KR20230122617A - Va-rna 수준이 낮은 생산자 세포 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포로서, AAV 캡시드 단백질인 VP1, VP2 및 VP3의 기능적 발현을 유지하면서 AAV 캡시드 단백질 VP1의 시작 코돈을 둘러싸는 단백질 키나아제 R(PKR) 활성화 서열이 불활성화되어 있는, 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 숙주 세포에서 상기 AAV를 발현시키는 단계를 포함하는, 아데노 관련 바이러스(AAV)의 생산 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포로서, AAV 캡시드 단백질인 VP1, VP2 및 VP3의 기능적 발현을 유지하면서 AAV 캡시드 단백질 VP1의 시작 코돈을 둘러싸는 단백질 키나아제 R(PKR) 활성화 서열이 불활성화되어 있는, 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포에서 상기 AAV를 발현시키는 단계를 포함하는, 아데노 관련 바이러스(AAV)의 생산 방법에 관한 것이다.
아데노 관련 바이러스(AAV)는 인간 및 몇몇의 다른 영장류 종을 감염시키는 작은 바이러스이다. 이들은 파르보바이러스(Parvoviridae)과의 디펜도파보바이러스(Dependoparvovirus) 속에 속한다. 이들은 작은(20nm) 복제 결함이 있고 외피가 없는 바이러스이다.
AAV는 현재 질병을 유발하는 것으로 알려져 있지 않으며 매우 약한 면역 반응만을 유발한다. 몇 가지 추가적 특징으로 인해, AAV는 유전자 치료를 위한 바이러스 벡터를 생성하고 및 동종 인간 질병 모델을 생성하기 위한 매력적인 후보가 된다. AAV를 사용하는 유전자 치료 벡터는 분열 세포와 분열 정지 세포 모두를 감염시킬 수 있으며 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않고 염색체외 상태로 지속될 수 있지만, 천연 바이러스에서는 바이러스를 통해 운반된 유전자가 숙주 게놈에 통합된다.
최근에는 AAV 유래 벡터를 기반으로 한 유전자 치료 임상시험뿐만 아니라 승인된 제품의 수가 급격히 증가하고 있다. 유전자 치료에서 AAV 벡터의 장점은 우수한 안전성 프로필, 위에서 언급한 비병원성, 이식유전자의 안정적인 발현, 및 분열 및 비분열 세포의 형질도입 가능성이다.
현재 재조합 AAV의 생산에는 많은 구성 요소가 필요하다. 일반적으로 AAV-게놈에 의해 암화화되는 레플리카제(Rep) 및 캡시드(Cap) 단백질이 재조합 바이러스 생산에 필요하며 트랜스(trans)로 공급된다. 헬퍼 유전자는 다양한 헬퍼 바이러스로부터 유래될 수 있으며, 가장 흔한 것은 아데노바이러스에서 유래된 헬퍼 바이러스 유전자인 E1 A, E1 B, E2A, E4orf6 및 VA RNA(바이러스 관련 RNA)이다. 또한, 역전된 말단 반복 서열(ITR)이 측면에 있는 관심 유전자(GOI)를 포함하는 전달 벡터가 필요하다.
오늘날의 AAV 기반 생산 시스템은 대부분 하기의 기법에 의존하지만 이 기법은 몇 가지 단점이 있다. 일시적 형질감염은 일반적으로 2- 또는 3-플라스미드 시스템(관심 유전자를 포함하는 전달 벡터, 아데노바이러스 헬퍼 기능이 있는 pHelper, 캡시드 및 레플리카제 기능을 제공하는 pAAV-Rep2CapX(CapX = 여러 AAV 혈청형의 캡시드 기능))을 필요로 한다. 그러나, 이러한 기법은 충분한 확장성(scalability), 견고성(robustness) 및 재현성이 부족하고 플라스미드 DNA에 대한 높은 비용을 수반한다. 이미 안정적으로 통합된 관심 유전자를 갖는 소위 생산자 세포주(producer cell line)는 대부분 HEK 또는 HeLa 세포를 기반으로 한다. 그러나 이러한 세포는 헬퍼 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스를 이용한 추가 감염을 필요로 한다. AAV 생산 동안 이러한 헬퍼 바이러스 추가는 우선 해당 헬퍼 바이러스의 생산, 최종 제품에서 헬퍼 바이러스를 제거하기 위한 생산된 AAV 벡터의 광범위한 정제, 및 헬퍼 바이러스의 부재를 확인하기 위한 많은 비용을 필요로 한다. 이는 단순 포진 바이러스(HSV) 기반 및 배큘로바이러스 기반 시스템에도 동일하게 적용되며, 이 중 후자는 추가로 충분한 확장성과 견고성이 부족하다.
AAV 생산에 필요한 모든 구성 요소가 세포에 안정적으로 통합되어 있는 완전히 안정적인 AAV 기반 생산자 세포주의 생산에는 다양한 어려움이 있다. 모든 헬퍼 기능을 세포에 통합하는 것은 어렵다. CAP 또는 HEK293 세포에서, E1 A 및 E1 B는 이미 구성적으로 발현된다. 헬퍼 기능인 E2A 및 E4orf6은 세포에 독성이 있다. 그러나, 이러한 헬퍼 기능은 유도성 프로모터로부터 발현될 수 있다. 이는 그 자신의 코딩 서열 내에 Pollll 프로모터가 있는 비코딩 VA RNA의 경우 더 어렵다. 따라서, 현재 VA RNA의 높은 발현 수준이 입증된 안정한 세포주는 없다.
VA RNA는 아데노바이러스에서 발견되는 비코딩 RNA이다. 이는 번역을 조절하는 역할을 한다. 이 RNA에는 VAI 또는 VA RNAI 및 VAII 또는 VA RNAII라고 하는 두 개의 카피가 있다. 이 두 VA RNA 유전자는 아데노바이러스 게놈에 있는 별개의 유전자이다. VA RNAI는 더 낮은 수준으로 발현되는 VA RNAII와 함께 주요 종이다. VAI는 E3 및 헥손(hexon)을 포함한 초기 및 후기 아데노바이러스 유전자의 번역을 자극한다. 일시적 형질감염 분석 결과 VAI는 리보좀 결합 전사체의 안정성을 증가시키는 것으로 확인되었다. 또한, VAI는 세포에서 처리되어, siRNA 또는 miRNA로 작용할 수 있는 22개 뉴클레오티드 길이의 RNA를 생성한다. 더욱이, VAI는 그렇지 않으면 진핵 개시 인자 2(elF2)를 인산화하게 되는 이중 가닥 RNA-활성화 단백질 키나아제 R에 대한 미끼(decoy) RNA로서 기능한다.
AAV와 관련하여, VA RNA는 고역가 AAV 생산에 중요하다. AAV 생산에서 VA RNA의 가장 잘 설명된 기능은 PKR 인산화/활성화 및 이에 따른 바이러스 단백질 발현의 감소로 이어지는 elF2alpha 인산화이다. elF2alpha는 사전 개시 복합체(pre-initiation complex)를 형성하도록 Met-tRNA 및 40S 리보솜에 결합함으로써 글로벌 번역을 조절하는 삼량체 진핵 개시 인자 2(elF2)의 서브유닛이다. 세린 51에서 인산화되면, 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)인 elF2B에 의해 elF2-결합 GDP가 GTP로 교환되는 것이 차단되어 단백질 합성이 억제된다. PKR은 VP1의 AUG를 둘러싸는 캡시드 유전자 RNA 리더 서열의 짧은 영역에 의해 활성화되는 것으로 확인되었다. 이 서열은 상류 rep 유전자에 내장된 p40 프로모터와 캡시드 유전자 사이에 있는 인트론의 일부이다. PKR 활성의 억제는 예를 들어 C형 간염 바이러스와 같은 다양한 바이러스의 감염 시 발생하는 일반적인 메커니즘이다.
이러한 맥락에서, Nayak 및 Pintel(Nayak, R. 및 Pintel, D.J.; Journal of Virology, 81(21); 2007; pp. 1 1908-1 1916)은 AAV 감염 주기 동안 VA RNA가 캡시드 발현에 어떻게 중요한지를 설명하고 있다. 즉, 캡시드 pre-mRNA가 PKR을 활성화하여 elF2a를 인산화하여 캡시드 단백질의 낮은 발현을 어떻게 유도하는 지를 설명하고 있다. 또한, 상기 문헌은 결실 실험에 의해 PKR 활성화 서열을 확인하고자 시도하고 있고 이를 VP1의 AUG 서열 주위의 약 200개의 뉴클레오티드로 좁히고 있다.
요약하면, 현재의 AAV 기반 생산 시스템은 재현성, 확장성 및 견고성의 측면에서 제한적이다. 또한, 헬퍼 바이러스에 대한 요구 사항으로 인해, 광범위한 정제 및 헬퍼 바이러스의 부재의 확인을 위한 많은 비용이 필요하다.
따라서, 본 발명의 근본적인 기술적 과제는 일시적 형질감염 또는 헬퍼 바이러스를 필요로 하지 않아서 높은 수준의 VA RNA 없이 AAV 유전자 치료 벡터의 산업적 및 확장가능한 생산을 가능하게 하는 AAV 벡터의 안정한 생산을 위한 확장가능한 시스템을 제공하는 것이다.
상기 기술적 문제에 대한 해결 방안은 청구범위에서 특징지어지는 구현예에 의해 달성된다.
특히, 제1 측면에서, 본 발명은 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포로서, AAV 캡시드 단백질인 VP1, VP2 및 VP3의 기능적 발현을 유지하면서 AAV 캡시드 단백질 VP1의 시작 코돈을 둘러싸는 단백질 키나아제 R(PKR) 활성화 서열이 불활성되어 있는, 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 AAV는 특정 AAV 혈청형으로 제한되지 않는다. 따라서, AAV는 아데노 관련 바이러스 혈청형 1(AAV1), AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAVDJ, AAVDJ8 및 AAVrh1O로부터 선택될 수 있다. 또한, AAV는 합성 혈청형, 예를 들어 상기 혈청형 중 2개 이상의 상이한 것들의 잡종, 또는 AAV 혈청형의 향성(tropism)을 변경시키는 상당한 돌연변이를 갖는 상기 혈청형 중 하나일 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서, AAV는 AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, 또는 AAV9이고, 바람직하게는 AAV8이다.
AAV 캡시드 단백질은 3개의 캡시드 단백질인 VP1, VP2 및 VP3을 포함하며, 이들 단백질은 p40으로 지정된 하나의 프로모터로부터 천연적으로 발현되고 cap 유전자에 의해 암호화된다. 이들 단백질의 분자량은 각각 87, 72 및 62kDa이다. AAV 캡시드는 1:1:10의 비율로 20면체 대칭으로 배열된 총 60개의 단량체인 VP1, VP2 및 VP3의 혼합물로 구성되며 추정 크기는 3.9 MDa이다.
