TW202116794A - 用於生物製造之合成遺傳因子 - Google Patents

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Abstract

描述用於腺相關病毒(Adeno-Associated Viruse, AAV)之經改良生產的重組建構體、細胞、及手段。亦描述使用該建構體及細胞以產生重組AAV的方法。

Description

用於生物製造之合成遺傳因子
腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)具有線性單股DNA (ssDNA)基因體，其在末端處具有兩個反向末端重複(inverted terminal repeat, ITR)。ITR側接兩個病毒基因-rep （複製）及cap （殼體），其分別編碼非結構及結構蛋白。該rep 基因透過使用兩種啟動子及交替剪接編碼四種調節蛋白Rep78、Rep68、Rep52、及Rep40。更具體而言，Rep78及Rep68係轉錄自P5啟動子且Rep 40及Rep52係轉錄自P19啟動子（其嵌入於Rep78及Rep68讀框內）。P5及P19啟動子係由腺病毒E1A基因活化且在細胞中係活性的，諸如使用該等腺病毒E1基因轉化的HEK293。這些Rep蛋白係關於AAV基因體複製。該cap 基因（透過轉譯之交替剪接及起始）產生三種殼體蛋白VP1（病毒蛋白1）、VP2及VP3，其等會組裝成病毒的近球形蛋白殼。該AAV病毒不編碼聚合酶，因此仰賴用於基因體複製的細胞聚合酶。
若該AAVrep 及cap 基因可穩定地整合或維持在細胞中，則哺乳動物細胞中之AAV的大規模生產可係可能的，且之後經誘導以在高密度培養物中生產AAV。然而，Rep蛋白的表現對於宿主細胞可係細胞毒性的或細胞生長抑制性的(cytostatic)，使其難以在表現rep 基因的宿主中培養穩定的細胞系，諸如表現該等腺病毒E1基因（諸如HEK293細胞）者。因為AAV編碼四種具有重疊讀框的Rep蛋白，這是起因於使用兩種啟動子及交替剪接，因此使用誘導型啟動子控制rep 基因表現並不容易。
該等四種Rep蛋白之細胞毒性或細胞生長抑制性本質已防止穩定細胞系的發展，該等細胞系可使用原生rep/cap 啟動子生產高效價的AAV (Clarket al . (1995) Hum. Gene Ther. 6:1329-1341; Chadeufet al . (2000) J. Gene med. 2:260-268）。數個群組已試圖重組地調節Rep表現。Yang將P5啟動子用小鼠金屬硫蛋白啟動子置換。雖然在HEK293中的穩定殖株展現出金屬誘導的rep78 表現，但rep50 及rep42 表現（由內部P19啟動子驅動）僅在低位準下偵測到，並且細胞的生長速率實質上降低(Yanget al . (1994) J. Virol 68: 4847-4856)。Ogasawara用含有位於loxP兩側之填充片段之普遍存在的啟動子置換P5啟動子，其可由Cre重組酶活化。rep52 、rep40 、或cap 基因均未在被腺病毒-Cre感染的穩定殖株中誘發，其表示組成型rep52/rep40 表現亦對細胞有害(Ogasawaraet al . (1999) J. Gen. Virol. 80: 2477-2480)。
Xiao及同事們描述了另一種調控rep 表現的方法(Qiaoet al . (2002) J. Virol. 76: 13015-13027; Yuanet al . (2011) Hum. Gene Ther. 22:613-624)。Xiao將人工內含子插入至所有四種Rep蛋白共享的編碼區之該rep 基因中，並將含有單獨的poly(A)序列或與puro （嘌呤黴素抗性基因）組合的loxP側接止擋匣插入至該內含子中。抑制所有該等Rep蛋白的表現，使HEK293細胞中的穩定細胞系得以產生。透過重組loxP位點將Cre重組酶遞送（藉由腺病毒感染）至細胞中來切除該止擋匣，使得全長pre-mRNA得以轉錄。然後藉由RNA剪接來精確地移除剩餘的內含子序列，恢復所有四種Rep蛋白之編碼序列，並因此起始來自經整合之ITR側接轉殖基因的AAV之生產。然而，由於Cre重組酶識別兩個相同的loxP位點，故該等loxP位點在重組後維持相同，由於Cre催化連接及切除反應兩者，因此可能進行其他重組。
AAVrep 基因僅在亦表現該腺病毒E1（早期區域1）基因的細胞中表現。已在不表現該等E1基因（包括HeLa）的宿主中建構數種穩定rep/cap 細胞系(Clarket al (1995) Hum. Gen. Therap. 6: 1329-1341; Yanget al . (1994) J. Virol. 68: 4847-4856; Gao et. Al (1998) Hu, Gen. Ther. 9: 2353-2362)、A549 (Gaoet al . (2002) Mol Ther. 5:644-659)、及Vero（Bealet al . (2007)第10屆美國基因治療年會，Seattle, WA，2007年5月30日至6月3日）。這些細胞系的最大缺點在於AAV生產需要完整的E1（且通常具有複製能力）腺病毒，其可能會由於AAV病毒製劑的污染物而增加安全性風險。
已描述了使用數種不同的病毒來提供輔助功能並將該重組轉殖基因及/或AAV基因傳遞至人類細胞之AAV生產系統，包括Herpes (Thomaset al . (2009) Hum Gene Ther. 20:861-70; Clementet al . (2009) Hum Gene Ther. 20:796-806)、牛痘病毒(Wanget al . (2017) Mol. Ther. Methods Clin Devel. 7: 146-155.)、及腺病毒(Fisheret al . (1996) Hum gene Ther. 7: 2079-2087; Gaoet al . (1998) Hum Gene Ther. 2353-2362. Liuet al . (1999) Gene Ther 6: 293-299)。這些方法需要生產數種不同的病毒（且在一些情況下為重組宿主細胞系）。AAV亦已生產於使用桿狀病毒之昆蟲細胞中(Mietzschet al . (2014) Hum Gene Ther. 25:212-22; Aslanidiet al . (2009) Proc Natl Acad Sci USA. 106:5059-5064; Cecchiniet al . (2011) Hum Gene Ther. 22:1021-1030)。昆蟲細胞與人細胞中產生的AAV在功能上是否等效仍是一個懸而未決的問題。
對於改良具有重組建構體及細胞的AAV之生產仍有需求。
在一個態樣中，本文提供一種非天然存在的核酸分子，其包含經修飾腺相關病毒(AAV)rep 基因，該基因具有編碼四種Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52、及Rep40之AAVrep 基因及插入至由該等四種Rep蛋白共享之該rep 基因的編碼序列中的人工內含子，其中該人工內含子包含止擋匣(stop cassette)，該止擋匣係插入在該人工內含子之5'剪接位點下游及分支位點上游，且該止擋匣以5'至3'的順序包含：(a)具有與SEQ ID NO:7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attP 位點，較佳的是具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點；(b)剪接受體；(c)終止子；及(d)具有與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attB 位點，較佳的是具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點。
在一個實施例中，該剪接受體包含SEQ ID NO:17之核苷酸序列。
在一個實施例中，該終止子包含多腺苷酸化信號。在一個實施例中，該終止子進一步包含SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。
在一個實施例中，該止擋匣包含編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶(neomycin phosphotransferase)表現匣。
在一個實施例中，該人工內含子以5'至3'的順序包含SEQ ID NO:14之核苷酸序列、該止擋匣、及SEQ ID NO:15之核苷酸序列。
在一個實施例中，該AAVrep 基因包含AAV1至AAV8中之一者之rep 基因、或其混合。在一個實施例中，該AAVrep 基因包含人類AAV2之該rep 基因，該基因具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號190至2202。在一個實施例中，該人工內含子係插入在GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號996至1905之間。在一個實施例中，該人工內含子係直接插入在GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號1052、1061、1712、1906、1022、1112、1475、1514、1700、1742、1784或1340、較佳的是核苷酸編號1052的下游。
在一個態樣中，本文提供一種非天然存在的核酸分子，其包含經修飾AAVrep 基因，該基因以5'至3'的順序包含：(a)具有SEQ ID NO:55之核苷酸序列的AAVrep 基因之5'部分；(b)人工內含子，其以5'至3'的順序包含：(i)具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列的5'內含子片段；(ii)止擋匣，其以5'至3'的順序包含：(1)具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點；(2)具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列的剪接受體；(3)具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣；(4)具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列的終止子；及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及(iii)具有SEQ ID NO:15之核苷酸序列的3'內含子片段；及(c)具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列的該AAVrep 基因之3'部分。
在一個態樣中，本文提供一種非天然存在的核酸分子，其包含經修飾AAVrep 基因，該基因以5'至3'的順序包含：(a)具有SEQ ID NO:73之核苷酸序列的AAVrep 基因之5'部分；(b)人工內含子，其以5'至3'的順序包含：(i)具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列的5'內含子片段；(ii)止擋匣，其以5'至3'的順序包含：(1)具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點；(2)具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列的剪接受體；(3)具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣；(4)具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列的終止子；及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及(iii)具有SEQ ID NO:66之核苷酸序列的3'內含子片段；及(c)具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列的該AAVrep 基因之3'部分。在一個實施例中，該止擋匣包含SEQ ID NO: 16之核苷酸序列。
在一個實施例中，該非天然存在的核酸分子進一步包括編碼三種殼體蛋白VP1、VP2及VP3的AAVcap 基因。在一個實施例中，該AAVcap 基因包含AAV1至AAV9及AAVDJ中之一者、或其混合之cap 基因。在一個實施例中，該AAVcap 基因包含具有GenBank存取號AY530579.1之核苷酸序列的人類AAV9之cap 基因。在一個實施例中，該AAVcap 基因進一步包含多腺苷酸化信號（較佳的是具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號4411至4466之AAV2的多腺苷酸化信號）及強化子（較佳的是具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號190至313之AV2rep P5啟動子），其中該多腺苷酸化信號及該強化子兩者皆係該cap 基因之該編碼序列的下游。在一個實施例中，該非天然存在的核酸分子進一步包括由該AAVcap 基因下游的一對AAV反向末端重複(ITR)側接的轉殖基因。
在一個實施例中，該非天然存在的核酸分子又進一步包括該經修飾AAVrep 基因上游的第一絕緣子及可選地由該等ITR側接之該轉殖基因下游的第二絕緣子，較佳地，該第一絕緣子及該第二絕緣子係獨立地選自由下列所組成之群組：(a)具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列的人類抗抑制因子40；(b)具有SEQ ID NO:25之核苷酸序列的小鼠抗抑制因子40；(c)具有GenBank存取號AY190749.1之核苷酸序列的抗抑制因子04；(d)具有GenBank存取號AY190750.1之核苷酸序列的抗抑制因子06；(e)具有GenBank存取號AY190751.1之核苷酸序列的抗抑制因子07；(f)具有GenBank存取號AY190752.1之核苷酸序列的抗抑制因子12；(g)具有GenBank存取號AY190753.1之核苷酸序列的抗抑制因子13；(h)具有GenBank存取號AY190754.1之核苷酸序列的抗抑制因子35；(i)具有GenBank存取號AY190755.1之核苷酸序列的抗抑制因子36；(j)具有GenBank存取號AY190757.1之核苷酸序列的抗抑制因子52；(k)具有GenBank存取號AY190758.1之核苷酸序列的抗抑制因子53；及(l)來自在二或更多個拷貝中具有AY040835.1之核苷酸序列的球蛋白基因座之雞HS4絕緣子，更佳地，該第一絕緣子及該第二絕緣子分別具有SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25之核苷酸序列。在一個實施例中，該非天然存在的核酸分子包含該經修飾AAVrep 基因上游之該第一絕緣子，並且進一步分別包含該轉殖基因上游及下游的第一間隔序列及第二間隔序列，其中該第一間隔序列及該第二間隔序列係獨立地選自由下列所組成之群組：(a) SEQ ID NO:67之核苷酸序列；及(b) SEQ ID NO:68之核苷酸序列。在一個實施例中，該ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；較佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列。
在一個態樣中，本文提供一種非天然存在的核酸分子，其以5'至3'的順序包含：(A)第一絕緣子，較佳地該第一絕緣子具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列；(B)經修飾AAVrep 基因，其以5'至3'的順序包含：(i) AAVrep 基因之5'部分，較佳地該AAVrep 基因之該5'部分具有SEQ ID NO:55之核苷酸序列；(ii)人工內含子，其以5'至3'的順序包含：(a) 5'內含子片段，較佳地該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列；(b)止擋匣，其以5'至3'的順序包含：(1)具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點；(2)剪接受體，較佳地該剪接受體具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列；(3)編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣；(4)終止子，較佳地該終止子具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列；及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及(c) 3'內含子片段，較佳地該3'內含子片段具有SEQ ID NO:15之核苷酸序列；(iii)該AAVrep 基因之3'部分，較佳地該AAVrep 基因之該3'部分具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列；(C) AAVcap 基因，較佳地該AAVcap 基因包含SEQ ID NO:57之核苷酸序列；(D)由一對AAV ITR側接之轉殖基因，較佳地，該AAV ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，且該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；更佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列；及(E)第二絕緣子，較佳地該第二絕緣子具有SEQ ID NO:25之核苷酸序列。
在一個態樣中，本文提供一種非天然存在的核酸分子，其以5'至3'的順序包含：(A)第一絕緣子，較佳地該第一絕緣子具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列；(B)經修飾AAVrep 基因，其以5'至3'的順序包含：(i) AAVrep 基因之5'部分，較佳地該AAVrep 基因之該5'部分具有SEQ ID NO:73之核苷酸序列；(ii)人工內含子，其以5'至3'的順序包含：(a) 5'內含子片段，較佳地該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列；(b)止擋匣，其以5'至3'的順序包含：(1)具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點；(2)剪接受體，較佳地該剪接受體具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列；(3)編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣；(4)終止子，較佳地該終止子具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列；及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及(c) 3'內含子片段，較佳地該3'內含子片段具有SEQ ID NO:66之核苷酸序列；(iii)該AAVrep 基因之3'部分，較佳地該AAVrep 基因之該3'部分具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列；(C) AAVcap 基因；(D)由下列側接之轉殖基因：(1)一對AAV ITR，較佳地，該AAV ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，且該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；更佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列；及(2)一對間隔序列，較佳地，該間隔序列具有SEQ ID NO:67及SEQ ID NO:68之核苷酸序列。
在一個態樣中，本文提供一種載體，其包含以上所述之非天然存在的核酸分子；較佳地，該載體係質體；更佳地，該質體包含SEQ ID NO:12之核苷酸序列。
在一個態樣中，本文提供一種載體，其包含以上所述之非天然存在的核酸分子；較佳地，該載體係質體；更佳地，該質體包含SEQ ID NO:70之核苷酸序列。
在一個態樣中，本文提供一種製造以上所述之非天然存在的核酸分子之方法。在具體實施例中，本文提供一種製造載體之方法，該載體包含以上所述之非天然存在的核酸分子；較佳地，該載體係質體；更佳地，該質體包含SEQ ID NO:12之核苷酸序列。在另一實施例中，本文提供一種製造載體之方法，該載體包含以上所述之非天然存在的核酸分子；較佳地，該載體係質體；更佳地，該質體包含SEQ ID NO:70之核苷酸序列。
在一個態樣中，本文提供一種細胞，其包含非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含經修飾腺相關病毒(AAV)rep 基因，該基因具有編碼四種Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52、及Rep40之AAVrep 基因及插入至由該等四種Rep蛋白共享之該rep 基因的編碼序列中的人工內含子，其中該人工內含子包含止擋匣，該止擋匣係插入在該人工內含子之5'剪接位點下游及分支位點上游，且該止擋匣以5'至3'的順序包含：(a)具有與SEQ ID NO:7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attP 位點，較佳的是具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點；(b)剪接受體；(c)終止子；及(d)具有與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attB 位點，較佳的是具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點。
在一個實施例中，該剪接受體包含SEQ ID NO:17之核苷酸序列。
在一個實施例中，該終止子包含多腺苷酸化信號。在一個實施例中，該終止子進一步包含SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。
在一個實施例中，該止擋匣包含編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶(neomycin phosphotransferase)表現匣。
在一個實施例中，該人工內含子以5'至3'的順序包含SEQ ID NO:14之核苷酸序列、該止擋匣、及SEQ ID NO:15之核苷酸序列。在另一實施例中，該人工內含子以5'至3'的順序包含SEQ ID NO:14之核苷酸序列、該止擋匣、及SEQ ID NO:66之核苷酸序列。
在一個實施例中，該AAVrep 基因包含AAV1至AAV8中之一者之rep 基因、或其混合。在一個實施例中，該AAVrep 基因包含人類AAV2之該rep 基因，該基因具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號190至2202。在一個實施例中，該人工內含子係插入在GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號996至1905之間。在一個實施例中，該人工內含子係直接插入在GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號1052、1061、1712、1906、1022、1112、1475、1514、1700、1742、1784或1340、較佳的是核苷酸編號1052的下游。
在一個態樣中，本文提供一種細胞，其包含非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含經修飾AAVrep 基因，該基因以5'至3'的順序包含：(a)具有SEQ ID NO:55之核苷酸序列的AAVrep 基因之5'部分；(b)人工內含子，其以5'至3'的順序包含：(i)具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列的5'內含子片段；(ii)止擋匣，其以5'至3'的順序包含：(1)具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點；(2)具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列的剪接受體；(3)具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣；(4)具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列的終止子；及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及(iii)具有SEQ ID NO:15之核苷酸序列的3'內含子片段；及(c)具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列的該AAVrep 基因之3'部分。
在一個態樣中，本文提供一種細胞，其包含非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含經修飾AAVrep 基因，該基因以5'至3'的順序包含：(a)具有SEQ ID NO:73之核苷酸序列的AAVrep 基因之5'部分；(b)人工內含子，其以5'至3'的順序包含：(i)具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列的5'內含子片段；(ii)止擋匣，其以5'至3'的順序包含：(1)具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點；(2)具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列的剪接受體；(3)具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣；(4)具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列的終止子；及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及(iii)具有SEQ ID NO:66之核苷酸序列的3'內含子片段；及(c)具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列的該AAVrep 基因之3'部分。
