CN115461066A - 用于基因疗法的编码天冬氨酸酰化酶(aspa)的经修饰的核酸和载体 - Google Patents

用于基因疗法的编码天冬氨酸酰化酶(aspa)的经修饰的核酸和载体 Download PDF

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Abstract

本公开涉及包含编码天冬氨酸酰化酶(ASPA)的经修饰的核酸的重组核酸和基因疗法载体及其变体，其用于治疗与ASPA的缺陷或功能障碍相关的疾病和病症，尤其是卡纳万病。

Description

用于基因疗法的编码天冬氨酸酰化酶(ASPA)的经修饰的核酸 和载体
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月28日提交的美国临时申请第63/016,507号及2020年9月11日提交的美国临时申请第63/077,144号的优先权。这些申请的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及编码天冬氨酸酰化酶(ASPA)的经修饰的核酸，使用编码ASPA的经修饰的核酸的方法，包含编码ASPA的经修饰的核酸的载体，以及载体在治疗与功能性ASPA水平减少相关的疾病、病症和病况(包括与N-乙酰基-L-天冬氨酸的细胞分解代谢减弱相关的疾病、病症和病况，例如卡纳万病(Canavan disease))中的用途。
背景技术
卡纳万病(CD)与编码天冬氨酸酰化酶(ASPA)(也称为氨基酰化酶2)的ASPA基因的表达减少和/或突变相关。天冬氨酸酰化酶活性减少导致由于NAA至天冬氨酸盐和乙酸盐的转化减少所引起的N-乙酰天冬氨酸(NAA)(也称为N-乙酰-L-天冬氨酸)的积累。ASPA酶涉及维持髓鞘形成性细胞的代谢完整性。在脑中，ASPA基因的表达主要限于产生白质的少突胶质细胞(oligodendrocyte)。NAA在脑中的积累与少突胶质细胞功能障碍、以及髓鞘的发育的干扰、以及与神经元相关的现有髓鞘的破坏相关。
CD是常染色体隐性遗传性疾病并且主要以新生儿/婴儿形式呈现。受此形式影响的儿童在婴儿期呈现与脑和脊髓中的髓磷脂退化相关的症状。症状包括智力障碍、先前获得的运动技能丧失、进食困难、肌肉张力异常、畸形巨头、瘫痪和癫痫发作。对于患有新生儿/婴儿CD的儿童而言，预期寿命通常限于前十年。患有轻度/青少年形式的CD的个体可能展现出语言及运动技能发育迟缓，并且具有平均寿命。
迄今为止，尚不存在用于停止或减慢CD的神经退行性作用的治疗方法。当前在临床使用中或正在评估中的治疗方法旨在减轻症状并最大限度地提高生活质量。物理疗法、喂食管和抗癫痫药物可用于治疗一些症状并提高生活质量。因此，非常需要治疗CD的新型治疗方法。
发明概述
本文公开并举例说明了编码天冬氨酸酰化酶(ASPA)的经修饰的核酸、以及包含经修饰的核酸的载体(例如，rAAV载体)、以及通过向有此需要的患者施用经修饰的核酸或包含经修饰的核酸的载体来治疗由ASPA蛋白的水平减少所介导的疾病、病症或病况的方法。
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等效物。此类等效物旨在由以下实施方案(E)涵盖。
E1.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的分离的核酸，其包含与SEQ ID NO:2的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E2.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的分离的核酸，其包含含有或组成为SEQID NO:2的序列的核酸序列。
E3.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的分离的核酸，其包含与SEQ ID NO:1的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E4.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的分离的核酸，其包含含有或组成为SEQID NO:1的序列的核酸序列。
E5.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的分离的核酸，其包含与SEQ ID NO:3的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E6.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的分离的核酸，其包含含有或组成为SEQID NO:3的序列的核酸序列。
E7.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸，其包含与SEQ ID NO:2的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E8.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸，其包含含有或组成为SEQ ID NO:2的序列的核酸序列。
E9.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸，其包含与SEQ ID NO:1的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E10.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸，其包含含有或组成为SEQ ID NO:1的序列的核酸序列。
E11.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸，其包含与SEQ ID NO:3的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E12.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸，其包含含有或组成为SEQ ID NO:3的序列的核酸序列。
E13.一种包含编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸的重组核酸，该经修饰的核酸包含与SEQ ID NO:2的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E14.一种包含编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸的重组核酸，该经修饰的核酸包含或组成为SEQ ID NO:2的核酸序列。
E15.一种包含编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸的重组核酸，该经修饰的核酸包含与SEQ ID NO:1的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E16.一种包含编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸的重组核酸，该经修饰的核酸包含或组成为SEQ ID NO:1的核酸序列。
E17.一种包含编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸的重组核酸，该经修饰的核酸包含与SEQ ID NO:3的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E18.一种包含编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸的重组核酸，该经修饰的核酸包含或组成为SEQ ID NO:3的核酸序列。
E19.如E13-E18中任一项所述的重组核酸，其进一步包含至少一个选自以下的元件：增强子、启动子、外显子、内含子和多聚腺苷酸化(polyA)信号序列。
E20.如E19所述的重组核酸，其中该增强子包含与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:17或两者的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E21.如E19-E20中任一项所述的重组核酸，其中该增强子包含或组成为SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:17或两者的核酸序列。
E22.如E19-E21中任一项所述的重组核酸，其中该启动子是组成型的或受调控的。
E23.如E19-E22中任一项所述的重组核酸，其中该启动子是可诱导的或可抑制的。
E24.如E19-E23中任一项所述的重组核酸，其中该启动子包含与SEQ ID NO:7的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E25.如E19-E24中任一项所述的重组核酸，其中该启动子包含或组成为SEQ IDNO:7的核酸序列。
E26.如E19-E25中任一项所述的重组核酸，其中该外显子包含与SEQ ID NO:8、SEQID NO:18或两者的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E27.如E19-E26中任一项所述的重组核酸，其中该外显子包含或组成为SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:18或两者的核酸序列。
E28.如E19-E27中任一项所述的重组核酸，其中该内含子包含与SEQ ID NO:9、SEQID NO:10或两者的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E29.如E19-E28中任一项所述的重组核酸，其中该内含子包含或组成为SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10或两者的核酸序列。
E30.如E19-E29中任一项所述的重组核酸，其中该polyA序列包含与SEQ ID NO:11的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E31.如E19-E30中任一项所述的重组核酸，其中该polyA序列包含或组成为SEQ IDNO:11的核酸序列。
E32.如E19-E31中任一项所述的重组核酸，其中该增强子可操作地连接至该经修饰的核酸。
E33.如E19-E32中任一项所述的重组核酸，其中该启动子可操作地连接至该经修饰的核酸。
E34.如E13-E18中任一项所述的重组核酸，其进一步包含至少一个选自以下的元件：巨细胞病毒(CMV)增强子、杂合形式的CBA启动子(CBh启动子)、鸡β-肌动蛋白(CBA)外显子、CBA内含子、小鼠微小病毒(MVM)内含子和牛生长激素(BGH)polyA。
E35.如E13-E18中任一项所述的重组核酸，其进一步包含至少一个选自以下的元件：包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列的CMV增强子；包含SEQ ID NO:7的核酸序列的CBh启动子；包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18的核酸序列的CBA外显子；包含SEQ IDNO:9的核酸序列的CBA内含子、包含SEQ ID NO:10的核酸序列的MMV内含子和包含SEQ IDNO:11的核酸序列的BGH polyA。
E36.一种载体基因组，其包含如E7-E12中任一项所述的经修饰的核酸或如E13-E35中任一项所述的重组核酸，其中该载体基因组进一步包含至少一个AAV ITR重复序列，该至少一个AAV ITR重复序列包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或两者的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E37.如E36所述的载体基因组，其中该至少一个AAV ITR重复序列包含或组成为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列或其组合。
E38.如E36或E37所述的载体基因组，其包含侧接编码ASPA的核酸序列的两个AAV2ITR序列和在编码ASPA的序列上游的CBh启动子。
E39.如E36-E38中任一项所述的载体基因组，其中该ASPA序列包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
E40.如E36-E39中任一项所述的载体基因组，其中该至少一个AAV2ITR序列包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列或其组合。
E41.如E36-E40中任一项所述的载体基因组，其中该CBh启动子包含SEQ ID NO:7的核酸序列。
E42.一种包含核酸的载体基因组，其中该核酸自5’至3’包含：
a)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19的核酸序列的AAV2 ITR；
b)包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17，优选SEQ ID NO:6的核酸序列的CMV增强子；
c)包含SEQ ID NO:7的核酸序列的CBh启动子；
d)包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18，优选SEQ ID NO:18的核酸序列的CBA外显子；
e)包含SEQ ID NO:9的核酸序列的CBA内含子；
f)包含SEQ ID NO:10的核酸序列的MMV内含子；
g)包含SEQ ID NO:1-3中任一项的核酸序列的编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸；
h)包含SEQ ID NO:11的核酸序列的BGH polyA；和
i)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列的AAV2 ITR。
E43.一种包含核酸的载体基因组，其中该核酸自5’至3’包含：
a)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19的核酸序列的AAV ITR；
b)包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17，优选SEQ ID NO:6的核酸序列的增强子；
c)包含SEQ ID NO:7的核酸序列的启动子；
d)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18，优选SEQ ID NO:18的核酸序列的外显子；
e)包含SEQ ID NO:9的核酸序列的内含子；
f)包含SEQ ID NO:10的核酸序列的内含子；
g)包含SEQ ID NO:1-3中任一项的核酸序列的编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸；
h)包含SEQ ID NO:11的核酸序列的PolyA；和
i)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19的核酸序列的AAV末端重复序列。
E44.如E36-43中任一项所述的载体基因组，其中该载体基因组是自身互补的。
E45.一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含如E36-E44中任一项所述的载体基因组和衣壳。
E46.一种包含载体基因组的rAAV载体，该载体基因组包含与SEQ ID NO:2的核酸序列约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E47.如E46所述的rAAV载体，其包含选自以下的衣壳：Olig001、Olig002、Olig003、AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAVhu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAV2i8、AAV2G9、AAV2i8G9、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N和AAV-LK03的衣壳。
E48.一种包含载体基因组的rAAV载体，该载体基因组包含与SEQ ID NO:1的核酸序列约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E49.如E48所述的rAAV载体，其包含选自以下的衣壳：Olig001、Olig002、Olig003、AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAVhu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAV2i8、AAV2G9、AAV2i8G9、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N和AAV-LK03的衣壳。
E50.一种包含载体基因组的rAAV载体，该载体基因组包含与SEQ ID NO:3的核酸序列约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。
E51.如E50所述的rAAV载体，其包含选自以下的衣壳：Olig001、Olig002、Olig003、AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAVhu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAV2i8、AAV2G9、AAV2i8G9、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N和AAV-LK03的衣壳。
E52.如E45-E51中任一项所述的rAAV载体，其中该衣壳选自Olig001、Olig002和Olig003衣壳。
E53.如E45-E52中任一项所述的rAAV载体，其中该衣壳是包含病毒蛋白1(VP1)的Olig001衣壳并且其中该VP1包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
E54.如E45-E53中任一项所述的rAAV载体，其中该衣壳是包含病毒蛋白1(VP1)的Oligo001衣壳并且其中该VP1包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
E55.如E45-E52中任一项所述的rAAV载体，其中该衣壳是包含病毒蛋白1(VP1)的Olig002衣壳并且其中该VP1包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
E56.如E45-E52和E55中任一项所述的rAAV载体，其中该衣壳是包含病毒蛋白1(VP1)的Oligo002衣壳并且其中该VP1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
E57.如E45-E52中任一项所述的rAAV载体，其中该衣壳是包含病毒蛋白1(VP1)的Olig003衣壳并且其中该VP1包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
E58.如E46-E52和E57中任一项所述的rAAV载体，其中该衣壳是包含病毒蛋白1(VP1)的Oligo003衣壳并且其中该VP1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
E59.如E45-E58中任一项所述的rAAV载体，其中该载体基因组是自身互补的。
E60.如E46-E59中任一项所述的rAAV载体，其中该载体基因组包含至少一个选自以下的元件：至少一个AAV反向末端重复(ITR)序列、增强子、启动子、外显子、内含子和多聚腺苷酸化(polyA)信号序列。
E61.如E60所述的rAAV载体，其中该增强子包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100相同的核酸序列。
E62.如E60或E61所述的rAAV载体，其中该增强子包含或组成为SEQ ID NO:6或SEQID NO:17的核酸序列。
E63.如E60-E62中任一项所述的rAAV载体，其中该启动子是组成型的或受调控的。
E64.如E60-E63中任一项所述的rAAV载体，其中该启动子是可诱导的或可抑制的。
E65.如E60-E64中任一项所述的rAAV载体，其中该启动子包含与SEQ ID NO:7的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸序列。
E66.如E60-E65中任一项所述的rAAV载体，其中该启动子包含或组成为SEQ IDNO:7的核酸序列。
E67.如E60-E66中任一项所述的rAAV载体，其中该外显子包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸序列。
E68.如E60-E67中任一项所述的rAAV载体，其中该外显子包含或组成为SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:18的核酸序列。
E69.如E60-E68中任一项所述的rAAV载体，其中该内含子包含与SEQ ID NO:9、SEQID NO:10或两者的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸序列。
E70.如E60-E69中任一项所述的rAAV载体，其中该内含子包含或组成为SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10或两者的核酸序列。
E71.如E60-E70中任一项所述的rAAV载体，其中该polyA序列包含与SEQ ID NO:11的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸序列。
E72.如E60-E71中任一项所述的rAAV载体，其中该polyA序列包含或组成为SEQ IDNO:11的核酸序列。
E73.如E60-E72中任一项所述的rAAV载体，其中该至少一个AAV ITR重复序列包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列或其组合至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸序列。
E74.如E60-E73中任一项所述的rAAV载体，其中该至少一个AAV ITR重复序列包含或组成为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列或其组合。
E75.如E46-E59中任一项所述的rAAV载体，其中该载体基因组进一步包含至少一个选自以下的元件：至少一个AAV2 ITR序列、CMV增强子、CBh启动子、CBA外显子1、CBA内含子1、MVM内含子和BGH polyA。
E76.如E46-E59中任一项所述的rAAV载体，其中该载体基因组进一步包含至少一个选自以下的元件：至少一个包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列或其组合的AAV2 ITR序列；包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列的CMV增强子；包含SEQ ID NO:7的核酸序列的CBh启动子；包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18的核酸序列的CBA外显子1；包含SEQ ID NO:9的核酸序列的CBA内含子1；包含SEQ ID NO:10的核酸序列的MMV内含子；和包含SEQ ID NO:11的核酸序列的BGH polyA。
E77.如E46-E59中任一项所述的rAAV载体，其中该载体基因组包含侧接编码ASPA的序列的两个AAV2 ITR序列和在编码ASPA的序列上游的CBh启动子。
E78.如E77所述的rAAV载体，其中该ASPA序列包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
E79.如E77或E78的rAAV载体，其中该AAV ITR序列包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列或其组合。
E80.如E77-E79中任一项所述的rAAV载体，其中该CBh启动子包含SEQ ID NO:7的核序列。
E81.一种包含载体基因组的rAAV载体，该载体基因组自5’至3’包含：
a)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列或其组合的AAV2ITR；
b)包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:16的核酸序列的CMV增强子；
c)包含SEQ ID NO:7的核酸序列的CBh启动子；
d)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18的核酸序列的CBA外显子1；
e)包含SEQ ID NO:9的核酸序列的CBA内含子1；
f)包含SEQ ID NO:10的核酸序列的MMV内含子；
g)包含SEQ ID NO:1-3中任一项的核酸序列的编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸；
h)包含SEQ ID NO:11的核酸序列的BGH polyA；和
i)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列或其组合的AAV2ITR。
E82.一种包含载体基因组的rAAV载体，该载体基因组自5’至3’包含：
a)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列或其组合的AAVITR；
b)包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列的增强子；
c)包含SEQ ID NO:7的核酸序列的启动子；
d)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18的核酸序列的外显子；
e)包含SEQ ID NO:9的核酸序列的内含子；
f)包含SEQ ID NO:10的核酸序列的内含子；
g)包含SEQ ID NO:1-3中任一项的核酸序列的编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸；
h)包含SEQ ID NO:11的核酸序列的PolyA；和
i)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列或其组合的AAV末端重复序列。
E83.如E81或E82所述的rAAV载体，其中该载体基因组是自身互补的。
E84.如E81-E83中任一项所述的rAAV载体，其中该载体包含含有VP1蛋白的Olig001衣壳，其中该VP1包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
E85.如E81-E83中任一项所述的rAAV载体，其中该载体包含含有VP1蛋白的Olig002衣壳，其中该VP1包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
E86.如E81-E83中任一项所述的rAAV载体，其中该载体包含含有VP1蛋白的Olig003衣壳，其中该VP1包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
E87.一种rAAV载体，其包含：i)包含VP1蛋白的Olig001衣壳，其中该VP1包含SEQID NO:14的氨基酸序列；和ii)自身互补载体基因组，其自5’至3’包含：
a)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列或其组合的AAV2ITR；
b)包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列的CMV增强子；
c)包含SEQ ID NO:7的核酸序列的CBh启动子；
d)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18的核酸序列的CBA外显子1；
e)包含SEQ ID NO:9的核酸序列的CBA内含子1；
f)包含SEQ ID NO:10的核酸序列的MMV内含子；
g)包含SEQ ID NO:1-3中任一项的核酸序列的编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸；
h)包含SEQ ID NO:11的核酸序列BGH polyA；和
i)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:12的核酸序列的AAV2 ITR。
E88.一种rAAV载体，其包含：i)包含VP1蛋白的Olig001衣壳，其中该VP1包含SEQID NO:14的氨基酸序列；和ii)自身互补载体基因组，其自5’至3’包含：
a)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列或其组合的AAVITR；
b)包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列的增强子；
c)包含SEQ ID NO:7的核酸序列的启动子；
d)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18的核酸序列的外显子；
e)包含SEQ ID NO:9的核酸序列的内含子；
f)包含SEQ ID NO:10的核酸序列的内含子；
g)包含SEQ ID NO:1-3中任一项的核酸序列的编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸；
h)包含SEQ ID NO:11的核酸序列的PolyA；和
i)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19的核酸序列或其组合的AAVITR。
E89.如E45-E88中任一项所述的rAAV载体，其中该载体在引入细胞中时减少该细胞中的NAA水平。
E90.如E89所述的rAAV载体，其中该细胞为脑细胞。
E91.如E89或E90所述的rAAV载体，其中该细胞为少突胶质细胞。
E92.如E45-E91中任一项所述的rAAV载体，其中与施用该载体前具有ASPA基因突变的受试者的平衡、握力和/或运动协调相比，该载体向该受试者的施用增加该受试者的平衡、握力和/或运动协调。
E93.如E45-E92中任一项所述的rAAV载体，其中与施用该载体前具有ASPA基因突变的受试者的广义运动功能(generalized motor function)相比，该载体向该受试者的施用增加该受试者的广义运动功能。
E94.如E45-E93中任一项所述的rAAV载体，其中与施用该载体前具有ASPA基因突变受试者的NAA水平相比，该载体向该受试者的施用减少该受试者中的NAA水平。
E95.如E45-E94中任一项所述的rAAV载体，其中与施用该载体前具有ASPA基因突变的受试者的丘脑的空泡体积分数相比，该载体向该受试者的施用减少该受试者的丘脑的空泡体积分数。
E96.如E45-E95中任一项所述的rAAV载体，其中与施用该载体前具有ASPA基因突变的受试者的小脑白质/脑桥的空泡体积分数相比，该载体向该受试者的施用减少该受试者的小脑白质/脑桥的空泡体积分数。
E97.如E45-E96中任一项所述的rAAV载体，其中与施用该载体前具有ASPA基因突变的受试者的丘脑的少突胶质细胞数量相比，该载体向该受试者的施用增加该受试者的丘脑的少突胶质细胞数量。
E98.如E45-E97中任一项所述的rAAV载体，其中与施用该载体前具有ASPA基因突变的受试者的大脑皮层的少突胶质细胞数量相比，该载体向该受试者的施用增加该受试者的大脑皮层的少突胶质细胞数量。
E99.如E45-E98中任一项所述的rAAV载体，其中与施用该载体前具有ASPA基因突变的受试者的丘脑的神经元数量相比，该载体向该受试者的施用增加该受试者的丘脑的神经元数量。
E100.如E45-E99中任一项所述的rAAV载体，其中与施用该载体前具有ASPA基因突变的受试者的大脑皮层的神经元数量相比，该载体向该受试者的施用增加该受试者的大脑皮层的神经元数量。
E101.如E45-E100中任一项所述的rAAV载体，其中与施用该载体前具有ASPA基因突变的受试者的皮层髓鞘形成相比，该载体向该受试者的施用增加该受试者的皮层髓鞘形成。
E102.如E92-E101中任一项所述的rAAV载体，其中该受试者为人类患者。
E103.如E92-E102中任一项所述的rAAV载体，其中该受试者为患有卡纳万病或处于发展卡纳万病的风险中的人类患者。
E104.如E92-E103中任一项所述的rAAV载体，其中该受试者具有至少一个ASPA基因突变。
E105.一种药物组合物，其包含如E7-E12中任一项所述的经修饰的核酸、如E13-E35中任一项所述的重组核酸、如E36-E44中任一项所述的载体基因组或如E45-E104中任一项所述的rAAV载体。