세 개의 VP는 모두 하나의 mRNA로부터 번역된다. 프리(pre)-mRNA가 합성된 후, 2개의 수용체(acceptor) 위치에서 선택적 스플라이싱으로 인해 2가지 상이한 방식으로 스플라이싱될 수 있다(도 1). 일반적으로, 특히 아데노바이러스가 있는 경우, 두 번째 스플라이스 수용체 부위가 선호되며 소위 "주요 스플라이스"를 나타낸다. 이러한 형태에서는, VP1 단백질의 합성이 시작되는 첫 번째 AUG 코돈이 절단되어 VP1 단백질 합성의 전체 수준이 감소한다. 주요 스플라이스에 남아 있는 첫 번째 AUG 코돈은 VP3 단백질의 개시 코돈이다. 그러나, 동일한 오픈 리딩 프레임에서 그 코돈의 업스트림에는 최적의 Kozak 컨텍스트로 둘러싸인 ACG 서열(트레오닌을 암호화)이 있다. 이것은 추가적인 N 말단 잔기를 갖는 VP3 단백질로 구성된 VP2 단백질의 낮은 수준의 합성에 기여한다.
더 큰 인트론이 절단되는 것이 바람직하고 주요 스플라이스에서 ACG 코돈이 훨씬 더 약한 번역 개시 신호이기 때문에, AAV 구조 단백질이 생체 내에서 합성되는 비율은 약 1:1:10이며, 이는 성숙한 바이러스 입자에서의 것과 동일하다.
캡시드 단백질 프리-mRNA에서, p40 프로모터에 의해 전사된 인트론에 존재하는 VP1의 AUG를 둘러싸는 짧은 서열이 PKR을 활성화시킨다. 활성 PKR은 elF2a를 인산화하고, 인산화된 elF2a는 캡시드 단백질 발현을 억제하며, 전체 시스템은 조절 음성 피드백 루프를 구성한다. VA RNA는 PKR을 억제하며, 이는 AAV를 다량으로 발현하려고 시도할 때 높은 수준의 VA RNA가 필요함을 설명한다.
Nayak과 Pintel은 처음의 AUG를 둘러싸는 서열을 결실시킴으로써 VA RNA의 요구 사항을 없앨 수 있음을 확인하였다. 그러나, 이것은 또한 VP1 단백질의 발현의 손실을 초래한다. Nayak과 Pintel은 세 가지 캡시드 단백질 모두를 올바른 비율로 발현하는 해결 방안을 제안하지 않고 있다. 또한, 그들은 VA RNA 없이 AAV 생산을 위한 안정한 세포주를 생성하기 위해 이러한 관찰을 사용하는 것을 제안하지도 않고 있다.
VP1의 발현을 손실하지 않고 높은 VA RNA 수준의 필요성을 없애기 위해, 유리하게도 본 발명은 캡시드 프리-mRNA의 인트론을 암호화하는 서열을 부분적으로 대체, 특히 상기 인트론의 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 다른 기원의 인트론으로 대체함으로써 VP1, VP2 및 VP3의 기능적 발현을 유지하면서 VP1의 AUG를 둘러싸는 PKR-활성화 서열이 불활성화될 수 있음을 발견하였다.
바람직한 구현예에서, 상기 PKR-활성화 서열은 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터인 p40을 다른 프로모터로 대체하고 코딩 캡시드 서열 외부의 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 함유하는 p40 인트론의 일부를 다른 기원의 인트론으로 대체함으로써 불활성화된다. 바람직하게는, 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터로 대체되고, 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40 인트론은 부분적으로 대체, 즉, 캡시드 코딩 서열 외부에서 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 대체하는 SV40 인트론으로 대체된다(도 1). 그러나, SV40 인트론 외에도, 적합한 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위(최소 컨센서스 서열 GT/AG)를 제공하는 임의의 인트론이 대체 인트론 역할을 할 수 있다. 각각의 인트론은 당업계에 공지되어 있다. 합성 CAG 프로모터 인트론 또는 (인간) 베타-글로빈 인트론이다.
바람직한 구현예에서, 각각의 변형된 AAV 캡시드 서열은 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 제어하에 있는 AAV 레플리카제(Rep) 단백질을 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 아데노바이러스 E1A 및 E1B 단백질을 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
이와 관련하여, 상기 E1A 및 E1B 단백질은 바람직하게는 구성적으로 발현된다. 또한, 본 발명에 적합한 숙주 세포는 특별히 제한되지 않으며 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 구성적 E1A 및 E1B 발현을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 CAP 세포, HEK293 세포 또는 Per.C6 세포이다. 즉, 상기 숙주 세포는 모두 구성적 E1A 및 E1B 발현을 특징으로 하는 상기 세포주로부터 유래된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 제어하에 있는 아데노바이러스 E2A 및 E4orf6 단백질을 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
또한, 본 발명의 숙주 세포는 바람직하게는 하나 이상의 관심 유전자(GOI)를 함유하는 전달 벡터를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하며, 이들 유전자는 바람직하게는 AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)이 측면에 위치하여 있다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 GOI는 특별히 제한되지 않으며, AAV 벡터의 수용체 내로의 전달이 관심 대상인 임의의 유전자를 포함한다. 이들 유전자는 예를 들어, 안구 질환, 실명 질환, 근육 질환, 뒤시엔느 근이영양증, GM2 신경절결절증 및 척수소뇌 운동 실조증 유형, ALS, 헌팅톤병, X-연관 중증 복합 면역결핍증(X-SCID), 아데노신 데아미나제 결핍증(ADA-SCID), 중추신경계 질환, 파킨슨병, 알츠하이머병, 간질환, 간효소 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증, 레베르 선천성 흑암시, 혈우병, β-지중해빈혈, 암 질환, 두경부암, 전이성 흑색종, 심장질환, 폐질환 또는 낭포성 섬유증, 비스코트-알드리치 증후군(WAS), 이색성 백질이영양증(MLD), 중증 지단백 리파제 결핍 장애(LPLD) 감염 질환, 중증 복합 면역결핍 증후군, HIV 감염, 니만피크병 C형 및 오르니틴 트랜스카바밀라아제(OTC) 결핍을 포함한 희귀 질환의 치료를 위한 것이다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 유도성 프로모터는 특별히 제한되지 않으며 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 바람직한 구현예에서, AAV 캡시드 단백질의 발현을 제어하는 유도성 프로모터 및/또는 AAV 레플리카제 단백질의 발현을 제어하는 유도성 프로모터 및/또는 아데노바이러스 E2A 및 E4orf6 단백질의 발현을 제어하는 유도성 프로모터는 3세대 TRE3G-프로모터와 같은 tet-유도성 프로모터이다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 다른 유도성 프로모터로는 쿠메이트-유도성 프로모터, 타목시펜-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터, FKCsA-유도성 프로모터, ABA-유도성 프로모터, 리보스위치 제어형 프로모터, 열 쇼크 프로모터 또는 광 전환(light-switchable) 시스템이 있다. 이와 관련하여, 상기 단백질 중 하나 이상 또는 전부는 동일한 종류의 독립적인 프로모터의 제어하에 발현될 수 있다.
이와 관련하여, 대안적인 구현예에서, 구성적 발현을 위한 비유도성 프로모터도 당업계에 공지된 바와 같이 사용될 수 있다. 각각의 프로모터는 CMV, EF1알파, SV40, RSV, UbC, CAG, BOS 및 PGK 프로모터를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포에서, PKR-활성화 서열은 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40을 다른 프로모터로 대체하고 코딩 캡시드 서열 외부의 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 함유하는 p40 인트론의 일부를 다른 기원의 인트론으로 대체함으로써 불활성화되고, 이때 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40은 구성적 또는 유도성 프로모터, 바람직하게는 유도성 프로모터로 대체되고, 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40 인트론은 부분적으로 대체, 즉, 캡시드 코딩 서열 외부에서 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 대체하는 인트론, 바람직하게는 SV40 인트론으로 대체되고, 유도성 프로모터로부터 AAV 캡시드 단백질의 코딩 서열의 시작 코돈까지의 각각의 뉴클레오티드 서열은 하기 구조를 갖는다:
프로모터 - N1 - 인트론 - N2 - ATG
여기서
프로모터는 구성적 또는 유도성 프로모터, 바람직하게는 유도성 프로모터이고, N1은 1 내지 4000개 뉴클레오티드의 서열이고,
인트론은 최소 컨센서스 서열인 GT/AG를 갖는 적합한 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위를 제공하는 인트론으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인트론이고, N2는 1 내지 4000개 뉴클레오티드의 서열이고,
ATG는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열의 시작 코돈이다.
바람직하게는, 상기 구조에서, 프로모터는 CMV, EF1알파, SV40, RSV, UbC, CAG, BOS 및 PGK 프로모터로 구성된 그룹으로부터 선택되는 구성적 프로모터, 또는 3세대 TRE3G-프로모터와 같은 tet-유도 프로모터, 쿠메이트-유도성 프로모터, 타목시펜-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터, FKCsA-유도성 프로모터, ABA-유도성 프로모터, 리보스위치 제어형 프로모터, 및 열 쇼크 프로모터-구동 광-전환 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유도성 프로모터이고, 유도성 프로모터, 특히 tet-유도성 프로모터가 특히 바람직하다. 또한, 상기 구조에서, 인트론은 바람직하게는 SV40 인트론, 합성 CAG 프로모터 인트론 및 (인간) 베타-글로빈 인트론으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인트론이다. 또한, N1 및 N2는 서로 독립적으로 바람직하게는 1 내지 3000개, 보다 바람직하게는 1 내지 2000개, 보다 바람직하게는 1 내지 1000개, 보다 바람직하게는 1 내지 500개, 더욱 바람직하게는 1 내지 300개 뉴클레오티드의 서열이다. 추가의 구현에에서, N1 및 N2는 서로 독립적으로 바람직하게는 50 내지 250개, 또는 100 내지 200개 뉴클레오티드의 서열이다.
보다 구체적인 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포에서, PKR-활성화 서열은 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40을 다른 프로모터로 대체하고 코딩 캡시드 서열 외부의 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 함유하는 p40 인트론의 일부를 다른 기원의 인트론으로 대체함으로써 불활성화되고,
이때 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40은 유도성 프로모터로 대체되고, 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40 인트론은 부분적으로 대체, 즉, 캡시드 코딩 서열 외부에서 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 대체하는 SV40 인트론으로 대체되고,
유도성 프로모터로부터 AAV 캡시드 단백질의 코딩 서열의 시작 코돈까지의 각각의 뉴클레오티드 서열은 (i) 서열번호 4 또는 서열번호 5에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 (ii) 서열번호 4 또는 서열번호 5와 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열이고(단 상기 전제 조건은 상기 뉴클레오티드 서열에 적용됨),
서열번호 4 또는 서열번호 5의 마지막 3개 뉴클레오티드인 ATG는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열의 시작 코돈이다.
