TW201723179A - 用於基因治療之經修飾的弗里德賴希（ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ）運動失調基因及載體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於提供一種經修飾之FXN基因，其可提高可用於治療弗里德賴希(Friedreich)運動失調之經編碼蛋白質共濟失調蛋白(frataxin)之表現。

Description

用於基因治療之經修飾的弗里德賴希(FRIEDREICH)運動失調基因及載體
本發明係關於經修飾之共濟失調蛋白(frataxin)(FXN)基因、包含經修飾之FXN基因的載體、藉由提供表現量提高的非突變(野生型)粒線體蛋白共濟失調蛋白使用經修飾之FXN基因及含有該等基因之載體治療弗里德賴希(Friedreich)運動失調的方法，該弗里德賴希運動失調包括心肌病及/或與其相關聯之神經退化性疾病。
弗里德賴希運動失調(FRDA)係與編碼粒線體蛋白共濟失調蛋白之FXN基因之表現的降低及/或該FXN基因之突變相關聯。FRDA為常染色體隱性疾病，意謂個人僅在其自雙親遺傳缺陷基因時罹患此疾病。FRDA係由導致mRNA及共濟失調蛋白之蛋白含量降低之FXN基因的突變引起。缺陷共濟失調蛋白表現引起關鍵代謝變化，包括氧化還原失衡及ATP缺乏。
FRDA為影響兒童及青少年且導致進行性殘疾及過早死亡的神經退化性疾病。神經體征與感覺神經元之退化相關聯，且穿過周邊神經及脊髓之感覺資訊的流動受到嚴重影響。亦存在來自小腦及脊髓之肌肉控制信號的 一些損害。此等問題導致逐漸喪失表徵FRDA之平衡、協調及肌肉強度。此外，患者往往罹患很可能造成過早死亡的肥厚性心肌病。心臟增大、不規則心跳及心臟病之其他症狀為明顯的。
咸信，共濟失調蛋白調節粒線體內部的使用氧產生能量所需之鐵的含量。共濟失調蛋白似乎充當鐵的儲存庫，僅在需要鐵來合成粒線體中之酶時釋放鐵。因此，共濟失調蛋白的缺乏導致此等酶的缺乏且進一步降低很可能解釋弗里德賴希運動失調影響神經系統及心臟之細胞之原因的粒線體功能。
到目前為止，不存在用於停止或減緩FRDA之負面影響的療法。臨床使用或在評估下之當前治療方法針對緩解症狀且最大化生命品質。物理治療及言語治療已用於改良運動。此外，一些藥物已用於治療心臟病。因此，非常需要一種用於治療與FRDA相關聯之症狀的新穎治療方法。
本文揭示及例示了編碼共濟失調蛋白(FXN)之經修飾核酸及包含該經修飾核酸的載體及藉由向有需要之患者投與經修飾核酸或包含該核酸之載體來治療由減少含量的FXN介導之疾病的方法。
熟習此項技術者使用不超過常規實驗之途徑即可識別或能夠確定本文中所描述之本發明的特定實施例的許多等效物。此類等效物意欲由以下實施例(E)涵蓋。
E1. 一種用於治療人類個體之FRDA的經修飾FXN基因，其中經修飾FXN基因已經修飾以更改GC核苷酸之含量及/或具有減少數目之CpG二核苷酸。
E2. 如實施例1之經修飾FXN基因，其中歸因於CpG基元之甲基 化，CpG二核苷酸的降低數目呈足以抑制基因表現之沉默的量。
E3. 如實施例1之經修飾FXN基因，其中相對於野生型基因，GC核苷酸之含量大於10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%。
E4. 如實施例3之經修飾FXN基因，其具有>0.75、>0.80、>0.85、>0.90或>0.95之密碼子適應指數。
E5. 如實施例3之經修飾FXN基因，其包含選自SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：9中之任一者的序列。
E6. 如實施例1之經修飾FXN基因，其中相對於野生型基因，GC核苷酸之含量小於10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%。
E7. 如實施例1之經修飾FXN基因，其包括於病毒載體或質體中。
E8. 如實施例7之經修飾FXN基因，其中病毒載體為自我互補AAV序列。
E9. 如實施例8之經修飾FXN基因，其中該病毒載體係選自由以下各者組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAV Hu.26、AAV2i8、AAV2G9、rhAAV10、rhAAV74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N、AAV-LK03，及其組合及變體。
E10. 如實施例8之經修飾FXN基因，其中病毒載體為祖AAV載體。
E11. 如實施例8之經修飾FXN基因，其中病毒載體為包括來自AAV2、AAV3B、AAV6或AAV8之AAV主鏈的組合且進一步包含來自AAV9之半乳糖(Gal)結合足跡的嵌合AAV。
E12. 如實施例1之經修飾FXN基因，其中共濟失調蛋白具有SEQ ID NO.1之胺基酸序列或其功能片段。
E13.一種用於治療與有需要個體之共濟失調蛋白缺乏相關聯之疾病的方法，其包含向該個體投與治療有效量之經修飾FXN基因，其中該經修飾FXN基因已經修飾以增加或減少GC核苷酸之含量及/或減少CpG二核苷酸的數目。
E14. 如實施例13之方法，其中經修飾FXN基因編碼具有SEQ ID NO.1之胺基酸序列的共濟失調蛋白。
E15. 如實施例13之方法，其中經修飾FXN基因在靶細胞中表現，其中該等靶細胞為心臟細胞或神經元細胞。
E16. 如實施例13之方法，其中經修飾FXN基因在病毒或非病毒載體中傳遞至靶細胞。
E17. 如實施例16之方法，其中載體係藉由全身注射或藉由直接心臟或顱內注射傳遞。
E18. 一種治療有需要個體之弗里德賴希運動失調(FRDA)之方法，該方法包含：提供包含經修飾FXN基因之至少一個重組病毒載體，其中該經修飾FXN基因已經修飾以增加或減少GC核苷酸之含量及/或減少CpG二核苷酸之量；及在使經修飾FXN基因表現於在個體之心臟及/或神經元組織中產生治療有效量之共濟失調蛋白的含量之條件下向個體投與重組病毒載體。
E19. 如實施例18之方法，其中向個體之神經元或心肌細胞投與重組病毒載體。
E20. 一種用編碼共濟失調蛋白肽或其功能片段之經修飾FXN基因轉 染之宿主細胞，其中經修飾FXN基因已經修飾以增加或減少GC核苷酸之含量及/或減少CpG二核苷酸之數目。
E21. 一種製備共濟失調蛋白肽或其片段之方法，其包含：用編碼共濟失調蛋白肽或其功能片段之經修飾FXN基因轉染宿主細胞；及將宿主細胞保持在足以表現共濟失調蛋白肽之生物條件下。
E22. 如實施例21之方法，其中經修飾FXN基因相較於如SEQ ID NO：2中所闡述之野生型共濟失調蛋白的核酸序列具有增加含量之GC核苷酸及/或減少含量之CpG二核苷酸。
E23. 一種包含經修飾FXN基因之醫藥組合物，其中經修飾FXN基因具有增加或減少含量之GC核苷酸及/或減少數目之CpG二核苷酸，及醫藥學上可接受之載劑。
E24.一種用於治療FRDA之方法，其包含向需要治療之個體傳遞包含編碼FXN基因之經修飾聚核苷酸序列的載體，其中FXN基因在靶細胞中表現，進而治療個體之FRDA。靶細胞較佳地為心臟或神經元細胞，且載體較佳地經由直接心臟或顱內注射傳遞至靶細胞。
E25. 如實施例1之經修飾核酸，其中相對於野生型基因，經修飾核酸具有降低的GC含量，該降低的GC含量比野生型基因小20%、30%、40%、50%或60%，同時仍具有與野生型相同之表現量。可將沉默突變引入至寫碼序列中，以便減少基因之GC含量。
E26. 一種具有降低含量之CpG二核苷酸之編碼FXN的經修飾核酸。
E27. 一種用於治療有需要人類個體之FRDA的編碼FXN之經修飾核酸(亦被稱作「經修飾FXN基因」)，其中經修飾FXN基因已經修飾以相對於如SEQ ID NO：2所闡述之編碼FXN的野生型核酸序列增加GC含量且減 少一定順式基元。
E28. 一種經修飾FXN基因，其具有呈抑制基因表現之沉默的量之減少數目的CpG二核苷酸，此係由於與CpG二核苷酸之數目相比較，CpG基元之甲基化存在於如SEQ ID NO：2所闡述之編碼FXN的野生型核酸序列中。
E29. 一種治療個體之FRDA的方法，該方法包含：提供包含實施例1至12、23、及25至28中之任一者之經修飾FXN基因的至少一個重組病毒載體，且在使經修飾FXN基因表現於在個體之心臟及/或神經元組織中產生治療有效量之共濟失調蛋白之含量的條件下向個體投與重組病毒載體。
E30. 一種用於降低有需要個體之神經元及心肌細胞之弗里德賴希運動失調的影響或治療該弗里德賴希運動失調的方法，其包含向該個體投與治療有效量之重組病毒載體，該重組病毒載體包含編碼蛋白共濟失調蛋白之經修飾FXN核酸。
E31. 一種用於治療有需要個體之弗里德賴希運動失調的方法，其包括基於投與核酸之基因治療，該核酸包含選自由序列SEQ ID NO：3-9組成之群的核苷酸序列。
E32. 一種包含腺相關病毒(AAV)載體或其功能片段的組合物，該腺相關病毒載體包含經修飾FXN基因，其中該AAV載體包含單股AAV載體基因組、雙股AAV載體基因組或自我互補(sc)AAV載體基因組。
E33. 一種表現載體，其包含包括經修飾FXN基因之聚核苷酸或其片段。
E34. 如實施例33之載體，其中AAV包含選自由以下各者組成之群的 血清型之衣殼：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rhAAV10、rhAAV74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV Hu.26、AAV1.1(SEQ ID NO：15)、AAV2.5(SEQ ID NO.13)、AAV6.1(SEQ ID NO：17)、AAV6.3.1(SEQ ID NO：18)、AAV9.45、AAV2i8(SEQ ID NO：29)、AAV2G9、AAV2-TT(SEQ ID NO：31)、AAV2-TT-S312N(SEQ ID NO：33)、AAV3B-S312N及AAV-LK03。
E35. 如實施例34之載體，其進一步包含：AAV1.1衣殼，其中胺基酸殘基265缺失(SEQ ID NO：15)；AAV 6.1衣殼，其中胺基酸殘基265缺失(SEQ ID NO：17)；AAV 6.3.1衣殼，其中胺基酸殘基265缺失且胺基酸殘基531自Lys變為Glu(SEQ ID NO：18)。野生型AAV1衣殼之核苷酸序列展示於(SEQ ID NO：14)中，且野生型AAV6衣殼之核苷酸序列闡述於(SEQ ID NO：16)中。
E36. 一種包含實施例1至12、23、及25至28中之任一者之經修飾FXN基因的嵌合AAV病毒載體，其進一步包含包括來自AAV2、AAV3、AAV6、AAV8之AAV主鏈之組合的衣殼以及來自AAV9之半乳糖(Gal)結合足跡。特定言之，將來自AAV9之半乳糖(Gal)結合足跡接枝至硫酸肝素結合AAV血清型2上以改良轉導效率。
E37.一種包含實施例1至12、23及25至28中之任一者之經修飾FXN基因的嵌合AAV病毒載體，其進一步包含其中載體衣殼包括與AAV1及或AAV6之265缺失突變組合之酪胺酸突變以及將半乳糖結合足跡添加至衣殼蛋白。
E38.一種包含實施例1至12、23及25至28中之任一者之經修飾FXN基因的嵌合AAV病毒載體，其進一步包含嵌入AAV之HI結構回圈或在AAV 2主鏈中之585 aa之適當位置的靶向肽。另外，祖AAV載體可用於治療性活體內基因治療。值得注意地，與當代病毒或其部分相比，自祖病毒序列組裝之病毒粒子的使用在當前人口中呈現降低之易感性至預存在免疫性。
E39. 一種宿主細胞，其包含實施例1至12、23及25至28中之任一者之經修飾FXN基因。
E40. 一種製備共濟失調蛋白肽或其片段之方法，其包含：用實施例1至12、23及25至28中之任一者之經修飾FXN基因轉染宿主細胞，及將宿主細胞保持在足以表現共濟失調蛋白肽之生物條件下。
E41. 一種實施例1至12、23及25至28中之任一者的經修飾FXN基因在治療弗里德賴希運動失調中之用途。
E42. 一種包含用於治療引起人類個體之心臟組織中之神經元及細胞之退化的弗里德賴希運動失調之經修飾FXN基因的醫藥組合物，其中經修飾FXN基因具有增加量之GC核苷酸、減少量之GC核苷酸及/或具有減少數目之CpG二核苷酸數目；及醫藥學上可接受之載劑。
E43. 一種編碼共濟失調蛋白之表現最佳化核酸，其包含選自SEQ ID NO：3-9中之任一者之核酸序列。
E44. 一種包含闡述於SEQ ID NO：1中之胺基酸的編碼共濟失調蛋白之經修飾核酸，其中核酸具有至少55%之GC含量、與SEQ ID NO：2之核酸序列相比減少數目之CpG二核苷酸、至少0.8之密碼子適應指數(CAI)，且其中其表現於與包含SEQ ID NO：2之核酸序列的野生型共濟失調蛋白的 表現量相比更高之含量。
E45. 如實施例44之經修飾核酸，其中CAI為至少0.86。
E46. 如實施例44之經修飾核酸，其中CAI為至少0.95。
E47. 如實施例44之經修飾核酸，其中CAI為至少0.98。
E48. 如實施例44至47中之任一者之經修飾核酸，其中GC含量為至少61%。
E49. 如實施例44至47中之任一者之經修飾核酸，其中GC含量為至少69%。
E50. 如實施例44至49中之任一者之經修飾核酸，其中CpG二核苷酸之數目為約114至124。
E51. 一種包含在SEQ ID NO：1中闡述之胺基酸序列的編碼共濟失調蛋白(FXN)之經修飾核酸，其中該核酸之表現量高於SEQ ID NO：2之野生型FXN核酸序列的表現量，且其中該經修飾核酸包含選自由以下各者組成之群的至少一個特性：至少55%之GC含量、不超過124之CpG二核苷酸數目，及至少0.76之密碼子適應指數(CAI)。
E52. 如實施例51之經修飾核酸，該核酸包含選自由以下各者組成之群的至少一個特性：至少0.86、至少0.95或至少0.98之CAI；GC含量為至少57%、至少61%，或至少69%；CpG二核苷酸之數目小於124；及選自由如SEQ ID NO：3-9中所闡述之序列組成之群的核酸序列。
E53. 一種編碼FXN之經修飾核酸，其中該核酸表現於與SEQ ID NO：2之野生型FXN核酸序列的表現量相比更高的含量，且其中核酸包含以下各者中之至少一者：選自由SEQ ID NO：3-9組成之群的核酸序列；至少55%之GC含量；不超過117之CpG二核苷酸數目；及至少0.86之CAI。
E54. 如實施例53之經修飾核酸，其中該核酸序列係選自由SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：7組成之群。
E55. 如實施例43至54中之任一者之經修飾核酸，其包含SEQ ID NO：7之核酸序列。
E56. 如實施例1至12、23、25至28及43至55中之任一者之經修飾核酸，其進一步包含編碼至少一個AAV末端重複序列(TR)之核酸序列。
E57. 如實施例55之經修飾核酸，其中核酸為單股、雙股及/或自我互補。
E58. 如實施例57之經修飾核酸，其中該核酸為自我互補。
E59. 如實施例1至12、23、25至28及43至58中之任一者之經修飾核酸，其進一步包含強化子。
E60. 如實施例59之經修飾核酸，其中強化子為細胞巨大病毒(CMV)立即早期強化子。
E61. 如實施例1至12、23、25至28及43至60中之任一者之經修飾核酸，其進一步包含啟動子。
E62. 如實施例1至12、23、25至28及43至61中之任一者之經修飾核酸，其中啟動子為組成性的或經調節的。
E63. 如實施例62之經修飾核酸，其中啟動子為經調節的。
E64. 如實施例63之經修飾核酸，其中啟動子為誘導性的或可抑制的。
E65. 如實施例1至12、23、25至28及43至64中之任一者之經修飾核酸，其進一步包含編碼膠原蛋白穩定序列(collagen stabilization sequence；CSS)之核酸序列。