在一個實施例中，該止擋匣包含SEQ ID NO: 16之核苷酸序列。
在一個實施例中，以上所述之細胞進一步包括編碼三種殼體蛋白VP1、VP2及VP3的AAVcap 基因。在一個實施例中，該AAVcap 基因包含AAV1至AAV9及AAVDJ中之一者、或其混合之cap 基因。在一個實施例中，該AAVcap 基因包含具有GenBank存取號AY530579.1之核苷酸序列的人類AAV9之cap 基因。在一個實施例中，AAVcap 基因包含AAV9的混合之cap 基因。
在一個實施例中，該AAVcap 基因進一步包含多腺苷酸化信號（較佳的是具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號4411至4466之AAV2的多腺苷酸化信號）及強化子（較佳的是具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號190至313之AAV2rep P5啟動子），其中該多腺苷酸化信號及該強化子兩者皆係該cap 基因之該編碼序列的下游。
在一個實施例中，包含cap 基因之細胞進一步包括轉殖基因，該轉殖基因由該AAVcap 基因下游的一對AAV反向末端重複(ITR)側接。在一個實施例中，該細胞進一步包括該經修飾AAVrep 基因上游的第一絕緣子及可選地由該等ITR側接之該轉殖基因下游的第二絕緣子，較佳地，該第一絕緣子及該第二絕緣子係獨立地選自由下列所組成之群組：(a)具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列的人類抗抑制因子40；(b)具有SEQ ID NO:25之核苷酸序列的小鼠抗抑制因子40；(c)具有GenBank存取號AY190749.1之核苷酸序列的抗抑制因子04；(d)具有GenBank存取號AY190750.1之核苷酸序列的抗抑制因子06；(e)具有GenBank存取號AY190751.1之核苷酸序列的抗抑制因子07；(f)具有GenBank存取號AY190752.1之核苷酸序列的抗抑制因子12；(g)具有GenBank存取號AY190753.1之核苷酸序列的抗抑制因子13；(h)具有GenBank存取號AY190754.1之核苷酸序列的抗抑制因子35；(i)具有GenBank存取號AY190755.1之核苷酸序列的抗抑制因子36；(j)具有GenBank存取號AY190757.1之核苷酸序列的抗抑制因子52；(k)具有GenBank存取號AY190758.1之核苷酸序列的抗抑制因子53；及(l)來自在二或更多個拷貝中具有AY040835.1之核苷酸序列的球蛋白基因座之雞HS4絕緣子，更佳地，該第一絕緣子及該第二絕緣子分別具有SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25之核苷酸序列。在一個實施例中，該細胞包含該經修飾AAVrep 基因上游之該第一絕緣子，並且進一步分別包含該轉殖基因上游及下游的第一間隔序列及第二間隔序列，其中該第一間隔序列及該第二間隔序列係獨立地選自由下列所組成之群組：(a) SEQ ID NO:67之核苷酸序列；及(b) SEQ ID NO:68之核苷酸序列。
在一個實施例中，該ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；較佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列。
在一個態樣中，本文提供一種細胞，其包含非天然存在的核酸分子，該核酸分子以5'至3'的順序包含：(A)第一絕緣子，較佳地該第一絕緣子具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列；(B)經修飾AAVrep 基因，其以5'至3'的順序包含：(i) AAVrep 基因之5'部分，較佳地該AAVrep 基因之該5'部分具有SEQ ID NO:55之核苷酸序列；(ii)人工內含子，其以5'至3'的順序包含：(a) 5'內含子片段，較佳地該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列；(b)止擋匣，其以5'至3'的順序包含：(1)具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點；(2)剪接受體，較佳地該剪接受體具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列；(3)編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣；(4)終止子，較佳地該終止子具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列；及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及(c) 3'內含子片段，較佳地該3'內含子片段具有SEQ ID NO:15之核苷酸序列；(iii)該AAVrep 基因之3'部分，較佳地該AAVrep 基因之該3'部分具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列；(C) AAVcap 基因，較佳地該AAVcap 基因包含SEQ ID NO:57之核苷酸序列；(D)由一對AAV ITR側接之轉殖基因，較佳地，該AAV ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，且該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；更佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列；及(E)第二絕緣子，較佳地該第二絕緣子具有SEQ ID NO:25之核苷酸序列。
在一個態樣中，本文提供一種細胞，其包含非天然存在的核酸分子，該核酸分子以5'至3'的順序包含：(A)第一絕緣子，較佳地該第一絕緣子具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列；(B)經修飾AAVrep 基因，其以5'至3'的順序包含：(i) AAVrep 基因之5'部分，較佳地該AAVrep 基因之該5'部分具有SEQ ID NO:73之核苷酸序列；(ii)人工內含子，其以5'至3'的順序包含：(a) 5'內含子片段，較佳地該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列；(b)止擋匣，其以5'至3'的順序包含：(1)具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點；(2)剪接受體，較佳地該剪接受體具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列；(3)編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣；(4)終止子，較佳地該終止子具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列；及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及(c) 3'內含子片段，較佳地該3'內含子片段具有SEQ ID NO:66之核苷酸序列；(iii)該AAVrep 基因之3'部分，較佳地該AAVrep 基因之該3'部分具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列；(C) AAVcap 基因；及(D)由下列側接之轉殖基因：(i)一對AAV ITR，較佳地，該AAV ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，且該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；更佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列；及(ii)一對間隔序列，較佳地，該間隔序列具有SEQ ID NO:67及SEQ ID NO:68之核苷酸序列。
在一個實施例中，該非天然存在的核酸分子係游離型，其具有SEQ ID NO:12之核苷酸序列。在另一實施例中，該非天然存在的核酸分子係游離型，其具有SEQ ID NO:70之核苷酸序列。
在一個實施例中，該細胞進一步包括編碼重組酶之核酸分子，該重組酶具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的胺基酸序列；較佳地，該核酸包含與SEQ ID NO: 3之核苷酸序列至少85%、至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一的核苷酸序列；更佳地，該細胞包含重組ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5 (Ad5)病毒，該病毒編碼具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列的重組酶。
在一個實施例中，該細胞進一步包括腺病毒E1A及E1B基因，較佳地該細胞係911細胞、pTG6559細胞、GH329細胞、N52.E6細胞、HeLa-E1細胞、UR細胞、VLI-293細胞、HEK293細胞、或PER.C6細胞。
在一個態樣中，本文提供一種生產包含轉殖基因之重組AAV的方法，其包含：(A)獲得第一宿主細胞，其包含：(i)經修飾AAVrep 基因，該基因以5'至3'的順序包含：(a) AAVrep 基因之5'部分，較佳地該AAVrep 基因具有SEQ ID NO:55之核苷酸序列；(b)人工內含子，其以5'至3'的順序包含：(1) 5'內含子片段，較佳地該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列；(2)止擋匣，其以5'至3'的順序包含：(aa)具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點；(bb)剪接受體，較佳地該剪接受體具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列；(cc)編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣；(dd)終止子，較佳地該終止子具有SEQ IDNO:19之核苷酸序列；及(ee)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及(3) 3'內含子片段，較佳地該3'內含子片段具有SEQ ID NO:15之核苷酸序列；(c)該AAVrep 基因之3'部分，較佳地該AAVrep 基因之該3'部分具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列；(ii) AAVcap 基因，較佳地該AAVcap 基因包含SEQ ID NO:57之核苷酸序列；及(iii)由一對AAV ITR側接之轉殖基因，較佳地，該ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；更佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列；(B)將該第一宿主細胞用重組腺病毒感染，該重組腺病毒包含編碼具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的重組酶之重組酶基因，以獲得進一步含有該重組酶基因的第二宿主細胞；(C)在生產包含該轉殖基因之該重組AAV的條件下生長該第二宿主細胞；及(D)可選地收集該重組AAV。
在一個態樣中，本文提供一種生產包含轉殖基因之重組AAV的方法，其包含：(A)獲得第一宿主細胞，其包含：(i)經修飾AAVrep 基因，該基因以5'至3'的順序包含：(a) AAVrep 基因之5'部分，較佳地該AAVrep 基因具有SEQ ID NO:73之核苷酸序列；(b)人工內含子，其以5'至3'的順序包含：(1) 5'內含子片段，較佳地該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列；(2)止擋匣，其以5'至3'的順序包含：(aa)具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點；(bb)剪接受體，較佳地該剪接受體具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列；(cc)編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣；(dd)終止子，較佳地該終止子具有SEQ IDNO:19之核苷酸序列；及(ee)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及(3) 3'內含子片段，較佳地該3'內含子片段具有SEQ ID NO:66之核苷酸序列；(c)該AAVrep 基因之3'部分，較佳地該AAVrep 基因之該3'部分具有SEQ ID NO:66之核苷酸序列；(ii) AAVcap 基因；及(iii)由下列側接之轉殖基因：(a)一對AAV ITR，較佳地，該ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；更佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列；及(b)一對間隔序列，較佳地，該間隔序列具有SEQ ID NO:67及SEQ ID NO:68之核苷酸序列；(B)將該第一宿主細胞用重組腺病毒感染，該重組腺病毒包含編碼具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的重組酶之重組酶基因，以獲得進一步含有該重組酶基因的第二宿主細胞；(C)在生產包含該轉殖基因之該重組AAV的條件下生長該第二宿主細胞；及(D)可選地收集該重組AAV。
在一個實施例中，該第一宿主細胞進一步包含該經修飾AAVrep 基因上游的第一絕緣子及可選地由該等ITR側接之該轉殖基因下游的第二絕緣子，較佳地，該第一絕緣子及該第二絕緣子係獨立地選自由下列所組成之群組：(a)具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列的人類抗抑制因子40；(b)具有SEQ ID NO:25之核苷酸序列的小鼠抗抑制因子40；(c)具有GenBank存取號AY190749.1之核苷酸序列的抗抑制因子04；(d)具有GenBank存取號AY190750.1之核苷酸序列的抗抑制因子06；(e)具有GenBank存取號AY190751.1之核苷酸序列的抗抑制因子07；(f)具有GenBank存取號AY190752.1之核苷酸序列的抗抑制因子12；(g)具有GenBank存取號AY190753.1之核苷酸序列的抗抑制因子13；(h)具有GenBank存取號AY190754.1之核苷酸序列的抗抑制因子35；(i)具有GenBank存取號AY190755.1之核苷酸序列的抗抑制因子36；(j)具有GenBank存取號AY190757.1之核苷酸序列的抗抑制因子52；(k)具有GenBank存取號AY190758.1之核苷酸序列的抗抑制因子53；及(l)來自在二或更多個拷貝中具有AY040835.1之核苷酸序列的球蛋白基因座之雞HS4絕緣子，更佳地，該第一絕緣子及該第二絕緣子分別具有SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25之核苷酸序列。
在一個實施例中，該第一宿主細胞包含該經修飾AAVrep 基因上游之該第一絕緣子，並且進一步分別包含該轉殖基因上游及下游的第一間隔序列及第二間隔序列，其中該第一間隔序列及該第二間隔序列係獨立地選自由下列所組成之群組：(a) SEQ ID NO:67之核苷酸序列；及(b) SEQ ID NO:68之核苷酸序列。
在一個實施例中，該第一宿主細胞係藉由將一或多種核酸分子引入至細胞中而獲得，該等核酸分子包含該經修飾AAVrep 基因、該AAVcap 基因、由該等ITR側接之該轉殖基因、該第一絕緣子、及該第二絕緣子。在一個實施例中，該第一宿主細胞係藉由將核酸分子引入至該細胞中而獲得，該核酸分子以5'至3'的順序包含該第一絕緣子、該經修飾AAVrep 基因、該AAVcap 基因、由該等ITR側接之該轉殖基因、該第一絕緣子、及該第二絕緣子、較佳地包含SEQ ID NO:12之核苷酸序列的質體。
在一個實施例中，該第一宿主細胞係藉由將一或多種核酸分子引入至細胞中而獲得，該等核酸分子包含該經修飾AAVrep 基因、該AAVcap 基因、由該等ITR側接之該轉殖基因、該第一絕緣子、該第一間隔序列、及該第二間隔序列。在一個實施例中，該第一宿主細胞係藉由將一或多種核酸分子引入至細胞中而獲得，該等核酸分子包含該經修飾AAVrep 基因、該AAVcap 基因、由該等ITR側接之該轉殖基因、該第一絕緣子、該第一間隔序列、及該第二間隔序列、較佳地包含SEQ ID NO:70之核苷酸序列的質體。
在一個實施例中，該重組腺病毒係重組ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5 (Ad5)病毒，該病毒包含SEQ ID NO:3之核苷酸序列。
在一個實施例中，該宿主細胞包含腺病毒E1A及E1B基因，較佳地該細胞係911細胞、pTG6559細胞、GH329細胞、N52.E6細胞、HeLa-E1細胞、UR細胞、VLI-293細胞、HEK293細胞、或PER.C6細胞。
在一個實施例中，用於生長該第二宿主細胞之條件包含用2-胺基嘌呤培養該第二細胞。在一個實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係小於約1.25 mM。在一個實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係約1 µM至約1.25 mM。在一個實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係約10 µM至約1.25 mM。在一個實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係約100 µM至約1.25 mM。在一個實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係約1.25 mM。
在一個實施例中，用2-胺基嘌呤培養該第二細胞係在用重組腺病毒感染該第一宿主細胞後約24小時起始。。
在一個態樣中，本文提供一種組成物，其包含如上所述之包含編碼重組酶之核酸分子的細胞、及2-胺基嘌呤。在一個實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係小於約1.25 mM。在一個實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係約1 µM至約1.25 mM。在一個實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係約10 µM至約1.25 mM。在一個實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係約100 µM至約1.25 mM。在一個實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係約1.25 mM。
在一個態樣中，本文提供一種非天然存在的核酸分子，其包含編碼絲胺酸重組酶之核苷酸序列，該絲胺酸重組酶具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。在一個實施例中，該非天然存在的核酸分子包括與SEQ ID NO:3之核苷酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。
在一個態樣中，本文提供一種載體，其包含該非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含編碼絲胺酸重組酶之核苷酸序列，該絲胺酸重組酶具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。
在一個態樣中，本文提供一種載體，其包含該非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含編碼絲胺酸重組酶之核苷酸序列，該絲胺酸重組酶具有與SEQ ID NO:3之胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。
在一個實施例中，該載體進一步包括啟動子，較佳的是可操作地連接至編碼該絲胺酸重組酶之該核苷酸序列的巨細胞病毒(CMV)啟動子。
在一個實施例中，該載體進一步包括多腺苷酸化信號，諸如猴病毒40 (SV40)多腺苷酸化信號，其可操作地連接至編碼該絲胺酸重組酶的該核苷酸序列。
在一個實施例中，該載體係DNA質體。在一些實施例中，該載體係重組腺病毒載體。
在一個實施例中，該載體係一種重組ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5 (Ad5)病毒，該病毒包含核苷酸序列，該核苷酸序列在CMV啟動子的控制下編碼具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列的絲胺酸重組酶，其中該核苷酸序列係進一步可操作地連接至SV40多腺苷酸化信號(NC_001669.1, nt 2550至2774)。
在一個態樣中，本文提供一種細胞，其包含非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含編碼絲胺酸重組酶之核苷酸序列，該絲胺酸重組酶具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%、諸如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。在一個實施例中，該細胞包括與SEQ ID NO: 3之核苷酸序列至少85%、諸如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性的核苷酸序列。
在一個態樣中，本文提供一種細胞，其包括包含該非天然存在的核酸分子之載體，該核酸分子包含編碼絲胺酸重組酶之核苷酸序列，該絲胺酸重組酶具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%、諸如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。在另一態樣中，本文提供一種細胞，其包括包含該非天然存在的核酸分子之載體，該核酸分子包含編碼絲胺酸重組酶之核苷酸序列，該絲胺酸重組酶具有與SEQ ID NO:3之胺基酸序列至少85%、諸如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。
在一個實施例中，該細胞進一步包括啟動子，較佳的是可操作地連接至編碼該絲胺酸重組酶之該核苷酸序列的巨細胞病毒(CMV)啟動子。
在一個實施例中，該細胞進一步包括多腺苷酸化信號，諸如猴病毒40 (SV40)多腺苷酸化信號，其可操作地連接至編碼該絲胺酸重組酶的該核苷酸序列。
在一個實施例中，該載體係DNA質體。在一些實施例中，該載體係重組腺病毒載體。
在一個實施例中，該重組腺病毒載體包括一種重組ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5 (Ad5)病毒，該病毒包含核苷酸序列，該核苷酸序列在CMV啟動子的控制下編碼具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列的絲胺酸重組酶，其中該核苷酸序列係進一步可操作地連接至SV40多腺苷酸化信號(NC_001669.1, nt 2550至2774)。
在一個實施例中，該細胞包括腺病毒E1A及E1B基因，較佳地該細胞係911細胞、pTG6559細胞、GH329細胞、N52.E6細胞、HeLa-E1細胞、UR細胞、VLI-293細胞、HEK293細胞、或PER.C6細胞。
在一個態樣中，本文提供一種在細胞中進行位點特異性重組的方法，該方法包含：(a)獲得包含核酸分子的細胞，該核酸分子具有與SEQ ID NO:7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attP 位點（較佳的是具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點）及與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attB 位點（較佳的是具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點）；(b)將非天然存在的核酸分子引入至該細胞中，該核酸分子編碼具有與SEQ ID NO:2至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的絲胺酸重組酶；及(c)在使該絲胺酸重組酶催化在該等attP 與attB 位點之間該位點特異性重組的條件下生長該細胞。
在一個態樣中，本文提供一種藉由在細胞中進行位點特異性重組之程序所產生的產物，該程序包含：(a)獲得包含核酸分子的細胞，該核酸分子具有與SEQ ID NO:7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attP 位點（較佳的是具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點）及與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attB 位點（較佳的是具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點）；(b)將非天然存在的核酸分子引入至該細胞中，該核酸分子編碼具有與SEQ ID NO:2至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的絲胺酸重組酶；及(c)在使該絲胺酸重組酶催化在該等attP 與attB 位點之間該位點特異性重組的條件下生長該細胞。