상기 나타낸 바와 같이, 상기 나타낸 특정 뉴클레오티드 서열과 서열 동일성을 갖는 핵산은 상기 특정 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오티드 서열은 상기 정의된 핵산과 적어도 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.2%, 98.4%, 98.6%, 98.8%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% , 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 이러한 핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오티드 결실, 삽입 및/또는 치환(교환)을 갖는다.
상기 정의된 바와 같은 핵산과 정의된 서열 동일성을 갖거나 상기 정의된 바와 같은 핵산과 특정 뉴클레오티드 결실, 삽입 및/또는 치환을 갖는 각각의 핵산은 임의의 종류의 프레임이동(frameshift) 돌연변이를 갖는 임의의 핵산을 제외한다.
또한, 상기 나타낸 특정 뉴클레오티드 서열과 특정 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 단백질의 맥락에서 상기 사용된 용어 "기능적"은 각각의 단백질이 특정 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질과 비교하여 동일하거나 적어도 충분한 활성 또는 기능을 가짐을 의미한다.
본 발명의 숙주 세포에 포함된 핵산은 유도성 프로모터, 폴리(A) 영역, 선택 마커, IRES 서열 및 강화 요소로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 요소를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 유도성 프로모터는 특별히 제한되지 않으며 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 3세대 TRE3G-프로모터와 같은 Tet-유도성 프로모터이다. 적합한 폴리(A) 영역은 특별히 제한되지 않으며 예를 들어 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, SV40 폴리(A) 영역이다. 적합한 선별 마커는 특별히 제한되지 않으며 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 블라스티시딘 또는 암피실린 내성 카세트와 같은 항생제 내성 카세트이다.
바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포에서, AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산, 및/또는 AAV 레플리카제 단백질을 암호화하는 핵산, 및/또는 아데노바이러스 E1A 및 E1B 단백질을 암호화하는 핵산, 및/또는 아데노바이러스 E2A 및 E4orf6 단백질을 암호화하는 핵산, 및/또는 GOI를 포함하는 전달 벡터를 암호화하는 핵산은 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합되어 있다.
바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 VA RNA를 발현하지 않거나, 단지 낮은 수준의 VA RNA를 발현한다. 예를 들어, 숙주 세포는 일시적 형질감염에 의해 달성되는 VA RNA 발현과 비교하여 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 100배, 보다 바람직하게는 적어도 1000배 감소된 VA RNA 발현 수준을 갖는다.
본 발명의 숙주 세포를 생성하는 방법, 즉, 본 발명의 핵산을 적합한 숙주 세포로 도입하는 방법은 특별히 제한되지 않으며 당업계에 공지되어 있다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 숙주 세포에서 AAV를 발현시키는 단계를 포함하는, 아데노 관련 바이러스(AAV)의 생산 방법에 관한 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 아데노 관련 바이러스(AAV)의 생산에서 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
AAV를 생성하기 위한 각각의 수단은 특별히 제한되지 않으며 당업계에 공지되어 있다.
구체적으로, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법 및 용도는 본 발명의 숙주 세포가 (i) AAV 캡시드 단백질을 발현하도록 하는 단계를 포함하고, 이때 본 발명에 따라, AAV 캡시드 단백질인 VP1, VP2 및 VP3의 기능적 발현을 유지하면서 AAV 캡시드 단백질 VP1의 시작 코돈을 둘러싸는 단백질 키나제 R(PKR) 활성화 서열이 불활성화되어 있다. 바람직하게는, VP1의 AUG를 둘러싸는 PKR-활성화 서열은 캡시드 프리-mRNA의 인트론을 부분적으로 대체, 특히 상기 인트론의 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 다른 기원의 인트론으로 대체함으로써 불활성화된다. 바람직한 구현예에서, 상기 PKR-활성화 서열은 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40을 다른 프로모터로 대체하고 코딩 캡시드 서열 외부의 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 함유하는 p40 인트론의 일부를 다른 인트론으로 대체함으로써 불활성화된다. 바람직하게는, 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40은 유도성 프로모터에 의해 대체되고/되거나, 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40 인트론은 부분적으로 대체, 캡시드 코딩 서열 외부에서 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 대체하는 SV40 인트론으로 대체된다(도 1). 그러나, SV40 인트론 외에도, 적합한 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 (최소 컨센서스 서열 GT/AG)를 제공하는 임의의 인트론이 대체 인트론 역할을 할 수 있다. 각각의 인트론은 당업계에 공지되어 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법 및 용도에 사용되는 숙주 세포는 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합된 AAV ITR이 측면에 있는 하나 이상의 GOI를 함유하는 전달 벡터를 추가로 갖는다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 본 발명의 방법 및 용도 과정 동안 VA RNA를 발현하지 않거나, 상기 정의된 바와 같이 낮은 수준의 VA RNA만을 발현한다.
구체적으로, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법 및 용도는 상기 기술된 바와 같이 AAV 입자를 생성하고, 숙주 세포를 롤러-병(roller-bottle), 세포-스택(cell-stack) 또는 고정층 생물반응기에서 부착 배양하거나, 숙주 세포를 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지를 사용하여 교반 탱크 생물 반응기, 웨이브(wave) 또는 백(bag) 배양 시스템에서 부유 상태로 배양하는 것을 포함한다. 생산 규모는 중간 범위의 밀리리터 범위의 작은 부피로부터 생산 실행(run)당 2000L 또는 20,000L의 대규모 부피까지 다양할 수 있다. 공정 유형은 추가의 공급 물질을 추가하지 않는 것을 의미하는 배치 실행(batch run) 또는 볼루스(bolus) 또는 연속적 공급물 추가가 있는 유가식 실행일 수 있다.
생존 가능한 세포 밀도와 같은 최대 역가 공정 매개변수를 달성하기 위해, 온도, 교반 속도, 속도, pH 및 삼투압이 생산 공정 동안에 변경될 수 있다. 또한, 특정 아미노산, 당류, 유기산, 보조인자, 비타민, 미네랄 또는 기타 요소의 고갈을 피하기 위해 부족한 성분을 세포 배양액에 보충하는 것이 생산 공정의 일부일 수 있다.
본 발명의 숙주 세포에서 각각의 단백질을 발현시키기 위한 수단은 특별히 제한되지 않으며 당업계에 공지되어 있다. 이들은 예를 들어 적합한 유도제(inducer)의 첨가에 의해 유도성 프로모터를 유도하는 것을 포함한다.
본 발명의 제1 측면에 대해 정의된 모든 정의 및 제한은 본 발명의 제2 및 제3 측면에 동일하게 적용된다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하는"/"포함한다"는 명시적으로 "..로 본질적으로 구성되는"/"..로 본질적으로 구선된다" 및 "..로 구성되는"/"..로 구성된다"라는 용어를 포함한다. 즉, 상기 용어 모두는 서로 교환 가능하다.
본 발명에서, AAV 캡시드 서열의 변형은 VA RNA 발현 수준이 매우 낮거나 전혀 없는 안정한 생산자 세포주를 가능하게 한다. 안정적인 AAV 생산자 세포주는 레플리카제, 헬퍼 및 캡시드 기능을 충분한 방식으로 발현해야 한다. 단백질 기능은 유도성 프로모터의 제어하에서 유도성이 될 수 있다.
특히, 본 발명은, 예를 들어 rep 및 cap을 분리하고 다른 인트론을 도입함으로써 VP 단백질의 발현 패턴을 수정하는 동시에 유지하는 방식으로 PKR 활성화 서열을 함유하는 200개의 뉴클레오티드 영역을 변형시키는 방법을 유리하게 확인하였다. 따라서, 높은 역가의 rAAV를 생성할 수 있도록 낮은 수준의 VA RNA를 발현하는 안정한 세포주에서 변형된 서열을 사용하는 것이 가능하다.
높은 수준의 VA RNA의 필요성을 회피하기 위해, 내인성 p40 프로모터는 다른 프로모터로 대체되고, 단백질 키나아제 R(PKR)을 활성화시키는 서열을 포함하는 인트론의 일부는 다른 인트론, 예를 들어, SV40, 베타-글로빈, 키메라 인트론으로 대체되어, VP 단백질의 올바른 비율을 유지하는 동시에 PKR을 활성화하지 않게 되어 높은 수준의 AAV 벡터 생산에 VA RNA가 거의 또는 전혀 필요하지 않게 된다.
이는 재현 가능하고 일관된 생성물 품질, 뛰어난 확장성, 비용 효율적인 생산, 헬퍼 바이러스의 필요성의 없음 및 더 큰 배치(batch)의 생산을 유리하게 제공한다.
도면은 다음을 나타낸다:
도 1:
p40 인트론이 있는 p40 프로모터 영역을 보여주는 캡시드 유전자좌의 개략도(SD: 스플라이스 공여체 부위, SA1: 스플라이스 수용체 부위 1, SA2: 스플라이스 수용체 부위 2). 위쪽 그림은 야생형 구성을 보여준다. 대체된 서열을 나타내는 수정된 버전의 아래. 이 경우 SD 및 SA1은 SV40 인트론에 의해 제공된다. 프로모터는 CMV와 같은 구성적 프로모터이거나 TRE3G와 같은 유도성일 수 있다.
도 2:
VA RNA가 플라스미드 상에 암호화된 일시적 형질감염을 통해 도입되는 일시적 접근법과 비교하여, VA RNA를 포함하는 안정적으로 통합된 핵산을 포함하는 안정한 CAP 프리-패키징(pre-packaging) 세포주 Z3081에서의 VA RNA 수준. 안정적으로 통합된 VA RNA가 있는 세포는 일시적 접근법과 비교할 때 최대 3 로그 감소된 VA RNA 양을 발현한다.
도 3:
빈 벡터 또는 추가적인 VA RNA와 함께 p40 프로모터 또는 SV40 인트론(TRE3G/SV40 인트론)이 있는 변형된 프로모터를 갖는 캡시드 작제물의 형질감염시 안정한 CAP 프리-패키징 SCC(단일 세포 클론)에서 AAV8 캡시드 단백질의 발현. 형질감염 5시간 후 세포를 1 mg/L 독시사이클린으로 처리하여 rep, E2A 및 E4orf6 단백질의 발현을 유도하였다. 항-VP1/VP2/VP3 항체(Progen사)를 사용하여 형질감염 3일 후 일시적으로 형질감염된 프리-패키징 세포의 세포 용해물에서 단백질 수준을 검출하였다.
도 4:
빈 벡터(eV) 또는 추가적인 VA RNA와 함께 SV40 인트론을 갖는 변형된 TRE3G 프로모터 또는 p40 프로모터를 갖는 AAV8 캡시드 작제물의 형질감염시 안정한 CAP 프리-패키징 SCC에서 PKR의 활성화 및 elF2a의 인산화. 형질감염 5시간 후 세포를 1 mg/L 독시사이클린으로 처리하여 안정적으로 통합된 레플리카제, E2A 및 E4ORF6 단백질의 발현을 유도하였다. 항-VP1/VP2/VP3 항체(Progen사), 항-Phospho-PKR 항체(Abeam사), 항-elF2a(Cell Signaling사) 및 로딩 대조군인 항-히스톤 H3 항체(Abeam사)를 사용하여 형질감염 3일 후 일시적으로 형질감염된 CAP 사전패키징 세포의 세포 용해물에서 단백질 수준을 검출하였다. 대조군으로서, 빈 벡터로 형질감염된 세포의 세포 용해물이 포함되었다.
