KR102200642B1 - 유전자 치료를 위한 변형된 프리드라이히 운동실조증 유전자 및 벡터 - Google Patents

유전자 치료를 위한 변형된 프리드라이히 운동실조증 유전자 및 벡터 Download PDF

Info

Publication number
KR102200642B1
KR102200642B1 KR1020187015819A KR20187015819A KR102200642B1 KR 102200642 B1 KR102200642 B1 KR 102200642B1 KR 1020187015819 A KR1020187015819 A KR 1020187015819A KR 20187015819 A KR20187015819 A KR 20187015819A KR 102200642 B1 KR102200642 B1 KR 102200642B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
seq
sequence
fxn
vector
Prior art date
Application number
KR1020187015819A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180077275A (ko
Inventor
리차드 제이 새멀스키
Original Assignee
뱀부 테라퓨틱스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 뱀부 테라퓨틱스 인코포레이티드 filed Critical 뱀부 테라퓨틱스 인코포레이티드
Publication of KR20180077275A publication Critical patent/KR20180077275A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102200642B1 publication Critical patent/KR102200642B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Abstract

본 발명은 프리드라이히 운동실조증의 치료에 사용될 수 있는 암호화된 단백질 프라탁신(FXN)의 증가된 발현을 제공하는 변형된 FXN 유전자에 관한 것이다.

