TW202206599A - 用於基因療法的編碼天冬胺酸醯化酶（ａｓｐａ）之經修飾核酸及載體 - Google Patents

用於基因療法的編碼天冬胺酸醯化酶（ａｓｐａ）之經修飾核酸及載體 Download PDF

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Abstract

本揭露係關於包含編碼天冬胺酸醯化酶(ASPA)之經修飾核酸的重組核酸及基因療法載體及其變異體，用於治療與ASPA之缺陷或功能障礙相關之疾病及病症，尤其康納丸氏病。

Description

用於基因療法的編碼天冬胺酸醯化酶(ASPA)之經修飾核酸及載體
相關申請案之交叉引用
本申請案要求2020年4月28日提交之美國臨時申請案第63/016,507號及2020年9月11日提交之美國臨時申請案第63/077,144號的優先權。申請案之內容以引用之方式整體併入本文。
本發明係關於編碼天冬胺酸醯化酶(ASPA)之經修飾核酸，使用編碼ASPA之經修飾核酸的方法，包含編碼ASPA之經修飾核酸的載體以及載體在治療與功能性ASPA水準減少相關之疾病、病症及病狀包括與N-乙醯基-L-天冬胺酸之細胞分解代謝減弱相關之疾病、病症及病狀例如康納丸氏病(Canavan disease)中的用途。
康納丸氏病(CD)與編碼天冬胺酸醯化酶(ASPA)(亦稱為胺基醯化酶2)之ASPA基因的表現減少及/或突變相關。天冬胺酸醯化酶活性減少導致N-乙醯天冬胺酸(NAA)(亦稱為N-乙醯基-L-天冬胺酸)積聚，此歸因於NAA至天冬胺酸鹽及乙酸鹽之轉化減少。ASPA酶涉及維持髓鞘形成性細胞之代謝完整性。在腦中，ASPA基因表現主要限於產生白質之寡樹突細胞。NAA在腦中之積聚與寡樹突細胞功能障礙、以及髓鞘之發育之干擾、以及與神經元相關之現有髓鞘之破壞相關。
CD為體染色體隱性遺傳性疾病並且主要以新生兒/嬰兒期形式呈現。受此形式影響之兒童在嬰兒期呈現與腦及脊髓中之髓磷脂退化相關的症狀。症狀包括智能障礙、先前掌握之運動技能喪失、進食困難、肌肉張力異常、巨頭畸形、癱瘓及癲癇發作。對於患有新生兒/嬰兒期CD之兒童而言，預期壽命通常限於前十年。患有輕度/青少年形式之CD的個體可能展現出語言及運動技能發育遲緩，並且具有中等壽命。
迄今為止，不存在用於停止或減慢CD之神經退行性作用的治療方法。當前在臨床使用中或正在評估中之治療方法係關於減輕症狀並使生活品質最大化。物理療法、餵食管和抗癲癇藥物可用於治療一些症狀並改善生活品質。因此，非常需要治療CD的新穎治療方法。
揭示並且例示了編碼天冬胺酸醯化酶(ASPA)之經修飾核酸、及包含經修飾核酸之載體(例如，rAAV載體)、及藉由向有需要之患者投與經修飾核酸或包含經修飾核酸之載體來治療藉由ASPA蛋白水準減少所介導之疾病、病症或病狀的方法。
熟習此項技術者將使用不多於一種常規實驗便認識到或能夠確定本文所述之本發明之特定實施例的許多等效物。此類等效物意欲由以下實施例(E)涵蓋。 E1. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經分離核酸，包含與核酸序列SEQ ID NO:2有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E2. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經分離核酸，包含有包含序列SEQ ID NO:2或由其組成的核酸序列。 E3. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經分離核酸，包含與核酸序列SEQ ID NO:1有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E4. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經分離核酸，包含有包含序列SEQ ID NO:1或由其組成的核酸序列。 E5. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經分離核酸，包含與核酸序列SEQ ID NO:3有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E6. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經分離核酸，包含有包含序列SEQ ID NO:3或由其組成的核酸序列。 E7. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸，包含與核酸序列SEQ ID NO:2有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E8. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸，包含有包含序列SEQ ID NO:2或由其組成的核酸序列。 E9. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸，包含與核酸序列SEQ ID NO:1有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E10. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸，包含有包含序列SEQ ID NO:1或由其組成的核酸序列。 E11. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸，包含與核酸序列SEQ ID NO:3有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E12. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸，包含有包含序列SEQ ID NO:3或由其組成的核酸序列。 E13. 一種包含編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸的重組核酸，該經修飾核酸包含與核酸序列SEQ ID NO:2有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E14. 一種包含編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸的重組核酸，該經修飾核酸包含核酸序列SEQ ID NO:2或由其組成。 E15. 一種包含編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸的重組核酸，該經修飾核酸包含與核酸序列SEQ ID NO:1有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E16. 一種包含編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸的重組核酸，該經修飾核酸包含核酸序列SEQ ID NO:1或由其組成。 E17. 一種包含編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸的重組核酸，該經修飾核酸包含與核酸序列SEQ ID NO:3有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E18. 一種包含編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸的重組核酸，該經修飾核酸包含核酸序列SEQ ID NO:3或由其組成。 E19. 如E13-E18中任一項所述之重組核酸，進一步包含至少一個選自由以下組成之群的元件：強化子、啟動子、外顯子、內含子及多腺苷酸化(polyA)訊息序列。 E20. 如E19所述之重組核酸，其中該強化子包含與核酸序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:17或兩者有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E21. 如E19-E20中任一項所述之重組核酸，其中該強化子包含核酸序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:17或兩者或由其組成。 E22. 如E19-E21中任一項所述之重組核酸，其中該啟動子係組成性或經調控的。 E23. 如E19-E22中任一項所述之重組核酸，其中該啟動子為可誘導或可抑制的。 E24. 如E19-E23中任一項所述之重組核酸，其中該啟動子包含與核酸序列SEQ ID NO:7有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E25. 如E19-E24中任一項所述之重組核酸，其中該啟動子包含核酸序列SEQ ID NO:7或由其組成。 E26. 如E19-E25中任一項所述之重組核酸，其中該外顯子包含與核酸序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18或兩者有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E27. 如E19-E26中任一項所述之重組核酸，其中該外顯子包含核酸序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18或兩者或由其組成。 E28. 如E19-E27中任一項所述之重組核酸，其中該內含子包含與核酸序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或兩者有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E29. 如E19-E28中任一項所述之重組核酸，其中該內含子包含核酸序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或兩者或由其組成。 E30. 如E19-E29中任一項所述之重組核酸，其中該polyA序列包含與核酸序列SEQ ID NO:11有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E31. 如E19-E30中任一項所述之重組核酸，其中該polyA序列包含核酸序列SEQ ID NO:11或由其組成。 E32. 如E19-E31中任一項所述之重組核酸，其中該強化子可操作地連接至該經修飾核酸。 E33. 如E19-E32中任一項所述之重組核酸，其中該啟動子可操作地連接至該經修飾核酸。 E34. 如E13-E18中任一項所述之重組核酸，進一步包含至少一個選自由以下組成之群的元件：巨細胞病毒(CMV)強化子、雜合形式之CBA啟動子(CBh啟動子)、雞β-肌動蛋白(CBA)外顯子、CBA內含子、小鼠微小病毒(MVM)內含子及牛生長激素(BGH) polyA。 E35. 如E13-E18中任一項所述之重組核酸，進一步包含至少一個選自由以下組成之群的元件：包含核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17之CMV強化子；包含核酸序列SEQ ID NO:7之CBh啟動子；包含核酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18之CBA外顯子；包含核酸序列SEQ ID NO:9之CBA內含子、包含核酸序列SEQ ID NO:10之MMV內含子及包含核酸序列SEQ ID NO:11之BGH polyA。 E36. 一種載體基因體，包含如E7-E12中任一項所述之經修飾核酸或如E13-E35中任一項所述之重組核酸，其中該載體基因體進一步包含至少一個AAV ITR重複序列，其包含與核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或兩者有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E37. 如E36所述之載體基因體，其中該至少一個AAV ITR重複序列包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19或其組合或由其組成。 E38. 如E36或E37所述之載體基因體，包含側接編碼ASPA之核酸序列及編碼ASPA之序列上游之CBh啟動子的兩個AAV2 ITR序列。 E39. 如E36-E38中任一項所述之載體基因體，其中該ASPA序列包含核酸序列SEQ ID NO:2。 E40. 如E36-E39中任一項所述之載體基因體，其中該至少一個AAV2 ITR序列包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19或其組合。 E41. 如E36-E40中任一項所述之載體基因體，其中該CBh啟動子包含核酸序列SEQ ID NO:7。 E42. 一種包含核酸之載體基因體，其中該核酸自5'至3'包含： a) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19之AAV2 ITR； b) 包含核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17、較佳SEQ ID NO:6之CMV強化子； c) 包含核酸序列SEQ ID NO:7之CBh啟動子； d) 包含核酸序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、較佳SEQ ID NO:18之CBA外顯子； e) 包含核酸序列SEQ ID NO:9之CBA內含子； f) 包含核酸序列SEQ ID NO:10之MMV內含子； g) 包含核酸序列SEQ ID NO:1-3中任一者之編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸； h) 包含核酸序列SEQ ID NO:11之BGH polyA；及 i) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19之AAV2 ITR。 E43. 一種包含核酸之載體基因體，其中該核酸自5'至3'包含： a) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19之AAV ITR； b) 包含核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17、較佳SEQ ID NO:6之強化子； c) 包含核酸序列SEQ ID NO:7之啟動子； d) 包含核酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18、較佳SEQ ID NO:18之外顯子； e) 包含核酸序列SEQ ID NO:9之內含子； f) 包含核酸序列SEQ ID NO:10之內含子； g) 包含核酸序列SEQ ID NO:1-3中任一者之編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸； h) 包含核酸序列SEQ ID NO:11之PolyA；及 i) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19的AAV末端重複序列。 E44. 如E36-43中任一項所述之載體基因體，其中該載體基因體為自身互補的。 E45. 一種重組腺相關病毒(rAAV)載體，包含如E36-E44中任一項所述之載體基因體及殼體。 E46. 一種包含載體基因體之rAAV載體，該載體基因體包含與核酸序列SEQ ID NO:2有約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E47. 如E46所述之rAAV載體，包含選自由以下殼體組成之群的殼體：Olig001、Olig002、Olig003、AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV hu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAV2i8、AAV2G9、AAV2i8G9、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N及AAV-LK03。 E48. 一種包含載體基因體之rAAV載體，該載體基因體包含與核酸序列SEQ ID NO:1有約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E49. 如E48所述之rAAV載體，包含選自由以下殼體組成之群的殼體：Olig001、Olig002、Olig003、AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV hu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAV2i8、AAV2G9、AAV2i8G9、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N及AAV-LK03。 E50. 一種包含載體基因體之rAAV載體，該載體基因體包含與核酸序列SEQ ID NO:3有約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。 E51. 如E50所述之rAAV載體，包含選自由以下殼體組成之群的殼體：Olig001、Olig002、Olig003、AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV hu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAV2i8、AAV2G9、AAV2i8G9、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N及AAV-LK03。 E52. 如E45-E51中任一項所述之rAAV載體，其中該殼體選自Olig001、Olig002及Olig003殼體。 E53. 如E45-E52中任一項所述之rAAV載體，其中該殼體為包含病毒蛋白1 (VP1)之Olig001殼體並且其中該VP1包含與胺基酸序列SEQ ID NO:14有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。 E54. 如E45-E53中任一項所述之rAAV載體，其中該殼體為包含病毒蛋白1 (VP1)之Oligo001殼體並且其中該VP1包含胺基酸序列SEQ ID NO:14。 E55. 如E45-E52中任一項所述之rAAV載體，其中該殼體為包含病毒蛋白1 (VP1)之Olig002殼體並且其中該VP1包含與胺基酸序列SEQ ID NO:15有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。 E56. 如E45-E52及E55中任一項所述之rAAV載體，其中該殼體為包含病毒蛋白1 (VP1)之Oligo002殼體並且其中該VP1包含胺基酸序列SEQ ID NO:15。 E57. 如E45-E52中任一項所述之rAAV載體，其中該殼體為包含病毒蛋白1 (VP1)之Olig003殼體並且其中該VP1包含與胺基酸序列SEQ ID NO:16有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。 E58. 如E46-E52及E57中任一項所述之rAAV載體，其中該殼體為包含病毒蛋白1 (VP1)之Oligo003殼體並且其中該VP1包含胺基酸序列SEQ ID NO:16。 E59. 如E45-E58中任一項所述之rAAV載體，其中該載體基因體為自身互補的。 E60. 如E46-E59中任一項所述之rAAV載體，其中該載體基因體包含至少一個選自由以下組成之群的元件：至少一個AAV反向末端重複(ITR)序列、強化子、啟動子、外顯子、內含子及多腺苷酸化(polyA)訊息序列。 E61. 如E60所述之rAAV載體，其中該強化子包含與核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性的核酸序列。 E62. 如E60或E61所述之rAAV載體，其中該強化子包含核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17或由其組成。 E63. 如E60-E62中任一項所述之rAAV載體，其中該啟動子為組成性或經調控的。 E64. 如E60-E63中任一項所述之rAAV載體，其中該啟動子為可誘導或可抑制的。 E65. 如E60-E64中任一項所述之rAAV載體，其中該啟動子包含與核酸序列SEQ ID NO:7有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性的核酸序列。 E66. 如E60-E65中任一項所述之rAAV載體，其中該啟動子包含核酸序列SEQ ID NO:7或由其組成。 E67. 如E60-E66中任一項所述之rAAV載體，其中該外顯子包含與核酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性的核酸序列。 E68. 如E60-E67中任一項所述之rAAV載體，其中該外顯子包含核酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18或由其組成。 E69. 如E60-E68中任一項所述之rAAV載體，其中該內含子包含與核酸序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或兩者有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性的核酸序列。 E70. 如E60-E69中任一項所述之rAAV載體，其中該內含子包含核酸序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或兩者或由其組成。 E71. 如E60-E70中任一項所述之rAAV載體，其中該polyA序列包含與核酸序列SEQ ID NO:11有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性的核酸序列。 E72. 如E60-E71中任一項所述之rAAV載體，其中該polyA序列包含核酸序列SEQ ID NO:11或由其組成。 E73. 如E60-E72中任一項所述之rAAV載體，其中該至少一個AAV ITR重複序列包含與核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19或其組合有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性的核酸序列。 E74. 如E60-E73中任一項所述之rAAV載體，其中該至少一個AAV ITR重複序列包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19或其組合或由其組成。 E75. 如E46-E59中任一項所述之rAAV載體，其中該載體基因體進一步包含至少一個選自由以下組成之群的元件：至少一個AAV2 ITR序列、CMV強化子、CBh啟動子、CBA外顯子1、CBA內含子1、MVM內含子及BGH polyA。 E76. 如E46-E59中任一項所述之rAAV載體，其中該載體基因體進一步包含至少一個選自由以下組成之群的元件：至少一個包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19或其組合之AAV2 ITR序列；包含核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17之CMV強化子；包含核酸序列SEQ ID NO:7之CBh啟動子；包含核酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18之CBA外顯子1；包含核酸序列SEQ ID NO:9之CBA內含子1；包含核酸序列SEQ ID NO:10之MMV內含子；及包含核酸序列SEQ ID NO:11之BGH polyA。 E77. 如E46-E59中任一項所述之rAAV載體，其中該載體基因體包含側接編碼ASPA之序列及編碼ASPA之序列上游之CBh啟動子的兩個AAV2 ITR序列。 E78. 如E77所述之rAAV載體，其中該ASPA序列包含核酸序列SEQ ID NO:2。 E79. 如E77或E78之rAAV載體，其中該AAV ITR序列包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19或其組合。 E80. 如E77-E79中任一項所述之rAAV載體，其中該CBh啟動子包含核酸序列SEQ ID NO:7。 E81. 一種包含載體基因體之rAAV載體，該載體基因體自5'至3'包含： a) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19或其組合之AAV2 ITR； b) 包含核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:16之CMV強化子； c) 包含核酸序列SEQ ID NO:7之CBh啟動子； d) 包含核酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18之CBA外顯子1； e) 包含核酸序列SEQ ID NO:9之CBA內含子1； f) 包含核酸序列SEQ ID NO:10之MMV內含子； g) 包含核酸序列SEQ ID NO:1-3中任一者之編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸； h) 包含核酸序列SEQ ID NO:11之BGH polyA；及 i) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO;19或其組合之AAV2 ITR。 E82. 一種包含載體基因體之rAAV載體，該載體基因體自5'至3'包含： a) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19或其組合之AAV ITR； b) 包含核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17之強化子； c) 包含核酸序列SEQ ID NO:7之啟動子； d) 包含核酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18之外顯子； e) 包含核酸序列SEQ ID NO:9之內含子； f) 包含核酸序列SEQ ID NO:10之內含子； g) 包含核酸序列SEQ ID NO:1-3中任一者之編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸； h) 包含核酸序列SEQ ID NO:11之PolyA；及 i) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19或其組合之AAV末端重複序列。 E83. 如E81或E82所述之rAAV載體，其中該載體基因體為自身互補的。 E84. 如E81-E83中任一項所述之rAAV載體，其中該載體包含有包含VP1蛋白之Olig001殼體，其中該VP1包含與胺基酸序列SEQ ID NO:14有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。 E85. 如E81-E83中任一項所述之rAAV載體，其中該載體包含有包含VP1蛋白之Olig002殼體，其中該VP1包含與胺基酸序列SEQ ID NO:15有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。 E86. 如E81-E83中任一項所述之rAAV載體，其中該載體包含有包含VP1蛋白之Olig003殼體，其中該VP1包含與胺基酸序列SEQ ID NO:16有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。 E87. 一種rAAV載體，其包含：i)包含VP1蛋白之Olig001殼體，其中該VP1包含胺基酸序列SEQ ID NO:14；及ii)自身互補載體基因體，自5'至3'包含： a) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19或其組合之AAV2 ITR； b) 包含核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17之CMV強化子； c) 包含核酸序列SEQ ID NO:7之CBh啟動子； d) 包含核酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18之CBA外顯子1； e) 包含核酸序列SEQ ID NO:9之CBA內含子1； f) 包含核酸序列SEQ ID NO:10之MMV內含子； g) 包含核酸序列SEQ ID NO:1-3中任一者之編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸； h) 包含核酸序列SEQ ID NO:11之BGH polyA；及 i) 包含核酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:12之AAV2 ITR。 E88. 一種rAAV載體，其包含：i)包含VP1蛋白之Olig001殼體，其中該VP1包含胺基酸序列SEQ ID NO:14；及ii)自身互補載體基因體，自5'至3'包含： a) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19或其組合之AAV ITR； b) 包含核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17之強化子； c) 包含核酸序列SEQ ID NO:7之啟動子； d) 包含核酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18之外顯子； e) 包含核酸序列SEQ ID NO:9之內含子； f) 包含核酸序列SEQ ID NO:10之內含子； g) 包含核酸序列SEQ ID NO:1-3中任一者之編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸； h) 包含核酸序列SEQ ID NO:11之PolyA；及 i) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19或其組合之AAV ITR。 E89. 如E45-E88中任一項所述之rAAV載體，其中該載體在引入細胞中時減少該細胞中之NAA水準。 E90. 如E89所述之rAAV載體，其中該細胞為腦細胞。 E91. 如E89或E90所述之rAAV載體，其中該細胞為寡樹突細胞。 E92. 如E45-E91中任一項所述之rAAV載體，其中與投與該載體之前具有ASPA基因突變之受試者之平衡、握力及/或運動協調相比，將該載體投與至該受試者增加該受試者之平衡、握力及/或運動協調。 E93. 如E45-E92中任一項所述之rAAV載體，其中與投與該載體之前具有ASPA基因突變之受試者之一般運動功能相比，將該載體投與至該受試者增加該受試者之一般運動功能。 E94. 如E45-E93中任一項所述之rAAV載體，其中與投與該載體之前具有ASPA基因突變之受試者之NAA水準相比，將該載體投與至該受試者減少該受試者之NAA水準。 E95. 如E45-E94中任一項所述之rAAV載體，其中與投與該載體之前具有ASPA基因突變之受試者的丘腦之液泡體積分率相比，將該載體投與至該受試者減少該受試者之丘腦之液泡體積分率。 E96. 如E45-E95中任一項所述之rAAV載體，其中與投與該載體之前具有ASPA基因突變之受試者之小腦白質/橋腦之液泡體積分率相比，將該載體投與至該受試者減少該受試者之小腦白質/橋腦之液泡體積分率。 E97. 如E45-E96中任一項所述之rAAV載體，其中與投與該載體之前具有ASPA基因突變之受試者之丘腦之寡樹突細胞數目相比，將該載體投與至該受試者增加該受試者之丘腦之寡樹突細胞數目。 E98. 如E45-E97中任一項所述之rAAV載體，其中與投與該載體之前具有ASPA基因突變之受試者之腦皮質之寡樹突細胞數目相比，將該載體投與至該受試者增加該受試者之腦皮質之寡樹突細胞數目。 E99. 如E45-E98中任一項所述之rAAV載體，其中與投與該載體之前具有ASPA基因突變之受試者之丘腦之神經元數目相比，將該載體投與至該受試者增加該受試者之丘腦之神經元數目。 E100. 