JP2022548270A - フリードライヒ運動失調症の治療のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本出願は、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）の治療のための組成物を提供する。これらには、限定されないが、ヒトフラタキシン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ ＦＸＮ）及びヒトフラタキシン（ＦＸＮ）ヌクレオチド配列を含む核酸構築物及び組換えベクターが本明細書に提供される。また、ＦＡの治療のための方法も提供される。ヒトフラタキシンの発現をインビトロ、エクスビボ、及びインビボで調節するための核酸構築物が、本明細書に提供される。

Description

従来の関連出願
本出願は、２０１９年９月１３日出願の米国仮出願第６２／８９９，９５３号の利益及び優先権を主張するものであり、この仮出願は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、概して、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）の治療のための組成物及び方法に関する。

配列表の参照による組み込み
本出願は、コンピュータ可読形態の配列表（ファイル名：１１９１５６３ｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔ、２０２０年９月１１日作成）を含み、これは、その全体において参照により本明細書に組み込まれ、本開示の部分を形成する。

フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）は、常染色体劣性疾患であり、米国で最も一般的な遺伝性運動失調症の形態であり、４０，０００人に約１人が罹患している。これは、ＦＸＮ遺伝子の第１のイントロンにおけるＧＡＡトリプレットの伸長によって引き起こされる（図１Ｂ）。健常な個体には存在しないこの変異（図１Ａ）は、ＦＸＮ転写を変化させ、鉄硫黄クラスターの組み立てに関与する小さなミトコンドリアタンパク質であるフラタキシン（ＦＸＮ）の発現を低下させる（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ ａｔａｘｉａ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｂｒ Ｍｅｄ Ｂｕｌｌ．２０１７；１２４（１）：１９－３０）。ＦＸＮ遺伝子のトリヌクレオチド反復拡張を有する２つの対立遺伝子を遺伝で受け継ぐ個体は、ＦＡを発症する可能性が高い。
ＦＡは、運動失調を引き起こす中枢神経系（ＣＮＳ）の進行性変性を特徴とし、心疾患（例えば、肥大性心筋症または心筋線維症）に関連する。これらの症状は、５歳から１５歳の間に現れ始め、男性と女性の両方で経時的に悪化する。しかしながら、約１５％の患者では、それほど深刻ではない遺伝子変異が、２５歳以降の疾患発症の原因となる。診断から１０～１５年以内に、ほとんどの罹患した個体は、十分な運動制御の喪失により車椅子生活を余儀なくされる（Ｒｕｍｍｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｌｏｓｓ ｏｆ Ａｍｂｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ Ａｔａｘｉａ ＥＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ．２０２０ Ｊａｎ ８；１８：１００２１３）。疾患の後期段階では、患者は、再起不能になり、一般に心臓疾患により成人期初期に死亡する。現在、ＦＡに対する既知の治癒法または有効な治療法は存在しない。

Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ ａｔａｘｉａ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｂｒ Ｍｅｄ Ｂｕｌｌ．２０１７；１２４（１）：１９－３０ Ｒｕｍｍｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｌｏｓｓ ｏｆ Ａｍｂｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ Ａｔａｘｉａ ＥＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ．２０２０ Ｊａｎ ８；１８：１００２１３

ヒトフラタキシンの発現をインビトロ、エクスビボ、及びインビボで調節するための核酸構築物が、本明細書に提供される。核酸構築物は、ヒトフラタキシン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ ＦＸＮ）を含む核酸配列と、ヒトフラタキシン（ＦＸＮ）をコードする核酸配列と、を含む。いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列番号６０のアミノ酸配列を有するヒトフラタキシンをコードする。いくつかの実施形態において、限定するものではないが、ヒトＦＸＮをコードする核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ ＦＸＮは、配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ ＦＸＮは、配列番号２を含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ ＦＸＮは、ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）結合部位を含む。ある特定の実施形態において、ＣＴＣＦ結合部位は、配列番号３または１６～２１のうちのいずれか１つを含む。

いくつかの実施形態において、ヒトＦＸＮをコードする核酸配列は、コドン最適化される。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ ＦＸＮは、ヒトＦＸＮをコードする核酸配列の上流に位置する。

いくつかの実施形態において、核酸構築物は、イントロンをさらに含み、イントロンは、５’ＵＴＲ ＦＸＮの下流及びヒトＦＸＮをコードする核酸の上流に配置される。

いくつかの実施形態において、核酸構築物は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む核酸配列をさらに含む。

いくつかの実施形態において、核酸構築物は、以下の順序で、
（ａ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む核酸配列、（ｂ）５’ＵＴＲ ＦＸＮを含む核酸配列、及び（ｃ）ヒトＦＸＮをコードする核酸配列を含み、ヒトＦＸＮをコードする核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、５’ＵＴＲ ＦＸＮ及びヒトＦＸＮをコードする核酸配列に作動可能に連結される。

いくつかの実施形態において、核酸構築物は、以下の順序で、（ａ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む核酸配列、（ｂ）５’ＵＴＲ ＦＸＮを含む核酸配列、（ｃ）イントロン、及び（ｄ）ヒトＦＸＮをコードする核酸配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、５’ＵＴＲ ＦＸＮ及びヒトＦＸＮをコードする核酸配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列番号６０を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、ヒトＦＸＮをコードする核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、デスミンプロモーター、ＣＢＡプロモーター、及びヒトフラタキシンプロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、配列番号４または配列番号５を含む。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、空間的に制限されたプロモーターである。いくつかの実施形態において、空間的に制限されたプロモーターは、ニューロン特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、骨格筋特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、星状細胞特異的プロモーター、ミクログリア特異的プロモーター、及びオリゴデンドロサイト特異的プロモーターからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、核酸構築物は、一対の逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含み、核酸構築物は、当該ＩＴＲによって各々に隣接する。

本明細書で提供される核酸構築物のうちのいずれかを含む組換えウイルスベクターも提供される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１血清型ベクター、ＡＡＶ２血清型ベクター、ＡＡＶ３血清型ベクター、ＡＡＶ４血清型ベクター、ＡＡＶ５血清型ベクター、ＡＡＶ６血清型ベクター、ＡＡＶ７血清型ベクター、ＡＡＶ８血清型ベクター、ＡＡＶ９血清型ベクター、ＡＡＶ Ｒｈ７４血清型ベクター、ＡＡＶＤＪ血清型ベクター、ならびにこれらの組み合わせ及び誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、一本鎖または自己相補的ＡＡＶベクターである。

いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、配列番号６、１４～１５、または２４～２８のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、配列番号６、１４～１５、または２４～２８のうちのいずれか１つである。

本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターのうちのいずれかを含む核酸も提供される。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶベクターを含む核酸は、プラスミドである。

本明細書で提供される組換えＡＡＶベクターのうちのいずれかを含む組換えＡＡＶ粒子も提供される。複数の本明細書に記載のＡＡＶ粒子のうちのいずれかもまた提供される。

複数の本明細書で提供されるＡＡＶ粒子のうちのいずれかを含む薬学的組成物が、さらに提供される。

本明細書に記載の核酸構築物または組換えウイルスベクターのうちのいずれかを含む遺伝子改変細胞も提供される。遺伝子改変細胞は、インビトロ改変細胞、エキソビボ改変細胞、またはインビボ改変細胞であり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、ヒトニューロン、ヒト心筋細胞、ヒト平滑筋細胞、ヒト骨格筋細胞、及びヒト肝細胞からなる群から選択される。

ＦＡを治療するための方法も提供される。本方法は、ＦＡを有する対象に、治療有効量の本明細書で提供される組換えＡＡＶ粒子のうちのいずれかを投与することを含む。

ヒト細胞におけるＦＸＮの発現を調節する方法も提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、ヒト細胞に、本明細書で提供される組換えＡＡＶベクターのうちのいずれかを導入することを含む。

ＦＡを有する対象のヒト細胞におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）濃度を増加させるための方法も提供される。本方法は、対象に、治療有効量の本明細書で提供される組換えＡＡＶ粒子のうちのいずれかを投与することを含む。いくつかの方法において、ヒト細胞は、ニューロン、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、及び肝細胞からなる群から選択される。

ＦＡを有する対象のヒト細胞におけるＡＴＰ濃度を増加させるための方法も提供される。本方法は、治療有効量の本明細書で提供される組換えＡＡＶ粒子のうちのいずれかを投与することを含む。いくつかの方法において、ヒト細胞は、ニューロン、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、及び肝細胞からなる群から選択される。

上記の概要は、例示的なものに過ぎず、決して限定することを意図するものではない。本明細書に記載の例示的な実施例及び特徴に加えて、本開示のさらなる態様、実施例、目的、及び特徴は、図面、詳細な説明、及び特許請求の範囲から完全に明らかになるであろう。

本出願は以下の図を含む。これらの図は、組成物及び方法のある特定の実施形態及び／または特色を例証すること、ならびに組成物及び方法の任意の記載（複数可）を補足することが意図される。書面による記載がかかるが事例であることを明示的に示さない限り、これらの図は組成物及び方法の範囲を限定するものではない。