E66. 如實施例1至12、23、25至28及43至65中之任一者之經修飾核酸，其進一步包含終止密碼子。
E67. 如實施例1至12、23、25至28及43至66中之任一者之經修飾核酸，其進一步包含聚腺苷酸化(polyA)信號序列。
E68. 如實施例67之經修飾核酸，其中啟動子係選自由以下各者組成之群：雞β肌動蛋白(CBA)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)啟動子、CMV強化子/CBA啟動子(CBh)，及合成CAG啟動子。
E69. 如實施例68之經修飾核酸，其中啟動子為CBh啟動子。
E70. 如實施例1至6、12、25至28及44至69中之任一者之經修飾核酸，其進一步包含編碼膠原蛋白穩定序列(CSS)之核酸序列。
E71. 一種重組AAV載體(rAAV)，其包含實施例1至12、23、25至28及43至70中之任一者之編碼FXN的經修飾核酸。
E72. 如實施例71之rAAV，其中該rAAV包含選自由來自以下各者之衣殼組成之群的衣殼：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、AAV2.5(SEQ ID NO.13)、AAV hu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV2i8、AAV2G9、AAV9.45、AAV2i8G9、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N及AAV-LK03。
E73. 如實施例72之rAAV，其中該衣殼係選自由AAV2-TT、AAV2-TT-S312N及AAV2i8衣殼組成之群。
E74. 如實施例73之rAAV，其中經修飾核酸包含SEQ ID NO：7之序 列，且其中衣殼係選自AAV2i8衣殼及AAV2-TT-S312N衣殼。
E75. 如實施例74之rAAV，其中核酸進一步包含側接編碼FXN之序列的兩個AAV末端重複序列，且進一步包含在編碼FXN之序列上游的CBh啟動子。
E76. 如實施例75之rAAV，該核酸進一步包含來自編碼FXN之序列的膠原蛋白穩定序列(CSS；SEQ ID NO：25)3'。
E77. 如實施例71至76中之任一者之rAAV，其中核酸包含牛生長激素polyA(bGHpolyA)信號序列。
E78. 一種rAAV載體，其包含AAV2i8衣殼，其中VP1包含SEQ ID NO：29之胺基酸，且進一步包含自5'至3'包含以下之核酸：(a)AAV2末端重複序列(TR)；(b)CBh啟動子，其包含SEQ ID NO：26之核酸序列；(c)編碼FXN之經修飾核酸，其包含選自由SEQ ID NO：3-9組成之群的核酸序列；(d)CSS，其具有SEQ ID NO：25之序列；(e)bGHpolyA信號序列，其具有SEQ ID NO：27之序列；及(f)AAV2 TR。
E79. 一種包含AAV2-TT衣殼之rAAV載體，其中VP1包含SEQ ID NO：31之胺基酸，且進一步包含自5'至3'包含以下之核酸：(a)AAV2 TR；(b)CBh啟動子，其包含SEQ ID NO：26之核酸序列；(c)編碼FXN之經修飾核酸，其包含選自由SEQ ID NO：3-9組成之群的核酸序列； (d)CSS，其具有SEQ ID NO：25之序列；(e)bGHpolyA信號序列，其具有SEQ ID NO：27之序列；及(f)AAV2 TR。
E80. 一種包含AAV2-TT-S312N衣殼之rAAV載體，其中VP1包含SEQ ID NO：33之胺基酸，且進一步包含自5'至3'包含以下之核酸：(a)AAV2 TR；(b)CBh啟動子，其包含SEQ ID NO：26之核酸序列；(c)編碼FXN之經修飾核酸，其包含選自由SEQ ID NO：3-9組成之群的核酸序列；(d)CSS，其具有SEQ ID NO：25之序列；(e)bGHpolyA信號序列，其具有SEQ ID NO：27之序列；及(f)AAV2 TR。
E81. 如實施例71至80中之任一者之rAAV載體，其中編碼FXN之經修飾核酸包含SEQ ID NO：7之核酸序列。
E82. 一種用於治療有需要個體之弗里德賴希運動失調之rAAV載體，其中該載體包含實施例1至6、12、25至28及71至81中之任一者之編碼共濟失調蛋白之經修飾核酸。
E83. 一種醫藥組合物，其包含實施例7至11、33至39及71至82中之任一者之rAAV載體及醫藥學上可接受的載劑。
E84. 一種治療個體之FRDA的方法，該方法包含投與以下各者中之至少一者：實施例1至12、23、25至28及43至70中之任一者之編碼共濟失調蛋白之經修飾核酸；實施例7至11、33至39及71至82中之任一者之rAAV載體；及實施例83之醫藥組合物。
E85. 如實施例84之方法，其中全身性地投與或藉由直接心臟或顱內投與來投與實施例7至11、33至39及71至82中之任一者之rAAV載體。
E86. 如實施例85之方法，其中顱內投與實施例71至82中之任一者之rAAV載體。
E87. 如實施例85之方法，其中直接向心臟投與實施例71至82中之任一者之rAAV載體。
E88. 如實施例84之方法，其中編碼FXN之經修飾核酸包含SEQ ID NO：6之核酸序列。
E89. 如實施例84之方法，其中編碼FXN之經修飾核酸包含SEQ ID NO：7之核酸序列。
E90. 一種治療由減少含量之FTX介導之疾病、病症或病狀的方法，該方法包含投與以下各者中之至少一者：實施例1至6、12、25至28及43至70中之任一者之編碼共濟失調蛋白的經修飾核酸；實施例7至11、33至39及71至82中之任一者之rAAV載體；及實施例83之醫藥組合物。
E91. 一種宿主細胞，其包含實施例1至6、12、25至28及43至70中之任一者之編碼FXN的經修飾核酸。
E92. 如實施例91之宿主細胞，其中細胞係選自由以下各者組成之群：VERO、WI38、MRC5、A549、HEK293細胞、B-50或任何其他HeLa細胞、HepG2、Saos-2、HuH7及HT1080。
E93. 如實施例92之宿主細胞，其中宿主細胞為適於在懸浮培養物中生長之HEK293。
E94. 如實施例91至93中之任一者之宿主細胞，其中細胞為具有ATCC第PTA 13274號之HEK293細胞。
E95. 一種包含實施例7至11、33至39及70至82中之任一者之rAAV載體的包裝細胞，其中該細胞進一步包含編碼AAV Rep蛋白之至少一個核酸、編碼AAV Cap蛋白之至少一個核酸，及編碼輔助功能之至少一個核酸。
E96. 一種用於製造rAAV載體之方法，該方法包含在製造rAAV之條件下培養實施例91至95中之任一者的細胞。
E97. 如實施例96之方法，其進一步包含分離所製造之rAAV。
E98. 以下各者中之至少一者提高細胞中之共濟失調蛋白含量之用途：實施例1至6、12、25至28及43至70中之任一者之編碼共濟失調蛋白的經修飾核酸；實施例7至11、33至39及71至82中之任一者的rAAV載體；及實施例83之醫藥組合物。
E99. 將如實施例1至6、12、25至28及43至70中之任一者之編碼共濟失調蛋白的經修飾核酸；實施例7至11、33至39及71至82中之任一者之rAAV載體；及實施例83之醫藥組合物用於增加個體之共濟失調蛋白的含量。
E100. 將如實施例1至6、12、25至28及43至70中之任一者之編碼共濟失調蛋白的經修飾核酸；實施例7至11、33至39及71至82中之任一者的rAAV載體；及實施例83之醫藥組合物用於治療個體之弗里德賴希運動失調。
本發明之其他特徵及優勢將自以下詳細描述、圖式、例示性實施例及申請專利範圍顯而易見。
圖1A及圖1B。圖1A及圖1B皆展示與野生型核酸相比來自編碼FXN 之所選經修飾核酸之共濟失調蛋白在HeLa細胞中之表現的結果(泳道1)。包含以下經修飾核酸之來自HeLa細胞之萃取物經檢查以偵測在細胞中產生之FXN。共濟失調蛋白係藉由使用抗共濟失調蛋白抗體之西方墨點法偵測，該抗體係使用與HRP(辣根過氧化酶)共軛以用於藉由將蛋白質印跡曝光於光敏薄膜之化學發光偵測的二級抗體來偵測。泳道裝載有來自用編碼共濟失調蛋白之以下經修飾核酸轉染之HeLa細胞的萃取物：泳道1：野生型對照核酸；泳道2：IDT2；泳道3：IDT5；泳道4：JCAT；泳道5：GeneArt；泳道6：Genscript(對照物)；及泳道7：Genscript(低CpG)。
圖2A至圖2F展示用於選殖至自我互補rAAV載體pTRs-KS-CBh-EGFP-bGHpolyA之各種經修飾FXN基因構造體之序列，其中使用野生型FXN基因(SEQ ID NO：2)或其經修飾版本(例如，SEQ ID NO：3-9)來替換EGFP標記基因。每一圖式展示WT FXN(圖2A)或經修飾FXN基因(圖2B至圖2F)。每一構造體包含(自5'至3')AgeI切割位點、FXN/經修飾FXN基因、AvrII切割位點、膠原蛋白穩定序列(CSS)、SpeI切割位點、bGHpolyA信號序列，及MluI切割位點。圖2A展示pTRs-KS-CBh-WTFXN-bGHpolyA構造體(SEQ ID NO：19)；圖2B展示整合式DNA技術IDT 1(IDT1)經修飾FXN基因構造體pTRs-KS-CBh-IDT1 FXN-bGHpolyA(SEQ ID NO：20)；圖2C展示IDT3經修飾FXN基因構造體pTRs-KS-CBh-IDT3 FXN-bGHpolyA(SEQ ID NO：21)；圖2D展示IDT4經修飾FXN基因構造體pTRs-KS-CBh-IDT4 FXN-bGHpolyA(SEQ ID NO：22)；圖2E展示GenScript經修飾FXN基因構造體pTRs-KS-CBh-GenScript FXN-bGHpolyA(SEQ ID NO：23)；且圖2F展示GenScript(低CpG)經修飾FXN基因構造體pTRs-KS-CBh-Genscript(低CpG)FXN-bGHpolyA(SEQ ID NO：24)，每一序列包括在圖2A至圖2F中自5'至3'經如下指示之元件(例如，AgeI、AvrII、CSS、SpeI、bGHpolyA及MluI)：以粗體指示之AgeI切割位點(ACCGGT)；呈小寫字母之FXN基因，藉由下劃線指示之AvrII切割位點(CCTAGG)；藉由雙下劃線指示之編碼膠原蛋白穩定序列(CSS)的序列；以 粗體帶下劃線 指示之SpeI切割位點( ACTAGT )；以斜體指示之牛生長激素聚腺苷酸化信號序列(bGHpolyA)；及以 粗斜體 指示之MluI切割位點( ACGCGT )。構造體中之FXN基因在AgeI切割位點上游之CBh啟動子的控制下。CBh啟動子之序列並未展示於圖2A至圖2F中，但闡述於SEQ ID NO：25中。
圖3展示描繪包括AgeI切割位點上游之CBh啟動子的載體之各種限制(切割)位點及元件的pTRs-KS-CBh-eGFP選殖構造體之載體(質體)圖。
圖4A及圖4B展示說明對照組、經治療突變及未治療突變雄性(圖4A)及雌性(圖4B)小鼠之基線心臟表型的曲線圖。圖4A在每一分組內自左至右展示對照雄性、經治療突變小鼠及未治療突變小鼠之心臟表型，其中該等分組為：EF(射血分數)、FS(縮短分數)；LV Vol_d(左心室容積舒張)；及LV Vol_s(左心室容積收縮)。圖4B展示雌性小鼠群組之基線心臟表型：對照組(圓形)；經治療突變小鼠(方形)；及未治療突變小鼠(三角形)。
圖5A及圖5B展示說明在5週齡(及對經治療突變小鼠之治療後14天)時與未經治療Mck突變小鼠中之心臟表型相比較的經治療Mck突變小鼠中之FRDA心臟表型的反轉的曲線圖。圖5A展示在rAAV-FXN注射14天之後的對照組(圓形)、經治療突變(方形)及未治療突變(三角形)之雄性小鼠的心臟表型。縮寫詞如下：AoV SV(主動脈瓣心搏出量)；AoV CO(主動脈 瓣心輸出量)；FS(縮短分數)；及LV Mass AW(左心室質量前壁)。圖5B展示在rAAV-FXN注射14天之後的對照組(圓形)、經治療突變(方形)及未治療突變(三角形)之雄性小鼠的心臟表型。縮寫詞如下：ES(射血分數)；FS(縮短分數)；AoV SV(主動脈瓣心搏出量)；AoV CO(主動脈瓣心輸出量)。
圖6A至圖6C展示說明在經治療Mck突變組之rAAV-FXN治療後的二十八(28)天之雄性及雌性對照小鼠(圓形)、經治療突變雄性及雌性小鼠(方形)及未治療突變雄性及雌性小鼠(三角形)的心臟功能的曲線圖。圖6A展示對歷時連續數週(亦即，3週齡(rAAV投與時間)、5週齡(rAAV投與後14天)及7週齡(rAAV投與後28天))之所有三個小鼠群組之左心室質量(LVM)超聲心動圖評估，其中在5週齡投與治療劑。圖6B展示歷時連續數週之所有三個小鼠群組之縮短因素(SF)超聲心動圖評估。圖6C展示歷時連續數週之所有三個小鼠群組的心輸出量超聲心動圖評估。資料為每組8個小鼠之平均值±S.E.M。使用多個t-測試比較(Sidak-Bonferroni method)將Mck突變小鼠之資料與Mck陽性對照組相比較。*p<0.05。
定義
除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域中一般技術者通常理解之含義。本文中所使用的術語僅出於描述特定實施例之目的且並不意欲限制本發明。如本發明之描述及所附申請專利範圍中所使用，除非上下文中另有清楚指示，否則單數形式「一」及「該」亦意欲包括複數形式。以下術語具有給定含義：如本文中所使用，當指代可量測值(諸如生物活性之量、聚核苷酸或 多肽序列之長度、G及C核苷酸之含量、密碼子適應指數、CpG二核苷酸之數目、劑量、時間、溫度及其類似物)時，術語「約」意謂涵蓋指定量之20%、10%、5%、1%、0.5%或甚至0.1%的變化。
如本文所用，術語「及/或」係指及涵蓋相關所列項目中之一或多者之任何及所有可能組合，以及當以替代性(「或」)解釋時不具有組合。
AAV「rep」及「cap」基因指代編碼腺相關病毒之複製及衣殼化蛋白質的聚核苷酸序列。AAV rep及cap在本文中被稱作AAV「封裝基因」。
本發明提供重組腺相關病毒(rAAV)載體。「AAV」為腺相關病毒之縮寫，且可用於指代病毒自身或其衍生物。除非另有要求，否則該術語覆蓋所有次型及天然存在及重組之形式兩者。縮寫詞「rAAV」指代重組腺相關病毒，其亦被稱作重組AAV載體(或「rAAV載體」)或簡稱為「AAV載體」。術語「AAV」包括例如各種血清型之AAV，例如，AAV 1型(AAV-1)、AAV 2型(AAV-2)、AAV 3型(AAV-3)、AAV 4型(AAV-4)、AAV 5型(AAV-5)、AAV 6型(AAV-6)、AAV 7型(AAV-7)、AAV 8型(AAV-8)、AAV 9型(AAV-9)、AAV 10型(AAV-10，包括AAVrh10)、AAVrh74、AAV 12型(AAV-12)、禽類AAV、牛AAV、犬類AAV、馬類AAV、靈長類AAV、非靈長類AAV，及綿羊類AAV。「靈長類AAV」指代感染靈長類之AAV，「非靈長類AAV」指代感染非靈長類哺乳動物之AAV，「牛AAV」指代感染牛哺乳動物之AAV等等。
出於若干原因各種血清型之AAV為有吸引力的，最顯著地為AAV被認為係非病原的且野生型病毒可整合其基因組位點，特異性地整合至人類19號染色體(Linden等人，1996年，Proc Natl Acad Sci USA 93：11288- 11294)。人類基因組中之AAV的插入位點被稱作AAVS1。與隨機整合相反之定點整合被認為很可能產生可預測的長期表現圖譜。
