１０６１、１７１２、１９０６、１０２２、１１１２、１４７５、１５１４、１７００、１７４２、１７８４、又は１３４０、好ましくはヌクレオチド番号１０５２のすぐ下流に挿入されている、請求項９に記載の非自然発生の核酸分子。
  11. 修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む、非自然発生の核酸分子であって、前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子が、５’から３’の順序で、
    （ａ）配列番号５５のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分と、
    （ｂ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、
    （ｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列を有する５’イントロン断片、
    （ｉｉ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、
    （１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、
    （２）配列番号１７のヌクレオチド配列を有するスプライスアクセプタ、
    （３）配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、
    （４）配列番号１９のヌクレオチド配列を有するターミネータ、及び
    （５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに
    （ｉｉｉ）配列番号１５のヌクレオチド配列を有する３’イントロン断片、を含む、人工イントロンと、
    （ｃ）配列番号５６のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分と、を含む、非自然発生の核酸分子。
  12. 修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む、非自然発生の核酸分子であって、前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子が、５’から３’の順序で、
    （ａ）配列番号７３のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分と、
    （ｂ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、
    （ｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列を有する５’イントロン断片、
    （ｉｉ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、
    （１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、
    （２）配列番号１７のヌクレオチド配列を有するスプライスアクセプタ、
    （３）配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、
    （４）配列番号１９のヌクレオチド配列を有するターミネータ、及び
    （５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに
    （ｉｉｉ）配列番号６６のヌクレオチド配列を有する３’イントロン断片、を含む、人工イントロンと、
    （ｃ）配列番号５６のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分と、を含む、非自然発生の核酸分子。
  13. 前記停止カセットが、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、請求項１１又は１２に記載の非自然発生の核酸分子。
  14. ３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の非自然発生の核酸分子。
  15. 前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が、ＡＡＶ１～ＡＡＶ９及びＡＡＶＤＪのうちの１つのｃａｐ遺伝子、又はそのハイブリッドを含む、請求項１４に記載の非自然発生の核酸分子。
  16. 前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３０５７９．１のヌクレオチド配列を有するヒトＡＡＶ９のｃａｐ遺伝子を含む、請求項１５に記載の非自然発生の核酸分子。
  17. 前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が、ポリアデニル化シグナル、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号４４１１～４４６６を有するＡＡＶ２のポリアデニル化シグナルと、エンハンサ、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１９０～３１３を有するＡＡＶ２ ｒｅｐ Ｐ５プロモータと、を更に含み、前記ポリアデニル化シグナル及び前記エンハンサが、両方とも前記ｃａｐ遺伝子のコード配列の下流にある、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の非自然発生の核酸分子。
  18. 前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子の下流の一対のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する導入遺伝子を更に含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の非自然発生の核酸分子。
  19. 前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の上流に第１のインシュレータ、及び任意選択的に、前記ＩＴＲが隣接する前記導入遺伝子の下流に第２のインシュレータを更に含み、好ましくは、前記第１のインシュレータ及び前記第２のインシュレータが、独立して、
    （ａ）配列番号２４のヌクレオチド配列を有するヒト抗リプレッサ要素４０、
    （ｂ）配列番号２５のヌクレオチド配列を有するマウス抗リプレッサ要素４０、
    （ｃ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７４９．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０４、
    （ｄ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５０．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０６、
    （ｅ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５１．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０７、
    （ｆ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５２．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素１２、
    （ｇ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５３．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素１３、
    （ｈ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５４．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素３５、
    （ｉ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５５．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素３６、
    （ｊ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５７．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素５２、