如E45-E99中任一項所述之rAAV載體，其中與投與該載體之前具有ASPA基因突變之受試者之腦皮質之神經元數目相比，將該載體投與至該受試者增加該受試者之腦皮質之神經元數目。 E101. 如E45-E100中任一項所述之rAAV載體，其中與投與該載體之前具有ASPA基因突變之受試者之皮質髓鞘形成相比，將該載體投與至該受試者增加該受試者之皮質髓鞘形成。 E102. 如E92-E101中任一項所述之rAAV載體，其中該受試者為人類患者。 E103. 如E92-E102中任一項所述之rAAV載體，其中該受試者為患有康納丸氏病或處於患上康納丸氏病之風險中的人類患者。 E104. 如E92-E103中任一項所述之rAAV載體，其中該受試者具有至少一個ASPA基因突變。 E105. 一種醫藥組合物，包含如E7-E12中任一項所述之經修飾核酸、如E13-E35中任一項所述之重組核酸、如E36-E44中任一項所述之載體基因體或如E45-E104中任一項所述之rAAV載體。 E106. 一種醫藥組合物，包含如E7-E12中任一項所述之經修飾核酸、如E13-E35中任一項所述之重組核酸、如E36-E44中任一項所述之載體基因體或如E45-E104中任一項所述之rAAV載體及醫藥學上可接受之載劑。 E107. 一種治療及/或預防與ASPA之缺陷或功能障礙相關之疾病、病症或病狀的方法，該方法包含向需要治療之受試者投與治療有效量的如E7-E12中任一項所述之經修飾核酸、如E13-E35中任一項所述之重組核酸、如E36-E44中任一項所述之載體基因體、如E45-E104中任一項所述之rAAV載體或如E105或E106所述之醫藥組合物。 E108. 如E107所述之方法，其中與ASPA之缺陷或功能障礙相關之該疾病、病症或病狀為康納丸氏病。 E109. 如E107或E108所述之方法，其中將該經修飾核酸、重組核酸、載體基因體、rAAV載體或醫藥組合物直接投與至需要治療之受試者之腦。 E110. 如E107-E109中任一項所述之方法，其中將該經修飾核酸、重組核酸、載體基因體、rAAV載體或醫藥組合物直接投與至需要治療之受試者之中樞神經系統。 E111. 如E107-E110中任一項所述之方法，其中將該經修飾核酸、重組核酸、載體基因體、rAAV載體或醫藥組合物投與至至少一個選自由以下組成之群的中樞神經系統之區域：腦實質、脊髓管、蜘蛛膜下腔、腦室、大池及其任何組合。 E112. 如E107-E111中任一項所述之方法，其中該經修飾核酸、重組核酸載體基因體、rAAV載體或醫藥組合物藉由至少一種選自由以下組成之群的方法來投與：腦實質內投與、鞘內投與、腦室內投與、大池內投與及其任何組合。 E113. 如E107-E112中任一項所述之方法，其中該受試者為人類患者。 E114. 如E107-E113中任一項所述之方法，其中該受試者為患有康納丸氏病或處於患上康納丸氏病之風險中之人類患者。 E115. 如E107-E114中任一項所述之方法，其中該受試者具有至少一個ASPA基因突變。 E116. 一種治療或預防康納丸氏病之方法，該方法包含以下步驟：i)評估受試者是否包含至少一個ASPA基因突變及ii)向該受試者投與治療有效量的如E7-E12中任一項所述之經修飾核酸、如E13-E35中任一項所述之重組核酸、如E36-E44中任一項所述之載體基因體、如E45-E104中任一項所述之rAAV載體或如E105或E106所述之醫藥組合物，由此治療或預防該受試者之康納丸氏病。 E117. 如E116所述之方法，其中該受試者經診斷患有康納丸氏病或經診斷為處於患上康納丸氏病之風險中。 E118. 一種治療或預防有需要之受試者的與ASPA缺陷相關之疾病的方法，包含向該受試者投與治療有效量的編碼ASPA之經修飾核酸，其中編碼ASPA之該經修飾核酸經密碼子最佳化。 E119. 如E118所述之方法，其中編碼ASPA之該經修飾核酸包含核酸序列SEQ ID NO:2。 E120. 如E118或E119所述之方法，其中編碼ASPA之該經修飾核酸編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO:4的ASPA蛋白。 E121. 如E118-E120中任一項所述之方法，其中編碼ASPA之該經修飾核酸在靶細胞中表現並且其中該靶細胞為寡樹突細胞。 E122. 如E118-E121中任一項所述之方法，其中編碼ASPA之該經修飾核酸在載體中遞送至該靶細胞。 E123. 如E122所述之方法，其中該載體為病毒載體或非病毒載體。 E124. 如E118-E123中任一項所述之方法，其中該載體藉由全身注射、直接顱內注射或直接脊髓管注射來投與至該受試者。 E125. 一種宿主細胞，包含如E7-E12中任一項所述之經修飾核酸、如E13-E35中任一項所述之重組核酸、如E36-E44中任一項所述之載體基因體或如E45-E104中任一項所述之rAAV載體。 E126. 如E125所述之宿主細胞，其中該細胞選自由以下組成之群：VERO、WI38、MRC5、A549、HEK293、B-50或任何其他HeLa細胞、HepG2、Saos-2、HuH7及HT1080。 E127. 如E125-E126所述之宿主細胞，其中該細胞為適於在懸浮培養物中生長的HEK293細胞。 E128. 如E125-E127中任一項所述之宿主細胞，其中該細胞為具有美國菌種保藏中心(ATCC)第PTA 13274號之HEK293細胞。 E129. 如E125-E128中任一項之所述宿主細胞，其中該細胞包含至少一種核酸，其編碼至少一種選自由以下組成之群的蛋白：AAV Rep蛋白、AAV殼體(Cap)蛋白、腺病毒早期區1A (E1a)蛋白、E1b蛋白、E2a蛋白、E4蛋白及病毒相關(VA) RNA。 E130. 一種治療康納丸氏病(CD)之套組，包含治療有效量的i)如E45-E104中任一項所述之rAAV載體或ii)如E105或E106所述之醫藥組合物。 E131. 如E130所述之套組，其中該套組進一步包含標籤或插頁，包括使用套組部件中之一或多者的說明書。 E132. 如E7-E12中任一項所述之經修飾核酸、如E13-E35中任一項所述之重組核酸、如E36-E44中任一項所述之載體基因體、如E45-E104中任一項所述之rAAV載體或如E105或E106所述之醫藥組合物，用於治療或預防與ASPA之缺陷或功能障礙相關之疾病、病症或病狀。 E133. 如E132所述之所用之經修飾核酸、重組核酸、載體基因體、rAAV載體或醫藥組合物，其中該疾病、病症或病狀為康納丸氏病。 E134. 如E7-E12中任一項所述之經修飾核酸、如E13-E35中任一項所述之重組核酸、如E36-E44中任一項所述之載體基因體、如E45-E104中任一項所述之rAAV載體或如E105或E106所述之醫藥組合物在製造用於治療及/或預防與ASPA之缺陷或功能障礙相關之疾病、病症或病狀之藥物中之用途。 E135. 如E134所述之用途，其中該疾病、病症或病狀為康納丸氏病。 E136. 一種確定藉由包含Olig001殼體之rAAV載體遞送至受試者之腦的轉基因之生物分佈的方法，其中由該轉基因編碼之蛋白經表現，該方法包含 a) 向該受試者投與該rAAV載體； b) 固定腦組織； c) 對腦進行電泳透明化； d) 對腦組織切片進行3D微觀成像； e) 偵測該蛋白； f) 視情況，定量存在於腦組織中之蛋白之量。 E137. 如E136所述之方法，其中該投與係藉由腦室內(ICV)注射、腦實質內(IP)注射、鞘內(IT)投與、大池內(ICM)注射或其組合進行。 E138. 如E136或137所述之方法，其中該腦組織使用例如多聚甲醛或福馬林來固定。 E139. 如E136-E138中任一項所述之方法，其中該定量包括立體渲染。 E140. 如E136-E139中任一項所述之方法，其中該轉基因編碼綠色螢光蛋白(GFP)。 E141. 如E136-E140中任一項所述之方法，其中組織中偵測到之轉基因表現之水準與rAAV載體轉導效率相關。 E142. 如E136-E141中任一項所述之方法，進一步包含(g)藉由評定細胞形態及GFP表現之空間位置確定來評估細胞型載體向性的步驟。 E143. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸，包含與核酸序列SEQ ID NO:1-3中任一者有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列及啟動子。 E144. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸，包含有包含序列SEQ ID NO:2或由其組成之核酸及啟動子。 E145. 一種核酸，包含編碼啟動子之核酸序列，並且進一步包含編碼ASPA之經修飾核酸序列，其中該經修飾核酸序列包含序列SEQ ID NO:2或由其組成。 E146. 一種經分離核酸，包含指定啟動子之核酸序列並且進一步包含有包含核酸序列SEQ ID NO:2或由其組成之核酸序列。 E147. 如E105所述之醫藥組合物，進一步包含350 mM NaCl及在PBS中之5% D-山梨醇。 E148. 如E106所述之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之載劑包含350 mM NaCl及在PBS中之5% D-山梨醇。
本發明之其他特徵及優點將自以下詳細描述、附圖、示範性實施例及申請專利範圍變得顯而易見。
定義
除非另外定義，否則本文使用之所有技術及科學術語具有與本發明之一般技術者通常所理解之含義。本文所用之術語係僅出於描述特定實施例之目的且不意欲限制本發明。除非上下文另外明確指示，否則如本發明之說明書及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一個」、「一種」及「該」意欲同樣包括複數形式。以下術語具有給出之含義：
如本文所用，術語「約」或「大約」係指可量測值諸如生物活性之量、多核苷酸或多肽序列之長度、G及C核苷酸之含量、密碼子適應指數、CpG二核苷酸之數目、劑量、時間、溫度及其類似值，並且除非另外說明，另外自上下文顯而易見或除了其中此數目超過可能值之100%以外，否則意欲包涵在任一方向上(大於或少於)指定量之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或甚至0.1%之變化。
如本文使用，術語「及/或」係指並且涵蓋相關列出項目中之一或多者之任何及所有可能組合，以及在以替代方式解釋時之缺少組合(「或」)。
如本文所用，術語「腺相關病毒」及/或「AAV」係指具有線性單股DNA基因體之小病毒及其變異體。該術語涵蓋所有亞型以及天然存在及重組形式兩者，除了在其他情形下需要以外。野生型基因體包含4681個堿基(Berns及Bohenzky (1987) Advances in Virus Research 32:243-307)並且包括各端處之末端重複序列(例如，反向末端重複(ITR))，該等序列順式充當DNA複製起點並且充當病毒之包裝訊息(packaging signal)。基因體包括兩個大開放閱讀框，分別被稱為AAV複製(「AAV rep」或「rep」)及殼體(「AAV cap」或「cap」)基因。AAV rep及cap亦可在本文中稱為AAV「包裝基因」。此等基因編碼涉及病毒基因體之複製及包裝的病毒蛋白。
在野生型AAV病毒中，三個殼體基因VP1、VP2及VP3在單一開放閱讀框內彼此重疊並且選擇性剪接導致產生VPI、VP2及VP3。(Grieger及Samulski (2005) J. Virol.79(15):9933-9944。)單一P40啟動子允許所有三種殼體蛋白以分別針對VP1、VP2、VP3以約1:1:10之比率表現，從而補充AAV殼體產生。更具體而言，VP1為全長蛋白，並且VP2及VP3由於N末端之截斷遞增而逐漸地縮短。熟知實例為如美國專利第7,906,111號描述之AAV9之殼體，其中VP1包含SEQ ID NO:123之胺基酸殘基1至736，VP2包含SEQ ID NO:123之胺基酸殘基138至736，並且VP3包含SEQ ID NO:123之胺基酸殘基203至736。如本文所用，術語「AAV Cap」或「cap」係指AAV殼體蛋白VP1、VP2及/或VP3，以及其變異體及類似物。
至少四種病毒蛋白自AAV rep基因合成，Rep 78、Rep 68、Rep 52及Rep 40，並且根據其表觀分子量來命名。如本文所用，「AAV rep」或「rep」意謂AAV複製蛋白Rep 78、Rep 68、Rep 52及/或Rep 40，以及其變異體及類似物。如本文所用，rep及cap係指野生型及重組(例如，經修飾嵌合及其類似者) rep及cap基因兩者以及其編碼的多肽。在一些實施例中，編碼rep之核酸包含來自多於一個AAV血清型之核苷酸。例如，編碼rep之核酸可包含來自AAV2血清型之核苷酸及來自AA3血清型之核苷酸(Rabinowitz等人(2002) J. Virology 76(2):791-801)。
如本文所用，術語「重組腺相關病毒載體」、「rAAV」及/或「rAAV載體」係指包含載體基因體之AAV，其中多核苷酸序列並非或並非完全來自AAV (例如，相對於AAV而言為異源之多核苷酸)，並且其中野生型AAV病毒基因體之rep及/或cap基因已自病毒基因體移除。當典型AAV之rep及/或cap基因已移除或不存在時(並且其中側接ITR通常來源於不同血清型之ITR，諸如但不限於AAV2 ITR，其中殼體不為AAV2)，AAV內之核酸，包括任何ITR及其之間的任何核酸，被稱為「載體基因體」。因此，術語rAAV載體涵蓋rAAV病毒顆粒，其包含殼體及異源核酸，亦即，最初不存在于天然狀態下之殼體中的核酸，並且以下稱為「載體基因體」。因此，「rAAV載體基因體」(或「載體基因體」)係指異源多核苷酸序列(包括至少一個ITR，通常但是不一定為不與存在於原始AAV中之原始核酸相關之ITR)，該異源多核苷酸序列可能但是不一定包含於AAV殼體內。rAAV載體基因體可為雙股(dsAAV)、單股(ssAAV)及/或自身互補的(scAAV)。
如本文所用，術語「rAAV載體」、「rAAV病毒顆粒」及/或「rAAV載體顆粒」係指以下AAV殼體，其包含至少一種AAV殼體蛋白(但是通常存在AAV之所有殼體蛋白，例如，VPI、VPS及VP3，或其變異體)並且含有載體基因體，該載體基因體包含最初不存在於原始AAV殼體中之異源核酸序列。此等術語與不為重組的「AAV病毒顆粒」或「AAV病毒」不同，其中殼體含有編碼rep及cap基因之病毒基因體並且若AAV病毒存在於亦包含輔助病毒諸如腺病毒及/或單純性疱疹病毒，及/或由其產生之必需輔助基因的細胞中，則其能夠複製。因此，產生rAAV載體顆粒必需包括使用重組DNA技術來產生重組載體基因體，因此，該載體基因體包含於殼體內以形成rAAV載體、rAAV病毒顆粒或rAAV載體顆粒。
在自然中及/或其突變體及變異體中均存在的AAV之各種血清型之基因體序列，以及反向末端重複序列(ITR)、rep蛋白及殼體亞單位之序列在此項技術中為已知的。此等序列可見於文獻或公用資料庫諸如GenBank中。參見例如GenBank登錄號NC-002077 (AAV-1)、AF063497 (AAV-1)、NC-001401 (AAV-2)、AF043303 (AAV-2)、NC-001729 (AAV-3)、NC_001863 (AAV-3B)、NC-001829 (AAV- 4)、U89790 (AAV-4)、NC-006152 (AAV-5)、AF513851 (AAV-7)、AF513852 (AAV-8)及NC-006261 (AAV-8)，其揭露以引用之方式併入本文。亦參見例如Srivistava等人(1983) J. Virology 45:555；Chiorini等人(1998) J. Virology 71:6823；Chiorini等人(1999) J. Virology 73: 1309；Bantel-Schaal等人(1999) J. Virology 73:939；Xiao等人(1999) J. Virology 73:3994；Muramatsu等人(1996) Virology 221:208；Shade等人(1986) J. Virol.58:921; Gao等人(2002) Proc.Nat. Acad.Sci.USA 99: 11854；Moris等人(2004) Virology 33:375-383；國際專利公開案WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；WO 2013/063379、WO 2014/194132、WO 2015/121501；及美國專利案第6,156,303號及第7,906,111號。
如本文所用，術語「改善」意謂受試者之疾病、病症或病狀、或其症狀、或潛在細胞反應之可偵測或可量測改良。可偵測或可量測改良包括在疾病、病症或病狀之發生、頻率、嚴重性、進展或持續時間、由其導致或與其相關之併發症、其症狀之改良或逆轉方面中的主觀或客觀減少、降低、抑制、壓抑、限制或控制。
如本文所用，術語「與…相關」係指當一者之存在、水準及/或形式與另一者之存在、水準及/或形式相關時的彼此關係。例如，若特定實體(例如，多肽、遺傳印記、代謝物、微生物等)之存在、水準及/或形式與疾病、病症或病狀之發生率及/或易感性相關(例如，在整個相關群體中)，則認為該特定實體與特定疾病、病症或病狀相關。在一些實施例中，若兩個或更多個實體直接或間接地相互作用，以使得其彼此物理接近及/或保持彼此物理接近，則其物理上彼此「締合」。在一些實施例中，物理上彼此締合之兩個或更多個實體彼此共價連接；在一些實施例中，物理上彼此締合之兩個或更多個實體不彼此共價連接而是非共價締合，例如，藉助於氫鍵、凡得瓦相互作用、疏水性相互作用、磁性及其組合。
如本文所用，術語「順式模體」或「順式元件」包含保守序列，諸如在基因體序列之末端處或附近存在並且公認用於起始複製的保守序列；在可能用於轉錄起始、剪接或終止的內部位置處之隱秘啟動子或序列。順式模體或順式元件與其相互作用之序列存在于相同核酸分子上。此與「反式模體」序列不同，該等序列與不位於相同核酸分子上之其他序列呈「反式」地起作用。
如本文所用，術語「編碼序列」或「編碼核酸」係指編碼蛋白或多肽的核酸序列並且表示在置於合適調控序列的控制下(可操作地連接)時在體外或在體內轉錄(在DNA的情況下)及轉譯(在mRNA的情況下)成多肽的序列。編碼序列之邊界通常藉由5' (胺基)末端處之起始密碼子及3' (羧基)末端處之轉譯終止密碼子來確定。編碼序列可包括但是不限於來自原核或真核mRNA之cDNA、來自原核或真核DNA之基因體DNA序列及甚至合成DNA序列。
如本文所用，術語「嵌合」係指病毒殼體，其殼體序列來自不同小病毒、較佳不同AAV血清型，如Rabinowitz等人, 美國專利第6,491,907號所描述，其揭露以全文引用之方式整體併入本文。亦參見Rabinowitz等人(2004) J. Virol.78(9):4421-4432。在一些實施例中，嵌合病毒殼體為AAV2.5殼體，其具有帶有以下突變的AAV2殼體之序列：263 Q至A；265插入T；705 N至A；708 V至A；及716 T至N。編碼此殼體之核苷酸序列定義為SEQ ID NO: 15，如WO 2006/066066所描述。其他較佳嵌合AAV殼體包括但不限於：描述於WO 2010/093784中之AAV2i8；描述於WO 2014/144229中之AAV2G9及AAV8G9；及AAV9.45 (Pulicherla等人(2011) Molecular Therapy 19(6):1070-1078)；描述於WO 2103/029030中之AAV-NP4、NP22、NP66、AAV-LK01至AAV-LK019；描述於WO 205/013313中之RHM4-1及RHM15-1至RHM5-6；描述於WO 2007/120542中之AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-DJ/9。
如本文所用，術語「保守取代」係指一個胺基酸由生物學、化學或結構上類似之殘基置換。生物學類似意謂取代不破壞生物活性。結構上類似意謂胺基酸具有長度類似之側鏈，諸如丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸，或具有類似大小。化學類似性意謂殘基具有相同電荷或兩者都為親水性或疏水性。具體實例包括：疏水性殘基，諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸，經另一殘基取代；或一個極性殘基取代另一殘基，諸如精胺酸取代離胺酸、麩胺酸取代天冬胺酸、麩醯胺酸取代天冬醯胺、絲胺酸取代蘇胺酸及其類似取代。保守取代之具體實例包括：疏水性殘基，諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸，取代另一殘基；極性殘基取代另一殘基，諸如精胺酸取代離胺酸、麩胺酸取代天冬胺酸或麩醯胺酸取代天冬醯胺及其類似取代。保守胺基酸取代通常包括例如以下組內之取代：甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。「保守取代」亦包含使用經取代之胺基酸來代替未經取代之母體胺基酸。
如本文所用，術語「側接」係指序列被其他元件側接並且指示相對於序列之上游及/或下游，亦即，5'及/或3'，存在一或多個側接元件。術語「側接」不意欲指示序列必需是連續的。例如，在編碼轉基因之核酸與側接元件之間可存在介入序列。序列(例如，轉基因)被兩個其他元件(例如，ITR)「側接」指示一個元件位於序列之5'並且另一者位於序列之3'；然而，在其之間可存在介入序列。
如本文所用，術語「片段」係指具有一定結構之材料或實體，該結構包含整體之離散部分但是缺少存在於整體中之一或多個部分。在一些實施例中，片段由離散部分組成。在一些實施例中，片段由存在於整體中之特徵結構元件或部分組成或包含該特徵結構元件或部分。在一些實施例中，聚合物片段包含存在於整個聚合物中之至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多個單體單元(例如，胺基酸殘基、核苷酸)，或由其組成。
如本文所用，術語「功能性(functional)」係指其表現出表徵之特性及/或活性形式之生物分子。生物分子可具有兩個功能(亦即，雙功能的)或許多功能(亦即，多功能的)。
如本文所用，術語「基因」係指含有至少一個能夠在轉錄及轉譯之後編碼特定多肽或蛋白的開放閱讀框之多核苷酸。「基因轉移」或「基因遞送」係指可靠地將外來DNA插入宿主細胞中之方法或系統。此等方法可導致非整合轉移DNA之瞬時表現、轉移複製子(例如游離基因體)之染色體外複製及表現及/或轉移遺傳物質向宿主細胞之基因體DNA中之整合。
如本文所用，術語「異源」或「外源」核酸係指出於載體介導的將核酸轉移/遞送至細胞中之目的，插入載體(例如，rAAV載體)中之核酸。異源核酸通常不同於載體(例如，AAV)核酸，亦即，相對于在天然狀態下之AAV中存在之病毒(例如，AAV)核酸而言，異源核酸為非天然的。一旦轉移(例如，轉導)或遞送至細胞中，包含在載體內之異源核酸可得以表現(例如，轉錄及轉譯，若合適)。或者，包含在載體內的轉移(轉導)或遞送至細胞中之異源核酸不一定表現。雖然術語「異源」在本文中不總是關於核酸來使用，但是即使在不存在修飾語「異源」的情況下，提到核酸亦意欲包括異源核酸。例如，異源核酸為編碼ASPA多肽之核酸，例如編碼用於治療康納丸氏病之ASPA的密碼子最佳化核酸。
如本文所用，術語「同源」或「同源性」係指在給定區域或部分上共享至少部分一致性的兩個或更多個參考實體(例如，核酸或多肽序列)。例如，當兩個肽中之胺基酸位置由相同胺基酸佔據時，肽在彼位置處為同源的。值得注意的是，同源肽保持與未修飾或參考肽相關之活性或功能，並且經修飾肽通常具有與未修飾序列之胺基酸序列「實質上同源」的胺基酸序列。當提及多肽、核酸或其片段時，「實質同源性」或「實質類似性」意謂當在適當插入或缺失的情況下與另一多肽、核酸(或其互補股)或其片段最佳比對時，在至少約95%至99%之序列中存在序列一致性。兩個序列之間的同源性(一致性)的程度可使用電腦程式或數學演算法來確定。計算序列同源性(或一致性)百分比之此等演算法通常考慮到在比較區域或範圍上之序列空隙及失配。示範性程式及演算法提供如下。
如本文所用，術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用並且係指引入外源核酸之細胞，並且包含此細胞之子代。宿主細胞包含「轉染體」、「轉型體」、「轉型細胞」及「轉導細胞」，包括原代轉染、轉型或轉導細胞，及由此衍生之子代，與繼代數目無關。在一些實施例中，宿主細胞為產生rAAV載體之包裝細胞。
如本文所用，術語「一致性」或「與…相同」係指聚合物分子之間，例如，核酸分子(例如，DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。在一些實施例中，若聚合物分子之序列為至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更大相同，則它們被認為彼此「實質上相同」。
兩個核酸或多肽序列之一致性百分比之計算例如可藉由出於最佳比較目的比對兩個序列來執行(例如，為了最佳比對，可將空隙引入第一及第二序列之一者或兩者中並且出於比較目的，可忽略不相同序列)。在某些實施例中，出於比較目的來比對之序列之長度為參考序列之長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。然後對對應位置處之核苷酸進行比較。當第一序列中之位置由與第二序列中對應位置相同的殘基(例如核苷酸或胺基酸)佔據時，則分子在彼位置處為相同的。兩個序列之間的一致性百分比隨序列共有的一致位置之數目而變化，考慮到了空隙之數目及各空隙之長度，需要引入該等空隙以達成兩個序列之最佳比對。序列之比較及兩個序列之間的一致性百分比之確定可使用數學演算法來完成。
為了確定一致性百分比或同源性，可使用在全球資訊網上在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/處可獲得之方法及電腦程式，包括BLAST來比對序列。另一比對演算法為FASTA，其可在來自Madison, Wis., USA之Genetics Computing Group (GCG)套件中獲得。用於比對之其他技術描述於Methods in Enzymology, 第266卷: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), Doolittle編, Academic Press, Inc。允許序列中之空隙的比對程式特別受到關注。Smith-Waterman係在序列比對中允許空隙的一種類型之演算法。參見Meth.Mol.Biol.70: 173-187 (1997)。同樣，使用Needleman及Wunsch比對方法之GAP程式可用於比對序列。參見J. Mol.Biol.48: 443-453 (1970)。
使用Smith和Waterman (1981, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489)之局部同源性演算法來確定序列一致性的BestFit程式亦受關注。空隙產生罰分的範圍通常為1至5，通常2至4並且在一些實施例中為3。空隙延伸罰分的範圍通常為約0.01至0.20並且在一些情況下為0.10。程式具有藉由輸入以供比較之序列來確定的預設參數。較佳地，序列一致性使用藉由程式確定之預設參數來確定。此程式亦可在來自Madison, WI, USA之Genetics Computing Group (GCG)套件獲得。
感興趣之另一程式為FastDB演算法。FastDB描述於Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, 第127-149頁, 1988, Alan R. Liss, Inc中。序列一致性百分比藉由FastDB基於以下參數來計算：失配罰分：1.00；空隙罰分：1.00；空隙大小罰分：0.33；及銜接罰分：30.0。
如本文所用，術語「增加」、「改善」或「減少」指示相對於基線量測結果的值，該基線量測結果例如在開始本文所述之治療之前在同一個體中之量測結果，或在不存在本文所述之治療的情況下在對照個體(或多個對照個體)中之量測結果。在一些實施例中，「對照個體」為患有與所治療個體相同形式之疾病或損傷的個體。
如本文所用，術語「反向末端重複」、「ITR」、「末端重複」及「TR」係指在AAV基因體末端處或附近之回文末端重複序列，主要包含互補、對稱佈置之序列。此等ITR可折疊以形成T形髮夾結構，該等結構在開始DNA複製期間充當引子。它們亦為病毒基因體整合至宿主基因體中；自宿主基因體拯救；以及將病毒核酸包入成熟病毒顆粒之殼體內所需的。載體基因體複製及其向病毒顆粒中包裝需要順式ITR。「5' ITR」係指AAV基因體之5'末端處及/或重組轉基因之5'之ITR。「3' ITR」係指AAV基因體之3'末端處及/或重組轉基因之3'之ITR。野生型ITR之長度大約為145 bp。經修飾或重組ITR可包含野生型AAV ITR序列之片段或部分。一般熟習此項技術者認識到在連續數輪的DNA複製期間，ITR序列可交換以使得5' ITR變成3' ITR，且反之亦然。在一些實施例中，至少一個ITR存在於重組載體基因體之5'及/或3'末端處，以使得載體基因體可包裝至殼體中以產生包含載體基因體之rAAV載體(在本文中亦稱為「rAAV載體顆粒」或「rAAV病毒顆粒」)。
如本文所用，術語「經分離」係指1)藉由人工來設計、生產、製備及或製造及/或2)與其在最初產生時(不論在天然狀態下及/或在實驗環境中)相關之組分中之至少一者分離的物質或組合物。總體上，經分離組合物實質上不含通常在天然狀態下與其締合之一或多種材料，例如，一或多種蛋白、核酸、脂質、碳水化合物及/或細胞膜。術語「經分離」不排除人造組合，例如，重組核酸、重組載體基因體(例如，rAAV載體基因體)、包裝載體基因體例如將載體基因體包入殼體內的rAAV載體顆粒(例如，但是不限於包含AAV/Olig001殼體之rAAV載體顆粒)及醫藥調配物。術語「經分離」亦不排除組合物之替代物理形式，諸如雜合體/嵌合體、多聚體/寡聚體、修飾(例如，磷酸化、醣基化、脂化)、變異體或衍生形式或者在人造的宿主細胞中表現之形式。
經分離物質或組合物可與約10%、約20%、約30%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或大於約99%的與其最初締合之其他組分分離。在一些實施例中，經分離劑為約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或大於約99%純。如本文所用，若物質實質上不含其他組分，則該物質為「純的」。在一些實施例中，如熟習此項技術者所理解，在與某些其他組分例如像一或多種載劑或賦形劑(例如，緩衝液、溶劑、水等)組合之後，物質可仍然被視為「經分離」或甚至「純的」；在此等實施例中，在不包括此等載劑或賦形劑的情況下計算物質之分離百分比或純度。
如本文所用，術語「核酸序列」、「核苷酸序列」及「多核苷酸」可互換地指由藉由磷酸二酯鍵聯所連接之單體核苷酸組成或包含該等單體核苷酸的任何分子。核酸可為寡核苷酸或多核苷酸。核酸序列在本文中以5'至3'方向之方向呈現。本揭露之核酸序列(亦即，多核苷酸)可為去氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子，並且係指核酸之所有形式，諸如雙股分子、單股分子、小或短髮夾RNA (shRNA)、微RNA、小或短干擾RNA (siRNA)、反式剪接RNA、反義RNA、信使RNA、轉移RNA、核糖體RNA。當多核苷酸為DNA分子時，該分子可為基因、cDNA、反義分子或任何前述分子之片段。核苷酸在本文中藉由單字母碼指示：腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌苷(I)及尿嘧啶(U)。核苷酸序列可經化學修飾或為人工的。核苷酸序列包括肽核酸(PNA)、嗎啉核酸(morpholinos)及鎖核酸(LNA)、以及二醇核酸(GNA)及蘇阿糖核酸(TNA)。此等序列中之各者與天然存在之DNA或RNA之區別在於分子之主鏈之變化。同樣，可使用硫代磷酸酯核苷酸。其他去氧核苷酸類似物包括可用於本揭露之核苷酸序列中之甲基膦酸酯、胺基磷酸酯、二硫代磷酸酯、N3'-P5'-胺基磷酸酯、及寡核糖核苷酸硫代磷酸酯及其2'-0-烯丙基類似物及2'-0-甲基核糖核苷酸甲基膦酸酯。
如本文所用，術語「核酸構建體」係指由使用重組DNA技術所產生之非天然存在之核酸分子(例如，重組核酸)。核酸構建體為單或雙股之核酸分子，其經修飾以含有以不存在於自然界中之方式來組合及佈置的核酸序列鏈段。核酸構建體可為「載體」(例如，質體、rAAV載體基因體、表現載體等)，亦即，經設計以將外源產生DNA遞送至宿主細胞中之核酸分子。
如本文所用，術語「可操作地連接」係指呈功能關係之核酸序列(或多肽)元件之鍵聯。當核酸與另一核酸序列呈某一功能關係時，其經可操作地連接。例如，若啟動子或其他轉錄調控序列(例如，強化子)影響編碼序列之轉錄，則其可操作地連接至編碼序列。在一些實施例中，可操作地連接意謂所連接之核酸序列為連續的。在一些實施例中，可操作地連接不意謂核酸序列為連續連接的，實情為介入序列在連接的核酸序列之間。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受」及「生理上可接受」係指適合於一或多個投與途徑、體內遞送或接觸的生物學上可接受之調配物，不論氣態、液態或固態，或其混合物。