在一個態樣中，本文提供一種用於獲得來自細胞之產物的程序，該程序包含：(a)獲得包含核酸分子的細胞，該核酸分子具有與SEQ ID NO:7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attP 位點（較佳的是具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點）及與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attB 位點（較佳的是具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點）；(b)將非天然存在的核酸分子引入至該細胞中，該核酸分子編碼具有與SEQ ID NO:2至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的絲胺酸重組酶；(c)在使該絲胺酸重組酶催化在該等attP 與attB 位點之間該位點特異性重組的條件下生長該細胞；及(d)從該細胞中生產並回收產物。
在一個態樣中，本文提供一種非天然存在的系統，其包含：用於經AAV媒介之重組之手段，其中該手段可選地包含轉殖基因因子。在一個態樣中，本文提供一種用於轉移該非天然存在的系統之手段，其包含：用於經AAV媒介之重組之手段，其中該手段可選地包含轉殖基因因子。
在一個態樣中，本文提供一種非天然存在的系統，其包含：用於重組包含下列之系統的重組手段：用於經AAV媒介之重組之手段，其中該手段可選地包含轉殖基因因子，其中該重組手段包括在催化期間使用至少一種絲胺酸殘基。在一個態樣中，本文提供一種用於轉移該非天然存在的系統之手段，其包含：用於重組包含下列之系統的重組手段：用於經AAV媒介之重組之手段，其中該手段可選地包含轉殖基因因子，其中該重組手段包括在催化期間使用至少一種絲胺酸殘基。
在一個態樣中，本文提供一種用於製造分子的手段，其中該用於製造分子的手段包含上述手段中之任一者並且能夠被複製。
在一個態樣中，本文提供一種用於經AAV媒介之位點特異性重組之程序，其包含：(a)用於執行獲得細胞之功能的步驟，其包含用於經AAV媒介之重組之手段，其中該手段可選地包含轉殖基因因子；(b)在催化期間使用至少一種絲胺酸殘基以使位點特異性重組的條件下，用於執行生長該細胞的功能之步驟。在一個實施例中，該程序包括獲得產物，其中可選地該產物係治療性產物。
發明之其他態樣、特徵、及優點，自下文揭露（包括實施方式與其較佳實施例，以及附加之申請專利範圍）觀之，係顯而易見者。
本申請案主張於2019年7月23日申請之美國臨時申請案第62/877,508號；2019年7月23日申請之美國臨時申請案第62/877,516號；2019年7月23日申請之美國臨時申請案第62/877,524號；2019年7月23日申請之美國臨時申請案第62/877,532號；2019年7月23日申請之美國臨時申請案第62/877,540號；2019年7月23日申請之美國臨時申請案第62/877,551號；2019年7月23日申請之美國臨時申請案第62/877,561號；及2019年7月23日申請之美國臨時申請案第62/877,577號等之優先權，其等全文以引用方式併入本文中。 電子提交序列表之參照
本申請案含有序列表，該序列表已經由EFS-Web以ASCII格式序列表電子提交，檔案名稱為「14620-192-185_SEQ_LISTING」，創建日期為2020年7月16日，且檔案大小為152,403位元組。經EFS-Web提交之序列表係本說明書之一部分，其全文以引用方式併入本文中。
各篇公開案、論文、及專利已於先前技術及整份說明書引用或描述；此等參考文獻之各者全文係以引用方式併入本文中。在本說明書中所包括之對於文件、行動、材料、裝置、物品、或其類似者的論述，目的在於提供關於本發明的脈絡。此等論述並非承認，任一或所有此等情事形成了關於任何所揭示或請求之發明的先前技術部分。
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學用語，均與本發明有關技術領域中具有通常知識者所通常了解之意義相同。在其他方面，在本文中所使用的某些用語具有如本說明書所闡述之意義。在本文中所引用的所有專利、已公開專利申請案及公開案係以引用方式併入，猶如全文說明於本文中。
必須注意的是，本文及附加之申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確說明。
除非以其他方式指示，在一系列因子之前的用語「至少(at least)」應理解為係指該序列中的每一因子。所屬技術領域中具有通常知識者將認可或僅使用例行實驗即可確定本文所述之本發明的特定實施例的許多等效物。該等等效物意欲涵蓋於本發明中。
在整份說明書及申請專利範圍中，除非上下文另有要求，否則詞語「包含(comprise)」及諸如「包含(comprises)」及「包含(comprising)」的變化形式，將理解為暗示包括所述整數或步驟或整數或步驟之群組，但不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟之群組。當用於本文時，用語「包含(comprising)」可經用語「含有(containing)」或「包括(including)」取代，或有時候在本文中使用用語「具有(having)」。
當用於本文時，「由…組成(consisting of)」排除所請之因子中未指定之任何因子、步驟、或成分。當用於本文時，「基本上由…組成(consisting essentially of)」不排除不會實質影響申請專利範圍之基本及新穎特徵的材料或步驟。在本文中，當任何前述用語「包含(comprising)」、「含有(containing)」、「包括(including)」、及「具有(having)」用於本申請案之態樣或實施例之上下文時，可由用語「由…組成(consisting of)」或「基本上由…組成(consisting essentially of)」置換。
如本文中所使用，多個所述因子之間的聯合用語「及/或(and/or)」係理解為涵蓋個別及組合選項兩者。例如，其中兩個因子係藉由「及/或」結合，第一選項係指第一因子在沒有第二因子的情況下之適用性。第二選項係指第二因子在沒有第一因子的情況下之適用性。第三選項係指第一及第二因子一起的適用性。這些選項之任一者應理解為落入該含義內，並因此滿足如本文中所使用之用語「及/或」之要求。該等選項之多於一者的並行適用性亦應理解為落入該含義內，並因此滿足用語「及/或」之要求。
除非另有說明，在本文中描述之任何數值（諸如濃度或濃度範圍）應理解為在所有情況下皆受到用語「約(about)」之修飾。因此，數值一般包括記載值之± 10%。例如，濃度1 mg/mL包括0.9 mg/mL至1.1 mg/mL。同樣地，1 mg/mL至10 mg/mL之濃度範圍包括0.9 mg/mL至11 mg/mL。如本文中所使用，明示使用之數值範圍包括所有可能的子範圍、在該範圍內之所有個別數值，包括在該等範圍內之整數及數值之分數，除非上下文以其他方式清楚指示。
當參考胺基酸序列使用時，用語「百分比(%)序列同一性」或「%同一性(% identity)」或「與…%同一(% identical to)」描述相較於構成胺基酸序列總長度的胺基酸殘基編號，二或更多個比對的胺基酸序列之相同胺基酸的匹配數（「命中」）。換句話說，使用比對，當比較序列並對其進行比對以獲得最大對應性時（如使用所屬技術領域中已知的序列比較演算法測量），或當手動比對及目視檢查時，可判定二或更多個序列胺基酸殘基相同之百分比（例如，在該等胺基酸序列全長上90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%同一性）。判定序列同一性所比較的序列可能因胺基酸的（多個）取代、（多個）添加、或（多個）缺失而不同。用於比對蛋白質序列之合適程式係所屬技術領域中具有通常知識者所習知。例如，蛋白質序列的百分比序列同一性可用諸如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA、或BLAST之程式，例如使用NCBI BLAST演算法來判定(Altschul SF,et al (1997),Nucleic Acids Res . 25:3389-3402)。
如本文中所使用，「非天然存在的(non-naturally occurring)」核酸或多肽係指在自然界中不存在之核酸或多肽。可在實驗室及/或製造設定中合成、處理、製造、及/或以其他方式操縱「非天然存在的」核酸或多肽。在一些情況下，非天然存在的核酸或多肽可包含經處理、加工、或操縱的天然存在的核酸或多肽，以展現該天然存在的核酸或多肽在處理前不存在的性質。如本文中所使用，「非天然存在的」核酸或多肽可係與所發現之天然來源單離或分離的核酸或多肽，且其缺乏與其在天然來源相關聯之序列的共價鍵。可重組或經由其他方法（諸如化學合成）來製成「非天然存在的」核酸或多肽。
如本文中所使用，用語「混合(hybrid)」當用於表示AAVcap 基因時，旨在意指包括與不同血清型殼體的部分結合之一種血清型殼體的部分之cap 基因。該用語亦包括AAVcap 基因變異體，其中該天然存在的AAV血清型序列含有一或多個非天然存在之突變。
如本文中所使用，用語「間隔序列(spacer sequence)」旨在意指非編碼核苷酸的區域，除了分離其他遺傳因子外，該核苷酸不具有表觀功能。
如本文中所使用，用語「可操作地連接的(optionally linked)」係指鍵聯或併接(juxtaposition)，其中所述之組分係處於允許其等以其預期方式起作用的關係。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄，則其可操作地連接至該編碼序列，或者可操作地連接至所關注之胺基酸序列的信號序列能夠在膜上分泌或易位所關注之胺基酸序列。
為了幫助本申請案的讀者，已將說明書分成各種不同的段落或章節，或指向本申請案之各種實施例。這些分段不應被視為是將來段落或章節或實施例與另一段落或章節或實施例實質斷開。相反地，所屬技術領域中具有通常知識者將理解，本說明書具有廣泛的應用並且涵蓋可設想的各種章節、段落、及文句之所有組合。任何實施例之討論僅意指為例示性並且不意欲暗示本揭露之範疇（包括申請專利範圍）限於這些實例。例如，儘管本文所述之本申請案的非天然存在的核酸或重組載體之實施例（例如，質體DNA或病毒載體）可含有特定組分，包括但不限於某些啟動子序列、強化子、或調節序列、內含子、AAV Rep及/或Cap之編碼序列、多腺苷酸化信號等以特定順序排列，所屬技術領域中具有通常知識者將理解，本文所揭示之概念可同等地應用於以其他順序排列的其他組分，該等其他組分可用於本申請案之核酸或載體中。本申請案設想以任何組合使用任何可應用組分，該組合具有可用於本申請案之核酸或載體中的任何序列，無論是否明確描述特定組合。
如本文中所使用，「載體(vector)」係用來載送遺傳物質至細胞中之核酸分子，在該細胞中可複製及/或表現該遺傳物質。可使用鑒於本揭露之所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何載體。載體之實例包括但不限於質體、病毒載體（噬菌體、動物病毒、及植物病毒）、黏接質體、及人工染色體（例如，YAC）。較佳地，載體係DNA質體。所屬技術領域中具有通常知識者可透過鑒於本揭露之標準重組技術建構本申請案之載體。
本申請案之載體可係表現載體。如本文中所使用，用語「表現載體(expression vector)」係指任何類型的遺傳建構體，該遺傳建構體包含編碼能夠被轉錄之RNA的核酸。表現載體包括（但不限於）用於重組蛋白表現之載體（諸如DNA質體或病毒載體）、及用於將核酸遞送進入對象體內以於該對象之組織中表現的載體（諸如DNA質體或病毒載體）。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，表現載體之設計可取決於諸如待轉化的宿主細胞之選擇、所欲之蛋白質表現位準等因素。
在本申請案之一些實施例中，載體係非病毒載體。非病毒載體之實例包括但不限於DNA質體、細菌人工染色體、酵母人工染色體、噬菌體等。較佳地，非病毒載體係DNA質體。「DNA質體(DNA plasmid)」，其與「DNA質體載體(DNA plasmid vector)」、「質體DNA (plasmid DNA)」或「質體DNA載體(plasmid DNA vector)」可互換使用，係指能夠在合適的宿主細胞中自主複製之雙股及大致上圓形的DNA序列。用於表現經編碼多核苷酸之DNA質體一般包含複製起點、多個選殖位點、及可選擇標記，其例如可係抗生素抗性基因。可使用之DNA質體的實例包括但不限於用於眾所周知的表現系統中之市售表現載體（包括原核系統及真核系統兩者），諸如pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.)，其可用於大腸桿菌中蛋白質的生產及/或表現；pYES2 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)，其可用於酵母的啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae )菌株中之生產及/或表現；MAXBAC® 完整桿狀病毒表現系統(Thermo Fisher Scientific)，其可用於在昆蟲細胞中生產及/或表現；pcDNA™或pcDNA3™ (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific)，其可用於哺乳動物細胞中高位準組成型蛋白質表現；及pVAX或pVAX-1 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific)，其可用於在大多數哺乳動物細胞中所關注之蛋白質的高位準瞬時表現。任何市售可得的DNA質體之主鏈可經修飾以最佳化該宿主細胞中的蛋白質表現，諸如反轉某些因子（例如，複製起點及/或抗生素抗性匣）之定向、置換質體之內源性啟動子（例如，抗生素抗性匣中的啟動子）、及/或藉由使用常規技術及輕易可得的起始材料來置換編碼轉錄蛋白之多核苷酸序列（例如，抗生素抗性基因之編碼序列）。（參見例如Sambrooket al ., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)）。
較佳地，DNA質體係適用於在哺乳動物宿主細胞中蛋白質表現的表現載體。適用於在哺乳動物宿主細胞中表現蛋白質的表現載體包括但不限於pUC、pcDNATM、pcDNA3TM、pVAX、pVAX-1、ADVAX、NTC8454等。例如，載體可基於pUC57，其含有pUC複製起點及安比西林抗性基因(SEQ ID NO:30)。其可進一步包含哺乳動物嘌呤黴素抗性基因匣，其係建構自疱疹病毒胸苷激酶基因啟動子(SEQ ID NO:26)、嘌呤黴素N-乙醯基轉移酶編碼區(SEQ ID NO:27)、及來自牛生長激素基因之多腺苷酸化信號(SEQ ID NO:28)。該載體亦可包含艾司坦-巴爾病毒(EBV) OriP複製起點片段(SEQ ID NO:29)，其代表EBV之「雙對稱(Dyad Symmetry)」區域及「重複家族(Family of Repeat)」區域之組合。
本申請案之載體亦可係病毒載體。通常，病毒載體係經基因工程改造的病毒，其攜帶經修飾病毒DNA或非傳染性但仍含有病毒啟動子及轉殖基因的RNA，因此允許轉殖基因轉譯通過病毒啟動子。因為病毒載體經常缺乏感染序列，所以其等需要輔助病毒或包裝線用於大規模轉染之包裝線。可使用的病毒載體之實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、痘病毒載體、腸病毒載體、委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan Equine Encephalitis)病毒載體、Semliki森林病毒載體、菸草鑲嵌病毒載體、慢病毒載體等。該載體亦可係非病毒載體。
較佳地，病毒載體係一種腺病毒載體，例如重組腺病毒載體。如本文中所使用，用語「重組腺病毒載體(recombinant adenovirus vector)」及「重組腺病毒載體(recombinant adenoviral vector)」可互換使用，且係指經基因工程改造的腺病毒，其經設計以將所關注之多核苷酸插入真核細胞，使得該多核苷酸隨後表現。可用作本發明之病毒載體的腺病毒之實例包括彼等具有或衍生自下列血清型者：Ad2、Ad5、Ad11、Ad12、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad40、Ad48、Ad49、Ad50、Ad52（例如，RhAd52）、及Pan9（亦稱為AdC68）；這些載體可衍生自例如人類、黑猩猩(chimpanzee)（例如ChAd1、ChAd3、ChAd7、ChAd8、ChAd21、ChAd22、ChAd23、ChAd24、ChAd25、ChAd26、ChAd27.1、ChAd28.1、ChAd29、ChAd30、ChAd31.1、ChAd32、ChAd33、ChAd34、ChAd35.1、ChAd36、ChAd37.2、ChAd39、ChAd40.1、ChAd41.1、ChAd42.1、ChAd43、ChAd44、ChAd45、ChAd46、ChAd48、ChAd49、ChAd49、ChAd50、ChAd67、或SA7P）、或恆河猴(rhesus)腺病毒（例如rhAd51、rhAd52、或rhAd53）。重組腺病毒載體可例如衍生自人類腺病毒（HAdV、或AdHu）、或猿猴(simian)腺病毒（諸如黑猩猩或大猩猩(gorilla)腺病毒（ChAd、AdCh、或SAdV）、或恆河猴腺病毒(rhAd)。
較佳地，腺病毒載體係重組人類腺病毒載體，例如重組人類腺病毒血清型5，或重組人類腺病毒血清型26、4、35、7、48等中之任一者。可用於本申請案之重組病毒載體可使用鑒於本揭露之所屬技術領域中已知的方法來製備。例如，鑒於基因密碼之簡併性，數個核酸序列可經設計以編碼相同多肽。編碼所關注蛋白質之多核苷酸可任選地經密碼子最佳化，以確保在該宿主細胞中之適當表現（例如，細菌細胞或哺乳動物細胞）。密碼子最佳化(codon-optimization)係所屬技術領域中廣泛應用的技術，且用於獲得密碼子最佳化之多核苷酸的方法係鑒於本揭露所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。
非天然存在的核酸分子或載體可包含一或多個表現匣。「表現匣(expression cassette)」係引導細胞機器以製造RNA及蛋白質的核酸分子或載體的一部分。表現匣可包含啟動子序列、開讀框、3'-未轉譯區(UTR)，其可選地包含多腺苷酸化信號。開讀框(open reading frame, ORF)係含有從開始密碼子至止擋密碼子之所關注蛋白質（例如，Rep、Cap、所關注重組酶或重組蛋白質）之編碼序列的讀框。將表現匣之調節因子可操作地連接至編碼所關注蛋白質之多核苷酸序列。
本申請案之非天然存在的核酸分子或載體可含有各種調節序列。如本文中所使用，用語「調節序列(regulating sequence)」係指任何允許、促成或調節核酸分子的功能性調節之序列，其包括複製、重複、轉錄、剪接、轉譯、穩定性及/或傳輸核酸或其衍生物之一者（亦即mRNA）進入宿主細胞或生物體。調節因子包括但不限於啟動子、強化子、多腺苷酸化信號、轉譯終止密碼子、核糖體結合因子、轉錄終止子、選擇標記、複製起點等。
非天然存在的核酸分子或載體可包含啟動子序列，較佳的是在表現匣內，以控制所關注蛋白質的表現。用語「啟動子(promoter)」係以其習知意義使用，且係指起始可操作地連接的核苷酸序列的轉錄之核苷酸序列。啟動子位於其轉錄之核苷酸序列附近的同一股上。啟動子可係組成型、誘導型、或阻遏型。啟動子可係天然存在或合成的。啟動子可衍生自包括病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲、及動物之來源。啟動子可係同源啟動子（亦即，衍生自與載體相同的遺傳來源）或異源啟動子（亦即，衍生自不同載體或遺傳來源）。例如，若待採用的載體係DNA質體，則該啟動子對於該質體可係內源性的（同源）或衍生自其他來源（異源）。較佳地，該啟動子係位於該多核苷酸上游，該多核苷酸在表現匣內編碼所關注蛋白質。
可使用之啟動子實例包括但不限於來自下列者之啟動子：猴病毒40 (SV40)、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、人類免疫缺乏病毒(HIV)啟動子（諸如牛免疫缺乏病毒(BIV)長末端重複(LTR)啟動子）、莫洛尼(Moloney)病毒啟動子、鳥白血病病毒(ALV)啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子（諸如該CMV即時早期啟動子(CMV-IE)）、艾司坦-巴爾病毒(EBV)啟動子、或勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子。啟動子亦可係來自人類基因（諸如人類肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅素、人類肌肉肌酸、或人類金屬硫蛋白）的啟動子。啟動子亦可係組織特異性啟動子，諸如天然或合成的肌肉或皮膚特異性啟動子。較佳地，啟動子係強的真核啟動子，諸如巨細胞病毒(CMV)啟動子(nt -672至+15)、EF1-α啟動子、疱疹病毒胸苷激酶基因啟動子(SEQ ID NO:26)等。
非天然存在的核酸分子或載體可包含穩定經表現轉錄本、增強RNA轉錄本的核輸出、及/或改善轉錄轉譯偶合的額外多核苷酸序列。此類序列之實例包括多腺苷酸化信號及強化子序列。多腺苷酸化信號一般位於編碼序列下游，以用於該載體之表現匣內的所關注蛋白質（例如，Rep、Cap、重組酶）。當由轉錄因子結合時，該等強化子序列係調節DNA序列，其強化相關基因的轉錄。強化子序列較佳地在啟動子序列下游且可在載體之表現匣內的編碼序列下游或上游。
可使用鑒於本揭露之所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何多腺苷酸化信號。例如，該多腺苷酸化信號可係SV40多腺苷酸化信號（例如，SEQ ID NO:60）、AAV2多腺苷酸化信號(bp 4411-4466, NC_001401.2)、來自單純皰疹病毒胸苷激酶基因(SEQ ID NO:23)、LTR多腺苷酸化信號、牛生長激素(bGH)多腺苷酸化信號、人類生長激素(hGH)多腺苷酸化信號、或人類β-球蛋白多腺苷酸化信號。較佳地，多腺苷酸化信號係牛生長激素(bGH)多腺苷酸化信號(SEQ ID NO:28)、具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號4411至4466之AAV2的多腺苷酸化信號、或SV40多腺苷酸化信號(SEQ ID NO:60)。
可使用鑒於本揭露之所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何一個強化子序列。例如，強化子序列可係人類肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅素、人類肌肉肌酸、或病毒強化子，諸如來自CMV、HA、RSV、或EBV之一者。特定增強子之實例包括但不限於：土撥鼠HBV轉錄後調節因子(WPRE)、衍生自人載脂蛋白A1前驅(ApoAI)之內含子/外顯子序列、人類T細胞白血病病毒第1型(HTLV-1)長末端重複(LTR)之未轉譯R-U5結構域、剪接增強子、合成兔β-球蛋白內含子、或其任何組合。
較佳地，強化子序列包含AAV之P5啟動子。該P5啟動子係該rep 基因之編碼序列內部的順式作用Rep依賴性因子(CARE)的一部分。當在順式中存在時，CARE顯示出增加複製及殼體化作用。在一些AAV生產細胞系中，CARE對染色體整合的rep 基因之擴增（如果不存在AAV ITR）亦係重要的。儘管不希望受到理論的束縛，但據信置於cap 編碼序列下游的P5啟動子可能充當增加Cap表現的強化子，從而使AAV產生，並且其亦提供增強子活性，用於擴增整合至染色體中的基因。
非天然存在的核酸分子或載體（諸如DNA質體）亦可包括細菌複製起點及抗生素抗性表現匣，用於在細菌細胞（例如大腸桿菌）中選擇及維持該質體。複製起點(origin of replication, ORI)係起始複製的序列，使得質體能夠再生並在細胞內存活。適用於本申請案之ORI之實例包括但不限於ColE1、pMB1、pUC、pSC101、R6K、及15A，較佳的是pUC。
用於在細菌細胞中選擇及維持之載體一般包括可操作地連接至抗生素抗性基因的啟動子序列。較佳地，可操作地連接至抗生素抗性基因的啟動子序列與可操作地連接至編碼所關注蛋白質之多核苷酸序列的啟動子序列不同。該抗生素抗性基因可經密碼子最佳化，且該抗生素抗性基因之序列組成通常經調節成細菌（例如，大腸桿菌）密碼子使用。可使用鑒於本揭露之所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何抗生素抗性基因，包括但不限於康黴素抗性基因(Kanr )、安比西林抗性基因(Ampr )、及四環黴素抗性基因(Tetr )，以及賦予對氯黴素、博萊黴素、大觀黴素(spectinomycin)、卡本西林(carbenicillin)等抗性的基因。
用於在哺乳動物細胞中選擇及維持之載體一般包括可操作地連接至編碼賦予可選擇標記之蛋白質的基因。較佳地，該基因進一步包含多腺苷酸化信號。例如，哺乳動物嘌呤黴素抗性基因匣可包含疱疹病毒胸苷激酶基因啟動子(SEQ ID NO:26)、嘌呤黴素N-乙醯基轉移酶編碼區(SEQ ID NO:27)、及來自牛生長激素基因之多腺苷酸化信號(SEQ ID NO:28)。
在人類細胞中重組AAV的製造需要AAV複製(rep )及殼體(cap )基因、腺病毒基因、及AAV-可包裝轉殖基因的表現，該轉殖基因由AAV反向末端重複(ITR)側接的表現匣組成。所有三種組分都可仰賴單獨的質體遞送至細胞以產生AAV，但是現有的轉染方法難以擴展成大規模培養。將一些該等因子摻入宿主細胞系中可使AAV生產更有效率，然而一些AAV及腺病毒基因係細胞生長抑制性或細胞毒性，因而限制了此方法。
本申請案描述非天然存在的核酸分子、載體、細胞、及使該AAVrep 基因可逆失活的方法，使得AAVrep 基因、AAVcap 基因及可包裝的轉殖基因可被維持及/或整合至合適的宿主細胞中並擴增。藉由表現重組酶之重組腺病毒感染這些細胞會重新活化該等rep 基因並誘導AAV複製及包裝。不同於由Xiao與同事所述的方法(Qiaoet al . (2002) J. Virol. 76: 13015-13027; Yuanet al . (2011) Hum. Gene Ther. 22:613-624)，其使用Cre（一種識別兩個相同loxP位點並催化連接及切除反應兩者的酪胺酸重組酶），本發明使用絲胺酸重組酶21 (SR21)（一種由本申請案之發明人新表徵之絲胺酸重組酶）。與Cre不同的是，SR21識別該等attP 及attB位點，其具有不同序列。在藉由SR21催化的連接反應之後，該等attP 及attB 位點重組及破壞，使得無額外重組的可能。因此，本申請案之方法可比由Cre催化更有效。本申請案之某些實施例包括額外的特徵，諸如在不同的人工內含子、強化子、絕緣子等中插入不同的止擋匣，其等進一步改善了先前技術之方法。本申請案之可逆失活/再活化系統允許在包裝細胞生長期間得以嚴密控制該AAVrep 基因，從而避免Rep蛋白對該宿主細胞的細胞生長抑制性/細胞毒性作用。在載體生產期間，其亦提供對該AAVrep 基因的強誘導作用及AAV載體的高產率。絲胺酸重組酶