E106.一种药物组合物，其包含如E7-E12中任一项所述的经修饰的核酸、如E13-E35中任一项所述的重组核酸、如E36-E44中任一项所述的载体基因组或如E45-E104中任一项所述的rAAV载体及药学上可接受的载剂。
E107.一种治疗和/或预防与ASPA的缺陷或功能障碍相关的疾病、病症或病况的方法，该方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的如E7-E12中任一项所述的经修饰的核酸、如E13-E35中任一项所述的重组核酸、如E36-E44中任一项所述的载体基因组、如E45-E104中任一项所述的rAAV载体或如E105或E106所述的药物组合物。
E108.如E107所述的方法，其中与ASPA的缺陷或功能障碍相关的该疾病、病症或病况为卡纳万病。
E109.如E107或E108所述的方法，其中将该经修饰的核酸、重组核酸、载体基因组、rAAV载体或药物组合物直接施用至需要治疗的受试者的脑。
E110.如E107-E109中任一项所述的方法，其中将该经修饰的核酸、重组核酸、载体基因组、rAAV载体或药物组合物直接施用至需要治疗的受试者的中枢神经系统。
E111.如E107-E110中任一项所述的方法，其中将该经修饰的核酸、重组核酸、载体基因组、rAAV载体或药物组合物施用至至少一个选自以下的中枢神经系统的区域：脑实质、脊髓管、蛛网膜下腔、脑室、枕大池及其任何组合。
E112.如E107-E111中任一项所述的方法，其中该经修饰的核酸、重组核酸载体基因组、rAAV载体或药物组合物通过至少一种选自以下的方法来施用：实质内施用、鞘内施用、脑室内施用、枕大池内施用及其任何组合。
E113.如E107-E112中任一项所述的方法，其中该受试者为人类患者。
E114.如E107-E113中任一项所述的方法，其中该受试者为患有卡纳万病或处于发展卡纳万病的风险中的人类患者。
E115.如E107-E114中任一项所述的方法，其中该受试者具有至少一个ASPA基因突变。
E116.一种治疗或预防卡纳万病的方法，该方法包括以下步骤：i)评估受试者是否包含至少一个ASPA基因突变，和ii)向该受试者施用治疗有效量的如E7-E12中任一项所述的经修饰的核酸、如E13-E35中任一项所述的重组核酸、如E36-E44中任一项所述的载体基因组、如E45-E104中任一项所述的rAAV载体或如E105或E106所述的药物组合物，从而治疗或预防该受试者的卡纳万病。
E117.如E116所述的方法，其中该受试者经诊断患有卡纳万病或经诊断处于发展卡纳万病的风险中。
E118.一种治疗或预防有此需要的受试者的与ASPA缺陷相关的疾病的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的编码ASPA的经修饰的核酸，其中该编码ASPA的经修饰的核酸经密码子优化。
E119.如E118所述的方法，其中该编码ASPA的经修饰的核酸包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
E120.如E118或E119所述的方法，其中该编码ASPA的经修饰的核酸编码具有SEQID NO:4的氨基酸序列的ASPA蛋白。
E121.如E118-E120中任一项所述的方法，其中该编码ASPA的经修饰的核酸在靶细胞中表达并且其中该靶细胞为少突胶质细胞。
E122.如E118-E121中任一项所述的方法，其中该编码ASPA的经修饰的核酸在载体中递送至该靶细胞。
E123.如E122所述的方法，其中该载体为病毒载体或非病毒载体。
E124.如E118-E123中任一项所述的方法，其中该载体通过全身注射、通过直接颅内注射或通过直接脊椎管注射施用至该受试者。
E125.一种宿主细胞，其包含如E7-E12中任一项所述的经修饰的核酸、如E13-E35中任一项所述的重组核酸、如E36-E44中任一项所述的载体基因组或如E45-E104中任一项所述的rAAV载体。
E126.如E125所述的宿主细胞，其中该细胞选自以下：VERO、WI38、MRC5、A549、HEK293、B-50或任何其他HeLa细胞、HepG2、Saos-2、HuH7和HT1080。
E127.如E125-E126所述的宿主细胞，其中该细胞为适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。
E128.如E125-E127中任一项所述的宿主细胞，其中该细胞为具有美国典型培养物保藏中心(ATCC)第PTA 13274号的HEK293细胞。
E129.如E125-E128中任一项的所述宿主细胞，其中该细胞包含至少一种核酸，该核酸编码至少一种选自以下的蛋白：AAV Rep蛋白、AAV衣壳(Cap)蛋白、腺病毒早期区1A(E1a)蛋白、E1b蛋白、E2a蛋白、E4蛋白和病毒相关(VA)RNA。
E130.一种用于治疗卡纳万病(CD)的试剂盒，其包含治疗有效量的i)如E45-E104中任一项所述的rAAV载体或ii)如E105或E106所述的药物组合物。
E131.如E130所述的试剂盒，其中该试剂盒进一步包含包括使用试剂盒组分中的一个或多个的说明的标签或插页。
E132.如E7-E12中任一项所述的经修饰的核酸、如E13-E35中任一项所述的重组核酸、如E36-E44中任一项所述的载体基因组、如E45-E104中任一项所述的rAAV载体或如E105或E106所述的药物组合物，其用于治疗或预防与ASPA的缺陷或功能障碍相关的疾病、病症或病况。
E133.如E132所述使用的经修饰的核酸、重组核酸、载体基因组、rAAV载体或药物组合物，其中该疾病、病症或病况为卡纳万病。
E134.如E7-E12中任一项所述的经修饰的核酸、如E13-E35中任一项所述的重组核酸、如E36-E44中任一项所述的载体基因组、如E45-E104中任一项所述的rAAV载体或如E105或E106所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与ASPA的缺陷或功能障碍相关的疾病、病症或病况的药物中的用途。
E135.如E134所述的用途，其中该疾病、病症或病况为卡纳万病。
E136.一种确定通过包含Olig001衣壳的rAAV载体递送至受试者的脑的转基因的生物分布的方法，其中表达由该转基因编码的蛋白，该方法包括
a)向该受试者施用该rAAV载体；
b)固定脑组织；
c)对脑进行电泳透明化；
d)对脑组织切片进行3D显微成像；
e)检测该蛋白；
f)任选地，对存在于脑组织中的蛋白的量进行定量。
E137.如E136所述的方法，其中该施用通过脑室内(ICV)注射、实质内(IP)注射、鞘内(IT)施用、枕大池内(ICM)注射或其组合来进行。
E138.如E136或137所述的方法，其中该脑组织使用例如多聚甲醛或福尔马林来固定。
E139.如E136-E138中任一项所述的方法，其中该定量包括立体渲染。
E140.如E136-E139中任一项所述的方法，其中该转基因编码绿色荧光蛋白(GFP)。
E141.如E136-E140中任一项所述的方法，其中组织中检测到的转基因表达的水平与rAAV载体转导效率相关。
E142.如E136-E141中任一项所述的方法，其进一步包含(g)通过细胞形态评估和GFP表达的空间位置确定来评估细胞型载体向性的步骤。
E143.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸，其包含与SEQ IDNO:1-3中任一项的核酸序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列和启动子。
E144.一种编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸，其包含含有或组成为SEQ ID NO:2的序列的核酸和启动子。
E145.一种核酸，其包含编码启动子的核酸序列，并且进一步包含编码ASPA的经修饰的核酸序列，其中该经修饰的核酸序列包含或组成为SEQ ID NO:2的序列。
E146.一种分离的核酸，其包含指定启动子的核酸序列并且进一步包含含有或组成为SEQ ID NO:2的核酸序列的核酸序列。
E147.如E105所述的药物组合物，其进一步包含350mM NaCl和在PBS中的5％ D-山梨醇。
E148.如E106所述的药物组合物，其中该药学上可接受的载剂包含350mM NaCl和在PBS中的5％ D-山梨醇。
本发明的其他特征和优点将在以下详细描述、附图、示例性实施方案和权利要求中显而易见。
附图说明
图1描述了如在细胞中使用HPLC测定的NAA的示例性剂量响应性减少，该细胞用1.0μg表达NAA合酶(Nat8L)的质粒转染并且用1.0μg、0.5μg、0.2μg或0.1μg包含野生型人ASPA序列(SEQ ID NO:3)或经修饰的例如密码子优化的ASPA序列原始(形式1)(SEQ ID NO:1)或密码子优化的ASPA序列新(形式2)(SEQ ID NO:2)的质粒共转染。
图2描述了通过经由实质内(IP)施用途径(ROA)施用的rAAV载体所转导的GFP阳性细胞的示例性取样。在各感兴趣的区域中对GFP阳性体细胞(箭头)进行评分以生成转导细胞的数量(N)的估计结果。
图3描述了在实质内(IP)施用AAV/Olig001-GFP后，6周龄nur7小鼠的皮层、胼胝体和外囊的皮层下白质、纹状体和小脑中的GFP阳性细胞(N)的示例性数量以及经由IP ROA施用1×1011个AAV/Olig001-GFP载体基因组的小鼠脑的矢状切片中的天然GFP荧光的代表性图像，其显示了注射部位附近的集中GFP表达。在144个切片中，使用分光器(k＝4)生成N的估计结果。呈现了各组(n＝5只动物)的平均值+/-sem。各感兴趣的区域内的剂量组之间的GFP阳性细胞数量的显著差异通过星号来指示。
图4描述了在鞘内(IT)施用AAV/Olig001-GFP后，在6周龄nur7小鼠的皮层、皮层下白质、纹状体和小脑中的GFP阳性细胞的示例性数量(N)以及经由鞘内(IT)ROA施用1×1011个AAV/Olig001-GFP载体基因组的小鼠脑的矢状切片中的天然GFP荧光的代表性图像，其显示了证明通过载体的转导的弥漫性皮质标志物表达以及同样证明该区域中细胞的转导的中等白质束细胞表达。呈现了各组(n＝5只动物)的平均值+/-sem。各感兴趣的区域内的剂量组之间的GFP阳性细胞数量的显著差异通过星号来指示。
图5描述了在脑室内(ICV)施用AAV/Olig001-GFP后，在6周龄nur7小鼠的皮层、皮层下白质、纹状体和小脑中的GFP阳性细胞的示例性数量(N)以及经由ICV ROA施用1×1011个AAV/Olig001-GFP载体基因组的小鼠脑的矢状切片中的天然GFP荧光的代表性图像，其显示了证明该区域中细胞载体的转导的强白质束GFP表达。呈现了各组(n＝5只动物)的平均值+/-sem。各感兴趣的区域内的剂量组之间的GFP阳性细胞数量的显著差异通过星号来指示。
图6描述了在枕大池内(ICM)施用AAV/Olig001-GFP后，在6周龄nur7小鼠的皮层、皮层下白质、纹状体及小脑中的GFP阳性细胞的示例性数量(N)以及经由ICM ROA施用1×1011个AAV/Olig001-GFP载体基因组的小鼠脑的矢状片中的天然GFP荧光的代表性图像，其显示了证明该区域中细胞的转导的中等白质束GFP标志物表达。呈现了各组(n＝5只动物)的平均值+/-sem。各感兴趣的区域内的剂量组之间的GFP阳性细胞数量的显著差异通过星号来指示。
图7描述了对于通过4种不同施用途径(IP、IT、ICV和ICM)施用至各动物的1×1011vg剂量，在以下四个感兴趣的区域中的示例性AAV/Olig001-GFP转导效率的直接比较：皮层、皮层下白质、纹状体和小脑，以及横向于实质内及脑室内的注射部位的切片中的天然GFP荧光的代表性图像。在ICV脑横向切片中，皮层和皮层下白质束转基因阳性细胞数量更多。对于各组，n＝5只动物，使用平均值+/-sem。单独感兴趣的区域之间GFP阳性细胞数量的显著差异通过星号来指示(*p<0.05，**p<0.01及***p<0.001)。
图8描述了在实质内(IP)、鞘内(IT)、脑室内(ICV)和枕大池内(ICM)载体施用后，6周龄nur7小鼠的皮层中的AAV/Olig001-GFP的示例性寡向性。皮层切片通过IHC使用Olig2和NeuN抗体分析。对于各组，n＝5只动物，使用与各指示抗原共标记的平均百分比+/-sem。星号指示组之间的显著差异。
图9描述了在实质内(IP)、鞘内(IT)、脑室内(ICV)和枕大池内(ICM)载体施用后，6周龄nur7小鼠的皮层下白质中的AAV/Olig001-GFP的示例性寡向性。皮层下白质的切片通过IHC使用Olig2和NeuN抗体分析。对于各组，n＝5只动物，使用与各指示抗原共标记的平均百分比+/-sem。
图10描述了在实质内(IP)、鞘内(IT)、脑室内(ICV)和枕大池内(ICM)载体施用后，6周龄nur7小鼠的纹状体中的AAV/Olig001-GFP的示例性寡向性，其中标志物检测证明通过载体的细胞转导。纹状体的切片通过IHC使用Olig2和NeuN抗体分析。对于各组，n＝5只动物，使用与各指示抗原共标记的平均百分比+/-sem。
图11描述了在实质内(IP)、鞘内(IT)、脑室内(ICV)和枕大池内(ICM)载体施用后，6周龄nur7小鼠的小脑中的AAV/Olig001-GFP的示例性寡向性，其中标志物检测证明通过载体的转导。小脑切片通过IHC使用Olig2和NeuN抗体分析。对于各组，n＝5只动物，使用与各指示抗原共标记的平均百分比+/-sem。
图12描述了ICV施用1×1011个载体基因组后2周，周龄匹配的野生型(WT)和nur7小鼠脑的皮层和皮层下白质中AAV/Olig001-GFP转导的示例性效率以及施用AAV/Olig001-GFP后野生型脑中的天然GFP荧光的代表性图像，其显示了相对受限的表达，并且从而证明通过载体的转导，尤其在皮层下白质中的转导。对于各组，n＝5只动物，每组平均GFP阳性细胞数量+/-sem，*p<0.05，**p<0.01。
图13描述了编码密码子优化的ASPA编码序列和调控元件的表达质粒。
图14描述了AAV/Olig001-ASPA处理(在三个剂量水平下)、野生型和nur7假处理小鼠的生命研究期过程中的示例性转棒掉落等待时间。数据呈现为平均值+/-sem，其中每组n＝12只动物。
图15描述了在野生型(WT)小鼠、AAV/Olig001-ASPA处理(在三个剂量水平下)和假处理nur7小鼠的生命研究期过程中的示例性旷场活动。数据呈现为平均值+/-sem，其中每组n＝12只动物。
图16描述了野生型(WT)、nur7假处理和AAV/Olig001-ASPA处理(在三个剂量水平下)小鼠脑的示例性NAA含量。数据表示为平均值+/-sem。NAA表示为每克湿组织重量的毫摩尔数(每组n＝6只动物)。AAV/Olig001-ASPA的剂量在x轴上指示。
图17描述了在22周龄时评估的在3个不同剂量水平下用AAV/Olig001-ASPA处理的nur7小鼠的每mg脑组织的示例性平均载体基因组拷贝数(vg/mg)。平均vg/mg值呈现为+/-sem(n＝6只动物/剂量组)。
图18描述了nur7假处理、AAV/Olig001-ASPA处理nur7和野生型小鼠的代表性H&E染色脑切片，其显示了空泡化区域。
图19描述了作为22周龄假处理和AAV/Olig001-ASPA处理nur7小鼠脑的丘脑及脑白质/脑桥的感兴趣的区域(ROI)的百分比的示例性空泡体积分数。星号指示组间的显著差异。
图20描述了针对证明少突胶质细胞的Olig2染色的假处理和AAV/Olig001-ASPA处理(2.5×1011vg剂量)nur7小鼠丘脑和皮层的代表性图像。
图21描述了22周龄野生型、假处理和AAV/Olig001-ASPA处理nur7小鼠的丘脑和皮层中的Olig2阳性细胞的示例性计数。数据表示为平均Olig2阳性细胞+/-sem(每组n＝6只动物)。星号指示组间的显著差异。
图22描述了针对NeuN染色的假处理和AAV/Olig001-ASPA处理(2.5×1011vg剂量)nur7小鼠丘脑和皮层的代表性图像。
图23描述了22周龄野生型、假处理和AAV/Olig001-ASPA处理nur7小鼠的丘脑和皮层中的NeuN阳性细胞的示例性计数。数据表示为平均NeuN阳性细胞+/-sem(每组n＝6只动物)。星号指示组间的显著差异。
图24描述了针对髓磷脂碱性蛋白(MBP)染色的假处理和AAV/Olig001-ASPA处理(2.5×1011vg剂量)nur7小鼠皮层的代表性图像。
图25描述了野生型、假处理和AAV/001-ASPA处理nur7小鼠皮层中的示例性髓磷脂碱性蛋白阳性纤维长度密度(MBP-LD)(μm/mm3)。数据表示为平均MBP-LD+/-sem(每组n＝6只动物)。星号指示组间的显著差异。
图26描述了来自ICV注射小鼠的初始固定的预透明化样品、组织透明化后样品、3DGFP荧光图像、半脑体积分割分析和强度热图(从左至右)的示例性脑图像。
图27描述了所有四个ICV注射半脑的强度热图。计算全半脑体积并且表示为灰色区域。计算的“低”GFP强度在灰色区域中指示；“高”GFP强度在白色区域中指示。
图28描述了经由ICV与IP施用途径施用AAV/Oligo001-GFP的动物的透明化脑的3D光片GFP荧光显微术图像。
图29A描述了显示与Olig2或NeuN共标记的GFP阳性细胞的评分的代表性高放大率图像。在各视野中对总GFP细胞进行评分，并且在相同视野中对Olig2和NeuN共标记的百分比进行评分。
图29B描述了经由ICV ROA给予AAV/Olig001-GFP的动物脑的SCWM束细胞中的GFP与Olig2共标记的代表性图像并且显示接近100％寡向性和几乎完全不存在的神经向性。
图29C描述了大浦肯野神经元中的小脑GFP转基因表达的代表性图像，其中在白质中具有稀疏Olig2共标记(箭头)。
图29D描述了在ICV ROA脑的纹状体中与Olig2共标记的GFP的代表性图像，其显示了与小脑向性的对比。
图29E描述了在处理BrdU标记和Olig2后，8周nur7和周龄匹配野生型初始脑中的白质束的代表性图像。
图29F描述了2周和8周野生型及nur7白质束中的BrdU细胞的示例性计数。呈现了每组的平均BrdU阳性细胞+/-sem。对于各组(各周龄的基因型)，n＝6。
图29G描述了经由ICV ROA用AAV/Olig001-GFP处理的nur7脑的皮层下白质中的BrdU/GFP共标记细胞的代表性图像。
图30A、30B和30C描述了生物分布体积分析。(A)ICV和IP成像的组织的体积。(B)在两个ROA中的平均和中值GFP荧光强度。(C)表示ROA中的低和高强度的体积GFP阳性分数。
图31A、31B和31C描述了用于药效学效果评估的CLARITY和SWIT CH工作流程。(A)组织透明化和标记方法。从左至右：完整小鼠脑、透明化之前的右半脑的中央2mm切片、在被动透明化1天后和被动透明化3天后的相同组织、以及显示先前标记蛋白的荧光信号的3D图像(绿色：细胞核，红色：髓磷脂碱性蛋白(MBP))。(B)Nur7、WT和Olig1-ASPA处理组织的代表性2mm切片。各图像中的红色箭头指示丘脑区域。(C)被动透明化一天后的组织透明度。
图32A、32B和32C描述了组织的基于2D区域的细胞计数。(A)来自具有相似解剖取向的所有三个组的3D图像的所提取的2D单一切片。红色方框标识丘脑和皮层区域中进行细胞计数的区域。(B)从(A)中的红色方框放大的图像数据，及相应的细胞分割。(C)平均细胞核密度(计数通过分割区域来归一化)。
图33A、33B、33C、33D、33E、33F、33G、33H和33I描述了药效学治疗效果的3D体积分析。(A)确定2mm组织切片的完全3D体积。(B)在3D体积内计算的平均荧光强度。(C)经由设定为超过2000的荧光值处的更具限制性的阈值(左图)或1000处的更具包含性的阈值(左图)的MBP表征。(D)在两种情况下，可观察到Nur7中的MBP缺陷。Olig1-ASPA组的效果可以在较低阈值中看出，其中总体值接近WT水平。(E)丘脑区域中的基于区域的3D分析，其中区域的一部分的手动分割显示为黄色。(F)此区域内的细胞核(SYTO)和髓磷脂(MBP)标志物的平均荧光。(G)皮层的一部分上的基于区域的分析，其中手动分割显示为黄色。(H)此皮层区域内的细胞核(SYTO)和髓磷脂(MBP)标志物的平均荧光。(I)3D细胞浓度(细胞核/100μm2)。
发明详述
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的且并非意在限制本发明。除非上下文另外明确指示，否则如本发明的说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”及“该”意在同样包括复数形式。以下术语具有给出的含义：
如本文所用，术语“约”或“大约”指可测量值如生物活性的量、多核苷酸或多肽序列的长度、G和C核苷酸的含量、密码子适应指数、CpG二核苷酸的数量、剂量、时间、温度等，并且除非另外说明，或从上下文显而易见，或除该数字会超过可能值的100％以外，否则意在涵盖在任一方向上(大于或小于)指定量的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。
如本文使用，术语“和/或”提及并且涵盖相关列出项目中的一个或多个的任何和所有可能组合，以及在以替代方式(“或”)解释时缺少组合。
如本文所用，术语“腺相关病毒”和/或“AAV”指具有线性单链DNA基因组的细小病毒及其变体。除非另外要求，否则该术语涵盖所有亚型以及天然存在和重组形式。野生型基因组包含4681个碱基(Berns和Bohenzky(1987)Advances in Virus Research 32:243-307)并且在各端处包括末端重复序列(例如，反向末端重复(ITR))，该序列以顺式作为DNA复制起点并且作为病毒的包装信号(packaging signal)。基因组包括两个大开放阅读框，分别称为AAV复制(“AAV rep”或“rep”)和衣壳(“AAV cap”或“cap”)基因。AAV rep和cap在本文中也可以称为AAV“包装基因”。这些基因编码参与病毒基因组的复制和包装的病毒蛋白。
在野生型AAV病毒中，三个衣壳基因VP1、VP2和VP3在单一开放阅读框内的彼此重叠以及可变剪接导致VPI、VP2和VP3的产生。(Grieger和Samulski(2005)J.Virol.79(15):9933-9944。)单一P40启动子允许所有三种衣壳蛋白针对VP1、VP2、VP3分别以约1:1:10的比率表达，从而补充AAV衣壳的产生。更具体而言，VP1为全长蛋白，而VP2和VP3由于N端截短的增加而逐渐地缩短。众所周知的实例是如美国专利第7,906,111号描述的AAV9的衣壳，其中VP1包含SEQ ID NO:123的氨基酸残基1至736，VP2包含SEQ ID NO:123的氨基酸残基138至736，并且VP3包含SEQ ID NO:123的氨基酸残基203至736。如本文所用，术语“AAV Cap”或“cap”指AAV衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，以及其变体和类似物。
至少四种病毒蛋白Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40从AAV rep基因合成，并且根据其表观分子量来命名。如本文所用，“AAV rep”或“rep”意指AAV复制蛋白Rep 78、Rep 68、Rep 52和/或Rep 40，以及其变体和类似物。如本文所用，rep和cap涉及野生型和重组(例如，经修饰的嵌合等)rep和cap基因以及其编码的多肽。在一些实施方案中，编码rep的核酸包含来自多于一个AAV血清型的核苷酸。例如，编码rep的核酸可包含来自AAV2血清型的核苷酸和来自AA3血清型的核苷酸(Rabinowitz等人(2002)J.Virology 76(2):791-801)。
如本文所用，术语“重组腺相关病毒载体”、“rAAV”和/或“rAAV载体”指包含载体基因组的AAV，其中多核苷酸序列并非或并非完全是AAV来源的(例如，与AA异源的多核苷酸)，并且其中野生型AAV病毒基因组的rep和/或cap基因已从病毒基因组移除。当典型AAV的rep和/或cap基因已移除或不存在时(并且其中侧接ITR通常衍生自不同血清型的ITR，例如但不限于其中衣壳不是AAV2的AAV2 ITR，)，AAV内的核酸包括任何ITR及其之间的任何核酸，被称为“载体基因组”。因此，术语rAAV载体涵盖rAAV病毒颗粒，该rAAV病毒颗粒包含衣壳和异源核酸即自然界中最初不存在于衣壳中的核酸，并且以下称为“载体基因组”。因此，“rAAV载体基因组”(或“载体基因组”)涉及异源多核苷酸序列(包括至少一个ITR，通常但不一定是与存在于原始AAV中的原始核酸不相关的ITR)，该异源多核苷酸序列可以但不必须包含于AAV衣壳内。rAAV载体基因组可以是双链的(dsAAV)、单链的(ssAAV)和/或自身互补的(scAAV)。
如本文所用，术语“rAAV载体”、“rAAV病毒颗粒”和/或“rAAV载体颗粒”指以下AAV衣壳，其包含至少一种AAV衣壳蛋白(尽管通常存在AAV的所有衣壳蛋白，例如VPI、VPS和VP3或其变体)并且含有载体基因组，该载体基因组包含最初不存在于原始AAV衣壳中的异源核酸序列。这些术语区别于非重组的“AAV病毒颗粒”或“AAV病毒”，其中衣壳含有编码rep和cap基因的病毒基因组并且如果存在于同样包含辅助病毒如腺病毒和/或单纯疱疹病毒，和/或由其产生的必需辅助基因的细胞中，则AAV病毒能够复制。因此，rAAV载体颗粒的产生必须包括使用重组DNA技术来产生重组载体基因组，因此，该载体基因组包含在衣壳内以形成rAAV载体、rAAV病毒颗粒或rAAV载体颗粒。
在自然界中和/或其突变体和变体中均存在的AAV的各种血清型的基因组序列，以及反向末端重复序列(ITR)、rep蛋白合衣壳亚基的序列是本领域已知的。此类序列可见于文献或公共数据库如GenBank中。参见例如GenBank登录号NC-002077(AAV-1)、AF063497(AAV-1)、NC-001401(AAV-2)、AF043303(AAV-2)、NC-001729(AAV-3)、NC_001863(AAV-3B)、NC-001829(AAV-4)、U89790(AAV-4)、NC-006152(AAV-5)、AF513851(AAV-7)、AF513852(AAV-8)和NC-006261(AAV-8)，其公开内容通过引用并入本文。另见例如Srivistava等人(1983)J.Virology 45:555；Chiorini等人(1998)J.Virology 71:6823；Chiorini等人(1999)J.Virology 73:1309；Bantel-Schaal等人(1999)J.Virology 73:939；Xiao等人(1999)J.Virology 73:3994；Muramatsu等人(1996)Virology 221:208；Shade等人(1986)J.Virol.58:921；Gao等人(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；Moris等人(2004)Virology 33:375-383；国际专利公开WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；WO 2013/063379、WO 2014/194132、WO 2015/121501；以及美国专利号6,156,303和7,906,111。
如本文所用，术语“改善”意味着受试者的疾病、病症或病况、或其症状、或潜在细胞反应的可检测的或可测量的改善。可检测的或可测量的改善包括疾病、病症或病况的发生、频率、严重性、进展或持续时间、由其导致或与其相关的并发症的主观或客观减少、降低、抑制、压抑、限制或控制、其症状的改善或逆转。
如本文所用，术语“与…相关”指当一者的存在、水平和/或形式与另一者的存在、水平和/或形式相关时的彼此关系。例如，如果特定实体(例如，多肽、遗传特征、代谢物、微生物等)的存在、水平和/或形式与疾病、病症或病况的发生率和/或易感性相关(例如，在整个相关群体中)，则认为该特定实体与特定疾病、病症或病况相关。在一些实施方案中，如果两个或更多个实体直接或间接地相互作用，使得它们彼此物理接近和/或保持彼此物理接近，则它们在物理上彼此“缔合”。在一些实施方案中，物理上彼此缔合的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施方案中，物理上彼此缔合的两个或更多个实体彼此不共价连接而是非共价缔合，例如通过氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性及其组合的方式。
如本文所用，术语“顺式基序”或“顺式元件”包括保守序列，如在基因组序列的末端处或附近发现并被识别用于起始复制的保守序列；在可能用于转录起始、剪接或终止的内部位置处的隐秘启动子或序列。顺式基序或顺式元件与其相互作用的序列存在于相同核酸分子上。这与不位于相同核酸分子上的其他序列以“反式”起作用的“反式基序”序列不同。
如本文所用，术语“编码序列”或“编码核酸”指编码蛋白或多肽的核酸序列并且表示在置于合适调控序列的控制下(可操作地连接)时在体外或在体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的序列。编码序列的边界通常通过5’(氨基)端处的起始密码子和3’(羧基)端处的翻译终止密码子来确定。编码序列可以包括但是不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列和甚至合成DNA序列。
如本文所用，术语“嵌合”涉及病毒衣壳，其衣壳序列来自不同的细小病毒、优选地不同AAV血清型，如Rabinowitz等人,美国专利号6,491,907所述，其公开内容通过引用其整体并入本文。另见Rabinowitz等人(2004)J.Virol.78(9):4421-4432。在一些实施方案中，嵌合病毒衣壳是AAV2.5衣壳，其具有带有以下突变的AAV2衣壳的序列：263Q至A；265插入T；705 N至A；708 V至A；和716 T至N。编码此衣壳的核苷酸序列定义为SEQ ID NO:15，如WO2006/066066所述。其他优选的嵌合AAV衣壳包括但不限于：描述于WO 2010/093784中的AAV2i8；描述于WO 2014/144229中的AAV2G9和AAV8G9；以及AAV9.45(Pulicherla等人(2011)Molecular Therapy 19(6):1070-1078)；描述于WO 2103/029030中的AAV-NP4、NP22、NP66、AAV-LK01至AAV-LK019；描述于WO 205/013313中的RHM4-1和RHM15-1至RHM5-6；描述于WO 2007/120542中的AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-DJ/9。
如本文所用，术语“保守取代”指一个氨基酸由生物学、化学或结构上相似的残基替换。生物学上相似意味着取代不破坏生物活性。结构上相似意味着氨基酸具有长度相似的侧链，如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，或具有相似大小。化学相似性意味着残基具有相同电荷或两者都为亲水性或疏水性。具体实例包括：用另一个疏水性残基取代疏水性残基，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；或一个极性残基取代另一极性残基，如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺、丝氨酸取代苏氨酸等。保守取代的具体实例包括：疏水性残基，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸彼此取代；极性残基取代另一个极性残基，如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺等。保守氨基酸取代通常包括例如下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。“保守取代”也包括使用经取代的氨基酸来代替未经取代的亲本氨基酸。
如本文所用，术语“侧接”指序列侧接其他元件并且指示相对于序列的上游和/或下游即5’和/或3’存在一个或多个侧接元件。术语“侧接”并非意在指示序列必须是连续的。例如，在编码转基因的核酸与侧接元件之间可以存在介入序列。序列(例如，转基因)被两个其他元件(例如，ITR)“侧接”指示一个元件位于序列的5’并且另一个位于序列的3’；然而，在其之间可以存在介入序列。
如本文所用，术语“片段”涉及具有包括整体的离散部分但缺少在整体中发现的一个或多个部分的结构的材料或实体。在一些实施方案中，片段由离散部分组成。在一些实施方案中，片段组成为或包含在整体中发现的特征结构元件或部分。在一些实施方案中，聚合物片段包含或组成为在整个聚合物中发现的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个单体单元(例如，氨基酸残基、核苷酸)。
如本文所用，术语“功能性(functional)”指其表现出表征的特性和/或活性的形式的生物分子。生物分子可具有两个功能(即，双功能的)或多个功能(即，多功能的)。
如本文所用，术语“基因”指含有至少一个能够在转录和翻译后编码特定多肽或蛋白的开放阅读框的多核苷酸。“基因转移”或“基因递送”涉及将外来DNA可靠地插入宿主细胞中的方法或系统。此类方法可导致非整合转移DNA的瞬时表达、转移复制子(例如附加体)的染色体外复制和表达和/或转移遗传物质向宿主细胞的基因组DNA中的整合。
如本文所用，术语“异源的”或“外源的”核酸指用于载体介导的核酸转移/递送至细胞中的目的而插入载体(例如，rAAV载体)中的核酸。异源核酸通常不同于载体(例如，AAV)核酸，即相对于自然界中AAV中发现的病毒(例如，AAV)核酸，异源核酸是非天然的。一旦转移(例如，转导)或递送至细胞中，包含在载体内的异源核酸可以得到表达(例如，如果合适的话，转录和翻译)。替代性地，包含在载体内的转移(转导)或递送至细胞中的异源核酸不必须表达。虽然术语“异源”在本文中不总是用于指核酸，但是即使在不存在修饰语“异源”的情况下，提及核酸也意在包括异源核酸。例如，异源核酸是编码ASPA多肽的核酸，例如编码用于治疗卡纳万病的ASPA的密码子优化的核酸。