    （ｋ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５８．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素５３、及び
    （ｌ）２つ又は３つ以上のコピーにおいてＡＹ０４０８３５．１のヌクレオチド配列を有するグロビン遺伝子座からのニワトリＨＳ４インシュレータからなる群から選択され、
    より好ましくは、前記第１のインシュレータ及び前記第２のインシュレータが、それぞれ、配列番号２４及び配列番号２５のヌクレオチド配列を有する、請求項１８に記載の非自然発生の核酸分子。
  20. 前記非自然発生の核酸分子が、前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の上流に前記第１のインシュレータを含み、前記導入遺伝子の上流及び下流にそれぞれ、第１のスペーサ配列及び第２のスペーサ配列を更に含み、前記第１のスペーサ配列及び前記第２のスペーサ配列が、独立して、
    ａ）配列番号６７のヌクレオチド配列、及び
    ｂ）配列番号６８のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項１９に記載の非自然発生の核酸分子。
  21. 前記ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、前記導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、前記コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、好ましくは、前記プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、前記ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の非自然発生の核酸分子。
  22. 非自然発生の核酸分子であって、５’から３’の順序で、
    （Ａ）第１のインシュレータであって、好ましくは、配列番号２４のヌクレオチド配列を有する、第１のインシュレータと、
    （Ｂ）修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であって、５’から３’の順序で、
    （ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分であって、好ましくは、配列番号５５のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分、
    （ｉｉ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、
    （ａ）５’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、５’イントロン断片、
    （ｂ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、
    （１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、
    （２）スプライスアクセプタであって、好ましくは、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、スプライスアクセプタ、
    （３）選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、
    （４）ターミネータであって、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列を有する、ターミネータ、及び
    （５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに
    （ｃ）３’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１５のヌクレオチド配列を有する、３’イントロン断片、を含む、人工イントロン、並びに
    （ｉｉｉ）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分であって、好ましくは、配列番号５６のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分、を含む、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子と、
    （Ｃ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子であって、好ましくは、配列番号５７のヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と、
    （Ｄ）一対のＡＡＶ ＩＴＲが隣接する導入遺伝子であって、好ましくは、前記ＡＡＶ ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、前記導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、前記コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、より好ましくは、前記プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、前記ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、導入遺伝子と、
    （Ｅ）第２のインシュレータであって、好ましくは、配列番号２５のヌクレオチド配列を有する、第２のインシュレータと、を含む、非自然発生の核酸分子。
  23. 非自然発生の核酸分子であって、５’から３’の順序で、
    （Ａ）第１のインシュレータであって、好ましくは、配列番号２４のヌクレオチド配列を有する、第１のインシュレータと、
    （Ｂ）修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であって、５’から３’の順序で、
    （ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分であって、好ましくは、配列番号７３のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分、
    （ｉｉ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、
    （ａ）５’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、５’イントロン断片、
    （ｂ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、
    （１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、
    （２）スプライスアクセプタであって、好ましくは、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、スプライスアクセプタ、
    （３）選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、
    （４）ターミネータであって、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列を有する、ターミネータ、及び
    （５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに
    （ｃ）３’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号６６のヌクレオチド配列を有する、３’イントロン断片、を含む、人工イントロン、並びに
    （ｉｉｉ）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分であって、好ましくは、配列番号５６のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分、を含む、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子と、
    （Ｃ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と、
    （Ｄ）導入遺伝子であって、