Description

유전자 치료를 위한 변형된 프리드라이히 운동실조증 유전자 및 벡터
본 발명은 변형된 프라탁신(frataxin: FXN) 유전자, 상기 변형된 FXN 유전자를 포함하는 벡터, 비-돌연변이(야생형) 미토콘드리아 단백질 프라탁신의 증가된 발현 수준을 제공함으로써 심근증 및/또는 그와 연관된 신경퇴행성 질환을 포함한 프리드라이히 운동실조증(Friedreich ataxia, FRDA)의 치료에 있어서, 상기 변형된 FXN 유전자 및 그를 함유하는 벡터를 사용하는 방법에 관한 것이다.
프리드라이히 운동실조증은 미토콘드리아 단백질 프라탁신을 암호화하는 FXN 유전자의 발현 감소 및/또는 상기 유전자에서의 돌연변이와 연관된다. FRDA는 상염색체 열성 질환이다. 즉, 개체들은 양쪽 부모로부터 결함있는 유전자를 물려받은 경우에만 상기 질환을 나타낸다. FRDA는 프라탁신의 mRNA 및 단백질 수준의 감소를 야기하는 FXN 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 결함있는 프라탁신 발현은 산화환원 불균형 및 ATP 결핍을 포함한 중요한 대사 변화들을 야기한다.
FRDA는 아동 및 청소년에서 발생하고 진행성 장애 및 조기 사망으로 이끄는 신경퇴행성 질환이다. 신경학적 징후는 감각 뉴런의 변성과 연관되며, 말초 신경 및 척수를 통한 감각 정보의 흐름이 심각하게 영향받는다. 또한 소뇌 및 척수로부터의 근육-조절 신호에도 어느 정도의 손상이 있다. 이러한 문제들은 FRDA를 특징짓는 균형, 조정력 및 근육 강도의 점진적인 소실을 초래한다. 또한, 환자들은 종종 조기 사망의 원인이 되기 쉬운 비후성 심근증을 나타낸다. 심장 비대, 불규칙한 심장박동 및 심장병의 다른 증상들이 분명하게 나타난다.
프라탁신 단백질은 산소를 이용하여 에너지를 생성하는데 필수적인 미토콘드리아 내부의 철 수준을 조절하는 것으로 생각된다. 프라탁신은 철의 저장소로서 작용하여 미토콘드리아에서 효소의 합성에 필요한 경우에만 철을 방출하는 것으로 보인다. 그러므로, 프라탁신의 결핍은 상기 효소들의 결핍을 야기하고, 또한 미토콘드리아 기능을 감소시켜, 프리드라이히 운동실조증이 신경계 및 심장의 세포들에 영향을 미치는 원인을 다분히 설명해준다.
지금까지, FRDA의 부정적 효과를 중단시키거나 지연시키기 위한 치료법은 존재하지 않았다. 임상적으로 사용되고 있거나 평가중에 있는 현재의 치료적 접근방법은 증상을 완화시키고 삶의 질을 최대화시키는 것을 지향한다. 물리 치료 및 언어 치료가 움직임을 개선하기 위해 사용되어 왔다. 또한, 몇몇 약제들이 심장 질환을 치료하기 위해 사용되어 왔다. 따라서, FRDA와 연관된 증상들을 치료하기 위한 새로운 치료적 접근방법이 중요하게 필요하다.
본원에서는 프라탁신(FXN)을 암호화하는 변형된 핵산, 및 상기 변형된 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 변형된 핵산 또는 핵산을 포함하는 벡터를 그를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 FXN의 감소된 수준에 의해 매개된 질환을 치료하는 방법이 개시되고 예시된다.
당해 분야에 숙련된 자라면 단지 통상적인 실험을 이용하여, 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 많은 등가물들을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 상기 등가물은 하기의 실시양태들(E)에 포함되는 것이다.
E1. GC 뉴클레오티드의 함량을 변화시키고/시키거나 감소된 수의 CpG 다이뉴클레오티드를 갖도록 변형된, 인간 대상에서 FRDA를 치료하기 위한 변형된 FXN 유전자.
E2. CpG의 감소된 수가 CpG 모티프의 메틸화로 인한 유전자 발현의 침묵을 억제하기에 충분한 양인, 실시양태 1의 변형된 FXN 유전자.
E3. GC 뉴클레오티드의 함량이 야생형 유전자에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70%보다 큰, 실시양태 1의 변형된 FXN 유전자.
E4. >0.75, >0.80, >0.85, >0.90 또는 >0.95인 코돈 적응 지수를 갖는, 실시양태 3의 변형된 FXN 유전자.
E5. 서열번호 3 내지 9 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는, 실시양태 3의 변형된 FXN 유전자.
E6. GC 뉴클레오티드의 함량이 야생형 유전자에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70% 미만인, 실시양태 1의 변형된 FXN 유전자.
E7. 바이러스 벡터 또는 플라스미드에 포함된, 실시양태 1의 변형된 FXN 유전자.
E8. 바이러스 벡터가 자가-상보적 AAV 서열인, 실시양태 7의 변형된 FXN 유전자.
E9. 바이러스 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV9.45, AAV Hu.26, AAV2i8, AAV2G9, rhAAV10, rhAAV74, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N, AAV-LK03, 및 그의 조합 및 변이체들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시양태 8의 변형된 FXN 유전자.
E10. 바이러스 벡터가 원형(ancestral) AAV 벡터인, 실시양태 8의 변형된 FXN 유전자.
E11. 바이러스 벡터가 AAV2, AAV3B, AAV6 또는 AAV8로부터의 AAV 주쇄들의 조합을 포함하고 AAV9로부터의 갈락토스(Gal) 결합 풋프린트를 추가로 포함하는 키메라 AAV인, 실시양태 8의 변형된 FXN 유전자.
E12. 프라탁신 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 기능성 단편을 갖는, 실시양태 1의 변형된 FXN 유전자.
E13. GC 뉴클레오티드의 함량을 증가 또는 감소시키고/시키거나 CpG 다이뉴클레오티드의 수를 감소시키도록 변형된 변형 FXN 유전자 치료 효과량을 대상에게 투여함을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상에서 프라탁신 결핍과 연관된 질환을 치료하는 방법.
E14. 변형된 FXN 유전자가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 프라탁신 단백질을 암호화하는, 실시양태 13의 방법.
E15. 변형된 FXN 유전자가 표적 세포에서 발현되고, 상기 표적 세포가 심장 또는 뉴런 세포인, 실시양태 13의 방법.
E16. 변형된 FXN 유전자가 바이러스 또는 비-바이러스 벡터에서 표적 세포로 전달되는, 실시양태 13의 방법.
E17. 벡터가 전신 주입에 의해 또는 직접적인 심장 또는 두개내 주입에 의해 전달되는, 실시양태 16의 방법.
E18. GC 뉴클레오티드의 함량을 증가 또는 감소시키고/시키거나 CpG 다이뉴클레오티드의 양을 감소시키도록 변형된 변형 FXN 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 1개 이상 제공하고; 변형된 FXN 유전자가 대상의 심장 및/또는 뉴런 조직에서 치료 효과량의 프라탁신을 생성하는 수준으로 발현되게 하는 조건하에서 상기 재조합 바이러스 벡터를 대상에게 투여함을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상에서 프리드라이히 운동실조증(FRDA)을 치료하는 방법.
E19. 재조합 바이러스 벡터가 대상의 뉴런 또는 심장 근육 세포에 투여되는, 실시양태 18의 방법.
E20. GC 뉴클레오티드의 함량을 증가 또는 감소시키고/시키거나 CpG 다이뉴클레오티드의 수를 감소시키도록 변형된, 프라탁신 펩티드 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 변형된 FXN 유전자로 형질감염된 숙주 세포.
E21. 숙주 세포를 프라탁신 펩티드 또는 그의 기능성 단편을 암호화하는 변형된 FXN 유전자로 형질감염시키고; 프라탁신 펩티드의 발현에 충분한 생물학적 조건하에서 숙주 세포를 유지시키는 것을 포함하는, 프라탁신 펩티드 또는 그의 단편을 제조하는 방법.
E22. 변형된 FXN 유전자가 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 야생형 프라탁신의 핵산 서열에 비해 증가된 수준의 GC 뉴클레오티드 및/또는 감소된 수준의 CpG 다이뉴클레오티드를 갖는, 실시양태 21의 방법.
E23. 증가 또는 감소된 함량의 GC 뉴클레오티드 및/또는 감소된 수의 CpG 다이뉴클레오티드를 갖는 변형된 FXN 유전자, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
E24. 표적 세포에서 발현되는 FXN 유전자를 암호화하는 변형된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 치료를 필요로 하는 대상에게 전달함으로써 대상에서 FRDA를 치료하는 것을 포함하는, FRDA를 치료하는 방법. 상기 표적 세포는 바람직하게는 심장 또는 뉴런 세포이고, 벡터는 바람직하게는 직접적인 심장 또는 두개내 주입을 통해 표적 세포에 전달된다.
E25. 변형된 핵산이, 야생형과 여전히 동일한 발현 수준을 가지면서 야생형 유전자보다 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 더 낮은, 야생형 유전자에 비해 감소된 GC 함량을 갖는, 실시양태 1의 변형된 핵산.
E26. 감소된 수준의 CpG 다이뉴클레오티드를 갖는, FXN을 암호화하는 변형된 핵산.
E27. 치료를 필요로 하는 인간 대상에서 FRDA를 치료하기 위한, FXN을 암호화하는 변형된 핵산("변형된 FXN 유전자"로도 지칭됨)으로서, 이때 상기 변형된 FXN 유전자가, 서열번호 2로 나타낸 FXN을 암호화하는 야생형 핵산 서열에 비해 GC 함량을 증가시키고 특정 시스(cis) 모티프를 감소시키도록 변형된, FXN을 암호화하는 변형된 핵산.
E28. 서열번호 2로 나타낸 FXN을 암호화하는 야생형 핵산 서열에 존재하는 CpG 다이뉴클레오티드의 수에 비해 CpG 모티프의 메틸화로 인한 유전자 발현의 침묵을 억제하는 양으로 감소된 수의 CpG 다이뉴클레오티드를 갖는 변형된 FXN 유전자.
E29. 실시양태 1 내지 12, 23 및 25 내지 28 중 어느 하나의 변형된 FXN 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 1개 이상 제공하고, 변형된 FXN 유전자가 대상의 심장 및/또는 뉴런 조직에서 치료 효과량의 프라탁신을 생성하는 수준으로 발현되게 하는 조건하에서 상기 재조합 바이러스 벡터를 대상에게 투여함을 포함하는, 대상에서 FRDA를 치료하는 방법.
E30. 단백질 프라탁신을 암호화하는 변형된 FXN 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터 치료 효과량을 대상에게 투여함을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상의 뉴런 및 심장 근육 세포에서 프리드라이히 운동실조증의 영향을 감소시키거나 프리드라이히 운동실조증을 치료하는 방법.
E31. 서열번호 3 내지 9의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 투여에 기반하는 유전자 치료를 포함하는, 그를 필요로 하는 대상에서 프리드라이히 운동실조증을 치료하는 방법.
E32. 변형된 FXN 유전자 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 포함하는 조성물로서, 이때 상기 AAV 벡터가 단일 가닥 AAV 벡터 게놈, 이중-가닥 AAV 벡터 게놈 또는 자가-상보적(sc) AAV 벡터 게놈을 포함하는 조성물.
E33. 변형된 FXN 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
E34. AAV가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rhAAV10, rhAAV74, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV Hu.26, AAV1.1(서열번호 15), AAV2.5(서열번호 13), AAV6.1(서열번호 17), AAV6.3.1(서열번호 18), AAV9.45, AAV2i8(서열번호 29), AAV2G9, AAV2-TT(서열번호 31), AAV2-TT-S312N(서열번호 33), AAV3B-S312N 및 AAV-LK03으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈청형의 캡시드를 포함하는, 실시양태 33의 벡터.
E35. 아미노산 잔기 265가 결실된 AAV1.1 캡시드(서열번호 15), 아미노산 잔기 265가 결실된 AAV 6.1 캡시드(서열번호 17), 아미노산 잔기 265가 결실되고 아미노산 잔기 531이 Lys로부터 Glu로 변화된 AAV 6.3.1 캡시드(서열번호 18)를 추가로 포함하는, 실시양태 34의 벡터. 야생형 AAV 1 캡시드의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14에 나타나 있고, 야생형 AAV 6 캡시드의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 16에 나타나 있다.
E36. AAV9로부터의 갈락토스(Gal) 결합 풋프린트와 함께, AAV2, AAV3, AAV6, AAV8로부터의 AAV 주쇄들의 조합을 포함하는 캡시드를 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 12, 23, 및 25 내지 28 중 어느 하나의 변형된 FXN 유전자를 포함하는 키메라 AAV 바이러스 벡터. 특히 AAV9로부터의 갈락토스(Gal) 결합 풋프린트는 형질도입 효율을 개선하기 위해 헤파린 설페이트-결합 AAV 혈청형 2 상에 그라프트된다.
E37. AAV1 및/또는 AAV6의 265 결실 돌연변이뿐 아니라 캡시드 단백질에 갈락토스 결합 풋프린트의 부가와 함께 티로신 돌연변이체를 포함하는 벡터 캡시드를 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 12, 23 및 25 내지 28 중 어느 하나의 변형된 FXN 유전자를 포함하는 키메라 AAV 바이러스 벡터.
E38. AAV의 HI 구조 루프에 또는 AAV2 주쇄중 585 아미노산의 위치에 삽입된 표적화 펩티드를 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 12, 23, 및 25 내지 28 중 어느 하나의 변형된 FXN 유전자를 포함하는 키메라 AAV 바이러스 벡터. 또한, 원형 AAV 벡터는 생체내 치료적 유전자 치료에 사용될 수 있다. 특히, 원형 바이러스 서열로부터 구성된 바이러스 입자들의 사용은 그 당시 바이러스 또는 그의 일부분보다 오늘날 인구에서 기존 면역에 대한 감소된 민감성을 나타낸다.
E39. 실시양태 1 내지 12, 23, 및 25 내지 28 중 어느 하나의 변형된 FXN 유전자를 포함하는 숙주 세포.
E40. 실시양태 1 내지 12, 23, 및 25 내지 28 중 어느 하나의 변형된 FXN 유전자로 숙주 세포를 형질감염시키고, 상기 숙주 세포를 프라탁신 단백질의 발현에 충분한 생물학적 조건하에서 유지시키는 것을 포함하는, 프라탁신 펩티드 또는 그의 단편을 제조하는 방법.
E41. 프리드라이히 운동실조증의 치료에 있어서, 실시양태 1 내지 12, 23, 및 25 내지 28 중 어느 하나의 변형된 FXN 유전자의 용도.
E42. 인간 대상의 심장 조직에서 뉴런 및 세포의 변성을 야기하는 프리드라이히 운동실조증을 치료하기 위한 변형된 FXN 유전자(상기 변형된 FXN 유전자는 증가된 양의 GC 뉴클레오티드, 감소된 양의 GC 뉴클레오티드를 가지고/가지거나 감소된 수의 CpG 다이뉴클레오티드를 갖는다); 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
E43. 서열번호 3 내지 9 중 어느 하나로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 프라탁신을 암호화하는 발현 최적화된 핵산.
E44. 서열번호 1에 나타낸 아미노산을 포함하는, 프라탁신을 암호화하는 변형된 핵산으로서, 55% 이상의 GC 함량, 서열번호 2의 핵산 서열에 비해 감소된 수의 CpG 다이뉴클레오티드, 0.8 이상의 코돈 적응 지수(CAI)를 가지고, 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 야생형 프라탁신의 발현 수준에 비해 더 큰 수준으로 발현되는 변형된 핵산.
E45. CAI가 0.86 이상인, 실시양태 44의 변형된 핵산.
E46. CAI가 0.95 이상인, 실시양태 44의 변형된 핵산.
E47. CAI가 0.98 이상인, 실시양태 44의 변형된 핵산.
E48. GC 함량이 61% 이상인, 실시양태 44 내지 47 중 어느 하나의 변형된 핵산.
E49. GC 함량이 69% 이상인, 실시양태 44 내지 47 중 어느 하나의 변형된 핵산.
E50. CpG 다이뉴클레오티드의 수가 약 114 내지 124인, 실시양태 44 내지 49 중 어느 하나의 변형된 핵산.
E51. 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 프라탁신(FXN)을 암호화하는 변형된 핵산으로서, 서열번호 2의 야생형 FXN 핵산 서열의 발현 수준에 비해 더 큰 수준으로 발현되고, 55% 이상의 GC 함량, 124 이하의 CpG 다이뉴클레오티드의 수 및 0.76 이상의 코돈 적응 지수(CAI)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 포함하는 변형된 핵산.
E52. 0.86 이상, 0.95 이상 또는 0.98 이상의 CAI; 57% 이상, 61% 이상 또는 69% 이상의 GC 함량; 124 미만의 CpG 다이뉴클레오티드의 수; 및 서열번호 3 내지 9에 나타낸 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 포함하는, 실시양태 51의 변형된 핵산.
E53. 서열번호 2의 야생형 FXN 핵산 서열의 발현 수준에 비해 더 큰 수준으로 발현되고, 서열번호 3 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열; 55% 이상의 GC 함량; 117 이하의 CpG 다이뉴클레오티드의 수; 및 0.86 이상의 CAI 중 하나 이상을 포함하는, FXN을 암호화하는 변형된 핵산.
E54. 핵산 서열이 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시양태 53의 변형된 핵산.
E55. 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는, 실시양태 43 내지 54 중 어느 하나의 변형된 핵산.
E56. 1개 이상의 AAV 말단 반복 서열(TR)을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 12, 23, 25 내지 28 및 43 내지 55 중 어느 하나의 변형된 핵산.
E57. 단일 가닥, 이중 가닥 및/또는 자가 상보적인, 실시양태 55의 변형된 핵산.
E58. 자가 상보적인, 실시양태 57의 변형된 핵산.
E59. 인핸서를 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 12, 23, 25 내지 28 및 43 내지 58 중 어느 하나의 변형된 핵산.
E60. 인핸서가 사이토메갈로바이러스(CMV) 급속-초기발현 인핸서인, 실시양태 59의 변형된 핵산.
E61. 프로모터를 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 12, 23, 25 내지 28 및 43 내지 60 중 어느 하나의 변형된 핵산.
E62. 프로모터가 구성 또는 조절 프로모터인, 실시양태 1 내지 12, 23, 25 내지 28 및 43 내지 61 중 어느 하나의 변형된 핵산.
E63. 프로모터가 조절 프로모터인, 실시양태 62의 변형된 핵산.
E64. 프로모터가 유도성 또는 억제성 프로모터인, 실시양태 63의 변형된 핵산.
E65. 콜라겐 안정화 서열(CSS)을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 12, 23, 25 내지 28 및 43 내지 64 중 어느 하나의 변형된 핵산.
E66. 정지 코돈을 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 12, 23, 25 내지 28 및 43 내지 65 중 어느 하나의 변형된 핵산.
E67. 풀리-아데닐화(폴리A) 신호 서열을 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 12, 23, 25 내지 28 및 43 내지 66 중 어느 하나의 변형된 핵산.
E68. 프로모터가 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, CMV 인핸서/CBA 프로모터(CBh), 및 합성 CAG 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시양태 67의 변형된 핵산.
E69. 프로모터가 CBh 프로모터인, 실시양태 68의 변형된 핵산.
E70. 콜라겐 안정화 서열(CSS)을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 6, 12, 25 내지 28 및 44 내지 69 중 어느 하나의 변형된 핵산.
E71. 실시양태 1 내지 12, 23, 25 내지 28 및 43 내지 70 중 어느 하나의 FXN을 암호화하는 변형된 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터(rAAV).
E72. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVrh74, AAV2.5(서열번호 13), AAV hu.26, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV2i8, AAV2G9, AAV9.45, AAV2i8G9, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N, 및 AAV-LK03으로부터의 캡시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 캡시드를 포함하는, 실시양태 71의 rAAV.
E73. 캡시드가 AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, 및 AAV2i8 캡시드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시양태 72의 rAAV.
E74. 변형된 핵산이 서열번호 7의 서열을 포함하고, 캡시드가 AAV2i8 캡시드 및 AAV2-TT-S312N 캡시드로부터 선택되는, 실시양태 73의 rAAV.
E75. 핵산이 FXN을 암호화하는 서열 측면에 위치한 2개의 AAV 말단 반복 서열을 포함하고 FXN을 암호화하는 서열의 상류에 CBh 프로모터를 추가로 포함하는, 실시양태 74의 rAAV.
E76. 상기 핵산이 FXN을 암호화하는 서열로부터 3'에 콜라겐 안정화 서열(CSS; 서열번호 25)을 추가로 포함하는, 실시양태 75의 rAAV.
E77. 핵산이 소 성장 호르몬 폴리A(bGHpolyA) 신호 서열을 포함하는, 실시양태 71 내지 76 중 어느 하나의 rAAV.
E78. VP1이 서열번호 29의 아미노산을 포함하는 AAV2i8 캡시드를 포함하고, 5'로부터 3'로 (a) AAV2 말단 반복 서열(TR); (b) 서열번호 26의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터; (c) 서열번호 3 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는, FXN을 암호화하는 변형된 핵산; (d) 서열번호 25의 서열을 갖는 CSS; (e) 서열번호 27의 서열을 갖는 bGHpolyA 신호 서열; 및 (f) AAV2 TR을 포함하는 핵산을 추가로 포함하는 rAAV 벡터.
E79. VP1이 서열번호 31의 아미노산을 포함하는 AAV2-TT 캡시드를 포함하고, 5'로부터 3'로 (a) AAV2 TR; (b) 서열번호 26의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터; (c) 서열번호 3 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는, FXN을 암호화하는 변형된 핵산; (d) 서열번호 25의 서열을 갖는 CSS; (e) 서열번호 27의 서열을 갖는 bGHpolyA 신호 서열; 및 (f) AAV2 TR을 포함하는 핵산을 추가로 포함하는 rAAV 벡터.
E80. VP1이 서열번호 33의 아미노산을 포함하는 AAV2-TT-S312N 캡시드를 포함하고, 5'로부터 3'로 (a) AAV2 TR; (b) 서열번호 26의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터; (c) 서열번호 3 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는, FXN을 암호화하는 변형된 핵산; (d) 서열번호 25의 서열을 갖는 CSS; (e) 서열번호 27의 서열을 갖는 bGHpolyA 신호 서열; 및 (f) AAV2 TR을 포함하는 핵산을 추가로 포함하는 rAAV 벡터.
E81. FXN을 암호화하는 변형된 핵산이 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는, 실시양태 71 내지 80 중 어느 하나의 rAAV 벡터.
E82. 실시양태 1 내지 6, 12, 25 내지 28 및 71 내지 81 중 어느 하나의 프라탁신을 암호화하는 변형된 핵산을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상에서 프리드라이히 운동실조증을 치료하기 위한 rAAV 벡터.
E83. 실시양태 7 내지 11, 33 내지 39 및 71 내지 82 중 어느 하나의 rAAV 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
E84. 실시양태 1 내지 12, 23, 25 내지 28 및 43 내지 70 중 어느 하나의 프라탁신을 암호화하는 변형된 핵산; 실시양태 7 내지 11, 33 내지 39 및 71 내지 82 중 어느 하나의 rAAV 벡터; 및 실시양태 83의 약학 조성물 중 적어도 하나를 투여함을 포함하는, 대상에서 FRDA를 치료하는 방법.
E85. 실시양태 7 내지 11, 33 내지 39 및 71 내지 82 중 어느 하나의 rAAV 벡터가 전신적으로, 또는 직접적인 심장 또는 두개내 투여에 의해 투여되는, 실시양태 84의 방법.
E86. 실시양태 71 내지 82 중 어느 하나의 rAAV 벡터가 두개내로 투여되는, 실시양태 85의 방법.
E87. 실시양태 71 내지 82 중 어느 하나의 rAAV 벡터가 심장내에 투여되는, 실시양태 85의 방법.
E88. FXN을 암호화하는 변형된 핵산이 서열번호 6의 핵산 서열을 포함하는, 실시양태 84의 방법.
E89. FXN을 암호화하는 변형된 핵산이 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는, 실시양태 84의 방법.
E90. 실시양태 1 내지 6, 12, 25 내지 28 및 43 내지 70 중 어느 하나의 프라탁신을 암호화하는 변형된 핵산; 실시양태 7 내지 11, 33 내지 39 및 71 내지 82 중 어느 하나의 rAAV 벡터; 및 실시양태 83의 약학 조성물 중 적어도 하나를 투여함을 포함하는, FTX의 감소된 수준에 의해 매개된 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
E91. 실시양태 1 내지 6, 12, 25 내지 28 및 43 내지 70 중 어느 하나의 FXN을 암호화하는 변형된 핵산을 포함하는 숙주 세포.
E92. VERO, WI38, MRC5, A549, HEK293 세포, B-50 또는 임의의 다른 HeLa 세포, HepG2, Saos-2, HuH7, 및 HT1080으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시양태 91의 숙주 세포.
E93. 현탁 배양에서의 성장에 적합한 HEK293인, 실시양태 92의 숙주 세포.
E94. ATCC 수탁번호 PTA 13274를 갖는 HEK293 세포인, 실시양태 91 내지 93 중 어느 하나의 숙주 세포.
E95. AAV Rep 단백질을 암호화하는 1개 이상의 핵산, AAV Cap 단백질을 암호화하는 1개 이상의 핵산, 및 헬퍼 기능을 암호화하는 1개 이상의 핵산을 추가로 포함하는, 실시양태 7 내지 11, 33 내지 39 및 70 내지 82 중 어느 하나의 rAAV 벡터를 포함하는 패키징 세포.
E96. rAAV가 생성되는 조건하에서 실시양태 91 내지 95 중 어느 하나의 세포를 배양하는 것을 포함하는, rAAV 벡터를 제조하는 방법.
E97. 생성된 rAAV를 단리하는 것을 추가로 포함하는, 실시양태 96의 방법.
E98. 세포에서 프라탁신의 수준을 증가시키기 위한, 실시양태 1 내지 6, 12, 25 내지 28 및 43 내지 70 중 어느 하나의 프라탁신을 암호화하는 변형된 핵산; 실시양태 7 내지 11, 33 내지 39 및 71 내지 82 중 어느 하나의 rAAV 벡터; 및 실시양태 83의 약학 조성물 중 적어도 하나의 용도.
E99. 대상에서 프라탁신의 수준을 증가시키는데 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 6, 12, 25 내지 28 및 43 내지 70 중 어느 하나의 프라탁신을 암호화하는 변형된 핵산; 실시양태 7 내지 11, 33 내지 39 및 71 내지 82 중 어느 하나의 rAAV 벡터; 및 실시양태 83의 약학 조성물.
E100. 대상에서 프리드라이히 운동실조증을 치료하는데 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 6, 12, 25 내지 28 및 43 내지 70 중 어느 하나의 프라탁신을 암호화하는 변형된 핵산; 실시양태 7 내지 11, 33 내지 39 및 71 내지 82 중 어느 하나의 rAAV 벡터; 및 실시양태 83의 약학 조성물.
본 발명의 다른 특징들 및 이점들은 하기의 상세한 설명, 도면, 예시적인 실시양태 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1a 및 1b. 도 1a 및 1b는 둘 다 야생형 핵산(1열)에 비해 FXN을 암호화하는 선택된 변형된 핵산들로부터 프라탁신의 HeLa 세포에서의 발현 결과를 나타낸다. 하기의 변형된 핵산들을 포함하는 HeLa 세포들로부터의 추출물을 세포에서 생성된 FXN을 검출하기 위해 검사하였다. 웨스턴 블롯(Western blot)을 감광성 필름에 노출시켜 화학발광 검출을 위한 HRP(양고추냉이 퍼옥시다제)와 접합된 2차 항체를 사용하여 검출된 항-프라탁신 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 프라탁신을 검출하였다. 열들은 프라탁신을 암호화하는 하기의 변형된 핵산들로 형질감염된 HeLa 세포들로부터의 추출물을 부하시켰다: 1열: 야생형 대조군 핵산; 2열: IDT2; 3열: IDT5; 4열: JCAT; 5열: GeneArt; 6열: Genscript(대조군); 및 7열: Genscript(저 CpG).
도 2a 내지 2f는, EGFP 마커 유전자가 야생형 FXN 유전자(서열번호 2) 또는 그의 변형된 버전(예를 들어, 서열번호 3 내지 9)으로 대체된 자가-상보적 rAAV 벡터 pTRs-KS-CBh-EGFP-bGHpolyA 내로의 클로닝을 위한 다양한 변형된 FXN 유전자 구조물들의 서열을 나타낸다. 각각의 도면은 WT FXN(도 2a) 또는 변형된 FXN 유전자(도 2b 내지 2f)를 나타낸다. 각각의 구조물은 (5'로부터 3'로) AgeI 절단 부위, FXN/변형된 FXN 유전자, AvrII 절단 부위, 콜라겐 안정성 서열(CSS), SpeI 절단 부위, bGHpolyA 신호 서열, 및 MluI 절단 부위를 포함한다. 도 2a는 pTRs-KS-CBh-WT FXN-bGHpolyA 구조물(서열번호 19)을 나타내고; 도 2b는 통합 DNA 기술(Integrated DNA Technologies) IDT 1(IDT1) 변형된 FXN 유전자 구조물 pTRs-KS-CBh-IDT1 FXN-bGHpolyA(서열번호 20)를 나타내고; 도 2c는 IDT3 변형된 FXN 유전자 구조물 pTRs-KS-CBh-IDT3 FXN-bGHpolyA(서열번호 21)를 나타내고; 도 2d는 IDT4 변형된 FXN pTRs-KS-CBh-IDT4 FXN-bGHpolyA(서열번호 22)를 나타내고; 도 2e는 GenScript 변형된 FXN 유전자 구조물 pTRs-KS-CBh-GenScript FXN-bGHpolyA(서열번호 23)를 나타내고; 도 2f는 GenScript(저 CpG) 변형된 FXN 유전자 구조물 pTRs-KS-CBh-Genscript(저 CpG) FXN-bGHpolyA(서열번호 24)를 나타내며, 각각의 서열은 도 2a 내지 2f에서 5'로부터 3'로 다음과 같이 나타낸 요소들(예를 들어, AgeI, AvrII, CSS, SpeI, bGHpolyA, 및 MluI)을 포함한다: 굵은 활자로 나타낸 AgeI 절단 부위(ACCGGT); 소문자로 나타낸 FXN 유전자, 밑줄로 나타낸 AvrII 절단 부위(CCTAGG); 이중 밑줄로 나타낸 콜라겐 안정화 서열(CSS)을 암호화하는 서열; 밑줄친 굵은 활자 로 나타낸 SpeI 절단 부위( ACTAGT ); 이탤릭체로 나타낸 소 성장 호르몬 폴리-아데닐화 신호 서열(bGHpolyA); 및 굵은 이탤릭체 로 나타낸 MluI 절단 부위( ACGCGT ). 구조물 중의 FXN 유전자는 AgeI 절단 부위로부터 상류의 CBh 프로모터의 조절하에 있다. CBh 프로모터의 서열은 도 2a 내지 2f에는 나타내지 않았지만, 서열번호 25에 나타나 있다.
도 3은 다양한 제한효소 (절단) 부위 및 AgeI 절단 부위로부터 상류의 CBh 프로모터를 포함하는 벡터의 요소들을 나타내고 있는 pTRs-KS-CBh-eGFP 클로닝 구조물에 대한 벡터 (플라스미드) 지도를 나타낸다.
도 4A 및 4B는 대조군, 처리된 돌연변이 및 미처리 돌연변이 수컷(도 4A) 및 암컷(도 4B) 마우스에서 기준선 심장 표현형을 보여주는 그래프들을 나타낸다. 도 4A는 왼쪽으로부터 오른쪽으로 각각의 분류군내에서 대조군 수컷, 처리된 돌연변이체 및 미처리 돌연변이체에 대한 심장 표현형을 나타내며, 이때 분류군들은 EF(박출분율), FS(구획단축률); LV Vol_d(확장기 좌심실 용량); 및 LV Vol_s(수축기 좌심실 용량)이다. 도 4B는 암컷 마우스 군: 대조군(원); 처리된 돌연변이체(사각형); 및 미처리 돌연변이체(삼각형)에 대한 기준선 심장 표현형을 나타낸다.
도 5A 및 5B는 5주령된 미처리 Mck 돌연변이 마우스에서의 심장 표현형과 비교한, 처리된 Mck 돌연변이 마우스에서(및 처리된 돌연변이체에서는 처리 14 일후에) FRDA 심장 표현형의 역전을 보여주는 그래프들을 나타낸다. 도 5A는 rAAV-FXN 주입 14 일후에 대조군(원), 처리된 돌연변이(사각형) 및 미처리 돌연변이(삼각형) 수컷 마우스의 심장 표현형을 나타낸다. 약자들은 다음과 같다: AoV SV(대동맥판막 박출량); AoV CO(대동맥판막 심박출량); FS(구획단축률); 및 LV Mass AW(좌심실 종괴 전벽). 도 5B는 rAAV-FXN 주입 14 일후에 대조군(원), 처리된 돌연변이(사각형) 및 미처리 돌연변이(삼각형) 암컷 마우스의 심장 표현형을 나타낸다. 약자들은 다음과 같다: EF(박출분율); FS(구획단축률); AoV SV(대동맥판막 박출량); AoV CO(대동맥판막 심박출량).
도 6A 내지 6C는 처리된 McK 돌연변이 군에서 rAAV-FXN 처리 28일 후 수컷 및 암컷 대조군 마우스(원), 처리된 돌연변이 수컷 및 암컷 마우스(사각형), 및 미처리 돌연변이 수컷 및 암컷 마우스(삼각형)에서의 심장 기능을 보여주는 그래프들을 나타낸다. 도 6A는 연속되는 수주에 걸쳐, 즉, 3주령(rAAV 투여시), 5주령(rAAV 투여 14일후) 및 7주령(rAAV 투여 28일후)에서 (이때 치료제는 5주령에 투여되었다) 3개 마우스 군들 모두에 대한 좌심실 종괴(LVM) 심장초음파 평가를 나타낸다. 도 6B는 연속되는 수주에 걸쳐 3개 마우스 군 모두에 대한 단축률 인자(SF) 심장초음파 평가를 나타낸다. 도 6C는 연속되는 수주에 걸쳐 3개 마우스 군 모두에 대한 심박출량 심장초음파 평가를 나타낸다. 데이터는 군 당 8마리 마우스들의 평균 ± S.E.M이다. Mck 돌연변이 마우스의 데이터는 다중 t-검정 비교(시닥-본페로니(Sidak-Bonferroni) 방법)를 이용하여 Mck 양성 대조군과 비교하였다. * p<0.05.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본원에서 사용된 전문용어는 특정 실시양태들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 설명 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형들은 문맥에서 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수형을 또한 포함하는 것이다. 하기의 용어들은 나타낸 의미들을 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "약"은, 생물 활성의 양, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 길이, G 및 C 뉴클레오티드의 함량, 코돈 적응 지수, CpG 다이뉴클레오티드의 수, 용량, 시간, 온도 등과 같은 측정가능한 값을 언급하는 경우, 명시된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 또는 심지어 0.1%의 변화를 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "및/또는"은 연관된 열거된 항목들 하나 이상의 모든 가능한 조합들뿐 아니라, 양자택일("또는")로 해석될 때 조합의 결여를 말하며 포함한다.
AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 아데노-연관 바이러스의 복제 및 캡시드화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열들을 말한다. AAV rep 및 cap는 본원에서 AAV "패키징 유전자"로 지칭된다.
본 개시내용은 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터를 제공한다. "AAV"는 아데노-연관 바이러스에 대한 약자이며, 바이러스 자체 또는 그의 유도체를 언급하기 위해 사용될 수 있다. 상기 용어는, 달리 요구되는 경우를 제외하고, 모든 아형들, 및 천연 및 재조합 형태 둘 다를 포함한다. 약자 "rAAV"는, 재조합 AAV 벡터(또는 "rAAV 벡터") 또는 간단히 "AAV 벡터"로도 지칭되는, 재조합 아데노-연관 바이러스를 말한다. 용어 "AAV"는, 예를 들어, 다양한 혈청형의 AAV, 예를 들어, 1형 AAV(AAV-1), 2형 AAV(AAV-2), 3형 AAV(AAV-3), 4형 AAV(AAV-4), 5형 AAV(AAV-5), 6형 AAV(AAV-6), 7형 AAV(AAV-7), 8형 AAV(AAV-8), 9형 AAV(AAV-9), 10형 AAV(AAV-10, AAVrh10 포함), AAVrh74, 12형 AAV(AAV-12), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV를 포함한다. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 말하고, "비-영장류 AAV"는 비-영장류 포유동물을 감염시키는 AAV를 말하고, "소 AAV"는 소 포유동물을 감염시키는 AAV를 말하는 등, 같은 식으로 반복된다.
AAV의 다양항 혈청형들은 여러 이유로, 가장 두드러지게는 AAV가 비-병원성인 것으로 생각되며 야생형 바이러스가 그 게놈을 인간 염색체 19 내에 부위-특이적으로 통합시킬 수 있다는 이유로 흥미를 끈다[Linden et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:11288-11294]. 인간 게놈내 AAV의 삽입 부위는 AAVS1로 불린다. 무작위 통합과 대조적으로, 부위-특이적 통합은 필시 예측가능한 장기 발현 프로필을 제공할 것으로 생각된다.
AAV의 다양한 혈청형들의 게놈 서열뿐 아니라, 천연 말단 반복 서열(TRs), Rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열들은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 서열들은 문헌에서 또는 진뱅크(GenBank)와 같은 공공 데이터베이스에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 진뱅크 등록 번호 NC-002077(AAV-1), AF063497(AAV-1), NC-001401(AAV-2), AF043303(AAV-2), NC-001729(AAV-3), NC-001829(AAV-4), U89790(AAV-4), NC-006152(AAV-5), AF513851(AAV-7), AF513852(AAV-8), 및 NC-006261(AAV-8)을 참조하며; 그 개시내용은 본원에 참고로 도입된다. 또한, 예를 들어, 문헌[Srivistava et al., 1983, J. Virology 45:555; Chiorini et al., 1998, J. Virology 71:6823; Chiorini et al., 1999, J. Virology 73: 1309; Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virology 73:939; Xiao et al., 1999, J. Virology 73:3994; Muramatsu et al., 1996, Virology 221:208; Shade et al., 1986, J. Virol. 58:921; Gao et al., 2002, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris et al., 2004, Virology 33:375-383]; 국제 특허 공개 WO 00/28061 호, WO 99/61601 호, WO 98/11244 호, WO 2013/063379 호, WO 2014/194132 호, WO 2015/121501 호, 및 미국 특허 제 6,156,303 호 및 제 7,906,111 호를 참조하시오.
본원에서 사용된 "rAAV 벡터"는, 전형적으로 세포의 유전자 형질전환에 중요한 서열인, AAV 기원을 갖지 않는 폴리뉴클레오티드 서열(즉, AAV에 이종인 폴리뉴클레오티드)을 포함하는 AAV 벡터를 말한다. 일부 실시양태에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 1개 이상, 및 때때로는 2개의 AAV 역 말단 반복 서열(ITR)이 측면에 위치할 수 있다. 용어 "rAAV 벡터"는 rAAV 벡터 입자 및 rAAV 벡터 플라스미드를 둘 다 포함한다. rAAV 벡터는 단일-가닥(ssAAV)이거나 자가-상보적(scAAV)일 수 있다. "AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "rAAV 벡터 입자"는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질(전형적으로는 야생형 AAV의 캡시드 단백질 전부로) 및 캡시드화 폴리뉴클레오티드 rAAV 벡터로 이루어진 바이러스 입자를 말한다. 상기 입자가 이종 폴리뉴클레오티드(즉, 야생형 AAV 게놈이 아닌 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 포유동물 세포에 전달될 전이유전자)를 포함하는 경우, 상기 입자는 전형적으로 "rAAV 벡터 입자" 또는 간단히 "rAAV 벡터"로 지칭된다. 따라서, rAAV 입자의 생성은 필수적으로 rAAV 벡터의 생성을 포함하며, 따라서 벡터는 rAAV 입자내에 함유된다.
본원에서 사용된 "재조합체"는, 벡터, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 세포가 클로닝, 제한효소 또는 접합 단계(예를 들어, 그 안에 포함되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 관하여)의 다양한 조합, 및/또는 자연에서 발견되는 생성물과 다른 구조물을 야기하는 다른 절차들의 생성물임을 의미한다. 재조합 바이러스 또는 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자이다. 상기 용어는 각각 원래 폴리뉴클레오티드 구조물의 복제물 및 원래 바이러스 구조물의 자손을 포함한다.
"AVV Rep"는 AAV 복제 단백질 및 그의 유사체를 의미한다.
"AAV Cap"는 AAV 캡시드 단백질, VP1, VP2 및 VP3 및 그의 유사체를 의미한다. 야생형 AAV 바이러스에서, 3개의 캡시드 유전자 vp1, vp2 및 vp3은 서로 중복된다(문헌[Grieger and Samulski, 2005, J. Virol. 79(15):9933-9944] 참조). 단일 P40 프로모터는 3개의 캡시드 단백질 모두가 약 1:1:10, vp1, vp2, vp3 각각의 비로 발현되게 하며, 이들 단백질은 rAAV 생성을 보완한다. 재조합 AAV 벡터의 생성을 위해, VP1:VP2:VP3의 바람직한 비는 약 1:1:1 내지 약 1:1:100의 범위, 바람직하게는 약 1:1:2 내지 약 1:1:50의 범위, 보다 바람직하게는 약 1:1:5 내지 약 1:1:20의 범위이다. VP1:VP2의 바람직한 비는 1:1이지만, VP1:VP2의 비의 범위는 1:50으로부터 50:1까지 달라질 수 있다.
공지되어 있는 AAV 혈청형들의 캡시드들의 아미노산 서열의 포괄적인 목록 및 배열은 문헌[Marsic et al., 2014, Molecular Therapy 22(11):1900-1909]에 특히 추가의 도 1에 제공되어 있다.
오직 예시적인 목적으로, 야생형 AAV2는 중복 서열들을 갖는 3개의 단백질(VP1, VP2 및 VP3; 총 60개의 캡시드 단백질들이 AAV 캡시드를 구성한다)로 이루어진 AAV의 작은(20 내지 25 nm) 정20면체 바이러스 캡시드를 포함한다. 단백질 VP1(735 aa; 진뱅크 등록 번호 AAC03780), VP2(598 aa; 진뱅크 등록 번호 AAC03778) 및 VP3(533 aa; 진뱅크 등록 번호 AAC03779)은 캡시드에 1:1:10의 비로 존재한다. 즉, AAV의 경우, VP1은 전장 단백질이고, VP2 및 VP3은, VP1에 비해 N-말단의 절두가 증가하는, VP1의 점점 더 짧은 형태이다.
"AAV TR"은, 주로 상보적인 비대칭적으로 정렬된 서열들을 포함하는, AAV 게놈의 말단에서의 또는 상기 말단 부근에서의 앞뒤대칭인 말단 반복 서열을 의미하며, 천연 AAV TR의 유사체 및 그의 유사체를 포함한다.
"시스-모티프"는 게놈 서열의 말단에서 또는 상기 말단 부근에서 발견되고 복제 개시를 위해 인식되는 바와 같은 보존된 서열; 번역 개시, 스플라이싱 또는 종결에 사용되기 쉬운 내부 위치들에서의 잠재성 프로모터 또는 서열을 포함한다.
"치료하는" 또는 "치료"는 상기 용어가 적용되는 장애 또는 병태의 진행, 또는 상기 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 역전시키거나 완화시키거나 억제하는 것을 의미한다.
"치료 효과량"은 대상에게 치료 이점을 제공하기 위해 필수적인 활성 약제의 최소량을 의미한다. 예를 들어, 환자에 대한 "치료 효과량"은 장애와 연관된 병리학적 증상, 질환 진행 또는 생리학적 병태의 개선, 또는 장애에 굴복하는 것에 대한 저항력을 유도하거나 개선하거나 안정시키거나, 진행을 지연시키거나 그렇지 않으면 야기하는 양이다.
"유전자"는 전사 및 번역된 후에 특정 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있는 1개 이상의 개방 해독틀을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"암호화 서열"은 특정 단백질을 암호화하는 서열을 의미하거나, "암호화 핵산"은 시험관내 또는 생체내에서 적절한 조절 서열(에 작동가능하게 연결될 때)의 조절하에 놓일 때 폴리펩티드로 전사(DNA의 경우)되고 번역(mRNA의 경우)되는 핵산 서열을 의미한다. 암호화 서열의 경계는 5' (아미노) 말단에서 개시 코돈 및 3' (카복시) 말단에서 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 암호화 서열은 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 원핵 또는 진핵 DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나, 이로 한정되지는 않는다.
"키메라"는, 바이러스 캡시드 또는 입자와 관련하여, 상기 캡시드 또는 입자가, 본원에 전체적으로 참고로 도입되는 라비노위츠 등(Rabinowitz et al.)의 미국 특허 제 6,491,907 호에 기술된 바와 같이, 상이한 파보바이러스, 바람직하게는 상이한 AAV 혈청형으로부터의 서열들을 포함하는 것을 의미한다(또한 문헌[Rabinowitz et al., 2004, J. Virol. 78(9):4421-4432] 참조). 특히 바람직한 키메라 바이러스 캡시드는, 하기의 돌연변이를 갖는 AAV2 캡시드의 서열을 갖는 AAV2.5 캡시드이다: 263 Q의 A로의 치환; 265 삽입 T; 705 N의 A로의 치환; 708 V의 A로의 치환; 및 716 T의 N으로의 치환(이때, 상기 캡시드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 WO 2006/066066 호에 기술된 바와 같이 서열번호 15로 정의된다). 다른 바람직한 키메라 AAV로는 WO 2010/093784 호에 기술된 AAV2i8, WO 2014/144229 호에 기술된 AAV2G9 및 AAV8G9, 및 AAV9.45[Pulicherla et al., 2011, Molecular Therapy 19(6):1070-1078]가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
다른 요소들이 측면에 위치한 서열과 관련하여, "측면에 위치한"은, 상류 및/또는 하류에, 즉, 서열에 대해 5' 및/또는 3'에 하나 이상의 측면 요소들의 존재를 나타낸다. 상기 용어 "측면에 위치한"은 서열이 반드시 인접해야 함을 나타내기 위한 것은 아니다. 예를 들어, 전이유전자를 암호화하는 핵산과 측면 요소 사이에 개재(intervening) 서열이 존재할 수 있다. 2개의 다른 요소들(예, TR)이 "측면에 위치한" 서열(예, 전이유전자)은 1개의 요소가 서열에 대해 5'에 위치하고 다른 요소가 서열에 대해 3'에 위치하는 것을 나타내지만; 그 사이에 개재 서열이 존재할 수 있다.
"폴리뉴클레오티드"는 포스포다이에스터 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드들의 서열을 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 본원에서 5'로부터 3' 방향으로 나타내었다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA) 분자 또는 리보핵산(RNA) 분자일 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 DNA 분자인 경우, 상기 분자는 유전자 또는 cDNA 분자일 수 있다. 뉴클레오티드 염기는 본원에서 단일 문자 코드: 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C), 이노신(I) 및 우라실(U)로 나타낸다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 표준 기술들을 이용하여 제조할 수 있다.