如本文所用，術語「多肽」、「蛋白」、「肽」或「由核酸序列編碼」(亦即，由多核苷酸序列編碼、由核苷酸序列編碼)係指與天然存在之蛋白一樣的全長天然序列，以及功能性子序列、經修飾形式或序列變異體，只要子序列、經修飾形式或變異體保留天然全長蛋白之一定程度的功能性即可。在本揭露之方法及用途中，由核酸序列編碼之此等多肽、蛋白及肽可但是不一定與內源蛋白相同，該內源蛋白為有缺陷的，或其在用基因療法治療之受試者中之表現不充足或缺乏。
如本文所用，術語「預防(prevent/prevention)」係指特定疾病、病症或病狀(例如，康納丸氏病)之一或多個體征或症狀之發作延遲、及/或頻率及/或嚴重性降低。在一些實施例中，預防基於群體來評定，以使得若在易感疾病、病症或病狀之群體中觀察到疾病、病症或病狀之一或多個體征或症狀之發展、頻率及/或強度之統計上顯著降低，則認為劑「預防」特定疾病、病症或病狀。當疾病、病症或病狀之發作延遲一段預定義時間，則預防可被視為完成。
如本文所用，術語「重組」係指作為選殖、限制或連接步驟(例如與其中包含之多核苷酸或多肽有關)及/或產生不同于存在於自然界中之產物的構建體之其他程序的各種組合之產物的載體、多核苷酸(例如，重組核酸)、多肽或細胞。重組病毒或載體(例如，rAAV載體)包含有包含重組核酸之載體基因體(例如，包含轉基因及一或多個調控元件之核酸，例如，編碼ASPA及CBh啟動子之密碼子最佳化核酸)。該等術語分別包括原始多核苷酸構建體之複製物及原始病毒構建體之子代。
如本文所用，術語「受試者」係指生物體，例如，哺乳動物(例如，人類、非人類哺乳動物、非人類靈長類動物、靈長類動物、實驗動物、小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠、貓、犬)。在一些實施例中，受試者為nur7小鼠。在一些實施例中，人類受試者為成人、青少年或兒科受試者。在一些實施例中，受試者患有疾病、病症或病狀，例如，可如本文所提供來治療之疾病、病症或病狀。在一些實施例中，受試者患有與天冬胺酸醯化酶活性缺陷或功能障礙相關之疾病、病症或病狀，例如，康納丸氏病。在一些實施例中，受試者易感疾病、病症或病狀。在一些實施例中，易感受試者易患疾病、病症或病狀及/或展示患上疾病、病症或病狀之風險增加(如與在參考受試者或群體中觀察到之平均風險相比)。在一些實施例中，受試者顯示疾病、病症或病狀之一或多個症狀。在一些實施例中，受試者不顯示疾病、病症、或病狀之特定症狀(例如，疾病之臨床表現)或特徵。在一些實施例中，受試者不顯示疾病、病症、或病狀之任何症狀或特徵。在一些實施例中，受試者為人類患者。在一些實施例中，受試者為投與及/或已投與診斷及/或療法(例如，康納丸氏病之基因療法)的個體。在一些實施例中，受試者為患有康納丸氏病之人類患者。
如本文所用，術語「實質上」係指展現感興趣的特徵或性質之總或接近總範圍或程度的定性狀況。一般熟習此項技術者應理解，生物及化學現象很少(若有)達到完成及/或進行至完全或達成或避免絕對結果。因此，術語「實質上」在本文中用於包羅許多生物及化學現象中固有的潛在缺乏完全性。
如本文所用，術語「症狀減少」或「減少症狀」係指當特定疾病、病症或病狀之一或多個症狀在量值(例如，強度、嚴重性等)及/或頻率方面減少時。出於清楚目的，特定症狀之發作之延遲被視為降低該症狀之頻率之一形式。
如本文所用，術語「治療性多肽」為可減輕或減少靶細胞(例如，經分離細胞)或生物體(例如，受試者)中之蛋白之不存在或缺陷所導致的症狀之肽、多肽或蛋白(例如，酶、結構蛋白、跨膜蛋白、運輸蛋白)。藉由轉基因編碼之治療性多肽或蛋白為賦予受試者益處之多肽或蛋白，例如，校正基因缺陷、校正與表現或功能相關之基因之缺乏。類似地，「治療性轉基因」為編碼治療性多肽之轉基因。在一些實施例中，在宿主細胞中表現之治療性多肽為自轉基因(亦即，引入宿主細胞中之外源核酸)表現之酶。在一些實施例中，治療性多肽為自轉導至大腦皮質細胞(例如，寡樹突細胞)中之治療性轉基因所表現之ASPA蛋白。
如本文所用，術語「治療有效量」係指產生針對性投與之所需治療效果的量。在一些實施例中，該術語係指當根據治療給藥方案向罹患或易感疾病、病症或病狀之群體投與時，足以治療該疾病、病症或病狀的量。在一些實施例中，治療有效量為降低疾病、病症及/或病狀之一或多個症狀之發生率及/或嚴重性及/或延遲其發作的量。一般熟習此項技術者應理解，術語「治療有效量」實際上不需要在具體個體中達成成功的治療。相反，治療有效量可為當向需要此類治療的患者投與時，在大量受試者中提供具體所要藥理學反應的量。
如本文所用，術語「轉基因」用於意謂遞送至及/或表現於宿主細胞、靶細胞或生物體(例如，受試者)中之任何異源多核苷酸。此「轉基因」可使用載體(例如，rAAV載體)遞送至宿主細胞、靶細胞或生物體。轉基因可以可操作地連接至控制序列，諸如啟動子。熟習此項技術者應瞭解，表現控制序列可基於促進轉基因在宿主細胞、靶細胞或生物體中之表現之能力來選擇。總體上，轉基因可以可操作地連接至在天然狀態下與轉基因締合之內源啟動子，但是更通常，轉基因可操作地連接至在天然狀態下轉基因不與其締合之啟動子。轉基因之實例為編碼治療性多肽例如ASPA多肽之核酸，並且示範性啟動子為在天然狀態下不與編碼ASPA之核苷酸可操作地連接的啟動子。此非內源啟動子可包括CBh啟動子，以及在此項技術中已知之許多其他啟動子。
感興趣之核酸可藉由在此項技術中熟知之多種技術來引入宿主細胞中，包括轉染及轉導。
「轉染」通常被稱為在不使用病毒載體的情況下將外源核酸引入細胞中之技術。如本文所用，術語「轉染」係指在不使用病毒載體的情況下，將重組核酸(例如，表現質體)轉移至細胞(例如，宿主細胞)中。引入重組核酸之細胞被稱為「轉染細胞」。轉染細胞可為宿主細胞(例如，CHO細胞、Pro10細胞、HEK293細胞)，其包含用於產生重組AAV載體之表現質體/載體。在一些實施例中，轉染細胞(例如，包裝細胞)可包含有包含轉基因(例如，ASPA轉基因)之質體、包含AAV rep基因及AAV cap基因之質體及包含輔助基因之質體。許多轉染技術在此項技術中為已知的，包括但不限於電穿孔、磷酸鈣沉澱、顯微注射、陽離子或陰離子脂質體及脂質體與核定位訊號之組合。
如本文所用，術語「轉導」係指藉由病毒載體(例如，rAAV載體)將核酸(例如，載體基因體)轉移至細胞(例如，靶細胞，包括但不限於寡樹突細胞)。在一些實施例中，康納丸氏病之基因療法包括將包含編碼ASPA之經修飾核酸的載體基因體轉導至寡樹突細胞中。藉由病毒或病毒載體來引入轉基因的細胞被稱為「轉導細胞」。在一些實施例中，轉導細胞為經分離細胞並且轉導離體發生。在一些實施例中，轉導細胞為生物體(例如，受試者)內之細胞並且轉導在體內發生。轉導細胞可為生物體之靶細胞，其藉由重組AAV載體轉導，以使得生物體之靶細胞表現多核苷酸(例如，轉基因，例如，編碼ASPA之經修飾核酸)。
可轉導之細胞包括任何組織或器官類型或任何來源(例如，中胚層、外胚層或內胚層)之細胞。細胞之非限制性實例包括：肝臟細胞(例如，肝細胞、肝竇內皮細胞)、胰臟細胞(例如，β胰島細胞、外分泌)、肺細胞、中樞或周圍神經系統(例如腦(例如，神經或室管膜細胞、寡樹突細胞)或脊柱)細胞、腎臟細胞、眼睛(例如，視網膜)細胞、脾細胞、皮膚細胞、胸腺細胞、睾丸細胞、肺細胞、膈肌細胞、心臟(心)細胞、肌肉或腰肌細胞、或腸道(例如，內分泌)細胞、脂肪組織(白色、棕色或米色)細胞、肌肉細胞(例如，纖維母細胞、肌細胞)、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、內皮細胞、唾液腺細胞、內耳神經細胞或造血(例如，血液或淋巴)細胞。其他實例包括幹細胞，例如發育或分化為以下各者之多能或專能前驅細胞：肝臟細胞(例如，肝細胞、肝竇內皮細胞)、胰臟細胞(例如，β胰島細胞、外分泌)、肺細胞、中樞或周圍神經系統(例如腦(例如，神經或室管膜細胞、寡樹突細胞)或脊柱)細胞、腎臟細胞、眼睛(例如，視網膜)細胞、脾細胞、皮膚細胞、胸腺細胞、睾丸細胞、肺細胞、膈肌細胞、心臟(心)細胞、肌肉或腰肌細胞、或腸道(例如，內分泌)細胞、脂肪組織(白色、棕色或米色)細胞、肌肉細胞(例如，纖維母細胞、肌細胞)、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、內皮細胞、唾液腺細胞、內耳神經細胞或造血(例如，血液或淋巴)細胞。
在一些實施例中，存在於組織或器官(例如，腦部)之特定區域內之細胞可藉由投與至組織或器官之rAAV載體(例如，包含ASPA轉基因之rAAV)來轉導。在一些實施例中，腦細胞用包含ASPA轉基因之rAAV來轉導。在一些實施例中，腦部皮質之細胞用包含ASPA轉基因之rAAV來轉導。在一些實施例中，腦細胞用包含ASPA轉基因之rAAV來轉導。在一些實施例中，腦部之皮質下白質細胞用包含ASPA轉基因之rAAV來轉導。在一些實施例中，腦部之小腦之細胞用包含ASPA轉基因之rAAV來轉導。
如本文所用，術語「治療(treat/treating/treatment)」係指投與療法，該療法部分或完全緩解、改善、減輕、抑制特定疾病、病症及/或病狀之一或多個症狀、特徵及/或病因，延遲其發作，降低其嚴重性及/或降低其發生率。
如本文所用，術語「載體」係指可藉由插入或併入核酸(例如，重組核酸)來操作的質體、病毒(例如，rAAV)、粘粒或其他媒介物。載體可用於各種目的，包括例如基因操作(例如，選殖載體)、將核酸引入/轉移至細胞中、在細胞中轉錄或轉譯所插入之核酸。在一些實施例中，載體核酸序列至少含有用於在細胞中增鏈之複製起點。在一些實施例中，載體核酸包含異源核酸序列、表現控制元件(例如，啟動子、強化子)、可選擇標記物(例如，抗生素抗性)、聚腺苷(polyA)序列及/或ITR。在一些實施例中，在遞送至宿主細胞時，核酸序列經增鏈。在一些實施例中，當在體外或體內遞送至宿主細胞時，細胞表現由異源核酸序列編碼之多肽。在一些實施例中，在遞送至宿主細胞時，核酸序列或核酸序列之一部分包裝至殼體中。宿主細胞可為經分離細胞或宿主生物體內之細胞。除了編碼多肽或蛋白之核酸序列(例如，轉基因)以外，額外序列(例如，調控序列)可存在於同一載體中(亦即，與基因呈順式)並且側接該基因。在一些實施例中，調控序列可存在於單獨(例如，第二)載體中，該載體反式起作用來調控基因之表現。質體載體可在本文中稱為「表現載體」。
如本文所用，術語「載體基因體」係指包裝或包入殼體內以形成rAAV載體的重組核酸序列。通常，載體基因體包含異源多核苷酸序列，例如，轉基因、調控元件、最初不存在於殼體中之ITR。在重組質體用於構建或製造重組載體(例如，rAAV載體)的情況下，載體基因體不包括整個質體而是實情為僅包括意欲藉由病毒載體來遞送之序列。重組質體之此非載體基因體部分通常被稱為「質體主鏈」，其對於質體之選殖、選擇及擴增(重組病毒載體產生之增鏈所需要之過程)而言是至關重要的，但是其本身不包裝或包入rAAV載體之殼體內。
如本文所用，術語「病毒載體」通常係指病毒顆粒，其充當核酸遞送媒介物並且包含包裝於病毒顆粒(亦即，殼體)內之載體基因體(例如，包含轉基因代替編碼AAV rep及cap之核酸)，並且包含例如慢病毒及細小病毒，包括AAV血清型及變異體(例如，rAAV載體)。重組病毒載體不包含有包含rep及/或cap基因之載體基因體。
本揭露提供包含經修飾ASPA編碼序列之經修飾核酸，及其在基因療法醫藥組合物中之用途。如本文所用，「經修飾」意謂編碼在天然狀態下存在之多肽的核酸序列經改變，以使得在一個實施例中，與在其他方面相同的細胞中，來自未修飾(亦即，天然存在的(包括基因之突變體形式))核酸序列之蛋白表現水準相比，經修飾核酸序列驅動細胞中之更高水準的蛋白表現。本揭露亦提供重組核酸，包括載體基因體，其包括經修飾ASPA編碼序列作為其序列之一部分。此外，本揭露提供經包裝之基因遞送媒介物，諸如rAAV載體，其包含經修飾ASPA編碼序列。本揭露亦包含在細胞中遞送及較佳表現經修飾ASPA編碼序列之方法。本揭露亦提供將經修飾ASPA編碼序列例如作為載體之組分及/或包裝為病毒基因遞送媒介物(例如，rAAV載體)之組分來投與至受試者之基因治療方法。可例如實現治療以增加受試者中之ASPA水準並且治療受試者中之ASPA缺乏。本揭露之此等態樣中之各者在後續章節中進一步論述。AAV 及 rAAV 載體 AAV
如以上論述，術語「腺相關病毒」及/或「AAV」係指具有線性單股DNA基因體之小病毒及其變異體。該術語涵蓋所有亞型以及天然存在及重組形式兩者，除了在其他情形下需要以外。小病毒，包括AAV，可用作基因療法載體，因為其可穿透細胞並且將核酸(例如，轉基因)引入細胞核中。在一些實施例中，引入核酸(例如，rAAV載體基因體)形成圓形串聯體，其作為游離基因體在轉導細胞之細胞核中繼續存在。在一些實施例中，將轉基因插入宿主細胞基因體中之特定位點，例如人類染色體19上之位點處。與隨機整合相反，鹹信位點特異性整合可能產生可預測的長期表現譜。AAV在人類基因體中之插入位點被稱為AAVS1。一旦引入細胞，由核酸編碼之多肽可藉由細胞來表現。因為AAV不與人類之任何致病性疾病相關，所以藉由AAV遞送之核酸可用於表現用於治療人類受試者之疾病、病症及/或病狀的治療性多肽。
多種AAV血清型存在於自然界中，並且迄今為止，已鑑定了至少十五種來自人類的野生型血清型(亦即，AAV1-AAV15)。天然存在及變異體血清型藉由具有蛋白殼體來區分，該蛋白殼體在血清學上不同於其他AAV血清型。AAV 1型(AAV1)、AAV 2型(AAV2)、AAV 3型(AAV3)包括AAV 3A型(AAV3A)及AAV 3B型(AAV3B)、AAV 4型(AAV4)、AAV 5型(AAV5)、AAV 6型(AAV6)、AAV 7型(AAV7)、AAV 8型(AAV8)、AAV 9型(AAV9)、AAV 10型(AAV10)、AAV 12型(AAV12)、AAVrh10、AAVrh74 (參見WO 2016/210170)、鳥類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV及羊AAV以及重組生產變異體(例如，具有插入、缺失及取代等之殼體變異體)，諸如被稱為AAV 2i8型(AAV2i8)、NP4、NP22、NP66、DJ、DJ/8、DJ/9、LK3、RHM4-1之變異體以及許多其他變異體。「靈長類動物AAV」係指感染靈長類動物之AAV，「非靈長類動物AAV」係指感染非靈長類哺乳動物之AAV，「牛AAV」係指感染牛哺乳動物之AAV，依此類推。基於針對一種AAV之抗體相較於針對另一種AAV之抗體之間缺少交叉反應性來確定血清型特殊性。此等交叉反應性差異通常歸因於殼體蛋白序列及抗原決定子之差異(例如，歸因於AAV血清型之VP1、VP2、及/或VP3序列差異)。然而，一些天然存在之AAV或人造AAV突變體(例如，重組AAV)可不展現與任何當前已知血清型之血清學差異。然後，此等病毒可被視為對應類型之亞組，或簡稱為變異體AAV。因此，如本文所用，術語「血清型」係指血清學上不同的病毒，例如，AAV，以及不是在血清學上不同但是可在給定血清型之亞組或變異體內的病毒，例如，AAV。
已知AAV血清型之殼體之胺基酸序列之綜合清單及比對由Marsic等人(2014) Molecular Therapy 22(11):1900-1909，尤其在補充第1圖中提供。
AAV之各種血清型之基因體序列，以及天然末端重複(ITR)之序列、rep蛋白及殼體亞單位在此項技術中為已知的。此等序列可見於文獻或公用資料庫諸如GenBank中。參見例如GenBank登錄號NC_002077 (AAV1)、AF063497 (AAV1)、NC_001401 (AAV2)、AF043303 (AAV2)、NC_001729 (AAV3)、NC_001863 (AAV3B)、NC_001829 (AAV4)、U89790 (AAV4)、NC_006152 (AAV5)、NC_001862 (AAV6)、AF513851 (AAV7)、AF513852 (AAV8)及NC_006261 (AAV8)，其揭揭露以引用之方式併入本文。亦參見例如Srivistava等人(1983) J. Virology 45:555；Chiorini等人(1998) J. Virology 71:6823；Chiorini等人(1999) J. Virology 73: 1309；Bantel-Schaal等人(1999) J. Virology 73:939；Xiao等人(1999) J. Virology 73:3994；Muramatsu等人(1996) Virology 221:208；Shade等人(1986) J. Virol.58:921; Gao等人(2002) Proc.Nat. Acad.Sci.USA 99: 11854；Moris等人(2004) Virology 33:375-383；國際專利公開案WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；WO 2013/063379；WO 2014/194132；WO 2015/121501；及美國專利案第6,156,303號及美國專利案第7,906,111號。僅出於說明性目的，野生型AAV2包含AAV之較小(20-25 nm)二十面體病毒殼體，其由具有重疊序列之三種蛋白(VP1、VP2及VP3；總共60個殼體蛋白組成AAV殼體)組成。蛋白VP1 (735 aa；Genbank登錄號AAC03780)，VP2 (598 aa；Genbank登錄號AAC03778)及VP3 (533 aa；Genbank登錄號AAC03779)以1:1:10比率存在於殼體中。亦即，對於AAV而言，VP1為全長蛋白並且VP2及VP3為VP1之逐步縮短型式，並且相對於VP1，N末端之截斷增加。重組 AAV
如以上論述，「重組腺相關病毒」或「rAAV」與野生型AAV之區別在於內源病毒基因體之全部或一部分置換為非天然序列。將非天然序列併入病毒中將病毒載體定義為「重組」載體，且由此為「rAAV載體」。rAAV載體可包括編碼所需蛋白或多肽(例如，ASPA多肽)的異源多核苷酸。重組載體序列可包入或包裝至AAV殼體中並且被稱為「rAAV載體」、「rAAV載體顆粒」、「rAAV病毒顆粒」或簡稱為「rAAV」。
對於rAAV載體的產生，所需的VP1:VP2:VP3之比率在約1:1:1至約1:1:100的範圍內，較佳在約1:1:2至約1:1:50的範圍內，更佳在約1:1:5至約1:1:20的範圍內。雖然所需的VP1:VP2之比率為1:1，但是VP1:VP2之比率範圍可自1:50至50:1變化。
本揭露提供包含不來源於AAV之多核苷酸序列(例如，對於AAV而言為異源的多核苷酸)的rAAV載體。異源多核苷酸可側接至少一個，並且有時兩個AAV末端重複序列(例如，反向末端重複(ITR))。側接ITR來之異源多核苷酸，在本文中亦稱為「載體基因體」，通常編碼感興趣之多肽，或感興趣之基因(「GOI」)，諸如治療性治療之靶標(例如，編碼用於治療康納丸氏病之ASPA的核酸)。將rAAV載體遞送或投與至受試者(例如患者)向受試者提供編碼的蛋白及肽。因此，rAAV載體可用於轉移/遞送異源多核苷酸以供表現，以便例如治療各種疾病、病症及病狀。
rAAV載體基因體通常保持與置換病毒rep及cap基因之異源核酸序列呈順式的145個堿基ITR。對於產生重組AAV載體而言，此等ITR為必需的；然而，包括部分或完全合成序列之經修飾AAV ITR及非AAV末端重複序列亦可用於此目的。ITR形成髮夾結構並且在感染之後發揮作用來例如充當互補DNA股之宿主細胞介導之合成的引子。ITR亦在病毒包裝、整合等中起作用。ITR係AAV基因體複製及包裝至rAAV載體中所需要的唯一順式AAV病毒元件。rAAV載體基因體視情況包含兩個ITR，該等ITR通常在包含異源序列(例如，編碼感興趣之基因之轉基因或感興趣之核酸序列包括但不限於反義、及siRNA、CRISPR分子以及許多其他分子)之載體基因體之5'及3'末端。5'及3' ITR可均包含相同序列，或各自可包含不同序列。AAV ITR可來自任何AAV，包括但不限於血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11或任何其他AAV。
本揭露之rAAV載體可包含來自不同於殼體血清型(例如，AAV8、Olig001)之AAV血清型(例如，野生型AAV2、其片段或變異體)之ITR。包含來自一種血清型之至少一個ITR，但是包含來自不同血清型之殼體的此rAAV載體可被稱為雜合病毒載體(參見美國專利第7,172,893號)。AAV ITR可包括整個野生型ITR序列，或為其變異體、片段或修飾，但是保留功能性。
在一些實施例中，異源多肽包含ITR (例如，來自AAV2之ITR，但是可包含來自任何野生型AAV血清型之ITR，或其變異體)，其定位于載體基因體之左及右端(亦即，分別為5'及3'末端)。在一些實施例中，左(例如，5') ITR包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19或由其組成。在一些實施例中，左(例如，5') ITR包含與SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19有約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，右(例如，3') ITR包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19或由其組成。在一些實施例中，右(例如，3') ITR包含與SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19有約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。各ITR彼此或與載體基因體中之其他元件呈順式但是可藉由可變長度之核酸序列分開，諸如包含編碼ASPA之經修飾核酸及調控元件的重組核酸。在一些實施例中，ITR為AAV2 ITR或其變異體，並且側接ASPA轉基因。在一些實施例中，rAAV包含ASPA轉基因(例如，包含核酸序列SEQ ID NO:2)，其側接AAV2 ITR (例如，具有如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19中所示之序列的ITR)。
在一些實施例中，rAAV載體基因體為線性、單股的並且側接AAV ITR。在轉錄及轉譯異源基因之前，大約4700個核苷酸之單股DNA基因體必須藉由DNA聚合酶(例如，轉導細胞內之DNA聚合酶)使用自引發ITR中之一者的游離3'-OH來起始第二股合成，從而轉化成雙股形式。在一些實施例中，全長單股載體基因體(亦即，有義及反義)黏著以產生全長雙股載體基因體。此情況可在帶有相反極性之基因體(亦即，有義或反義)的多個rAAV載體同時轉導同一細胞時發生。不論其如何產生，一旦形成雙股載體基因體，細胞可轉錄並轉譯雙股DNA並且表現異源基因。
自rAAV載體之轉基因表現之效率可受到在表現之前將單股rAAV基因體(ssAAV)轉化成雙股DNA之需求的阻礙。此步驟藉由使用可包裝反向重複基因體之自身互補AAV基因體(scAAV)來規避，該反向重複基因體可在不需要DNA合成或多個載體基因體之間的堿基配對的情況下折疊成雙股DNA (McCarty，(2008)Molec.Therapy 16(10):1648-1656；McCarty等人, (2001) Gene Therapy 8:1248-1254；McCarty等人, (2003) Gene Therapy 10:2112-2118)。scAAV載體之限制係待包裝於殼體中之獨特轉基因、調控元件及IRT之大小為ssAAV載體基因體(亦即，約4,900個核苷酸，包括兩個ITR)之大小的約一半(亦即，約2,500個核苷酸，其中2,200個核苷酸可為轉基因及調控元件，加上約145個核苷酸ITR之兩個拷貝)。
藉由使用不包含末端分解位點(TRS)之核酸，或藉由改變來自包含載體基因體之載體(例如質體)之一個rAAV ITR的TRS，由此防止自彼末端起始複製，來製成scAAV載體基因體(參見美國專利第8,784,799號)。宿主細胞內之AAV複製起始于scAAV載體基因體之野生型ITR並且延續至缺少或包含改變末端解套(resolution)位點之ITR，然後橫穿基因體返回，從而產生互補股。因此，所得互補單一核酸分子為自身互補核酸分子，其產生在中間具有突變(未分解) ITR，並且在各末端處具有野生型ITR的載體基因體。在一些實施例中，缺少TRS或包含改變TRS之突變體ITR處於載體基因體之5'末端。在一些實施例中，缺少TRS或包含未解套(裂解)之改變TRS的突變體ITR處於載體基因體之3'末端。在一些實施例中，突變體ITR包含核酸SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19。
不希望受理論束縛，雖然scAAV基因體之兩個半部為互補的，但是在殼體內不可能存在實質性堿基配對，因為許多堿基與內部殼體之胺基酸殘基接觸並且磷酸主鏈朝向中心隔離(McCarty，Molec.Therapy (2008) 16(10):1648-1656)。可能在去殼時，scAAV基因體之兩個半部黏著以形成dsDNA髮夾分子，其中在一個末端具有共價閉合ITR並且在另一末端具有兩個開放式ITR。ITR側接尤其編碼轉基因之雙股區域及與其呈順式之調控元件。
rAAV載體之病毒殼體可來自野生型AAV或變異體AAV，諸如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAVrh74 (參見WO2016/210170)、AAV12、AAV2i8、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、RHM4-1 (WO 2015/013313之SEQ ID NO:5)、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV hu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9,45、AAV2i8、AAV29G、AAV2,8G9、AVV-LK03、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N、AAV鳥類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV、蛇AAV、山羊AAV、蝦AAV、羊AAV及其變異體(參見例如Fields等人, VIROLOGY，第2卷，第69章 (第4版，Lippincott-Raven Publishers)。殼體可來源於美國專利第7,906,111號；Gao等人(2004) J. Virol.78:6381；Morris等人(2004) Virol.33:375；WO 2013/063379；WO 2014/194132揭示之許多AAV血清型；並且包括在WO 2015/121501中揭示之真實型(true type) AAV (AAV-TT)變異體以及在WO 2015/013313中揭示之RHM4-1、RHM15-1至RHM15-6及其變異體。熟習此項技術者知道可能存在仍未鑑定的執行相同或類似功能的其他AAV變異體。AAV cap蛋白之完全補體包含VP1、VP2及VP3。包含編碼AAV VP殼體蛋白之核苷酸序列的ORF可包含少於完全補體AAV Cap蛋白或可提供AAV cap蛋白之完全補體。
在另一實施例中，本揭露提供祖性AAV載體用於治療性體內基因療法之用途。具體而言，電腦模擬來源之序列可從頭合成並且表徵其生物活性。除了組裝成rAAV載體以外，祖性序列之預測及合成可使用WO 2015/054653所描述之方法來完成，其內容以引用之方式併入本文。值得注意的是，如與同代病毒或其一部分相比，自祖性病毒序列組裝之rAAV載體可展現對於人類群體中之預先存在之免疫力的敏感性減少。
在一些實施例中，包含藉由衍生自多於一種AAV血清型(例如，野生型AAV血清型、變異體AAV血清型)之核苷酸序列編碼之殼體蛋白的rAAV載體被稱為「嵌合載體」或「嵌合殼體」(參見美國專利第6,491,907號，其全部揭露以引用之方式併入本文)。在一些實施例中，嵌合殼體蛋白藉由衍生自2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種AAV血清型之核酸序列編碼。在一些實施例中，重組AAV載體包含衍生自例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVrh74、AAVrh10、AAV2i8或其變異體之殼體序列，由此產生包含任何前述AAV血清型之胺基酸之組合的嵌合殼體蛋白(參見，Rabinowitz等人(2002) J. Virology 76(2):791-801)。替代地，嵌合殼體可包含來自一種血清型之VP1、來自不同血清型之VP2、來自仍不同血清型之VP3及其組合的混合物。例如嵌合病毒殼體可包括AAV1 cap蛋白或亞單位及至少一個AAV2 cap蛋白或亞單位。嵌合殼體可例如包括具有一或多個B19 cap亞單位之AAV殼體，例如，AAV cap蛋白或亞單位可由B19 cap蛋白或亞單位置換。例如，在一個實施例中，AAV殼體之VP3亞單位可由B19之VP2亞單位置換。在一些實施例中，嵌合殼體為如WO2014052789所描述之Olig001殼體並且其以引用之方式併入本文。
在一些實施例中，嵌合載體經工程改造以展現改變的向性或對於特定組織或細胞型之向性。術語「向性」係指病毒優先進入某些細胞或組織類型中及/或促進進入某些細胞或組織類型中的與細胞表面之優先相互作用。AAV向性通常藉由不同病毒殼體蛋白與其同源細胞受體之間的特定相互作用來確定(Lykken等人(2018) J. Neurodev.Disord.10:16)。較佳地，一旦病毒或病毒載體進入細胞，藉由載體基因體(例如，rAAV載體基因體)攜帶之序列(例如，異源序列諸如轉基因)經表現。
「向性概況」係指各種組織及/或器官中之一或多個靶細胞之轉導模式。例如，嵌合AAV殼體可具有特徵在於寡樹突細胞有效轉導且神經元、星形細胞及其他CNS細胞僅低轉導的向性概況。參見WO2014/052789，其以引用之方式併入本文。若當直接投與至CNS中時，優先轉導寡樹突細胞而不是神經元、星形細胞及其他CNS細胞型，則此嵌合殼體可被視為「對於寡樹突細胞具有特異性」，展現對於寡樹突細胞之向性，並且在本文中稱為「寡向性」。在一些實施例中，至少約80%藉由對於寡樹突細胞具有特異性之殼體轉導之細胞為寡樹突細胞，例如，至少約85%、90%、95%、96%、97%，98%、99%或更多轉導細胞為寡樹突細胞。
在一些實施例中，rAAV載體可用於治療或預防「與寡樹突細胞功能障礙相關之病症」。如本文所用，術語「與寡樹突細胞功能障礙相關」係指與在其他方面相同的正常寡樹突細胞相比，寡樹突細胞被破壞、損失或不正確地發揮作用的疾病、病症或病狀。該術語包含寡樹突細胞直接受影響之疾病、病症及病狀，以及繼發於其他細胞之破壞，寡樹突細胞變成功能障礙的疾病、病症或病狀。在一些實施例中，與寡樹突細胞功能障礙相關之病症為康納丸氏病(CD)。
在一些實施例中，具有對於寡樹突細胞之向性的嵌合AAV殼體為Olig001 (亦稱為BNP61)並且包含來自AAV1、AAV2、AAV6、AAV8及AAV9之序列(參見WO 2014/052789)。在一些實施例中，Oligo001殼體VP1藉由包含核酸序列SEQ ID NO:13或由其組成之核酸序列編碼。在一些實施例中，Olig001殼體VP1藉由與核酸序列SEQ ID NO:13有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的核酸序列編碼。
核酸序列編碼重疊AAV殼體蛋白VP1、VP2及VP3。Olig001殼體蛋白之胺基酸序列在SEQ ID NO:14中列出，其中VP1開始於SEQ ID NO:14之胺基酸殘基1(甲硫胺酸)，VP2開始於胺基酸殘基148(蘇胺酸)並且VP3開始於胺基酸殘基203(甲硫胺酸)。
在一些實施例中，具有對於寡樹突細胞之向性之嵌合AAV殼體為Olig002 (亦稱為BNP62)或Olig003 (亦稱為BNP63)(參見WO 2014/052789)。在一些實施例中，Oligo002殼體VP1包含胺基酸序列SEQ ID NO:15或由其組成。在一些實施例中，Olig002殼體VP1胺基酸序列與序列SEQ ID NO:15有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性。在一些實施例中，核酸包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO:15的序列。在一些實施例中，Oligo003殼體包含胺基酸序列SEQ ID NO:16或由其組成。在一些實施例中，Olig003殼體VP1胺基酸序列與SEQ ID NO:16有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性。在一些實施例中，核酸包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO:16的序列。