    （１）一対のＡＡＶ ＩＴＲであって、好ましくは、前記ＡＡＶ ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、前記導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、前記コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、より好ましくは、前記プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、前記ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、一対のＡＡＶ ＩＴＲ、及び
    （２）一対のスペーサ配列であって、好ましくは、前記スペーサ配列が、配列番号６７及び配列番号６８のヌクレオチド配列を有する、一対のスペーサ配列、が隣接する、導入遺伝子と、を含む、非自然発生の核酸分子。
  24. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の非自然発生の核酸分子を含むベクターであって、好ましくは、前記ベクターが、プラスミドであり、より好ましくは、前記プラスミドが、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
  25. 請求項１～２１又は２３のいずれか一項に記載の非自然発生の核酸分子を含むベクターであって、好ましくは、前記ベクターが、プラスミドであり、より好ましくは、前記プラスミドが、配列番号７０のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
  26. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の非自然発生の核酸分子を作製する方法。
  27. 請求項２４又は２５に記載のベクターを作製する方法。
  28. ４つのＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を有する、修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐ遺伝子と、前記４つのＲｅｐタンパク質によって共有される前記ｒｅｐ遺伝子のコード配列に挿入された人工イントロンと、を含む、非自然発生の核酸分子を含む、細胞であって、前記人工イントロンが、前記人工イントロンの５’スプライス部位の下流及び分岐部位の上流に挿入された停止カセットを含み、前記停止カセットが、５’から３’の順序で、
    （ａ）配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、好ましくは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位と、
    （ｂ）スプライスアクセプタと、
    （ｃ）ターミネータと、
    （ｄ）配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、好ましくは、配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位と、を含む、細胞。
  29. 前記スプライスアクセプタが、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の細胞。
  30. 前記ターミネータが、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項２８又は２９に記載の細胞。
  31. 前記ターミネータが、配列番号１９のヌクレオチド配列を更に含む、請求項３０に記載の細胞。
  32. 前記停止カセットが、選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセットを含む、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の細胞。
  33. 前記人工イントロンが、５’から３’の順序で、配列番号１４のヌクレオチド配列、前記停止カセット、及び配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の細胞。
  34. 前記人工イントロンが、５’から３’の順序で、配列番号１４のヌクレオチド配列、前記停止カセット、及び配列番号６６のヌクレオチド配列を含む、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の細胞。
  35. 前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子が、ＡＡＶ１～ＡＡＶ８のうちの１つのｒｅｐ遺伝子、又はそのハイブリッドを含む、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の細胞。
  36. 前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子が、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１９０～２２０２を有するヒトＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子を含む、請求項３５に記載の細胞。
  37. 前記人工イントロンが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号９９６～１９０５の間に挿入されている、請求項３６に記載の細胞。
  38. 前記人工イントロンが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１０５２、１０６１、１７１２、１９０６、１０２２、１１１２、１４７５、１５１４、１７００、１７４２、１７８４、又は１３４０、好ましくはヌクレオチド番号１０５２のすぐ下流に挿入されている、請求項３７に記載の細胞。
  39. 修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む、非自然発生の核酸分子を含む細胞であって、前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子が、５’から３’の順序で、
    （ａ）配列番号５５のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分と、
    （ｂ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、
    （ｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列を有する５’イントロン断片、
    （ｉｉ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、
    （１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、
    （２）配列番号１７のヌクレオチド配列を有するスプライスアクセプタ、
    （３）配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、
    （４）配列番号１９のヌクレオチド配列を有するターミネータ、及び
    （５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに
    （ｉｉｉ）配列番号１５のヌクレオチド配列を有する３’イントロン断片、を含む、人工イントロンと、
    （ｃ）配列番号５６のヌクレオチド配列を有する前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分と、を含む、細胞。
  40. 修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む、非自然発生の核酸分子を含む細胞であって、前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子が、５’から３’の順序で、
    （ａ）配列番号７３のヌクレオチド配列を有するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分と、
    （ｂ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、
    （ｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列を有する５’イントロン断片、