如本文所用，术语“同源”或“同源性”指在给定区域或部分上共享至少部分同一性的两个或更多个参考实体(例如，核酸或多肽序列)。例如，当两个肽中的氨基酸位置由相同氨基酸占据时，肽在该位置处为同源的。值得注意的是，同源肽将保留与未修饰或参考肽相关的活性或功能，并且经修饰的肽通常具有与未修饰序列的氨基酸序列“基本上同源”的氨基酸序列。当提及多肽、核酸或其片段时，“实质同源性”或“实质相似性”意味着当在适当插入或缺失的情况下与另一多肽、核酸(或其互补链)或其片段最佳对齐时，在至少约95％至99％的序列中存在序列同一性。两个序列间的同源性(同一性)的程度可使用计算机程序或数学算法来确定。计算序列同源性(或同一性)百分比的此类算法通常考虑到在比较区域或范围上的序列空位和错配。示例性程序和算法提供如下。
如本文所用，术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且指引入外源核酸的细胞，并且包含此细胞的子代。宿主细胞包含“转染体”、“转化体”、“转化细胞”和“转导细胞”，包括原代转染、转化或转导的细胞以及由此衍生的子代，与传代次数无关。在一些实施方案中，宿主细胞是用于产生rAAV载体的包装细胞。
如本文所用，术语“同一性”或“与…相同”指聚合物分子之间，例如，核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多相同，则它们被认为彼此“基本上相同”。
两个核酸或多肽序列的同一性百分比的计算例如可通过出于最佳比较目的比对两个序列来进行(例如，为了最佳比对，可将空位引入第一和第二序列的一者或两者中并且出于比较目的可忽略不相同序列)。在某些实施方案中，出于比较目的来比对的序列的长度为参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后对对应位置处的核苷酸进行比较。当第一序列中的位置由与第二序列中对应位置处相同的残基(例如核苷酸或氨基酸)占据时，则分子在该位置处相同。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数量的函数，考虑到空位的数量和各空位的长度，需要引入空位以实现两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。
为了确定同一性百分比或同源性，可使用可在万维网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/处获得的方法和计算机程序包括BLAST来比对序列。另一比对算法为FASTA，其可在来自Madison,Wis.,美国的Genetics Computing Group(GCG)包中获得。用于比对的其他技术描述于Methods in Enzymology,第266卷:Computer Methods for MacromolecularSequence Analysis(1996),Doolittle编,Academic Press,Inc。允许序列中的空位的比对程序特别有兴趣。Smith-Waterman是一种在序列比对中允许空位的算法。参见Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)。同样，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可用于比对序列。参见J.Mol.Biol.48:443-453(1970)。
对使用Smith和Waterman(1981,Advances in Applied Mathematics 2:482-489)的局部同源性算法来确定序列同一性的BestFit程序也产生了兴趣。空位产生罚分的范围通常为1至5，通常2至4并且在一些实施方案中为3。空位延伸罚分的范围通常为约0.01至0.20并且在一些情况下为0.10。程序具有通过由输入以供比较的序列确定的默认参数。优选地，序列同一性使用通过程序确定的默认参数来确定。此程序也可以在来自Madison,WI,美国的Genetics Computing Group(GCG)包中获得。
另一个感兴趣的程序是FastDB算法。FastDB描述于Current Methods inSequence Comparison and Analysis,Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications,第127-149页,1988,Alan R.Liss,Inc中。序列同一性百分比通过FastDB基于以下参数来计算：错配罚分：1.00；空位罚分：1.00；空位大小罚分：0.33；以及衔接罚分：30.0。
如本文所用，术语“增加”、“改善”或“降低”指示相对于基线测量结果的值，该基线测量结果如在开始本文所述的处理前在同一个体中的测量结果，或在不存在本文所述的处理的情况下在对照个体(或多个对照个体)中的测量结果。在一些实施方案中，“对照个体”为患有与待处理个体相同形式的疾病或损伤的个体。
如本文所用，术语“反向末端重复”、“ITR”、“末端重复”和“TR”指在AAV基因组末端处或附近的回文末端重复序列，主要包含互补的、对称排列的序列。这些ITR可折叠以形成T形发夹结构，在DNA复制起始期间充当引物。它们也是病毒基因组整合至宿主基因组中所需的；用于从宿主基因组中拯救；以及用于将病毒核酸衣壳化为成熟病毒颗粒。载体基因组复制及其包装成病毒颗粒需要顺式ITR。“5’ITR”指AAV基因组的5’末端处和/或重组转基因的5’的ITR。“3’ITR”指AAV基因组的3’末端处和/或重组转基因的3’的ITR。野生型ITR的长度约为145bp。经修饰的或重组的ITR可包含野生型AAV ITR序列的片段或部分。本领域普通技术人员将理解，在连续数轮的DNA复制期间，ITR序列可以交换使得5’ITR变为3’ITR，且反之亦然。在一些实施方案中，至少一个ITR存在于重组载体基因组的5’和/或3’末端处，以使得载体基因组可包装至衣壳中以产生包含载体基因组的rAAV载体(在本文中也称为“rAAV载体颗粒”或“rAAV病毒颗粒”)。
如本文所用，术语“分离的”指1)通过人工来设计、产生、制备和或制造和/或2)与其在最初产生时(无论是在自然界和/或在实验环境中)相关的组分中的至少一个分离的物质或组合物。总体上，分离的组合物基本上不含通常在自然界中与其缔合的一种或多种材料，例如，一种或多种蛋白、核酸、脂质、碳水化合物和/或细胞膜。术语“分离的”不排除人造组合，例如，重组核酸、重组载体基因组(例如，rAAV载体基因组)、包装例如衣壳化载体基因组的rAAV载体颗粒(例如但不限于包含AAV/Olig001衣壳的rAAV载体颗粒)和药学制剂。术语“分离的”也不排除组合物的替代物理形式，如杂合体/嵌合体、多聚体/寡聚体、修饰(例如，磷酸化、糖基化、脂化)、变体或衍生形式或者在宿主细胞中表达的人造形式。
分离的物质或组合物可与约10％、约20％、约30％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％的与其最初缔合的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的药剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％纯。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则该物质为“纯的”。在一些实施方案中，如本领域技术人员所理解，在与某些其他组分例如一种或多种载剂或赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)组合后，物质可仍然被认为是“分离的”或甚至“纯的”；在此类实施方案中，在不包括此类载剂或赋形剂的情况下计算物质的分离百分比或纯度。
如本文所用，术语“核酸序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”可互换地指组成为或包含通过磷酸二酯键联所连接的单体核苷酸的任何分子。核酸可以是寡核苷酸或多核苷酸。核酸序列在本文中以5’至3’方向的方向呈现。本公开的核酸序列(即，多核苷酸)可以是脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子，并且指所有形式的核酸如双链分子、单链分子、小或短发夹RNA(shRNA)、微小RNA、小或短干扰RNA(siRNA)、反式剪接RNA、反义RNA、信使RNA、转移RNA、核糖体RNA。当多核苷酸为DNA分子时，该分子可以是基因、cDNA、反义分子或任何前述分子的片段。核苷酸在本文中通过单字母代码指示：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌苷(I)和尿嘧啶(U)。核苷酸序列可以是化学修饰的或人工的。核苷酸序列包括肽核酸(PNA)、吗啉核酸(morpholinos)和锁核酸(LNA)、以及二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。通过分子骨架的改变，可以将此类序列中的每个与天然存在的DNA或RNA区分开。同样，可使用硫代磷酸酯核苷酸。其它脱氧核苷酸类似物包括可用于本公开的核苷酸序列中的甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、N3’-P5’-氨基磷酸酯、和寡核糖核苷酸硫代磷酸酯及其2’-0-烯丙基类似物和2’-0-甲基核糖核苷酸甲基膦酸酯。
如本文所用，术语“核酸构建体”指由重组DNA技术的使用所产生的非天然存在的核酸分子(例如，重组核酸)。核酸构建体为单链或双链的核酸分子，其经修饰以含有以不存在于自然界中的方式来组合和排列的核酸序列链片段。核酸构建体可以是“载体”(例如，质粒、rAAV载体基因组、表达载体等)，即经设计以将外源产生的DNA递送至宿主细胞中的核酸分子。
如本文所用，术语“可操作地连接”指核酸序列(或多肽)元件以功能关系连接。当核酸位于与另一核酸序列的功能关系中时，其可操作地连接至另一核酸序列。例如，如果启动子或其他转录调控序列(例如，增强子)影响编码序列的转录，则其可操作地连接至编码序列。在一些实施方案中，可操作地连接意味着所连接的核酸序列是连续的。在一些实施方案中，可操作地连接不意味着核酸序列为连续连接的，而是在那些连接的核酸序列之间的插入序列。
如本文所用，术语“药学上可接受”和“生理学上可接受”指适合于一个或多个施用、体内递送或接触途径的生物学上可接受的制剂、气体、液体或固体或其混合物。
如本文所用，术语“多肽”、“蛋白”、“肽”或“由核酸序列编码”(即，由多核苷酸序列编码、由核苷酸序列编码)指与天然存在的蛋白一样的全长天然序列，以及功能性序列、经修饰的形式或序列变体，只要该序列、经修饰的形式或变体保留天然全长蛋白的一定程度的功能性即可。在本公开的方法和用途中，由核酸序列编码的此类多肽、蛋白和肽可以但不必需与有缺陷的、或其表达在用基因疗法治疗的受试者中不充足或缺乏的内源蛋白相同。
如本文所用，术语“预防”或“防止”指特定疾病、病症或病况(例如，卡纳万病)的一个或多个体征或症状的发作延迟、和/或频率和/或严重性降低。在一些实施方案中，预防在群体基础上评估，使得如果在易感疾病、病症或病况的群体中观察到疾病、病症或病况的一个或多个体征或症状的进展、频率和/或强度的统计学上显著的降低，则认为药剂“预防”特定疾病、病症或病况。当疾病、病症或病况的发作延迟了预定时间段时，则可以认为预防已经完成。
如本文所用，术语“重组”指作为克隆、限制或连接步骤(例如与其中包含的多核苷酸或多肽有关)和/或产生不同于存在于自然界中的产物的构建体的其他程序的各种组合的产物的载体、多核苷酸(例如，重组核酸)、多肽或细胞。重组病毒或载体(例如，rAAV载体)包含含有重组核酸的载体基因组(例如，包含转基因和一个或多个调控元件的核酸，例如，编码ASPA和CBh启动子的密码子优化的核酸)。该术语分别包括原始多核苷酸构建体的复制物和原始病毒构建体的子代。
如本文所用，术语“受试者”指生物体，例如，哺乳动物(例如，人、非人哺乳动物、非人灵长类动物、灵长类动物、实验动物、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、猫、犬)。在一些实施方案中，受试者为nur7小鼠。在一些实施方案中，人受试者为成人、青少年或儿童受试者。在一些实施方案中，受试者患有疾病、病症或病况，例如，可如本文所提供来治疗的疾病、病症或病况。在一些实施方案中，受试者患有与天冬氨酸酰化酶活性缺陷或功能障碍相关的疾病、病症或病况，例如卡纳万病。在一些实施方案中，受试者易感疾病、病症或病况。在一些实施方案中，易感受试者易患疾病、病症或病况和/或发展患上疾病、病症或病况的风险增加(如与在参考受试者或群体中观察到的平均风险相比)。在一些实施方案中，受试者显示疾病、病症或病况的一个或多个症状。在一些实施方案中，受试者不显示疾病、病症、或病况的特定症状(例如，疾病的临床表达)或特征。在一些实施方案中，受试者不显示疾病、病症、或病况的任何症状或特征。在一些实施方案中，受试者为人患者。在一些实施方案中，受试者为施用和/或已施用诊断和/或疗法(例如，卡纳万病的基因疗法)的个体。在一些实施方案中，受试者为患有卡纳万病的人患者。
如本文所用，术语“基本上”指展现感兴趣的特征或性质的全部或接近全部范围或程度的定性条件。本领域普通技术人员应理解，生物和化学现象很少(如果有的话)达到完成和/或进行至完全或达成或绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕获许多生物和化学现象中固有的潜在缺乏完整性。
如本文所用，术语“症状减少”或“减少症状”指特定疾病、病症或病况的一个或多个症状在量值(例如，强度、严重性等)和/或频率方面减少。出于清楚目的，特定症状的发作的延迟被认为是降低该症状的频率的一种形式。
如本文所用，术语“治疗性多肽”是可减轻或减少靶细胞(例如，分离的细胞)或生物体(例如，受试者)中的蛋白的不存在或缺陷所导致的症状的肽、多肽或蛋白(例如，酶、结构蛋白、跨膜蛋白、转运蛋白)。通过转基因编码的治疗性多肽或蛋白为赋予受试者益处，例如校正基因缺陷、校正与表达或功能相关的基因缺陷的多肽或蛋白。类似地，“治疗性转基因”是编码治疗性多肽的转基因。在一些实施方案中，在宿主细胞中表达的治疗性多肽是由转基因(即，引入宿主细胞中的外源核酸)表达的酶。在一些实施方案中，治疗性多肽是由转导至大脑皮层细胞(例如，少突胶质细胞)中的治疗性转基因所表达的ASPA蛋白。
如本文所用，术语“治疗有效量”指产生其所施用的期望治疗效果的量。在一些实施方案中，该术语指当根据治疗性给药方案向患有或易感疾病、病症或病况的群体施用时，足以治疗该疾病、病症或病况的量。在一些实施方案中，治疗有效量是降低疾病、病症和/或病况的一个或多个症状的发生率和/或严重性和/或延迟其发作的量。本领域普通技术人员应理解，术语“治疗有效量”实际上不需要在具体个体中实现成功的治疗。相反，治疗有效量可以是当向需要此类治疗的患者施用时，在大量受试者中提供特别期望的药理学反应的量。
如本文所用，术语“转基因”用于意指递送至和/或表达于宿主细胞、靶细胞或生物体(例如，受试者)中的任何异源多核苷酸。此“转基因”可使用载体(例如，rAAV载体)递送至宿主细胞、靶细胞或生物体。转基因可以可操作地连接至控制序列如启动子。本领域技术人员将理解，表达控制序列可基于促进转基因在宿主细胞、靶细胞或生物体中表达的能力来选择。通常，转基因可以可操作地连接至在天然状态下与转基因缔合的内源启动子，但是更典型地，转基因可操作地连接至在天然状态下转基因不与其缔合的启动子。转基因的实例为编码治疗性多肽例如ASPA多肽的核酸，并且示例性启动子为在天然状态下不与编码ASPA的核苷酸可操作地连接的启动子。此非内源启动子可包括CBh启动子，以及本领域已知的许多其他启动子。
感兴趣的核酸可通过本领域熟知的多种技术包括转染和转导引入宿主细胞中。
“转染”通常被称为在不使用病毒载体的情况下将外源核酸引入细胞中的技术。如本文所用，术语“转染”指在不使用病毒载体的情况下，将重组核酸(例如，表达质粒)转移至细胞(例如，宿主细胞)中。引入重组核酸的细胞被称为“转染细胞”。转染的细胞可以是宿主细胞(例如，CHO细胞、Pro10细胞、HEK293细胞)，其包含用于产生重组AAV载体的表达质粒/载体。在一些实施方案中，转染细胞(例如，包装细胞)可包含含有转基因(例如，ASPA转基因)的质粒、含有AAV rep基因和AAV cap基因的质粒以及含有辅助基因的质粒。许多转染技术是本领域已知的，包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、阳离子或阴离子脂质体和与核定位信号组合的脂质体。
如本文所用，术语“转导”指通过病毒载体(例如，rAAV载体)将核酸(例如，载体基因组)转移至细胞(例如，靶细胞，包括但不限于少突胶质细胞)。在一些实施方案中，用于卡纳万病的基因疗法包括将包含编码ASPA的经修饰的核酸的载体基因组转导至少突胶质细胞中。通过病毒或病毒载体来引入转基因的细胞被称为“转导的细胞”。在一些实施方案中，转导的细胞是分离的细胞并且转导离体发生。在一些实施方案中，转导的细胞是生物体(例如，受试者)内的细胞并且转导在体内发生。转导的细胞可以是生物体的靶细胞，其通过重组AAV载体转导，以使得生物体的靶细胞表达多核苷酸(例如，转基因，例如，编码ASPA的经修饰的核酸)。
可转导的细胞包括任何组织或器官类型或任何来源(例如，中胚层、外胚层或内胚层)的细胞。细胞的非限制性实例包括：肝脏细胞(例如，肝细胞、窦状内皮细胞)、胰脏细胞(例如，β胰岛细胞、外分泌细胞)、肺细胞、中枢或周围神经系统细胞(如脑细胞(例如，神经或室管膜细胞、少突胶质细胞)或脊柱细胞)、肾脏细胞、眼细胞(例如，视网膜细胞)、脾细胞、皮肤细胞、胸腺细胞、睾丸细胞、肺细胞、膈膜细胞、心脏(心)细胞、肌肉或腰肌细胞、或肠道细胞(例如，内分泌细胞)、脂肪组织(白色、棕色或米色)细胞、肌肉细胞(例如，纤维母细胞、肌细胞)、滑膜细胞、软骨细胞、破骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、唾液腺细胞、内耳神经细胞或造血(例如，血液或淋巴)细胞。其他实例包括干细胞，例如发育或分化为以下的多潜能(pluripotent)或多能(multipotent)祖细胞：肝脏细胞(例如，肝细胞、窦状内皮细胞)、胰脏细胞(例如，β胰岛细胞、外分泌细胞)、肺细胞、中枢或周围神经系统细胞(如脑细胞(例如，神经或室管膜细胞、少突胶质细胞)或脊柱细胞)、肾脏细胞、眼细胞(例如，视网膜细胞)、脾细胞、皮肤细胞、胸腺细胞、睾丸细胞、肺细胞、膈膜细胞、心脏(心)细胞、肌肉或腰肌细胞、或肠道细胞(例如，内分泌细胞)、脂肪组织(白色、棕色或米色)细胞、肌肉细胞(例如，纤维母细胞、肌细胞)、滑膜细胞、软骨细胞、破骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、唾液腺细胞、内耳神经细胞或造血(例如，血液或淋巴)细胞。
在一些实施方案中，存在于组织或器官(例如，脑)的特定区域内的细胞可通过施用至组织或器官的rAAV载体(例如，包含ASPA转基因的rAAV)来转导。在一些实施方案中，脑细胞用包含ASPA转基因的rAAV来转导。在一些实施方案中，大脑皮层的细胞用包含ASPA转基因的rAAV来转导。在一些实施方案中，脑纹状体细胞用包含ASPA转基因的rAAV来转导。在一些实施方案中，脑的皮层下白质细胞用包含ASPA转基因的rAAV来转导。在一些实施方案中，脑的小脑细胞用包含ASPA转基因的rAAV来转导。
如本文所用，术语“治疗”、“处理”或“疗法”指施用疗法，该疗法部分或完全缓解、改善、减轻、抑制特定疾病、病症/或病况的一个或多个症状、特征和/或病因，延迟其发作，降低其严重性和/或降低其发生率。
如本文所用，术语“载体”指质粒、病毒(例如，rAAV)、粘粒或可通过插入或引入核酸(例如，重组核酸)来操作的其他媒介物。载体可用于各种目的，包括例如基因操作(例如，克隆载体)、将核酸引入/转移至细胞中、在细胞中转录或翻译所插入的核酸。在一些实施方案中，载体核酸序列至少含有用于在细胞中增殖的复制起点。在一些实施方案中，载体核酸包含异源核酸序列、表达控制元件(例如，启动子、增强子)、选择标记(例如，抗生素抗性)、聚腺苷(polyA)序列和/或ITR。在一些实施方案中，在递送至宿主细胞时，核酸序列被扩增。在一些实施方案中，当在体外或体内递送至宿主细胞时，细胞表达由异源核酸序列编码的多肽。在一些实施方案中，在递送至宿主细胞时，核酸序列或核酸序列的一部分包装至衣壳中。宿主细胞可以是分离的细胞或宿主生物体内的细胞。除了编码多肽或蛋白的核酸序列(例如，转基因)以外，额外序列(例如，调控序列)可存在于同一载体中(即，与基因呈顺式)并且侧接该基因。在一些实施方案中，调控序列可存在于单独(例如，第二)载体中，该载体以反式起作用来调控基因的表达。质粒载体可在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“载体基因组”指包装或包裹入衣壳内以形成rAAV载体的重组核酸序列。通常，载体基因组包括异源多核苷酸序列，例如，转基因、调控元件、最初不存在于衣壳中的ITR。在重组质粒用于构建或制造重组载体(例如，rAAV载体)的情况下，载体基因组不包括整个质粒而仅包括旨在通过病毒载体来递送的序列。重组质粒的这个非载体基因组部分通常被称为“质粒骨架”，其对于质粒的克隆、选择和扩增(重组病毒载体产生的增殖所需要的过程)而言是必要的，但是其本身不包装或包裹入rAAV载体的衣壳内。
如本文所用，术语“病毒载体”通常指病毒颗粒，其充当核酸递送媒介物并且包含包装于病毒颗粒(即，衣壳)内的载体基因组(例如，包含转基因而不是编码AAV rep和cap的核酸)，并且包括例如慢病毒和细小病毒，包括AAV血清型和变体(例如，rAAV载体)。重组病毒载体不包含含有rep和/或cap基因的载体基因组。
本公开提供包含经修饰的ASPA编码序列的经修饰的核酸，及其在基因疗法药物组合物中的用途。如本文所用，“经修饰的”意味着编码在天然状态下存在的多肽的核酸序列被改变，以使得在一个实施方案中，与来自其他方面相同的细胞中的未修饰的(即，天然存在的(包括基因的突变体形式))核酸序列的蛋白表达水平相比，经修饰的核酸序列驱动细胞中更高水平的蛋白表达。本公开还提供包括载体基因组的重组核酸，其包括经修饰的ASPA编码序列作为其序列的一部分。此外，本公开提供包装的基因递送媒介物，诸如rAAV载体，其包括经修饰的ASPA编码序列。本公开还包含在细胞中递送以及优选地表达经修饰的ASPA编码序列的方法。本公开还提供将经修饰的ASPA编码序列例如作为载体的组分和/或包装为病毒基因递送媒介物(例如，rAAV载体)的组分来施用至受试者的基因治疗方法。例如可以进行治疗以增加受试者中的ASPA水平并且治疗受试者中的ASPA缺乏。本公开的这些方面中的每一个在后续部分中进一步论述。
AAV及rAAV载体
AAV
如前所述，术语“腺相关病毒”和/或“AAV”指具有线性单链DNA基因组的细小病毒及其变体。除非另有要求，该术语涵盖所有亚型以及天然存在形式和重组形式。包括AAV在内的细小病毒可用作基因疗法载体，因为其可穿透细胞并且将核酸(例如，转基因)引入细胞核中。在一些实施方案中，引入的核酸(例如，rAAV载体基因组)形成环状多联体，其作为附加体持续存在于转导细胞的细胞核中。在一些实施方案中，将转基因插入宿主细胞基因组中的特定位点，例如人染色体19上的位点处。与随机整合相反，据信位点特异性整合可以产生可预测的长期表达谱。AAV在人基因组中的插入位点被称为AAVS1。一旦引入细胞，由核酸编码的多肽可通过细胞表达。因为AAV不与人的任何致病性疾病相关，所以通过AAV递送的核酸可用于表达用于治疗人受试者的疾病、病症和/或病况的治疗性多肽。
多种AAV血清型存在于自然界中，并且迄今为止，已鉴定了至少十五种来自人的野生型血清型(即，AAV1-AAV15)。天然存在的血清型和变体血清型的区别在于具有在血清学上不同于其他AAV血清型的衣壳蛋白。AAV 1型(AAV1)、AAV 2型(AAV2)、AAV 3型(AAV3)包括AAV 3A型(AAV3A)和AAV 3B型(AAV3B)、AAV 4型(AAV4)、AAV 5型(AAV5)、AAV 6型(AAV6)、AAV 7型(AAV7)、AAV 8型(AAV8)、AAV 9型(AAV9)、AAV 10型(AAV10)、AAV 12型(AAV12)、AAVrh10、AAVrh74(参见WO 2016/210170)、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV和羊AAV以及重组产生的变体(例如，具有插入、缺失和取代等的衣壳变体)，如被称为AAV 2i8型(AAV2i8)、NP4、NP22、NP66、DJ、DJ/8、DJ/9、LK3、RHM4-1的变体以及许多其他变体。“灵长类动物AAV”指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类动物AAV”指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”指感染牛哺乳动物的AAV，依此类推。基于针对一种AAV的抗体相较于针对另一种AAV的抗体之间交叉反应性的缺乏来确定血清型独特性。此交叉反应性差异通常由于衣壳蛋白序列及抗原决定簇的差异(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2、和/或VP3序列差异)。然而，一些天然存在的AAV或人造AAV突变体(例如，重组AAV)可以不与任何当前已知的血清型展现出血清学差异。此类病毒可以被认为是相应类型的亚组，或简称为变体AAV。因此，如本文所用，术语“血清型”指血清学上不同的病毒例如AAV，以及不在血清学上不同但是可在给定血清型的亚组或变体内的病毒例如AAV。
已知AAV血清型的衣壳的氨基酸序列的综合列表和比对由Marsic等人(2014)Molecular Therapy 22(11):1900-1909提供，尤其在补充图1中提供。
AAV的各种血清型的基因组序列，以及天然末端重复(ITR)的序列、rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。此类序列可见于文献或公共数据库如GenBank中。参见例如GenBank登录号NC_002077(AAV1)、AF063497(AAV1)、NC_001401(AAV2)、AF043303(AAV2)、NC_001729(AAV3)、NC_001863(AAV3B)、NC_001829(AAV4)、U89790(AAV4)、NC_006152(AAV5)、NC_001862(AAV6)、AF513851(AAV7)、AF513852(AAV8)和NC_006261(AAV8)，其公开通过引用并入本文。另见例如Srivistava等人(1983)J.Virology 45:555；Chiorini等人(1998)J.Virology 71:6823；Chiorini等人(1999)J.Virology 73:1309；Bantel-Schaal等人(1999)J.Virology 73:939；Xiao等人(1999)J.Virology 73:3994；Muramatsu等人(1996)Virology 221:208；Shade等人(1986)J.Virol.58:921；Gao等人(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；Moris等人(2004)Virology 33:375-383；国际专利公开WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；WO 2013/063379；WO 2014/194132；WO 2015/121501；以及美国专利第6,156,303号和美国专利第7,906,111号。仅出于说明性目的，野生型AAV2包含小(20-25nm)AAV二十面体病毒衣壳，衣壳由具有重叠序列的三种蛋白(VP1、VP2和VP3；总共60个衣壳蛋白组成AAV衣壳)组成。蛋白VP1(735aa；Genbank登录号AAC03780)，VP2(598aa；Genbank登录号AAC03778)和VP3(533aa；Genbank登录号AAC03779)以1:1:10的比例存在于衣壳中。也就是说，对于AAV而言，VP1为全长蛋白并且VP2和VP3为VP1的逐步缩短形式，并且相对于VP1，N端的截短增加。
重组AAV
如前所述，“重组腺相关病毒”或“rAAV”通过将内源病毒基因组的全部或一部分替换为非天然序列与野生型AAV的区分开来。将非天然序列引入病毒中将病毒载体定义为“重组”载体，且因此定义为“rAAV载体”。rAAV载体可包括编码期望蛋白或多肽(例如，ASPA多肽)的异源多核苷酸。重组载体序列可包裹或包装至AAV衣壳中并且被称为“rAAV载体”、“rAAV载体颗粒”、“rAAV病毒颗粒”或简称为“rAAV”。
对于rAAV载体的产生，VP1:VP2:VP3的期望比率在约1:1:1至约1:1:100的范围内，优选地在约1:1:2至约1:1:50的范围内，更优选地在约1:1:5至约1:1:20的范围内。虽然VP1:VP2的期望比率为1:1，但是VP1:VP2的比率范围可从1:50至50:1变化。
本公开提供包含非AAV来源的多核苷酸序列(例如，对AAV异源的多核苷酸)的rAAV载体。异源多核苷酸可以侧接至少一个，并且有时两个AAV末端重复序列(例如，反向末端重复(ITR))。通过ITR侧接的异源多核苷酸，在本文中也称为“载体基因组”，通常编码感兴趣的多肽，或感兴趣的基因(“GOI”)，如治疗性治疗的靶标(例如，编码用于治疗卡纳万病的ASPA的核酸)。rAAV载体至受试者(例如患者)的递送或施用向受试者提供编码的蛋白和肽。因此，rAAV载体可用于转移/递送异源多核苷酸以供表达，用于例如治疗各种疾病、病症和病况。
rAAV载体基因组通常保持与取代病毒rep和cap基因的异源核酸序列呈顺式的145个碱基ITR。对于产生重组AAV载体而言，此类ITR是必需的；然而，包括部分或完全合成序列的经修饰的AAV ITR和非AAV末端重复序列也可以用于此目的。ITR形成发夹结构并且例如在感染后作为互补DNA链的宿主细胞介导的合成的引物来发挥作用。ITR也在病毒包装、整合等中起作用。ITR是AAV基因组复制和包装至rAAV载体中所需要的唯一顺式AAV病毒元件。rAAV载体基因组任选地包含两个ITR，该ITR通常在包含异源序列(例如，编码感兴趣的基因或感兴趣的核酸序列(包括但不限于反义、和siRNA、CRISPR分子以及许多其他分子)的转基因)的载体基因组的5’和3’末端。5’和3’ITR可以均包含相同序列，或各自可以包含不同序列。AAV ITR可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11或任何其他AAV。
本公开的rAAV载体可包含来自不同于衣壳血清型(例如，AAV8、Olig001)的AAV血清型(例如，野生型AAV2、其片段或变体)的ITR。包含来自一种血清型的至少一个ITR，但是包含来自不同血清型的衣壳的此类rAAV载体可称为杂合病毒载体(参见美国专利号7,172,893)。AAV ITR可以包括整个野生型ITR序列，或为其变体、片段或修饰，但是保留功能性。
在一些实施方案中，异源多肽包含位于载体基因组的左末端和右末端(即，分别为5’和3’末端)的ITR(例如，来自AAV2的ITR，但是可以包含来自任何野生型AAV血清型或其变体的ITR)。在一些实施方案中，左(例如，5’)ITR包含或组成为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19的核酸序列。在一些实施方案中，左(例如，5’)ITR包含与SEQ ID NO:5、SEQID NO:12或SEQ ID NO:19约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。在一些实施方案中，右(例如，3’)ITR包含或组成为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19的核酸序列。在一些实施方案中，右(例如，3’)ITR包含与SEQ ID NO:5、SEQID NO:12或SEQ ID NO:19约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。各ITR彼此或与载体基因组中的其他元件呈顺式但是可以通过可变长度的核酸序列如包含编码ASPA的经修饰的核酸和调控元件的重组核酸分开。在一些实施方案中，ITR为AAV2 ITR或其变体，并且侧接ASPA转基因。在一些实施方案中，rAAV包含侧接AAV2 ITR(例如，具有如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19中所示的序列的ITR)的ASPA转基因(例如，包含SEQ ID NO:2的核酸序列)。
在一些实施方案中，rAAV载体基因组是线性的、单链的并且侧接AAV ITR。在转录和翻译异源基因之前，大约4700个核苷酸的单链DNA基因组必须通过DNA聚合酶(例如，转导细胞内的DNA聚合酶)使用自引发ITR中的一个的游离3'-OH来起始第二链合成，从而转化成双链形式。在一些实施方案中，全长单链载体基因组(即，正义和反义)退火以产生全长双链载体基因组。在带有相反极性的基因组(即，正义或反义)的多个rAAV载体同时转导同一细胞时发生可以发生这种情况。不论其如何产生，一旦形成双链载体基因组，细胞就可以转录并翻译双链DNA并且表达异源基因。