바이러스에 의한 세포의 "형질도입"은 바이러스 입자로부터 세포로 핵산이 전이됨을 의미한다.
"변형된 FXN 유전자"는 FXN을 암호화하는 야생형 핵산(예, 서열번호 2)과 비교하여 1개 이상의 변형을 갖는, FXN을 암호화하는 변형된 핵산(예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열)을 의미하며, 이때 상기 변형은 증가된 GC 함량, 감소된 GC 함량, 또는 감소된 CpG 함량을 갖는 FXN 유전자를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직하게, 변형된 FXN 유전자는 개선된 단백질 발현을 나타낸다, 예를 들어, 상기 유전자에 의해 암호화된 단백질은 다른 동일한 세포에서 야생형 유전자에 의해 제공된 단백질의 발현 수준에 비해 세포에서 검출가능하게 더 큰 수준으로 발현된다.
세포의 "형질감염"은 유전 물질이 세포를 유전적으로 변형시킬 목적으로 세포내에 도입되는 것을 의미한다. 형질감염은 인산칼슘, 폴리에틸렌이민, 전기천공 등과 같은, 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다.
"폴리펩티드"는 달리 나타내지 않는 한 펩티드 및 단백질 둘 다를 포함한다.
"유전자 전이" 또는 "유전자 전달"은 외래 DNA를 숙주 세포내에 확실하게 삽입하기 위한 방법 또는 시스템을 말한다. 상기 방법은 비-통합 전이된 DNA의 일시적 발현, 전이된 레플리콘(예를 들어, 에피솜)의 염색체외 복제 및 발현, 또는 숙주 세포의 게놈 DNA내로의 전이 유전 물질의 통합을 야기할 수 있다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 그 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는, 1차 형질전환된 세포, 및 계대수에 관계없이 그로부터 유도된 자손을 포함하는 "형질전환체", "형질전환 세포" 및 "형질도입 세포"를 포함한다.
"전이유전자"는, 표적 세포(본원에서는 "숙주 세포"로도 지칭됨)로의 전달 및 표적 세포에서의 발현을 포함하기 위해 벡터(바이러스 벡터 포함)에 혼입된 임의의 이종 뉴클레오티드 서열, 및 연관된 발현 조절 서열, 예를 들어, 프로모터를 의미하기 위해 사용된다. 당해 분야에 기술을 가진 자들은 발현 조절 서열이 표적 세포에서 전이유전자의 발현을 촉진하는 능력에 기반하여 선택될 것임을 인지할 것이다. 전이유전자의 예는 치료 폴레핍티드를 암호화하는 핵산이다.
"벡터"는 시험관내 또는 생체내에서, 숙주 세포내로 전달될 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스를 의미한다.
"실질적인 상동성" 또는 "실질적인 유사성"은, 핵산 또는 그의 단편을 언급하는 경우, 또 다른 핵산(또는 그의 상보적 가닥)과 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실하에 최적으로 정렬될 때 서열의 적어도 약 95 내지 99%에서 뉴클레오티드 서열 동일성이 있음을 의미한다.
"재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종 서열(즉, 바이러스 기원을 갖지 않는 폴리뉴클레오티드 서열)을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터를 의미한다. 재조합 파보바이러스 벡터의 경우, 재조합 폴리뉴클레오티드는 1개 이상, 바람직하게는 2개의 역 말단 반복 서열(ITR)이 측면에 위치한다.
펩티드와 관련하여 사용된 "상동성"은 두 펩티드 사이의 아미노산 서열 유사성을 말한다. 두 펩티드 모두에서의 아미노산 위치가 동일한 아미노산에 의해 점유된 경우, 이들은 상기 위치에서 상동성이다. 따라서, "실질적으로 상동성"은, 전적으로는 아니지만 대부분 상동성이고 그것이 상동성인 서열과 같은 활성의 대부분 또는 전부를 유지하는 아미노산 서열을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 상동성"은 서열이 기준 펩티드에 대해 50% 이상 동일하고, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 95% 상동성인 것을 의미한다. 또 다른 펩티드 서열 변형, 예를 들어, 펩티드가 비변형 펩티드와 실질적으로 동일한 활성 또는 기능을 갖는 한, 본원에 개시된 서열들의 아미노산 서열의 미미한 변이, 결실, 치환 또는 유도체화가 포함된다. 아미노산의 유도체들로는 트라이플루오로류신, 헥사플루오로류신, 5,5,5-트라이플루오로이소류신, 4,4,4-트라이플루오로발린, p-플루오로페닐알린, o-플루오로티로신, m-플루오로티로신, 2,3-다이플루오로티로신, 4-플루오로히스티딘, 2-플루오로히스티딘, 2,4-다이플루오로히스티딘, 플루오로프롤린, 다이플루오로프롤린, 4-하이드록시프롤린, 셀레노메티오닌, 텔루로메티오닌, 셀레노시스테인, 셀레나트립토판, 4-아미노트립토판, 5-아미노트립토판, 5-하이드록시트립토판, 7-아자트립토판, 4-플루오로트립토판, 5-플루오로트립토판, 6-플루오로트립토판, 호모알릴글리신, 호모프로파길글리신, 2-부티닐글리신, 시스-크로틸글리신, 알릴글리신, 디하이드로류신, 디하이드로프롤린, 2-아미노-3-메틸-4-펜테노산, 아지도호모알라닌, 아시도알라닌, 아지도노르류신, p-에티닐페닐알라닌, p-아지도페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아세틸페닐알라닌 및 벤조푸라닐알라닌이 포함될 수 있으나, 이로 한정되지는 않는다. 특히, 변형된 펩티드는 비변형 펩티드와 연관된 활성 또는 기능을 유지할 것이며, 상기 변형된 펩티드는 일반적으로 비변형 서열의 아미노산 서열과 "실질적으로 상동성인" 아미노산 서열을 가질 것이다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 또 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대해, 정렬될 때 두 서열을 비교시 염기 또는 아미노산의 백분율이 동일함을 의미하는, 특정 퍼센트 "서열 동일성"을 갖는다. 서열 유사성은 많은 상이한 방식으로 결정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위해, 서열들은, ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 월드 와이드 웹 상에서 이용가능한, BLAST를 포함한 방법 및 컴퓨터 프로그램들을 이용하여 정렬될 수 있다. 또 다른 정렬 알고리즘은 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨팅 그룹(Genetics Computing Group)(GCG) 패키지에서 이용가능한 FASTA이다. 정렬을 위한 다른 기술은 문헌[Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc]에 기술되어 있다. 서열중에 갭(gap)을 허용하는 정렬 프로그램이 특히 관심을 끈다. 스미스-워터맨(Smith-Waterman)은 서열 정렬시 갭을 허용하는 알고리즘의 한 유형이다(문헌[Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)] 참조. 또한, 니들만 및 분쉬(Needleman and Wunsch) 정렬 방법을 이용하는 GAP 프로그램도 서열을 정렬시키기 위해 사용될 수 있다(문헌[J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)] 참조).
서열 동일성을 결정하기 위해 스미스 및 워터맨[1981, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489]의 국소 상동성 알고리즘을 사용하는 BestFit 프로그램이 관심을 끈다. 갭 생성 페널티는 일반적으로 1 내지 5, 통상적으로 2 내지 4의 범위일 것이며, 많은 실시양태에서 3일 것이다. 갭 연장 페널티는 일반적으로 약 0.01 내지 0.20의 범위일 것이며 많은 경우에서 0.10일 것이다. 상기 프로그램은 비교되기 위해 입력된 서열들에 의해 결정된 디폴트 파라미터를 갖는다. 바람직하게, 서열 동일성은 상기 프로그램에 의해 결정된 디폴트 파라미터를 사용하여 결정된다. 상기 프로그램은 또한 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨팅 그룹(GCG) 패키지로부터 이용가능하다.
관심을 끄는 또 다른 프로그램은 FastDB 알고리즘이다. FastDB는 문헌[Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1988, Alan R. Liss, Inc]에 기술되어 있다.
퍼센트 서열 동일성은 다음 파라미터들에 기반하여 FastDB에 의해 산출된다: 미스매치 페널티: 1.00; 갭 페널티: 1.00; 갭 크기 페널티: 0.33; 및 연결 페널티: 30.0.
본 발명은 변형된 FXN 유전자를 제공한다. 본 발명은 또한 그 서열의 일부로서 변형된 FXN 유전자, 예를 들어, 야생형 FXN 유전자 서열에 비해 더 크거나 더 작은 양의 GC 뉴클레오티드를 포함하는 GC 함량 최적화된 FXN 유전자 서열 및/또는 야생형 FXN 유전자에 존재하는 CpG 다이뉴클레오티드의 수준에 비해 감소된 CpG 다이뉴클레오티드의 수준을 갖는 FXN 유전자 서열을 포함하는 핵산 구조물, 예를 들어, 벡터를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 조절 요소들과 같은 다른 요소들과 함께 변형된 FXN 서열을 포함하는 플라스미드 및/또는 기타 벡터를 포함한다. 또한, 본 발명은 변형된 FXN 서열을 포함하는 패키징된 유전자 전달 비히클, 예를 들어, 바이러스 캡시드를 제공한다. 본 발명은 또한 변형된 서열을 세포에서의 발현을 촉진시키는데 필요한 요소들과 함께 세포내에 전달함으로써 변형된 FXN 유전자를 전달, 및 바람직하게는 발현하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한, 변형된 FXN 유전자 서열이, 예를 들어, 벡터의 한 성분으로서 대상에게 투여되고/되거나 바이러스 유전자 전달 비히클의 한 성분으로서 패키징되는 유전자 치료 방법을 제공한다. 치료는, 예를 들어, 대상에서 프라탁신의 수준을 증가시키고 상기 대상에서 프라탁신 결핍을 치료하도록 수행될 수 있다. 본 발명의 상기 양태들은 각각 이후의 단락들에서 더 논의된다.
프라탁신의 발현을 위한 변형된 핵산
본 발명은 프라탁신을 암호화하는 변형된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 상기 변형된 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 변형을 포함하는 야생형 또는 천연 FXN 유전자 서열을 포함한다.
한 양태에서, 변형된 핵산 서열은 다른 동일한 세포에서 서열번호 2의 야생형 핵산 서열로부터의 프라탁신 발현에 비해 세포에서 프라탁신의 검출가능하게 더 큰 발현 수준을 제공한다. 이것은 "발현 최적화된" 또는 "증대된 발현" 핵산으로, 또는 간단히 "변형된 핵산"으로 지칭될 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 언급되는 바와 같이 "최적화된" 또는 "코돈-최적화된"은, 예를 들어, 희귀 코돈의 사용을 최소화하거나, CpG 다이뉴클레오티드의 수를 감소시키거나, 잠재성 스플라이스 공여체 또는 수용체 부위를 제거하거나, 코작(Kozak) 서열을 제거하거나, 리보솜 유입 부위를 제거하거나 하는 등에 의해 암호화 서열의 발현을 증가시키기 위해, 야생형 암호화 서열(예를 들어, 프라탁신에 대한 암호화 서열)에 비해 최적화된 암호화 서열을 말한다.
변형의 예로는 하나 이상의 시스-작용 모티프의 제거 및 하나 이상의 코작 서열의 도입이 포함된다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 시스-작용 모티프가 제거되고 하나 이상의 코작 서열이 도입된다.
제거될 수 있는 시스 작용 모티프의 예로는 내부 TATA-박스; chi-부위; 리보솜 유입 부위; ARE, INS 및/또는 CRS 서열 요소; 반복 서열 및/또는 RNA 2차 구조물; (잠재성) 스플라이스 공여체 및/또는 수용체 부위, 분기점; 및 SaII가 포함된다.
한 실시양태에서, GC 함량(예를 들어, 핵산 서열에 존재하는 G 및 C 뉴클레오티드의 수)은 서열번호 2의 야생형 FXN 유전자 서열에 비해 증대된다. 상기 GC 함량은 야생형 유전자(서열번호 2)보다 바람직하게는 5% 이상, 보다 바람직하게는 6% 이상, 보다 더 바람직하게는 7% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 8% 이상, 보다 바람직하게는 9% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 10% 이상, 보다 더 바람직하게는 12% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 14% 이상, 보다 더 바람직하게는 15% 이상, 보다 바람직하게는 17% 이상, 보다 더 바람직하게는 20% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 30% 이상, 보다 더 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 70% 이상 더 크다.
또 다른 실시양태에서, GC 함량은 서열중 G(구아닌) 및 C(시토신) 뉴클레오티드의 백분율로서 나타낸다. 즉, 프라탁신을 암호화하는 야생형 핵산(서열번호 1)의 GC 함량은 약 55%인 반면, 본 발명의 대표적인 변형된 FXN 유전자들의 GC 함량은 IDT-3(서열번호 8)의 경우 약 57%, Genescript(서열번호 6)의 경우 57%; GeneArt(서열번호 5)의 경우 61%, 및 JCAT(서열번호 4)의 경우 69%의 범위이다. 따라서, 본 발명의 변형된 핵산은, 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 프라탁신을 암호화하는 야생형 핵산 서열의 약 55%의 GC 함량과 비교하여, 57% 이상, 보다 바람직하게는 61% 이상의 GC 함량, 훨씬 더 바람직하게는 69% 이상의 GC 함량을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 변형된 핵산의 GC 함량은 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 프라탁신을 암호화하는 야생형 핵산의 GC 함량보다 더 크다. 당해 분야에 숙련된 자라면, 핵산 코드의 퇴보에 대한 지식하에, 단백질을 암호화하는 핵산의 서열과 무관하게, 그로부터 발현된 프라탁신의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열임을 인지할 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 FXN을 암호화하는 변형된 핵산의 GC 함량은 야생형 FXN 유전자(서열번호 2)의 GC 함량과 대략 동일하다. 즉, 55%이다.
또한, 프라탁신을 암호화하는 변형된 핵산(즉, 변형된 FXN 유전자)의 코돈 적응 지수는 바람직하게는 0.74 이상, 바람직하게는 0.76 이상, 훨씬 더 바람직하게는 0.77 이상, 보다 더 바람직하게는 0.80 이상, 바람직하게는 0.85 이상, 보다 바람직하게는 0.86 이상, 보다 더 바람직하게는 0.87 이상, 훨씬 더 바람직하게는 0.90 이상, 보다 더 바람직하게는 0.95 이상, 가장 바람직하게는 0.98 이상이다.
또 다른 실시양태에서, 변형된 FXN 서열은 FXN을 암호화하는 야생형 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 2)에 비해 약 10%, 20%, 30%, 50% 이상 감소된 CpG 다이뉴클레오티드의 감소된 수준을 갖는다.
CpG 다이뉴클레오티드의 메틸화는 진핵생물에서 유전자 발현의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, 진핵생물에서 CpG 다이뉴클레오티드의 메틸화는 근본적으로 전사 기관을 방해하는 것을 통해 유전자 발현을 침묵시키는 역할을 한다. 따라서, CpG 모티프의 메틸화에 의해 유발된 유전자 침묵으로 인해, 감소된 수의 CpG 다이뉴클레오티드를 갖는 본 발명의 핵산 및 벡터는 높고 오래 지속되는 전이유전자 발현 수준을 제공할 것이다.
한 실시양태에서, 변형된 FXN 유전자는 야생형 FXN 유전자보다 적은 잠재적 CpG 섬 영역, 즉 128개를 포함한다. 바람직하게, 변형된 FXN 유전자는 약 124개의 잠재적 CpG 섬 영역, 보다 바람직하게는 약 123개, 훨씬 더 바람직하게는 약 117개, 보다 바람직하게는 약 114개의 잠재적 CpG 섬 영역을 포함한다.
변형된 FXN 유전자 서열은 또한 발현 벡터내로의 서브클로닝을 촉진하기 위해 측면 제한효소 부위를 포함할 수 있다. 많은 상기 제한효소 부위들은 당해 분야에 공지되어 있으며, 도 2a 내지 2f, 및 도 3(scAAV 플라스미드 벡터 pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH의 플라스미드 지도) 및 표 8(서열번호 19 내지 23)에 나타낸 제한효소 부위, 예를 들어, AgeI, AvrII, SpeI 및 MluI를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본 발명은 또한 기능적으로 활성인 단편 프라탁신을 암호화하는, 서열번호 3 내지 9 중 어느 하나의 단편을 포함한다. "기능적으로 활성인" 또는 "기능성 프라탁신"은 상기 단편이 전장 프라탁신과 동일하거나 유사한 생물 활성을 제공하는 것을 나타낸다. 즉, 상기 단편은, 주요 Fe-S 클러스터 결손을 교정하거나, 미토콘드리아 철 축적[Puccio et al., 2001, Nature Genetics 27:181-186; Seznec et al., 2004, Human Mol. Genet. 13:1017-1024] 및 문헌[Perdomini et al., 2014, Nature Med. 20(5):542-547]에서 논의된 바와 같은 다른 결함들을 감소시키는 것을 포함하나 이로 한정되지는 않는 동일한 활성을 제공한다. FXN 또는 그의 기능성 단편의 생물 활성은 또한 Mck 마우스에서 본원 다른 곳에서 입증된 바와 같은 FRDA와 연관된 심장 표현형을 역전시키거나 방지하는 것을 포함한다.
본 발명은 변형된 FXN 유전자 서열 및 다양한 조절 또는 제어 요소들을 포함하는 핵산 벡터를 포함한다. 유전자 발현에 유용한 조절 요소들의 정확한 성질은 유기체에 따라서 및 세포 유형에 따라서 달라질 것이다. 일반적으로, 상기 조절 요소들은 해당 세포에서 RNA 전사의 개시를 유도하는 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 구성적이거나 조절될 수 있다. 구성적 프로모터는 작동가능하게 연결된 유전자가 항상 필수적으로 발현되도록 하는 프로모터이다. 조절된 프로모터는 활성화되거나 불활성화될 수 있는 프로모터이다. 조절된 프로모터는 통상적으로 "오프" 상태이지만 "온" 상태가 되도록 유도될 수 있는 유도성 프로모터, 및 통상적으로 "온" 상태이지만 "오프" 상태가 될 수 있는 "억제성" 프로모터를 포함한다. 온도, 호르몬, 사이토카인, 중금속 및 조절 단백질을 포함한 많은 상이한 조절인자들이 알려져 있다. 상기 구분은 절대적이지 않으며; 구성적 프로모터는 종종 어느 정도 조절될 수 있다. 일부 경우에서, 예를 들어, 병리적 상태가 개선될 때 자연적으로 하향조절되는 프로모터를 사용하여, 전이유전자 발현의 조절을 제공하기 위해 내인성 경로를 사용할 수 있다.
적합한 프로모터의 예로는 아데노바이러스 프로모터, 예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기발현 프로모터; 이종 프로모터, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터; 호흡기 세포융합 바이러스 프로모터; 라우스 육종(Rous Sarcoma) 바이러스(RSV) 프로모터; 알부민 프로모터; 유도성 프로모터, 예를 들어, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터; 메탈로티오네인 프로모터; 열충격 프로모터; α-1-항트립신 프로모터; B형 간염 표면 항원 프로모터; 트랜스페린 프로모터; 아포지질단백질 A-1 프로모터; 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터, CBh 프로모터(서열번호 25), 및 CAG 프로모터(사이토메갈로바이러스 초기발현 인핸서 요소 및 프로모터, 첫번째 엑손, 닭 베타-액틴 유전자의 제 1 엑손 및 제 1 인트론, 및 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체)[Alexopoulou et al., 2008, BioMed. Central Cell Biol. 9:2], 및 인간 FXN 프로모터가 포함된다. 프로모터는 조직-특이적 프로모터, 예를 들어, 간 세포에서 활성인 마우스 알부민 프로모터 뿐 아니라 트랜스티레틴 프로모터(TTR)일 수 있다.
또 다른 양태에서, FXN을 암호화하는 변형된 핵산은 FXN 단백질의 발현을 증가시키기 위해 인핸서를 추가로 포함한다. 사이토메갈로바이러스 주요 급속-초기발현 인핸서를 포함하나 이로 한정되지는 않는 많은 인핸서들이 당해 분야에 공지되어 있다. 보다 특히, CMV MIE 프로모터는 3개의 영역: 조절자, 고유 영역 및 인핸서를 포함한다[Isomura and Stinski, 2003, J. Virol. 77(6):3602-3614]. CMV 인핸서 영역은 다른 프로모터 또는 그의 일부와 결합되어, 그에 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 더 증가시키기 위한 하이브리드 프로모터를 형성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Gray et al., 2011, Human Gene Therapy 22:1143-1153]에 기술된 바와 같이, 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터 또는 그의 일부는 CMV 프로모터/인핸서 또는 그의 일부와 결합되어, 닭 베타-액틴 하이브리드 프로모터(chicken beta-actin hybrid promoter)를 나타내는 "CBh" 프로모터로 지칭되는 CBA의 한 버전을 생성할 수 있다.
또한, 제어 요소들은 콜라겐 안정화 서열(CSS), 정지 코돈, 종료 코돈, 및 진핵세포 mRNA의 3' 말단에서 폴리-아데노신 "꼬리"의 효과적인 부가를 유도하기 위한(예를 들어, 문헌[Goodwin and Rottman, 1992, J. Biol. Chem. 267(23):16330-16334] 참조) 폴리-아데닐화 신호 서열, 예를 들어, 소 성장 호르몬 폴리 A 신호 서열(bGHpolyA)(이로 한정되지는 않는다)을 포함할 수 있다.
비-바이러스 벡터
특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 전형적으로, 비-바이러스 벡터는 변형된 FXN 유전자 또는 그의 변이체를 열거한 핵산 서열들을 포함하는 플라스미드일 수 있다.
패키징된 변형 FXN 서열
변형된 FXN 유전자 서열은 또한 패키징된 바이러스 벡터의 한 성분으로서 제공될 수 있다. 일반적으로, 패키징된 바이러스 벡터는 캡시드에 패키징된 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터 및 바이러스 캡시드는 이후의 단락들에서 논의된다. rAAV 벡터에 패키징된 핵산은 단일-가닥(ss), 자가-상보적(sc) 또는 이중-가닥(ds)일 수 있다.
바이러스 벡터
전형적으로, 전이유전자를 함유하는 바이러스 벡터는 상기 전이유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 적절한 조절 요소들, 및 세포 형질도입을 매개하는 바이러스 단백질의 생성에 필수적인 요소들로부터 구성된다. 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스바이러스 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터들이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법에 따라 생성된 패키징된 바이러스 벡터들의 바이러스 벡터 성분은 1개 이상의 전이유전자, 예를 들어, 변형된 FXN 유전자 서열 및 상기 변형된 FXN 유전자 서열의 발현을 조절하기 위한 연관된 발현 조절 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 파보바이러스 게놈, 예를 들어, rep 및 cap가 결실되고/되거나 변형된 FXN 유전자 서열 및 그의 연관된 발현 조절 서열로 치환된 AAV 게놈의 일부분을 포함한다. 변형된 FXN 유전자 서열은 전형적으로, 바이러스 rep 및 cap 단백질을 암호화하는 핵산 대신에, 바이러스 복제에 적절한 1개 또는 2개의 AAV TR 또는 TR 요소들에 인접하여 삽입된다(즉, 이들이 측면에 위치한다)[Xiao et al., 1997, J. Virol. 71(2): 941-948]. 표적 세포에서 변형된 FXN 유전자 서열의 조직-특이적 발현을 촉진하는데 사용하기에 적합한 다른 조절 서열도 또한 포함될 수 있다.
당해 분야에 숙련된 자라면 전이유전자를 포함하고 바이러스 복제에 필요한 바이러스 단백질(예를 들어, cap 및 rep)이 결여된 AAV 벡터는, 상기 단백질들이 바이러스 복제 및 패키징에 필수적이기 때문에, 복제될 수 없음을 인지할 것이다. 또한, AAV는, 헬퍼 바이러스에 의한 세포의 공-감염 없이 세포에서 복제될 수 없다는 점에서 디펜도바이러스(Dependovirus)이다. 헬퍼 바이러스는 전형적으로 아데노바이러스 또는 단순 헤르페스 바이러스를 포함한다. 또는, 하기에서 논의되는 바와 같이, 다양한 헬퍼 요소들을 암호화하는 하나 이상의 핵산으로 세포를 형질감염시킴으로써 패키징 세포에 헬퍼 기능(E1a, E1b, E2a, E4, 및 VA RNA)이 제공될 수 있고/있거나 세포는 헬퍼 단백질을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, HEK 293은 인간 세포를 아데노바이러스 5 DNA로 형질전환시켜 생성되었으며, 현재 E1 및 E3을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다수의 아데노바이러스 유전자를 발현한다(예를 들어, 문헌[Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59-72] 참조). 따라서, 상기 헬퍼 기능은, 예를 들어, 헬퍼 기능을 암호화하는 플라스미드에 의해 세포에 상기 헬퍼 기능을 공급할 필요없이 HEK293 패키징 세포에 의해 제공될 수 있다.
바이러스 벡터는 임의의 적합한 핵산 구조물, 예를 들어, DNA 또는 RNA 구조물일 수 있으며, 단일 가닥이거나, 이중 가닥이거나 이중화(즉, WO 2001/92551 호에 기술된 바와 같이 자가 상보적)될 수 있다.
당해 분야에 숙련된 자라면 rAAV 벡터가 "스터퍼(stuffer)" 또는 "필러(filler)" 서열(필러/스터퍼)을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 전이유전자를 포함하는 핵산은 AAV 캡시드내로 핵산의 최적 패키징을 위해 대략 4.1 내지 4.9 kb 크기 미만임을 인지할 것이다(문헌[Grieger and Samulski, 2005, J. Virol. 79(15):9933-9944] 참조). 즉, AAV 벡터는 전형적으로, 일반적으로 약 4 kb 내지 약 5.2 kb, 또는 그보다 약간 더 큰 정의된 크기 범위를 갖는 DNA의 삽입물을 수용한다. 따라서, 더 짧은 서열의 경우, 바이러스 입자내로의 AAV 벡터 패키징에 허용되는 바이러스 게놈 서열의 통상적인 크기 부근 또는 상기 통상적인 크기로 길이를 조정하기 위해 삽입 단편에 필러/스터퍼가 포함된다. 다양한 실시양태에서, 필러/스터퍼 핵산 서열은 핵산의 비번역(비-단백질 암호화) 절편이다. rAAV 벡터의 특정 실시양태에서, 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 4.7 Kb 미만의 길이를 가지며, 필러/스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 이종 폴리뉴클레오티드 서열과 결합시(예를 들어, 벡터내에 삽입시) 약 3.0 내지 5.5 Kb, 또는 약 4.0 내지 5.0 Kb, 또는 약 4.3 내지 4.8 Kb의 전체 길이를 갖는다.
인트론도 또한 바이러스 입자내로의 AAV 벡터 패키징을 위한 길이를 달성하기 위해 필러/스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열로 작용할 수 있다. 필러/스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열로 작용하는 인트론 및 인트론 단편도 또한 발현을 증대시킬 수 있다. 예를 들어, 인트론 요소의 혼입은 인트론 요소 부재하에서의 발현에 비해 발현을 증대시킬 수 있다[Kurachi et al., 1995, J. Biol. Chem. 270(10):5276-5281]. 또한, 필러/스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며, WO 2014/144486 호에 기술된 것들이 포함되나 이로 한정되지는 않는다.
바이러스 캡시드
패키징된 바이러스 벡터의 바이러스 캡시드 성분은 파보바이러스 캡시드일 수 있다. AAV Cap 및 키메라 캡시드가 바람직하다. 적합한 파보바이러스 바이러스 캡시드 성분의 예는 자율적 파보바이러스 또는 디펜도바이러스와 같은 파보바이러스과로부터의 캡시드 성분이다. 예를 들어, 바이러스 캡시드는 AAV 캡시드(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV9.45, AAVrh10, AAVrh74, RHM4-1(WO 2015/013313 호의 서열번호 5), AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N, AAV-LK03, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 및 현재 알려져 있거나 나중에 발견된 임의의 다른 AAV)일 수 있다(예를 들어, 문헌[Fields et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)] 참조). 캡시드는 미국 특허 제 7,906,111 호; 문헌[Gao et al., 2004, J. Virol. 78:6381; Moris et al., 2004, Virol. 33:375]; WO 2013/063379 호; WO 2014/194132 호에 개시된 다수의 AAV 혈청형들로부터 유도될 수 있고; WO 2015/121501 호에 개시된 트루 타입(true type) AAV(AAV-TT) 변이체, 및 WO 2015/013313 호에 개시된 RHM4-1, RHM15-1 내지 RHM15-6, 및 그의 변이체를 포함하며, 당해 분야에 숙련된 자라면 동일하거나 유사한 기능을 수행하거나 2개 이상의 AAV 캡시드들로부터의 성분을 포함할 수 있는 아직 확인되지 않은 다른 변이체들이 존재할 가능성이 있음을 알 것이다. AAV Cap 단백질의 완전 보체는 VP1, VP2 및 VP3을 포함한다. AAV VP 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ORF는 완전 보체 미만의 AAV Cap 단백질을 포함할 수 있거나, AAV Cap 단백질의 완전 보체가 제공될 수 있다.
AAV Cap 단백질 중 하나 이상은, 전체 개시내용이 본원에 참고로 도입되는 라비노위츠 등의 미국 특허 제 6,491,907 호에 기술된 바와 같이, 2개 이상의 바이러스, 바람직하게는 2개 이상의 AAV로부터의 AAV Cap의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질일 수 있다. 예를 들어, 키메라 바이러스 캡시드는 AAV1 Cap 단백질 또는 서브유닛 및 1개 이상의 AAV2 Cap 또는 서브유닛을 포함할 수 있다. 키메라 캡시드는, 예를 들어, 하나 이상의 B19 Cap 서브유닛을 갖는 AAV 캡시드를 포함할 수 있다, 예를 들어, AAV Cap 단백질 또는 서브유닛이 B19 Cap 단백질 또는 서브유닛으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, AAV 캡시드의 Vp3 서브유닛은 B19의 Vp2 서브유닛으로 치환될 수 있다.
또 다른 실시양태는 AAV9로부터의 갈락토스(Gal) 결합 풋프린트와 AAV2, AAV3, AAV6, AAV8 등으로부터의 AAV 주쇄의 조합을 포함하는, 합성된 키메라 바이러스 균주를 포함한다. 아데노-연관 바이러스(AAV)는 세포 표면 결합을 위한 1차 수용체로서 헤파란 설페이트(HS), 갈락토스(Gal), 또는 시알산(Sia)을 이용하는 헬퍼-의존성 파보바이러스이다. 예를 들어, AAV 혈청형 2 및 3b는 HS를 이용한다. AAV1, 4 및 5는 상이한 결합 특이성하에 Sia에 결합하고, AAV 혈청형 6은 Sia 및 HS를 둘 다 인식하는 반면, AAV9는 숙주 세포 결합에 Gal을 이용한다. 특히, AAV9로부터의 갈락토스(Gal) 결합 풋프린트는 헤파린 설페이트-결합 AAV 혈청형 2 상에 그라프팅되었으며, 단지 수직 글리칸 결합 풋프린트의 그라프팅은 형질도입 효율을 개선시킨다. AAV9로부터의 Gal 결합 풋프린트를 AAV2 VP3 주쇄 내에 삽입시킴으로써, 또는 구조적 정렬 및 부위-특이적 돌연변이유발을 이용하여 키메라 AAV2i8 캡시드 주형에 의해 새로운 이중 글리칸-결합 균주(AAV2G9) 및 키메라 근육-친화성 균주(AAV2i8G9)를 생성하였다. 시험관내 결합 및 형질도입 분석에 의해 세포 유입을 위해 AAV2G9에 의한 HS 및 Gal 수용체 둘 다의 이용이 확인되었다. 전이유전자 발현의 동역학의 후속 생체내 특성화 및 벡터 게놈 생체분포 프로필은 상기 합리적으로 조작된 키메라 AAV 균주에 의한 빠르고, 지속적이며 증대된 전이유전자 발현을 보여준다. 유사한 개선된 형질도입 프로필이 간-탈표적화된, 근육-특이적 AAV2i8G9 키메라를 사용하여 관찰되었다[Shen, et al., 2013, J. Biol. Chem. 288(4):28814-28823]. 상기 새로운 그라프팅 결합은 본원에 참고로 도입된 WO2014/144229 호에 상세하게 기술되어 있다. 또 다른 간 탈표적화 AAV, 예를 들어, AAV9.45가 본원에 전체적으로 나타낸 바와 같이 참고로 도입되는 문헌[Pulicherla et al., 2011, Molecular Therapy 19(6):1070-1078]에 기술되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 생체내 치료적 유전자 치료에 사용하기 위한 원형 AAV 벡터의 용도를 제공한다. 특히, 인실리코(in silico)-유도된 서열을 드 노보(de novo) 합성하고 생물 활성에 대해 특성화하였다. 이러한 노력은 9개의 기능성 추정상 원형 AAV의 생성 및 AAV 혈청형 1, 2, 8 및 9의 예측된 원형인 Anc80의 확인을 이끌었다[Zinn et al., 2015, Cell Reports 12:1056-1068]. 바이러스 입자로 구성하는 것 이외에 상기 원형 서열의 예측 및 합성은 본원에 참고로 도입되는 WO 2015/054653 호에 기술된 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 특히, 원형 바이러스 서열들로부터 구성된 바이러스 입자의 사용은 그 당시 바이러스 또는 그의 일부분보다 오늘날 인구에서 기존 면역에 대한 감소된 민감성을 나타낸다.
패키징된 바이러스 벡터의 생성
본 발명은 본 발명의 패키징된 바이러스 벡터를 생성하도록 배양될 수 있는, "숙주 세포"에 포함되는 패키징 세포를 포함한다. 본 발명의 패키징 세포는 일반적으로 이종 (1) 바이러스 벡터 기능(들), (2) 패키징 기능(들), 및 (3) 헬퍼 기능(들)을 갖는 세포를 포함한다. 상기 구성 기능들 각각은 이후의 단락들에서 논의된다.
초기에, 상기 벡터는 숙련된 전문가에게 공지된 여러 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, WO 2013/063379 호 참조). 바람직한 방법은 모든 취지에서 본원에 참고로 도입되는 문헌[Grieger, et al. 2015, Molecular Therapy 24(2):287-297]에 기술되어 있다. 간략하게, HEK293 세포의 효과적인 형질감염이 출발점으로 사용되는데, 이때 적격 임상 마스터 세포 은행으로부터의 부착성 HEK293 세포주가 신속하고 확장가능한 rAAV 생성을 가능하게 하는 진탕 플라스크 및 웨이브(WAVE) 생물반응기에서 동물 성분이 없는 현탁 조건에서 성장시키기 위해 사용된다. 삼중 형질감염 방법(예를 들어, WO 96/40240 호)을 이용하여, 현탁 HEK293 세포주는 형질감염 48 시간후에 수확시 1x105보다 큰 벡터 게놈 함유 입자(vg)/세포 또는 1x1014 vg/L보다 큰 세포 배양물을 생성한다. 보다 특히, 삼중 형질감염은, 패키징 세포가 3개의 플라스미드로 형질감염되는 것을 말한다: 한 플라스미드는 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화하고, 또 다른 플라스미드는 다양한 헬퍼 기능(예를 들어, 아데노바이러스 또는 HSV 단백질, 예를 들어, E1a, E1b, E2a, E4, 및 VA RNA)을 암호화하고, 또 다른 플라스미드는 전이유전자 및 그의 다양한 조절 요소들(예를 들어, 변형된 FXN 유전자 및 CBh 프로모터)을 암호화한다.
목적 수율을 달성하기 위해, 성장 및 형질감염 둘 다를 촉진하는 상용성 무혈청 현탁 배지의 선택, 형질감염 시약의 선택, 형질감염 조건 및 세포 밀도와 같은 다수의 변수들이 최적화된다. AAV 혈청형 1 내지 6, 8, 9 및 다양한 키메라 캡시드의 고순도 벡터 제제를 제공한, 이온 교환 크로마토그래피 방법에 기반한 일반적인 정제 방법도 또한 개발되었다. 상기 사용자-친화적 방법은 1 주일 이내에 완료될 수 있고, 높은 전체 입자 대 빈 입자 비(>90% 전체 입자)를 제공하고, 임상 용도에 적합한 정제후 수율(>1x1013 vg/L) 및 순도를 제공하며, 모든 혈청형 및 키메라 입자들에 대해 일반적이다. 상기 확장가능한 제조 기술은, 환자들에게 투여된, 망막 혈관신생(AAV2), B형 혈우병(scAAV8), 거대 축삭 신경병증(scAAV9) 및 망막색소변성증(AAV2)에 대한 GMP 제 1상 임상 AAV 벡터를 제조하기 위해 사용되었다. 또한, 형질감염후 여러 시점에서의 배양 배지로부터 rAAV를 수거하는 것을 포함하는 관류 방법을 시행함으로써 전체 벡터 생성에 최소 5배가 증가하였다.
바이러스 벡터 기능
본 발명의 패키징 세포는 패키징 및 벡터 기능과 함께 바이러스 벡터 기능을 포함한다. 바이러스 벡터 기능은 전형적으로, rep 및 cap가 결실되고 변형된 FXN 서열 및 그의 연관된 발현 조절 서열로 치환된 파보바이러스 게놈, 예를 들어, AAV 게놈의 일부분을 포함한다. 바이러스 벡터 기능은 패키징을 위한 바이러스 벡터의 복제를 야기하기에 충분한 발현 조절 서열을 포함한다. 전형적으로, 바이러스 벡터는, rep 및 cap가 결실되고 전이유전자 및 그의 연관된 발현 조절 서열로 치환된 파보바이러스 게놈, 예를 들어, AAV 게놈의 일부분을 포함한다. 상기 전이유전자는 전형적으로, 결실된 바이러스 rep 및 cap ORF 대신에 2개의 AAV TR이 측면에 위치한다. 적절한 발현 조절 서열, 예를 들어, 표적 세포에서 전이유전자의 조직-특이적 발현을 촉진하는데 사용하기에 적합한 조직-특이적 프로모터 및 다른 조절 서열이 포함된다. 전이유전자는 전형적으로, 치료 폴리펩티드 또는 마커 폴리펩티드를 생성하도록 발현될 수 있는 핵산 서열이다.
"이중화 벡터"는 본원에서 "이량체성" 또는 "자가-상보적" 벡터로 상호교환적으로 지칭될 수 있다. 이중화 파보바이러스 입자는, 예를 들어, 비리온 DNA(vDNA)를 함유하는 파보바이러스 캡시드를 포함할 수 있다. vDNA는 자가-상보적이어서 바이러스 캡시드로부터 방출시 헤어핀(hairpin) 구조를 형성할 수 있다. 이중화 vDNA는, 통상적인 파보바이러스 벡터에 필요한 바와 같은, 제 2-가닥 합성이 필요없이 숙주 세포에 의해 발현(즉, 전사 및 선택적으로, 번역)될 수 있는 이중-가닥 DNA를 숙주 세포에 제공하는 것으로 생각된다. 이중화/자가-상보적 rAAV 벡터는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, WO 2001/92551 호, WO 2015/006743 호, 및 기타 다수에 기술되어 있다.
바이러스 벡터 기능은 사물스키 등(Samulski et al.)의 미국 특허 제 7,465,583 호(전체 개시내용이 이중화 벡터에 관한 교지내용에 대해 본원에 참고로 도입됨)에 기술된 바와 같이 이중화 벡터 주형으로서 적절히 제공될 수 있다. 이중화 벡터는 이량체성 자가-상보적(sc) 폴리뉴클레오티드(전형적으로는, DNA)이다. 이중화 벡터 게놈은 바람직하게는 선택된 파보바이러스 캡시드(예, AAV 캡시드) 내에서의 캡시드화를 위한 충분한 패키징 서열을 함유한다. 당해 분야에 숙련된 자라면 상기 이중화 vDNA가 모든 조건하에서 이중-가닥 형태로 존재하지 않을 수도 있지만, 상보적 뉴클레오티드 염기의 어닐링에 유리한 조건하에서 이중가닥 형태로 존재하는 능력을 가짐을 인지할 것이다. "이중화 파보바이러스 입자"는 하이브리드, 키메라 및 표적화 바이러스 입자를 포함한다. 바람직하게, 이중화 파보바이러스 입자는 AAV 캡시드를 가지며, 상기 캡시드는 또한 전술한 바와 같이 키메라 또는 표적화 캡시드일 수 있다.
바이러스 벡터 기능은 사물스키 등의 미국 특허 제 7,465,583 호(전체 개시내용이 이중화 벡터에 관한 교지내용에 대해 본원에 참고로 도입됨)에 기술된 바와 같이 이중화 벡터 주형으로서 적절히 제공될 수 있다. 이중화 벡터는 이량체성 자가-상보적(sc) 폴리뉴클레오티드(전형적으로는, DNA)이다. 예를 들어, 이중화 벡터의 DNA는 가닥간 염기 쌍형성으로 인해 이중-가닥 헤어핀 구조를 형성하도록 선택될 수 있다. 이중화 DNA 벡터의 두 가닥 모두는 바이러스 캡시드 내에 패키징될 수 있다. 이중화 벡터는 이중-가닥 DNA 바이러스 벡터에 필적하는 기능을 제공하며 통상적으로 바이러스에 의해 캡슐화되는 단일-가닥 게놈에 상보적인 DNA를 합성하기 위한 표적 세포의 필요를 경감시킬 수 있다.
바이러스 벡터에 사용하기 위해 선택된 TR(들)(분해성 및 비-분해성)은 바람직하게는 AAV 서열들이며, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5 및 6이 바람직하다. 분해성 AAV TR은, 상기 TR이 목적하는 기능, 예를 들어, 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 복구 등을 매개하는 한, 야생형 TR 서열을 갖지 않아도 된다(예를 들어, 야생형 서열은 삽입, 결실, 절두 또는 미스센스(missense) 돌연변이에 의해 변이될 수 있다). TR은 AAV 역 말단 반복 서열로 작용하는 합성 서열, 예를 들어, 전체 개시내용이 본원에 참고로 도입되는 사물스키 등의 미국 특허 제 5,478,745 호에 기술된 바와 같은 "이중-D 서열"일 수 있다. 반드시 그렇지는 않지만, 전형적으로, TR은 동일한 파보바이러스로부터 유도된다, 예를 들어, 2개의 TR 서열 모두 AAV2로부터 유도된다.
패키징 기능은 캡시드 성분을 포함한다. 캡시드 성분은 바람직하게는 파보바이러스 캡시드, 예를 들어, AAV 캡시드 또는 키메라 AAV 캡시드 기능으로부터 유도된다. 적절한 파보바이러스 바이러스 캡시드 성분의 예는 자율적 파보바이러스 또는 디펜도바이러스와 같은 파보바이러스과로부터의 캡시드 성분이다. 예를 들어, 캡시드 성분은 AAV 캡시드, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVrh74, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV Hu.26, AAV1.1(서열번호 15), AAV2.5(서열번호 13), AAV6.1(서열번호 17), AAV6.3.1(서열번호 18), AAV9.45, AAV2i8(서열번호 29), AAV2G9, AAV2i8G9, AAV2-TT(서열번호 31), AAV2-TT-S312N(서열번호 33), AAV3B-S312N 및 AAV-LK03, 및 아직 확인되지 않거나 비-인간 영장류 공급원으로부터의 다른 새로운 캡시드들로부터 선택될 수 있다. 캡시드 성분은 2개 이상의 AAV 캡시드로부터의 성분들을 포함할 수 있다.
보다 바람직한 실시양태에서, VP 캡시드 단백질 중 하나 이상은, 라비노위츠 등의 미국 특허 제 6,491,907 호에 기술된 바와 같이, 2개 이상의 바이러스, 바람직하게는 2개 이상의 AAV로부터의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질이다. 키메라 캡시드는 본원에서, a) 바이러스 수율, b) 면역 반응, c) 표적화, d) 탈-표적화 등을 변화시키기에 충분한 또 다른 혈청형과 조합된 1개 혈청형으로부터의 아미노산 잔기를 1개 이상 갖는 것으로 기술되어 있다.
또 다른 키메라 단백질은 본원에 참고로 도입되는 문헌[Li, et al., 2008, Mol. Ther. 16(7):1252-1260]에 나타낸 설명에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로, 방향적 진화를 통해 세포 유형-특이적 벡터를 개발하기 위해 DNA 셔플링-기반 접근방법을 이용하였다. 아데노-연관 바이러스(AAV) 혈청형 1 내지 9의 캡시드 게놈은 키메라 캡시드 라이브러리를 생성하기 위해 무작위로 단편화되고 PCR을 이용하여 재구성되었다. AAV1, 2, 8, 및 9로부터의 게놈 단편들을 함유하는 단일 감염성 클론(키메라-1829)을, AAV에 대해 낮은 허용성을 갖는 것으로 이전에 밝혀진 인테그린이 없는 햄스터 흑색종 세포주로부터 단리하였다. 분자 모델링 연구는 AAV2가 정20면체의 3중 대칭축에서 표면 루프에 기여하지만, AAV1 및 9는 각각 2중적 및 5중적 대칭 상호작용에 기여함을 시사한다. C-말단 도메인(AAV9)은 합리적인 돌연변이유발을 통한 흑색종 친화성의 중요한 구조적 결정인자로 확인되었다. 키메라-1829는 1차 수용체로서 헤파란 설페이트를 사용하고 모든 혈청형들보다 더 효율적으로 흑색종 세포를 형질도입시킨다. AAV 또는 다른 바이러스 캡시드 서열을 사용하여 대체 세포/조직 유형들에 상기 기술을 적용하면 인간 유전자 전이를 위한 벡터로서 새로운 부류의 생물 나노입자를 수득하기 쉽다.
패키징된 바이러스 벡터는 일반적으로, 형질도입된 세포에서 벡터 DNA의 패키징 및 변형된 FXN 유전자 서열의 후속 발현을 야기하기에 충분한, 본원에서 "전이유전자" 또는 "전이유전자 발현 카세트"로 지칭되는, 변형된 FXN 유전자 서열, 및 TR 요소들이 측면에 위치한 발현 조절 서열을 포함한다. 바이러스 벡터 기능은, 예를 들어, 플라스미드 또는 앰플리콘의 한 성분으로서 세포에 공급될 수 있다. 바이러스 벡터 기능은 세포주 내에서 염색체외에 존재할 수 있고/있거나 세포의 염색체 DNA내에 통합될 수 있다.
전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주입, 양이온 또는 음이온성 리포좀, 및 핵 위치 신호와 병용되는 리포좀을 포함하나 이로 한정되지는 않는, 복제 및 패키징을 위해 바이러스 벡터 기능을 갖는 뉴클레오티드 서열을 세포성 숙주내에 도입시키는 임의의 방법을 이용할 수 있다. 바이러스 벡터 기능이 바이러스 벡터를 사용한 형질감염에 의해 제공되는 실시양태에서는, 바이러스 감염을 야기하기 위한 표준 방법을 이용할 수 있다.
패키징 기능
패키징 기능은 바이러스 벡터 복제 및 패키징을 위한 유전자를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 패키징 기능은, 필요한 대로, 바이러스 유전자 발현, 바이러스 벡터 복제, 통합 상태로부터 바이러스 벡터의 방출, 바이러스 유전자 발현, 및 바이러스 입자내로의 바이러스 벡터의 패키징에 필수적인 기능들을 포함할 수 있다. 패키징 기능은 플라스미드 또는 앰플리콘, 바큘로바이러스(Baculovirus) 또는 HSV 헬퍼 구조물과 같은 유전자 구조물을 사용하여 패키징 세포에 함께 또는 따로따로 공급될 수 있다. 패키징 기능은 패키징 세포내에서 염색체외에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 세포의 염색체 DNA내에 통합된다. 예로는 AAV Rep 및 Cap 단백질을 암호화하는 유전자가 포함된다.
헬퍼 기능
헬퍼 기능은 바이러스 벡터의 패키징을 개시하기 위해 필요한, 패키징 세포의 활성 감염을 수립하기 위해 필요한 헬퍼 바이러스 요소들을 포함한다. 예로는 바이러스 벡터의 패키징을 제공하기에 충분한 아데노바이러스, 바큘로바이러스 및/또는 헤르페스 바이러스로부터 유도된 기능들이 포함된다. 예를 들어, 아데노바이러스 헬퍼 기능은 전형적으로 아데노바이러스 성분 E1a, E1b, E2a, E4, 및 VA RNA를 포함한다. 패키징 기능은 필요한 바이러스로 패키징 세포를 감염시킴으로써 공급될 수 있다. 패키징 기능은 플라스미드 또는 앰플리콘과 같은 유전자 구조물을 사용하여 패키징 세포에 함께 또는 따로따로 공급될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Rabinowitz et al., 2002, J. Virol. 76:791]에 기술된 바와 같은 pXR 헬퍼 플라스미드, 및 문헌[Grimm et al., 1998, Human Gene Therapy 9:2745-2760]에 기술된 pDG 플라스미드를 참조하시오. 패키징 기능은 패키징 세포내에서 염색체외에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 세포의 염색체 DNA(예를 들어, HEK293 세포에서 E1 또는 E3)내에 통합된다.
임의의 적합한 헬퍼 바이러스 기능이 사용될 수 있다. 예를 들어, 패키징 세포가 곤충 세포인 경우, 바큘로바이러스가 헬퍼 바이러스의 역할을 할 수 있다. 헤르페스 바이러스도 또한 AAV 패키징 방법에서 헬퍼 바이러스로 사용될 수 있다. AAV Rep 단백질(들)을 암호화하는 하이브리드 헤르페스 바이러스는 보다 확장가능한 AAV 벡터 생성 계획을 유리하게 촉진할 수 있다.
전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주입, 양이온 또는 음이온성 리포좀, 및 핵 위치 신호와 병용되는 리포좀을 포함하나 이로 한정되지는 않는, 복제 및 패키징을 위해 헬퍼 기능을 갖는 뉴클레오티드 서열을 세포성 숙주내에 도입시키는 임의의 방법을 이용할 수 있다. 헬퍼 기능이 바이러스 벡터를 사용한 형질감염 또는 헬퍼 바이러스를 사용한 감염에 의해 제공되는 실시양태에서는, 바이러스 감염을 야기하기 위한 표준 방법을 이용할 수 있다.
패키징 세포
당해 분야에 공지되어 있는 임의의 적합한 허용 세포 또는 패키징 세포를 패키징된 바이러스 벡터의 생성에 사용할 수 있다. 포유동물 세포 또는 곤충 세포가 바람직하다. 본 발명의 실행에 있어서, 패키징 세포의 생성에 유용한 세포의 예로는, 예를 들어, 인간 세포주, 예를 들어, VERO, WI38, MRC5, A549, HEK 293 세포(구성적 프로모터의 조절하에 기능성 아데노바이러스 E1을 발현함), B-50 또는 임의의 다른 HeLa 세포, HepG2, Saos-2, HuH7, 및 HT1080 세포주가 포함된다. 한 양태에서, 패키징 세포는 현탁 배양으로 성장할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 세포는 무혈청 배양으로 성장할 수 있다. 한 실시양태에서, 패키징 세포는 무혈청 배지중에서 현탁액중에서 성장하는 HEK293이다. 또 다른 실시양태에서, 패키징 세포는 미국 특허 제 9,441,206 호에 기술되고 ATCC 수탁번호 PTA 13274로 기탁된 HEK293 세포이다. WO 2002/46359 호에 개시된 세포주들을 포함하나 이로 한정되지는 않는 많은 rAAV 패키징 세포주들이 당해 분야에 공지되어 있다.