    （ｉｉ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、
    （１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、
    （２）配列番号１７のヌクレオチド配列を有するスプライスアクセプタ、
    （３）配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、
    （４）配列番号１９のヌクレオチド配列を有するターミネータ、及び
    （５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに
    （ｉｉｉ）配列番号６６のヌクレオチド配列を有する３’イントロン断片、を含む、人工イントロンと、
    （ｃ）配列番号５６のヌクレオチド配列を有する前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分と、を含む、細胞。
  41. 前記停止カセットが、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、請求項３０又は４０に記載の細胞。
  42. ３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を更に含む、請求項２８～４１のいずれか一項に記載の細胞。
  43. 前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が、ＡＡＶ１～ＡＡＶ９及びＡＡＶＤＪのうちの１つのｃａｐ遺伝子、又はそのハイブリッドを含む、請求項４２に記載の細胞。
  44. 前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３０５７９．１のヌクレオチド配列を有するヒトＡＡＶ９のｃａｐ遺伝子を含む、請求項４３に記載の細胞。
  45. 前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が、ＡＡＶ９のハイブリッドのｃａｐ遺伝子を含む、請求項４３に記載の細胞。
  46. 前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が、ポリアデニル化シグナル、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号４４１１～４４６６を有するＡＡＶ２のポリアデニル化シグナルと、エンハンサ、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１９０～３１３を有するＡＡＶ２ ｒｅｐ Ｐ５プロモータと、を更に含み、前記ポリアデニル化シグナル及び前記エンハンサが、両方とも前記ｃａｐ遺伝子のコード配列の下流にある、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の細胞。
  47. 前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子の下流の一対のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する導入遺伝子を更に含む、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の細胞。
  48. 前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の上流に第１のインシュレータ、及び任意選択的に、前記ＩＴＲが隣接する前記導入遺伝子の下流に第２のインシュレータを更に含み、好ましくは、前記第１のインシュレータ及び前記第２のインシュレータが、独立して、
    （ａ）配列番号２４のヌクレオチド配列を有するヒト抗リプレッサ要素４０、
    （ｂ）配列番号２５のヌクレオチド配列を有するマウス抗リプレッサ要素４０、
    （ｃ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７４９．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０４、
    （ｄ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５０．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０６、
    （ｅ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５１．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０７、
    （ｆ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５２．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素１２、
    （ｇ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５３．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素１３、
    （ｈ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５４．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素３５、
    （ｉ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５５．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素３６、
    （ｊ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５７．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素５２、
    （ｋ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５８．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素５３、及び
    （ｌ）２つ又は３つ以上のコピーにおいてＡＹ０４０８３５．１のヌクレオチド配列を有するグロビン遺伝子座からのニワトリＨＳ４インシュレータからなる群から選択され、
    より好ましくは、前記第１のインシュレータ及び前記第２のインシュレータが、それぞれ、配列番号２４及び配列番号２５のヌクレオチド配列を有する、請求項４７に記載の細胞。
  49. 前記細胞が、前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の上流に前記第１のインシュレータを含み、前記導入遺伝子の上流及び下流にそれぞれ、第１のスペーサ配列及び第２のスペーサ配列を更に含み、前記第１のスペーサ配列及び前記第２のスペーサ配列が、独立して、
    ａ）配列番号６７のヌクレオチド配列、及び
    ｂ）配列番号６８のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項４８に記載の細胞。
  50. 前記ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、前記導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、前記コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、好ましくは、前記プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、前記ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の細胞。
  51. 非自然発生の核酸分子を含む細胞であって、前記非自然発生の核酸分子が、５’から３’の順序で、
    （Ａ）第１のインシュレータであって、好ましくは、配列番号２４のヌクレオチド配列を有する、第１のインシュレータと、
    （Ｂ）修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であって、５’から３’の順序で、
    （ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分であって、好ましくは、配列番号５５のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分、