来自rAAV载体的转基因表达的效率可受到在表达前需要将单链rAAV基因组(ssAAV)转化成双链DNA的阻碍。此步骤通过使用可以包装反向重复基因组的自身互补AAV基因组(scAAV)来规避，该反向重复基因组可以在不需要DNA合成或多个载体基因组之间的碱基配对的情况下折叠成双链DNA(McCarty，(2008)Molec.Therapy 16(10):1648-1656；McCarty等人,(2001)Gene Therapy 8:1248-1254；McCarty等人,(2003)Gene Therapy 10:2112-2118)。scAAV载体的限制为待包装于衣壳中的独特转基因、调控元件和IRT的大小为ssAAV载体基因组(即，约4,900个核苷酸，包括两个ITR)的大小的约一半(即，约2,500个核苷酸，其中2,200个核苷酸可以是转基因和调控元件，加上约145个核苷酸ITR的两个拷贝)。
通过使用不包含末端解析位点(TRS)的核酸，或通过改变来自包含载体基因组的载体(例如质粒)的一个rAAV ITR的TRS，从而防止复制从该末端起始，来制备scAAV载体基因组(参见美国专利号8,784,799)。宿主细胞内的AAV复制起始于scAAV载体基因组的野生型ITR并且延续至缺少或包含改变的末端解析位点的ITR，然后返回穿过基因组以产生互补链。因此，所得互补单一核酸分子为自身互补核酸分子，其导致载体基因组在中间具有突变的(未解析的)ITR并且在各末端处具有野生型ITR。在一些实施方案中，缺少TRS或包含改变TRS的突变体ITR处于载体基因组的5’末端。在一些实施方案中，缺少TRS或包含未解析(裂解)的改变的TRS的突变体ITR处于载体基因组的3’末端。在一些实施方案中，突变体ITR包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19的核酸。
不希望受理论束缚，虽然scAAV基因组的两个半部是互补的，但是在衣壳内不可能存在大量碱基配对，因为许多碱基与内部衣壳的氨基酸残基接触并且磷酸骨架朝向中心隔离(McCarty，Molec.Therapy(2008)16(10):1648-1656)。scAAV基因组的两个半部可能在脱壳时退火以形成dsDNA发夹分子，其中在一个末端具有共价闭合ITR并且在另一末端具有两个开放式ITR。ITR侧接额外编码转基因和与其呈顺式的调控元件的双链区。
rAAV载体的病毒衣壳可以来自野生型AAV或变体AAV，如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAVrh74(参见WO2016/210170)、AAV12、AAV2i8、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、RHM4-1(WO 2015/013313的SEQID NO:5)、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV hu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9,45、AAV2i8、AAV29G、AAV2,8G9、AVV-LK03、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N、AAV禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV、蛇AAV、山羊AAV、虾AAV、绵羊AAV及其变体(参见例如Fields等人,VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。衣壳可以衍生自美国专利号7,906,111；Gao等人(2004)J.Virol.78:6381；Morris等人(2004)Virol.33:375；WO 2013/063379；WO2014/194132公开的许多AAV血清型；并且包括在WO 2015/121501中公开的真型(truetype)AAV(AAV-TT)变体以及在WO 2015/013313中公开的RHM4-1、RHM15-1至RHM15-6及其变体。本领域技术人员将知道可能存在仍未鉴定的执行相同或类似功能的其他AAV变体。AAVcap蛋白的完全补体包含VP1、VP2和VP3。包含编码AAV VP衣壳蛋白的核苷酸序列的ORF可包含少于完全补体的AAV Cap蛋白或可提供AAV cap蛋白的完全补体。
在另一实施方案中，本公开提供祖先AAV载体用于治疗性体内基因疗法的用途。具体而言，计算机衍生的序列可以从头合成并且表征生物活性。除了组装成rAAV载体以外，祖先序列的预测和合成可以使用WO 2015/054653所描述的方法来完成，其内容通过引用并入本文。值得注意的是，与现代病毒或其部分相比，由祖先病毒序列组装的rAAV载体可以对人类群体中预先存在的免疫力展现出降低的敏感性。
在一些实施方案中，包含由衍生自多于一种AAV血清型(例如，野生型AAV血清型、变体AAV血清型)的核苷酸序列编码的衣壳蛋白的rAAV载体被称为“嵌合载体”或“嵌合衣壳”(参见美国专利号6,491,907，其全部公开通过引用并入本文)。在一些实施方案中，嵌合衣壳蛋白由衍生自2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种AAV血清型的核酸序列编码。在一些实施方案中，重组AAV载体包括衍生自例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVrh74、AAVrh10、AAV2i8或其变体的衣壳序列，由此产生包含任何前述AAV血清型的氨基酸的组合的嵌合衣壳蛋白(参见，Rabinowitz等人(2002)J.Virology 76(2):791-801)。替代性地，嵌合衣壳可以包含来自一种血清型的VP1、来自不同血清型的VP2、来自又一种不同血清型的VP3及其组合的混合物。例如嵌合病毒衣壳可以包括AAV1 cap蛋白或亚基和至少一个AAV2 cap蛋白或亚基。嵌合衣壳可以例如包括具有一个或多个B19 cap亚基的AAV衣壳，例如，AAV cap蛋白或亚基可由B19 cap蛋白或亚基取代。例如，在一个实施方案中，AAV衣壳的VP3亚基可由B19的VP2亚基取代。在一些实施方案中，嵌合衣壳为如WO2014052789所描述的Olig001衣壳并且通过引用并入本文。
在一些实施方案中，嵌合载体经工程改造以展现改变的向性或对于特定组织或细胞类型的向性。术语“向性”指病毒优先进入某些细胞或组织类型中和/或促进进入某些细胞或组织类型中的与细胞表面的优先相互作用。AAV向性通常由不同病毒衣壳蛋白与其同源细胞受体之间的特异性相互作用来确定(Lykken等人(2018)J.Neurodev.Disord.10:16)。优选地，一旦病毒或病毒载体进入细胞，由载体基因组(例如，rAAV载体基因组)携带的序列(例如，异源序列如转基因)被表达。
“向性谱”指一个或多个靶细胞在各种组织和/或器官中的转导模式。例如，嵌合AAV衣壳可具有特征在于少突胶质细胞有效转导且神经元、星形细胞和其他CNS细胞仅低转导的向性谱。参见WO2014/052789，其通过引用并入本文。如果当直接施用至CNS中时，优先转导少突胶质细胞而不是神经元、星形细胞和其他CNS细胞类型，则此嵌合衣壳可被认为“对于少突胶质细胞具有特异性”，展现出对于少突胶质细胞的向性，并且在本文中称为“寡向性”。在一些实施方案中，至少约80％通过对于少突胶质细胞具有特异性的衣壳转导的细胞为少突胶质细胞，例如，至少约85％、90％、95％、96％、97％，98％、99％或更多的转导细胞为少突胶质细胞。
在一些实施方案中，rAAV载体可用于治疗或预防“与少突胶质细胞功能障碍相关的病症”。如本文所用，术语“与少突胶质细胞功能障碍相关”指与在其他方面相同的正常少突胶质细胞相比，少突胶质细胞被破坏、损失或不正确地发挥作用的疾病、病症或病况。该术语包含少突胶质细胞直接受影响的疾病、病症和病况，以及少突胶质细胞继发于其他细胞的破坏而变得功能障碍的疾病、病症或病况。在一些实施方案中，与少突胶质细胞功能障碍相关的病症为卡纳万病(CD)。
在一些实施方案中，具有对于少突胶质细胞的向性的嵌合AAV衣壳为Olig001(也称为BNP61)并且包含来自AAV1、AAV2、AAV6、AAV8和AAV9的序列(参见WO 2014/052789)。在一些实施方案中，Oligo001衣壳VP1由包含或组成为SEQ ID NO:13的核酸序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，Olig001衣壳VP1由与SEQ ID NO:13的核酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸序列编码。
核酸序列编码重叠的AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。Olig001衣壳蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中示出，其中VP1开始于SEQ ID NO:14的氨基酸残基1(甲硫氨酸)，VP2开始于氨基酸残基148(苏氨酸)并且VP3开始于氨基酸残基203(甲硫氨酸)。
在一些实施方案中，具有对于少突胶质细胞的向性的嵌合AAV衣壳为Olig002(也称为BNP62)或Olig003(也称为BNP63)(参见WO 2014/052789)。在一些实施方案中，Oligo002衣壳VP1包含或组成为SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，Olig002衣壳VP1氨基酸序列与SEQ ID NO:15的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在一些实施方案中，核酸包含编码SEQ ID NO:15的氨基酸序列的序列。在一些实施方案中，Oligo003衣壳包含或组成为SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，Olig003衣壳VP1氨基酸序列与SEQ ID NO:16至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在一些实施方案中，核酸包含编码SEQ ID NO:16的氨基酸序列的序列。
在一些实施方案中，包含嵌合AAV衣壳(例如，Olig001)和治疗性转基因的rAAV载体可用于治疗与少突胶质细胞功能障碍相关的疾病、病症或病况。在此疾病、病症或病况中，少突胶质细胞被破坏、损失或不正确地发挥作用。这可以是对少突胶质细胞的直接影响的结果或少突胶质细胞继发于其他细胞的破坏而变得功能障碍时的结果。在一些实施方案中，包含AAV/Olig001衣壳和经修饰的ASPA核酸的rAAV载体用于治疗卡纳万病。
重组核酸
本公开的重组核酸包括经修饰的核酸以及包含经修饰的核酸的质粒和载体基因组。重组核酸、质粒或载体基因组可以包含调控序列以调节(例如，质粒的)扩增和/或控制经修饰的核酸(例如，转基因)的表达。重组核酸也可以作为病毒载体(例如，rAAV载体)的组分提供。通常，病毒载体包括包含包装于衣壳中的重组核酸的载体基因组。
经修饰的核酸
经修饰的基因、核酸或多核苷酸或其变体形式(例如，转基因)指偏离参考序列的核酸。参考序列可以是天然存在的野生型序列(例如，基因)并且可以包括天然存在的变体(例如，剪接变体、选择性阅读框)。本领域技术人员将意识到，参考序列可以发现于公开可用的数据库如GenBank(ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中。与参考序列相比，经修饰的/变体核酸可以具有实质上相同、更大或较小的活性、功能或表达。优选地，如本文中可互换使用的经修饰的或变体核酸展现出改善的蛋白表达，例如，与在其他方面相同的细胞中由内源基因(例如，野生型基因、突变基因)提供的蛋白的表达水平相比，由此编码的蛋白在细胞中以可检测的更高水平表达。在一些实施方案中，如本文中可互换使用的经修饰的或变体核酸(例如，编码ASPA的经修饰的核酸)展现出改善的蛋白表达，例如，与在其他方面相同的细胞中由包含突变的内源基因提供的蛋白的表达水平相比，由此编码的蛋白在细胞中以可检测的更高水平表达。
对核酸的修饰包括参考序列的一个或多个核苷酸取代(例如，1-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-100或更多个核苷酸的取代)、添加(例如，1-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-100或更多个核苷酸的插入)、缺失(例如，1-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-100或更多个核苷酸的缺失，基序、结构域、片段等的缺失)。经修饰的核酸可以与参考序列约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％约97％约98％或约99％相同。
经修饰的核酸可以编码与参考多肽有约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或100％的同一性的多肽。在一些实施方案中，编码ASPA的经修饰的核酸(例如，SEQ ID NO:2)编码与参考多肽(例如，SEQ ID NO:4)有100％的同一性的多肽。
在一些实施方案中，经修饰的核酸(例如，转基因)编码野生型蛋白。此经修饰的核酸可以是密码子优化的。如在本文中可互换提及的“优化的”或“密码子优化的”指编码序列相对于野生型编码序列或参考序列(例如，ASPA多肽的编码序列)已被优化以增加多肽的表达，例如通过最小化稀有密码子的使用、减少CpG二核苷酸的数量、去除隐蔽剪接供体或受体位点、去除Kozak序列、去除核糖体进入位点等进行。在一些实施方案中，与在其他方面相同的细胞中来自野生型基因的蛋白的表达水平相比，来自密码子优化的序列(例如，编码ASPA的经修饰的核酸)的蛋白的表达水平增加。在一些实施方案中，与在其他方面相同的细胞中来自野生型基因的蛋白表达水平相比，来自密码子优化的序列(例如，编码ASPA的经修饰的核酸)的蛋白的表达水平不增加(例如，表达基本相似)。在一些实施方案中，与在其他方面相同的细胞中突变基因的蛋白的表达水平相比，来自密码子优化的序列(例如，编码ASPA的经修饰的核酸)的蛋白的表达水平增加。
修饰的实例包括消除一个或多个顺式作用基序和引入一个或多个Kozak序列。在一些实施方案中，消除一个或多个顺式作用基序并且引入一个或多个Kozak序列。
可消除的顺式作用基序的实例包括内部TATA盒；chi位点；核糖体进入位点；ARE、INS和/或CRS序列元件；重复序列和/或RNA二级结构；(隐蔽)剪接供体和/或受体位点、分支点；和限制位点。
在一些实施方案中，经修饰的核酸编码经修饰的或变体多肽。由经修饰的核酸编码的经修饰的多肽可保留由野生型编码的或参考序列编码的多肽的功能或活性的全部或部分。在一些实施方案中，经修饰的多肽具有一个或多个非保守或保守氨基酸变化。在一些实施方案中，已证明在多肽的功能中发挥有限作用或没有作用的某些结构域不存在于经修饰的多肽(例如，某些结合结构域)中(例如，WO 2016/097219)。存在于rAAV载体中的经修饰的核酸由于rAAV衣壳的包装能力可以包含比野生型编码的或参考序列更少的核苷酸(例如，缩短的微型肌营养不良蛋白转基因，参见WO 2001/83695；B-结构域缺失人因子VIII转基因，参见WO 2017/074526)，并且也包括截短的和密码子优化的缩短的转基因(例如，WO2017/221145所描述的密码子优化的微型肌营养不良蛋白转基因)。在一些实施方案中，与由参考序列编码的多肽的功能或活性相比，由经修饰的核酸编码的多肽具有更少、相同或更大的功能或活性，但是至少具有功能或活性的一部分。
相对于参考和/或野生型序列(例如，野生型ASPA编码的序列)，经修饰的核酸可以具有改变的GC含量(例如，存在于核酸序列中的G和C核苷酸的数量)、改变(例如，增加或减少)的CpG二核苷酸含量和/或改变(例如，增加或减少)的密码子适应指数(CAI)。参见，例如，WO 2017/077451(讨论本领域公知的对于感兴趣的核酸序列进行密码子优化的各种考虑因素，包括用于分析核酸序列以进行优化的公开可用的软件)。如本文所用，改变指特定值、量或效果的减少或增加。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的核酸序列的GC含量相对于参考和/或野生型基因或编码序列增加。经修饰的核酸的GC含量比野生型编码序列(例如，SEQ ID NO:3)的GC含量高至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少12％、至少14％、至少15％、至少17％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％。在一些实施方案中，GC含量表示为序列中的G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶)核苷酸的百分比。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的核酸序列的密码子适应指数为至少0.74、至少0.76、至少0.77、至少0.80、至少0.85、至少0.86、至少0.87、至少0.90、至少0.95或至少0.98。
在一些实施方案中，与野生型或参考核酸序列相比，本公开的经修饰的核酸序列具有降低的CpG二核苷酸的水平，降低约10％、20％、30％、50％或更多。在一些实施方案中，经修饰的核酸比参考序列(例如，野生型序列)少1-5、少5-10、少10-15、少15-20、少20-25、少25-30、少30-40、少40-45或少45-50或少甚至更多个二核苷酸。
已知CpG二核苷酸的甲基化在真核生物中的基因表达的调控中发挥重要作用。具体而言，真核生物中的CpG二核苷酸的甲基化基本上通过干扰转录机制来使基因表达沉默。因此，由于CpG基序的甲基化引起的基因沉默，具有减少的CpG二核苷酸数量的核酸和载体提供高且更持久的转基因表达水平。
经修饰的核酸序列可包括侧接限制位点以促进亚克隆到表达载体中。许多此类限制位点在本领域中是众所周知的，并且包括但不限于图13中示出的限制位点如AvaI、XmaI和XmaI。
本公开包含SEQ ID NO:1-3中示出的序列中任一个的片段并且其编码ASPA多肽的功能活性片段。“功能活性”或“功能性ASPA多肽”指示片段提供与全长ASPA多肽相同或相似的生物功能和/或活性。即，片段提供相同的活性，包括但不限于将NAA转换成乙酸盐和天冬氨酸盐的能力。ASPA或其功能片段的生物活性还涵盖如在本文中别处和在nur7小鼠中所证明的逆转或预防与卡纳万病相关的神经退行性表型。
本公开提供经修饰的ASPA核酸序列，其编码ASPA多肽并且与野生型核酸序列(例如SEQ ID NO:3；GenBank登录号NM_000049.4或NM_001128085.1，其具有替代5’UTR但是编码相同ASPA蛋白(SEQ ID NO:4))相比，包含至少一个修饰。
在一些实施方案中，编码ASPA的经修饰的核酸是编码野生型ASPA多肽(例如，SEQID NO:4)的密码子优化的核酸并且包含序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，编码ASPA的经修饰的核酸是密码子优化的核酸并且由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列组成。在一些实施方案中，编码ASPA的经修饰的核酸是密码子优化的核酸并且包含与SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的序列至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的序列。
在一些实施方案中，包含编码ASPA的经修饰的核酸的细胞表现出增加的蛋白表达，例如，与包含野生型ASPA核酸的在其他方面相同的细胞或包含编码ASPA的突变体核酸的在其他方面相同的细胞中蛋白的表达水平相比，由此编码的蛋白在细胞中以可检测的更高水平表达。在一些实施方案中，与包含野生型ASPA核酸的在其他方面相同的细胞中的ASPA蛋白表达水平相比，包含编码ASPA的经修饰的核酸(例如，包含SEQ ID NO:2的核酸序列)的细胞中的ASPA蛋白表达水平增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约120％、约140％、约150％、约200％、约300％、约400％或更多。在一些实施方案中，与包含编码ASPA的突变体核酸的在其他方面相同的细胞中的ASPA蛋白表达水平相比，包含编码ASPA的经修饰的核酸(例如，包含SEQ ID NO:2的核酸序列)的细胞中的ASPA蛋白表达水平增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约120％、约140％、约150％、约200％、约300％、约400％或更多。
在一些实施方案中，这可以称为“表达优化的”或“增强的表达”核酸，或简称为“经修饰的核酸”。
普通技术人员会理解，由本公开的经修饰的核酸及其变体(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)编码的多肽是“功能性ASPA多肽”，其提供与由编码ASPA的野生型核酸(例如，SEQ ID NO:3)编码的ASPA多肽相同或相似的生物功能和/或活性。即，由编码ASPA的经修饰的核酸编码的ASPA多肽提供相同的活性，包括但不限于将NAA转换成乙酸盐和天冬氨酸盐的能力。ASPA的生物活性涵盖如在本文中别处和在nur7小鼠中所证明的逆转或预防与卡纳万病相关的神经退行性表型，包括但不限于转棒掉落等待时间(rotarod latency tofall)表现改善、旷场通过距离改善、脑组织中的NAA减少、脑(例如，丘脑、小脑白质/脑桥)中的空泡体积减少、脑(例如，丘脑、皮层)中的Olig2阳性细胞增加和/或皮质髓鞘形成增加。
调控元件
本公开包含重组核酸，其包括编码ASPA的经修饰的核酸和各种调控或控制元件。通常，调控元件为影响可操作地连接的多核苷酸的表达的核酸序列。可用于基因表达的调控元件的精确性质不同生物体以及不同细胞型间有所不同，包括例如启动子、增强子、内含子等，目的在于促进正确的异源多核苷酸转录和翻译。调控控制可以在转录、翻译、剪接、信号稳定性等水平上受到影响。通常，调节转录的调控控制元件并列于转录多核苷酸的5’末端附近(即，上游)。调控控制元件也可以位于转录序列的3’末端(即，下游)或在转录物内(例如，在内含子中)。调控控制元件可位于远离转录序列的位置处(例如，1至100、100至500、500至1000、1000至5000、5000至10,000或更多个核苷酸)。然而，由于AAV载体基因组的长度，调控控制元件通常在距多核苷酸的1至1000个核苷酸的范围内。
启动子
如本文所用，术语“启动子”如“真核启动子”指在真核细胞(例如，少突胶质细胞)中起始特定基因或一个或多个编码序列(例如，ASPA编码序列)的转录的核苷酸序列。启动子可与其他调控元件或区域一起运作以指导基因或编码序列的转录水平。此类调控元件包括例如转录结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点以及已知直接或间接地起作用以调控来自启动子的转录量的其他核苷酸序列，包括例如衰减子、增强子和沉默子。启动子通常位于相同链上并且接近转录起始位点，即与其可操作地连接的基因或编码序列的5’。启动子的长度通常为100–1000个核苷酸。相对于不存在启动子时相同基因的表达，启动子通常使基因表达增加。
如本文所用，“核心启动子”或“最小启动子”指正确地起始转录所需要的启动子序列的最小部分。其可包括以下中的任一个：转录起始位点、RNA聚合酶结合位点和一般转录因子结合位点。启动子也可以包含含有其他主要调控元件(例如，增强子、沉默子、边界元件、绝缘子)的近端启动子序列(核心启动子的5’)以及远端启动子序列(核心启动子的3’)。
合适启动子的实例包括：腺病毒启动子，例如腺病毒主要晚期启动子；异源启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒启动子；劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子；白蛋白启动子；诱导型启动子，例如小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子；金属硫蛋白启动子；热休克启动子；α-1-抗胰蛋白酶启动子；乙型肝炎表面抗原启动子；转铁蛋白启动子；载脂蛋白A-1启动子；鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子，延伸因子1a启动子(EF1a)，CBA启动子的杂交形式(CBh启动子)和CAG启动子(巨细胞病毒早期增强子和启动子、鸡β-肌动蛋白基因的第一外显子及第一内含子以及兔β-珠蛋白基因的剪接受体)(Alexopoulou等人(2008)BioMed.Central Cell Biol.9:2)；以及人ASPA基因启动子。在一些实施方案中，启动子为CBh启动子的片段或变体并且包含或组成为SEQ ID NO:7的核酸序列。
在本公开的一些实施方案中，真核启动子序列(例如，CBh启动子)可操作地连接至编码ASPA的经修饰的核酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:7的核酸序列的启动子(例如，CBh启动子)可操作地连接至编码ASPA的经修饰的核酸。在一些实施方案中，包含或组成为与SEQ ID NO:7的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸序列的启动子可操作地连接至包含SEQ ID NO:2的核酸序列的核酸。在一些实施方案中，包含与SEQ ID NO:7的核酸序列至少95％相同的核酸序列的启动子可操作地连接至与SEQ ID NO:2的核酸序列至少95％相同的核酸序列并且在少突胶质细胞中诱导由SEQ ID NO:2的核酸序列编码的多肽的表达。在一些实施方案中，与在其他方面相同的细胞中由不可操作地连接至包含SEQ ID NO:7的核酸的启动子的包含SEQ ID NO:2的核酸序列的核酸编码的多肽的表达水平相比，由可操作地连接至包含含有SEQ ID NO:7的核酸的启动子的包含SEQ ID NO:2的核酸序列的核酸编码的多肽在细胞中的表达水平可检测的更高。在一些实施方案中，包含含有与SEQ ID NO:7的核酸序列至少95％相同的核酸序列的启动子的重组核酸可操作地连接至与SEQ ID NO:2的核酸序列至少95％相同的核酸序列并且在少突胶质细胞中诱导由SEQ ID NO:2的核酸序列编码的多肽的表达。
启动子可以是组成型的、组织特异性的或受调控的。组成型启动子是导致可操作地连接的基因基本上在所有时候都表达的启动子。在一些实施方案中，在大多数生理和发育条件下，组成型启动子在大多数真核组织中有活性。
受调控的启动子是可以被激活或失活的启动子。受调控的启动子包括通常“关闭”但是可被诱导以“开启”的诱导型启动子和通常“开启”但是可“关闭”的“抑制型”启动子。许多不同调控因子为已知的，包括温度、激素、细胞因子、重金属和调控蛋白。区别并非绝对的；组成型启动子可以经常在某种程度上受到调控。在一些情况下，内源通路可用于提供转基因表达的调控，例如，使用在病理状况改善时自然地下调的启动子。
组织特异性启动子是仅在特定类型的组织、细胞或器官中有活性的启动子。通常，组织特异性启动子由对于特定组织、细胞及/或器官具有特异性的转录激活元件来识别。例如，与在其他组织中相比，组织特异性启动子可以在一各或多个特定组织(例如，两个、三个或四个)中更具活性。在一些实施方案中，与在其他组织中相比，由组织特异性启动子调控的基因的表达在启动子对其具有特异性的组织中高得多。在一些实施方案中，在除了启动子对其具有特异性的组织以外的任何组织中，启动子可能几乎没有活性或基本上没有活性。启动子可以是组织特异性启动子，如小鼠白蛋白启动子或运甲状腺素蛋白启动子(TTR)，它们在肝脏细胞中具有活性。组织特异性启动子的其他实例包括来自编码骨骼α-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌营养不良蛋白、肌肉肌酸激酶的基因的启动子，其诱导骨骼肌中的表达(Li等人(1999)Nat.Biotech.17:241-245)。肝脏特异性表达可使用来自白蛋白基因的启动子(Miyatake等人(1997)J.Virol.71:5124-5132)、乙型肝炎病毒核心启动子(Sandig，等人(1996)Gene Ther.3:1002-1009)和α-胎蛋白(Arbuthnot等人，(1996)Hum.Gene.Ther.7:1503-1514)来诱导。
增强子
在另一方面，编码治疗性多肽的经修饰的核酸进一步包含增加治疗性多肽(例如，ASPA蛋白)的表达的增强子。通常，增强子元件位于启动子元件的上游但是也可以位于下游或在另一个序列(例如，转基因)内。增强子可位于经修饰的核酸的上游或下游100个核苷酸、200个核苷酸、300个或更多个核苷酸处。增强子通常增加经修饰的核酸(例如，编码治疗性多肽的，例如，编码ASPA的)的表达，其超过通过单独的启动子元件提供的增加的表达。
许多增强子是本领域已知的，包括但不限于巨细胞病毒主要立即早期增强子。更具体而言，巨细胞病毒(CMV)MIE启动子包含三个区域：调节子、独特区域和增强子(Isomura和Stinski(2003)J.Virol.77(6):3602-3614)。CMV增强子区域可与另一个启动子或其一部分组合，以形成杂合启动子，从而进一步增加与其可操作地连接的核酸的表达。例如，鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或其一部分可以与CMV启动子/增强子或其一部分组合，以制备代表鸡β-肌动蛋白杂合启动子的称为“CBh”启动子的CBA形式，如Gray等人(2011,Human GeneTherapy 22:1143-1153)所描述。与启动子一样，增强子可以是组成型的、组织特异性的或受调控的。
在本公开的一些实施方案中，增强子序列(例如，CMV增强子)可操作地连接至编码ASPA的经修饰的核酸。在一些实施方案中，包含或组成为SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列的增强子(例如，CMV增强子)可操作地连接至编码ASPA的经修饰的核酸。在一些实施方案中，包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸序列的增强子可操作地连接至包含SEQ IDNO:2的核酸序列的核酸，并且任选地可操作地连接至包含SEQ ID NO:7的核酸序列的启动子。在一些实施方案中，包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列至少95％相同的核酸序列的增强子可操作地连接至与SEQ ID NO:2的核酸序列至少95％相同的核酸序列并且在少突胶质细胞中诱导由SEQ ID NO:2的核酸序列编码的多肽的表达。在一些实施方案中，包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列至少95％相同的核酸序列的增强子可操作地连接至与SEQ ID NO:7的核酸序列至少95％相同的核酸序列，并且可操作地连接至与SEQID NO:2的核酸序列至少95％相同的核酸序列，并且SEQ ID NO:6(或SEQ ID NO:17)和SEQID NO:7的核酸序列一起在少突胶质细胞中诱导由SEQ ID NO:2的核酸序列编码的多肽的表达。在一些实施方案中，与在其他方面相同的细胞中由不可操作地连接至包含SEQ IDNO:5的核酸的增强子的SEQ ID NO:2编码的多肽的表达水平相比，由可操作地连接至包含SEQ ID NO:6(或SEQ ID NO:17)的核酸序列的增强子的SEQ ID NO:2的核酸序列编码的多肽在细胞中的表达水平可检测的更高。在一些实施方案中，重组核酸包含含有与SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列至少95％相同的核酸序列的增强子，其可操作地连接至与SEQ ID NO:7的核酸序列至少95％相同的核酸序列，并且可操作地连接至与SEQ ID NO:2的核酸序列至少95％相同的核酸序列，并且SEQ ID NO:6(或SEQ ID NO:17)和SEQ ID NO:7的核酸序列一起在少突胶质细胞中诱导由SEQ ID NO:2的核酸序列编码的多肽的表达。
填充区(filler)、间隔区和充填区(stuffer)
如本文所公开，计划用于rAAV载体中的重组核酸可以包括额外的核酸元件以将核酸的长度调整至接近将AAV包装至rAAV载体中可接受的病毒基因组序列的正常大小(例如，大约4.7至4.9千碱基)或调整至该正常大小(Grieger和Samulski(2005)J.Virol.79(15):9933-9944)。此序列可以互换地称为填充区、间隔区或充填区。在一些实施方案中，填充区DNA为核酸的未翻译(非蛋白编码)链段。在一些实施方案中，填充区或充填区多核苷酸序列是长度在约1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90-90-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1000、1000-1500、1500-2000、2000-3000之间或更长的序列。
AAV载体通常接受具有大小在约4kb至约5.2kb或约4.1至4.9kb的范围内的DNA插入以将核酸最佳包装至AAV衣壳中。在一些实施方案中，rAAV载体包含总长度在约3.0kb至约3.5kb、约3.5kb至约4.0kb、约4.0kb至约4.5kb、约4.5kb至约5.0kb或约5.0kb至约5.2kb之间的载体基因组。在一些实施方案中，rAAV载体包含总长度为约4.7kb的载体基因组。在一些实施方案中，rAAV载体包含自身互补的载体基因组。虽然rAAV载体中的自身互补(sc)载体基因组的总长度等于单链(ss)载体基因组(即，约4kb至约5.2kb)，但是编码sc载体基因组的核酸序列(即，包含转基因、调控元件和ITR)必须仅为编码ss载体基因组的核酸序列的一半长度，以将sc载体基因组包装在衣壳中。