健常な個体（例えば、ＦＡを有しない個体）及びＦＡを有する個体におけるゲノムＤＮＡ配列及びその発現を示す。Ａは、健常な個体におけるゲノムＤＮＡ配列及びその発現を示す。Ｂは、ＦＡを有する個体におけるゲノムＤＮＡ配列及びその発現を示す。 ＦＡを有する個体における外因性核酸及びその発現を示す。Ａは、ＦＡを有する個体における外因性核酸及びその調節されない発現を示す。Ｂは、ＦＡを有する個体における外因性核酸及びその調節された発現を示す。 ５’ＵＴＲ ＦＸＮ（配列番号２）に作動可能に連結されたヒトＦＸＮ ＯＲＦ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含むＡＡＶベクター配列を示す。 ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の全細胞抽出物で実施されたウエスタンブロットを示す。 ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞の全細胞抽出物で実施されたウエスタンブロットを示す。 Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞の全細胞抽出物で実施されたウエスタンブロットを示す。 Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞のＡＴＰ含有量を示す棒グラフを示す。 Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞の全細胞抽出物で実施されたウエスタンブロットを示す。 Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞の全細胞抽出物のｑＰＣＲ結果を示す棒グラフを示す。 異なるベクター、異なるプロモーター、及び／または５’ＵＴＲを有する及び有しないヒトフラタキシンをコードするコドン最適化配列のマップである。デスミンプロモーター、５’ＵＴＲ、及びヒトフラタキシンをコードするコドン最適化配列を含むＬＰ１００１ ＡＡＶベクターのマップである。 異なるベクター、異なるプロモーター、及び／または５’ＵＴＲを有する及び有しないヒトフラタキシンをコードするコドン最適化配列のマップである。ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター及びヒトフラタキシンをコードするコドン最適化配列を含むＬＰ１００２ ＡＡＶベクターのマップである。 ＣＢＡプロモーター、５’ＵＴＲ、及びヒトフラタキシンをコードするコドン最適化配列を含むＬＰ１００３ ＡＡＶベクターのマップである。 デスミン（ＤＥＳ）プロモーター及びヒトフラタキシンをコードするコドン最適化配列を含むＬＰ１００４ ＡＡＶベクターのマップである。 ＣＢＡプロモーター、３’ＵＴＲ、及びヒトフラタキシンをコードするコドン最適化配列を含むＬＰ１０４９ ＡＡＶベクターのマップである。 ＡＡＶ８ＴＭベクター（配列番号６１）のマップである。 対照及び患者線維芽細胞におけるプラスミド誘導性ＦＸＮ発現の毒性を示す。線維芽細胞を、ＣＢＡまたはＤＥＳプロモーターによって制御されるＦＸＮを発現するプラスミドで、５’ＵＴＲの有無にかかわらずトランスフェクトした。（Ａ）正常な健常な個体またはフリードライヒ運動失調症患者からの線維芽細胞を、示されているようにプラスミド構築物でトランスフェクトした。（Ｂ）線維芽細胞培養における潜在的プラスミド毒性を評価するために、ＤＮＡ含有量を、ＣｙＱＵＡＮＴ増殖アッセイによって測定した。線は、毒性が観察されなかった値を表す。対照線維芽細胞において、５’ＵＴＲを含有するプラスミドは、５’ＵＴＲを有しない構築物と比較して、約２００％低減した毒性を示した。すべてのＦＸＮ発現プラスミドは、ＦＡ患者線維芽細胞において減衰したレベルの毒性を示した。（Ｃ）ＡＴＰレベルに対するＦＸＮ過剰発現の影響を決定するために、ミトコンドリアを対照から単離し、線維芽細胞をトランスフェクトした。線は、取得した最大ＡＴＰ値を示す。全体として、５’ＵＴＲを含有するプラスミドで処理した線維芽細胞培養物において、５’ＵＴＲを有しないプラスミドと比較して、ＡＴＰ含有量が高かった。（Ｃ）平均値を、＋／－標準誤差（９６ウェルプレート中のｎ＝４つのウェル）によって提示する。統計分析を、二元配置分散分析、続いてテューキーの事後分析により行って、各群を互いに比較した。 対照及び患者線維芽細胞におけるプラスミド誘導性ＦＸＮ発現の毒性を示す。線維芽細胞を、ＣＢＡまたはＤＥＳプロモーターによって制御されるＦＸＮを発現するプラスミドで、５’ＵＴＲの有無にかかわらずトランスフェクトした。（Ａ）正常な健常な個体またはフリードライヒ運動失調症患者からの線維芽細胞を、示されているようにプラスミド構築物でトランスフェクトした。（Ｂ）線維芽細胞培養における潜在的プラスミド毒性を評価するために、ＤＮＡ含有量を、ＣｙＱＵＡＮＴ増殖アッセイによって測定した。線は、毒性が観察されなかった値を表す。対照線維芽細胞において、５’ＵＴＲを含有するプラスミドは、５’ＵＴＲを有しない構築物と比較して、約２００％低減した毒性を示した。すべてのＦＸＮ発現プラスミドは、ＦＡ患者線維芽細胞において減衰したレベルの毒性を示した。（Ｃ）ＡＴＰレベルに対するＦＸＮ過剰発現の影響を決定するために、ミトコンドリアを対照から単離し、線維芽細胞をトランスフェクトした。線は、取得した最大ＡＴＰ値を示す。全体として、５’ＵＴＲを含有するプラスミドで処理した線維芽細胞培養物において、５’ＵＴＲを有しないプラスミドと比較して、ＡＴＰ含有量が高かった。（Ｃ）平均値を、＋／－標準誤差（９６ウェルプレート中のｎ＝４つのウェル）によって提示する。統計分析を、二元配置分散分析、続いてテューキーの事後分析により行って、各群を互いに比較した。 対照及び患者線維芽細胞におけるプラスミド誘導性ＦＸＮ発現の毒性を示す。線維芽細胞を、ＣＢＡまたはＤＥＳプロモーターによって制御されるＦＸＮを発現するプラスミドで、５’ＵＴＲの有無にかかわらずトランスフェクトした。（Ａ）正常な健常な個体またはフリードライヒ運動失調症患者からの線維芽細胞を、示されているようにプラスミド構築物でトランスフェクトした。（Ｂ）線維芽細胞培養における潜在的プラスミド毒性を評価するために、ＤＮＡ含有量を、ＣｙＱＵＡＮＴ増殖アッセイによって測定した。線は、毒性が観察されなかった値を表す。対照線維芽細胞において、５’ＵＴＲを含有するプラスミドは、５’ＵＴＲを有しない構築物と比較して、約２００％低減した毒性を示した。すべてのＦＸＮ発現プラスミドは、ＦＡ患者線維芽細胞において減衰したレベルの毒性を示した。（Ｃ）ＡＴＰレベルに対するＦＸＮ過剰発現の影響を決定するために、ミトコンドリアを対照から単離し、線維芽細胞をトランスフェクトした。線は、取得した最大ＡＴＰ値を示す。全体として、５’ＵＴＲを含有するプラスミドで処理した線維芽細胞培養物において、５’ＵＴＲを有しないプラスミドと比較して、ＡＴＰ含有量が高かった。（Ｃ）平均値を、＋／－標準誤差（９６ウェルプレート中のｎ＝４つのウェル）によって提示する。統計分析を、二元配置分散分析、続いてテューキーの事後分析により行って、各群を互いに比較した。 トランスフェクトした線維芽細胞におけるヒトＦＸＮレベルを示す。（Ａ）ウエスタンブロット画像及び（Ｂ）トランスフェクトした対照及び疾患線維芽細胞の画像（ｎ＝２）の定量化を、Ｇａｐｄｈを内部対照として使用して定量化した。（Ｃ）トランスフェクトした対照及び疾患線維芽細胞におけるヒトＦＸＮの検出のためのＥＬＩＳＡ（ｎ＝２）。結果は、ＦＸＮ発現構築物で処理したすべての細胞における形質導入及び発現を示す。発現レベルは、５’ＵＴＲを有するプラスミドと比較して、５’ＵＴＲを欠くプラスミドでトランスフェクトした細胞においてより高かった。 トランスフェクトした線維芽細胞におけるヒトＦＸＮレベルを示す。（Ａ）ウエスタンブロット画像及び（Ｂ）トランスフェクトした対照及び疾患線維芽細胞の画像（ｎ＝２）の定量化を、Ｇａｐｄｈを内部対照として使用して定量化した。（Ｃ）トランスフェクトした対照及び疾患線維芽細胞におけるヒトＦＸＮの検出のためのＥＬＩＳＡ（ｎ＝２）。結果は、ＦＸＮ発現構築物で処理したすべての細胞における形質導入及び発現を示す。発現レベルは、５’ＵＴＲを有するプラスミドと比較して、５’ＵＴＲを欠くプラスミドでトランスフェクトした細胞においてより高かった。 トランスフェクトした線維芽細胞におけるヒトＦＸＮレベルを示す。（Ａ）ウエスタンブロット画像及び（Ｂ）トランスフェクトした対照及び疾患線維芽細胞の画像（ｎ＝２）の定量化を、Ｇａｐｄｈを内部対照として使用して定量化した。（Ｃ）トランスフェクトした対照及び疾患線維芽細胞におけるヒトＦＸＮの検出のためのＥＬＩＳＡ（ｎ＝２）。結果は、ＦＸＮ発現構築物で処理したすべての細胞における形質導入及び発現を示す。発現レベルは、５’ＵＴＲを有するプラスミドと比較して、５’ＵＴＲを欠くプラスミドでトランスフェクトした細胞においてより高かった。 インビトロでのフラタキシンプラスミドの５’非翻訳領域と３’非翻訳領域との比較の結果を示す。健常な（対照）及びＦＡ患者からの線維芽細胞を、ＣＢＡプロモーターの制御下で、ＵＴＲの有無にかかわらず５μｇのＦＸＮを発現するプラスミドでトランスフェクトした（表２）。トランスフェクトしなかった細胞（プラスミドなし）及びＣＢＡ－ＧＦＰでトランスフェクトした細胞を、それぞれ、陰性対照及びトランスフェクション対照として使用した。細胞を、構築物のトランスフェクション後の細胞蜜集度の視覚化のために２４ウェルプレート中で画像化した。 インビトロでのフラタキシンプラスミドの５’非翻訳領域と３’非翻訳領域との比較の結果を示す。健常な（対照）及びＦＡ患者からの線維芽細胞を、ＣＢＡプロモーターの制御下で、ＵＴＲの有無にかかわらず５μｇのＦＸＮを発現するプラスミドでトランスフェクトした（表２）。トランスフェクトしなかった細胞（プラスミドなし）及びＣＢＡ－ＧＦＰでトランスフェクトした細胞を、それぞれ、陰性対照及びトランスフェクション対照として使用した。ＣｙＱＵＡＮＴアッセイによってトランスフェクション後に、細胞生存率を測定した。 インビトロでのフラタキシンプラスミドの５’非翻訳領域と３’非翻訳領域との比較の結果を示す。健常な（対照）及びＦＡ患者からの線維芽細胞を、ＣＢＡプロモーターの制御下で、ＵＴＲの有無にかかわらず５μｇのＦＸＮを発現するプラスミドでトランスフェクトした（表２）。トランスフェクトしなかった細胞（プラスミドなし）及びＣＢＡ－ＧＦＰでトランスフェクトした細胞を、それぞれ、陰性対照及びトランスフェクション対照として使用した。毒性分析は、ＣＢＡ－５’－ＦＸＮと比較した場合、対照線維芽細胞におけるＣＢＡ－ＦＸＮが細胞生存率を低下させたことを示した。しかしながら、ＦＡ線維芽細胞は、毒性の同じ分布を示さない。 インビトロでのフラタキシンプラスミドの５’非翻訳領域と３’非翻訳領域との比較の結果を示す。健常な（対照）及びＦＡ患者からの線維芽細胞を、ＣＢＡプロモーターの制御下で、ＵＴＲの有無にかかわらず５μｇのＦＸＮを発現するプラスミドでトランスフェクトした（表２）。トランスフェクトしなかった細胞（プラスミドなし）及びＣＢＡ－ＧＦＰでトランスフェクトした細胞を、それぞれ、陰性対照及びトランスフェクション対照として使用した。同様に、非トランスフェクト細胞及びトランスフェクト細胞におけるＡＴＰ含有量を測定した。 インビトロでのフラタキシンプラスミドの５’非翻訳領域と３’非翻訳領域との比較の結果を示す。健常な（対照）及びＦＡ患者からの線維芽細胞を、ＣＢＡプロモーターの制御下で、ＵＴＲの有無にかかわらず５μｇのＦＸＮを発現するプラスミドでトランスフェクトした（表２）。トランスフェクトしなかった細胞（プラスミドなし）及びＣＢＡ－ＧＦＰでトランスフェクトした細胞を、それぞれ、陰性対照及びトランスフェクション対照として使用した。ＥＬＩＳＡによるフラタキシン過剰発現の検出は、ＣＢＡ－ＦＸＮでトランスフェクトした対照線維芽細胞において、内因性フラタキシンレベルを上回って約１６倍高かった。ＣＢＡ－５’－ＦＸＮ及びＣＢＡ－３’－ＦＸＮは、内因性フラタキシン発現（ＣＢＡ－ＧＦＰ）と比較して、発現において約１０倍高かった。フラタキシン及びＧＡＰＤＨに対するウエスタンブロット後に、密度分析を行った。 インビトロでのフラタキシンプラスミドの５’非翻訳領域と３’非翻訳領域との比較の結果を示す。健常な（対照）及びＦＡ患者からの線維芽細胞を、ＣＢＡプロモーターの制御下で、ＵＴＲの有無にかかわらず５μｇのＦＸＮを発現するプラスミドでトランスフェクトした（表２）。トランスフェクトしなかった細胞（プラスミドなし）及びＣＢＡ－ＧＦＰでトランスフェクトした細胞を、それぞれ、陰性対照及びトランスフェクション対照として使用した。ＥＬＩＳＡによるフラタキシン過剰発現の検出は、ＣＢＡ－ＦＸＮでトランスフェクトした対照線維芽細胞において、内因性フラタキシンレベルを上回って約１６倍高かった。ＣＢＡ－５’－ＦＸＮ及びＣＢＡ－３’－ＦＸＮは、内因性フラタキシン発現（ＣＢＡ－ＧＦＰ）と比較して、発現において約１０倍高かった。フラタキシン及びＧＡＰＤＨに対するウエスタンブロット後に、密度分析を行った。 インビトロでのフラタキシンプラスミドの５’非翻訳領域と３’非翻訳領域との比較の結果を示す。健常な（対照）及びＦＡ患者からの線維芽細胞を、ＣＢＡプロモーターの制御下で、ＵＴＲの有無にかかわらず５μｇのＦＸＮを発現するプラスミドでトランスフェクトした（表２）。トランスフェクトしなかった細胞（プラスミドなし）及びＣＢＡ－ＧＦＰでトランスフェクトした細胞を、それぞれ、陰性対照及びトランスフェクション対照として使用した。ＥＬＩＳＡによるフラタキシン過剰発現の検出は、ＣＢＡ－ＦＸＮでトランスフェクトした対照線維芽細胞において、内因性フラタキシンレベルを上回って約１６倍高かった。ＣＢＡ－５’－ＦＸＮ及びＣＢＡ－３’－ＦＸＮは、内因性フラタキシン発現（ＣＢＡ－ＧＦＰ）と比較して、発現において約１０倍高かった。フラタキシン及びＧＡＰＤＨに対するウエスタンブロット後に、密度分析を行った。 インビトロでのフラタキシンプラスミドの５’非翻訳領域と３’非翻訳領域との比較の結果を示す。健常な（対照）及びＦＡ患者からの線維芽細胞を、ＣＢＡプロモーターの制御下で、ＵＴＲの有無にかかわらず５μｇのＦＸＮを発現するプラスミドでトランスフェクトした（表２）。トランスフェクトしなかった細胞（プラスミドなし）及びＣＢＡ－ＧＦＰでトランスフェクトした細胞を、それぞれ、陰性対照及びトランスフェクション対照として使用した。フラタキシン及びｔｏｍｍ２０の免疫細胞化学的検出は、ミトコンドリア内でのフラタキシンの共局在化を確認し（Ｈ）、各条件下での対照及び疾患細胞の染色は、タンパク質発現を反映したものであった（Ｉ）。 インビトロでのフラタキシンプラスミドの５’非翻訳領域と３’非翻訳領域との比較の結果を示す。健常な（対照）及びＦＡ患者からの線維芽細胞を、ＣＢＡプロモーターの制御下で、ＵＴＲの有無にかかわらず５μｇのＦＸＮを発現するプラスミドでトランスフェクトした（表２）。トランスフェクトしなかった細胞（プラスミドなし）及びＣＢＡ－ＧＦＰでトランスフェクトした細胞を、それぞれ、陰性対照及びトランスフェクション対照として使用した。フラタキシン及びｔｏｍｍ２０の免疫細胞化学的検出は、ミトコンドリア内でのフラタキシンの共局在化を確認し（Ｈ）、各条件下での対照及び疾患細胞の染色は、タンパク質発現を反映したものであった（Ｉ）。 インビトロで観察される毒性を低減させるためのプラスミド含有量の滴定を示す。トランスフェクトした線維芽細胞で見られる潜在的な毒性を理解するために、用量反応（ｕｇ ＤＮＡ）曲線を行った。対照及びＦＡ線維芽細胞を、ＣＢＡプロモーターによって駆動されるＦＸＮを発現するプラスミド構築物でトランスフェクトした（表２）。１×－１．２５μｇ、２×－２．５μｇ、及び４×－５μｇは、各条件のプラスミド濃度を表す。細胞毒性分析は、ＣＢＡ－ＦＸＮが最も高い毒性をもたらすことを示したが、しかしながら、プラスミドの滴定（すなわち、減少）は、細胞死の程度を減弱させた。 野生型マウスにおける内因性フラタキシンレベルを示す。 ＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮの静脈内投与後の野生型マウスにおけるヒトフラタキシンのレベルを示す。ＡＡＶの静脈内投与は、心臓、骨格筋、及び肝臓におけるフラタキシンの有意な上昇をもたらす。ヒトＦＸＮの発現は、脳内では検出されず、カプシドが使用される投薬量において低い血液脳関門透過性を示すことを示唆した。 大槽内（ＩＣＭ）及び筋肉内（ＩＭ）にＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮを注射した野生型マウスにおけるヒトフラタキシン発現を示す。（Ａ～Ｃ用量）脳、脊髄、及び骨格筋におけるヒトフラタキシンの検出。（Ｄ）フラタキシン（ＤＡＢ検出）に対して指向されるＩＨＣは、ＩＣＭ送達（用量：３ｅ＋１１ｖｇ／ｇの脳）後の髄質及び橋全体にわたって発現を示す。 大槽内（ＩＣＭ）及び筋肉内（ＩＭ）にＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮを注射した野生型マウスにおけるヒトフラタキシン発現を示す。（Ａ～Ｃ用量）脳、脊髄、及び骨格筋におけるヒトフラタキシンの検出。（Ｄ）フラタキシン（ＤＡＢ検出）に対して指向されるＩＨＣは、ＩＣＭ送達（用量：３ｅ＋１１ｖｇ／ｇの脳）後の髄質及び橋全体にわたって発現を示す。 大槽内（ＩＣＭ）及び筋肉内（ＩＭ）にＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮを注射した野生型マウスにおけるヒトフラタキシン発現を示す。（Ａ～Ｃ用量）脳、脊髄、及び骨格筋におけるヒトフラタキシンの検出。（Ｄ）フラタキシン（ＤＡＢ検出）に対して指向されるＩＨＣは、ＩＣＭ送達（用量：３ｅ＋１１ｖｇ／ｇの脳）後の髄質及び橋全体にわたって発現を示す。 大槽内（ＩＣＭ）及び筋肉内（ＩＭ）にＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮを注射した野生型マウスにおけるヒトフラタキシン発現を示す。（Ａ～Ｃ用量）脳、脊髄、及び骨格筋におけるヒトフラタキシンの検出。（Ｄ）フラタキシン（ＤＡＢ検出）に対して指向されるＩＨＣは、ＩＣＭ送達（用量：３ｅ＋１１ｖｇ／ｇの脳）後の髄質及び橋全体にわたって発現を示す。 フラタキシン発現に対するイントロン配置の影響を示す。５’ＵＴＲを含まない構築物は、非常に有意な発現をもたらす（レーン３及び６）。イントロンとＦＸＮとの間に５’ＵＴＲを含むと、ＦＮＸの発現が低くなる（レーン５）。５’ＵＴＲ、イントロン、及びＦＸＮをその順序で含めると、所望のＦＸＮ発現レベル（レーン２及び４）がもたらされる。 調節領域を有する例示的な５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号３３）を示す。