    （ｉｉ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、
    （ａ）５’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、５’イントロン断片、
    （ｂ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、
    （１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、
    （２）スプライスアクセプタであって、好ましくは、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、スプライスアクセプタ、
    （３）選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、
    （４）ターミネータであって、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列を有する、ターミネータ、及び
    （５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに
    （ｃ）３’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１５のヌクレオチド配列を有する、３’イントロン断片、を含む、人工イントロン、並びに
    （ｉｉｉ）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分であって、好ましくは、配列番号５６のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分、を含む、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子と、
    （Ｃ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子であって、好ましくは、配列番号５７のヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と、
    （Ｄ）一対のＡＡＶ ＩＴＲが隣接する導入遺伝子であって、好ましくは、前記ＡＡＶ ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、前記導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、前記コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、より好ましくは、前記プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、前記ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、導入遺伝子と、
    （Ｅ）第２のインシュレータであって、好ましくは、配列番号２５のヌクレオチド配列を有する、第２のインシュレータと、を含む、細胞。
  52. 非自然発生の核酸分子を含む細胞であって、前記非自然発生の核酸分子が、５’から３’の順序で、
    （Ａ）第１のインシュレータであって、好ましくは、配列番号２４のヌクレオチド配列を有する、第１のインシュレータと、
    （Ｂ）修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であって、５’から３’の順序で、
    （ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分であって、好ましくは、配列番号７３のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分、
    （ｉｉ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、
    （ａ）５’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、５’イントロン断片、
    （ｂ）停止カセットであって、５’から３’の順序で、
    （１）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、
    （２）スプライスアクセプタであって、好ましくは、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、スプライスアクセプタ、
    （３）選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、
    （４）ターミネータであって、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列を有する、ターミネータ、及び
    （５）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに
    （ｃ）３’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号６６のヌクレオチド配列を有する、３’イントロン断片、を含む、人工イントロン、並びに
    （ｉｉｉ）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分であって、好ましくは、配列番号５６のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分、を含む、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子と、
    （Ｃ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と、
    （Ｄ）導入遺伝子であって、
    （ｉ）一対のＡＡＶ ＩＴＲであって、好ましくは、前記ＡＡＶ ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、前記導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、前記コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、より好ましくは、前記プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、前記ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、一対のＡＡＶ ＩＴＲ、及び
    （ｉｉ）一対のスペーサ配列であって、好ましくは、前記スペーサ配列が、配列番号６７及び配列番号６８のヌクレオチド配列を有する、一対のスペーサ配列、が隣接する、導入遺伝子と、を含む、細胞。
  53. 前記非自然発生の核酸分子が、エピソーム性であり、配列番号１２のヌクレオチド配列を有する、請求項２８～５１のいずれか一項に記載の細胞。
  54. 前記非自然発生の核酸分子が、エピソーム性であり、配列番号７０のヌクレオチド配列を有する、請求項２８～５０又は５２のいずれか一項に記載の細胞。
  55. 配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼをコードする、核酸分子を更に含み、好ましくは、前記核酸が、配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、前記細胞が、配列番号２のアミノ酸配列を有するリコンビナーゼをコードする、組換えΔＥ１／ΔＥ３アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ウイルスを含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の細胞。
  56. アデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を更に含み、好ましくは、前記細胞が、９１１細胞、ｐＴＧ６５５９細胞、ＧＨ３２９細胞、Ｎ５２．Ｅ６細胞、ＨｅＬａ－Ｅ１細胞、ＵＲ細胞、ＶＬＩ－２９３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の細胞。
  57. 導入遺伝子を含む組換えＡＡＶを産生する方法であって、
    （Ａ）第１の宿主細胞を得ることであって、前記第１の宿主細胞が、
    （ｉ）修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であって、５’から３’の順序で、