各種血清型之AAV的基因組序列以及自然末端重複序列(TR)之序列、Rep蛋白質及衣殼次單元為此項技術中已知的。此類序列可發現於文獻中或諸如GenBank之公共資料庫中。參看，例如，GenBank寄存編號NC-002077(AAV-1)、AF063497(AAV-1)、NC-001401(AAV-2)、AF043303(AAV-2)、NC-001729(AAV-3)、NC-001829(AAV-4)、U89790(AAV-4)、NC-006152(AAV-5)、AF513851(AAV-7)、AF513852(AAV-8)及NC-006261(AAV-8)；該等GenBank寄存編號之揭示內容以引用之方式併入本文中。亦參看，例如，Srivistava等人，1983，J.Virology 45：555；Chiorini等人，1998，J.Virology 71：6823；Chiorini等人，1999，J.Virology 73：1309；Bantel-Schaal等人，1999，J.Virology 73：939；Xiao等人，1999，J.Virology 73：3994；Muramatsu等人，1996，Virology 221：208；Shade等人，1986，J.Virol.58：921；Gao等人，2002，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99：11854；Moris等人，2004，Virology 33：375-383；國際專利公開案WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；WO 2013/063379；WO 2014/194132；WO 2015/121501；及美國專利第6,156,303號及第7,906,111號。
如本文所使用之「rAAV載體」係指包含不屬於AAV來源之聚核苷酸序列(亦即，與AAV異源之聚核苷酸)的AAV載體，通常為細胞之遺傳轉化的感興趣序列。在一些實施例中，異源聚核苷酸可藉由至少一個，且有時藉由兩個AAV末端反向重複序列(ITRs)側接。術語rAAV載體涵蓋rAAV載體粒子及rAAV載體質體兩者。rAAV載體可為單股(ssAAV)或自 我互補(scAAV)。「AAV病毒」或「AAV病毒粒子」或「rAAV載體粒子」係指由至少一個AAV衣殼蛋白(通常藉由野生型AAV之所有衣殼蛋白)及衣殼化聚核苷酸rAAV載體組成的病毒粒子。若粒子包含異源聚核苷酸(亦即，除野生型AAV基因組，諸如待傳遞至哺乳動物細胞之轉殖基因以外的聚核苷酸)，則其通常被稱作「rAAV載體粒子」或簡稱為「rAAV載體」。因此，rAAV粒子之製造必定包括rAAV載體之製造，因此載體內含於rAAV粒子。
如本文所使用之「重組」意謂載體、聚核苷酸、多肽或細胞為選殖、限制或連接步驟(例如與聚核苷酸或包含於其中之多肽相關)及/或導致構造體不同於在自然界中發現之產品的其他程序之各種組合的產物。重組病毒或載體為包含重組性聚核苷酸之病毒粒子。該等術語分別包括原始聚核苷酸構造體及原始病毒構造體之子代的複製品。
「AAV Rep」意謂AAV複製蛋白及其類似物。
「AAV Cap」意謂AAV衣殼蛋白、VP1、VP2及VP3及其類似物。在野生型AAV病毒中，三種衣殼基因vp1、vp2及vp3彼此重疊。參看，Grieger及Samulski，2005，J.Virol.79(15)：9933-9944。單個P40啟動子允許所有三種衣殼蛋白vp1、vp2、vp3分別以約1：1：10之比率表現，其與rAAV製造互補。對於重組AAV載體之製造，VP1：VP2：VP3之所要比率在約1：1：1至約1：1：100的範圍內，較佳地在約1：1：2至約1：1：50的範圍內，更佳地在約1：1：5至約1：1：20的範圍內。儘管VP1：VP2之所要比率為1：1，但VP1：VP2之比率範圍可在1：50至50：1之範圍內變化。
已知AAV血清型之衣殼之胺基酸序列的全面清單及比對由Marsic等人，2014，Molecular Therapy 22(11)：1900-1909提供，尤其在補充圖1 處。
僅出於說明之目的，野生型AAV2包含藉由重疊序列由三種蛋白(VP1、VP2及VP3；總共60個衣殼蛋白組成AAV衣殼)組成之AAV的較小(20nm至25nm)二十面體病毒衣殼。蛋白VP1(735 aa；Genbank寄存編號AAC03780)、VP2(598 aa；Genbank寄存編號AAC03778)及VP3(533 aa；Genbank寄存編號AAC03779)在衣殼中以1：1：10之比率存在。亦即，對於AAV，VP1為全長蛋白，且VP2及VP3為VP1的進行性更短版本，相對於VP1具有增大的N端截短。
「AAV TR」意謂在AAV基因組之末端或末端附近之回文末端重複序列，包含通常互補、對稱地佈置之序列，且包括自然AAV TR及其類似物之類似物。
「順式基元」包括諸如在基因組序列之端處或接近端發現且經辨識用於複製初始化之保存序列；內部位置處之隱含啟動子或序列很可能用於轉錄初始化、拼接或終止。
「治療」意謂反轉、減緩或禁止此類術語所適用之病症或病狀或此類病症或病狀的一或多種症狀之進程。
「治療有效量」意謂必需向個體提供治療益處之活性劑的最小量。舉例而言，對患者之「治療有效量」為引發、改良、穩定、減緩進程或以其他方式引起病理症狀、與病症相關聯之疾病進程或生理條件或屈服於病症之抵抗力的改良。
「基因」意謂含有能夠在經轉錄及轉譯之後編碼特定多肽或蛋白之至少一個開放閱讀框架的聚核苷酸。
「寫碼序列」意謂「編碼特定蛋白」或「編碼核酸」之序列，其表 示當置於適當之調節序列的控制下(可操作地連接於適當之調節序列)時，該核酸序列經轉錄(在DNA之情況下)及轉譯(在mRNA之情況下)為活體外或活體內多肽。寫碼序列之邊界藉由5'(胺基)端處之起始密碼子及3'(羧基)端處之翻譯終止密碼子判定。寫碼序列可包括(但不限於)來自原核或真核mRNA之cDNA、來自原核或真核DNA之基因組DNA序列，及甚至合成DNA序列。
「嵌合」意謂關於病毒衣殼或粒子，該衣殼或粒子包括來自不同細小病毒(較佳地不同AAV血清型)之序列，如Rabinowitz等人美國專利6,491,907中所描述，該專利之揭示內容以全文引用之方式併入於本文中。亦參看Rabinowitz等人，2004，J.Virol.78(9)：4421-4432。尤其較佳的嵌合病毒衣殼為AAV2.5衣殼，其具有帶以下突變之AAV2衣殼的序列：263 Q至A；265插入T；705 N至A；708 V至A；及716 T至N。其中如WO 2006/066066中所描述將編碼此類衣殼之核苷酸序列定義為SEQ ID NO：15。其他較佳的嵌合AAV包括(但不限於)：描述於WO 2010/093784中之AAV2i8、描述於WO 2014/144229中之AAV2G9及AAV8G9，及AAV9.45(Pulicherla等人，2011，Molecular Therapy 19(6)：1070-1078)。
「側接」，關於藉由其他元件側接之序列，指示相對於序列在上游及/或下游存在一或多個側接元件，亦即，5'及/或3'。術語「側接」並不意欲指示序列必需為連續的。舉例而言，編碼轉基因之核酸與側接元件之間可存在插入序列。藉由兩個其他元件(例如，TR)「側接」之序列(例如，轉基因)指示一個元件位於序列之5'且另一元件位於序列之3'；然而，可存在在其之間的插入序列。
「聚核苷酸」意謂藉由磷酸二酯鍵連接之核苷酸的序列。在本文中在自5'至3'方向之方向上呈現聚核苷酸。本發明之聚核苷酸可為去氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。其中聚核苷酸為DNA分子，彼分子可為基因或cDNA分子。在本文中藉由單字母碼指示核苷酸鹼基：腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸(腺)嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌核苷(I)及尿嘧啶(U)。可使用熟習此項技術者所熟知之標準技術來製備本發明之聚核苷酸。
藉由病毒「轉導」細胞意謂存在核酸自病毒粒子至細胞之轉移。
「經修飾FXN基因」意謂與編碼FXN之野生型核酸(例如，SEQ ID NO：2)相比較具有至少一個修飾之編碼FXN的經修飾核酸(例如，SEQ ID NO：1之胺基酸序列)，其中該修飾包括(但不限於)增加之GC含量、減少之GC含量或具有減少之CpG含量的FXN基因。較佳地，經修飾FXN基因展現經改良之蛋白表現，例如，藉此與由野生型基因提供之蛋白在細胞中之表現量相比較，經編碼蛋白在其他相同細胞中以可偵測地較高含量表現。
細胞之「轉染」意謂出於基因修飾細胞之目的將遺傳物質引入至細胞中。轉染可藉由此項技術中已知之各種方式實現，諸如磷酸鈣、聚乙二亞胺、電穿孔及其類似物。
除非另外規定，否則「多肽」涵蓋肽及蛋白兩者。
「基因轉移」或「基因傳遞」係指用於可靠地將外來DNA插入至宿主細胞的方法或系統。此類方法可導致非整合式經轉移DNA的短暫表現、經轉移複製子(例如，游離基因體)之染色體外複製及表現，或經轉移遺傳物質至宿主細胞之基因組DNA中的整合。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換 使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」、「經轉型細胞」及「經轉導細胞」，該等「轉型體」、「經轉型細胞」及「經轉導細胞」包括主要經轉型細胞及自其衍生之後代而不考慮繼代之數目。
針對傳遞至靶細胞(在本文中亦稱為「宿主細胞」)且包括在靶細胞中之表現，「轉基因」用於意謂併入於載體(包括病毒載體)中之任何異源核苷酸序列及相關聯表現控制序列，諸如啟動子。熟習此項技術者應理解，將基於促進轉基因在靶細胞中之表現的能力選擇表現控制序列。轉基因之實例為編碼治療性多肽的核酸。
「載體」意謂包含待傳遞至活體外或活體內之宿主細胞中之聚核苷酸的重組質體或病毒。
當指代核酸或其片段時，「實質同源性」或「實質相似性」意謂指示：當適當之核苷酸插入或缺失與另一核酸(或其互補股)最佳地對準時，存在與該序列至少約95%至99%一致的核苷酸序列。
「重組病毒載體」意謂包含一或多個異源序列(亦即，不屬於病毒來源之多核苷酸序列)的重組性聚核苷酸載體。在重組細小病毒載體之情況下，重組性聚核苷酸係藉由至少一個、較佳地兩個末端反向重複序列(ITRs)側接。
「同源」在關於肽使用時係指兩種肽之間的胺基酸序列相似性。當兩種肽中之胺基酸位置由相同胺基酸佔據時，其在彼位置同源。因此「實質上同源」意謂很大程度上但不完全同源之胺基酸序列，且當該序列同源時其保留大部分或所有活性。如本文中所使用，如本文所使用之「實質上同源」意謂序列與參考肽至少50%相同，且同源性為較佳地至少75%且更 佳地95%。當肽具有與未經修飾肽實質上相同的活性或功能的時候，額外肽序列修飾包括在內，諸如本文揭示之序列的胺基酸序列之微小變化、缺失、替代物或衍生物。胺基酸之衍生物可包括(但不限於)：三氟白胺酸、六氟白胺酸、5,5,5-三氟異白胺酸、4,4,4-三氟纈胺酸、p-氟苯丙胺酸、o-氟酪胺酸、m-氟酪胺酸、2,3-二氟酪胺酸、4-氟組胺酸、2-氟組胺酸、2,4-二氟組胺酸、氟脯胺酸、二氟脯胺酸、4-羥脯胺酸、硒甲硫胺酸、碲甲硫胺酸、硒半胱胺酸、硒色胺酸、4-胺基色胺酸、5-胺基色胺酸、5-羥色胺酸、7-氮雜色胺酸、4-氟色胺酸、5-氟色胺酸、6-氟色胺酸、高烯丙基甘胺酸、高炔丙基甘胺酸、2-丁炔基甘胺酸、順式-巴豆基甘胺酸、烯丙基甘胺酸、脫氫白胺酸、脫氫脯胺酸、2-胺基-3-甲基-4-戊烯酸、疊氮基高丙胺酸、疊氮基丙胺酸(asidoalanine)、疊氮基正白胺酸、p-乙炔基苯丙胺酸、p-疊氮基苯丙胺酸、p-溴苯基丙胺酸、p-乙醯基苯丙胺酸及苯并呋喃基丙胺酸。值得注意地，經修飾肽將保留與未經修飾肽相關聯之活性或功能，經修飾肽將大體上具有與未經修飾序列之胺基酸序列「實質上同源」的胺基酸序列。
聚核苷酸或多肽與另一聚核苷酸或多肽具有一定百分比「序列一致性」，意謂，當比對時，在比較兩個序列時鹼基或胺基酸之彼百分比相同。可以多種不同方式判定序列相似性。為判定序列一致性，可使用方法及電腦程式(包括BLAST，在全球資訊網ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上可用)比對序列。另一比對演算法為FASTA，其在遺傳學計算群組(Genetics Computing Group；GCG)封裝(來自Wis.，Madison，美國)中可用。用於比對之其他技術描述於Methods in Enzymology第266卷：Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996)，Doolittle編， Academic Press公司中。尤其受關注之係准許序列中之空隙的比對程式。Smith-Waterman為一種准許序列比對中之空隙的演算法。參看Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)。又，使用Needleman及Wunsch比對方法之GAP程式可用於比對序列。參看J.Mol.Biol.48：443-453(1970)。
所關注之係BestFit程式使用Smith and Waterman之局部同源演算法(1981，Advances in Applied Mathematics 2：482-489)以判定序列一致性。空隙產生罰分將大體在1至5、通常2至4之範圍內，且在許多實施例中將為3。空隙擴展罰分將大體在約0.01至0.20之範圍內，且在許多例項中將為0.10。程式具有由經輸入以相比較之序列判定的預設參數。較佳地，使用由程式判定之預設參數來判定序列一致性。亦自遺傳學計算群組(GCG)封裝(來自Madison,WI，美國)商購此程式。
所關注之另一程式為FastDB演算法。FastDB描述於Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications，第127頁至149頁，1988，Alan R.Liss公司中。
基於以下參數藉由FastDB計算百分比序列一致性：不匹配罰分：1.00；空隙罰分：1.00；空隙大小罰分：0.33；及連接罰分：30.0。
本發明提供經修飾的FXN基因。本發明亦提供核酸構造體，諸如載體，其包括作為其序列之部分，經修飾的FXN基因(例如，GC含量最佳化的FXN基因序列)與野生型FXN基因序列相比較包含更大或更小量之GC核苷酸，及/或與野生型FXN基因中存在之CpG二核苷酸之含量相比較，FXN基因序列具有減少含量的CpG二核苷酸。舉例而言，本發明包括質體及/或其他載體，該等其他載體包括經修飾的FXN序列以及其他元件(諸如 調節元件)。此外，本發明提供包括經修飾FXN序列之經封裝的基因運載工具，諸如病毒衣殼。本發明亦包括傳遞方法，且較佳地，藉由將經修飾序列傳遞至細胞以及促進細胞中之表現所需的元件來表現經修飾的FXN基因。本發明亦提供基因治療方法，其中向個體投與經修飾的FXN基因序列，例如，作為載體之組分及/或經封裝為病毒基因運載工具的組分。治療可例如見效以提高個體之共濟失調蛋白的含量且治療個體之共濟失調蛋白缺乏。在隨後部分中進一步論述本發明之此等態樣中的每一者。
用於共濟失調蛋白之表現的經修飾核酸
本發明提供編碼共濟失調蛋白之經修飾核苷酸序列。經修飾之核苷酸序列包括含有一或多個修飾之野生型或自然FXN基因序列。
在一個態樣中，與來自SEQ ID NO：2之野生型核酸序列之共濟失調蛋白在細胞中之表現相比較，經修飾核酸序列提供共濟失調蛋白在其他相同細胞中之可偵測地更高表現量。此可被稱作「表現最佳化」或「增強表現」核酸，或簡稱為「經修飾核酸」。
如在本文中可互換地指代，「最佳化」或「經密碼子優化」係指寫碼序列已相對於野生型寫碼序列(例如，共濟失調蛋白之寫碼序列)經最佳化以提高寫碼序列之表現，例如，藉由最小化罕見密碼子之使用、降低CpG二核苷酸之數目、移除隱含剪接供體或受體位點、移除Kozak序列、移除核糖體進入位點，及類似者。