配列番号１は、フラタキシンｃＤＮＡ配列からのコドン最適化ＯＲＦであるＦＸＮヌクレオチド配列である。

配列番号２は、例示的な５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列である。

配列番号３は、ＣＴＣＦタンパク質結合部位である。

配列番号４は、デスミンプロモーター配列である。

配列番号５は、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター配列である。

配列番号６は、デスミンプロモーター配列（配列番号４）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含む組換えＡＡＶベクター配列であり、デスミンプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたデスミン５’ＵＴＲ（配列番号２２）及び５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）をさらに含む。

配列番号７は、組換えＡＡＶベクターをコードするプラスミド配列である。組換えＡＡＶベクターは、デスミンプロモーター配列（配列番号４）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含み、デスミンプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたデスミン５’ＵＴＲ（配列番号２２）をさらに含む。

配列番号８は、組換えＡＡＶベクターをコードするプラスミド配列である。組換えＡＡＶベクターは、デスミンプロモーター配列（配列番号４）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含み、デスミンプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたデスミン５’ＵＴＲ（配列番号２２）及び５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）をさらに含む。

配列番号９は、ヒトＦＸＮヌクレオチド配列を有するＣ末端Ｖ５エピトープタグインフレームをさらに含むことを除いては、配列番号７に類似するプラスミド配列である。

配列番号１０は、ヒトＦＸＮヌクレオチド配列を有するＣ末端Ｖ５エピトープタグインフレームをさらに含むことを除いては、配列番号８に類似するプラスミド配列である。

配列番号１１は、組換えＡＡＶベクターを含むプラスミド配列である。組換えＡＡＶベクターは、ＣＢＡプロモーター配列（配列番号５）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含み、ＣＢＡプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたＣＢＡ ５’ＵＴＲ（配列番号２３）及び５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）をさらに含む。

配列番号１２は、組換えＡＡＶベクターを含むプラスミド配列である。組換えＡＡＶベクターは、ＣＢＡプロモーター配列（配列番号５）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含み、ＣＢＡプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたＣＢＡ ５’ＵＴＲ（配列番号２３）をさらに含む。

配列番号１３は、組換えＡＡＶベクターを含むプラスミド配列である。組換えＡＡＶベクターは、デスミンプロモーター配列（配列番号４）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含み、デスミンプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置された５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）をさらに含む。

配列番号１４は、ＣＢＡプロモーター配列（配列番号５）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含む組換えＡＡＶベクター配列であり、ＣＢＡプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたＣＢＡ ５’ＵＴＲ（配列番号２３）及び５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）をさらに含む。

配列番号１５は、デスミンプロモーター配列（配列番号４）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含む組換えＡＡＶベクター配列であり、デスミンプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置された５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）をさらに含む。

配列番号１６～２１は、ＣＴＣＦタンパク質結合部位である。

配列番号２２は、デスミン５’ＵＴＲである。

配列番号２３は、ＣＢＡ ５’ＵＴＲである。

配列番号２４は、組換えＡＡＶベクター（ＬＰ１００１）を含むプラスミド配列である。組換えＡＡＶベクターは、以下の順序で、作動可能な連結において、デスミンプロモーター配列（配列番号４）、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）、イントロン、コドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含む。

配列番号２５は、組換えＡＡＶベクター（ＬＰ１００２）を含むプラスミド配列である。組換えＡＡＶベクターは、以下の順序で、作動可能な連結において、ＣＭＶプロモーター配列（配列番号３４）、ＣＢＡプロモーター（配列番号５）、イントロン、及びコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含む。

配列番号２６は、組換えＡＡＶベクター（ＬＰ１００３）を含むプラスミド配列である。組換えＡＡＶベクターは、以下の順序で、作動可能な連結において、ＣＭＶプロモーター配列（配列番号３４）、ＣＢＡプロモーター（配列番号５）、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）、イントロン、及びコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含む。

配列番号２７は、組換えＡＡＶベクター（ＬＰ１００４）を含むプラスミド配列である。組換えＡＡＶベクターは、以下の順序で、作動可能な連結において、デスミンプロモーター配列（配列番号４）、イントロン、及びコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含む。

配列番号２８は、組換えＡＡＶベクター（ＬＰ１０４９）を含むプラスミド配列である。組換えＡＡＶベクターは、以下の順序で、作動可能な連結において、ＣＭＶプロモーター配列（配列番号３４）、ＣＢＡプロモーター配列（配列番号５）、イントロン、コドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）、及び３’ＵＴＲ ＦＸＮ（配列番号３５）を含む。

配列番号２９は、ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＥＧＦＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：受託番号ＭＫ２２５６７２）を含む自己相補プラスミド配列である。

配列番号３０は、プライマーである。

配列番号３１は、プライマーである。

配列番号３２は、プライマーである。

配列番号３３は、ＴＦＡＰ２（配列番号５７）、ＳＲＦ１（配列番号５６）、及びＳＰ１（配列番号５８）調節領域を有する例示的な５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列である。