도 5:
조립된 캡시드(AAV8)에 대한 ELISA. 프리-패키징 HEK293 기반 단일 세포 클론을 변형된 AAV8 캡시드 작제물(TRE3G/SV40 인트론) 또는 AAV8 p40 인트론(AAV8 또는 AAV2) 캡시드 작제물(TRE3G/p40 인트론) 및 ITR이 측면에 있는 AAV GOI 작제물(GFP)로 형질감염시켰다. p40 인트론 작제물의 경우, VA RNA 작제물과 함께 추가의 형질감염을 수행하였다. 형질감염 5시간 후 세포를 1 mg/L 독시사이클린으로 유도하였다. 형질감염 3일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 제조사의 지침에 따라 AAV8 Progen 캡시드 ELISA를 사용하여 캡시드 발현에 대해 분석했다. 이러한 ELISA는 완전히 조립된 바이러스 입자만을 검출했다. 추가의 VA-RNA가 없는 TRE3G/SV40 인트론 작제물의 경우 1012 입자/mL에 가까운 높은 수준의 조립된 캡시드가 검출되었지만, TRE3G I p40 인트론 작제물의 경우 추가의 VA-RNA의 동시 형질감염 시에만 검출되었다.
도 6:
조립된 캡시드(AAV8)에 대한 ELISA. 프리-패키징 CAP 기반 단일 세포 클론을 변형된 AAV8 캡시드 작제물(TRE3G/SV40 인트론) 또는 AAV8 p40 인트론(AAV8) 캡시드 작제물(TRE3G I p40 인트론) 및 ITR이 측면에 있는 AAV GOI 작제물(GFP)로 형질감염시켰다. p40 작제물의 경우 VA RNA 작제물과 함께 추가 형질감염을 수행하였다. 형질감염 5시간 후 세포를 1 mg/L 독시사이클린으로 유도하였다. 형질감염 3일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 제조사의 지침에 따라 AAV8 Progen 캡시드 ELISA를 사용하여 캡시드 발현에 대해 분석하였다. 이러한 ELISA는 완전히 조립된 바이러스 입자만을 검출했다. 추가의 VA-RNA가 없는 TRE3G/SV40 인트론 작제물의 경우 1012 입자/mL에 가까운 높은 수준의 조립된 캡시드가 검출되었지만, TRE3G/p40 인트론 작제물의 경우 추가의 VA-RNA의 동시형질감염 시에만 검출되었다.
도 7:
변형된 TRE3G/SV40 인트론 및 TRE3G/p40-인트론(AAV2 및 AAV8) 캡시드 작제물을 사용한 HEK293 기반 프리-패키징 SCC에서 rAAV8-GFP 생산의 qPCR 분석. HEK293 기반 프리-패키징 SCC는 변형된 캡시드 작제물(TRE3G/SV40 인트론) 또는 p40 인트론(TRE3G/p40 인트론 AAV8 또는 AAV2 유래) 캡시드 작제물 및 AAV2 ITR이 측면에 있는 GOI 작제물(GFP)로 형질감염시켰다. p40 인트론(TRE3G/p40 인트론) 캡시드 작제물의 경우, 생산성에 미치는 VARNA의 영향을 분석하기 위해 VA-RNA 유무에 관계없이 두 번의 형질감염을 수행했다. 형질감염 발현 5시간 후, 안정적으로 통합된 레플리카제의 발현 및 헬퍼 기능은 1 mg/L 독시사이클린에 의해 유도하였다. 형질감염 3일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 SV40 PolyA 지정(directed) 프라이머/프로브를 사용하여 qPCR을 통해 패키징된 바이러스 게놈에 대해 분석하였다.
도 8:
변형된 TRE3G/SV40 인트론 및 TRE3G/p40-인트론(AAV8) 캡시드 작제물을 사용한 CAP 기반 프리-패키징 SCC에서 rAAV8-GFP 생산의 qPCR 분석. CAP 기반 프리-패키징 SCC는 변형된 캡시드 작제물(TRE3G I SV40 인트론) 또는 p40 인트론(TRE3G I p40 인트론) 캡시드 작제물 및 AAV2 ITR가 측면에 있는 GOI 작제물(GFP)로 형질감염시켰다. p40 인트론(TRE3G I p40 인트론) 캡시드 작제물의 경우, 생산성에 미치는 VA-RNA의 영향을 분석하기 위해 VA-RNA 유무에 관계없이 두 번의 형질감염을 수행하였다. 형질감염 5시간 후, 안정적으로 통합된 레플리카제의 발현 및 헬퍼 기능은 1 mg/L 독시사이클린에 의해 유도하였다. 형질감염 3일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 GFP 지정 프라이머/프로브를 사용하여 qPCR을 통해 패키징된 바이러스 게놈에 대해 분석하였다.
도 9:
변형된 CMV I SV40 인트론 작제물을 사용한 안정한 CAP 프리-패키징 SCC에서 AAV8 캡시드 단백질의 발현. 프리-패키징 SCC#1을 Gol 함유 전달 작제물로서 GFP와 함께 CMV/SV40 인트론 변형된 캡시드 작제물로 형질감염시키고 형질감염 5시간 후 독시사이클린으로 유도하였다. 항-VP1/VP2/VP3 항체(Progen사)를 사용하여 형질감염 4일 후 일시적으로 형질감염된 CAP 프리-패키징 세포의 세포 용해물(P = 펠릿) 및 상층액(SN)에서 단백질 수준을 검출하였다.
도 10:
조립된 캡시드(AAV8)에 대한 ELISA. 3개의 상이한 프리-패키징 CAP 단일 세포 클론(SCC#1, SCC#2, SCC#3)을 변형된 AAV8 캡시드 작제물(CMV I SV40 인트론) 및 ITR이 측면에 있는 AAV GOI 작제물(GFP)로 형질감염시켰다. 형질감염 5시간 후 세포를 1 mg/L 독시사이클린으로 유도하였다. 형질감염 3일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 제조사의 지침에 따라 AAV8 Progen 캡시드 ELISA를 사용하여 캡시드 발현에 대해 분석하였다. 이러한 ELISA는 완전히 조립된 바이러스 입자만을 검출했다. 1011 입자/mL 이상의 높은 수준의 조립된 캡시드가 검출되었다.
도 11:
변형된 CMV I SV40 인트론 캡시드 작제물을 사용한 프리-패키징 SCC(SCC#1, SCC#2, SCC#3)에서 rAAV8-GFP 생산의 qPCR 분석. 3개의 상이한 프리-패키징 SCC를 변형된 캡시드 작제물(CMV I SV40 인트론) 및 AAV2 ITR이 측면에 있는 GOI 작제물(GFP)로 형질감염시켰다. 형질감염 5시간 후, 안정적으로 통합된 레플리카제의 발현 및 헬퍼 기능은 1 mg/L 독시사이클린에 의해 유도하였다. 형질감염 3일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 SV40 PolyA 지정 프라이머/프로브를 사용하여 qPCR을 통해 패키징된 바이러스 게놈에 대해 분석하였다.
도 12:
프리-패키징 SCC #1에서 유래된 물질을 사용한 형질도입 분석. 간략하게 말해서, 형질감염된 프리-패키징 SCC#1로부터의 세포 현탁액을 동결-해동 사이클에 의해 용해시키고 HEK293T 세포의 형질도입에 사용하였다. 형질도입 48시간 후, GFP 양성 HEK293T 세포의 측정에 의해 형질도입을 모니터링하였다.
도 13:
독시사이클린 유도 시 SV40 인트론뿐만 아니라 변형된 유도성 프로모터를 함유하는 캡시드 작제물, 헬퍼 기능 및 안정적으로 통합된 유도성 레플리카제를 손상시키는(compromising) 안정한 패키징 풀(packaging pool) Z3189 유래의 세포 용해물에서 정확한 화학량론으로 캡시드 발현(AAV8)을 나타내는 웨스턴 블롯. 패키징 풀에서 매우 낮은 수준의 VA RNA에도 불구하고, VP1:VP2:VP3에 대해 대략 1:1:10의 정확한 화학량론에서 캡시드 단백질이 생성된다.
도 14:
선택된 CAP rAAV8-GFP 생산자 단일 세포 클론의 바이러스 게놈 생산. 안정적으로 통합된 레플리카제, E2A, E4ORF6, VA RNA, 변형된 캡시드 작제물(유도성 프로모터/SV40 인트론) 및 ITR이 측면에 있는 GOI를 손상시키는 CAP rAAV8 GFP 생산자 SCC에서 AAV 생산은 독시사이클린의 첨가에 의해 유도하였다. 유도 7일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 SV40 PolyA 지정 프라이머/프로브를 사용하여 qPCR을 통해 패키징된 바이러스 게놈에 대해 분석하였다.
도 15:
선택된 CAP rAAV8-GFP 생산자 단일 세포 클론의 AAV8-ELISA 분석. 안정적으로 통합된 레플리카제, E2A, E4ORF6, VA RNA, 변형된 캡시드 작제물 및 ITR이 측면에 있는 GOI를 손상시키는 CAP rAAV8 GFP 생산자 SCC에서의 AAV 생산은 독시사이클린의 첨가에 의해 유도하였다. 유도 7일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 제조사의 지침에 따라 AAV8-ELISA(Progen사)를 사용하여 조립된 캡시드에 대해 분석하였다.
도 1:
p40 인트론이 있는 p40 프로모터 영역을 보여주는 캡시드 유전자좌의 개략도(SD: 스플라이스 공여체 부위, SA1: 스플라이스 수용체 부위 1, SA2: 스플라이스 수용체 부위 2). 위쪽 그림은 야생형 구성을 보여준다. 대체된 서열을 나타내는 수정된 버전의 아래. 이 경우 SD 및 SA1은 SV40 인트론에 의해 제공된다. 프로모터는 CMV와 같은 구성적 프로모터이거나 TRE3G와 같은 유도성일 수 있다.
도 2:
VA RNA가 플라스미드 상에 암호화된 일시적 형질감염을 통해 도입되는 일시적 접근법과 비교하여, VA RNA를 포함하는 안정적으로 통합된 핵산을 포함하는 안정한 CAP 프리-패키징(pre-packaging) 세포주 Z3081에서의 VA RNA 수준. 안정적으로 통합된 VA RNA가 있는 세포는 일시적 접근법과 비교할 때 최대 3 로그 감소된 VA RNA 양을 발현한다.