修飾的實例包括消除一或多個順式作用基元及引入一或多個Kozak序列。在一個實施例中，消除一或多個順式作用基元且引入一或多個Kozak序列。
可經消除之順式作用基元的實例包括：內部TATA盒；chi位點；核 糖體進入位點；ARE、INS、及/或CRS序列元件；重複序列及/或RNA二級結構；(隱含)剪接供體及/或受體位點、分支點；及Sall。
在一個實施例中，相對於SEQ ID NO：2之野生型FXN基因序列，GC含量(例如核酸序列中存在之G及C核苷酸之數目)增加。GC含量比野生型基因(SEQ ID NO：2)多較佳地至少5%、更佳地至少6%、更佳地至少7%、甚至更佳地至少8%、更佳地至少9%、甚至更佳地至少10%、更佳地至少12%、甚至更佳地至少14%、更佳地至少15%、更佳地至少17%、甚至更佳地至少20%、甚至更佳地至少30%、更佳地至少40%、更佳地至少50%、甚至更佳地至少60%且最佳地至少70%。
在另一實施例中，GC含量以G(鳥嘌呤)及C(胞嘧啶)核苷酸在序列中之百分比表示。亦即，編碼共濟失調蛋白之野生型核酸(SEQ ID NO：1)的GC含量為約55%，而本發明之代表性經修飾FXN基因的GC含量之範圍為IDT-3(SEQ ID NO：8)約57%、Genescript(SEQ ID NO：6)57%；GeneArt(SEQ ID NO：5)61%及JCAT(SEQ ID NO：4)69%。因此，與如SEQ ID NO：2中所闡述之編碼共濟失調蛋白之野生型核酸序列約55%的GC含量相比較，本發明的經修飾核酸包含至少57%、更佳地至少61%之GC含量，甚至更佳地至少69%的GC含量。
在一個實施例中，本發明的經修飾核酸之GC含量大於包含SEQ ID NO：2之核酸序列的編碼共濟失調蛋白之野生型核酸的GC含量。熟習此項技術者應理解，在知曉核酸碼之簡併性之情況下，與編碼蛋白之核酸序列無關，自其表現之共濟失調蛋白的胺基酸序列較佳地為SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明的編碼FXN之經修飾核酸的GC含量與野生 型FNX基因(SEQ ID NO：2)之GC含量相同(亦即，為約55%)。
另外，編碼共濟失調蛋白之經修飾核酸(亦即，經修飾的FXN基因)之密碼子適應指數為較佳地至少0.74、較佳地至少0.76、甚至更佳地至少0.77、更佳地至少0.80、較佳地至少0.85、更佳地至少0.86、更佳地至少0.87、甚至更佳地至少0.90、更佳地至少0.95，且最佳地至少0.98。
在另一實施例中，與編碼FXN之野生型核酸序列(例如，SEQ ID NO：2)相比較，經修飾的FXN序列具有減少含量的CpG二核苷酸，該含量減少約10%、20%、30%、50%或更多。
已知，CpG二核苷酸之甲基化在真核細胞之基因表現的調節中起重要作用。特定言之，真核細胞中之CpG二核苷酸的甲基化基本上用於經由干擾轉錄機制來沉默基因表現。因此，歸因於藉由CpG基元之甲基化誘發的基因沉默，具有減少數目之CpG二核苷酸的本發明之核酸及載體將提供較高且長效的轉基因表現量。
在一個實施例中，經修飾的FXN基因包含比野生型FXN基因少之潛在CpG島區域，亦即，128個。較佳地，經修飾的FXN基因包含約124個潛在CpG島區域，更佳地約123個，甚至更佳地約117個，且更佳地約114個潛在CpG島區域。
經修飾的FXN基因序列亦可包括促進次選殖至表現載體中之側接限制位點。許多此類限制位點為此項技術中熟知的且包括(但不限於)圖2A至圖2F、及圖3(scAAV質體載體pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH之質體圖)及表8(SEQ ID NO：19-23)中所展示之彼等位點，諸如，AgeI、AvrII、SpeI及MluI。
本發明亦包括編碼功能活性片段共濟失調蛋白之序列SEQ ID NO：3 至9中之任一者的片段。「功能活性」或「功能性共濟失調蛋白」指示片段提供與全長共濟失調蛋白相同或類似之生物活性。亦即，片段提供相同活性包括(但不限於)：校正主要Fe-S集群缺乏；降低粒線體鐵積累(Puccio等人，2001，Nature Genetics 27：181-186；Seznec等人，2004，Human Mol.Genet.13：1017-1024)；及如Perdomini等人，2014，Nature Med.20(5)：542-547中所論述的其他缺乏。FXN或其功能片段之生物活性亦涵蓋逆轉或防止Mck小鼠中與如本文中其他處表明之FRDA相關聯的心臟表型。
本發明包括含有經修飾FXN基因序列及各種調節或對照元件之核酸載體。適用於基因表現之調節元件的精確性質將在自生物體至生物體及自細胞類型至細胞類型之範圍內變化。大體而言，其包括引導所關注之細胞中之RNA轉錄的初始化之啟動子。啟動子可為組成性或經調節的。組成性啟動子為使得可操作地連接之基因基本上始終經表現的彼等。經調節的啟動子為可經活化或去活化之彼等。經調節的啟動子包括誘導性啟動子，其通常為「關閉」但可經誘發以變為「打開」，及「可抑制」啟動子，其通常為「打開」但可變為「關閉」。許多不同調節子為已知的，包括溫度、激素、細胞激素、重金屬及調節蛋白。區別並不絕對；組成性啟動子可往往經調節至某一含量。在一些情況下，內源性路徑可經利用以提供轉基因表現之調節，例如，使用在病理條件改良時自然地下調之啟動子。
合適的啟動子的實例包括：腺病毒啟動子，諸如腺病毒主要晚期啟動子；異源啟動子，諸如細胞巨大病毒(CMV)啟動子；呼吸道融合性病毒啟動子；勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子；白蛋白啟動子；誘導性啟動子，諸如小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子；金屬硫蛋白啟動子；熱休克啟動 子；α-1-抗胰蛋白酶啟動子；B型肝炎表面抗原啟動子；運鐵蛋白啟動子；脂蛋白元A-1啟動子；雞β肌動蛋白CBA)啟動子，CBh啟動子(SEQ ID NO：25)及CAG啟動子(細胞巨大病毒早期強化子元件及啟動子、第一外顯子、及雞β肌動蛋白基因之第一內含子，及家兔β血球蛋白基因之剪接受體)(Alexopoulou等人，2008，BioMed.Central Cell Biol.9：2)，及人類FXN啟動子。啟動子可為組織特異性啟動子，諸如小鼠白蛋白啟動子，其如同甲狀腺素運載蛋白啟動子(TTR)一樣在肝細胞中具活性。
在另一態樣中，編碼FXN之經修飾核酸進一步包含增加FXN蛋白之表現的強化子。許多強化子在此項技術中已知，包括(但不限於)細胞巨大病毒主要立即早期強化子。更特定而言，CMV MIE啟動子包含三個區域：調節劑、獨特區域及強化子(Isomura及Stinski，2003，J.Virol.77(6)：3602-3614)。CMV強化子區域可與其他啟動子或其部分組合，從而形成混合式啟動子以進一步增加可操作地連接其之核酸的表現。舉例而言，雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子或其部分可與CMV啟動子/強化子或其部分組合，從而使CBA之版本稱為「CBh」啟動子，其表示雞β肌動蛋白混合式啟動子，如Gray等人(2011，Human Gene Therapy 22：1143-1153)中所描述。
此外，控制元件可包括膠原蛋白穩定序列(CSS)、終止密碼子、終止序列，及聚腺苷酸化信號序列，諸如(但不限於)牛生長激素聚A信號序列(bGHpolyA)，從而在真核mRNA之3'端處推進聚腺苷「尾部」之有效添加(參看，例如，Goodwin及Rottman，1992，J.Biol.Chem.267(23)：16330-16334)。
非病毒載體
在一特定實施例中，根據本發明使用之載體為非病毒載體。通常，非病毒載體可為包括敍述經修飾FXN基因之核酸序列的質體或其變體。
經封裝之經修飾FXN序列
經修飾FXN基因序列亦可提供為經封裝病毒載體之組分。大體而言，經封裝病毒載體包括封裝於衣殼中之病毒載體。病毒載體及病毒衣殼論述於隨後部分中。封裝於rAAV載體中之核酸可為單股(ss)、自我互補(sc)或雙股(ds)。
病毒載體
通常，攜載轉基因之病毒載體係由編碼轉基因之聚核苷酸、合適之調節元件及製造介導細胞轉導之病毒蛋白所需的元件組裝。病毒載體的實例包括但不限於腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、疱疹病毒及腺相關聯病毒(AAV)載體。
根據本發明之方法產生之經封裝病毒載體的病毒載體組分包括至少一個轉基因，例如，經修飾的FXN基因序列及用於控制經修飾FXN基因序列之表現的相關聯表現控制序列。
在較佳實施例中，病毒載體包括細小病毒基因組(諸如rep及cap缺失及/或由經修飾的FXN基因序列及其相關聯表現控制序列替代之AAV基因組)的一部分。經修飾的FXN基因序列通常嵌入至與適合病毒複製之一個或兩個AAV TR或TR元件相鄰(亦即，由其側接)(Xiao等人，1997，J.Virol.71(2)：941-948)，替代編碼病毒rep及cap蛋白之核酸。亦可包括適用於促進經修飾的FXN基因序列在靶細胞中之組織特異性表現的其他調節序列。
熟習此項技術者應理解，包含轉基因且不具有病毒複製所需之病毒 蛋白(例如，cap及rep)的AAV載體不能複製，此係由於此類蛋白質為病毒複製及包裝所必要。此外，AAV為一種依賴病毒(Dependovirus)，原因在於其不能在無藉由輔助病毒之細胞協同感染的情況下在細胞中複製。輔助病毒通常包括腺病毒或單純疱疹病毒。替代地，如下文所論述，可提供給包裝細胞之輔助功能(E1a、E1b、E2a、E4及VA RNA)包括藉由用編碼各種輔助元件之一或多個核酸轉染細胞，及/或該細胞可包含編碼輔助蛋白之核酸。舉例而言，HEK 293係由用腺病毒5 DNA轉化人類細胞而產生，且目前表現許多種腺病毒基因，包括(但不限於)E1及E3(參看，例如，Graham等人，1977，J.Gen.Virol.36：59-72)。因此，彼等輔助功能可由HEK 293包裝細胞提供，而無需藉由例如編碼其之質體將其供應至細胞。
病毒載體可為任何合適的核酸構造體，諸如DNA或RNA構造體，且可為單股、雙股、或雙螺旋(亦即，如WO 2001/92551中所描述之自我互補)。
熟習此項技術者應理解，rAAV載體可進一步包括「填充片段」或「填充」序列(填充/填充片段)，其中包含轉基因之核酸小於大約4.1kb至4.9kb大小時，最適合包裝核酸進入AAV衣殼中。參看，Grieger及Samulski，2005，J.Virol.79(15)：9933-9944。亦即，AAV載體通常接受具有指定大小範圍(通常約4kb至約5.2kb，或略多)之DNA的嵌段。因此，對於較短序列，於嵌段中包含填充/填充片段，以便將長度調整至接近或處於正常大小的病毒基因組序列，以讓AAV載體接受用於包裝進入病毒粒子中。在各種實施例中，填充/填充片段核酸序列為核酸之未轉譯(非蛋白質編碼)片段。在rAAV載體之特定實施例中，異源聚核苷酸序列具有小於4.7Kb之長度，且填充/填充片段聚核苷酸序列具有之長度使其 在與異源聚核苷酸序列組合(例如，插入至載體)時，具有在約3.0kb至5.5Kb之間、或約4.0kb至5.0Kb之間，或約4.3kb至4.8Kb之間的總長度。
內含子亦可充當填充/填充片段聚核苷酸序列，以便獲得封裝至病毒粒子中之AAV載體的長度。充當填充/填充片段聚核苷酸序列之內含子及內含子片段亦可增強表現。舉例而言，與在不存在內含子元件之情況下的表現相比較，包括內含子元件可增強表現(Kurachi等人，1995，J.Biol.Chem.270(10)：5276-5281)。此外，填充/填充片段聚核苷酸序列為此項技術中熟知且包括(但不限於)WO 2014/144486中所描述之彼等。
病毒衣殼
經封裝病毒載體之病毒衣殼組分可為細小病毒衣殼。AAV Cap及嵌合衣殼為較佳的。合適之細小病毒衣殼組分的實例為來自細小病毒科之衣殼組分，諸如自發性細小病毒或依賴病毒。舉例而言，病毒衣殼可為AAV衣殼(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1(WO 2015/013313之SEQ ID NO：5)、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N、AAV-LK03、蛇AAV、禽類AAV、牛AAV、大類AAV、馬類AAV、綿羊類AAV、山羊AAV、蝦AAV，及目前已知或後續發現之任何其他AAV。參看，例如，Fields等人，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。衣殼可衍生自以下各者中所揭示之多個AAV血清型：美國專利第7,906,111號；Gao等人，2004，J.Virol.78：6381；Moris等人，2004，Virol.33：375；WO 2013/063379；WO 2014/194132；且包括WO 2015/121501中所揭示之理 想類型AAV(AAV-TT)變體，及WO 2015/013313中所揭示之RHM4-1、RHM15-1至RHM15-6，及其變體，且熟習此項技術者應知曉，很可能存在尚未識別之執行相同或類似功能之其他變體，或可包括來自兩個或多於兩個AAV衣殼的組分。AAV Cap蛋白之全集包括VP1、VP2及VP3。包含編碼AAV VP衣殼蛋白之核苷酸序列的ORF可包含小於全集AAV Cap蛋白或可提供AAV Cap蛋白之全集。
AAV Cap蛋白中之一或多者可為嵌合蛋白，其包括來自兩個或多於兩個病毒(較佳地兩個或多於兩個AAV)之AAV Cap的胺基酸序列，如Rabinowitz等人，美國專利6,491,907中所描述，該專利之全部揭示內容以引用之方式併入本文中。舉例而言，嵌合病毒衣殼可包括AAV1 Cap蛋白或次單元及至少一個AAV2 Cap或次單元。嵌合衣殼可例如包括具有一或多個B19 Cap次單元之AAV衣殼，例如，AAV Cap蛋白或次單元可由B19 Cap蛋白或次單元替換。舉例而言，在較佳實施例中，AAV衣殼之Vp3次單元可由B19之Vp2次單元替換。
另一實施例包括嵌合病毒株，其經合成包括來自AAV2、AAV3、AAV6、AAV8等之AAV主鏈的組合以及來自AAV9之半乳糖(Gal)結合足跡。腺相關病毒(AAV)為將硫酸乙醯肝素(HS)、半乳糖(Gal)或唾液酸(Sia)用作細胞表面結合之主要受體的輔助依賴型細小病毒。舉例而言，AAV血清型2及3b利用HS.AAV1、4及5結合具有不同鍵聯特異性之Sia，AAV血清型6辨識Sia及HS兩者，而AAV9將Gal用於宿主細胞連接。特定言之，來自AAV9之半乳糖(Gal)結合足跡接枝至硫酸肝素結合AAV血清型2上，且僅正交聚糖結合足跡之接枝改良轉導效率。藉由使用結構性比對及定點誘變將來自AAV9之Gal結合足跡併入於AAV2 VP3主鏈或嵌合 AAV2i8衣殼模板中來產生新雙聚糖結合病毒株(AAV2G9)及嵌合肌肉向性病毒株(AAV2i8G9)。活體外結合及轉導檢定藉由用於細胞進入之AAV2G9確認HS及Gal受體兩者之採用。轉基因表現動力學之後續活體內特徵化及載體基因組生物分佈特徵指示藉由此經合理改造之嵌合AAV病毒株的較快、持久、及經提高轉基因表現。類似經改良之轉導特徵係用肝臟去靶向肌肉特異性AAV2i8G9嵌合體觀察到(Shen等人，2013，J.Biol.Chem.288(4)：28814-28823)。此類新接枝組合完全地描述於WO2014/144229中，WO2014/144229之內容以引用之方式併入本文中。額外肝去靶向AAV(諸如AAV9.45)描述於Pulicherla等人，2011，Molecular Therapy 19(6)：1070-1078中，其內容以全文引用之方式併入本文中，以供參考。