配列番号３４は、ＣＭＶエンハンサー配列である。

配列番号３５は、３’ＵＴＲ ＦＸＮである。

配列番号３６は、配列番号２４に含まれるイントロン配列である。

配列番号３７は、スプライスドナー部位及び受容体部位を有する改変ＳＶ４０イントロンである。

配列番号３８は、例示的な変異ＩＴＲ配列である。

配列番号３９は、例示的なＩＴＲ配列である。

配列番号４０は、ヒト３’ＵＴＲ ＦＸＮである。

配列番号４１は、切断された３’ＵＴＲ ＦＸＮである。

配列番号４２は、例示的なフラタキシンプロモーター配列である。

配列番号４３は、例示的なフラタキシンプロモーター配列である。

配列番号４４は、アンピシリン耐性遺伝子である。

配列番号４５は、カナマイシン耐性遺伝子である。

配列番号４６は、推定される鉄結合ドメインを含まない例示的な３’ＵＴＲ ＦＸＮ配列である。

配列番号４７は、ミトコンドリア局在化シグナルを含まない例示的な３’ＵＴＲ ＦＸＮ配列である。

配列番号４８は、Ｌ２レトロ転位因子を含まない例示的な５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号５４）である。

配列番号４９は、代替のＲＮＡ輸出シグナルを含まない例示的な５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号５５）である。

配列番号５０は、ＣＴＣＦドメインを含まない例示的な５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列である。

配列番号５１は、例示的な５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列である。

配列番号５２は、例示的な５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列である。

配列番号５３は、触媒結合ドメインを含まない例示的な５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号５９）である。

配列番号５４は、Ｌ２レトロ転位因子である。

配列番号５５は、代替のＲＮＡ輸出シグナルである。

配列番号５６は、ＳＲＦ調節配列である。

配列番号５７は、ＴＦＡＰ２調節配列である。

配列番号５８は、調節ＳＰ１配列である。

配列番号５９は、アコニターゼ結合ドメインである。

配列番号６０は、ヒトフラタキシンの例示的なアミノ酸配列である。

配列番号６１は、ＡＡＶ８トリプルカプシド変異体ベクター配列である。

配列番号６２は、例示的な５’ＵＴＲ ＦＸＮである。

配列番号６３は、ウシ成長ホルモンポリアデン化配列をコードする核酸配列である。

フラタキシン発現を復元するための現在のアプローチは、高レベルのフラタキシンを発現するために調節されない高活性プロモーター配列を使用することに焦点を当てている（図２Ａ）。しかしながら、リスクは、このアプローチに関連している。調節されない上昇した生理学的レベルのフラタキシンは、ミトコンドリア呼吸の低下をもたらし、これは、ミトコンドリア毒性を引き起こし得る。実際、ＦＸＮの過剰発現は、インビトロ（Ｖａｎｎｏｃｃｉ ｅｔ ａｌ．“Ａｄｄｉｎｇ ａ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ ａｔａｘｉａ：ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｒａｔａｘｉｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ，” Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ．２０１８；１１（６）：ｄｍｍ０３２７０６）及びインビボ（Ｂｅｌｂｅｌｌａａ ｅｔ ａｌ．“Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆｒａｔａｘｉｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ，” Ａｐｒｉｌ ２０２０．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０３．３１．０１５２５５、Ｂｅｌｂｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈａｌｆ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｆｕｌｌｙ ｒｅｓｃｕｅ Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ ａｔａｘｉａ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｅｌｌ－ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，” Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１９；２８（８）：１２７４－１２８５）の両方で毒性であることが報告されている。

ＦＡ患者において調節された生理学的レベルのＦＸＮ発現を達成するために、本発明者らは、ＦＸＮの５’ＵＴＲを、ＦＸＮ発現を調節し、上昇した生理学的レベルのＦＸＮ発現に関連する毒性を回避する調節配列として同定した。対象においてＦＡを治療する方法で使用するための組成物が、本明細書に提供される。これらの組成物には、ヒトフラタキシン５’ＵＴＲ（５’ＵＴＲ ＦＸＮ）及びＦＸＮをコードする核酸配列を含む、新規の核酸構築物、組換えウイルスベクター及び細胞が含まれるが、これらに限定されない。

核酸構築物
ヒトフラタキシン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ ＦＸＮ）及びヒトフラタキシン（ＦＸＮ）をコードする核酸配列を含む核酸構築物が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、ヒトＦＸＮをコードする核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する（以下に記載されるように）。いくつかの実施形態において、ヒトＦＸＮをコードする核酸配列は、ヒトＦＸＮをコードする天然に存在するヌクレオチド配列ではない。

ａｔｇｔｇｇａｃａｔ ｔｇｇｇｇｃｇｇａｇ ｇｇｃａｇｔｇｇｃｇ ｇｇｔｃｔｔｃｔｔｇ ｃｇｔｃｔｃｃｃａｇ ｃｃｃａｇｃａｃａｇｇｃａｃａａａｃａｔ ｔｇａｃｔａｇａｇｔ ｔｃｃｃｃｇｇｃｃａ ｇｃｇｇａｇｔｔｇｇ ｃｃｃｃｔｃｔｃｔｇ ｔｇｇａｃｇｇｃｇｇｇｇａｃｔｇｃｇｇａ ｃｇｇａｔａｔａｇａ ｃｇｃｃａｃｃｔｇｃ ａｃａｃｃｔｃｇａａ ｇａｇｃｔａｇｔｔｃ ａａａｔｃａｇｃｇｇｇｇｃｃｔｃａａｔｃ ａａａｔｃｔｇｇａａ ｃｇｔｔａａｇａａｇ ｃａｇａｇｔｇｔｇｔ ａｃｃｔｔａｔｇａａ ｃｔｔｇａｇａａａａａｇｃｇｇａａｃｃｃ ｔｃｇｇｃｃａｃｃｃ ａｇｇｇｔｃａｔｔｇ ｇａｔｇａａａｃａａ ｃｃｔａｔｇａｇａｇ ｇｃｔｔｇｃｇｇａａｇａｇａｃａｔｔｇｇ ａｔａｇｃｔｔｇｇｃ ｃｇａａｔｔｃｔｔｔ ｇａａｇａｃｃｔｔｇ ｃｃｇａｃａａａｃｃ ｃｔａｔａｃａｔｔｔｇａｇｇａｔｔａｃｇ ａｔｇｔｃｔｃｃｔｔ ｃｇｇｃｔｃｔｇｇｔ ｇｔｃｃｔｇａｃｔｇ ｔｇａａｇｔｔｇｇｇ ｇｇｇｃｇａｃｃｔｃｇｇａａｃｇｔａｃｇ ｔａａｔａａａｔａａ ｇｃａｇａｃｔｃｃｇ ａａｔａａａｃａａａ ｔｔｔｇｇｔｔｇｔｃ ｃｔｃａｃｃａａｇｔａｇｃｇｇｃｃｃｃａ ａｇｃｇｇｔａｔｇａ ｔｔｇｇａｃｔｇｇｇ ａａｇａａｃｔｇｇｇ ｔａｔａｃｔｃｃｃａ ｃｇａｃｇｇｃｇｔｔａｇｃｃｔｇｃａｃｇ ａａｃｔｇｔｔｇｇｃ ａｇｃｃｇａｇｃｔｔ ａｃａａａａｇｃｔｔ ｔｇａａｇａｃａａａ ａｃｔｇｇａｃｃｔｃ（配列番号１）

５’ＵＴＲ ＦＸＮ
全体を通して使用されるとき、５’ＵＴＲ ＦＸＮは、ヒトＦＸＮをコードする核酸の開始コドンの上流にある、非翻訳核酸配列である。本明細書に記載されるように、５’ＵＴＲ ＦＸＮは、ＦＸＮ発現を調節することができる。調節されたＦＸＮ発現は、ＦＸＮ発現及びミトコンドリア呼吸の調節された生理学的レベルを達成し、それによって、調節されない上昇した生理学的レベルのＦＸＮ発現及び低減したミトコンドリア呼吸を回避するために所望され得る。理論に拘束されることを望むものではないが、この調節は、５’ＵＴＲ及びヒトＦＸＮヌクレオチド配列をコードする本開示の核酸から転写されるｍＲＮＡの転写及び／または翻訳に対する５’ＵＴＲ ＦＸＮのシス効果を介して達成することができると考えられる。５’ＵＴＲ ＦＸＮ内の調節要素を、図１９（配列番号３３）に示す。

５’ＵＴＲ ＦＸＮは、配列番号２（以下に記載されるように）またはその断片に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。
ＣＡＧＴＣＴＣＣＣＴＴＧＧＧＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＴＴＴＧＣＡＣＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴＧＴＴＡＡＡＴＧＣＡＣＧＡＡＴＡＧＴＧＣＴＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＧＧＴＣＴＡＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＧＧＧＧＴＣＧＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＣＡＧＡＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣ（配列番号２）

５’ＵＴＲ ＦＸＮは、配列番号２を含むヌクレオチド配列またはその断片を含むことができる。他の例において、５’ＵＴＲ ＦＸＮは、配列番号配列番号３３、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号６２を含むことができる。この断片は、配列番号２のいずれかまたは両方の末端で、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上短いヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ ＦＸＮを含む核酸配列は、完全長ＦＸＮプロモーターではない。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ ＦＸＮを含むヌクレオチド配列は、配列番号４２または配列番号４３を含まない。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ ＦＸＮを含む核酸配列は、配列番号２、配列番号３３、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３を含む核酸配列であり、いずれかの末端で、長さが配列番号４３よりも少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００塩基対短い。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ ＦＸＮを含む核酸配列は、配列番号２を含み、いずれかの末端で、長さが配列番号４２よりも少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００塩基対短い核酸配列ではない。

５’ＵＴＲ ＦＸＮは、ヒトＦＸＮをコードする核酸配列、例えば、配列番号６０をコードする核酸配列の上流に位置し得る。５’ＵＴＲ ＦＸＮは、ＣＴＣＦ結合部位を含むことができる。ＣＴＣＦ結合部位は、配列番号３または１６～２１のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含むことができる。ＣＴＣＦ結合部位は、配列番号３または１６～２１のうちの少なくとも１つを含むことができる。５’ＵＴＲ ＦＸＮは、配列番号３及び１６～２１のうちのいずれか１つを含む少なくとも１つのＣＴＣＦ結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ ＦＸＮは、機能的ＣＴＣＦ結合部位を含まず、例えば、ＣＴＣＦ結合部位は、変異されるか、または５’ＵＴＲ ＦＸＮから除去される。機能的ＣＴＣＦ結合部位を含まない例示的な５’ＵＴＲ ＦＸＮは、本明細書において配列番号５０として記載される。

本明細書で使用される場合、「ＦＸＮ発現の調節された生理学的レベル」は、野生型細胞で観察されるものと同様であるタンパク質レベルでのＦＸＮ発現のレベルを指す。例えば、本開示の方法に従って処理されるホモ接合型ＧＡＡ反復拡張ＦＸＮ対立遺伝子を含む、筋肉または神経由来細胞における「ＦＸＮ発現の調節された生理学的レベル」は、同様または同系のバックグラウンドの野生型細胞と同様のＦＸＮ発現レベルを示すことができる。このような「ＦＸＮ発現の調節された生理学的レベル」は、十分なＦＸＮの欠如に起因する、またはＦＸＮ遺伝子の調節されない発現に起因する過剰などのＦＸＮの有害な過剰に起因する、疾患細胞における細胞ミトコンドリア機能に対する悪影響を低減することができる。