    （ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分であって、好ましくは、配列番号５５のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分、
    （ｂ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、
    （１）５’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、５’イントロン断片、
    （２）停止カセットであって、５’から３’の順序で、
    （ａａ）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、
    （ｂｂ）スプライスアクセプタであって、好ましくは、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、スプライスアクセプタ、
    （ｃｃ）選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、
    （ｄｄ）ターミネータであって、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列を有する、ターミネータ、及び
    （ｅｅ）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに
    （３）３’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１５のヌクレオチド配列を有する、３’イントロン断片、を含む、人工イントロン、
    （ｃ）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分であって、好ましくは、配列番号５６のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分、を含む、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、
    （ｉｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子であって、好ましくは、配列番号５７のヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、
    （ｉｉｉ）一対のＡＡＶ ＩＴＲが隣接する導入遺伝子であって、好ましくは、前記ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、前記導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、前記コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、より好ましくは、前記プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、前記ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、導入遺伝子、を含む、第１の宿主細胞を得ることと、
    （Ｂ）前記第１の宿主細胞を、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するリコンビナーゼをコードするリコンビナーゼ遺伝子を含む組換えアデノウイルスに感染させて、前記リコンビナーゼ遺伝子を更に含有する第２の宿主細胞を得ることと、
    （Ｃ）前記導入遺伝子を含む前記組換えＡＡＶが産生される条件下で、前記第２の宿主細胞を成長させることと、
    （Ｄ）任意選択的に、前記組換えＡＡＶを採取することと、を含む、方法。
  58. 導入遺伝子を含む組換えＡＡＶを産生する方法であって、
    （Ａ）第１の宿主細胞を得ることであって、前記第１の宿主細胞が、
    （ｉ）修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であって、５’から３’の順序で、
    （ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分であって、好ましくは、配列番号７３のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の５’部分、
    （ｂ）人工イントロンであって、５’から３’の順序で、
    （１）５’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する、５’イントロン断片、
    （２）停止カセットであって、５’から３’の順序で、
    （ａａ）配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、
    （ｂｂ）スプライスアクセプタであって、好ましくは、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、スプライスアクセプタ、
    （ｃｃ）選択可能なマーカーをコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット、
    （ｄｄ）ターミネータであって、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列を有する、ターミネータ、及び
    （ｅｅ）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、を含む、停止カセット、並びに
    （３）３’イントロン断片であって、好ましくは、配列番号６６のヌクレオチド配列を有する、３’イントロン断片、を含む、人工イントロン、
    （ｃ）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分であって、好ましくは、配列番号６６のヌクレオチド配列を有する、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部分、を含む、修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、
    （ｉｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、並びに
    （ｉｉｉ）導入遺伝子であって、
    （ａ）一対のＡＡＶ ＩＴＲであって、好ましくは、前記ＩＴＲが、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、前記導入遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモータを含み、前記コード配列が、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されており、より好ましくは、前記プロモータが、配列番号２１のヌクレオチド配列を有し、前記ポリアデニル化シグナルが、ヌクレオチド配列の配列番号２３を有する、一対のＡＡＶ ＩＴＲ、及び
    （ｂ）一対のスペーサ配列であって、好ましくは、前記スペーサ配列が、配列番号６７及び配列番号６８のヌクレオチド配列を有する、一対のスペーサ配列、が隣接する、導入遺伝子、を含む、第１の宿主細胞を得ることと、
    （Ｂ）前記第１の宿主細胞を、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するリコンビナーゼをコードするリコンビナーゼ遺伝子を含む組換えアデノウイルスに感染させて、前記リコンビナーゼ遺伝子を更に含有する第２の宿主細胞を得ることと、
    （Ｃ）前記導入遺伝子を含む前記組換えＡＡＶが産生される条件下で、前記第２の宿主細胞を成長させることと、
    （Ｄ）任意選択的に、前記組換えＡＡＶを採取することと、を含む、方法。
  59. 前記第１の宿主細胞が、前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の上流に第１のインシュレータ、及び任意選択的に、前記ＩＴＲが隣接する前記導入遺伝子の下流に第２のインシュレータを更に含み、好ましくは、前記第１のインシュレータ及び前記第２のインシュレータが、独立して、
    （ａ）配列番号２４のヌクレオチド配列を有するヒト抗リプレッサ要素４０、
    （ｂ）配列番号２５のヌクレオチド配列を有するマウス抗リプレッサ要素４０、
    （ｃ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７４９．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０４、