在又一實施例中，本發明提供用於治療性活體內基因治療的祖AAV載體之使用。特定言之，電子雜交衍生序列經重新合成且針對生物活性經表徵。此努力引起九個功能性推定祖AAV之產生及Anc80(AAV血清型1、2、8及9之經預測祖先)之識別(Zinn等人，2015，Cell Reports 12：1056-1068)。除了組裝至病毒粒子中之外，此類祖序列之預測及合成可藉由使用描述於WO 2015/054653中之方法實現，WO 2015/054653之內容以引用之方式併入本文中。值得注意地，與當代病毒或其部分相比，自祖病毒序列組裝之病毒粒子的使用在當前人口中呈現降低之易感性至預存在免疫性。
經封裝病毒載體之製造
本發明包括由「宿主細胞」涵蓋之包裝細胞，該等包裝細胞可經培養以產生本發明之經封裝病毒載體。本發明之包裝細胞大體上包括具有異 源(1)病毒載體功能、(2)封裝功能及(3)輔助功能之細胞。此等組分功能中之每一者論述於隨後部分中。
最初，載體可藉由本領域技術人員已知之若干方法製得(參看，例如，WO 2013/063379)。較佳方法描述於Grieger等人，2015，Molecular Therapy 24(2)：287-297中，其內容出於所有目的以引用之方式併入本文中。簡言之，將HEK293細胞之有效轉染用作起點，其中將來自合格臨床主細胞庫之黏附HEK293細胞株用於在允許快速及可調式rAAV製造之搖瓶及WAVE生物反應器中之無動物組分懸浮條件下生長。使用三重轉染方法(例如，WO 96/40240)，在轉染之後48小時收穫時，懸浮HEK293細胞株產生大於1×105含有粒子(vg)/細胞之載體基因組或大於1×1014vg/L之細胞培養。更特定而言，三重轉染係指用三個質體轉染包裝細胞之事實：一個質體編碼AAV rep及cap基因，另一質體編碼各種輔助功能(例如，腺病毒或HSV蛋白，諸如E1a、E1b、E2a、E4及VA RNA，且另一質體編碼轉基因及其各種控制元件(例如，經修飾的FXN基因及CBh啟動子)。
為實現所要產量，最佳化多個變量：諸如選擇支援生長及轉染兩者之相容的無血清懸浮培養基，選擇轉染試劑、轉染條件及細胞密度。基於離子交換層析方法，通用純化策略亦經開發，其導致AAV血清型1至6、8、9之高純度載體預備及各種嵌合衣殼。此使用者友好製程可在一週內完成，導致較高滿至空粒子比率(>90%全部粒子)，提供純化後產量(>1×1013vg/L)及適用於臨床應用且關於所有血清型及嵌合粒子通用之純度。此可調式製造技術已用於針對視網膜新血管生成(AAV2)、B型血友病(scAAV8)、巨軸突神經病(scAAV9)及色素性視網膜炎(AAV2)製造GMP I期臨床AAV載體，已向患者投與該等AAV載體。另外，整個載體 製造中藉由實施灌注方法之5倍增加的最小值需要在轉染後之大量時間點自培養基收穫rAAV。
病毒載體功能
本發明之包裝細胞包括病毒載體功能以及封裝及載體功能。病毒載體功能通常包括細小病毒基因組(諸如rep及cap缺失及由經修飾的FXN序列及其相關聯表現控制序列替代之AAV基因組)的一部分。病毒載體功能包括導致用於封裝之病毒載體之複製的充足表現控制序列。通常，病毒載體包括細小病毒基因組(諸如rep及cap缺失及由轉基因及其相關聯表現控制序列替代之AAV基因組)的一部分。轉基因通常由兩個AAV TR側接，替代缺失之病毒rep及cap ORF。適當之表現控制序列(諸如適用於促進轉基因在靶細胞中之組織特異性表現的組織特異性啟動子及其他調節序列)包括在內。轉基因通常為可經表現以產生治療性多肽或標誌物多肽的核酸序列。
「複式載體」在本文中可互換地被稱作「二聚」或「自我互補」載體。複式細小病毒粒子可例如包含含有病毒粒子DNA(vDNA)之細小病毒衣殼。vDNA為自我互補以使得在自病毒衣殼釋放之後其可形成髮夾結構。複式vDNA似乎將可藉由宿主細胞表現(亦即，轉錄及視情況轉譯)之雙股DNA提供至宿主細胞而無需第二股合成，常規細小病毒載體有此需要。複式/自我互補rAAV載體為此項技術中熟知的且描述於例如WO 2001/92551、WO 2015/006743及許多其他者中。
病毒載體功能可合適地提供為複式載體模板，如Samulski等人之美國專利第7,465,583號(針對關於複式載體之其教示，其全部揭示內容以引用之方式併入本文中)中所描述。複式載體為二聚自我互補(sc)聚核苷酸 (通常，DNA)。複式載體基因組針對所選細小病毒衣殼(例如，AAV衣殼)內之衣殼化較佳地含有充足封裝序列。熟習此項技術者將瞭解，複式vDNA在所有條件下可能不會以雙股形式存在，但在促進互補核苷酸鹼基之退火的條件下有此能力。「複式細小病毒粒子」涵蓋混合式、嵌合及靶向病毒粒子。較佳地，複式細小病毒粒子具有AAV衣殼，該衣殼可進一步為嵌合或靶向衣殼，如上文所描述。
病毒載體功能可合適地提供為複式載體模板，如Samulski等人之美國專利第7,465,583號(針對關於複式載體之其教示，其全部揭示內容以引用之方式併入本文中)中所描述。複式載體為二聚自我互補(sc)聚核苷酸(通常，DNA)。舉例而言，歸因於股內鹼基配對，複式載體之DNA可經所選以便形成雙股髮夾結構。複式DNA載體之兩股可封裝於病毒衣殼內。複式載體提供與雙股DNA病毒載體相當之功能且可緩解靶細胞將互補DNA合成至通常藉由病毒囊封之單股基因組的需要。
經所選用於病毒載體之TR(可解析及非可解析)較佳地為AAV序列，其中血清型1、2、3、4、5及6為較佳。可解析AAV TR無需具有野生型TR序列(例如，野生型序列可藉由插入、缺失、截短或錯義突變更改)，只要TR介導所要功能(例如，病毒封裝、整合及/或原病毒拯救及類似者)即可。TR可為充當AAV末端反向重複之合成序列，諸如如Samulski等人之美國專利第5,478,745號中所描述之「雙D序列」，該美國專利之全部揭示內容以全文引用之方式併入於本文中。通常但未必，TR係來自相同細小病毒，例如，兩個TR序列皆來自AAV2。
封裝功能包括衣殼組分。衣殼組分較佳地來自細小病毒衣殼，諸如AAV衣殼或嵌合AAV衣殼功能。合適之細小病毒衣殼組分的實例為來自 細小病毒科之衣殼組分，諸如自發性細小病毒或依賴病毒。舉例而言，衣殼組分可選自AAV衣殼，例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV Hu.26、AAV1.1(SEQ ID NO：15)、AAV2.5(SEQ ID NO：13)、AAV6.1(SEQ ID NO：17)、AAV6.3.1(SEQ ID NO：18)、AAV9.45、AAV2i8(SEQ ID NO：29)、AAV2G9、AAV2i8G9、AAV2-TT(SEQ ID NO：31)、AAV2-TT-S312N(SEQ ID NO：33)、AAV3B-S312N及AAV-LK03，及如尚未識別的或來自非人類靈長類源之其他新穎衣殼。衣殼組分可包括來自兩個或多於兩個AAV衣殼之組分。
在一更佳實施例中，VP衣殼蛋白中之一或多者為嵌合蛋白，包含來自兩個或多於兩個病毒、較佳地兩個或多於兩個AAV之胺基酸序列，如Rabinowitz等人，美國專利6,491,907中所描述。嵌合衣殼在本文中描述為具有來自與另一血清型組合之一個血清型的足以修飾a)病毒產量、b)免疫反應、c)靶向、d)去靶向等的至少一個胺基酸殘基。
其他嵌合蛋白可藉由Li等人，2008，Mol.Ther.16(7)：1252-1260中闡述之指令製得，其內容以引用之方式併入本文中。特定言之，將基於DNA改組之方法用於經由定向進化開發細胞型特異性載體。腺相關病毒(AAV)血清型1至9之衣殼基因組使用PCR隨機地分段及重組以產生嵌合衣殼庫。含有來自AAV1、2、8及9之基因組片段的單個感染性選殖(嵌合-1829)與先前經展示具有至AAV之低複製容許度的整合素負型倉鼠黑素瘤細胞株隔離。分子模型化研究表明AAV2促成對稱之二十面體三重軸線處 的表面回圈，而AAV1及9分別促成兩倍及五倍對稱相互作用。將C端結構域(AAV9)識別為黑素瘤向性至合理誘變的關鍵結構性決定子。嵌合-1829將硫酸乙醯肝素用作主要受體且比所有血清型更有效地轉導黑素瘤細胞。很可能使用AAV或其他病毒衣殼序列將此技術應用於替代細胞/組織類型以產生作為人類基因轉移之載體之一類新生物奈米粒子。
經封裝病毒載體大體上包括由TR元件側接之經修飾的FXN基因序列及表現控制序列，在本文中被稱作「轉基因」或「轉基因表現卡匣」，其足以導致載體DNA之封裝及經修飾的FXN基因序列在經轉導細胞中之後續表現。病毒載體功能可例如作為質體或擴增子之組分供應至細胞。病毒載體功能可染色體外地存在於細胞株內及/或可整合至細胞之染色體DNA中。
可採用將攜載病毒載體功能核苷酸序列引入至細胞宿主以供複製及封裝的任何方法，包括但不限於：電穿孔、磷酸鈣沈澱、顯微注射、陽離子或陰離子脂質體，及與核定位信號組合之脂質體。在其中藉由使用病毒載體之轉染提供病毒載體功能的實施例中，可使用用於製造病毒感染的標準方法。
封裝功能
封裝功能包括用於病毒載體複製及封裝的基因。因此，例如，封裝功能視需要可包括：病毒基因表現、病毒載體複製、自整合式狀態拯救病毒載體、病毒基因表現及將病毒載體封裝至病毒粒子中所需的功能。可使用諸如質體或擴增子、桿狀病毒或HSV輔助構造體之基因構造體將封裝功能共同或單獨地供應至包裝細胞。封裝功能可染色體外地存在於包裝細胞內，但較佳地整合於細胞之染色體DNA中。實例包括編碼AAV Rep及 Cap蛋白之基因。
輔助功能
輔助功能包括建立包裝細胞之活動性感染所需的輔助病毒元件，此為起始病毒載體之封裝所需要的。實例包括衍生自腺病毒、桿狀病毒及/或疱疹病毒之足以引起病毒載體之封裝的功能。舉例而言，腺病毒輔助功能通常將包括腺病毒組分E1a、E1b、E2a、E4及VA RNA。封裝功能可藉由用所需病毒感染包裝細胞而提供。可使用諸如質體或擴增子之基因構造體將封裝功能共同或單獨地供應至包裝細胞。參看，例如，如Rabinowitz等人，2002，J.Virol.76：791中所描述之pXR輔助質體，及Grimm等人，1998，Human Gene Therapy 9：2745-2760中所描述之pDG質體。封裝功能可染色體外地存在於包裝細胞內，但較佳地整合於細胞之染色體DNA(例如，HEK 293細胞中之E1或E3)中。
可採用任何合適之輔助病毒功能。舉例而言，在包裝細胞為昆蟲細胞之情況下，桿狀病毒可充當輔助病毒。在AAV封裝方法中亦可將疱疹病毒用作輔助病毒。編碼AAV Rep蛋白之混合式疱疹病毒可有利地促進更可調式AAV載體製造方案。
可採用將攜載輔助功能之核苷酸序列引入至細胞宿主以供複製及封裝的任何方法，包括但不限於：電穿孔、磷酸鈣沈澱、顯微注射、陽離子或陰離子脂質體，及與核定位信號組合之脂質體。在其中藉由使用病毒載體之轉染或使用輔助病毒之感染提供輔助功能的實施例中，可使用用於製造病毒感染之標準方法。
包裝細胞
在經封裝病毒載體之製造中可採用此項技術中已知的任何合適之容 許或包裝細胞。哺乳動物細胞或昆蟲細胞為較佳的。在本發明之實踐中適用於包裝細胞之製造的細胞之實例包括例如：諸如VERO之人細胞株、WI38、MRC5、A549、HEK 293細胞(其表現在組成性啟動子之控制下的功能性腺病毒E1)、B-50或任何其他HeLa細胞、HepG2、Saos-2、HuH7及HT1080細胞株。在一個態樣中，包裝細胞能夠在懸浮培養物中生長，更佳地，細胞能夠在無血清培養中生長。在一個實施例中，包裝細胞為在不含血清之培養基中懸浮生長的HEK293。在另一實施例中，包裝細胞為US專利第9,441,206號中所描述之HEK293細胞，且經寄存為ATCC第PTA 13274號。大量rAAV包裝細胞株在此項技術中已知，包括(但不限於)WO 2002/46359中所揭示之彼等。
用作包裝細胞之細胞株包括昆蟲細胞株。可根據本發明使用允許AAV之複製且可維持培養之任何昆蟲細胞。實例包括：草地黏蟲，諸如Sf9或Sf21細胞株；果蠅屬細胞株；或蚊子細胞株，例如，白蚊伊蚊衍生細胞株。較佳細胞株為草地黏蟲Sf9細胞株。將針對關於異源多肽之表現之昆蟲細胞的使用之其教示、將核酸引入至此類細胞中之方法、及維持培養此類細胞之方法的以下參考文件併入本文中：Methods in Molecular Biology，Richard編，Humana Press，NJ(1995)；O'Reilly等人，Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual，Oxford Univ.Press(1994)；Samulski等人，1989，J.Virol.63：3822-3828；Kajigaya等人，1991，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88：4646-4650；Ruffing等人，1992，J.Virol.66：6922-6930；Kimbauer等人，1996，Virol.219：37-44；Zhao等人，2000，Virol.272：382-393；及Samulski等人，美國專利第6,204,059號。
可使用此項技術中已知之任何方法製造根據本發明之病毒衣殼，例如，藉由來自桿狀病毒之表現(Brown等人，(1994)Virology 198：477-488)。作為另一替代，本發明的病毒載體可使用桿狀病毒載體在昆蟲細胞中製造以如例如由Urabe等人，2002，Human Gene Therapy 13：1935-1943所描述之傳遞rep/cap基因及rAAV模板。
在另一態樣中，本發明提供在昆蟲細胞中製造rAAV之方法，其中桿狀病毒封裝系統或載體可經建構以藉由將此等基因改造至桿狀病毒載體之多角體蛋白編碼區域中且藉由至宿主細胞中之轉染製造病毒重組體來攜載AAV Rep及Cap編碼區域。在針對AAV使用Baculavirus製造時值得注意地是，較佳地，AAV DNA載體產物為類似分子之自我互補AAV而無需使用至AAV ITR之突變。此似乎為昆蟲細胞中之低效AAV rep基因巧合的副產物，其藉助於功能性Rep酵素活性之缺少產生自我互補DNA分子。宿主細胞為感染桿狀病毒之細胞或其中已引入編碼桿狀病毒輔助功能之額外核酸或其中包括此等桿狀病毒輔助功能。此等桿狀病毒病毒可表現AAV組分且隨後促進衣殼之製造。
在製造期間，包裝細胞大體上包括一或多個病毒載體功能以及足以引起病毒載體之複製及封裝的輔助功能及封裝功能。可使用基因構造體(諸如質體或擴增子)將此等不同功能共同或單獨地供應至包裝細胞，且該等功能可染色體外地存在於細胞株內或整合於細胞之染色體中。
可向細胞供應已併入之所陳述功能中之任何一或多者，例如，具有染色體外地併入或整合於細胞之染色體DNA中之一或多個載體功能的細胞株；具有染色體外地併入或整合於細胞之染色體DNA中之一或多個封裝功能的細胞株；或具有染色體外地併入或整合於細胞之染色體DNA中 之輔助功能的細胞株。
rAAV純化
rAAV載體可藉由此項技術之標準方法(諸如藉由管柱層析法或氯化銫梯度)純化。用於純化rAAV載體之方法為此項技術中已知的且包括以下各者中描述之方法：Clark等人，1999，Human Gene Therapy 10(6)：1031-1039；Schenpp及Clark，2002，Methods Mol.Med.69：427-443；美國專利第6,566,118號及WO 98/09657。
治療方法
經修飾的FXN基因可用於弗里德賴希運動失調相關病症(諸如，退化性神經肌肉病症及/或與弗里德賴希運動失調相關聯之心肌病)的基因治療。個人可能需要基因治療，此係由於作為FXN基因之寫碼序列中的一或多個突變之結果，FXN經不適當地表現，例如，具有不正確胺基酸序列，或在錯誤組織中或在錯誤時間處表現或表現不足。本發明之經修飾FXN基因可用作基因治療以提高蛋白共濟失調蛋白之產量且藉此提高粒線體中之能量生產。參看，例如，美國專利第9,066,966號。
本發明之載體的靶細胞為能夠表現共濟失調蛋白之細胞，諸如哺乳動物之心臟系統之彼等，神經元細胞、肌肉細胞及其他細胞具有恰當細胞機制以處理前驅體從而產生具有共濟失調蛋白活性之蛋白。
