ES2774966T3 - Variantes de aav y composiciones, métodos y usos para la transferencia de genes a células, órganos y tejidos - Google Patents

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Abstract

Una particula de AAV recombinante que comprende una secuencia de la capside de AAV, en donde la particula de AAV encapsida un genoma de vector que comprende una secuencia polinucleotidica heterologa que codifica la proteina del Factor IX, y en donde la secuencia de la capside de AAV es al menos 99,5 % identica y tiene al menos una sustitucion de aminoacidos en las posiciones de aminoacidos 195, 199, 201 o 202, de la secuencia de la capside VP1 establecida como la SEQ ID NO:1.

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de aav y composiciones, métodos y usos para la transferencia de genes a células, órganos y tejidos
Introducción
Los trastornos genéticos, causados por la ausencia o un defecto en un gen deseable (pérdida de función) o la expresión de un gen indeseable o defectuoso o (ganancia de función) conducen a una variedad de enfermedades. Un ejemplo de trastorno genético por pérdida de función es la hemofilia, un trastorno hemorrágico hereditario causado por una deficiencia en el factor VIII de coagulación (FVIII, hemofilia A) o factor IX (FIX, hemofilia B). Un ejemplo de trastorno genético por ganancia de función es la enfermedad de Huntington, una enfermedad causada por un gen "HTT" patológico (que codifica la proteína huntingtina) que codifica una proteína mutada que se acumula y conduce a la destrucción gradual de las neuronas, particularmente en los ganglios basales y la corteza cerebral.
El tratamiento actual para la hemofilia consiste en la administración intravenosa de factor de coagulación recombinante ya sea a petición, en caso de hemorragia, o profilácticamente. Sin embargo, este enfoque terapéutico tiene varios inconvenientes, como la necesidad de infusiones repetidas, el costo del tratamiento, el riesgo de desarrollar respuestas inmunes anti-factor terapéutico y el riesgo de hemorragias potencialmente mortales. Estas limitaciones han provocado el desarrollo de terapias basadas en genes para la hemofilia. Con este fin, la hemofilia es ideal para la terapia basada en la transferencia de genes, ya que 1) la ventana terapéutica es muy amplia, ya que niveles solamente por encima del 1 % de lo normal ya pueden provocar un cambio en el fenotipo de grave a moderado, y los niveles del 100 % no están asociados a ningún efecto secundario; 2) la expresión específica de tejido del transgén terapéutico no es estrictamente necesaria; y 3) existe una experiencia considerable en la medición de los criterios de valoración de la eficacia terapéutica. Además, se ha demostrado que la expresión hepática del factor de coagulación induce tolerancia inmunológica hacia el propio factor de coagulación, lo que reduce la probabilidad de respuestas inmunes potencialmente dañinas contra el factor de coagulación.
Actualmente, los vectores de virus adenoasociados (AAV) se reconocen como los vectores de transferencia de genes de elección, ya que tienen el mejor perfil de seguridad y eficacia para la administración de genes in vivo. De los serotipos de AAV aislados hasta ahora, AAV2 y AAV8 se han utilizado para seleccionar como objetivo el hígado de seres humanos afectados por hemofilia B grave. Ambos vectores funcionaron eficientemente, y en el caso de AAV8 se documentó la expresión a largo plazo del transgén terapéutico. Los datos recientes en seres humanos mostraron que seleccionar como objetivo el hígado con un vector de AAV logra la expresión a largo plazo del transgén FIX a niveles terapéuticos.
Si bien estos datos son prometedores, la identificación de serotipos de AAV con alto tropismo hacia el hígado y baja seroprevalencia en humanos (un huésped natural para el AAV de tipo natural) es fundamental para 1) lograr niveles terapéuticos de expresión transgénica en el hígado a la dosis de vector más baja posible para disminuir el riesgo de desencadenar respuestas inmunitarias anti-cápside de AAV; y 2) los serotipos de a Av alternativos con seroprevalencia única permitirán tratar a aquellas poblaciones de pacientes que de otro modo no serían elegibles para la transferencia génica con AAV debido a la inmunidad humoral preexistente hacia AAV. La invención aborda estas necesidades y proporciona beneficios adicionales.
Resumen
La presente invención se define por las reivindicaciones. Por consiguiente, la presente invención se refiere a una partícula de AAV recombinante que comprende una secuencia de la cápside de AAV, en donde la partícula de AAV encapsida un genoma del vector que comprende una secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica la proteína del Factor IX, y en donde la secuencia de la cápside de AAV es al menos 99,5 % idéntica a la secuencia de la cápside VP1 establecida como la SEQ ID NO: 1 y tiene al menos una sustitución de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 195, 199, 201 o 202. La presente invención se refiere además a una partícula de AAV recombinante que comprende una cápside de AAV que encapsida un genoma de vector que comprende una secuencia polinucleotídica heteróloga, en donde la cápside de AAV comprende una proteína VP1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, en donde la secuencia polinucleotídica heteróloga codifica una proteína del Factor IX humano, y en donde el genoma del vector comprende además un promotor o potenciador específico del hígado unido de forma operable a dicha secuencia polinucleotídica heteróloga, y repeticiones terminales invertidas de AAV que flanquean los extremos 5' y 3' de la secuencia polinucleotídica heteróloga. La presente invención también se refiere a una partícula de AAV recombinante que comprende una cápside de AAV que encapsida un genoma de vector que comprende una secuencia polinucleotídica heteróloga, en donde la cápside de AAV comprende una proteína VP1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, en donde la secuencia polinucleotídica heteróloga codifica una proteína del Factor IX humano, y en donde el genoma del vector comprende además un promotor o potenciador específico del hígado unido de forma operable a dicha secuencia polinucleotídica heteróloga, y una repetición terminal invertida de AAV que flanquea los extremos 5' o 3' de la secuencia polinucleotídica heteróloga. Generalmente en la presente memoria se proporciona un vector de serotipo AAV-Rh74 de virus adenoasociado (AAV) y vectores de AAV relacionados y partículas virales. Estos vectores incluyen AAV-Rh74 que selecciona como objetivo a los hepatocitos del hígado, entre otros tipos de células. Como vector para la administración de la secuencia polinucleotídica, AAV-Rh74 y los vectores de AAV relacionados controlan la expresión del polinucleótido en las células. Los polinucleótidos que codifican proteínas, como las proteínas para aplicaciones terapéuticas, pueden expresarse a niveles terapéuticos después de la administración.
Los ejemplos de AAV-Rh74 y vectores de AAV relacionados incluyen variantes de AAV-Rh74. Las variantes de la cápside particulares incluyen una secuencia de cápside Rh74 con una sustitución de aminoácidos en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 195, 199, 201 o 202, de la secuencia de cápside RH74 VP1 (SEQ ID NO: 1). En aspectos particulares, los residuos corresponden a un aminoácido A, V, P o N en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 195, 199, 201 o 202 de la secuencia de la cápside RH74 VP1 (SEQ ID NO: 1). En aspectos más particulares, la secuencia de la cápside tiene un residuo A en la posición de aminoácido 195; un residuo V en las posiciones de aminoácidos 199, un residuo P en la posición de aminoácidos 201, o un residuo N en la posición de aminoácidos 202 de la secuencia de la cápside RH74 VP1 (SEQ ID NO: 1). En otros aspectos más particulares, la secuencia de la cápside tiene dos, tres o los cuatro de los siguientes: un residuo A en la posición de aminoácido 195; un residuo V en las posiciones de aminoácidos 199, un residuo P en la posición de aminoácido 201, o un residuo N en la posición de aminoácido 202 de la secuencia de la cápside RH74 VP1 (SEQ ID NO: 1).
Las partículas de AAV recombinantes descritas en la presente memoria incluyen una secuencia de la cápside de AAV de cualquier variante de la cápside, como RHM4-1 (SEQ ID NO: 5), RHM15-1 (SEQ ID NO: 6), RHM15-2 (SEQ ID NO: 7), RHM15-3/RHM15-5 (SEQ ID NO: 8), RHM15-4 (SEQ ID NO: 9) o RHM15-6 (SEQ ID NO: 10). Una partícula de AAV recombinante puede encapsidar o empaquetar un genoma de vector (por ejemplo, un vector viral tal como un genoma de vector de AAV). Dichas partículas de AAV recombinantes incluyen un genoma de vector viral (por ejemplo, AAV) que también incluye una secuencia polinucleotídica heteróloga.
La transferencia de polinucleótidos mediada por AAV-Rh74 y vectores de AAV relacionados produjeron niveles de expresión de proteínas que fueron significativamente más altos que varios otros serotipos estudiados actualmente en entornos preclínicos y clínicos. En particular, AAV-Rh74 dirige los polinucleótidos al hígado con una eficiencia al menos comparable o superior al método de referencia para la transducción hepática, AAV8, tanto en ratones como en perros con hemofilia B. (ver, por ejemplo, las Figuras 1 y 2). Las variantes de AAV-Rh74 como, por ejemplo, la variante de la cápside RHM4-1 (SEQ ID NO: 5) dirigen los polinucleótidos al hígado con una eficiencia comparable o superior a AAV8 y superior a Rh74 AAV en ratones (ver, por ejemplo, la Figura 5). Además, los datos en primates no humanos muestran que AAV-Rh74 y las variantes de AAV-Rh74 como RHM4-1 son aproximadamente dos veces más potentes que AAV8 para mediar la expresión de hFIX derivada del hígado (ver, por ejemplo, las Figuras 4 y 6).
Por lo tanto, AAV-Rh74 y las variantes de AAV-Rh74 como las variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1) pueden usarse para administrar polinucleótidos, tales como secuencias codificantes de genes, para expresar proteínas que proporcionan un beneficio deseable o terapéutico, así como para nucleótidos inhibidores que reducen o inhiben la expresión de un gen indeseable o defectuoso, para tratar así una variedad de enfermedades. Por ejemplo, se puede usar AAV-Rh74 y variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1) como vectores para administrar a las células, tejidos y órganos, tales como genes terapéuticos para el hígado (por ejemplo, FIX, FVIII) para tratar la hemofilia A, B, etc. Dichos vectores de AAV-Rh74 y variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1) también se pueden usar para administrar genes para una amplia gama de otras deficiencias metabólicas o de proteínas plasmáticas, o para otros fines terapéuticos, tales como, entre otros, genes que codifican nucleasas de dedos de zinc para llevar a cabo la edición del genoma en el hígado, y para la administración local (hepática) de agentes inmunomoduladores como interferón alfa para el tratamiento de infecciones por el virus de la hepatitis, o para tratar prácticamente cualquier enfermedad que requiera la transducción hepática o la presencia del producto transgénico terapéutico en el torrente sanguíneo (que se puede lograr dirigiendo los transgenes para la expresión hepática).
Además de la administración eficiente de polinucleótidos mediante vectores de AAV-Rh74 y AAV relacionados como las variantes de AAV-Rh74 tales como las variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1) a las células in vitro, ex vivo e in vivo, la prevalencia de anticuerpos anti-AAV-Rh74 en humanos es menor que la de los anticuerpos anti-AAV2, y difiere de la de los anticuerpos anti-AAV8 (Tabla 1). Debido a la baja seroprevalencia, los vectores de AAV-Rh74 y AAV relacionados tales como las variantes (de la cápside) de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1) se pueden usar en un mayor porcentaje de seres humanos, que de otro modo no serían elegibles para la transferencia de genes, por ejemplo, seres humanos que podrían ser seropositivos para otros serotipos de AAV (por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, Aa V8, AAV9, AAV10 , AAv 11, etc.). Además, el AAV-Rh74 y los vectores relacionados, como las variantes del AAV-Rh74, incluidas las variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1), pueden producirse de manera eficiente a títulos elevados (Tabla 2). Por lo tanto, se puede producir AAV-Rh74 y vectores de AAV relacionados en grandes cantidades para las enfermedades clínicas de mayor prevalencia.
En la presente memoria también se describen vectores recombinantes de AAV-Rh74 y vectores de AAV relacionados tales como variantes de AAV-Rh74 tales como partículas de variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1) que incluyen (encapsidan, empaquetan) genomas de vectores de AAV. Un vector de AAV recombinante puede incluir una secuencia polinucleotídica heteróloga. Un genoma del vector de AAV recombinante puede ser encapsidado o empaquetado por una cápside de AAV-Rh74 o un AAV relacionado, tal como las variantes de AAV-Rh74, tal como una variante de la cápside (por ejemplo, RHM4-1).
En vectores de AAV recombinantes, tales como vectores de AAV-Rh74 y vectores de AAV relacionados, tales como partículas de variantes (de la cápside) de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1) que incluyen (encapsidan, empaquetan) los genomas de vectores de AAV recombinantes, la secuencia polinucleotídica heteróloga puede o es transcrita y posteriormente traducida en una proteína. Alternativamente, el polinucleótido heterólogo puede transcribirse en un transcrito que en sí mismo tiene una función o actividad (por ejemplo, como un ácido nucleico inhibidor).
En varios aspectos, la secuencia polinucleotídica heteróloga codifica una proteína terapéutica. En aspectos particulares, la proteína es un factor de coagulación sanguínea (por ejemplo, Factor XIII, Factor IX, Factor X, Factor VIII, Factor VIIa o proteína C), CFTR (proteína reguladora transmembrana de fibrosis quística), un anticuerpo, proteína de 65 kDa específica del epitelio pigmentario de la retina (RPE65), eritropoyetina, receptor de LDL, lipoproteína lipasa, ornitina transcarbamilasa, p-globina, a-globina, espectrina, a-antitripsina, adenosina desaminasa (ADA), un transportador de metal (ATP7A o a TP7), sulfamidasa, una enzima implicada en una enfermedad de almacenamiento lisosomal (ARSA), hipoxantina guanina fosforribosil transferasa, p-25 glucocerebrosidasa, esfingomielinasa, hexosaminidasa lisosómica, cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada, una hormona, un factor de crecimiento (por ejemplo, factores de crecimiento similares a la insulina 1 y 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico -3 y -4, factor neurotrófico derivado del cerebro, factor de crecimiento derivado de la glia, factor de crecimiento transformante a y p, etc.), una citocina (por ejemplo, a-interferón, p-interferón, interferón-Y, interleucina-2, interleucina-4, interleucina 12, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, linfotoxina, etc.), un producto de gen suicida (por ejemplo, timidina quinasa del virus del herpes simple, citosina desaminasa, toxina de la difteria, citocromo P450, desoxicitidina quinasa, factor de necrosis tumoral, etc.), una proteína de resistencia a medicamentos (por ejemplo, que proporciona resistencia a un medicamento utilizado en la terapia contra el cáncer), una proteína supresora de tumores (por ejemplo, p53, Rb, Wt-1, NF1, Von Hippel-Lindau (VHL), poliposis coli adenomatosa (APC)), un péptido con propiedades inmunomoduladoras, un péptido o proteína tolerogénica o inmunogénica Tregitopes, o hCDRI, insulina, glucoquinasa, guanilato ciclasa 2d (LCA-GUCY2D), proteína de acompañamiento Rab 1 (Coroideremia), LCA 5 (LCA- lebercilina), aminotransferasa de cetoácido de ornitina (atrofia girata), retinosquisis 1 (retinosquisis ligada a X), USH1C (síndrome de Usher 1C), GTPasa de retinitis pigmentaria ligada a X (XLRP), m Er TK (formas de AR de RP: retinitis pigmentaria), DFNB1 (sordera asociada a conexina 26), ACHM 2, 3 y 4 (acromatopsia), PKD-1 o PKD-2 (enfermedad poliquística del riñón), TPP1, CLN2, deficiencias genéticas causales de enfermedades de almacenamiento lisosómico (por ejemplo, sulfatasas, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, catepsina A, GM2-AP, NPC1, VPC2, proteínas activadoras de esfingolípidos, etc.), una o más nucleasas de dedos de zinc para la edición del genoma o secuencias de donantes utilizadas como moldes de reparación para la edición del genoma.
En aspectos adicionales, la secuencia polinucleotídica heteróloga codifica una proteína terapéutica que a su vez inhibe la expresión o función de una proteína indeseable o anormal (disfuncional) presente (endógena) en un sujeto. En otros aspectos, la secuencia polinucleotídica heteróloga es un polinucleótido que, cuando se transcribe, se transcribe en un ácido nucleico inhibidor (por ejemplo, ARN inhibidor). En aspectos más particulares, un ácido nucleico inhibidor es una secuencia monocatenaria, o forma una secuencia bicatenaria o tricatenaria. En otros aspectos más particulares, un ácido nucleico inhibitorio es un micro-ARN (miRNA), ARNip, shRNA, ARN trans-empalme, ARN antisentido o ARN de formación triple.
En otros aspectos más particulares, un ácido nucleico inhibidor inhibe la expresión de: gen de la huntingtina (HTT), un gen asociado con la atrofia dentatorubropalidoluisiana (por ejemplo, atrofina 1, ATN1); el receptor de andrógenos del cromosoma X en la atrofia muscular espinobulbar, ataxina humana 1, 2, 3 y 7, el canal de calcio dependiente de voltaje Cav2.1 P/Q codificado por (CACNA1A), proteína de unión a TATA, cadena opuesta de Ataxina 8, también conocida como ATXN8OS, isoforma de la subunidad B beta reguladora de 55 kDa de serina/treonina-proteína fosfatasa 2A en la ataxia espinocerebelosa (tipo 1,2, 3, 6, 7, 8, 12, 17), FMR1 (retraso mental por X frágil 1) en el síndrome X frágil, FMR1 (retraso mental por X frágil 1) en el síndrome de ataxia/temblor asociado a X frágil, FMR1 (retraso mental por X frágil 2) o miembro 2 de la familia AF4/FMR2 en retraso mental por XE frágil; Miotonina proteína quinasa (MT-PK) en distrofia miotónica; Frataxina en la ataxia de Friedreich; un mutante del gen de superóxido dismutasa 1 (SOD1) en la esclerosis lateral amiotrófica; un gen involucrado en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson y/o la enfermedad de Alzheimer; apolipoproteína B (APOB) y proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), hipercolesterolemia; Tat de VIH, transactivador del virus de la inmunodeficiencia humana del gen de transcripción, en la infección por VIH; TAR de VIH, gen con elemento de respuesta del transactivador del virus de inmunodeficiencia humana, en la infección por VIH; receptor de quimiocina C-C (CCR5) en la infección por VIH; proteína de la nucleocápside del virus del sarcoma de Rous (RSV) en la infección por el RSV, microARN específico de hígado (miR-122) en la infección por el virus de la hepatitis C; p53, lesión renal aguda o retraso de la función del injerto en el trasplante renal o lesión renal en la insuficiencia renal aguda; proteína quinasa N3 (PKN3) en tumores malignos sólidos metastásicos o recurrentes avanzados; LMP2, LMP2 también conocida como subunidad proteasómica beta-tipo 9 (PSMB 9), melanoma metastásico; LMP7, también conocida como subunidad proteasómica tipo beta 8 (PSMB 8), melanoma metastásico; MECL1 también conocida como subunidad proteasoma betatipo 10 (PSMB 10), melanoma metastásico; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en tumores sólidos; proteína del huso de quinesina en tumores sólidos, supresor de la apoptosis de CLL de células B/linfoma (BCL-2) en leucemia mieloide crónica; ribonucleótido reductasa M2 (RRM2) en tumores sólidos; furina en tumores sólidos; quinasa tipo polo 1 (PLK1) en tumores hepáticos, diacilglicerol aciltransferasa 1 (DGAT1) en la infección por hepatitis C, beta-catenina en poliposis adenomatosa familiar; receptor adrenérgico beta2, glaucoma; RTP801/Redd1 también conocida como proteína 4 de transcrito inducible por daño en el ADN, en el edema macular diabético (DME) o la degeneración macular relacionada con la edad; receptor I del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR1) en la degeneración macular relacionada con la edad o la neovascularización coroidea, la caspasa 2 en la neuropatía óptica isquémica no arterítica; proteína mutante de queratina 6A N17K en paquioniquia congénita; secuencias genómicas/génicas del virus de la gripe A en la infección por gripe; secuencias genómicas/génicas del coronavirus en el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) en la infección por SARS; secuencias genómicas/génicas del virus sincitial respiratorio en la infección por virus sincitial respiratorio; secuencia genómica/génica del filovirus del Ébola en la infección por Ébola; secuencias genómicas/génicas del virus de la hepatitis B y C en la infección por hepatitis B y C; secuencias genómicas/génicas del virus del herpes simple (HSV) en la infección por HSV, secuencias genómicas/génicas del coxsackievirus B3 en la infección por coxsackievirus B3; silenciamiento de un alelo patogénico de un gen (silenciamiento específico de alelo) como torsina A (TORI A) en la distonía primaria, alelo pan-clase I y alelo específico de HLA en un trasplante; gen de la rodopsina mutante (RHO) en la retinitis pigmentaria hereditaria autosómica dominante (adRP); o el ácido nucleico inhibitorio se une a un transcrito de cualquiera de los genes o secuencias anteriores.
Los vectores de AAV recombinantes y AAV-Rh74 y los vectores de AAV relacionados, como las variantes de vectores de AAV-Rh74, tales como las partículas de variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1) que incluyen (encapsidan, empaquetan) el genoma de vector de AAV recombinante incluyen elementos adicionales que funcionan en cis o en trans. Un vector viral recombinante (por ejemplo, AAV) y/o un vector de AAV-Rh74 o un vector de AAV relacionado, tal como una partícula de variantes (de la cápside) del AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1) que incluye (encapsida, empaqueta) el genoma del vector de AAV recombinante también puede tener: una o más secuencias de repetición terminal invertida (ITR) que flanquean el extremo 5' o 3' de la secuencia polinucleotídica heteróloga; una secuencia de control de la expresión que dirige la transcripción de la secuencia polinucleotídica heteróloga (por ejemplo, un promotor o potenciador que contribuye a la transcripción de la secuencia polinucleotídica heteróloga, como un elemento de control constitutivo o regulable, o un elemento de control de la expresión específico de tejido); una secuencia de poliadenina localizada en 3' de la secuencia polinucleotídica heteróloga; un marcador de selección (por ejemplo, una proteína que proporciona resistencia a los antibióticos, como resistencia a la kanamicina); y/o un origen de replicación.
Los vectores de AAV recombinantes y los vectores de AAV-Rh74 y los vectores de AAV relacionados, tales como las variantes de AAV-Rh74, incluidas las partículas de variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1) que incluyen (encapsidan, empaquetan) el genoma del vector de AAV recombinante también pueden incluir elementos adicionales. Un genoma de vector recombinante puede incluir una secuencia polinucleotídica heteróloga y un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno. En aspectos particulares, una secuencia polinucleotídica heteróloga tiene una longitud menor que aproximadamente 4,7 Kb. En otros aspectos particulares, una secuencia polinucleotídica heteróloga tiene una longitud menor que 4,7 Kb y se ubica dentro de dos secuencias ITR de virus adenoasociados (AAV). En aspectos particulares adicionales, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno tiene una longitud que cuando se combina con la secuencia polinucleotídica heteróloga, la longitud total combinada de la secuencia polinucleotídica heteróloga y el relleno o secuencia polinucleotídica de relleno está entre aproximadamente 3,0-5,5 Kb, o entre aproximadamente 4,0-5,0 Kb, o entre aproximadamente 4,3-4,8 Kb.