    （ｄ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５０．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０６、
    （ｅ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５１．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素０７、
    （ｆ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５２．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素１２、
    （ｇ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５３．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素１３、
    （ｈ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５４．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素３５、
    （ｉ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５５．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素３６、
    （ｊ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５７．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素５２、
    （ｋ）ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１９０７５８．１のヌクレオチド配列を有する抗リプレッサ要素５３、及び
    （ｌ）２つ又は３つ以上のコピーにおいてＡＹ０４０８３５．１のヌクレオチド配列を有するグロビン遺伝子座からのニワトリＨＳ４インシュレータからなる群から選択され、
    より好ましくは、前記第１のインシュレータ及び前記第２のインシュレータが、それぞれ、配列番号２４及び配列番号２５のヌクレオチド配列を有する、請求項５７又は５８に記載の方法。
  60. 前記第１の宿主細胞が、前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の上流に前記第１のインシュレータを含み、前記導入遺伝子の上流及び下流にそれぞれ、第１のスペーサ配列及び第２のスペーサ配列を更に含み、前記第１のスペーサ配列及び前記第２のスペーサ配列が、独立して、
    ａ）配列番号６７のヌクレオチド配列、及び
    ｂ）配列番号６８のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記第１の宿主細胞が、前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、前記ＩＴＲが隣接する前記導入遺伝子、前記第１のインシュレータ、及び前記第２のインシュレータを含む、１つ又は２つ以上の核酸分子を細胞に導入することによって得られる、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記第１の宿主細胞が、５’から３’の順序で、前記第１のインシュレータ、前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、前記ＩＴＲが隣接する前記導入遺伝子、前記第１のインシュレータ、及び前記第２のインシュレータを含む核酸分子、好ましくは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むプラスミドを、前記細胞に導入することによって得られる、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記第１の宿主細胞が、前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、前記ＩＴＲが隣接する前記導入遺伝子、前記第１のインシュレータ、前記第１のスペーサ配列、及び前記第２のスペーサ配列を含む、１つ又は２つ以上の核酸分子を細胞に導入することによって得られる、請求項５７、５８、又は６０に記載の方法。
  64. 前記第１の宿主細胞が、前記修飾ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、前記ＩＴＲが隣接する前記導入遺伝子、前記第１のインシュレータ、前記第１のスペーサ配列、及び前記第２のスペーサシーケンサを含む、１つ又は２つ以上の核酸分子、好ましくは、配列番号７０のヌクレオチド配列を含むプラスミドを細胞に導入することによって得られる、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記組換えアデノウイルスが、配列番号３のヌクレオチド配列を含む組換えΔＥ１／ΔＥ３アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ウイルスである、請求項５７～６２のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記宿主細胞が、アデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を含み、好ましくは、前記宿主細胞が、９１１細胞、ｐＴＧ６５５９細胞、ＧＨ３２９細胞、Ｎ５２．Ｅ６細胞、ＨｅＬａ－Ｅ１細胞、ＵＲ細胞、ＶＬＩ－２９３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である、請求項５７～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記第２の宿主細胞を成長させるための前記条件が、２－アミノプリンで前記第２の細胞を培養することを含む、請求項５７～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. ２－アミノプリン濃度が、約１．２５ｍＭ未満である、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記２－アミノプリン濃度が、約１μＭ～約１．２５ｍＭである、請求項６７又は６８に記載の方法。
  70. 前記２－アミノプリン濃度が、約１０μＭ～約１．２５ｍＭである、請求項６７又は６８に記載の方法。
  71. 前記２－アミノプリン濃度が、約１００μＭ～約１．２５ｍＭである、請求項６７又は６８に記載の方法。
  72. 前記２－アミノプリン濃度が、約１．２５ｍＭである、請求項６７又は６８に記載の方法。
  73. ２－アミノプリンで前記第２の細胞を培養することが、組換えアデノウイルスによる前記第１の宿主細胞の感染の約２４時間後に開始される、請求項６７～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 請求項５５に記載の細胞と、２－アミノプリンと、を含む組成物。
  75. ２－アミノプリン濃度が、約１．２５ｍＭ未満である、請求項７４に記載の組成物。
  76. 前記２－アミノプリン濃度が、約１μＭ～約１．２５ｍＭである、請求項７４に記載の組成物。
  77. 前記２－アミノプリン濃度が、約１０μＭ～約１．２５ｍＭである、請求項７４に記載の組成物。
  78. 前記２－アミノプリン濃度が、約１００μＭ～約１．２５ｍＭである、請求項７４に記載の組成物。
  79. 前記２－アミノプリン濃度が、約１．２５ｍＭである、請求項７４に記載の組成物。
  80. 配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、非自然発生の核酸分子。
  81. 配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも有する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項７４に記載の非自然発生の核酸分子。
  82. 請求項８０又は８１に記載の非自然発生の核酸を含むベクター。
  83. プロモータ、好ましくは、前記セリンリコンビナーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータを更に含む、請求項８２に記載のベクター。