패키징 세포로 사용하기 위한 세포주로는 곤충 세포주가 포함된다. AAV의 복제를 허용하고 배양물중에서 유지될 수 있는 임의의 곤충 세포가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예로는 Sf9 또는 Sf21 세포주와 같은 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포주, 초파리(Drosophila)속 세포주, 또는 모기 세포주, 예를 들어, 흰줄숲모기(Aedes albopictus) 유래 세포주가 포함된다. 바람직한 세포주는 스포돕테라 프루기페르다 Sf9 세포주이다. 하기의 참조문헌들이, 이종 폴리펩티드의 발현을 위한 곤충 세포의 사용, 상기 세포내에 핵산을 도입하는 방법, 및 배양물중에서 상기 세포를 유지하는 방법에 관한 교지내용에 대해 본원에 참고로 도입된다: 문헌[Methods in Molecular Biology, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995); O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994); Samulski et al., 1989, J. Virol. 63:3822-3828; Kajigaya et al., 1991, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-4650; Ruffing et al., 1992, J. Virol. 66:6922-6930; Kimbauer et al., 1996, Virol. 219:37-44; Zhao et al., 2000, Virol. 272:382-393]; 및 사물스키 등의 미국 특허 제 6,204,059 호.
본 발명에 따른 바이러스 캡시드는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여, 예를 들어, 바큘로바이러스로부터의 발현에 의해 생성될 수 있다[Brown et al., (1994) Virology 198:477-488]. 또 다른 대안으로서, 본 발명의 바이러스 벡터는, 예를 들어, 문헌[Urabe et al., 2002, Human Gene Therapy 13:1935-1943]에 기술된 바와 같이 rep/cap 유전자 및 rAAV 주형을 전달하기 위해 바큘로바이러스 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 생성될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 바큘로바이러스 벡터의 폴리헤드린 암호화 영역내에 AVV Rep 및 Cap 암호화 유전자를 조작하고 숙주 세포내에 형질감염시켜 바이러스 재조합체를 생성함으로써 AVV Rep 및 Cap 암호화 영역을 갖도록 바큘로바이러스 패키징 시스템 또는 벡터가 구성될 수 있는, 곤충 세포에서 rAAV를 생성하는 방법을 제공한다. 특히, AAV에 바큘로바이러스 생성을 이용하는 경우, 바람직하게 AAV DNA 벡터 생성물은, AAV ITR에 대한 돌연변이를 이용하지 않는 분자와 같이 자가-상보적 AAV이다. 상기 AAV는 기능성 Rep 효소 활성의 결여로 인해 자가-상보적 DNA 분자를 생성하는 곤충 세포에서 불충분한 AAV rep 니킹(nicking)의 부산물인 것으로 생각된다. 숙주 세포는 바큘로바이러스-감염된 세포이거나 그 안에 바큘로바이러스 헬퍼 기능을 암호화하는 추가의 핵산이 도입되거나 그 안에 상기 바큘로바이러스 헬퍼 기능을 포함한다. 상기 바큘로바이러스 바이러스는 AAV 성분들을 발현할 수 있으며, 이어서 캡시드의 생성을 촉진할 수 있다.
생성시, 패키징 세포는 일반적으로 바이러스 벡터의 복제 및 패키징을 제공하기에 충분한 헬퍼 기능 및 패키징 기능과 함께 하나 이상의 바이러스 벡터 기능을 포함한다. 상기 다양한 기능들은 플라스미드 또는 앰플리콘과 같은 유전자 구조물을 사용하여 패키징 세포에 함께 또는 따로따로 공급될 수 있으며, 이들은 세포주내에서 염색체외에 존재하거나 세포의 염색체내에 통합될 수 있다.
임의의 하나 이상의 언급한 기능들이 이미 혼입된 세포, 예를 들어, 하나 이상의 벡터 기능이 염색체외에 혼입되거나 세포의 염색체 DNA내에 통합된 세포주, 하나 이상의 패키징 기능이 염색체외에 혼입되거나 세포의 염색체 DNA내에 통합된 세포주, 또는 헬퍼 기능이 염색체외에 혼입되거나 세포의 염색체 DNA내에 통합된 세포주가 공급될 수 있다.
rAAV 정제
rAAV 벡터는 컬럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배와 같이 당해 분야에서 표준인 방법에 의해 정제할 수 있다. rAAV 벡터를 정제하기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 문헌[Clark et al., 1999, Human Gene Therapy 10(6):1031-1039; Schenpp and Clark, 2002, Methods Mol. Med. 69:427-443]; 미국 특허 제 6,566,118 호 및 WO 98/09657 호에 기술된 방법들을 포함한다.
치료 방법
변형된 FXN 유전자는 프리드라이히 운동실조증 연관 장애, 예를 들어, 프리드라이히 운동실조증과 연관된 퇴행성 신경-근육 장애 및/또는 심근증의 유전자 치료에 사용될 수 있다. FXN 유전자의 암호화 서열에서의 하나 이상의 돌연변이로 인해 FXN이 부적절하게 발현되기 때문에, 예를 들어, 부정확한 아미노산 서열을 가지거나 부적당한 조직에서 또는 부적당한 시간에 발현되거나 부족하게 발현되기 때문에 개체는 유전자 치료를 필요로 할 수 있다. 본 발명의 변형된 FXN 유전자는 단백질 프라탁신의 생성을 증대시켜 미토콘드리아에서 에너지 생성을 증가키시는 유전자 치료로서 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제 9,066,966 호 참조).
본 발명의 벡터들의 표적 세포는 프라탁신을 발현할 수 있는 세포, 예를 들어, 포유동물의 심장계의 세포, 뉴런 세포, 근육 세포, 및 프라탁신 활성을 갖는 단백질을 생성하도록 전구체를 가공하는 적절한 세포 기관을 갖는 다른 세포이다.
약학 조성물
특정 실시양태에서, 본 발명은 프라탁신의 감소된 발현에 의해 매개되거나 그와 연관된 질환 또는 병태, 예를 들어, 프리드라이히 운동실조증을 예방하거나 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 세포에서 FXN의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 변형된 FXN 유전자를 포함하는 벡터를 치료 효과량으로 포함한다. 상기 조성물은 변형된, 예를 들어, 최적화된, FXN을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하며, 이때 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 다른 약제, 약학 물질, 담체, 보조제, 희석제 등을 추가로 포함한다. 주입시, 담체는 전형적으로 액체일 것이다. 주입 매질로서, 주입 용액에 통상적인 첨가제, 예를 들어, 안정화제, 염 또는 식염수, 및/또는 완충제를 함유하는 물을 사용하는 것이 바람직하다.
예시적인 약학적으로 허용되는 담체로는 멸균성, 발열원-비함유수 및 멸균성, 발열원-비함유 인산 완충 식염수가 포함된다. 생리적으로 허용되는 담체는 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 약학적으로 허용되는 담체는 생물학적으로나 달리 바람직하지 않지 않은 것들이다. 즉, 상기 물질은 물질의 유리한 생물학적 효과를 능가하는 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않고 대상에게 투여될 수 있다.
약학 조성물은, 예를 들어, 생체외에서 세포의 형질감염에 사용되거나 바이러스 벡터 또는 세포를 대상에게 직접 투여하는데 사용될 수 있다.
변형된 FXN 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 벡터는 바람직하게는 생물학적으로 효과적인 양으로 세포에 투여된다. 바이러스 벡터가 생체내에서 세포에 투여되는(예를 들어, 바이러스가 하기에서 기술하는 바와 같은 대상에게 투여되는) 경우, 바이러스 벡터의 생물학적 효과량은 표적 세포에서 전이유전자의 형질도입 및 발현을 야기하기에 충분한 양이다.
한 실시양태에서, 본 발명은, 핵산을 단독으로, 또는 프라탁신을 암호화하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터(플라스미드, 바이러스, 나노입자, 리포좀, 또는 세포에 핵산을 제공하기 위한 임의의 공지된 방법 포함)중에서 세포에 투여함으로써 세포에서 프라탁신의 수준을 증가시키는 방법을 포함한다. 상기 방법은, 프라탁신을 암호화하는 mRNA의 수준 및/또는 발현된 프라탁신 단백질의 수준이 핵산이 투여되지 않은 다른 동일한 세포에서의 프라탁신(mRNA 및/또는 단백질)의 수준보다 검출가능하게 더 큰 방법을 포함한다. 숙련된 전문가라면 세포가 시험관내에서 배양되거나 성장될 수 있거나 유기체중에(즉, 생체내) 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 세포는 세포내 프라탁신의 수준이 증가될 수 있도록 내인성 프라탁신을 발현할 수 있고/있거나, 세포는, 특히 인간 프라탁신에 대한 하나보다 많은 야생형 대립유전자가 존재할 수 있기 때문에 야생형 프라탁신, 예를 들어, 서열번호 2의 서열을 갖는 프라탁신의 돌연변이체 또는 변이체인 내인성 프라탁신을 발현할 수 있다. 따라서, 프라탁신의 수준은 다른 동일하지만 미처리된 세포에서 발현된 프라탁신의 수준에 비해 증가된다.
본 발명의 또 다른 양태는 생체내에서 변형된 유전자를 함유하는 벡터로 대상을 치료하는 방법이다. 그를 필요로 하는 인간 대상 또는 동물에게 벡터를 투여하는 것은 바이러스 벡터를 투여하기 위한 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의할 수 있다.
벡터는 치료 표준에 더해서 및 치료 표준에 부가로서 투여될 수 있다. 즉, 벡터는 또 다른 치료제 또는 화합물과 동시에, 같은 시기에, 또는 통상적인 방법을 이용하여 당해 분야에 숙련된 자가 결정하는 바와 같은 결정된 투여 간격으로 동시-투여될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 rAAV는 rAAV-FXN 벡터와 같거나 다른 캡시드 단백질을 포함하는 빈 캡시드(즉, 핵산 분자를 함유하지 않는 바이러스 캡시드)와 동시-투여될 수 있다. 이것은 당해 분야에 숙련된 자라면 빈 캡시드의 동시-투여가 본 발명의 rAAV의 면역 반응, 예를 들어, 중화 반응을 감소시킬 수 있음을 이해할 것이기 때문이다. 즉, 빈 캡시드는, 예를 들어, WO 2015/013313 호에서 논의된 바와 같은 rAAV-FXN 벡터가 중화 항체(Nab) 면역 반응을 방지하게 하는 디코이(decoy)로서 작용할 수 있다.
예시적인 투여 방식은 정맥내, 피하, 피내, 근육내 및 관절내 투여 등뿐 아니라 직접적인 조직 또는 장기 주사를 포함하나 이로 한정되지 않는 전신 투여이다.
한 실시양태에서, 벡터는 전신적으로 투여된다. 당해 분야에 숙련된 자라면 전신 투여가 FXN을 암호화하는 치료 유전자를 그중에서 FXN의 감소된 수준에 의해 발병된, 모든 근육을 포함한 모든 조직에 전달할 수 있음을 인지할 것이다.
그럼에도 불구하고, 숙련된 전문가라면 벡터가 FXN 결핍에 의해 발병된 부위들, 즉, 뇌 및 심장으로 직접 전달될 수 있음을 인지할 것이다.
따라서, 다른 바람직한 실시양태에서, 변형된 FXN 유전자를 포함하는 본 발명의 벡터는 심장 또는 중추 신경계(CNS) 조직내에 직접 주사에 의해 투여된다.
한 실시양태에서, FXN을 암호화하는 변형된 핵산, 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물은 척추강내, 신경내, 대뇌내, 뇌실내 투여를 포함하여 두개내로 전달된다.
한 실시양태에서, FXN을 암호화하는 변형된 핵산, 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물은, 심외막 주사 후 최소개흉술에 의해, 관상동맥내 주사에 의해, 심내막심근 주사에 의해 또는 심장에 유용한 또 다른 유형의 주사에 의해 심근내에 직접 투여됨으로써 심장에 전달된다.
또 다른 투여 경로는 또한 직접적 기관노출(visualization) 하의 벡터의 국소 적용, 예를 들어, 표면 피질 적용 또는 다른 비-정위적(nonstereotactic) 적용을 포함할 수 있다. 벡터는 또한, 예를 들어, 척추강내로 심실내에 전달되거나 정맥내 주사에 의해 전달될 수 있다.
본 발명 벡터의 표적 세포는 프리드라이히 운동실조증과 연관된 심근증으로 고통받는 대상의 심근 세포이다. 바람직하게, 상기 대상은 인간 성인 또는 아동이다. 그러나, 척추동물 적용도 또한 고려된다.
본 발명 벡터의 표적 세포는 또한 CNS, 바람직하게는 뉴런 세포를 포함한다. 프리드라이히 운동실조증의 신경퇴행적 양상을 치료하기 위한 뇌로의 전달은 척추강내 투여에 의할 수 있다.
한 양태에서, FXN을 암호화하는 변형된 핵산, 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물은 FA 연관 심근증 및/또는 상기 질환의 신경퇴행적 양상을 치료하기 위해 전신적으로, 예를 들어, 정맥내로 전달된다.
또 다른 실시양태에서, 벡터는 2개 이상의 경로에 의해 투여된다. 즉, 벡터는 전신적으로 및 또한 뇌 및/또는 심장내로 직접, 또는 그의 임의의 조합으로 투여될 수 있다.
2개 이상의 경로에 의해 수행되는 경우, 벡터의 투여는 동시적이거나 같은 시기에 일어날 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다. 대신, 상이한 경로를 통한 투여는 각 투여 사이의 시간 간격하에 별개로 수행될 수 있다. 적절한 투여 요법은 각 개별적 환자에 대해 최대 치료 이익을 달성하도록 당해 분야에 숙련된 자에 의해 통상적으로 결정된다.
한 양태에서, 본 발명은, 대상에서 프라탁신의 수준을 증가시키는데 사용하기 위한, 벡터 또는 약학 조성물 중 핵산을 포함하나 이로 한정되지는 않는 본 발명의 프라탁신을 암호화하는 1개 이상의 변형된 핵산을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은, 대상에서 프리드라이히 운동실조증을 치료하는데 사용하기 위한, 1개 이상의 변형된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 rAAV 벡터, 및 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
상기 용도는, 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같은 FRDA에 대한 치료 표준에 더해서 및/또는 상기 치료 표준과 함께, 변형된 핵산 또는 상기 변형된 핵산을 포함하는 벡터를 투여함을 포함한다.
주사가능물질은 액체 용액 또는 현탁액, 주사전 액체중에서의 용해 또는 현탁에 적합한 고체 형태로서, 또는 유화액으로서, 통상적인 형태로 제조될 수 있다.
변형된 FXN 유전자를 갖는 바이러스 벡터의 투여량은 투여 방식, 치료될 질환 또는 병태, 개별적인 대상의 상태, 특정 바이러스 벡터, 및 전달될 유전자에 따라 달라질 것이며, 통상적인 방식으로 결정될 수 있다. 치료 효과를 달성하기 위한 예시적인 투여량은 적어도 약 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015 형질도입 단위 이상, 바람직하게는 약 108 내지 1013 형질도입 단위, 보다 더 바람직하게는 1012 형질도입 단위/체중 kg의 바이러스 역가이다.
변형된 FXN 유전자는 표적 세포에서의 발현에 적절한 조절 요소를 갖는 DNA 분자의 성분들로서 투여될 수 있다. 변형된 FXN 유전자는 rAAV 벡터와 같은 바이러스 플라스미드의 성분들로서 투여될 수 있다. 바이러스 입자는, 문맥 혈관계로의 생체내 직접 전달로서든지 또는 치료받은 후 형질도입된 세포를 공여체내에 다시 도입시킨 동물로부터의 세포로 벡터 바이러스 입자를 시험관내에서 투여함을 포함하는 생체외 치료로서든지, 바이러스 입자 단독으로서 투여될 수 있다.
등가물
상기 기재된 명세서는 당해 분야에서 숙련된 자가 본 개시내용을 실행할 수 있게 하는데 충분한 것으로 간주된다. 상기 설명 및 실시예는 개시내용의 특정한 예시적인 실시양태를 상술한다. 그러나, 상기 설명이 본문에서 아무리 상세하게 나타날 수 있다 해도, 개시내용은 많은 방식으로 실행될 수 있으며 개시내용은 첨부된 특허청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 함을 인지할 것이다.
특허, 특허출원, 논문, 텍스트북 등을 포함하여 본원에 인용된 모든 참조문헌, 및 그 안에 인용된 참조문헌들은, 아직 도입되지 않은 정도까지, 전체적으로 본원에 참고로 도입된다.
예시적 실시양태
본 발명은 하기의 실험 실시예를 참조로 더 상세히 기술된다. 이들 실시예는 오직 예시의 목적으로 제공되며, 달리 명시되지 않는 한 제한하려는 것이 아니다. 따라서, 본 발명은 결코 하기 실시예들로 제한되는 것으로 해석해서는 안되며, 오히려 본원에 제공된 교지내용의 결과로서 명백해지는 모든 변화들을 포함하는 것으로 해석해야 한다.
실시예
실시예 1: 자가-상보적 rAAV - FXN 구조물의 생성
재료 및 방법
벡터 구성
자가-상보적 AAV 게놈을 암호화하는 pTRs-KS-CBh-EGFP-bGHpolyA 구조물(도 3에 다이어그램으로 나타냄)을 전이유전자 발현 구조물의 주쇄로 사용하였다[Gray et al., 2011, Human Gene Therapy 22:1143-1153]. 2개의 코돈 최적화된 FXN 유전자 삽입물이 pUC57 중에 GenScript로부터 배열되었고(즉, Genscript 및 Genscript(저 CpG)), 주쇄 벡터에서 EGFP를 대체하기 위해 사용되었다. Genscript(서열번호 6) 및 Genscript(저 CpG)(서열번호 7) 변형된 FXN 유전자는 각각 도 3에 예시된 바와 같이 CBh 프로모터에 작동가능하게 연결되었다. GenScript FXN(서열번호 6 및 7) 구조물은, 모두 도 2e(Genscript) 및 2f(Genscript(저 CpG))에 도시된 바와 같이, N-말단 AgeI 부위, FXN 정지 코돈의 하류에 콜라겐 안정성 서열(CSS)(5'-CCCAGCCCACTTTTCCCCAA-3'), CSS의 하류에 소 성장 호르몬(BGH) 폴리A 서열, 및 BGH 폴리A의 하류에 MluI 부위를 포함하였다. pTRs-KS-CBh-FXN-bGHpolyA 구조물 내로의 삽입을 위한 예시적인 삽입물은 도 2a 내지 2f에 도시되어 있고 표 8에 나타내었다. 보다 특히, 야생형 프라탁신 유전자(WT FXN; 서열번호 2)를 pTRs-KS-CBh-WT FXN-bGHpolyA 내에 클로닝하였고(도 2a); IDT1 변형된 FXN 유전자(서열번호 11)는 pTRs-KS-CBh-IDT1-bGHpolyA 내에 클로닝하였고(도 2b); IDT3 저 발현인자 변형된 FXN 유전자를 암호화하는 핵산(서열번호 8)은 pTRs-KS-CBh-IDT3-bGHpolyA 내에 클로닝하였고(도 2c); IDT4 변형된 FXN 유전자(서열번호 12)는 pTRs-KS-CBh-IDT4-bGHpolyA 내에 클로닝하였으며(도 2d); Genscript(대조군) 변형된 FXN 유전자(서열번호 6)는 pTRs-KS-CBh-Genescript-bGHpolyA 내에 클로닝하였고(도 2e); Genscript(저 CpG) 변형된 FXN 유전자(서열번호 7)는 pTRs-KS-CBh-Genescript(저 CpG )-bGHpolyA 내에 클로닝하였다(도 2f). FXN 유전자를 암호화하는 각각의 삽입물은 벡터내에 클로닝하였고, 상기 유전자는 5' 측면에 AgeI 부위 및 3' 측면에 AvrII 절단 부위에 이어, AvrII 부위 다음에 CSS 서열, CSS 다음에 SpeI 절단 부위, SpeI 절단 부위 다음에 bGHpolyA 신호 서열, 및 polyA 신호 서열 다음에 MluI 절단 부위가 측면에 위치하였다.
주쇄 pTRs-KS-CBh-EGFP-bGHpolyA 및 FXN 유전자 구조물을 AgeI 및 MluI(각각 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), R0552S 및 R0198S)로 절단하고, 겔 추출하고, ExTaq 폴리머라제(클론테크(Clontech), RR001A)를 사용하여 접합시켰다. 접합 반응물을 SURE 세포(에이질런트(Agilent), 200227) 내에 형질전환시키고, 37 ℃에서 SOC 회수 배지(Cat. No. 15544-034, 인비트로겐(Invitrogen)) 중에 1 시간동안 놓아 둔 후, 암피실린(10 mg/ml)을 함유한 LB 플레이트 상에 플레이팅하였다. 콜로니들을 서열분석하고 바이러스 생성을 위한 증폭을 위해 선택하였다. AAV 혈청형 2 캡시드를 갖는 재조합 AAV(rAAV) 벡터를 기술된 바와 같이[Grieger et al., 2006, Nature Protocols 1:1412-1428] 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포에서 3중-형질감염 방법에 의해 UNC 벡터 코어(UNC Vector Core)로 생성하였다. 또는, 혈청형 2i8 캡시드(서열번호 28의 아미노산 서열)를 갖는 rAAV 벡터를 유사하게 생성하였다. 자가-상보적 게놈을 함유하는 매우 순수한 재조합 바이러스를 비-이온 이오딕사놀 구배에 통과시킨 후 이온 교환 크로마토그래피에 의해 회수하였다. 피크 분획들을 qPCR로 측정한 다음 5% d-솔비톨을 함유하는 포스페이트-완충 식염수(PBS)에서 투석시켰다. 바이러스 역가는 qPCR에 의해 측정하였다[Gray et al., 2010, J. Amer. Soc. Gene Therapy 18:570-578]. 시험관내에서 1차 검사(하기) 후에, GenScript(저 CpG)를 사용하여 pTRs-KS-CBh-Genescript (low CpG )-bGHpolyA 중 FXN 정지 코돈 앞에 삽입된 HA 태그 TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT를 갖는 구조물을 생성하였다.
노스캐롤라이나 대학교(The University of North Carolina, UNC) 벡터 코어는 rAAV TK 혈청형을 갖는 FXN-HA 구조물을 갖는 바이러스를 생성하였다.
sc rAAV - FXN의 시험관내 검사
HEK293(ATCC: CRL-1573) 및 HeLa(ATCC: CCL-2) 세포를 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM, 깁코(Gibco)) 중에서 유지시켰다. 세포 성장 배지는 9% 태아 소 혈청(FBS, 깁코), 3.4 mM l-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(깁코)으로 보충하였다. 세포는 37 ℃에서 5% CO2 대기중에서 유지하였다. 딥스틱 분석: 세포를 24-웰 플레이트에 접종시켜 24 시간(h)에 약 60% 밀집도에 도달시킨 다음, 10,000(VG/세포)의 MOI에서 scAAV-FXN(본원에서 "rAAV-FXN" 또는 "rAAV-FXN-HA"로 상호교환적으로 지칭됨)으로 3중으로 모의 처리하거나 감염시켰다. 형질도입 60 시간후에(h p.t.) 세포를 프라탁신 단백질 정량 딥스틱 분석(Frataxin Protein Quantity Dipstick Assay, 압캠(Abcam), ab109881)에 대한 제조사의 프로토콜에 따라 처리하였다. 데이터는 이미지J(ImageJ)를 이용하여 처리하였다.
웨스턴 블로팅 :
세포를 6-웰 플레이트에 접종시켜 24 시간에 약 60% 밀집도에 도달시킨 다음, 10,000(VG/세포)의 MOI에서 scAAV-FXN으로 모의 처리하거나 감염시켰다. 형질도입 60 시간후에 세포 용해 완충액(0.0625 M 트리스(Tris)-HCl pH 6.8, 10% 글리세롤, 2% SDS, 5% 2-머캅토에탄올, 0.02%(w/v) 브로모페놀 블루)으로 세포를 용해시켰다. 15 ㎕의 HeLa 단백질 용해물을 15 내지 4% TGX 겔 상에서 겔 전기영동에 의해 분리하고, 단백질을 니트로셀룰로스 막(NCM)에 일렉트로블로팅하였다. PBS-T 중의 5% 무지방 분유를 사용하여 NCM을 차단하였다. 항-프라탁신 항체(압캠, 18A5DB1)를 5% 우유를 함유한 PBS-T 중에서 사용하였다. 5% 우유 함유 PBS-T 중의 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 2차 항체를 사용하여 항-프라탁신의 존재를 검출하였다. 웨스턴브라이트 ECL 웨스턴 블로팅 검출 키트(WesternBright ECL Western Blotting Detection kit)(어드밴스타(Advansta), K-12045-D50)를 제조사의 지시에 따라 검출에 사용하였다.
도 1a 및 1b는 HeLa 세포에서 FXN을 암호화하는 비최적화, 즉, 야생형 서열(서열번호 1)의 발현과 비교한 다양한 최적화된 서열들의 발현에 대한 결과를 나타낸다. 보다 특히, 도 1a 및 1b는 둘 다 프라탁산을 암호화하는 삽입물을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 HeLa 세포에서 프라탁신(FXN)의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯의 사진을 나타낸다. 도 1a는 1 초동안 노출된 웨스턴브라이트 블롯 필름의 사진에서 HeLa 세포에서의 FXN의 발현을 나타낸다. 도 1b는 1 초동안 노출된 웨스턴브라이트 블롯 필름의 사진에서 나타낸 바와 같이 HeLa 세포에서 FXN의 발현을 보여주는 도 1a에 나타낸 실험의 반복을 나타낸다. 도 1a 및 1b에서 각각의 겔 열들은 FXN을 암호화하는 야생형 핵산 서열로부터의 발현과 비교한, 본 발명의 변형된 FXN 유전자로부터의 FXN의 발현을 나타낸다. 즉, 1열은 FXN을 암호화하는 야생형 비-변형된 핵산(서열번호 2)에 의해 유도된 발현을 나타내고; 2열은 IDT2 변형된 FXN 유전자(서열번호 3)에 의해 유도된 발현을 나타내고; 3열은 IDT5 변형된 FXN 유전자(서열번호 9)에 의해 유도된 발현을 나타내고; 4열은 JCAT 변형된 FXN 유전자(서열번호 4)에 의해 유도된 발현을 나타내고; 5열은 GeneArt 변형된 FXN 유전자(서열번호 5)에 의해 유도된 발현을 나타내고; 6열은 GenScript(대조군) 변형된 FXN 유전자(서열번호 6)에 의해 유도된 발현을 나타내고; 7열은 Genscript(저 CpG) 변형된 FXN 유전자(서열번호 7)에 의해 유도된 발현을 나타내고; GFP 열은 FXN을 암호화하는 핵산을 대신하는 삽입물에 의해 암호화되는, 검출 마커인 녹색 형광 단백질을 암호화하는 전이유전자의 발현을 나타낸다.
나타낸 데이터는 여러개의 변형된 FXN 핵산 서열들[특히 4열(JCAT), 5열(GeneArt), 6열(Genscript) 및 7열(Genscript 저CpG)]이 야생형 핵산 서열(1열)에 비해 HeLa 세포에서 프라탁신의 더 큰 발현을 제공하였음을 입증한다. 각 열에서 액틴 부하 대조군은 단백질 부하 대조군으로서 사용된다.
전형적으로 서열중 뉴클레오티드의 총수의 백분율로서 나타내는, 핵산 서열중 GC 뉴클레오티드 함량은, 증가되는 mRNA의 안정성, 및 전형적으로 증가된 GC 함량에 의해 불리하게 영향을 받는 2차 구조 및 전이유전자를 포함하나 이로 한정되지는 않는 다수의 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 숙련된 전문가라면 변형된 핵산의 GC 함량이, 불리한 영향에 대해, 예를 들어, 증가된 GC 함량에 의해 매개된 2차 구조에 대해 핵산의 안정성과 그로부터 전사된 mRNA 사이의 균형을 반영함을 인지할 것이다.
CAI(코돈 적응 지수)는 동의 코돈 사용빈도 편향의 척도이다. 상기 지수는 각 코돈의 상대값을 평가하기 위해 한 종으로부터 고도로 발현된 유전자들의 기준 집합을 사용하며, 유전자에 대한 점수는 그 유전자 내의 모든 코돈들의 사용 빈도로부터 산출된다. 상기 지수는, 선택이 코돈 사용빈도 패턴을 선택하는데 효과적이었던 정도를 평가한다. 상기 지수는 유전자의 발현 수준을 예측하고 상이한 유기체/종에서 코돈 사용빈도를 비교하기 위해 사용될 수 있다. 인간 코돈 최적화는 하기 요인들의 균형을 달성하기 위해 프라탁신 유전자에 수행되었다:
전사 효율 - GC 함량, CpG 다이뉴클레오티드 함량, 잠재성 스플라이싱 부위 등;
번역 효율 - 코돈 사용빈도 편향, GC 함량, mRNA 2차 구조, 미성숙 폴리A 부위, RNA 불안정성 모티프, 내부 리보좀 결합 부위; 및
단백질 재접힘 - 코돈 사용빈도 편향, 코돈과 안티-코돈의 상호작용, RNA 2차 구조.
기본적으로, 코돈 최적화는 상기 변수들의 균형을 이루어서, 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 바람직하게는 프라탁신 유전자 서열의 더 높은 발현을 달성하고, 메시지(GC 함량, DNA 및 RNA 둘 다에서의 2차 구조)의 안정성을 증가시키는 등을 이룬다.
CpG 섬은 형질도입된 세포에서 Tol-유사 수용체 9(TLR9)에 의해 인식될 수 있으며 외래(외인성) DNA에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 CpG 섬의 수가 프라탁신을 암호화하는 야생형 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 2) 중 CpG 섬 모티프의 수에 비해 감소된, 프라탁신을 암호화하는 변형된 핵산을 포함한다.
본원에 예시된 각각의 변형된 FXN 유전자에 대한 CAI, 퍼센트 GC 함량, 및 잠재적 CpG 섬 영역의 수를 하기 표 1에 나타내었다.
도 1a 및 1b
겔 열 번호		 FXN 유전자 이름 코돈 적응 지수 (CAI) %GC 함량 잠재적 CpG 섬
영역의 수		 서열번호
1 WT-FXN 0.71 55 128 2
뉴클레오티드 서열 22 0.71 55 -- 10
IDT-1 0.73 52 114 11
2 IDT-2 0.76 56 124 3
IDT-3 0.80 57 123 8
IDT-4 0.74 54 123 12
3 IDT-5 0.77 55 124 9
4 JCAT 0.98 69 144 4
5 GeneART 0.95 61 117 5
6 Genescript (대조군) 0.87 57 257 6
7 Genescript (저 CpG) 0.86 55 117 7
즉, FXN을 암호화하는 야생형 핵산(WT-FXN; 서열번호 2)의 경우, 핵산 서열은 0.71의 CAI 및 55%의 % GC 함량을 나타낸다. 대조적으로, JCAT 변형된 FXN 유전자는 0.98의 CAI 및 69%의 GC 함량을 나타내며, 이들은 둘 다 WT-FXN에 대한 값보다 실질적으로 더 높다.
잠재적 CpG 섬은 http://www.bioinformatics.org/sms2/cpg_islands.html에서 찾은 대중적으로 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 확인하였다. CpG 섬 소프트웨어는 문헌[Gardiner-Garden and Frommer, 1987, J. Mol. Biol. 196(2):261-282]에 기술된 방법을 이용하여 잠재적 CpG 섬 영역들을 기록하였다. 계산은 1 bp 간격으로 서열을 가로질러 이동하는 200 염기쌍(bp) 창을 사용하여 수행하였다. CpG 섬은 Obs/Exp 값이 0.6보다 크고 GC 함량이 50%보다 큰 서열 범위로 정의된다. 한 창에서 CpG 이량체의 예상된 수는 창 길이로 나눈, 창 중 "G"의 수를 곱한 창 중 "C"의 수로서 산출되었다. 따라서, 핵산 서열에 존재하는 잠재적 CpG 섬은 소프트웨어에 의해 제공된 창 내에 문제의 서열을 입력함으로써 용이하게 측정될 수 있다("미가공 서열 또는 하나 이상의 FASTA 서열을 텍스트 영역 아래에 복사하여 붙인다. 입력 한계는 100000개의 문자이다"에 대한 설명으로 나타냄). CpG 섬은 종종 척추동물 유전자의 5' 영역에서 발견되므로, 상기 프로그램은 게놈 서열내 잠재적 유전자를 강조하기 위해 사용될 수 있다.
높은 발현 수준 및 높은 GC 함량(55%), 높은 CAI(0.86) 및 CpG 다이뉴클레오티드의 적은 수(117)로 인해, Genscript(저 CpG) 변형된 FXN 유전자를 하기에 나타낸 동물 실험에서 사용된 scAAV-2i8 벡터의 생성을 위해 선택하였다.
실시예 2: 프리드라이히 운동실조증의 마우스 모델에서의 생체내 치료
FRDA의 당해 분야에 알려진 마우스 모델[Perdomini et al., 2014, Nature Med. 20(5):542]을 이용하여 rAAV 매개 FXN 유전자 치료의 잠재적 효능을 평가하였다. 즉, 3개 군의 마우스들을 검사하였다: 미처리 Mck 양성 대조군 마우스(Mck-Cre x FXN L3/WT), 미처리 Mck 돌연변이 마우스(Mck-Cre x FXN L3/L-), 및 FXN 유전자를 포함하는 rAAV의 한 용량을 투여받은 처리된 Mck 돌연변이 마우스[여기서는, 변형된 FXN 유전자가 서열번호 7의 핵산 서열(GenScript(저 CpG))을 포함하고 FXN 유전자가 전술한 바와 같이 pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH 구조물내에 클로닝되어 pTRs-KS-CBh-Genscript(low CpG)-bGHpolyA를 제공하였다].
마우스 연구에 사용된 rAAV-FXN 벡터는 AAV2i8 캡시드를 추가로 포함하였다. 또한, pTRs-KS-CBh-Genscript (low CpG )-bGHpolyA 구조물은 검출가능한 헤마글루티닌 태그를 암호화하는 핵산 서열(rAAV-FXN-HA)을 추가로 포함하였으며, 이때 상기 HA 태그를 암호화하는 서열은, 예를 들어, 항-HA 마우스 mAb(HA.11 클론 16B12, 코반스 리서치 프로덕츠 인코포레이티드(Covance Research Products, Inc.), 미국 뉴저지주 프린스턴 소재)와 같은 항-HA 항체를 사용하여 HA의 존재를 검출함으로써 프라탁신의 발현이 용이하게 검출되고 위치를 확인할 수 있도록, 변형된 FXN 유전자의 3'에 위치하였다. 상기 벡터는 rAAV-FXN-HA로 지정되었다.
상기 연구의 3개 동물군은 표 2에 열거되고 설명되어 있다.
군 표지 군 번호 용량 수준
vg/kg		 동물의 수
(혼성)		 종료 연령
주수
Mck 양성 대조군 Mck-Cre x FXN L3/WT 0 8 8주
미처리 Mck
돌연변이 마우스		 미처리 Mck-Cre x FXN L3/L- 0 8 8주
처리된 Mck
돌연변이 마우스		 rAAV-FXN-HA 처리된 Mck-Cre x FXN L3/L- 1x1013 8 8주
A. 바이오마커 연구
방법
혈장내 갈렉틴 -3 및 H- FABP의 측정
5주령(처리후 2주) 및 8주령(처리후 5주)에 이소플루란 마취후 안구뒤 천자에 의해 혈액을 수거하였다.
갈렉틴-3은 레이바이오텍(RayBiotech)의 마우스 갈렉틴-3 엘리사 키트(Mouse Galectin-3 Elisa Kit)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 혈장중에서 측정하였다.
H-FABP는 하이컬트바이오텍(HycultBiotech)의 마우스 H-FABP 엘리사 키트(Mouse H-FABP Elisa Kit)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 혈장중에서 측정하였다.
심장 균질액중 숙시네이트 데하이드로게나제 활성의 측정
희생시, 심장을 수거하고 각 군의 4마리 마우스의 심장의 절반을 SDH 활성 측정을 위해 순간 냉동시켰다.
심장 균질액중 SDH 활성 측정은 바이오비전(Biovision)의 숙시네이트 데하이드로게나제 활성 비색 분석 키트(Succinate Dehydrogenase Activity Colorimetric Assay Kit)(카탈로그 # K660-100)의 지시에 따라 수행하였다.
조직내 인간 프라탁신의 측정
희생시, 심장(절반), 골격근(비복근) 및 간 조직을 수거하고 프라탁신 측정을 위해 순간 냉동시켰다.
조직 균질액 중에서의 측정은 인간 프라탁신 엘리사 키트(Human Frataxin Elisa Kit, 압캠; ab176112)의 지시에 따라 수행하였다.
조직학
소뇌(치상핵 포함), 생식선, 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 골격근(비복근 및 비장근), 비장 및 경추, 흉추 및 요추를 포르말린-고정시켰다. 이어서, 척추뼈들을 EDTA 용액을 사용하여 탈석회화시켰다. 모든 장기들을 파라핀 포매시켜 5 ㎛-두께의 절편들: 척추뼈(척수 및 배근신경절 둘 다 포함) 및 심장의 경우 가로 절편을 수득하였다. 모든 장기들을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고; 심장 섬유화를 마손(Masson)의 삼색 염색을 이용하여 평가하였다.
심장초음파
마취된 마우스(이소플루란 1 내지 2%)에서 베보-2100 비주얼 소닉스(Vevo-2100 Visual Sonics) 초음파검사장치 상에서 30 MHz 선형 프로브(MS 400)를 사용하여 경흉부 심장초음파 영상을 포착하였다.
평가를 위해 하기의 파라미터들을 측정하였다:
a) 심장 형태 및 심실 수축 기능(단축(Short axis), SAX): 좌심실 확장말기(LVEDD) 및 수축말기 직경(LVESD), 격벽(SW) 및 후벽 두께(PW), 좌심실 질량(LVM= 1.055x [(EDD+SW+PW) 3-EDD3)]), 박출분율 및 구획단축률, 및 심박출량;
b) 혈류역학 프로필: 심장내 압력 변화(AoV 및 RV 기능)를 검출하기 위한 폐 및 대동맥 속도 및 압력.
마우스
마우스들은 온도- 및 습도-제어되는 동물 시설에서 12시간 명-암 주기하에 물과 표준 설치류 먹이(D03, 세이프(SAFE), 프랑스 빌무아송-쉬르-오르주)를 무제한 공급하면서 유지시켰다. 모든 동물 절차 및 실험들은 동물 관리 및 사용(Com'Eth 2011-007)에 대해 지역 윤리 위원회(Comite d'Ethique en Experimentation Animale IGBMC-ICS)에 승인받았다.
마우스들의 일일 2회 임상 관찰을 수행하고, 프로토콜 종료까지 체중을 매주 기록하고 2일마다 음식 섭취량을 기록하였다.
생체-분포 및 유전자 치료 연구를 위해, 3주령된 마우스를 이소플루란(1 내지 2%)으로 마취시키고, 처리군의 경우 rAAV-FXN-HA 벡터를 1x1013 vg/kg의 용량으로 및 미처리 MCK 돌연변이 마우스 및 대조군의 경우 동등한 부피의 식염수로 안구뒤 정맥에 정맥내 주사하였다.
마우스 심장 기능을, 처리 시작 2일전(기준선 표현형)에, 5주령(처리 14일후) 및 7주령(처리 28일후)에 이소플루란 마취(1 내지 2%)하에 심장초음파로 평가하였다. 5주 및 8주령에, 본원 다른 곳에서 상술한 바와 같이 혈액 채취를 수행하여 심장 유형 지방산 결합 단백질(H-FABP), 갈렉틴-3 및 숙시네이트 데하이드로게나제(SDH)의 농도를 측정하였다.
희생시, 모든 동물들로부터 체중, 체장, 심장, 비장, 신장, 부신 및 간 중량을 기록하였다. 부신, 소뇌, 경추, 흉추 및 요추, 생식선(고환 및 난소), 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 수컷의 전립선, 골격근(비복근 및 비장근), 비장 및 흉선을 병리학적 평가 및 ELISA 분석을 위해 군당 4마리 동물들로부터 수거하였다.
군당 네(4)마리의 다른 동물들의 소뇌(치상핵 포함), 경추, 흉추 및 요추 배근신경절, 심장, 신장, 간, 폐, 생식선, 췌장, 골격근(비복근 및 비장근) 및 비장을 수거하고 분자 생물학을 위해 즉시 순간 냉동시켰다.
결과
잠재적 바이오마커의 확인
다양한 바이오마커들의 수준을 3개 군의 마우스들에서 측정하였다: 미처리 Mck 양성 대조군, 미처리 Mck 돌연변이 마우스, 및 FXN 유전자를 포함하고 HA 태그 펩티드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 rAAV2i8(AAV-FXN-HA)의 한 용량을 투여받은 처리된 Mck 돌연변이 마우스.
혈장내 갈렉틴 -3 및 H- FABP의 측정
5주령(처리된 Mck 돌연변이 마우스의 경우 AAV 처리 2주후) 및 8주령(처리된 Mck 돌연변이 마우스의 경우 rAAV 처리 5주후)에 이소플루란 마취후 안구뒤 천자에 의해 혈액을 수거하고, 갈렉틴-3 및 H-FABP의 수준을 표준 방법을 이용하여 측정하였다.
갈렉틴 -3:
5주령에, 갈렉틴-3 수준이, 미처리 Mck 돌연변이 마우스 군에 비해 미처리 Mck 양성 대조군에서 및 처리된 Mck 돌연변이 마우스 군에서 더 높은 경향이 있을지라도, 갈렉틴-3 수준은 3개 군들 사이에서 필적하였다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 8주령에, 갈렉틴-3 수준은 음성 대조군에서보다 미처리 Mck 돌연변이 군에서 훨씬 더 낮았다. 갈렉틴-3 수준은 음성 대조군에서보다 실험군에서 더 낮은 경향이 있었지만, 갈렉틴-3 수준은 실험군과 양성 대조군 사이에서 필적하였다.
혈장 갈렉틴 -3 수준 (ng/ml)
5주 8주
평균 +/- sem 평균 +/- sem
미처리 Mck 양성 대조군 마우스 (n=8) 41.2 +/- 3.5 68 +/- 7.8
미처리 Mck 돌연변이 마우스 (n=8) 49.7 +/- 3.6 42 +/- 2.1
처리된 Mck 돌연변이 마우스 (n=8) 49.7 +/- 4.4 48.9 +/- 4.5
놀랍게도, 미처리 Mck 양성 대조군의 마우스들은 5주령에서보다 8주령에서 갈렉틴-3의 더 높은 수준을 나타내었지만, 미처리 Mck 돌연변이 마우스군 및 처리된 Mck 돌연변이 마우스군의 경우에는 8주령에서 갈렉틴-3의 수준이 5주령에서의 수준에 필적하였다.
결론적으로, 갈렉틴-3은 Mck 마우스에 대한 상기 연구의 경우 적절한 심장 바이오마커가 아닌 것으로 생각된다. 미처리 Mck 돌연변이 마우스 군의 마우스들은 상기 파라미터에서, 갈렉틴-3이 적절한 바이오마커였을 경우 예상된 증가를 나타내지 않았다.
H- FABP :
표준 검출 방법을 사용하여 동일 샘플 군내의 마우스들 사이에서 H-FABP 수준에 큰 가변성이 관찰되었다.
표 4에 나타낸 바와 같이, H-FABP 혈액 수준은 5주령 및 8주령 모두에서 3개 마우스 군 사이에서 필적하였다.
혈장 H- FABP (ng/ml)
5주 8주
평균 +/- sem 평균 +/- sem
미처리 Mck 양성 대조군 (n=8) 177.8 +/- 33.9 98.8 +/- 25.0
미처리 Mck 돌연변이 마우스 (n=8) 187.1 +/- 38.8 139.8 +/- 41.5
처리된 Mck 돌연변이 마우스 (n=8) 232.2 +/- 53.3 129.6 +/- 25.8
각 군에서 5주령과 8주령 사이에서 H-FABP 수준에 유의적인 변화는 관찰되지 않았다.
결론적으로, H-FABP는 Mck 마우스에 대한 상기 연구에서 적절한 심장 바이오마커가 아닌 것으로 보이며; 미처리 Mck 돌연변이 군에서 상기 파라미터에서 예상된 증가는 관찰되지 않았고 동일 군내 마우스들 사이에서 중요한 가변성이 관찰되었다.
심장 균질액 중 SDH 활성
표준 방법을 이용하여 연구 말기에(8주령, 처리된 돌연변이 마우스 군에서는 AAV 처리 5주후) 수거된 심장으로부터의 심장 균질액에서 SDH 활성을 측정하였다. 각 군은 네(4) 마리의 마우스로 이루어졌다.
표 5에 나타낸 결과는 SDH 활성이 3개 마우스 군 사이에서 필적하였음을 보여준다. 미처리 Mck 돌연변이 군에 비해 미처리 Mck 양성 대조군에서 SDH 활성의 감소는 관찰되지 않았다.
심장 균질액중 SDH 활성
(U/g 단백질)
미처리 Mck 양성 대조군 (n=4) 4.14 +/- 0.52
미처리 Mck 돌연변이 마우스 (n=4) 3.64 +/- 0.77
처리된 Mck 돌연변이 마우스 (n=4) 4.24 +/- 0.62
동일 군내의 마우스들 사이에서 SDH 활성에 중요한 가변성이 관찰되었다. 또한, 미처리 Mck 양성 대조군에서 SDH 활성의 예상된 감소는 관찰되지 않았다.
심장, 골격근 및 간 균질액 중 프라탁신 수준
표 6에 나타낸 바와 같이 표준 방법을 이용하여 희생시 수거된 심장, 골격근 및 간으로부터 인간 프라탁신 단백질의 수준을 측정하였다.
인간 프라탁신은 미처리 Mck 양성 대조군 및 미처리 Mck 돌연변이 군의 어떤 검사된 조직(심장, 골격근 및 간)에서도 검출할 수 없었다(즉, 수준은 분석의 최저 검출 한계[LLD] 미만이었다).
rAAV-FXN을 투여받은 처리된 Mck 돌연변이 마우스에서, 인간 프라탁신 단백질은 심장 균질액에서 38.35 +/- 1.99 ng/mg의 수준으로, 및 골격근에서는 더 낮은 농도: 4.57 +/- 0.39 ng/mg로 검출되었다. 또한, 간에서는 미량의 인간 프라탁신이 검출되었다(0.07 +/- 0.01 ng/mg의 단백질).
조직내 프라탁신 (ng/mg 단백질)
심장 골격근 간
평균 +/- sem 평균 +/- sem 평균 +/- sem
음성 대조군 (n=4) <LLD <LLD <LLD
양성 대조군 (n=4) <LLD <LLD <LLD
실험군 (n=4) 38.35 +/- 1.99 4.57 +/- 0.39 0.07 +/- 0.01
상기 데이터들은 FXN 유전자를 포함하는 rAAV 벡터가 프리드라이히 운동실조증(FRDA)의 마우스 모델에서 프라탁신 수준을 증가시킬 수 있음을 입증한다. 또한, 상기 데이터들은 FXN 수준이, 간에서 훨씬 더 낮은 수준하에, 심장에서, 및 보다 적게, 골격근에서 증가되도록 생체내에서 rAAV-FXN 전신 투여에 의해 증가될 수 있음을 보여준다. 따라서, 상기 데이터들은 생체내 FXN 수준이, 필요하지 않고/않거나 바람직하지 않은 경우에는(즉, 간에는) FXN의 전달을 최소화하면서, 발병된 조직, 예를 들어, 심장 및 골격근에서 선택적으로 증가될 수 있음을 입증한다.
전체 병리학
미처리 Mck 양성 대조군 수컷 마우스는 미처리 및 AAV-처리된 Mck 돌연변이 동물에 비해 훨씬 더 길었다(9.39 cm 대 8.89 cm [+5.62%]. P = 0.011 [t-검정]). 다른 유의적인 육안으로 보이는 병변은 관찰되지 않았으며, 특히 수컷 및 암컷 둘 다에서 심장 중량에 있어 육안으로 보이는 병변 또는 유의적인 변화는 관찰되지 않았다.
조직학
심장
한마리의 미처리 Mck 양성 대조군 동물(#58)에서 최소 간질 섬유화가 관찰되었다. 다른 3마리 미처리 Mck 양성 대조군 심장은 모두 정상이었다.
그러나, 분석된 4마리의 미처리 Mck 돌연변이 동물 모두에서 최소(마우스 #38) 및 중등도(마우스 #41, #49 및 81) 간질 섬유화가 관찰되었다. 상기 병변은 마우스 #38(최소) 및 #81(경도)에서 심근세포 팽윤의 심장내 병소와 연관되었다. 섬유화는 마우스 #41 및 #49에서 중등도 마크로파지 염증, 최소 산재성 팽윤, 및 심근세포의 경도 액포화와 연관되었다. 마우스 #41 및 #81에서는 아니츠코우(Anitschkow)(올빼미눈-모양) 핵이 관찰되었다.
전체적인 평가에서, 미처리 Mck 돌연변이 코호트와 극명하게 대조적으로, rAAV-FXN-처리된 Mck 돌연변이 마우스의 심장은, 마우스 #47 및 #13에서 소수의 아니치코우 핵이 관찰된 것을 제외하고 정상적으로 보였다.
신장
모든 군에서, 다수의 수질 세관들의 내강에서 유의적인 무기질화가 빈번히 관찰되었다. 빈도는 미처리 Mck 양성 대조군 동물에서 4/4(비록 이들은 Cre 전이유전자를 발현하지만), 미처리 Mck 돌연변이 동물에서 3/4, 및 일정 용량의 rAAV-FXN을 투여받은 처리된 Mck 돌연변이 동물에서 2/4이었다. 무기질화의 중증도는 미처리 Mck 양성 대조군 및 미처리 Mck 돌연변이 군에 비해 rAAV-처리된 Mck 돌연변이 군에서 감소된 것으로 나타났다. 관의 호염기구증가(재생)가 미처리 Mck 양성 대조군의 2/4 동물에서, 미처리 Mck 돌연변이 군의 3/4에서, 및 AAV-처리된 Mck 돌연변이 군의 1마리 동물에서 관찰되었다.
간: 최소 문맥주위 염증이 1마리의 미처리 Mck 양성 대조군 동물(#38)에서 관찰되었다.
폐: 경도의 기관지주위 염증이 1마리의 미처리 Mck 돌연변이 동물(#41)에서 관찰되었다.
다른 유의적인 현미경적 병변은 관찰되지 않았다. 특히, 척수, 배근신경절 및 소뇌는 모두 정상이었다.
심장초음파
처리전 기저세포 표현형
심장초음파 측정은 미처리 Mck 양성 대조군에 비해 미처리 Mck 돌연변이 수컷 마우스에서 감소된 좌심실 기능을 나타내었다. 상기 심부전은 수축기 및 확장기 둘 다에서 좌심실(LV) 수축력(구획단축률 및 박출분율)의 감소 및 LV 부피의 증가를 특징으로 한다. 상기 단계에서, 미처리 Mck 돌연변이 암컷 마우스에서는 심장 표현형이 관찰되지 않았다.
도 4A는 3주령 (A) 수컷 및 (B) 암컷에서 심장초음파에 의한 수축기 기능 및 LV 부피의 평가 그래프를 나타낸다. 데이터는 군당 8 마리 마우스의 평균 ± S.E.M이다. Mck 돌연변이(처리 및 미처리군 둘 다) 마우스의 데이터를 다중 t-검정 비교(시닥-본페로니 방법)를 이용하여 미처리 Mck 양성 대조군과 비교하였다. * p<0.05
rAAV 처리 14일후 (5주령) 결과 :
FRDA 심근증의 치료를 위한 유전자 치료 접근방법의 가능성을 조사하기 위해, 1x1013 vg/kg 용량의 AAV.FXN-HA의 단일 정맥내 주사를 3주령의 돌연변이 마우스(처리된 Mck 돌연변이 군)에게 투여하였다. 주사 14일후에(5주령), 심장초음파 측정은 처리된 Mck 돌연변이 수컷에서 심장 혈액동역학(심박출량)의 개선 및 정상에 가까운 형태 발달(수축력, LV 질량)을 나타내었다. 대조적으로, 미처리 Mck 돌연변이 마우스에서는 심부전이 여전히 관찰되었다. 놀랍게도, 암컷에서, 심장 수축력 결함이, 처리되었든지 미처리되었든지, 모든 Mck 돌연변이 마우스에서 관찰되었다.
도 5A 내지 5B는 수컷(도 5A) 및 암컷(도 5B)에서 5주령에서 심장초음파에 의한 수축기 기능 및 LV 부피의 평가를 나타낸다. 데이터는 군당 8마리 마우스의 평균 ± S.E.M이다. 돌연변이 마우스들의 데이터를 다중 t-검정 비교(시닥-본페로니 방법)를 이용하여 대조군과 비교하였다. * p<0.05.
rAAV 처리 28일후 (7주령) 결과 :
rAAV 치료 28일 후에(7주령), 처리된 Mck 돌연변이 수컷 및 암컷은 완전히 정상화되었고 이들과 미처리 Mck 양성 대조군 마우스들 사이에서 구별할 수 없게 되었다. 심장 질환의 상기 완전한 교정(수컷) 및 예방(암컷)은 처리된 Mck 돌연변이 마우스에서 입증되었다. 대조적으로, 미처리 Mck 돌연변이 마우스는, 좌심실 구획단축률 및 심박출량뿐 아니라 좌심실 비대에 현저한 감소와 함께 급격히 진행하는 심부전이 발생하였다.
도 6A 내지 6C는 연속적인 수주동안 미처리 Mck 양성 대조군, 및 처리 및 미처리 Mck 돌연변이 마우스에 대한 좌심실 질량(LVm), 구획단축률(SF) 및 심박출량의 심장초음파 평가를 이용하여 수득된 데이터를 나타내는 그래프를 보여준다. 데이터는 군당 8마리 마우스의 평균 ± S.E.M이다. Mck 돌연변이 마우스의 데이터를 다중 t-검정 비교(시닥-본페로니 방법)를 이용하여 미처리 Mck 양성 대조군과 비교하였다. * p<0.05.
결론
심장초음파의 결과
본 연구에서는, 선택적으로 1x1013 vg/kg의 용량으로 검출가능한 헤마글루티닌(HA) 벡터(본원에서 rAAV-FXN-HA로 지칭됨)를 추가로 포함하는 rAAV-FXN의 효능을 평가하였다. 상기 용량은 야생형 FXN을 암호화하는 rrhAAV10 벡터를 사용한 동일한 Mck 마우스 심장-특이적 프리드라이히 운동실조증 마우스 모델에서 이미 기술된 용량보다 약 5배 적었다[Perdomini et al., 2014, Nature Medicine 20(5):542].
도 5A에 나타낸 바와 같이, 3주령에서, 미처리 Mck 돌연변이 수컷 마우스는, 동일 연령의 동일 군의 암컷(도 5B)에서는 관찰되지 않은, 좌심실(LV) 기능장애를 나타내기 시작하였다. AAV.FXN-HA 주사 십사(14)일 후에(5주령), 심장 표현형의 점진적 교정이 Mck 돌연변이 수컷에서 관찰되었지만, Mck 돌연변이 암컷에서는 더 약했다. 어떤 특정 이론에 결부시키고자 하는 것이 아니고, 상기 차이는 상기 프로토콜에서 지금까지 사용된 수컷 또는 감소된 수의 마우스에 비해 암컷에서 심장 표현형의 늦은 출발에 기인할 수 있다.