内含子和外显子
在一些实施方案中，重组核酸包括例如内含子、外显子和/或其部分。内含子可以作为填充区或充填区多核苷酸序列发挥功能以实现将载体基因组包装至rAAV载体中的合适长度。与在不存在内含子和/或外显子元件时的表达相比，内含子和/或外显子序列也可以增强多肽(例如，转基因)的表达(Kurachi等人(1995)J.Biol.Chem.270(10):576-5281；WO 2017/074526)。此外，填充区/充填区多核苷酸序列(也被称为“绝缘子”)在本领域中是众所周知的并且包括但不限于WO 2014/144486和WO 2017/074526所描述的多核苷酸序列。
内含子元件可衍生自与异源多核苷酸相同的基因，或衍生自完全不同基因或其他DNA序列(例如，鸡β-肌动蛋白基因、小鼠微小病毒(MVM))。在一些实施方案中，重组核酸包括选自衍生自非同源基因(即，非衍生自经修饰的核酸，例如，转基因)的内含子和外显子的至少一个元件。在一些实施方案中，内含子衍生自鸡β-肌动蛋白基因，例如包含或组成为SEQ IDNO:9的核酸序列。在一些实施方案中，内含子包含与SEQ ID NO:9的核酸序列约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。在一些实施方案中，内含子衍生自MVM，例如包含或组成为SEQ ID NO:10的核酸序列。在一些实施方案中，内含子包含与SEQ ID NO:10的核酸序列约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。在一些实施方案中，外显子衍生自鸡β-肌动蛋白基因，例如包含或组成为SEQ ID NO:8的核酸序列。在一些实施方案中，外显子包含与SEQ ID NO:8的核酸序列约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或100％相同的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含增强子序列(例如，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17)、启动子序列(例如，SEQ ID NO:7)、外显子(例如，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18)和内含子(例如，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10)中的至少一个并且调控任选地由SEQ ID NO:2的核酸序列编码的异源多肽的表达。在一些实施方案中，与在其他方面相同的细胞中由不可操作地连接至此类调控元件的SEQ ID NO:2的核酸序列编码的多肽的表达水平相比，由可操作地连接至包含以下中至少一个的调控区域的SEQ ID NO:2的核酸序列编码的多肽在细胞中的表达水平可检测的更高：增强子序列(例如，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17)、启动子序列(例如，SEQ ID NO:7)、外显子(例如，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18)和内含子(例如，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10)。
在一些实施方案中，重组核酸包含经修饰的SEQ ID NO:2的核酸，其可操作地连接至包含以下中至少一个的调控元件：增强子序列(例如，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17)、启动子序列(例如，SEQ ID NO:7)、外显子(例如，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18)和内含子(例如，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10)。
多聚腺苷酸化信号序列(polyA)
另外的调控元件可包括终止密码子、终止序列和多聚腺苷酸化(polyA)信号序列，例如但不限于牛生长激素polyA信号序列(BHG polyA)。polyA信号序列驱动在真核mRNA的3’末端处有效添加指导基因转录终止的多聚腺苷“尾”(参见，例如，Goodwin和RottmanJ.Biol.Chem.(1992)267(23):16330-16334)。polyA信号作为新形成的前体mRNA在其3’末端的内切核酸切割并且向此3’末端添加仅由腺嘌呤碱基组成的RNA片段的信号。polyA尾对于mRNA的细胞核输出、翻译和稳定性很重要。在一些实施方案中，polyA是SV40早期多聚腺苷酸化信号、SV40晚期多聚腺苷酸化信号、HSV胸苷激酶多聚腺苷酸化信号、鱼精蛋白基因多聚腺苷酸化信号、腺病毒5E1b多聚腺苷酸化信号、生长激素多聚腺苷酸化信号、PBGD多聚腺苷酸化信号或计算机设计的多聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，并且任选地与本文所述的一个或多个其他调控元件组合，重组核酸的polyA信号序列是能够指导和影响由编码ASPA的经修饰的核酸(例如，SEQ ID NO:2)的转录所产生的前体mRNA的内切核酸切割和多聚腺苷酸化的polyA信号。在一些实施方案中，polyA序列包含或组成为SEQ ID NO:11的核酸序列。在一些实施方案中，polyA序列包含与SEQ ID NO:11的核酸序列约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或100相同的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含增强子序列(例如，SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:17)、启动子序列(例如，SEQ ID NO:7)、外显子(例如，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18)、内含子(例如，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10)和polyA(SEQ ID NO:11)中的至少一个并且调控任选地由SEQ ID NO:2的核酸序列编码的异源多肽的表达。
在一些实施方案中，对于少突胶质细胞具有向性的rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)含有自身互补载体基因组，该基因组包含AAV ITR(例如，AAV2 ITR)和包含编码ASPA的经修饰(亦即，密码子优化)的核酸以及以下调控元件中至少一个的重组核酸：增强子(例如，CMV增强子)、启动子(例如，CBh启动子)、外显子(例如，CBA外显子1)、内含子(例如，CBA内含子、MVM内含子)和polyA(例如，BHG polyA)。
在一些实施方案中，对于少突胶质细胞具有向性的rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)含有自身互补基因组，该基因组包含AAV ITR(例如，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12和/或SEQ ID NO:19)和包含编码ASPA的经修饰的(即，密码子优化的)核酸(例如，SEQ ID NO:2)以及以下调控元件中至少一个的重组核酸：增强子(例如，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17)、启动子(例如，SEQ ID NO:7)、外显子(例如，CBA外显子SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18)、内含子(例如，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)和polyA(例如，SEQ ID NO:11)。
在一些实施方案中，对于少突胶质细胞具有向性的rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)含有包含SEQ ID NO:20的自身互补基因组。
本公开的rAAV载体的生物活性
在一些实施方案中，本公开的rAAV载体(例如，包含ASPA转基因)转导靶细胞(例如，少突胶质细胞)并且介导生物活性。在一些实施方案中，rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)转导靶细胞(例如，少突胶质细胞)并且介导选自以下的至少一种可检测活性：
(i)在体外降低细胞中的NAA水平；
(ii)改善、增加和/或增强平衡、握力和/或运动协调；
(iii)改善、增加和/或增强掉落等待时间(秒)；
(iv)改善、增加和/或增强广义运动功能；
(v)降低、抑制和/或中和体内NAA水平的积累；
(vi)降低、抑制和/或中和丘脑中的空泡体积分数；
(vii)降低、抑制和/或中和小脑白质/脑桥中的空泡体积分数；
(viii)改善、增加和/或增强丘脑中的少突胶质细胞的数量；
(ix)改善、增加和/或增强皮层中的少突胶质细胞的数量；
(x)改善、增加和/或增强丘脑中的神经元的数量；
(xi)改善、增加和/或增强皮层中的神经元的数量；以及
(xii)改善、增加和/或皮质髓鞘形成。
在一些实施方案中，转导靶细胞(例如，少突胶质细胞)并且介导(i)至(xii)中的至少一种可检测活性的rAAV载体是AAV/Oligo001-ASPA。
在一些实施方案中，与用包含编码ASPA的野生型核酸序列(例如，SEQ ID NO:3)的rAAV转导的在其他方面相同的细胞中的NAA水平相比，用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)转导的细胞的NAA水平降低。在一些实施方案中，与用包含编码ASPA的替代密码子优化的核酸(例如，SEQ ID NO:1)的rAAV转导的在其他方面相同的细胞中的NAA水平相比，用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)转导的细胞的NAA水平降低。在一些实施方案中，与未转导的包含编码ASPA的突变体核酸的在其他方面相同的细胞中的NAA水平相比，用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)转导的细胞的NAA水平降低。
在一些实施方案中，与在体内用包含编码ASPA的野生型核酸序列(例如，SEQ IDNO:3)的rAAV转导的在其他方面相同的细胞中的NAA水平相比，在体内用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)转导的细胞的NAA水平降低。在一些实施方案中，与在体内用包含编码ASPA的替代密码子优化的核酸(例如，SEQ ID NO:1)的rAAV转导的在其他方面相同的细胞中的NAA水平相比，在体内用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)转导的细胞的NAA水平降低。在一些实施方案中，与未转导的包含突变体核酸的在其他方面相同的细胞中的NAA水平相比，在体内用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)转导的细胞的NAA水平降低。
在一些实施方案中，如通过例如转棒表现所测量的，与未施用rAAV载体的具有ASPA基因突变的在其他方面相似的受试者的平衡、握力和/或运动协调相比，或与施用rAAV载体之前的同一受试者相比，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者中的平衡、握力和/或运动协调显著改善。
在一些实施方案中，如通过例如转棒表现所测量的，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者的平衡、握力和/或运动协调与没有ASPA基因突变并且未施用rAAV载体的在其他方面相似的受试者中的平衡、握力和/或运动协调没有区别。在一些实施方案中，rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)经由脑室内(ICV)施用途径来施用。在一些实施方案中，滚轮表现测量为以秒为单位的掉落等待时间。
在一些实施方案中，如通过例如旷场活动性所测量的，与未施用rAAV载体的具有ASPA基因突变的在其他方面相似的受试者的广义运动功能相比，或与施用rAAV载体之前的受试者中的功能相比，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者中的广义运动功能显著改善。在一些实施方案中，rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)经由脑室内(ICV)施用途径来施用。
在一些实施方案中，如通过例如旷场活动性所测量的，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者中的广义运动功能与没有ASPA基因突变并且未施用rAAV的在其他方面相似的受试者中的广义运动功能没有区别。在一些实施方案中，rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)经由脑室内(ICV)施用途径来施用。
在一些实施方案中，与未施用rAAV载体的具有ASPA基因突变的在其他方面相似的受试者的脑中的NAA水平相比，或与施用rAAV载体之前的受试者中的NAA水平相比，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者的脑中的NAA水平显著降低。在一些实施方案中，与没有ASPA基因突变并且未施用rAAV载体的在其他方面相似的受试者的脑中的NAA水平相比，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者的脑中的NAA水平降低或没有区别。
在一些实施方案中，与未施用rAAV载体的具有ASPA基因突变的在其他方面相似的受试者的丘脑中的空泡分数相比，或与施用rAAV载体之前的受试者相比，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者的丘脑中的空泡体积分数显著降低，其中空泡分率通过例如无偏体视学来测量。在一些实施方案中，与未施用rAAV载体的具有ASPA基因突变的在其他方面相似的受试者的小脑白质/脑桥中的空泡分数相比，或与施用rAAV载体之前的受试者相比，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者的小脑白质/脑桥中的空泡体积分数显著降低，其中空泡分数通过例如无偏体视学来测量。
在一些实施方案中，与未施用载体的具有ASPA基因突变的在其他方面相似的受试者的丘脑中的少突胶质细胞的数量相比，或与施用载体之前的受试者相比，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者的丘脑中的少突胶质细胞的数量显著增加，其中丘脑中的少突胶质细胞的数量通过例如使用Olig2抗体的IHC和无偏体视学来测量。在一些实施方案中，与未施用rAAV载体的具有ASPA基因突变的在其他方面相似的受试者的大脑皮层中的少突胶质细胞的数量相比，或与施用载体之前的同一受试者相比，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者的大脑皮层中的少突胶质细胞的数量显著增加，其中大脑皮层中的少突胶质细胞的数量通过例如使用Olig2抗体的IHC和无偏体视学来测量。在一些实施方案中，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者的大脑皮层中的少突胶质细胞的数量与没有ASPA基因突变并且未施用rAAV载体的在其他方面相似的受试者的大脑皮层中的少突胶质细胞的数量没有区别，其中大脑皮层中的少突胶质细胞的数量通过例如使用Olig2抗体的IHC和无偏体视学来测量。
在一些实施方案中，与未施用rAAV载体的具有ASPA基因突变的在其他方面相同受试者的丘脑中的神经元的数量相比，或与施用载体之前的受试者相比，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者的丘脑中的神经元的数量显著增加，其中丘脑中的神经元的数量通过例如使用NeuN抗体的IHC和无偏体视学来测量。在一些实施方案中，与未施用rAAV载体的具有ASPA基因突变的在其他方面相似受试者的大脑皮层中的神经元的数量相比，或与施用载体之前的受试者相比，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者的大脑皮层中的神经元的数量显著增加，其中大脑皮层中的神经元的数量通过例如使用NeuN抗体的IHC和无偏体视学来测量。在一些实施方案中，施用rAAV载体(例如，AAV/Olig001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者的大脑皮层中的神经元的数量与没有ASPA基因突变并且未施用rAAV载体的在其他方面相似的受试者的大脑皮层中的神经元的数量没有区别，其中大脑皮层中的神经元的数量通过例如使用NeuN抗体的IHC和无偏体视学来测量。
在一些实施方案中，与未施用rAAV载体的具有ASPA基因突变的在其他方面相似的受试者的脑中的皮质髓鞘形成相比，或与施用载体之前的受试者的脑中的皮质髓鞘形成相比，施用rAAV载体(例如，AAV/Oligo001-ASPA)的具有ASPA基因突变的受试者的脑中的皮质髓鞘形成显著增加，其中皮质髓鞘形成通过例如皮质髓磷脂碱性蛋白正纤维长度密度(MBP-LD)来测量。
病毒载体的组装
携带转基因(例如，ASPA)的病毒载体(例如，rAAV载体)由编码转基因的多核苷酸、合适调控元件和产生介导细胞转导的病毒蛋白所必需的元件组装而成。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒和腺相关病毒(AAV)载体，特别是rAAV载体(如前所述)。
根据本公开的方法产生的rAAV载体的载体基因组组分包括至少一个转基因，例如编码ASPA的经修饰的核酸和控制编码ASPA的经修饰的核酸的表达的相关表达控制序列。
在优选实施方案中，载体基因组包含细小病毒基因组的一部分，如其中rep和cap缺失和/或由经修饰的核酸(例如，转基因，例如，编码ASPA的经修饰的核酸)取代的AAV基因组及其相关联的表达控制序列。编码ASPA的经修饰的核酸通常相邻地插入至一个或两个(即，侧接于)足以用于病毒复制的AAV ITR或ITR元件(Xiao等人(1997)J.Virol.71(2):941-948)，取代编码病毒rep和cap蛋白的核酸。也可以包括适合用于促进编码ASPA的经修饰的核酸在靶细胞(例如，少突胶质细胞)中的组织特异性表达的其他调控序列。
包装细胞
本领域技术人员将理解包含转基因并且缺少病毒复制所需要的病毒蛋白(例如，cap和rep)的rAAV载体不能复制，因为此类蛋白对于病毒复制和包装是必不可少的。Cap和rep基因可作为与向载体基因组提供转基因的质粒分开的质粒的一部分来提供给细胞(例如，宿主细胞，例如，包装细胞)。
“包装细胞”或“生产细胞”指以下细胞或细胞系，该细胞或细胞系可以用载体、质粒或DNA构建体转染并且反式提供病毒载体的完全复制和包装所需要的所有缺失功能。rAAV载体组装的所需基因包括载体基因组(例如，编码ASPA的经修饰的核酸、调控元件和ITR)、AAV rep基因、AAV cap基因和来自其他病毒如例如腺病毒的某些辅助基因。普通技术人员将理解，AAV产生所需的基因可以以各种方式包括例如一各或多个质粒的转染引入包装细胞中。然而，在一些实施方案中，一些基因(例如，rep基因、cap基因、辅助基因)可以已经存在于包装细胞中，或整合至基因组中或携带于附加体上。在一些实施方案中，包装细胞以组成型或可诱导方式来表达一种或多种缺失病毒功能。
本领域中已知的任何合适包装细胞均可用于产生包装病毒载体。哺乳动物细胞或昆虫细胞是优选的。可用于在本公开的实践中产生包装细胞的细胞的实例包括例如人细胞系，如PER.C6、WI38、MRC5、A549、HEK293细胞(其在组成型启动子的控制下表达功能性腺病毒E1)、B-50或任何其他HeLa细胞、HepG2、Saos-2、HuH7和HT1080细胞系。合适的非人哺乳动物细胞系包括例如VERO、COS-1、COS-7、MDCK、BHK21-F、HKCC或CHO细胞。
在一些实施方案中，包装细胞能够在悬浮培养物中生长。在一些实施方案中，包装细胞能够在无血清培养基中生长。例如，HEK293细胞在无血清培养基中悬浮生长。在另一实施方案中，包装细胞为如美国专利号9,441,206所描述并且寄存为美国典型培养物保藏中心(ATCC)号PTA 13274的HEK293细胞。许多rAAV包装细胞系在本领域中为已知的，包括但不限于WO 2002/46359中所公开的那些。
作为包装细胞使用的细胞系包括昆虫细胞系。允许复制AAV并且可维持在培养物中的任何昆虫细胞均可根据本公开来使用。实例包括草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(如Sf9或Sf21)细胞系、果蝇属(Drosophila spp.)细胞系或蚊子细胞系(例如，白纹伊蚊(Aedes albopictus)衍生细胞系)。优选的细胞系是草地贪夜蛾Sf9细胞系。以下参考文献由于其教导涉及昆虫细胞用于表达异源多肽的用途、将核酸引入此类细胞中的方法和将此类细胞维持在培养物中的方法而并入本文中：Methods in MolecularBiology,Richard编,Humana Press,NJ(1995)；O'Reilly等人,Baculovirus ExpressionVectors:A Laboratory Manual,Oxford Univ.Press(1994)；Samulski等人(1989)J.Virol.63:3822-3828；Kajigaya等人(1991)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88:4646-4650；Ruffing等人(1992)J.Virol.66:6922-6930；Kimbauer等人(1996)Virol.219:37-44；Zhao等人(2000)Virol.272:382-393；和美国专利号6,204,059。
作为进一步的替代方案，本公开的病毒载体可以在昆虫细胞中使用递送rep/cap基因和rAAV模板的杆状病毒载体来产生，如例如Urabe等人(2002)Human Gene Therapy13:1935-1943所描述。当使用杆状病毒产生AAV时，在一些实施方案中，载体基因组为自身互补的。在一些实施方案中，宿主细胞是杆状病毒感染的细胞(例如，昆虫细胞)，其任选地包含编码杆状病毒辅助功能的额外核酸，由此促进病毒衣壳的产生。
包装细胞通常包括一种或多种病毒载体功能以及足以导致病毒载体的复制和包装的辅助功能和包装功能。这些不同的功能可以使用遗传构建体如质粒或扩增子来一起或单独地提供至包装细胞，并且其可以存在于细胞系的染色体外或整合至宿主细胞的染色体中。在一些实施方案中，包装细胞用至少以下转染：i)包含载体基因组的质粒，该载体基因组包含密码子优化的人ASPA转基因(例如，SEQ ID NO:2)和AAV ITR(例如，SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:12)并且进一步包含以下调控元件中的至少一个：增强子(例如，SEQ ID NO:6)、启动子(例如，SEQ ID NO:7)、外显子(例如，CBA外显子SEQ ID NO:8)、内含子(例如，SEQ IDNO:9及SEQ ID NO:10)和polyA(例如，SEQ ID NO:11)；以及ii)包含rep基因(例如，AAV2rep)和cap基因(例如，Olig001 cap)的质粒。
在一些实施方案中，向宿主细胞提供并入例如宿主细胞系内的一种或多种包装或辅助功能，该宿主细胞具有染色体外并入或整合至细胞的染色体DNA中的一种或多种载体功能。
辅助功能
AAV为依赖病毒因为其在没有通过辅助病毒共感染细胞的情况下不能在细胞中复制。辅助功能包括建立包装细胞的主动感染所需要的辅助病毒元件，这是起始病毒载体的包装所需要的。辅助病毒通常包括腺病毒或单纯疱疹病毒。腺病毒辅助功能通常包括腺病毒组分腺病毒早期区1A(E1a)、E1b、E2a、E4和病毒相关(VA)RNA。通过用一个或多个编码不同辅助元件的核酸来转染细胞，可将辅助功能(例如，E1a、E1b、E2a、E4和VA RNA)提供给包装细胞。替代性地，宿主细胞(例如，包装细胞)可以包含编码辅助蛋白的核酸。例如，HEK293细胞通过用腺病毒5DNA转化人细胞来产生并且现在表达许多腺病毒基因，包括但不限于E1和E3(参见，例如，Graham等人(1977)J.Gen.Virol.36:59-72)。因此，这些辅助功能可通过HEK293包装细胞提供，而不需要通过例如编码它们的质粒来将它们供应至细胞。在一些实施方案中，包装细胞用至少以下来转染：i)包含载体基因组的质粒，该载体基因组包含密码子优化的人ASPA转基因(例如，SEQ ID NO:2)和AAV ITR(例如，SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:12)并且进一步包含以下调控元件中的至少一个：增强子(例如，SEQ ID NO:6)、启动子(例如，SEQ ID NO:7)、外显子(例如，CBA外显子SEQ ID NO:8)、内含子(例如，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)和poly A(例如，SEQ ID NO:11)；ii)包含rep基因(例如，AAV2 rep)和cap基因(例如，Olig001 cap)的质粒；以及iii)包含辅助功能的质粒。
可使用将带有辅助功能的核苷酸序列引入细胞宿主中以实现复制和包装的任何方法，包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、阳离子或阴离子脂质体和脂质体与核定位信号的组合。在一些实施方案中，辅助功能通过使用病毒载体的转染来提供，或可使用产生病毒感染的标准方法通过使用辅助病毒的感染来提供。
载体基因组可以是任何合适的重组核酸，如DNA或RNA构建体并且可以是单链、双链或双链体的(duplexed)(即，自身互补，如WO 2001/92551所描述)。
包装病毒载体的产生
病毒载体可通过技术人员已知的多种方法来产生(参见，例如WO 2013/063379)。优选的方法描述于Grieger等人(2015)Molecular Therapy24(2):287-297，其内容通过引用并入本文用于所有目的。简而言之，HEK293细胞的有效转染用作起始点，使用来自合格临床种源细胞库的贴壁HEK293细胞系用于在摇瓶和WAVE生物反应器中在无动物成分的悬浮条件下生长，以允许快速和可扩展的rAAV产生。使用三重转染方法(例如，WO 96/40240)，在转染后48小时收获时，HEK293细胞系悬浮液可产生大于1×105个含有载体基因组的颗粒(vg)/细胞或大于1×1014vg/L的细胞培养物。更具体而言，三重转染指其中包装细胞用三种质粒转染的方法：一种质粒编码AAV rep和cap(例如，Olig001 cap)基因，另一种质粒编码各种辅助功能(例如，腺病毒或HSV蛋白如E1a、E1b、E2a、E4和VARNA，并且另一种质粒编码转基因(例如，ASPA)和控制转基因表达的各种元件。
将单链载体基因组以约相等比例作为正链或负链包装至衣壳中。在rAAV载体的一些实施方案中，载体基因组处于正链极性中(即，DNA链的有义或编码序列)。在rAAV载体的一些实施方案中，载体处于负链极性中(即，反义或模板DNA链)。鉴于正链的核苷酸序列为5’至3’取向，以其5’至3’取向的负链的核苷酸序列可以确定为正链的核苷酸序列的反向补体。
为了实现期望的产率，对多种变量如支持生长和转染的兼容无血清悬浮培养基的选择、转染试剂的选择、转染条件和细胞密度进行优化。
rAAV载体可通过本领域中的标准方法如通过柱色谱法或氯化铯梯度来纯化。用于纯化rAAV载体的方法是本领域已知的并且包括Clark等人(1999)Human Gene Therapy 10(6):1031-1039；Schenpp和Clark(2002)Methods Mol.Med.69:427-443；美国专利号6,566,118和WO 98/09657所描述的方法。
可使用基于离子交换色谱法的通用纯化策略产生AAV血清型1-6、8、9和各种嵌合衣壳(例如，Olig001)的高纯度载体制备物。在一些实施方案中，该过程可以在一周内完成，得到高的满衣壳与空衣壳比率(>90％满衣壳)，提供适合于临床应用的纯化后产率(>1×1013vg/L)和纯度。在一些实施方案中，此方法相对于所有血清型和嵌合衣壳是通用的。可扩展的制备技术可用于制备GMP临床和商品级rAAV载体(例如，用于治疗卡纳万病)。
在本公开的rAAV载体已生产及纯化之后，其可经滴定(例如，可对样品中rAAV载体的量进行定量)以制备用于向受试者如患有卡纳万病的人受试者施用的组合物。rAAV载体滴定可使用在本领域中已知的方法来完成。
在一些实施方案中，包括含有载体基因组的颗粒和不含有载体基因组的“空”衣壳的病毒颗粒的数量可通过电子显微术例如透射电子显微术(TEM)来确定。此基于TEM的方法可提供样品中载体颗粒(或在野生型AAV的情况下的病毒颗粒)的数量。
在一些实施方案中，rAAV载体基因组可使用定量PCR(qPCR)，使用针对载体基因组中的序列的引物来滴定，该序列例如ITR序列(例如，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:19)和/或转基因(例如，SEQ ID NO:2)或调控元件中的序列。通过对于已知浓度的标准品(如含有载体基因组的序列的质粒)的稀释液平行进行qPCR，可以生成标准曲线，从而允许将rAAV载体的浓度计算为每单位体积如微升或毫升的载体基因组(vg)的数量。通过将如通过例如电子显微术所测量的载体颗粒的数量与样品中载体基因组的数量比较，可以确定空衣壳的数量。因为载体基因组含有治疗性转基因，所以与载体颗粒的数量相比，载体样品的vg/kg或vg/ml可能更能指示受试者接受的载体的治疗量，因为载体颗粒中的一些可以是空的且不含有载体基因组。一旦确定了储备溶液中的rAAV载体基因组的浓度，就可以将其稀释至合适的缓冲液中或针对缓冲液进行透析，以便用于制备向受试者(例如，患有卡纳万病的受试者)施用的组合物。
治疗方法
如本文所公开的经修饰的核酸(如编码ASPA的经修饰的核酸)可用于基因疗法治疗和/或预防与ASPA多肽的缺陷或功能障碍相关的疾病、病症或病况(例如，卡纳万病)以及ASPA基因的上调可以产生治疗益处或改善的任何其他病况和或疾病，例如，与在其他方面健康的个体中的ASPA多肽的水平或功能相比，通过ASPA多肽的水平或功能的减少来介导或与其相关的疾病、病症或病况。
如本文所公开的包含编码ASPA的经修饰的核酸的载体基因组和/或rAAV载体可用于基因疗法治疗和/或预防与ASPA酶的缺陷或功能障碍相关或由其导致的疾病、病症或病况(例如，卡纳万病)以及ASPA酶的上调可以产生治疗益处或改善的任何其他病况和/或疾病。在一些实施方案中，本公开的方法包括rAAV载体或其药物组合物在治疗受试者的卡纳万病中的用途。在一些实施方案中，本公开的方法包括使用rAAV载体(例如，AAV/Oligo001-ASPA)或其药物组合物增加有此需要的受试者的ASPA的水平。
本公开的编码ASPA的经修饰的核酸、包含编码ASPA的经修饰的核酸的载体基因组和/或包含编码ASPA的经修饰的核酸的rAAV载体(例如，AAV/Oligo001-ASPA)，其可用于制备用于治疗和/或预防与ASPA的缺陷或功能障碍(例如，功能性ASPA酶的水平降低，如在卡纳万病中)相关或由其导致的疾病、病症或病况以及ASPA的上调可以产生治疗益处或改善的任何其他病况或疾病的药物。
在一些实施方案中，与ASPA酶的缺陷或功能障碍相关的疾病、病症或病况(例如，卡纳万病)以及ASPA基因表达的上调和/或功能性ASPA酶的表达增加可以产生治疗益处或改善的任何其他病况和/或疾病的基因疗法治疗和/或预防，包括向需要治疗的受试者(例如，患者)施用治疗有效量的本公开的编码ASPA的经修饰的核酸、包含编码ASPA的经修饰的核酸的载体基因组和/或包含编码ASPA的经修饰的核酸的rAAV载体(例如，AAV/Oligo001-ASPA)。
与基线测量结果(如本文所述的治疗起始之前同一个体的测量结果或者不存在本文所述的治疗时一个对照个体(或多个对照个体从而建立比较水平)的测量结果)相比，用治疗有效量的本公开的编码ASPA的经修饰的核酸、包含编码ASPA的经修饰的核酸的载体基因组和/或包含经修饰的核酸ASPA的rAAV载体(例如，AAV/Oligo001-ASPA)治疗受试者(例如，患者)可以减轻、改善、治疗、预防卡纳万病的一个或多个症状或降低其严重性。在一些实施方案中，“对照个体”是患有与所治疗个体相同形式的疾病或损伤，但是当前未治疗，但是将来可能接受治疗的个体。
例如，与对照个体中的NAA积累相比，或与治疗前同一个体的NAA积累相比，用治疗有效量的编码ASPA的经修饰的核酸、包含编码ASPA的经修饰的核酸的载体基因组和/或rAAV载体(例如，AAV/Oligo001-ASPA)治疗受试者可减少NAA积累。在一些实施方案中，与对照个体相比，或与治疗前同一个体相比，在所治疗的受试者中，NAA积累减少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