도 3:
빈 벡터 또는 추가적인 VA RNA와 함께 p40 프로모터 또는 SV40 인트론(TRE3G/SV40 인트론)이 있는 변형된 프로모터를 갖는 캡시드 작제물의 형질감염시 안정한 CAP 프리-패키징 SCC(단일 세포 클론)에서 AAV8 캡시드 단백질의 발현. 형질감염 5시간 후 세포를 1 mg/L 독시사이클린으로 처리하여 rep, E2A 및 E4orf6 단백질의 발현을 유도하였다. 항-VP1/VP2/VP3 항체(Progen사)를 사용하여 형질감염 3일 후 일시적으로 형질감염된 프리-패키징 세포의 세포 용해물에서 단백질 수준을 검출하였다.
도 4:
빈 벡터(eV) 또는 추가적인 VA RNA와 함께 SV40 인트론을 갖는 변형된 TRE3G 프로모터 또는 p40 프로모터를 갖는 AAV8 캡시드 작제물의 형질감염시 안정한 CAP 프리-패키징 SCC에서 PKR의 활성화 및 elF2a의 인산화. 형질감염 5시간 후 세포를 1 mg/L 독시사이클린으로 처리하여 안정적으로 통합된 레플리카제, E2A 및 E4ORF6 단백질의 발현을 유도하였다. 항-VP1/VP2/VP3 항체(Progen사), 항-Phospho-PKR 항체(Abeam사), 항-elF2a(Cell Signaling사) 및 로딩 대조군인 항-히스톤 H3 항체(Abeam사)를 사용하여 형질감염 3일 후 일시적으로 형질감염된 CAP 사전패키징 세포의 세포 용해물에서 단백질 수준을 검출하였다. 대조군으로서, 빈 벡터로 형질감염된 세포의 세포 용해물이 포함되었다.
도 5:
조립된 캡시드(AAV8)에 대한 ELISA. 프리-패키징 HEK293 기반 단일 세포 클론을 변형된 AAV8 캡시드 작제물(TRE3G/SV40 인트론) 또는 AAV8 p40 인트론(AAV8 또는 AAV2) 캡시드 작제물(TRE3G/p40 인트론) 및 ITR이 측면에 있는 AAV GOI 작제물(GFP)로 형질감염시켰다. p40 인트론 작제물의 경우, VA RNA 작제물과 함께 추가의 형질감염을 수행하였다. 형질감염 5시간 후 세포를 1 mg/L 독시사이클린으로 유도하였다. 형질감염 3일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 제조사의 지침에 따라 AAV8 Progen 캡시드 ELISA를 사용하여 캡시드 발현에 대해 분석했다. 이러한 ELISA는 완전히 조립된 바이러스 입자만을 검출했다. 추가의 VA-RNA가 없는 TRE3G/SV40 인트론 작제물의 경우 1012 입자/mL에 가까운 높은 수준의 조립된 캡시드가 검출되었지만, TRE3G I p40 인트론 작제물의 경우 추가의 VA-RNA의 동시 형질감염 시에만 검출되었다.
도 6:
조립된 캡시드(AAV8)에 대한 ELISA. 프리-패키징 CAP 기반 단일 세포 클론을 변형된 AAV8 캡시드 작제물(TRE3G/SV40 인트론) 또는 AAV8 p40 인트론(AAV8) 캡시드 작제물(TRE3G I p40 인트론) 및 ITR이 측면에 있는 AAV GOI 작제물(GFP)로 형질감염시켰다. p40 작제물의 경우 VA RNA 작제물과 함께 추가 형질감염을 수행하였다. 형질감염 5시간 후 세포를 1 mg/L 독시사이클린으로 유도하였다. 형질감염 3일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 제조사의 지침에 따라 AAV8 Progen 캡시드 ELISA를 사용하여 캡시드 발현에 대해 분석하였다. 이러한 ELISA는 완전히 조립된 바이러스 입자만을 검출했다. 추가의 VA-RNA가 없는 TRE3G/SV40 인트론 작제물의 경우 1012 입자/mL에 가까운 높은 수준의 조립된 캡시드가 검출되었지만, TRE3G/p40 인트론 작제물의 경우 추가의 VA-RNA의 동시형질감염 시에만 검출되었다.
도 7:
변형된 TRE3G/SV40 인트론 및 TRE3G/p40-인트론(AAV2 및 AAV8) 캡시드 작제물을 사용한 HEK293 기반 프리-패키징 SCC에서 rAAV8-GFP 생산의 qPCR 분석. HEK293 기반 프리-패키징 SCC는 변형된 캡시드 작제물(TRE3G/SV40 인트론) 또는 p40 인트론(TRE3G/p40 인트론 AAV8 또는 AAV2 유래) 캡시드 작제물 및 AAV2 ITR이 측면에 있는 GOI 작제물(GFP)로 형질감염시켰다. p40 인트론(TRE3G/p40 인트론) 캡시드 작제물의 경우, 생산성에 미치는 VARNA의 영향을 분석하기 위해 VA-RNA 유무에 관계없이 두 번의 형질감염을 수행했다. 형질감염 발현 5시간 후, 안정적으로 통합된 레플리카제의 발현 및 헬퍼 기능은 1 mg/L 독시사이클린에 의해 유도하였다. 형질감염 3일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 SV40 PolyA 지정(directed) 프라이머/프로브를 사용하여 qPCR을 통해 패키징된 바이러스 게놈에 대해 분석하였다.
도 8:
변형된 TRE3G/SV40 인트론 및 TRE3G/p40-인트론(AAV8) 캡시드 작제물을 사용한 CAP 기반 프리-패키징 SCC에서 rAAV8-GFP 생산의 qPCR 분석. CAP 기반 프리-패키징 SCC는 변형된 캡시드 작제물(TRE3G I SV40 인트론) 또는 p40 인트론(TRE3G I p40 인트론) 캡시드 작제물 및 AAV2 ITR가 측면에 있는 GOI 작제물(GFP)로 형질감염시켰다. p40 인트론(TRE3G I p40 인트론) 캡시드 작제물의 경우, 생산성에 미치는 VA-RNA의 영향을 분석하기 위해 VA-RNA 유무에 관계없이 두 번의 형질감염을 수행하였다. 형질감염 5시간 후, 안정적으로 통합된 레플리카제의 발현 및 헬퍼 기능은 1 mg/L 독시사이클린에 의해 유도하였다. 형질감염 3일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 GFP 지정 프라이머/프로브를 사용하여 qPCR을 통해 패키징된 바이러스 게놈에 대해 분석하였다.
도 9:
변형된 CMV I SV40 인트론 작제물을 사용한 안정한 CAP 프리-패키징 SCC에서 AAV8 캡시드 단백질의 발현. 프리-패키징 SCC#1을 Gol 함유 전달 작제물로서 GFP와 함께 CMV/SV40 인트론 변형된 캡시드 작제물로 형질감염시키고 형질감염 5시간 후 독시사이클린으로 유도하였다. 항-VP1/VP2/VP3 항체(Progen사)를 사용하여 형질감염 4일 후 일시적으로 형질감염된 CAP 프리-패키징 세포의 세포 용해물(P = 펠릿) 및 상층액(SN)에서 단백질 수준을 검출하였다.
도 10:
조립된 캡시드(AAV8)에 대한 ELISA. 3개의 상이한 프리-패키징 CAP 단일 세포 클론(SCC#1, SCC#2, SCC#3)을 변형된 AAV8 캡시드 작제물(CMV I SV40 인트론) 및 ITR이 측면에 있는 AAV GOI 작제물(GFP)로 형질감염시켰다. 형질감염 5시간 후 세포를 1 mg/L 독시사이클린으로 유도하였다. 형질감염 3일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 제조사의 지침에 따라 AAV8 Progen 캡시드 ELISA를 사용하여 캡시드 발현에 대해 분석하였다. 이러한 ELISA는 완전히 조립된 바이러스 입자만을 검출했다. 1011 입자/mL 이상의 높은 수준의 조립된 캡시드가 검출되었다.
도 11:
변형된 CMV I SV40 인트론 캡시드 작제물을 사용한 프리-패키징 SCC(SCC#1, SCC#2, SCC#3)에서 rAAV8-GFP 생산의 qPCR 분석. 3개의 상이한 프리-패키징 SCC를 변형된 캡시드 작제물(CMV I SV40 인트론) 및 AAV2 ITR이 측면에 있는 GOI 작제물(GFP)로 형질감염시켰다. 형질감염 5시간 후, 안정적으로 통합된 레플리카제의 발현 및 헬퍼 기능은 1 mg/L 독시사이클린에 의해 유도하였다. 형질감염 3일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 SV40 PolyA 지정 프라이머/프로브를 사용하여 qPCR을 통해 패키징된 바이러스 게놈에 대해 분석하였다.
도 12:
프리-패키징 SCC #1에서 유래된 물질을 사용한 형질도입 분석. 간략하게 말해서, 형질감염된 프리-패키징 SCC#1로부터의 세포 현탁액을 동결-해동 사이클에 의해 용해시키고 HEK293T 세포의 형질도입에 사용하였다. 형질도입 48시간 후, GFP 양성 HEK293T 세포의 측정에 의해 형질도입을 모니터링하였다.
도 13:
독시사이클린 유도 시 SV40 인트론뿐만 아니라 변형된 유도성 프로모터를 함유하는 캡시드 작제물, 헬퍼 기능 및 안정적으로 통합된 유도성 레플리카제를 손상시키는(compromising) 안정한 패키징 풀(packaging pool) Z3189 유래의 세포 용해물에서 정확한 화학량론으로 캡시드 발현(AAV8)을 나타내는 웨스턴 블롯. 패키징 풀에서 매우 낮은 수준의 VA RNA에도 불구하고, VP1:VP2:VP3에 대해 대략 1:1:10의 정확한 화학량론에서 캡시드 단백질이 생성된다.
도 14:
선택된 CAP rAAV8-GFP 생산자 단일 세포 클론의 바이러스 게놈 생산. 안정적으로 통합된 레플리카제, E2A, E4ORF6, VA RNA, 변형된 캡시드 작제물(유도성 프로모터/SV40 인트론) 및 ITR이 측면에 있는 GOI를 손상시키는 CAP rAAV8 GFP 생산자 SCC에서 AAV 생산은 독시사이클린의 첨가에 의해 유도하였다. 유도 7일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 SV40 PolyA 지정 프라이머/프로브를 사용하여 qPCR을 통해 패키징된 바이러스 게놈에 대해 분석하였다.
도 15:
선택된 CAP rAAV8-GFP 생산자 단일 세포 클론의 AAV8-ELISA 분석. 안정적으로 통합된 레플리카제, E2A, E4ORF6, VA RNA, 변형된 캡시드 작제물 및 ITR이 측면에 있는 GOI를 손상시키는 CAP rAAV8 GFP 생산자 SCC에서의 AAV 생산은 독시사이클린의 첨가에 의해 유도하였다. 유도 7일 후, 세포 현탁액 샘플을 채취하고 제조사의 지침에 따라 AAV8-ELISA(Progen사)를 사용하여 조립된 캡시드에 대해 분석하였다.