由大絲胺酸重組酶家族之成員（諸如SR21）所催化的位點特異性重組不需要細胞機制即可進行同源重組。一般而言，其需要一種識別該等位點、斷裂、及連接該DNA的特異化重組酶。基於胺基酸序列同源性及機制相關性，大多數位點特異性重組酶分為兩個家族之一者：酪胺酸重組酶家族或絲胺酸重組酶家族。該等名稱源於保留的親核性胺基酸殘基，其用於在股交換期間攻擊DNA並與其變成共價連接。
絲胺酸重組酶結合並重組單獨的重組識別位點，稱為「附接位點」：attP ，「附接噬菌體」及attB ，「附接細菌」染色體。該等attP 及attB 位點係由圍繞中央二核苷酸重組交換位點的雙對稱組成。attP 及attB 位點的左右兩半部藉由鋅帶(ZD)及重組酶(RD)結構域與重組酶單體結合(Rutherfordet al . (2013) Nucleic Acids Res. 41:8341-8356)。
如以下實例中更詳細描述者，在本發明中在沙福芽孢桿菌菌株CCMA-560之基因體中新識別之絲胺酸重組酶，在本文中稱為「絲胺酸重組酶21」或「SR21」。在本發明中亦表徵由SR21識別的該等attP 及attB 位點。
在一個大致態樣中，本申請案係關於一種非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含編碼絲胺酸重組酶之核苷酸序列，該絲胺酸重組酶具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%、諸如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。較佳地，該非天然存在的核酸分子包含編碼絲胺酸重組酶的核苷酸序列，該絲胺酸重組酶具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列。在一個實施例中，該非天然存在的核酸分子包含與SEQ ID NO:3之核苷酸序列具有至少85%、諸如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。
在某些實施例中，本申請案係關於包含該非天然存在的核酸之載體。該載體可係表現載體，其在所關注之細胞（例如，細菌細胞或哺乳動物細胞）中表現該絲胺酸重組酶。在一個實施例中，該載體在CMV啟動子或本文所述或所屬技術領域中已知之任何其他合適的啟動子的控制下在哺乳動物細胞中表現該絲胺酸重組酶。在某些實施例中，該載體可進一步包括多腺苷酸化信號，諸如猴病毒40 (SV40)多腺苷酸化信號或本文所述或所屬技術領域中已知的任何其他合適的多腺苷酸化信號。
在一個實施例中，該載體係DNA質體，諸如具有SEQ ID NO:10之核苷酸序列的質體P175。
在另一實施例中，該載體係病毒載體，諸如重組腺病毒載體。
在一個實施例中，該載體係重組ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5 (Ad5)病毒，該病毒包含核苷酸序列，該核苷酸序列編碼具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%同一性、諸如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的絲胺酸重組酶，且該編碼序列係在哺乳動物細胞中有作用的啟動子的控制下。較佳地，該啟動子係CMV啟動子。更佳地，該重組Ad5載體以5'至3'的順序包含CMV啟動子，該CMV啟動子可操作地連接至編碼SEQ IDNO:2之胺基酸序列的核苷酸序列，該核苷酸序列係可操作地連接至SV40多腺苷酸化信號(NC_001669.1, nt 2550至2774)。在一個實施例中，該編碼SEQ ID NO:2之胺基酸序列的核苷酸序列係與SEQ ID NO:3相同，除了該細菌轉譯起始密碼子「TTG」係由「ATG」置換，並且引入三個點突變以破壞SEQ ID NO:3內的限制性核酸內切酶識別位點。這些限制性核酸內切酶識別位點係Xba I位點(TCTAGA)；Sac I位點(GAGCTC)；EcoRI位點(GAATTC)。
可使用鑒於本揭露之所屬技術領域中已知的任何方法製成編碼本申請案之絲胺酸酶的載體。
如以下實例中所更詳細描述者，本發明中識別用於本申請案之絲胺酸重組酶的attP 及attB 位點。在某些實施例中，本申請案之絲胺酸重組酶識別包含SEQ ID NO:7之核苷酸序列或其變體的attP 位點。在某些實施例中，本申請案之絲胺酸重組酶識別包含與SEQ ID NO:7至少90%、諸如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attP 位點。
在某些實施例中，本申請案之絲胺酸重組酶識別包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列或其變體的attB 位點。在某些實施例中，本申請案之絲胺酸重組酶識別包含與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少90%、諸如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attB 位點。
在一個實施例中，本申請案係關於一種在細胞中進行位點特異性重組的方法。該方法包含： 1)    獲得包含核酸分子的細胞，該核酸分子具有與SEQ ID NO:7至少90%同一的核苷酸序列的attP 位點及與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少90%同一的核苷酸序列的attB 位點； 2)    將非天然存在的核酸分子引入至該細胞中，該核酸分子編碼具有與SEQ ID NO:2至少85%同一性、諸如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的絲胺酸重組酶；及 3)    在使該絲胺酸重組酶催化在該等attP 與attB 位點之間該位點特異性重組的條件下生長該細胞。
在一較佳實施例中，本申請案係關於一種在細胞中進行位點特異性重組的方法。該方法包含： 1)    獲得包含核酸分子的細胞，該核酸分子具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點及SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點； 2)    將非天然存在的核酸分子引入至該細胞中，該核酸分子編碼具有SEQ ID NO:2之胺基酸的絲胺酸重組酶；及 3)    在使該絲胺酸重組酶催化在該等attP 與attB 位點之間該位點特異性重組的條件下生長該細胞。用於生產重組AAV 之建構體、細胞、及方法
如以下實例中所說明，本申請案之新識別的絲胺酸重組酶可用來改善重組AAV的生產。 經修飾AAV rep 基因建構體
在一個大致態樣中，本申請案係關於一種非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含經修飾腺相關病毒(AAV)rep 基因，該基因具有編碼四種Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52、及Rep40之AAVrep 基因及插入至由該等四種Rep蛋白共享之該rep 基因的編碼序列中的人工內含子。該人工內含子包含止擋匣，該止擋匣係插入在該人工內含子之5'剪接位點下游及分支位點上游，且該止擋匣以5'至3'的順序包含：(i)具有與SEQ ID No:7至少90%、諸如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attP 位點，(ii)剪接受體；(iii)終止子；及(iv)具有與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少90%、諸如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attB 位點。較佳地，該attP 位點具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列且該attB 位點具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列。
如本文中所使用，「內含子(intron)」係經廣泛地定義為可藉由RNA剪切而移除的核苷酸序列。「RNA剪接(RNA splicing)」意指從前驅mRNA切除內含子以形成成熟mRNA。本文中所使用之「人工內含子(artificial intron)」係指不是基因之天然發生的內含子但仍可藉由RNA剪接而移除的核苷酸序列。例如，「人工內含子(artificial intron)」可係具有經插入止擋匣之天然存在的內含子。
內含子（包括人工內含子）含有5'剪接位點或接合點(junction)、剪接受體或分支點、及3'剪接位點或剪接接合點(junction)。用語「5'剪接位點」或「5'剪接接合點」意指外顯子-內含子接合點的位置，其中該接合點係在基因或核酸片段之5'片段的3'端與該內含子之5'端之間，並且包括在RNA剪接所需的內含子之5'端處的共通序列。用語「剪接受體」或「分支點」係指核苷酸，通常係腺苷酸，位於距3'剪接位點大約20至50 bp處，其在RNA剪接期間的第一次酯交換反應期間幫助形成套索結構(lariat structure)。用語「3'剪接位點」或「3'剪接接合點」意指外顯子-內含子接合點的位置，其中該接合點係在基因或核酸片段之3'片段的5'端與該內含子之3'端之間，並且亦包括在RNA剪接所需的內含子之3'端處的共通序列。用語「共通序列(consensus sequence)」意指在RNA剪接所需的5'或3'剪接接合點中或與之相鄰的核苷酸；這些序列通常係不變的或高度保留的。
大量的mRNA的分析顯示某些核苷酸在典型的內含子及剪接接合點中係保留的。例如，內含子之幾乎不變的鹼基係5'-GU及3'-AG。這些5'及3'保留區兩側的某些鹼基通常以異常（非隨機）頻率出現。同樣保留的係分支點腺苷酸，通常距3'剪接位點20至50個鹼基。請參見例如Gaoet al (2008) Nucleic Acids Research 36: 2257-2267的圖4，其顯示在外顯子的情況下對於內含子的一般共識，Gaoet al (2008)之全部內容以引用方式併入本文中。然而，內含子的中央區域的長度可在40至50,000個鹼基之間，因此通常不需要進行剪接。內含子藉由剪接體作為套索狀結構從RNA或前驅mRNA移除。經由二個依序的酯交換反應來進行外顯子一起的剪接。
可藉由所屬技術領域中已知的任何方法來完成內含子插入經表現序列中。側接的外顯子環境以及實際使用的內含子序列在是否可有效剪接出新的「內含子」方面發揮作用。可藉由電腦模擬(in silico)製造複合序列並使用線上剪接預測程式來測試適用於本發明之內含子，以尋找對於有效的RNA剪接給出足夠高的得分之rep 基因序列與內含子序列的組合。鑒於本揭露，可測試及最佳化基因體或合成序列中的任一個內含子以用於本發明之建構體。
為了破壞Rep78、Rep68、Rep52、及Rep40之所有四種rep 開讀框的表現，較佳地將人工內含子插入至由該四種Rep蛋白共享之rep 基因的編碼序列。因此，在某些實施例中，為了破壞所有四種ORF，將人工內含子插入至AAV2 (NC_001401.2)的核苷酸996及至多1905之後或另一個AAVrep 基因中的對應位置。但是，為了使止擋匣在插入人工內含子中時起作用，較佳係將內含子插入該rep 基因中，並儘可能地在上游。
另外，該內含子插入位點上游及下游的外顯子環境對於定義什麼將作為可能的插入位點很重要，例如，在上述外顯子的情況下對於內含子的一般共識。在一個實施例中，該共通序列CAG^G（其中^標記該插入所在的位置）如下發生在AAV2中的rep 基因的相關區域中，其中數字表示插入之前AAV的最後一個核苷酸：1052、1061、1712、及1906。在另一實施例中，該共通序列AAG^G發生在AAV2的位置1022（如Qiao所使用的）、1112、1475、1514、1700、1742、及1784中。其他共通序列（諸如AAG^A）發生在例如AAV2的核苷酸1340處。鑒於本揭露，亦可在其他AAV的rep 基因中識別較佳的插入位點。
可用於本發明的人工內含子可衍生自任何來源，諸如來自基因體庫。如下所述，可藉由聚合酶連鎖反應(PCR)使用引子從人類DNA獲得內含子。能夠在細胞中進行RNA剪接的任何內含子皆可用於本發明之方法。在以下實例中，該內含子係人類β-肌動蛋白基因的內含子。
根據本申請案之實施例，除了經由人工內含子進行RNA剪接外，亦可經由插入該人工內含子的止擋匣進行DNA剪接來調節Rep蛋白的表現。該止擋卡匣包含由該等attP 及attB 位點側接之轉錄終止子，該等位點由絲胺酸重組酶特異性識別，諸如本發明中所特徵化者。在一個實施例中，該終止子包含一或多個多腺苷酸化信號。在另一實施例中，該終止子包含另一個用於有效轉錄終止的序列，諸如來自該多腺苷酸化信號下游人類β-球蛋白基因的序列，其編碼自切割RNA模體，較佳地具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列。其他終止子亦可用於本發明，諸如可裂解自身RNA的錘頭核酶(ribozyme)。請參見West (2008) Molecular Cell 29:600-610之使用其他核酶置換該β球蛋白因子，及Kharma (2016) Nucleic Acids Res. 44:e39之設計核酶的描述，兩者之內容以全文引用方式併入本文中。
在一個實施例中，該止擋匣進一步包含編碼可選擇標記之基因。在一個實施例中，該可選擇標記基因包含新黴素磷酸轉移酶表現匣(neo ) (SEQ ID NO:18)，其係由哺乳動物啟動子（例如，小鼠磷酸甘油酯激酶1）及細菌（例如，Lac zya）啟動子並接著多腺苷酸化信號（諸如來自SV40）所驅動。該基因分別在哺乳動物及細菌細胞中賦予對新黴素及康黴素的抗性。儘管不希望受到理論的束縛，但據信除了提供用於細胞系發育的可選擇標記外，可選擇標記基因可進一步阻斷該rep 基因的轉錄，從而增加含有該經修飾rep 基因之宿主細胞的穩定性。可用於本發明之其他可選擇標記基因包括但不限於抗生素選擇基因（嘌呤黴素、潮黴素、博萊黴素）、代謝基因（例如，麩醯胺酸合成酶或次黃嘌呤鳥嘌呤之磷酸核糖基轉移酶(HPRT)）、病毒標記（諸如mCherry）、酶（諸如β-半乳糖酶）、分泌的鹼性磷酸酶、或任何其他合適的標記基因。
在另一實施例中，該止擋匣包含剪接受體以預防該止擋匣從初級mRNA轉錄本中剪接出來。可使用任何天然存在的剪接受體位點或合成序列，前提是該剪接受體未被跳過。根據本申請案之實施例，該剪接受體含有符合該共通序列(yTnAynn)的分支點序列，其中y係C或T，且n係任何核苷酸、多嘧啶通道(4-24 nt)、「AG」二核苷酸、及20至80 bp之真核基因外顯子序列（或當置於內含子序列旁時充當外顯子之合成序列）。NetGene2剪接預測軟體應將該序列識別為剪接受體位點(www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/; Brunak, S., Engelbrecht, J., and Knudsen, S.: Prediction of Human mRNA Donor and Acceptor Sites from the DNA Sequence, Journal of Molecular Biology, 1991, 220, 49-65)置信得分為0.4或更好（或用類似的剪接預測軟體）；得分接近1.0更佳。在一個實施例中，該剪接受體包含來自小鼠HPRT基因之SEQ ID NO:17之核苷酸序列（NC_000086.7，核苷酸53001998至53002138），加上來自人類刺豚鼠(agouti)傳訊蛋白之29 nt區（NC_000020.11，核苷酸34262765至34262793）。
根據本申請案之實施例，該止擋匣係插入在該人工內含子之5'剪接供體位點下游及「分支位點」上游。可在兩個位點之間的任何位置插入該止擋匣，前提是該插入不會損壞該等位點的功能。在一個實施例中，該止擋匣係插入在該兩個位點中間。在以下實例中所述之一個例示性實施例中，該止擋匣係插入至人類β-肌動蛋白基因之內含子中，使得該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列且該3'內含子片段具有SEQ ID NO:15之核苷酸序列。
如本文所提供，在一些實施例中，該3'內含子片段可包括間隔序列而使得該REP/CAP基因太大以致於無法包裝在AAV中。例如，該AAV包裝限制係大約5.0 kb。因此，可根據本文提供之揭露內容產生使該REP/CAP基因大於大約5.0 kb的間隔序列。在一些實施例中，該間隔序列係插入在該3'內含子片段中的2 kb隨機間隔子。因此，在以下實例中所述之例示性實施例中，該止擋匣係插入至人類β-肌動蛋白基因之內含子中，使得該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列且該3'內含子片段具有SEQ ID NO:66之核苷酸序列。然而，應理解的是該間隔序列不需要是2 kb，且可係導致REP/CAP基因大於大約5.0 kb的任何長度。
任何AAVrep 基因可包括在本發明之經修飾rep 基因中。例如，該AAVrep 基因可包含AAV1至AAV8中之一者之rep 基因、或其混合。該AAVrep 基因之序列可得自例如GenBank，對於各種AAV基因體具有下列之GenBank存取號：AAV1，GenBank存取號NC_002077.1；AAV2，GenBank存取號NC_001401.2；AAV3，GenBank存取號NC_001729.1；AAV4，GenBank存取號NC_001829.1；AAV5，GenBank存取號NC_006152.1；AAV6，GenBank存取號AF028704.1；AAV7，GenBank存取號NC_006260.1；及AAV8，GenBank存取號NC_006261.1。
在以下實例中，使用具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號190至2202的人類AAV2之rep 基因。
在一些實施例中，可對該rep 基因中之隱蔽性剪接位點進行修飾以移除此位點處之剪接。例如，可進行對DNA序列的同義突變，其中該DNA序列係經突變的，但該突變不改變經編碼的胺基酸。 具有經修飾AAV rep 基因及AAV cap 基因之建構體
在另一大致態樣中，本申請案係關於非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含本申請案之經修飾AAVrep 基因及AAVcap 基因、或其混合。較佳地，該AAVcap 基因係該經修飾AAVrep 基因的下游。
在一個實施例中，該AAVcap 基因進一步包含可操作地連接至該基因之編碼序列的多腺苷酸化信號。在以下實例中所述之例示性實施例中，在該AAV9cap 編碼序列下游包括AAV2多腺苷酸化信號(bp 4411-4466, NC_001401.2)。
在另一實施例中，該AAVcap 基因進一步包含強化子。在以下實例中，該AAV2多腺苷酸化信號下游包括AAV2rep P5啟動子(bp 190-313, NC_001401.2)。
在某些實施例中，該AAVcap 基因編碼該等殼體蛋白VP1、VP2、及VP3之全部三者。
在其他實施例中，該AAVcap 基因編碼該等殼體蛋白之小於三者。例如，據報導AAV血清型1至5可成功包裝、複製、及轉導沒有VP2的細胞(Griegeret al ., J Virol. 2005年八月；79(15): 9933-9944)。因此，在一個實施例中，AAVcap 基因編碼AAV1至AAV5中任一者之VP1及VP3（但不編碼VP2）、或其混合。
任何AAVcap 基因皆可用於本發明中。例如，AAVcap 基因可係AAV1至AAV8、AAV9、AAVDJ中之一者之cap 基因、或其混合。在一個實施例中，該cap 基因係AAV9變體。該AAVcap 基因的序列可得自例如，GenBank。請參見上述對於AAV1至AAV8基因體之GenBank存取號。該AAV9基因體具有GenBank存取號No. AY530579.1，且該AAVDJ具有GenBank蛋白質存取號3J1Q_A。
在一個實施例中，於以下實例中所述，使用具有GenBank存取號AY530579.1之核苷酸序列的人類AAV9之cap 開讀框。 具有經修飾AAV rep 基因、AAV cap 基因、及轉殖基因之建構體
在另一大致態樣中，本申請案係關於非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含本申請案之經修飾AAVrep 基因、AAVcap 基因、及由AAV反向末端重複(ITR)側接之轉殖基因。
ITR係AAV之生物學中重要的順式-活性序列。ITR的關鍵角色係在AAV DNA複製。除了在AAV複製中的作用以外，ITR對於AAV基因體包裝、轉錄、非許可條件下之負調節、及位點特異性整合亦係重要的。
在一個實施例中，130 bp ITR包含SEQ ID NO:20之核苷酸序列，其衍生自3' AAV2 ITR（核苷酸4535-4664，NC_001401.2）用來側接該轉殖基因。在另一實施例中，使用較短的經突變ITR。例如，對於較短的基因，ITR突變為較短的基因，並且該基因可折疊成雙股形式以增加表現並在感染後加速表現。請參見McCarty 2008 Mol Ther. 2008; 16(10):1648-56。
在另一實施例中，該轉殖基因包含促進劑，較佳的是哺乳動物細胞中之啟動子功能。在以下所述之實例中，人類EF1-α啟動子（包括外顯子1、內含子1、及內含子2之部分）(SEQ ID NO:21)係包括在該轉殖基因中。
在另一實施例中，該轉殖基因包含多腺苷酸化信號。在以下所述之實例中，來自單純皰疹病毒胸苷激酶基因(SEQ ID NO:23)之多腺苷酸化信號係包括在該轉殖基因中。
在又一實施例中，非天然存在的核酸分子包含一對側接經修飾AAVrep 基因、AAVcap 基因、及經ITR側接的轉殖基因之絕緣子。在另一實施例中，非天然存在的核酸分子包含經修飾AAVrep 基因上游之單一絕緣子、AAVcap 基因、及ITR側接的轉殖基因。在一個實施例中，該絕緣子包含阻斷基因表現之染色質相關阻遏的基因體因子(Kwakset al . (2003) Nature Biotechnology 21: 554-558; Kwakset al . (2003) Nature Biotechnology 21: 822)。
可在本發明中使用任何合適的絕緣子，諸如本文中所述者。在一個實施例中，該絕緣子係具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列的人類抗抑制因子40。在另一實施例中，該絕緣子係具有SEQ ID NO:25之核苷酸序列的小鼠抗抑制因子40。在另一實施例中，在另一實施例中，該絕緣子係具有GenBank存取號AY190749.1之核苷酸序列的抗抑制因子04。在另一實施例中，該絕緣子係具有GenBank存取號AY190750.1之核苷酸序列的抗抑制因子06。在另一實施例中，該絕緣子係具有GenBank存取號AY190751.1之核苷酸序列的抗抑制因子07。在另一實施例中，該絕緣子係具有GenBank存取號AY190752.1之核苷酸序列的抗抑制因子12。在另一實施例中，該絕緣子係具有GenBank存取號AY190753.1之核苷酸序列的抗抑制因子13。在另一實施例中，該絕緣子係具有GenBank存取號AY190754.1之核苷酸序列的抗抑制因子35。在另一實施例中，該絕緣子係具有GenBank存取號AY190755.1之核苷酸序列的抗抑制因子36。在另一實施例中，該絕緣子係具有GenBank存取號AY190757.1之核苷酸序列的抗抑制因子52。在另一實施例中，該絕緣子係具有GenBank存取號AY190758.1之核苷酸序列的抗抑制因子53。在另一實施例中，該絕緣子係來自在二或更多個拷貝中具有AY040835.1之核苷酸序列的球蛋白基因座之雞HS4絕緣子。
包含一對絕緣子之非天然存在的核酸分子可具有與所關注基因片段相同或不同的一對側接絕緣子。較佳地，不同的絕緣子係用來作為一對側接於所關注的基因片段。在以下實例所述之一個例示性實施例中，人類抗抑制因子40 (AY190756.1, SEQ ID NO:24)及小鼠抗抑制因子40 (SEQ ID NO:25)係用作為該等絕緣子。在以下實例所述之另一例示性實施例中，人類抗抑制因子40 (AY190756.1, SEQ ID NO:24)係用作該絕緣體。
如本文所提供，本揭露之建構體亦可包括在該AAV轉殖基因兩側上的間隔序列，以降低錯誤包裝其他載體組分的風險。在一個實施例中，該非天然存在的核酸分子分別包含該轉殖基因上游及下游的第一及第二間隔序列。在某些實施例中，該等間隔序列係2 kb間隔序列。在一具體實施例中，該非天然存在的核酸分子包含該經修飾AAV rep基因上游之該第一絕緣子，並且進一步分別包含該轉殖基因上游及下游的第一及第二間隔序列，其中該第一絕緣子及該第二間隔序列係獨立地選自由下列所組成之群組：(a) SEQ ID NO:67之核苷酸序列；及(b) SEQ ID NO:68之核苷酸序列。 用於生產重組AAV 的細胞及方法
來自本申請案之經修飾AAVrep 基因的該Rep蛋白的表現受到DNA剪接及RNA剪接機制兩者的嚴格控制，並因此使含有該經修飾rep 基因的穩定宿主細胞得以在生物反應器中產生並生長至高編號。對於AAV生產，首先將含有經修飾AAVrep 基因、AAVcap 基因、及由ITR側接之轉殖基因的穩定宿主細胞生長至高編號，接著用在經修飾AAVrep 基因中識別該等attP 及attB 位點的絲胺酸重組酶之複製缺陷型腺病毒轉染。藉由該絲胺酸重組酶所催化之在該等attP 與attB 位點之間的位點特異性重組將該止擋匣剪接出來，導致產生包含由功能性內含子分開之5'及3'rep 編碼序列兩者的前驅mRNA。然後藉由普遍存在的細胞機器（剪接體）切除內含子，產生編碼四種Rep蛋白的mRNA，從而以高滴度生產AVV。
可藉由將細胞以編碼該等基因之一或多個核酸分子的細胞轉導來獲得含有經修飾AAVrep 基因、AAVcap 基因、及由ITR側接之轉殖基因的穩定宿主細胞。在一個實施例中，藉由將細胞以編碼經修飾AAVrep 基因及AAVcap 基因之第一核酸分子轉導以獲得包含該經修飾AAVrep 基因及AAVcap 基因的第一宿主細胞，並且進一步將該第一宿主細胞以編碼由ITR側接之轉殖基因的第二核酸分子轉導來獲得穩定宿主細胞。在一個實施例中，該經修飾AAVrep 基因及該AAVcap 基因係穩定地整合至該第一宿主細胞之染色體中。在另一實施例中，該經修飾AAVrep 基因及該AAVcap 基因在該第一宿主細胞中維持游離型。由ITR側接之轉殖基因亦可穩定地整合至宿主細胞中或維持游離型(episomal)。
在另一實施例中，藉由將細胞以編碼經修飾AAVrep 基因、AAVcap 基因、及由ITR側接之轉殖基因的核酸分子轉導來獲得穩定宿主細胞。該經修飾AAVrep 基因、該AAVcap 基因及由ITR側接之轉殖基因可穩定地整合至宿主細胞中或維持游離型。
穩定宿主細胞可在表現絲胺酸酶之腺病毒被感染之前，使該穩定宿主細胞生長至高細胞密度。