醫藥組合物
在特定實施例中，本發明提供用於預防或治療由共濟失調蛋白之減少表現介導或與共濟失調蛋白之減少表現相關聯之疾病或病狀(例如，弗里德賴希運動失調)的醫藥組合物。組合物包含治療有效量之載體，該載體包含可增加FXN在細胞中之表現量的經修飾FXN基因。組合物包含載 體，該載體包含編碼FXN之經修飾(例如，經最佳化)核酸，其中該組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑及/或其他藥劑、醫藥劑、載劑、佐劑、稀釋劑等。對於注射，載劑將通常為液體。作為注射介質，使用含有對於注射溶液而言常見之添加劑(諸如穩定劑、鹽或鹽水及/或緩衝劑)的水為較佳的。
例示性醫藥學上可接受的載劑包括無菌、無熱原質水及無菌、無熱原質磷酸鹽緩衝鹽水。生理學上可接受之載劑包括醫藥學上可接受的載劑。醫藥學上可接受的載劑為在生物學上或其他方面不會不適宜之彼等載劑，亦即，可向個體投與該物質而不引起超過該物質之有利生物作用的不適宜生物作用。
醫藥組合物可例如用於離體細胞之轉染或直接向個體投與病毒載體或細胞。
較佳地以生物學上有效量向細胞投與包含經修飾FXN基因之重組病毒載體。若活體內向細胞投與病毒載體(例如，如下文所描述向個體投與病毒)，則病毒載體之生物學上有效量為足以引起轉基因在靶細胞中之轉導及表現的量。
在一個實施例中，本發明包括藉由單獨地或在包含編碼共濟失調蛋白之經修飾核酸的載體中(包括質體、病毒、奈米粒子、脂質體，或用於將核酸提供至細胞的任何已知方法)向細胞投與核酸來提高共濟失調蛋白在細胞中之含量的方法。該方法包含一種方法，其中編碼共濟失調蛋白之mRNA的含量及/或所表現共濟失調蛋白之含量可偵測地大於共濟失調蛋白(mRNA及/或蛋白)在並未投與核酸之其他相同細胞中的含量。熟習此項技術者應理解，細胞可在活體外培養或生長或可存在於生物體中(亦即， 活體內)。此外，細胞可表現內源性共濟失調蛋白，使得共濟失調蛋白在細胞中之含量可增加，及/或細胞可表現為野生型共濟失調蛋白之突變體或變體的內源性共濟失調蛋白，例如，具有SEQ ID NO：2之序列的共濟失調蛋白，尤其當人類共濟失調蛋白可存在多於一個野生型對偶基因時。因此，與表現於其他相同但未經治療之細胞中之共濟失調蛋白的含量相比較共濟失調蛋白之含量增加。
本發明之另一態樣為用含有經修飾基因之載體活體內治療個體的方法。可藉由此項技術中已知的用於投與病毒載體之任何方式向有需要之人類個體或動物投與載體。
可另外投與載體且將其作為照護標準之佐劑。亦即，載體可與另一治療劑或化合物同步、同時或以熟習此項技術者使用常規方法確定之確定給藥間隔共投與。
在一個態樣中，本發明之rAAV可與包含與rAAV-FXN載體相同或不同之衣殼蛋白的空衣殼(亦即，不含有核酸分子之病毒衣殼)共投與。此係由於熟習此項技術者應理解，空衣殼之共投與可降低本發明之rAAV的免疫反應，例如，中和反應。亦即，空衣殼可充當允許rAAV-FXN載體之誘餌以避免如例如WO 2015/013313中所論述之中和抗體(Nab)免疫反應。
全身投與之例示性投與模式包括(但不限於)：靜脈內、皮下、皮內、肌內及關節內投與，及類似者，以及直接組織或器官注射。
在一個實施例中，載體經全身性地投與。熟習此項技術者應理解，全身投與可將編碼FXN之治療性基因傳遞至受其中減少含量之FXN影響的所有組織，包括所有肌肉。
儘管如此，熟習此項技術者應理解，載體可直接傳遞至受FXN缺乏 影響之區域，亦即，大腦及心臟。
因此，在其他較佳實施例中，藉由直接注射將包含經修飾FXN基因之發明性載體投與至心臟或中樞神經系統(CNS)組織中。
在一個實施例中，編碼FNX之經修飾核酸、載體或包含該載體之組合物經顱內傳遞，包括鞘內、神經內、腦內、心室內投與。
在一個實施例中，編碼FNX之經修飾核酸、載體或包含該載體之組合物藉由利用心外注射隨後小切口、利用冠狀動脈內注射、利用心內膜心肌注射或利用可用於心臟之另一注射類型直接投與至心肌中傳遞至心臟。
額外投與途徑亦可包含在直接目測下之載體的局部應用，例如，淺皮層應用或其他非定向性應用。載體亦可例如鞘內或藉由靜脈注射傳遞至心室中。
本發明之載體的靶細胞為罹患與弗里德賴希運動失調相關聯之心肌病的個體之心肌細胞。較佳地，個體為人類、成人或兒童。然而，亦預期獸醫應用。
本發明之載體的靶細胞亦包括CNS(較佳地神經元)之細胞。傳遞至大腦以治療弗里德賴希運動失調之神經退化性態樣可藉由鞘內投與。
在一個態樣中，全身性地(例如，靜脈內)傳遞編碼FNX之經修飾核酸、載體或包含該載體之組合物以治療FA相關聯之心肌病及/或該疾病之神經退化性態樣。
在另一實施例中，藉由至少兩個途徑投與載體。亦即，可全身性地且亦直接地將載體投與至大腦及/或心臟或其任何組合中。
若經由至少兩個途徑執行，則載體之投與可但無需同步或同時。實際上，經由不同途徑之投與可以每一投與之間的時間間隔單獨地執行。藉 由熟習此項技術者例行地判定適當之給藥方案以實現每一個別患者之最大治療益處。
在一個態樣中，本發明包括用於提高個體之共濟失調蛋白含量的編碼本發明之共濟失調蛋白的至少一個經修飾核酸，包括(但不限於)載體或醫藥組合物中之核酸。
在一個態樣中，本發明包括用於治療個體之弗里德賴希運動失調的至少一個經修飾核酸、包含該核酸之rAAV載體、及包含該核酸或該載體之醫藥組合物。
除了如此項技術中已知之FRDA的照護標準之外及/或與該照護標準並行，用途涵蓋投與經修飾核酸或包含經修飾核酸之載體。
可注射劑可呈習知形式，以液體溶液或懸浮液形式，以適用於在注射之前溶解或懸浮之固體形式或以乳液形式製備。
具有經修飾FXN基因之病毒載體的劑量將取決於投與模式、待治療之疾病或病狀、個別個體之病狀、特定病毒載體，及待傳遞之基因，且可以例行方式判定。用於實現療效之例示性劑量為至少約105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015個轉導單位或更多的病毒滴定量，較佳地約108至1013個轉導單位，更佳地1012個轉導單位/kg體重。
經修飾FXN基因可作為具有適合於在靶細胞中表現之調節元件的DNA分子之組分經投與。經修飾FXN基因可作為病毒質體之組分(諸如rAAV載體)經投與。病毒粒子可僅作為病毒粒子經投與，無論在活體內直接傳遞至門靜脈脈管時抑或在離體治療時，該離體治療包含在活體外將載體病毒粒子投與至來自接受治療之動物的細胞，隨後引入返回至供體之經 轉導細胞。
等效物
前述書面說明書被視為足以使熟習此項技術者實踐本發明。前述描述及實例詳述了本發明之某些例示性實施例。然而，將瞭解，無論以文字呈現之前述內容如何詳細，本發明可以許多方式實踐，且本發明應根據所附申請專利範圍及其任何等效物解釋。
本文中所引用之全部參考文獻(包括專利、專利申請案、論文、教科書及類似者)及其中引用的參考文獻就其尚未引用的程度而言係以全文引用之方式特此併入本文中。
例示性實施例
參考以下實驗性實例來進一步詳細描述本發明。除非另外規定，否則提供此等實例僅出於說明的目的，且不意欲為限制性的。因此，本發明決不應解釋為限於以下實例，而是應解釋為涵蓋由於本文所提供之教示而變得明顯之任何及所有變化形式。
實例 實例1：自我互補rAAV-FXN構造體之產生 材料及方法 載體建構
將編碼自我互補AAV基因組之pTRs-KS-CBh-EGFP-bGHpolyA構造體(在圖3中圖解展示)用作轉基因表現構造體之主鏈(Gray等人，2011，Human Gene Therapy 22：1143-1153)。兩個密碼子最佳化FXN基因嵌段係自pUC57中之GenScript定序，亦即，Genscript及Genscript(低CpG)，且用於替換主鏈載體中之EGFP。Genscript(SEQ ID NO：6)及Genscript (低CpG)(SEQ ID NO：7)經修飾FXN基因如圖3中所說明之各自可操作地連接至CBh啟動子。GenScript FXN(SEQ ID NO：6及7)構造體包括均如圖2E(Genscript)及圖2F(Genscript(低CpG))中所展示之N端AgeI位點、FXN終止密碼子下游之膠原蛋白穩定序列(CSS)(5-CCCAGCCCACTTTTCCCCAA-3')、CSS下游之牛生長激素(BGH)polyA序列、BGH polyA下游之MluI位點。插入至pTRs-KS-CBh-FXN-bGHpolyA構造體中之例示性嵌段展示於圖2A至圖2F中且闡述於表8中。更特定而言，野生型共濟失調蛋白基因(WT FXN；SEQ ID NO：2)經選殖至pTRs-KS-CBh-WT FXN-bGHpolyA中(圖2A)；IDT1經修飾FXN基因(SEQ ID NO：11)經選殖至pTRs-KS-CBh-IDT1-bGHpolyA中(圖2B)；編碼IDT3低表現經修飾FXN基因(SEQ ID NO：8)之核酸經選殖至pTRs-KS-CBh-IDT3-bGHpolyA中(圖2C)；IDT4經修飾FXN基因(SEQ ID NO：12)經選殖至pTRs-KS-CBh-IDT4-bGHpolyA中(圖2D)；Genscript(對照)經修飾FXN基因(SEQ ID NO：6)經選殖至pTRs-KS-CBh-Genescript-bGHpolyA中(圖2E)；且Genscript(低CpG)經修飾FXN基因(SEQ ID NO：7)經選殖至pTRs-KS-CBh-Genescript(低CpG)-bGHpolyA中(圖2F)。編碼FXN基因之每一嵌段經選殖至載體中，且該基因由5'側上之AgeI位點及由3'側上之AvrII切割位點側接，繼之以AvrII位點之後的CSS序列、CSS之後的SpeI切割位點、SpeI切割位點之後的bGHpolyA信號序列，及polyA信號序列之後的MluI切割位點。
用AgeI及MluI(New England Biolabs，各別地R0552S及R0198S)消化、凝膠提取及使用ExTaq聚合酶(Clontech，RR001A)連接主鏈pTRs-KS-CBh-EGFP-bGHpolyA及FXN基因構造體。連接反應轉換成SURE細 胞(Agilent，200227)，在37℃下放置於SOC回收培養基(目錄號15544-034，Invitrogen)中歷時一小時，隨後用(10mg/ml)塗覆於LB板上。針對病毒製造之擴增定序及選擇菌落。具有AAV血清型2衣殼之重組AAV(rAAV)載體如所描述藉由三重轉染方法在人胚腎293(HEK293)細胞中產生UNC載體核心(Grieger等人，2006，Nature Protocols 1：1412-1428)。替代地，類似地製造具有血清型2i8衣殼(SEQ ID NO：28之胺基酸序列)的rAAV載體。含有自我互補基因組之高純重組病毒藉由非離子碘克沙醇梯度接著離子交換層析回收。峰值由qPCR判定，隨後以含有5%d-山梨醇之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)滲析。病毒滴定量係由qPCR判定(Gray等人，2010，J.Amer.Soc.Gene Therapy 18：570-578)。遵循活體外初步測試(下文)，將GenScript(低CpG)用於產生具有在pTRs-KS-CBh-Genescript(低CpG)-bGHpolyA中之FXN終止密碼子之前嵌入的HA標籤TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT之構造體。
北卡羅萊納大學(UNC)載體核心用rAAV TK血清型產生具有FXN-HA構造體之病毒。
sc rAAV-FXN之活體外測試
HEK293(ATCC：CRL-1573)及HeLa(ATCC：CCL-2)細胞維持於Dulbecco之經修飾Eagle培養基中(DMEM，Gibco)。細胞生長培養基補充有9%之胎牛血清(FBS，Gibco)、3.4mM l-麩醯胺酸、100U/ml青黴素及100μg/ml鏈黴素(Gibco)。細胞在37℃下保持於5%CO2氛圍中。量桿檢定：細胞接種於24孔板中以使得其在24小時(h)內達至大約60%匯合，隨後在MOI 10,000(VG/細胞)下用scAAV-FXN(在本文中可互換地被稱作「rAAV-FXN」或「rAAV-FXN-HA」一式三份地模擬處理或感染。在轉 導後60h(h p.t.)，細胞係根據針對Frataxin Protein Quantity Dipstick Assay之製造商協定(Abcam，ab109881)。使用ImageJ處理資料。
西方墨點法：
細胞接種於6孔板中以使得其在24h內達至大約60%匯合，隨後在MOI 10,000(VG/細胞)下用scAAV-FXN模擬處理或感染。在轉導後60h，用細胞溶解緩衝液(0.0625M三-HCl pH 6.8、10%甘油、2%SDS、5%2-巰基乙醇、0.02%(w/v)溴酚藍)來溶解細胞。藉由使用15-4%TGX凝膠來凝膠電泳分離十五(15)μl HeLa蛋白溶解物，且蛋白經電轉染至硝化纖維素膜(NCM)。使用PBS-T中之5%脫脂奶粉阻斷NCM。抗共濟失調蛋白抗體(Abcam，18A5DB1)用於具有5%牛奶之PBS-T中。將具有5%乳抗體之PBS-T中的共軛辣根過氧化酶(HRP)二級抗體用於偵測抗共濟失調蛋白之存在。將WesternBright ECL西方墨點偵測套組(Advansta，K-12045-D50)用於偵測每一製造商之說明書。
圖1A至圖1B展示與編碼FXN(SEQ ID NO：1)之未最佳化(亦即，野生型)序列在HeLa細胞中之表現相比較的不同最佳化序列之表現的結果。更特定而言，圖1A及圖1B兩者展示西方墨點之像片，該像片展示共濟失調蛋白(FXN)在用包含編碼共濟失調蛋白之嵌段的表現載體轉染之HeLa細胞中之表現。圖1A在暴露了1秒之WesternBright墨點薄膜之像片中展示FXN在HeLa細胞中之表現。圖1B展示圖1A中所展示之表明如暴露了1秒之WesternBright墨點薄膜之像片中所展示的FXN在HeLa細胞中之表現之實驗的重複。圖1A及圖1B中之每一凝膠泳道展示與來自編碼FXN之野生型核酸序列之表現相比較的來自本發明之經修飾FXN基因之FXN的表現。亦即，泳道1展示由編碼FXN之野生型非經修飾核酸(SEQ ID NO：2)驅動 之表現；泳道2展示由IDT2經修飾FXN基因(SEQ ID NO：3)驅動之表現；泳道3展示由IDT5經修飾FXN基因(SEQ ID NO：9)驅動之表現；泳道4展示由JCAT經修飾FXN基因(SEQ ID NO：4)驅動之表現；泳道5展示由GeneArt經修飾FXN基因(SEQ ID NO：5)驅動之表現；泳道6展示由GenScript(對照)經修飾FXN基因(SEQ ID NO：6)驅動之表現；泳道7展示由Genscript(低CpG)經修飾FXN基因(SEQ ID NO：7)驅動之表現；且泳道GFP展示編碼綠色螢光蛋白之轉基因之表現，由嵌段而非編碼FXN之核酸編碼的可偵測標記。
所展示資料表明若干經修飾FXN核酸序列--尤其泳道4(JCAT)、5(GeneArt)、6(Genscript)及7(Genscript低CpG)--相對於野生型核酸序列(泳道1)提供共濟失調蛋白在HeLa細胞中之更高表現。每一泳道中之肌動蛋白內參考物係作為蛋白內參考物。
核酸序列中之GC核苷酸含量(通常表現為序列中之核苷酸總數目的百分比)可具有多個影響，包括(但不限於)：mRNA之穩定性增加，二級結構及轉基因通常受增加的GC含量負面地影響。因此，熟習此項技術者應理解，相對於負面影響，經修飾核酸之GC含量反映核酸之增加的穩定性與自其轉錄之mRNA之間的平衡，例如，在由增加的GC含量介導之二級結構上。