El relleno o secuencias polinucleotídicas de relleno pueden ubicarse en la secuencia del vector en cualquier posición deseada de manera que no impida una función o actividad del vector. En un aspecto, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno no se ubica entre una ITR 5' y/o 3' que flanquea los respectivos extremos 5' y/o 3' de una secuencia polinucleotídica heteróloga. En otro aspecto, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno se ubica dentro de una ITR 5' y/o 3' que flanquea los respectivos extremos 5' y/o 3' de una secuencia polinucleotídica heteróloga. En un aspecto adicional, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno se ubica adyacente a una ITR 5' y/o 3' que flanquea los respectivos extremos 5' y/o 3' de una secuencia polinucleotídica heteróloga. En un aspecto adicional, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno se ubica dentro de una secuencia polinucleotídica heteróloga, por ejemplo, análoga a un intrón dentro de un ácido nucleico genómico.
Por consiguiente, en diversos aspectos, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno se ubica adyacente a una secuencia ITR de AAV; se ubica dentro de dos secuencias ITR de virus adenoasociados (AAV); se ubica fuera de dos secuencias ITR de virus adenoasociado (AAV); o hay dos rellenos o secuencias polinucleotídicas de relleno, un primer relleno o secuencia polinucleotídica de relleno que se ubica dentro de dos secuencias ITR de virus adenoasociado (AAV), y un segundo relleno o secuencia polinucleotídica de relleno que se ubica fuera de dos secuencias ITR de virus adenoasociado (AAV).
En aspectos más particulares, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno tiene una longitud que cuando se combina con dicha secuencia polinucleotídica heteróloga, la longitud total combinada de la secuencia polinucleotídica heteróloga y el relleno o secuencia polinucleotídica de relleno está entre aproximadamente 3,0-5,5 Kb, entre aproximadamente 4,0­ 5,0 Kb, o entre aproximadamente 4,3-4,8 Kb, cuando se ubica dentro de dos secuencias ITR de virus adenoasociado (AAV). En otros aspectos más particulares, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno tiene una longitud mayor que 4,7 Kb, entre aproximadamente 5,0-10,0 Kb, o entre aproximadamente 6,0-8,0 Kb, cuando se ubica fuera de dos secuencias ITR de virus adenoasociado (AAV).
En varios aspectos adicionales, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno es una secuencia entre aproximadamente 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100- 150, 150-200, 200-250, 250-300, 300­ 400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5500-6000, 6000-7000, 7000-8000, u 8000-9000 nucleótidos de longitud.
Típicamente, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno es inerte o inocuo y no tiene función ni actividad. En varios aspectos particulares, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno no es una secuencia polinucleotídica bacteriana, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno no es una secuencia que codifica una proteína o péptido, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno es una secuencia distinta de cualquiera de: la secuencia polinucleotídica heteróloga, una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de AAV, un elemento de control de la expresión, un origen de replicación, un marcador de selección o una secuencia de poli-adenina (poli-A).
En varios aspectos particulares adicionales, un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno es una secuencia intrónica que está relacionada o no con la secuencia polinucleotídica heteróloga. En aspectos particulares, la secuencia intrónica se ubica dentro de la secuencia polinucleotídica heteróloga. En otros aspectos particulares, la secuencia intrónica está relacionada con la secuencia polinucleotídica heteróloga ya que el intrón está en el ADN genómico, tal como el ADN genómico que codifica una proteína la cual también está codificada por la secuencia polinucleotídica heteróloga.
Los vectores de AAV recombinantes y AAV-Rh74 y los vectores de AAV relacionados, tales como las variantes de AAV-Rh74, tales como las partículas de variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1) que incluyen (encapsidan, empaquetan) el genoma del vector de AAV recombinante se pueden incluir dentro de las células. Las células pueden comprender células auxiliares lisadas para producir partículas de virus (AAV) (por ejemplo, vectores de AAV-Rh74 o vectores de AAV relacionados como las variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1)), o células objetivo en las que se desea expresar la secuencia polinucleotídica heteróloga.
Los vectores de AAV recombinantes y los vectores de AAV-Rh74 y los vectores de AAV relacionados, tales como las partículas de las variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1) que incluyen (encapsidan, empaquetan) el genoma del vector de AAV recombinante pueden incluirse dentro de las composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones son útiles para la administración del vector recombinante (por ejemplo, AAV) y partículas virales como los vectores de AAV-Rh74 y vectores de AAV relacionados como las variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1) que incluyen (encapsidan, empaquetan) los genomas de vectores recombinantes (por ejemplo, AAV) a un sujeto.
Los vectores de AAV recombinantes y los vectores de AAV-Rh74 y los vectores de AAV relacionados, tales como las partículas de las variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, las variantes de la cápside como RHM4-1) que incluyen (encapsidan, empaquetan) el genoma del vector de AAV recombinante pueden emplearse en diversos métodos y usos. En consecuencia, se proporcionan métodos y usos para administrar o transferir una secuencia polinucleotídica heteróloga a un organismo o célula, tal como un mamífero o una célula de un mamífero.
Un método o uso puede incluir la administración de un vector de virus adenoasociado (AAV) que incluye una secuencia polinucleotídica heteróloga (por ejemplo, a través de un vector de AAV-Rh74 o AAV relacionado, como una partícula de variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1)) que incluye (encapsida, empaqueta) el genoma del vector a un mamífero o una célula de un mamífero en condiciones adecuadas para administrar o transferir la secuencia polinucleotídica heteróloga al mamífero o la célula de un mamífero. En un aspecto, el método o uso permite la transferencia/administración del polinucleótido heterólogo al mamífero y/o la célula. En otro aspecto, el método permite la transferencia/administración del polinucleótido heterólogo al mamífero y/o la célula, y la posterior transcripción del polinucleótido heterólogo formando así un transcrito. En otro aspecto, el método permite la transferencia/administración del polinucleótido heterólogo a la célula, la transcripción posterior para formar un transcrito y la traducción posterior para formar un producto génico (proteína). En particular, por ejemplo, en los dos últimos aspectos, una secuencia polinucleotídica heteróloga se une de forma operable a un elemento de control de la expresión que confiere la transcripción de la secuencia polinucleotídica heteróloga, y opcionalmente la traducción posterior del transcrito.
En aspectos adicionales, un método o uso es para administrar o transferir una secuencia polinucleotídica heteróloga a un sujeto (por ejemplo, mamífero) o una célula de un sujeto (por ejemplo, mamífero), e incluye administrar una partícula viral (por ejemplo, AAV-Rh74 o AAV relacionado tales como partículas de variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1)), una pluralidad de tales partículas virales (por ejemplo, AAV) o una composición farmacéutica de dicha partícula viral (por ejemplo, de AAV-Rh74 o AAV relacionado) tales como las variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1) o una pluralidad de tales partículas virales (por ejemplo, de AAV) a un sujeto (por ejemplo, mamífero) o una célula del sujeto (por ejemplo , mamífero), para así administrar o transferir una secuencia polinucleotídica heteróloga al sujeto (por ejemplo, mamífero) o la célula del sujeto (por ejemplo, mamífero). Un método o uso puede ser para tratar a un sujeto (por ejemplo, un mamífero) deficiente o que necesita una expresión o función proteica, o que necesita una expresión o función reducida de una proteína endógena (por ejemplo, una proteína indeseable, anormal o disfuncional), que incluye proporcionar una partícula viral (por ejemplo, AAV-Rh74 y AAV relacionado, como partículas de variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1)), una pluralidad de tales partículas virales (por ejemplo, de AAV) o una composición farmacéutica de una partícula viral (por ejemplo, de AAV-Rh74 y AAV relacionado, tal como variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1)) o una pluralidad de tales partículas virales (por ejemplo, AAV); y administrar la partícula viral (por ejemplo, de AAV-Rh74 y AAV relacionado, como las variantes de a Av -Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1)), la pluralidad de tales partículas virales (por ejemplo, de AAV), o la composición farmacéutica de la partícula viral (por ejemplo, de AAV-Rh74 y AAV relacionados, tales como las partículas de variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1)) o una pluralidad de tales partículas virales (por ejemplo, AAV) al sujeto (por ejemplo, mamíferos), donde la secuencia polinucleotídica heteróloga se expresa en el mamífero, o en donde la secuencia polinucleotídica heteróloga codifica una secuencia o proteína inhibidora que reduce la expresión o función de una proteína endógena (por ejemplo, una proteína indeseable, anormal o disfuncional) en el sujeto (por ejemplo, mamífero).
Los métodos y usos para la administración o suministro incluyen cualquier modo compatible con un sujeto. En aspectos particulares, una partícula viral (por ejemplo, de AAV-Rh74 o Aa V relacionado, como variante de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1)) o una pluralidad de tales partículas virales (por ejemplo, AAV) (por ejemplo, vectores de AAV-Rh74 o vectores de AAV relacionados, tales como variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1)) se administra o suministra por vía intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, oral, por intubación, por catéter, dérmica, intracraneal, por inhalación, intracavitaria o mucosal.
Los sujetos incluyen mamíferos, como seres humanos y no humanos (por ejemplo, primates). En aspectos particulares, un sujeto se beneficiaría o necesita la expresión de una secuencia polinucleotídica heteróloga.
En la presente memoria también se describen métodos para producir plásmidos y partículas virales de vectores recombinantes (por ejemplo, AAV) (por ejemplo, AAV-Rh74 y AAV relacionados, tales como variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1)) que incluyen (encapsidan, empaquetan) un vector recombinante (por ejemplo, AAV). Un método para producir partículas virales o de AAV recombinantes puede incluir introducir en una célula auxiliar de empaquetamiento un plásmido de un vector recombinante (por ejemplo, de AAV) para producir una infección viral productiva (por ejemplo, de AAV-Rh74 y AAV relacionado, como las variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1)); y cultivar las células auxiliares en condiciones para producir partículas virales recombinantes (por ejemplo, de AAV-Rh74 o AAV relacionado, tales como variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1)). Además, un método para producir partículas virales o de AAV recombinantes con cantidades reducidas de partículas virales recombinantes (por ejemplo, de AAV-Rh74 y AAV relacionado, tales como variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1)) en las que el vector viral recombinante incluye ácido nucleico contaminante, puede incluir introducir en una célula auxiliar de empaquetamiento un plásmido de un vector recombinante (por ejemplo, de AAV); y cultivar las células auxiliares en condiciones para producir partículas virales recombinantes (por ejemplo, de AAV-Rh74 y AAV relacionado, tales como variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside, tales como RHM4-1)), en donde las partículas virales recombinantes (por ejemplo, de AAV-Rh74 y AAV relacionado, tales como las variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1)) producidas tienen un número reducido de partículas virales (por ejemplo, de AAV-Rh74 y AAV relacionado, como las variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside tales como RHM4-1)) con genomas de vectores recombinantes que contienen ácido nucleico contaminante en comparación con el número de partículas virales (por ejemplo, de AAV-Rh74 y AAV relacionados, como las variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1)) que contienen ácido nucleico contaminante producido en condiciones en las que el relleno o secuencia polinucleotídica de relleno está ausente del vector viral recombinante. En aspectos particulares, el ácido nucleico contaminante es ácido nucleico bacteriano; o una secuencia distinta de la secuencia polinucleotídica heteróloga, o ITR, promotor, potenciador, origen de replicación, secuencia de poli-adenina o marcador de selección.
Las células auxiliares incluyen células de mamífero. Una célula auxiliar puede proporcionar funciones auxiliares (por ejemplo, de AAV) para empaquetar la secuencia polinucleotídica heteróloga en una partícula viral (por ejemplo, Partícula de AAV tal como AAV-Rh74 y vectores de AAV relacionados tales como variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside tales como RHM4-1)). En aspectos particulares, una célula auxiliar proporciona proteínas Rep y/o Cap de AAV (por ejemplo, proteínas Rep78 o/y Rep68); una célula auxiliar se transfecta de manera estable o transitoria con polinucleótido(s) que codifica(n) la(s) secuencia(s) de proteínas Rep y/o Cap; una célula auxiliar se transfecta de manera estable o transitoria con la(s) secuencia(s) que codifica(n) el polinucleótido de la proteína Rep78 y/o Rep68.
Los plásmidos del vector recombinante (por ejemplo, AAV) pueden basarse en cualquier cepa o serotipo, incluidos híbridos o quimeras de diferentes serotipos. Las partículas virales recombinantes (por ejemplo, de AAV) se basan típicamente en AAV-Rh74 o AAV relacionado, como AAV-Rh74 y AAV relacionado, como las variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1)), pero también incluyen híbridos o quimeras con diferentes serotipos. Los serotipos de AAV representativos incluyen, sin limitación, los serotipos AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y Rh10. En consecuencia, las partículas virales recombinantes (por ejemplo, AAV) que comprenden genomas de vectores pueden incluir una proteína de la cápside de un serotipo diferente, una mezcla de serotipos o híbridos o quimeras de diferentes serotipos, como una proteína de la cápside VP1, VP2 o VP3 del serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10. Además, los vectores recombinantes (por ejemplo, AAV), secuencias, plásmidos, genomas vectoriales, pueden incluir elementos de cualquier serotipo, una mezcla de serotipos, o híbridos o quimeras de diferentes serotipos. Un vector de AAV recombinante puede incluir una secuencia de Cap, Rep y/o ITR derivadas del serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 o Rh10, o una mezcla, híbrido o quimera de cualquiera de los serotipos AAV anteriores.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra los niveles plasmáticos de factor IX humano (FIX) en ratones C57BL/6 (n = 5 por grupo) a los que se inyectaron a través de la vena de la cola vectores de AAV que expresaban el transgén FIX bajo control de un promotor específico de hígado. Dosis de vector 2,510 genomas de vector por ratón. Los niveles plasmáticos del producto del transgén FIX (proteína FIX) se midieron mediante ELISA en las semanas 1,2 y 4 tras la transferencia génica. AAV-Rh74 confirió los niveles más altos de expresión del transgén FIX.
La Figura 2 muestra los niveles plasmáticos de FIX canino en perros con hemofilia B después de la administración de 312 genomas de vectores por kilogramo (kg) de peso. Los vectores de AAV se infundieron por vía intravenosa (IV) a través de la vena safena, y se monitorizaron los niveles de FIX mediante ELISA. La expresión del transgén terapéutico FIX estaba controlada por un promotor específico de hígado. Los vectores AAV8 y AAV-Rh74 tuvieron un rendimiento similar en perros con hemofilia B, y fueron superiores a AAV6.
La Figura 3 muestra las secuencias de aminoácidos de VP1, VP2 y VP3 de AAV-Rh74 y, para VP1, la secuencia de polinucleótidos (ADN) (SEQ ID NOs: 1-4).
La Figura 4 muestra la administración del vector AAV8 y AAVrh74 que expresaba el Factor IX humano (FIX) (bajo control de un promotor específico de hígado) a macacos rhesus, un primate no humano, y la expresión de FIX en los animales. Los animales que recibieron los vectores AAVrh74-FIX (las últimas dos barras en el margen derecho) expresaron el transgén FIX a niveles más altos en comparación con los otros grupos de animales inyectados a la misma dosis.
La Figura 5 muestra los niveles de expresión del factor IX humano en plasma en animales a los que se administró el vector de expresión del factor IX humano de AAV encapsidado por el AAV indicado (variantes de Rh74, tales como la variante RHM4-1), en comparación con el vector de expresión del factor IX humano de AAV encapsidado por Rh74 y AAV8.
La Figura 6 muestra la administración de un vector de AAV8 y variante RHM4-1 de AAV-Rh74 que expresa el Factor IX humano (bajo el control de un promotor específico de hígado) a macacos cangrejeros, un primate no humano, y la expresión de FIX en los animales.
Descripción detallada
La invención se basa, al menos en parte, en datos que indican que el serotipo AAV-Rh74 del virus adenoasociado (AAV) y variantes de AAV relacionados tales como variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6) tienen un alto tropismo hacia los hepatocitos, que son las células del hígado. Como un vector para la transferencia/administración de polinucleótidos (por ejemplo genes, ácido nucleico inhibidor, etc.) a las células, AAV-Rh74 y variantes de AAV relacionados como las variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6) pueden usarse para proporcionar niveles terapéuticos de expresión en el hígado después de la administración intravenosa. Además, la transferencia/administración de genes mediada por vectores de AAV-Rh74 y variantes de AAV relacionados, como las variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6) produjo niveles de expresión de proteínas que fueron significativamente más altos que varios otros serotipos (véanse, por ejemplo, las Figuras 1, 2, 4, 5 y 6). En particular, el vector de AAV-Rh74 y las variantes de la cápside de AAV-Rh74 relacionadas (por ejemplo, RHM4-1) dirigen los genes para el suministro al hígado con una eficiencia al menos comparable y típicamente superior al método de referencia para la transducción hepática, AAV8, en perros y/o en ratones y/o macacos con hemofilia B. Por lo tanto, los vectores de AAV-Rh74 y variantes de AAV relacionados como las variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1) se pueden usar para transferir/administrar polinucleótidos heterólogos, tales como secuencias codificantes (genes) para proteínas que proporcionan un beneficio deseable o terapéutico, así como un ácido nucleico inhibidor (por ejemplo, antisentido) que reduce o inhibe la expresión de un gen indeseable o defectuoso (por ejemplo, patológico), por lo que se trata una variedad de enfermedades. Por ejemplo, un genoma de vector recombinante (por ejemplo, AAV) puede empaquetarse o encapsidarse dentro del vector de AAV-Rh74 o variantes de AAV relacionados tales como variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6) para transferir/administrar un polinucleótido heterólogo en una célula.
Como se establece en la presente memoria, el virus adenoasociado (AAV) serotipo AAV-Rh74 y variantes de AAV relacionados, tales como las variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6) proporcionan un medio para el suministro de secuencias polinucleotídicas en células ex vivo, in vitro e in vivo. Dichas secuencias polinucleotídicas pueden codificar proteínas, de manera que las células en las que se administran los polinucleótidos expresan las proteínas codificadas. Por ejemplo, un vector de AAV recombinante puede incluir polinucleótidos heterólogos que codifican una proteína o péptido deseado, o un polinucleótido heterólogo que cuando se transcribe comprende una secuencia inhibidora (por ejemplo, ARN), por ejemplo, una secuencia que se dirige a un gen para la inhibición de la expresión. La administración o suministro del vector a un sujeto (por ejemplo, un mamífero), por lo tanto, proporciona no solo polinucleótidos heterólogos que codifican proteínas y péptidos al sujeto, sino también ácidos nucleicos inhibidores que se dirigen a genes para la inhibición de la expresión o función en el sujeto.
Por lo tanto, en la presente memoria se describen vectores de AAV-Rh74 y variantes de vectores de AAV relacionados, como las variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6) que incluyen (encapsidan o empaquetan) el genoma del vector que incluye secuencias polinucleotídicas que codifican péptidos y proteínas, así como secuencias polinucleotídicas que comprenden, directamente o cuando se transcriben, ácidos nucleicos inhibidores que se dirigen a genes para la inhibición de la expresión o función.
Un "vector" o "vector de AAV" recombinante se deriva del genoma de tipo natural de un virus, tal como AAV mediante el uso de métodos moleculares para eliminar el genoma de tipo natural del virus (por ejemplo, AAV) y reemplazarlo con un ácido nucleico no nativo, tal como una secuencia polinucleotídica heteróloga (por ejemplo, un casete de expresión génica terapéutico). Típicamente, para AAV, una o ambas secuencias de repetición terminal invertida (ITR) del genoma de AAV de tipo natural se mantienen en el vector de AAV. Un vector viral recombinante (por ejemplo, de AAV) se distingue de un genoma viral (por ejemplo, de AAV), ya que todo o parte del genoma viral ha sido reemplazado por una secuencia no nativa con respecto al ácido nucleico genómico viral (por ejemplo, de AAV) tal como una secuencia polinucleotídica heteróloga. Por lo tanto, la incorporación de una secuencia no nativa, como un polinucleótido heterólogo, define el vector viral (por ejemplo, AAV) como un vector "recombinante", que en el caso de AAV puede denominarse "vector rAAV."
Una secuencia de un vector recombinante (por ejemplo, de AAV) se puede empaquetar en un virus (también denominado en la presente memoria "partícula" o "virión") para la posterior infección (transformación) de una célula, ex vivo, in vitro o in vivo. Cuando una secuencia de un vector recombinante se encapsida o empaqueta en una partícula de AAV, la partícula se puede denominar "rAAV". Dichas partículas o viriones incluirán típicamente proteínas que encapsidan o empaquetan el genoma del vector. Ejemplos particulares incluyen proteínas de la envoltura viral y, en el caso de AAV, las proteínas de la cápside.
Un vector recombinante (por ejemplo, de AAV) puede ser un vector de parvovirus. Los parvovirus son virus pequeños con un genoma de ADN monocatenario. Los "virus adenoasociados" (AAV) pertenecen a la familia de los parvovirus.
Los parvovirus que incluyen AAV son virus útiles como vectores de terapia génica ya que pueden penetrar en las células e introducir ácido nucleico/material genético de manera que el ácido nucleico/material genético pueda mantenerse estable en las células. Además, estos virus pueden introducir ácido nucleico/material genético en sitios específicos, por ejemplo, como un sitio específico en el cromosoma 19. Debido a que el AAV no está asociado con la enfermedad patogénica en seres humanos, los vectores de AAV pueden administrar secuencias polinucleotídicas heterólogas (por ejemplo, proteínas y agentes terapéuticos) a pacientes humanos sin causar patogénesis o enfermedad sustancial por AAV.
El AAV-Rh74 y las variantes relacionadas del AAV, como el AAV-Rh74 o AAV relacionado, como los serotipos (por ejemplo, secuencias de VP1, VP2 y/o VP3) de las variantes del AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1) pueden ser distintos o no de otros serotipos de AAV, incluidos, por ejemplo, AAV1-AAV11 o Rh10 (por ejemplo, distinto de las secuencias de VP1, VP2 y/o VP3 de cualquiera de los serotipos de AAV1-AAV11 o Rh10). Como se usa en la presente memoria, el término "serotipo" es una distinción utilizada para referirse a un AAV que tiene una cápside que es serológicamente distinta de otros serotipos de AAV. La distinción serológica se determina basándose en la falta de reactividad cruzada entre los anticuerpos contra un AAV en comparación con otro AAV. Dichas diferencias de reactividad cruzada generalmente se deben a diferencias en las secuencias de proteínas de la cápside/determinantes antigénicos (por ejemplo, debido a las diferencias en las secuencias de VP1, VP2 y/o VP3 de los serotipos de AAV). A pesar de la posibilidad de que las variantes de AAV-Rh74, incluidas las variantes de la cápside, pueden no ser serológicamente distintas de Rh74 u otro AAV, difieren en al menos un residuo de nucleótido o aminoácido en comparación con Rh74 u otro AAV.
Según la definición tradicional, un serotipo significa que el virus de interés se ha probado contra suero específico para todos los serotipos existentes y caracterizados para neutralizar la actividad y no se han encontrado anticuerpos que neutralicen el virus de interés. A medida que se descubren más aislamientos de virus de origen natural y/o se generan mutantes de la cápside, puede haber o no diferencias serológicas con cualquiera de los serotipos existentes actualmente. Por lo tanto, en los casos en que el nuevo virus (por ejemplo, AAV) no tiene diferencia serológica, este nuevo virus (por ejemplo, AAV) sería un subgrupo o una variante del serotipo correspondiente. En muchos casos, las pruebas de serología para la actividad neutralizante aún no se han realizado en virus mutantes con modificaciones de la secuencia de la cápside para determinar si son de otro serotipo de acuerdo con la definición tradicional de serotipo. En consecuencia, por conveniencia y para evitar la repetición, el término "serotipo" se refiere en términos generales tanto a virus serológicamente distintos (por ejemplo, AAV) como a virus (por ejemplo, AAV) que no son serológicamente distintos que pueden estar dentro de un subgrupo o una variante de un serotipo dado.