使用鑒於本揭露之所屬技術領域中已知的任何方法，將表現本申請案之絲胺酸重組酶的複製缺陷型腺病毒引入至穩定的宿主細胞中。在一個實施例中，該複製缺陷型腺病毒係包含重組ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5 (Ad5)病毒，該病毒包含核苷酸序列，該核苷酸序列編碼與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%同一、較佳的是與SEQ ID NO:2 100%同一的胺基酸序列。例如，該腺病毒可包含與SEQ ID NO:3至少85%同一的核苷酸序列，較佳的是與SEQ ID NO:3至少95%同一。
如本文所揭示，本揭露亦包括用於增加AAV生產的方法及組成物，其藉由使本文所述之細胞與2-胺基嘌呤(2-AP)接觸。在該腺病毒生命週期的晚期階段，該病毒會抑制宿主蛋白質合成。這部分係由於晚期腺病毒100千道耳頓(kDa)蛋白的作用所致，該蛋白將Mnk1激酶從該cap-起始錯合物eIF4F中置換出來，導致eIF4E的去磷酸化並抑制cap-依賴性mRNA的轉譯（參見例如，Cuesta (2004), J. Virology 78: 7707-7716）。腺病毒晚期基因轉錄物在其5'末端包含一個三方前導序列，該序列藉由所謂的核醣體分流(shunting)機制啟動轉譯（參見例如，Yueh (2000) Genes Dev 14: 414-421）。在AAV生產細胞系的環境下，預期cap依賴性轉譯的抑制會阻斷AAV REP及CAP基因以及AAV複製及包裝所需的早期腺病毒蛋白的表達。因此，在一些實施例中，使用腺病毒誘導劑，用阻斷宿主蛋白質轉譯關閉的化學物質培養細胞，以提高AAV生產細胞系的效率。
在某些實施例中，該阻斷宿主蛋白質轉譯關閉的化學品係2-胺基嘌呤(2-AP)。已顯示2-AP阻斷由腺病毒誘導之宿主蛋白質合成的關閉（參見例如，Zhang and Schneider (1994) J. Virology 68: 2544-2555; Huang and Schneider (1990) PNAS 87: 7115-7119）。用2-AP處理生產AAV的細胞能夠減少感染的細胞病變作用，包括恢復通常被晚期感染所降解的細胞角蛋白網絡(Zhang and Schneider (1994) J. Virology 68: 2544-2555)。2-AP在體外抑制許多激酶，包括RNA依賴性蛋白激酶PKR（亦稱為真核轉譯起始因子2α激酶2，EIF2AK2）(DeBenedetti (1983) J Biol Che, 258: 14556-14562)，但無法阻斷腺病毒感染後發生的細胞中之PKR活化及eIF-2α的磷酸化(Huang and Schneider (1990) PNAS 87: 7115-7119)。2-AP確實將早期腺病毒DNA-結合蛋白(DBP)位準提高了10至20倍，而mRNA位準卻沒有提高(Huang and Schneider (1990) PNAS 87: 7115-7119)，與對cap依賴性轉譯的影響一致。
因此，在一些實施例中，生產包含轉殖基因之重組AAV的方法包括用2-胺基嘌呤培養本揭露之細胞。在一些實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係小於約10 mM。在一些實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係小於約5 mM。在一些實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係小於約2.25 mM。在一些實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係小於約1.25 mM。在一些實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係約1 µM至約1.25 mM。在一些實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係約10 µM至約1.25 mM。在一些實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係約100 µM至約1.25 mM。在一些實施例中，該2-胺基嘌呤濃度係約1.25 mM。
在具體實施例中，本揭露之細胞係在用重組腺病毒感染後約24小時與2-胺基嘌呤接觸。在一些實施例中，本揭露之細胞係在用重組腺病毒感染後約20小時與2-胺基嘌呤接觸。在一些實施例中，本揭露之細胞係在用重組腺病毒感染後約12小時與2-胺基嘌呤接觸。在一些實施例中，本揭露之細胞係在用重組腺病毒感染後約30小時與2-胺基嘌呤接觸。在一些實施例中，本揭露之細胞係在用重組腺病毒感染後約36小時與2-胺基嘌呤接觸。在一些實施例中，本揭露之細胞係在用重組腺病毒感染後約48小時與2-胺基嘌呤接觸。 實例
本申請案的下列實例是要進一步說明本申請案的本質。所屬技術領域中具有通常知識者將領會的是，能夠對以上所述的實施例進行變更而不違背其廣義的發明概念。因此，應了解本發明並未受限於揭示之具體實施例，而是意欲涵蓋如本實施方式所定義之屬於本發明之精神及範疇內的修改。材料
細胞：HEK293細胞（American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA，目錄號CRL-1573）；PEAK-rapid（ATCC, Manassas, VA，目錄號CRL2828）。
組織培養基及試劑：OptiMEM培養基（Thermo-fisher, Waltham, MA；目錄號31985-062）；DMEM，高葡萄糖（Thermo-fisher，目錄號10569-010）；DMEM，無酚紅（Thermo-fisher；目錄號A14430-01）；Hyclone透析胎牛血清（Thermo-fisher；目錄號SH30079.03）；96孔TC盤（Corning, Corning NY；目錄號3596）；6孔組織培養盤，清透（Corning，目錄號3516）；培養盤96，不透明白色（PerkinElmer, Waltham, MA；目錄號6005680）；TrypLE選擇細胞解離試劑（Thermo-fisher，目錄號12563-011）；達爾伯克(Dulbecco's)磷酸鹽緩衝鹽水，無鈣，無鎂，D-PBS（Thermo-fisher，目錄號14190-144）；遺傳黴素(Geneticin)(G418) 50 mg/ml（Thermo-fisher，目錄號10131-027）；來自白黑鏈黴菌(Streptomyces alboniger)之嘌呤黴素二鹽酸鹽(Sigma Aldrich P9620)；T150組織培養瓶150 mm2（Corning，目錄號CLS430825）；GlutaMax 100x（Thermo-fisher，目錄號35050-061）；經非組織培養處理之6孔培養盤（Corning，目錄號351146）；Hyperflask M容器（Corning，目錄號10030）；2.5% ClonaCell甲基纖維素於DMEM中（沒有麩醯胺酸且含有葡萄糖、丙酮酸鈉、及碳酸氫鈉）（StemCell Technologies, Vancouver, British Columbia, Canada目錄號03899-DI）。
轉染試劑：Fugene-HD轉染試劑（Promega, Madison WI，目錄號E2311）；脂染胺3000轉染試劑（Thermo-fisher目錄號L3000008）；去氧核苷酸（Millipore-Sigma, St. Louis, MO，目錄號D7295-2ML）。
試管：15 ml錐形管（Corning，目錄號430053）；1.5 ml螺桿蓋試管（Sarstedt AG & Co. KG, Germany，目錄號72.692.005）。
純化套組及分析試劑：質體自旋小量製備套組（Qiagen, Hilden, Germany，目錄號27106）；CHROMA SPIN™+TE-1000管柱（Takara Bio USA, Mountainview CA，目錄號636079）；Dual-Glo螢光素酶分析系統（Promega, Madison WI，目錄號E2940）；銀染色套組（Thermo-fisher目錄號24600）；具有Phase-maker tube的Trizol Plus RNA純化套組（Thermo-fisher Catalog Number目錄號A33254）；不含DNA的套組（Thermo-fisher目錄號AM1906）；Nucleospin凝膠及PCR清除套組（Takara Bio USA，目錄號740609.5）。
酶：SSpe I-HF（New England Biolabs, Ipswich, MA，目錄號R3133S）；來自牛胰臟的DNAse I grade II（Sigma-Aldrich，目錄號10104159001）；NEXT Ultra II Q5 Master Mix（New England Biolabs，目錄號M05445S）。
緩衝液及化學藥品：CutSmart®緩衝液（1X緩衝液組分：50 mM的乙酸鉀、20 mM Tris-乙酸酯、10 mM的乙酸鎂、100 µg/ml BSA、pH 7.9@25℃）（New England Biolabs，目錄號B7204S）；Benzonase核酸酶（Sigma-Aldrich，目錄號E1014-25K）；含有1.5 mM MgCl2之10x GeneAmp PCR緩衝液I（Thermo-fisher目錄號N8080006）；去氧膽酸鈉（Sigma-Aldrich，目錄號D6750-25g）；1M TRIS-HCL PH8.5（Thermo-fisher，目錄號T1085）；10x GeneAmp PCR緩衝液I（Thermo-Fisher目錄號N8080006）[100 mM Tris-HCl, pH 8.3（在25℃下）；500 mM KCl; 15 mM MgCl2; 0.01%明膠於高壓滅菌、去離子、經超過濾水]中；10% Pluronic F-68（Thermo-Fisher目錄號24040-032）；剪切鮭魚精子DNA (10 mg/ml)（Thermo-Fisher目錄號AM9680）；病毒稀釋緩衝液(VDB) [1x GeneAmp PCR緩衝液I、2 µg/ml的剪切鮭魚精子DNA、及0.05% Pluronic F-68）；β-巰基乙醇（Sigma-Aldrich，目錄號M3148）；腺病毒配方緩衝液（10 mM Tris (pH 7.4)、1 mM MgCl2、75 mM NaCl、5%蔗糖、0.02%聚山梨醇酯80、0.1 mM EDTA、10 mM組胺酸、0.5% EtOH）；2-胺基嘌呤，硝酸鹽（Sigma-Aldrich，目錄號A2380），於DMEM+ 2% FBS中溶解至100 mM。
RT-PCR試劑：SuperScript III第一股合成系統（Thermo-fisher目錄號188080-051）；Q5熱啟動高保真度2X Master Mix（New England Biolabs，目錄號M0494S）；具有溴化乙錠之1% TAE Mini ReadyAgarose Gel（Bio-RAD，目錄號1613016）；Dark Reader藍光透照器（Clare Chemicals, Dolores, CO，目錄號DR46B）
數位液滴PCR：探針用2X SuperMix（Bio-Rad目錄號186-3026）；DG32 AutoDG卡匣（Bio-Rad目錄號1864108）；自動液滴產生器油於PBS中（Bio-Rad目錄號1864110）；液滴讀取器油（Bio-Rad目錄號1863004）；Eppendorf twin.tec 96孔PCR盤（目錄號951020346）；自動化液滴產生器（Bio-Rad目錄號186-4101）；QX200液滴讀取器（Bio-Rad目錄號186-4003）；具有深孔反應模組之C1000Touch熱循環儀（Bio-Rad，目錄號185-1197）。
PrimeTime qPCR分析物：這些分析物的20x存料由正向及反向PCR引子（在18 µM下）及含有螢光淬滅劑ZEN及Black Hole Quencher 1 (3IABkFQ)及FAM或HEX螢光報導子染料（在5 µM下）的5'核酸酶探針所組成。分析物係由Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville IA合成。用於qPCR分析物之引子及探針序列如下： mCherry：引子1 (SEQ ID NO:36, 5'-CTGTTCCACGATGGTGTAGTC-3')；引子2 (SEQ ID NO:37, 5'-TGAGGTCAAGACCACCTACA-3')；探針(SEQ ID NO:38, 5'-FAM-TTGGACATC-ZEN-ACCTCCCACAACGAG-3IABkFQ-3')； 腺病毒外顯子2 (Ad5E2)：引子1 (SEQ ID NO:39, 5'-GGGTGATGCAGTAGAAGGTAAG-3')；引子2 (SEQ ID NO:40, 5'-ATGAAGTTCGGCGGAGATG-3')；探針(SEQ ID NO:41, 5'-HEX-TC TTGTTCC-Zen-CAGCGGTCCCATC-3IABkFQ-3')； P5（AAV之P5啟動子區域）：引子1 (SEQ ID NO:42, 5'-GTGGTCACGCTGGGTATTTA-3')；引子2 (SEQ ID NO:43, 5'-GGGACCTTAATCACAATCTCGT-3')；探針(SEQ ID NO:44, 5'-FAM-TTTGAAGCG-ZEN-GGAGGTTTGAACGC-31ABkFQ-3')； AAV REP基因：引子1 (SEQ ID NO:45, 5'-GTCCGTGAGTGAAGCAGATATT-3')；引子2 (SEQ ID NO:46, 5'-TTCGATCAACTACGCAGACAG-3')；探針(SEQ ID NO:47, 5'-FAM-TCTGATGCT-ZEN-GTTTCCCTGCAGACA-3IABkFQ-3')； AAV9 CAP基因：引子1 (SEQ ID NO:48, 5'-CCGGGTCCAAGGTATTTGTAA-3')；引子2 (SEQ ID NO:49, 5'-CTCAACCCAAGGCAAATCAAC-3')；探針(SEQ ID NO:50, 5'-FAM-ACATCAAGA-ZEN-CAACGCTCGAGGTCT-3IABkFQ-3')；及 β內醯胺酶（安比西林抗性）基因：引子1 (SEQ ID NO:51, 5'-CCAGAAACGCTGGTGAAAGTA-3')；引子2 (SEQ ID NO:52, 5'-CTCAAGGATCTTACCGCTGTTG-3')；探針(SEQ ID NO:53, 5'-FAM-TGCACGAGT-ZEN-GGGTTACATCGAACT-3IABkFQ-3')。
PAGE電解質：4x NuPAGE LDS樣本緩衝液（Thermo-Fisher，目錄號NP0007）；4-12% Bis-Tris PAGE凝膠於1x MOPS運行緩衝液中（Thermo-Fisher，目錄號NP0322PK2）；20x NuPAGE MOPS SDS運行緩衝液（Thermo-Fisher，目錄號NP0001）。
AAV純化緩衝液及供應商：0.2 µm PES的膜過濾器（Thermo-Fisher目錄號567-0020）；0.5 × 5 cm POROS GoPure層析管柱，用POROS CaptureSelect AAVX樹脂預填充（Thermo-fisher目錄號A36652）；Amicon 15 100kDa MWCO過濾器（Millipore-Sigma目錄號UFC910024）；CIM QA Disk 0.34 ml體積(BIA Separations, Slovenia)；緩衝液A (20 mM Tris pH7.5, 400 mM NaCl)；緩衝液B（25 mM Tris pH7.5，40 mM NaCl，及1.5 mM MgCl2）；緩衝液C（20 mM檸檬酸鈉pH 2.5，400 mM NaCl）；緩衝液D（100 mM檸檬酸鈉，10 mM Tris，pH 8.0）；緩衝液E (20 mM BTP pH10.0, 0.001% Pluronic F68, 10 mM NaCl)；緩衝液F（20 mM Bis-TRIS丙烷pH 10.0，0.001% Pluronic F68，400 mM NaCl）；Bis-TRIS丙烷(BTP)（Millipore Sigma目錄號B4679）。
其他設備：AKTA Explorer FPLC系統(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)；AKTA純化系統(GE Healthcare Life Sciences)；Envision多標記讀取器型號2104 (PerkinElmer, Waltham, MA)。SR21 重組酶之識別及重組表現
用SPBeta c2整合酶蛋白(Query, SEQ ID NO:1)作為查詢，在NCBI之非冗餘蛋白資料庫進行BLAST搜索，在沙福芽孢桿菌菌株CCMA-560中鑑定出推定絲胺酸重組酶(Sbjct, SEQ ID NO:2)在蛋白質位準處具有64%序列同一性（圖1）。該推定絲胺酸重組酶或整合酶係推定原噬菌體插入的一部分。將此重組酶命名為SR21（絲胺酸重組酶(Serine Recombinase) 21）。編碼SR21之DNA序列係顯示於SEQ ID No:3。
藉由使用來自重組酶編碼區的3'端之CCMA-560 DNA序列作為查詢(SEQ ID NO:58)，在NCBI之序列數據庫進行BLAST搜索，識別出與CCMA-560密切相關且不含有該原噬菌體插入（該「Fairview」菌株）之細菌菌株（圖2）。對應於CCMA-560中之推定原噬菌體插入位點上游及下游序列之Fairview菌株的DNA序列，在本文中稱為「插入前序列(pre-insertion sequence)」，且係顯示於SEQ ID NO:4。使用此序列(SEQ ID NO:4)作為對BLAST的查詢，CCMA-560菌株的基因體序列識別了其他噬菌體-宿主DNA接合點94 kb上游。沙福芽孢桿菌菌株CCMA-560之右及左原噬菌體-宿主DNA接合點的序列分別顯示於SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6中。
藉由交換中央相同區域(「ACTGACAAAGCGGT)」) (SEQ ID NO:54)上游的序列，分別從該宿主DNA接合點(SEQ ID NO:5)及(SEQ ID NO:6)重構SR21重組酶attP 及attB 序列，並選擇最大化該雙對稱之該中央二核苷酸及att 位點邊界：attP (SEQ ID NO:7)；attB-CCMA-560 (SEQ ID NO:8)。衍生自沙福芽孢桿菌之Fairview菌株的宿主DNA接合點(SEQ ID NO:4)之attB 序列(SEQ ID NO:9)含有相對於來自菌株CCMA-560 (SEQ ID NO:8)之經重構attB 序列的兩個失配。圖3顯示attP 與這兩個交替的attB 序列比對，突顯雙對稱的位置。測量哺乳動物細胞中的重組酶活性
藉由基因合成(GENEWIZ, Plainfield, NJ)建構載體(P175) (SEQ ID NO:10)，以在CMV啟動子的控制下在哺乳動物細胞中表現SR21重組酶，接著是SV40多腺苷酸化信號。該SR21重組酶開讀框係與SEQ ID NO:3相同，除了該細菌轉譯起始密碼子「TTG」係由「ATG」置換，並且引入三個點突變以破壞限制性核酸內切酶識別位點。該開讀框中之此等變化不會導致經編碼SR21重組酶胺基酸序列的任何變化。
亦藉由基因合成建構重組酶報導子質體(P41) (GENEWIZ, Plainfield, NJ)（SEQ ID NO:11；圖4）。其編碼由EF1α啟動子所驅動的組成性表現之綠色螢光蛋白(GFP)-自切割F2A-海腎螢光素酶(rLUC)融合蛋白。其亦以相對於該CMV啟動子之反義定向編碼由SR21attP (SEQ ID NO:7)及attB (SEQ ID NO:9)信號側接之經重組酶活化-mCherry-自切割P2A-螢火蟲螢光素酶(fLUC)報導基因。當SR21重組酶重組該等attP 及attB 信號時，該編碼區經反轉成正義定向，並且表現該mCherry-P2A-fLUC蛋白（請參見圖4）。
為了測量人類細胞中之SR21重組酶活性，將75,000個HEK293細胞接種至100 µl高葡萄糖DMEM + 10%胎牛血清的96孔組織培養盤的各孔中。如表1所示，將該重組酶報導子質體(P041) ±該SR21重組酶表現質體(P175) +去氧核苷酸（以標準化DNA量）與Fugene-HD轉染試劑於OptiMEM培養基中在室溫下複合15分鐘，並一式三份轉染至所接種細胞的孔中。將盤在37℃下培養48小時。 [表1]轉染條件
樣本 P41重組酶報導子 P175重組酶表現質體 去氧核苷酸 Fugene-HD OptiMEM
1 4 µl (100 ng) 無 12 µl (300 ng) 1.2 µl 22.8 µl
2 4 µl (100 ng) 4 µl (100 ng) 8 µl (200 ng) 1.2 µl 22.8 µl
使用來自Promega的Dual Glo分析套組，依序在轉染孔中分析螢火蟲螢光素酶(fLUC)及海腎螢光素酶(rLUC)。將培養基從該組織培養盤的轉染孔中移除，並添加100 µl之DMEM培養基（無酚紅）與Dual Glo螢光素酶+ fLUC基質的1:1混合物。將盤在室溫下培養10分鐘。將溶解產物轉移至不透明的白色96孔中。使用Envision多標記讀取器測量fLUC活性。接下來，每孔添加50 µl的Stop-and-Glo緩衝液+海腎基質，並將該盤以溫和振盪培養10分鐘。在相同Envision讀取器上讀取該海腎螢光素酶信號。
結果：當與該重組酶表現質體共轉染時，該重組酶報導子產生的螢火蟲螢光素酶比與去氧核苷酸共轉染時產生的螢火蟲螢光素酶多1535倍（表2）。此差異不能藉由不同的轉染效率來解釋，因為在單獨的報導子轉染中海腎螢光素酶(rLUC)活性高5倍。此數據證實SR21重組酶在人類細胞中係高度活性的，並且該結果代表三個獨立的實驗。 [表2]在HEK293細胞中的重組酶活性
樣本 說明 fLUC rLUC fLUC活性增加倍數
1 僅報導子 4.3E03 ± 1.2E03 1.4E07 ± 2.6E06   
2 報導子+重組酶 6.6E06 ± 3.9E05 3.4E06 ± 1.6E05 1535
建構REP/CAP + 轉殖基因質體
若該AAV複製(REP)及殼體(CAP)基因可穩定地整合，則哺乳動物細胞中之AAV的大規模生產可係可能的，且之後經誘導以在高密度培養物中生產AAV。然而，REP蛋白的表現係毒性的，使其難以在表現REP基因的宿主中培養穩定的細胞系，諸如表現該等腺病毒E1基因（諸如HEK293細胞）者。野生型AAV編碼四種具有重疊讀框的REP蛋白，這是由於使用兩種啟動子及交替剪接所致。因此，使用誘導性啟動子來控制REP表現並不容易。先前的工作證實，在人工內含子內部的REP編碼區插入「止擋匣」，可在HEK293細胞中產生穩定細胞系(Qiaoet al . (2002) J. Virol. 76: 13015; Yuanet al . (2011) Hum Gene Therap. 22: 613-624)。使用藉由腺病毒感染所遞送的Cre重組酶切除止擋匣恢復了REP表現並起始了ITR側接的轉殖基因之AAV複製。在此實例中，在含有ITR側接的轉殖基因的質體中之REP/CAP表現匣的環境下，建構了經重組酶活化的REP基因之經改良版本。
使用AAV2 REP基因（人類AAV2之bp 190-2202，NC_001401.2）、接著是AAV9 CAP開讀框(AY530579.1)、AAV2多腺苷酸化信號(bp 4411-4466, NC_001401.2)、及AAV2 REP P5啟動子的第二個拷貝(bp 190-313, NC_001401.2)建構了AAV REP/CAP9表現匣(SEQ ID NO:13)。
使用剪接預測軟體(NetGene2 at www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/; Brunak, S., Engelbrecht, J., and Knudsen, S.: Prediction of Human mRNA Donor and Acceptor Sites from the DNA Sequence,Journal of Molecular Biology , 1991, 220, 49-65.)以選擇合適的位置，將來自人類β-肌動蛋白基因的內含子插入至REP編碼區。將內含子插入AAV2 (NC_001401.2)中核苷酸編號1052的下游，該區域係所有四種REP轉錄本共有的區域。該內含子及該插入位置兩者皆不同於Qiaoet al . (2002) J. Virol. 76: 13015)所使用者。隨後將止擋匣插入在該β-肌動蛋白內含子的上游及下游半部兩者之間（分別為SEQ ID 14及SEQ ID 15）。止擋匣
轉錄止擋匣(SEQ ID NO:16)係由下列因子組成： ●    SR21attP (SEQ ID NO:7) ●    來自小鼠HPRT基因的強剪接受體(SEQ ID NO:17)（NC_000086.7，核苷酸53001998至53002138），加上來自人類刺豚鼠傳訊蛋白之29 nt區域（NC_000020.11，核苷酸34262765至34262793）。將此包括在內以預防該止擋匣從初級mRNA轉錄本中剪接出來。 ●    新黴素磷酸轉移酶表現匣(SEQ ID NO:18)係藉由哺乳動物啟動子（例如，小鼠磷酸甘油酯激酶1）及細菌(Lac zya)啟動子並接著由來自SV40之多腺苷酸化信號所驅動。該基因分別在哺乳動物及細菌細胞中賦予對新黴素及康黴素的抗性。 ●    來自編碼自切割RNA模體的多腺苷酸化信號下游的人類β-球蛋白基因之序列，對於有效的轉錄終止係重要的(Teixeiraet al . (2004) Nature 432: 526-30; SEQ ID No:19)。 ●    SR21attB (SEQ ID NO:8)。AAV 轉殖基因
在該AAV REP/CAP區下游之P439載體(SEQ ID NO:12)中編碼AAV反向末端重複(ITR)側接的轉殖基因。130 bp ITR (SEQ ID NO:20)係衍生自3' AAV2 ITR（核苷酸4535至4664，NC_001401.2）且插入在HPRT-E2A-mCherry轉殖基因上游及該轉殖基因的反向3'。
該轉殖基因由人類EF1-α啟動子（包括外顯子1、內含子1、及內含子2之部分）(SEQ ID NO:21)、編碼mCherry-自剪接E2A連接子-人類HPRT融合基因之序列(SEQ ID No:22)、及來自單純皰疹病毒胸苷激酶基因(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase Gene) (SEQ ID NO:23)之多腺苷酸化信號組成。絕緣子