본 발명은 하기의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다:
서열번호 1
SV40 PolyA 프라이머 전방향
서열번호 2
SV40 PolyA 프라이머 역방향
서열번호 3
SV40 PolyA 프로브
서열번호 4
캡시드의 TRE3G-SV40 인트론-ATG
프로모터
인트론
시작 코돈
서열번호 5
캡시드의 CMV-SV40 인트론-ATG
프로모터
인트론
시작 코돈
서열번호 6
캡시드의 TRE3G-P40 인트론 (AAV2)-ATG
프로모터
인트론
시작 코돈
서열번호 7
캡시드의 TRE3G-P40 인트론 (AAV8)-ATG
프로모터
인트론
시작 코돈
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시될 것이나, 이에 제한되지 않는다.
실시예
실험 과정
세포 배양:
CAP 세포 및 파생된 프리-패키징, 패키징 또는 생산자 세포주는 120 내지 185rpm(5 cm 궤도), 5% CO2 및 37℃에서 진탕 배양기에서 진탕 플라스크(125mL, Corning사)에서 4mM GlutaMAX(Gibco사)가 보충된 화학적으로 규정된 동물 성분이 없는 PEM 배지(Thermo Fisher Scientific사)에서 일상적으로 배양하였다.
일상적인 배양 동안, 세포는 매 72 내지 96시간마다 0.5 내지 1 x 106개 세포/ml의 생존 세포 밀도로 신선한 배지로 희석하였다. 생존 세포 밀도 및 생존률은 CEDEX XS 세포 카운터(Innovatis사, Roche Applied Science) 또는 ViCell Blu(Beckman Coulter사)를 사용하여 트리판 블루 배제에 의해 결정하였다.
뉴클레오펙션 및 안정적인 풀 생성:
제조사의 지침에 따라 Lonza사의 뉴클레오펙터(Nucleofector)를 사용하여 안정적인 풀을 생성하였다.
각 뉴클레오펙션 반응을 위해 1 x 107개 세포를 원심분리(500 x g, 5분)로 수확했다. 세포를 100 μL 완전 뉴클레오펙터 용액 V(Lonza사)에 재현탁시키고 선형화된 발현 벡터 5 μg과 혼합하였다. DNA/세포 현탁액을 큐벳으로 옮기고 X001 프로그램을 사용하여 뉴클레오펙션을 수행하였다. 형질감염된 세포를 12.5mL 성장 배지로 옮기고 전술한 바와 같이 37℃, 5% CO2, 185rpm에서 배양하였다.
안정한 풀의 생성을 위해, 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고 이전에 기재된 바와 같이 진탕 인큐베이터에서 배양한 후 형질감염 72 내지 96시간 후에 선별 배지에 재현탁시켰다.
| 세포주 | 구성요소 |
| 프리-패키징 세포주 | Tet3G, 유도성 Rep, 유도성 헬퍼 |
| 패키징 세포주 | Tet3G, 유도성 Rep, 유도성 헬퍼, 유도성 캡시드(유도성(incl.) 프로모터/SV40 인트론) |
| 생산자 세포주 | Tet3G, 유도성 Rep, 유도성 헬퍼, 유도성 캡시드(유도성(incl.) 프로모터/SV40 인트론), GOI GFP |
캡시드 단백질 발현 및 PKR 및 EIF2a 인산화를 테스트하기 위한 일시적 형질감염 및 웨스턴 블롯:
일시적 형질감염:
일시적 형질감염은 Freestyle 293 배지(Thermo Fisher Scientific사)에서 PEImax(PolySciences사)를 사용하여 수행하였다. 형질감염 5시간 후, 세포에 완전한 PEM 배지(Thermo Fisher Scientific)를 공급하고, 안정적으로 통합된 레플리카제 및 보조 기능의 발현을 1pg/mL 독시사이클린을 첨가하여 유도했다. 달리 명시되지 않은 경우, 형질감염 72시간 후 단백질 발현 분석을 수행하였다.
웨스턴 블롯:
웨스턴 블롯 분석은, 형질감염 72시간 후 수확하였으며 프로테아제 및 포스파타아제 억제제가 보충된 RIPA 완충액을 사용하여 용해시킨 1 x 105개의 형질감염된 세포의 세포 용해물을 이용하여 수행하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 하기의 항체를 사용했다: 마우스-항-VP1/VP2/VP3 항체(Progen사, 독일), 항-Phospho-PKR 항체(Abeam사), 항-Phospho-elF2a 항체(Cell Signaling사) 및 양고추냉이 과산화효소 표지 항마우스 및 항토끼 항체(Cell Signaling사). 화학발광 검출기(INTAS)를 통해 Pierce ECL WB 기판 키트를 사용하여 단백질을 검출했다.
변형된 캡시드 작제물을 사용한 프리-패키징, 패키징 또는 생산자 세포로부터 바이러스 생산:
헬퍼 기능의 안정적인 통합에 의해 제공되는 제한된 양의 VA RNA의 존재하에 변형된 캡시드 작제물을 사용한 바이러스 생산을 테스트하기 위해, AAV 생성에 필요한 누락된 구성 요소를 일시적 형질감염을 통해 세포에 도입했다(표 2). AAV 생산은 독시사이클린을 통해 레플리카제 및 헬퍼 단백질의 발현을 유도함으로써 개시하였다.
형질감염 3일 후, 세포 현탁액 샘플을 수확하고 최종 농도 0.5%의 Triton-X를 첨가하여 용해시켰다.
| 세포주 | 안정한 통합된 구성요소 | 트랜스로 제공된 AAV 생산을 위한 상보적인 구성요소 |
| 프리-패키징 세포주 | Tet3G, 유도성 Rep, 유도성 헬퍼 | AAV8 캡시드(CMV/SV 40 인트론), TRE3G/SV40 인트론, 또는 TRE3G/p40 인트론(AAV2 또는 AAV8), GOI GFP |
| 패키징 세포주 | Tet3G, 유도성 Rep, 유도성 헬퍼, 유도성 캡시드(유도성 프로모터/SV40 인트론) | |
| 생산자 세포주 | Tet3G, 유도성 Rep, 유도성 헬퍼, 유도성 캡시드(유도성 프로모터/SV40 인트론), GOI GFP |
바이러스 역가를 결정하기 위한 qPCR:
SV40 PolyA에 대한 하기의 프라이머/이중 표지 프로브 조합(MWG, Eurofins; 표 3)을 사용하여 바이러스 역가를 측정했다.
| 프라이머/프로브 | 서열 |
| SV40 PolyA 프라이머 전방향 | (서열번호 1) |
| SV40 PolyA 프라이머 역방향 | (서열번호 2) |
| SV40 PolyA 프로브 | (서열번호 3) |
Fam: 6-카르복시플루오레세인; BHQ1: 블랙홀 ??처
표준으로서, 정의된 카피 수를 갖는 선형화된 이식유전자 플라스미드를 사용했다. qPCR 반응물은 2 x Brilliant Multiplex qPCR Master Mix(Agilent사), 뉴클레아제가 없는 H2O(Thermo Fisher Scientific사), 프라이머/프로브 믹스 및 시료/표준 성분을 포함하였다. qPCR은 제조사의 지침에 따라 Agilent Mx3005P에서 실행하였다.
조립된 캡시드에 대한 ELISA:
조립된 캡시드에 특이적인 ELISA는 제조사의 지침에 따라 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트(Progen사)를 사용하여 수행하였다.
VA RNA 발현 분석:
VA RNA 발현을 테스트하기 위해, 제조사의 지침에 따라 NucleoSpin miRNA 키트를 사용하여 RNA를 분리했다. 역전사 후, VA RNA에 특이적인 프라이머/프로브 조합을 사용하여 VA RNA 발현에 대한 분석을 수행하고 제조사의 지침에 따라 Agilent Mx3005P에서 실행하였다.
형질도입 분석:
간략하게, 세포 용해물은 4주기의 동결-해동에 의해 제조하였다. 부착성 HEK293T 세포를 시딩하고 AAV 입자를 첨가하였다. 형질도입 48시간 후, 형질도입된 세포를 GFP 측정을 통해 정량화했다.
실시예 1
캡시드 발현에 미치는 VA RNA의 영향
도입:
CAP 세포는 E1 A/E1 B를 암호화하는 작제물을 이용한 안정적인 형질감염에 의해 불멸화된 인간 양막 세포 유래 현탁 세포이다. 프리패키징 세포는 부모 CAP 세포를 기반으로 하며 (i) tet 활성제, (ii) tet-유도성 프로모터의 제어하에 있는 레플리카제(AAV2) 및 아데노바이러스 헬퍼 기능(E2A, E4orf6) 및 (iii) 아데노바이러스 VA RNA를 안정적으로 발현한다. 그러나, PollII RNA 프로모터와 함께 아데노바이러스 VA RNA를 안정적인 프리-패키징 세포주의 게놈에 안정적으로 통합하면, VA RNA가 pHelper 플라스미드의 세포에 도입되는 일시적인 형질 감염 접근법과 비교하여 VA RNA 수준이 매우 낮아지며(도 2) RNA 수준이 약 3로그 감소한다.
VA RNA는 고역가 AAV 생산에 중요하다. AAV 생산 내에서 VA RNA의 기능은 PKR 인산화/활성화를 억제함으로써 elF2alpha 인산화를 억제하여 바이러스 레플리카제 및 캡시드 단백질의 단백질 발현을 감소시키는 것이다. PKR은 VP1의 AUG를 둘러싸는 캡시드 단백질의 RNA 리더 서열 내의 서열에 의해 활성화되는 것으로 확인되었다. 본원에 기술된 실시예에서, AAV8 캡시드 작제물은 SV40 인트론을 갖는 Tet3G 프로모터(p5/p40/인트론)를 포함하는 변형된 캡시드 작제물, 또는 AAV2 p5 미니 프로모터 및 그의 인트론을 갖는 AAV2 캡시드 p40 프로모터를 포함하는 P40 프로모터 작제물을 함유하였다. 이들은 VA RNA(VA RNA만을 발현하는 작제물) 또는 대조군으로 사용되는 빈 벡터와 공동 형질감염시켰다(표 4). 독시사이클린의 첨가를 통해 안정적으로 통합된 rep 및 헬퍼 유전자의 유도 후, 세포 용해물을 제조하고 캡시드 발현에 대해 분석하였다.
| 형질 감염 | 공동 형질 감염 |
| 변형된 인트론/프로모터를 갖는 캡시드 | 빈 벡터 |
| p40 프로모터를 갖는 캡시드 | 빈 벡터 |
| p40 프로모터를 갖는 캡시드 | VA RNA |
결과:
프리-패키징 세포주는 일시적 접근법과 비교하여 최대 3로그 감소된 VA RNA 수준을 가진다(도 2). 흥미롭게도, AAV p40 프로모터 및 이의 인트론 영역을 갖는 캡시드 작제물은 추가적인 VA RNA 구조물 없이는 발현을 나타내지 않았지만, 추가적인 VA RNA 기능의 공동-형질감염시 증가를 나타냈다. TRE3G 프로모터 및 SV40 인트론을 손상시키는 변형된 프로모터 작제물을 사용한 AAV8 캡시드 발현은 프리-패키징 SCC에서 추가 VA RNA가 없는 경우에도 검출될 수 있었다. 또한, SV40 인트론 작제물로 인해 스플라이싱이 발생할 수 있으므로 세 가지 다른 캡시드 단백질 VP1:VP2:VP3 사이의 정확한 비율이 달성될 수 있다(약 1:1:10). 서로 다른 VP 사이의 정확한 비율은 AAV의 형질도입 효율, 생성된 바이러스 벡터의 효능, 및 이에 따른 치료용 유전자 치료제로서의 잠재적 사용을 위해 중요하다(도 3).