Los plásmidos del vector recombinante (por ejemplo, de AAV), así como los métodos y usos de los mismos, incluyen cualquier cepa o serotipo viral. Como ejemplo no limitante, un plásmido de un vector recombinante (por ejemplo, de a Av ) puede basarse en cualquier genoma de a Av , como AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -rh74, -rh10 o AAV-2i8, por ejemplo. Dichos vectores pueden basarse en la misma cepa o serotipo (o subgrupo o variante), o ser diferentes entre sí. Como ejemplo no limitante, un plásmido de un vector recombinante (por ejemplo, de AAV) basado en el genoma de un serotipo puede ser idéntico a una o más de las proteínas de la cápside que empaquetan el vector. Además, un plásmido de un vector recombinante (por ejemplo, de AAV) puede basarse en un genoma de un serotipo de AAV (por ejemplo, AAV2) distinto de una o más de las proteínas de la cápside que empaquetan el vector, en cuyo caso al menos una de las tres proteínas de la cápside pueden ser una AAV-Rh74 o una variante de AAV relacionado como AAV-Rh74 o un AAV relacionado como las variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RH M15-5, RHM15-4 y RHM15-6), por ejemplo.
AAV-Rh74 tiene secuencias de genes/proteínas idénticas a las secuencias características de AAV-Rh74 (véanse, por ejemplo, VP1, VP2, VP3 de la Figura 3). Como se usa en la presente memoria, un "vector de AAV relacionado con a Av -Rh74" y las variaciones gramaticales del mismo se refieren a una o más proteínas de AAV (por ejemplo, secuencias de VP1, VP2 y/o VP3) que tienen una identidad de secuencia sustancial con una o más secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas que comprenden AAV-Rh74. Tales vectores de AAV relacionados con AAV-Rh74 pueden tener, por lo tanto, una o más secuencias distintas de AAV-Rh74, pero pueden exhibir una identidad de secuencia sustancial con uno o más genes y/o tener una o más características funcionales de AAV-Rh74 (por ejemplo, tales como tropismo celular/tisular). Por ejemplo, la variante de AAV RHM4-1 relacionada con AAV-Rh74 tiene una cápside con cuatro aminoácidos diferentes de la cápside Rh74. Ejemplos de AAV-Rh74 y variantes de AAV relacionados como AAV-Rh74 o AAV relacionado tales como las secuencias de las variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6) incluyen VP1, VP2 y/o VP3 establecidas en la presente, por ejemplo, en la Figura 3. En un ejemplo no limitante, un vector de AAV relacionado con AAV-Rh74 tiene un polinucleótido, polipéptido o subsecuencia de este que incluye o consiste en una secuencia al menos un 80 % o más (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, etc.) idéntica a una o más secuencias de VP1, VP2 y/o VP3 de AAV-Rh74 expuestas en la Figura 3.
En la presente memoria se describen métodos y usos que incluyen secuencias de AAV-Rh74 (polipéptidos y nucleótidos) y subsecuencias de las mismas que exhiben menos del 100 % de identidad de secuencia con una secuencia génica o proteica de AAV-Rh74 de referencia (por ejemplo, las secuencias de VP1, VP2 y/o VP3 expuestas en la Figura 3), pero son distintas y no idénticas a los genes o proteínas de AAV conocidos, tales como genes o proteínas de AAV1-AAV11, AAV-Rh10, etc. Un polipéptido de AAV-Rh74 o una subsecuencia del mismo puede incluir o consistir en una secuencia al menos un 80 % o más idéntica, por ejemplo, 85 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, etc., es decir, hasta un 100 % idéntica a cualquier secuencia de AAV-Rh74 de referencia o subsecuencia de la misma (por ejemplo, las secuencias de VP1, VP2 y/o VP3 expuestas en la Figura 3). En aspectos particulares, una variante relacionada con AAV-Rh74 tiene una, dos, tres o cuatro de las cuatro sustituciones de aminoácidos establecidas en AAV-Rh74 (por ejemplo, la variante de la cápside RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6).
Los vectores recombinantes (por ejemplo, de AAV), incluidos AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 o AAV-2i8 y las secuencias variantes, relacionadas, híbridas y quiméricas, pueden construirse mediante el uso de técnicas recombinantes que son conocidas por los expertos en la técnica, para incluir una o más secuencias polinucleotídicas heterólogas (transgenes) flanqueadas con una o más secuencias funcionales de ITR de AAV. Dichos vectores pueden tener uno o más de los genes de AAV de tipo natural delecionados completamente o en parte, por ejemplo, un gen rep y/o cap, pero conservan al menos una secuencia ITR flanqueante funcional, según sea necesario para el rescate, la replicación y el empaquetamiento del vector recombinante en una partícula del vector de AAV. Por lo tanto, un genoma de vector de AAV incluiría secuencias requeridas en cis para la replicación y el empaquetamiento (por ejemplo, secuencias ITR funcionales)
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a todas las formas de ácido nucleico, oligonucleótidos, que incluyen el ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). Los polinucleótidos incluyen ADN genómico, cADN y ADN antisentido, y ARNm sometido o no a corte y empalme, ARNr, ARNt y ADN o ARN inhibidor (ARNi, por ejemplo, (sh)ARN en horquilla pequeña o corta, microARN (miRNA), (si)ARN de interferencia pequeño o corto, ARN de corte y empalme en trans o a Rn antisentido). Los polinucleótidos incluyen polinucleótidos de origen natural, sintéticos y alterados o modificados intencionadamente, así como análogos y derivados. Los polinucleótidos pueden ser simples, dobles o triples, lineales o circulares, y pueden tener cualquier longitud. Al analizar los polinucleótidos, en la presente memoria se puede describir una secuencia o estructura de un polinucleótido particular de acuerdo con la convención de proporcionar la secuencia en la dirección 5' a 3'.
Un polinucleótido "heterólogo" se refiere a un polinucleótido insertado en un vector (por ejemplo, AAV) para fines de transferencia/administración, mediada por el vector, del polinucleótido a una célula. Los polinucleótidos heterólogos son típicamente distintos del ácido nucleico del vector (por ejemplo, de AAV), es decir, no son nativos con respecto al ácido nucleico viral (por ejemplo, AAV). Una vez transferido/administrado a la célula, un polinucleótido heterólogo, contenido dentro del virión, se puede expresar (por ejemplo, transcribir y traducir, si es apropiado). Alternativamente, no es necesaria la expresión de un polinucleótido heterólogo transferido/administrado en una célula, contenido dentro del virión. Aunque el término "heterólogo" no siempre se usa en la presente memoria en referencia a los polinucleótidos, la referencia a un polinucleótido incluso en ausencia del modificador "heterólogo" incluye los polinucleótidos heterólogos a pesar de la omisión.
Los "polipéptidos", "proteínas" y "péptidos" codificados por las "secuencias polinucleotídicas" incluyen secuencias nativas de longitud completa, como con las proteínas de origen natural, así como subsecuencias funcionales, formas modificadas o variantes de secuencia siempre que la subsecuencia, la forma o variante modificada conserve cierto grado de funcionalidad de la proteína nativa de longitud completa. En los métodos y usos descritos en la presente memoria, dichos polipéptidos, proteínas y péptidos codificados por las secuencias polinucleotídicas pueden ser, aunque no necesariamente, idénticos a la proteína endógena que es defectuosa, o cuya expresión es insuficiente o deficiente en el mamífero tratado.
Los virus adenoasociados (AAV) serotipo AAV-Rh74 y variantes de AAV relacionados como variantes de AAV-Rh74 (por ejemplo, variantes de la cápside como RHM4-1, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6), pueden usarse para introducir/administrar polinucleótidos de forma estable o transitoria en las células y la progenie de las mismas. El término "transgén" se usa en la presente memoria para referirse convenientemente a dicho polinucleótido heterólogo que se ha introducido en una célula u organismo. Los transgenes incluyen cualquier polinucleótido, como un gen que codifica un polipéptido o una proteína, un polinucleótido que se transcribe hasta un polinucleótido inhibidor o un polinucleótido que no se transcribe (por ejemplo, carece de un elemento de control de la expresión, como un promotor que controla la transcripción).
Por ejemplo, en una célula que tiene un transgén, el transgén se ha introducido/transferido mediante la "transformación" de la célula con un vector, tal como AAV. Los términos "transformar" y "transfectar" se refieren a la introducción de una molécula tal como un polinucleótido en una célula u organismo huésped.
Una célula en la que se ha introducido el transgén se denomina una “célula transformada” o “transformante”. Por consiguiente, una célula "transformada" o "transfectada" (por ejemplo, en un mamífero, como una célula o tejido o célula de un órgano), significa un cambio genético en una célula después de la incorporación de una molécula exógena, por ejemplo, un polinucleótido o proteína (por ejemplo, un transgén) en la célula. Por lo tanto, una célula "transfectada" o "transformada" es una célula, o una progenie de la misma, en la que se ha introducido una molécula exógena, por ejemplo. La(s) célula(s) puede(n) propagarse, y la proteína introducida se puede expresar, o el ácido nucleico se puede transcribir. Para usos y métodos de terapia génica, una célula transformada puede estar en un sujeto.
El polinucleótido introducido puede o no integrarse en el ácido nucleico de la célula u organismo receptor. Si un polinucleótido introducido se integra en el ácido nucleico (ADN genómico) de la célula u organismo receptor, puede mantenerse de forma estable en esa célula u organismo y transmitirse o heredarse por las células u organismos de la progenie de la célula u organismo receptor. Finalmente, el ácido nucleico introducido puede existir en la célula receptora o en el organismo huésped solo transitoriamente.
Las células que pueden transformarse incluyen una célula de cualquier tipo de tejido u órgano, de cualquier origen (por ejemplo, mesodermo, ectodermo o endodermo). Los ejemplos no limitantes de células incluyen hígado (por ejemplo, hepatocitos, células endoteliales sinusoidales), páncreas (por ejemplo, células de los islotes beta), pulmón, sistema nervioso central o periférico, como el cerebro (por ejemplo, Células neurales, gliales o ependimales) o médula espinal, riñón, ojo (por ejemplo, retina, componentes celulares), bazo, piel, timo, testículos, pulmón, diafragma, corazón (cardíaco), músculo o psoas, o intestino (por ejemplo, endocrino), tejido adiposo (blanco, marrón o beige), músculo (por ejemplo, fibroblastos), sinoviocitos, condrocitos, osteoclastos, células epiteliales, células endoteliales, células de las glándulas salivales, células nerviosas del oído interno o células hematopoyéticas (por ejemplo, sanguíneas o linfáticas). Otros ejemplos incluyen células madre, como las células progenitoras pluripotentes o multipotentes que se desarrollan o se diferencian en el hígado (por ejemplo, Hepatocitos, células endoteliales sinusoidales), páncreas (por ejemplo, células de los islotes beta), pulmón, sistema nervioso central o periférico, como el cerebro (por ejemplo, células neurales, gliales o ependimales) o médula espinal, riñón, ojo (retina, componentes celulares), bazo, piel, timo, testículos, pulmón, diafragma, corazón (cardíaco), músculo o psoas o intestino (por ejemplo, endocrino), tejido adiposo (blanco, marrón o beige), músculo (por ejemplo, fibroblastos), sinoviocitos, condrocitos, osteoclastos, células epiteliales, células endoteliales, células de las glándulas salivales, células nerviosas del oído interno o células hematopoyéticas (por ejemplo, sanguíneas o linfáticas).
Una "molécula terapéutica" puede ser un péptido o proteína que puede aliviar o reducir los síntomas que resultan de una ausencia o defecto en una proteína en una célula o sujeto. Alternativamente, un péptido o proteína "terapéutico" codificado por un transgén es uno que confiere un beneficio a un sujeto, por ejemplo, para corregir un defecto genético, para corregir una deficiencia genética (de expresión o funcional), o un efecto anticanceroso.
Los ejemplos no limitantes particulares de polinucleótidos heterólogos que codifican productos génicos (por ejemplo, proteínas terapéuticas) que son útiles de acuerdo con la presente descripción incluyen, pero sin limitación: genes que comprenden o codifican CFTR (proteína reguladora transmembrana de fibrosis quística), un factor de la coagulación sanguínea (de formación de coágulos) (Factor XIII, Factor IX, Factor X, Factor VIII, Factor VIIa, proteína C, etc.) que incluye factores de coagulación sanguínea con ganancia de función, un anticuerpo, proteína específica del epitelio pigmentario de la retina de 65 kDa (RPE65), eritropoyetina, receptor de LDL, lipoproteína lipasa, ornitina transcarbamilasa, P-globina, a-globina, espectrina, a-antitripsina, adenosina desaminasa (ADA), un transportador de metales (ATP7A o ATP7), sulfamidasa, una enzima involucrada en la enfermedad de almacenamiento lisosómico (ARSA), hipoxantina guanina fosforribosil transferasa, P-25 glucocerebrosidasa, esfingomielinasa, hexosaminidasa lisosómica, deshidrogenasa de cetoácidos de cadena ramificada, una hormona, un factor de crecimiento (por ejemplo, factores de crecimiento similares a insulina 1 y 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico -3 y -4, factor neurotrófico derivado de cerebro, factor de crecimiento derivado de la glía, factor de crecimiento transformante a y p, etc.), una citocina (por ejemplo, interferón a, interferón P, interferón y, interleucina-2, interleucina-4, interleucina 12, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, linfotoxina, etc.), un producto de gen suicida (por ejemplo, timidina quinasa del virus herpes simple, citosina desaminasa, toxina de la difteria, citocromo P450, desoxicitidina quinasa, factor de necrosis tumoral, etc.), una proteína de resistencia a medicamentos (por ejemplo, que proporciona resistencia a un medicamento utilizado en la terapia contra el cáncer), una proteína supresora de tumores (por ejemplo, p53, Rb, Wt-1, NF1, Von Hippel-Lindau (VHL), poliposis coli adenomatosa (APC)), un péptido con propiedades inmunomoduladoras, un péptido o proteína tolerogénica o inmunogénica Tregitopes [de Groot et al., Blood, 15 de oct. de 2008; 112(8): 3303], o hCDRI [Sharabi et al., Proc Natl Acad Sci USA. 6 de junio de 2006; 103 (23): 8810-5], insulina, glucoquinasa, guanilato ciclasa 2D (LCA-GUCY2D), proteína de acompañamiento Rab 1 (coroideremia), LCA 5 (LCA-lebercilina), aminotransferasa de cetoácido de ornitina (atrofia girata), Retinosquisis 1 (retinosquisis ligada al cromosoma X), USH1C (síndrome de Usher 1C), GTPasa de la retinitis pigmentaria ligada al X (XLRP), MERTK (formas AR de RP: retinitis pigmentaria), DFNB1 (sordera asociada a conexina 26), ACHM 2, 3 y 4 (acromatopsia), PKD-1 o PKD-2 (enfermedad renal poliquística), TPP1, CLN2, deficiencias genéticas causales de enfermedades de almacenamiento lisosómico (por ejemplo, sulfatasas, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, catepsina A, GM2-AP, NPC1, VPC2, proteínas activadoras de esfingolípidos, etc.), una o más nucleasas de dedos de zinc para la edición del genoma, o secuencias donantes utilizadas como moldes de reparación para la edición del genoma.
Otros ejemplos no limitantes de polinucleótidos heterólogos que codifican productos génicos (por ejemplo, proteínas terapéuticas) que son útiles de acuerdo con la presente descripción incluyen los que pueden usarse en el tratamiento de una enfermedad o trastorno que incluye, pero no se limita a, fibrosis quística (y otras enfermedades pulmonares), hemofilia A, hemofilia B, talasemia, anemia y otros trastornos sanguíneos, SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia y otros trastornos neurológicos, cáncer, diabetes mellitus, distrofias musculares (por ejemplo, Duchenne, Becker), enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hurler, deficiencia de adenosina desaminasa, enfermedades de almacenamiento de glucógeno y otros defectos metabólicos, enfermedades degenerativas de la retina (y otras enfermedades del ojo) y enfermedades de órganos sólidos (por ejemplo, cerebro, hígado, riñón, corazón).
Todas las formas mamíferas y no mamíferas de polinucleótidos que codifican productos génicos, incluidos los genes y proteínas no limitantes descritos en la presente memoria, están expresamente incluidos, ya sean conocidos o desconocidos. Por lo tanto, la presente descripción incluye genes y proteínas de animales no mamíferos, mamíferos que no son humanos y humanos, cuyos genes y proteínas funcionan de manera sustancialmente similar a los genes y proteínas humanos descritos en la presente memoria. Un ejemplo no limitante de gen no mamífero es un dominio de nucleasa Fok, que es de origen bacteriano. Ejemplos no limitantes de secuencias FIX de mamíferos no humanos se describen en Yoshitake et al., 1985, anteriormente mencionado; Kurachi et al., 1995, anteriormente mencionado; Jallat et al., 1990, anteriormente mencionado; Kurachi et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6461-6464; Jaye et al., 1983, Nucl. Acids Res. 11:2325-2335; Anson et al., 1984, EMBO J. 3: 1053-1060; Wu et al., 1990, Gene 86:275-278; Evans et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:10095 (1989), Blood 74:207-212; Pendurthi et al., 1992, Thromb. Res. 65:177-186; Sakar et al., 1990, Genomics 1990, 6:133-143; y Katayama et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4990-4994.
Como se expone en la presente memoria, las secuencias polinucleotídicas heterólogas (transgenes) incluyen secuencias de ácido nucleico inhibitorias y antisentido. Los oligonucleótidos inhibidores, antisentido, ARNip (a Rn interferente pequeño), miRNA (micro ARN), shARN (ARN en horquilla pequeña), ARNi y antisentido pueden modular la expresión de un gen objetivo. Dichas moléculas incluyen aquellas capaces de inhibir la expresión de un gen objetivo involucrado en la mediación de un proceso patológico, por lo que reduce, inhibe o alivia uno o más síntomas de una enfermedad.
Una molécula antisentido incluye polinucleótidos monocatenarios, bicatenarios o tricatenarios, y ácidos nucleicos peptídicos (PNA) que se unen a transcritos de ARN o ADN (por ejemplo, ADN genómico). Los oligonucleótidos derivados del sitio de inicio de la transcripción de un gen objetivo, por ejemplo, entre las posiciones -10 y 10 desde el sitio de inicio, son otro ejemplo particular. Las moléculas inversas que forman moléculas triples puede unirse al ADN bicatenario, inhibiendo así la transcripción del gen. "ARNi" es el uso de secuencias de ARN monocatenarias o bicatenarias para inhibir la expresión génica (véase, por ejemplo, Kennerdell et al., Cell 95: 1017 (1998); y Fire et al., Nature, 391: 806 (1998)). Las secuencias de ARN bicatenario de una región codificante de genes objetivo pueden usarse, por lo tanto, para inhibir o impedir la expresión/transcripción de genes de acuerdo con los métodos y usos descritos en la presente memoria. Los ARNi y antisentido pueden producirse sobre la base de ácidos nucleicos que codifican secuencias de genes objetivo (por ejemplo, huntingtina o HTT), tal como un ácido nucleico que codifica HTT de mamífero y humano. Por ejemplo, un ácido nucleico monocatenario o bicatenario (por ejemplo, ARN) puede seleccionar como objetivo el transcrito de HTT (por ejemplo, ARNm).
Un "ARNip" se refiere a una molécula terapéutica involucrada en el proceso de interferencia de ARN para una reducción génica o silenciamiento génico post-transcripcional específico de secuencia. Los ARNip tienen homología con la secuencia del ARNm afín del gen objetivo. Los ARN interferentes pequeños (ARNip) pueden sintetizarse in vitro o generarse mediante la escisión por la ribonucleasa III a partir de ARNdc más largos y son los mediadores de la degradación de ARNm específica de secuencia. El ARNip u otros ácidos nucleicos de este tipo descritos en la presente memoria pueden sintetizarse químicamente mediante el uso de fósforo amiditos de ribonucleósidos adecuadamente protegidos y un sintetizador de ADN/ARN convencional. El ARNip puede sintetizarse como dos moléculas de ARN complementarias separadas, o como una molécula de ARN única con dos regiones complementarias. Los proveedores comerciales de moléculas de ARN sintético o reactivos de síntesis incluyen Applied Biosystems (Foster City, CA, EE. UU.), Proligo (Hamburgo, Alemania), Dharmacon Research (Lafayette, Colorado, EE. UU.), Pierce Chemical (parte de Perbio Science, Rockford, Ill., EE. UU.), Glen Research (Sterling, Virginia, EE. UU.), ChemGenes (Ashland, Mass., EE. UU.) Y Cruachem (Glasgow, Reino Unido). Las construcciones específicas de ARNip para inhibir el ARNm de un gen objetivo pueden tener entre 15 y 50 nucleótidos de longitud, y más típicamente aproximadamente 20-30 nucleótidos de longitud. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden incorporarse fácilmente en los vectores virales descritos en la presente memoria mediante el uso de métodos convencionales conocidos por un experto en la materia.
Los ejemplos particulares y no limitantes de genes (por ejemplo, ADN genómico) o el transcrito de un gen patógeno (por ejemplo, ARN o ARNm) que se pueden seleccionar como objetivo con las secuencias inhibidoras de ácido nucleico descritas en la presente memoria incluyen, pero sin limitación: genes asociados con enfermedades de repetición de polinucleótidos como el gen de huntingtina (HTT), un gen asociado con la atrofia dentatorubropalidoluisiana (por ejemplo, atrofina 1, ATN1); receptor de andrógenos del cromosoma X en la atrofia muscular espinobulbar, ataxina-1, -2, -3 y -7 humana, canal de calcio dependiente de voltaje Cav2.1 P/Q codificado por (CACNA1A), proteína de unión a TATA, cadena opuesta de ataxina 8, también conocida como ATXN8OS, isoforma de la subunidad B beta reguladora de 55 kDa de serina/treonina-proteína fosfatasa 2A en la ataxia espinocerebelosa (tipo 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12, 17), FMR1 (retraso mental por X frágil 1) en el síndrome X frágil, FMR1 (retraso mental por X frágil 1) en el síndrome de ataxia/temblor asociado a X frágil, FMR1 (retraso mental por X frágil 2) o miembro 2 de la familia AF4/FMR2 en retraso mental por XE frágil; miotonina proteína quinasa (MT-PK) en distrofia miotónica; frataxina en la ataxia de Friedreich; un mutante del gen de superóxido dismutasa 1 (SOD1) en la esclerosis lateral amiotrófica; un gen involucrado en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson y/o la enfermedad de Alzheimer; apolipoproteína B (APOB) y proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), hipercolesterolemia; Tat de VIH, transactivador del gen de transcripción del virus de la inmunodeficiencia humana, en la infección por VIH; TAR de VIH, gen del elemento de respuesta del transactivador del virus de inmunodeficiencia humana, en la infección por VIH; receptor de quimiocina C-C (CCR5) en la infección por VIH; proteína de la nucleocápside del virus del sarcoma de Rous (RSV) en la infección por el RSV, microARN específico de hígado (miR-122) en la infección por el virus de la hepatitis C; p53, lesión renal aguda o retraso de la función del injerto en el trasplante renal o insuficiencia renal aguda por lesión renal; proteína quinasa N3 (PKN3) en tumores malignos sólidos metastásicos o recurrentes avanzados; LMP2, LMP2 también conocidas como subunidad proteasómica beta-tipo 9 (PSMB 9), melanoma metastásico; LMP7, también conocida como subunidad proteasómica beta tipo 8 (PSMB 8), melanoma metastásico; MECL1 también conocida como subunidad proteasómica beta-tipo 10 (PSMB 10), melanoma metastásico; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en tumores sólidos; proteína del huso de quinesina en tumores sólidos, supresor de la apoptosis de células B CLL/linfoma (BCL-2) en leucemia mieloide crónica; ribonucleótido reductasa M2 (RRM2) en tumores sólidos; furina en tumores sólidos; quinasa tipo polo 1 (PLK1) en tumores hepáticos, diacilglicerol aciltransferasa 1 (DGAT1) en la infección por hepatitis C, beta-catenina en poliposis adenomatosa familiar; receptor adrenérgico beta2, glaucoma; RTP801/Redd1 también conocida como proteína 4 de transcrito inducible por daño en el DAN, en el edema macular diabético (DME) o la degeneración macular relacionada con la edad; receptor I del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR1) en la degeneración macular relacionada con la edad o la neovascularización coroidea, la caspasa 2 en la neuropatía óptica isquémica no arterítica; proteína mutante queratina 6A N17K en paquioniquia congénita; secuencias genómicas/génicas del virus de la gripe A en la infección por gripe; secuencias genómicas/génicas del coronavirus en el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) en la infección por SARS; secuencias genómicas/génicas del virus sincitial respiratorio en la infección por virus sincitial respiratorio; secuencia genómica/génica del filovirus del Ébola en la infección por Ébola; secuencias genómicas/génicas del virus de la hepatitis B y C en la infección por hepatitis B y C; secuencias genómicas /génicas del virus del herpes simple (HSV) en la infección por HSV, secuencias genómicas/génicas del coxsackievirus B3 en la infección por coxsackievirus B3; silenciamiento de un alelo patogénico de un gen (silenciamiento específico de alelo) como torsina A (TOR1A) en la distonía primaria, alelo pan-clase I y alelo de HLA específico en un trasplante; o gen de la rodopsina mutante (RHO) en la retinitis pigmentaria hereditaria autosómica dominante (adRP).