REP/CAP及ITR-轉殖基因因子係由阻斷基因表現之染色質相關阻遏的基因體因子側接(Kwakset al . (2003) Nature Biotechnology 21: 554-558; Kwakset al .(2003) Nature Biotechnology 21: 822)：人類抗抑制因子40 (AY190756.1, SEQ ID No:24)及小鼠抗抑制因子40 (SEQ ID NO:25)。質體主鏈
該質體主鏈含有下列因子： ●    哺乳動物嘌呤黴素抗性基因匣係建構自疱疹病毒胸苷激酶基因啟動子(SEQ ID NO:26)、嘌呤黴素N-乙醯基轉移酶編碼區(SEQ ID NO:27)、及來自牛生長激素基因之多腺苷酸化信號(SEQ ID NO:28)。 ●    一種艾司坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus, EBV) OriP複製起點片段(SEQ ID NO:29)，其代表EBV之「雙對稱」區域及「重複家族」區域之組合 ●    pUC57載體序列編碼質體複製起點及安比西林(ampicillin)抗性基因(SEQ ID NO:30)。
在SEQ ID NO:12中給出完整質體P439的序列。藉由SR21 重組酶移除止擋匣之測試效率
為了測試該止擋匣是否可藉由SR21重組酶在人類細胞中精確地移除，根據製造商之說明，使用脂染胺(Lipofectamine) 3000將載體P439 (SEQ ID NO:12)及SR21重組酶表現載體P175 (SEQ ID NO:10)共轉染至PEAK-Rapid細胞中，並且在37℃下於5% CO2中在含有DMEM及10% FBS的培養基中培養三天。移除培養基，將細胞用D-PBS洗滌一次，然後在37℃下用TrypLE培養5分鐘。將細胞轉移至無菌微量離心管中，藉由離心製粒，用1 ml D-PBS洗滌一次並再次製粒。藉由使用經設計以用於從細菌單離質體的Qiagen Spin Miniprep套組，藉由鹼裂解回收游離的質體。
為了破壞未重組的質粒DNA，將等分試樣的回收DNA用Spe I-HF酶在1x CutSmart 緩衝液中在37℃下消化1小時並在80℃下消化20分鐘。使用NEXT Ultra II Q5 Master Mix，在下列循環條件下，用引子P349F3 (SEQ ID NO:32)及P349R9 (SEQ ID NO:33)使回收的DNA經受PCR擴增：98℃1 min; 35x (98℃10s, 72℃10s); 5 min 72℃。當在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳時，觀察到單一具有預期大小的PCR產物。將PCR產物藉由粒徑篩析層析法使用CHROMA SPIN™+TE-1000管柱純化。使用用於PCR (GeneWiz)之相同引子將PCR產物定序。所得之序列(SEQ ID NO:34)顯示，藉由SR21重組酶透過重組該等attP (SEQ ID NO:7)及attB (SEQ ID NO:8)序列，該止擋匣已從質體P439精確移除，產生attL 重組序列(SEQ ID NO:35)。表現SR21 重組酶的重組腺病毒血清型5 之構造
重組ΔE1/ Δe3腺病毒血清型5 (Ad5)病毒係藉由在PER.C6細胞中的同源重組程序在Batavia Biosciences (Leiden, the Netherlands)產生(Fallauxet al . (1998) Hum Gene Ther. 9: 1909-1917)，如先前所述用於生產E1缺失的載體(Havenga et a. (2001) J. Virol 75:3335-3342)，除了使用缺少E3區域之經修飾黏接質體之外（pWE/Ad5.AflII‐rITRsp. ΔE3，專利US6340595B1）。PER.C6細胞與此黏接質體及含有1至454之Ad5序列（左邊ITR及包裝信號）的質體P321 (SEQ ID NO:31)、含有巨細胞病毒(CMV)啟動子(nt -672至+15)之轉殖表現匣、該SR21重組酶編碼區、猴病毒40 (SV40)多腺苷酸化信號(NC_001669.1, nt 2550至2774)、及第二Ad5序列（範圍從nt 3511至6095）共表現。在PER.C6細胞中的P321 Ad5序列(nt 3511-6095)與黏接質體pWE/Ad5.AflII‐rITRsp. ΔE3之間的同源重組產生重組腺病毒。藉由兩步驟CsCl-梯度帶化程序獲得經純化的病毒原液，並將經單離之病毒原液透析至腺病毒配方緩衝液（10 mM Tris (pH 7.4)，1 mM MgCl2 ，75 mM NaCl，5%蔗糖，0.02%聚山梨醇酯80，0.1 mM EDTA，10 mM組胺酸，0.5% EtOH）。穩定的細胞系產生
根據製造商的說明，使用脂染胺3000將質體P439 (SEQ ID NO:12)轉染至黏附的PEAK-RAPID細胞，並在37℃下將其在T25培養瓶中於DMEM+ 10% FBS+ 0.05 mg/ml遺傳黴素中培養。24小時之後，用TrypLE處理細胞並將其轉移至含有DMEM+ 10% FBS+ 0.05 mg/ml遺傳黴素+ 0.5 µg/ml嘌呤黴素之T75培養瓶中。將細胞以每週1:10分至相同培養基中連續兩週。在轉染後第三週時，將細胞每週以1:10分在含有DMEM+ 10% FBS+ 0.05 mg/ml遺傳黴素+ 5.0 µg/ml嘌呤黴素之培養基中達三週。
藉由將細胞稀釋至1% ClonaCell甲基纖維素於DMEM + 30% FBS+ 1x GlutaMax+ 5 µg/ml嘌呤黴素+ 0.05 mg/ml遺傳黴素中，接種至非經組織培養處理之6孔盤中，並在37℃下培養三週來生產單細胞殖株。使用移液器將殖株自甲基纖維素盤轉移至96孔經TC處理之盤中，該盤含有DMEM+ 10% FBS+ 0.05 mg/ml遺傳黴素+5.0 µg/ml嘌呤黴素。藉由標準方法在相同培養基中擴增殖株。篩選殖株
為了篩選生產AAV的殖株，將細胞以一式兩份接種至100 µl DMEM+ 10% FBS中之96孔盤中，並在37℃下培養整夜。將SR21腺病毒稀釋成每ml無血清DMEM中1E8個病毒基因體。用100 µl稀釋的腺病毒置換來自經接種細胞的培養基，並將盤在37℃下培養四天。藉由添加10 µl之下列混合物來裂解細胞：5%去氧膽酸鹽於PBS中+ 10單位Benzonase。將盤在37℃下培養2小時。將盤以3000 rpm離心5分鐘以沉澱細胞碎屑，且上清液中之AAV病毒藉由數位液滴PCR (ddPCR)定量。數位液滴PCR (ddPCR)
ddPCR定量係基於Locket al . (2014) Human Gene Therapy methods 23: 115-125所述之方法。在20 µl含有1x PCR緩衝液+ 20 mM Tris pH 8.5 + 8單位DNAse I的反應中，將二µl的裂解液在37℃下之熱循環儀的96孔盤中用DNAse消化1小時。將2 µl的DNAse消化樣本用98 µl病毒稀釋緩衝液(VDB)稀釋，並且將2 µl的該稀釋液添加至ddPCR反應中，該ddPCR反應含有用於mCherry轉殖基因之1x PCR SuperMix + 1x PCR引子/探針（參見材料章節）。使用Bio-Rad自動化液滴產生器形成ddPCR液滴。PCR循環如下：95℃10 min；42x（94℃30s，60℃1 min，72℃15s，所有三個循環時間為每秒2℃）；98℃10min；保持4℃。依據製造商之說明，在Bio-Rad液滴讀取器上偵測到FAM螢光。使產生最高DNAse抗性粒子且偵測為FAM螢光陽性液滴之殖株經歷擴增及進一步篩選。篩選殖株- 第二次分析
將待篩選之殖株的1.25E6個細胞接種至於3 ml MEM+ 10% FBS中之6孔盤的單孔中，並在37℃下培養2天。將生長培養基用含有5E8個Ad5-SR21病毒粒子之3 ml DMEM+ 10% FBS置換。將盤返回至37℃培養3天。將細胞與培養基轉移至15 ml試管中並使其經歷3個冷凍解凍循環（乾冰/37℃培養），接著在3000 rpm下離心5分鐘以將細胞碎屑製粒。使2 µl的各樣本經歷DNAse消化並用上述的mCherry分析進行ddPCR定量。在用Ad5-SR21病毒感染後，P439C4細胞產生最多AAV，且經選擇以用於進一步表徵（表3）。 [表3]篩選分析中之AAV生產
殖株# 總AAV（DNAse-抗性粒子）
殖株1 4.4E+08 ± 7.6E+07
殖株3 2.5E+09 ± 3.4E+08
殖株4 4.4E+09 ± 5.6E+07
殖株5 1.8E+09 ± 1.9E+08
殖株12 7.5E+08 ± 9.8E+07
殖株18 1.6E+08 ± 2.6E+07
殖株20 9.8E+07 ± 1.4E+07
殖株25 1.2E+09 ± 6.4E+07
殖株28 1.3E+08 ± 1.2E+07
殖株32 1.5E+09 ± 1.3E+08
殖株36 2.8E+08 ± 3.0E+07
殖株41 1.0E+09 ± 8.9E+07
時間進程實驗
進行新的實驗以判定在兩個不同生長溫度下培養基中之AAV生產及分泌之動力學。將兩mL非酶解離溶液添加至T150培養瓶中經PBS-洗滌之P439-C4細胞單層，並且將燒瓶在37℃下培養5分鐘。將培養瓶用8 ml的DMEM+10% FBS洗滌，並且將細胞轉移至50 ml的離心管中。將細胞以1500 rpm離心5分鐘,，並將團塊再懸浮於DMEM+2% FBS中。將細胞以相同培養基稀釋至每毫升1.25E6個細胞。將四ml的細胞接種至四種6孔盤的各孔中。將1 ml (2E8 vp)於DMEM+ 2% FBS中的Ad5-CMV-SR21腺病毒添加至孔中。將兩盤在37℃下培養，且將兩盤在32℃下在5% CO2下培養。每天使用細胞刮刀回收細胞及培養基持續8天，以移除附接的細胞，並將樣本轉移至15 ml錐形管中。將試管以3000 rpm旋轉5分鐘，並將等分試樣轉移至1.5 ml螺旋蓋管中並在-20℃下冷凍直到ddPCR分析。
將樣本如上所述以一式兩份進行處理，並且將各經DNAse處理的樣本在VDB中製成三份連續稀釋液。在ddPCR反應中將樣本定量，該反應含有1x PCR Master Mix + 1x mCherry-FAM分析物+ 1x Ad5E2-HEX分析物（請參見材料章節）。如上所述進行ddPCR。結果：
在細胞培養基中的腺病毒及AAV在8天時程期間增加（表4）。腺病毒複製在32℃下較慢，導致較高的AAV生產，這可能是由於腺病毒的細胞病變作用延遲所致。每個細胞在32℃下的AAV產量超過14,000個基因組拷貝。 [表4]經過8天時間進程之AAV及腺病毒產率
   AAV GC/細胞 Ad5 GC/細胞
感染後天數 32℃ 37℃ 32℃ 37℃
1 4 ± 1 22 ± 0 8 ± 1 161 ± 4
2 11 ± 2 174 ± 26 223 ± 14 1319 ± 292
3 2009 ± 137 803 ± 110 2028 ± 155 4941 ± 75
4 4275 ± 274 975 2600 ± 168 5806 ± 159
5 7406 ± 309 1672 ± 49 5041 ± 446 12000 ± 442
6 7469 ± 75 4109 ± 214 4781 ± 610 33344 ± 1781
7 10313 ± 619 5034 ± 75 8344 ± 663 20594 ± 1547
8 14031 ± 221 5563 ± 88 13313 ± 177 22875 ± 442
Hyperflask 培養物
將8.3E07個P439C4細胞接種至550 ml的DMEM + 10% FBS+ 0.5 µg/mL嘌呤黴素+50.0 µg/mL G418中的兩個Hyperflask M容器中，並在37℃下培養3天。3天生長後的密度估計為每瓶3.6E8個細胞。藉由在550 ml的DMEM10% FBS中稀釋病毒，將培養瓶以40 MOI (1.4E10 vp)或20 MOI (7.2E09 vp)感染，並用稀釋的病毒置換在hyperflask中的培養基。將細胞在32℃下在5% CO2下培養7天。7天後從感染物中收集上清液，並藉由通過0.2 µm PES的膜過濾器來提純。AAVX 純化
將0.5 × 5 cm的POROS GoPure層析管柱（用POROS CaptureSelect AAVX樹脂預填充至床體積為1 mL，附接至AKTA Explorer FPLC系統），用10倍管柱體積(CV)緩衝液A (20 mM Tris pH7.5, 400 mM NaCl)在3 ml/min之流率下平衡。4.5 mL/min之流速裝載病毒懸浮液，接著添加10 mL的緩衝液A以洗去未結合樣本。藉由用5 ml的低鹽benzonase緩衝液、緩衝液B（25 mM Tris pH7.5，40 mM NaCl，及1.5 mM MgCl2）平衡管柱、接著用含有250單位/ml的Benzonase之15 ml緩衝液B裝載管柱來進行管柱上的DNA消化。然後將管柱在室溫下培養30分鐘，接著用緩衝液A的緩衝液進行15 CV洗滌。用15 CV的緩衝液C（20 mM檸檬酸鈉pH 2.5，400 mM的NaCl）以0.5 mL流份洗提病毒，該等流份立即用25 µL的500 mM Bis-TRIS丙烷pH 10.0中和。觀察到單峰洗提。收集曲線下的所有流份、濃縮，並使用15 100kDa MWCO (Cat# UFC910024, Fisher)用三輪緩衝液添加/離心，將緩衝液交換成緩衝液D（100 mM檸檬酸鈉，10 mM Tris，pH 8.0）。使經緩衝液交換及濃縮的親和力層析產物進行陰離子交換層析，以進一步將AAV純化遠離空殼體。陰離子交換層析法
將親和力層析產物（病毒懸浮液）於緩衝液E (20 mM BTP pH10.0, 0.001% Pluronic F68, 10 mM NaCl)中稀釋至45 mL，並在AKTA純化系統(GE Healthcare Life Sciences)上以2 ml/min之流速裝載至CIM QA碟（BIA分離，0.34 ml體積）上。用10 CV的無菌過濾緩衝液E (20 mM BTP pH10.0, 0.001% Pluronic F68, 10 mM NaCl)洗滌管柱。在60 CV梯度下自100%緩衝液E至100%緩衝液F（20 mM Bis-TRIS丙烷pH 10.0，0.001% Pluronic F68，400 mM NaCl）洗提病毒；收集0.5 mL流份。收集曲線下的所有流份，並使用Amicon 15 100kDa MWCO (cat#: UFC910024, Fisher)以2000 × g離心5分鐘進行濃縮，並將緩衝液更換成緩衝液D（100 mM檸檬酸鈉，10 mM Tris，pH 8.0）。蛋白質視覺化
在補充有5% β-巰基乙醇的NuPage LDS樣本緩衝液(4x)中，將2 µL濃縮洗出液加熱變性（95℃達10分鐘），並在1x MOPS運行緩衝液中在4至12% Bis-Tris PAGE凝膠上進行電泳。根據製造商的說明，使凝膠經受銀染色。ddPCR
使用上述的mCherry分析，藉由數位液滴PCR測量病毒濃度。結果
當以20及40 MOI感染時，Hyperflask容器中的P439C4細胞之感染及生長分別產生了1.9E13及7.0E13個基因體拷貝(GC)。20及40 MOI的感染分別對應於每個細胞5.2E4及1.9E5個GC。透過PAGE電泳及銀染色檢查病毒樣本的純度。僅對應於三個AAV9殼體異構體（VP1、VP2、及VP3）的三條帶係可見的（圖5）。該等殼體蛋白（VP1 (87 kDa)、VP2 (72 kDa)、及VP3 (62 kDa)係以大約1:1:10的預期化學計量存在，如先前針對其他重組AAV載體所記述者(Daya and Berns (2008) Clin Microbiol Rev. 21: 583-593)。測量錯誤包裝的DNA 位準
編碼AAV REP或CAP基因的序列及衍生自在生產過程中使用的質體載體之原核序列可非特異性地包裝至AAV粒子中，在用於基因治療時存在潛在的安全隱患（請參見例如，Schnodt and Buning,Hum Gene Ther Methods. , 2017; 28(3):101-108）。風險包括透過同源重組產生具有復制能力的AAV、殼體基因表現觸發細胞毒性T淋巴細胞反應、及對原核序列的免疫系統識別，從而導致炎症反應及/或基因靜默。在藉由三重轉染或從生產的細胞系中純化的重組AAV製劑中，分別報導了2%、0.4%至1.0%、及1.3%至6.3%的殼體化rep、cap、及原核生物序列(Nonyet al. (2003) J. Virology 77: 776-781; Gaoet al. (2008) Molecular Therapy 16: S105; Chaudeufet al. (2005) Molecular therapy 12: 744-753)。
為了判定與上述生產系統關聯的錯誤包裝位準，藉由ddPCR判定該轉染載體（ITR側接的轉殖基因之外部）的四種序列之豐度：a) P5啟動子；b) AAV REP基因；c) AAV9 CAP基因；及d) β-內醯胺酶（安比西林抗性）基因。將來自前述之20及40 MOI hyperflask培養物的純化病毒製劑一式三份以DNAse消化、在VDB中連續稀釋、並使其經受ddPCR。含有這些序列之病毒粒子的濃度表示為含有mCherry轉殖基因的AAV粒子的百分比（表5）。0.04%之最高的殼體化率係P5啟動子在病毒A prep（由感染重組腺病毒的20 MOI產生）中之殼體化率。然而，在prep B (40 MOI)中（其中AAV產率高出許多），P5的殼體化率僅0.007%。REP、CAP、及安比西林基因序列係相同或更低。CAP位準係0.007%至0.009%，其低於先前報導的用於血友病B基因治療試驗所生產的重組AAV2的四種臨床批次之0.016%至0.021% cap殼體化率。(2009) Molecular Therapy 17: 144-152)。因此，此處描述對於生產及純化重組AAV的方法導致錯誤包裝DNA的發生率非常低，與臨床基因治療計劃可能需要的一致。 [表5]包裝在經純化病毒中之非轉殖基因序列的豐度
   P5啟動子 REP CAP 安比西林
病毒A (20 MOI) 0.0398% ± 0.0023% 0.0078% ± 0.0003% 0.0092% ± 0.0002% 0.0051% ± 0.005%
病毒B (40 MOI) 0.0074% ± 0.0032% 0.0005% ± 0.0002% 0.007% ± 0.0001% 0.0003% ± 0.0001%
顯示四種探針相對於含有mCherry轉殖基因的粒子之DNAse抗性粒子平均百分比±標準偏差，用於分析兩種AAV載體製劑。在止擋匣切除之後，REP 基因的RNA 剪接之RT-PCR 分析
為了判定當止擋匣切除時是否正確地剪接插入至建構體P439中的REP基因中的內含子，進行了RT-PCR實驗。
將來自PEAK-RAPID細胞中P439之穩定池的一千萬個細胞藉由離心沉澱，並將其再懸浮於15 ml的DMEM+2% FBS + 1E9 Ad5-CMV-SR21病毒顆粒中。將細胞接種至T75培養瓶中然後在37℃下培養四十八小時。使用細胞刮刀分離細胞。將培養基及細胞轉移至15 ml離心管中，並以1500 rpm離心10分鐘以沉澱細胞。使用具有Phase-maker管的Trizol Plus RNA純化套組自細胞團塊純化RNA。
為了移除任何汙染的DNA，將31 µg的RNA用來自不含DNA套組之1 µl的DNAse在1x消化緩衝液中在37℃下處理30分鐘。添加5 µl的DNAse無活化漿液，並且在2分鐘的培養期間將樣本倒置數次。將RNA樣本以10,000 × g離心5分鐘並將RNA轉移至新的無菌管。
用SuperScript III第一股合成系統將RNA反轉錄。將80 µg RNA、1 µl 50 µM寡聚-DT、及1 µl 10 mM dNTPS在無菌管中混合並在65℃下培養5分鐘及在冰上培養2分鐘。添加十µl的2x混合物（2x RT緩衝液，10 mM MgCl2，20 mM二硫蘇糖醇，0.5 µl RNAse-out，及0.5 µl反轉錄酶）。模擬RT反應係相同的，除了用水置換反轉錄酶。將反應在50℃下培養50分鐘並在冰上培養2分鐘。添加一µl RNAse H並將樣本在37℃下培養20分鐘。
五十µl PCR反應含有1 µl的反轉錄RNA、25 µl Q5熱啟動高保真2X Master Mix、及0.5 µM的兩種引子。使反應進行熱循環如下：
98℃1 min；35個循環之(98℃10s, 69℃10s, 72℃36s)；5 min 72℃。
將五µl的反應在1xTAE緩衝液及溴化乙錠中的1%瓊脂糖凝膠上離析。在Dark Reader透照器上在藍光照明下將條帶可視化。使用Nucleospin凝膠及PCR清潔套組從切除的帶中回收DNA。使用循環定序及染劑-終止子化學法，將DNA在GeneWiz (South Plainfield, NJ)用PCR引子定序。結果：
來自模擬RT模板的PCR反應沒有產生可檢測的產物，表示基因體DNA已從RNA樣本中消除。從P439中切除止擋匣後，使用引子AAVRT-F1 (SEQ ID NO:62)及P349R9 (SEQ ID NO:63)進行PCR，產生兩種具有類似螢光強度的PCR產物，這些產物均衍生自剪接的轉錄本。一種產物是由在經工程改造之β-肌動蛋白剪接供體及受體位點處剪接而得到（分別為SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:15；圖8）。第二產物是由5' REP基因(SEQ ID NO:64)供體位點與下游的β-肌動蛋白受體之間的剪接得到（圖8）。預測此剪接事件相對於野生型AAV2移除REP編碼序列的64 bp，將產生框移並產生截頭REP蛋白。此意味著突變該上游剪接供體位點可增加活性REP蛋白的豐度，並使AAV生產更加有效。更新AAV 建構體：P600 (SEQ ID NO:70)
對質體P439 (SEQ ID NO:12)進行幾處改變，得到建構體P600 (SEQ ID NO:70)。首先，該止擋匣上游的REP基因之該剪接供體係經突變的。簡而言之，將在5' REP序列(SEQ ID NO:64)中所識別之剪接供體位點的核苷酸GT突變成AT (SEQ ID NO:65)。預測此突變以消除在此位點的剪接而不改變該REP蛋白質序列。
為了降低止擋匣切除後可將該REP/CAP基因包裝至AAV殼體中的可能性，設計2 kb隨機序列(SEQ ID NO:66)並插入在該attB序列下游及該肌動蛋白剪接序列上游，以增加經工程改造的內含子的大小。使用NetGene 2軟體（上述的）鑑別潛在的剪接位點，並將其移除。此插入將REP/CAP基因的大小從4.3 kb增加至6.4 kb，其遠高於5.0 kb AAV包裝的限制。
基於這樣的假設，相鄰AAV ITR的序列亦可能在從基因體中進行轉殖基因拯救期間被擴增，並且可能被錯誤包裝成AAV殼體（參見例如，Schnodt and Buning,Hum Gene Ther Methods. , 2017; 28(3):101-108），兩個隨機2 kb非編碼間隔子因子係經設計以側接該轉殖基因，以減小錯誤包裝DNA的潛在影響。在左AAV ITR的上游插入一個因子(SEQ ID NO:67)，並在右AAV ITR的下游插入第二個(SEQ ID NO:68)經置換的小鼠抗抑制因子40 (SEQ ID NO:25)。
此外，該cap 基因係AAV9變體（參見例如，Hindereret al .,Hum Gene Ther . 2018; 29(3):285-298）。
最後，P439中之ITR側接的轉殖基因編碼序列係由編碼mCherry-IRES-SEAP（分泌型鹼性磷酸酶）蛋白之SEQ ID NO:69置換。
所得建構體P600的完整序列在SEQ ID NO:70中揭示，並且將該質體之繪示顯示於圖9中。在穩定彙集中來自P600 的AAV 生產
將建構體P600轉染至Peak-RAPID細胞中，並且透過選擇0.5 µg/ml嘌呤黴素來產生穩定池，基本上如上文對於P439細胞所述。在分析AAV生產之前，使細胞以1:10通過達6週。
將2.5E6個P600-PEAK-Rapid p6細胞接種至5 ml的DMEM+ 10% FBS中的三個T25燒瓶中，並在37℃下培養三天。在感染當天，將該等燒瓶中之一者的細胞密度判定為6.6E6個活細胞，其中用TrypLE回收細胞並使用錐蟲藍排除法計數。將兩個餘留培養瓶中之培養基用含有2.6E8個Ad5-CMV-SR21病毒粒子之11 ml的DMEM+ 2% FBS置換。將培養瓶在32℃下培養24小時。將一ml於DMEM+ 2% FBS中之1.25 mM的2-胺基嘌呤添加至一個燒瓶中。將一ml的DMEM+ 2% FBS添加至另一培養瓶，並且將兩個培養瓶在32℃下額外培養7天。將培養基自培養瓶中回收，以3,000 rpm離心5分鐘以沈澱細胞及與碎屑。使2 µl的各樣本上清液經歷DNAse消化並使用上述的mCherry分析進行ddPCR定量。
AAV生產位準係示於表6中。當用Ad5-CMV-SR21感染時，P600穩定池活躍於產生AAV。在2-胺基嘌呤（一種經報導可阻斷腺病毒誘導的CAP依賴性mRNA轉譯的藥物）的存在下，AAV病毒生產量增加了2.5倍（參見例如，Zhang and Schneider (1994) J. Virology 68: 2544-2555; and Huang and Schneider (1990) PNAS 87: 7115-7119）。儘管已報導在感染後1至2小時10 mM 2-AP治療阻斷了腺病毒感染的細胞病變作用並且至少三天無毒（參見例如，Zhang and Schneider (1994) J. Virology 68: 2544-2555; and Huang and Schneider (1990) PNAS 87: 7115-7119)），我們發現濃度在1.25 mM以上且添加時間早於24小時，對於我們的AAV生產細胞系統中的AAV生產具有抑制作用。這些數據意味著抑制晚期腺病毒基因計劃（尤其是cap-依賴性mRNA轉譯的關閉）係一種在生產細胞系中增加AAV產量的有用策略。 [表6]
樣本 介質 AAV GC/細胞
1 DMEM+ 2% FBS 23,826 ± 2990
2 DMEM+ 2% FBS+ 1.25 mM 2-AP 59, 356 ± 11,026
在人類細胞中重組的腺相關病毒(AAV)的製造需要AAV複製(REP)及殼體(CAP)基因、腺病毒基因、及AAV-可包裝轉殖基因的表現，該轉殖基因由AAV反向末端重複(ITR)側接的表現匣組成。所有三種組分都可仰賴單獨的質體遞送至細胞以產生AAV，但是現有的轉染方法難以擴展成大規模培養。將一些該等因子摻入宿主細胞系中可使AAV生產更有效率，然而一些AAV及腺病毒基因係細胞生長抑制性或細胞毒性，因而限制了此方法。本發明描述使AAV REP基因可逆失活的方式，使得AAV REP、CAP、及可包裝轉殖基因可整合至合適的宿主細胞中並擴增。藉由表現重組酶之複製缺陷型重組腺病毒（例如，ΔE1/ΔE3）感染這些細胞會重新活化該等REP基因並誘導AAV複製及包裝。