在一些實施例中，包含嵌合AAV殼體(例如，Olig001)及治療性轉基因之rAAV載體可用於治療與寡樹突細胞功能障礙相關之疾病、病症或病狀。在此疾病、病症或病狀中，寡樹突細胞被破壞、損失或不正確地發揮作用。此可為對於寡樹突細胞之直接效應之結果或為當繼發於其他細胞之破壞，寡樹突細胞變成功能障礙時的結果。在一些實施例中，包含AAV/Olig001殼體及經修飾ASPA核酸之rAAV載體用於治療康納丸氏病。重組核酸
本揭露之重組核酸包括經修飾核酸以及包含經修飾核酸之質體及載體基因體。重組核酸、質體或載體基因體可包含調節(例如，質體之)增鏈及/或控制經修飾核酸(例如，轉基因)之表現的調控序列。重組核酸亦可提供為病毒載體(例如，rAAV載體)之組分。總體上，病毒載體包括包含包裝於殼體中之重組核酸的載體基因體。經修飾核酸
經修飾基因、核酸或多核苷酸或其變異體形式(例如，轉基因)係指偏離參考序列之核酸。參考序列可為天然存在之野生型序列(例如，基因)並且可包括天然存在之變異體(例如，剪接變異體、替代閱讀框)。熟習此項技術者知道，參考序列可發現於可公開獲得資料庫諸如GenBank (ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中。如與參考序列相比，經修飾/變異體核酸可具有實質上相同、更大或較小的活性、功能或表現。較佳地，如本文中可互換使用之經修飾或變異體核酸展現蛋白表現改良，例如，與在其他方面相同的細胞中，藉由內源基因(例如，野生型基因、突變基因)提供之蛋白之表現水準相比，由此編碼之蛋白在細胞中以可偵測地更大水準表現。在一些實施例中，如本文中可互換使用之經修飾或變異體核酸(例如，編碼ASPA之經修飾核酸)展現蛋白表現改良，例如，與在其他方面相同的細胞中，藉由包含突變之內源基因提供之蛋白之表現水準相比，由此編碼之蛋白在細胞中以可偵測地更大水準表現。
核酸之修飾包括參考序列之一或多個核苷酸取代(例如，1-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-100或更多個核苷酸之取代)、添加(例如，1-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-100或更多個核苷酸之插入)、缺失(例如，1-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-100或更多個核苷酸之缺失，模體、域、片段等之缺失)。經修飾核酸可與參考序列有約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%約97%約98%或約99%一致性。
經修飾核酸可編碼與參考多肽有約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%或100%一致性的多肽。在一些實施例中，編碼ASPA之經修飾核酸(例如，SEQ ID NO:2)編碼與參考多肽(例如，SEQ ID NO:4)有100%一致性的多肽。
在一些實施例中，經修飾核酸(例如，轉基因)編碼野生型蛋白。此經修飾核酸可為密碼子最佳化的。如在本文中可互換提及之「最佳化」或「密碼子最佳化」係指編碼序列相對於野生型編碼序列或參考序列(例如，ASPA多肽之編碼序列)經最佳化以增加多肽之表現，例如藉由最少化稀有密碼子之使用、減少CpG二核苷酸之數目、移除隱秘接合供體或受體位點、移除Kozak序列、移除核糖體進入位點及其類似方法進行。在一些實施例中，與在其他方面相同的細胞中，來自野生型基因之蛋白之表現水準相比，來自密碼子最佳化序列(例如，編碼ASPA之經修飾核酸)之蛋白之表現水準增加。在一些實施例中，與在其他方面相同的細胞中，來自野生型基因之蛋白表現水準相比，來自密碼子最佳化序列(例如，編碼ASPA之經修飾核酸)之蛋白之表現水準不增加(例如，表現實質上類似)。在一些實施例中，與在其他方面相同的細胞中自突變基因之蛋白之表現水準相比，自密碼子最佳化序列(例如，編碼ASPA之經修飾核酸)之蛋白之表現水準增加。
修飾之實例包括消除一或多個順式作用模體及引入一或多個Kozak序列。在一些實施例中，消除一或多個順式作用模體並且引入一或多個Kozak序列。
可消除之順式作用模體之實例包括內部TATA盒；chi位點；核糖體進入位點；ARE、INS及/或CRS序列元件；重複序列及/或RNA二級結構；(隱秘)接合供體及/或受體位點、分支點；及限制位點。
在一些實施例中，經修飾核酸編碼經修飾或變異體多肽。藉由經修飾核酸編碼之經修飾多肽可保留藉由野生型編碼或參考序列編碼之多肽之功能或活性的全部或一部分。在一些實施例中，經修飾多肽具有一或多個非保守或保守胺基酸變化。在一些實施例中，已證明在多肽之功能中發揮有限作用或沒有作用的某些域不存在於經修飾多肽(例如，某些結合域)中(例如，WO 2016/097219)。存在於rAAV載體中之經修飾核酸可歸因於rAAV殼體之包裝能力而包含比野生型編碼或參考序列更少的核苷酸(例如，縮短的微小肌營養不良蛋白轉基因，參見WO 2001/83695；B-域缺失人類因子VIII轉基因，參見WO 2017/074526)，並且亦包括截斷且密碼子最佳化的縮短轉基因(例如，WO 2017/221145所描述之密碼子最佳化微小肌營養不良蛋白轉基因)。在一些實施例中，與藉由參考序列編碼之多肽之功能或活性相比，藉由經修飾核酸編碼之多肽具有更少、相同或更大的功能或活性，但是至少具有一部分。
相對於參考及/或野生型序列(例如，野生型ASPA編碼序列)，經修飾核酸可具有改變之GC含量(例如，存在於核酸序列中之G及C核苷酸之數目)、改變(例如，增加或減少)之CpG二核苷酸含量及/或改變(例如，增加或減少)之密碼子適應指數(CAI)。參見，例如，WO 2017/077451 (論述在此項技術中熟知的對於感興趣之核酸序列之密碼子最佳化的各種考慮因素，包括分析核酸序列以供最佳化的可公開獲得軟體)。如本文所用，改變係指特定值、量或效應之減少或增加。
在一些實施例中，本揭露之經修飾核酸序列之GC含量相對於參考及/或野生型基因或編碼序列增加。經修飾核酸之GC含量比野生型編碼序列(例如，SEQ ID NO:3)之GC含量大至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少12%、至少14%、至少15%、至少17%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%。在一些實施例中，GC含量表示為序列中之G (鳥嘌呤)及C (胞嘧啶)核苷酸之百分比。
在一些實施例中，本揭露之經修飾核酸序列之密碼子適應指數為至少0.74、至少0.76、至少0.77、至少0.80、至少0.85、至少0.86、至少0.87、至少0.90、至少0.95或至少0.98。
在一些實施例中，與野生型或參考核酸序列相比，本揭露之經修飾核酸序列之CpG二核苷酸之水準降低，降低約10%、20%、30%、50%或更多。在一些實施例中，經修飾核酸比參考序列(例如，野生型序列)少1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-45或45-50或更多個二核苷酸。
已知CpG二核苷酸之甲基化在真核生物中之基因表現之調控中發揮重要作用。具體而言，真核生物中之CpG二核苷酸之甲基化基本上用來經由干擾轉錄機制來使基因表現緘默。因此，由於藉由CpG模體之甲基化來誘發之基因緘默，CpG二核苷酸之數目減少的核酸及載體提供更高且更持久的轉基因表現水準。
經修飾核酸序列可包括側接限制位點以促進次向表現載體中之選殖。許多此等限制位點在此項技術中為熟知的，並且包括但不限於第 13 圖 示出的限制位點，諸如AvaI、XmaI及XmaI。
本揭露包含SEQ ID NO:1-3中示出之序列中任一者之片段並且其編碼ASPA多肽之功能活性片段。「功能活性」或「功能性ASPA多肽」指示片段提供與全長ASPA多肽相同或類似生物功能及/或活性。亦即，片段提供相同活性，包括但不限於將NAA轉換成乙酸鹽及天冬胺酸鹽之能力。ASPA或其功能片段之生物活性亦涵蓋如在本文中別處所示並且在nur7小鼠中的逆轉或預防與康納丸氏病相關之神經退化性表型。
本揭露提供經修飾ASPA核酸序列，其編碼ASPA多肽並且與野生型核酸序列(例如SEQ ID NO:3；GenBank登錄號NM_000049.4或NM_001128085.1，其具有替代5'UTR但是編碼相同ASPA蛋白(SEQ ID NO:4))相比，包含至少一個修飾。
在一些實施例中，編碼ASPA之經修飾核酸為編碼野生型ASPA多肽(例如，SEQ ID NO:4)之密碼子最佳化核酸並且包含序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。在一些實施例中，編碼ASPA之經修飾核酸為密碼子最佳化核酸並且由序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2組成。在一些實施例中，編碼ASPA之經修飾核酸為密碼子最佳化核酸並且包含與序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%一致性的序列。
在一些實施例中，包含編碼ASPA之經修飾核酸之細胞展現蛋白表現增加，例如，與包含野生型ASPA核酸之在其他方面相同的細胞或包含編碼ASPA之突變體核酸之在其他方面相同的細胞中蛋白之表現水準相比，由此編碼之蛋白在細胞中以可偵測地更大水準表現。在一些實施例中，與包含野生型ASPA核酸之在其他方面相同的細胞中之ASPA蛋白表現水準相比，包含編碼ASPA之經修飾核酸(例如，包含核酸序列SEQ ID NO:2)之細胞中的ASPA蛋白表現水準增加約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約120%、約140%、約150%、約200%、約300%、約400%或更多。在一些實施例中，與包含編碼ASPA之突變體核酸之在其他方面相同的細胞中之ASPA蛋白表現水準相比，包含編碼ASPA之經修飾核酸(例如，包含核酸序列SEQ ID NO:2)之細胞中的ASPA蛋白表現水準增加約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約120%、約140%、約150%、約200%、約300%、約400%或更多。
在一些實施例中，此可被稱為「表現最佳化」或「表現增強」核酸，或簡稱為「經修飾核酸」。
一般熟習此項技術者應理解，藉由本揭露之經修飾核酸及其變異體(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)編碼之多肽為「功能性ASPA多肽」，其提供與藉由編碼ASPA之野生型核酸(例如，SEQ ID NO:3)編碼之ASPA多肽相同或類似的生物功能及/或活性。亦即，藉由編碼ASPA之經修飾核酸編碼之ASPA多肽提供相同活性，包括但不限於將NAA轉換成乙酸鹽及天冬胺酸鹽之能力。ASPA之生物活性涵蓋如在本文中別處展示的在nur7小鼠中逆轉或預防與康納丸氏病相關之神經退化性表型，包括但不限於滾輪掉落等待時間(rotarod latency to fall)之表現改良、開放空間通過距離改良、腦組織中之NAA減少、腦部(例如，丘腦、小腦白質/橋腦)中之液泡體積減少、腦部(例如，丘腦、皮質)中之Olig2陽性細胞增加及/或皮質髓鞘形成增加。 調控元件
本揭露包含一種重組核酸，其包括編碼ASPA之經修飾核酸及各種調控或控制元件。通常，調控元件為影響可操作地連接之多核苷酸之表現的核酸序列。不同生物體以及不同細胞型的可用于基因表現之調控元件之確切性質有所不同，包括例如啟動子、強化子、內含子等，目的在於促進正確的異源多核苷酸轉錄及轉譯。調節控制可轉錄、轉譯、剪接、訊息穩定性等水準下實現。通常，調節轉錄之調節控制元件並列於轉錄多核苷酸之5'末端附近(亦即，上游)。調控控制元件亦可位於轉錄序列之3'末端(亦即，下游)或在轉錄物內(例如，在內含子中)。調控控制元件可位於遠離轉錄序列之距離處(例如，1至100、100至500、500至1000、1000至5000、5000至10,000或更多個核苷酸)。然而，歸因於AAV載體基因體之長度，調控控制元件通常在自多核苷酸之1至1000個核苷酸內。 啟動子
如本文所用，術語「啟動子」諸如「真核啟動子」係指在真核細胞(例如，寡樹突細胞)中起始特定基因或一或多個編碼序列(例如，ASPA編碼序列)之轉錄的核苷酸序列。啟動子可與其他調控元件或區域一起運作以引導基因或編碼序列之轉錄水準。此等調控元件包括例如轉錄結合位點、抑制及活化蛋白結合位點及已知直接或間接地起作用以調控自啟動子轉錄量之其他核苷酸序列，包括例如衰減子、強化子及沉默子。啟動子最經常位於相同股上並且接近轉錄開始位點、其可操作地連接之基因或編碼序列之5'。啟動子之長度通常為100–1000個核苷酸。相對于不存在啟動子時相同基因之表現，啟動子通常使基因表現增加。
如本文所用，「核心啟動子」或「最小啟動子」係指正確地啟始轉錄所需要之啟動子序列之最小部分。其可包括以下中之任一者：轉錄開始位點、RNA聚合酶之結合位點及一般轉錄因子結合位點。啟動子亦可包含含有其他主要調控元件(例如，強化子、沉默子、邊界元件、絕緣子)之近端啟動子序列(核心啟動子之5')以及遠端啟動子序列(核心啟動子之3')。
合適啟動子之實例包括：腺病毒啟動子，例如腺病毒主要晚期啟動子；異源啟動子，例如巨細胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞病毒啟動子；勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子；白蛋白啟動子；誘導型啟動子，例如小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子；金屬硫蛋白啟動子；熱激啟動子；α-1-抗胰蛋白酶啟動子；B型肝炎表面抗原啟動子；轉鐵蛋白啟動子；載脂蛋白A-1啟動子；雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子，延伸因子1a啟動子(EF1a)，CBA啟動子之雜交形式(CBh啟動子)和CAG啟動子(巨細胞病毒早期強化子及啟動子、雞β-肌動蛋白基因之第一外顯子及第一內含子及兔β-珠蛋白基因之剪接受體)(Alexopoulou等人(2008) BioMed.Central Cell Biol.9:2)；及人類ASPA基因啟動子。在一些實施例中，啟動子為CBh啟動子之片段或變異體並且包含核酸序列SEQ ID NO:7或由其組成。
在本揭露之一些實施例中，真核啟動子序列(例如，CBh啟動子)可操作地連接至編碼ASPA之經修飾核酸。在一些實施例中，包含核酸序列SEQ ID NO:7的啟動子(例如，CBh啟動子)可操作地連接至編碼ASPA之經修飾核酸。在一些實施例中，包含與核酸序列SEQ ID NO:7有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性的核酸序列或由其組成之啟動子可操作地連接至包含核酸序列SEQ ID NO:2的核酸。在一些實施例中，包含與核酸序列SEQ ID NO:7有至少95%一致性的核酸序列的啟動子可操作地連接至與核酸序列SEQ ID NO:2有至少95%一致性的核酸序列並且在寡樹突細胞中誘導由核酸序列SEQ ID NO:2編碼之多肽之表現。在一些實施例中，與在其他方面相同的細胞中，由不可操作地連接至包含核酸SEQ ID NO:7之啟動子的包含核酸序列SEQ ID NO:2的核酸編碼之多肽之表現水準相比，由可操作地連接至包含有包含SEQ ID NO:7之核酸之啟動子的包含核酸序列SEQ ID NO:2的核酸編碼之多肽在細胞中之表現水準可偵測地更大。在一些實施例中，重組核酸包含有包含與核酸序列SEQ ID NO:7有至少95%一致性的核酸序列的啟動子可操作地連接至與核酸序列SEQ ID NO:2有至少95%一致性的核酸序列並且在寡樹突細胞中誘導由核酸序列SEQ ID NO:2編碼之多肽之表現。
啟動子可為組成性、組織特異性或經調控的。組成性啟動子係導致可操作地連接基因基本上在所有時候都表現的啟動子。在一些實施例中，在大多數生理及發育條件下，組成性啟動子在大多數真核組織中起作用。
經調控啟動子係可活化或失活之啟動子。經調控啟動子包括通常「關閉」但是可誘導以「開啟」的可誘導啟動子及通常「開啟」但是可「關閉」的「可抑制」啟動子。許多不同調控因子為已知的，包括溫度、激素、細胞介素、重金屬及調控蛋白。區別並非絕對的；組成性啟動子可經常在某種程度上得到調控。在一些情況下，內源途徑可用于提供轉基因表現之調控，例如，使用在病理狀況改良時自然地下調之啟動子。
組織特異性啟動子係僅在特定類型的組織、細胞或器官中起作用之啟動子。通常，組織特異性啟動子藉由對於特定組織、細胞及/或器官具有特異性之轉錄活化元件來識別。例如，與在其他組織中相比，組織特異性啟動子可在一或多個特定組織(例如，兩個、三個或四個)中更具活性。在一些實施例中，與在其他組織中相比，藉由組織特異性啟動子調節之基因之表現在啟動子對其具有特異性之組織中高得多。在一些實施例中，在除了啟動子對其具有特異性之組織以外的任何組織中，可能存在啟動子之活性極少或實質上沒有活性。啟動子可為組織特異性啟動子，諸如小鼠白蛋白啟動子或甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)，其在肝臟細胞中起作用。組織特異性啟動子之其他實例包括來自編碼骨骼α-肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈2A、肌營養不良蛋白、肌肉肌酸激酶之基因的啟動子，其誘導骨骼肌中之表現(Li等人(1999) Nat. Biotech.17:241-245)。肝臟特異性表現可使用來自白蛋白基因之啟動子(Miyatake等人(1997) J. Virol. 71:5124-5132)、B型肝炎病毒核心啟動子(Sandig，等人(1996) Gene Ther. 3:1002-1009)及α-胎蛋白(Arbuthnot等人，(1996) Hum. Gene. Ther. 7:1503-1514)來誘導。 強化子
在另一態樣中，編碼治療性多肽之經修飾核酸進一步包含增加治療性多肽(例如，ASPA蛋白)之表現的強化子。通常，強化子元件位於啟動子元件之上游但是亦可位於下游或在另一個序列(例如，轉基因)內。強化子可位於經修飾核酸之上游或下游100個核苷酸、200個核苷酸、300個核苷酸或更多。強化子通常增加經修飾核酸(例如，編碼治療性多肽，例如，編碼ASPA)之表現，超過藉由單獨啟動子元件提供之增加之表現。
許多強化子在此項技術中為已知的，包括但不限於巨細胞病毒主要即刻早期強化子。更具體而言，巨細胞病毒(CMV) MIE啟動子包含三個區域：調節子、獨特區域及強化子(Isomura及Stinski (2003) J. Virol.77(6):3602-3614)。CMV強化子區域可與另一個啟動子或其一部分組合，以形成雜交啟動子，從而進一步增加與其可操作地連接之核酸之表現。例如，雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子或其一部分可與CMV啟動子/強化子或其一部分組合，產生被稱為「CBh」啟動子之CBA型式，其代表雞β-肌動蛋白雜交啟動子，如Gray等人(2011, Human Gene Therapy 22:1143-1153)所描述。與啟動子一樣，強化子可為組成性、組織特異性或經調控的。
在本揭露之一些實施例中，強化子序列(例如，CMV強化子)可操作地連接至編碼ASPA之經修飾核酸。在一些實施例中，包含核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17或其組成之強化子(例如，CMV強化子)可操作地連接至編碼ASPA之經修飾核酸。在一些實施例中，包含與核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性的核酸序列之強化子可操作地連接至包含核酸序列SEQ ID NO:2的核酸，並且視情況可操作地連接至包含核酸序列SEQ ID NO:7的啟動子。在一些實施例中，包含與核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17有至少95%一致性的核酸序列的強化子可操作地連接至與核酸序列SEQ ID NO:2有至少95%一致性的核酸序列並且在寡樹突細胞中誘導由核酸序列SEQ ID NO:2編碼之多肽之表現。在一些實施例中，包含與核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17有至少95%一致性的核酸序列的強化子可操作地連接至與核酸序列SEQ ID NO:7有至少95%一致性的核酸序列，並且可操作地連接至與核酸序列SEQ ID NO:2有至少95%一致性的核酸序列，並且SEQ ID NO:6 (或SEQ ID NO:17)及核酸序列SEQ ID NO:7一起在寡樹突細胞中誘導由核酸序列SEQ ID NO:2編碼之多肽之表現。在一些實施例中，與在其他方面相同的細胞中，由不可操作地連接至包含核酸SEQ ID NO:5之強化子的SEQ ID NO:2編碼之多肽之表現水準相比，由可操作地連接至包含核酸序列SEQ ID NO:6 (或SEQ ID NO:17)之強化子的核酸序列SEQ ID NO:2編碼之多肽在細胞中之表現水準可偵測地更大。在一些實施例中，重組核酸包含有包含與核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17有至少95%一致性的核酸序列的強化子，其可操作地連接至與核酸序列SEQ ID NO:7有至少95%一致性的核酸序列，並且可操作地連接至與核酸序列SEQ ID NO:2有至少95%一致性的核酸序列，並且核酸序列SEQ ID NO:6 (或SEQ ID NO:17)及SEQ ID NO:7一起在寡樹突細胞中誘導由核酸序列SEQ ID NO:2編碼之多肽之表現。 填充區、間隔區及充填區
如本文所揭示，意欲用於rAAV載體中之重組核酸可包括額外核酸元件以便將核酸之長度調整至接近將AAV包裝至rAAV載體中可接受之病毒基因體序列之正常大小(例如，大約4.7至4.9千堿基)或該正常大小(Grieger及Samulski(2005) J. Virol.79(15):9933-9944)。此序列可互換地被稱為填充區、間隔區或充填區。在一些實施例中，填充區DNA為核酸之未轉譯(非蛋白編碼)鏈段。在一些實施例中，填充區或充填區多核苷酸序列之長度在約1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90-90-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1000、1000-1500、1500-2000、2000-3000之間或更長。
AAV載體通常接受具有大小在約4 kb至約5.2 kb或約4.1至4.9 kb之範圍內的DNA插入以便將核酸最佳包裝至AAV殼體中。在一些實施例中，rAAV載體包含總長度在約3.0 kb至約3.5 kb、約3.5 kb至約4.0 kb、約4.0 kb至約4.5 kb、約4.5 kb至約5.0 kb或約5.0 kb至約5.2 kb之間的載體基因體。在一些實施例中，rAAV載體包含總長度為約4.7 kb的載體基因體。在一些實施例中，rAAV載體包含自身互補的載體基因體。雖然rAAV載體中之自身互補(sc)載體基因體之總長度等於單股(ss)載體基因體(亦即，約4 kb至約5.2 kb)，但是編碼sc載體基因體之核酸序列(亦即，包含轉基因、調控元件及ITR)必須僅為編碼ss載體基因體之核酸序列的一半長度，以便將sc載體基因體包裝在殼體中。 內含子及外顯子
在一些實施例中，重組核酸包含例如內含子、外顯子及/或其一部分。內含子可充當填充區或充填區多核苷酸序列以便達成將載體基因體包裝至rAAV載體中之合適長度。與在不存在內含子及/或外顯子元件時之表現相比，內含子及/或外顯子序列亦可增強多肽(例如，轉基因)之表現(Kurachi等人(1995) J. Biol.Chem.270 (10):576-5281; WO 2017/074526)。此外，填充區/充填區多核苷酸序列(亦被稱為「絕緣子」)在此項技術中為熟知的並且包括但不限於WO 2014/144486及WO 2017/074526所描述之多核苷酸序列。
內含子元件可衍生自與異源多核苷酸相同的基因，或衍生自完全不同基因或其他DNA序列(例如，雞β-肌動蛋白基因、小鼠微小病毒(MVM))。在一些實施例中，重組核酸包含選自衍生自非同源基因(亦即，非衍生自經修飾核酸，例如，轉基因)之內含子及外顯子的至少一個元件。在一些實施例中，內含子衍生自雞β-肌動蛋白基因，例如包含核酸序列SEQ ID NO:9或由其組成。在一些實施例中，內含子包含與核酸序列SEQ ID NO:9有約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，內含子衍生自MVM，例如包含核酸序列SEQ ID NO:10或由其組成。在一些實施例中，內含子包含與核酸序列SEQ ID NO:10有約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，外顯子衍生自雞β-肌動蛋白基因，例如包含核酸序列SEQ ID NO:8或由其組成。在一些實施例中，外顯子包含與核酸序列SEQ ID NO:8有約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，重組核酸包含強化子序列(例如，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17)、啟動子序列(例如，SEQ ID NO:7)、外顯子(例如，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18)及內含子(例如，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10)中之至少一者並且調節視情況由核酸序列SEQ ID NO:2編碼之異源多肽的表現。在一些實施例中，與在其他方面相同的細胞中，由不可操作地連接至此等調控元件的核酸序列SEQ ID NO:2編碼之多肽之表現水準相比，由可操作地連接至包含以下中至少一者之調控區域的核酸序列SEQ ID NO:2編碼之多肽在細胞中之表現水準可偵測地更大：強化子序列(例如，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17)、啟動子序列(例如，SEQ ID NO:7)、外顯子(例如，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18)及內含子(例如，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10)。
在一些實施例中，重組核酸包含經修飾核酸SEQ ID NO:2，其可操作地連接至包含以下中至少一者之調控元件：強化子序列(例如，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17)、啟動子序列(例如，SEQ ID NO:7)、外顯子(例如，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18)及內含子(例如，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10)。 多腺苷酸化訊息序列 (polyA)
另外的調控元件可包括停止密碼子、終止序列及多腺苷酸化(polyA)訊息序列，諸如但不限於牛生長激素polyA訊息序列(BHG polyA)。polyA訊息序列驅動在真核mRNA之3'末端處有效添加聚腺苷「尾」，其引導終止基因轉錄(參見，例如，Goodwin及Rottman J. Biol.Chem.(1992) 267(23):16330-16334)。polyA訊息充當用於對新形成前驅mRNA在其3'末端進行內切核酸裂解並且向此3'末端添加僅由腺嘌呤堿基組成之RNA鏈段的訊息。polyA尾對於mRNA之細胞核輸出、轉譯及穩定性為重要的。在一些實施例中，polyA為SV40早期多腺苷酸化訊息、SV40晚期多腺苷酸化訊息、HSV胸苷激酶多腺苷酸化訊息、魚精蛋白基因多腺苷酸化訊息、腺病毒5 E1b多腺苷酸化訊息、生長激素多腺苷酸化訊息、PBGD多腺苷酸化訊息或電腦模擬設計多腺苷酸化訊息。
在一些實施例中，並且視情況與本文所述之一或多個其他調控元件組合，重組核酸之polyA訊息序列係能夠引導及實現由編碼ASPA之經修飾核酸(例如，SEQ ID NO:2)之轉錄所產生的前驅mRNA之內切核酸裂解及多腺苷酸化的polyA訊息。在一些實施例中，polyA序列包含核酸序列SEQ ID NO:11或由其組成。在一些實施例中，polyA序列包含與核酸序列SEQ ID NO:11有約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%或100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，重組核酸包含強化子序列(例如，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17)、啟動子序列(例如，SEQ ID NO:7)、外顯子(例如，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18)、內含子(例如，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10)及polyA (SEQ ID NO:11)中之至少一者並且調節視情況由核酸序列SEQ ID NO:2編碼之異源多肽之表現。
在一些實施例中，對於寡樹突細胞具有向性之rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)含有自身互補載體基因體，該基因體包含AAV ITR (例如，AAV2 ITR)及包含編碼ASPA之經修飾(亦即，密碼子最佳化)核酸及以下調控元件中至少一者的重組核酸：強化子(例如，CMV強化子)、啟動子(例如，CBh啟動子)、外顯子(例如，CBA外顯子1)、內含子(例如，CBA內含子、MVM內含子)及polyA (例如，BHG polyA)。
在一些實施例中，對於寡樹突細胞具有向性的rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)含有自身互補基因體，該基因體包含AAV ITR (例如，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12及/或SEQ ID NO:19)及包含編碼ASPA之經修飾(亦即，密碼子最佳化)核酸(例如，SEQ ID NO:2)及以下調控元件中至少一者的重組核酸：強化子(例如，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17)、啟動子(例如，SEQ ID NO:7)、外顯子(例如，CBA外顯子SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18)、內含子(例如，SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10)及polyA (例如，SEQ ID NO:11)。
在一些實施例中，對於寡樹突細胞具有向性之rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)含有包含SEQ ID NO:20之自身互補基因體。本揭露之 rAAV 載體之生物活性
在一些實施例中，本揭露之rAAV載體(例如，包含ASPA轉基因)轉導靶細胞(例如，寡樹突細胞)並且介導生物活性。在一些實施例中，rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)轉導靶細胞(例如，寡樹突細胞)並且介導選自由以下組成之群的至少一個可偵測活性： (i) 在體外降低細胞中之NAA水準； (ii) 改良、增加及/或增強平衡、握力及/或運動協調； (iii) 改良、增加及/或增強掉落等待時間(秒)； (iv) 改良、增加及/或增強一般運動功能； (v) 在體內降低、抑制及/或中和NAA水準之積聚； (vi) 降低、抑制及/或中和丘腦中之液泡體積分率； (vii) 降低、抑制及/或中和小腦白質/橋腦中之液泡體積分率； (viii) 改良、增加及/或增強丘腦中之寡樹突細胞之數目； (ix) 改良、增加及/或增強皮質中之寡樹突細胞之數目； (x) 改良、增加及/或增強丘腦中之神經元之數目； (xi) 改良、增加及/或增強皮質中之神經元之數目；及 (xii) 改良、增加及/或皮質髓鞘形成。
在一些實施例中，轉導靶細胞(例如，寡樹突細胞)並且介導(i)至(xii)中之至少一種可偵測活性的rAAV載體係AAV/Oligo001-ASPA。