Los polinucleótidos, polipéptidos y subsecuencias de los mismos incluyen las formas modificadas y las variantes. Como se usan en la presente memoria, los términos "modificar" o "variante", y las variaciones gramaticales de los mismos, significan que un polinucleótido, polipéptido o subsecuencia del mismo se desvía de una secuencia de referencia. Por lo tanto, las secuencias modificadas y las variantes pueden tener sustancialmente la misma, mayor o menor actividad o función que una secuencia de referencia, pero al menos conservan una actividad o función parcial de la secuencia de referencia.
Por consiguiente, en la presente memoria también se describen variantes naturales y no naturales. Dichas variantes incluyen variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside de AAV-Rh74. Ejemplos particulares de tales variantes de la cápside de AAV-Rh74 incluyen RHM 15-1, RHM 15-2, RHM 15-3, RHM 15-4, RHM 15-5, RHM 15-6 y RHM4-1 (véase, por ejemplo, la Figura 5).
Dichas variantes también incluyen las variantes con ganancia y pérdida de función. Por ejemplo, las secuencias de ADN de FIX humano de tipo natural, cuyas variantes o mutantes proteicos conservan la actividad, o son terapéuticamente efectivas, o son comparativamente o incluso más terapéuticamente activas que el FIX humano invariante en los métodos y usos descritos en la presente memoria. En un ejemplo particular, el colágeno IV sirve para atrapar FIX, lo que significa que cuando se introduce en el tejido muscular de un mamífero, parte del FIX no está disponible para participar en la coagulación sanguínea porque se retiene en los espacios intersticiales en el tejido muscular. Una mutación en la secuencia de FIX que da como resultado una proteína con una unión reducida al colágeno IV (por ejemplo, pérdida de la función) es un mutante útil en los métodos descritos en la presente memoria, por ejemplo, para el tratamiento de la hemofilia. Un ejemplo de dicho gen FIX humano mutante codifica una proteína FIX humana con el aminoácido alanina en lugar de lisina en la posición del quinto aminoácido desde el comienzo de la proteína madura.
Los ejemplos no limitantes de modificaciones incluyen una o más sustituciones de nucleótidos o aminoácidos (por ejemplo, 1-3, 3-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-100 o más nucleótidos o residuos), como una arginina por un residuo de lisina (por ejemplo, una o más sustituciones por arginina de una lisina como se establece en cualquiera de RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6) adiciones (por ejemplo, inserciones o 1-3, 3­ 5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-100 o más nucleótidos o residuos) y deleciones (por ejemplo, subsecuencias o fragmentos) de una secuencia de referencia. Una secuencia modificada o variante puede conservar al menos parte de una función o una actividad de la secuencia sin modificar.
Dichas formas y variantes modificadas pueden tener menos, igual o más, pero al menos una parte, de una función o actividad de una secuencia de referencia, por ejemplo, como se describe en la presente memoria.
Una variante puede tener una o más diferencias o modificaciones de secuencia de aminoácidos no conservativas o conservativas, o ambas. Una "sustitución conservativa" es la sustitución de un aminoácido por un residuo biológico, químico o estructuralmente similar. Biológicamente similar significa que la sustitución no destruye una actividad biológica. Estructuralmente similar significa que los aminoácidos tienen cadenas laterales con una longitud similar, como alanina, glicina y serina, o un tamaño similar. La similitud química significa que los residuos tienen la misma carga o son hidrofílicos o hidrofóbicos. Los ejemplos particulares incluyen la sustitución de un residuo hidrofóbico, como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, como la sustitución de arginina por lisina (por ejemplo, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6), ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, serina por treonina, y similares. Los ejemplos particulares de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo hidrofóbico como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, la sustitución de un residuo polar por otro, como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina y similares. Por ejemplo, las sustituciones conservativas de aminoácidos típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Una "sustitución conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido original no sustituido.
Por consiguiente, en la presente memoria se describen además variantes de genes y proteínas (por ejemplo, de polinucleótidos que codifican las proteínas descritas en la presente memoria) que conservan una o más actividades biológicas (por ejemplo, una función en la coagulación sanguínea, etc.). Dichas variantes de proteínas o polipéptidos incluyen proteínas o polipéptidos que se han modificado o pueden modificarse usando la tecnología de ADN recombinante, de modo que la proteína o el polipéptido posea propiedades alteradas o adicionales, por ejemplo, las variantes que confieren una mayor estabilidad de la proteína en el plasma o una mayor actividad de la proteína. Las variantes pueden diferir de una secuencia de referencia, como los polinucleótidos, las proteínas o los péptidos naturales.
A nivel de la secuencia de nucleótidos, un gen variante natural y no natural serán típicamente al menos aproximadamente un 50 % idénticos, más típicamente aproximadamente un 70 % idénticos, incluso más típicamente aproximadamente un 80 % idénticos (90 % o más de identidad) al gen de referencia. A nivel de la secuencia de aminoácidos, una proteína variante natural y no natural tendrán típicamente al menos aproximadamente un 70 % de identidad, más típicamente aproximadamente un 80 % de identidad, incluso más típicamente aproximadamente un 90 % o más de identidad con la proteína de referencia, aunque se permiten regiones sustanciales de ausencia de identidad en las regiones no conservadas (por ejemplo, menos del 70 % de identidad, como menos del 60 %, 50 % o incluso 40 %). Las secuencias pueden tener al menos un 60 %, 70 %, 75 % o más de identidad (por ejemplo, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad) respecto de una secuencia de referencia. Los expertos en la técnica conocen los procedimientos para la introducción de cambios de nucleótidos y aminoácidos en un polinucleótido, proteína o polipéptido (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2007)).
El término "identidad", "homología" y sus variaciones gramaticales significan que dos o más entidades referenciadas son iguales, cuando son secuencias "alineadas". Así, a modo de ejemplo, cuando dos secuencias de polipéptidos son idénticas, tienen la misma secuencia de aminoácidos, al menos dentro de la región o porción referenciada. Cuando dos secuencias polinucleotídicas son idénticas, tienen la misma secuencia de polinucleótidos, al menos dentro de la región o porción referenciada. La identidad puede estar en un área definida (región o dominio) de la secuencia. Un "área" o "región" de identidad se refiere a una porción de dos o más entidades referenciadas que son iguales. Por lo tanto, cuando dos secuencias de proteína o ácido nucleico son idénticas en una o más áreas o regiones de la secuencia, comparten identidad dentro de esa región. Una secuencia "alineada" se refiere a múltiples secuencias de polinucleótidos o proteínas (aminoácidos), que a menudo contienen correcciones para bases o aminoácidos ausentes o adicionales (huecos) en comparación con una secuencia de referencia
La identidad puede extenderse a lo largo de toda la secuencia o una parte de la secuencia. En aspectos particulares, la longitud de la secuencia que comparte el porcentaje de identidad es 2, 3, 4, 5 o más polinucleótidos o aminoácidos contiguos, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc. aminoácidos contiguos. En aspectos particulares adicionales, la longitud de la identidad de secuencia compartida es de 20 o más polinucleótidos o aminoácidos contiguos, por ejemplo, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, etc. aminoácidos contiguos. En otros aspectos particulares, la longitud de la secuencia que comparte identidad es 35 o más polinucleótidos o aminoácidos contiguos, por ejemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49, 50, etc., aminoácidos contiguos. En otros aspectos particulares adicionales, la longitud de la secuencia que comparte identidad es 50 o más polinucleótidos o aminoácidos contiguos, por ejemplo, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80 -85, 85-90, 90-95, 95-100, 100-110, etc. polinucleótidos o aminoácidos contiguos.
Los términos "homólogo" u "homología" significan que dos o más entidades referenciadas comparten al menos una identidad parcial a lo largo de una región o porción dada. "Áreas, regiones o dominios" de homología o identidad significan que una porción de dos o más entidades referenciadas comparten homología o son iguales. Por lo tanto, cuando dos secuencias son idénticas en una o más regiones de secuencia, comparten identidad en estas regiones. "Homología sustancial" significa que una molécula se conserva estructural o funcionalmente de modo que tiene o se predice que tiene al menos una estructura o función parcial de una o más de las estructuras o funciones (por ejemplo, una función o actividad biológica) de la molécula de referencia, o la región o porción pertinente/correspondiente de la molécula de referencia con la que comparte homología.
El alcance de la identidad (homología) entre dos secuencias se puede determinar utilizando un programa informático y un algoritmo matemático. Tales algoritmos que calculan el porcentaje de identidad de secuencia (homología) generalmente explican los huecos en la secuencia y los errores de apareamiento en la región o área de comparación. Por ejemplo, un algoritmo de búsqueda BLAST (por ejemplo, BLAST 2.0) (véase, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990), disponible públicamente a través del NCBI) tiene los siguientes parámetros de búsqueda ilustrativos: error de apareamiento -2; apertura de hueco 5; extensión del hueco 2. Para las comparaciones de secuencias de polipéptidos, se usa un algoritmo b La STP típicamente en combinación con una matriz de puntuación, como PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 o BLOSUM 50. Los programas de comparación de secuencias FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) y SSEARCH también se utilizan para cuantificar el grado de identidad (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132: 185 (2000) y Smith et al., J. Mol. Biol. 147: 195 (1981)). También se han desarrollado programas para cuantificar la similitud estructural de proteínas utilizando la cartografía topológica basada en Delaunay (Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).
Los polinucleótidos incluyen adiciones e inserciones, por ejemplo, dominios heterólogos. Una adición (por ejemplo, dominio heterólogo) puede ser una unión covalente o no covalente de cualquier tipo de molécula a una composición. Típicamente, las adiciones e inserciones (por ejemplo, un dominio heterólogo) confieren una función o actividad complementaria o distinta.
Las adiciones e inserciones incluyen secuencias quiméricas y de fusión, que es una secuencia de polinucleótidos o proteínas que tiene una o más moléculas que normalmente no están presentes en una secuencia nativa de referencia (de tipo natural) unida covalentemente a la secuencia. Los términos "fusión" o "quimérico" y las variaciones gramaticales de los mismos, cuando se usan respecto de una molécula, significan que una porción o parte de la molécula contiene una entidad diferente distinta (heteróloga) de la molécula, ya que no suelen existir juntas en la naturaleza. Es decir, por ejemplo, una porción de la fusión o quimera incluye o consiste en una porción que no existe en la naturaleza, y es estructuralmente distinta.
El término "vector" se refiere a un plásmido, virus (por ejemplo, vector de AAV), cósmido u otro vehículo que pueda manipularse mediante la inserción o incorporación de un polinucleótido. Dichos vectores se pueden usar para la manipulación genética (es decir, "vectores de clonación"), para introducir/transferir polinucleótidos a las células y para transcribir o traducir el polinucleótido insertado en las células. Una secuencia de ácido nucleico como vector generalmente contiene al menos un origen de replicación para la propagación en una célula y opcionalmente elementos adicionales, tales como una secuencia polinucleotídica heteróloga, elemento de control de la expresión (por ejemplo, un promotor, potenciador), marcador de selección (por ejemplo, resistencia a antibióticos), secuencia de poli-adenina.
Como se usa en la presente memoria, el término "recombinante", como un modificador de un vector viral, tal como vectores de AAV recombinantes, así como un modificador de secuencias como polinucleótidos y polipéptidos recombinantes, significa que las composiciones (por ejemplo, AAV o secuencias) han sido manipuladas (es decir, modificadas genéticamente) de una manera que generalmente no se da en la naturaleza. Un ejemplo particular de un vector recombinante, como un vector de AAV, sería cuando un polinucleótido que normalmente no está presente en el genoma viral de tipo natural (por ejemplo, AAV) se inserta dentro del genoma viral. Por ejemplo, un ejemplo de un polinucleótido recombinante sería cuando un polinucleótido heterólogo (por ejemplo, un gen) que codifica una proteína se clona en un vector, con o sin las regiones 5', 3' y/o intrónicas con las que el gen está normalmente asociado dentro del genoma viral (por ejemplo, de AAV). Aunque el término "recombinante" no siempre se usa en la presente memoria en referencia a los vectores virales, tales como los vectores de AAV, así como secuencias tales como polinucleótidos y polipéptidos, las formas recombinantes de AAV y las secuencias que incluyen los polinucleótidos y polipéptidos, se incluyen expresamente a pesar de tal omisión.
Un "genoma" de vector recombinante (por ejemplo, un genoma de un vector de AAV) puede encapsidarse o empaquetarse en un virus (también denominado en la presente memoria "partícula" o "virión") para la infección posterior (transducción o transformación) de una célula, ex vivo, in vitro o in vivo. Cuando un genoma de un vector de AAV recombinante se encapsida o empaqueta en una partícula de AAV, la partícula se puede denominar "rAAV". Dichas partículas o viriones incluirán típicamente proteínas que encapsidan o empaquetan el genoma del vector. Ejemplos particulares incluyen proteínas de la cápside viral y de la envoltura, y en el caso de AAV, proteínas de la cápside de AAV.
Para un plásmido recombinante, un "genoma" de un vector se refiere a la porción de la secuencia plasmídica recombinante que finalmente se empaqueta o encapsida para formar una partícula viral. En caso de que se usen plásmidos recombinantes para construir o fabricar vectores recombinantes, el genoma del vector no incluye la porción del "plásmido" que no corresponde a la secuencia genómica del vector del plásmido recombinante. Esta porción genómica del plásmido recombinante que no corresponde al vector se conoce como la “cadena principal del plásmido”, que es importante para la clonación y amplificación del plásmido, un proceso que es necesario para la propagación y la producción de virus recombinante, pero no se empaqueta ni encapsida en partículas virales (por ejemplo, AAV).
Por lo tanto, un "genoma" del vector se refiere a la porción del plásmido del vector que está empaquetado o encapsidado por un virus (por ejemplo, AAV) y que contiene una secuencia polinucleotídica heteróloga. La porción genómica del plásmido recombinante que no corresponde al vector incluye la cadena principal que es importante para la clonación y amplificación del plásmido, pero no es empaquetada ni encapsidada por el virus (por ejemplo, AAV).
Un vector viral se deriva o se basa en uno o más elementos de ácido nucleico que comprenden un genoma viral. Los vectores virales particulares incluyen vectores de parvovirus, tales como vectores de virus adenoasociados (AAV).
Las secuencias de vectores recombinantes se manipulan mediante inserción o incorporación de un polinucleótido. Como se describe en la presente memoria, un plásmido de un vector generalmente contiene al menos un origen de replicación para la propagación en una célula y uno o más elementos de control de la expresión.
Las secuencias del vector que incluye vectores de AAV pueden incluir uno o más "elementos de control de la expresión". Típicamente, los elementos de control de la expresión son secuencia(s) de ácido nucleico que influyen en la expresión de un polinucleótido unido de forma operable. Los elementos de control, incluidos los elementos de control de la expresión tal como se exponen en la presente memoria, como promotores y potenciadores, presentes dentro de un vector se incluyen para facilitar la transcripción adecuada y, si es apropiado, la traducción del polinucleótido heterólogo (por ejemplo, un promotor, potenciador, señal de corte y empalme para intrones, mantenimiento del marco de lectura correcto del gen para permitir la traducción en el marco de lectura del ARNm, y codones de parada, etc.). Tales elementos típicamente actúan en cis, pero también pueden actuar en trans.
El control de la expresión puede efectuarse a nivel de la transcripción, traducción, corte y empalme, estabilidad del mensajero, etc. Normalmente, un elemento de control de la expresión que modula la transcripción se yuxtapone cerca del extremo 5' del polinucleótido transcrito (es decir, "en posición anterior"). Los elementos de control de la expresión también se pueden ubicar en el extremo 3' de la secuencia transcrita (es decir, “en posición posterior”) o dentro del transcrito (por ejemplo, en un intrón). Los elementos de control de la expresión pueden ubicarse a una distancia de la secuencia transcrita (por ejemplo, 100 a 500, 500 a 1000, 2000 a 5000, 5000 a 10 000 o más nucleótidos del polinucleótido), incluso a distancias considerables. Sin embargo, debido a las limitaciones de longitud del polinucleótido, para los vectores de AAV, dichos elementos de control de la expresión estarán típicamente dentro de 1 a 1000 nucleótidos del polinucleótido.
Funcionalmente, la expresión del polinucleótido heterólogo unido de forma operable puede controlarse al menos en parte mediante el elemento (por ejemplo, el promotor), de modo que el elemento modula la transcripción del polinucleótido y, según corresponda, la traducción del transcrito. Un ejemplo específico de un elemento de control de la expresión es un promotor, que generalmente se encuentra en 5' de la secuencia transcrita. Otro ejemplo de un elemento de control de la expresión es un potenciador, que puede ubicarse en 5', 3' de la secuencia transcrita, o dentro de la secuencia transcrita.
Un "promotor" como se usa en la presente memoria puede referirse a una secuencia de ADN que se encuentra adyacente a una secuencia polinucleotídica que codifica un producto recombinante. Un promotor está típicamente unido de forma operable a una secuencia adyacente, por ejemplo, un polinucleótido heterólogo. Un promotor típicamente aumenta una cantidad expresada a partir de un polinucleótido heterólogo en comparación con una cantidad expresada cuando el promotor no existe.
Un "potenciador" como se usa en la presente memoria puede referirse a una secuencia que se encuentra adyacente al polinucleótido heterólogo. Los elementos potenciadores se ubican típicamente en posición anterior de un elemento promotor pero también funcionan y se pueden ubicar en posición posterior o dentro de una secuencia de ADN (por ejemplo, un polinucleótido heterólogo). Por lo tanto, un elemento potenciador puede ubicarse 100 pares de bases, 200 pares de bases, o 300 o más pares de bases en posición anterior o en posición posterior de un polinucleótido heterólogo. Los elementos potenciadores típicamente aumentan la expresión de un polinucleótido heterólogo por encima de la expresión aumentada proporcionada por un elemento promotor.
Los elementos de control de la expresión (por ejemplo, los promotores) incluyen aquellos activos en un tipo particular de tejido o célula, denominados en la presente memoria "elementos/promotores de control de la expresión específicos de tejido". Los elementos de control de la expresión específicos de tejido son típicamente activos en células o tejidos específicos (por ejemplo, hígado, cerebro, sistema nervioso central, médula espinal, ojo, retina, hueso, músculo, pulmón, páncreas, corazón, célula renal, etc.). Los elementos de control de la expresión son típicamente activos en estas células, tejidos u órganos porque son reconocidos por las proteínas activadoras de la transcripción u otros reguladores de la transcripción, que son exclusivos de un tipo específico de célula, tejido u órgano.
Por ejemplo, si se desea la expresión en el músculo esquelético, se puede usar un promotor activo en el músculo. Estos incluyen promotores de genes que codifican a-actina esquelética, cadena ligera 2A de la miosina, distrofina, creatina quinasa muscular, así como promotores musculares sintéticos con actividades superiores a los promotores naturales (véase, por ejemplo, Li, et al., Nat. Biotech. 17: 241-245 (1999)). Ejemplos de promotores que son específicos de tejido para el hígado son la albúmina, Miyatake, et al. J. Virol., 71: 5124-32 (1997); promotor del núcleo del virus de la hepatitis B, Sandig, et al., Gene Ther. 3: 1002-9 (1996); alfafetoproteína (Af P), Arbuthnot, et al., Hum. Gene. Ther., 7:1503-14 (1996)], hueso (osteocalcina, Stein, et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997); sialoproteína ósea, Chen, et al., J. Bone Miner. Res. 1 1: 654-64 (1996)), linfocitos (CD2, Hansal, et al., J. Immunol., 161: 1063-8 (1998); cadena pesada de inmunoglobulina; cadena a de receptor de células T), neuronal (promotor de enolasa específica de neuronas (NSE), Andersen, et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13: 503-15 (1993); gen de cadena ligera de neurofilamentos, Piccioli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611-5 (1991); el gen vgf específico de neuronas, Piccioli, et al., Neuron, 15: 373-84 (1995)]; entre otros.
Los elementos de control de la expresión también incluyen promotores/potenciadores ubicuos o promiscuos que son capaces de controlar la expresión de un polinucleótido en muchos tipos de células diferentes. Dichos elementos incluyen, entre otros, las secuencias promotoras/potenciadoras tempranas inmediatas del citomegalovirus (CMV), las secuencias promotoras/potenciadoras del virus del sarcoma de Rous (RSV) y los otros promotores/potenciadores virales activos en una variedad de tipos de células de mamíferos, o elementos sintéticos que no están presentes en la naturaleza (véase, por ejemplo, Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)), el promotor de SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de p-actina citoplasmática y el promotor de fosfoglicerol cinasa (PGK).
Los elementos de control de la expresión también pueden conferir una expresión que sea regulable, es decir, una señal o estímulo aumenta o disminuye la expresión del polinucleótido heterólogo unido de forma operable. Un elemento regulable que aumenta la expresión del polinucleótido unido de forma operable en respuesta a una señal o estímulos también se denomina "elemento inducible" (es decir, es inducido por una señal). Los ejemplos particulares incluyen, pero sin limitación, un promotor inducible por hormonas (por ejemplo, esteroides). Un elemento regulable que disminuye la expresión del polinucleótido unido de forma operable en respuesta a una señal o estímulo se denomina "elemento reprimible" (es decir, la señal disminuye la expresión de tal manera que cuando la señal se elimina o está ausente, la expresión aumenta). Típicamente, la cantidad de aumento o disminución conferida por tales elementos es proporcional a la cantidad de señal o estímulo presente; cuanto mayor es la cantidad de señal o estímulo, mayor es el aumento o la disminución de la expresión. Ejemplos particulares no limitantes incluyen promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc; el promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por hormonas esteroides; el sistema promotor de polimerasa T7 (WO 98/10088); el sistema reprimible por tetraciclina (Gossen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)); el sistema inducible por tetraciclina (Gossen, et al., Science. 268: 1766-1769 (1995); ver también Harvey, et al., Curr. Opin. Chem Biol. 2: 512-518 (1998)); el sistema inducible RU486 (Wang, et al., Nat. Biotech.