상기 결과들은 rAAV-변형된 FXN의 전신 투여가 FRDA의 Mck 돌연변이 마우스 모델에서의 심장 질환 표현형을 역전시킴을 시사한다. 상기 결과들은 또한 rAAV-변형된 FXN 투여가 그를 필요로 하는 대상에서 FRDA를 방지 및/또는 역전시킬 수 있음을 시사한다.
rAAV-FXN 주입 28일 후에, 심장 기능의 완전한 회복이 처리된 Mck 돌연변이 수컷 및 암컷에서 관찰되어, 주입된 FXN 전이유전자에 의한 병리의 강한 교정을 시사하였다. 즉, 도 6A 내지 6C에 나타낸 데이터는 rAAV-FXN 투여 28일 후까지 FRDA 심장 표현형의 교정을 보여준다. 보다 특히, 도 6A는 처리된 Mck 돌연변이 마우스 및 대조군(WT 야생형 Mck-Cre 마우스) 둘 다의 좌심실 질량(LVm)은 구분할 수 없는 반면 미처리(삼각형) Mck 돌연변이 마우스는 훨씬 더 큰 LVm(*p<0.05)을 나타냄을 보여준다. 도 6B는 rAAV-FXN 처리 28일후까지 양성 대조군(WT L3 Mck-Cre 마우스; 원) 및 처리된 Mck 돌연변이(L-) 마우스(사각형)가 둘 다 실질적으로 동일한 구획단축률(SF) 측정치를 나타내었음을 보여주는 데이터를 나타낸다. 대조적으로, 도 6B는 미처리 Mck 돌연변이 마우스(삼각형)가 크게 감소된 SF(*p<0.05)를 나타내었음을 보여준다. 또한, 도 6C는, rAAV로 처리후 28일까지, 처리된 Mck 돌연변이 마우스(사각형)가, 현저하게 감소된 심박출량(삼각형; *p<0.05)을 나타낸 미처리 Mck 돌연변이 마우스(삼각형)와 비교하여 대조군 마우스(원)와 구분할 수 없는 심박출량을 나타내었음을 보여주는 데이터를 나타낸다. 모든(처리 및 미처리) Mck 돌연변이 마우스들은 다중 t-검정 비교(시닥-본페로니 방법)를 이용하여 대조군 미처리 마우스와 비교하였다. 도 6A 내지 6C에 나타낸 각각의 그래프에 대해, *<0.05가 바람직하다.
상기 데이터들은 프라탁신을 암호화하는 변형된 핵산을 포함하는 rAAV의 투여가 FRDA의 당해 분야에-인지된 마우스 모델에서 Mck 표현형을 역전시키고/시키거나 방지할 수 있음을 충분히 입증한다. 따라서, 상기 데이터는, rAAV-변형된 FXN 매개 치료가 그를 필요로 하는 대상에서, FRDA, 또는 야생형(예를 들어, 기능성) 프라탁신의 감소된 수준에 의해 매개된 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 잠재적인 유용한 치료일 수 있음을 뒷받침한다. 상기 데이터는 전신으로 투여된 rAAV-변형된-FXN이 FRDA를 치료 또는 예방할 수 있음을 입증하지만, 상기 결과들은, 치료가 또한 두개내 또는 직접적인 심장 투여와 같은(이로 한정되지는 않음) rAAV-FXN의 다른, 예를 들어, 보다 직접적인 투여 경로를 포함함을 또한 뒷받침한다. 즉, 전신 투여는 치료적인 것으로 입증되었으므로, 당해 분야에 숙련된 자라면 본원에 제공된 개시내용에 기반하여 보다 직접적인 투여 경로가 또한 치료적 이익을 제공할 수 있음을 이해할 것이다.
상기 결과들은 변형된 FXN 유전자의 rAAV 벡터 전달을 이용한 유전자 치료가 FRDA를 갖는 환자들에게 및 야생형/기능성 프라탁신의 감소된 수준을 나타내는 대상에서 신장 결석을 치료 또는 예방하기 위한 가능성있는 치료 접근방법임을 강하게 뒷받침한다.
실시예 3: 프리드라이히 운동실조증의 마우스 모델에서 rAAV - FXN의 생체내 투여에 대한 조직학 연구
연구 설계
24 마리의 8주령된 C57BL6/N 수컷 및 암컷 마우스를 조직병리학적 분석을 위해 평가하였다.
8 마리 마우스가 기능성의 조작된 인간 프라탁신 대립유전자(Mck-Cre x FXN L3/WT; 이하에서 "Mck 양성 대조군 마우스"로 지칭됨)에 결합된 Mck-Cre 전이유전자(MCK: 근육 생성 키나제)를 가졌다. 16 마리 마우스는 불활성 조작된 프라탁신 대립유전자(Mck-Cre x FXN L3/L-; 이하에서, "Mck 돌연변이 마우스"로 지칭됨)에 결합된 동일한 전이유전자를 가졌다. Mck 돌연변이 마우스들 중에서, 8 마리는 프라탁신-암호화 rAAV2i8(rAAV-FXN; 1013 vg/kg)을 주입하였다(이하에서, "처리된 Mck 돌연변이 마우스"로 지칭됨). 나머지 8 마리 Mck 돌연변이 마우스들은 동일 부피의 식염수를 투여받았다(이하에서, "미처리 Mck 돌연변이 마우스"). 양성 대조군 마우스 군(Mck-Cre x FXN L3/WT)은 식염수를 투여하였다. 하기 표 7 참조.
군 표지 군 번호 용량 수준
vg/kg		 동물 수
(혼성)		 종료
연령 주수
Mck 양성 대조군 마우스 Mck-Cre x FXN L3/WT 0 8 8주
미처리 Mck
돌연변이 마우스		 미처리 Mck-Cre x FXN L3/L- 0 8 8주
처리된 Mck
돌연변이 마우스		 rAAV-FXN-HA 처리된
Mck-Cre x FXN L3/L-		 1x1013 8 8주
방법
희생시, 모든 동물들로부터 체중, 체장, 및 심장, 비장, 신장, 부신 및 간 중량을 기록하였다. 부신, 소뇌, 경추, 흉추 및 요추, 생식선(고환 및 난소), 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 수컷의 전립선, 골격근(비복근 및 비장근), 췌장 및 흉선을 병리학적 평가 및 ELISA 분석을 위해 군당 네(4)마리 동물들로부터 수거하였다.
군당 4마리의 다른 동물들의 소뇌(치상핵 포함), 경추, 흉추 및 요추 배근신경절, 심장, 신장, 간, 폐, 생식선, 췌장, 골격근(비복근 및 비장근) 및 비장을 수거하고 분자 생물학을 위해 즉시 순간 냉동시켰다.
조직학
소뇌(치상핵 포함), 생식선, 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 골격근(비복근 및 비장근), 비장 및 경추, 흉추 및 요추를 포르말린-고정시켰다. 이어서, 척추뼈들을 EDTA 용액을 사용하여 탈석회화시켰다. 모든 장기들을 파라핀 포매시켜 5 ㎛-두께의 절편들: 척추뼈(척수 및 배근신경절 둘 다 포함) 및 심장의 경우 가로 절편을 수득하였다. 모든 장기들을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 심장 섬유화를 마손의 삼색 염색을 이용하여 평가하였다.
ELISA 분석
심장의 절반, 간 우엽, 및 비장근 및 비복근을 수거 직후 순간 냉동시켰다.
결과
전체 병리학
Mck 양성 대조군 수컷 마우스는 미처리 Mck 돌연변이 마우스 및 처리된 Mck 돌연변이 마우스에 비해 훨씬 더 길었다(9.39 cm 대 8.89 cm [+5.62%]. P = 0.011 [t-검정]). 다른 유의적인 육안으로 보이는 병변은 관찰되지 않았으며, 특히 수컷 및 암컷 둘 다에서 심장 중량에 있어 육안으로 보이는 병변 또는 유의적인 변화는 관찰되지 않았다.
조직학
심장
Mck-Cre x FXN L3/WT: 한마리의 Mck 양성 대조군 동물(#58)에서 최소 간질 섬유화가 관찰되었다. 다른 3마리 양성 대조군 마우스의 심장은 모두 정상이었다.
미처리 Mck-Cre x FXN L3/L-: 대조적으로, 분석된 4마리의 미처리 Mck 돌연변이 동물 모두에서 최소(마우스 #38) 및 중등도(마우스 #41, #49, 및 81) 간질 섬유화가 관찰되었다. 상기 병변은 마우스 #38(최소) 및 #81(경도)에서 심근세포 팽윤의 심장내 병소와 연관되었다. 섬유화는 마우스 #41 및 #49에서 중등도 마크로파지 염증, 최소 산재성 팽윤, 및 심근세포의 경도 액포화와 연관되었다. 마우스 #41 및 #81에서는 아니츠코우(올빼미눈-모양) 핵이 관찰되었다.
처리된 Mck-Cre x FXN L3/L-: 미처리 Mck 돌연변이 마우스와 대조적으로, rAAV-FXN 처리된 Mck 돌연변이 마우스의 심장은, 마우스 #47 및 #13에서 소수의 아니치코우 핵이 관찰된 것을 제외하고 정상적으로 보였다.
신장
3개 군 모두에서, 다수의 수질 세관들의 내강에서 유의적인 무기질화가 빈번히 관찰되었다. 빈도는 Mck 양성 대조군 동물에서 4/4, 미처리 Mck 돌연변이 동물에서 3/4, 및 rAAV-FXN 처리된 Mck 돌연변이 동물에서 2/4이었다. 무기질화의 중증도는 Mck 양성 대조군 및 미처리 Mck 돌연변이 군에 비해 rAAV-FXN 처리된 Mck 돌연변이 군에서 감소된 것으로 나타났다. 관의 호염기구증가(재생)가 Mck 양성 대조군 마우스의 2/4 동물에서, 미처리 Mck 돌연변이 군의 3/4에서, 및 rAAV-FXN 처리된 Mck 돌연변이 군의 1마리 동물에서 관찰되었다.
간: 최소 문맥주위 염증이 1마리의 Mck 양성 대조군 동물(#38)에서 관찰되었다.
폐: 경도의 기관지주위 염증이 1마리의 미처리 Mck 돌연변이 동물(#41)에서 관찰되었다.
다른 유의적인 현미경적 병변은 관찰되지 않았다. 특히, 척수, 배근신경절 및 소뇌는 모든 군에서 모두 정상이었다.
조직학 결과
조직학과 관련하여, 미처리 Mck 돌연변이 마우스의 심근세포에서 관찰된 올빼미눈 모양-핵, 팽윤 및 액포화는 모두 심장 퇴화의 지표이다. 마크로파지 염증과 연관된 간질 섬유화는 심근세포의 세포 사멸에 상응할 수 있다. 따라서, 미처리 Mck 돌연변이 마우스의 심근세포가 변성된다, 즉, 세포가 감소된 기능을 겪게 되고 병리학은 세포 사멸 및 후속 심부전으로 발전된다.
엄격하게, rAAV-FXN 전신 전달은 상기 표현형을 역전시키고, rAAV-처리된 Mck 돌연변이 마우스(수컷 및 암컷 둘 다)는 정상으로 보였으며 심근세포 변성의 유의적인 징후를 나타내지 않았다. 상기 데이터들은 rAAV-huFXN 형질도입이 내인성 마우스 Fxn 유전자 불활성화 효과를 역전시키기에 충분히 효과적임을 입증한다. 따라서, 상기 데이터는 또한 rAAV-변형된 FXN 매개 전신 투여가, 그를 필요로 하는 대상에서, 프리드라이히 운동실조증과 같은(이로 한정되지는 않는다) 야생형 (기능성) 프라탁신의 감소된 수준에 의해 매개된 질환, 장애 또는 병태를 역전시키고/시키거나 예방할 수 있음을 뒷받침한다. 앞에서 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 교지내용들을 숙지한 숙련된 전문가라면 그를 필요로 하는 대상에게 치료 이익을 제공하기 위해 다른 투여 경로, 예를 들어, 두개내 및 심장내를 포함한 보다 직접적인 경로가 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
신장 분석 결과 미처리 Mck 양성 대조군 및 미처리 Mck 돌연변이 동물 둘 다의 수질에서 신장 결석의 존재를 확인하였으며, 이것은 흔치않은 병변이다. 상기 동물들에게 특정 식단이 제시되지 않았기 때문에, 그들의 연령을 고려하여, 상기 병변의 빈도 및 중증도는 이것이 우연한 병변이 아니라 유전자형과 관련된 병변임을 강하게 시사한다. 흥미롭게도, 상기 병변 중증도는 rAAV-FXN 처리에 의해 특히 감소되어, 신장 결석 발생이 Fxn 기능에서 및/또는 단백질의 수준에서의 변화와 관련됨을 시사한다. 따라서, 마우스 프라탁신 유전자에 loxP 서열(인트론 영역에서이긴 하지만)이 측면에 위치하는 소위 L3 대립유전자는 정상하위(hypomorph) 대립유전자일 수 있다. 이것은 상피통과(trans-epithelial) 전해질 활성 수송을 유지하기 위해 상기 세포들에서의 미토콘드리아의 중요한 역할과 일치된다. 출원인이 알고 믿는 한, 상기 병변들은 프리드라이히 운동실조증의 임상 관찰에서 또는 FRDA 마우스 모델에서 지금까지 보고된 적이 없었다.
그러므로, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상에서 신장 결석의 발생 또는 성장을 포함하나 그로 한정되지는 않는 신장 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법을 포함하며, 이때 상기 신장 질환, 장애 또는 병태는 대상에서 프라탁신(예를 들어, 기능성 및/또는 야생형 프라탁신)의 감소된 수준에 의해 매개된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 대상에서 프라탁신의 수준을 평가하고, 대상에서 상기 프라탁신의 수준을 신장 결석이 발병되지 않은 것으로 알려진 대상에서의 프라탁신 수준과 비교하고/하거나 프라탁신 수준을 다른 건강한 개체에 대해 측정되거나 당해 분야에 공지되어 있는 "표준 프라탁신 수준"과 비교하고, 대상에서 프라탁신 수준이 다른 건강한 개체에서의 프라탁신 수준 미만이고/이거나 표준 프라탁신 수준 미만인 경우 대상에게 rAAV-변형된 프라탁신을 투여함으로써, 대상에서 신장 결석을 치료하고/하거나 예방하는 것을 포함한다.
최종적으로, HA 염색을 이용하여 세포내 rAAV-FXN-HA를 검출할 수 있다. 첫째, 이것은 얼마나 많은 세포가 심장 기능을 회복시키거나 유지시키기 위해 FXN을 발현해야 하는지를 정량화하는데 중요하다. 둘째, Mck 유전자(및 따라서 Mck 프로모터에 의해 유도된 Cre 재조합효소)는 신장에서 발현될 것으로 예상되지 않는다. 신장에서 rAAV-FXN-HA를 검출하거나 검출하지 않는 것은 신장 결석 생성이 수질 항상성에 대한 HA-FXN의 예상치 못한 직접적인 영향인지 아닌지를 밝히는 것을 용이하게 할 수 있다.
결론
요컨대, 본원에 나타낸 데이터는 변형된 FXN 유전자를 암호화하는 rAAV의 투여, 심지어 전신 투여가 프라탁신의 감소 또는 부재와 연관된 영향을 치료(예방 및/또는 역전)할 수 있음을 입증한다. 따라서, 상기 데이터는 세포 및 치료를 필요로 하는 대상에서 프라탁신의 rAAV 매개된 발현이 프리드라이히 운동실조증과 같은(이로 한정되지는 않는다) 프라탁신의 결여 또는 결핍과 연관되거나 그에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하는데 유용한 치료법일 수 있음을 뒷받침한다.
개시된 교지내용은 다양한 용도, 방법, 키트 및 조성물들과 관련하여 기술되었지만, 본원의 교지내용 및 하기에 청구된 본 발명으로부터 벗어나지 않고 다양한 변화 및 변경이 이루어질 수 있음을 인지할 것이다. 상기 실시예들은 개시된 교지내용을 더 잘 예시하기 위해 제공되며, 본원에 나타낸 교지내용의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 본 교지내용은 상기 예시적인 실시양태들의 견지에서 기술되었지만, 숙련된 전문가라면 과도한 실험없이 상기 예시적 실시양태들의 많은 변화 및 변경이 가능함을 쉽게 이해할 것이다. 모든 상기 변화 및 변경은 본 교지내용의 범위내에 속한다.
특허, 특허출원, 논문, 텍스트북 등을 포함하여 본원에 인용된 모든 참조문헌들, 및 그안에 인용된 참조문헌들은 아직 도입되지 않은 정도까지 전체로 참고로 도입된다. 도입된 문헌 및 유사한 자료들 중 하나 이상이 정의된 용어, 용어 사용, 설명된 교지내용 등을 포함하나 이로 한정되지는 않는 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우, 본 출원이 규제한다.
상기 설명 및 실시예는 본 발명의 특정한 명확한 실시양태들을 상술하고 본 발명자들에 의해 고려된 가장 우수한 방식을 기술하고 있다. 그러나, 상기 설명이 본문에서 아무리 상세하게 나타날 수 있다 해도, 본 발명은 많은 방식으로 실행될 수 있으며 본 발명은 첨부된 특허청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 함을 인지할 것이다.
Figure 112018054670601-pct00001
Figure 112018054670601-pct00002
Figure 112018054670601-pct00003
Figure 112018054670601-pct00004
Figure 112018054670601-pct00005
Figure 112018054670601-pct00006
Figure 112018054670601-pct00007
Figure 112018054670601-pct00008
Figure 112018054670601-pct00009
Figure 112018054670601-pct00010
Figure 112018054670601-pct00011
Figure 112018054670601-pct00012
Figure 112018054670601-pct00013
Figure 112018054670601-pct00014
Figure 112018054670601-pct00015
Figure 112018054670601-pct00016
Figure 112018054670601-pct00017
Figure 112018054670601-pct00018
SEQUENCE LISTING <110> Bamboo Therapeutics, Inc. <120> MODIFIED FRIEDREICH ATAXIA GENES AND VECTORS FOR GENE THERAPY <130> PC45291A <140> PCT/IB2016/056572 <141> 2016-11-01 <150> US 62/251,288 <151> 2015-11-05 <150> US 62/411,980 <151> 2016-10-24 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of human wild type frataxin <400> 1 Met Trp Thr Leu Gly Arg Arg Ala Val Ala Thr Gly Leu Leu Ala Ser 1 5 10 15 Pro Ser Pro Ala Gln Ala Gln Thr Leu Thr Arg Val Pro Arg Pro Ala 20 25 30 Glu Leu Ala Pro Leu Cys Gly Arg Arg Gly Leu Arg Thr Asp Ile Asp 35 40 45 Ala Thr Cys Pro Arg Arg Ala Ser Ser Asn Gln Arg Gly Leu Asn Gln 50 55 60 Ile Trp Asn Val Lys Lys Gln Ser Val Tyr Leu Met Asn Leu Arg Lys 65 70 75 80 Ser Gly Thr Leu Gly His Pro Gly Ser Leu Asp Glu Thr Thr Tyr Glu 85 90 95 Arg Leu Ala Glu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Ala Glu Phe Phe Glu Asp 100 105 110 Leu Ala Asp Lys Pro Tyr Thr Phe Glu Asp Tyr Asp Val Ser Phe Gly 115 120 125 Ser Gly Val Leu Thr Val Lys Leu Gly Gly Asp Leu Gly Thr Tyr Val 130 135 140 Ile Asn Lys Gln Thr Pro Asn Lys Gln Ile Trp Leu Ser Ser Pro Ser 145 150 155 160 Ser Gly Pro Lys Arg Tyr Asp Trp Thr Gly Lys Asn Trp Val Tyr Ser 165 170 175 His Asp Gly Val Ser Leu His Glu Leu Leu Ala Ala Glu Leu Thr Lys 180 185 190 Ala Leu Lys Thr Lys Leu Asp Leu Ser Ser Leu Ala Tyr Ser Gly Lys 195 200 205 Asp Ala 210 <210> 2 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding wild type frataxin <400> 2 atgtggactc tcgggcgccg cgcagtagcc ggcctcctgg cgtcacccag cccagcccag 60 gcccagaccc tcacccgggt cccgcggccg gcagagttgg ccccactctg cggccgccgt 120 ggcctgcgca ccgacatcga tgcgacctgc acgccccgcc gcgcaagttc gaaccaacgt 180 ggcctcaacc agatttggaa tgtcaaaaag cagagtgtct atttgatgaa tttgaggaaa 240 tctggaactt tgggccaccc aggctctcta gatgagacca cctatgaaag actagcagag 300 gaaacgctgg actctttagc agagtttttt gaagaccttg cagacaagcc atacacgttt 360 gaggactatg atgtctcctt tgggagtggt gtcttaactg tcaaactggg tggagatcta 420 ggaacctatg tgatcaacaa gcagacgcca aacaagcaaa tctggctatc ttctccatcc 480 agtggaccta agcgttatga ctggactggg aaaaactggg tgtactccca cgacggcgtg 540 tccctccatg agctgctggc cgcagagctc actaaagcct taaaaaccaa actggacttg 600 tcttccttgg cctattccgg aaaagatgct 630 <210> 3 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDT2 optimized nucleotide sequence encoding frataxin <400> 3 atgtggacac tgggcagaag ggcggtggcc ggactgttgg cgagtcccag tcccgcgcag 60 gcgcagaccc ttactagggt gccgcggccc gcggagctgg cgccactctg cggtcgccgc 120 ggtctgagaa cggacattga tgccacttgt acacctcgga gggccagctc caaccaaagg 180 ggccttaatc aaatttggaa cgtgaagaag cagtccgtct acctgatgaa ccttcggaag 240 tcagggaccc tgggccaccc gggaagcttg gatgaaacaa cttacgaaag gttggcggag 300 gagaccttgg attctcttgc agagttcttc gaagacctgg ctgataagcc ttacaccttt 360 gaggactacg atgtgtcttt tggatctgga gtgctgaccg ttaaactggg cggggatctg 420 ggcacctacg tgattaacaa gcaaactcca aacaagcaga tctggctttc aagccccagt 480 agcgggccaa aacgctacga ttggaccgga aagaattggg tttacagcca cgatggcgtt 540 tcactgcacg agcttctggc agcagaactg acaaaagcac tcaagacgaa gctcgacttg 600 tcatccttgg catactccgg aaaggatgcc 630 <210> 4 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JCAT Optimized Nucleotide sequence encoding frataxin <400> 4 atgtggaccc tgggccgccg cgccgtggcc ggcctgctgg ccagccccag ccccgcccag 60 gcccagaccc tgacccgcgt gccccgcccc gccgagctgg cccccctgtg cggccgccgc 120 ggcctgcgca ccgacatcga cgccacctgc accccccgcc gcgccagcag caaccagcgc 180 ggcctgaacc agatctggaa cgtgaagaag cagagcgtgt acctgatgaa cctgcgcaag 240 agcggcaccc tgggccaccc cggcagcctg gacgagacca cctacgagcg cctggccgag 300 gagaccctgg acagcctggc cgagttcttc gaggacctgg ccgacaagcc ctacaccttc 360 gaggactacg acgtgagctt cggcagcggc gtgctgaccg tgaagctggg cggcgacctg 420 ggcacctacg tgatcaacaa gcagaccccc aacaagcaga tctggctatc tagccccagc 480 agcggcccca agcgctacga ctggaccggc aagaactggg tgtacagcca cgacggcgtg 540 agcctgcacg agctgctggc cgccgagctg accaaggccc tgaagaccaa gctggacctg 600 agcagcctgg cctacagcgg caaggacgcc 630 <210> 5 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GeneArt optimized nucleotide sequence encoding frataxin <400> 5 atgtggacac tggggagaag ggctgtggcc ggactgctgg cttctccatc tccagcccag 60 gcccagaccc tgaccagagt gcctagacct gccgaactgg cccctctgtg tggcagaaga 120 ggcctgagaa ccgacatcga cgccacctgt acccccagaa gggccagcag caatcagcgg 180 ggcctgaatc agatctggaa cgtgaagaaa cagagcgtgt acctgatgaa cctgagaaag 240 agcggcaccc tgggccaccc tggaagcctg gatgagacaa cctacgagcg gctggccgag 300 gaaaccctgg attccctggc cgagttcttc gaggacctgg ccgacaagcc ctacaccttc 360 gaggattacg acgtgtcctt cggcagcggc gtgctgacag tgaagctggg cggagatctg 420 ggcacctacg tgatcaacaa gcagaccccc aacaaacaga tctggctatc tagccccagc 480 agcggcccca agagatacga ttggaccggc aagaactggg tgtacagcca cgacggcgtg 540 tccctgcatg agctgctggc tgccgagctg accaaggccc tgaaaacaaa gctggacctg 600 tccagcctgg cctacagcgg caaggatgcc 630 <210> 6 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genscript (control) optimized Nucleotide sequence encoding frataxin <400> 6 atgtggacac tgggccggag agccgtcgct gggctgctgg catcaccatc ccccgcacag 60 gcacagaccc tgacaagagt ccctcggcca gcagagctgg ccccactgtg cgggcggaga 120 ggactgcgaa ccgacatcga tgctacttgt accccaaggc gagcaagctc caaccagcga 180 gggctgaacc agatttggaa tgtgaagaaa cagtctgtct acctgatgaa tctgagaaag 240 agcggcactc tgggacaccc tggcagcctg gacgagacca cctacgagcg gctggccgag 300 gaaaccctgg attccctggc cgagttcttt gaagacctgg ctgataagcc atacaccttc 360 gaagactatg acgtgagctt cggcagcggc gtgctgacag tcaaactggg cggggacctg 420 ggaacatacg tgatcaacaa gcagactcct aacaagcaga tttggctgtc tagtccctca 480 agcggcccta agaggtacga ctggacaggg aaaaactggg tgtatagtca cgatggcgtc 540 tcactgcatg agctgctggc cgctgaactg actaaagccc tgaaaactaa actggacctg 600 tcttccctgg catactctgg caaggacgcc 630 <210> 7 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genscript (low CpG) nucleotide sequence encoding frataxin <400> 7 atgtggactc tgggccggag agcagtggca ggactgctgg caagtccatc acctgctcag 60 gcacagactc tgacaagagt cccaagacct gcagagctgg ctccactgtg cgggaggcgc 120 ggactgagaa cagacatcga tgctacatgt actcctcgac gggcaagctc caaccagcga 180 gggctgaacc agatttggaa tgtgaagaaa cagtccgtct acctgatgaa tctgaggaag 240 tcaggcaccc tggggcaccc aggaagtctg gacgagacca catatgaacg gctggctgag 300 gaaacactgg attctctggc cgagttcttt gaagacctgg ctgataagcc ctacacattc 360 gaagactatg atgtgagctt tggatccggc gtgctgactg tcaaactggg cggggacctg 420 ggcacttacg tgatcaacaa gcagacccct aacaagcaga tttggctgtc tagtccttca 480 agcggaccaa agcggtacga ctggaccggc aaaaactggg tgtattctca cgatggggtc 540 agtctgcatg agctgctggc cgctgaactg accaaggccc tgaagacaaa actggacctg 600 tcctctctgg catatagcgg aaaagatgcc 630 <210> 8 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDT3 optimized Nucleotide sequence encoding frataxin <400> 8 atgtggacac tgggaaggcg cgccgtggcc ggtctgttgg catcaccatc cccagcccag 60 gctcagacac tcacccgagt cccaagaccc gcagagctgg cccctctgtg cgggcgccga 120 ggccttcgca ccgatatcga tgctacatgc acgccacgca gagctagctc aaatcagagg 180 ggactcaacc agatatggaa tgtcaagaag caaagcgtgt atctcatgaa cctccggaaa 240 agcggcaccc tgggacatcc cgggtctctc gacgagacca cttatgaaag actggcagag 300 gagactcttg acagtctggc ggagttcttc gaagacctcg ctgacaagcc atataccttc 360 gaagattacg acgtctcctt cggctctggg gtgctgactg tcaagcttgg cggcgacctg 420 gggacctacg tgatcaacaa gcagactcca aacaagcaaa tctggctatc tagtccaagc 480 tccggaccca agagatacga ttggacaggc aagaattggg tttactccca cgacggggtg 540 tccctccatg agctgctggc cgcagagctg acgaaggccc tgaagaccaa gctggatctc 600 tcctccctgg catacagtgg taaggacgct 630 <210> 9 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDT5 optimized Nucleotide sequence encoding frataxin <400> 9 atgtggacac tgggccggcg cgccgtcgct gggctgctcg caagccccag cccagcccaa 60 gcgcagactc tgactagggt gccgcggcct gccgagttgg cccccctgtg cggtaggaga 120 ggcctgcgca cagacatcga tgccacttgc acaccccggc gggccagctc taaccaaagg 180 ggcctgaatc aaatttggaa cgtcaaaaaa cagtctgtat atctgatgaa tctccggaaa 240 tctggaacgc tcgggcatcc cggatctctt gacgagacca cctacgagcg actggccgag 300 gaaacccttg acagcctggc agaattcttt gaggatctgg ctgataaacc ctataccttt 360 gaagattacg atgtgagttt tggtagcgga gtactgactg ttaagctggg cggtgatctc 420 ggtacgtatg ttatcaataa acaaaccccc aataaacaga tttggctctc ctccccatcc 480 tctgggccta agcgctatga ctggacagga aagaattggg tctattcaca cgacggagtc 540 agtttgcacg agctcctcgc cggcagagtt accaaggccc ttaagactaa gctcgacctg 600 tcaagcctcg cttactctgg taaggacgct 630 <210> 10 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding frataxin <400> 10 atgtggactc tcgggcgccg cgcagtagcc ggcctcctgg cgtcacccag cccggcccag 60 gcccagaccc tcacccgggt cccgcggccg gcagagttgg ccccactctg cggccgccgt 120 ggcctgcgca ccgacatcga tgcgacctgc acgccccgcc gcgcaagttc gaaccaacgt 180 ggcctcaacc agatttggaa tgtcaaaaag cagagtgtct atttgatgaa tttgaggaaa 240 tctggaactt tgggccaccc aggctctcta gatgagacca cctatgaaag actagcagag 300 gaaacgctgg actctttagc agagtttttt gaagaccttg cagacaagcc atacacgttt 360 gaggactatg atgtctcctt tgggagtggt gtcttaactg tcaaactggg tggagatcta 420 ggaacctatg tgatcaacaa gcagacgcca aacaagcaaa tctggctatc ttctccatcc 480 agtggaccta agcgttatga ctggactggg aaaaactggg tgtactccca cgacggcgtg 540 tccctccatg agctgctggc cgcagagctc actaaagcct taaaaaccaa actggacttg 600 tcttccttgg cctattccgg aaaagatgct 630 <210> 11 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDT-1 optimized Nucleotide sequence encoding frataxin <400> 11 atgtggactc tgggtaggcg agcggtggcc ggcctgttgg catctcctag tcctgcacaa 60 gctcaaacgc tgactagagt ccctcggcca gcagaactgg cgccactttg cggccggcgc 120 ggtcttcgca ctgatattga tgccacttgc acaccccggc gcgcctccag taatcagcgg 180 ggacttaatc aaatttggaa tgtgaagaag cagtctgtgt atcttatgaa tctgcggaag 240 agcgggaccc tgggccaccc tggtagcctt gatgaaacca cctatgagcg cctggccgaa 300 gagacactgg acagtcttgc cgagtttttt gaggatctgg ccgacaaacc ttatactttt 360 gaggactatg acgtgtcctt tggatctggt gtattgaccg taaaactcgg gggagacctt 420 gggacgtatg taataaataa gcagacccca aacaagcaga tctggctatc ttctccaagt 480 agtggtccta agagatatga ttggacgggc aagaactggg tctattccca tgatggcgtc 540 tctttgcatg aactccttgc agcagagctg accaaggcct tgaagaccaa attggatctc 600 agcagcctcg cctatagtgg caaagatgca 630 <210> 12 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDT-4 optimized Nucleotide sequence encoding frataxin <400> 12 atgtggactc tgggccggcg ggccgtagct ggcttgctgg ctagcccaag tcccgcccag 60 gctcagactc tcaccagggt acccaggccc gcagagcttg ctccactctg cggacgcagg 120 ggtctgcgaa ccgatatcga cgcaacttgc acgccgcgga gggcctcttc aaaccagaga 180 ggactcaatc aaatttggaa tgtaaagaaa cagagcgtgt atctcatgaa cctccgaaag 240 agtgggactc ttgggcaccc cggctccctg gacgagacta cttacgagcg cctggccgaa 300 gaaaccttgg attccctggc ggagtttttt gaagacttgg cagacaagcc ttataccttc 360 gaggattacg acgtgagttt tggctctggt gttcttacag tcaagctcgg tggcgacctt 420 ggcacttatg taattaacaa gcagacacct aacaagcaga tctggctttc tagtccgtct 480 tccggtccca aaaggtacga ttggactgga aagaactggg tctacagtca cgacggtgtc 540 tccctgcacg aattgcttgc ggcagagctg actaaggcgc tcaaaacaaa actggatctg 600 tccagccttg cctatagcgg gaaggacgca 630 <210> 13 <211> 2211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding chimeric AAV2.5 Vector Capsid VP1 <400> 13 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60 cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120 gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240 cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300 caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360 gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420 ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480 aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540 tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600 aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660 gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780 tccagcgctt caacgggagc ctcgaacgac aatcactact ttggctacag caccccttgg 840 gggtattttg acttcaacag attccactgc cacttttcac cacgtgactg gcaaagactc 900 atcaacaaca actggggatt ccgacccaag agactcaact tcaagctctt taacattcaa 960 gtcaaagagg tcacgcagaa tgacggtacg acgacgattg ccaataacct taccagcacg 1020 gttcaggtgt ttactgactc ggagtaccag ctcccgtacg tcctcggctc ggcgcatcaa 1080 ggatgcctcc cgccgttccc agcagacgtc ttcatggtgc cacagtatgg atacctcacc 1140 ctgaacaacg ggagtcaggc agtaggacgc tcttcatttt actgcctgga gtactttcct 1200 tctcagatgc tgcgtaccgg aaacaacttt accttcagct acacttttga ggacgttcct 1260 ttccacagca gctacgctca cagccagagt ctggaccgtc tcatgaatcc tctcatcgac 1320 cagtacctgt attacttgag cagaacaaac actccaagtg gaaccaccac gcagtcaagg 1380 cttcagtttt ctcaggccgg agcgagtgac attcgggacc agtctaggaa ctggcttcct 1440 ggaccctgtt accgccagca gcgagtatca aagacatctg cggataacaa caacagtgaa 1500 tactcgtgga ctggagctac caagtaccac ctcaatggca gagactctct ggtgaatccg 1560 ggcccggcca tggcaagcca caaggacgat gaagaaaagt tttttcctca gagcggggtt 1620 ctcatctttg ggaagcaagg ctcagagaaa acaaatgtgg acattgaaaa ggtcatgatt 1680 acagacgaag aggaaatcag gacaaccaat cccgtggcta cggagcagta tggttctgta 1740 tctaccaacc tccagagagg caacagacaa gcagctaccg cagatgtcaa cacacaaggc 1800 gttcttccag gcatggtctg gcaggacaga gatgtgtacc ttcaggggcc catctgggca 1860 aagattccac acacggacgg acattttcac ccctctcccc tcatgggtgg attcggactt 1920 aaacaccctc ctccacagat tctcatcaag aacaccccgg tacctgcgaa tccttcgacc 1980 accttcagtg cggcaaagtt tgcttccttc atcacacagt actccacggg acaggtcagc 2040 gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaaac gctggaatcc cgaaattcag 2100 tacacttcca actacgccaa gtctgtcaat gtggacttta ctgtggacaa taatggcgtg 2160 tattcagagc ctcgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta a 2211 <210> 14 <211> 2211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding wildtypeAAV1 capsid (VP1) <400> 14 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60 gagtggtggg acttgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120 gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca aagcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420 ggaaagaaac gtccggtaga gcagtcgcca caagagccag actcctcctc gggcatcggc 480 aagacaggcc agcagcccgc taaaaagaga ctcaattttg gtcagactgg cgactcagag 540 tcagtccccg atccacaacc tctcggagaa cctccagcaa cccccgctgc tgtgggacct 600 actacaatgg cttcaggcgg tggcgcacca atggcagaca ataacgaagg cgccgacgga 660 gtgggtaatg cctcaggaaa ttggcattgc gattccacat ggctgggcga cagagtcatc 720 accaccagca cccgcacctg ggccttgccc acctacaata accacctcta caagcaaatc 780 tccagtgctt caacgggggc cagcaacgac aaccactact tcggctacag caccccctgg 840 gggtattttg atttcaacag attccactgc cacttttcac cacgtgactg gcagcgactc 900 atcaacaaca attggggatt ccggcccaag agactcaact tcaaactctt caacatccaa 960 gtcaaggagg tcacgacgaa tgatggcgtc acaaccatcg ctaataacct taccagcacg 1020 gttcaagtct tctcggactc ggagtaccag cttccgtacg tcctcggctc tgcgcaccag 1080 ggctgcctcc ctccgttccc ggcggacgtg ttcatgattc cgcaatacgg ctacctgacg 1140 ctcaacaatg gcagccaagc cgtgggacgt tcatcctttt actgcctgga atatttccct 1200 tctcagatgc tgagaacggg caacaacttt accttcagct acacctttga ggaagtgcct 1260 ttccacagca gctacgcgca cagccagagc ctggaccggc tgatgaatcc tctcatcgac 1320 caatacctgt attacctgaa cagaactcaa aatcagtccg gaagtgccca aaacaaggac 1380 ttgctgttta gccgtgggtc tccagctggc atgtctgttc agcccaaaaa ctggctacct 1440 ggaccctgtt atcggcagca gcgcgtttct aaaacaaaaa cagacaacaa caacagcaat 1500 tttacctgga ctggtgcttc aaaatataac ctcaatgggc gtgaatccat catcaaccct 1560 ggcactgcta tggcctcaca caaagacgac gaagacaagt tctttcccat gagcggtgtc 1620 atgatttttg gaaaagagag cgccggagct tcaaacactg cattggacaa tgtcatgatt 1680 acagacgaag aggaaattaa agccactaac cctgtggcca ccgaaagatt tgggaccgtg 1740 gcagtcaatt tccagagcag cagcacagac cctgcgaccg gagatgtgca tgctatggga 1800 gcattacctg gcatggtgtg gcaagataga gacgtgtacc tgcagggtcc catttgggcc 1860 aaaattcctc acacagatgg acactttcac ccgtctcctc ttatgggcgg ctttggactc 1920 aagaacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacgcctg ttcctgcgaa tcctccggcg 1980 gagttttcag ctacaaagtt tgcttcattc atcacccaat actccacagg acaagtgagt 2040 gtggaaattg aatgggagct gcagaaagaa aacagcaagc gctggaatcc cgaagtgcag 2100 tacacatcca attatgcaaa atctgccaac gttgatttta ctgtggacaa caatggactt 2160 tatactgagc ctcgccccat tggcacccgt taccttaccc gtcccctgta a 2211 <210> 15 <211> 2208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding modified AAV1.1 capsid VP1 <400> 15 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60 gagtggtggg acttgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120 gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca aagcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420 ggaaagaaac gtccggtaga gcagtcgcca caagagccag actcctcctc gggcatcggc 480 aagacaggcc agcagcccgc taaaaagaga ctcaattttg gtcagactgg cgactcagag 540 tcagtccccg atccacaacc tctcggagaa cctccagcaa cccccgctgc tgtgggacct 600 actacaatgg cttcaggcgg tggcgcacca atggcagaca ataacgaagg cgccgacgga 660 gtgggtaatg cctcaggaaa ttggcattgc gattccacat ggctgggcga cagagtcatc 720 accaccagca cccgcacctg ggccttgccc acctacaata accacctcta caagcaaatc 780 tccagtgctt caggggccag caacgacaac cactacttcg gctacagcac cccctggggg 840 tattttgatt tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca gcgactcatc 900 aacaacaatt ggggattccg gcccaagaga ctcaacttca aactcttcaa catccaagtc 960 aaggaggtca cgacgaatga tggcgtcaca accatcgcta ataaccttac cagcacggtt 1020 caagtcttct cggactcgga gtaccagctt ccgtacgtcc tcggctctgc gcaccagggc 1080 tgcctccctc cgttcccggc ggacgtgttc atgattccgc aatacggcta cctgacgctc 1140 aacaatggca gccaagccgt gggacgttca tccttttact gcctggaata tttcccttct 1200 cagatgctga gaacgggcaa caactttacc ttcagctaca cctttgagga agtgcctttc 1260 cacagcagct acgcgcacag ccagagcctg gaccggctga tgaatcctct catcgaccaa 1320 tacctgtatt acctgaacag aactcaaaat cagtccggaa gtgcccaaaa caaggacttg 1380 ctgtttagcc gtgggtctcc agctggcatg tctgttcagc ccaaaaactg gctacctgga 1440 ccctgttatc ggcagcagcg cgtttctaaa acaaaaacag acaacaacaa cagcaatttt 1500 acctggactg gtgcttcaaa atataacctc aatgggcgtg aatccatcat caaccctggc 1560 actgctatgg cctcacacaa agacgacgaa gacaagttct ttcccatgag cggtgtcatg 1620 atttttggaa aagagagcgc cggagcttca aacactgcat tggacaatgt catgattaca 1680 gacgaagagg aaattaaagc cactaaccct gtggccaccg aaagatttgg gaccgtggca 1740 gtcaatttcc agagcagcag cacagaccct gcgaccggag atgtgcatgc tatgggagca 1800 ttacctggca tggtgtggca agatagagac gtgtacctgc agggtcccat ttgggccaaa 1860 attcctcaca cagatggaca ctttcacccg tctcctctta tgggcggctt tggactcaag 1920 aacccgcctc ctcagatcct catcaaaaac acgcctgttc ctgcgaatcc tccggcggag 1980 ttttcagcta caaagtttgc ttcattcatc acccaatact ccacaggaca agtgagtgtg 2040 gaaattgaat gggagctgca