在一些實施例中，與用包含編碼ASPA之野生型核酸序列(例如，SEQ ID NO:3)之rAAV轉導的在其他方面相同的細胞中之NAA水準相比，用rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)轉導之細胞之NAA水準降低。在一些實施例中，與用包含編碼ASPA之替代密碼子最佳化核酸(例如，SEQ ID NO:1)之rAAV轉導的在其他方面相同的細胞中之NAA水準相比，用rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)轉導之細胞之NAA水準降低。在一些實施例中，與未轉導的包含編碼ASPA之突變體核酸的在其他方面相同的細胞中之NAA水準相比，用rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)轉導之細胞之NAA水準降低。
在一些實施例中，與在體內用包含編碼ASPA之野生型核酸序列(例如，SEQ ID NO:3)之rAAV轉導的在其他方面相同的細胞中之NAA水準相比，在體內用rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)轉導之細胞之NAA水準降低。在一些實施例中，與在體內用包含編碼ASPA之替代密碼子最佳化核酸(例如，SEQ ID NO:1)之rAAV轉導的在其他方面相同的細胞中之NAA水準相比，在體內用rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)轉導之細胞之NAA水準降低。在一些實施例中，與未轉導的包含突變體核酸的在其他方面相同的細胞中之NAA水準相比，在體內用rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)轉導之細胞之NAA水準降低。
在一些實施例中，如藉由例如滾輪表現所量測，與未投與rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突變之在其他方面類似的受試者之平衡、握力及/或運動協調相比，或與投與rAAV載體之前的同一受試者相比，投與rAAV載體之具有ASPA基因突變之受試者中之平衡、握力及/或運動協調顯著改良。
在一些實施例中，如藉由例如滾輪表現所量測，投與rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突變之受試者之平衡、握力及/或運動協調與沒有ASPA基因突變並且未投與rAAV載體之在其他方面類似的受試者中之平衡、握力及/或運動協調無區別。在一些實施例中，rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)經由腦室內(ICV)投與途徑來投與。在一些實施例中，滾輪表現量測為以秒為單位之掉落等待時間。
在一些實施例中，如藉由例如開放空間活動性所量測，與未投與rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突變之在其他方面類似的受試者之一般運動功能相比，或與投與rAAV載體之前的受試者中之功能相比，投與rAAV載體之具有ASPA基因突變之受試者中之一般運動功能顯著改良。在一些實施例中，rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)經由腦室內(ICV)投與途徑來投與。
在一些實施例中，如藉由例如開放空間活動性所量測，投與rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突變之受試者中之一般運動功能與沒有ASPA基因突變並且未投與rAAV之在其他方面類似的受試者中之一般運動功能無區別。在一些實施例中，rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)經由腦室內(ICV)投與途徑來投與。
在一些實施例中，與未投與rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突變之在其他方面類似的受試者之腦部中之NAA水準相比，或與投與rAAV載體之前的受試者中之NAA水準相比，投與rAAV載體之具有ASPA基因突變之受試者之腦部中之NAA水準顯著減少。在一些實施例中，投與rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突變之受試者之腦部中之NAA水準與沒有ASPA基因突變並且未投與rAAV載體之在其他方面類似的受試者之腦部中之NAA水準無區別。
在一些實施例中，與未投與rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突變之在其他方面類似的受試者之丘腦中之液泡分率相比，或與投與rAAV載體之前的受試者相比，投與rAAV載體之具有ASPA基因突變之受試者之丘腦中之液泡體積分率顯著減少，其中液泡分率藉由例如無偏體視學來量測。在一些實施例中，與未投與rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突變之在其他方面類似的受試者之小腦白質/橋腦中之液泡分率相比，或與投與rAAV載體之前的受試者相比，投與rAAV載體之具有ASPA基因突變之受試者之小腦白質/橋腦中之液泡體積分率顯著減少，其中液泡分率藉由例如無偏體視學來量測。
在一些實施例中，與未投與載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突變之在其他方面類似的受試者之丘腦中之寡樹突細胞之數目相比，或與投與載體之前的受試者相比，投與rAAV載體之具有ASPA基因突變之受試者之丘腦中之寡樹突細胞之數目顯著增加，其中丘腦中之寡樹突細胞之數目藉由例如IHC使用Olig2抗體及無偏體視學來量測。在一些實施例中，與未投與rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突變之在其他方面類似的受試者之腦皮質中之寡樹突細胞之數目相比，或與投與載體之前的同一受試者相比，投與rAAV載體之具有ASPA基因突變之受試者之腦皮質中之寡樹突細胞之數目顯著增加，其中腦皮質中之寡樹突細胞之數目藉由例如IHC使用Olig2抗體及無偏體視學來量測。在一些實施例中，投與rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)之具有ASPA基因突變之受試者之腦皮質中之寡樹突細胞之數目與沒有ASPA基因突變並且未投與rAAV載體之在其他方面類似的受試者之腦皮質中之寡樹突細胞之數目無區別，其中腦皮質中之寡樹突細胞之數目藉由例如IHC使用Olig2抗體及無偏體視學來量測。
在一些實施例中，與未投與rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突變之在其他方面相同受試者之丘腦中之神經元之數目相比，或與投與載體之前的受試者相比，投與rAAV載體之具有ASPA基因突變之受試者之丘腦中之神經元之數目顯著增加，其中丘腦中之神經元之數目藉由例如IHC使用NeuN抗體及無偏體視學來量測。在一些實施例中，與未投與rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突變之在其他方面類似受試者之腦皮質中之神經元之數目相比，或與投與載體之前的受試者相比，投與rAAV載體之具有ASPA基因突變之受試者之腦皮質中之神經元之數目顯著增加，其中腦皮質中之神經元之數目藉由例如IHC使用NeuN抗體及無偏體視學來量測。在一些實施例中，投與rAAV載體(例如，AAV/Olig001-ASPA)之具有ASPA基因突變之受試者之腦皮質中之神經元之數目與沒有ASPA基因突變並且未投與rAAV載體之在其他方面類似的受試者之腦皮質中之神經元之數目無區別，其中腦皮質中之神經元之數目藉由例如IHC使用NeuN抗體及無偏體視學來量測。
在一些實施例中，與未投與rAAV載體(例如，AAV/Oligo001-ASPA)的具有ASPA基因突變之在其他方面類似的受試者之腦中之皮質髓鞘形成相比，或與投與載體之前的受試者之腦中之皮質髓鞘形成相比，投與rAAV載體的具有ASPA基因突變之受試者之腦中之皮質髓鞘形成顯著增加，其中皮質髓鞘形成藉由例如皮質髓磷脂鹼性蛋白陽性纖維長度密度(MBP-LD)來量測。病毒載體之組裝
帶有轉基因(例如，ASPA)之病毒載體(例如，rAAV載體)自編碼轉基因之多核苷酸、合適調控元件及產生介導細胞轉導之病毒蛋白所必需之元件來組裝。病毒載體之實例包括但不限於腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、疱疹病毒及腺相關病毒(AAV)載體，及尤其rAAV載體(如以上論述)。
根據本揭露之方法產生之rAAV載體之載體基因體組分包括至少一個轉基因，例如編碼ASPA之經修飾核酸及控制編碼ASPA之經修飾核酸之表現的相關表現控制序列。
在一個較佳實施例中，載體基因體包含小病毒基因體之一部分，諸如其中rep及cap缺失及/或藉由經修飾核酸(例如，轉基因，例如，編碼ASPA之經修飾核酸)置換的AAV基因體及其相關聯的表現控制序列。編碼ASPA之經修飾核酸通常與一或兩個(亦即，側接) AAV ITR或適當於病毒複製之ITR元件(Xiao等人(1997) J. Virol.71(2): 941-948)相鄰地插入，代替編碼病毒rep及cap蛋白之核酸。亦可包含適合用於促進編碼ASPA之經修飾核酸在靶細胞(例如，寡樹突細胞)中之組織特異性表現的其他調控序列。包裝細胞
熟習此項技術者認識到包含轉基因並且缺少病毒複製所需要之病毒蛋白(例如，cap及rep)的rAAV載體不能複製，因為此等蛋白為病毒複製及包裝必不可少的。cap及rep基因可作為與向載體基因體供應轉基因之質體分開的質體之一部分來供應給細胞(例如，宿主細胞，例如，包裝細胞)。
「包裝細胞」或「生產細胞」意謂以下細胞或細胞株，該細胞或細胞株可用載體、質體或DNA構建體轉染並且反式提供病毒載體之完全複製及包裝所需要的所有缺失功能。rAAV載體組裝之所需基因包括載體基因體(例如，編碼ASPA之經修飾核酸、調控元件及ITR)、AAV rep基因、AAV cap基因及來自其他病毒諸如例如腺病毒之某些輔助基因。一般熟習此項技術者應理解，AAV產生之必要基因可以各種方式包括例如一或多個質體之轉染來引入包裝細胞中。然而，在一些實施例中，一些基因(例如，rep基因、cap基因、輔助基因)可已經存在於包裝細胞中，整合至基因體中或承載于游離基因上。在一些實施例中，包裝細胞以組成性或可誘導方式來表現一或多種缺失病毒功能。
在此項技術中已知的任何合適包裝細胞均可用於產生包裝病毒載體。哺乳動物細胞或昆蟲細胞為較佳的。可用於在本揭露之實踐中產生包裝細胞的細胞之實例包括例如人類細胞株，諸如PER.C6、WI38、MRC5、A549、HEK293細胞(其在組成性啟動子之控制下表現功能性腺病毒E1)、B-50或任何其他HeLa細胞、HepG2、Saos-2、HuH7及HT1080細胞株。合適的非人類哺乳動物細胞株包括例如VERO、COS-1、COS-7、MDCK、BHK21-F、HKCC或CHO細胞。
在一些實施例中，包裝細胞能夠在懸浮培養物中生長。在一些實施例中，包裝細胞能夠在無血清培養基中生長。例如，HEK293細胞在無血清培養基中懸浮生長。在另一實施例中，包裝細胞為如美國專利第9,441,206號所描述並且寄存為美國菌種保藏中心(ATCC)第PTA 13274號之HEK293細胞。許多rAAV包裝細胞株在此項技術中為已知的，包括但不限於WO 2002/46359中所揭示者。
作為包裝細胞使用之細胞株包括昆蟲細胞株。允許複製AAV並且可維持在培養物中之任何昆蟲細胞均可根據本揭露來使用。實例包括草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(諸如Sf9或Sf21細胞株)、果蠅屬種(Drosophila spp.)細胞株或蚊子細胞株(例如，白線斑蚊(Aedes albopictus)來源細胞株)。較佳細胞株為草地貪夜蛾Sf9細胞株。以下參考文獻由於其教示涉及昆蟲細胞用於表現異源多肽之用途、將核酸引入此等細胞中之方法及將此等細胞維持在培養物中之方法而併入本文中：Methods in Molecular Biology, Richard編, Humana Press, NJ (1995)；O'Reilly等人, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford Univ.Press (1994)；Samulski等人(1989) J. Virol.63:3822-3828；Kajigaya等人(1991) Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88: 4646-4650；Ruffing等人(1992) J. Virol.66:6922-6930；Kimbauer等人(1996) Virol.219:37-44；Zhao等人(2000) Virol.272:382-393；及美國專利第6,204,059號。
作為另一個替代方案，本揭露之病毒載體可在昆蟲細胞中使用遞送rep/cap基因之桿狀病毒載體及rAAV模板來生產，如例如Urabe等人(2002) Human Gene Therapy 13:1935-1943所描述。當使用桿狀病毒產生AAV時，在一些實施例中，載體基因體為自身互補的。在一些實施例中，宿主細胞為桿狀病毒感染細胞(例如，昆蟲細胞)，其視情況包含編碼桿狀病毒輔助功能之額外核酸，由此促進產生病毒殼體。
包裝細胞通常包括一或多種病毒載體功能以及足以導致病毒載體之複製及包裝的輔助功能及包裝功能。此等各種功能可使用遺傳構建體諸如質體或擴增子來一起或單獨地供應至包裝細胞，並且其可染色體外地存在於細胞株內或整合至宿主細胞之染色體中。在一些實施例中，包裝細胞用至少以下各者轉染：i)包含載體基因體之質體，該載體基因體包含密碼子最佳化人類ASPA轉基因(例如，SEQ ID NO:2)及AAV ITR (例如，SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:12)並且進一步包含以下調控元件中之至少一者：強化子(例如，SEQ ID NO:6)、啟動子(例如，SEQ ID NO:7)、外顯子(例如，CBA外顯子SEQ ID NO:8)、內含子(例如，SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10)及polyA (例如，SEQ ID NO:11)；及ii)包含rep基因(例如，AAV2 rep)及cap基因(例如，Olig001 cap)之質體。
在一些實施例中，向宿主細胞供應併入例如宿主細胞株內之包裝或輔助功能中之一或多者，該宿主細胞具有染色體外併入或整合至細胞之染色體DNA中的一或多種載體功能。輔助功能
AAV為依賴病毒，因為在沒有藉由輔助病毒共感染細胞的情況下，其不能在細胞中複製。輔助功能包括確立包裝細胞之主動感染所需要的輔助病毒元件，該主動感染係起始病毒載體之包裝所需要的。輔助病毒通常包括腺病毒或單純性疱疹病毒。腺病毒輔助功能通常包括腺病毒組分腺病毒早期區1A (E1a)、E1b、E2a、E4及病毒相關(VA) RNA。藉由用一或多個編碼各種輔助元件之核酸來轉染細胞，可將輔助功能(例如，E1a、E1b、E2a、E4及VA RNA)提供給包裝細胞。替代地，宿主細胞(例如，包裝細胞)可包含編碼輔助蛋白之核酸。例如，HEK293細胞藉由用腺病毒5 DNA轉型人類細胞來產生並且現在表現許多腺病毒基因，包括但不限於E1及E3 (參見，例如，Graham等人(1977) J. Gen.Virol.36:59-72)。因此，彼等輔助功能可藉由HEK 293包裝細胞提供，而不需要藉由例如編碼其之質體來將其供應至細胞。在一些實施例中，包裝細胞用至少以下各者來轉染：i)包含載體基因體之質體，該載體基因體包含密碼子最佳化人類ASPA轉基因(例如，SEQ ID NO:2)及AAV ITR(例如，SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:12)並且進一步包含以下調控元件中之至少一者：強化子(例如，SEQ ID NO:6)、啟動子(例如，SEQ ID NO:7)、外顯子(例如，CBA外顯子SEQ ID NO:8)、內含子(例如，SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10)及聚腺苷酸(例如，SEQ ID NO:11)；ii)包含rep基因(例如，AAV2 rep)及cap基因(例如，Olig001 cap)之質體；及iii)包含輔助功能之質體。
可使用將帶有輔助功能之核苷酸序列引入細胞宿主中以實現複製及包裝的任何方法，包括但不限於電穿孔、磷酸鈣沉澱、顯微注射、陽離子或陰離子脂質體及脂質體與核定位訊息之組合。在一些實施例中，輔助功能藉由使用病毒載體之轉染來提供，或可使用藉由使用輔助病毒之感染來產生病毒感染之標準方法。
載體基因體可為任何合適重組核酸，諸如DNA或RNA構建體並且可為單股、雙股或雙工(亦即，自身互補，如WO 2001/92551所描述)。包裝病毒載體之產生
病毒載體可藉由熟習此項技術者已知之多種方法來產生(參見，例如WO 2013/063379)。較佳方法描述於Grieger等人(2015) Molecular Therapy 24(2):287-297，其內容出於所有目的以引用之方式併入本文。簡言之，HEK293細胞之有效轉染用作起始點，其中在振盪燒瓶及允許快速且可擴充rAAV產生之WAVE生物反應器中使用來自合格臨床種源細胞庫之貼附型HEK293細胞株以在無動物組分懸浮條件下生長。使用三重轉染方法(例如，WO 96/40240)，在轉染後48小時收穫時，HEK293細胞株懸浮液可產生大於1×105 個含有載體基因體之顆粒(vg)/細胞或大於1×1014 vg/L細胞培養物。更具體而言，三重轉染係指其中包裝細胞用三種質體轉染的方法：一種質體編碼AAV rep及cap (例如，Olig001 cap)基因，另一種質體編碼各種輔助功能(例如，腺病毒或HSV蛋白諸如E1a、E1b、E2a、E4及VA RNA，並且另一種質體編碼轉基因(例如，ASPA)及控制轉基因表現之各種元件。
將單股載體基因體作為約相等比例之正股或負股包裝至殼體中。在rAAV載體之一些實施例中，載體基因體處於正股極性中(亦即，DNA股之有義或編碼序列)。在rAAV載體之一些實施例中，載體處於負股極性中(亦即，反義或模板DNA股)。鑒於正股之核苷酸序列為5'至3'取向，為5'至3'取向之負股之核苷酸序列可確定為正股之核苷酸序列之反向補體。
為了達成所需產率，對許多變數進行最佳化，諸如支持生長及轉染的相容無血清懸浮培養基之選擇、轉染試劑之選擇、轉染條件及細胞密度。
rAAV載體可藉由在此項技術中之標準方法諸如藉由管柱層析或氯化銫梯度來純化。用於純化rAAV載體之方法在此項技術中為已知的並且包括Clark等人(1999) Human Gene Therapy 10(6):1031-1039；Schenpp及Clark (2002) Methods Mol.Med.69:427-443；美國專利第6,566,118號及WO 98/09657所描述之方法。
可使用基於離子交換層析方法之通用純化策略產生AAV血清型1-6、8、9及各種嵌合殼體(例如，Olig001)之高純度載體製備物。在一些實施例中，此過程可在一週內完成，得到高滿殼體與空殼體比率(＞90%滿殼體)，提供適合於臨床應用之純化後產率(＞1×1013 vg/L)及純度。在一些實施例中，此方法相對於所有血清型及嵌合殼體為通用的。可擴充製造技術可用於製造GMP臨床及商品級rAAV載體(例如，用於治療康納丸氏病)。
在本揭露之rAAV載體已生產及純化之後，其可經滴定(例如，可對樣品中rAAV載體之量進行定量)以製備用於向受試者諸如患有康納丸氏病之人類受試者投與的組合物。rAAV載體滴定可使用在此項技術中已知的方法來完成。
在一些實施例中，包括含有載體基因體之顆粒及不含有載體基因體之「空」殼體的病毒顆粒之數目可藉由電子顯微術例如透射電子顯微術(TEM)來確定。此基於TEM之方法可提供樣品中載體顆粒(或在野生型AAV的情況下的病毒顆粒)之數目。
在一些實施例中，rAAV載體基因體可使用定量PCR (qPCR)，使用針對載體基因體中之序列的引子來滴定，該等序列例如ITR序列(例如，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19)及/或轉基因(例如，SEQ ID NO:2)或調控元件中之序列。藉由並行地對於已知濃度之標準品(諸如含有載體基因體之序列之質體)的稀釋液執行qPCR，可產生標準曲線，從而允許將rAAV載體之濃度計算為每單位體積諸如微升或毫升的載體基因體(vg)之數目。藉由將如藉由例如電子顯微術所量測之載體顆粒之數目與樣品中載體基因體之數目比較，可確定空殼體之數目。因為載體基因體含有治療性轉基因，所以與載體顆粒之數目相比，vg/kg或vg/ml載體樣品可更能指示受試者接受之載體之治療量，載體顆粒中之一些可為空的且不含有載體基因體。一旦確定了儲備溶液中之rAAV載體基因體之濃度，可將其稀釋至合適緩衝液中或針對緩衝液進行滲析，以便用於製備向受試者(例如，患有康納丸氏病之受試者)投與之組合物。治療方法
如本文所揭示之經修飾核酸(諸如編碼ASPA之經修飾核酸)可用于基因療法治療及/或預防與ASPA多肽之缺陷或功能障礙相關之疾病、病症或病狀(例如，康納丸氏病)以及ASPA基因之上調可產生治療益處或改良的任何其他病狀及或疾病，例如，與在其他方面健康個體中之ASPA多肽之水準或功能相比，藉由ASPA多肽之水準或功能之減少來介導或與其相關的疾病、病症或病狀。
如本文所揭示之包含編碼ASPA之經修飾核酸的載體基因體及/或rAAV載體可用于基因療法治療及/或預防與ASPA酶之缺陷或功能障礙相關或由其導致之疾病、病症或病狀(例如，康納丸氏病)以及ASPA酶之上調可產生治療益處或改良的任何其他病狀及/或疾病。在一些實施例中，本揭露之方法包括rAAV載體或其醫藥組合物在治療受試者之康納丸氏病中之用途。在一些實施例中，本揭露之方法包括rAAV載體(例如，AAV/Oligo001-ASPA)或其醫藥組合物增加有需要之受試者之ASPA之水準的用途。
本揭露之編碼ASPA之經修飾核酸、包含編碼ASPA之經修飾核酸之載體基因體及/或包含編碼ASPA之經修飾核酸之rAAV載體(例如，AAV/Oligo001-ASPA)可用於製備用於治療及/或預防與ASPA之缺陷或功能障礙(例如，功能性ASPA酶之水準降低，諸如在康納丸氏病中)相關或由其導致之疾病、病症或病狀及ASPA之上調可產生治療益處或改良之任何其他病狀或疾病的藥物。
在一些實施例中，與ASPA酶之缺陷或功能障礙相關之疾病、病症或病狀(例如，康納丸氏病)以及ASPA基因表現之上調及/或功能性ASPA酶之表現增加可產生治療益處或改良的任何其他病狀及/或疾病的基因療法治療及/或預防包括向需要治療之受試者(例如，患者)投與治療有效量的本揭露之編碼ASPA之經修飾核酸、包含編碼ASPA之經修飾核酸之載體基因體及/或包含編碼ASPA之經修飾核酸之rAAV載體(例如，AAV/Oligo001-ASPA)。
與基線量測結果(諸如起始本文所述之治療之前同一個體之量測結果或者不存在本文所述之治療時對照個體(或多個對照個體，由此建立比較水準)之量測結果)相比，用治療有效量的本揭露之編碼ASPA之經修飾核酸、包含編碼ASPA之經修飾核酸之載體基因體及/或包含經修飾核酸ASPA之rAAV載體(例如，AAV/Oligo001-ASPA)治療受試者(例如，患者)可減輕、改善、治療、預防康納丸氏病之一或多個症狀或降低其嚴重性。在一些實施例中，「對照個體」為患有與所治療個體相同形式之疾病或損傷，但是當前未治療，但是將來可能接受治療的個體。
例如，與對照個體中之NAA積聚相比，或與治療之前同一個體之NAA積聚相比，用治療有效量之編碼ASPA之經修飾核酸、包含編碼ASPA之經修飾核酸之載體基因體及/或rAAV載體(例如，AAV/Oligo001-ASPA)治療受試者可減少NAA積聚。在一些實施例中，與對照個體相比，或與治療之前同一個體相比，在所治療之受試者中，NAA積聚減少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約100%。
在一些實施例中，與對照個體之天冬胺酸鹽及/或乙酸鹽水准相比，或與治療之前同一個體之天冬胺酸鹽及/或乙酸鹽水准相比，用治療有效量之編碼ASPA之經修飾核酸、包含編碼ASPA之經修飾核酸之載體基因體及/或rAAV載體(例如，AAV/Oligo001-ASPA)治療受試者可增加天冬胺酸鹽及/或增加乙酸鹽水准。在一些實施例中，與對照個體相比，或與治療之前同一個體比較，在所治療之受試者中，天冬胺酸鹽及/或乙酸鹽水准增加約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約100%。
在一些實施例中，與對照個體中或治療之前受試者中之情況相比，治療亦可減輕、改善、治療、預防或減少腦及脊髓中之髓磷脂退化、智能障礙、喪失先前掌握之運動技能、進食困難、肌肉張力異常、巨頭畸形、癱瘓及癲癇發作之嚴重性及/或語言及運動技能發展延遲。在一些實施例中，與對照個體中之情況相比，或與治療之前同一受試者相比，用治療有效量之本揭露之編碼ASPA之經修飾核酸、包含編碼ASPA之經修飾核酸之載體基因體及/或包含編碼ASPA之經修飾核酸之rAAV載體治療受試者(例如，患者)亦可增加、改良平衡、握力及或運動協調及一般運動功能、預防其進一步損失或對其進行增強。在一些實施例中，與對照個體中之情況相比，或與治療之前同一受試者相比，用治療有效量之本揭露之編碼ASPA之經修飾核酸、包含編碼ASPA之經修飾核酸之載體基因體及/或包含編碼ASPA之經修飾核酸之rAAV載體治療受試者(例如，患者)可減少腦部(例如，丘腦、小腦白質/橋腦)中之液泡體積分率，增加腦部(例如，丘腦、皮質)中之寡樹突細胞之數目，增加腦部(例如，丘腦、皮質)中之神經元之數目及/或增加皮質髓鞘形成。
適合於治療之受試者包括具有不足量之功能性基因產物(蛋白)，或處於產生不足量之功能性基因產物(蛋白)之風險中，或具有功能性基因產物(蛋白)之缺陷，或產生異常、部分功能性或非功能基因產物(蛋白，例如，酶)，從而可導致疾病的任何受試者。在一些實施例中，在展現疾病、病症或病狀(例如，康納丸氏病)之任何症狀之前，患者用本揭露之載體或醫藥組合物進行治療。在一些實施例中，藉由基因分析來診斷為處於疾病、病症或病狀(例如，康納丸氏病)之風險中之患者在展現症狀之前用rAAV本揭露之載體或組合物進行治療。
在一些實施例中，待治療之受試者可為哺乳動物，並且特別地，受試者為人類患者，例如，患有康納丸氏病之患者。受試者可能需要治療，因為由於ASPA基因之編碼序列中之一或多個突變，ASPA蛋白具有不正確的胺基酸序列，並且由此功能減少或沒有功能，在錯誤組織或錯誤時間表現，表現不足或根本不表現。可投與本發明之編碼ASPA之經修飾核酸來增強、改良或提供功能性ASPA酶之產生，該酶可進而催化NAA分解成天冬胺酸鹽及乙酸鹽，以及如在本文中別處論述之其他生物功能。
本發明之rAAV載體之靶細胞為細胞，尤其寡樹突細胞，此細胞通常內源地能夠表現ASPA酶，諸如哺乳動物之腦中之酶。
在提及如本文描述之治療方法的實施例中，此等實施例亦為用於該治療中，或替代地用於製造用於該治療中之藥物的進一步實施例。醫藥組合物
在具體實施例中，本揭露提供醫藥組合物或藥物，其用於預防或治療藉由ASPA之表現及/或活性減少來介導或與其相關之疾病、病症或病狀，例如，康納丸氏病。在一些實施例中，醫藥組合物包含經修飾核酸、重組核酸、病毒載體基因體、表現載體、宿主細胞或rAAV載體及醫藥學上可接受之載劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含治療有效量之載體(例如，病毒載體基因體、表現載體、rAAV載體)或宿主細胞，其包含編碼ASPA之經修飾核酸，可增加細胞中之ASPA之表現水準及/或活性水準。
在一些實施例中，醫藥組合物包含治療有效量之載體(例如，病毒載體基因體、表現載體、rAAV載體)或宿主細胞(例如，用於離體基因療法)，其包含編碼ASPA之經修飾核酸，其中組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及/或其他醫藥劑。醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑或其他醫藥劑不為生物學上或在其他方面不合需要的劑，例如，材料可投與至受試者而不導致超過材料之有利生物效應的不當生物效應。
任何合適醫藥學上可接受之載劑或賦形劑可用於製備根據本發明之醫藥組合物(參見例如，Remington The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (編) Mack Publishing Company, April 1997)。
醫藥組合物通常在製造及儲存條件下為無菌、無熱源且穩定的。醫藥組合物可調配為溶液(例如，水、鹽水、右旋糖溶液、緩衝溶液或其他醫藥學上無菌流體)、微乳液、脂質體或適合於容納高產物(例如，病毒載體顆粒、微粒或奈米顆粒)濃度之其他有序結構。在一些實施例中，包含本揭露之經修飾核酸、包含經修飾核酸之載體基因體、宿主細胞或rAAV載體的醫藥組合物在水或緩衝鹽水溶液中調配。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇以及其類似物)及其合適混合物之溶劑或分散介質。恰當流動性可例如藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、在分散液情況下藉由維持所需粒子大小及藉由使用界面活性劑來維持。在一些實施例中，將等滲劑例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉包含於組合物中可為較佳的。可注射組合物之延長吸收可藉由將延遲吸收之劑例如單硬脂酸鹽及明膠包含在組合物中來產生。在一些實施例中，本揭露之核酸、載體及/或宿主細胞可在控制釋放調配物中投與，例如，在包含緩慢釋放聚合物或保護產物免於快速釋放之其他載劑的組合物中，包括植入及微膠囊化遞送系統。
在一些實施例中，本揭露之醫藥組合物為腸胃外醫藥組合物，包括適合於靜脈內、動脈內、皮下、皮內、腹膜內、肌肉內、關節內、腦實質內(IP)、鞘內(IT)、腦室內(ICV)及/或大池內(ICM)投與之組合物。在一些實施例中，包含有包含編碼ASPA之經修飾核酸之rAAV載體的醫藥組合物經調配以用於藉由ICV注射來投與。
在一些實施例中，rAAV載體(例如，AAV/Olig001 ASPA)在350 mM NaCl及PBS中之5% D-山梨醇中調配。投與方法
本揭露之編碼轉基因(例如，ASPA)之經修飾核酸或包含經修飾核酸的載體(例如，載體基因體、rAAV載體)可投與至受試者(例如，患者)以便治療受試者。將載體投與至有需要之人類受試者或動物可藉由在此項技術中已知用於投與載體之任何手段進行。本揭露之載體之靶細胞包含CNS之細胞，較佳寡樹突細胞。
載體可附加於標準護理治療以及作為標準護理治療之輔助來投與。亦即，載體可與另一種劑、化合物、藥物、治療或治療方案同時、同期、或以熟習此項技術者使用常規方法來確定之確定給藥時間間隔來共同投與。本文揭示之用途包括與此項技術中已知用於康納丸氏病之標準護理同時、附加於該標準護理及/或以同步給藥時程來投與本揭露之rAAV載體。
在一些實施例中，組合組合物包含一或多種免疫抑制劑。在一些實施例中，組合組合物包含有包含轉基因(例如，編碼ASPA之經修飾核酸)的rAAV載體及一或多種免疫抑制劑。在一些實施例中，方法包括將包含轉基因(例如，編碼ASPA之經修飾核酸)之rAAV載體投與或遞送至受試者以及在投與載體之前預防性地或在投與載體之後(亦即，在針對載體及/或由其提供之蛋白的反應之症狀顯而易見之前或之後)將免疫抑制劑投與至受試者。
在一些實施例中，本發明之rAAV可與空殼體(亦即，不含有核酸分子或載體基因體之病毒殼體)共同投與，該等空殼體包含與包含經修飾核酸(例如，編碼ASPA)之rAAV載體相同或不同的殼體蛋白。熟習此項技術者應理解，共同投與空殼體可減少對於本揭露之rAAV之免疫反應，例如，中和反應。不希望受任何特定理論束縛，空殼體可充當使得包含經修飾核酸(例如，編碼ASPA)之rAAV載體避免中和抗體(Nab)免疫反應之免疫誘餌，如在例如WO 2015/013313中論述。
在一個實施例中，本揭露之載體(例如，包含編碼ASPA之經修飾核酸之rAAV載體)係全身投與。示範性全身投與方法包括但不限於靜脈內(例如，門靜脈)、動脈內(例如，股動脈、肝動脈)、血管內、皮下、皮內、腹膜內、經粘膜、肺內、淋巴管內及肌肉內投與及其類似者以及直接組織或器官注射。熟習此項技術者應認識到，全身投與可將經修飾核酸(例如，編碼ASPA之經修飾核酸)遞送至所有組織。在一些實施例中，直接組織或器官投與包含投與至肝臟。在一些實施例中，直接組織或器官投與包含投與至直接受ASPA缺陷影響之區域(例如，腦及/或中樞神經系統)。在一些實施例中，將本揭露之載體及其醫藥組合物投與至腦實質(亦即，藉由腦實質內投與)、脊髓管或蜘蛛膜下腔以使得其到達腦脊髓液(CSF)(亦即，藉由鞘內投與)、腦室(亦即，藉由腦室內投與)及/或大池腦(亦即，藉由大池內投與)。