실시예 2:
PKR 활성화 및 발현 수준에 미치는 캡시드 변형의 영향
도입:
프리-패키징 세포에서, 본래의 p40 프로모터가 있는 캡시드의 발현은 TRE3G 프로모터 및 SV40 인트론이 있는 변형된 캡시드 작제물을 사용하는 것과 비교하여 매우 낮은 발현 수준을 초래한다. 그러나, VA RNA의 추가적인 발현은 역가를 증가시킨다(실시예 1 참조). 캡시드 단백질의 RNA 리더 서열에서 PKR 활성화 서열의 대체로 인해 PKR 활성화가 감소될 것이라는 가설을 테스트하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
SV40 인트론을 갖는 TRE3G 프로모터를 포함하는 변형된 캡시드 작제물, 또는 p5 미니 프로모터, p40 프로모터 및 이의 인트론을 포함하는 AAV p40 프로모터 작제물을 포함하는 AAV8 캡시드 작제물은 VA RNA를 암호화하는 추가 플라스미드의 존재 또는 부재 하에 프리패키징 세포에 동시 형질감염시켰다(표 4). 안정적으로 통합된 rep 및 헬퍼 유전자의 유도 후, 세포 용해물을 제조하고 캡시드 발현 및 PKR 및 elF2a 인산화에 대해 분석하였다.
결과:
본원에 기재된 AAV 프리-패키징 세포주는 일시적 접근법과 비교하여 매우 낮은 VA RNA 수준을 가지며(그림 2), PKR 활성화 서열을 포함하는 AAV p5/p40/인트론 작제물을 사용하여 세포에서 캡시드 단백질 역가가 감소한다. 그러나, TRE3G/SV40 인트론 작제물을 사용하여, 천연 AAV 프로모터의 PKR 활성화 서열을 다른 프로모터로 대체하는 것을 포함하면 더 높은 역가가 발생한다. 캡시드 발현을 감소시키는 것으로 기재된, PKR 및 하류측 표적 elF2a의 인산화 수준은 실제로 p40 프로모터 및 이의 인트론 함유 캡시드 작제물의 형질감염시 증가했지만, 변형된 작제물을 사용한 경우에는 그렇지 않았다(도 4).
따라서, 그의 인트론과 함께 p40 프로모터를 SV40 인트론과 함께 변형된 TRE3G 프로모터로 대체하면 캡시드 단백질 VP1:VP2:VP3의 정확한 비율 뿐만 아니라 감소된 PKR 및 이후의 감소된 elF2a 인산화로 인해 증가된 단백질 발현이 얻어진다.
실시예 3:
변형된 캡시드 작제물 대 p40 인트론 작제물을 비교하는 AAV 생산 및 여러 기원의 프리-패키징 세포주에서 추가의 VA-RNA의 영향
도입:
rAAV8-GFP의 생산은 CAP 세포에 기반한 하나의 프리-패키징 SCC 및 HEK293 세포에 기반한 하나의 프리-패키징 SCC에서, 이들 SCC를 AAV2 ITR가 측면에 있는 GOI로서 GFP를 포함하는 작제물과 조합으로 변형된 캡시드 작제물(SV40 인트론을 가진 TRE3G-프로모터) 또는 p40-인트론 캡시드 작제물(AAV2(서열번호 6) 또는 AAV8(서열번호 7) 유래 p40 인트론을 갖는 TRE3G 프로모터로 형질감염시켜서 평가했다. 또한, 빈 벡터 또는 VA-RNA를 발현하는 벡터를 공동 형질감염시켰다. 매우 낮은 수준의 VA RNA로 유도성 rep 및 헬퍼 기능을 발현하는 프리-패키징 단일 세포 클론에의 형질감염을 수행하였다. AAV 생산은 형질감염 5시간 후 독시사이클린 유도를 통해 개시하였다.
조립된 온전한 AAV 바이러스 입자(vp)의 역가는 ELISA를 통해 분석하였고, 바이러스 게놈(vg)의 역가는 SV40pA 또는 GFP 지정 프라이머 및 프로브를 사용하여 qPCR을 통해 분석하였다.
결과:
이러한 연구에 사용된 ELISA는 조립된 캡시드의 구조적 에피토프를 인식한다. 따라서, 두 세포주에 기반한 프리-패키징 SCC와 함께 변형된 TRE3G/SV40 인트론 캡시드 작제물을 사용하여 1E11 입자/ml 이상을 검출하면, 높은 역가를 갖는 완전히 조립된 기능성 AAV 입자가 이러한 작제물로부터 생성된다는 것이 확인된다. 비교해 보면, 동일한 TRE3G 프로모터의 제어하에 캡시드로 p40 인트론 작제물을 형질감염시켰을 때 생성된 캡시드 역가는 두 세포주를 기반으로 한 프리-패키징 클론의 경우 상당히 낮았다(10배 이상). VA-RNA의 첨가를 통해 역가는 매우 낮은 수준의 VA-RNA를 갖는 세포에서 TRE3G/SV40 인트론 작제물을 사용하여 달성된 수준으로 회복될 수 있다(도 5 및 도 6). 전체 바이러스 입자의 형성에 미치는 인트론 구성 및 VA-RNA 추가의 영향은 qPCR에 의해 측정된 바이러스 게놈 역가를 통해 분석하였다. 또한, 인트론 구성 사이의 캡시드 발현의 차이는 qPCR에 의해 확인된 바와 같이 바이러스 게놈 역가의 차이를 초래했다. 또한 여기에서, p40 인트론 작제물에 VA RNA를 추가하면, 역가는 추가의 VA-RNA 없이 TRE3G/SV40 인트론 작제물로 달성된 수준으로 회복되었다(도 7 및 도 8). 요약하면, 이들 데이터는 TRE3G/SV40 인트론 작제물이 VA-RNA의 부재 하에 효율적인 AAV 생산을 유도함으로써, 변형되지 않은 p40 인트론이 있는 VA-RNA의 존재 하에서만 도달할 수 있는 수준을 달성함을 보여준다.
실시예 4:
변형된 캡시드 작제물을 사용한 AAV 생산
도입:
rAAV8-GFP의 생성은 변형된 캡시드 작제물(SV40 인트론이 있는 CMV-프로모터) 및 AAV2 ITR가 측면에 있는 GOI로서 GFP로 작제물로 SCC를 형질감염시켜서 3개의 별개의 프리-패키징 SCC에서 평가했다. 유도성 rep 및 헬퍼 기능을 이미 발현하는 프리-패키징 단일 세포 클론에의 형질 감염이 수행되었지만, 위에서 나타낸 바와 같이 VA RNA의 수준은 매우 낮았다. AAV 생산은 형질감염 5시간 후 독시사이클린 유도를 통해 개시하였다.
조립된 온전한 AAV 바이러스 입자의 역가는 ELISA를 통해 분석하였고, vg/mL 역가는 SV40pA 지정 프라이머 및 프로브를 사용하여 qPCR을 통해 분석하였다. 감염성은 형질도입 분석을 통해 결정하였다.
결과:
이러한 연구에 사용된 ELISA는 조립된 캡시드의 구조적 에피토프를 인식한다. 따라서, 프리-패키징 SCC와 함께 변형된 CMV I SV40 인트론 캡시드 작제물을 사용한 1E11 입자/ml 이상의 검출은 완전히 조립된 기능성 AAV 입자가 이들로부터 생성됨을 나타낸다(도 10). 이러한 AAV 입자는 qPCR에 의해 확인된 바와 같이 바이러스 게놈으로 효율적으로 패키징된다. 3개의 상이한 평가된 프리-패키징 세포의 경우, 약 1 E10/mL의 바이러스 게놈 역가가 검출될 수 있었다(도 11).
후기 엔도솜으로부터 AAV 입자를 방출하는데 포스포리파제 A2(PLA2) 활성이 필요하기 때문에 VP1은 AAV 입자의 감염성에 중요한 반면, VP2 및 VP3은 올바른 비리온 조립에 중요하다.
웨스턴 블롯에서 생성된 AAV 입자의 분석 결과, 예상된 비율로 세 가지 단백질인 VP1, VP2 및 VP3 모두의 발현이 확인되었다(도 9). 형질도입 분석에서 생성된 AAV 입자의 분석 결과는 ~34% AAV 형질도입된 리포터 세포를 나타내고, 따라서 변형된 캡시드 작제물을 사용하여 생성된 AAV 입자의 감염성을 입증한다(도 12). 이는 VP1:VP2:VP3의 올바른 화학양론이 달성될 수 있는 캡시드 입자의 생산을 다시 설명한다.
결론적으로, 다른 프리-패키징 SCC에서 극도로 낮은 수준의 VA-RNA에도 불구하고, 완전히 기능적인 AAV는 여기에 설명된 접근법에 의해 생성된다.
실시예 5:
변형된 캡시드 프로모터 영역을 이용한 안정한 패키징 세포주의 생성
도입:
SV40 인트론과 함께 유도성 프로모터의 제어하에 있는 변형된 캡시드 작제물을 프리-패키징 SCC에 도입하였다. 선택을 통해 안정적인 풀이 생성되었다. 풀 생성 후, 세포를 1 x 106개 세포/mL의 밀도로 시딩하고 1pg/mL 독시사이클린을 첨가하여 캡시드 생산을 유도하였다. 또한, 유도되지 않은 대조군이 포함되었다. 유도 3일 후, 세포 용해물을 제조하고 정확한 화학량론의 캡시드 생산을 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
결과:
프리-패키징 세포주에 기반하여 유도성 프로모터의 제어하에 있는 변형된 캡시드 작제물을 사용하여 완전히 안정한 패키징 풀을 생성하였다. 독시사이클린 유도 시, 안정적인 세포주는 낮은 수준의 VA RNA에도 불구하고 캡시드 단백질을 고효율로 그리고 웨스턴 블롯에 의해 확인된 적절한 비율로 발현하였다(도 13).