gaaagaaaac agcaagcgct ggaatcccga agtgcagtac 2100 acatccaatt atgcaaaatc tgccaacgtt gattttactg tggacaacaa tggactttat 2160 actgagcctc gccccattgg cacccgttac cttacccgtc ccctgtaa 2208 <210> 16 <211> 2211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding wildtype AAV6 capsid (VP1) <400> 16 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60 gagtggtggg acttgaaacc tggagccccg aaacccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120 gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggatgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca aagcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaagaaga gggttctcga accttttggt ctggttgagg aaggtgctaa gacggctcct 420 ggaaagaaac gtccggtaga gcagtcgcca caagagccag actcctcctc gggcattggc 480 aagacaggcc agcagcccgc taaaaagaga ctcaattttg gtcagactgg cgactcagag 540 tcagtccccg acccacaacc tctcggagaa cctccagcaa cccccgctgc tgtgggacct 600 actacaatgg cttcaggcgg tggcgcacca atggcagaca ataacgaagg cgccgacgga 660 gtgggtaatg cctcaggaaa ttggcattgc gattccacat ggctgggcga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacatg ggccttgccc acctataaca accacctcta caagcaaatc 780 tccagtgctt caacgggggc cagcaacgac aaccactact tcggctacag caccccctgg 840 gggtattttg atttcaacag attccactgc catttctcac cacgtgactg gcagcgactc 900 atcaacaaca attggggatt ccggcccaag agactcaact tcaagctctt caacatccaa 960 gtcaaggagg tcacgacgaa tgatggcgtc acgaccatcg ctaataacct taccagcacg 1020 gttcaagtct tctcggactc ggagtaccag ttgccgtacg tcctcggctc tgcgcaccag 1080 ggctgcctcc ctccgttccc ggcggacgtg ttcatgattc cgcagtacgg ctacctaacg 1140 ctcaacaatg gcagccaggc agtgggacgg tcatcctttt actgcctgga atatttccca 1200 tcgcagatgc tgagaacggg caataacttt accttcagct acaccttcga ggacgtgcct 1260 ttccacagca gctacgcgca cagccagagc ctggaccggc tgatgaatcc tctcatcgac 1320 cagtacctgt attacctgaa cagaactcag aatcagtccg gaagtgccca aaacaaggac 1380 ttgctgttta gccgggggtc tccagctggc atgtctgttc agcccaaaaa ctggctacct 1440 ggaccctgtt accggcagca gcgcgtttct aaaacaaaaa cagacaacaa caacagcaac 1500 tttacctgga ctggtgcttc aaaatataac cttaatgggc gtgaatctat aatcaaccct 1560 ggcactgcta tggcctcaca caaagacgac aaagacaagt tctttcccat gagcggtgtc 1620 atgatttttg gaaaggagag cgccggagct tcaaacactg cattggacaa tgtcatgatc 1680 acagacgaag aggaaatcaa agccactaac cccgtggcca ccgaaagatt tgggactgtg 1740 gcagtcaatc tccagagcag cagcacagac cctgcgaccg gagatgtgca tgttatggga 1800 gccttacctg gaatggtgtg gcaagacaga gacgtatacc tgcagggtcc tatttgggcc 1860 aaaattcctc acacggatgg acactttcac ccgtctcctc tcatgggcgg ctttggactt 1920 aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacgcctg ttcctgcgaa tcctccggca 1980 gagttttcgg ctacaaagtt tgcttcattc atcacccagt attccacagg acaagtgagc 2040 gtggagattg aatgggagct gcagaaagaa aacagcaaac gctggaatcc cgaagtgcag 2100 tatacatcta actatgcaaa atctgccaac gttgatttca ctgtggacaa caatggactt 2160 tatactgagc ctcgccccat tggcacccgt tacctcaccc gtcccctgta a 2211 <210> 17 <211> 2205 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding modified AAV6.1 capsid VP1 <400> 17 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctdgag ggcattcgcg 60 agtggtggga cttgaaacct ggagccccga aacccaaagc caaccagcaa aagcaggacg 120 acggccgggg tdggtgcttc ctggctacaa gtacctcgga cccttcaacg gactcgacaa 180 gggggagccc gtcaacgcgg cggatgcagc ggccctcgag cacgacaagg cctacgacca 240 gcagctcaaa gcgggtgaca atccgtacct gcggtataac cacgccgacg ccgagtttca 300 ggagcgtctg caagaagata cgtcttttgg gggcaacctc gggcgagcag tcttccaggc 360 caagaagagg gttctcgaac cttttggtdg gttgaggaag gtgctaagac ggctcctgga 420 aagaaacgtc cggtagagca gtcgccacaa gagccagact cctcctcggg cattggcaag 480 acaggccagc agcccgctaa aaagagactc aattttggtc agactggcga ctcagagtca 540 gtccccgacc cacaacctct cggagaacct ccagcaaccc ccgctgctgt gggacctact 600 acaatggctt caggcggtgg cgcaccaatg gcagacaata acgaaggcgc cgacggagtg 660 ggtaatgcct caggaaattg gcattgcgat tccacatggc tgggcgacag agtcatcacc 720 accagcaccc gaacatgggc cttgcccacc tataacaacc acctctacaa gcaaatctcc 780 agtgcttcag gggccagcaa cgacaaccac tacttcggct acagcacccc ctgggggtat 840 tttgatttca acagattcca ctgccatttc tcaccacgtg actggcagcg actcatcaac 900 aacaattggg gattccggcc caagagactc aacttcaagc tcttcaacat ccaagtcaag 960 gaggtcacga cgaatgatgg cgtcacgacc atcgctaata accttaccag cacggttcaa 1020 gtcttctcgg actcggagta ccagttgccg tacgtcctcg gctctgcgca ccagggctgc 1080 ctccctccgt tcccggcgga cgtgttcatg attccgcagt acggctacct aacgctcaac 1140 aatggcagcc aggcagtggg acggtcatcc ttttactgcc tggaatattt cccatcgcag 1200 atgctgagaa cgggcaataa ctttaccttc agctacacct tcgaggacgt gcctttccac 1260 agcagctacg cgcacagcca gagcctggac cggctgatga atcctctcat cgaccagtac 1320 ctgtattacc tgaacagaac tcagaatcag tccggaagtg cccaaaacaa ggacttgctg 1380 tttagccggg ggtctccagc tggcatgtct gttcagccca aaaactggct acctggaccc 1440 tgttaccggc agcagcgcgt ttctaaaaca aaaacagaca acaacaacag caactttacc 1500 tggactggtg cttcaaaata taaccttaat gggcgtgaat ctataatcaa ccctggcact 1560 gctatggcct cacacaaaga cgacaaagac aagttctttc ccatgagcgg tgtcatgatt 1620 tttggaaagg agagcgccgg agcttcaaac actgcattgg acaatgtcat gatcacagac 1680 gaagaggaaa tcaaagccac taaccccgtg gccaccgaaa gatttgggac tgtggcagtc 1740 aatctccaga gcagcagcac agaccctgcg accggagatg tgcatgttat gggagcctta 1800 cctggaatgg tgtggcaaga cagagacgta tacctgcagg gtcctatttg ggccaaaatt 1860 cctcacacgg atggacactt tcacccgtct cctctcatgg gcggctttgg acttaagcac 1920 ccgcctcctc agatcctcat caaaaacacg cctgttcctg cgaatcctcc ggcagagttt 1980 tcggctacaa agtttgcttc attcatcacc cagtattcca caggacaagt gagcgtggag 2040 attgaatggg agctgcagaa agaaaacagc aaacgctgga atcccgaagt gcagtataca 2100 tctaactatg caaaatctgc caacgttgat ttcactgtgg acaacaatgg actttatact 2160 gagcctcgcc ccattggcac ccgttacctc acccgtcccc tgtaa 2205 <210> 18 <211> 2208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding modified AAV6.3.1 capsid VP1 <400> 18 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60 gagtggtggg acttgaaacc tggagccccg aaacccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120 gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggatgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca aagcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaagaaga gggttctcga accttttggt ctggttgagg aaggtgctaa gacggctcct 420 ggaaagaaac gtccggtaga gcagtcgcca caagagccag actcctcctc gggcattggc 480 aagacaggcc agcagcccgc taaaaagaga ctcaattttg gtcagactgg cgactcagag 540 tcagtccccg acccacaacc tctcggagaa cctccagcaa cccccgctgc tgtgggacct 600 actacaatgg cttcaggcgg tggcgcacca atggcagaca ataacgaagg cgccgacgga 660 gtgggtaatg cctcaggaaa ttggcattgc gattccacat ggctgggcga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacatg ggccttgccc acctataaca accacctcta caagcaaatc 780 tccagtgctt caggggccag caacgacaac cactacttcg gctacagcac cccctggggg 840 tattttgatt tcaacagatt ccactgccat ttctcaccac gtgactggca gcgactcatc 900 aacaacaatt ggggattccg gcccaagaga ctcaacttca agctcttcaa catccaagtc 960 aaggaggtca cgacgaatga tggcgtcacg accatcgcta ataaccttac cagcacggtt 1020 caagtcttct cggactcgga gtaccagttg ccgtacgtcc tcggctctgc gcaccagggc 1080 tgcctccctc cgttcccggc ggacgtgttc atgattccgc agtacggcta cctaacgctc 1140 aacaatggca gccaggcagt gggacggtca tccttttact gcctggaata tttcccatcg 1200 cagatgctga gaacgggcaa taactttacc ttcagctaca ccttcgagga cgtgcctttc 1260 cacagcagct acgcgcacag ccagagcctg gaccggctga tgaatcctct catcgaccag 1320 tacctgtatt acctgaacag aactcagaat cagtccggaa gtgcccaaaa caaggacttg 1380 ctgtttagcc gggggtctcc agctggcatg tctgttcagc ccaaaaactg gctacctgga 1440 ccctgttacc ggcagcagcg cgtttctaaa acaaaaacag acaacaacaa cagcaacttt 1500 acctggactg gtgcttcaaa atataacctt aatgggcgtg aatctataat caaccctggc 1560 actgctatgg cctcacacaa agacgacgaa gacaagttct ttcccatgag cggtgtcatg 1620 atttttggaa aggagagcgc cggagcttca aacactgcat tggacaatgt catgatcaca 1680 gacgaagagg aaatcaaagc cactaacccc gtggccaccg aaagatttgg gactgtggca 1740 gtcaatctcc agagcagcag cacagaccct gcgaccggag atgtgcatgt tatgggagcc 1800 ttacctggaa tggtgtggca agacagagac gtatacctgc agggtcctat ttgggccaaa 1860 attcctcaca cggatggaca ctttcacccg tctcctctca tgggcggctt tggacttaag 1920 cacccgcctc ctcagatcct catcaaaaac acgcctgttc ctgcgaatcc tccggcagag 1980 ttttcggcta caaagtttgc ttcattcatc acccagtatt ccacaggaca agtgagcgtg 2040 gagattgaat gggagctgca gaaagaaaac agcaaacgct ggaatcccga agtgcagtat 2100 acatctaact atgcaaaatc tgccaacgtt gatttcactg tggacaacaa tggactttat 2160 actgagcctc gccccattgg cacccgttac ctcacccgtc ccctgtaa 2208 <210> 19 <211> 983 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding human wild type frataxin (WT FXN) for cloning into pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH scAAV vector <400> 19 tagaagaccg gtcgccacca tgtggactct cgggcgccgc gcagtagccg gcctcctggc 60 gtcacccagc ccagcccagg cccagaccct cacccgggtc ccgcggccgg cagagttggc 120 cccactctgc ggccgccgtg gcctgcgcac cgacatcgat gcgacctgca cgccccgccg 180 cgcaagttcg aaccaacgtg gcctcaacca gatttggaat gtcaaaaagc agagtgtcta 240 tttgatgaat ttgaggaaat ctggaacttt gggccaccca ggctctctag atgagaccac 300 ctatgaaaga ctagcagagg aaacgctgga ctctttagca gagttttttg aagaccttgc 360 agacaagcca tacacgtttg aggactatga tgtctccttt gggagtggtg tcttaactgt 420 caaactgggt ggagatctag gaacctatgt gatcaacaag cagacgccaa acaagcaaat 480 ctggctatct tctccatcca gtggacctaa gcgttatgac tggactggga aaaactgggt 540 gtactcccac gacggcgtgt ccctccatga gctgctggcc gcagagctca ctaaagcctt 600 aaaaaccaaa ctggacttgt cttccttggc ctattccgga aaagatgctt gacgagcggc 660 cgctcctagg agcagtatcg atcccagccc acttttcccc aatacgacta gtactcgact 720 gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 780 gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 840 agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 900 gaagacaaca gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga 960 accagctttg gacgcgtctt aag 983 <210> 20 <211> 983 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDT1 Codon optimized nucleotide sequence encoding FXN for cloning into pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH scAAV vector <400> 20 tagaagaccg gtcgccacca tgtggactct gggtaggcga gcggtggccg gcctgttggc 60 atctcctagt cctgcacaag ctcaaacgct gactagagtc cctcggccag cagaactggc 120 gccactttgc ggccggcgcg gtcttcgcac tgatattgat gccacttgca caccccggcg 180 cgcctccagt aatcagcggg gacttaatca aatttggaat gtgaagaagc agtctgtgta 240 tcttatgaat ctgcggaaga gcgggaccct gggccaccct ggtagccttg atgaaaccac 300 ctatgagcgc ctggccgaag agacactgga cagtcttgcc gagttttttg aggatctggc 360 cgacaaacct tatacttttg aggactatga cgtgtccttt ggatctggtg tattgaccgt 420 aaaactcggg ggagaccttg ggacgtatgt aataaataag cagaccccaa acaagcagat 480 ctggctcagc tctccaagta gtggtcctaa gagatatgat tggacgggca agaactgggt 540 ctattcccat gatggcgtct ctttgcatga actccttgca gcagagctga ccaaggcctt 600 gaagaccaaa ttggatctca gcagcctcgc ctatagtggc aaagatgcat agcgagcggc 660 cgctcctagg agcagtatcg atcccagccc acttttcccc aatacgacta gtactcgact 720 gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 780 gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 840 agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 900 gaagacaaca gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga 960 accagctttg gacgcgtctt aag 983 <210> 21 <211> 983 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized nucleotide sequence encoding FXN IDT3 (low expresser) for cloning into pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH scAAV vector <400> 21 tagaagaccg gtcgccacca tgtggacact gggaaggcgc gccgtggccg gtctgttggc 60 atcaccatcc ccagcccagg ctcagacact cacccgagtc ccaagacccg cagagctggc 120 ccctctgtgc gggcgccgag gccttcgcac cgatatcgat gctacatgca cgccacgcag 180 agctagctca aatcagaggg gactcaacca gatatggaat gtcaagaagc aaagcgtgta 240 tctcatgaac ctccggaaaa gcggcaccct gggacatccc gggtctctcg acgagaccac 300 ttatgaaaga ctggcagagg agactcttga cagtctggcg gagttcttcg aagacctcgc 360 tgacaagcca tataccttcg aagattacga cgtctccttc ggctctgggg tgctgactgt 420 caagcttggc ggcgacctgg ggacctacgt gatcaacaag cagactccaa acaagcaaat 480 ctggctcagc agtccaagct ccggacccaa gagatacgat tggacaggca agaattgggt 540 ttactcccac gacggggtgt ccctccatga gctgctggcc gctgagctga cgaaggccct 600 gaagaccaag ctggatctct cctccctggc atacagtggt aaggacgctt gacgagcggc 660 cgctcctagg agcagtatcg atcccagccc acttttcccc aatacgacta gtactcgact 720 gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 780 gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 840 agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 900 gaagacaaca gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga 960 accagctttg gacgcgtctt aag 983 <210> 22 <211> 983 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon-optimized nucleotide sequence encoding FXN IDT4 for cloning into pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH scAAV vector <400> 22 tagaagaccg gtcgccacca tgtggactct gggccggcgg gccgtagctg gcttgctggc 60 tagcccaagt cccgcccagg ctcagactct caccagggta cccaggcccg cagagcttgc 120 tccactctgc ggacgcaggg gtctgcgaac cgatatcgac gcaacttgca cgccgcggag 180 ggcctcttca aaccagagag gactcaatca aatttggaat gtaaagaaac agagcgtgta 240 tctcatgaac ctccgaaaga gtgggactct tgggcacccc ggctccctgg acgagactac 300 ttacgagcgc ctggccgaag aaaccttgga ttccctggcg gagttttttg aagacttggc 360 agacaagcct tataccttcg aggattacga cgtgagtttt ggctctggtg ttcttacagt 420 caagctcggt ggcgaccttg gcacttatgt aattaacaag cagacaccta acaagcagat 480 ctggctttct agtccgtctt ccggtcccaa aaggtacgat tggactggaa agaactgggt 540 ctacagtcac gacggtgtct ccctgcacga attgcttgcg gctgagctga ctaaggcgct 600 caaaacaaaa ctggatctgt ccagccttgc ctatagcggg aaggacgcat gacgagcggc 660 cgctcctagg agcagtatcg atcccagccc acttttcccc aatacgacta gtactcgact 720 gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 780 gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 840 agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 900 gaagacaaca gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga 960 accagctttg gacgcgtctt aag 983 <210> 23 <211> 983 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon-optimized nucleotide sequence encoding FXN GenScript for cloning into pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH scAAV vector <400> 23 tagaagaccg gtcgccacca tgtggacact gggccggaga gccgtcgctg ggctgctggc 60 atcaccatcc cccgcacagg cacagaccct gacaagagtc cctcggccag cagagctggc 120 cccactgtgc gggcggagag gactgcgaac cgacatcgat gctacttgta ccccaaggcg 180 agcaagctcc aaccagcgag ggctgaacca gatttggaat gtgaagaaac agtctgtcta 240 cctgatgaat ctgagaaaga gcggcactct gggacaccct ggcagcctgg acgagaccac 300 ctacgagcgg ctggccgagg aaaccctgga ttccctggcc gagttctttg aagacctggc 360 tgataagcca tacaccttcg aagactatga cgtgagcttc ggcagcggcg tgctgacagt 420 caaactgggc ggggacctgg gaacatacgt gatcaacaag cagactccta acaagcagat 480 ttggctgtct agtccctcaa gcggccctaa gaggtacgac tggacaggga aaaactgggt 540 gtatagtcac gatggcgtct cactgcatga gctgctggcc gctgaactga ctaaagccct 600 gaaaactaaa ctggacctgt cttccctggc atactctggc aaggacgcct gacgagcggc 660 cgctcctagg agcagtatcg atcccagccc acttttcccc aatacgacta gtactcgact 720 gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 780 gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 840 agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 900 gaagacaaca gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga 960 accagctttg gacgcgtctt aag 983 <210> 24 <211> 983 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon-optimized nucleotide sequence encoding FXN GenScript (low CpG) for cloning into pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH scAAV vector <400> 24 tagaagaccg gtcgccacca tgtggactct gggccggaga gcagtggcag gactgctggc 60 aagtccatca cctgctcagg cacagactct gacaagagtc ccaagacctg cagagctggc 120 tccactgtgc gggaggcgcg gactgagaac agacatcgat gctacatgta ctcctcgacg 180 ggcaagctcc aaccagcgag ggctgaacca gatttggaat gtgaagaaac agtccgtcta 240 cctgatgaat ctgaggaagt caggcaccct ggggcaccca ggaagtctgg acgagaccac 300 atatgaacgg ctggctgagg aaacactgga ttctctggcc gagttctttg aagacctggc 360 tgataagccc tacacattcg aagactatga tgtgagcttt ggatccggcg tgctgactgt 420 caaactgggc ggggacctgg gcacttacgt gatcaacaag cagaccccta acaagcagat 480 ttggctgtct agtccttcaa gcggaccaaa gcggtacgac tggaccggca aaaactgggt 540 gtattctcac gatggggtca gtctgcatga gctgctggcc gctgaactga ccaaggccct 600 gaagacaaaa ctggacctgt cctctctggc atatagcgga aaagatgcct gacgagcggc 660 cgctcctagg agcagtatcg atcccagccc acttttcccc aatacgacta gtactcgact 720 gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 780 gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 840 agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 900 gaagacaaca gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga 960 accagctttg gacgcgtctt aag 983 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding collagen stabilizing sequence <400> 25 cccagcccac ttttccccaa 20 <210> 26 <211> 797 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of CBh promoter <400> 26 tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 60 gtcaatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 120 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 180 caatgacggt aaatggcccg cctggcattg tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 240 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac 300 gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat 360 tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 420 ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 480 gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 540 aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgacgctg ccttcgcccc gtgccccgct 600 ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 660 gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 720 agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 780 ctttttttca ggttgga 797 <210> 27 <211> 254 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of bGHpoly A signal sequence <400> 27 ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 60 gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 120 ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 180 ggattgggaa gacaacagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 240 ggaaagaacc agct 254 <210> 28 <211> 2208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding AAV2i8 capsid (VP1) <400> 28 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60 cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120 gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240 cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300 caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360 gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420 ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480 aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540 tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600 aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660 gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780 tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840 tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900 aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960 aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020 caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080 tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140 aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200 cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260 cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320 tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380 cagttttctg tggccggacc cagtaacatg gctgtccagg gaaggaactg gcttcctgga 1440 ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaattt 1500 gcttggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560 ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620 atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680 gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740 accaacctcc agcaacagaa cacagcacca gctaccgcag atgtcaacac acaaggcgtt 1800 cttccaggca tggtctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860 attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920 caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980 ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040 gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100 acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160 tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208 <210> 29 <211> 735 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of AAV2i8 capsid (VP1) <400> 29 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Val 450 455 460 Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala Pro Ala Thr 580 585 590 Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655 Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 30 <211> 2208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding AAV2-TT capsid (VP1) <400> 30 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60 cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120 gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240 cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300 caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360 gcgaaaaaga ggattcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420 ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gcggagccag actcctcctc gggaaccgga 480 aagtcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540 tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600 aatacgatgg cttcaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660 gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780 tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840 tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900 aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcagcttca agctctttaa cattcaagtc 960 aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020 caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080 tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140 aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200 cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260 cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320 tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgat gtcaaggctt 1380 cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440 ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acagctgcgg ataacaacaa cagtgattac 1500 tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560 ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtatt ttcctcagag cggggttctc 1620 atctttggga agcaagactc aggaaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680 gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740 accaacctcc agagcggcaa cacacaagca gctacctcag atgtcaacac acaaggcgtt 1800 cttccaggca tggtctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860 attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920 caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980 ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040 gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100 acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160 tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208 <210> 31 <211> 735 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of AAV2-TT capsid (VP1) <400> 31 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Ala Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Met Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ala Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Asp Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Tyr Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Asp Ser Gly Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Ser Gly Asn Thr Gln Ala Ala Thr 580 585 590 Ser Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655 Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 32 <211> 2208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding AAV2-TT-S312N capsid (VP1) <400> 32 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60 cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120 gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240 cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300 caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360 gcgaaaaaga ggattcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420 ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gcggagccag actcctcctc gggaaccgga 480 aagtcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540 tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600 aatacgatgg cttcaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660 gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780 tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840 tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900 aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960 aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020 caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080 tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140 aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200 cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260 cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320 tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgat gtcaaggctt 1380 cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440 ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acagctgcgg ataacaacaa cagtgattac 1500 tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560 ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtatt ttcctcagag cggggttctc 1620 atctttggga agcaagactc aggaaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680 gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740 accaacctcc agagcggcaa cacacaagca gctacctcag atgtcaacac acaaggcgtt 1800 cttccaggca tggtctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860 attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920 caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980 ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040 gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100 acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160 tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208 <210> 33 <211> 735 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of AAV2-TT-S312N capsid (VP1) <400> 33 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Ala Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Met Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ala Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Asp Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Tyr Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Asp Ser Gly Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Ser Gly Asn Thr Gln Ala Ala Thr 580 585 590 Ser Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655 Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735