前述發明內容以及下文中本申請案之較佳實施例的實施方式在結合附圖閱讀時可更有利理解。然而應理解的是，本申請案並不受限於圖式中所示確切實施例。 〔圖 1 〕顯示SPBetac2整合酶蛋白(SEQ ID NO:1, query)與在沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis )菌株CCMA-560 (SEQ ID NO:2, Sbjct)之基因體中經識別的推定絲胺酸重組酶的比對統計及序列比對，序列ID: WP_029708089.1，長度為535個胺基酸。該二種蛋白質在來自胺基酸1-529之蛋白質位準下具有64%序列同一性。此推定絲胺酸重組酶在本文中係命名為SR21（絲胺酸重組酶21）。 〔圖 2 〕顯示代表插入前基因座之菌株的識別：CCMA-560 DNA序列(query)與沙福芽孢桿菌菌株Fairview contig56_1 (Sbjct)的全基因體散彈槍序列之核苷酸464352至464839的比對統計及序列比對，序列ID: NZ_JFBY01000018.1，長度為568093個核苷酸。 〔圖 3 〕顯示SR21重組酶attP 及attB 位點。該等attP 及attB 位點係由圍繞中央二核苷酸重組交換位點（劃底線）的雙對稱(dyad symmetry)組成。半部位點經編號。在attB 序列中引入空格以顯示由先前研究推斷的鋅帶結構域(ZD)及重組酶結構域(RD)結合的序列比對(Rutherfordet al . (2013) Nucleic Acids Res. 41:8341-8356)。與ZD或RD結構域的三或四個同一的殘基以粗體表示。所示者為該attP (SEQ ID NO:7)與兩個交替的attB 序列(SEQ ID NO:8)及(SEQ ID NO:9)的比對。 〔圖 4 〕繪示報導基因的重組酶活化。質體P41編碼兩個報導子基因轉錄本。由EF1α啟動子驅動的第一者具有組成型活性，並在綠色螢光蛋白(GFP)與藉由自切割F2A胜肽連接子連接的海腎螢光素酶(renilla luciferase)之間編碼融合蛋白。由CMV所驅動的第二轉錄物包括SR21重組酶attB 位點(SEQ ID NO:9)，接著是由該P2A自切割胜肽連接子及SR21attP 位點連接的編碼mCherry及螢火蟲螢光素酶之反向融合蛋白編碼區。螢光素酶及mCherry皆不表現，因為其等相對於該啟動子處於相反定向。當表現SR21重組酶時，該等attB 及attP 序列重組，其導致該等報導基因倒置且螢火蟲螢光素酶及mCherry表現。 〔圖 5 〕顯示根據本申請案之實施例所產生之經純化的重組AAV樣本中之AAV殼體蛋白。從用質體P439穩定轉染的細胞中純化樣本，使其在Hyperflask容器中以20 MOI (A)及40 MOI (B)生長並感染，並且經受PAGE及銀染色。 〔圖 6 〕繪示根據本申請案之實施例具有人工內含子之rep/cap 表現匣，該人工內含子具有插入其中的止擋匣。 〔圖 7 〕繪示根據本申請案之實施例的載體（質體P439）。 〔圖 8 〕繪示在P439中藉由RT-PCR所識別的RNA剪接位點之位置及序列。頂部圖式代表止擋匣切除之後的REP基因結構。REP之5'及3'半部係由該β-肌動蛋白內含子之上游半部(SEQ IDNO:14)、該SR21 AttL因子(SEQ ID 35)、及β-肌動蛋白內含子之下游半部(SEQ ID NO:15)隔開。在(2)該β-肌動蛋白剪接供體(SEQ ID NO:71)與(3) β-肌動蛋白剪接受體(SEQ ID NO:72)之間的剪接係由實線表示。在(1) 5'REP序列中之上游剪接供體(SEQ ID No:64)與(3) 3'β-肌動蛋白受體(SEQ ID NO:72)之間的剪接係用虛線顯示。剪接供體及受體之序列顯示如下。小寫字母序列表示該內含子序列。 〔圖 9 〕繪示根據本申請案之實施例之載體（質體P600）。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
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Claims (106)

  1. 一種非天然存在的核酸分子，其包含經修飾腺相關病毒(AAV)rep 基因，該基因具有編碼四種Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52、及Rep40之AAVrep 基因及插入至由該等四種Rep蛋白共享之該rep 基因的編碼序列中的人工內含子，其中該人工內含子包含止擋匣(stop cassette)，該止擋匣係插入在該人工內含子之5'剪接位點下游及分支位點上游，且該止擋匣以5'至3'的順序包含： (a)   具有與SEQ ID NO:7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attP 位點，較佳的是具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點； (b)   剪接受體； (c)   終止子；及 (d)   具有與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attB 位點，較佳的是具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點。
  2. 如請求項1之非天然存在的核酸分子，其中該剪接受體包含SEQ ID NO:17之核苷酸序列。
  3. 如請求項1或2之非天然存在的核酸分子，其中該終止子包含多腺苷酸化信號。
  4. 如請求項3之非天然存在的核酸分子，其中該終止子進一步包含SEQ ID NO:19之核苷酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之非天然存在的核酸分子，其中該止擋匣包含編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶(neomycin phosphotransferase)表現匣。
  6. 如請求項1至5中任一項之非天然存在的核酸分子，其中該人工內含子以5'至3'的順序包含SEQ ID NO:14之核苷酸序列、該止擋匣、及SEQ ID NO:15之核苷酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之非天然存在的核酸分子，其中該AAVrep 基因包含AAV1至AAV8中之一者、或其混合之rep 基因。
  8. 如請求項7之非天然存在的核酸分子，其中該AAVrep 基因包含人類AAV2之該rep 基因，該基因具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號190至2202。
  9. 如請求項8之非天然存在的核酸分子，其中該人工內含子係插入在GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號996至1905之間。
  10. 如請求項9之非天然存在的核酸分子，其中該人工內含子係直接插入在GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號1052、1061、1712、1906、1022、1112、1475、1514、1700、1742、1784或1340、較佳的是核苷酸編號1052的下游。
  11. 一種非天然存在的核酸分子，其包含經修飾AAVrep 基因，該基因以5'至3'的順序包含： (a)   具有SEQ ID NO:55之核苷酸序列的AAVrep 基因之5'部分； (b)   人工內含子，其以5'至3'的順序包含： (i)   具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列的5'內含子片段； (ii)  止擋匣，其以5'至3'的順序包含： (1)  具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點； (2)  具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列的剪接受體； (3)  具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣； (4)  具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列的終止子；及 (5)  具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及 (iii)   具有SEQ ID NO:15之核苷酸序列的3'內含子片段；及 (c)   具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列的該AAVrep 基因之3'部分。
  12. 一種非天然存在的核酸分子，其包含經修飾AAVrep 基因，該基因以5'至3'的順序包含： (a)   具有SEQ ID NO:73之核苷酸序列的AAVrep 基因之5'部分； (b)   人工內含子，其以5'至3'的順序包含： (i)     具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列的5'內含子片段； (ii)    止擋匣，其以5'至3'的順序包含： (1)  具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點； (2)  具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列的剪接受體； (3)  具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣； (4)  具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列的終止子；及 (5)  具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及 (iii)   具有SEQ ID NO:66之核苷酸序列的3'內含子片段；及 (c)   具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列的該AAVrep 基因之3'部分。
  13. 如請求項11或12之非天然存在的核酸分子，其中該止擋匣包含SEQ ID NO:16之核苷酸序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之非天然存在的核酸分子，其進一步包含編碼三種殼體蛋白VP1、VP2及VP3之AAVcap 基因。
  15. 如請求項14之非天然存在的核酸分子，其中該AAVcap 基因包含AAV1至AAV9及AAVDJ中之一者、或其混合之cap 基因。
  16. 如請求項15之非天然存在的核酸分子，其中該AAVcap 基因包含具有GenBank存取號AY530579.1之核苷酸序列的人類AAV9之cap 基因。
  17. 如請求項14至16中任一項之非天然存在的核酸分子，其中該AAVcap 基因進一步包含多腺苷酸化信號（較佳的是具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號4411至4466之AAV2的多腺苷酸化信號）及強化子（較佳的是具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號190至313之AAV2rep P5啟動子），其中該多腺苷酸化信號及該強化子兩者皆係該cap 基因之該編碼序列的下游。
  18. 如請求項14至17中任一項之非天然存在的核酸分子，其進一步包含由該AAVcap 基因下游的一對AAV反向末端重複(ITR)側接之轉殖基因。
  19. 如請求項18之非天然存在的核酸分子，其進一步包含該經修飾AAVrep 基因上游的第一絕緣子及可選地由該等ITR側接之該轉殖基因下游的第二絕緣子，較佳地，該第一絕緣子及該第二絕緣子係獨立地選自由下列所組成之群組： (a)   具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列的人類抗抑制因子40； (b)   具有SEQ ID NO:25之核苷酸序列的小鼠抗抑制因子40； (c)   具有GenBank存取號AY190749.1之核苷酸序列的抗抑制因子04； (d)   具有GenBank存取號AY190750.1之核苷酸序列的抗抑制因子06； (e)   具有GenBank存取號AY190751.1之核苷酸序列的抗抑制因子07； (f)   具有GenBank存取號AY190752.1之核苷酸序列的抗抑制因子12； (g)   具有GenBank存取號AY190753.1之核苷酸序列的抗抑制因子13； (h)   具有GenBank存取號AY190754.1之核苷酸序列的抗抑制因子35； (i)    具有GenBank存取號AY190755.1之核苷酸序列的抗抑制因子36； (j)    具有GenBank存取號AY190757.1之核苷酸序列的抗抑制因子52； (k)   具有GenBank存取號AY190758.1之核苷酸序列的抗抑制因子53；及 (l)    來自在二或更多個拷貝中具有AY040835.1之核苷酸序列的球蛋白基因座之雞HS4絕緣子， 更佳地，該第一絕緣子及該第二絕緣子分別具有SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25之核苷酸序列。
  20. 如請求項19之非天然存在的核酸分子，其中該非天然存在的核酸分子包含該經修飾AAVrep 基因上游的該第一絕緣子，並且進一步分別包含該轉殖基因上游及下游的第一間隔序列及第二間隔序列，其中該第一間隔序列及該第二間隔序列係獨立地選自由下列所組成之群組： a)    SEQ ID NO:67之核苷酸序列；及 b)    SEQ ID NO:68之核苷酸序列。
  21. 如請求項18至20中任一項之非天然存在的核酸分子，其中該ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；較佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列。
  22. 一種非天然存在的核酸分子，其以5'至3'的順序包含： (A)  第一絕緣子，較佳地該第一絕緣子具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列； (B)   經修飾AAVrep 基因，其以5'至3'的順序包含： (i)   AAVrep 基因之5'部分，較佳地該AAVrep 基因之該5'部分具有SEQ ID NO:55之核苷酸序列； (ii)  人工內含子，其以5'至3'的順序包含： (a)   5'內含子片段，較佳地該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列； (b)   止擋匣，其以5'至3'的順序包含： (1)   具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點； (2)   剪接受體，較佳地該剪接受體具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列； (3)   編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣； (4)   終止子，較佳地該終止子具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列；及 (5)   具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及 (c)   3'內含子片段，較佳地該3'內含子片段具有SEQ ID NO:15之核苷酸序列； (iii) 該AAVrep 基因之3'部分，較佳地該AAVrep 基因之該3'部分具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列； (C)   AAVcap 基因，較佳地該AAVcap 基因包含SEQ ID NO:57之核苷酸序列； (D)  由一對AAV ITR側接之轉殖基因，較佳地，該AAV ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，且該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；更佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列；及 (E)   第二絕緣子，較佳地該第二絕緣子具有SEQ ID NO:25之核苷酸序列。
  23. 一種非天然存在的核酸分子，其以5'至3'的順序包含： (A)  第一絕緣子，較佳地該第一絕緣子具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列； (B)   經修飾AAVrep 基因，其以5'至3'的順序包含： (i)   AAVrep 基因之5'部分，較佳地該AAVrep 基因之該5'部分具有SEQ ID NO:73之核苷酸序列； (ii)  人工內含子，其以5'至3'的順序包含： (a)   5'內含子片段，較佳地該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列； (b)   止擋匣，其以5'至3'的順序包含： (1)  具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點； (2)  剪接受體，較佳地該剪接受體具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列； (3)  編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣； (4)  終止子，較佳地該終止子具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列；及 (5)  具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及 (c)   3'內含子片段，較佳地該3'內含子片段具有SEQ ID NO:66之核苷酸序列； (iii) 該AAVrep 基因之3'部分，較佳地該AAVrep 基因之該3'部分具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列； (C)   AAVcap 基因； (D)  由下列側接之轉殖基因： (1)  一對AAV ITR，較佳地，該AAV ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，且該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；更佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列；及 (2)  一對間隔序列，較佳地，該間隔序列具有SEQ ID NO:67及SEQ ID NO:68之核苷酸序列。
  24. 一種載體，其包含如請求項1至22中任一項之非天然存在的核酸分子；較佳地，該載體係質體；更佳地，該質體包含SEQ ID NO:12之核苷酸序列。
  25. 一種載體，其包含如請求項1至21或23中任一項之非天然存在的核酸分子；較佳地，該載體係質體；更佳地，該質體包含SEQ ID NO:70之核苷酸序列。
  26. 一種製造如請求項1至23中任一項之非天然存在的核酸分子之方法。
  27. 一種製造如請求項24或25之載體的方法。
  28. 一種細胞，其包含非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含經修飾腺相關病毒(AAV)rep 基因，該基因具有編碼四種Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52、及Rep40之AAVrep 基因及插入至由該等四種Rep蛋白共享之該rep 基因的編碼序列中的人工內含子，其中該人工內含子包含止擋匣，該止擋匣係插入在該人工內含子之5'剪接位點下游及分支位點上游，且該止擋匣以5'至3'的順序包含： (a)   具有與SEQ ID NO:7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attP 位點，較佳的是具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點； (b)   剪接受體； (c)   終止子；及 (d)   具有與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attB 位點，較佳的是具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點。
  29. 如請求項28之細胞，其中該剪接受體包含SEQ ID NO: 17之核苷酸序列。
  30. 如請求項28或29之細胞，其中該終止子包含多腺苷酸化信號。
  31. 如請求項30之細胞，其中該終止子進一步包含SEQ ID NO:19之核苷酸序列。
  32. 如請求項28至31中任一項之細胞，其中該止擋匣包含編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣。
  33. 如請求項28至32中任一項之細胞，其中該人工內含子以5'至3'的順序包含SEQ ID NO:14之核苷酸序列、該止擋匣、及SEQ ID NO:15之核苷酸序列。
  34. 如請求項28至32中任一項之細胞，其中該人工內含子以5'至3'的順序包含SEQ ID NO:14之核苷酸序列、該止擋匣、及SEQ ID NO:66之核苷酸序列。
  35. 如請求項28至33中任一項之細胞，其中該AAVrep 基因包含AAV1至AAV8中之一者、或其混合之rep 基因。
  36. 如請求項35之細胞，其中該AAVrep 基因包含人類AAV2之該rep 基因，該基因具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號190至2202。
  37. 如請求項36之細胞，其中該人工內含子係插入在GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號996至1905之間。
  38. 如請求項37之細胞，其中該人工內含子係直接插入在GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號1052、1061、1712、1906、1022、1112、1475、1514、1700、1742、1784或1340、較佳的是核苷酸編號1052的下游。
  39. 一種細胞，其包含非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含經修飾AAVrep 基因，該基因以5'至3'的順序包含： (a)   具有SEQ ID NO:55之核苷酸序列的AAVrep 基因之5'部分； (b)   人工內含子，其以5'至3'的順序包含： (i)     具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列的5'內含子片段； (ii)    止擋匣，其以5'至3'的順序包含： (1)  具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點； (2)  具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列的剪接受體； (3)  具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣； (4)  具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列的終止子；及 (5)  具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及 (iii)   具有SEQ ID NO:15之核苷酸序列的3'內含子片段；及 (c)   具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列的該AAVrep 基因之3'部分。
  40. 一種細胞，其包含非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含經修飾AAVrep 基因，該基因以5'至3'的順序包含： (a)   具有SEQ ID NO:73之核苷酸序列的AAVrep 基因之5'部分； (b)   人工內含子，其以5'至3'的順序包含： (i)     具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列的5'內含子片段； (ii)    止擋匣，其以5'至3'的順序包含： (1)  具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點； (2)  具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列的剪接受體； (3)  具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣； (4)  具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列的終止子；及 (5)  具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及 (iii)   具有SEQ ID NO:66之核苷酸序列的3'內含子片段；及 (c)   具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列的該AAVrep 基因之3'部分。
  41. 如請求項39或40之細胞，其中該止擋匣包含SEQ ID NO:16之核苷酸序列。
  42. 如請求項28至‎41中任一項之細胞，其進一步包含編碼三種殼體蛋白VP1、VP2及VP3之AAVcap 基因。
  43. 如請求項42之細胞，其中該AAVcap 基因包含AAV1至AAV9及AAVDJ中之一者、或其混合之cap 基因。
  44. 如請求項43之細胞，其中該AAVcap 基因包含具有GenBank存取號AY530579.1之核苷酸序列的人類AAV9之cap 基因。
  45. 如請求項43之細胞，其中AAVcap 基因包含AAV9的混合之cap 基因。
  46. 如請求項42至45之細胞，其中該AAVcap 基因進一步包含多腺苷酸化信號（較佳的是具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號4411至4466之AAV2的多腺苷酸化信號）及強化子（較佳的是具有GenBank存取號NC_001401.2之核苷酸序列的核苷酸編號190至313之AAV2rep P5啟動子），其中該多腺苷酸化信號及該強化子兩者皆係該cap 基因之該編碼序列的下游。
  47. 如請求項42至46中任一項之細胞，其進一步包含由該AAVcap 基因下游的一對AAV反向末端重複(ITR)側接之轉殖基因。