실시예 6:
생산자 세포주
도입:
SV40 인트론 및 ITR이 측면에 있는 GOI GFP와 함께 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 변형된 캡시드 작제물을 렌티바이러스 형질도입에 의해 프리-패키징 SCC에 도입하여 완전히 안정한 생산자 세포주를 생성했다. 이러한 폴리클로날 풀은 높은 생산자 세포를 얻기 위해 단일 세포 클로닝의 출발점 역할을 했다. 소규모 24 딥(deep) 웰 플레이트 실험에서 가장 유망한 SCC를 확인한 후, 유도 시 rAAV8-GFP 생산에 대한 ambr 실행에서 선택된 SCC를 분석했다. 간략히 말해서, 세포를 1 x 106개 세포/mL로 시딩하고 시딩 3일 후 독시사이클린을 첨가하여 유도했다. 여러 시점에서 샘플을 채취하고 AAV 생산을 ELISA 및 qPCR로 측정했다.
결과:
변형된 캡시드 작제물을 사용하여, 안정적인 생산자 세포주를 성공적으로 생성하였다. 최선의 생산자 SCC는 ambr15 실행에서 생산성에 대해 분석하였다. 유도 시, 완전히 안정한 생산자 세포주는 단지 낮은 수준의 VA RNA만을 갖는 프리-패키징 클론을 기반으로 함에도 불구하고 캡시드 ELISA 및 qPCR에 의해 검출된 바와 같이 높은 역가의 rAAV8-GFP 생산을 나타내었다(도 14 및 도 15). 변형된 작제물을 사용한 캡시드 수준은 109 범위 내지 1010 중반 범위 사이의 SCC 및 바이러스 게놈 생산에 따라 1010 내지 1013 캡시드/mL의 범위였다.
SEQUENCE LISTING
<110> CEVEC PHARMACEUTICALS GMBH
<120> PRODUCER CELL HAVING LOW LEVELS OF VA-RNA
<130> IP20234306DE
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SV40 PolyA primer forward
<400> 1
agcaatagca tcacaaattt cacaa 25
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SV40 PolyA primer reverse
<400> 2
ccagacatga taagatacat tgatgagtt 29
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SV40 PolyA probe
<400> 3
agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtc 36
<210> 4
<211> 551
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> TRE3G-SV40intron-ATG of capsid
<400> 4
gagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatgaagagt ttactcccta tcagtgatag 60
agaacgtatg cagactttac tccctatcag tgatagagaa cgtataagga gtttactccc 120
tatcagtgat agagaacgta tgaccagttt actccctatc agtgatagag aacgtatcta 180
cagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatatccagt ttactcccta tcagtgatag 240
agaacgtata agctttaggc gtgtacggtg ggcgcctata aaagcagagc tcgtttagtg 300
aaccgtcaga tcgcctggag caattccaca acacttttgt cttataccaa ctttccgtac 360
cacttcctac cctcgtaaag actctagagg atccggtact cgaggaactg aaaaaccaga 420
aagttaactg gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg 480
tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctaggcc tgtacggaag 540
tgttacttat g 551
<210> 5
<211> 872
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CMV-SV40intron-ATG of capsid
<400> 5
aattcgagct tgcatgcctg caggtcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 60
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 120
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 180
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 240
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 300
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 360
gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 420
gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 480
tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag 540
tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc 600
gggaccgatc cagcctccgg actctagagg atccggtact cgaggaactg aaaaaccaga 660
aagttaactg gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg 720
tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctaggcc tgtacggaag 780
tgttacttct gctctaaaag ctgcggaatt gtacccgcgg ccgcttaatt aaatcgatac 840
cggtttcgaa acgcgtgata aatgccacca tg 872
<210> 6
<211> 733
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> TRE3G-p40 intron (AAV2)-ATG of capsid
<400> 6
gagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatgaagagt ttactcccta tcagtgatag 60
agaacgtatg cagactttac tccctatcag tgatagagaa cgtataagga gtttactccc 120
tatcagtgat agagaacgta tgaccagttt actccctatc agtgatagag aacgtatcta 180
cagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatatccagt ttactcccta tcagtgatag 240
agaacgtata agctttaggc gtgtacggtg ggcgcctata aaagcagagc tcgtttagtg 300
aaccgtcaga tcgcctggag caattccaca acacttttgt cttataccaa ctttccgtac 360
cacttcctac cctcgtaaac cgttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 420
aactacgcag acaggtacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg 480
tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga 540
cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa 600
aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc 660
actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataaatgatt 720
taaatcaggt atg 733
<210> 7
<211> 769
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> TRE3G-p40 intron (AAV8)-ATG of capsid
<400> 7
gagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatgaagagt ttactcccta tcagtgatag 60
agaacgtatg cagactttac tccctatcag tgatagagaa cgtataagga gtttactccc 120
tatcagtgat agagaacgta tgaccagttt actccctatc agtgatagag aacgtatcta 180
cagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatatccagt ttactcccta tcagtgatag 240
agaacgtata agctttaggc gtgtacggtg ggcgcctata aaagcagagc tcgtttagtg 300
aaccgtcaga tcgcctggag caattccaca acacttttgt cttataccaa ctttccgtac 360
cacttcctac cctcgtaaac ctcgaggaac tgaaaaacca gaaagttaac agtcgcggat 420
ccatcgacgt cagacgcgga aggagctccg gtggactttg ccgacaggta ccaaaacaaa 480
tgttctcgtc acgcgggcat gcttcagatg ctgtttccct gcaaaacgtg cgagagaatg 540
aatcagaatt tcaacatttg cttcacacac ggggtcagag actgctcaga gtgtttcccc 600
ggcgtgtcag aatctcaacc ggtcgtcaga aagaggacgt atcggaaact ctgtgcgatt 660
catcatctgc tggggcgggc tcccgagatt gcttgctcgg cctgcgatct ggtcaacgtg 720
gacctggatg actgtgtttc tgagcaataa atgacttaaa ccaggtatg 769
Claims (15)
- 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포로서, AAV 캡시드 단백질인 VP1, VP2 및 VP3의 기능적 발현을 유지하면서 AAV 캡시드 단백질 VP1의 시작 코돈을 둘러싸는 단백질 키나제 R(PKR) 활성화 서열이 불활성화되어 있는, 숙주 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 PKR-활성화 서열은 캡시드 프리(pre)-mRNA를 암호화하는 서열의 인트론의 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 대체함(replacing)으로써 불활성화되는, 숙주 세포.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PKR-활성화 서열은 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40을 다른 프로모터로 대체하고 코딩 캡시드 서열 외부의 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 포함하는 p40 인트론의 일부를 다른 기원의 인트론으로 대체함으로써 불활성화되는, 숙주 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40은 유도성 프로모터에 의해 대체되고/되거나, 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40 인트론은 캡시드 코딩 서열 외부의 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 대체하고 적합한(fitting) 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위를 제공하는 대체 인트론에 의해 대체되는, 숙주 세포.
- 제4항에 있어서, 상기 대체 인트론은 SV40 인트론, 합성 CAG 프로모터 인트론 및 베타-글로빈 인트론으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 숙주 세포.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
유도성 프로모터의 제어하에 있는 AAV 레플리카제(Rep) 단백질을 암호화하는 핵산, 및/또는
아데노바이러스 E1 A 및 E1 B 단백질을 암호화하는 핵산, 및/또는
유도성 프로모터의 제어하에 있는 아데노바이러스 E2A 및 E4orf6 단백질을 암호화하는 핵산,을 추가로 포함하는 숙주 세포. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 관심 유전자(GOI)를 포함하는 전달 벡터를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 캡시드 단백질의 발현을 제어하는 유도성 프로모터 및/또는 AAV 레플리카제 단백질의 발현을 제어하는 유도성 프로모터 및/또는 아데노바이러스 E2A 및 E4orf6 단백질의 발현을 제어하는 유도성 프로모터는, tet-유도성 프로모터, 쿠메이트-유도성 프로모터, 타목시펜-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터, FKCsA-유도성 프로모터, ABA-유도성 프로모터, 리보스위치 제어형 프로모터, 및 열 충격 프로모터-구동 광 전환 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 숙주 세포.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PKR-활성화 서열은 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40을 다른 프로모터로 대체하고 코딩 캡시드 서열 외부의 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 포함하는 p40 인트론의 일부를 다른 기원의 인트론으로 대체함으로써 불활성화되고,
상기 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40은 구성적 또는 유도성 프로모터로 대체되고, 상기 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40 인트론은 부분적으로 대체, 즉, 캡시드 코딩 서열 외부에서 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 대체하는 인트론으로 대체되고,
상기 프로모터로부터 상기 AAV 캡시드 단백질의 코딩 서열의 시작 코돈까지의 각각의 뉴클레오티드 서열은 하기 구조를 갖는, 숙주 세포:
프로모터 - N1 - 인트론 - N2 - ATG
여기서,
프로모터는 구성적 또는 유도성 프로모터이고,
N1은 1 내지 4000개 뉴클레오티드의 서열이고,
인트론은 최소 컨센서스 서열인 GT/AG를 갖는 적합한(fitting) 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위를 제공하는 인트론으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인트론이고,
N2는 1 내지 4000개 뉴클레오티드의 서열이고,
ATG는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열의 시작 코돈임. - 제9항에 있어서, 프로모터는 제3세대 TRE3G-프로모터와 같은 tet-유도성 프로모터, 쿠메이트-유도성 프로모터, 타목시펜-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터, FKCsA-유도성 프로모터, ABA-유도성 프로모터, 리보스위치 제어 프로모터, 및 열 충격 프로모터-구동 광 전환 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유도성 프로모터인, 숙주 세포.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 인트론은 SV40 인트론, 합성 CAG 프로모터 인트론, 및 베타-글로빈 인트론으로 이루어진 구성된 그룹으로부터 선택되는 인트론인, 숙주 세포.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 PKR-활성화 서열은 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40을 다른 프로모터로 대체하고 코딩 캡시드 서열 외부의 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 함유하는 p40 인트론의 일부를 다른 기원의 인트론으로 대체함으로써 불활성화되고,
상기 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40은 다른 프로모터로 대체되고, 상기 천연 AAV 캡시드 단백질 프로모터 p40 인트론은 부분적으로 대체, 즉, 캡시드 코딩 서열의 외부에서 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위 1을 대체하는 SV40 인트론으로 대체되고,
상기 프로모터로부터 상기 AAV 캡시드 단백질의 코딩 서열의 시작 코돈까지의 각각의 뉴클레오티드 서열은
(i) 서열번호 4 또는 서열번호 5에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는
(ii) 서열번호 4 또는 서열번호 5와 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열(단 상기 전제 조건은 상기 뉴클레오티드 서열에 적용됨)이고,
서열번호 4 또는 서열번호 5의 마지막 3개 뉴클레오티드인 ATG는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열의 시작 코돈인, 숙주 세포. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, CAP 세포, HEK293 세포 및 Per.C6 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포로부터 유래되는 것인 숙주 세포.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포에서 상기 AAV를 발현시키는 단계를 포함하는, 아데노 관련 바이러스(AAV)의 생산 방법.
- 아데노-관련 바이러스(AAV)의 생산에서 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 용도.
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