因此，在一些實施例中，本揭露之包含編碼ASPA之經修飾核酸之載體藉由直接注射至腦中(例如，至實質、腦室、大池等中)及/或CSF (例如，至脊髓管或蜘蛛膜下腔中)來投與，以治療康納丸氏病之神經退化性態樣。本揭露之載體之靶細胞包含位於胼胝體、紋狀體及/或小腦之皮質、皮質下白質中之細胞。在一些實施例中，本揭露之載體之靶細胞為寡樹突細胞。額外投與途徑亦可包含在直接可視化下局部應用載體，例如，表面皮質應用或其他非立體定向應用。
在一些實施例中，本揭露之載體藉由至少兩種途徑來投與。例如，載體全身投與且亦直接投與至腦中。若經由至少兩種途徑來投與，載體之投與可但是不一定為同時或同時期的。替代地，經由不同途徑的投與可分開地執行，在每次投與之間有一時間間隔。
本揭露之編碼ASPA之經修飾核酸、包含編碼ASPA之經修飾核酸之載體基因體及/或包含編碼ASPA之經修飾核酸之rAAV載體可用於離體轉導細胞或直接投與至受試者(例如，直接投與患有康納丸氏病之患者之CNS)。在一些實施例中，將轉導細胞(例如，宿主細胞)投與至受試者以治療或預防疾病、病症或病狀(例如，康納丸氏病之細胞療法)。包含經修飾治療性核酸(例如，編碼ASPA)之rAAV載體較佳以生物學有效量來投與至細胞。在一些實施例中，載體之生物學有效量為足以導致在靶細胞中轉導及表現編碼ASPA之經修飾核酸(亦即，轉基因)的量。
在一些實施例中，本揭露包括一種藉由將編碼ASPA之經修飾核酸單獨或在載體(包括質體、病毒載體、奈米顆粒、脂質體、或將核酸提供至細胞之任何已知方法)中投與至細胞(體內、體外或離體)來增加細胞中ASPA之水準及/或活性的方法。
rAAV載體之劑量取決於例如投與模式、待治療之疾病或病狀、疾病之階段及/或攻擊性、個別受試者之狀況(年齡、性別、體重等)、特定病毒載體、待表現之蛋白之穩定性、對於載體之宿主免疫反應及/或待遞送之基因。總體上，劑量範圍為至少1 × 108 或更多，例如，1 × 109 、1 × 1010 、1 × 1011 、1 × 1012 、1 × 1013 、1 × 1014 、1 × 1015 或更多載體基因體(vg)/公斤(kg)受試者體重，以便達成治療效果。
在一些實施例中，編碼ASPA之經修飾核酸可作為DNA分子(例如，重組核酸)之組分來投與，該DNA分子具有適合於在靶細胞(例如，寡樹突細胞)中表現之調控元件(例如，啟動子)。編碼ASPA之經修飾核酸可作為質體或病毒載體諸如rAAV載體之組分來投與。rAAV載體可藉由將載體(例如，直接遞送至CNS)直接遞送至需要治療之患者(例如，康納丸氏患者)來體內投與。可藉由將載體體外投與至需要治療之供體患者之細胞，隨後將轉導細胞引入回到供體中來將rAAV載體離體投與至患者(例如，細胞療法)。
本揭露包含一種投與方法，其導致與未投與經修飾核酸(例如，編碼ASPA之經修飾核酸)之在其他方面相同的細胞中之ASPA表現(mRNA及/或蛋白)或ASPA活性之水準相比，編碼ASPA之mRNA之水準、ASPA蛋白表現之水準及/或ASPA活性之水準可偵測地更大。
在另一實施例中，本揭露包含一種投與方法，其導致與未投與經修飾核酸(例如，編碼ASPA之經修飾核酸)之在其他方面相同的細胞中存在之功能性ASPA (mRNA及/或蛋白)之水準相比，編碼功能性ASPA之mRNA之水準及/或功能性(例如，生物活性) ASPA蛋白表現之水準可偵測地更大。亦即，本發明包含增加細胞中功能性ASPA之水準的方法，其中細胞產生正常水準之ASPA但是與正常野生型ASPA相比，ASPA蛋白缺少活性或表現出活性減少。
熟習此項技術者應理解，細胞可在體外培養或生長或可存在於生物體中(亦即，在體內)。此外，細胞可表現內源ASPA，以使得細胞中之ASPA之增加水準，且/或細胞表現的內源ASPA為野生型ASPA之突變體或變異體，例如 ，具有序列SEQ ID NO:3的ASPA，尤其當可能存在人類ASPA之多於一種野生型對偶基因時。因此，與在其他方面相同、但是未治療之細胞中表現之ASPA之水準比較，ASPA之水準增加。套組
本揭露提供一種在其中具有包裝材料及一或多種組分的套組。套組通常包含標籤或包裝插頁，包括組分之描述或其中的組分之體外、體內或離體使用之說明書。套組可含有此等組分之集合，例如，經修飾核酸、重組核酸、載體基因體、rAAV載體rAAV及視情況第二活性劑諸如化合物、治療劑、藥物或組合物。
套組係指含有套組之一或多個組件的實體結構。包裝材料可以無菌方式維持組分並且可由通常用於此等目的之材料(例如，紙、玻璃、塑膠、箔、安瓿、小瓶、管等)製成。
標籤或插頁可包括其中之一或多種組分、劑量、活性成分之臨床藥理學包括作用機制、藥物動力學及藥效學的鑑別資訊。標籤或插頁可包括鑑別製造、批號、製造地點及日期、截止日期之資訊。標籤或插頁可包括關於套組組分可針對性使用之疾病(例如，康納丸氏病)的資訊。標籤或插頁可包括供臨床醫師或受試者在方法、用途或治療規程或治療方案中使用套組組分中之一或多者的說明書。說明書可包括劑量、持續時間頻率及實踐本文所述任何方法、用途、治療規程或預防或治療方案的說明書。
標籤或插頁可包括關於潛在不良副作用、併發症或反應之資訊，諸如給受試者或臨床醫師的關於不適合於使用特定組合物之情形的警告。等效物
認為前述書面說明係足以能夠使熟習此項技術者來實踐本揭露。前述描述及實例詳述本揭露之某些示範性實施例。然而，應當理解，無論前述以文本形式表現得如何詳細，本揭露仍可以許多方式實踐，且應根據隨附申請專利範圍及其任何等同物解釋本揭露。
本文所引用之所有參考文獻，包括專利、專利申請案、論文、教科書及其類似者以及其中所引用之參考文獻，如果尚未被引用，則以全文引用之方式併入本文。示範性實施例
藉由參考以下實驗實例更詳細地描述本發明。僅出於說明目的提供此等實例，並且此等實例不欲具有限制性，除非另外規定。因此，本發明決不應理解為限於以下實例，而是應理解為涵蓋由於本文中提供之教導而變得明顯的任何及所有變化。實例 實例 1 ：使用包含編碼 ASPA 之密碼子最佳化核酸之 rAAV 載體， NAA 之劑量反應性減少
將人類胚胎腎(HEK)細胞用1.0 ug表現NAA合成酶(Nat8L)之質體轉染並且用0.1、0.2、0.5或1.0 µg包含以下之質體共轉染：野生型人類ASPA核酸序列(SEQ ID NO:3)、編碼ASPA之密碼子最佳化核酸(包含核酸序列SEQ ID NO:1，參見Francis等人(2016) Neurobiol. Dis. 96:323-334)或包含核酸序列SEQ ID NO:2的編碼ASPA之密碼子最佳化核酸。NAA濃度藉由HPLC (n=4/組)來量測。相對於用編碼ASPA之野生型核酸或編碼ASPA之密碼子最佳化核酸SEQ ID NO:1轉染之培養物，在使用編碼ASPA之密碼子最佳化核酸SEQ ID NO:2轉染之培養物中觀察到NAA之劑量反應性減少(第 1 圖 )。實例 2 ：寡向性 AAV/Olig001 之生物分佈
進行此研究以在遺傳性人類腦白質失養症康納丸氏病之小鼠模型中定義寡向性AAV (AAV/Olig001；(WO2014/052789；Powell等人(2016) Gen. Ther.23:807-814))殼體變異體在促進廣泛CNS寡樹突細胞轉導中最有效的劑量及投與途徑(ROA)。在成年、症狀性康納丸氏小鼠(nur7)中測試經由四個不同ROA遞送之AAV/Olig001之三個劑量，並且在轉導後兩週，藉由生成四個感興趣之解剖區域中報道基因綠色螢光蛋白(GFP)陽性細胞之體視學估計來對載體蔓延及轉導進行定量。藉由對此等相同區域中之與GFP共標記之譜系特異性抗原之發生率進行評分來評定經由各ROA遞送之AAV/Olig001之向性，以驗證寡向性。所使用之ROA為腦實質內(IP)、鞘內(IT)、腦室內(ICV)及大池內(ICM)。經由各途徑投與載體之三個劑量，1×1010 、1×1011 及5×1011 總載體基因體(VG)，其中在所有治療隊列中，遞送之材料之體積為恆定的，並且對進行之各者進行直接成對比較，以定義將AAV/Olig001應用于康納丸氏病的劑量及ROA之最佳組合。使用六週齡天冬胺酸醯化酶缺陷nur7小鼠(Traka等人(2008) J. Neurosci 28:11537-11549)，其代表康納丸氏病之急性症狀期。藉由此研究產生之結果形成支持AAV/Olig001臨床應用於當前難治性白質疾病諸如康納丸氏病的後續臨床前功效研究之基礎。 材料 AAV/Olig001載體
產生含有GFP報道基因之組成性表現匣的兩個批次之AAV/Olig001載體(批號7660及批號LAV38A)。所產生的所有載體均包含GFP報道基因，其藉由側接自身互補AAV ITR之雜交CMV/雞β-肌動蛋白啟動子(CBh)驅動。載體藉由HEK293細胞之瞬時轉染，接著進行碘克沙醇梯度離心及離子交換層析來產生(Gray等人, (2013) Gene Ther.20:450-9)。載體之濃度定義為病毒載體基因體(vg)之總數目，其藉由儲備製劑中之DNA酶耐受性AAV反向末端重複(ITR)序列之qPCR定量來確定。 動物
此項研究中所用之所有動物自在經批准機構協定下維持於Rowan School of Osteopathic Medicine動物設施中的群落來產生。初始動物來源於商業來源(Jackson Laboratories)。nur7小鼠係康納丸氏病之經良好表徵之模型，其編碼神經膠質水解酶天冬胺酸醯化酶(aspa )之基因中具有鈍化點突變，使得蛋白不具有功能性(Traka等人J. Neuroscience (2008) 28(45)11537-11549)。同型nur7突變動物自異型攜帶動物之配對來產生並且使用內部自訂SNP檢定及即時PCR來進行基因型分析。
在0.9%鹽水中稀釋至合適濃度之AAV/Olig001-GFP藉由立體定位注射來遞送至處於吸入麻醉下(4%誘導並且保持滴定至一定效應)的6週齡nur7突變體小鼠。產生藉由各自提供不同投與途徑(ROA)來區分之四個治療隊列：鞘內(IT)、腦實質內(IP)、腦室內(ICV)及大池內(ICM)。在各ROA隊列內，建立藉由各ROA所投與之載體劑量來定義之動物亞組(1×1010 、1×1011 及5×1011 總載體基因體)。
因此，對於各ROA，產生了藉由劑量定義之三個亞組，其中在各ROA下，各劑量n=5只動物，供給該研究總共60只nur7小鼠。將AAV/Olig001-GFP投與至麻醉小鼠，並且對於所有手術，不論劑量或ROA如何，5 µL之總遞送體積為恆定的。IP ROA需要在5個立體定位坐標處5×注射1 µL載體，使用數位泵浦，以0.1 µL/min之速率，兩次注射在各半球的前及後皮質下白質(亦即，總共在扣帶進行4次注射)並且在小腦白質中進行1次額外注射(得到總共5次)。IT ROA動物接受將載體單次5 µL輸注到經由在L5與L6之間的腰椎穿剌接近之蜘蛛膜下腔中。ICV ROA動物接受載體之兩次2.5 µL注射，每次均以0.1 µL/min之速率注射在各側腦室中。ICM ROA動物接受以0.1 µL/min之速率經由大池直接遞送至CSF之5 µL載體。在手術之前20分鐘，所有動物均接受0.5 mL 20%甘露糖醇(ip)。在AAV/Olig001-GFP遞送之後，將所有動物分群圈養兩週，然後處死以供死後分析。
每天兩次給予初始2週及8週齡野生型及nur7小鼠之組全身BrdU (50 mg/kg，ip)連續兩天，然後在第三天處死。將BrdU以50 mg/kg之濃度投與至動物。使用可商購獲得的抗體(Millipore-Sigma)，在1 M HCL中DNA水解之後，將腦組織切片處理以供BrdU染色。 方法 藉由無偏體視學對載體生物分佈進行定量
載體手術之後兩週，將動物深度麻醉，並且用0.9%鹽水繼之以新鮮製備的緩衝之4%多聚甲醛進行經心灌注，製備腦。將灌注腦切除並且在4℃下，後固定於4% PFA中隔夜。將固定腦冷凍保存並且急驟冷凍於乾冰/異戊烷浴中並且儲存於-80℃下，然後進行免疫組織化學處理。各腦產生連續40 µm矢狀切片(總共144個切片)並且使用可商購獲得之抗體(Sigma/Millipore)，針對GFP對每第4個切片進行染色。皮質、皮質下白質、紋狀體及小腦中之GFP陽性體細胞藉由無偏體視學、使用分光器方法(第 2 圖 )(West等人Anat.Rec.(1991) 231:482-97)來評分。使用聯接至配備有機動載台之直立明視野顯微鏡的體視學軟體(Stereologer, Stereology Resource Center)產生四個感興趣之不同區域內之GFP陽性體細胞之計數，即，腦皮質、胼胝體及外囊之皮質下白質、紋狀體及小腦。在感興趣之各區域中，使用下式將取樣分率中之GFP陽性細胞再轉化成絕對估計結果，ΣQ*( t/h)*(1/asf)*(1/ssf )，其中ΣQ = 顆粒計數，t =切片厚度，h = 計數框架高度，asf = 區域取樣分率，且ssf = 切片取樣分率。對於由此產生之所有資料集，藉由計算滿足少於15%總方差貢獻(CV)臨限值之誤差係數(CE)來監測樣品內變化，以減少掩蔽樣品之間之真實生物變化的技術雜訊。N 之平均組平均值估計結果中之顯著差異藉由未配對雙尾學生t檢驗來確定，其中臨限值顯著性p＜0.05。 載體向性之定量
藉由對與GFP螢光共標記之譜系特異性抗原進行評分，對AAV/Olig001-GFP轉導腦中之載體向性進行定量。使用可商購獲得之抗體(Sigma/Millipore)，對於NeuN (存在於脊椎動物之大多數CNS及PNS神經元細胞型中)、GFAP (神經膠質原纖維酸性蛋白)或Olig2 (寡樹突細胞譜系轉錄因子2)免疫組織化學的替代切片進行處理，以便分別標記神經元、星形細胞及寡樹突細胞。使用掃描共焦顯微術以在各感興趣之區域中產生多點影像堆疊。使用NIS-Elements Advanced Research軟體(Nikon)對總GFP陽性細胞以及各堆疊中與各譜系特異性抗原(Olig2及NeuN)共標記之GFP陽性細胞之數目進行計數。整理每個個別腦之數目(在以樣品間隔4自各腦取樣之總和中，8個連續切片)。個別切片中之ROI藉由軟體來畫輪廓並且每200 um2安置之個別點以高放大率取樣，以對GFP免疫螢光體細胞及GFP/Olig2或NeuN陽性細胞體兩者進行評分。與Olig2或NeuN共標記之GFP陽性體細胞之總數藉由將GFP陽性體細胞之數目除以各系列切片中之譜系特異性共標記來計算。計算各ROA之平均值(n=5只動物)。 結果 腦實質內(IP) ROA劑量反應
給予IP ROA動物靶向半球及小腦兩者中之皮質下白質的5次個別注射。載體投與後2週，將經治療動物處死(8週齡)並且對腦進行處理以供GFP免疫組織化學，並且皮質、皮質下白質、紋狀體及小腦中之GFP陽性體細胞使用無偏體視學、使用分光器來評分以提供各感興趣之區域中之轉導細胞之絕對估計結果。所投與之AAV/Olig001-GFP之所有三個劑量導致整個腦中之細胞之顯著轉導水準。(第 3 圖 )在皮質內，在1×1010 與1×1011 vg劑量之間，轉導細胞數目之增加為顯著的(+1.6倍，p=0.0096)，但是在最高5×1011 劑量下之進一步增加不明顯(p=0.659)，表明飽和(第 3 圖 )。在胼胝體及外囊之皮質下白質中，高水準之轉導為明顯的，其中陽性細胞在緊鄰四個注射部位處最集中。皮質下白質GFP陽性細胞亦以劑量依賴性方式增加，其中自1×1010 至1×1011 劑量之2.2倍增加為統計上顯著的(p=0.0144)，但是自1×1011 至5×1011 之1.3倍增加未能達到統計顯著性(p=0.283)。適度紋狀體轉導為明顯的。自1×1010 至1×1011 之3.4倍增加為高度顯著的(p=4.38×10-5 )，但是在5×1011 劑量下，轉導之進一步增加為不明顯的(p=0.706)。小腦內之轉基因表現限於直接圍繞單一注射部位之區域，其中1×1011 及5×1011 劑量均導致超過先前劑量之顯著增加(1×1011 ：1.5倍增加 [p=0.0016]；5×1011 ：1.4倍增加 [p=0.0019])。皮質呈現最高數目之轉導細胞(513,477)，隨後為皮質下白質(178,362)、小腦(86,820)並且最後為紋狀體(62,706)。GFAP共標記少於2%。 鞘內(IT) ROA劑量反應
AAV/Olig001-GFP之IT投與導致轉基因表現在整個腦中之極好分佈，除了胼胝體及外囊之皮質下白質以外(第 4 圖 )。自1×1010 至1×1011 vg，皮質轉導之高顯著增加為明顯的(6.1倍增加，p=0.000026)，其中在5×1011 vg劑量下沒有顯著增加(p=0.273)。雖然IT ROA皮質中之GFP表現之分佈極好，但是與IP腦相比，表現強度稍微減少。毫不奇怪，在脊髓之腰區中，可觀GFP表現為顯著的，表明在到達腦途中，脊髓組織對載體有一些稀釋。IT ROA腦中之最吸引人的觀察結果係在胼胝體及外囊中缺乏轉基因表現。雖然當劑量自1×1010 增加至1×1011 時，觀察到GFP表現白質束細胞之極顯著增加(6.3倍增加，p=0.00021)，但是IT ROA腦中之轉導白質細胞之絕對數為相對適中的。在1×1011 劑量下，腦之此白質束區域中之陽性細胞之平均數目為64,970，相比之下相同劑量下之IP腦為178,362。與皮質ROA一樣，在IT ROA腦中，將劑量自1×1011 進一步增加至5×1011 未顯著增加轉導白質束細胞之數目(p=0.203)。
在各連續劑量下，紋狀體呈現轉導細胞之劑量反應性增加。將劑量自1×1010 增加至1×1011 導致紋狀體中之2.7倍多GFP陽性細胞(p=0.001)。隨後增加至5×1011 劑量導致陽性細胞增加3.2倍(p=0.000037)，產生與IP ROA腦紋狀體轉導可比較的數目(IT在5×1011 下之平均值為79,444，IP在5×1011 下之平均值為65,203)。
IT ROA導致強小腦轉基因表現，其中當自1×1010 移動至1×1011 劑量時，觀察到顯著1.5倍增加(p=0.0064)，但是在5×1011 劑量下，未觀察到進一步增加。小腦轉導與IP ROA腦為可比較的，並且在1×1011 及5×1011 劑量下為稍微但是不顯著更高的。 腦室內(ICV) ROA劑量反應
ICV投與AAV/Olig001-GFP導致在所有感興趣之區域中之顯著轉基因表現，其中皮質下白質之特別穩健的轉導為顯著的(第 5 圖 )。當劑量自1×1010 增加至1×1011 時，所有感興趣之區域顯示轉導細胞數目之劑量反應性增加，但是與1×1011 劑量相比，在5×1011 劑量下，在大多數區域中存在細微不顯著增加，除了小腦。皮層轉基因表現為與IP ROA腦可比較的，其中當劑量自1×1010 增加至1×1011 時，轉基因陽性細胞增加2倍(p=0.00029)，並且投與5×1011 劑量之後之進一步增加1.2倍，未能達到統計顯著性(p=0.123)。
ICV腦中之皮質下白質轉導為實質性的，並且當劑量自1×1010 增加至1×1011 時，觀察到GFP陽性白質束細胞之2倍增加(p=0.00052)。在最高5×1011 劑量下觀察到適度非顯著增加(p=0.334)。在1×1011 劑量下之ICV腦中之皮質下白質轉導相對於IP腦顯著增加1.5倍(p=0.041)，並且相對于IT ROA腦增加4.2倍(p=0.0001)。
在ICV劑量隊列之紋狀體中觀察到轉基因表現之極類似模式，其中加當劑量自1×1010 增加至1×1011 時，觀察到GFP陽性細胞之顯著2倍增加(p=0.000043)，但是在5×1011 劑量下沒有顯著進一步增加(p=0.537)。在ICV腦中之穩健紋狀體轉基因表現為明顯的，並且相對於IP腦，此區域中之GFP陽性細胞增加2.5倍(p=0.00004)。
小腦ICV轉導為穩健的，其中在兩個連續較高劑量下觀察到GFP陽性細胞之劑量依賴性增加(在1×1011 下+2倍，p=9.56×10-6 ；在5×1011 下+1.5倍，p=0.00073)。在1×1011 劑量下，相對於IP腦，GFP陽性細胞增加1.7倍(p=0.0001)，並且相對於IT數目，增加1.4倍(p=0.0013)。在ICV ROA腦中，小腦為呈現GFP陽性細胞之進一步可觀增加的唯一區域。
在整個取樣過程中明顯的IP與ICV ROA腦之間的主要差異點係載體在ICV組中之更大分佈。在IP腦中，注射部位處之轉基因表現更強烈，但是自該部位迅速地稀釋。相反，ICV轉基因表現相對均勻地分佈於腦之大得多區域。 大池內(ICM) ROA劑量反應
ICM投與AAV/Olig001-GFP導致皮質、紋狀體及小腦中之相對廣泛的轉基因但是有限的轉基因表現。然而，與IT ROA腦一樣，在ICM腦之皮質下白質中不存在顯著轉基因表現(第 6 圖 )。皮層轉基因表現為劑量反應性的，其中各連續較高劑量導致GFP陽性細胞顯著增加(1×1011 ，2.2倍增加p=0.018；5×1011 ，1.3倍增加p=0.043)。在1×1011 劑量下，紋狀體及小腦出現GFP陽性細胞之顯著增加(對於紋狀體及小腦，分別p=2.49×10-6 及p=0.0062)，其中最高5×1011 劑量導致僅在小腦中之陽性細胞進一步增加(p=0.061)。藉由ICM ROA之皮質下白質束之轉導為明顯適中的。雖然將投與劑量自1×1010 增加至1×1011 導致GFP陽性細胞之顯著增加(p=0.00086)，但是存在的轉基因陽性細胞之實際數目為相對可忽略的。
相對於ICV腦，ICM皮質下白質GFP陽性細胞減少14.2倍(ICV平均值271,274；ICM平均值18,996，p=0.00002)並且相對於下一個最低皮質下白質轉導ROA動物組IT，減少3.4倍(IT平均值64,970)，使得ICM成為在轉導白質中之效力最小ROA。在其他感興趣之區域中之分佈為與其他ROA治療組可比較的，其中當與所有三個其他ROA相比時，皮質轉導沒有明顯的顯著差異。在與ICV ROA相比時，經由ICM之紋狀體轉導稍微減少(p=0.043)。在1×1011 劑量下，紋狀體ICM GFP表現顯著大於IP (+2.0倍，p=0.00005)及IT (+5.1倍，p=0.0000005)。在所檢查的四個ROA中之任一者中，ICM腦呈現最高數目之轉導小腦細胞。在1×1011 劑量下，小腦ICM轉導相對于ICV增加1.5倍(ICM平均值228,282；ICV平均值157,203)，相對于IP增加2.6倍，並且相對于IT增加2.2倍。 投與途徑(ROA)比較
對於本文研究之所有ROA，在所有感興趣之區域中，將載體劑量自1×1010 增加至1×1011 引起轉導細胞數目增加2至3倍，而進一步劑量遞增至5×1011 導致總體轉導細胞可忽略的增加。在各感興趣之區域中，1×1011 劑量下之所有四個ROA之直接比較揭示所有四個ROI中之轉導細胞之絕對數目之明顯差異(第 7 圖 )。對於各ROA而言，用1×1011 個載體基因體轉導之腦之皮質中之轉導細胞之數目未顯著不同，全部都產生平均44,000-50,000個陽性體細胞。相比之下，在皮質下白質中，ICV ROA存在明顯優勢，其中與任何其他組相比，在ICV腦中，轉導細胞數目顯著更高。ICV及IP轉導腦分別給出轉導白質束細胞之最高及第二最高數目。經由ICV ROA用1×1011 個AAV/Olig001-GFP載體基因體轉導之腦白質束中之平均2.7×105 個陽性細胞顯著大於存在於經受相同劑量之IP腦中之平均1.8×105 陽性細胞(p=0.041)。
IT及ICM ROA兩者在轉導皮質下白質細胞方面係效率低的，其中與ICV組中之平均2.7×105 個陽性細胞相比，ICM組中之平均1.9×104 個細胞顯著地少14倍(p=0.000083)，並且IT組少4倍(p=0.0001)。此在呈現髓磷脂缺陷之疾病模型系統中可為成問題的。
ICV途徑亦導致與所有其他ROA相比，在ICV腦中，用更高數目之GFP陽性細胞有效轉導紋狀體中之細胞(ICV相比於IP p=3.68×10-5 ；ICV相比於IT p=1.61×10-5 ；ICV相比於ICM p=0.043)。在所有IP、IT及ICV ROA中，小腦之轉導效率為可比較的，但是ICM腦呈現最高數目之轉導小腦細胞(ICM相比於ICV p=0.045)。
雖然IP及ICV ROA腦在特定區域中的藉由AAV/Olig001-GFP轉導之細胞之絕對數目方面為可比較的，但是IP腦中之大多數陽性細胞計數為與注射部位緊鄰之切片之乘積，而ICV腦中之陽性細胞為相對均勻分佈。全身性非隨機體視學取樣允許鑑別自個別腦取樣之切片之間之變化(樣本內變化)，並且表示為資料集中之誤差係數(CE)，其藉由將重複估計結果之平均值標準誤差除以平均值來計算。CE為被取樣群體中之總方差之一半，並且真實生物方差(CV)，或個別腦之間之平均值之差異構成另一半。個別IP腦之平均CE計算為總方差之約12%，而ICV腦之平均CE為約3%，意味著在ICV腦中取樣之所有切片中，GFP陽性細胞更均勻分佈。在IP腦中，距取樣切片所在之注射部位橫向愈遠，所取樣之個別切片中之陽性細胞之實際數目變得愈少，而ICV腦中之陽性細胞數目始終接近於所有取樣切片處之樣本內平均值。此差異之最終結果係載體在ICV ROA中腦相對於IP腦之更大蔓延，尤其在皮質及皮質下白質中(第 7 圖 )。 結論
使用四個不同ROA，定義了在診斷時相當準確地模擬康納丸氏腦之急性症狀性動物中有益於總體CNS寡樹突細胞轉導之劑量與ROA之組合。在除了小腦以外的所有感興趣之區域中投與AAV/Olig001-GFP載體產生大於70%寡向性，而不需要譜系特異性表現元件。在所有ROA中，轉基因陽性寡樹突細胞之劑量依賴性增加為明顯的，其中腦室內ROA促進更高數目之轉導白質束細胞，同時在此關鍵的感興趣之區域中維持大於90%寡向性。此等資料強調殼體-細胞表面相互作用為寡向性之主要決定因素，對於臨床應用於對於寡樹突細胞具有特異性之異常現象諸如康納丸氏病而言，該決定因素為最相關的。此等資料亦證明Olig001殼體具有用於治療寡樹突細胞相關疾病、病症及/或病狀包括康納丸氏病之潛在治療殼體。實例 3 ：藉由投與途徑 (ROA) 之載體向性
AAV/Olig001之顯著特徵為其與其他AAV殼體變異體相比之明顯寡向性(Powell等人(2016) Gen.Ther.23:807-814；Francis等人(2016) Neurobiol.Dis.96:323-334)。對於應用于康納丸氏病(其按照定義為白質病症)，AAV/Olig001載體在藉由不同ROA應用時必須能夠展現此向性。寡向性可歸因於諸如干預年齡之變數而變化(Gholizadeh等人Hum.Gene Ther.Methods (2013) 24:205-13；Foust等人Nature Biotech.(2009) 27:59-65)，並且雖然先前研究證明了AAV/Olig001在新生nur7小鼠中之寡向潛力(Francis等人Neurobiol.Dis.(2016) 96:323-334)，但是將此趨向潛力轉移至年齡較大的症狀性動物仍然未經測試。為此目的，針對在6週齡動物中之對於載體向性之潛在影響，評定在實例2中使用的1×1011 劑量下之所有四個ROA。針對GFP轉基因與譜系特異性抗原Olig2 (亦即，寡樹突細胞之靶標特異性標記)及NeuN (亦即，神經元之靶標特異性標記)之共標記，對用於產生GFP陽性細胞之絕對數目的皮質、皮質下白質、紋狀體及小腦進行分析。 結果
所有四個ROA產生可比較的結果，其中寡向性為完整的。非寡樹突細胞轉基因表現可歸因於神經元，其中在所有4個ROA隊列中觀察到極少星形細胞表現GFP(＜5%)。
在IT、ICV及ICM ROA中間，Olig2與GFP之皮層共標記為可比較的，其中與Olig2共標記之總GFP陽性細胞之百分比始終為約75%。在IP轉導腦中，與Olig2共標記之GFP陽性細胞為約62.3%，此減少為較小的但是為顯著的(第 8 圖 )。在此等相同腦中與NeuN共標記之GFP陽性細胞基本上占其餘轉導皮質群體(35.1%)。所有三個IT、ICV及ICM ROA呈現約20%NeuN共標記。在IT ROA腦中，與Olig2共標記之皮質GFP陽性細胞為75.5%並且與NeuN共標記之皮質GFP陽性細胞為20.2%。ICV ROA腦在皮質中呈現70.8%寡向性及23.6%趨神經性，而ICM腦之皮質表現76% GFP與Olig2共標記，並且17.4% GFP與NeuN共標記。在4個不同ROA中間表現的寡向性差異為較小的，但是IP ROA呈現NeuN共標記之顯著增加(p=0.0043相比於IT；p=0.0119相比於ICV；p=0.00059相比於ICM)，此情況與相對於其他3個ROA，Olig2共標記之輕微但是顯著的減少是一致的(p=0.026相比於IT；p=0.048相比於ICV；p=0.0085相比於ICM)，表明以寡向性為代價，IP ROA促成趨神經性之較小增加。又，IP ROA在NeuN共標記之增加方面係值得注意的(+1.5倍，p=0.012)，表明在此ROA中，Olig2共標記減少藉由神經元轉導增加來解釋。IP ROA腦中之大部分GFP-NeuN共標記集群在注射部位附近，指示與注射部位緊鄰的AAV/Olig001-GFP之飽和數量。
在所有四個ROA中，Olig2與GFP之皮質下白質共標記＞90% (第 9 圖 )。在所有四個ROA中，NeuN與GFP之共標記＜6%。在ROA之間，未觀察到與任一抗原之共標記百分比之顯著差異，表明不論ROA為何，對於富含白質區域中之寡樹突細胞的強烈偏好。藉由ICV轉導，在胼胝體中接近普遍存在Olig2共標記並且不存在NeuN共標記。
在所有ROA中間，Olig2與GFP之紋狀體共標記為可比較的，其中與Olig2共標記之總GFP陽性細胞之百分比＞80% (第 10 圖 )。紋狀體中之其餘GFP陽性細胞(＜20%)與NeuN共標記。
在所有四個ROA中，與所研究的其他腦區域比較，小腦共標記展示Olig2及NeuN之相反比率。在所有四個ROA中，Olig2共標記之百分比為總GFP陽性細胞之10% (第 11 圖 )。轉基因表現由小腦中之神經元主導，其佔GFP表現細胞之80%以上。在小腦中，在ROA隊列之間，未觀察到與任一抗原共標記百分比之顯著差異。顆粒細胞層中之較大柏京野神經元為強GFP陽性的(第 29C 圖 )，其中在小腦白質束內，Olig2/GFP共標記僅為零星的。此情況與在皮質下白質中觀察到之接近100%寡向性(第 29B 圖 )，及在相對神經元密集區域諸如皮質及紋狀體中觀察到之70%至80%寡向性形成對比(第 29D 圖 )。在1×1011 劑量下針對各ROA評分之總GFP陽性細胞按總GFP陽性細胞之最高至最低平均值(+/- sd)之順序來排序，其中n=5：ICV 1104256.4 (106816.96)；IP 841365.6 (121722.7)；ICM 815486.9 (106979.7)；IT 742143.1 (79496.5)。
ICV ROA產生總GFP陽性細胞之最高數目(個別腦中之所有ROA計數之總和)，其比下一個排序ROA IP大1.3倍(p=0.0067)。在包括ICM (p=0.0027)及IT (p=0.0003)之所有ROA中，ICV腦中之總數目顯著增加。IP ROA腦中之細胞數目未顯著增加超過ICM (p=0.730)或IT數目(p=0.165)，表明ICV ROA在轉導總細胞方面明顯地更好。ICV及IP隊列之間之總體GFP陽性細胞數目之差異之大約75% (約262,891)藉由皮質下白質(35%)及紋狀體(36%) ROI來解釋，表明在兩個ROA隊列中之＞80%寡向性。此意謂ICV腦包含比IP腦多至少約210,000個轉導寡樹突細胞。若此分析限於皮質下白質內，亦即按照所有ROA呈現＞90%寡向性之ROI，則當經由ICV ROA投與AAV/Olig001時，預期每個腦至少多轉導83,000個寡樹突細胞。當針對呈現GFP轉基因表現之最差水準之ROA隊列，亦即ICM隊列進行評定時，ICV投與導致AAV/Olig001轉導寡樹突細胞超過200,000個細胞/腦之增加。
成年哺乳動物CNS已知在白質中容納顯著數目之寡樹突細胞前驅細胞(Dawson等人Mol.Cell Neurosci.(2003)24:476-488)，並且先前展示了在幼年nur7中呈未成熟寡樹突細胞轉換增加形式的嘗試髓鞘再生之證據(Francis等人 J. Cerebral Blood Flow Metabolism (2012) 32:1725-36)。鑒於即使在成年腦中，白質具有顯著的髓鞘再生之能力，成年nur7白質中之未成熟寡樹突細胞之駐留群體之持久性必須被視為寡向性基因遞送載體之理想靶標。
為了評估增殖寡樹突細胞前驅細胞/未成熟寡樹突細胞之相對數目，每天兩次給予nur7及野生型小鼠全身BrdU持續兩天並且在第三天處死，以便進行BrdU/Olig2共標記之過程(第 29E-G 圖 )。在2及8週齡隊列中起始BrdU投與以對幼年及成年腦中之增殖寡樹突細胞之可能持久性進行定量。各年齡之基因型隊列之胼胝體及外囊中BrdU陽性細胞之計數揭示在2週齡nur7腦相對於野生型的BrdU陽性細胞之1.8倍增加(p=0.029)及在8週nur7腦中之1.6倍增加(p=0.034)(第 29F 圖 )。在兩種年齡下，nur7白質中之絕大多數BrdU細胞與Olig2共標記，指示成年症狀性nur7小鼠之白質中之增殖前驅細胞/未成熟寡樹突細胞之持久性。給予三個6週齡nur7小鼠之子集全身BrdU持續兩天，然後用1×1011 vg之AAV/Olig001-GFP轉導，並且轉導後2週將此等動物處死以獲得白質束中之增殖細胞轉導證據。在此等動物之白質束中觀察到許多BrdU/GFP共標記細胞，指示駐留前驅細胞/未成熟細胞之成功轉導。
經由ICV ROA，將一組與nur7 ROA隊列年齡匹配(亦即6週齡)之健康野生型動物用1×1011 vg AAV/Olig001-GFP轉導，並且2週後處死以便產生皮質及皮質下白質束內之GFP陽性細胞之體視學估計結果(第 8 圖 )。GFP陽性細胞之估計結果揭示野生型腦與nur7大腦相比之皮質及皮質下白質之顯著2倍減少(對於各相應ROI而言，p=0.00032及p=0.0116)。野生型腦中之皮質下白質GFP轉基因表現很多限於與野生型腦中之側腦室緊鄰之區域，而雖然皮質表現適度地分散，但是在轉導細胞之絕對數目方面係非常適中的。 結論