  48. 如請求項47之細胞，其進一步包含該經修飾AAVrep 基因上游的第一絕緣子及可選地由該等ITR側接之該轉殖基因下游的第二絕緣子，較佳地，該第一絕緣子及該第二絕緣子係獨立地選自由下列所組成之群組： (a)   具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列的人類抗抑制因子40； (b)   具有SEQ ID NO:25之核苷酸序列的小鼠抗抑制因子40； (c)   具有GenBank存取號AY190749.1之核苷酸序列的抗抑制因子04； (d)   具有GenBank存取號AY190750.1之核苷酸序列的抗抑制因子06； (e)   具有GenBank存取號AY190751.1之核苷酸序列的抗抑制因子07； (f)   具有GenBank存取號AY190752.1之核苷酸序列的抗抑制因子12； (g)   具有GenBank存取號AY190753.1之核苷酸序列的抗抑制因子13； (h)   具有GenBank存取號AY190754.1之核苷酸序列的抗抑制因子35； (i)    具有GenBank存取號AY190755.1之核苷酸序列的抗抑制因子36； (j)    具有GenBank存取號AY190757.1之核苷酸序列的抗抑制因子52； (k)   具有GenBank存取號AY190758.1之核苷酸序列的抗抑制因子53；及 (l)    來自在二或更多個拷貝中具有AY040835.1之核苷酸序列的球蛋白基因座之雞HS4絕緣子， 更佳地，該第一絕緣子及該第二絕緣子分別具有SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25之核苷酸序列。
  49. 如請求項48之細胞，其中該細胞包含該經修飾AAVrep 基因上游的該第一絕緣子，並且進一步分別包含該轉殖基因上游及下游的第一間隔序列及第二間隔序列，其中該第一間隔序列及該第二間隔序列係獨立地選自由下列所組成之群組： a)    SEQ ID NO:67之核苷酸序列；及 b)    SEQ ID NO:68之核苷酸序列。
  50. 如請求項47至49中任一項之細胞，其中該ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；較佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列。
  51. 一種細胞，其包含非天然存在的核酸分子，該核酸分子以5'至3'的順序包含： (A)  第一絕緣子，較佳地該第一絕緣子具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列； (B)   經修飾AAVrep 基因，其以5'至3'的順序包含： (i)    AAVrep 基因之5'部分，較佳地該AAVrep 基因之該5'部分具有SEQ ID NO:55之核苷酸序列； (ii)   人工內含子，其以5'至3'的順序包含： (a)   5'內含子片段，較佳地該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列； (b)   止擋匣，其以5'至3'的順序包含： (1)  具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點； (2)  剪接受體，較佳地該剪接受體具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列； (3)  編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣； (4)  終止子，較佳地該終止子具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列；及 (5)  具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及 (c)   3'內含子片段，較佳地該3'內含子片段具有SEQ ID NO:15之核苷酸序列； (iii)  該AAVrep 基因之3'部分，較佳地該AAVrep 基因之該3'部分具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列； (C)   AAVcap 基因，較佳地該AAVcap 基因包含SEQ ID NO:57之核苷酸序列； (D)  由一對AAV ITR側接之轉殖基因，較佳地，該AAV ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，且該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；更佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列；及 (E)   第二絕緣子，較佳地該第二絕緣子具有SEQ ID NO:25之核苷酸序列。
  52. 一種細胞，其包含非天然存在的核酸分子，該核酸分子以5'至3'的順序包含： (A)  第一絕緣子，較佳地該第一絕緣子具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列； (B)   經修飾AAVrep 基因，其以5'至3'的順序包含： (i)     AAVrep 基因之5'部分，較佳地該AAVrep 基因之該5'部分具有SEQ ID NO:73之核苷酸序列； (ii)    人工內含子，其以5'至3'的順序包含： (a)   5'內含子片段，較佳地該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列； (b)   止擋匣，其以5'至3'的順序包含： (1)   具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點； (2)   剪接受體，較佳地該剪接受體具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列； (3)   編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣； (4)   終止子，較佳地該終止子具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列；及 (5)   具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及 (c)   3'內含子片段，較佳地該3'內含子片段具有SEQ ID NO:66之核苷酸序列； (iii)   該AAVrep 基因之3'部分，較佳地該AAVrep 基因之該3'部分具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列； (C)   AAVcap 基因；及 (D)  由下列側接之轉殖基因： (i)     一對AAV ITR，較佳地，該AAV ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，且該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；更佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列；及 (ii)    一對間隔序列，較佳地，該間隔序列具有SEQ ID NO:67及SEQ ID NO:68之核苷酸序列。
  53. 如請求項28至51中任一項之細胞，其中該非天然存在的核酸分子係游離型(episomal)，其具有SEQ ID NO:12之核苷酸序列。
  54. 如請求項28至50或52中任一項之細胞，其中該非天然存在的核酸分子係游離型，其具有SEQ ID NO:70之核苷酸序列。
  55. 如請求項52至54中任一項之細胞，其進一步包含編碼重組酶之核酸分子，該重組酶具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的胺基酸序列；較佳地，該核酸包含與SEQ ID NO: 3之核苷酸序列至少85%、至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一的核苷酸序列；更佳地，該細胞包含重組ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5 (Ad5)病毒，該病毒編碼具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列的重組酶。
  56. 如請求項52至55中任一項之細胞，其進一步包含腺病毒E1A及E1B基因，較佳地該細胞係911細胞、pTG6559細胞、GH329細胞、N52.E6細胞、HeLa-E1細胞、UR細胞、VLI-293細胞、HEK293細胞、或PER.C6細胞。
  57. 一種生產包含轉殖基因之重組AAV的方法，其包含： (A)  獲得第一宿主細胞，其包含： (i)   經修飾AAVrep 基因，其以5'至3'的順序包含： (a)  AAVrep 基因之5'部分，較佳地該AAVrep 基因具有SEQ ID NO:55之核苷酸序列； (b)  人工內含子，其以5'至3'的順序包含： (1)   5'內含子片段，較佳地該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列； (2)   止擋匣，其以5'至3'的順序包含： (aa)  具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點； (bb)  剪接受體，較佳地該剪接受體具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列； (cc)  編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣； (dd)  終止子，較佳地該終止子具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列；及 (ee)  具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及 (3)   3'內含子片段，較佳地該3'內含子片段具有SEQ ID NO:15之核苷酸序列； (c)  該AAVrep 基因之3'部分，較佳地該AAVrep 基因之該3'部分具有SEQ ID NO:56之核苷酸序列； (ii)  AAVcap 基因，較佳地該AAVcap 基因包含SEQ ID NO:57之核苷酸序列；及 (iii) 由一對AAV ITR側接之該轉殖基因，較佳地，該ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；更佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列； (B)   將該第一宿主細胞用重組腺病毒感染，該重組腺病毒包含編碼具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的重組酶之重組酶基因，以獲得進一步含有該重組酶基因的第二宿主細胞； (C)   在生產包含該轉殖基因之該重組AAV的條件下使該第二宿主細胞生長；及 (D)  可選地收集該重組AAV。
  58. 一種生產包含轉殖基因之重組AAV的方法，其包含： (A)  獲得第一宿主細胞，其包含： (i)  經修飾AAVrep 基因，其以5'至3'的順序包含： (a)   AAVrep 基因之5'部分，較佳地該AAVrep 基因具有SEQ ID NO:73之核苷酸序列； (b)   人工內含子，其以5'至3'的順序包含： (1)  5'內含子片段，較佳地該5'內含子片段具有SEQ ID NO:14之核苷酸序列； (2)  止擋匣，其以5'至3'的順序包含： (aa)    具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點； (bb)   剪接受體，較佳地該剪接受體具有SEQ ID NO:17之核苷酸序列； (cc)    編碼可選擇標記之基因，較佳的是具有SEQ ID NO:18之核苷酸序列的新黴素磷酸轉移酶表現匣； (dd)   終止子，較佳地該終止子具有SEQ ID NO:19之核苷酸序列；及 (ee)    具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點；及 (3)  3'內含子片段，較佳地該3'內含子片段具有SEQ ID NO:66之核苷酸序列； (c)   該AAVrep 基因之3'部分，較佳地該AAVrep 基因之該3'部分具有SEQ ID NO:66之核苷酸序列； (ii)   AAVcap 基因；及 (iii)  該轉殖基因係由下列側接： (a)   一對AAV ITR，較佳地，該ITR具有SEQ ID NO:20之核苷酸序列，該轉殖基因包含可操作地連接至編碼序列的啟動子，且該編碼序列係可操作地連接的多腺苷酸化信號；更佳地，該啟動子具有SEQ ID NO:21之核苷酸序列且該多腺苷酸化信號具有SEQ ID NO:23之核苷酸序列；及 (b)   一對間隔序列，較佳地，該間隔序列具有SEQ ID NO:67及SEQ ID NO:68之核苷酸序列； (B)   將該第一宿主細胞用重組腺病毒感染，該重組腺病毒包含編碼具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的重組酶之重組酶基因，以獲得進一步含有該重組酶基因的第二宿主細胞； (C)   在生產包含該轉殖基因之該重組AAV的條件下使該第二宿主細胞生長；及 (D)  可選地收集該重組AAV。
  59. 如請求項57或58之方法，其中該第一宿主細胞進一步包含該經修飾AAVrep 基因上游的第一絕緣子及可選地由該等ITR側接之該轉殖基因下游的第二絕緣子，較佳地，該第一絕緣子及該第二絕緣子係獨立地選自由下列所組成之群組： (a)   具有SEQ ID NO:24之核苷酸序列的人類抗抑制因子40； (b)   具有SEQ ID NO:25之核苷酸序列的小鼠抗抑制因子40； (c)   具有GenBank存取號AY190749.1之核苷酸序列的抗抑制因子04； (d)   具有GenBank存取號AY190750.1之核苷酸序列的抗抑制因子06； (e)   具有GenBank存取號AY190751.1之核苷酸序列的抗抑制因子07； (f)   具有GenBank存取號AY190752.1之核苷酸序列的抗抑制因子12； (g)   具有GenBank存取號AY190753.1之核苷酸序列的抗抑制因子13； (h)   具有GenBank存取號AY190754.1之核苷酸序列的抗抑制因子35； (i)    具有GenBank存取號AY190755.1之核苷酸序列的抗抑制因子36； (j)    具有GenBank存取號AY190757.1之核苷酸序列的抗抑制因子52； (k)   具有GenBank存取號AY190758.1之核苷酸序列的抗抑制因子53；及 (l)    來自在二或更多個拷貝中具有AY040835.1之核苷酸序列的球蛋白基因座之雞HS4絕緣子， 更佳地，該第一絕緣子及該第二絕緣子分別具有SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25之核苷酸序列。
  60. 如請求項59之方法，其中該第一宿主細胞包含該經修飾AAVrep 基因上游的該第一絕緣子，並且進一步分別包含該轉殖基因上游及下游的第一間隔序列及第二間隔序列，其中該第一間隔序列及該第二間隔序列係獨立地選自由下列所組成之群組： a)    SEQ ID NO:67之核苷酸序列；及 b)    SEQ ID NO:68之核苷酸序列。
  61. 如請求項57至59中任一項之方法，其中該第一宿主細胞係藉由將一或多種核酸分子引入至細胞中而獲得，該等核酸分子包含該經修飾AAVrep 基因、該AAVcap 基因、由該等ITR側接之該轉殖基因、該第一絕緣子、及該第二絕緣子。
  62. 如請求項61之方法，其中該第一宿主細胞係藉由將核酸分子引入至該細胞中而獲得，該核酸分子以5'至3'的順序包含該第一絕緣子、該經修飾AAVrep 基因、該AAVcap 基因、由該等ITR側接之該轉殖基因、該第一絕緣子、及該第二絕緣子、較佳的是包含SEQ ID NO:12之核苷酸序列的質體。
  63. 如請求項57、58、或60之方法，其中該第一宿主細胞係藉由將一或多種核酸分子引入至細胞中而獲得，該等核酸分子包含該經修飾AAVrep 基因、該AAVcap 基因、由該等ITR側接之該轉殖基因、該第一絕緣子、該第一間隔序列、及該第二間隔序列。
  64. 如請求項63之方法，其中該第一宿主細胞係藉由將一或多種核酸分子引入至細胞中而獲得，該等核酸分子包含該經修飾AAVrep 基因、該AAVcap 基因、由該等ITR側接之該轉殖基因、該第一絕緣子、該第一間隔序列、及該第二間隔序列、較佳的是包含SEQ ID NO:70之核苷酸序列的質體。
  65. 如請求項57至62中任一項之方法，其中該重組腺病毒係重組ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5 (Ad5)病毒，該病毒包含SEQ ID NO:3之核苷酸序列。
  66. 如請求項57至65中任一項之方法，其中該宿主細胞包含腺病毒E1A及E1B基因，較佳地該宿主細胞係911細胞、pTG6559細胞、GH329細胞、N52.E6細胞、HeLa-E1細胞、UR細胞、VLI-293細胞、HEK293細胞、或PER.C6細胞。
  67. 如請求項57至66中任一項之方法，其中用於使該第二宿主細胞生長之該等條件包含用2-胺基嘌呤培養該第二細胞。
  68. 如請求項67之方法，其中該2-胺基嘌呤濃度係小於約1.25 mM。
  69. 如請求項67或68之方法，其中該2-胺基嘌呤濃度係約1 µM至約1.25 mM。
  70. 如請求項67或68之方法，其中該2-胺基嘌呤濃度係約10 µM至約1.25 mM。
  71. 如請求項67或68之方法，其中該2-胺基嘌呤濃度係約100 µM至約1.25 mM。
  72. 如請求項67或68之方法，其中該2-胺基嘌呤濃度係約1.25 mM。
  73. 如請求項67至72中任一項之方法，其中用2-胺基嘌呤培養該第二細胞係在用重組腺病毒感染該第一宿主細胞後約24小時起始。
  74. 一種組成物，其包含如請求項55之細胞、及2-胺基嘌呤。
  75. 如請求項74之組成物，其中該2-胺基嘌呤濃度係小於約1.25 mM。
  76. 如請求項74之組成物，其中該2-胺基嘌呤濃度係約1 µM至約1.25 mM。
  77. 如請求項74之組成物，其中該2-胺基嘌呤濃度為約10 µM至約1.25 mM。
  78. 如請求項74之組成物，其中該2-胺基嘌呤濃度為約100 µM至約1.25 mM。
  79. 如請求項74之組成物，其中該2-胺基嘌呤濃度係約1.25 mM。
  80. 一種非天然存在的核酸分子，其包含編碼絲胺酸重組酶之核苷酸序列，該絲胺酸重組酶具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。
  81. 如請求項74之非天然存在的核酸分子，其包含與SEQ ID NO:3之核苷酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。
  82. 一種載體，其包含如請求項80或81之非天然存在的核酸。
  83. 如請求項82之載體，其進一步包含啟動子，較佳的是可操作地連接至編碼該絲胺酸重組酶之核苷酸序列的巨細胞病毒(CMV)啟動子。
  84. 如請求項82或83之載體，其進一步包含多腺苷酸化信號，諸如猿猴病毒40 (SV40)多腺苷酸化信號，其可操作地連接至編碼該絲胺酸重組酶的該核苷酸序列。
  85. 如請求項82至84中任一項之載體，其係DNA質體。
  86. 如請求項82至85中任一項之載體，其係重組腺病毒載體。
  87. 如請求項86之載體，其係重組ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5 (Ad5)病毒，該病毒包含核苷酸序列，該核苷酸序列在CMV啟動子的控制下編碼具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列的絲胺酸重組酶，其中該核苷酸序列係進一步可操作地連接至SV40多腺苷酸化信號（NC_001669.1，nt 2550至2774）。
  88. 一種細胞，其包含非天然存在的核酸分子，該核酸分子包含編碼絲胺酸重組酶之核苷酸序列，該絲胺酸重組酶具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少85%、諸如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。
  89. 如請求項88之細胞，其包含與SEQ ID NO: 3之核苷酸序列至少85%、諸如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。
  90. 一種細胞，其包含載體，該載體包含如請求項88或89之非天然存在的核酸。
  91. 如請求項90之細胞，其進一步包含啟動子，較佳的是可操作地連接至編碼該絲胺酸重組酶之該核苷酸序列的巨細胞病毒(CMV)啟動子。
  92. 如請求項90或91之細胞，其進一步包含多腺苷酸化信號，諸如猿猴病毒40 (SV40)多腺苷酸化信號，其可操作地連接至編碼該絲胺酸重組酶的該核苷酸序列。
  93. 如請求項90至92之細胞，其中該載體係DNA質體。
  94. 如請求項90至93中任一項之細胞，其中該載體係重組腺病毒載體。
  95. 如請求項94之細胞，其中該重組腺病毒載體係重組ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5 (Ad5)病毒，該病毒包含核苷酸序列，該核苷酸序列在CMV啟動子的控制下編碼具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列的絲胺酸重組酶，其中該核苷酸序列係進一步可操作地連接至SV40多腺苷酸化信號（NC_001669.1，nt 2550至2774）。
  96. 如請求項88至95之細胞，其包含腺病毒E1A及E1B基因，較佳地該細胞係911細胞、pTG6559細胞、GH329細胞、N52.E6細胞、HeLa-E1細胞、UR細胞、VLI-293細胞、HEK293細胞、或PER.C6細胞。
  97. 一種在細胞中進行位點特異性重組的方法，其包含： (a)   獲得包含核酸分子的細胞，該核酸分子具有與SEQ ID NO:7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attP 位點（較佳的是具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點）及與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attB 位點（較佳的是具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點）； (b)   將非天然存在的核酸分子引入至該細胞中，該核酸分子編碼具有與SEQ ID NO:2至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的絲胺酸重組酶；及 (c)   在使該絲胺酸重組酶催化在該等attP 與attB 位點之間該位點特異性重組的條件下使該細胞生長。
  98. 一種藉由在細胞中進行位點特異性重組之程序所生產的產物，該程序包含： (a)   獲得包含核酸分子的細胞，該核酸分子具有與SEQ ID NO:7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attP 位點（較佳的是具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點）及與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attB 位點（較佳的是具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點）； (b)   將非天然存在的核酸分子引入至該細胞中，該核酸分子編碼具有與SEQ ID NO:2至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的絲胺酸重組酶；及 (c)    在使該絲胺酸重組酶催化在該等attP 與attB 位點之間該位點特異性重組的條件下使該細胞生長。
  99. 一種用於從細胞中獲得產物之程序，其包含： (a)   獲得包含核酸分子的細胞，該核酸分子具有與SEQ ID NO:7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attP 位點（較佳的是具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列的attP 位點）及與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的核苷酸序列的attB 位點（較佳的是具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之核苷酸序列的attB 位點）； (b)   將非天然存在的核酸分子引入至該細胞中，該核酸分子編碼具有與SEQ ID NO:2至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的絲胺酸重組酶； (c)   在使該絲胺酸重組酶催化在該等attP 與attB 位點之間該位點特異性重組的條件下生長該細胞；及 (d)   從該細胞中生產並回收產物。
  100. 一種非天然存在的系統，其包含： 用於經AAV介導之重組之手段，其中該手段可選地包含轉殖基因因子。
  101. 一種用於轉移如請求項100之非天然存在的系統之手段。
  102. 一種非天然存在的系統，其包含： 用於重組如請求項100之系統的重組手段，其中該重組手段包括在催化期間使用至少一種絲胺酸殘基。
  103. 一種用於轉移如請求項102之非天然存在的系統之手段。
  104. 一種用於製造分子之手段，其中該用於製造分子之手段包含如請求項100至103中任一項之手段並且能夠複製。
  105. 一種用於AAV介導之位點特異性重組之程序，其包含： (a)   用於執行獲得細胞的功能之步驟，其包含如請求項100之手段； (b)   在催化期間使用至少一種絲胺酸殘基以使位點特異性重組的條件下，用於執行使該細胞生長的功能之步驟。
  106. 如請求項105之用於AAV介導之位點特異性重組之程序，其包含獲得產物，其中可選地該產物係治療性產物。
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