15: 239-243 (1997) y Wang, et al., Gene Ther. 4: 432-441 (1997)], y el sistema inducible por rapamicina (Magari et al., J. Clin. Invest. 100: 2865-2872 (1997); Rivera et al., Nat. Medicine. 2: 1028-1032 (1996)). Otros elementos de control regulables que pueden ser útiles en este contexto son aquellos que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda.
Los elementos de control de la expresión también incluyen el (los) elemento(s) nativo(s) para el polinucleótido heterólogo. Se puede usar un elemento de control nativo (por ejemplo , un promotor) cuando se desea que la expresión del polinucleótido heterólogo imite la expresión nativa. El elemento nativo puede usarse cuando la expresión del polinucleótido heterólogo deba regularse temporal o evolutivamente, o de una manera específica de tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. También se pueden usar otros elementos nativos de control de la expresión, como intrones, sitios de poliadenilación o secuencias consenso de Kozak.
Como se usa en la presente memoria, el término "unión operable" o "unido de manera operable" se refiere a una yuxtaposición física o funcional de los componentes así descritos para permitirles funcionar de la manera prevista. En el ejemplo de un elemento de control de la expresión en unión operable con un polinucleótido, la relación es tal que el elemento de control modula la expresión del ácido nucleico. Más específicamente, por ejemplo, dos secuencias de ADN unidas de forma operable significa que los dos ADN están dispuestos (en cis o trans) en una relación tal que al menos una de las secuencias de ADN puede ejercer un efecto fisiológico sobre la otra secuencia.
Los vectores que incluyen vectores de AAV pueden incluir otros elementos de ácido nucleico. Estos elementos incluyen, sin limitación, una o más copias de una secuencia ITR de AAV, un elemento promotor/potenciador, una señal de terminación de la transcripción, regiones no traducidas en 5' o 3' (por ejemplo, secuencias de poliadenilación) que flanquean una secuencia polinucleotídica, o todo o una parte del intrón I. Tales elementos también incluyen opcionalmente una señal de terminación de la transcripción. Un ejemplo particular no limitante de una señal de terminación de la transcripción es la señal de terminación de la transcripción de SV40.
Como se describe en la presente memoria, los vectores de AAV generalmente aceptan insertos de ADN que tienen un rango definido de tamaño que generalmente es de aproximadamente 4 kb a aproximadamente 5,2 kb, o un poco más. Por lo tanto, para secuencias más cortas, se incluye un relleno en el fragmento del inserto para ajustar la longitud al tamaño cercano o normal de la secuencia genómica del virus que sea aceptable para el empaquetamiento del vector de AAV en la partícula del virus. Un relleno/ secuencia de ácido nucleico de relleno puede ser un segmento de ácido nucleico no traducido (que no codifica proteínas). En un aspecto particular de un vector de AAV, una secuencia polinucleotídica heteróloga tiene una longitud inferior a 4,7 Kb y el relleno o secuencia polinucleotídica de relleno tiene una longitud que cuando se combina (por ejemplo, insertada en un vector) con la secuencia polinucleotídica heteróloga tiene una longitud total entre aproximadamente 3,0-5,5 Kb, o entre aproximadamente 4,0-5,0 Kb, o entre aproximadamente 4,3-4,8 Kb.
Un intrón también puede funcionar como un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno para lograr una longitud para el empaquetamiento del vector de AAV en una partícula viral. Los intrones y los fragmentos intrónicos (por ejemplo, la porción del intrón I de FIX) que funcionan como un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno también pueden potenciar la expresión. Por ejemplo, la inclusión de un elemento intrónico puede potenciar la expresión en comparación con la expresión en ausencia del elemento intrónico (Kurachi et al., 1995, anteriormente mencionado).
El uso de intrones no se limita a la inclusión de secuencias de intrones I de FIX, sino que también incluye otros intrones, los cuales pueden estar asociados con el mismo gen (por ejemplo, Cuando el polinucleótido heterólogo codifica FIX, el intrón se deriva de un intrón presente en la secuencia genómica de FIX) o asociado con un gen completamente diferente u otra secuencia de ADN. Por consiguiente, otras regiones de ácido nucleico no traducidas (que no codifican proteínas), como los intrones encontrados en secuencias genómicas de genes afines (relacionados) (la secuencia polinucleotídica heteróloga codifica toda o una parte de la misma proteína codificada por la secuencia genómica) y genes no afines (no relacionados) (la secuencia polinucleotídica heteróloga codifica una proteína que es distinta de la proteína codificada por la secuencia genómica) también pueden funcionar como relleno o secuencias polinucleotídicas de relleno de acuerdo con la presente descripción.
Una "porción del intrón I", como se usa en la presente memoria, significa una región del intrón I que tiene una longitud de nucleótidos de aproximadamente 0,1 kb a aproximadamente 1,7 kb, cuya región mejora la expresión de FIX, típicamente en aproximadamente 1,5 veces o más en un plásmido o molde de vector viral en comparación con la expresión de FIX en ausencia de una porción del intrón I. Una porción más específica es una porción de 1,3 kb del intrón 1.
El término "oligonucleótido" como se usa en la presente memoria se refiere a secuencias, cebadores y sondas definidas como una molécula de ácido nucleico compuesta por dos o más ribo- o desoxirribonucleótidos, típicamente más de tres. El tamaño exacto del oligonucleótido dependerá de varios factores y de la aplicación y uso particulares del oligonucleótido, pero típicamente un oligonucleótido tiene una longitud entre aproximadamente 5-50 nucleótidos.
El término "cebador", como se usa en la presente memoria, se refiere a un oligonucleótido de ADN, ya sea monocatenario o bicatenario, derivado de un sistema biológico, generado por digestión con enzimas de restricción, o producido sintéticamente que, cuando se coloca en el entorno adecuado, es capaz de actuar funcionalmente como un iniciador de la síntesis de ácido nucleico dependiente de molde. Cuando se presenta con un molde de ácido nucleico apropiado, precursores adecuados de nucleósidos trifosfato de ácidos nucleicos, una enzima polimerasa, cofactores adecuados y condiciones tales como una temperatura y pH adecuados, el cebador se puede extender en su extremo 3' mediante la adición de nucleótidos por la acción de una polimerasa o actividad similar para producir un producto por extensión del cebador. El cebador puede variar en longitud según las condiciones particulares y los requisitos de la aplicación. Por ejemplo, en aplicaciones de diagnóstico, el cebador oligonucleotídico tiene típicamente una longitud de 15-30 o más nucleótidos. El cebador debe ser lo suficientemente complementario al molde deseado para cebar la síntesis del producto de extensión deseado, es decir, para hibridar con la cadena deseada del molde de una manera suficiente para proporcionar el resto hidroxilo 3' del cebador en la yuxtaposición apropiada para su uso en el inicio de la síntesis por una polimerasa o enzima similar. No se requiere que la secuencia del cebador represente un complemento exacto del molde deseado. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos no complementaria puede unirse al extremo 5' de un cebador complementario. Alternativamente, las bases no complementarias se pueden intercalar dentro de la secuencia del cebador oligonucleotídico, siempre que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena del molde deseado para proporcionar funcionalmente un complejo de molde-cebador para la síntesis del producto de extensión.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha descrito en las patentes de los Estados Unidos núms. 4,683,195, 4,800,195 y 4,965,188.
La frase "hibridar específicamente" se refiere a la asociación entre dos moléculas de ácido nucleico monocatenarias de secuencia suficientemente complementaria para permitir la hibridación en condiciones predeterminadas que generalmente se utilizan en la técnica (a veces denominadas "sustancialmente complementarias"). En particular, el término se refiere a la hibridación de dos secuencias polinucleotídicas con secuencias sustancialmente complementarias, con respecto a la exclusión sustancial de hibridación con otras secuencias no complementarias de ácidos nucleicos monocatenarios.
Un "gen marcador de selección" se refiere a un gen que cuando se expresa confiere un fenotipo seleccionable, tal como resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina), en una célula transformada. Un gen "reportero" es uno que proporciona una señal detectable. Un ejemplo no limitante de un gen reportero es el gen de la luciferasa.
Los polinucleótidos y polipéptidos que incluyen formas modificadas pueden prepararse usando diversas técnicas de clonación estándar, ADn recombinante, mediante expresión celular o traducción in vitro y técnicas de síntesis química. La pureza de los polinucleótidos se puede determinar mediante secuenciación, electroforesis en gel y similares. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden aislarse usando hibridación o técnicas de cribado de bases de datos informáticas. Dichas técnicas incluyen, pero sin limitación: (1) hibridación de bibliotecas de ADN genómico o cADN con sondas para detectar secuencias de nucleótidos homólogas; (2) detección de anticuerpos para detectar polipéptidos que tienen características estructurales compartidas, por ejemplo, usando una biblioteca de expresión; (3) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con ADN genómico o cADN usando cebadores capaces de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico de interés; (4) búsquedas informáticas en bases de datos de secuencias para secuencias relacionadas; y (5) cribado diferencial de una biblioteca de ácido nucleico sustraída.
Los polinucleótidos y polipéptidos que incluyen formas modificadas también se pueden producir mediante síntesis química con el uso de métodos conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, un aparato de síntesis automatizada (véase, por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA). Los péptidos se pueden sintetizar, completamente o parcialmente, utilizando métodos químicos (véase, por ejemplo, Caruthers (1980). Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215; Horn (1980); y Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA). La síntesis de péptidos puede realizarse usando diversas técnicas en fase sólida (véase, por ejemplo, Roberge Science 269: 202 (1995); Merrifield, Methods Enzymol. 289: 3 (1997)), y se puede lograr la síntesis automatizada, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos ABI 431A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El término "aislado", cuando se usa como modificador de una composición, significa que las composiciones están hechas por la mano del hombre o están separadas, completamente o al menos en parte, de su entorno natural in vivo.
Generalmente, las composiciones aisladas están sustancialmente exentas de uno o más materiales con los que normalmente están asociadas en la naturaleza, por ejemplo, una o más proteínas, ácido nucleico, lípidos, carbohidratos, membrana celular. El término "aislado" no excluye las combinaciones producidas artificialmente, por ejemplo, una secuencia de un vector recombinante (por ejemplo, AAV) o una partícula viral (por ejemplo, vector de AAV-Rh74 o vector de AAV relacionado, como las variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) que empaqueta o encapsida un genoma de vector y una formulación farmacéutica. El término "aislado" no excluye las formas físicas alternativas de la composición, tales como híbridos/quimeras, multímeros/oligómeros, modificaciones (por ejemplo, fosforilación, glicosilación, lipidación) o formas derivatizadas, o formas expresadas en células huésped producidas artificialmente.
Los métodos y usos descritos en la presente memoria proporcionan un medio para administrar (transducir) polinucleótidos heterólogos (transgenes) en una amplia gama de células huésped, que incluyen células en división o no. Las secuencias de vectores recombinantes (por ejemplo, de AAV), plásmidos, genomas de vectores, partículas virales recombinantes (por ejemplo, de AAV-Rh74 o AAV relacionados, tales como variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)), los métodos, los usos y las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente memoria son adicionalmente útiles en un método para administrar una proteína, péptido o ácido nucleico a un sujeto que lo necesite, como un método de tratamiento. De esta manera, la proteína, péptido o ácido nucleico se puede producir in vivo en un sujeto. El sujeto puede beneficiarse o necesitar la proteína, péptido o ácido nucleico porque el sujeto tiene una deficiencia de la proteína, péptido o ácido nucleico, o porque la producción de la proteína, péptido o ácido nucleico en el sujeto puede producir algún efecto terapéutico, como método de tratamiento o de otra manera. Alternativamente, puede ser deseable inhibir o reducir la expresión o producción de un gen objetivo involucrado en un proceso de enfermedad, por ejemplo, para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, cáncer o aterosclerosis, por ejemplo para lograr un efecto terapéutico.
En general, las secuencias de vectores recombinantes (por ejemplo, de AAV), plásmidos, genomas de vectores, partículas de virus recombinantes (por ejemplo, AAV-Rh74 o AAV relacionados, tales como variantes de AAV-Rh74, tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)), los métodos y usos pueden usarse para administrar cualquier polinucleótido heterólogo (transgén) con un efecto biológico para tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con cualquier trastorno relacionado con la expresión génica insuficiente o indeseable. Las secuencias de vectores recombinantes (por ejemplo, de AAV), plásmidos, genomas de vectores, partículas de virus recombinantes (por ejemplo, AAV-Rh74 o AAV relacionados, tales como variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)), métodos y usos pueden usarse para llevar a cabo una terapia para varios estados patológicos.
Existe una serie de enfermedades hereditarias en las que se conocen y se han clonado genes defectuosos. En general, los estados patológicos anteriores se dividen en dos clases: estados de deficiencia, generalmente de enzimas, que generalmente se heredan de manera recesiva, y estados de desequilibrio, que al menos a veces involucran proteínas reguladoras o estructurales, que se heredan de manera dominante. Para las enfermedades con estados de deficiencia, la transferencia de genes podría usarse para llevar un gen normal a los tejidos afectados para una terapia de reemplazo, así como para crear modelos animales para la enfermedad usando mutaciones antisentido. Para estados patológicos con desequilibrio, la transferencia de genes podría usarse para crear un estado patológico en un sistema modelo, que luego podría usarse para contrarrestar el estado patológico. Por lo tanto, las secuencias del vector recombinante (por ejemplo, de AAV), plásmidos, genomas de vectores, partículas de virus recombinantes (por ejemplo, vectores de AAV-Rh74 o vectores de AAV relacionados tales como variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)), Los métodos y usos permiten el tratamiento de enfermedades genéticas. Como se usa en la presente memoria, un estado patológico se trata al remediar parcial o totalmente la deficiencia o el desequilibrio que provoca la enfermedad o la hace más grave. También es posible el uso de la integración, específica de un sitio, de secuencias de ácido nucleico para provocar mutaciones o corregir defectos.
Los estados patológicos ilustrativos incluyen, entre otros: fibrosis quística (y otras enfermedades pulmonares), hemofilia A, hemofilia B, talasemia, anemia y otros trastornos de la coagulación sanguínea, SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia y otros trastornos neurológicos, cáncer, diabetes mellitus, distrofias musculares (por ejemplo, Duchenne, Becker), enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hurler, deficiencia de adenosina desaminasa, enfermedades de almacenamiento de glucógeno y otros defectos metabólicos, enfermedad de Pompe, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedades degenerativas de la retina (coroideremia, amaurosis congénita de Leber y otras enfermedades del ojo), enfermedades de órganos sólidos (por ejemplo, cerebro, hígado, riñón, corazón) y similares.
En la presente memoria también se describen métodos de tratamiento y usos que incluyen vectores recombinantes descritos en la presente memoria (por ejemplo, de AAV), genomas de vectores, partículas virales recombinantes (por ejemplo, vectores de AAV-Rh74 o vectores de AAV relacionados, tales como variantes de AAV-Rh74, tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) y partículas virales descritas en la presente memoria (por ejemplo, AAV-Rh74 o AAV relacionado, tales como variantes de AAV-Rh74, tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) que incluyen genomas de vectores. Los métodos y usos descritos en la presente memoria son ampliamente aplicables a las enfermedades susceptibles de tratamiento mediante la introducción de un gen que codifica una proteína, o mediante el aumento o estimulación de la expresión o función del gen, por ejemplo, la adición o sustitución de genes. Los métodos y usos descritos en la presente memoria también son ampliamente aplicables a enfermedades susceptibles de tratamiento mediante la reducción o disminución de la expresión o función génica, por ejemplo, la inactivación génica o la reducción de la expresión génica (reducción génica).
Los ejemplos particulares no limitantes de enfermedades tratables descritas en la presente memoria incluyen las expuestas en la presente, así como una enfermedad pulmonar (por ejemplo, fibrosis quística), un trastorno de la coagulación sanguínea o hemorrágico (por ejemplo, hemofilia A o hemofilia B con o sin inhibidores), talasemia, un trastorno sanguíneo (por ejemplo, anemia), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), epilepsia, enfermedades de almacenamiento lisosómico, trastornos de acumulación de cobre o hierro (por ejemplo, enfermedad de Wilson o de Menkes), deficiencia de lipasa ácida lisosómica, un trastorno neurológico o neurodegenerativo, cáncer, diabetes tipo 1 o tipo 2, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hurler, deficiencia de adenosina desaminasa, un defecto metabólico (por ejemplo, enfermedades del almacenamiento de glucógeno), una enfermedad degenerativa de la retina (como deficiencia o defecto de RPE65, coroideremia y otras enfermedades oculares) y una enfermedad de un órgano sólido (por ejemplo, cerebro, hígado, riñón, corazón).
Además, los vectores recombinantes (por ejemplo, de VAA), genomas de vectores, partículas de virus recombinantes (por ejemplo, vectores de AAV-Rh74 o vectores de AAV relacionados, tales como variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)), los métodos y usos se pueden emplear para administrar ácidos nucleicos que codifican anticuerpos monoclonales o fragmentos de estos para proporcionar efectos biológicos beneficiosos para tratar o mejorar los síntomas asociados con cánceres, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunitarias tales como artritis reumatoide.
Un método o uso descrito en la presente memoria puede incluir: (a) proporcionar una partícula viral (por ejemplo, de AAV-Rh74 o AAV relacionado tal como variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1)) que comprende un genoma de vector, el genoma de vector comprende una secuencia polinucleotídica heteróloga (y, opcionalmente, un relleno/secuencia polinucleotídica de relleno), en donde la secuencia polinucleotídica heteróloga está unida de forma operable a un elemento de control de la expresión que confiere la transcripción de dicha secuencia polinucleotídica; y (b) administrar una cantidad de la partícula viral al mamífero de manera que dicho polinucleótido heterólogo se exprese en el mamífero.
Un método o uso descrito en la presente memoria puede incluir la administración o transferencia de una secuencia polinucleotídica heteróloga a un mamífero o una célula de un mamífero, mediante la administración de una partícula viral (por ejemplo, de AAV) (por ejemplo, de AAV-Rh74 o AAV relacionado, como variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside (por ejemplo, Rh M4-1)) o una pluralidad de partículas virales (por ejemplo, de AAV) (por ejemplo, de AAV-Rh74 o AAV relacionado, tales como variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) que comprende un genoma de vector, el genoma del vector comprende la secuencia polinucleotídica heteróloga (y opcionalmente un relleno/secuencia polinucleotídica de relleno) a un mamífero o una célula de un mamífero, para así suministrar o transferir la secuencia polinucleotídica heteróloga al mamífero o la célula del mamífero.
Un método o uso descrito en la presente memoria para tratar a un mamífero deficiente con necesidad de la expresión o función de una proteína puede incluir proporcionar una partícula viral (por ejemplo, de AAV) (por ejemplo, AAV-Rh74 o AAV relacionado, tal como variantes de AAV-Rh74, tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) o una pluralidad de partículas virales (por ejemplo, de AAV) (por ejemplo, de AAV-Rh74 o AAV relacionado, tales como variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) que comprenden un genoma de vector, el genoma del vector comprende una secuencia polinucleotídica heteróloga (y opcionalmente un relleno/secuencia polinucleotídica de relleno); y administrar la partícula viral o la pluralidad de partículas virales al mamífero, donde la secuencia polinucleotídica heteróloga codifica una proteína expresada en el mamífero, o donde la secuencia polinucleotídica heteróloga codifica una secuencia o proteína inhibidora que reduce la expresión de una proteína endógena en el mamífero.
En aspectos particulares descritos en la presente memoria, métodos y usos descritos en la presente, la expresión del polinucleótido heterólogo codifica una proteína o ácido nucleico inhibidor que proporciona un beneficio terapéutico para el mamífero (por ejemplo, ser humano). En aspectos particulares adicionales, se incluye un relleno/secuencia polinucleotídica de relleno en la secuencia del vector de manera que la longitud combinada con la secuencia polinucleotídica heteróloga tiene una longitud total de entre aproximadamente 3,0-5,5 Kb, o entre aproximadamente 4,0­ 5,0 Kb, o entre aproximadamente 4,3-4,8 Kb.
Los métodos y usos también descritos en la presente memoria incluyen métodos de tratamiento, que dan como resultado cualquier efecto terapéutico o beneficioso. En varios métodos y usos se incluyen además inhibir, disminuir o reducir uno o más síntomas adversos (por ejemplo, físicos), trastornos, enfermedades, afecciones o complicaciones causadas por la enfermedad o asociadas con esta, tales como reducción del tiempo de coagulación sanguínea, reducción de la dosis de administración de la proteína suplementaria de un factor de coagulación.
Por lo tanto, un efecto terapéutico o beneficioso del tratamiento es cualquier mejora o beneficio objetivo o subjetivo medible o detectable proporcionado a un sujeto particular. Un efecto terapéutico o beneficioso puede ser, pero no necesariamente, la eliminación completa de todos o cualquier síntoma adverso particular, trastorno, enfermedad o complicación de una enfermedad. Por lo tanto, se alcanza un resultado clínico satisfactorio cuando hay una mejora creciente o una reducción parcial de un síntoma adverso, trastorno, enfermedad o complicación causada o asociada con una enfermedad, o una inhibición, disminución, reducción, supresión, prevención, límite o control del empeoramiento o la progresión de uno o más síntomas adversos, trastornos, enfermedades o complicaciones causadas o asociadas con la enfermedad, durante un período corto o largo (horas, días, semanas, meses, etc.).
Las composiciones, tales como genomas de vectores, partículas de virus recombinantes (por ejemplo, vectores de AAV-Rh74 o vectores de AAV relacionados, tales como variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) incluidos genomas de vectores, y métodos y usos descritos en la presente memoria, se pueden administrar en una cantidad suficiente o efectiva a un sujeto que lo necesite. Una "cantidad efectiva" o "cantidad suficiente" se refiere a una cantidad que proporciona, en dosis únicas o múltiples, sola o en combinación con otra u otras composiciones (agentes terapéuticos, como un fármaco), tratamientos, protocolos o agentes de regímenes terapéuticos, una respuesta detectable de cualquier duración de tiempo (a largo o corto plazo), un resultado esperado o deseado o un beneficio para un sujeto de cualquier grado medible o detectable o de cualquier duración de tiempo (por ejemplo, durante minutos, horas, días, meses, años, o curación).
La dosis del genoma del vector o partícula viral (por ejemplo, de AAV, tal como un vector de AAV-Rh74 o un vector de AAV relacionado tal como variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) para lograr un efecto terapéutico, por ejemplo, la dosis en genomas del vector/por kilogramo de peso corporal (vg/kg), variará en función de varios factores que incluyen, entre otros: la vía de administración, el nivel de expresión de los polinucleótidos heterólogos requerido para lograr un efecto terapéutico, la enfermedad específica tratada, cualquier respuesta inmunitaria del huésped contra el vector viral, una respuesta inmunitaria del huésped contra el polinucleótido heterólogo o el producto de expresión (proteína), y la estabilidad de la proteína expresada. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente un rango de dosis de viriones para tratar a un paciente que tiene una enfermedad o trastorno particular sobre la base de los factores mencionados anteriormente, así como otros factores. En general, las dosis variarán en al menos 1X108 o más, por ejemplo, 1X109, 1X1010, 1X1011, 1X1012, 1X1013 o 1X1014, o más, genomas de vector por kilogramo (vg/kg) de peso del sujeto, para lograr un efecto terapéutico.