CAI(密碼子適應指數)為同義密碼子使用偏向之量測值。該指數使用來自物種之高表現基因的參考集以分析每一密碼子之相對值，且基因之分值係自彼基因中之所有密碼子之使用頻率計算。指數評估在選擇密碼子使用之模式中選擇已生效的程度。其可用於預測基因之表現量且用於比較不同生物/物種中之密碼子使用。對共濟失調蛋白基因執行人類密碼子最 佳化以實現以下因素之平衡：轉錄效率--GC含量、CpG二核苷酸含量、隱含剪接位點等；轉譯效率--密碼子使用偏向、GC含量、mRNA二級結構、過早polyA位點、RNA不穩定基元、內部核糖體結合位點；及蛋白再摺疊--密碼子使用偏向、密碼子及抗密碼子之相互作用，RNA二級結構。
基本上，密碼子最佳化平衡此等變量以(較佳地)實現更高表現共濟失調蛋白基因序列、增加訊息(GC含量、DNA及RNA兩者中之二級結構)的穩定性及類似者，如此項技術中已知的。
CpG島可由經轉導細胞中之類Tol受體九(TLR9)辨識且可將免疫反應引發至外來(外源)DNA。因此，在一個實施例中，本發明涵蓋編碼共濟失調蛋白之經修飾核酸，其中CpG島之數目與編碼共濟失調蛋白之野生型核酸序列(例如，SEQ ID NO：2)中之CpG島基元之數目相比已減少。
CAI、GC百分比含量及本文中例示之每一經修飾FXN基因之潛在CpG島區域數目展示於下文表1中。
亦即，對於編碼FXN之野生型核酸(WT-FXN；SEQ ID NO：2)，核酸序列表明CAI為0.71且%GC含量為55%。相反地，JCAT經修飾FXN基因表明CAI為0.98及GC含量為69%，其兩者實質上高於WT-FXN之值。
使用在http：//www.bioinformatics.org/sms2/cpg_islands.html發現之公開可用軟體識別潛在CpG島。CpG島軟體使用由Gardiner-Garden及Frommer，1987，J.Mol.Biol.196(2)：261-282描述之方法報告潛在CpG島區域。在1個鹼基對(bp)時間間隔處使用跨越序列之200個bp窗口執行計算。將CpG島定義為序列範圍，其中Obs/Exp值大於0.6且GC含量大於50%。如下計算窗口中之CpG二聚體的期望數目：窗口中之『C』的數目乘以窗口中之『G』的數目，除以窗口長度。因此，存在於核酸序列中之潛在CpG島可易於藉由將爭議中序列輸入至由軟體提供之窗口中來判定(藉由「將原始序列或一或多個FASTA序列黏貼至以下文字區域中。輸入限制為100000個字符」之指令指示)。CpG島往往發現於脊椎動物基因之5'區域中，因此，此程式可用於反白顯示基因組序列中之潛在基因。
歸因於較高表現量及較高GC含量(55%)、較高CAI(0.86)及較低數目個CpG二核苷酸(117)，Genscript(低CpG)經修飾FXN基因經選擇用於製造以下闡述之動物實驗中所使用的scAAV-2i8載體。
實例2：弗里德賴希運動失調之小鼠模型中的活體內治療
將此項技術中公認的FRDA之小鼠模型(Perdomini等人，2014，Nature Med.20(5)：542)用於分析rAAV介導之FXN基因治療的潛在功效。亦即，檢查三組小鼠：未經治療Mck陽性對照小鼠(Mck-Cre x FXN L3/WT)、未經治療Mck突變小鼠(Mck-Cre x FXN L3/L-)，及接收包含FXN基因之rAAV的一劑量的經治療Mck突變小鼠，其中經修飾FXN基因 包含SEQ ID NO：7之核酸序列(GenScript(低CpG))且FXN基因經選殖至如上文所描述之pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH構造體中以提供pTRs-KS-CBh-Genscript(低CpG)-bGHpolyA。
小鼠研究中使用之rAAV-FXN載體進一步包含AAV2i8衣殼。此外，pTRs-KS-CBh-Genscript(低CpG)-bGHpolyA構造體進一步包含編碼可偵測血球凝集素標籤(rAAV-FXN-HA)之核酸序列，其中編碼HA標籤之序列位於經修飾FXN基因之3'，使得共濟失調蛋白之表現可易於藉由偵測HA之存在而偵測及定位，例如，使用抗HA抗體，諸如抗HA小鼠mAb(HA.11選殖16B12，Covance Research Products公司，Princeton，NJ)。載體為指定的rAAV-FXN-HA。
研究之三個動物組列於且描述於表2中。
A.生物標記物研究 方法 血漿中之半乳糖凝集素-3及H-FABP之量測
在5週齡(治療後2週)及8週齡(治療後5週)時在異氟醚麻醉之後藉由眼眶後穿刺採集血液。
使用來自根據製造商之說明書的RayBiotech的小鼠半乳糖凝集素-3 Elisa套組在血漿中量測半乳糖凝集素-3。
使用來自根據製造商之說明書的HycultBiotech之小鼠H-FABP Elisa套組在血漿中量測H-FABP。
心臟均質物中之琥珀酸去氫酶活性的量測
在處死之後，心臟經採集且每組4個小鼠之心臟的一半經快速冷凍以用於量測SDH活性。
心臟均質物之SDH活性量測遵循來自Biovision之琥珀酸去氫酶活性比色檢定套組(目錄#K660-100)之指令執行。
組織中之人類共濟失調蛋白的量測
在處死之後，心臟(一半)、骨骼肌(腓腸肌)及肝組織經採集及快速冷凍以用於共濟失調蛋白之量測。
組織均質物之量測遵循人類共濟失調蛋白Elisa套組(Abcam；ab176112)之指令執行。
組織學
小腦(包括齒狀核)、性腺、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、胰腺、骨骼肌(腓腸肌及比目魚肌)、脾臟及頸椎、胸及腰椎為甲醛液固定的。隨後使用EDTA溶液脫鈣脊椎。所有器官經石蠟包埋以獲得5μm厚部分；脊椎(包括脊髓及背根節)及心臟之橫向部分。用蘇木精及伊紅染色所有器官；使用梅森氏(Masson)三色染色法評估心臟纖維化。
超聲心動圖：
藉由Vevo-2100 Visual Sonics回聲儀上之30MHz線性探針(MS 400)在經麻醉小鼠(異氟醚1-2%)中捕獲之經胸超聲心動影像。
以下參數經量測以分析： a)心臟形態及心室收縮功能(短軸，SAX)：左心室端部舒張(LVEDD)及端部收縮直徑(LVESD)、中隔(SW)及後壁厚度(PW)、左心室質量(LVM=1.055×[(EDD+SW+PW)3-EDD3)])、射出及縮短分數及心輸出量；b)血液動力學特徵：肺及主動脈速度及偵測心內壓力變化之壓力(AoV及RV功能)。
小鼠
小鼠保持在控制溫度及濕度之動物設施中，該動物設施具有12h光-暗循環，可以自由飲水及攝取標準嚙齒動物食物(D03，SAFE，Villemoisson-sur-Orge，法國)。所有動物程序及實驗係由針對動物照護及使用之地方道德委員會(Comité d'Ethique en Expérimentation Animale IGBMC-ICS)核准(Com'Eth 2011-007)。
每天兩次執行小鼠臨床觀察，每週一次記錄體重及每2天記錄攝食量，直至過程結束為止。
對於生物分佈及基因治療研究，用異氟醚(1-2%)麻醉3週齡小鼠，且針對治療組，將劑量為1×1013vg/kg之rAAV-FXN-HA載體經靜脈注射至眼眶後靜脈，且針對未經治療MCK突變小鼠及對照組，則使用相等體積之鹽水。
在開始治療之前2天(基線表型)、在5週齡(治療後14天)及7週齡(治療後28天)時，藉由超聲心動圖，在異氟醚麻醉(1-2%)下，評估小鼠心臟功能。在5週齡及8週齡時，採集血液，如本文中其他處所詳述，量測心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)、半乳糖凝集素-3及琥珀酸去氫酶(SDH)的濃度。
在處死之後，記錄所有動物之體重、身長、心臟、脾臟、腎臟、腎上腺及肝臟重量。自每組4隻動物採集腎上腺、小腦、頸椎、胸及腰椎、性腺(睪丸及卵巢)、心臟、腎臟、肝臟、肺、胰腺、雄性之前列腺、骨骼肌(腓腸肌及比目魚肌)、脾臟及胸腺，用於病理評估及ELISA檢定。
採集每組其他4隻動物之小腦(包括齒狀核)、頸椎、胸及腰背根節、心臟、腎臟、肝臟、肺、性腺、胰腺、骨骼肌(腓腸肌及比目魚肌)及脾臟，且迅速冷凍，用於分子生物學。
結果 潛在生物標記物之識別
在三組小鼠中判定各種生物標記物之含量：未經治療Mck陽性對照組、未經治療Mck突變小鼠，及接受包含FXN基因且進一步包含編碼HA標籤肽之核酸的rAAV2i8(AAV-FXN-HA)之劑量的經治療Mck突變小鼠。
血漿中之半乳糖凝集素-3及H-FABP之量測
在5週齡(對經治療Mck突變小鼠之AAV治療的2週)及8週齡(對經治療Mck突變小鼠群組之rAAV治療的5週)時在異氟醚麻醉之後藉由眼眶後穿刺採集血液，且使用標準方法量測半乳糖凝集素-3及H-FABP之含量。
半乳糖凝集素-3：
在5週齡時，3個群組之間的半乳糖凝集素-3含量為相當的，即使與未經治療Mck突變小鼠群組相比較未經治療Mck陽性對照組及經治療Mck突變小鼠群組中之半乳糖凝集素-3含量趨於更高。
如表3中所展示，在8週齡時，未經治療Mck突變組中之半乳糖凝集素-3含量明顯地低於陰性對照組。實驗性群組中之半乳糖凝集素-3含量趨 於比陰性對照組更低，而實驗群組與陽性對照組之間的半乳糖凝集素-3含量相當。
出人意料地，未經治療Mck陽性對照組之小鼠在8週齡時比在5週齡時顯示更高半乳糖凝集素-3含量，而針對未經治療Mck突變小鼠群組及經治療Mck突變小鼠群組，在8週齡時之半乳糖凝集素-3含量與在5週齡時之含量相當。
總之，其呈現出半乳糖凝集素-3對關於Mck小鼠之此研究而言並非適當之心臟生物標記物。未經治療Mck突變小鼠群組中之小鼠在半乳糖凝集素-3為適當之生物標記物時並未展示此參數之預期增加。
H-FABP：
使用標準偵測方法在同一樣本群組內之小鼠之間觀測到H-FABP含量之極大可變性。
如表4中所展示，可對在5週齡及8週齡兩者時之3組小鼠之間的H-FABP血液含量進行比較。
在每組中之5週齡及8週齡之間沒有觀測到H-FABP含量之顯著改變。
總之，由此看來，H-FABP對關於Mck小鼠之此研究而言並非適當之心臟生物標記物；在未經治療Mck突變組中未觀測到此參數之預期增加，且在同一群組中之小鼠之間觀測到重要可變性。
心臟均質物中之SDH活性
使用標準方法量測來自在研究結束(8週齡、經治療突變小鼠群組之AAV治療的5週)時所採集之心臟之心臟均質物中的SDH活性。每組由四個(4)小鼠組成。
表5中所展示之結果展示可在3組小鼠之間比較SDH活性。與未經治療Mck突變組相比較，在未經治療Mck陽性對照組中未觀測到SDH活性降低。
在同一群組中之小鼠之間觀測到SDH活性之重要可變性。此外，在未經治療Mck陽性對照組中未觀測到SDH活性之預期降低。
心臟、骨骼肌及肝組織均質物中之共濟失調蛋白含量
如表6中所展示使用標準方法自在處死時採集之心臟、骨骼肌及肝臟量測人類共濟失調蛋白含量。
在未經治療Mck陽性對照組及未經治療Mck突變組之經檢查組織(心臟、骨骼肌及肝臟)中的任一者中沒有偵測到人類共濟失調蛋白(亦即，含量低於檢定之偵測下限[LLD])。
在接受rAAV-FXN之經治療Mck突變小鼠中，在含量為38.35+/-1.99ng/mg之心臟均質物中及在4.57+/-0.39ng/mg之較低濃度下的骨骼肌中偵 測到人類共濟失調蛋白。此外，在肝臟中偵測到人類共濟失調蛋白之跡線(0.07+/-0.01ng/mg蛋白)。
此等資料表明用包含FXN基因之rAAV載體進行之治療可增加弗里德賴希運動失調(FRDA)之小鼠模型的共濟失調蛋白含量。另外，此等資料展示FXN含量可藉由rAAV-FXN全身投與活體內增加，使得心臟中之FXN含量增加，且在骨骼肌增加較小程度，其中在肝臟中含量低得多。因此，此等資料表明活體內FXN含量可在受影響組織中選擇性地增加，例如，心臟及骨骼肌，同時在FXN為非所需及/或所要(例如，關於肝臟)的情況下最小化FXN之傳遞。
大體病理學
未經治療Mck陽性對照雄性小鼠與未經治療及經AAV治療之Mck突變動物相比較明顯更長(9.39cm與8.89cm[+5.62%]。P=0.011[t-測試])。未觀測到其他顯著肉眼可見損傷，尤其在雄性及雌性兩者之心臟重量中未觀測到肉眼可見損傷或顯著變化。
組織學 心臟
在一個未經治療Mck陽性對照動物(#58)中觀測到最小間質纖維化。所有其他3個未經治療Mck陽性對照組心臟為正常的。
然而，在經分析之所有4個未經治療Mck突變動物中觀測到最小(小鼠 #38)及中度(小鼠#41、#49及81)間質纖維化。此損傷與小鼠#38(最小)及#81(輕微)中腫脹之心肌細胞的心內膜病灶相關聯。在小鼠#41及#49中，纖維化與心肌細胞之中度巨噬細胞發炎、最小播散性腫脹及輕微液胞化相關聯。在小鼠#41及#81中觀測到阿尼契柯氏(Anitschkow)(鷹眼形)核。
與未經治療Mck突變群形成鮮明對比，在整個評估中，除在小鼠#47及#13中觀測到極少阿尼契柯氏核以外，經rAAV-FXN治療之Mck突變小鼠的心臟呈現正常。
腎臟
在所有群組中，常常在多個髓質小管之管腔中觀測到顯著礦化。頻率針對未經治療Mck陽性對照動物為4/4(儘管其表現Cre轉基因)，針對未經治療Mck突變動物為3/4，且針對接受一劑量之rAAV-FXN的經治療Mck突變動物為2/4。與未經治療Mck陽性對照組及未經治療Mck突變組相比較，經rAAV治療之Mck突變組中呈現礦化強度之降低。管狀嗜鹼性(再生)在2/4之未經治療Mck陽性對照組中的動物中、在3/4之未經治療Mck突變組中的動物中及在經AAV治療之Mck突變組中之1個動物中觀測到。
肝臟：在一個未經治療Mck陽性對照動物(#38)中觀測到最小門靜脈周發炎。
肺臟：在一個未經治療Mck突變動物(#41)中觀測到輕微支氣管周發炎。
未觀測到其他顯著顯微損傷。特別言之，脊髓、背根節及小腦均正常。
超聲心動圖 治療之前的基本表型
超聲心動圖量測結果展示與未經治療Mck陽性對照組相比較，未經治療Mck突變雄性小鼠之左心室功能降低。此心機能不全係藉由左心室(LV)收縮性(縮短分數及射血分數)之減少及LV容積(收縮及舒張兩者)之增加表徵。在彼階段中，在未經治療Mck突變雌性小鼠中未觀測到心臟表型。
圖4A展示藉由3週齡(A)雄性及(B)雌性之超聲心動圖評估收縮功能及LV容積之曲線圖。資料為每組8個小鼠之平均值±S.E.M。使用多個t-測試比較(Sidak-Bonferroni法)將Mck突變(經治療及未經治療兩者)小鼠之資料與未經治療Mck陽性對照組進行比較。*p<0.05
rAAV治療之後14天(5週齡)的結果：
為調查用於治療FRDA心肌病之基因治療方法的潛能，以單獨靜脈內注射向3週齡突變小鼠(經治療Mck突變組)投與劑量為1×1013vg/kg之AAV.FXN-HA。在注射之後14天(5週齡)，超聲心動圖量測結果展示經治療Mck突變雄性之心臟血流動力學(心輸出量)的改良及接近正常形態發展(收縮性、LV質量)。相反地，仍在未經治療Mck突變小鼠中觀測到心機能不全。出人意料地，在雌性中，在所有Mck突變小鼠(無論經治療或未經治療)中觀測到心肌收縮性缺陷。
圖5A至圖5B展示藉由5週齡雄性(圖5A)及雌性(圖5B)之超聲心動圖評估收縮功能及LV容積。資料為每組8個小鼠之平均值±S.E.M。使用多個t-測試比較(Sidak-Bonferroni法)將突變小鼠之資料與對照組進行比較。*p<0.05.
rAAV治療之後28天(7週齡)的結果：
在rAAV治療二十八(28)天(7週齡)，經治療Mck突變雄性及雌性完全 歸一化且變得不能在彼此之間及與未經治療Mck陽性對照小鼠區分開來。這樣，在經治療Mck突變小鼠中表明心臟疾病之完全校正(雄性)及預防(雌性)。相反地，未經治療Mck突變小鼠出現急進性心機能不全，伴隨左心室縮短分數及心輸出量明顯減少以及左心室肥大。
圖6A至圖6C展示描繪使用對歷時連續數週之未經治療Mck陽性對照組、及經治療及未經治療Mck突變小鼠之左心室質量(LVm)、縮短分數(SF)及心輸出量之超聲心動圖評估獲得的資料之曲線圖。資料為每組8個小鼠之平均值±S.E.M。使用多個t-測試比較(Sidak-Bonferroni法)將Mck突變小鼠之資料與未經治療Mck陽性對照群組進行比較。*p<0.05.