在一些实施方案中，与对照个体的天冬氨酸盐和/或乙酸盐水平相比，或与治疗前同一个体的天冬氨酸盐和/或乙酸盐水平相比，用治疗有效量的编码ASPA的经修饰的核酸、包含编码ASPA的经修饰的核酸的载体基因组和/或rAAV载体(例如，AAV/Oligo001-ASPA)治疗受试者可以增加天冬氨酸盐和/或增加乙酸盐水平。在一些实施方案中，与对照个体相比，或与治疗前同一个体相比，在所治疗的受试者中，天冬氨酸盐和/或乙酸盐水平增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
在一些实施例中，与对照个体中或治疗前受试者中的情况相比，治疗还可以减轻、改善、治疗、预防或降低脑和脊髓中的髓磷脂退化、智力障碍、先前获得的运动技能的丧失、进食困难、肌肉张力异常、畸形巨头、瘫痪和癫痫发作的严重性和/或语言和运动技能发展的延迟。在一些实施方案中，与对照个体中的情况相比，或与治疗前同一受试者相比，用治疗有效量的本公开的编码ASPA的经修饰的核酸、包含编码ASPA的经修饰的核酸的载体基因组和/或包含编码ASPA的经修饰的核酸的rAAV载体治疗受试者(例如，患者)还可以增加、改善、增强平衡、握力和或运动协调和广义运动功能，或预防其进一步丧失。在一些实施方案中，与对照个体中的情况相比，或与治疗前同一受试者相比，用治疗有效量的本公开的编码ASPA的经修饰的核酸、包含编码ASPA的经修饰的核酸的载体基因组和/或包含编码ASPA的经修饰的核酸的rAAV载体治疗受试者(例如，患者)可减少脑(例如，丘脑、小脑白质/脑桥)中的空泡体积分数，增加脑(例如，丘脑、皮层)中的少突胶质细胞的数量，增加脑(例如，丘脑、皮层)中的神经元的数量和/或增加皮质髓鞘形成。
适合于治疗的受试者包括具有不足量的功能性基因产物(蛋白)，或处于产生不足量的功能性基因产物(蛋白)的风险中，或具有功能性基因产物(蛋白)的缺陷，或产生异常、部分功能性或非功能基因产物(蛋白，例如，酶)，从而可以导致疾病的任何受试者。在一些实施方案中，在表现出疾病、病症或病况(例如，卡纳万病)的任何症状之前，患者用本公开的载体或药物组合物进行治疗。在一些实施方案中，通过基因分析诊断为处于疾病、病症或病况(例如，卡纳万病)的风险中的患者在表现出症状之前用本公开的rAAV载体或组合物进行治疗。
在一些实施方案中，待治疗的受试者可以是哺乳动物，并且特别地，受试者是人患者，例如，患有卡纳万病的患者。因为由于ASPA基因的编码序列中的一个或多个突变，ASPA蛋白具有不正确的氨基酸序列，并且由此功能减少或没有功能，在错误组织或错误时间表达，表达不足或根本不表达，受试者可能需要治疗。可施用本发明的编码ASPA的经修饰的核酸来增强、改善或提供功能性ASPA酶的产生，该酶可进而催化NAA分解成天冬氨酸盐和乙酸盐，以及如在本文别处讨论的其他生物功能。
本发明的rAAV载体的靶细胞是细胞，尤其是少突胶质细胞，此细胞通常能够内源地表达ASPA酶如哺乳动物脑中的酶。
在提及如本文所述的治疗方法的实施方案中，此类实施方案也是用于该治疗，或替代地用于制备用于该治疗的药物的进一步实施方案。
药物组合物
在特定实施方案中，本公开提供药物组合物或药物，其用于预防或治疗通过ASPA的表达和/或活性减少来介导或与其相关的疾病、病症或病况，例如，卡纳万病。在一些实施方案中，药物组合物包含经修饰的核酸、重组核酸、病毒载体基因组、表达载体、宿主细胞或rAAV载体和药物学上可接受的载剂。
在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的载体(例如，病毒载体基因组、表达载体、rAAV载体)或宿主细胞，其包含可以增加细胞中的ASPA的表达水平和/或活性水平的编码ASPA的经修饰的核酸。
在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的载体(例如，病毒载体基因组、表达载体、rAAV载体)或宿主细胞(例如，用于离体基因疗法)，其包含编码ASPA的经修饰的核酸，其中组合物进一步包含药物学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂和/或其他药剂。药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂或其他药剂不是生物学上或在其他方面不期望的药剂，例如，可以将材料施用至受试者而不导致超过材料的有利生物效应的不期望的生物效应。
任何合适的药学上可接受的载剂或赋形剂可用于制备根据本发明的药物组合物(参见例如，Remington The Science and Practice of Pharmacy,Alfonso R.Gennaro(编)Mack Publishing Company,April 1997)。
药物组合物通常为无菌的、无热原且在制备和储存条件下稳定的。药物组合物可配制为溶液(例如，水、盐水、右旋糖溶液、缓冲溶液或其他药学无菌流体)、微乳液、脂质体或适合于容纳高产物(例如，病毒载体颗粒、微粒或纳米颗粒)浓度的其他有序结构。在一些实施方案中，包含本公开的经修饰的核酸、包含经修饰的核酸的载体基因组、宿主细胞或rAAV载体的药物组合物在水或缓冲盐水溶液中配制。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可例如在分散体的情况下通过使用包衣(如卵磷脂)、通过维持所需粒子大小以及通过使用表面活性剂来维持。在一些实施方案中，优选地将等渗剂例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠包括于组合物中。可通过将延迟吸收的药剂例如单硬脂酸盐和明胶包含在组合物中以带来可注射组合物的延长吸收。在一些实施方案中，本公开的核酸、载体和/或宿主细胞可以在控释制剂中施用，例如，在包含缓释聚合物或保护产物免于快速释放的其他载剂的组合物包括植入及微胶囊化递送系统中施用。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物是肠胃外药物组合物，包括适合于静脉内、动脉内、皮下、皮内、腹膜内、肌肉内、关节内、脑实质内(IP)、鞘内(IT)、脑室内(ICV)和/或枕大池内(ICM)施用的组合物。在一些实施方案中，包含含有编码ASPA的经修饰的核酸的rAAV载体的药物组合物经配制以用于通过ICV注射施用。
在一些实施方案中，rAAV载体(例如，AAV/Olig001 ASPA)在PBS中的350mM NaCl和5％ D-山梨醇中配制。
施用方法
本公开的编码转基因(例如，ASPA)的经修饰的核酸或包含经修饰的核酸的载体(例如，载体基因组、rAAV载体)可施用至受试者(例如，患者)以治疗受试者。将载体施用至有此需要的人受试者或动物可通过本领域中已知用于施用载体的任何方式进行。本公开的载体的靶细胞包括CNS的细胞，优选少突胶质细胞。
载体可以作为标准护理治疗的补充和辅助施用。即，载体可与另一种药剂、化合物、药物、治疗或治疗方案同时、同期、或以本领域技术人员使用常规方法能确定的确定给药时间间隔来共同施用。本文公开的用途包括与本领域中已知用于卡纳万病的标准护理同时、补充和/或以同步给药时程来施用本公开的rAAV载体。
在一些实施方案中，组合组合物包括一种或多种免疫抑制剂。在一些实施方案中，组合组合物包括包含转基因(例如，编码ASPA的经修饰的核酸)的rAAV载体和一种或多种免疫抑制剂。在一些实施方案中，方法包括将包含转基因(例如，编码ASPA的经修饰的核酸)的rAAV载体施用或递送至受试者以及在施用载体之前预防性地或在施用载体之后(即，在针对载体和/或由其提供的蛋白的应答的症状显而易见之前或之后)将免疫抑制剂施用至受试者。
在一些实施方案中，本发明的rAAV可与空衣壳(即，不含有核酸分子或载体基因组的病毒衣壳)共同施用，该空衣壳包含与包含经修饰的核酸(例如，编码ASPA)的rAAV载体相同或不同的衣壳蛋白。本领域技术人员将理解，空衣壳的共同施用可减少对于本公开的rAAV的免疫应答，例如，中和应答。不希望受任何特定理论束缚，空衣壳可用作使得包含经修饰的核酸(例如，编码ASPA)的rAAV载体避免中和抗体(Nab)免疫应答的免疫诱饵，如在例如WO 2015/013313中所讨论。
在一个实施方案中，本公开的载体(例如，包含编码ASPA的经修饰的核酸的rAAV载体)全身施用。示例性全身施用方法包括但不限于静脉内(例如，门静脉)、动脉内(例如，股动脉、肝动脉)、血管内、皮下、皮内、腹膜内、经粘膜、肺内、淋巴管内及肌肉内施用等以及直接组织或器官注射。本领域技术人员将理解，全身施用可将经修饰的核酸(例如，编码ASPA的经修饰的核酸)递送至所有组织。在一些实施方案中，直接组织或器官施用包含施用至肝脏。在一些实施方案中，直接组织或器官施用包含施用至直接受ASPA缺陷影响的区域(例如，脑和/或中枢神经系统)。在一些实施方案中，将本公开的载体及其药物组合物施用至脑实质(亦即，通过脑实质内施用)、脊椎管或蛛网膜下腔以使得其到达脑脊液(CSF)(即，通过鞘内施用)、脑室(即，通过脑室内施用)和/或枕大池(即，通过枕大池内施用)。
因此，在一些实施方案中，本公开的包含编码ASPA的经修饰的核酸的载体通过直接注射至脑中(例如，至实质、脑室、枕大池等中)和/或CSF(例如，至脊椎管或蛛网膜下腔中)来施用，以治疗卡纳万病的神经退行性方面。本公开的载体的靶细胞包含位于皮层、胼胝体的皮层下白质、纹状体和/或小脑中的细胞。在一些实施方案中，本公开的载体的靶细胞为少突胶质细胞。额外的施用途径还可以包括在直接可视化下局部应用载体，例如，表面皮质应用或其他非立体定向应用。
在一些实施方案中，本公开的载体通过至少两种途径来施用。例如，载体全身施用且也直接施用至脑中。如果经由至少两种途径来施用，载体的施用可以但不必是同时或同期的。替代性地，经由不同途径的施用可分开进行，在每次施用之间具有时间间隔。
本公开的编码ASPA的经修饰的核酸、包含编码ASPA的经修饰的核酸的载体基因组和/或包含编码ASPA的经修饰的核酸的rAAV载体可用于离体转导细胞或直接施用至受试者(例如，直接施用至患有卡纳万病的患者的CNS)。在一些实施方案中，将转导细胞(例如，宿主细胞)施用至受试者以治疗或预防疾病、病症或病况(例如，用于卡纳万病的细胞疗法)。包含经修饰的治疗性核酸(例如，编码ASPA)的rAAV载体优选地以生物学有效量施用至细胞。在一些实施方案中，载体的生物学有效量为足以导致编码ASPA的经修饰的核酸(即，转基因)在靶细胞中转导和表达的量。
在一些实施方案中，本公开包括通过将编码ASPA的经修饰的核酸单独或在载体(包括质粒、病毒载体、纳米颗粒、脂质体、或将核酸提供至细胞的任何已知方法)中施用至细胞(体内、体外或离体)来增加细胞中ASPA的水平和/或活性的方法。
rAAV载体的剂量取决于例如施用模式、待治疗的疾病或病况、疾病的阶段和/或侵袭性、个体受试者的状况(年龄、性别、体重等)、特定病毒载体、待表达的蛋白的稳定性、对载体的宿主免疫应答和/或待递送的基因。通常，剂量范围为至少1×108或更多，例如，1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015或更多载体基因组(vg)/千克(kg)受试者体重，以达成治疗效果。
在一些实施方案中，编码ASPA的经修饰的核酸可作为DNA分子(例如，重组核酸)的组分施用，该DNA分子具有适合于在靶细胞(例如，少突胶质细胞)中表达的调控元件(例如，启动子)。编码ASPA的经修饰的核酸可作为质粒或病毒载体如rAAV载体的组分施用。rAAV载体可通过将载体直接递送(例如，直接递送至CNS)至需要治疗的患者(例如，卡纳万患者)来体内施用。可通过将载体体外施用至需要治疗的供体患者的细胞，随后将转导细胞引回到供体中来将rAAV载体离体施用至患者(例如，细胞疗法)。
本公开包括施用方法，其导致与未施用经修饰的核酸(例如，编码ASPA的经修饰的核酸)的在其他方面相同的细胞中的ASPA表达(mRNA和/或蛋白)或ASPA活性的水平相比，编码ASPA的mRNA的水平、ASPA蛋白表达的水平和/或ASPA活性的水平可检测的更高。
在另一实施方案中，本公开包括施用方法，其导致与未施用经修饰的核酸(例如，编码ASPA的经修饰的核酸)的在其他方面相同的细胞中存在的功能性ASPA(mRNA和/或蛋白)的水平相比，编码功能性ASPA的mRNA的水平和/或功能性(例如，生物活性)ASPA蛋白表达的水平可检测的更高。即，本发明包括增加细胞中功能性ASPA的水平的方法，其中细胞产生正常水平的ASPA但是与正常野生型ASPA相比，ASPA蛋白缺少活性或表现出活性减少。
本领域技术人员将理解，细胞可在体外培养或生长或可存在于生物体中(即，体内)。此外，细胞可表达内源ASPA，以使得细胞中的ASPA的水平增加，和/或细胞表达是野生型ASPA的突变体或变体的内源ASPA，例如，具有序列SEQ ID NO:3的ASPA，尤其当可能存在人ASPA的多于一个野生型等位基因时。因此，与在其他方面相同、但是未治疗的细胞中表达的ASPA的水平比较，ASPA的水平增加。
试剂盒
本公开提供在其中具有包装材料和一种或多种组分的试剂盒。试剂盒通常包括标签或包装插页，其中包括组分的描述或其中的组分的体外、体内或离体使用的说明。试剂盒可以含有此类组分的集合，例如，经修饰的核酸、重组核酸、载体基因组、rAAV载体rAAV以及任选地第二活性剂如化合物、治疗剂、药物或组合物。
试剂盒指含有试剂盒的一个或多个元件的物理结构。包装材料可以无菌方式维持组分并且可由通常用于此目的的材料(例如，纸、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)制成。
标签或插页可包括其中的一种或多种组分的鉴定信息、剂量、活性成分的临床药理学包括作用机制、药代动力学和药效学。标签或插页可包括鉴别制造、批号、制造地点和日期、有效期的信息。标签或插页可包括关于试剂盒组分可针对性使用的疾病(例如，卡纳万病)的信息。标签或插页可包括供临床医师或受试者在方法、用途或治疗规程或治疗方案中使用试剂盒组分中的一个或多个的说明书。说明书可包括剂量、持续时间频率和实践本文所述任何方法、用途、治疗规程或预防或治疗方案的说明。
标签或插页可包括关于潜在不良副作用、并发症或反应的信息，如给受试者或临床医师的关于不适合于使用特定组合物的情况的警告。
等效物
认为前述书面说明书足以能够使本领域技术人员实践本公开。前述描述和实施例详述了本公开的某些示例性实施方案。然而，应当理解，无论前述内容在文本中表现得如何详细，本公开仍可以许多方式实践，且本公开应根据所附权利要求及其任何等效物解释。
本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以及其中所引用的参考文献，在它们尚未被引用的范围内，通过整体引用并入本文。
示例性实施方案
通过参考以下实验实施例进一步详细地描述本发明。这些实施例仅出于说明目的提供，并且除非另有说明否则并非意在限制。因此，本发明绝不应理解为限于以下实施例，而是应理解为涵盖由于本文中提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。
实施例
实施例1：使用包含编码ASPA的密码子优化的核酸的rAAV载体导致的NAA的剂量响 应性降低
将人胚肾(HEK)细胞用1.0ug表达NAA合酶(Nat8L)的质粒转染并且用0.1、0.2、0.5或1.0μg包含以下的质粒共转染：野生型人ASPA核酸序列(SEQ ID NO:3)、编码ASPA的密码子优化的核酸(包含SEQ ID NO:1的核酸序列，参见Francis等人(2016)Neurobiol.Dis.96:323-334)或包含SEQ ID NO:2的核酸序列的编码ASPA的密码子优化的核酸。NAA浓度通过HPLC(n＝4/组)来测量。相对于用编码ASPA的野生型核酸或SEQ ID NO:1的编码ASPA的密码子优化的核酸转染的培养物，在使用SEQ ID NO:2的编码ASPA的密码子优化的核酸转染的培养物中观察到NAA的剂量响应性降低(图1)。
实施例2：寡向性AAV/Olig001的生物分布
进行本研究以在遗传性人脑白质营养不良、卡纳万病的小鼠模型中确定寡向性(oligotropic)AAV(AAV/Olig001；(WO2014/052789；Powell等人(2016)Gen.Ther.23:807-814))衣壳变体在促进广泛CNS少突胶质细胞转导中最有效的剂量和施用途径(ROA)。在成年、症状性卡纳万小鼠(nur7)中测试经由四种不同的ROA递送的AAV/Olig001的三个剂量，并且在转导后两周，通过生成四个感兴趣的解剖区域中报告基因绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞的体视学估计来对载体传播和转导进行定量。通过对这些相同区域中的与GFP共标记的谱系特异性抗原的发生率进行评分来评估经由每种ROA递送的AAV/Olig001的向性，以验证寡向性(oligotropism)。所使用的ROA为实质内(IP)、鞘内(IT)、脑室内(ICV)和枕大池内(ICM)。经由各途径施用载体的三个剂量：1×1010、1×1011和5×1011总载体基因组(VG)，其中在所有处理队列中，递送的材料的体积是恒定的，并且对每组进行直接成对比较，以确定将AAV/Olig001应用于卡纳万病的剂量和ROA的最佳组合。使用六周龄天冬氨酸酰化酶缺陷nur7小鼠(Traka等人(2008)J.Neurosci 28:11537-11549)，其代表卡纳万病的急性症状期。通过此研究产生的结果形成了支持AAV/Olig001临床应用于当前难治性白质疾病如卡纳万病的后续临床前功效研究的基础。
材料
AAV/Olig001载体
产生两批含有GFP报告基因的组成型表达盒的AAV/Olig001载体(批号7660和批号LAV38A)。所产生的所有载体均包含GFP报告基因，其由侧接自身互补AAV ITR的杂合CMV/鸡β-肌动蛋白启动子(CBh)驱动。通过瞬时转染HEK293细胞，接着进行碘克沙醇梯度离心和离子交换色谱法来产生载体(Gray等人,(2013)Gene Ther.20:450-9)。载体的浓度定义为病毒载体基因组(vg)的总数，其通过储备制剂中的DNAse抗性AAV反向末端重复(ITR)序列的qPCR定量来确定。
动物
此项研究中所用的所有动物由在经批准的机构方案下维持于Rowan School ofOsteopathic Medicine动物设施中的群落产生。初始动物来源于商业来源(JacksonLaboratories)。nur7小鼠是良好表征的卡纳万病模型，其在编码神经胶质水解酶天冬氨酸酰化酶(aspa)的基因中存在失活点突变，使得蛋白不具有功能性(Traka等人J.Neuroscience(2008)28(45)11537-11549)。纯合nur7突变动物由杂合载体动物的配对来产生并且使用内部定制的SNP测定和实时PCR来进行基因分型。
在0.9％盐水中稀释至合适浓度的AAV/Olig001-GFP通过立体定位注射递送至处于吸入麻醉下(4％诱导并保持滴定以发挥作用)的6周龄nur7突变体小鼠。生成通过各自提供不同施用途径(ROA)来区分的四个处理队列：鞘内(IT)、实质内(IP)、脑室内(ICV)和枕大池内(ICM)。在每个ROA队列内，建立通过每个ROA所施用的载体剂量来限定的动物亚组(1×1010、1×1011和5×1011总载体基因组)。
因此，对于每个ROA，生成了通过剂量限定的三个亚组，其中在每个ROA下，每个剂量n＝5只动物，提供了总共60只nur7小鼠用于研究。将AAV/Olig001-GFP施用至麻醉的小鼠，并且对于所有手术，无论剂量或ROA如何，5μL的总递送体积是恒定的。IP ROA需要在5个立体定位坐标处注射5次1μL载体，使用数字泵，以0.1μL/min的速率，在每个脑半球注射两次至前部和后部皮层下白质(即，总共在扣带进行4次注射)并且在小脑白质中进行1次额外注射(以提供总共5次注射)。IT ROA动物经由L5和L6之间的腰椎穿剌接受单次5μL载体输注至蛛网膜下腔中。ICV ROA动物接受两次2.5μL的载体注射，每次均以0.1μL/min的速率注射至各侧脑室中。ICM ROA动物接受以0.1μL/min的速率经由枕大池直接递送至CSF的5μL载体。在手术前20分钟，所有动物均接受0.5mL 20％甘露糖醇(ip)。在AAV/Olig001-GFP递送之后，将所有动物分组饲养两周，然后处死以用于死后分析。
连续两天每天两次给予幼稚2周和8周龄野生型和nur7小鼠组全身性BrdU(50mg/kg，ip)，然后在第三天处死。将BrdU以50mg/kg的浓度施用至动物。在1M HCL中DNA水解之后，使用可商购获得的抗体(Millipore-Sigma)对脑组织切片进行BrdU染色处理。
方法
通过无偏体视学的载体生物分布定量
载体手术后两周，将动物深度麻醉，并且用0.9％盐水随后用新鲜制备的缓冲的4％多聚甲醛进行经心灌注，以制备脑。将灌注的脑切除并且在4℃下于4％ PFA中后固定过夜。将固定的脑冷冻保存并且在干冰/异戊烷浴中快速冷冻并且储存于-80℃下，然后进行免疫组织化学处理。对每个脑产生连续的40μm矢状切片(总共144个切片)并且使用可商购获得的抗体(Sigma/Millipore)对每第4个切片进行GFP染色。皮层、皮层下白质、纹状体和小脑中的GFP阳性体细胞通过无偏体视学使用光学分馏器方法来评分(图2)(West等人Anat.Rec.(1991)231:482-97)。使用偶联至配备有电动载物台的直立明场显微镜的Stereology软件(Stereologer,Stereology Resource Center)在四个感兴趣的不同区域(即，大脑皮层、胼胝体和外囊的皮层下白质、纹状体和小脑)内生成GFP阳性体细胞计数。在感兴趣的各区域中，使用公式ΣQ*(t/h)*(1/asf)*(1/ssf)将取样分数中的GFP阳性细胞重新转换成绝对估计结果，其中ΣQ＝颗粒计数，t＝切片厚度，h＝计数框架高度，asf＝面积取样分数，且ssf＝切片取样分数。对于由此生成的所有数据集，通过计算满足少于15％总方差(CV)阈值贡献的误差系数(CE)来监测样品内变化，以减少掩蔽样品之间的真实生物方差的技术噪声。N的平均组平均估计值中的显著差异通过未配对双尾学生t检验来确定，其中阈值显著性p＜0.05。
载体向性的定量
通过对用GFP荧光共标记的谱系特异性抗原进行评分，对AAV/Olig001-GFP转导的脑中的载体向性进行定量。使用可商购获得的抗体(Sigma/Millipore)，对于NeuN(存在于脊椎动物的大多数CNS和PNS神经元细胞类型中)、GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白)或Olig2(少突胶质细胞谱系转录因子2)免疫组织化学的替代切片进行处理，以分别标记神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。使用扫描共聚焦显微术以在每个感兴趣的区域中生成多点图像堆栈。使用NIS-Elements Advanced Research软件(Nikon)对总GFP阳性细胞以及各堆栈中与各谱系特异性抗原(Olig2和NeuN)共标记的GFP阳性细胞的数量进行计数。整理每个单独脑的数量(从每个脑中总共取样8个连续切片，其中取样间隔为4)。单独切片中的ROI通过软件勾勒并且每200um2放置单独的点以高倍率取样，以对GFP免疫荧光体细胞和GFP/Olig2或NeuN阳性细胞体进行评分。与Olig2或NeuN共标记的GFP阳性体细胞的总数通过将GFP阳性体细胞的数量除以各系列切片中的谱系特异性共标记来计算。计算各ROA的平均值(n＝5只动物)。
结果
实质内(IP)ROA剂量响应
给予IP ROA动物靶向大脑半球和小脑的皮层下白质的5次单独注射。载体施用后2周(8周龄)，将处理的动物处死并且对脑进行处理用于GFP免疫组织化学，并且皮层、皮层下白质、纹状体和小脑中的GFP阳性体细胞使用无偏体视学使用光学分馏器来评分以提供每个感兴趣的区域中的转导细胞的绝对估计结果。所施用的AAV/Olig001-GFP的所有三个剂量导致整个脑中的细胞的显著转导水平。(图3)在皮层内，在1×1010和1×1011vg的剂量之间，转导细胞数量显著增加(+1.6倍，p＝0.0096)，但是在最高5×1011剂量下没有明显的进一步增加(p＝0.659)，这表明达到了饱和(图3)。在胼胝体和外囊的皮层下白质中，存在明显的高水平转导，其中阳性细胞在紧邻四个注射部位处最集中。皮层下白质GFP阳性细胞也以剂量依赖性方式增加，其中从1×1010至1×1011剂量的2.2倍增加是统计上显著的(p＝0.0144)，但是从1×1011至5×1011的1.3倍增加未能达到统计显著性(p＝0.283)。存在明显的中等程度纹状体转导。从1×1010至1×1011的3.4倍增加是高度显著的(p＝4.38×10-5)，但是在5×1011剂量下，转导没有明显的进一步增加(p＝0.706)。小脑内的转基因表达限于紧邻单一注射部位周围的区域，其中1×1011和5×1011剂量均导致超过先前剂量的显著增加(1×1011：1.5倍增加[p＝0.0016]；5×1011：1.4倍增加[p＝0.0019])。皮层呈现最高数量的转导细胞(513,477)，随后是皮层下白质(178,362)、小脑(86,820)，并且最后是纹状体(62,706)。GFAP共标记少于2％。
鞘内(IT)ROA剂量响应
AAV/Olig001-GFP的IT施用导致转基因表达在除了胼胝体和外囊的皮层下白质以外的整个脑中的极好分布(图4)。从1×1010至1×1011vg的皮层转导存在明显的高显著增加(6.1倍增加，p＝0.000026)，其中在5×1011vg剂量下没有显著增加(p＝0.273)。虽然IT ROA皮层中的GFP表达的分布极好，但是与IP脑相比，表达强度略有降低。不出所料，在脊髓的腰部区域中发现了可观的GFP表达，这表明在到达脑的路径中，脊髓组织对载体进行了一些稀释。IT ROA脑中的最吸引人的观察结果是在胼胝体和外囊中缺乏转基因表达。虽然当剂量从1×1010增加至1×1011时，观察到表达GFP的白质束细胞的极显著增加(6.3倍增加，p＝0.00021)，但是IT ROA脑中的转导白质细胞的绝对数是相对适中的。在1×1011剂量下，脑的白质束区域中的阳性细胞的平均数量为64,970，相比之下相同剂量下的IP脑为178,362。与皮层ROA一样，在IT ROA脑中，将剂量从1×1011进一步增加至5×1011未显著增加转导的白质束细胞的数量(p＝0.203)。
在各连续剂量下，纹状体呈现转导细胞的剂量响应性增加。将剂量从1×1010增加至1×1011导致纹状体中的2.7倍更多的GFP阳性细胞(p＝0.001)。随后增加至5×1011剂量观察到阳性细胞增加3.2倍(p＝0.000037)，这导致产生与IP ROA脑纹状体转导相当的数量(IT在5×1011下的平均值为79,444，IP在5×1011下的平均值为65,203)。
IT ROA导致小脑转基因强表达，其中当从1×1010移动至1×1011剂量时，观察到显著的1.5倍增加(p＝0.0064)，但是在5×1011剂量下，未观察到进一步增加。小脑转导与IPROA脑相当，并且在1×1011和5×1011剂量下略高但是不显著更高。
脑室内(ICV)ROA剂量响应
ICV施用AAV/Olig001-GFP导致在所有感兴趣的区域中的显著的转基因表达，尤其是显著的皮层下白质的强烈转导(图5)。当剂量从1×1010增加至1×1011时，所有感兴趣的区域显示出转导细胞数量的剂量响应性增加，但是与1×1011剂量相比，在5×1011剂量下，除了小脑，在大多数区域中存在细微的不显著增加。皮层转基因表达与IP ROA脑相当，其中当剂量从1×1010增加至1×1011时，转基因阳性细胞增加2倍(p＝0.00029)，并且施用5×1011剂量后进一步增加1.2倍，未能达到统计显著性(p＝0.123)。
ICV脑中的皮层下白质转导是显著的，其中当剂量从1×1010增加至1×1011时，观察到GFP阳性白质束细胞的2倍增加(p＝0.00052)。在最高5×1011剂量下观察到中等程度的非显著增加(p＝0.334)。在1×1011剂量下的ICV脑中的皮层下白质转导相对于IP脑显著增加1.5倍(p＝0.041)，并且相对于IT ROA脑增加4.2倍(p＝0.0001)。
在ICV剂量组的纹状体中观察到非常相似的转基因表达模式，其中当剂量从1×1010增加至1×1011时，观察到GFP阳性细胞显著增加2倍(p＝0.000043)，但是在5×1011剂量下没有显著的进一步增加(p＝0.537)。在ICV脑中存在明显的强烈纹状体转基因表达，并且相对于IP脑，该区域中的GFP阳性细胞增加2.5倍(p＝0.00004)。
存在强烈的小脑ICV转导，其中在两个连续较高剂量下观察到GFP阳性细胞的剂量依赖性增加(在1×1011下+2倍，p＝9.56×10-6；在5×1011下+1.5倍，p＝0.00073)。在1×1011剂量下，相对于IP脑，GFP阳性细胞增加1.7倍(p＝0.0001)，并且相对于IT数量，增加1.4倍(p＝0.0013)。在ICV ROA脑中，小脑是唯一呈现GFP阳性细胞的进一步可观增加的区域。
在整个取样过程中，IP和ICV ROA脑之间的明显的主要差异点是载体在ICV组中的更大分布。在IP脑中，注射部位处的转基因表达更强烈，但是从该部位迅速地稀释。相反，ICV转基因表达相对均匀地分布于脑的更大区域。
枕大池内(ICM)ROA剂量响应
ICM施用AAV/Olig001-GFP导致皮层、纹状体和小脑中的相对广泛但中等程度的转基因表达。然而，与IT ROA脑一样，在ICM脑的皮层下白质中缺乏显著的转基因表达(图6)。皮层转基因表达是剂量响应性的，其中各连续更高剂量导致GFP阳性细胞显著增加(1×1011，2.2倍增加，p＝0.018；5×1011，1.3倍增加，p＝0.043)。在1×1011剂量下，纹状体和小脑出现GFP阳性细胞的显著增加(对于纹状体和小脑，分别为p＝2.49×10-6和p＝0.0062)，其中最高的5×1011剂量仅在小脑中导致阳性细胞进一步增加(p＝0.061)。通过ICM ROA的皮层下白质束的转导明显是中等程度的。虽然将施用剂量从1×1010增加至1×1011导致GFP阳性细胞的显著增加(p＝0.00086)，但是存在的转基因阳性细胞的实际数量为相对可忽略的。
相对于ICV脑，ICM皮层下白质GFP阳性细胞减少14.2倍(ICV平均值271,274；ICM平均值18,996，p＝0.00002)并且相对于次低的皮层下白质转导ROA动物组IT减少3.4倍(IT平均值64,970)，使得ICM成为在转导白质中最不有效的ROA。在其他感兴趣的区域中的分布与其他ROA处理组相当，其中当与所有三种其他ROA相比时，皮层转导没有明显的显著差异。在与ICV ROA相比时，经由ICM的纹状体转导略有减少(p＝0.043)。在1×1011剂量下，纹状体ICM GFP表达显著高于IP(+2.0倍，p＝0.00005)和IT(+5.1倍，p＝0.0000005)。在所检查的四种ROA中的任一种中，ICM脑呈现最高数量的转导的小脑细胞。在1×1011剂量下，小脑ICM转导相对于ICV增加1.5倍(ICM平均值228,282；ICV平均值157,203)，相对于IP增加2.6倍，并且相对于IT增加2.2倍。
施用途径(ROA)比较
对于本文研究的所有ROA，在所有感兴趣的区域中，将载体剂量从1×1010增加至1×1011引起转导细胞数量增加2至3倍，而进一步剂量递增至5×1011导致转导细胞总体可忽略的增加。在各感兴趣的区域中，1×1011剂量下的所有四种ROA的直接比较揭示了所有四个ROI中的转导细胞的绝对数量的明显差异(图7)。对于各ROA而言，用1×1011个载体基因组转导的脑的皮层中的转导细胞的数量没有显著不同，其中所有都导致平均44,000-50,000个阳性体细胞。相比之下，在皮层下白质中，ICV ROA存在明显优势，其中与任何其他组相比，在ICV脑中，转导细胞数量显著更高。ICV和IP转导脑分别产生转导白质束细胞的最高和次高数量。经由ICV ROA用1×1011个AAV/Olig001-GFP载体基因组转导的脑白质束中的平均2.7×105个阳性细胞显著高于存在于经受相同剂量的IP脑中的平均1.8×105个阳性细胞(p＝0.041)。
IT和ICM ROA两者在转导皮层下白质细胞方面均效率低下，其中与ICV组中的平均2.7×105个阳性细胞相比，ICM组中的平均1.9×104个细胞显著地少14倍(p＝0.000083)，并且IT组少4倍(p＝0.0001)。这可能在出现髓磷脂缺陷的疾病模型系统中值得关注。
ICV途径还导致纹状体中细胞的有效转导，其中与所有其他ROA相比，在ICV脑中GFP阳性细胞的数量更高(ICV相比于IP，p＝3.68×10-5；ICV相比于IT，p＝1.61×10-5；ICV相比于ICM，p＝0.043)。在所有IP、IT和ICV ROA中，小脑的转导效率相当，但是ICM脑呈现最高数量的转导的小脑细胞(ICM相比于ICV，p＝0.045)。
虽然IP和ICV ROA脑在特定区域中通过AAV/Olig001-GFP转导的细胞的绝对数量相当，但是IP脑中的大部分阳性细胞计数是由与注射部位紧邻的切片导致的，而ICV脑中的阳性细胞的分布相对均匀。系统性非随机立体学取样允许鉴别从单个脑取样的切片之间的方差(样品内方差)，并且表示为数据集中的误差系数(CE)，其通过将重复估计结果的平均值的标准误差除以平均值来计算。CE是被取样群体中的总方差的一半，其中真实生物方差(CV)，或单个脑之间平均值的差异构成另一半。单个IP脑的平均CE计算为总方差的约12％，而ICV脑的平均CE为约3％，这意味着在ICV脑中取样的所有切片中，GFP阳性细胞更均匀地分布。在IP脑中，距取样切片所在的注射部位横向越远，所取样的单个切片中的阳性细胞的实际数量变得越少，而ICV脑中的阳性细胞数量始终接近于所有取样切片处的样品内平均值。该差异的最终结果是载体在ICV ROA脑中相对于IP脑的传播更大，尤其在皮层和皮层下白质中(图7)。
结论