タンパク質レベルでの「ＦＸＮ発現の調節された生理学的レベル」は、野生型細胞のものと同様であり得る。例えば、タンパク質レベルでのＦＸＮ発現の調節された生理学的レベルは、野生型細胞におけるＦＸＮタンパク質レベルの少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１５５％、少なくとも１６０％、少なくとも１６５％、少なくとも１７０％、少なくとも１７５％、少なくとも１８０％、少なくとも１８５％、少なくとも１９０％、少なくとも１９５％、または少なくとも２００％であり得る。

いくつかの実施形態において、核構築物（例えば、プロモーター、５’ＵＴＲ ＦＸＮ、及びヒトＦＸＮをコードする核酸を含む構築物）に５’ＵＴＲ ＦＸＮを含むと、５’ＵＴＲ ＦＸＮを含まない核酸構築物（例えば、プロモーター及びヒトＦＸＮをコードする核酸を含む構築物）を有する細胞のＦＸＮ発現のレベルよりも少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低い細胞のＦＸＮ発現のレベルをもたらす。

ヒトフラタキシン（ＦＸＮヌクレオチド配列
本明細書で使用される場合、「ヒトＦＸＮをコードする核酸配列」または
ヒトＦＸＮヌクレオチド配列」は、ヒトフラタキシンＦＸＮ ｃＤＮＡ配列（例えば、配列番号１）であり得る。ヒトＦＸＮをコードする任意の核酸配列は、ヒトＦＸＮをコードする天然及び非天然に存在する核酸を含む、本明細書に記載の５’ＵＴＲ ＦＸＮに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列番号６０、または１つ以上の保存的置換を有する配列番号６０をコードする。配列番号１は、ヒトフラタキシンタンパク質（配列番号６０）をコードする例示的なコドン最適化核酸配列である。ヒトフラタキシンの例示的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１３５．２下でも見出され得る。
ｍｗｔｌｇｒｒａｖａ ｇｌｌａｓｐｓｐａｑ ａｑｔｌｔｒｖｐｒｐ ａｅｌａｐｌｃｇｒｒ ｇｌｒｔｄｉｄａｔｃ ｔｐｒｒａｓｓｎｑｒ
ｇｌｎｑｉｗｎｖｋｋ ｑｓｖｙｌｍｎｌｒｋ ｓｇｔｌｇｈｐｇｓｌ ｄｅｔｔｙｅｒｌａｅ ｅｔｌｄｓｌａｅｆｆ ｅｄｌａｄｋｐｙｔｆ
ｅｄｙｄｖｓｆｇｓｇ ｖｌｔｖｋｌｇｇｄｌ ｇｔｙｖｉｎｋｑｔｐ ｎｋｑｉｗｌｓｓｐｓ ｓｇｐｋｒｙｄｗｔｇ ｋｎｗｖｙｓｈｄｇｖ
ｓｌｈｅｌｌａａｅｌ ｔｋａｌｋｔｋｌｄｌ ｓｓｌａｙｓｇｋｄａ（配列番号６０）

いくつかの実施形態において、ＦＸＮヌクレオチド配列は、配列番号１に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有することができる。ＦＸＮヌクレオチド配列は、配列番号１を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＦＸＮヌクレオチド配列は、本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターまたは粒子のうちのいずれかによって感染される細胞の発現のためにコドン最適化される。例えば、組換えＡＡＶ感染細胞が、ヒト細胞である場合、ＦＸＮをコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチド、例えば配列番号１が、ＦＸＮポリペプチドを産生するために使用され得ることが企図される。コドン最適化のための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎｌｙ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｃｏｄｏｎｓ，” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １０９：４７－５４（２０１５）を参照のこと）。ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）も使用することができる。

プロモーター
本明細書に記載の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物も、提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の構築物の構成要素または要素は、非天然に存在する構築物を作製するために動作可能に連結される。換言すると、要素は、天然に存在する細胞のゲノム内で連結され得るため、連結されない。

多数のプロモーターを、本明細書に記載の構築物に使用することができる。プロモーターは、転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼ及び他のタンパク質の認識及び結合に関与する転写の開始から上流及び／または下流に位置する領域または配列である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、例えば、限定するものではないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩコアプロモーターである。本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩコアプロモーターは、基底転写装置が組み立てられることを可能にする最小配列である。例えば、この配列は、長さが４０塩基対であり得、ＴＡＴＡボックス、開始要素（Ｉｎｒ）及び／または下流プロモーター要素（ＤＰＥ）を含み得る。例えば、Ｄｏｍｅｎｇｅｒ ａｎｄ Ｇｒｉｍｍ，“Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ－ｄｏ ｎｏｔ ｊｕｄｇｅ ａ ｖｉｒｕｓ（ｏｎｌｙ） ｂ ｙｉｔｓ ｃｏｖｅｒ，” Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２９（Ｒ１）：Ｒ３－Ｒ１４（２０１９）を参照のこと。いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターであり、例えば、プロモーターは、化学的または物理的に調節され得る。化学的に調節されたプロモーター及び／またはエンハンサーは、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、または金属の存在によって調節され得る。例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーターまたはグルココルチコイド誘導性プロモーターが挙げられる。本発明の核酸はまた、特定の細胞、組織、または器官における核酸の発現を促進するために、組織特異的プロモーターの制御下にあり得る。メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター、及び他の調節可能なプロモーターなどの任意の調節可能なプロモーター（その多くの例は当該技術分野で周知である）もまた、企図される。さらに、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ誘導性系、ならびにＦｌｐリコンビナーゼ誘導性プロモーター系も使用され得、これらはいずれも当該技術分野で既知である。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」、「作動可能に配置される」などの用語は、第１の核酸配列（例えば、タンパク質または非コードＲＮＡ配列のコード配列）が、少なくとも第２の核酸配列に共有結合的に接続されていることを意味し、そのため、２つの配列のうちの少なくとも１つが、他の核酸配列への影響を発揮することができる。例えば、ヒトＦＸＮヌクレオチド配列は、プロモーター配列に作動可能に連結され得、そのため、プロモーター配列がヒトＦＸＮヌクレオチド配列の転写を指示することができ、それによってヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現に寄与する。同様に、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列は、プロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置することができ、そのため、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列がヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現を調節することができる。

いくつかの実施形態において、核酸構築物は、５’ＵＴＲ ＦＸＮに作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと、ヒトＦＸＮをコードする核酸配列と、を含む核酸配列をさらに含む。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、例えば、デスミンプロモーター配列（配列番号４）、ＣＢＡプロモーター配列（配列番号５）、またはフラタキシンプロモーター配列、例えば、配列番号４２、配列番号４３、またはそれらの断片であり得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、配列番号４を含むことができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、配列番号５を含むことができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、配列番号４２または配列番号４３を含むことができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、配列番号４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むことができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、配列番号５に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むことができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、配列番号４２または配列番号４３に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むことができる。

いくつかの実施形態において、５”ＵＴＲ ＦＸＮに作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、５’ＵＴＲ ＦＸＮと関連する内因性プロモーターではなく、すなわち、それは、異なるタンパク質、例えば、デスミンまたはＣＢＡプロモーターに由来する。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ ＦＸＮ及びヒトＦＸＮをコードする核酸配列に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、フラタキシンプロモーターではない。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ ＦＸＮに作動可能に連結されたプロモーターは、配列番号４２、配列番号４３、またはいずれかの配列の相補鎖を含まない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の構築物のうちのいずれも、ヒトフラタキシンプロモーター（例えば、配列番号４２もしくは配列番号４３）または３’ＵＴＲ ＦＸＮ（例えば、配列番号４０もしくは配列番号４１）を含まない。

デスミン、ＣＢＡ、またはフラタキシンプロモーターの断片は、この断片が由来したプロモーターの少なくとも１つの活性、例えば、細胞（例えば、神経細胞または筋肉細胞の核酸の転写の促進を少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上保持する限り、本明細書に記載の構築物においても使用することができることが理解される。断片は、野生型プロモーターよりも少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００またはそれ以上短いヌクレオチドで、または野生型プロモーター配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するプロモーター配列であり得る。例えば、長さが配列番号４、配列番号５、配列番号４２、または配列番号４３よりも少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、または５００塩基対短い断片は、プロモーターとして使用することができる。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの５’ＵＴＲは、本開示のプロモーターまたは構築物のうちのいずれかから除去して、ヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現をさらに調節することができる。配列番号４及び配列番号５は、それぞれ、デスミンプロモーター及びＣＢＡプロモーターの例であり、これらは、５’ＵＴＲを含まない。

いくつかの実施形態において、エンハンサー配列、例えば、ＣＭＶエンハンサー（例えば、配列番号３４）は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、ＣＭＶエンハンサーがプロモーター、例えばＣＢＡプロモーター、及びイントロンに作動可能に連結されている場合、このプロモーターは、ＣＡＧプロモーターと称される。ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、及びイントロンを含む例示的な構築物は、配列番号２５及び配列番号２６として提供される。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、空間的に制限されたプロモーター、例えば、組織または細胞特異的プロモーターである。空間的に制限されたプロモーターは、ニューロン特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、骨格筋特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、星状細胞特異的プロモーター、ミクログリア特異的プロモーター、及びオリゴデンドロサイト特異的プロモーターからなる群から選択されるものなど、任意の好適なプロモーターであり得る。本明細書で使用される場合、特定の発現は、発現産物が特定の組織（複数可）または細胞型（複数可）においてのみ発現されることを意味するものではなく、実質的に特定の組織（複数可）または細胞型（複数可）に限定される発現を指す。例えば、Ｐａｃａｋ ｅｔ ａｌ．“Ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｒａ－ｖａｓｃｕｌａｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｍｉｃｅ．”Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ６（１３） ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７９－０５５６－６－１３ （２００８）を参照のこと。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの５’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ ＦＸＮ、及びＦＸＮヌクレオチド配列に、以下の例示的な順序で、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター－ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの５’ＵＴＲ－５’ＵＴＲ ＦＸＮ－ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。例えば、核酸構築物は、デスミンプロモーター配列（配列番号４）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含み得、デスミンプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたデスミン５’ＵＴＲ（配列番号２２）及び５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）をさらに含む。

核酸構築物はまた、ＣＢＡプロモーター配列（配列番号５）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含み得、ＣＢＡプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたＣＢＡ ５’ＵＴＲ（配列番号２３）及び５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）をさらに含む。

他の構築物において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、５’ＵＴＲ ＦＸＮ及びＦＸＮヌクレオチド配列に、以下の例示的な順序で、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター－５’ＵＴＲ ＦＸＮ －ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。例えば、核酸構築物は、デスミンプロモーター配列（配列番号４）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含み得、デスミンプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置された５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）をさらに含む。核酸構築物はまた、ＣＢＡプロモーター配列（配列番号５）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）も含み得、ＣＢＡプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置された５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）をさらに含む。

イントロン
本明細書に記載の核酸構築物のうちのいずれも、１つ以上のイントロンヌクレオチド配列をさらに含むことができる。イントロンは、発現を調節するために核酸構築物内の任意の好適な位置に位置することができる。イントロン配列は、５’ＵＴＲ ＦＸＮの上流に位置することができる。イントロンは、５’ＵＴＲ ＦＸＮの下流に位置することができる。いくつかの実施形態において、イントロンは、５’ＵＴＲ ＦＸＮとヒトＦＸＮをコードする核酸配列との間に配置される。イントロン及びそのスプライシングは、ヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現に寄与し得る。配列番号３６及び配列番号３７（以下に記載）は、本明細書で提供される構築物のうちのいずれかで使用することができる例示的なイントロン配列である。他のイントロン配列は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｄｏｍｅｎｇｅｒ ａｎｄ Ｇｒｉｍｍ；ａｎｄ Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＲＮＡ ３’ ｐｒｏｃｅｓｉｎｇ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＲＮＡ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（４）：９３７－９４７（１９９０）を参照のこと。
ｇｔａａｇｔａｔｃａａａｇｔａｔｃａａｇｇｔｔａｃａａｇａｃａｇｇｔｔｔａａｇｇａｇａｃｃａａｔａｇａａａｃｔｇｇｇｃｔｔｇｔｃｇａｇａｃａｇａｇａａｇａｃｔｃｔｔｇｃｇｔｔｔｃｔｇａｔａｇｇｃａｃｃｔａｔｔｇｇｔｃｔｔａｃｔｇａｃａｔｃｃａｃｔｔｔｇｃｃｔｔｔｃｔｃｔｃｃａｃａｇ（配列番号３６）。
ｇｔａａｇｔｔｔａｇｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃｔｔｔｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃｃｃｇｇａｔｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃａａａｔｃａａａｇａａｃｔｇｃｔｃｃｔｃａｇｔｇｇａｔｇｔｔｇｃｃｔｔｔａｃｔｔｃｔａｇ（配列番号３７）。