實例2及3展現AAV/Olig001 GFP載體之腦室內(ICV)投與途徑提供載體蔓延及寡樹突細胞向性之最佳組合。至關重要地，此ROA似乎完全適合於轉導皮質下白質，亦即受康納丸氏病病狀影響之組織。因此，轉導幾十萬個細胞並且維持對於寡樹突細胞之接近100%向性之能力賦予AAV/Olig001超過其他AAV殼體之顯著優勢。四至六週齡nur7胼胝體/外囊具有大約1,500,000個Olig2陽性細胞，因而，經由ICV ROA來投與1×1011 劑量之AAV/Olig001載體具有轉導約20%之駐留寡樹突細胞群體的潛力。應注意，nur7小鼠之白質束存在嘗試髓鞘再生之證據並且含有顯著數目之增殖寡樹突細胞前驅細胞。鑒於單一寡樹突細胞能夠使多個軸突之髓鞘形成，用治療性AAV/Olig001載體轉導白質之後的髓鞘再生之潛力係顯著的。
其他CSF靶向ROA，即IT及ICM，呈現相對較差白質束轉導，並且不考慮作為治療性ROA之首先選擇。IP腦在轉導細胞數目方面接近可比較的轉導水準，但是此等細胞中的大部分集中于注射部位周圍。此等部位處之細胞可能具有任何其他ROA中之更大載體基因體拷貝數/細胞，但是與ICV ROA相比，遠離此等部位蔓延之載體係顯著較低的。藉由ICV投與之GFP轉導之更廣泛分佈係有利的，可在轉導細胞數目與每個轉導細胞之載體拷貝數目之間達成合適平衡。
事實上，在實例2及3中之IP腦中之轉基因表現之強濃度與寡樹突細胞向性之較小但是顯著減少及皮質內之趨神經性之均衡增加相關。此指示用AAV/Olig001使區域飽和可導致寡樹突細胞特異性減少。應注意在本研究中使用之動物中，相對於野生型，nur7小鼠中之皮質寡樹突細胞之數目減少並且存在應力及細胞凋亡之證據(Francis等人(2012) J. Cereb.Blood Fl.Metab.32:1725-1736)，預期其可影響轉導效率。
所有感興趣之區域中之載體向性為75-90%寡向性，除了小腦以外。在所有ROA組中，此區域呈現＞80%趨神經性。在顆粒層柏京野神經元中觀察到特別強的轉基因表現。向性之此明顯逆轉之原因不容易顯而易知，但是小腦明顯地係相對於駐留細胞型的不同解剖實體。小腦內之柏京野細胞以較低但是可觀水準來表現Olig2，並且與其他腦區域中之其他神經元之表面相比，AAV/Olig001殼體具有顯著不同的與柏京野神經元表面之相互作用係可能的。
當前實例示出在nur7康納丸氏病小鼠之整個腦中，AAV/Olig001促進穩健寡突膠質轉基因表現，其中小腦為重要例外。在腦之所有其他區域中，達成＞70%寡向性而不需要譜系特異性啟動子。相對于其他非寡向性殼體血清型中之選擇性啟動子使用，AAV/Olig001殼體對於寡突膠質表面之固有親和力為顯著優勢，因為其確保儘可能接近於總劑量的所遞送載體在靶細胞中表現。此等資料鑑別靶向腦中之白質的不同ROA之優勢，並且ICV ROA展示對於作為治療康納丸氏病之模型的症狀性成年nur7小鼠之臨床前功效研究的適用性。實例 4 ：野生型與 nur7 腦之間 AAV/Olig001-GFP 轉導效率之差異
康納丸氏病之nur7小鼠模型在2週齡表現出總體運動功能障礙之症狀。到6週齡，nur7腦遭受顯著細胞損失、白質損失及廣泛液泡化。因此，與健康腦相比，6週nur7腦係顯著地不同微環境，可能影響AAV/Olig001-GFP蔓延及轉導。事實上，如與nur7小鼠腦中之轉導水準相比，在6週齡野生型小鼠之隊列中，經由ICV ROA投與1×1011 劑量導致在皮質及皮質下白質中之顯著減少水準之轉導(第 12 圖 )(各組n=5只動物，示出平均值+/-sem，*p≤0.05，**p≤0.01)。
皮質及皮質下白質中之GFP陽性細胞之體視學估計證明野生型腦中之轉基因表現之顯著減少之發生率(至少50%減少)。強GFP螢光限於與側腦室緊鄰之區域，並且在野生型腦中具有適中皮質及皮質下白質GFP螢光訊息。小腦中之轉基因表現較差。此等資料指示對於AAV/Olig001蔓延及轉導效率之基因型特異性效應。又，因為與人類康納丸氏腦一樣，nur7腦係重度液泡化，具有過分地較腦室並且具有深遠地較高NAA，因此此等體征及症狀可潛在影響人類AAV/Olig001治療劑之載體蔓延及生物分佈。實例 5 ：體內投與 AAV/Olig001-ASPA 至 nur7 小鼠改良滾輪表現 方法
向6週齡nur7小鼠投與一定劑量的包含密碼子最佳化ASPA序列SEQ ID NO:2之AAV/Olig001-ASPA。編碼密碼子最佳化ASPA及調控元件之表現質體在第 13 圖 中示出。2.5×1011 、7.5×1010 或2.5×1010 vg之總劑量經由腦室內(ICV)投與途徑(ROA)來投與。所有劑量隊列之載體以5 μl之總體積來遞送，並且2.5 μl注射於腦之各半球之側腦室中。藉由經由相同ROA來注射等效體積之生理鹽水，產生年齡匹配nur7動物之對照隊列。年齡匹配初始野生型動物用作所有運動功能測試之校準參考。投與載體之後兩週，針對自加速滾輪之掉落等待時間及使用開放空間活性室之一般活動，每月測試動物一次持續四個月。所有行為測試藉由對於治療不知情之個體來執行。 結果 滾輪表現
在所投與之最高劑量(2.5×1011 vg)下，AAV/Olig001-ASPA將nur7小鼠中之如藉由滾輪表現所量測之逐步惡化平衡、握力及/或運動協調拯救至與年齡匹配野生型動物無區別並且非常顯著改良超過假nur7對照之水準。在此劑量下，如藉由重複量測ANOVA所確定，AAV/Olig001-ASPA治療動物中之增加滾輪表現在整個研究期中係顯著的(p=0.028)並且在各個別時間點係顯著更高的，如藉由未配對學生t檢驗所確定。在中程劑量(7.5×1010 vg)下，AAV/Olig001-ASPA亦在所測試之每個時點促成nur7小鼠中之顯著改良滾輪表現，但是此改良在整個研究期中不顯著(重複量測ANOVA p=0.19)。在所投與之最低劑量(2.5×1010 vg)下，AAV/Olig001-ASPA在僅所測試的最後兩個時間點(18及22個月)有效促進改良滾輪表現。表 1 提供各治療組之以秒為單位量測之平均掉落等待時間(與標准偏差)。對於各組，測試12只小鼠(6只雄性及6只雌性)。表 2 提供各年齡之AAV/Olig001-ASPA治療與假nur7小鼠之間之未配對t檢驗比較之p值。除了10及14週投與2.5×1010 之小鼠相比於假治療小鼠，在所有組中觀察到統計上顯著改良。表 1. 滾輪掉落等待時間。
   平均(SD) 掉落等待時間( 秒)
劑量 10 週 14 週 18 週 22 週
2.5 × 1011 239.83 (36.7) 234.89 (32.3) 217.78 (41.1) 201.63 (50.2)
7.5 × 1010 230.278 (52.1) 222.67 (64.7) 199.78 (55.7) 183.28 (50.4)
2.5 × 1010 218.25 (68.6) 195.89 (97.6) 171.14 (55.7) 169.08 (55.8)
假 187.94 (41.8) 148.39 (39.5) 119.39 (27.2) 96.06 (23.5)
野生型 232.95 (34.5) 234.12 (37.8) 227.63 (31.1) 208.78 (55.5)
表 2. AAV/Olig001-ASPA治療小鼠與假治療小鼠之間的滾輪等待時間差異之P值。
   未配對t 檢驗之P 值
劑量 10 週 14 週 18 週 22 週
2.5 × 1011 相比於假 0.00385137 6.5919E-06 6.0627E-07 1.2282E-06
7.5 × 1010 相比於假 0.03906939 0.00272419 0.00018 1.8767E-05
2.5 × 1010 相比於假 0.2046576 0.13253963 0.00849161 0.00039049
第 14 圖 示出各AAV/Olig001-ASPA nur7劑量隊列、假nur7及初始野生型對照之生活中研究期過程中之繪製滾輪平均掉落等待時間。在所有3個劑量隊列中，掉落等待時間增加，其中藉由重複量測ANOVA(*)，最高劑量在完整研究期內係顯著的。 開放空間活動
在進行滾輪之各年齡，亦評定動物在開放空間活動室中之一般運動功能(第 15 圖 )。每次給予動物單一20分鐘進程，並且記錄每次進程之總行進距離。相對於年齡匹配野生型動物，假nur7小鼠在所有年齡，尤其在最後時間點表現出顯著活動過度。在22週齡，相對於野生型，假nur7動物呈現活動之顯著3倍增加(行進距離；p=0.0202)。相反，2.5×1011 劑量之AAV/Olig001-ASPA在nur7小鼠中導致正規化活性水準，該等水準相對於假對照係統計上顯著的(p=0.0312)並且與年齡匹配野生型無區別。較低7.5×1010 劑量之AAV/Olig001-ASPA導致以下活動模式，該等活動模式更緊密地類似於野生型而不是假nur7模式，但是在22週齡恰好在相對於假之統計顯著性之臨限值以下(p=0.1181)。最低(2.5×1010 )劑量之AAV/Olig001-ASPA不顯著地使病理過度活動正規化並且更緊密地類似於假nur7對照而不是野生型指示物。
評估此等相同動物之開放空間活動展示AAV/Olig001-ASPA治療nur7動物之活動過度之劑量依賴性正常化。資料呈現為平均值+/- sem，其中每組n=6只動物。 NAA積聚及載體基因體(vg)拷貝數
22週之滾輪測試之後，將小鼠處死，並且將腦組織分離。對各腦之一個半球進行處理以供NAA之HPLC分析，並且對剩餘半球進行處理以供藉由定量PCR來分析載體基因體(vg)拷貝數。
假鹽水治療nur7小鼠腦包含通常較高NAA，如自ASPA功能之損失所預期(第 16 圖 )。在AAV/Olig001-ASPA治療隊列中觀察到病理學升高NAA之劑量反應性減少，其中最高2.5×1011 劑量導致非常顯著的2.6倍減少(p=5.06×10-6 )，中間的7.5×1010 劑量導致1.6倍減少(p=5.17×10-5 )，並且最低2.5×1010 劑量導致1.4倍減少(p=0.001)。用最高劑量之AAV/Olig001-ASPA治療之nur7腦中之NAA事實上顯著低於年齡匹配野生型腦中之NAA (p=0.0012)。
使用針對NAA所分析之腦所剩餘之半球來藉由定量PCR、使用定製TaMan探針/引子集來定量載體基因體(vg)拷貝數，該探針/引子集靶向重組AAV/Olig001-ASPA表現匣之牛生長激素(BGH)多腺苷酸化序列。半球之總DNA含量使用可商購獲得之DNA純化柱及套組(Qiagen)來分離並且由此產生之DNA樣品相對於純化質體標準曲線來運作，以便產生各樣品之vg/濕組織重量。所產生的VG/mg組織值反映所投與之AAV/Olig001-ASPA之劑量(第 17 圖 )，其與對於載體劑量之NAA反應一致。 液泡化分析
藉由無偏體視學分析用AAV/Olig001-ASPA治療之nur7小鼠之腦，以定量隨著載體劑量而變化的丘腦及小腦白質/橋腦中之液泡體積分率(第 18 圖 )。各感興趣之區域內之由空腔佔據之面積定義為液泡並且呈現為總體感興趣之區域體積之百分比。在各劑量下，AAV/Olig001-ASPA治療導致完全拯救丘腦液泡化，如與假治療小鼠相比，丘腦液泡體積分率之高度顯著減少所示(2.5×1011 ，p=4.6×10-8 ；7.5×1010 ，p=6.4×10-8 ；及2.5×1010 ，p=6.2×10-8 )(第 19 圖 )。與假治療小鼠相比，小腦白質/橋腦中之液泡化亦在所有劑量下顯著地經拯救(2.5×1011 ，p=1.3×10-5 ；7.5×1010 ，p=2.5×10-5 ；及2.5×1010 ，p=0.0009)，但是拯救度與所投與之載體劑量成比例。最低2.5×1010 劑量隊列呈現之液泡體積分率顯著增加，超過最高2.5×1011 劑量之液泡體積分率(p=5.74×10-6 )，同時仍然顯著少於假治療對照中之液泡體積分率(p=0.0009)(第 19 圖 )。 寡樹突細胞恢復
對針對液泡化分析之相同腦進行處理以用於Olig2免疫組織化學以鑑別寡樹突細胞。藉由無偏體視學針對Olig2陽性細胞對丘腦及皮質進行取樣以鑑別分別受液泡化影響及不受其影響的區域中之產生白質之駐留細胞中之顯著差異(第 20 圖 )。相對於年齡匹配野生型腦，假nur7腦呈現Olig2陽性細胞之大量4.6倍損失，僅佔正常野生型含量之21% (p=4.9×10-7 )。AAV/Olig001-ASPA治療nur7小鼠及假治療nur7小鼠之丘腦中之Olig2計數(第 21 圖 )揭示相對於假對照，所有三個AAV/Olig001-ASPA治療nur7隊列中之寡樹突細胞顯著增加(2.5×1011 vg，p=6.75×10-8 ；7.7×1010 vg，p=0.026；2.3×1010 vg，p=3.18×10-5 )。皮質區中之Olig2損失不太急劇但是顯著(相比於野生型小鼠，假治療nur7小鼠中減少1.7倍；p=0.0025)。相對於假治療nur7對照小鼠，2.5×1011 vg治療nur7腦之皮質之Olig2含量(第 21 圖 )亦顯著增加(p=0.0002)，但是兩個較低劑量隊列腦不顯著增加。 神經元恢復
在用於Olig2染色之相同22週齡腦中，針對NeuN陽性神經元對丘腦及皮質進行評分(第 22 圖 )。假治療nur7動物呈現之丘腦神經元之數目為年齡匹配野生型動物值之約35% (p=2.8×10-5 )(第 23 圖 )。用2.5×1011 AAV/Olig001-ASPA治療之Nur7小鼠包含之丘腦神經元之數目增加，超過假治療對照小鼠2.3倍(p=0.0009)並且為野生型小鼠中觀察到之丘腦神經元之約84%。在兩個較低劑量7.5×1010 及2.5×1010 下，AAV/Olig001-ASPA促成丘腦NeuN陽性細胞增加，分別增加超過假治療對照小鼠1.8及1.6倍(p=0.012；p=0.042)。在皮質(運動及軀體感覺)中，相對於年齡匹配野生型小鼠腦，假治療nur7小鼠腦中之神經元損失不太深遠，但是顯著。假治療小鼠之皮質包含NeuN陽性細胞為在野生型小鼠中觀察到之約80%，表示1.2倍減少(p=0.005)。用2.5×1011 AAV/Olig001-ASPA治療之Nur7小鼠包含之皮質神經元之數目為在野生型小鼠中觀察到之皮質神經元之約98%，並且比在假治療nur7小鼠中觀察到之皮質神經元之數目增加1.2倍(p=0.013)。AAV/Olig001-ASPA之連續劑量導致相對於假治療，皮質神經元之穩定的1.2倍增加。對於7.5×1010 劑量，取樣資料之高變化使得此增加為不重要的(p=0.113)。在最低2.5×1010 劑量下，AAV/Olig001-ASPA治療小鼠維持超過假治療對照之皮質神經元之顯著1.2倍增加(p=0.05)。 經改良之髓鞘形成
使用無偏體視學定量假治療及AAV/Olig001-ASPA治療22週齡nur7腦之整個皮質中之皮質髓磷脂鹼性蛋白-陽性纖維長度密度(MBP-LD)，以便提供用AAV/Olig001-ASPA治療之後的髓鞘形成恢復度之指數。使用電腦產生探針，針對MBP陽性纖維，對運動及軀體感覺皮質進行取樣，以對3維組織空間中之各向同性探針纖維相互作用進行評分，並且皮質內之總MBP陽性纖維長度總和除以取樣組織之體積得到最終MBP長度密度(μm纖維/mm3 )(第 24 圖 )。當與年齡匹配野生型腦比較時，假nur7腦呈現皮質MBPLD之非常顯著的2倍減少(p=0.0001)。用所有三個劑量之AAV/Olig001-ASPA來治療導致相對於假對照之皮質MBP-LD之顯著增加，其中改良度與劑量成比例(2.5×1011 p=0.0014；7.5×1010 p=0.003；2.5×1010 p=0.016)。假治療及AAV/Olig001-ASPA治療之nur7小鼠腦用抗髓磷脂鹼性蛋白(MBP)染色(第 25 圖 )。
此等資料表現出康納丸氏病之小鼠模型之AAV/Olig001-ASPA治療改良平衡、握力及/或運動協調、運動功能，降低存在於腦中之NAA之量，降低腦之液泡化，增加Olig2及NeuN陽性細胞之數目並且恢復髓鞘形成。實例 6 ：康納丸氏基因療法之 CLARITY 輔助生物分佈
在呈現康納丸氏病表型之Nur7小鼠腦中之具有綠色螢光蛋白(GFP)轉基因之寡樹突細胞向性rAAV載體(Olig001)之生物分佈使用三維(3D)組織透明話及成像方法來評估。此允許對經由替代投與途徑(ROA)投與之Nur7小鼠半腦內之載體生物分佈進行整體表現及容積量測。比較腦室內(ICV)及腦實質內(IP) ROA之生物分佈功效，並且此方法用於補充自傳統的二維(2D)組織學評估獲得之習知體視學資料。
此實例展示3D方法之適用性，及其在評估康納丸氏病小鼠模型之成年鼠半腦中之AAV/Olig001-GFP生物分佈中之意義。結果呈現為光片顯微術資料之3D透明化腦影像及生物分佈估計之列出參數的視覺定性及定量表示。 樣品製備及成像
每個ROA之四隻成年小鼠(總共八隻)在6週齡接受5×1011 載體基因體(vg)/動物並且在給藥後兩週處死。接受並且製備用於3D組織透明化及體積光片顯微術成像的PFA固定之腦。將各腦矢狀平分並且對右半球進行使用CLARITY之組織透明化(Chung等人，Nature，2013)。各樣品以水凝膠包埋及聚合作用來同樣地製備，隨後使用商業裝置(X-Clarity, Logos Biosystems)、利用可商購獲得之試劑(Logos Biosystems)進行電泳組織透明化。獲得樣品處置期間之主要步驟之宏觀顯微照片以便記錄樣品狀況(第 26 圖 )。
各透明化半腦之完全3D顯微術成像使用Zeiss Z.1光片顯微鏡、使用5×放大率物鏡及涵蓋各半腦整體的基於並列之採集來執行。調整成像參數來偵測GFP表現並且在所有樣品中保持恆定以便在樣品中確保一致性並實現相對比較。在自組織透明化至影像採集及分析之相同條件下，對所有樣品進行處理並且成像。 影像處理及分析
使用各半腦之內部定製設計演算法，對原始資料集進行預處理並且重構成完全、無縫3D影像。最終影像各自包含一個半腦並且輸入至商用3D影像處理及分析程式(Imaris, Bitplane)中以進行整體、定量生物分佈分析。首先，計算全半腦體積內之整體平均及中值(GFP)訊號值。此外，選擇兩個GFP強度臨限值來指定「低」或「高」GFP表現(第 27 圖 )。然後，此等臨限值在所有樣品中保持恆定以獲得一致性。然後確定此等分類強度區域之體積並且與全半腦體積比較以產生「vol%高/低表現」(表3)。 結果
各半腦之宏觀顯微照片及完整3D成像揭示在兩個ROA中GFP表現之可變生物分佈模式(IP相比於ICV；第 28 圖及第 30 圖 )。另外，細胞型向性藉由視覺評定細胞形態及所確定的其空間位置來評估。雖然視載體蔓延範圍而定，此等生物分佈模式在樣品中為不同的，但是次區域轉導模式之類似性在樣品中仍然是一致的，諸如小腦中之柏京野細胞中之高表現。然後，對於各半腦，計算並列出『低』及『高』GFP表現之定量以及整體強度(表3)。與先前實例中之體視學評定一致，在ICV注射之後，在作為康納丸氏病之關鍵區域之皮質下白質內，透明化半腦顯示極好載體蔓延。另外，儘管IP注射產生高GFP強度之次區域，但是此等次區域中之大部分集中在注射部位附近，支持自體視學評定獲得之結論。表 3 . 4個ICV注射半腦之定量。
   平均強度 中值強度 以mm3 為單位之體積 Vol% 高表現 Vol% 低表現
ICV1 276 282 280 0.14% [0.39 mm3 ] 7.04% [19.72 mm3 ]
ICV2 428 287 330 2.69% [8.87 mm3 ] 30.94% [102.1 mm3 ]
ICV3 1348 931 250 27.86% [69.64 mm3 ] 97.82% [244.54 mm3 ]
ICV4 363 305 311 0.30% [0.92 mm3 ] 31.34% [97.47 mm3 ]
結論及意義
完整的組織透明化鼠腦之容積成像提供AAV/Olig001生物分佈之更綜合且整體的評定。實現分佈之完全採集及定量之定製演算法支持自體視學方法獲得之更高解析度定量。器官水準成像之評估提供保持3D空間結構及區域連接性的此生物分佈之總體評估。最終，在執行AAV/Olig001 ROA之額外評估來評估最佳轉導效率及細胞型特異性向性時，各種ROA之數位編譯可用于產生用於未來參考之數位『文庫』。實例 7 ： AAV 生物分佈及藥效學效應之基於 CLARITY 之體積評定
在此實例中，利用以上實例6中描述之CLARITY組織透明化技術來評估並展現在nur7小鼠腦中注射AAV/Olig001-ASPA之後，整體及局部轉基因介導之脫髓鞘之逆轉之藥理學效應。
簡言之，將nur7小鼠劃分成兩組並且以如上所述方式經由ICV或IP途徑來投與AAV/Olig001-ASPA (「Olig1」或「Olig1-ASPA」)或鹽水(「Nur7」)。然後以如上所述方式來分析兩組小鼠之腦以定量丘腦及小腦白質/橋腦中之液泡體積分率。亦分析野生型小鼠(「WT」)之腦作為對照組。結果展示於第 31 圖 中。更具體而言，第 31B 圖 中之箭頭指示nur7小鼠之丘腦區域表現出可見液泡化，其不存在於WT中並且在Olig1-ASPA治療組織中幾乎完全拯救。另外，如第 31C 圖 示出，在被動透明化一天之後，nur7小鼠組織達到比WT及Olig1-ASPA治療組織更高的透明度。此等結果證明AAV/Olig001-ASPA治療在nur7小鼠中減少腦之液泡化並且恢復髓鞘形成。
亦在來自具有類似解剖取向之所有三個組的3D影像之提取2D單一切片中執行細胞計數分析(第 32A 圖 )。如第 32B 圖 及第 32C 圖 示出，雖然平均細胞核密度(按照分割區域來正規化之計數)顯示皮質區域內之細胞密度之總體極少差異，但是Nur7組之小鼠在丘腦區域中具有顯著更低的總體細胞核密度/細胞核區域。相比之下，Olig1-ASPA組及WT組似乎在丘腦區域中具有類似總體細胞核密度或細胞核區域。此等結果證明nur7小鼠之AAV/Olig001-ASPA治療維持或增加丘腦區域中之細胞之數目至接近於WT組中所觀察到之水準。
以如上所述方式，對針對液泡化分析之腦進行處理以供MBP之免疫螢光染色，以鑑別寡樹突細胞。為此，執行3D容積分析以檢查藥效學治療效果。測定2 mm組織切片之完全3D體積並且計算SYTO (細胞核標記物)以及MBP之平均螢光強度。發現來自Nur7組之小鼠之組織表現出更低平均MBP螢光值。相比之下，Olig1-ASPA治療組具有增加的總體MBP訊號，幾乎達到WT組之水準(第 33B 圖 )。
執行額外3D容積分析，其中MBP體積經由訊號臨限值來計算。更限制性地以設定於超過2000之螢光值之臨限值(第 33C 圖 ，左圖)，或更具包含性地以1000之更臨限值(第 33C 圖 ，右圖)來執行臨限值。在兩種情況下，在Nur7組之小鼠中觀察到MBP缺陷(第 33D 圖 )。相比之下，在Olig1-ASPA組中並且尤其在使用較低臨限值時，明顯地發現MBP體積之增加，其中總體MBP體積值接近WT組之水準(第 33D 圖 )。
基於區域之分析在丘腦區域中以3D方式執行。區域之一部分的手動分割在第 33E 圖 中示出。此區域內之細胞核(SYTO)及髓磷脂(MBP)標記物之平均螢光強度在第 33F 圖 中示出。發現Olig1-ASPA組之SYTO及MBP水準幾乎達到WT組之水準。相比之下，Nur7樣品展示兩種標記物中之較低平均螢光值。亦對皮質之一部分執行基於區域之分析。第 33G 圖 及第 33H 圖 顯示在此皮質區域內細胞核(SYTO)及髓磷脂(MBP)標記物之平均螢光強度水準。總體趨勢類似於第 33F 圖 示出之趨勢。亦獲得皮質及丘腦區域中之3D細胞濃度(每100 um2 之細胞核)。如第 33I 圖 示出，Nur7組之小鼠中兩個區域中之總體細胞核濃度較低。相比之下，Olig1-ASPA組之小鼠之丘腦區域中之3D細胞濃度展示接近於WT組之水準的水準。
此等結果證明投與AAV/Olig001-ASPA拯救或逆轉nur7小鼠腦中之脫髓鞘及細胞損失。等效物
認為前述書面說明係足以能夠使熟習此項技術者來實踐本揭露。前述描述及實例詳述本揭露之某些示範性實施例。然而，應當理解，無論前述以文本形式表現得如何詳細，本揭露仍可以許多方式實踐，且應根據隨附申請專利範圍及其任何等同物解釋本揭露。
本文所引用之所有參考文獻，包括專利、專利申請案、論文、教科書及其類似者以及其中所引用之參考文獻，如果尚未被引用，則以全文引用之方式併入本文。 表4 序列
SEQ ID NO: 描述 序列
SEQ ID NO:1 密碼子最佳化ASPA - 原始 ATGACCTCCTGTCATATAGCCGAGGAGCACATCCAGAAAGTGGCCATTTTCGGCGGGACACATGGGAACGAGCTGACTGGCGTTTTCCTGGTCAAGCACTGGCTCGAAAATGGCGCGGAAATTCAGAGAACGGGCCTGGAGGTCAAACCTTTTATTACTAACCCCCGCGCGGTGAAGAAATGTACCCGGTACATCGACTGCGATCTTAACCGAATCTTTGATCTGGAAAATCTGGGAAAAAAAATGAGCGAGGACCTGCCCTACGAAGTCCGCAGAGCACAGGAGATTAATCATCTCTTCGGACCCAAGGACTCCGAGGACAGCTACGATATCATCTTCGACTTGCACAATACTACTTCCAATATGGGATGTACCTTGATACTGGAGGACTCACGAAATAACTTCTTGATTCAGATGTTCCATTACATCAAAACCTCTCTCGCTCCTCTCCCTTGCTACGTATATTTGATCGAGCACCCTAGTCTGAAATATGCCACTACACGAAGCATAGCTAAGTATCCCGTTGGTATTGAGGTGGGCCCCCAGCCCCAGGGAGTGCTGCGGGCTGACATCCTTGACCAGATGAGAAAAATGATCAAACACGCCCTTGACTTCATCCACCACTTTAATGAAGGCAAAGAGTTTCCTCCCTGTGCCATAGAGGTGTATAAAATCATCGAAAAAGTTGACTATCCACGGGATGAGAACGGCGAGATCGCTGCCATCATCCATCCCAATTTGCAAGATCAGGATTGGAAACCTTTGCACCCAGGCGACCCTATGTTCCTGACATTGGATGGCAAGACCATACCCCTGGGTGGTGATTGCACTGTGTACCCAGTTTTCGTAAACGAGGCAGCGTACTATGAAAAGAAAGAGGCATTTGCAAAAACCACTAAGTTGACACTGAATGCCAAGAGCATTAGATGCTGTCTTCATTAA   
SEQ ID NO:2 密碼子最佳化ASPA - 新 ATGACCTCCTGTCATATAGCCGAGGAGCACATCCAGAAAGTGGCCATTTTCGGCGGGACACACGGAAACGAACTTACAGGAGTGTTTCTGGTGAAACACTGGCTTGAAAATGGTGCGGAGATCCAAAGGACCGGCCTGGAGGTCAAACCTTTTATTACAAATCCCCGGGCGGTCAAGAAGTGCACACGGTACATTGATTGTGATCTTAATCGCATATTCGACCTGGAGAACCTTGGGAAGAAAATGTCTGAAGATCTGCCCTACGAAGTGAGGCGAGCACAAGAGATAAACCACCTGTTCGGACCGAAAGACAGTGAAGACTCCTATGACATCATTTTCGACCTGCACAACACTACGAGTAACATGGGGTGTACCCTGATCCTCGAAGACTCCCGAAACAATTTCCTGATACAGATGTTTCATTACATCAAAACTAGTCTGGCCCCTCTCCCCTGCTACGTTTATCTGATCGAACACCCTTCTCTCAAATACGCTACCACCCGCTCTATTGCTAAGTACCCCGTCGGGATCGAGGTCGGCCCACAACCTCAAGGTGTGCTCCGGGCCGATATTTTGGACCAGATGAGAAAGATGATTAAACACGCTCTCGACTTCATTCACCACTTTAACGAGGGGAAGGAATTTCCCCCTTGTGCCATCGAGGTTTATAAGATTATCGAGAAGGTGGACTACCCAAGAGACGAAAACGGGGAGATAGCTGCCATCATCCACCCTAATTTGCAAGATCAGGACTGGAAGCCCCTGCACCCAGGAGACCCCATGTTTCTGACCTTGGATGGAAAGACGATCCCCCTGGGCGGTGATTGTACAGTGTACCCAGTCTTTGTCAACGAGGCCGCTTACTATGAGAAAAAGGAGGCTTTTGCAAAGACAACAAAGCTCACTTTGAATGCAAAGTCCATCAGGTGCTGTCTGCACTAA   
SEQ ID NO:3 編碼野生型ASPA之核苷酸序列(NM_000049.4)    ATGACTTCTTGTCACATTGCTGAAGAACATATACAAAAGGTTGCTATCTTTGGAGGAACCCATGGGAATGAGCTAACCGGAGTATTTCTGGTTAAGCATTGGCTAGAGAATGGCGCTGAGATTCAGAGAACAGGGCTGGAGGTAAAACCATTTATTACTAACCCCAGAGCAGTGAAGAAGTGTACCAGATATATTGACTGTGACCTGAATCGCATTTTTGACCTTGAAAATCTTGGCAAAAAAATGTCAGAAGATTTGCCATATGAAGTGAGAAGGGCTCAAGAAATAAATCATTTATTTGGTCCAAAAGACAGTGAAGATTCCTATGACATTATTTTTGACCTTCACAACACCACCTCTAACATGGGGTGCACTCTTATTCTTGAGGATTCCAGGAATAACTTTTTAATTCAGATGTTTCATTACATTAAGACTTCTCTGGCTCCACTACCCTGCTACGTTTATCTGATTGAGCATCCTTCCCTCAAATATGCGACCACTCGTTCCATAGCCAAGTATCCTGTGGGTATAGAAGTTGGTCCTCAGCCTCAAGGGGTTCTGAGAGCTGATATCTTGGATCAAATGAGAAAAATGATTAAACATGCTCTTGATTTTATACATCATTTCAATGAAGGAAAAGAATTTCCTCCCTGCGCCATTGAGGTCTATAAAATTATAGAGAAAGTTGATTACCCCCGGGATGAAAATGGAGAAATTGCTGCTATCATCCATCCTAATCTGCAGGATCAAGACTGGAAACCACTGCATCCTGGGGATCCCATGTTTTTAACTCTTGATGGGAAGACGATCCCACTGGGCGGAGACTGTACCGTGTACCCCGTGTTTGTGAATGAGGCCGCATATTACGAAAAGAAAGAAGCTTTTGCAAAGACAACTAAACTAACGCTCAATGCAAAAAGTATTCGCTGCTGTTTACATTAG   
SEQ ID NO:4 人類野生型ASPA之胺基酸序列(NP_000040.1) MTSCHIAEEHIQKVAIFGGTHGNELTGVFLVKHWLENGAEIQRTGLEVKPFITNPRAVKKCTRYIDCDLNRIFDLENLGKKMSEDLPYEVRRAQEINHLFGPKDSEDSYDIIFDLHNTTSNMGCTLILEDSRNNFLIQMFHYIKTSLAPLPCYVYLIEHPSLKYATTRSIAKYPVGIEVGPQPQGVLRADILDQMRKMIKHALDFIHHFNEGKEFPPCAIEVYKIIEKVDYPRDENGEIAAIIHPNLQDQDWKPLHPGDPMFLTLDGKTIPLGGDCTVYPVFVNEAAYYEKKEAFAKTTKLTLNAKSIRCCLH   
SEQ ID NO:5 5' ITR CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG   
SEQ ID NO:6 CMV強化子 CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTTGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCAT   
SEQ ID NO:7 CBh啟動子 TCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG   
SEQ ID NO:8 CBA外顯子1 GGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGT   
SEQ ID NO:9 CBA內含子1 GTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGC
SEQ ID NO:10 MVM內含子 AAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGGAGCACCTGCCTGAAATCACTTTTTTTCAGGTTGG   