使用四种不同ROA，确定了在诊断时密切模拟卡纳万脑的急性症状性动物中有益于总体CNS少突胶质细胞转导的剂量与ROA的组合。在除了小脑以外的所有感兴趣的区域中施用AAV/Olig001-GFP载体产生大于70％的寡向性，而不需要谱系特异性表达元件。在所有ROA中，转基因阳性少突胶质细胞的剂量依赖性增加是显而易见的，其中脑室内ROA促进更高数量的转导白质束细胞，同时在此关键的感兴趣的区域中维持大于90％的寡向性。这些数据强调衣壳-细胞表面相互作用是寡向性的主要决定因素，对于临床应用于对少突胶质细胞具有特异性的异常情况如卡纳万病而言，该决定因素是最相关的。这些数据也证明Olig001衣壳具有用于治疗少突胶质细胞相关疾病、病症和/或病况包括卡纳万病的潜在治疗性衣壳。
实施例3：通过施用途径(ROA)的载体向性
AAV/Olig001的显著特征是其与其他AAV衣壳变体相比明显的寡向性(Powell等人(2016)Gen.Ther.23:807-814；Francis等人(2016)Neurobiol.Dis.96:323-334)。对于应用于卡纳万病(其根据定义为白质病症)，AAV/Olig001载体在通过不同ROA应用时必须能够展现此向性。寡向性可由于如干预年龄的变量而变化(Gholizadeh等人Hum.GeneTher.Methods(2013)24:205-13；Foust等人Nature Biotech.(2009)27:59-65)，并且虽然先前的工作证明了AAV/Olig001在新生nur7小鼠中的寡向潜力(Francis等人Neurobiol.Dis.(2016)96:323-334)，但是将此向性潜力转移至年龄较大的症状性动物仍然未经测试。为此目的，在6周龄动物中评估了在实施例2中使用的1×1011剂量下的所有四种ROA对载体向性的潜在影响。针对GFP转基因与谱系特异性抗原Olig2(即，少突胶质细胞的靶标特异性标记)和NeuN(即，神经元的靶标特异性标记)的共标记，对用于产生GFP阳性细胞的绝对数量的皮层、皮层下白质、纹状体和小脑进行分析。
结果
所有四种ROA产生相当的结果，其中寡向性完好无损。非少突胶质细胞转基因表达可归因于神经元，其中在所有4个ROA队列中观察到极少的星形胶质细胞表达GFP(<5％)。
在IT、ICV和ICM ROA中，Olig2与GFP的皮层共标记相当，其中与Olig2共标记的总GFP阳性细胞的百分比始终为约75％。在IP转导脑中，与Olig2共标记的GFP阳性细胞为约62.3％，此减少较小但却是显著的(图8)。在这些相同脑中与NeuN共标记的GFP阳性细胞基本上占据了其余转导皮层群体(35.1％)。所有三个IT、ICV和ICM ROA呈现约20％的NeuN共标记。在IT ROA脑中，与Olig2共标记的皮层GFP阳性细胞为75.5％并且与NeuN共标记的皮层GFP阳性细胞为20.2％。ICV ROA脑在皮层中呈现70.8％的寡向性和23.6％的神经向性，而ICM脑的皮层呈现76％的GFP与Olig2共标记，以及17.4％的GFP与NeuN共标记。在4种不同ROA中表现的寡向性差异较小，但是IP ROA呈现NeuN共标记的显著增加(p＝0.0043，相比于IT；p＝0.0119，相比于ICV；p＝0.00059，相比于ICM)，该增加对应于相对于其他3种ROA，Olig2共标记的轻微但显著的减少(p＝0.026，相比于IT；p＝0.048，相比于ICV；p＝0.0085，相比于ICM)，这表明以寡向性为代价，IP ROA促成神经向性的较小增加。此外，IP ROA在NeuN共标记的增加方面值得注意(+1.5倍，p＝0.012)，表明在此ROA中，Olig2共标记的减少归因于神经元转导的增加。IP ROA脑中的大部分GFP-NeuN共标记聚集在注射部位附近，这指示与注射部位紧邻的AAV/Olig001-GFP的数量达到饱和。
在所有四种ROA中，Olig2与GFP的皮层下白质共标记>90％(图9)。在所有四种ROA中，NeuN与GFP的共标记<6％。在ROA之间，没有观察到与任一抗原的共标记百分比的显著差异，表明与ROA无关的对于富含白质区域中的少突胶质细胞的强烈偏好。通过ICV转导，在胼胝体中存在接近普遍存在的Olig2共标记并且不存在NeuN共标记。
在所有ROA中，Olig2与GFP的纹状体共标记相当，其中与Olig2共标记的总GFP阳性细胞的百分比>80％(图10)。纹状体中的其余GFP阳性细胞(<20％)与NeuN共标记。
在所有四种ROA中，与所研究的其他脑区域比较，小脑共标记展示Olig2和NeuN的截然不同的比率。在所有四种ROA中，Olig2共标记的百分比为总GFP阳性细胞的10％(图11)。转基因表达由小脑中的神经元主导，其占GFP表达细胞的80％以上。在小脑中，在ROA队列之间，未观察到与任一抗原共标记百分比的显著差异。颗粒细胞层中的较大浦肯野神经元(purkinje neuron)为强GFP阳性的(图29C)，其中在小脑白质束内仅有零星的Olig2/GFP共标记。此情况与在皮层下白质中观察到的接近100％的寡向性(图29B)，以及在相对神经元密集区域如皮层和纹状体中观察到的70％至80％的寡向性形成对比(图29D)。在1×1011剂量下针对各ROA评分的总GFP阳性细胞按总GFP阳性细胞的最高至最低平均值(+/-sd)的顺序来排序，其中n＝5：ICV 1104256.4(106816.96)；IP 841365.6(121722.7)；ICM815486.9(106979.7)；IT 742143.1(79496.5)。
ICV ROA产生总GFP阳性细胞的最高数量(单独脑中的所有ROA计数的总和)，其比下一个排序的ROA IP高1.3倍(p＝0.0067)。在包括ICM(p＝0.0027)和IT(p＝0.0003)的所有ROA中，ICV脑中的总数量显著增加。IP ROA脑中的细胞数量未显著增加超过ICM(p＝0.730)或IT数量(p＝0.165)，表明ICV ROA在转导总细胞方面明显地更好。ICV和IP队列之间总体GFP阳性细胞数量差异的大约75％(约262,891)归因于皮层下白质(35％)和纹状体(36％)ROI，在这两个ROA队列中均表现出>80％的寡向性。这意味着ICV脑比IP脑在某些区域多包含至少约210,000个转导的少突胶质细胞。如果此分析限于皮层下白质内，即按照所有ROA呈现>90％的寡向性的ROI，则当经由ICV ROA施用AAV/Olig001时，预期至少多转导83,000个少突胶质细胞/脑。当针对呈现GFP转基因表达的最差水平的ROA队列，即ICM队列进行评估时，ICV施用导致AAV/Olig001转导的少突胶质细胞超过200,000个细胞/脑的增加。
已知成年哺乳动物CNS在白质中容纳显著数量的少突胶质细胞前体细胞(Dawson等人Mol.Cell Neurosci.(2003)24:476-488)，并且先前显示了在幼年nur7中呈未成熟少突胶质细胞转换增加形式的尝试髓鞘再生的证据(Francis等人J.Cerebral Blood FlowMetabolism(2012)32:1725-36)。鉴于即使在成年脑中，白质也具有显著的髓鞘再生的能力，成年nur7白质中的未成熟少突胶质细胞的驻留群体的持久性必须被视为寡向性基因递送载体的理想靶标。
为了评估增殖少突胶质细胞祖细胞/未成熟少突胶质细胞的相对数量，每天两次给予nur7和野生型小鼠全身BrdU持续两天并且在第三天处死，以便进行BrdU/Olig2共标记的过程(图29E-G)。在2和8周龄队列中起始BrdU的施用以对幼年和成年脑中的增殖少突胶质细胞的可能持久性进行定量。各年龄的基因型队列的胼胝体和外囊中BrdU阳性细胞的计数揭示与野生型相比，BrdU阳性细胞在2周龄nur7脑中的1.8倍增加(p＝0.029)和在8周nur7脑中的1.6倍增加(p＝0.034)(图29F)。在两种周龄下，nur7白质中的绝大多数BrdU细胞与Olig2共标记，这指示成年症状性nur7小鼠的白质中的增殖祖细胞/未成熟少突胶质细胞的持久性。给予三个6周龄nur7小鼠的子集全身性BrdU持续两天，然后用1×1011vg的AAV/Olig001-GFP转导，并且转导后2周将这些动物处死以获得白质束中的增殖细胞转导证据。在这些动物的白质束中观察到许多BrdU/GFP共标记细胞，指示驻留祖细胞/未成熟细胞的成功转导。
经由ICV ROA，将一组与nur7 ROA队列年龄匹配(即6周龄)的健康野生型动物用1×1011vg AAV/Olig001-GFP转导，并且2周后处死以产生皮层和皮层下白质束内的GFP阳性细胞的体视学估计结果(图8)。GFP阳性细胞的估计结果揭示野生型脑与nur7大脑相比的皮层和皮层下白质的2倍的显著减少(对于各相应ROI而言，p＝0.00032和p＝0.0116)。野生型脑中的皮层下白质GFP转基因表达非常受限于与野生型脑中的侧脑室紧邻的区域，而虽然皮层表达相当地分散，但是在转导细胞的绝对数量方面是非常适中的。
结论
实施例2和3证明，AAV/Olig001 GFP载体的脑室内(ICV)施用途径提供了载体扩散和少突胶质细胞向性的最佳组合。至关重要地，这种ROA似乎完全适合于转导皮层下白质，即受卡纳万病病理学影响的组织。因此，转导几十万个细胞并且维持对于少突胶质细胞的接近100％向性的能力赋予AAV/Olig001超过其他AAV衣壳的显著优势。四至六周龄nur7胼胝体/外囊具有大约1,500,000个Olig2阳性细胞，因而，经由ICV ROA来施用1×1011剂量的AAV/Olig001载体具有转导约20％的驻留少突胶质细胞群体的潜力。应注意，nur7小鼠的白质束存在尝试髓鞘再生的证据并且含有显著数量的增殖少突胶质细胞祖细胞。鉴于单一少突胶质细胞能够使多个轴突髓鞘化，用治疗性AAV/Olig001载体转导白质后的髓鞘再生的潜力是显著的。
其他CSF靶向ROA，即IT和ICM，呈现相对较差的白质束转导，并且不被考虑作为治疗性ROA的首选。IP脑在转导细胞数量方面接近相当的转导水平，但是这些细胞中的大部分集中于注射部位。这些部位处的细胞可能具有比任何其他ROA更多的载体基因组拷贝数/细胞，但是与ICV ROA相比，从这些部位扩散的载体显著较低。通过ICV施用的GFP转导的更广泛分布是有利的，因为可在转导细胞数量与每个转导细胞的载体拷贝数量之间实现合适的平衡。
事实上，在实施例2和3中的IP脑中的转基因表达的强浓度与少突胶质细胞向性的较小但是显著的减少和皮层内的神经向性的均衡增加相关。这表明用AAV/Olig001使区域饱和可导致少突胶质细胞特异性减少。应注意在本研究中使用的动物中，相对于野生型，nur7小鼠中的皮层少突胶质细胞的数量减少并且存在应激和细胞凋亡的证据(Francis等人(2012)J.Cereb.Blood Fl.Metab.32:1725-1736)，预期这可能影响转导效率。
除了小脑以外，所有感兴趣的区域中的载体向性为75-90％的寡向性。在所有ROA组中，此区域呈现>80％的神经向性。在颗粒层浦肯野神经元中观察到特别强的转基因表达。向性的这种明显逆转的原因并不明显，但是小脑明显地是相对于驻留细胞类型的独特解剖实体。小脑内的浦肯野细胞以较低但是可观水平表达Olig2，并且与其他脑区域中的其他神经元的表面相比，AAV/Olig001衣壳可能与浦肯野神经元表面具有显著不同的的相互作用。
当前的实施例表明，在nur7卡纳万病小鼠的整个脑中，AAV/Olig001促进少突胶质转基因的强烈表达，其中小脑是重要例外。在脑的所有其他区域中，在不需要谱系特异性启动子的情况下实现了>70％的寡向性。相对于其他非寡向性衣壳血清型中的选择性启动子使用，AAV/Olig001衣壳对于少突胶质表面的固有亲和力是显著优势，因为其确保尽可能接近于所递送的总剂量的载体在靶细胞中表达。这些数据确定了靶向脑中的白质的不同ROA的优势，其中ICV ROA展示对于作为治疗卡纳万病的模型的症状性成年nur7小鼠的临床前功效研究的适用性。
实施例4：野生型与nur7脑之间AAV/Olig001-GFP转导效率的差异
卡纳万病的nur7小鼠模型在2周龄表现出总体运动功能障碍的症状。到6周龄，nur7脑遭受显著细胞损失、白质损失和广泛空泡化。因此，与健康脑相比，6周nur7脑是显著不同的微环境，可能影响AAV/Olig001-GFP的传播和转导。事实上，如与nur7小鼠脑中的转导水平相比，在6周龄野生型小鼠的队列中，经由ICV ROA施用1×1011剂量导致在皮层和皮层下白质中的显著降低水平的转导(图12)(各组n＝5只动物，显示为平均值+/-sem，*p≤0.05，**p≤0.01)。
皮层和皮层下白质中的GFP阳性细胞的体视学估计证明野生型脑中的转基因表达的显著减少的发生率(至少50％的减少)。强GFP荧光限于与侧脑室紧邻的区域，并且在野生型脑中具有中等程度皮层和皮层下白质GFP荧光信号。小脑中的转基因表达较差。这些数据表明AAV/Olig001传播和转导效率的基因型特异性效应。此外，因为nur7脑与人卡纳万脑一样重度空泡化，具有过大的脑室并且具有显著升高的NAA，因此这些体征和症状可以潜在影响人AAV/Olig001治疗剂的载体传播和生物分布。
实施例5：体内施用AAV/Olig001-ASPA至nur7小鼠改善了转棒表现
方法
向6周龄nur7小鼠施用一剂的包含SEQ ID NO:2的密码子优化的ASPA序列的AAV/Olig001-ASPA。编码密码子优化的ASPA和调控元件的表达质粒在图13中示出。2.5×1011、7.5×1010或2.5×1010vg的总剂量经由脑室内(ICV)施用途径(ROA)施用。所有剂量组的载体以5μl的总体积递送，其中2.5μl注射于脑的各半球的侧脑室中。通过经由相同ROA注射等体积的生理盐水，以产生年龄匹配的nur7动物的对照组。年龄匹配的幼稚野生型动物用作所有运动功能测试的校准参考。施用载体后两周，针对从加速转棒掉落的等待时间和使用旷场活动室的总体活动，每月测试动物一次持续四个月。所有行为测试由对于处理不知情的个人来进行。
结果
转棒表现
在所施用的最高剂量(2.5×1011vg)下，AAV/Olig001-ASPA将nur7小鼠中的如通过转棒表现所测量的逐步恶化的平衡、握力和/或运动协调拯救至与年龄匹配的野生型动物无区别并且相对于假处理nur7对照非常显著改善的水平。在此剂量下，AAV/Olig001-ASPA处理动物中的增加的转棒表现在整个研究期中是显著的(p＝0.028)，如通过重复测量ANOVA所确定的，并且在每个单独的时间点显著更高，如通过未配对学生t检验所确定的。在中等剂量(7.5×1010vg)下，AAV/Olig001-ASPA在所测试的每个时间点也促进了nur7小鼠中的显著改善的转棒表现，但是此改善在整个研究期中不显著(重复测量ANOVAp＝0.19)。在所施用的最低剂量(2.5×1010vg)下，AAV/Olig001-ASPA仅在所测试的最后两个时间点(18和22个月)有效促进改善的转棒表现。表1提供了各处理组的以秒为单位测量的平均掉落等待时间(具有标准偏差)。对于各组，测试了12只小鼠(6只雄性和6只雌性)。表2提供了各年龄的AAV/Olig001-ASPA处理与假处理nur7小鼠之间的未配对t检验比较的p值。除了10和14周施用2.5×1010的小鼠相比于假处理小鼠之外，在所有组中观察到统计上的显著改善。
表1.转棒掉落等待时间。
Figure BDA0003914670460000871
表2.AAV/Olig001-ASPA处理小鼠与假处理小鼠之间的转棒等待时间差异的P值。
Figure BDA0003914670460000872
图14示出了各AAV/Olig001-ASPA nur7剂量组、假处理nur7和幼稚野生型对照的生命研究期过程中的绘制的转棒平均掉落等待时间。在所有3个剂量组中，掉落等待时间增加，其中通过重复测量ANOVA(*)，最高剂量在整个研究期内是显著的。
旷场活动
在进行转棒的各年龄中，还评估了动物在旷场活动室中的广义运动功能(图15)。每次给予动物单次20分钟进程，并且记录每次进程的总行进距离。相对于年龄匹配的野生型动物，假处理nur7小在所有年龄，尤其在最后时间点表现出显著活动过度。在22周龄，相对于野生型，假处理nur7动物呈现活动的3倍显著增加(行进距离；p＝0.0202)。相反，2.5×1011剂量的AAV/Olig001-ASPA在nur7小鼠中导致正常活动水平，该水平相对于假处理对照是统计上显著的(p＝0.0312)并且与年龄匹配的野生型无区别。较低7.5×1010剂量的AAV/Olig001-ASPA导致更紧密地类似于野生型而不是假处理nur7模式的活动模式，但是在22周龄与假处理相比恰好在相对于统计显著性的阈值以下(p＝0.1181)。最低(2.5×1010)剂量的AAV/Olig001-ASPA没有显著地使病理性过度活动正常化并且更紧密地类似于假处理nur7对照而不是野生型参考。
在这些相同动物中对旷场活动的评估证明了AAV/Olig001-ASPA处理的nur7动物的活动过度的剂量依赖性正常化。数据表示为平均值+/-sem，其中每组n＝6只动物。
NAA积累和载体基因组(vg)拷贝数
在22周的转棒测试后，将小鼠处死，并且将脑组织分离。对每个脑的一个半球进行处理以用于NAA的HPLC分析，并且对剩余半球进行处理以用于通过定量PCR来分析载体基因组(vg)拷贝数。
假盐水处理的nur7小鼠脑包含通常较高的NAA，如从ASPA功能的损失所预期的(图16)。在AAV/Olig001-ASPA处理组中观察到病理学升高的NAA的剂量响应性减少，其中最高2.5×1011剂量导致非常显著的2.6倍减少(p＝5.06×10-6)，中等的7.5×1010剂量导致1.6倍减少(p＝5.17×10-5)，并且最低的2.5×1010剂量导致1.4倍减少(p＝0.001)。用最高剂量的AAV/Olig001-ASPA处理的nur7脑中的NAA事实上显著低于年龄匹配的野生型脑中的NAA(p＝0.0012)。
使用针对NAA所分析的脑所剩余的半球通过使用靶向重组AAV/Olig001-ASPA表达盒的牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化序列的定制TaMan探针/引物组的定量PCR来定量载体基因组(vg)拷贝数。半球的总DNA含量使用可商购获得的DNA纯化柱和试剂盒(Qiagen)来分离并且由此产生的DNA样品相对于纯化质粒标准曲线来运行，以产生各样品的vg/湿组织重量。所产生的VG/mg组织值反映所施用的AAV/Olig001-ASPA的剂量(图17)，其与NAA对于载体剂量的响应一致。
空泡化分析
通过无偏体视学分析用AAV/Olig001-ASPA处理的nur7小鼠的脑，以定量随载体剂量而变化的丘脑和小脑白质/脑桥中的空泡体积分数(图18)。各感兴趣的区域内的由空腔占据的面积定义为空泡并且呈现为总体感兴趣的区域体积的百分比。在每个剂量下，AAV/Olig001-ASPA处理导致丘脑空泡化的完全拯救，如与假处理小鼠相比，丘脑空泡体积分数的高度显著降低所示(2.5×1011，p＝4.6×10-8；7.5×1010，p＝6.4×10-8；和2.5×1010，p＝6.2×10-8)(图19)。与假处理小鼠相比，小脑白质/脑桥中的空泡化也在所有剂量下得到显著地拯救(2.5×1011，p＝1.3×10-5；7.5×1010，p＝2.5×10-5；和2.5×1010，p＝0.0009)，但是拯救的程度与所施用的载体剂量成比例。最低2.5×1010剂量组呈现的空泡体积分数显著高于最高2.5×1011剂量的空泡体积分数(p＝5.74×10-6)，同时仍然显著少于假处理对照中的空泡体积分数(p＝0.0009)(图19)。
少突胶质细胞恢复
对用于空泡化分析的相同脑进行处理以进行Olig2免疫组织化学以鉴定少突胶质细胞。通过无偏体视学针对Olig2阳性细胞对丘脑和皮层进行取样以鉴定分别受空泡化影响以及不受其影响的区域中的产生驻留白质的细胞中的显著差异(图20)。相对于年龄匹配的野生型脑，假处理nur7脑呈现Olig2阳性细胞的大量4.6倍损失，仅占正常野生型含量的21％(p＝4.9×10-7)。AAV/Olig001-ASPA处理的nur7小鼠和假处理nur7小鼠的丘脑中的Olig2计数(图21)显示，相对于假处理对照，所有三个AAV/Olig001-ASPA处理的nur7队列中的少突胶质细胞显著增加(2.5×1011vg，p＝6.75×10-8；7.7×1010vg，p＝0.026；2.3×1010vg，p＝3.18×10-5)。皮层区中的Olig2损失不太剧烈但是显著(相比于野生型小鼠，假处理nur7小鼠中减少1.7倍；p＝0.0025)。相对于假处理nur7对照小鼠，2.5×1011vg处理的nur7脑的皮层的Olig2含量(图21)也显著增加(p＝0.0002)，但在是两个较低剂量组的脑中不显著增加。
神经元恢复
在用于Olig2染色的相同22周龄脑中，针对NeuN阳性神经元对丘脑和皮层进行评分(图22)。假处理nur7动物呈现的丘脑神经元的数量为年龄匹配的野生型动物值的约35％(p＝2.8×10-5)(图23)。用2.5×1011AAV/Olig001-ASPA处理的Nur7小鼠包含的丘脑神经元的数量相较于假处理对照小鼠增加2.3倍(p＝0.0009)并且为野生型小鼠中观察到的丘脑神经元的约84％。在两个较低剂量7.5×1010和2.5×1010下，AAV/Olig001-ASPA促进丘脑NeuN阳性细胞增加，相较于假处理对照小鼠分别增加1.8和1.6倍(p＝0.012；p＝0.042)。在皮层(运动和躯体感觉)中，相对于年龄匹配的野生型小鼠脑，假处理nur7小鼠脑中的神经元损失不太严重但是显著。假处理小鼠的皮层包含的NeuN阳性细胞为在野生型小鼠中观察到的约80％，表示1.2倍的减少(p＝0.005)。用2.5×1011AAV/Olig001-ASPA处理的Nur7小鼠包含的皮层神经元的数量为在野生型小鼠中观察到的皮层神经元的约98％，并且比在假处理nur7小鼠中观察到的皮层神经元的数量增加1.2倍(p＝0.013)。AAV/Olig001-ASPA的连续剂量导致相对于假处理，皮层神经元的稳定的1.2倍增加。对于7.5×1010剂量，取样数据的高方差使得这种增加不显著(p＝0.113)。在最低2.5×1010剂量下，AAV/Olig001-ASPA处理的小鼠维持相较于假处理对照的皮层神经元的显著1.2倍增加(p＝0.05)。
改善的髓鞘形成
使用无偏体视学定量假处理和AAV/Olig001-ASPA处理的22周龄nur7脑的整个皮层中的皮质髓磷脂碱性蛋白阳性纤维长度密度(MBP-LD)，以提供用AAV/Olig001-ASPA处理后的髓鞘形成恢复度的指数。使用计算机生成的探针对运动和躯体感觉皮层的MBP阳性纤维进行取样，以对3维组织空间中的各向同性探针纤维相互作用进行评分，并且然后通过皮层内的总MBP阳性纤维长度总和除以取样组织的体积得到最终MBP长度密度(μm纤维/mm3)(图24)。当与年龄匹配的野生型脑比较时，假处理nur7脑呈现皮层MBPLD的非常显著的2倍减少(p＝0.0001)。用所有三个剂量的AAV/Olig001-ASPA来处理导致相对于假处理对照的皮层MBP-LD的显著增加，其中改善程度与剂量成比例(2.5×1011p＝0.0014；7.5×1010p＝0.003；2.5×1010p＝0.016)。假处理和AAV/Olig001-ASPA处理的nur7小鼠脑用抗髓磷脂碱性蛋白(MBP)染色(图25)。
这些数据证明卡纳万病的小鼠模型的AAV/Olig001-ASPA处理改善平衡、握力和/或运动协调、运动功能，降低存在于脑中的NAA的量，降低脑的空泡化，增加Olig2和NeuN阳性细胞的数量并且恢复髓鞘形成。
实施例6：用于卡纳万基因疗法的CLARITY辅助生物分布
具有绿色荧光蛋白(GFP)转基因的少突胶质细胞向性rAAV载体(Olig001)在呈现卡纳万病表型的Nur7小鼠脑中的生物分布使用三维(3D)组织透明化和成像方法来评估。这允许对经由替代施用途径(ROA)施用的Nur7小鼠半脑内的载体生物分布进行全局表示和体积测量。比较脑室内(ICV)和实质内(IP)ROA的生物分布功效，并且该方法用于补充从传统的二维(2D)组织学评估获得的常规体视学数据。
本实施例证明了3D方法的适用性，及其在评估卡纳万病小鼠模型的成年鼠半脑中的AAV/Olig001-GFP生物分布中的意义。结果呈现为光片显微术数据的3D透明化脑影像和生物分布估计的列表参数的视觉定性和定量表示。
样品制备和成像
每种ROA的四只成年小鼠(总共八只)在6周龄接受5×1011载体基因组(vg)/动物并且在给药后两周处死。接收PFA固定的脑并且制备用于3D组织透明化和体积光片显微术成像。将各脑矢状平分并且对右半球使用CLARITY进行组织透明化(Chung等人，Nature，2013)。各样品以水凝胶包埋和聚合作用来同样地制备，随后使用商业装置(X-Clarity,Logos Biosystems)、利用可商购获得的试剂(Logos Biosystems)进行电泳组织透明化。获得样品处理期间的主要步骤的宏观显微照片以便记录样品状况(图26)。
各透明化半脑的完全3D显微术成像使用Zeiss Z.1光片显微镜、使用5×放大率物镜和覆盖各半脑整体的基于平铺的采集来进行。调整成像参数来检测GFP表达并且在所有样品中保持恒定以在样品中确保一致性并实现相对比较。从组织透明化至图像采集和分析，所有样品均在相同条件下进行处理和成像。
图像处理和分析
使用针对各半脑的内部定制设计算法，对原始数据集进行预处理并且重构成完整、无缝的3D图像。最终图像各自含有一个半脑并且输入至商用3D图像处理和分析程序(Imaris,Bitplane)中以进行整体、定量生物分布分析。首先，计算全半脑体积内的整体平均和中值(GFP)信号值。此外，选择两个GFP强度阈值来指定“低”或“高”GFP表达(图27)。然后，这些阈值在所有样品中保持不变以获得一致性。然后确定这些分类强度区域的体积并且与全半脑体积比较以产生“vol％高/低表达”(表3)。
结果
各半脑的宏观显微照片和完整3D成像揭示了在两种ROA中GFP表达的可变生物分布模式(IP相比于ICV；图28和图30)。另外，细胞类型向性通过视觉评估细胞形态和所确定的其空间位置来评估。虽然这些生物分布模式在样品中根据载体传播的程度而有所不同，但是亚区域转导模式的相似性在样品中保持一致，如小脑中的浦肯野细胞中的高表达。然后，对于各半脑，计算并列出“低”和“高”GFP表达的定量以及整体强度(表3)。与先前实施例中的体视学评估一致，在ICV注射后，透明化半脑在作为卡纳万病的关键区域的皮层下白质内显示出优异的载体传播。另外，尽管IP注射产生高GFP强度的亚区域，但是这些亚区域中的大部分集中在注射部位附近，这支持了从体视学评估获得的结论。
表3.4个ICV注射半脑的定量。
Figure BDA0003914670460000921
结论和意义
完整的组织透明化鼠脑的体积成像提供了对AAV/Olig001生物分布的更综合且整体的评估。实现分布的完全采集和定量的定制算法支持从体视学方法获得的更高分辨率定量。器官水平成像的评估提供了保留3D空间结构和区域连接性的该生物分布的总体评估。最终，在进行AAV/Olig001 ROA的额外评估来评估最佳转导效率和细胞类型特异性向性时，各种ROA的数字汇编(digital compilation)可用于生成用于未来参考的数字“文库”。
实施例7：基于CLARITY的AAV生物分布和药效学效应的体积评估
在该实施例中，利用以上实施例6中描述的CLARITY组织透明化技术来评估并证明在nur7小鼠脑中注射AAV/Olig001-ASPA之后，整体和局部转基因介导的脱髓鞘逆转的药理学效应。
简而言之，将nur7小鼠分成两组并且以如上所述方式经由ICV或IP途径来施用AAV/Olig001-ASPA(“Olig1”或“Olig1-ASPA”)或盐水(“Nur7”)。然后以如上所述方式来分析两组小鼠的脑以定量丘脑和小脑白质/脑桥中的空泡体积分数。还分析了野生型小鼠(“WT”)的脑作为对照组。结果展示于图31中。更具体而言，图31B中的箭头指示nur7小鼠的丘脑区域表现出可见空泡化，其不存在于WT中并且在Olig1-ASPA处理的组织中几乎被完全拯救。另外，如图31C所示，在被动透明化一天之后，nur7小鼠组织达到比WT和Olig1-ASPA处理的组织更高的透明度。这些结果证明，AAV/Olig001-ASPA处理在nur7小鼠中减少脑的空泡化并且恢复髓鞘形成。
还对来自具有类似解剖取向的所有三个组的3D图像提取的2D单一切片进行细胞计数分析(图32A)。如图32B和图32C所示，虽然平均细胞核密度(按照分割区域归一化的计数)显示皮层区域内的细胞密度的总体极少差异，但是Nur7组的小鼠在丘脑区域中具有显著更低的总体细胞核密度/细胞核区域。相比之下，Olig1-ASPA组和WT组似乎在丘脑区域中具有相似的总体细胞核密度或细胞核区域。这些结果证明，nur7小鼠的AAV/Olig001-ASPA处理使丘脑区域中的细胞的数量维持或增加至接近于WT组中所观察到的水平。
以如上所述方式，对用于空泡化分析的脑进行处理以用于MBP的免疫荧光染色，以鉴定少突胶质细胞。为此，进行3D体积分析以检查药效学治疗效果。测定2mm组织切片的完整3D体积并且计算SYTO(细胞核标记物)以及MBP的平均荧光强度。发现来自Nur7组的小鼠的组织表现出更低的平均MBP荧光值。相比之下，Olig1-ASPA处理组具有增加的整体MBP信号，几乎达到WT组的水平(图33B)。
进行另外的3D体积分析，其中MBP体积通过信号阈值计算。阈值更限制性地以设定于超过2000的荧光值的阈值(图33C，左图)，或更包含性地以1000的阈值(图33C，右图)来执行。在两种情况下，在Nur7组的小鼠中观察到MBP缺陷(图33D)。相比之下，在Olig1-ASPA组中并且尤其在使用较低阈值时，明显地发现MBP体积的增加，其中总MBP体积值接近WT组的水平(图33D)。
基于区域的分析在丘脑区域中以3D方式进行。区域的一部分的手动分割在图33E中示出。此区域内的细胞核(SYTO)和髓磷脂(MBP)标记物的平均荧光强度在图33F中示出。发现Olig1-ASPA组的SYTO和MBP水平几乎达到WT组的水平。相比之下，Nur7样品在两种标记物中均表现出较低的平均荧光值。还对皮层的一部分进行了基于区域的分析。图33G和图33H显示了在此皮层区域内细胞核(SYTO)和髓磷脂(MBP)标记物的平均荧光强度水平。总体趋势类似于图33F所示的趋势。还获得了皮层和丘脑区域中的3D细胞浓度(每100um2的细胞核)。如图33I所示，Nur7组的小鼠中两个区域中的总体细胞核浓度较低。相比之下，Olig1-ASPA组的小鼠的丘脑区域中的3D细胞浓度显示出接近于WT组水平的水平。
这些结果证明，施用AAV/Olig001-ASPA拯救或逆转nur7小鼠脑中的脱髓鞘和细胞损失。
等价物
认为前述书面说明足以能够使本领域技术人员实践本公开。前述描述和实施例详述乐本公开的某些示例性实施方案。然而，应当理解，无论前述内容以文本形式表现得如何详细，本公开仍可以许多方式实践，且应根据所附权利要求及其任何等价物解释本公开。
本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以及其中所引用的参考文献，在它们尚未被引用的范围内，通过整体引用并入本文。
表4
序列
Figure BDA0003914670460000951
Figure BDA0003914670460000961
Figure BDA0003914670460000971
Figure BDA0003914670460000981
Figure BDA0003914670460000991
Figure BDA0003914670460001001
Figure BDA0003914670460001011
序列表
<110> 美国辉瑞有限公司
<120> 用于基因疗法的编码天冬氨酸酰化酶(ASPA)的经修饰的核酸和载体
<130> 323429.00101
<150> 63/016,507
<151> 2020-04-28
<150> 63/077,144
<151> 2020-09-11
<160> 20
<170> PatentIn 版本 3.5
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Met Thr Ser Cys His Ile Ala Glu Glu His Ile Gln Lys Val Ala Ile
1 5 10 15
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His Trp Leu Glu Asn Gly Ala Glu Ile Gln Arg Thr Gly Leu Glu Val
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<400> 5
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgg 106
<210> 6
<211> 284
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 6
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 120
gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 180
cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca tttgcccagt acatgacctt atgggacttt 240
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccat 284
<210> 7
<211> 278
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 7
tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60
ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120
ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 180
cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 240
ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcg 278