Usando la hemofilia como ejemplo, en términos generales, se cree que, para lograr un efecto terapéutico, se necesita una concentración de factor de coagulación sanguínea que sea mayor que el 1 % de la concentración de factor encontrada en un individuo normal para cambiar un fenotipo de enfermedad grave por uno moderado. Un fenotipo grave se caracteriza por daño articular y hemorragias potencialmente mortales. Para convertir un fenotipo de enfermedad moderada en uno leve, se cree que se necesita una concentración de factor de coagulación sanguínea superior al 5 % de lo normal. Con respecto al tratamiento de un sujeto hemofílico de este tipo, una dosis típica es de al menos 1X1010 genomas de vector (vg) por kilogramo (vg/kg) de peso del sujeto, o entre aproximadamente 1X1010 y 1X1011 vg/kg de peso del sujeto, o entre aproximadamente 1X1011 y 1X1012 vg/kg de peso del sujeto, o entre aproximadamente 1X1012 y 1X1013 vg/kg de peso del sujeto, para lograr un efecto terapéutico deseado.
Las dosis de una "cantidad efectiva" o "cantidad suficiente" para un tratamiento (por ejemplo, para mejorar o proporcionar un beneficio o mejora terapéutica) generalmente son efectivas para proporcionar una respuesta a uno, varios o todos los síntomas adversos, consecuencias o complicaciones de la enfermedad, uno o más síntomas adversos, trastornos, enfermedades, patologías o complicaciones, por ejemplo, causadas o asociadas con la enfermedad, en un grado medible, aunque disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar o controlar la progresión o el empeoramiento de la enfermedad es un resultado satisfactorio.
Una cantidad efectiva o una cantidad suficiente puede proporcionarse, pero no necesariamente, en una sola administración, puede requerir múltiples administraciones y puede administrarse, pero no necesariamente, sola o en combinación con otra composición (por ejemplo, agente), tratamiento, protocolo o régimen terapéutico. Por ejemplo, la cantidad puede aumentarse proporcionalmente según lo indique la necesidad del sujeto, el tipo, el estado y la gravedad de la enfermedad tratada o los efectos secundarios (si los hay) del tratamiento. Además, una cantidad efectiva o una cantidad suficiente no necesita ser efectiva o suficiente si se administra en dosis únicas o múltiples sin una segunda composición (por ejemplo, otro fármaco o agente), tratamiento, protocolo o régimen terapéutico, ya que pueden incluirse dosis adicionales, cantidades o duración por encima y más allá de tales dosis, o composiciones adicionales (por ejemplo, fármacos o agentes), tratamientos, protocolos o regímenes terapéuticos para considerarlas efectivas o suficientes en un sujeto dado. Las cantidades consideradas efectivas también incluyen cantidades que dan como resultado una reducción del uso de otro tratamiento, régimen terapéutico o protocolo, como la administración de una proteína del factor de coagulación recombinante para el tratamiento de un trastorno de la coagulación (por ejemplo, hemofilia A o B).
No es necesario que una cantidad efectiva o una cantidad suficiente sea efectiva en todos y cada uno de los sujetos tratados, ni en la mayoría de los sujetos tratados en un grupo o población dada. Una cantidad efectiva o una cantidad suficiente significa efectividad o suficiencia en un sujeto en particular, no en un grupo o en la población general. Como es típico para tales métodos, algunos sujetos exhibirán una mayor respuesta, o una respuesta menor o nula a un método o uso de tratamiento dado. Por lo tanto, las cantidades apropiadas dependerán de la afección tratada, el efecto terapéutico deseado, así como del sujeto individual (por ejemplo, la biodisponibilidad dentro del sujeto, género, edad, etc.).
El término "mejorar" significa una mejora detectable o medible en la enfermedad de un sujeto o un síntoma de la misma, o una respuesta celular subyacente. Una mejora detectable o medible incluye una disminución, reducción, inhibición, supresión, límite o control subjetivo u objetivo de la aparición, frecuencia, gravedad, progresión o duración de la enfermedad, o una complicación causada o asociada con la enfermedad, o una mejora en un síntoma o una causa subyacente o una consecuencia de la enfermedad, o una reversión de la enfermedad.
Por lo tanto, un resultado eficaz del tratamiento puede conducir a un "efecto terapéutico" o "beneficio" de disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar, controlar o prevenir la aparición, frecuencia, gravedad, progresión o duración de una enfermedad, o uno o más síntomas adversos o causas subyacentes o consecuencias de la enfermedad en un sujeto. Por lo tanto, los métodos de tratamiento y los usos que afectan a una o más causas subyacentes de la enfermedad o síntomas adversos se consideran beneficiosos. Una disminución o reducción en el empeoramiento, como la estabilización de la enfermedad, o un síntoma adverso de la misma, también es un resultado eficaz del tratamiento.
Por lo tanto, no es necesario que un beneficio o mejora terapéutica sea la eliminación completa de la enfermedad, o cualquiera, la mayoría o todos los síntomas adversos, complicaciones, consecuencias o causas subyacentes asociadas con la enfermedad. Por lo tanto, se logra un resultado satisfactorio cuando hay una mejora creciente en una enfermedad de un sujeto, o una disminución, reducción, inhibición, supresión, límite, control o prevención parcial de la ocurrencia, frecuencia, gravedad, progresión o duración, o la inhibición o reversión de la enfermedad (por ejemplo, estabilizando uno o más síntomas o complicaciones), durante un período de tiempo corto o largo (horas, días, semanas, meses, etc.). La eficacia de un método o uso, como un tratamiento que proporciona un beneficio terapéutico potencial o una mejora de una enfermedad, puede determinarse mediante varios métodos.
Los métodos y usos descritos en la presente memoria se pueden combinar con cualquier compuesto, agente, fármaco, tratamiento u otro régimen o protocolo terapéutico que tenga una actividad o efecto terapéutico, beneficioso, aditivo, sinérgico o complementario deseado. Las composiciones y tratamientos de combinación ilustrativos incluyen segundos agentes activos, tales como productos biológicos (proteínas), agentes y fármacos. Dichos productos biológicos (proteínas), agentes, fármacos, tratamientos y terapias se pueden administrar o realizar antes, sustancialmente de forma simultánea o después de cualquier otro método o uso descrito en la presente memoria, por ejemplo, un método terapéutico para tratar en un sujeto una enfermedad de la coagulación sanguínea.
El compuesto, agente, fármaco, tratamiento u otro régimen o protocolo terapéutico puede administrarse como una composición combinada, o administrarse por separado, tal como concurrentemente o en serie o secuencialmente (antes o después) del suministro o administración de un genoma o virus del vector (por ejemplo, vector de AAV-Rh74 o vector de AAV relacionado tal como variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) descritos en la presente memoria. Por lo tanto, la presente descripción proporciona combinaciones en las que un método o uso descrito en la presente está en combinación con cualquier compuesto, agente, fármaco, régimen terapéutico, protocolo de tratamiento, proceso, remedio o composición, establecidos en la presente memoria o conocidos por un experto en la técnica. El compuesto, agente, fármaco, régimen terapéutico, protocolo de tratamiento, proceso, remedio o composición se puede administrar o realizar antes, sustancialmente de forma simultánea o después de la administración de un genoma o virus del vector (por ejemplo, vector de AAV-Rh74 o vector de AAV relacionado tales como variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) descritos en la presente memoria, a un sujeto. Los ejemplos específicos no limitantes de aspectos de combinación, por lo tanto, incluyen los anteriores u otro compuesto, agente, fármaco, régimen terapéutico, protocolo de tratamiento, proceso, remedio o composición.
Los métodos y usos descritos en la presente memoria también incluyen, entre otras cosas, métodos y usos que dan como resultado una menor necesidad o uso de otro compuesto, agente, fármaco, régimen terapéutico, protocolo de tratamiento, proceso o remedio. Por ejemplo, para una enfermedad de la coagulación sanguínea, un método o uso descrito en la presente memoria tiene un beneficio terapéutico si en un sujeto dado una dosis menos frecuente o reducida o la eliminación de la administración de una proteína de un factor de coagulación recombinante suplementa el factor de coagulación endógeno deficiente o defectuoso (anormal o mutante) en el sujeto. Por lo tanto, de acuerdo con la presente descripción, se proporcionan métodos y usos para reducir la necesidad o el uso de otro tratamiento o terapia.
La presente descripción es útil en animales que incluyen aplicaciones médicas veterinarias. Por lo tanto, los sujetos adecuados incluyen mamíferos, tales como seres humanos, así como mamíferos no humanos. El término "sujeto" se refiere a un animal, típicamente un mamífero, como humanos, primates no humanos (simios, gibones, gorilas, chimpancés, orangutanes, macacos), un animal doméstico (perros y gatos), un animal de granja (aves de corral como pollos y patos, caballos, vacas, cabras, ovejas, cerdos) y animales de experimentación (ratón, rata, conejo, conejillo de Indias). Los sujetos humanos incluyen sujetos fetales, neonatos, lactantes, juveniles y adultos. Los sujetos incluyen modelos de enfermedades animales, por ejemplo, ratones y otros modelos animales de enfermedades de la coagulación sanguínea y otros conocidos por los expertos en la técnica.
Como se establece en la presente memoria, los vectores y las partículas virales (por ejemplo, AAV-Rh74 o AAV relacionados, como las variantes de AAV-Rh74, como las variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) que comprenden dichos vectores se pueden usar para proporcionar una proteína a un sujeto donde hay una cantidad insuficiente de la proteína o una deficiencia en un producto génico funcional (proteína), o para proporcionar un ácido nucleico o proteína inhibitoria a un sujeto que produce un producto génico (proteína) anormal, parcialmente funcional o no funcional que puede conducir a la enfermedad. En consecuencia, los sujetos apropiados para el tratamiento incluyen aquellos que tienen o corren el riesgo de producir una cantidad insuficiente o que tienen una deficiencia en un producto génico funcional (proteína), o producen un producto génico anormal, parcialmente funcional o no funcional (proteína), que puede conducir a la enfermedad. Los sujetos apropiados para el tratamiento descrito en la presente memoria también incluyen aquellos que tienen o corren el riesgo de producir un producto génico (proteína) anormal o defectuoso (mutante) que conduce a una enfermedad tal que la reducción de las cantidades, la expresión o la función del producto genético (proteína) anormal o defectuoso (mutante) conduciría al tratamiento de la enfermedad, o reduciría uno o más síntomas o mejoraría la enfermedad. Por lo tanto, los sujetos de interés incluyen los sujetos que tienen tales defectos, independientemente del tipo de enfermedad, el momento o el grado de inicio, la progresión, la gravedad, la frecuencia o el tipo o duración de los síntomas.
La "profilaxis" y las variaciones gramaticales de la misma significan un método en el que el contacto, la administración o la administración in vivo a un sujeto es anterior a la enfermedad. La administración in vivo a un sujeto se puede realizar antes del desarrollo de un síntoma adverso, afección, complicación, etc. causada o asociada con la enfermedad. Por ejemplo, se puede usar un tamizaje (por ejemplo, genético) para identificar a tales sujetos como candidatos para los métodos y usos descritos en la presente memoria, aunque el sujeto puede no manifestar la enfermedad. Por lo tanto, tales sujetos incluyen los seleccionados como positivos para una cantidad insuficiente o una deficiencia en un producto génico funcional (proteína), o que producen un producto génico (proteína) anormal, parcialmente funcional o no funcional, que puede conducir a la enfermedad; y los sujetos que dan positivo para un producto génico (proteína) anormal o defectuoso (mutante) que conduce a la enfermedad, a pesar de que dichos sujetos no manifiestan los síntomas de la enfermedad.
Los métodos y usos descritos en la presente memoria incluyen el suministro y la administración sistémica, regional o local, o por cualquier vía, por ejemplo, mediante inyección, infusión, por vía oral (por ejemplo, ingestión o inhalación) o tópica (por ejemplo, transdérmica). Dicho suministro o administración incluye la vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intracavitaria, intracraneal, transdérmica (tópica), parenteral, por ejemplo, transmucosal o rectal. Las vías de suministro o administración ilustrativas incluyen la intravenosa (iv), intraperitoneal (ip), intraarterial, intramuscular, parenteral, subcutánea, intrapleural, tópica, dérmica, intradérmica, transdérmica, parenteral, por ejemplo, transmucosal, intracraneal, intraespinal, oral (alimentaria), mucosal, por la respiración, intranasal, mediante intubación, intrapulmonar, mediante instilación intrapulmonar, bucal, sublingual, intravascular, intratecal, intracavitaria, iontoforética, intraocular, oftálmica, óptica, intraglandular, intraorgánica, intralinfática.
Las dosis pueden variar y dependen de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico, el tipo, el inicio, la progresión, la gravedad, la frecuencia, la duración o la probabilidad de la enfermedad a la que se dirige el tratamiento, el resultado clínico deseado, los tratamientos previos o simultáneos, la salud general, la edad, el sexo, la raza o la competencia inmunológica del sujeto y otros factores que apreciará el experto en la técnica. La cantidad, el número, la frecuencia o la duración de la dosis pueden aumentarse o reducirse proporcionalmente, según lo indicado por cualquier efecto secundario adverso, las complicaciones u otros factores de riesgo del tratamiento o la terapia y el estado del sujeto. El experto en la técnica apreciará los factores que pueden influir en la dosis y el tiempo requeridos para proporcionar una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico o profiláctico.
Los métodos y usos descritos en la presente memoria se pueden poner en práctica dentro de 1-2, 2-4, 4-12, 12-24 o 24­ 72 horas después de que se haya identificado que un sujeto tiene la enfermedad seleccionada como objetivo para el tratamiento, tiene uno o más síntomas de la enfermedad, o se ha sometido al análisis e identificado como positivo, tal como se establece en la presente memoria, aunque el sujeto no tenga uno o más síntomas de la enfermedad. Por supuesto, los métodos y usos descritos en la presente memoria se pueden poner en práctica 1-7, 7-14, 14-21, 21-48 o más días, meses o años después de que un sujeto se haya identificado por tener la enfermedad seleccionada como objetivo para el tratamiento, tenga uno o más síntomas de la enfermedad, o se haya examinado e identificado como positivo, como se establece en la presente memoria.
Un vector recombinante (por ejemplo, de AAV, como el vector de AAV-Rh74 o vector de AAV relacionado, como las variantes de AAV-Rh74, como las variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)), secuencias, plásmidos, genomas de vectores, partículas virales recombinantes (por ejemplo, de AAV, como el vector de AAV-Rh74 o el vector de AAV relacionado, como las variantes de AAV-Rh74, como las variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) y otras composiciones, agentes, fármacos, productos biológicos (proteínas) pueden incorporarse en las composiciones farmacéuticas, por ejemplo, un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones farmacéuticas son útiles, entre otras cosas, para la administración a un sujeto in vivo o ex vivo.
Como se usan en la presente memoria, las expresiones "farmacéuticamente aceptable" y "fisiológicamente aceptable" significan una formulación biológicamente aceptable, gaseosa, líquida o sólida, o una mezcla de las mismas, que es adecuada para una o más vías de administración, administración o contacto in vivo. Una composición "farmacéuticamente aceptable" o "fisiológicamente aceptable" es un material que no es indeseable biológicamente o de cualquier otra manera, por ejemplo, el material puede administrarse a un sujeto sin causar efectos biológicos indeseables importantes. Por lo tanto, dicha composición farmacéutica puede usarse, por ejemplo, en la administración de un vector viral o una partícula viral (por ejemplo, de AAV-Rh74 o AAV relacionado, tales como variantes de AAV-Rh74, tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) o célula transformada a un sujeto.
Dichas composiciones incluyen disolventes (acuosos o no acuosos), disoluciones (acuosas o no acuosas), emulsiones (por ejemplo, aceite en agua o agua en aceite), suspensiones, jarabes, elixires, medios de dispersión y suspensión, recubrimientos, agentes isotónicos y promotores o retardadores de la absorción, compatibles con la administración farmacéutica o el contacto o suministro in vivo. Los disolventes, disoluciones y suspensiones acuosas y no acuosas pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen comprimidos (recubiertos o no recubiertos), cápsulas (duras o blandas), microesferas, polvos, gránulos y cristales. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios (por ejemplo, conservantes, agentes antibacterianos, antivirales y antifúngicos) a las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para que sean compatibles con una ruta particular de administración, como se establece en la presente memoria o como conoce un experto en la técnica. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas incluyen vehículos, diluyentes o excipientes adecuados para la administración por diversas rutas.
Las composiciones adecuadas para administración parenteral comprenden disoluciones, suspensiones o emulsiones acuosas y no acuosas del compuesto activo, cuyas preparaciones son típicamente estériles y pueden ser isotónicas con la sangre del receptor deseado. Los ejemplos ilustrativos no limitantes incluyen agua, solución salina, dextrosa, fructosa, etanol, aceites animales, vegetales o sintéticos.
Para la administración transmucosal o transdérmica (por ejemplo, contacto tópico), se pueden incluir agentes penetrantes en la composición farmacéutica. Los agentes penetrantes se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. Para la administración transdérmica, el ingrediente activo puede formularse en aerosoles, esprays, pomadas, bálsamos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica. Para el contacto con la piel, las composiciones farmacéuticas incluyen típicamente pomadas, cremas, lociones, pastas, geles, esprays, aerosoles o aceites. Los vehículos que pueden usarse incluyen vaselina, lanolina, polietilenglicoles, alcoholes, potenciadores transdérmicos y combinaciones de los mismos.
Se pueden añadir codisolventes y adyuvantes a la formulación. Los ejemplos no limitantes de codisolventes contienen grupos hidroxilo u otros grupos polares, por ejemplo, alcoholes, tales como alcohol isopropílico; glicoles, tales como propilenglicol, polietilenglicol, polipropilenglicol, éter de glicol; glicerol; polialcoholes de oxietileno y ésteres de ácidos grasos de polioxietileno. Los adyuvantes incluyen, por ejemplo, tensioactivos tales como lecitina de soja y ácido oleico; ésteres de sorbitán tales como trioleato de sorbitán; y polivinilpirrolidona.
Las composiciones farmacéuticas y los sistemas de administración apropiados para los genomas de vectores, partículas virales (por ejemplo, un vector de AAV-Rh74 o vector de AAV relacionado tal como variantes de AAV-Rh74 como las variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4-1)) y los métodos y usos descritos en la presente memoria se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12a ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel y Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11a ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; y Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., págs. 253-315).
Una "forma farmacéutica unitaria", como se usa en la presente memoria, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada opcionalmente en asociación con un vehículo farmacéutico (excipiente, diluyente, vehículo o agente de relleno) que, cuando se administra en una o más dosis, se calcula que produzca un efecto deseado (por ejemplo, efecto profiláctico o terapéutico). Las formas farmacéuticas unitarias pueden estar, por ejemplo, en ampollas y viales, que pueden incluir una composición líquida, o una composición en estado liofilizado; se puede añadir un vehículo líquido estéril, por ejemplo, antes de la administración in vivo. Las formas farmacéuticas unitarias individuales se pueden incluir en kits o envases multidosis. Las secuencias de vectores recombinantes (por ejemplo, de AAV), plásmidos, genomas de vectores, partículas de virus recombinantes (por ejemplo, vector de AAV-Rh74 o vector de AAV relacionado, tales como variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1)), y composiciones farmacéuticas de estos se pueden empaquetar en una forma farmacéutica unitaria o múltiple para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación.
En la presente memoria también se describen kits con un material de embalaje y uno o más componentes en el mismo. Un kit generalmente incluye una etiqueta o un prospecto que incluye una descripción de los componentes o instrucciones para el uso in vitro, in vivo o ex vivo de los componentes que contiene. Un kit puede contener una colección de tales componentes, por ejemplo, un genoma de vector (por ejemplo, de AAV) o partícula viral (por ejemplo, vector de AAV-Rh74 o vector de AAV relacionado, tales como variantes de AAV-Rh74 tales como variantes de la cápside (por ejemplo, RHM4- 1)) y opcionalmente un segundo componente activo, tal como otro compuesto, agente, fármaco o composición.
Un kit se refiere a una estructura física que alberga uno o más componentes del kit. El material de embalaje puede mantener los componentes de forma estéril, y puede estar fabricado de un material comúnmente utilizado para tales fines (por ejemplo, papel, fibra corrugada, vidrio, plástico, papel de aluminio, ampollas, frascos, tubos, etc.).
Las etiquetas o los prospectos pueden incluir información de identificación de uno o más componentes, cantidades de dosis, farmacología clínica de los ingredientes activos, incluido el mecanismo de acción, farmacocinética y farmacodinámica. Las etiquetas o prospectos pueden incluir información de identificación del fabricante, números de lote, ubicación y fecha de fabricación, fechas de caducidad. Las etiquetas o los prospectos pueden incluir información que identifique la información del fabricante, los números de lote, la ubicación y la fecha de fabricación. Las etiquetas o los prospectos pueden incluir información sobre una enfermedad para la cual se puede usar un componente del kit. Las etiquetas o los prospectos pueden incluir instrucciones para que el médico o el sujeto usen uno o más de los componentes del kit en un método, uso o protocolo de tratamiento o régimen terapéutico. Las instrucciones pueden incluir cantidades de dosis, frecuencia o duración, e instrucciones para poner en práctica cualquiera de los métodos, usos, protocolos de tratamiento o regímenes profilácticos o terapéuticos descritos en la presente memoria.
Las etiquetas o los prospectos pueden incluir información sobre cualquier beneficio que un componente pueda proporcionar, como un beneficio profiláctico o terapéutico. Las etiquetas o los prospectos pueden incluir información sobre posibles efectos secundarios adversos, complicaciones o reacciones, tales como advertencias al sujeto o al médico con respecto a las situaciones en las que no sería apropiado usar una composición en particular. Los efectos secundarios adversos o las complicaciones también pueden ocurrir cuando el sujeto tiene, tomará o esté tomando uno o más medicamentos que pueden ser incompatibles con la composición, o si el sujeto ha recibido o recibirá otro protocolo de tratamiento o régimen terapéutico que sería incompatible con la composición y, por lo tanto, las instrucciones podrían incluir información sobre tales incompatibilidades.
Las etiquetas o prospectos incluyen "material impreso", por ejemplo, papel o cartón, separado o fijado a un componente, un kit o material de embalaje (por ejemplo, una caja), o unido a una ampolla, tubo o frasco que contiene un componente del kit. Las etiquetas o prospectos pueden incluir adicionalmente un medio legible por ordenador, como una etiqueta impresa con un código de barras, un disco, un disco óptico como un CD o DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, cinta magnética o un medio de almacenamiento eléctrico como RAM y ROM o híbridos de estos, como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos, medios FLASH o tarjetas de memoria.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayos descritos en la presente, los métodos y materiales adecuados se describen en la presente memoria.
Todas las características descritas en la presente memoria pueden combinarse en cualquier combinación. Cada característica descrita en la memoria descriptiva se puede sustituir por una característica alternativa que tenga un mismo propósito, equivalente o similar. Por lo tanto, a menos que se indique expresamente lo contrario, las características descritas (por ejemplo, una secuencia de vector recombinante (por ejemplo, de AAV), plásmido, genoma del vector o partícula viral recombinante (por ejemplo, vector de AAV-Rh74 o vector de AAV relacionado, tales como variantes de la cápside de AAV-Rh74 (por ejemplo, RHM4-1)) son un ejemplo de un género de características equivalentes o similares.