  84. 前記セリンリコンビナーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結された、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルなどのポリアデニル化シグナルを更に含む、請求項８２又は８３に記載のベクター。
  85. ＤＮＡプラスミドである、請求項８２～８４のいずれか一項に記載のベクター。
  86. 組換えアデノウイルスベクターである、請求項８２～８５のいずれか一項に記載のベクター。
  87. ＣＭＶプロモータの制御下で、配列番号２のアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、組換えΔＥ１／ΔＥ３アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ウイルスであり、前記ヌクレオチド配列が、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＮＣ＿００１６６９．１、ｎｔ２５５０～２７７４）に更に作動可能に連結されている、請求項８６に記載のベクター。
  88. 配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、非自然発生の核酸分子を含む細胞。
  89. 配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項８８に記載の細胞。
  90. 請求項８８又は８９に記載の非自然発生の核酸を含むベクターを含む細胞。
  91. プロモータ、好ましくは、前記セリンリコンビナーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータを更に含む、請求項９０に記載の細胞。
  92. 前記セリンリコンビナーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結された、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルなどのポリアデニル化シグナルを更に含む、請求項９０又は９１に記載の細胞。
  93. 前記ベクターが、ＤＮＡプラスミドである、請求項９０～９２のいずれか一項に記載の細胞。
  94. 前記ベクターが、組換えアデノウイルスベクターである、請求項９０～９３のいずれか一項に記載の細胞。
  95. 前記組換えアデノウイルスベクターが、ＣＭＶプロモータの制御下で、配列番号２のアミノ酸配列を有するセリンリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、組換えΔＥ１／ΔＥ３アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ウイルスであり、前記ヌクレオチド配列が、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＮＣ＿００１６６９．１、ｎｔ２５５０～２７７４）に更に作動可能に連結されている、請求項９４に記載の細胞。
  96. アデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を含み、好ましくは、前記細胞が、９１１細胞、ｐＴＧ６５５９細胞、ＧＨ３２９細胞、Ｎ５２．Ｅ６細胞、ＨｅＬａ－Ｅ１細胞、ＵＲ細胞、ＶＬＩ－２９３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である、請求項８８～９５のいずれか一項に記載の細胞。
  97. 細胞内で部位特異的組換えを実施する方法であって、
    （ａ）配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、好ましくは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、及び配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、好ましくは、配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位を有する核酸分子を含む、細胞を得ることと、
    （ｂ）配列番号２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するセリンリコンビナーゼをコードする非自然発生の核酸分子を、前記細胞に導入することと、
    （ｃ）前記セリンリコンビナーゼが、前記ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の前記部位特異的組換えを触媒することを可能にする条件下で、前記細胞を成長させることと、を含む方法。
  98. 細胞内で部位特異的組換えを実施するプロセスによって産生される生成物であって、前記プロセスが、
    （ａ）配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、好ましくは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、及び配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、好ましくは、配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位を有する核酸分子を含む、細胞を得ることと、
    （ｂ）配列番号２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するセリンリコンビナーゼをコードする非自然発生の核酸分子を、前記細胞に導入することと、
    （ｃ）前記セリンリコンビナーゼが、前記ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の前記部位特異的組換えを触媒することを可能にする条件下で、前記細胞を成長させることと、を含む、生成物。
  99. 細胞から生成物を得るためのプロセスであって、
    （ａ）配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、好ましくは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するａｔｔＰ部位、及び配列番号８又は配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位、好ましくは、配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ部位を有する核酸分子を含む、細胞を得ることと、
    （ｂ）配列番号２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するセリンリコンビナーゼをコードする非自然発生の核酸分子を、前記細胞に導入することと、
    （ｃ）前記セリンリコンビナーゼが、前記ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の前記部位特異的組換えを触媒することを可能にする条件下で、前記細胞を成長させることと、
    （ｄ）前記細胞から生成物を産生及び回収することと、を含む、プロセス。
  100. 非自然発生の系であって、
    ＡＡＶ媒介組換えのための手段を含み、前記手段が、任意選択的に、トランスジェニック要素を含む、非自然発生の系。
  101. 請求項１００に記載の非自然発生の系を移すための手段。
  102. 非自然発生の系であって、
    請求項１００に記載の系を組み換えるための組換え手段を含み、前記組換え手段が、触媒中に少なくとも１つのセリン残基を使用することを含む、非自然発生の系。
  103. 請求項１０２に記載の非自然発生の系を移すための手段。
  104. 分子を製造するための手段であって、請求項１００～１０３のいずれか一項に記載の手段を含み、複製することが可能である、分子を製造するための手段。
  105. ＡＡＶ媒介部位特異的組換えのためのプロセスであって、
    （ａ）請求項１００に記載の手段を含む、細胞を得る機能を実行するための工程と、
    （ｂ）触媒中に少なくとも１つのセリン残基を使用する部位特異的組換えを可能にする条件下で、前記細胞を成長させる機能を実行するための工程と、を含む、プロセス。
  106. 生成物を得ることを含み、任意選択的に、前記生成物が、治療用生成物である、請求項１０５に記載のＡＡＶ媒介部位特異的組換えのためのプロセス。
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