<210> 8
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 8
ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 60
ccccggctct gactgaccgc gt 82
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 9
gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agc 43
<210> 10
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 10
aagaggtaag ggtttaaggg atggttggtt ggtggggtat taatgtttaa ttacctggag 60
cacctgcctg aaatcacttt ttttcaggtt gg 92
<210> 11
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 11
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa cagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 12
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 12
tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagctggc 60
gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctg 113
<210> 13
<211> 2214
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 13
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360
gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420
ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctcctc gggcatcggc 480
aagacaggcc agcagcccgc taaaaagaga ctcaatttcg gtcagactgg cgacacagag 540
tcagtcccag accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600
cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660
gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720
accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780
tccaacggga catcgggagg agccaccaac gacaacacct acttcggcta cagcaccccc 840
tgggggtatt ttgactttaa cagattccac tgccactttt caccacgtga ctggcagcga 900
ctcatcaaca acaactgggg attccggccc aagagactca gcttcaagct cttcaacatc 960
caggtcaagg aggtcacgca gaatgaaggc accaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020
acggtccagg tcttcacgga ctcggagtac cagctgccgt acgttctcgg ctctgcccac 1080
cagggctgcc tgcctccgtt cccggcggac gtgttcatga ttccccagta cggctaccta 1140
acactcaaca acggtagtca ggccgtggga cgctcctcct tctactgcct ggaatacttt 1200
ccttcgcaga tgctgagaac cggcaacaac ttccagttta cttacacctt cgaggacgtg 1260
cctttccaca gcagctacgc ccacagccag agcttggacc ggctgatgaa tcctctgatt 1320
gaccagtacc tgtactactt gtctcggact caaacaacag gaggcacggc aaatacgcag 1380
actctgggct tcagccaagg tgggcctaat acaatggcca atcaggcaaa gaactggctg 1440
ccaggaccct gttaccgcca acaacgcgtc tcaacgacaa ccgggcaaaa caacaatagc 1500
aactttgcct ggactgctgg gaccaaatac catctgaatg gaagaaattc attggctaat 1560
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atcctgattt ttggcaaaca aaatgctgcc agagacaatg cggattacag cgatgtcatg 1680
ctcaccagcg aggaagaaat caaaaccact aaccctgtgg ctacagagga atacggtatc 1740
gtggcagata acttgcagca gcaaaacacg gctcctcaaa ttggaactgt caacagccag 1800
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ctgaaacatc ctccgcctca gatcctgatc aagaacacgc ctgtacctgc ggatcctccg 1980
accaccttca accagtcaaa gctgaactct ttcatcacgc aatacagcac cggacaggtc 2040
agcgtggaaa ttgaatggga gctgcagaag gaaaacagca agcgctggaa ccccgagatc 2100
cagtacacct ccaactacta caaatctaca agtgtggact ttgctgttaa tacagaaggc 2160
gtgtactctg aaccccaccc cattggcacc cgttacctca cccgtcccct gtaa 2214
<210> 14
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 14
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp Asn
260 265 270
Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala Asn
325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu
340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn
370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr Thr
405 410 415
Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser
435 440 445
Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly Phe
450 455 460
Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu
465 470 475 480
Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly Gln
485 490 495
Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His Leu
500 505 510
Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr His
515 520 525
Lys Asp Asp Lys Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile Phe
530 535 540
Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val Met
545 550 555 560
Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu
565 570 575
Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala Pro
580 585 590
Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp
595 600 605
Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro
610 615 620
His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly
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Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro
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Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe Ile
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Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu
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Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser
690 695 700
Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly
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Val Tyr Ser Glu Pro His Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro
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Leu
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 15
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
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Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
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Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
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Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
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Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
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Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305 310 315 320
Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn Asn
325 330 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu Pro
340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr Thr Phe
405 410 415
Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420 425 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg
435 440 445
Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly Phe Ser
450 455 460
Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro
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Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly Gln Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr His Lys
515 520 525
Asp Asp Lys Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val Met Leu
545 550 555 560
Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Glu
565 570 575
Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala Pro Gln
580 585 590
Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
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Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
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Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
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Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
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Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
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65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
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100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
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165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
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195 200 205
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Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
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245 250 255
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275 280 285
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Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385 390 395 400
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agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 900
ctttttttca ggttggaccg gtatgacctc ctgtcatata gccgaggagc acatccagaa 960
agtggccatt ttcggcggga cacacggaaa cgaacttaca ggagtgtttc tggtgaaaca 1020
ctggcttgaa aatggtgcgg agatccaaag gaccggcctg gaggtcaaac cttttattac 1080
aaatccccgg gcggtcaaga agtgcacacg gtacattgat tgtgatctta atcgcatatt 1140
cgacctggag aaccttggga agaaaatgtc tgaagatctg ccctacgaag tgaggcgagc 1200
acaagagata aaccacctgt tcggaccgaa agacagtgaa gactcctatg acatcatttt 1260
cgacctgcac aacactacga gtaacatggg gtgtaccctg atcctcgaag actcccgaaa 1320
caatttcctg atacagatgt ttcattacat caaaactagt ctggcccctc tcccctgcta 1380
cgtttatctg atcgaacacc cttctctcaa atacgctacc acccgctcta ttgctaagta 1440
ccccgtcggg atcgaggtcg gcccacaacc tcaaggtgtg ctccgggccg atattttgga 1500
ccagatgaga aagatgatta aacacgctct cgacttcatt caccacttta acgaggggaa 1560
ggaatttccc ccttgtgcca tcgaggttta taagattatc gagaaggtgg actacccaag 1620
agacgaaaac ggggagatag ctgccatcat ccaccctaat ttgcaagatc aggactggaa 1680
gcccctgcac ccaggagacc ccatgtttct gaccttggat ggaaagacga tccccctggg 1740
cggtgattgt acagtgtacc cagtctttgt caacgaggcc gcttactatg agaaaaagga 1800
ggcttttgca aagacaacaa agctcacttt gaatgcaaag tccatcaggt gctgtctgca 1860
ctaagcggcc gcggggatcc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 1920
ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 1980
aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 2040
gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaacagca ggcatgctgg ggatgcggtg 2100
ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc agctttggac gcgtaggaac ccctagtgat 2160
ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt 2220
cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gccagctggc 2280
gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctg 2333

Claims (40)

1.编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的分离的核酸，其包含与SEQ ID NO:2的核酸序列至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
2.编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸，其包含与SEQ ID NO:2的核酸序列至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
3.包含编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸的载体基因组，所述经修饰的核酸包含与SEQ ID NO:2的核酸序列至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
4.如权利要求3所述的载体基因组，其中所述载体基因组是重组腺相关病毒(rAAV)载体基因组。
5.如权利要求3或4所述的载体基因组，其中所述载体基因组是自身互补的。
6.重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含：包含经修饰的核酸的载体基因组，所述经修饰的核酸包含与SEQ ID NO:2的核酸序列至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的核酸序列；以及选自以下的衣壳：Olig001、Olig002、Olig003、AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAVhu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAV2i8、AAV2G9、AAV2i8G9、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-DJ/9和AAV-LK03的衣壳。
7.如权利要求6所述的rAAV载体，其中所述衣壳是Olig001、Olig002或Olig003衣壳。
8.如权利要求6或7所述的rAAV载体，其中所述衣壳是包含病毒蛋白1(VP1)的Olig001衣壳并且其中所述VP1包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
9.如权利要求6-8中任一项所述的rAAV载体，其中所述衣壳是包含VP1的Oligo001衣壳并且其中所述VP1包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
10.如权利要求6-9中任一项所述的rAAV载体，其中所述载体基因组是自身互补的。
11.如权利要求6-10中任一项所述的rAAV载体，其中所述载体基因组进一步包含至少一个选自以下的元件：至少一个AAV反向末端重复(ITR)序列、增强子、启动子、外显子、内含子和多腺苷酸化(polyA)信号序列。
12.如权利要求6-11中任一项所述的rAAV载体，其中所述载体基因组进一步包含至少一个选自以下的元件：至少一个AAV2 ITR、巨细胞病毒(CMV)增强子、杂合形式的CBA启动子(CBh启动子)、鸡β-肌动蛋白(CBA)外显子、CBA内含子、小鼠微小病毒(MVM)内含子和牛生长激素(BGH)polyA。
13.如权利要求6-12中任一项所述的rAAV载体，其中所述载体基因组进一步包含至少一个选自以下的元件：至少一个包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19的核酸序列的ITR；包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列的增强子；包含SEQ ID NO:7的核酸序列的启动子；包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18的核酸序列的外显子；包含SEQ ID NO:9的核酸序列的内含子；包含SEQ ID NO:10的核酸序列的内含子；和包含SEQ ID NO:11的核酸序列的polyA。
14.包含载体基因组的rAAV载体，所述载体基因组从5’至3’包含：
a)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19的核酸序列的AAV反向末端重复(ITR)；
b)包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列的增强子；
c)包含SEQ ID NO:7的核酸序列的启动子；
d)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18的核酸序列的外显子；
e)包含SEQ ID NO:9的核酸序列的内含子；
f)包含SEQ ID NO:10的核酸序列的内含子；
g)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸；
h)包含SEQ ID NO:11的核酸序列的polyA；和
i)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19的核酸序列的AAV ITR。
15.如权利要求14所述的rAAV载体，其中所述核酸是自身互补的。
16.如权利要求14或15所述的rAAV载体，其中所述载体包含含有病毒蛋白1(VP1)的Olig001衣壳并且其中所述VP1包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
17.rAAV载体，其包含：包含病毒蛋白1(VP1)的Olig001衣壳并且其中所述VP1包含SEQID NO:14的氨基酸序列；以及自身互补核酸，所述自身互补核酸从5’至3’包含：
a)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19的核酸序列的AAV2反向末端重复(ITR)；
b)包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核酸序列的CMV增强子；
c)包含SEQ ID NO:7的核酸序列的CBh启动子；
d)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:18的核酸序列的CBA外显子1；
e)包含SEQ ID NO:9的核酸序列的CBA内含子1；
f)包含SEQ ID NO:10的核酸序列的MMV内含子；
g)包含SEQ ID NO:2的核酸序列的编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)的经修饰的核酸；
h)包含SEQ ID NO:11的核酸序列的BGH polyA；和
i)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:19的核酸序列的AAV2 ITR。
18.药物组合物，其包含如权利要求6-17中任一项所述的rAAV载体。
19.治疗和/或预防与ASPA的缺陷或功能障碍相关的疾病、病症或病况的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如权利要求6-17中任一项所述的rAAV载体或如权利要求17所述的药物组合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述与ASPA的缺陷或功能障碍相关的疾病、病症或病况为卡纳万病。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述rAAV载体直接施用至脑和/或中枢神经系统。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体施用至选自以下的中枢神经系统的区域：脑实质、脊椎管、蛛网膜下腔、脑室、枕大池及其组合。
23.如权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体通过选自以下的方法来施用：实质内施用、鞘内施用、脑室内施用、枕大池内施用及其组合。
24.宿主细胞，其包含如权利要求1所述的分离的核酸、如权利要求2所述的经修饰的核酸、如权利要求3-5中任一项所述的载体基因组或如权利要求6-17中任一项所述的rAAV载体。
25.如权利要求24所述的宿主细胞，其中所述细胞选自以下：VERO、WI38、MRC5、A549、HEK293、B-50或任何其它HeLa细胞、HepG2、Saos-2、HuH7和HT1080。
26.如权利要求25所述的宿主细胞，其中所述细胞为适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。
27.如权利要求26所述的宿主细胞，其中所述细胞是具有美国典型培养物保藏中心(ATCC)号PTA 13274的HEK293细胞。
28.如权利要求25-27中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞包含至少一种核酸，所述至少一种核酸编码至少一种选自以下的蛋白：AAV rep蛋白、AAV衣壳(Cap)蛋白、腺病毒(Ad)早期区1A(E1a)蛋白、Ad E1b蛋白、Ad E2a蛋白、Ad E4蛋白和病毒相关(VA)RNA。
29.用于治疗卡纳万病(CD)的试剂盒，其包含治疗有效量的如权利要求1所述的分离的核酸、如权利要求2所述的经修饰的核酸、如权利要求3-5中任一项所述的载体基因组、如权利要求6-17中任一项所述的rAAV载体或如权利要求18所述的药物组合物。
30.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含标签或插页，所述标签或插页包括使用试剂盒组分中的一个或多个的说明。
31.如权利要求1所述的分离的核酸、如权利要求2所述的经修饰的核酸、如权利要求3-5中任一项所述的载体、如权利要求6-17中任一项所述的rAAV载体或如权利要求18所述的药物组合物，其用于治疗或预防与ASPA的缺陷或功能障碍相关的疾病、病症或病况。
32.如权利要求31所述使用的分离的核酸、经修饰的核酸、载体基因组、rAAV载体或药物组合物，其中所述疾病、病症或病况为卡纳万病。
33.如权利要求1所述的分离的核酸、如权利要求2所述的经修饰的核酸、如权利要求3-5中任一项所述的载体或如权利要求6-17中任一项所述的rAAV载体在制备用于治疗和/或预防与ASPA的缺陷或功能障碍相关的疾病、病症或病况的药物中的用途。
34.如权利要求33所述的用途，其中所述疾病、病症或病况为卡纳万病。
35.确定受试者的脑中转基因的生物分布的方法，其中所述转基因从包含Olig001衣壳的rAAV载体表达，所述方法包括
a)通过脑室内(ICV)注射或实质内(IP)注射将所述rAAV载体施用至所述受试者；
b)固定脑；
c)对脑进行电泳透明化；
d)对脑组织切片进行3D显微成像；
e)对转基因表达进行定量。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述转基因编码标记物并且其中所述标记物是绿色荧光蛋白(GFP)。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述转基因编码ASPA。
38.如权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述转基因表达与rAAV载体转导效率相关。
39.如权利要求35-38中任一项所述的方法，其进一步包括步骤(f)，所述步骤(f)包括通过细胞形态评估和空间位置确定来评估细胞类型向性。
40.如权利要求35-39中任一项所述的方法，其进一步包括对转基因表达进行立体渲染。
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