Como se usa en la presente memoria, las formas singulares "un(a)", "y" y "el/la" incluyen las referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un polinucleótido" incluye una pluralidad de tales polinucleótidos, la referencia a "un vector" incluye una pluralidad de tales vectores, y la referencia a "un virus" o "partícula" incluye una pluralidad de tales viriones / partículas.
Como se usan en la presente memoria, todos los valores numéricos o rangos numéricos incluyen los números enteros dentro de tales rangos y las fracciones de los valores o los números enteros dentro de los rangos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, como ilustración, la referencia al menos a un 80 % de identidad incluye un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, etc., así como 81,1 %, 81,2 %, 81,3 %, 81,4 %, 81,5 %, etc., 82,1 %, 82,2 %, 82,3 %, 82,4 %, 82,5 %, etc., y así sucesivamente.
La referencia a un número entero con más (mayor) o menos que incluye cualquier número mayor o menor que el número de referencia, respectivamente. Así, por ejemplo, una referencia a menos de 1000 incluye 999, 998, 997, etc. hasta el número uno (1); y menos de 100, incluye 99, 98, 97, etc. hasta el número uno (1).
Como se usa en la presente memoria, todos los valores numéricos o rangos incluyen las fracciones de los valores y los enteros dentro de dichos rangos, y las fracciones de los enteros dentro de dichos rangos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, como ilustración, la referencia a un rango numérico, como un rango de porcentaje, tal como 1-10 incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, así como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, etc., y así sucesivamente. La referencia a un rango de 1-50, por lo tanto, incluye 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc., hasta 50 y que incluye a este, así como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, etc., 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, etc., y así sucesivamente.
La referencia a una serie de rangos incluye los rangos que combinan los valores de los límites de los diferentes rangos dentro de la serie. Por lo tanto, para ilustrar la referencia a una serie de rangos de 11-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50­ 60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5500-6000, 6000-7000, 7000-8000 u 8000-9000, incluye los rangos de 10-50, 50-100, 100-1000, 1000-3000, 2000-4000, etc.
Ejemplos
Ejemplo 1
Este ejemplo incluye una descripción de varios materiales y métodos.
Ratones: Ratones C57BL/6J (TN) machos de 8-10 semanas de edad, n = 5 por grupo experimental. El perro es un perro HB de la colonia Chapel Hill de la Universidad de Carolina del Norte que porta una mutación sin sentido en el gen FIX (Evans et al., Proc Natl Acad Sci USA 86: 10095 (1989)).
Construcciones de vectores de AAV: Los estudios in vivo en ratones se realizaron usando una construcción que expresa FIX humano bajo control del promotor específico de hígado de ApoE-hAAT. El estudio en perros utilizó un promotor casi idéntico y el transgén FIX canino.
Metodología de transferencia génica: Todos los vectores se administraron por vía intravenosa. En los ratones a través de la vena de la cola (se administró un volumen de 200 microlitros por ratón, el vector se diluyó en PBS). En los perros, el vector se administró a través de la vena safena.
Determinación de la expresión de FIX: Se utilizó un ELISA para medir los niveles de FIX. En ratones, el par de anticuerpos de ELISA de FIX humanos (captura y secundario) es de Affinity Biologicals. En perros, se usó un par de anticuerpos también de Affinity Biologicals como se describe en Haurigot et al. (Mol Ther 18: 1318 (2010)).
Análisis estadístico: El análisis estadístico se realizó con una prueba t de dos colas para datos independientes. Los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Mediciones de anticuerpos contra AAV: Se usó un ensayo de neutralización in vitro descrito en Manno et al., (Nat Med 12: 342 (2006)) y Mingozzi et al. (Nat Med 13:419 (2007)) para la medición de anticuerpos. En resumen, se usaron dos construcciones de vectores de AAV en el ensayo, un vector monocatenario que expresaba p-galactosidasa bajo control del promotor de CMV (ssAAV-LacZ), o un vector autocomplementario que expresaba el gen indicador de Renilla, AAV-Rh74-CBA-Renilla, bajo control del promotor de p-actina de pollo (CBA). Para aumentar la eficiencia de la transducción de vectores de AAV in vitro, se usaron células 2V6.11 (ATCC), que expresaron el gen adenoviral E4 bajo control de un promotor inducible. Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1,25x104 células/pocillo y se añadió una dilución 1:1000 de ponasterona A (Invitrogen) al medio para inducir la expresión de E4. El día del ensayo, las diluciones semilogarítmicas en serie del suero de ensayo inactivado térmicamente se mezclaron con medio que contenía virus. Para el vector ssAAV-LacZ, la concentración de virus utilizada en el ensayo fue de ~1x1010 vg/ml para AAV2 y ~5,5x1010 vg/ml para AAV5, 6 u 8. Para el vector scAAV-Luc, la concentración de virus en el ensayo fue entre -50 y 150 veces menor. La actividad residual del transgén indicador se midió usando un ensayo colorimétrico (ssAAV-LacZ) o un luminómetro (scAAV-Luc).
Las subclases de IgG o Ig total anti-cápside de AAV se midieron con un ensayo de captura; las placas de ELISA se recubrieron con 5x1010 partículas de cápside/ml de cápsides vacías de AAV. Las placas se bloquearon con BSA al 2 %, Tween 20 al 0,05 % en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente, y se cargaron diluciones en serie de las muestras en los pocillos y se incubaron durante la noche a 4 °C. Se utilizaron anticuerpos anti-IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM humana conjugados con biotina como anticuerpos de detección; se añadió estreptavidina-HRP para la detección del sustrato. La concentración de Ig se determinó frente a curvas patrón hechas con una dilución en serie de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM purificadas (Sigma).
Producción de AAV: El proceso para la producción de vectores se describe con detalle en Ayuso et al. (Gene Ther 17: 503 (2010)).
Ejemplo 2
Este ejemplo incluye una descripción de los estudios en animales de transferencia de genes FIX humanos (ratones) y la expresión de FIX después de la transferencia de los genes.
A los ratones C57BL/6 (n = 5 por grupo) se les inyectaron a través de la vena de la cola vectores de AAV que portaban el gen de Factor IX (FIX) (2,510 genomas de vectores por ratón) bajo control de un promotor específico de hígado. Se determinaron los niveles plasmáticos del producto transgénico de FIX humano (proteína) en los ratones mediante ELISA en las semanas 1, 2 y 4 tras la transferencia génica, y se ilustran en la Figura 1. AAV-Rh74 mostró el nivel más alto de expresión transgénica en los animales.
Ejemplo 3
Este ejemplo incluye una descripción de los estudios en animales y datos que demuestran la administración efectiva de FIX mediada por AAV-Rh74 a niveles terapéuticos en perros con hemofilia.
En resumen, a los perros con hemofilia B se les infundieron por vía intravenosa (IV) a través de la vena safena 3 x 1012 genomas de vectores por kg de peso. La expresión del transgén terapéutico FIX estaba controlada por un promotor específico de hígado. Los vectores y los niveles de FIX se monitorizaron mediante ELISA. Los niveles plasmáticos de FIX canino se muestran en la Figura 2. AAV-Rh74 y AAV8 tuvieron un rendimiento similar en los perros con hemofilia B, y ambos fueron superiores a AAV6.
Ejemplo 4
Este ejemplo incluye una descripción de los estudios que muestran la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-AAV (NAb) en humanos.
Los datos de la Tabla 1 muestran los anticuerpos neutralizantes anti-AAV (NAb) medidos en humanos con un ensayo in vitro. Los sujetos con un título de NAb menor o igual a 1:1 se definen como vírgenes o de bajo título para los anticuerpos anti-AAV, y pueden elegirse para la transferencia génica para ese serotipo de AAV (señalados en gris). Los pacientes con títulos entre 1:1 y 1:3 se consideran permisivos para AAV siempre que se utilicen cápsides vacías como señuelos. Las muestras con títulos superiores a 1:3 se consideran no permisivas a la transducción de AAV después de la inyección sistémica y se rellenan en gris claro. AAV-Rh74 exhibió la menor prevalencia de NAb anti-AAV en comparación con AAV-2 y AAV-8.
Tabla 1
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Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0002
Figure imgf000029_0001
Ejemplo 5
Este ejemplo incluye una descripción de los datos que muestran las cantidades de producción de diferentes serotipos de AAV, incluido AAV-Rh74.
Los datos de la Tabla 2 muestran el rendimiento de producción de los diferentes serotipos de AAV. Se informa el tamaño del lote de virus en las botellas rotatorias, el rendimiento total del vector y el rendimiento por botella. Todos los serotipos se empaquetaron con el mismo casete de expresión. AAV-Rh74 tiene un rendimiento comparable o mayor que los otros serotipos evaluados, concretamente, AAV-8, AAV-dj y AAV-2.
Tabla 2
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Ejemplo 6
Este ejemplo incluye una descripción de los datos que muestran que el vector AAVrh74 que expresa el Factor IXhumano (FIX) bajo control de un promotor específico de hígado administrado a macacos rhesus condujo a cantidades de producción de FIX en los animales, y a niveles más altos que el vector AAV8 administrado en la misma cantidad.
En resumen, a los animales se les administró AAV8 o AAVrh74 a una dosis de 2x1012 genomas de vector (vg)/kg de peso. Los vectores se formularon en solución salina o en una mezcla de vector y cápside vacía de AAV (indicada EC).
La Figura 4 es un gráfico de histograma del promedio (semanas 2 a 8) y el error estándar o la media de FIX humana medida mediante un ELISA que detecta específicamente FIX humano en plasma de macaco rhesus. Los animales que recibieron el vector AAVrh74-FIX se muestran en las últimas dos barras en el margen derecho. Los datos muestran que los animales que recibieron los vectores AAVrh74 (las dos últimas barras en el margen derecho) expresaron el transgén FIX a niveles más altos en comparación con los otros grupos de animales inyectados a la misma dosis (barras negras y grises). Los niveles promedio se compararon mediante la prueba t de Student bilateral para datos independientes. Uno de los animales que recibieron AAV-RHM4-1-FIX desarrolló un inhibidor contra el producto transgénico del factor IX humano, lo cual es un fenómeno bien documentado que ocurre en aproximadamente el 20 % de los macacos tratados con un vector de FIX humano. El segundo animal tratado con RHM4-1 expresó niveles de FIX alrededor de 2 veces mayores en comparación con los macacos tratados con AAV8.
Ejemplo 7
Este ejemplo incluye una descripción de varias variantes de la cápside Rh74.
Brevemente, se introdujeron varias sustituciones en la secuencia de la cápside Rh74 para producir variantes de la cápside Rh74. Las diferentes variantes de la cápside Rh74 y los aminoácidos sustituidos en cada posición fueron los siguientes: Tabla 3: Variantes Sustituciones de aminoácidos y posiciones indicadas en la cápside VP1
RHM4_1 G195A-L199V-S201P-G202N
RHM15_1 G195A-L199V-S201P-G202N K( 137/259/333/530/552/569/38/51/77/169/547)R
RHM15_2 G195A-L199V-S201P-G202N K( 137/259/333/530/552/569/38/51/77/163/169)R
RHM15_3 G195A-L199V-S201P-G202N K( 137/259/333/530/552/569/38/51/77/163/547)R
RHM15_4 G195A-L199V-S201P-G202N K( 137/259/333/530/552/569/38/51/77/163/668)R
RHM15_5 G195A-L199V-S201P-G202N K( 137/259/333/530/552/569/38/51/77/547/163)R
RHM15_6 G195A-L199V-S201P-G202N K( 137/259/333/530/552/569/38/51/77/547/688)R
La variante RHM4-1 tenía una sustitución de alanina, valina, prolina y asparagina en las posiciones de aminoácidos 195, 199, 201 y 202, respectivamente, de la cápside VP1 de Rh74. La secuencia de aminoácidos de la cápside VP1 variante RHM4-1, con los residuos sustituidos a, v, p y n, subrayados y en negrita, es la siguiente (SEQ ID NO: 5):
1 maadgylpdwlednlsegirewwdlkpgapkpkanqqkqdngrglvlpgykylgpfngld 61 kgepvnaadaaalehdkaydqqlqagdnpylrynhadaefqerlqedtsfggnlgravfq 121 akkrvleplglvespvktapgkkrpvepspqrspdsstgigkkgqqpakkrlnfgqtgds 181 esvpdpqpigeppaapsgvgEntmaagggapmadnnegadgvgsssgnwhcdstwlgdrv 241 ittstrtwalptynnhlykqisngtsggstndntyfgystpwgyfdfnrfhchfsprdwq 301 rlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtqnegtktiannltstiqvftdseyqlpyvlgsa 361 hqgclppfpadvfmipqygyltlnngsqav grssfycleyfpsqmlrtgnnfefsynfed 421 vpfhssyahsqsldrlmnplidqylyylsrtqstggtagtqqllfsqagpnnmsaqaknw 481 lpgpcyrqqrvs 111sqnnnsnfawtgatkyhlngrds1vnpgvamathkddeer f fpss 541 gvlmfgkqgagkdnvdyssvmltseeeikttnpvateqygwadnlqqqnaapivgavns 601 qgalpgmvwqnrdvylqgpiwakiphtdgnfhpsplmggfglkhpppqilikntpvpadp 661 pttfnqaklasfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqytsnyykstnvdfavnte 721 yseprpigtryltrnl
La secuencia de ácido nucleico de la cápside VP1 variante RHM4-1, con codones que codifican a, v, p y n, subrayados y en negrita, es la siguiente (SEQ ID NO: 11):
1 atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgc 61 gagtggtgggacctgaaacctggagccccgaaacccaaagccaaccagcaaaagcaggac 121 aacggccggggtctggtgcttcctggctacaagtacctcggacccttcaacggactcgac 181 aagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgac 241 cagcagctccaagcgggtgacaatccgtacctgcggtataatcacgccgacgccgagttt 301 caggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgcgcagtcttccag 361 gccaaaaagcgggttctcgaacctctgggcctggttgaatcgccggttaagacggctcct 421 ggaaagaagagaccggtagagccatcaccccagcgctctccagactcctctacgggcatc 481 ggcaagaaaggccagcagcccgcaaaaaagagactcaattttgggcagactggcgactca 541 gagtcagtccccgaccctcaaccaatcggagaaccaccagcagccccctctggtgjtggga 601 cctaatacaatggctgcaggcggtggcgctccaatggcagacaataacgaaggcgccgac 661 ggagtgggtagttcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtc 721 atcaccaccagcacccgcacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaagcaa 781 atctccaacgggacctcgggaggaagcaccaacgacaacacetacttcggctacagcacc 841 ccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcag 901 cgactcatcaacaacaactggggattccggcccaagaggctcaacttcaagctcttcaac 961 atccaagtcaaggaggtcacgcagaatgaaggcaccaagaccatcgccaataaccttacc 1021 agcacgattcaggtctttacggactcggaataccagctcccgtacgtgctcggctcggcg 1081 caccagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtcttcatgattcctcagtacgggtac 1141 ctgactctgaacaatggcagtcaggctgtgggccggtcgtccttctactgcctggagtac 1201 tttccttctcaaatgctgagaacgggcaacaactttgaattcagctacaacttcgaggac 1261 gtgcccttccacagcagctacgcgcacagccagagcctggaccggctgatgaaccctctc 1321 atcgaccagtacttgtactacctgtcccggactcaaagcacgggcggtactgcaggaact 1381 cagcagttgctattttctcaggccgggcctaacaacatgtcggctcaggccaagaactgg 1441 ctacccggtccctgctaccggcagcaacgcgtctccacgacactgtcgcagaacaacaac 1501 agcaactttgcctggacgggtgccaccaagtatcatctgaatggcagagactctctggtg 1561 aatcctggcgttgccatggctacccacaaggacgacgaagagcgattttttccatccagc 1621 ggagtcttaatgtttgggaaacagggagctggaaaagacaacgtggactatagcagcgtg 1681 atgctaaccagcgaggaagaaataaagaccaccaacccagtggccacagaacagtacggc 1741 gtggtggccgataacctgcaacagcaaaacgccgctcctattgtaggggccgtcaatagt 1801 caaggagccttacctggcatggtgtggcagaaccgggacgtgtacctgcagggtcccatc 1861 tgggccaagattcctcatacggacggcaactttcatccctcgccgctgatgggaggcttt 1921 ggactgaagcatccgcctcctcagatcctgattaaaaacacacctgttcccgcggatcct 1981 ccgaccaccttcaatcaggccaagctggcttctttcatcacgcagtacagtaccggccag 2041 gtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggagaacagcaaacgctggaacccagag 2101 attcagtacacttccaactactacaaatctacaaatgtggactttgctgtcaatactgag 2161 ggtacttattccgagcctcgccccattggcacccgttacctcacccgtaatctg
Las variantes RHM15-1, 15-2, 15-3, 15-4, 1-5 y 15-6 también tenían una sustitución de alanina, leucina, prolina y asparagina en las posiciones de aminoácidos 195, 199, 201 y 202, respectivamente, de la cápside VP1 de Rh74. Además, estas variantes tenían múltiples sustituciones de lisina por arginina en varias posiciones.