Claims (39)

  1. ◈청구항 1은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    프라탁신(FXN)을 암호화하는 변형된 핵산으로서,
    상기 프라탁신이 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 핵산이, 동일한 세포 내에서 서열번호 2의 야생형 FXN 핵산 서열의 발현 수준에 비해 더 큰 수준으로 발현되고, 서열번호 4 내지 7에 나타낸 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는, 변형된 핵산.
  2. 삭제
  3. FXN을 암호화하는 변형된 핵산으로서,
    상기 핵산이, 동일한 세포 내에서 서열번호 2의 야생형 FXN 핵산 서열의 발현 수준에 비해 더 큰 수준으로 발현되고,
    서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는, 변형된 핵산.
  4. 삭제
  5. ◈청구항 5은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제 1 항에 있어서,
    서열번호 5 또는 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 변형된 핵산.
  6. ◈청구항 6은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제 1 항에 따른 FXN를 암호화하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터.
  7. 제 3 항에 따른 FXN를 암호화하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터인, 벡터.
  9. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    핵산이 자가-상보적인, 벡터.
  10. 제 8 항에 있어서,
    rAAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVrh74, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV Hu.26, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV9.45, AAV2i8, AAV2G9, AAV2i8G9, AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N 및 AAV-LK03의 캡시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 캡시드를 추가로 포함하는, 벡터.
  11. 제 10 항에 있어서,
    캡시드가 AAV2i8, AAV9, AAV-LK03 및 AAV2-TT-S312N의 캡시드로 이루어진 군에서 선택되는, 벡터.
  12. 제 10 항에 있어서,
    변형된 핵산이 하나 이상의 아데노-연관 바이러스(AAV) 말단 반복 서열, 인핸서, 프로모터, 콜라겐 안정화 서열(CSS), 정지 코돈 및 폴리-아데닐화(폴리A) 신호 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 요소를 추가로 포함하는, 벡터.
  13. 제 12 항에 있어서,
    2개의 AAV 말단 반복 서열, 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴(CBh) 프로모터, CSS, 및 소 성장 호르몬 폴리-아데닐화 신호 서열(bGHpolyA)을 추가로 포함하는 벡터.
  14. 5'로부터 3'로
    (a) AAV2 말단 반복 서열;
    (b) 서열번호 26의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터;
    (c) 제 1 항 또는 제 3 항에 따른 FXN을 암호화하는 변형된 핵산;
    (d) 서열번호 25의 서열을 포함하는 CSS;
    (e) 서열번호 27의 서열을 포함하는 bGHpolyA 신호 서열; 및
    (f) AAV2 말단 반복 서열
    을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  15. 제 14 항에 있어서,
    VP1이 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 AAV2i8 캡시드를 추가로 포함하고, 5'로부터 3'로 (a) AAV2 말단 반복 서열; (b) 서열번호 26의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터; (c) 서열번호 4 내지 7 중 어느 하나의 서열을 포함하는, FXN을 암호화하는 변형된 핵산; (d) 서열번호 25의 서열을 포함하는 CSS; (e) 서열번호 27의 서열을 포함하는 bGHpolyA 신호 서열; 및 (f) AAV2 말단 반복 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  16. 제 14 항에 있어서,
    VP1이 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 AAV2-TT-S312N 캡시드를 추가로 포함하고, 5'로부터 3'로 (a) AAV2 말단 반복 서열; (b) 서열번호 26의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터; (c) 서열번호 4 내지 7 중 어느 하나의 서열을 포함하는, FXN을 암호화하는 변형된 핵산; (d) 서열번호 25의 서열을 포함하는 CSS; (e) 서열번호 27의 서열을 포함하는 bGHpolyA 신호 서열; 및 (f) AAV2 말단 반복 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  17. ◈청구항 17은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    치료를 필요로 하는 환자에서 프리드라이히 운동실조증(FRDA)을 치료하기 위한 rAAV 벡터로서,
    상기 rAAV 벡터가 FXN을 암호화하는 변형된 핵산을 포함하되, 상기 FXN이 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 변형된 핵산이 서열번호 4 내지 7 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  18. ◈청구항 18은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제 17 항에 있어서,
    FXN을 암호화하는 변형된 핵산이 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  19. 제 1 항 또는 제 3 항에 따른 FXN을 암호화하는 변형된 핵산을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 프리드라이히 운동실조증(FRDA)을 치료하기 위한 rAAV 벡터.
  20. 제 19 항에 따른 rAAV 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 프리드라이히 운동실조증(FRDA)의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    rAAV 벡터가 전신적으로, 직접적인 심장 투여에 의해, 또는 두개내 투여에 의해 투여되는, 약학 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서,
    rAAV 벡터가 두개내로 투여되는, 약학 조성물.
  23. 제 21 항에 있어서,
    rAAV 벡터가 심장내에 직접 투여되는, 약학 조성물.
  24. 제 21 항에 있어서,
    전신적 투여가 정맥내 투여인, 약학 조성물.
  25. 제 21 항에 있어서,
    FXN을 암호화하는 변형된 핵산이 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는, 약학 조성물.
  26. 제 1 항 또는 제 3 항에 따른 FXN을 암호화하는 변형된 핵산, 또는 제 7 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  27. 제 26 항에 있어서,
    VERO, WI38, MRC5, A549, HEK293 세포, B-50 세포, B-50이 아닌 HeLa 세포, HepG2, Saos-2, HuH7 및 HT1080으로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
  28. 제 27 항에 있어서,
    현탁 배양에서의 성장에 적합한 HEK293 세포인 숙주 세포.
  29. 제 27 항에 있어서,
    ATCC(American Type Culture Collection) 수탁번호 PTA 13274를 갖는 HEK293 세포인 숙주 세포.
  30. 제 26 항에 있어서,
    복제(Rep) 단백질, 캡시드(Cap) 단백질, 아데노바이러스 초기 영역 1a(E1a) 단백질, E1b 단백질, E2a 단백질, E4 단백질 및 VA(viral associated) RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아데노바이러스 성분을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  31. ◈청구항 31은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제 1 항에 있어서,
    세포에서 FXN의 수준을 증가시키는데 사용하기 위한, 변형된 핵산.
  32. 제 3 항에 있어서,
    세포에서 FXN의 수준을 증가시키는데 사용하기 위한, 변형된 핵산.
  33. ◈청구항 33은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제 18 항에 있어서,
    대상에서 프리드라이히 운동실조증을 치료하는데 사용하기 위한 rAAV 벡터.
  34. 제 12 항에 있어서,
    5'로부터 3'로
    (a) AAV2 말단 반복 서열;
    (b) 서열번호 26의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터;
    (c) 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는, FXN을 암포화하는 변형된 핵산;
    (d) 서열번호 27의 핵산 서열을 포함하는 bGHpolyA 신호 서열; 및
    (e) AAV2 말단 반복 서열
    을 포함하는 핵산을 포함하는, 벡터.
  35. 제 34 항에 있어서,
    AAV2i8, AAV9, AAV-LK03 및 AAV2-TT-S312N의 캡시드로 이루어진 군에서 선택되는 캡시드를 포함하는 벡터.
  36. 제 34 항에 있어서,
    FXN을 암호화하는 서열에 직접 후속하는(immediately following) 서열번호 25의 핵산 서열을 포함하는 CSS를 포함하는, 벡터.
  37. 제 36 항에 있어서,
    AAV2i8의 캡시드를 포함하고,
    5'로부터 3'으로
    (a) AAV2 말단 반복 서열;
    (b) 서열번호 26의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터;
    (c) 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 FXN을 암호화하는 변형된 핵산;
    (d) 서열번호 25의 핵산 서열을 포함하는 CSS;
    (e) 서열번호 27의 핵산 서열을 포함하는 bGHpolyA 신호 서열; 및
    (f) AAV2 말단 반복 서열
    을 포함하는, 벡터.
  38. 제 36 항에 있어서,
    AAV9의 캡시드를 포함하고,
    5'로부터 3'으로
    (a) AAV2 말단 반복 서열;
    (b) 서열번호 26의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터;
    (c) 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 FXN을 암호화하는 변형된 핵산;
    (d) 서열번호 25의 핵산 서열을 포함하는 CSS;
    (e) 서열번호 27의 핵산 서열을 포함하는 bGHpolyA 신호 서열; 및
    (f) AAV2 말단 반복 서열
    을 포함하는, 벡터.
  39. 제 36 항에 있어서,
    AAV-LK03의 캡시드를 포함하고,
    5'로부터 3'으로
    (a) AAV2 말단 반복 서열;
    (b) 서열번호 26의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터;
    (c) 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 FXN을 암호화하는 변형된 핵산;
    (d) 서열번호 25의 핵산 서열을 포함하는 CSS;
    (e) 서열번호 27의 핵산 서열을 포함하는 bGHpolyA 신호 서열; 및
    (f) AAV2 말단 반복 서열
    을 포함하는, 벡터.