SEQ ID NO:11 BGH polyA CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAACAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
SEQ ID NO:12 3' ITR TCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTG   
SEQ ID NO:13 Olig001 (BNP61)殼體之核酸序列 ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCTCGGGCATCGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGGACATCGGGAGGAGCCACCAACGACAACACCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAGCTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACGCAGAATGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCGGAGTACCAGCTGCCGTACGTTCTCGGCTCTGCCCACCAGGGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCCCAGTACGGCTACCTAACACTCAACAACGGTAGTCAGGCCGTGGGACGCTCCTCCTTCTACTGCCTGGAATACTTTCCTTCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTCCAGTTTACTTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCCCACAGCCAGAGCTTGGACCGGCTGATGAATCCTCTGATTGACCAGTACCTGTACTACTTGTCTCGGACTCAAACAACAGGAGGCACGGCAAATACGCAGACTCTGGGCTTCAGCCAAGGTGGGCCTAATACAATGGCCAATCAGGCAAAGAACTGGCTGCCAGGACCCTGTTACCGCCAACAACGCGTCTCAACGACAACCGGGCAAAACAACAATAGCAACTTTGCCTGGACTGCTGGGACCAAATACCATCTGAATGGAAGAAATTCATTGGCTAATCCTGGCATCGCTATGGCAACACACAAAGACGACAAGGAGCGTTTTTTTCCCAGTAACGGGATCCTGATTTTTGGCAAACAAAATGCTGCCAGAGACAATGCGGATTACAGCGATGTCATGCTCACCAGCGAGGAAGAAATCAAAACCACTAACCCTGTGGCTACAGAGGAATACGGTATCGTGGCAGATAACTTGCAGCAGCAAAACACGGCTCCTCAAATTGGAACTGTCAACAGCCAGGGGGCCTTACCCGGTATGGTTTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGACGGCAACTTCCACCCGTCTCCGCTGATGGGCGGCTTTGGCCTGAAACATCCTCCGCCTCAGATCCTGATCAAGAACACGCCTGTACCTGCGGATCCTCCGACCACCTTCAACCAGTCAAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAATACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATTGAATGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCCGAGATCCAGTACACCTCCAACTACTACAAATCTACAAGTGTGGACTTTGCTGTTAATACAGAAGGCGTGTACTCTGAACCCCACCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTCCCCTGTAA   
SEQ ID NO:14 Olig001 (BNP61)殼體之胺基酸序列 MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDKERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPHPIGTRYLTRPL   
SEQ ID NO:15 Olig002 (BNP62)殼體之胺基酸序列 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDKERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPHPIGTRYLTRPL   
SEQ ID NO:16 Olig003 (BNP63)殼體之胺基酸序列 MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLQGDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGETGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDKERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPHPIGTRYLTRPL
SEQ ID NO:17 強化子 CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTGTGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG
SEQ ID NO:18 CBA外顯子1 GGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAG
SEQ ID NO:19 3'ITR CGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTG
SEQ ID NO:20 ASPA轉基因匣 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGGGTTCGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTGTGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCTGAGCAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGGAGCACCTGCCTGAAATCACTTTTTTTCAGGTTGGACCGGTATGACCTCCTGTCATATAGCCGAGGAGCACATCCAGAAAGTGGCCATTTTCGGCGGGACACACGGAAACGAACTTACAGGAGTGTTTCTGGTGAAACACTGGCTTGAAAATGGTGCGGAGATCCAAAGGACCGGCCTGGAGGTCAAACCTTTTATTACAAATCCCCGGGCGGTCAAGAAGTGCACACGGTACATTGATTGTGATCTTAATCGCATATTCGACCTGGAGAACCTTGGGAAGAAAATGTCTGAAGATCTGCCCTACGAAGTGAGGCGAGCACAAGAGATAAACCACCTGTTCGGACCGAAAGACAGTGAAGACTCCTATGACATCATTTTCGACCTGCACAACACTACGAGTAACATGGGGTGTACCCTGATCCTCGAAGACTCCCGAAACAATTTCCTGATACAGATGTTTCATTACATCAAAACTAGTCTGGCCCCTCTCCCCTGCTACGTTTATCTGATCGAACACCCTTCTCTCAAATACGCTACCACCCGCTCTATTGCTAAGTACCCCGTCGGGATCGAGGTCGGCCCACAACCTCAAGGTGTGCTCCGGGCCGATATTTTGGACCAGATGAGAAAGATGATTAAACACGCTCTCGACTTCATTCACCACTTTAACGAGGGGAAGGAATTTCCCCCTTGTGCCATCGAGGTTTATAAGATTATCGAGAAGGTGGACTACCCAAGAGACGAAAACGGGGAGATAGCTGCCATCATCCACCCTAATTTGCAAGATCAGGACTGGAAGCCCCTGCACCCAGGAGACCCCATGTTTCTGACCTTGGATGGAAAGACGATCCCCCTGGGCGGTGATTGTACAGTGTACCCAGTCTTTGTCAACGAGGCCGCTTACTATGAGAAAAAGGAGGCTTTTGCAAAGACAACAAAGCTCACTTTGAATGCAAAGTCCATCAGGTGCTGTCTGCACTAAGCGGCCGCGGGGATCCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAACAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTTTGGACGCGTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTG   
第 1 圖 描繪如在細胞中使用HPLC確定的NAA之示範性劑量反應減少，該等細胞用1.0 µg表現NAA合成酶(Nat8L)之質體轉染並且用1.0 µg、0.5 µg、0.2 µg或0.1 µg包含野生型人類ASPA序列(SEQ ID NO:3)或經修飾例如密碼子最佳化ASPA序列原始(型式1)(SEQ ID NO:1)或密碼子最佳化ASPA序列新(型式2)(SEQ ID NO:2)的質體來共轉染。第 2 圖 描繪藉由經由腦實質內(IP)投與途徑(ROA)來投與之rAAV載體所轉導之GFP陽性細胞之示範性取樣。在各感興趣之區域中對GFP陽性體細胞(箭頭)進行評分以產生轉導細胞之數目(N)之估計結果。第 3 圖 描繪在腦實質內(IP)投與AAV/Olig001-GFP之後，6週齡nur7小鼠之皮質、胼胝體及外囊之皮質下白質、紋狀體及小腦中之GFP陽性細胞(N )之示範性數目以及經由IP ROA投與1×1011 個AAV/Olig001-GFP載體基因體之小鼠之腦之矢狀切面中之自然GFP螢光之代表性影像，展示相鄰於注射部位之集中GFP表現。在144個切片中，使用分光器(k=4)產生N 之估計結果。呈現了各組(n=5只動物)之平均值+/- sem。各感興趣之區域內的劑量隊列之間的GFP陽性細胞數目之顯著差異藉由星號來指示。第 4 圖 描繪在鞘內(IT)投與AAV/Olig001-GFP之後，在6週齡nur7小鼠之皮質、皮質下白質、紋狀體及小腦中之GFP陽性細胞(N )之示範性數目以及經由鞘內(IT)ROA投與1×1011 個AAV/Olig001-GFP載體基因體之小鼠之腦之矢狀切面之自然GFP螢光之代表性影像，展示證明載體轉導之彌漫性皮質標記物表現及亦證明彼區域中細胞之轉導的適度白質束細胞表現。呈現了各組(n=5只動物)之平均值+/- sem。各感興趣之區域內的劑量隊列之間的GFP陽性細胞數目之顯著差異藉由星號來指示。第 5 圖 描繪在腦室內(ICV)投與AAV/Olig001-GFP之後，在6週齡nur7小鼠之皮質、皮質下白質、紋狀體及小腦中之GFP陽性細胞(N )之示範性數目以及經由ICV ROA來投與1×1011 個AAV/Olig001-GFP載體基因體之小鼠之腦之矢狀切面中之自然GFP螢光之代表性影像，展示證明彼區域中細胞載體之轉導的強白質束GFP表現。呈現了各組(n=5只動物)之平均值+/- sem。各感興趣之區域內的劑量隊列之間的GFP陽性細胞數目之顯著差異藉由星號來指示。第 6 圖 描繪在大池內(ICM)投與AAV/Olig001-GFP之後，在6週齡nur7小鼠之皮質、皮質下白質、紋狀體及小腦中之GFP陽性細胞(N )之示範性數目以及經由ICM ROA來投與1×1011 個AAV/Olig001-GFP載體基因體之小鼠之腦之矢狀切面中之自然GFP螢光之代表性影像，展示證明彼區域中細胞之轉導的適度白質束GFP標記物表現。呈現了各組(n=5只動物)之平均值+/- sem。各感興趣之區域內的劑量隊列之間的GFP陽性細胞數目之顯著差異藉由星號來指示。第 7 圖 描繪對於藉由4種不同投與途徑(IP、IT、ICV及ICM)投與至各動物之1×1011 vg劑量，在四個感興趣之區域中之示範性AAV/Olig001-GFP轉導效率之直接比較：皮質、皮質下白質、紋狀體及小腦以及橫向於腦實質內及腦室內之注射部位之切片中之自然GFP螢光之代表性影像。在ICV腦橫向切片中，皮質及皮質下白質束轉基因陽性細胞數量更多。對於各組，n=5只動物，以平均值+/- sem。個別感興趣之區域之間GFP陽性細胞數目之顯著差異藉由星號來指示(* p＜0.05，** p＜0.01及***p＜0.001)。第 8 圖 描繪在腦實質內(IP)、鞘內(IT)、腦室內(ICV)及大池內(ICM)載體投與之後，6週齡nur7小鼠之皮質中之AAV/Olig001-GFP之示範性寡向性。皮質切片藉由IHC使用Olig2及NeuN抗體分析。對於各組，n=5只動物，以與各指示抗原共標記之平均百分比+/- sem。星號指示組之間的顯著差異。第 9 圖 描繪在腦實質內(IP)、鞘內(IT)、腦室內(ICV)及大池內(ICM)載體投與之後，6週齡nur7小鼠之皮質下白質中之AAV/Olig001-GFP之示範性寡向性。皮質下白質之切片藉由IHC使用Olig2及NeuN抗體分析。對於各組，n=5只動物，以與各指示抗原共標記之平均百分比+/- sem。第 10 圖 描繪在腦實質內(IP)、鞘內(IT)、腦室內(ICV)及大池內(ICM)載體投與之後，6週齡nur7小鼠之紋狀體物質中之AAV/Olig001-GFP之示範性寡向性，其中標記物偵測證明藉由載體之細胞轉導。紋狀體物質之切片藉由IHC使用Olig2及NeuN抗體分析。對於各組，n=5只動物，以與各指示抗原共標記之平均百分比+/- sem。第 11 圖 描繪在腦實質內(IP)、鞘內(IT)、腦室內(ICV)及大池內(ICM)載體投與之後，6週齡nur7小鼠之小腦中之AAV/Olig001-GFP之示範性寡向性，其中標記物偵測證明藉由載體之轉導。小腦切片藉由IHC使用Olig2及NeuN抗體分析。對於各組，n=5只動物，以與各指示抗原共標記之平均百分比+/- sem。第 12 圖 描繪ICV投與1×1011 個載體基因體後2週，年齡匹配野生型(WT)及nur7小鼠腦之皮質及皮質下白質中AAV/Olig001-GFP轉導之示範性效率以及投與AAV/Olig001-GFP之後野生型腦中之自然GFP螢光之代表性影像，展示相對受限之表現，並且由此證明藉由載體之轉導，尤其在皮質下白質中。對於各組，n=5只動物，每組平均GFP陽性細胞數目+/- sem，*p＜0.05，** p＜0.01。第 13 圖 描繪編碼密碼子最佳化ASPA編碼序列及調控元件之表現質體。第 14 圖 描繪AAV/Olig001-ASPA治療(在三個劑量水準下)、野生型及nur7假治療小鼠之生活中研究期之過程中之示範性滾輪掉落等待時間。資料呈現為平均值+/- sem，其中每組n=12只動物。第 15 圖 描繪在野生型(WT)小鼠、AAV/Olig001-ASPA治療(在三個劑量水準下)及假治療nur7小鼠之生活中研究期之過程中的示範性開放空間活動。資料呈現為平均值+/- sem，其中每組n=12只動物。第 16 圖 描繪野生型(WT)、nur7假治療及AAV/Olig001-ASPA治療(在三個劑量水準下)小鼠腦之示範性NAA含量。資料表示為平均值+/- sem。NAA表示為每公克濕組織重量之毫莫耳數(每組n=6只動物)。AAV/Olig001-ASPA之劑量在x軸上指示。第 17 圖 描繪在22週齡評定的在3個不同劑量水準下用AAV/Olig001-ASPA治療之nur7小鼠之示範性平均每mg腦組織之載體基因體拷貝數(vg/mg)。平均vg/mg值呈現為+/-sem(n=6只動物/劑量隊列)。第 18 圖 描繪nur7假治療、AAV/Olig001-ASPA治療nur7及野生型小鼠之代表性H&E染色腦切片，展示液泡化區域。第 19 圖 描繪作為22週齡假治療及AAV/Olig001-ASPA治療nur7小鼠之腦之丘腦及腦白質/橋腦之感興趣之區域(ROI)之百分比的示範性液泡體積分率。星號指示組之間的顯著差異。第 20 圖 描繪針對證明寡樹突細胞之Olig2染色的假治療及AAV/Olig001-ASPA治療(2.5×1011 vg劑量) nur7小鼠丘腦及皮質之代表性影像。第 21 圖 描繪22週齡野生型、假治療及AAV/Olig001-ASPA治療nur7小鼠之丘腦及皮質中之Olig2陽性細胞之示範性計數。資料表示為平均Olig2陽性細胞+/- sem (每組n=6只動物)。星號指示組之間的顯著差異。第 22 圖 描繪針對NeuN來染色之假治療及AAV/Olig001-ASPA治療(2.5×1011 vg劑量) nur7小鼠丘腦及皮質之代表性影像。第 23 圖 描繪22週齡野生型、假治療及AAV/Olig001-ASPA治療nur7小鼠之丘腦及皮質中之NeuN陽性細胞之示範性計數。資料表示為平均NeuN陽性細胞+/- sem (每組n=6只動物)。星號指示組之間的顯著差異。第 24 圖 描繪針對髓磷脂鹼性蛋白(MBP)染色之假治療及AAV/Olig001-ASPA治療(2.5×1011 vg劑量) nur7小鼠皮質之代表性影像。第 25 圖 描繪野生型、假治療及AAV/001-ASPA治療nur7小鼠皮質中之示範性髓磷脂鹼性蛋白陽性纖維長度密度(MBP-LD)(µm/mm3 )。資料表示為平均MBP-LD +/- sem (每組n=6只動物)。星號指示組之間的顯著差異。第 26 圖 描繪初始固定的預透明化樣品、組織透明化後樣品、3D GFP螢光影像、半腦體積分割分析及強度熱圖(自左至右)之ICV注射小鼠之示範性腦影像。第 27 圖 描繪所有四個ICV注射半腦之強度熱圖。計算全半腦體積並且表示為灰色區域。計算「低」GFP強度在灰色區域中指示；「高」GFP強度在白色區域中指示。第 28 圖 描繪經由ICV相對於IP投與途徑投與AAV/Oligo001-GFP之動物之透明化腦的3D光片GFP螢光顯微術影像。第 29A 圖 描繪代表性高放大率影像，其示出與Olig2或NeuN共標記之GFP陽性細胞之評分。在各視場中對總GFP細胞進行評分，並且在相同場中對Olig2及NeuN共標記之百分比進行評分。第 29B 圖 描繪經由ICV ROA給予AAV/Olig001-GFP之動物之腦之SCWM束細胞中之GFP與Olig2共標記的代表性影像並且證明接近100%寡向性及幾乎完全不存在趨神經性。第 29C 圖 描繪大柏京野神經元中之小腦GFP轉基因表現之代表性影像，在白質中具有稀疏Olig2共標記(箭頭)。第 29D 圖 描繪在ICV ROA腦之紋狀體中之GFP與Olig2共標記的代表性影像，顯示出與小腦向性之對比。第 29E 圖 描繪在處理BrdU標記及Olig2之後，8週nur7及年齡匹配野生型初始腦中之白質束之代表性影像。第 29F 圖 描繪2週及8週野生型及nur7白質束中之BrdU細胞之示範性計數。呈現了每組之平均BrdU陽性細胞+/-sem。對於各組(各年齡之基因型)，n=6。第 29G 圖 描繪經由ICV ROA用AAV/Olig001-GFP治療之nur7腦之皮質下白質中之BrdU/GFP共標記細胞之代表性影像。第 30A 、 30B 及 30C 圖 描述生物分佈容積分析。(A) ICV及IP成像之組織之體積。(B)在兩種ROA下之平均及中值GFP螢光強度。(C)表示ROA下之低及高強度之體積GFP陽性的分率。第 31A 、 31B 及 31C 圖 描述藥效學效應評估之CLARITY及SWITCH工作流程。(A)組織透明化及標記方法。自左至右：完整小鼠腦、透明化之前的右半腦之中央2 mm切片、在被動透明化1天之後及被動透明化3天之後的相同組織以及顯示先前標記蛋白之螢光訊息的3D影像(綠色：細胞核，紅色：髓磷脂鹼性蛋白(MBP))。(B) Nur7、WT及Olig1-ASPA治療組織之代表性2 mm切片。各影像中之紅色箭頭指示丘腦區域。(C)被動透明化一天之後的組織透明度。第 32A 、 32B 及 32C 圖 描述組織的基於2D區域之細胞計數。(A)來自具有類似解剖取向之所有三個組的3D影像之所提取2D單一切片。紅色方框標識丘腦及皮質區域中的其中執行細胞計數之區域。(B)自(A)中之紅色方框放大之影像資料，及相應細胞分割。(C)平均細胞核密度(計數按照分割區域來正規化)。第 33A 、 33B 、 33C 、 33D 、 33E 、 33F 、 33G 、 33H 及 33I 圖 描述藥效學治療效果之3D容積分析。(A)確定2 mm組織切片之完全3D體積。(B)在3D體積內計算之平均螢光強度。(C)經由設定於超過2000之螢光值處之更具限制性臨限值(左圖)或1000處之更具包含性臨限值(左圖)的MBP表徵。(D)在兩種情況下，可觀察到Nur7中之MBP缺乏。Olig1-ASPA組之效應可以在較低臨限值中看出，其中總體值接近WT水準。(E)丘腦區域中的基於區域之3D分析，其中區域之一部分的手動分割以黃色來示出。(F)此區域內之細胞核(SYTO)及髓磷脂(MBP)標記物之平均螢光。(G)皮質之一部分上之基於區域之分析，其中手動分割以黃色來示出。(H)此皮質區域內之細胞核(SYTO)及髓磷脂(MBP)標記物之平均螢光。(I) 3D細胞濃度(細胞核/100 um2 )。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
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Claims (40)

  1. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經分離核酸，包含與核酸序列SEQ ID NO:2有至少約80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致性的核酸序列。
  2. 一種編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸，包含與核酸序列SEQ ID NO:2有至少約80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致性的核酸序列。
  3. 一種包含編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸的載體基因體，該經修飾核酸包含與核酸序列SEQ ID NO:2有至少約80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致性的核酸序列。
  4. 如請求項3所述之載體基因體，其中該載體基因體為重組腺相關病毒(rAAV)載體基因體。
  5. 如請求項3或4所述之載體基因體，其中該載體基因體為自身互補的。
  6. 一種重組腺相關病毒(rAAV)載體，包含：包含經修飾核酸之載體基因體，該經修飾核酸包含與核酸序列SEQ ID NO:2有至少約80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致性的核酸序列；及殼體，選自由以下殼體組成之群：Olig001、Olig002、Olig003、AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAVhu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAV2i8、AAV2G9、AAV2i8G9、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-DJ/9及AAV-LK03。
  7. 如請求項6所述之rAAV載體，其中該殼體為Olig001、Olig002或Olig003殼體。
  8. 如請求項6或7所述之rAAV載體，其中該殼體為包含病毒蛋白1 (VP1)之Olig001殼體並且其中該VP1包含與胺基酸序列SEQ ID NO:14有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。
  9. 如請求項6-8中任一項所述之rAAV載體，其中該殼體為包含VP1之Oligo001殼體並且其中該VP1包含胺基酸序列SEQ ID NO:14。
  10. 如請求項6-9中任一項所述之rAAV載體，其中該載體基因體為自身互補的。
  11. 如請求項6-10中任一項所述之rAAV載體，其中該載體基因體進一步包含至少一個選自由以下組成之群的元件：至少一個AAV反向末端重複(ITR)序列、強化子、啟動子、外顯子、內含子及多腺苷酸化(polyA)訊息序列。
  12. 如請求項6-11中任一項所述之rAAV載體，其中該載體基因體進一步包含至少一個選自由以下組成之群的元件：至少一個AAV2 ITR、巨細胞病毒(CMV)強化子、雜合形式之CBA啟動子(CBh啟動子)、雞β-肌動蛋白(CBA)外顯子、CBA內含子、小鼠微小病毒(MVM)內含子及牛生長激素(BGH) polyA。
  13. 如請求項6-12中任一項所述之rAAV載體，其中該載體基因體進一步包含至少一個選自由以下組成之群的元件：至少一個包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19之ITR；包含核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17之強化子；包含核酸序列SEQ ID NO:7之啟動子；包含核酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18之外顯子；包含核酸序列SEQ ID NO:9之內含子；包含核酸序列SEQ ID NO:10之內含子；及包含核酸序列SEQ ID NO:11之polyA。
  14. 一種包含載體基因體之rAAV載體，該載體基因體自5'至3'包含： a) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19之AAV反向末端重複序列(ITR)； b) 包含核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17之強化子； c) 包含核酸序列SEQ ID NO:7之啟動子； d) 包含核酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18之外顯子； e) 包含核酸序列SEQ ID NO:9之內含子； f) 包含核酸序列SEQ ID NO:10之內含子； g) 包含核酸序列SEQ ID NO:2之編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸 h) 包含核酸序列SEQ ID NO:11之polyA；及 i) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19之AAV ITR。
  15. 如請求項14所述之rAAV載體，其中該核酸為自身互補的。
  16. 如請求項14或15所述之rAAV載體，其中該載體包含有包含病毒蛋白1 (VP1)之Olig001殼體並且其中該VP1包含胺基酸序列SEQ ID NO:14。
  17. 一種rAAV載體，其包含：包含病毒蛋白1 (VP1)之Olig001殼體並且其中該VP1包含胺基酸序列SEQ ID NO:14；及自身互補核酸，自5'至3'包含： a) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19之AAV2反向末端重複序列(ITR)； b) 包含核酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17之CMV強化子； c) 包含核酸序列SEQ ID NO:7之CBh啟動子； d) 包含核酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18之CBA外顯子1； e) 包含核酸序列SEQ ID NO:9之CBA內含子1； f) 包含核酸序列SEQ ID NO:10之MMV內含子； g) 包含核酸序列SEQ ID NO:2之編碼天冬胺酸醯基轉移酶(ASPA)之經修飾核酸； h) 包含核酸序列SEQ ID NO:11之BGH polyA；及 i) 包含核酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19之AAV2 ITR。
  18. 一種醫藥組合物，其包含如請求項6-17中任一項所述之rAAV載體。
  19. 一種治療及/或預防與ASPA之缺陷或功能障礙相關之疾病、病症或病狀的方法，該方法包括投與治療有效量的如請求項6-17中任一項所述之rAAV載體或如請求項17所述之醫藥組合物。
  20. 如請求項19所述之方法，其中與ASPA之缺陷或功能障礙相關之該疾病、病症或病狀為康納丸氏病。
  21. 如請求項19或20之方法，其中該rAAV載體直接投與至腦及/或中樞神經系統。
  22. 如請求項19-21中任一項所述之方法，其中該rAAV載體投與至選自由以下組成之群的中樞神經系統之區域：腦實質、脊髓管、蜘蛛膜下腔、腦室、大池及其組合。
  23. 如請求項19-22中任一項所述之方法，其中該rAAV載體藉由選自由以下組成之群的方法來投與：腦實質內投與、鞘內投與、腦室內投與、大池內投與及其組合。
  24. 一種宿主細胞，其包含如請求項1所述之經分離核酸、如請求項2所述之經修飾核酸、如請求項3-5中任一項所述之載體基因體或如請求項6-17中任一項所述之rAAV載體。
  25. 如請求項24所述之宿主細胞，其中該細胞選自由以下組成之群：VERO、WI38、MRC5、A549、HEK293、B-50或任何其他HeLa細胞、HepG2、Saos-2、HuH7及HT1080。
  26. 如請求項25所述之宿主細胞，其中該細胞為適於在懸浮培養物中生長的HEK293細胞。
  27. 如請求項26所述之宿主細胞，其中該細胞為具有美國菌種保藏中心(ATCC)第PTA 13274號之HEK293細胞。
  28. 如請求項25-27中任一項所述之宿主細胞，其中該細胞包含至少一種核酸，其編碼至少一種選自由以下組成之群的蛋白：AAV rep蛋白、AAV殼體(Cap)蛋白、腺病毒(Ad)早期區1A (E1a)蛋白、Ad E1b蛋白、Ad E2a蛋白、Ad E4蛋白及病毒相關(VA) RNA。
  29. 一種用於治療康納丸氏病(CD)之套組，其包含治療有效量的如請求項1所述之經分離核酸、如請求項2所述之經修飾核酸、如請求項3-5中任一項所述之載體基因體、如請求項6-17中任一項所述之rAAV載體或如請求項18所述之醫藥組合物。
  30. 如請求項29所述之套組，其中該套組進一步包含標籤或插頁，包括使用套組部件中之一或多者的說明書。
  31. 如請求項1所述之經分離核酸、如請求項2所述之經修飾核酸、如請求項3-5中任一項所述之載體、如請求項6-17中任一項所述之rAAV載體或如請求項18所述之醫藥組合物，用於治療或預防與ASPA之缺陷或功能障礙相關之疾病、病症或病狀。
  32. 如請求項31所述之所用之經分離核酸、經修飾核酸、載體基因體、rAAV載體或醫藥組合物，其中該疾病、病症或病狀為康納丸氏病。
  33. 如請求項1所述之經分離核酸、如請求項2所述之經修飾核酸、如請求項3-5中任一項所述之載體或如請求項6-17中任一項所述之rAAV載體在製造用於治療及/或預防與ASPA之缺陷或功能障礙相關之疾病、病症或病狀之藥物中之用途。
  34. 如請求項33所述之用途，其中該疾病、病症或病狀為康納丸氏病。
  35. 一種確定受試者之腦中轉基因之生物分佈的方法，其中該轉基因自包含Olig001殼體之rAAV載體表現，該方法包含 a) 藉由腦室內(ICV)注射或腦實質內(IP)注射將該rAAV載體投與至該受試者； b) 固定腦； c) 對腦進行電泳透明化； d) 對腦組織切片進行3D微觀成像； e) 定量轉基因表現。
  36. 如請求項35所述之方法，其中該轉基因編碼標記物並且其中該標記物為綠色螢光蛋白(GFP)。
  37. 如請求項35所述之方法，其中該轉基因編碼ASPA。
  38. 如請求項35-37中任一項所述之方法，其中該轉基因表現與rAAV載體轉導效率相關。
  39. 如請求項35-38中任一項所述之方法，進一步包含步驟(f)，其包含藉由評定細胞形態及空間位置確定來評估細胞型向性。
  40. 如請求項35-39中任一項所述之方法，進一步包含轉基因表現之立體渲染。
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