結論 超聲心動圖之結果
在此研究中，分析劑量為1×1013vg/kg之視情況進一步包含可偵測血球凝集素標籤(HA)載體的rAAV-FXN(在本文中被稱作rAAV-FXN-HA)之療效。此劑量比先前在同一Mck小鼠心臟特異性弗里德賴希運動失調小鼠模型中所描述之劑量低大約5倍，該弗里德賴希運動失調小鼠模型使用編碼野生型FXN之rrhAAV10載體(Perdomini等人，2014，Nature Medicine 20(5)：542)。
如圖5A中所展示，在3週齡時，未經治療Mck突變雄性小鼠開始出現左心室(LV)功能不全，在相同週齡之同一群組之雌性中未觀測到該左心室功能不全(圖5B)。在AAV.FXN-HA注射之後十四(14)天(在5週齡時)，在Mck突變雄性中觀測到心臟表型之進行性校正，但該進行性校正在Mck突變雌性中較少。在不希望受任何特定理論束縛的情況下，此差異可歸因於與雄性相比較雌性中之心臟表型的開始更晚或歸因於到目前為止此協定 中所使用之小鼠數目的減少。
此等結果表明經rAAV修飾的FXN之全身投與逆轉FRDA的Mck突變小鼠模型中之心臟疾病表型。此等結果進一步表明經rAAV修飾的FXN投與可預防及/或逆轉有需要個體之FRDA。
rAAV-FXN注射後二十八(28)天，在經治療Mck突變雄性及雌性中觀測到心臟功能之完全恢復，其表明利用所注射FXN轉基因之病變的穩健校正。亦即，圖6A至圖6C中所展示之資料表明rAAV-FXN投與之後二十八(28)天的FRDA心臟表型之校正。更特定而言，圖6A展示當未經治療(三角形)Mck突變小鼠呈現明顯地更高左心室質量(LVm)時，經治療Mck突變小鼠及對照組(WT野生型Mck-Cre小鼠)兩者之LVm為不可區分的(*p<0.05)。圖6B展示資料，該資料表明在rAAV-FXN治療之後28天，陽性對照組(WT L3 Mck-Cre小鼠；圓形)及經治療Mck突變(L-)小鼠(方形)兩者表明實質上相同縮短分數(SF)量測結果。相反地，圖6B表明未經治療Mck突變小鼠(三角形)顯示極大地減少之SF(*p<0.05)。另外，圖6C展示資料：該資料表明在用rAAV進行治療之後28天，與展示明顯減少之心輸出量(三角形；*p<0.05)的未經治療Mck突變小鼠(三角形)相比較，經治療Mck突變小鼠(方形)顯現不可與對照小鼠(圓形)區分之心輸出量。所有(經治療及未經治療)Mck突變小鼠係使用多個t-測試比較(Sidak-Bonferroni法)與對照未經治療小鼠進行比較。對於圖6A至圖6C中所展示之每一曲線圖，指示*<0.05。
此等資料充分地表明包含編碼共濟失調蛋白之經修飾核酸的rAAV之投與可逆轉及/或預防FRDA之此項技術中公認的小鼠模型中的Mck表型。因此，此等資料證明經rAAV修飾的FXN介導之治療可為用於治療或預防 有需要個體之減少含量的FRDA或由野生型(例如，功能性)共濟失調蛋白介導之疾病、病症或病狀的潛在有用療法。儘管此等資料表明全身性地投與rAAV經修飾FXN可治療或預防FRDA，但此等結果進一步證明治療亦包括rAAV-FXN投與之其他(例如，更直接)途徑，諸如(但不限於)，顱內或直接心臟投與。亦即，由於全身投與表明為療法，故熟習此項技術者基於本文中所提供之本發明應理解，更直接投與途徑亦可提供治療益處。
此等結果強有力地證明使用經修飾FXN基因之rAAV載體傳遞的基因治療為用於患有FRDA之患者及用於治療或預防顯示野生型/功能性共濟失調蛋白含量減少之個體的腎結石的潛在療法。
實例3：在弗里德賴希運動失調之小鼠模型中活體內投與rAAV-FXN之組織學研究 研究設計
二十四(24)個8週齡C57BL6/N雄性及雌性小鼠經分析用於組織病理學分析。
八(8)個小鼠持有與功能性經改造人類共濟失調蛋白對偶基因相關聯之Mck-Cre轉基因(MCK：Muscular Creatine Kinase)(Mck-Cre x FXN L3/WT；下文中被稱作「Mck陽性對照小鼠」)。十六(16)個小鼠持有目前與無活性經改造共濟失調蛋白對偶基因相關聯之相同轉基因(Mck-Cre x FXN L3/L-；下文中被稱作「Mck突變小鼠」)。在Mck突變小鼠當中，八(8)個注射編碼共濟失調蛋白之rAAV2i8(rAAV-FXN；1013vg/kg)(下文中為「經治療Mck突變小鼠」)。剩餘八(8)個Mck突變小鼠接受相等體積之鹽水(下文中為「未經治療Mck突變小鼠」)。陽性對照小鼠群組(Mck-Cre x FXN L3/WT)經投與鹽水。參看下表7。
方法
在處死之後，自所有動物記錄體重、身長及心臟、脾臟、腎臟、腎上腺及肝臟重量。自每組四(4)個動物採集腎上腺、小腦、頸椎、胸及腰椎、性腺(睪丸及卵巢)、心臟、腎臟、肝臟、肺、胰腺、雄性前列腺、骨骼肌(腓腸肌及比目魚肌)、脾臟及胸腺以用於病理評估及ELISA檢定。
每組4個其他動物之小腦(包括齒狀核)、頸椎、胸及腰背根節、心臟、腎臟、肝臟、肺、性腺、胰腺、骨骼肌(腓腸肌及比目魚肌)及脾臟經採集且迅速冷凍以用於分子生物學。
組織學
小腦(包括齒狀核)、性腺、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、胰腺、骨骼肌(腓腸肌及比目魚肌)、脾臟及頸椎、胸及腰椎為甲醛液固定的。隨後使用EDTA溶液脫鈣脊椎。所有器官經石蠟包埋以獲得5μm厚部分，脊椎(包括脊髓及背根節)及心臟之橫向部分。用蘇木精及伊紅染色所有器官。使用梅森氏三色染色法評估心臟纖維化。
ELISA檢定
在採集之後立即快速冷凍心臟的一半、肝臟之右葉、及比目魚肌及腓腸肌。
結果 大體病理學
Mck陽性對照雄性小鼠與未經治療Mck突變小鼠及經治療Mck突變小鼠相比較明顯更長(9.39cm與8.89cm[+5.62%]。P=0.011[t-測試])。未觀測到其他顯著肉眼可見損傷，尤其在雄性及雌性兩者之心臟重量中未觀測到肉眼可見損傷或顯著變化。
組織學 心臟
Mck-Cre x FXN L3/WT：在一個Mck陽性對照動物(#58)中觀測到最小間質纖維化。所有其他3個陽性對照小鼠心臟為正常的。
未經治療Mck-Cre x FXN L3/L-：相反地，在經分析之所有4個未經治療Mck突變小鼠中觀測到最小(小鼠#38)及中度(小鼠#41、#49及81)間質纖維化。此損傷與小鼠#38(最小)及#81(輕微)中腫脹之心肌細胞的心內膜病灶相關聯。在小鼠#41及#49中，纖維化與心肌細胞之中度巨噬細胞發炎、最小播散性腫脹及輕微液胞化相關聯。在小鼠#41及#81中觀測到阿尼契柯氏(鷹眼形)核。
經治療Mck-Cre x FXN L3/L-：與未經治療Mck突變小鼠相反，除在小鼠#47及#13中觀測到極少阿尼契柯氏核以外，經rAAV-FXN治療之Mck突變小鼠的心臟呈現正常。
腎臟
在所有三組中，常常在多個髓質小管之管腔中觀測到顯著礦化。礦化頻率針對Mck陽性對照動物為4/4，針對未經治療Mck突變動物為3/4，且針對經rAAV-FXN治療之Mck突變動物為2/4。與Mck陽性對照組及未 經治療Mck突變組相比較，經rAAV-FXN治療之Mck突變組中呈現礦化強度之降低。管狀嗜鹼性(再生)在2/4之Mck陽性對照小鼠中的動物中、在3/4之未經治療Mck突變組中之動物中及在經rAAV-FXN治療之Mck突變組中之1個動物中觀測到。
肝臟：在一個Mck陽性對照動物(#38)中觀測到最小門靜脈周發炎。
肺臟：在一個未經治療Mck突變動物(#41)中觀測到輕微支氣管周發炎。
未觀測到其他顯著顯微損傷。特別言之，所有群組之脊髓、背根節及小腦均為正常的。
組織學結果
關於組織學，在未經治療Mck突變小鼠之心肌細胞中觀測到之鷹眼核、腫脹及液胞化均為心臟退化之標誌。與巨噬細胞發炎相關聯之間質纖維化可對應於心肌細胞死亡。因此，未經治療Mck突變小鼠之心肌細胞退化，意謂細胞經受下降之功能及演變至細胞死亡及後續心臟衰竭的病變。
引人注目地，rAAV-FXN全身傳遞逆轉此表型且經rAAV治療之Mck突變小鼠(雄性及雌性兩者)呈現正常且未展示顯著的心肌細胞退化跡象。此等資料表明rAAV-huFXN轉導足以逆轉內源性小鼠Fxn基因不活化影響。因此，此等資料進一步使證明經rAAV修飾之FXN介導之全身投與可逆轉及/或預防由有需要個體之減少含量的野生型(功能性)共濟失調蛋白減少含量之減少介導的疾病、病症或病狀，諸如(但不限於)，弗里德賴希運動失調。如先前所指出，擁有本發明之教示的熟習此項技術者應理解，可將其他投與途徑(例如，包括顱內及至心臟之更直接途徑)用於向有需要個體提供治療益處。
對腎臟之分析識別為不常見損傷之未經治療Mck陽性對照組及未經治療Mck突變動物兩者之髓質中之腎結石(其為不常見損傷)的存在。由於未向此等動物提議特定膳食且考慮到其年齡，病變之頻率及強度強有力地表明此並非偶發損傷，而係與基因型相關之損傷。引人關注地，此損傷強度藉由rAAV-FXN治療部分地降低，其表明腎結石發展係關於Fxn功能及/或蛋白含量之改變。因此，所謂的L3對偶基因(其中小鼠共濟失調蛋白基因由loxP序列側接(儘管在內含子區域中))可為減效對偶基因。此應與維持經上皮電解質活性傳輸之此等細胞中之粒線體的關鍵作用一致。就申請人之知識及信念而言，到目前為止，此等病變尚未報告於弗里德賴希運動失調臨床觀測中，或報告於FRDA小鼠模型中。
因此，本發明涵蓋治療或預防腎臟疾病、病症或病狀之方法，包括(但不限於)：有需要個體罹患或生長腎結石，其中腎臟疾病、病症或病狀係由個體之減少含量的共濟失調蛋白(例如，功能性及/或野生型共濟失調蛋白)介導。
在一個實施例中，本發明包括評定個體之共濟失調蛋白含量；將個體之共濟失調蛋白含量與已知未罹患腎結石之個體的共濟失調蛋白含量相比較及/或將共濟失調蛋白含量與針對其他健康個人判定之或此項技術中已知的「標準共濟失調蛋白含量」相比較，及在個體之共濟失調蛋白含量低於其他健康個人之共濟失調蛋白含量及/或低於標準共濟失調蛋白含量時向該個體投與經rAAV修飾的共濟失調蛋白，藉此治療及/或預防個體之腎結石。
最終，HA染色可用於偵測細胞內之rAAV-FXN-HA。首先，定量應表現FXN以恢復或維持心臟功能之細胞的數目將為重要的。其次，並未預 期在腎臟中表現Mck基因(且因此由Mck啟動子驅動之Cre重組酶)。是否偵測腎臟中之rAAV-FXN-HA可有助於闡明腎結石形成是否為對髓質內穩定之HA-FXN的未預期直接影響。
結論
總之，本文中呈現之資料表明投與(甚至全身性地)編碼經修飾FXN基因之rAAV可治療(預防及/或逆轉)與共濟失調蛋白之減少或缺失相關聯的影響。因此，資料證明介導共濟失調蛋白在細胞及有需要之個體中之表現的rAAV可為用以治療與共濟失調蛋白之缺少或缺乏相關聯或由共濟失調蛋白之缺少或缺乏介導之疾病或病症(諸如(但不限於)弗里德賴希運動失調)的有用療法。
儘管已參考不同申請案、方法、套組及組合物描述所揭示之教示，但應瞭解，可在不脫離本文中之教示及下文所主張之本發明的情況下進行各種變化及修改。提供前述實例以更好地說明本發明之教示，且不意欲限制本文中所呈現之教示的範疇。雖然已在此等例示性實施例方面描述本發明教示，但熟習此項技術者將容易理解在不過度實驗情況下此等例示性實施例之大量變化及修改為可能的。所有該等變化及修改皆在本教示之範疇內。
本文中所引用之全部參考文獻(包括專利案、專利申請案、論文、課本及類似者)及其中引用的參考文獻至其尚未引用之程度，在此以全文引用之方式併入本文中。在所併入文獻及類似材料中之一或多者(包括(但不限於)定義術語、術語用法、所述技術等)與本申請案不同或抵觸的情況下，以本申請案為準。
前述描述及實例詳述本發明的某些特定實施例，且描述本發明人預 期之最佳模式。然而，將瞭解，無論以文字呈現之前述內容如何詳細，本發明可以許多方式實踐，且本發明應根據所附申請專利範圍及其任何等效物解釋。
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<223> 編碼共濟失調蛋白之IDT3最佳化核苷酸序列
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<223> 編碼共濟失調蛋白之IDT5最佳化核苷酸序列
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<223> 用於選殖至pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH scAAV載體中之編碼人類野生型共濟失調蛋白(WT FXN)之核苷酸序列
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<212> DNA
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<220>
<223> 用於選殖至pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH scAAV載體中之編碼FXN之IDT1密碼子最佳化核苷酸序列
<400> 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 用於選殖至pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH scAAV載體中之編碼FXN IDT3(低表現)之密碼子最佳化核苷酸序列
<400> 21
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於選殖至pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH scAAV載體中之編碼FXN IDT4之密碼子最佳化核苷酸序列
<400> 22
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 用於選殖至pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH scAAV載體中之編碼FXN GenScript之密碼子最佳化核苷酸序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於選殖至pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH scAAV載體中之編碼FXN GenScript (低CpG)之密碼子最佳化核苷酸序列
<400> 24
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<212> DNA
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<223> 編碼膠原蛋白穩定序列之核酸序列
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<223> CBh啟動子之核酸序列
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<223> bGHpoly A信號序列之核酸序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼AAV2i8衣殼(VP1)之核苷酸序列
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<210> 29
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV2i8衣殼(VP1)之胺基酸序列
<400> 29
<210> 30
<211> 2208
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 編碼AAV2-TT衣殼(VP1)之核酸
<400> 30
<210> 31
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV2-TT衣殼(VP1)之胺基酸序列
<400> 31
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 編碼AAV2-TT-S312N衣殼(VP1)之核酸
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<210> 33
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV2-TT-S312N衣殼(VP1)之胺基酸序列
<400> 33

Claims (33)

  1. 一種包含在SEQ ID NO：1中闡述之胺基酸序列的編碼共濟失調蛋白(frataxin)(FXN)之經修飾核酸，其中該核酸之表現量高於SEQ ID NO：2之野生型FXN核酸序列的表現量，且其中該經修飾核酸包含選自由以下各者組成之群的至少一個特性：GC含量為至少55%、CpG二核苷酸數目不超過124，及密碼子適應指數(CAI)為至少0.76。
  2. 如請求項1之經修飾核酸，該核酸包含選自由以下各者組成之群的至少一個特性：(a)CAI為至少0.86、至少0.95或至少0.98；(b)GC含量為至少57%、至少61%或至少69%；(c)CpG二核苷酸之數目小於124；(d)選自由如SEQ ID NO：3至9中所闡述之序列組成之群的核酸序列。
  3. 一種編碼FXN之經修飾核酸，其中該核酸之表現量高於SEQ ID NO：2之該野生型FXN核酸序列的表現量，且其中該核酸包含以下各者中之至少一者：(a)選自由SEQ ID NO：3至9組成之群的核酸序列；(b)GC含量為至少55%；(c)CpG二核苷酸數目不超過117；及(d)CAI為至少0.86。
  4. 如請求項3之經修飾核酸，其中該核酸序列係選自由SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：7組成之群。
  5. 如請求項1之經修飾核酸，其包含SEQ ID NO：7之核酸序列。
  6. 一種載體，其包含如請求項1之經修飾核酸。
  7. 一種載體，其包含如請求項3之經修飾核酸。
  8. 如請求項7之載體，其中該載體為重組腺相關病毒載體(rAAV)且該核酸為自我互補。
  9. 如請求項8之rAAV，其中該rAAV包含選自由以下各者之衣殼組成之群的衣殼：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV Hu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAV2i8、AAV2G9、AAV2i8G9、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N及AAV-LK03。
  10. 如請求項9之rAAV，其中該經修飾核酸包含SEQ ID NO：7之序列，且其中衣殼係選自AAV2i8之衣殼及AAV2-TT-S312N之衣殼。
  11. 如請求項10之rAAV，其中該核酸進一步包含選自由以下各者組成之群的至少一個元件：至少一個AAV末端重複序列、強化子、啟動子、終止密碼子及聚腺苷酸化(polyA)信號序列。
  12. 如請求項11之rAAV，該rAAV包含兩個AAV末端重複序列、CBh啟動子、編碼膠原蛋白穩定序列(CSS)之序列，及牛生長激素聚腺苷酸化信號序列(bGHpolyA)。
  13. 一種rAAV載體，其包含自5'至3'包含以下之核酸：(a)AAV2末端重複序列；(b)CBh啟動子，其包含SEQ ID NO：25之核酸序列；(c)編碼如請求項3之FXN的經修飾核酸；(d)CSS，其具有SEQ ID NO：24之序列；(e)bGHpolyA信號序列，其具有SEQ ID NO：26之序列；及(f)AAV2末端重複序列。
  14. 如請求項13之rAAV載體，其進一步包含AAV2i8衣殼，其中VP1包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，該載體進一步包含自5'至3'包含以下之自我互補核酸：(a)AAV2末端重複序列；(b)CBh啟動子，其包含SEQ ID NO：25之該核酸序列；(c)編碼FXN之經修飾核酸，其包含SEQ ID NO：7之序列； (d)CSS，其具有SEQ ID NO：24之序列；(e)bGHpolyA信號序列，其具有SEQ ID NO：26之序列；及(f)AAV2末端重複序列。
  15. 如請求項13之rAAV載體，其進一步包含AAV2-TT-S312N衣殼，其中該VP1包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，該載體進一步包含自5'至3'包含以下之自我互補核酸：(a)AAV2末端重複序列；(b)CBh啟動子，其包含SEQ ID NO：25之該核酸序列；(c)編碼FXN之經修飾核酸，其包含SEQ ID NO：7之序列；(d)CSS，其具有SEQ ID NO：24之序列；(e)bGHpolyA信號序列，其具有SEQ ID NO：26之序列；及(f)AAV2末端重複序列。
  16. 一種用於治療有需要患者之弗里德賴希(Friedreich)運動失調(FRDA)的rAAV載體，其中該rAAV包含選自由以下各者組成之群的編碼FXN之經修飾核酸：(a)經修飾核酸，其包含在SEQ ID NO：1中闡述之胺基酸序列，其中該核酸之表現量高於SEQ ID NO：2之野生型FXN核酸序列的表現量，且進一步包含至少55%之GC含量、不超過124的CpG二核苷酸數目，及至少0.76的密碼子適應指數(CAI)；(b)經修飾核酸，其包含至少0.86之CAI、至少55%之GC含量，及不超過117之CpG二核苷酸數目； (c)經修飾核酸，其包含SEQ ID NO：5之核酸序列；及(d)經修飾核酸，其包含SEQ ID NO：7之核酸序列。
  17. 如請求項16之經修飾核酸，其包含SEQ ID NO：7之核酸序列。
  18. 一種用於治療有需要患者之弗里德賴希運動失調的rAAV載體，其中該載體包含如請求項3之編碼共濟失調蛋白的經修飾核酸。
  19. 一種醫藥組合物，其包含如請求項18之rAAV載體。
  20. 一種如請求項18之rAAV載體的用途，其係用於製造用於治療FRDA之藥物。
  21. 如請求項20之用途，其中藉由直接心臟投與或藉由顱內投與，以供全身性投與該藥物。
  22. 如請求項21之用途，其中該藥物經顱內投與。
  23. 如請求項21之用途，其中直接向心臟投與該藥物。
  24. 如請求項21之用途，其中編碼FXN之該經修飾核酸包含SEQ ID NO：7之核酸序列。
  25. 一種如請求項18之rAAV載體之用途，其係用於製造用於治療由減少含量之FXN介導之疾病、病症或病狀之藥物。
  26. 一種宿主細胞，其包含如請求項3之編碼FXN的經修飾核酸。
  27. 如請求項26之宿主細胞，其中該細胞係選自由以下各者組成之群：VERO、WI38、MRC5、A549、HEK293細胞、B-50或任何其他HeLa細胞、HepG2、Saos-2、HuH7及HT1080。
  28. 如請求項27之宿主細胞，其中該宿主細胞為適於在懸浮培養物中生長之HEK293。
  29. 如請求項27之宿主細胞，其中該細胞為具有ATCC第PTA 13274號之HEK293細胞。
  30. 如請求項26之宿主細胞，該細胞包含編碼選自由以下各者組成之群的至少一種蛋白質的至少一種核酸：Rep蛋白、Cap蛋白、E1a蛋白、E1b蛋白、E2a蛋白、E4蛋白及VA RNA。
  31. 如請求項1之編碼共濟失調蛋白的經修飾核酸，其用於增加共濟失調蛋白在細胞中之含量。
  32. 如請求項3之編碼共濟失調蛋白的經修飾核酸，其用於增加共濟失調 蛋白在細胞中之含量。
  33. 如請求項18之rAAV載體，其用於治療個體之弗里德賴希運動失調。
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