KR1020187015819A 2015-11-05 2016-11-01 유전자 치료를 위한 변형된 프리드라이히 운동실조증 유전자 및 벡터 KR102200642B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562251288P 2015-11-05 2015-11-05
US62/251,288 2015-11-05
US201662411980P 2016-10-24 2016-10-24
US62/411,980 2016-10-24
PCT/IB2016/056572 WO2017077451A1 (en) 2015-11-05 2016-11-01 Modified friedreich ataxia genes and vectors for gene therapy

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217000034A Division KR20210005994A (ko) 2015-11-05 2016-11-01 유전자 치료를 위한 변형된 프리드라이히 운동실조증 유전자 및 벡터

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180077275A KR20180077275A (ko) 2018-07-06
KR102200642B1 true KR102200642B1 (ko) 2021-01-12

Family

ID=57288476

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187015819A KR102200642B1 (ko) 2015-11-05 2016-11-01 유전자 치료를 위한 변형된 프리드라이히 운동실조증 유전자 및 벡터
KR1020217000034A KR20210005994A (ko) 2015-11-05 2016-11-01 유전자 치료를 위한 변형된 프리드라이히 운동실조증 유전자 및 벡터

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217000034A KR20210005994A (ko) 2015-11-05 2016-11-01 유전자 치료를 위한 변형된 프리드라이히 운동실조증 유전자 및 벡터

Country Status (18)

Country Link
US (2) US10548947B2 (ko)
EP (1) EP3370778A1 (ko)
JP (2) JP6767483B2 (ko)
KR (2) KR102200642B1 (ko)
CN (1) CN108348621A (ko)
AU (2) AU2016347887B2 (ko)
BR (1) BR112018007453A2 (ko)
CA (1) CA2947584A1 (ko)
CO (1) CO2018004564A2 (ko)
HK (1) HK1250924A1 (ko)
IL (1) IL259141A (ko)
MX (1) MX2018005084A (ko)
PE (1) PE20181156A1 (ko)
PH (1) PH12018500964A1 (ko)
RU (2) RU2021102893A (ko)
SG (2) SG11201802408RA (ko)
TW (2) TWI654301B (ko)
WO (1) WO2017077451A1 (ko)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10617770B2 (en) * 2015-04-24 2020-04-14 University Of Florida Research Foundation, Incorporated AAV vector for treatment of Friedreich's ataxia
GB201508026D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Capsid
CN108289932A (zh) 2015-05-22 2018-07-17 D·D·格恩金 胞外dna作为神经变性的治疗靶点
MX2018005084A (es) * 2015-11-05 2019-05-16 Bamboo Therapeutics Inc Genes de ataxia de friedreich modificados y vectores para terapia genica.
WO2017165167A1 (en) * 2016-03-23 2017-09-28 The Regents Of The University Of California Methods of treating mitochondrial disorders
EP3491440A4 (en) 2016-09-21 2020-02-26 Commscope Technologies LLC ADAPTERLOCKANORDNUNG
NZ752941A (en) 2016-11-09 2023-04-28 Intrexon Corp Frataxin expression constructs
CN112501208A (zh) 2017-10-03 2021-03-16 普利维尔治疗公司 用于溶酶体障碍的基因疗法
CN111542549A (zh) 2017-10-03 2020-08-14 普利维尔治疗公司 用于溶酶体障碍的基因疗法
AU2018346105C1 (en) 2017-10-03 2023-10-12 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
EP4089173A1 (en) * 2017-10-17 2022-11-16 Fundació Institut d'Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol Vectors for the treatment of friedreich's ataxia
CN112292453A (zh) 2018-01-16 2021-01-29 Cls治疗有限公司 通过肝脏表达具有脱氧核糖核酸酶（dna酶）活性的酶治疗疾病
WO2020028840A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating friedreich's ataxia
CN113166748A (zh) * 2018-08-10 2021-07-23 逻辑生物治疗公司 用于治疗mma的非破坏性基因疗法
AU2019346655A1 (en) * 2018-09-28 2021-05-06 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
AU2019381776A1 (en) * 2018-11-16 2021-07-01 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus for treating Pompe disease
KR20210103469A (ko) * 2018-11-21 2021-08-23 스트라이드바이오 인코포레이티드 재조합 바이러스 벡터 및 이를 생산하기 위한 핵산
CA3133357A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Sigilon Therapeutics, Inc. Compositions, devices and methods for factor vii therapy
MX2021012184A (es) 2019-04-10 2022-01-24 Prevail Therapeutics Inc Terapias genicas para trastornos lisosomales.
US20230144548A1 (en) * 2019-06-30 2023-05-11 John Fraser Wright Recombinant aav vectors with altered immunogencity and methods of making the same
AU2020299026A1 (en) * 2019-07-04 2022-01-20 Children's Medical Research Institute Methods and AAV vectors for in vivo transduction
WO2021011368A1 (en) * 2019-07-12 2021-01-21 Dmitry Dmitrievich Genkin Treatment of diseases associated with protein misfolding by nervous system expression of an enzyme which has a deoxyribonuclease (dnase) activity
EP4028027A4 (en) * 2019-09-13 2023-11-01 Lacerta Therapeutics, Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING FRIEDREICH AAXIA
US11905523B2 (en) 2019-10-17 2024-02-20 Ginkgo Bioworks, Inc. Adeno-associated viral vectors for treatment of Niemann-Pick Disease type-C
AU2020405149A1 (en) * 2019-12-19 2022-07-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for treating Friedreich's ataxia
CN113755524B (zh) * 2020-06-02 2023-11-03 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 用于治疗脊髓性肌萎缩的腺相关病毒载体及其用途
WO2022026516A1 (en) * 2020-07-29 2022-02-03 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Transgene cassettes, aav vectors, and aav viral vectors for expression of human codon-optimized cstb
IL302608A (en) 2020-11-03 2023-07-01 Pfizer Methods for producing AAV vectors using ion exchange chromatography
CA3205924A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. Methods for purification of aav vectors by affinity chromatography
EP4271420A1 (en) * 2021-01-04 2023-11-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Methods and compositions for treatment of friedreich's ataxia
WO2022150772A1 (en) * 2021-01-11 2022-07-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for treating friedreich's ataxia
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2023114816A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Neurogene, Inc. Recombinant optimized galc constructs and methods for treating galc-associated disorders
GB202201242D0 (en) 2022-01-31 2022-03-16 Univ Edinburgh Recombinant optimized mecp2 cassettes and methods for treating rett syndrome and related disorders
GB202206336D0 (en) 2022-04-29 2022-06-15 Univ Edinburgh Recombinant therapeutic FMR1 constructs and methods of treating fragile X syndrome and related disorders
WO2024003687A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Pfizer Inc. Nucleic acids encoding acid alpha-glucosidase (gaa) and vectors for gene therapy
CN117089514A (zh) * 2023-10-13 2023-11-21 思鹏生物科技(苏州)有限公司 提升hek293细胞系aav生产效率的细胞筛选驯化方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010536358A (ja) 2007-08-20 2010-12-02 グラクソ グループ リミテッド 製造方法
JP2013526840A (ja) 2009-12-21 2013-06-27 ファーマシーネ，インコーポレイテッド 組み換えブチリルコリンエステラーゼおよびその切断型
US20140221462A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of cardiomyopathy due to friedreich ataxia

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62144903A (ja) * 1985-12-19 1987-06-29 Nobuo Ikeda 木材への処理液注入方法
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
JP4108746B2 (ja) 1995-06-07 2008-06-25 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル ヘルパーウイルスを含まないａａｖ産生
KR20000068501A (ko) 1996-09-06 2000-11-25 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 재조합 아데노-관련 바이러스 지정 유전자 요법을 위한 방법
US20030215422A1 (en) 1996-09-11 2003-11-20 John A. Chiorini Aav4 vector and uses thereof
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
WO1999061601A2 (en) 1998-05-28 1999-12-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Aav5 vector and uses thereof
DE69936104T2 (de) 1998-11-05 2008-01-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nukleinsäuresequenzen des adeno-assoziierten virus des serotyps i, und vektoren und wirtszellen, die diese enthalten
AU780231B2 (en) 1998-11-10 2005-03-10 University Of North Carolina At Chapel Hill, The Virus vectors and methods of making and administering the same
ATE318923T1 (de) 2000-06-01 2006-03-15 Univ North Carolina Doppelsträngige parvovirus-vektoren
CA2399576A1 (en) 2000-12-07 2002-06-13 Universite De Nantes Inducible highly productive raav packaging cell-lines
CN1856576B (zh) 2003-09-30 2011-05-04 宾夕法尼亚州立大学托管会 腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用
CN101124328A (zh) 2004-12-15 2008-02-13 北卡罗来纳查佩尔山大学 嵌合载体
US8889641B2 (en) 2009-02-11 2014-11-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
WO2011097640A1 (en) * 2010-02-08 2011-08-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecules encoding rantes, and compositions comprising and methods of using the same
EP2394667A1 (en) * 2010-06-10 2011-12-14 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Vectors and sequences for the treatment of diseases
JP6188686B2 (ja) * 2011-06-09 2017-08-30 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド フラタキシン（ｆｘｎ）への天然アンチセンス転写物の阻害によるｆｘｎ関連疾患の治療
EP2771455B1 (en) 2011-10-28 2016-10-05 The University of North Carolina At Chapel Hill Cell line for production of adeno-associated virus
AU2014229051B2 (en) 2013-03-15 2020-07-16 The Children's Hospital Of Philadelphia Vectors comprising stuffer/filler polynucleotide sequences and methods of use
AU2014227766B2 (en) 2013-03-15 2018-10-04 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for dual glycan binding AAV vectors
CA2907799A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
RU2705249C2 (ru) 2013-07-12 2019-11-06 Дзе Чилдрен'З Хоспитал Оф Филадельфия Вектор aav и анализ на нейтрализующие антитела против aav (аденоассоциированного вируса)
PT3024498T (pt) 2013-07-22 2020-03-06 Childrens Hospital Philadelphia Variante aav e composições, métodos e usos para transferência genética em células, órgãos e tecidos
ES2714535T3 (es) 2013-10-11 2019-05-28 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Métodos para predecir secuencias de virus ancestrales y usos de los mismos
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
MX2018005084A (es) * 2015-11-05 2019-05-16 Bamboo Therapeutics Inc Genes de ataxia de friedreich modificados y vectores para terapia genica.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010536358A (ja) 2007-08-20 2010-12-02 グラクソ グループ リミテッド 製造方法
JP2013526840A (ja) 2009-12-21 2013-06-27 ファーマシーネ，インコーポレイテッド 組み換えブチリルコリンエステラーゼおよびその切断型
US20140221462A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of cardiomyopathy due to friedreich ataxia

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020200976A1 (en) 2020-02-27
RU2021102893A (ru) 2021-03-03
EP3370778A1 (en) 2018-09-12
JP2021019591A (ja) 2021-02-18
PH12018500964A1 (en) 2018-11-12
US20200384073A1 (en) 2020-12-10
AU2016347887B2 (en) 2019-11-14
AU2016347887A1 (en) 2018-04-19
PE20181156A1 (es) 2018-07-19
US10548947B2 (en) 2020-02-04
TW201723179A (zh) 2017-07-01
WO2017077451A1 (en) 2017-05-11
SG11201802408RA (en) 2018-05-30
KR20180077275A (ko) 2018-07-06
TW201920673A (zh) 2019-06-01
SG10201912763QA (en) 2020-02-27
HK1250924A1 (zh) 2019-01-18
JP6767483B2 (ja) 2020-10-14
CO2018004564A2 (es) 2018-12-14
CA2947584A1 (en) 2017-05-05
BR112018007453A2 (pt) 2018-10-23
CN108348621A (zh) 2018-07-31
TWI743442B (zh) 2021-10-21
TWI654301B (zh) 2019-03-21
IL259141A (en) 2018-06-28
KR20210005994A (ko) 2021-01-15
AU2020200976B2 (en) 2021-09-30
RU2018116076A (ru) 2019-10-28
RU2018116076A3 (ko) 2020-08-21
US20170128528A1 (en) 2017-05-11
JP2018531609A (ja) 2018-11-01
RU2743792C2 (ru) 2021-02-26
MX2018005084A (es) 2019-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102200642B1 (ko) 유전자 치료를 위한 변형된 프리드라이히 운동실조증 유전자 및 벡터
US9506052B2 (en) Modified factor VIII and factor IX genes
EP3113787B1 (en) Improved raav vectors and methods for transduction of photoreceptors and rpe cells
JP6174318B2 (ja) アデノ随伴ウイルス構築物を含んでなるコンダクティング気道細胞を標的とするための組成物
ES2230569T3 (es) Funciones accesorias para uso en la produccion de viriones aav recombinantes.
KR20210112339A (ko) 윌슨병을 치료하기 위한 유전자 요법 구축물
US20220389456A1 (en) Modified soluble vegf receptor-1 genes and vectors for gene therapy
TW202206447A (zh) 具血影蛋白(spectrin)融合結構域之微型化肌肉萎縮蛋白及其用途
RU2807158C2 (ru) Генотерапевтические конструкции для лечения болезни вильсона
WO2023131345A1 (zh) 用于x染色体连锁肾上腺脑白质营养不良的基因治疗药物和方法
CN117377500A (zh) 具有改善的组织向性的腺相关病毒载体衣壳

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
A107 Divisional application of patent
GRNT Written decision to grant