いくつかの実施形態において、イントロンは、ヒトフラタキシンをコードする天然に存在する核酸には見られないイントロンである。

例えば、限定するものではないが、以下の例示的な順序で、（ａ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む核酸配列、（ｂ）５’ＵＴＲ ＦＸＮを含む核酸配列、（ｃ）イントロン、及び（ｄ）ヒトＦＸＮをコードする核酸配列を含む核酸構築物が、本明細書で提供され、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、５’ＵＴＲ ＦＸＮ及びヒトＦＸＮをコードする核酸配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、ヒトＦＸをコードする核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、核酸構築物は、ヒトフラタキシン３’ＵＴＲ（３’ＵＴＲ ＦＸＮ）またはヒトＦＸＮのコード配列の下流に配置される切断された３’ＵＴＲ ＦＸＮをさらに含む。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、３’ＵＴＲ ＦＸＮまたは切断された３’ＵＴＲ ＦＸＮがＦＸＮの発現を調節するための調節要素を含まないため、ヒトフラタキシン３’ＵＴＲ（３’ＵＴＲ ＦＸＮ）または切断された３’ＵＴＲ ＦＸＮを含まない。３’ＵＴＲの例としては、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４６、配列番号４７、またはそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、核酸構築物は、一対の逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含み、核酸構築物は、当該ＩＴＲによって各々に隣接する。例示的なＩＴＲ配列としては、配列番号３８、配列番号３９、及びそれらの逆相補体が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、核酸構築物は、ポリアデニル化（ポリＡ）配列、例えば、ポリＡウシ成長ホルモン配列をコードする核酸配列をさらに含む。配列番号６３は、ウシ成長ホルモンポリＡ配列をコードする例示的な配列である。

全体を通して使用されるように、「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれか形態での、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそのポリマーを指す。本明細書で提供される配列のうちのいずれかに相補的な配列も、提供される。ＲＮＡが記載される場合、その対応するｃＤＮＡもまた記載され、ウリジンはチミジンとして表されることを理解されたい。ｃＤＮＡが記載される場合、その対応するｍＲＮＡもまた記載される。具体的に限定されない限り、当該用語は、参照核酸と類似する特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を網羅する。核酸配列は、デオキシリボ核酸及びリボ核酸の組み合わせを含むことができる。このようなデオキシリボ核酸及びリボ核酸には、天然に存在する分子及び合成類似体の両方が含まれる。本発明のポリヌクレオチドはまた、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステムアンドループ構造などを含むが、これらに限定されない配列のすべての形態を網羅する。

別段の指示のない限り、特定の核酸配列は、明示的に指示された配列に加えて。保存的に修飾されたそのバリアント（例えば縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的な配列も黙示的に網羅する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基により置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。

配列番号１～６３のうちのいずれか１つに対して少なくとも６０％の同一性を有する核酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる核酸配列が、本明細書で提供される。本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈で使用される場合、「同一性」または「実質的同一性」という用語は、参照配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を指す。あるいは、同一性パーセントは、６０％～１００％の任意の整数であり得る。例示的な実施形態は、本明細書に記載のプログラムを使用する参照配列、好ましくは、以下に記載されるように、標準パラメータを使用するＢＬＡＳＴと比較して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％含む。当業者は、これらの値が、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定する場合に、コドン縮重、アミノ酸類似性、読み取りフレーム配置などを考慮に入れることによって、適切に調整することができることを認識するであろう。

配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として機能し、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することができ、または代替的なパラメータを指定することができる。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。

本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、２０～６００、通常は約５０～約２００、さら通常は約１００～約１５０からなる群から選択される隣接位置の数のうちのいずれか１つのセグメントへの言及を含み、この中で、配列が、２つの配列を最適に整列させた後で同じ数の隣接位置の参照配列と比較する。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法により、これらのアルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴ）のコンピュータ実装により、または手動アラインメント及び目視検査により、実行され得る。

パーセント配列同一性及び配列類似性を判定するのに好適なアルゴリズムは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されるＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを介して一般に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列における同じ長さのワードと整列するときに何らかの正値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす、問い合わせ配列における長さの短いワードＷを特定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を特定することを伴う。Ｔは、近傍のワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記を参照）。これらの最初の近傍のワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシード値として機能する。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加することができる限り、各配列に沿って両方向に延びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチする残基の対に対するリワードスコア、常に０超）及びＮ（ミスマッチの残基に対するペナルティスコア、常に０未満）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコア化マトリックスを使用して累積スコアを算出する。各方向のワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ外れる場合、累積スコアが、１つ以上の負とスコア化される残基アラインメントの蓄積に起因してゼロ以下になる場合、またはいずれかの配列の末端に達する場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、２８のワードサイズ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝１、Ｎ＝－２、及び両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワードサイズ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の１つの測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こり得る確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸の参照核酸との比較における最小和確率が約０．０１未満、より好ましくは約１０^－５未満、最も好ましくは約１０^－２０未満である場合に、参照配列に類似していると見なされる。

本明細書で提供される組換え核酸は、目的となる宿主細胞または生物における発現のために発現カセットに含まれ得る。カセットは、さらに、生物に共形質転換される少なくとも１つの追加の遺伝子または遺伝子要素を含有してもよい。追加の遺伝子または要素が含まれる場合、構成要素は、作動可能に連結される。本発明のプロモーターは、宿主細胞におけるコード配列の発現を指示または駆動することができる。他の調節領域（すなわち、転写調節領域、及び翻訳終結領域）を含むことができる。

追加の調節シグナルとしては、転写開始出発部位、オペレーター、活性化剤、エンハンサー、他の調節要素、リボソーム結合部位、開始コドン、終結シグナルなどが挙げられるが、これらに限定されない。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ １１」）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０） Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、及びそれらに列挙される参考文献を参照のこと。

発現カセットはまた、形質転換された細胞の選択のための選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性を付与する遺伝子、例えば、いくつか挙げると、ハイグロマイシン耐性、カナマイシン耐性、アンピシリン耐性、ゲンタマイシン耐性、ネオマイシン耐性を付与する遺伝子が挙げられる。追加の選択可能なマーカーが既知であり、任意のマーカーを使用することができる。アンピシリン耐性及びカナマイシン耐性を付与する遺伝子のための例示的な配列は、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５として本明細書で提供される。本明細書に記載の構築物のうちのいずれか、例えば、ｐＬＰ１００１、ｐＬＰ１００２、ｐＬＰ１００３、ｐＬｐ１００４、またはｐＬＰ１０４９におけるアンピシリン耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子で置き換えることができる。

発現カセットの調製において、様々なＤＮＡ断片を操作して、適切な方向で、かつ必要に応じて、適切な読み取りフレームにおいてＤＮＡ配列を提供することができる。この目的のために、アダプターまたはリンカーを用いて、ＤＮＡ断片を連結してもよく、または他の操作が関与して、好都合な制限部位、過剰なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを提供することができる。この目的のために、インビトロ変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、移行及び横断が、関与し得る。

ベクター
本明細書に記載の核酸構築物のうちのいずれかを含むベクターも、提供される。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミドである。いくつかの実施形態において、ベクターは、組換えウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。ウイルスベクターの例としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載のウイルスベクターのうちのいずれも、対象への投与のためにウイルス粒子またはビリオンに包装することができることを理解されたい。

いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、５’逆方向末端反復及び３’逆方向末端反復を含むＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、一本鎖ＡＡＶベクターまたは自己相補的ＡＡＶベクターであり得る。

本明細書で使用される場合、「組換えＡＡＶベクター」は、ＡＡＶに通常は存在しない核酸配列（すなわち、ＡＡＶとは異種のポリヌクレオチド）、例えば、ヒトフラタキシンを発現する本明細書に記載の核酸構築物のうちのいずれかを含むＡＡＶベクターを指す。概して、異種核酸は、少なくとも１つ、一般的には２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接される。組換えＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子及び組換えＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。組換えＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。

いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、配列番号６～１４及び２４～２８のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、配列番号６～１４及び２４～２８のうちのいずれか１つを含む。

組換えＡＡＶベクターは、パッケージングのためのウイルス配列をさらに含むことができる。任意の欠損したウイルス機能は、パッケージング細胞によってトランスで供給され得る。例えば、遺伝子療法で使用される組換えＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有し得、ベクターのバランスは、目的となる配列（例えば、５’ＵＴＲ ＦＸＮ及びＦＸＮヌクレオチド配列）を含むことができる。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶキャプシドにパッケージングするために含まれ得る。パッケージング細胞はまた、他のＡＡＶ遺伝子（例えば、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードするが、ＩＴＲ配列を欠くプラスミドを含有することができる。ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如により、かなりの量でパッケージ化されない場合がある。パッケージング細胞はまた、ＡＡＶベクターの複製ならびにｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進することができるヘルパーウイルスとしてアデノウイルスに感染させることができる。パッケージング細胞は、ＡＡＶベクターの複製ならびにｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進するアデノウイルスなどのヘルパーウイルスの遺伝子産物をコードするヘルパープラスミドでトランスフェクトすることができる。

パッケージング細胞からのＡＡＶ粒子の精製は、ウイルスベクターを産生するパッケージング細胞の成長、続いて細胞上清及び／または粗溶解物からのウイルスベクター粒子の収集を伴うことができる。次いで、ＡＡＶを、例えば、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、米国特許第７４１９８１７号及びＵＳ６９８９２６４）、イオン交換クロマトグラフィー及びＣｓＣｌまたはイオジキサノール密度遠心分離（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１０９４１９８Ａ１０）、免疫親和性クロマトグラフィー（例えば、ＷＯ２０１６１２８４０８）、またはＡＶＢセファロースを使用する精製（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって精製することができる。

本明細書で使用される場合、組換えＡＡＶ粒子またはビリオンは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド化された組換えＡＡＶベクターを含むウイルス粒子である。本明細書で使用される場合、組換えＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド化された組換えＡＡＶベクターを含むウイルス粒子である。「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」、または「組換えＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド化されたポリヌクレオチド組換えＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。粒子が異種核酸配列（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外の核酸配列）を含む場合、それは、組換えＡＡＶベクターと称され得る。したがって、組換えＡＡＶ粒子またはビリオンの生成は、組換えＡＡＶベクターの生成を必然的に含み、例えば、ベクターは、組換えＡＡＶ粒子内に含有される。ＡＡＶベクター及びビリオンを生成するための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７９８：２６７－２８４（２０１２）を参照のこと）。