La secuencia de aminoácidos de la cápside VP1 variante RHM15-1 es la siguiente (SEQ ID NO: 6):
1 maadgylpdwlednlsegirewwcLlkpgapkpkanqqrqdngrglvlpgyrylgpfngld
61 kgepvnaadaaalehdraydqqlqagdnpylrynhadaefqerlqedtsfggnlgravfq
121 akkrvleplglvespvrtapgkkrpvepspqrspds stgigkkgqqparkrlnfgqtgds 181 esvpdpqpigeppaapsgvgpntmaagggapmadnnegadgvgs ssgnwhcdstwlgdrv
241 ittstrtwalptynnhlyrqisngt sggstndntyfgystpwgyfdfnrfhchf sprdwq 301 rlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtqnegtrtiannltstiqvftdseyqlpyvlgsa 361 hqgclppfpadvfmipqygyltlnngsqavgrs sfyeleyfpsqmlrtgnnfef synfed 421 vpfhs syahsqsldrlmnplidqylyylsrtqstggtagtqqllf sqagpnnmsaqaknw 481 lpgpcyrqqrvsttlsqnnnsnfawtgatkyhlngrdslvnpgvamathrddeerffps s 541 gvlmfgrqgagrdnvdys svmltseeeirttnpvateqygvvadnlqqqn aapivgavns 601 qgalpgmvwqnrdvylqgpiwakiphtdgnfhpsplmggfglkhpppqilikntpvpadp 661 pttfnqaklasfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqyt snyykstnvdfavnte 721 gtyseprpigtryltrnl
La secuencia de ácido nucleico de la cápside VP1 variante RHM15-1 es la siguiente (SEQ ID NO: 12):
1 atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgc
61 gagtggtgggacctgaaacctggagccccgaaacccaaagccaaccagcaaaggcaggac 121 aacggccggggtctggtgcttcctggctacaggtacctcggacccttcaacggactcgac 181 aagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcgagcacgacagggcctacgac 241 cagcagctccaagcgggtgacaatccgtacctgcggtataatcacgccgacgccgagttt 301 caggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgcgcagtcttccag 361 gccaaaaagcgggttctcgaacctctgggcctggttgaatcgccggttaggacggctcct 421 ggaaagaagagaccggtagagccatcaccccagcgctctccagactcctctacgggcatc 481 ggcaagaaaggccagcagcccgcaagaaagagactcaattttgggcagactggcgactca 541 gagtcagtccccgaccctcaaccaatcggagaaccaccagcagccccctctggtgtggga 601 cctaatacaatggctgcaggcggtggcgctccaatggcagacaataacgaaggcgccgac 661 ggagtgggtagttcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtc 721 atcaccaccagcacccgcacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaggcaa 781 atctccaacgggacctcgggaggaagcaccaacgacaacacctacttcggctacagcacc 841 ccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcag 901 cgactcatcaacaacaactggggattccggcccaagaggctcaacttcaagctcttcaac 961 atccaagtcaaggaggtcacgcagaatgaaggcaccagga ccatcgccaa taaccttacc 1021 agcacgattcaggtctttacggactcggaataccagctcc cgtacgtgct cggctcggcg 1081 caccagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtcttca tgattcctca gtacgggtac 1141 ctgactctgaacaatggcagtcaggctgtgggccggtcgt ccttctactg cctggagtac 1201 tttccttctcaaatgctgagaacgggcaacaactttgaat tcagctacaa cttcgaggac 1261 gtgcccttccacagcagctacgcgcacagccagagcctgg accggctgat gaaccctctc 1321 atcgaccagtacttgtactacctgtcccggactcaaagca cgggcggtac tgcaggaact 1381 cagcagttgctattttctcaggccgggcctaacaacatgt cggctcaggc caagaactgg 1441 ctacccggtccctgctaccggcagcaacgcgtctccacga cactgtcgca gaacaacaac 1501 agcaactttgcctggacgggtgccaccaagtatcatctga atggcagaga ctctctggtg 1561 aatcctggcgttgccatggctacccacagggacgacgaag agcgattttt tccatccagc 1621 ggagtcttaatgtttgggagacagggagctggaagagaca acgtggacta tagcagcgtg 1681 atgctaaccagcgaggaagaaataaggaccaccaacccag tggccacaga acagtacggc 1741 gtggtggccgataacctgcaacagcaaaacgccgctccta ttgtaggggc cgtcaatagt 1801 caaggagccttacctggcatggtgtggcagaaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc 1861 tgggccaagattcctcatacggacggcaactttcatccct cgccgctgat gggaggcttt 1921 ggactgaagcatccgcctcctcagatcctgattaaaaaca cacctgttcc cgcggatcct 1981 ccgaccaccttcaatcaggccaagctggcttctttcatca cgcagtacag taccggccag 2041 gtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggagaaca gcaaacgctg gaacccagag 2101 attcagtacacttccaactactacaaatctacaaatgtgg actttgctgt caatactgag 2161 ggtacttattccgagcctcgccccattggcacccgttacc tcacccgtaa tctgtaa
La secuencia de aminoácidos de la cápside VP1 variante RHM15-2 es la siguiente (SEQ ID NO: 7):
1 maadgylpdwlednlsegirewwdlkpgapkpkanqqrqd ngrglvlpgy rylgpfngld 61 kgepvnaadaaalehdraydqqlqagdnpylrynhadaef qerlqedtsf ggnlgravfq 121 akkrvleplglvespvrtapgkkrpvepspqrspdsstgi gkrgqqpark rlnfgqtgds 181 esvpdpqpigeppaapsgvgpntmaagggapmadnnegad gvgsssgnwh cdstwlgdrv 241 ittstrtwalptynnhlyrqisngtsggstndntyfgyst pwgyfdfnrf hchfsprdwq 301 rlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtqnegtrtiannlt stiqvftdse yqlpyvlgsa 361 hqgclppfpadvfmipqygyltlnngsqavgrssfycley fpsqmlrtgn nfefsynfed 421 vpfhssyahsqsldrlmnplidqylyylsrtqstggtagt qqllfsqagp nnmsaqaknw 481 lpgpcyrqqrvsttlsqnnnsnfawtgatkyhlngrdslv npgvamathr ddeerffpss 541 gvlmfgkqgagrdnvdyssvmltseeeirttnpvateqyg vvadnlqqqn aapivgavns 601 qgalpgmvwqnrdvylqgpiwakiphtdgnfhpsplmggf glkhpppqil ikntpvpadp 661 pttfnqaklasfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpe iqytsnyyks tnvdfavnte 721 gtyseprpigtryltrnl
La secuencia de ácido nucleico de la cápside VP1 variante RHM15-2 es la siguiente (SEQ ID NO: 13):
1 atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 61 gagtggtgggacctgaaacctggagccccgaaacccaaag ccaaccagca aaggcaggac 121 aacggccggggtctggtgcttcctggctacaggtacctcg gacccttcaa cggactcgac 181 aagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcg agcacgacag ggcctacgac 241 cagcagctccaagcgggtgacaatccgtacctgcggtata atcacgccga cgccgagttt 301 caggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacc tcgggcgcgc agtcttccag 361 gccaaaaagcgggttctcgaacctctgggcctggttgaat cgccggttag gacggctcct 421 ggaaagaagagaccggtagagccatcaccccagcgctctc cagactcctc tacgggcatc 481 ggcaagagaggccagcagcccgcaagaaagagactcaatt ttgggcagac tggcgactca 541 gagtcagtccccgaccctcaaccaatcggagaaccaccag cagccccctc tggtgtggga 601 cctaatacaatggctgcaggcggtggcgctccaatggcag acaataacga aggcgccgac 661 ggagtgggtagttcctcaggaaattggcattgcgattcca catggctggg cgacagagtc 721 atcaccaccagcacccgcacctgggccctgcccacctaca acaaccacct ctacaggcaa 781 atctccaacgggacctcgggaggaagcaccaacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 841 ccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccact tttcaccacg tgactggcag 901 cgactcatcaacaacaactggggattccggcccaagaggc tcaacttcaa gctcttcaac 961 atccaagtcaaggaggtcacgcagaatgaaggcaccagga ccatcgccaa taaccttacc 1021 agcacgattcaggtctttacggactcggaataccagctcc cgtacgtgct cggctcggcg 1081 caccagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtcttca tgattcctca gtacgggtac 1141 ctgactctgaacaatggcagtcaggctgtgggccggtcgt ccttctactg cctggagtac 1201 tttccttctcaaatgctgagaacgggcaacaactttgaat tcagctacaa cttcgaggac 1261 gtgcccttccacagcagctacgcgcacagccagagcctgg accggctgat gaaccctctc 1321 atcgaccagtacttgtactacctgtcccggactcaaagca cgggcggtac tgcaggaact 1381 cagcagttgctattttctcaggccgggcctaacaacatgt cggctcaggc caagaactgg 1441 ctacccggtccctgctaccggcagcaacgcgtctccacga cactgtcgca gaacaacaac 1501 agcaactttgcctggacgggtgccaccaagtatcatctga atggcagaga ctctctggtg 1561 aatcctggcgttgccatggctacccacagggacgacgaag agcgattttt tccatccagc 1621 ggagtcttaatgtttgggaaacagggagctggaagagaca acgtggacta tagcagcgtg 1681 atgctaaccagcgaggaagaaataaggaccaccaacccag tggccacaga acagtacggc 1741 gtggtggccgataacctgcaacagcaaaacgccgctccta ttgtaggggc cgtcaatagt 1801 caaggagccttacctggcatggtgtggcagaaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc 1861 tgggccaagattcctcatacggacggcaactttcatccct cgccgctgat gggaggcttt 1921 ggactgaagcatccgcctcctcagatcctgattaaaaaca cacctgttcc cgcggatcct 1981 ccgaccaccttcaatcaggccaagctggcttctttcatea cgcagtacag taccggccag 2041 gtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggagaaca gcaaacgctg gaacccagag 2101 attcagtacacttccaactactacaaatctacaaatgtgg actttgctgt caatactgag 2161 ggtacttattccgagcctcgccccattggcacccgttacc tcacccgtaa tctgtaa
La secuencia de aminoácidos de la cápside VP1 variante RHM15-3/RHM15-5 es la siguiente (SEQ ID NO: 8):
1 maadgylpdwlednlsegir ewwdlkpgapkpkanqqrqd ngrglvlpgy rylgpfngld 61 kgepvnaadaaalehdraydqqlqagdnpylrynhadaef qerlqedtsf ggnlgravfq 121 akkrvleplglvespvrtapgkkrpvepspqrspdsstgi gkrgqqpakk rlnfgqtgds 181 esvpdpqpigeppaapsgvgpntmaagggapmadnnegad gvgsssgnwh cdstwlgdrv 241 ittstrtwalptynnhlyrqisngtsggstndntyfgyst pwgyfdfnrf hchfsprdwq 301 rlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtqnegtrtiannlt stiqvftdse yqlpyvlgsa 361 hqgclppfpadvfmipqygyltlnngsqavgrssfycley fpsqmlrtgn nfefsynfed 421 vpfhssyahsqsldrlmnplidqylyylsrtqstggtagt qqllfsqagp nnmsaqaknw 481 lpgpcyrqqrvsttlsqnnnsnfawtgatkyhlngrdslv npgvamathr ddeerffpss 541 gvlmfgrqgagrdnvdyssvmltseeeirttnpvateqyg vvadnlqqqn aapivgavns 601 qgalpgmvwqnrdvylqgpiwakiphtdgnfhpsplmggf glkhpppqil ikntpvpadp 661 pttfnqaklasfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpe iqytsnyyks tnvdfavnte 721 atvseprpicrtrvltrnl
La secuencia de ácido nucleico de la cápside VP1 variante RHM15-3/RHM15-5 es la siguiente (SEQ ID NO: 14):
1 atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 61 gagtggtgggacctgaaacctggagccccgaaacccaaag ccaaccagca aaggcaggac 121 aacggccggggtctggtgcttcctggctacaggtacctcg gacccttcaa cggactcgac 181 aagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcg agcacgacag ggcctacgac 241 cagcagctccaagcgggtgacaatccgtacctgcggtata atcacgccga cgccgagttt 301 caggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacc tcgggcgcgc agtcttccag 361 gccaaaaagcgggttctcgaacctctgggcctggttgaat cgccggttag gacggctcct 421 ggaaagaagagaccggtagagccatcaccccagcgctctc cagactcctc tacgggcatc 481 ggcaagagaggccagcagcccgcaaaaaagagactcaatt ttgggcagac tggcgactca 541 gagtcagtccccgaccctcaaccaatcggagaaccaccag cagccccctc tggtgtggga 601 cctaatacaatggctgcaggcggtggcgctccaatggcag acaataacga aggcgccgac 661 ggagtgggtagttcctcaggaaattggcattgcgattcca catggctggg cgacagagtc 721 atcaccaccagcacccgcacctgggccctgcccacctaca acaaccacct ctacaggcaa 781 atctccaacgggacctcgggaggaagcaccaacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 841 ccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccact tttcaccacg tgactggcag 901 cgactcatcaacaacaactggggattccggcccaagaggc tcaacttcaa gctcttcaac 961 atccaagtcaaggaggtcacgcagaatgaaggcaccagga ccatcgccaa taaccttacc 1021 agcacgattcaggtctttacggactcggaataccagctcc cgtacgtgct cggctcggcg 1081 caccagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtcttca tgattcctca gtacgggtac 1141 ctgactctgaacaatggcagtcaggctgtgggccggtcgt ccttctactg cctggagtac 1201 tttccttctcaaatgctgagaacgggcaacaactttgaat tcagctacaa cttcgaggac 1261 gtgcccttccacagcagctacgcgcacagccagagcctgg accggctgat gaaccctctc 1321 atcgaccagtacttgtactacctgtcccggactcaaagca cgggcggtac tgcaggaact 1381 cagcagttgctattttctcaggccgggcctaacaacatgt cggctcaggc caagaactgg 1441 ctacccggtccctgctaccggcagcaacgcgtctccacga cactgtcgca gaacaacaac 1501 agcaactttgcctggacgggtgccaccaagtatcatctga atggcagaga ctctctggtg 1561 aatcctggcgttgccatggctacccacagggacgacgaag agcgattttt tccatccagc 1621 ggagtcttaatgtttgggagacagggagctggaagagaca acgtggacta tagcagcgtg 1681 atgctaaccagcgaggaagaaataaggaccaccaacccag tggccacaga acagtacggc 1741 gtggtggccgataacctgcaacagcaaaacgccgctccta ttgtaggggc cgtcaatagt 1801 caaggagccttacctggcatggtgtggcagaaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc 1861 tgggccaagattcctcatacggacggcaactttcatccct cgccgctgat gggaggcttt 1921 ggactgaagcatccgcctcctcagatcctgattaaaaaca cacctgttcc cgcggatcct 1981 ccgaccaccttcaatcaggccaagctggcttctttcatea cgcagtacag taccggccag 2041 gtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggagaaca gcaaacgctg gaacccagag 2101 attcagtacacttccaactactacaaatctacaaatgtgg actttgctgt caatactgag 2161 ggtacttattccgagcctcgccccattggcacccgttacc tcacccgtaa tctgtaa
La secuencia de aminoácidos de la cápside VP1 variante RHM15-4 es la siguiente (SEQ ID NO: 9):
1 maadgylpdwlednlsegirewwdlkpgap kpkanqqrqd ngrglvlpgy rylgpfngld 61 kgepvnaadaaalehdraydqqlqagdnpy lrynhadaef qerlqedtsf ggnlgravfq 121 akkrvleplglvespvrtapgkkrpvepsp qrspdsstgi gkrgqqpakk rlnfgqtgds 181 esvpdpqpigeppaapsgvgpntmaaggga pmadnnegad gvgsssgnwh cdstwlgdrv 241 ittstrtwalptynnhlyrqisngtsggst ndntyfgyst pwgyfdfnrf hchfsprdwq 301 rlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtqne gtrtiannlt stiqvftdse yqlpyvlgsa 361 hqgclppfpadvfmipqygyltlnngsqav grssfycley fpsqmlrtgn nfefsynfed 421 vpfhssyahsqsldrlmnplidqylyylsr tqstggtagt qqllfsqagp nnmsaqaknw 481 lpgpcyrqqrvsttlsqnnnsnfawtgatk yhlngrdslv npgvamathr ddeerffpss 541 gvlmfgkqgagrdnvdyssvmltseeeirt tnpvateqyg vvadnlqqqn aapivgavns 601 qgalpgmvwqnrdvylqgpiwakiphtdgn fhpsplmggf glkhpppqil ikntpvpadp 661 pttfnqarlasfitqystgqvsveiewelq kenskrwnpe iqytsnyyks tnvdfavnte 721 gtyseprpigtryltrnl
La secuencia de ácido nucleico de la cápside VP1 variante RHM15-4 es la siguiente (SEQ ID NO: 15):
1 atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 61 gagtggtgggacctgaaacctggagccccgaaacccaaag ccaaccagca aaggcaggac 121 aacggccggggtctggtgcttcctggctacaggtacctcg gacccttcaa cggactcgac 181 aagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcg agcacgacag ggcctacgac 241 cagcagctccaagcgggtgacaatccgtacctgcggtata atcacgccga cgccgagttt 301 caggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacc tcgggcgcgc agtcttccag 361 gccaaaaagcgggttctcgaacctctgggcctggttgaat cgccggttag gacggctcct 421 ggaaagaagagaccggtagagccatcaccccagcgctctc cagactcctc tacgggcatc 481 ggcaagagaggccagcagcccgcaaaaaagagactcaatt ttgggcagac tggcgactca 541 gagtcagtccccgaccctcaaccaatcggagaaccaccag cagccccctc tggtgtggga 601 cctaatacaatggctgcaggcggtggcgctccaatggcag acaataacga aggcgccgac 661 ggagtgggtagttcctcaggaaattggcattgcgattcca catggctggg cgacagagtc 721 atcaccaccagcacccgcacctgggccctgcccacctaca acaaccacct ctacaggcaa 781 atctccaacgggacctcgggaggaagcaccaacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 841 ccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccact tttcaccacg tgactggcag 901 cgactcatcaacaacaactggggattccggcccaagaggc tcaacttcaa gctcttcaac 961 atccaagtcaaggaggtcacgcagaatgaaggcaccagga ccatcgccaa taaccttacc 1021 agcacgattcaggtctttacggactcggaataccagctcc cgtacgtgct cggctcggcg 1081 caccagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtcttca tgattcctca gtacgggtac 1141 ctgactctgaacaatggcagtcaggctgtgggccggtcgt ccttctactg cctggagtac 1201 tttccttctcaaatgctgagaacgggcaacaactttgaat tcagctacaa cttcgaggac 1261 gtgcccttccacagcagctacgcgcacagccagagcctgg accggctgat gaaccctctc 1321 atcgaccagtacttgtactacctgtcccggactcaaagca cgggcggtac tgcaggaact 1381 cagcagttgctattttctcaggccgggcctaacaacatgt cggctcaggc caagaactgg 1441 ctacccggtccctgctaccggcagcaacgcgtctccacga cactgtcgca gaacaacaac 1501 agcaactttgcctggacgggtgccaccaagtatcatctga atggcagaga ctctctggtg 1561 aatcctggcgttgccatggctacccacagggacgacgaag agcgattttt tccatccagc 1621 ggagtcttaatgtttgggaaacagggagctggaagagaca acgtggacta tagcagcgtg 1681 atgctaaccagcgaggaagaaataaggaccaccaacccag tggccacaga acagtacggc 1741 gtggtggccgataacctgcaacagcaaaacgccgctccta ttgtaggggc cgtcaatagt 1801 caaggagccttacctggcatggtgtggcagaaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc 1861 tgggccaagattcctcatacggacggcaactttcatccct cgccgctgat gggaggcttt 1921 ggactgaagcatccgcctcctcagatcctgattaaaaaca cacctgttcc cgcggatcct 1981 ccgaccaccttcaatcaggccaggctggcttctttcatea cgcagtacag taccggccag 2041 gtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggagaaca gcaaacgctg gaacccagag 2101 attcagtacacttccaactactacaaatctacaaatgtgg actttgctgt caatactgag 2161 ggtacttattccgagcctcgccccattggcacccgttacc tcacccgtaa tctgtaa
La secuencia de aminoácidos de la cápside VP1 variante RHM15-6 es la siguiente (SEQ ID NO: 10):
1 maadgylpdwlednlsegirewwdlkpgapkpkanqqrqdngrglvlpgy r ylgpfngld 61 kgepvnaadaaalehdraydqqlqagdnpylrynhadaefqerlqedtsf ggnlgravfq 121 akkrvleplglvespvrtapgkkrpvepspqrspds stgigkkgqqpakk rlnfgqtgds 181 esvpdpqpigeppaapsgvgpntmaagggapmadnnegadgvgsssgnwh cdstwlgdrv 241 ittstrtwalptynnhlyrqisngtsggstndntyfgystpwgyfdfnrf hchf sprdwq 301 rlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtqnegtrtiannltstiqvftdse yqlpyvlgsa 361 hqgclppfpadvfmipqygyltlnngsqavgrssfyeleyfpsqmlrtgn nfef synfed 421 vpfhssyahsqsldrlmnplidqylyylsrtqstggtagtqqllfsqagp nnmsaqaknw 481 lpgpcyrqqrvsttlsqnnnsnfawtgatkyhlngrdslvnpgvamathr ddeerffpss 541 gvlmf grqgagrdnvdys svmlt seee irttnpvateqygvvadnlqqqn aapivgavns 601 qgalpgmvwqnrdvylqgpiwakiphtdgnfhpsplmggfglkhpppqil ikntpvpadp 661 pttfnqarlasfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqytsnyyks tnvdfavnte 721 gtyseprpigtryltrnl
La secuencia de ácido nucleico de la cápside VP1 variante RHM15-6 es la siguiente (SEQ ID NO: 16):
1 atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 61 gagtggtgggacctgaaacctggagccccgaaacccaaag ccaaccagca aaggcaggac 121 aacggccggggtctggtgcttcctggctacaggtacctcg gacccttcaa cggactcgac 181 aagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcg agcacgacag ggcctacgac 241 cagcagctccaagcgggtgacaatccgtacctgcggtata atcacgccga cgccgagttt 301 caggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacc tcgggcgcgc agtcttccag 361 gccaaaaagcgggttctcgaacctctgggcctggttgaat cgccggttag gacggctcct 421 ggaaagaagagaccggtagagccatcaccccagcgctctc cagactcctc tacgggcatc 481 ggcaagaaaggccagcagcccgcaaaaaagagactcaatt ttgggcagac tggcgactca 541 gagtcagtccccgaccctcaaccaatcggagaaccaccag cagccccctc tggtgtggga 601 cctaatacaatggctgcaggcggtggcgctccaatggcag acaataacga aggcgccgac 661 ggagtgggtagttcctcaggaaattggcattgcgattcca catggctggg cgacagagtc 721 atcaccaccagcacccgcacctgggccctgcccacctaca acaaccacct ctacaggcaa 781 atctccaacgggacctcgggaggaagcaccaacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 841 ccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccact tttcaccacg tgactggcag 901 cgactcatcaacaacaactggggattccggcccaagaggc tcaacttcaa gctcttcaac 961 atccaagtcaaggaggtcacgcagaatgaaggcaccagga ccatcgccaa taaccttacc 1021 agcacgattcaggtctttacggactcggaataccagctcc cgtacgtgct cggctcggcg 1081 caccagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtcttca tgattcctca gtacgggtac 1141 ctgactctgaacaatggcagtcaggctgtgggccggtcgt ccttctactg cctggagtac 1201 tttccttctcaaatgctgagaacgggcaacaactttgaat tcagctacaa cttcgaggac 1261 gtgcccttccacagcagctacgcgcacagccagagcctgg accggctgat gaaccctctc 1321 atcgaccagtacttgtactacctgtcccggactcaaagca cgggcggtac tgcaggaact 1381 cagcagttgctattttctcaggccgggcctaacaacatgt cggctcaggc caagaactgg

Claims (27)

REIVINDICACIONES
1. Una partícula de AAV recombinante que comprende una secuencia de la cápside de AAV, en donde la partícula de a Av encapsida un genoma de vector que comprende una secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica la proteína del Factor IX, y en donde la secuencia de la cápside de AAV es al menos 99,5 % idéntica y tiene al menos una sustitución de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 195, 199, 201 o 202, de la secuencia de la cápside VP1 establecida como la SEQ ID NO:1.
2. La partícula de AAV recombinante de conformidad con la reivindicación 1, en donde la secuencia de la cápside de AAV tiene un aminoácido A, V, P o N en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 195, 199, 201 o 202 de la secuencia de la cápside VP1 establecida como la SEQ ID NO:1.
3. La partícula de AAV recombinante de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuencia de la cápside de AAV (i) tiene uno cualquiera, (ii) tiene dos cualesquiera, (iii) tiene tres cualesquiera, o (iv) tiene todos de los siguientes: un residuo A en la posición de aminoácido 195;
un residuo V en las posiciones de aminoácido 199, un residuo P en la posición de aminoácido 201, o un residuo N en la posición de aminoácido 202 de la secuencia de la cápside VP1 establecida como la SEQ ID NO: 1.
4. La partícula de AAV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia de la cápside de AAV comprende una secuencia de la cápside VP1 establecida como la SEQ ID NO:5.
5. La partícula de AAV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el genoma del vector comprende además un elemento de control de la expresión que confiere la transcripción de dicha secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica la proteína del Factor IX, dicho elemento de control de la expresión comprende preferiblemente un elemento de control constitutivo o regulable, y con mayor preferencia comprende un elemento de control de la expresión o promotor específico de tejido.
6. La partícula de AAV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde una o más secuencias de repetición terminal invertida (ITR) flanquean el extremo 5' o 3' de la secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica la proteína del Factor IX.
7. La partícula de AAV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la secuencia de la cápside de AAV establecida como la SEQ ID NO: 1 tiene 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos.
8. Una partícula de AAV recombinante que comprende una cápside de AAV que encapsida un genoma del vector que comprende una secuencia polinucleotídica heteróloga, en donde la cápside de a Av comprende una proteína VP1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, en donde la secuencia polinucleotídica heteróloga codifica una proteína del Factor IX humana, y en donde el genoma del vector comprende además un promotor o potenciador específicos del hígado, unido de forma operable a dicha secuencia polinucleotídica heteróloga, y repeticiones terminales invertidas de AAV que flanquean los extremos 5' y 3' de la secuencia polinucleotídica heteróloga.
9. Una partícula de AAV recombinante que comprende una cápside de AAV que encapsida un genoma del vector que comprende una secuencia polinucleotídica heteróloga, en donde la cápside de a Av comprende una proteína VP1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, en donde la secuencia polinucleotídica heteróloga codifica una proteína del Factor IX humana, y en donde el genoma del vector comprende además un promotor o potenciador específico del hígado unido de forma operable a dicha secuencia polinucleotídica heteróloga, y una repetición terminal invertida de AAV que flanquea los extremos 5' o 3' de la secuencia polinucleotídica heteróloga.
10. La partícula de AAV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la secuencia polinucleotídica heteróloga comprende además un relleno o secuencia polinucleotídica de relleno.
11. La partícula de AAV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde las secuencias de repetición terminal invertida de AAV son de AAV2.
12. La partícula de AAV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha secuencia polinucleotídica está flanqueada por regiones no traducidas en 5' y 3'.
13. La partícula de AAV recombinante de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12, en donde la secuencia polinucleotídica heteróloga comprende además una secuencia de poli A.
14. La partícula de AAV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la secuencia polinucleotídica heteróloga comprende además al menos una porción de un intrón.
15. La partícula de AAV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la secuencia polinucleotídica heteróloga comprende además al menos una porción del intrón I del gen del Factor IX humano.
16. La partícula de AAV recombinante de conformidad con la reivindicación 15, en donde dicha porción del intrón I del gen del Factor IX humano tiene una longitud de nucleótidos de 0,1 kb a 1,7 kb.
17. La partícula de AAV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde dicho potenciador y promotor específico del hígado es un potenciador y promotor de ApoE-hAAT.
18. La partícula de AAV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde la proteína del Factor IX es una variante humana con ganancia de función más activa que el Factor IX humano de tipo natural.
19. Una composición farmacéutica que comprende la partícula de AAV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
20. Un método para producir la partícula de AAV recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende cultivar una célula auxiliar que comprende un plásmido recombinante que comprende el genoma de dichas partículas de AAV recombinante.
21. La partícula de AAV recombinante o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para usar en el tratamiento de un mamífero deficiente en la expresión o función de la proteína del Factor IX mediante la expresión de dicha proteína del Factor IX en el mamífero.
22. La partícula de AAV recombinante o composición farmacéutica para usar de conformidad con la reivindicación 21, en donde la cantidad de partícula de AAV recombinante administrada es suficiente para proporcionar un efecto terapéutico a dicho mamífero.
23. La partícula de AAV recombinante o composición farmacéutica para usar de conformidad con las reivindicaciones 21 o 22, en donde el mamífero es un ser humano, y el efecto terapéutico trata la hemofilia B.
24. La partícula de AAV recombinante o composición farmacéutica para usar de conformidad con la reivindicación 22 o 23, en donde el efecto terapéutico cambia un fenotipo de enfermedad de Hemofilia B severa a un fenotipo de enfermedad de Hemofilia B moderada o leve.
25. La partícula de AAV recombinante o composición farmacéutica para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en donde dicha partícula de AAV recombinante se debe administrar a una dosis de al menos 1X1010 genomas del vector (vg) por kilogramo (vg/kg) del peso de el mamífero, o entre aproximadamente 1X1010 a 1X1011 vg/kg del peso del mamífero, o entre aproximadamente 1X1011 a 1X1012 vg/kg del peso del mamífero, o entre aproximadamente 1X1012 a 1X1013 vg/kg del peso del mamífero.
26. La partícula de AAV recombinante o composición farmacéutica para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en donde dicha partícula de AAV recombinante se debe administrar por vía parenteral, intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, por intubación, por catéter o por vía intracavitaria.
27. La partícula de AAV recombinante o composición farmacéutica para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, que comprende además el uso de una cápside vacía de AAV.
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