本明細書に記載のベクターのうちのいずれかを含む細胞も、提供される。宿主細胞は、インビトロ宿主細胞、エキソビボ宿主細胞、またはインビボ宿主細胞であり得る。本明細書に記載の宿主細胞のうちのいずれかの集団も、提供される。本明細書に記載の１つ以上の宿主細胞を含む細胞培養物も、提供される。細菌（例えば、大腸菌及び他の細菌株）、動物（特に哺乳動物）、及びアーキバス菌起源の細胞を含む多くの細胞の培養及び生成のための方法は、当該技術分野で入手可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、及びＢｅｒｇｅｒ（上記すべて）、ならびにＦｒｅｓｈｎｅｙ （１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，３^ｒｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ならびにそこで引用される参考文献；Ｄｏｙｌｅ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９７） Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｈｕｍａｓｏｎ（１９７９） Ａｎｉｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４^ｔｈ Ｅｄ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、及びＲｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：１０１６－１０２４を参照のこと。

宿主細胞は、例えば、細菌細胞を含む原核細胞であり得る。あるいは、細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＨＥＬＡ細胞、鳥類細胞、骨髄腫細胞、ピキア細胞、昆虫細胞、または植物細胞であり得る。いくつかの他の好適な宿主細胞株が、開発されており、骨髄腫細胞株、線維芽細胞株、及び黒色腫細胞株などの様々な腫瘍細胞株を含む。目的となる核酸セグメントを含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じて変化する周知の方法によって宿主細胞に移行または導入することができる。

ベクターを細胞に導入するための方法は、当該技術分野で既知である。本明細書で使用される場合、核酸を細胞に導入する文脈において「導入する」という語句は、核酸配列の細胞の外側から細胞の内側への転位を指す。ある場合によっては、導入とは、細胞の外側から細胞の核の内側への核酸の転位を指す。かかる転位の様々な方法が企図されており、限定されないが、エレクトロポレーション、ナノ粒子送達、ウイルス送達、ナノワイヤーまたはナノチューブとの接触、受容体媒介性内在化、細胞透過性ペプチドを介した転位、リポソーム媒介性転位、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクタミン、リン酸カルシウム、または原核細胞もしくは真核細胞宿主への核酸の導入するための現在知られているまたは将来特定される任意の方法が挙げられる。標的化ヌクレアーゼ系（例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、またはメガタール（ＭＴ）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ５， Ａｒｔｉｃｌｅ Ｎｏ．１（２０２０））も、核酸を宿主細胞に導入するために使用することができる。

ＡＡＶ血清型
本明細書で提供される組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶ粒子は、任意の天然または組換えＡＡＶ血清型を含むか、またはそれに由来することができる。ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．ｔ １９、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ変異、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ変異、ＢＡＡＶ、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、Ｊａｐａｎｅｓｅ ＡＡＶ １０、ｔｒｕｅ ｔｙｐｅ ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ １０、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＡＶ、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ １００－１、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ １００－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ １００－３、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ １００－７、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ １０－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ １０－６、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ １０－８、ＡＡＶ ＳＭ １００－１０、ＡＡＶ ＳＭ １００－３、ＡＡＶ ＳＭ １０－１、ＡＡＶ ＳＭ １０－２、及び／またはＡＡＶ ＳＭ １０－８を含むが、これらに限定されない、血清型のうちのいずれかから選択された血清型及びそれらのバリアントであり得るか、またはそれらに基づき得る。

ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４などであるが、これらに限定されない、Ｎ Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９（６）：１０７０－１０７８（２０１１）によって記載されるように、ＡＡＶ９配列における変異であり得るか、またはそれを有し得る。

ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ３Ｂ（ＵＳ６１５６３０３の配列番号１及び１０）、ＡＡＶ６（ＵＳ６１５６３０３の配列番号２、７、及び１１）、ＡＡＶ２（ＵＳ６１５６３０３の配列番号３及び８）、ＡＡＶ３Ａ（ＵＳ６１５６３０３の配列番号４及び９）またはそれらの誘導体などであるが、これらに限定されない、米国特許第ＵＳ６１５６３０３号に記載の配列であり得るか、またはそれを有し得る。

血清型は、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２（１２）：５８８７－５９１１（２００８））によって記載されるように、ＡＡＶＤＪ８（またはＡＡＶ－ＤＪ８）などのＡＡＶＤＪまたはその誘導体であり得る。ＡＡＶＤＪ８のアミノ酸配列は、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を除去するために、２つ以上の変異を含むことができる。米国特許第７５８８７７２号の配列番号１として記載されるＡＡＶ－ＤＪ配列は、２つの変異：（１）アミノ酸５８７におけるアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変化するＲ５８７Ｑ、及び（２）アミノ酸５９０におけるアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がスレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変化するＲ５９０Ｔを含むことができる。別の非限定的な例として、ＡＡＶＤＪ８のアミノ酸配列は、３つの変異：（１）アミノ酸４０６におけるリジン（Ｋ；Ｌｙｓ）がアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）に変化するＫ４０６Ｒ、（２）アミノ酸５８７におけるアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変化するＲ５８７Ｑ、及び（３）アミノ酸５９０におけるアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がスレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変化するＲ５９０Ｔを含むことができる。

ＡＡＶ血清型は、ｔｒｕｅ ｔｙｐｅ ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号２）、「ＵＰｅｎｎ ＡＡＶ１０」（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号８）、「Ｊａｐａｎｅｓｅ ＡＡＶ１０」（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号９）、またはそれらのバリアントなどであるが、これらに限定されない、国際公開第ＷＯ２０１５１２１５０１号に記載の配列であり得るか、またはそれを有し得る。

ＡＡＶカプシド血清型の選択または使用は、種々の種に由来し得る。例えば、ＡＡＶは、トリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）であり得る。ＡＡＶ血清型は、ＡＡＡＶ（ＵＳ９２３８８００の配列番号１、２、４、６、８、１０、１２、及び１４）またはそのバリアントなどであるが、これに限定されない、米国特許第ＵＳ９２３８８００号に記載の配列であり得るか、またはそれを有し得る。

ＡＡＶは、ウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）であり得る。ＢＡＡＶ血清型は、限定されないが、ＢＡＡＶ（ＵＳ９１９３７６９の配列番号１及び６）またはそのバリアントなどであるが、これに限定されない、米国特許第ＵＳ９１９３７６９号に記載の配列であり得るか、またはそれを有し得る。ＢＡＡＶ血清型は、ＢＡＡＶ（ＵＳ７４２７３９６の配列番号５及び６）またはそのバリアントなどであるが、これに限定されない、米国特許第ＵＳ７４２７３９６号に記載の配列であり得るか、またはそれを有し得る。

ＡＡＶは、カプリンＡＡＶであり得る。カプリンＡＡＶ血清型は、限定されないが、カプリンＡＡＶ（ＵＳ７４２７３９６の配列番号３）またはそのバリアントなどであるが、これらに限定されない、米国特許第ＵＳ７４２７３９６号に記載の配列であり得るか、またはそれを有し得る。

ＡＡＶは、２つ以上の親血清型からのハイブリッドＡＡＶとして操作され得る。ＡＡＶは、ＡＡＶ２及びＡＡＶ９からの配列を含むＡＡＶ２Ｇ９であり得る。ＡＡＶ２Ｇ９ ＡＡＶ血清型は、米国特許公開第ＵＳ２０１６００１７００５号に記載の配列であり得るか、またはそれを有し得る。

ＡＡＶは、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９（６）：１０７０－１０７８（２０１１）によって記載されるように、アミノ酸３９０～６２７（ＶＰ１番号付け）の変異を有するＡＡＶ９カプシドライブラリーによって生成された血清型であり得る。血清型ならびに対応するヌクレオチド及びアミノ酸置換は、ＡＡＶ９．１（Ｇ１５９４Ｃ；Ｄ５３２Ｈ）、ＡＡＶ６．２（Ｔ１４１８Ａ及びＴ１４３６Ｘ；Ｖ４７３Ｄ及びＩ４７９Ｋ）、ＡＡＶ９．３（Ｔ１２３８Ａ；Ｆ４１３Ｙ）、ＡＡＶ９．４（Ｔ１２５０Ｃ及びＡ１６１７Ｔ；Ｆ４１７Ｓ）、ＡＡＶ９．５（Ａ１２３５Ｇ、Ａ１３１４Ｔ、Ａ１６４２Ｇ、Ｃ１７６０Ｔ；Ｑ４１２Ｒ、Ｔ５４８Ａ、Ａ５８７Ｖ）、ＡＡＶ９．６（Ｔ１２３１Ａ；Ｆ４１１Ｉ）、ＡＡＶ９．９（Ｇ１２０３Ａ、Ｇ１７８５Ｔ；Ｗ５９５Ｃ）、ＡＡＶ９．１０（Ａ１５００Ｇ、Ｔ１６７６Ｃ；Ｍ５５９Ｔ）、ＡＡＶ９．１１（Ａ１４２５Ｔ、Ａ１７０２Ｃ、Ａ１７６９Ｔ；Ｔ５６８Ｐ、Ｑ５９０Ｌ）、ＡＡＶ９．１３（Ａ１３６９Ｃ、Ａ１７２０Ｔ；Ｎ４５７Ｈ、Ｔ５７４Ｓ）、ＡＡＶ９．１４（Ｔ１３４０Ａ、Ｔ１３６２Ｃ、Ｔ１５６０Ｃ、Ｇ１７１３Ａ；Ｌ４４７Ｈ）、ＡＡＶ９．１６（Ａ１７７５Ｔ；Ｑ５９２Ｌ）、ＡＡＶ９．２４（Ｔ１５０７Ｃ、Ｔ１５２１Ｇ；Ｗ５０３Ｒ）、ＡＡＶ９．２６（Ａ１３３７Ｇ、Ａ１７６９Ｃ；Ｙ４４６Ｃ、Ｑ５９０Ｐ）、ＡＡＶ９．３３（Ａ１６６７Ｃ；Ｄ５５６Ａ）、ＡＡＶ９．３４（Ａ１５３４Ｇ、Ｃ１７９４Ｔ；Ｎ５１２Ｄ）、ＡＡＶ９．３５（Ａ１２８９Ｔ、Ｔ１４５０Ａ、Ｃ１４９４Ｔ、Ａ１５１５Ｔ、Ｃ１７９４Ａ、Ｇ１８１６Ａ；Ｑ４３０Ｌ、Ｙ４８４Ｎ、Ｎ９８Ｋ、Ｖ６０６Ｉ）、ＡＡＶ９．４０（Ａ１６９４Ｔ、Ｅ５６５Ｖ）、ＡＡＶ９．４１（Ａ１３４８Ｔ、Ｔ１３６２Ｃ；Ｔ４５０Ｓ）、ＡＡＶ９．４４（Ａ１６８４Ｃ、Ａ１７０１Ｔ、Ａ１７３７Ｇ；Ｎ５６２Ｈ、Ｋ５６７Ｎ）、ＡＡＶ９．４５（Ａ１４９２Ｔ、Ｃ１８０４Ｔ；Ｎ４９８Ｙ、Ｌ６０２Ｆ）、ＡＡＶ９．４６（Ｇ１４４１Ｃ、Ｔ１５２５Ｃ、Ｔ１５４９Ｇ；Ｇ４８１Ｒ、Ｗ５０９Ｒ、Ｌ５１７Ｖ）、９．４７（Ｇ１２４１Ａ、Ｇ１３５８Ａ、Ａ１６６９Ｇ、Ｃ１７４５Ｔ；Ｓ４１４Ｎ、Ｇ４５３Ｄ、Ｋ５５７Ｅ、Ｔ５８２Ｉ）、ＡＡＶ９．４８（Ｃ１４４５Ｔ、Ａ１７３６Ｔ；Ｐ４８２Ｌ、Ｑ５７９Ｌ）、ＡＡＶ９．５０（Ａ１６３８Ｔ、Ｃ１６８３Ｔ、Ｔ１８０５Ａ；Ｑ５４６Ｈ、Ｌ６０２Ｈ）、ＡＡＶ９．５３（Ｇ１３０１Ａ、Ａ１４０５Ｃ、Ｃ１６６４Ｔ、Ｇ１８１１Ｔ；Ｒ１３４Ｑ、Ｓ４６９Ｒ、Ａ５５５Ｖ、Ｇ６０４Ｖ）、ＡＡＶ９．５４（Ｃ１５３１Ａ、Ｔ１６０９Ａ；Ｌ５１１Ｉ、Ｌ５３７Ｍ）、ＡＡＶ９．５５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）、ＡＡＶ９．５８（Ｃ１４７５Ｔ、Ｃ１５７９Ａ；Ｔ４９２Ｉ、Ｈ５２７Ｎ）、ＡＡＶ．５９（Ｔ１３３６Ｃ；Ｙ４４６Ｈ）、ＡＡＶ９．６１（Ａ１４９３Ｔ；Ｎ４９８Ｉ）、ＡＡＶ９．６４（Ｃ１５３１Ａ、Ａ１６１７Ｔ；Ｌ５１１Ｉ）、ＡＡＶ９．６５（Ｃ１３３５Ｔ、Ｔ１５３０Ｃ、Ｃ１５６８Ａ；Ａ５２３Ｄ）、ＡＡＶ９．６８（Ｃ１５１０Ａ；Ｐ５０４Ｔ）、ＡＡＶ９．８０（Ｇ１４４１Ａ，；Ｇ４８１Ｒ）、ＡＡＶ９．８３（Ｃ１４０２Ａ、Ａ１５００Ｔ；Ｐ４６８Ｔ、Ｅ５００Ｄ）、ＡＡＶ９．８７（Ｔ１４６４Ｃ、Ｔ１４６８Ｃ；Ｓ４９０Ｐ）、ＡＡＶ９．９０（Ａ１１９６Ｔ；Ｙ３９９Ｆ）、ＡＡＶ９．９１（Ｔ１３１６Ｇ、Ａ１５８３Ｔ、Ｃ１７８２Ｇ、Ｔ１８０６Ｃ；Ｌ４３９Ｒ、Ｋ５２８Ｉ）、ＡＡＶ９．９３（Ａ１２７３Ｇ、Ａ１４２１Ｇ、Ａ１６３８Ｃ、Ｃ１７１２Ｔ、Ｇ１７３２Ａ、Ａ１７４４Ｔ、Ａ１８３２Ｔ；Ｓ４２５Ｇ、Ｑ４７４Ｒ、Ｑ５４６Ｈ、Ｐ５７１Ｌ、Ｇ５７８Ｒ、Ｔ５８２Ｓ、Ｄ６１１Ｖ）、ＡＡＶ９．９４（Ａ１６７５Ｔ；Ｍ５５９Ｌ）、及びＡＡＶ９．９５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）であり得るが、これらに限定されない。

ＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む血清型であり得る。非限定的な例として、血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ８であり得る。

ＡＡＶは、Ｄｅｖｅｒｍａｎ．２０１６．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．３４（２）：２０４－２０９に記載されるように、ＰＨＰ．ＡまたはＰＨＰ．Ｂなどのバリアントであり得る。

本開示はまた、ＡＡＶ粒子生成に必要な構成要素のすべてを安定的に発現する細胞株を創出することを含むパッケージング細胞を生成する方法も提供する。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子が欠如した組換えＡＡＶゲノムを含むプラスミド（または複数のプラスミド）、組換えＡＡＶゲノムとは別のＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーが、細胞のゲノムに統合される。ＡＡＶゲノムは、例えば、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順によって細菌プラスミドに導入されてきた。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させることができる。この方法のいくつかの利点は、細胞が選択可能であり、かつ組換えＡＡＶの大規模生産に適していることである。好適な方法の他の例は、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、組換えＡＡＶゲノム及び／またはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入する。組換えＡＡＶ生成の全般的な原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）で概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）；米国特許第ＵＳ５１７３４１４号；ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第ＵＳ５６５８７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２；米国特許第ＵＳ５７８６２１１号；米国特許第ＵＳ５８７１９８２号；及び米国特許第ＵＳ６２５８５９５号に記載されている。

ＡＡＢベクター血清型は、標的細胞タイプにマッチさせることができる。例えば、以下の例示的な細胞タイプは、特に示されるＡＡＶ血清型によって形質導入することができる。表１を参照のこと。

薬学的組成物
本明細書に記載の組換えウイルスベクターまたはウイルス粒子のうちのいずれかを含む薬学的組成物が、本明細書に提供される。薬学的組成物は、例えば、送達を増加させる（例えば、標的細胞の感染を増加させる、及び／または感染させることができる細胞の範囲を増加させる）、組換えベクターの安定性を増加させる、または組換えベクター、例えば、ＡＡＶベクターの免疫原性を減少させるのに好適な追加の構成要素を含むことができる。例えば、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／または塩を含み得る。薬学的に許容される担体は、患者への組換えＡＡＶベクターの送達または活性を実質的に妨げることができる量の緩衝液、化合物、凍結保存剤、保存剤、または他の薬剤を除外することができる。例示的な液体担体は、組換えＡＡＶベクター及び水に加えて材料を含有しない無菌水性溶液、または生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理食塩水、またはその両方（例えば、リン酸緩衝食塩水）を含有する無菌水性溶液である。またさらに、水性担体は、２つ以上の緩衝塩、さらに塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの塩、ブドウ糖、ポリエチレングリコール、ならびに他の溶質を含有することができる。また液体組成物は、水に加えて及び水以外に、液相も含有することができる。このような追加の液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、及び水－油エマルジョンである。

薬学的組成物は、対象の細胞（複数可）における発現産物の産生を可能にするように、対象に送達することができる。薬学的組成物は、レシピエントが、細胞におけるＦＸＮ発現を調節する、及び／または対象におけるＦＡを治療する有効量の発現産物を産生することを可能にする十分な遺伝子材料を含む。

いくつかの実施形態において、薬学的組成物はまた、薬学的に許容される賦形剤も含有する。かかる賦形剤としては、それ自体で、組成物を投与される個体へ有害な免疫応答を誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る任意の医薬剤が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤としては、水、生理食塩水、グリセロール、糖、及びエタノールなどの液体が挙げられるがこれらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば鉱酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、及び同種のものなど）；及び有機酸の塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、及び同種のものなど）は、その中に含まれ得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、及び同種のものなどの補助物質は、かかるビヒクル中に存在し得る。これらの材料を含有する薬学的に許容される担体、賦形剤、及び製剤の調製は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載される。

非経口投与に好適な薬学的製剤は、水溶液中、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理学的に緩衝された生理食塩水中で製剤化され得る。水性注入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製してもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。任意に、懸濁液はまた、好適な安定剤または高度に濃縮された溶液の調製を可能にする化合物の溶解度を増加させる薬剤も含有し得る。

遺伝子改変細胞
本明細書に記載の核酸構築物または組換えウイルスベクターのうちのいずれかを含む遺伝子改変細胞も、本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、「遺伝子改変細胞」は、本明細書に記載の核酸構築物または組換えウイルスベクターのうちのいずれかを細胞に導入した結果として、少なくとも１つのゲノム改変を有する細胞を指す。遺伝子改変細胞は、インビトロ遺伝子改変細胞、エキソビボ遺伝子改変細胞、またはインビボ遺伝子改変細胞であり得る。

遺伝子改変細胞は、ヒト幹細胞（例えば、多能性幹細胞、例えば、ニューロン及び心筋細胞に分化し得る間葉系幹細胞）、ヒトニューロン、ヒト心筋細胞、ヒト平滑筋細胞、ヒト骨格筋細胞、及びヒト肝細胞からなる群から選択されるものなどの任意の好適な遺伝子改変細胞であり得る。

いくつかの実施形態において、骨髄由来間葉系幹細胞は、ＦＡを有する対象から単離され、５’ＵＴＲ及びヒトＦＸをコードする核酸配列を含む核酸構築物を挿入するように遺伝子改変される。次いで、遺伝子改変細胞を、対象に再び自己移植する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞を全身に送達して、ＦＡ患者の脳及び心臓への移植片の標的送達を可能にすることができる。例えば、Ｔａｊｉｒｉ ｅｔ ａｌ．“Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ Ａｔａｘｉａ，” Ｍｅｄ．Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ ８３（３）：２９６－２９８（２０１４）を参照のこと。細胞の遺伝子改変のための核酸及びベクターの導入のための方法を、上に記載する。

「遺伝子改変」という用語は、細胞、生物、ウイルス、ウイルスベクター、または他の生物学的作用物質のＤＮＡゲノム（または場合によってはＲＮＡゲノム）の任意の変化を指す。遺伝子改変の非限定的な例としては、挿入、欠失、置換、外因性核酸が細胞及び／または生物に付加されるトランスフェクションまたは形質転換などの手順、ならびにクローニング技術が挙げられる。

「挿入」という用語は、核酸配列における１つ以上のヌクレオチドの付加を指す。挿入は、いくつかのヌクレオチドの小さな挿入から、ｃＤＮＡまたは遺伝子などの大きなセグメントの挿入までの範囲であり得る。

「欠失」という用語は、核酸配列における１つ以上のヌクレオチドの喪失もしくは除去、または遺伝子の機能の喪失もしくは除去を指す。場合によっては、欠失には、例えば、いくつかのヌクレオチド、エクソン、イントロン、遺伝子セグメント、または遺伝子の全配列の喪失が含まれ得る。場合によっては、遺伝子の欠失は、遺伝子の機能もしくは発現またはその遺伝子産物の除去または低減を指す。これは、遺伝子内またはその近傍の配列の欠失からだけでなく、遺伝子の発現を破壊する他の事象（例えば挿入、ナンセンス変異）からも生じ得る。

「置換」という用語は、核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドを同数のヌクレオチドで置き換えることを指す。

核酸配列の遺伝子改変は、「組換え」配列をもたらし得る。例えば、本開示は、本明細書に開示される要素を含むように遺伝子改変された「組換えＡＡＶベクター」を提供する。

治療の方法
ＦＡを治療するための方法も、提供される。本方法は、ＦＡを有する対象に、治療有効量の本明細書で提供される組換えＡＡＶ粒子のうちのいずれかを投与することを含む。

全体を通して使用されるように、対象によって、個体が意味される。対象は、成人の対象または小児の対象であり得る。小児の対象は、生まれた時から１８歳の年齢中の範囲の対象を包含する。好ましくは、対象は、動物、例えば哺乳動物（霊長動物など）、及びより好ましくはヒトである。非ヒト霊長動物も同様に対象である。対象という用語は、飼育動物（ネコ、イヌなど）、家畜（例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験用動物（例えばフェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ラット、アレチネズミ、モルモットなど）を包含する。したがって、獣医学的使用及び医学的製剤が、本明細書において企図される。

全体を通して使用されるように、「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、ＦＡの１つ以上の影響または症状を低減または遅延させる方法を指す。対象は、ＦＡと診断され得る。治療は、単なる症状ではなく背景病理を低減する方法も指し得る。対象への投与の効果は、疾患の１つ以上の症状の低減、疾患の重症度の低減、疾患の完全な除去、または１つ以上の症状の開始もしくは悪化の遅延であるが、これらに限定されない、効果を有し得る。例えば、開示される方法は、治療の前の対象と比較した場合に、または対照の対象もしくは対照値と比較した場合に、疾患の１つ以上の症状（例えば、対象における腕及び脚の筋力低下、運動失調、糖尿病、心筋症など）に約１０％の低減があるならば、治療であると判断される。したがって、低減は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量の低減であり得る。

ヒト細胞におけるＦＸＮの発現を調節する方法も提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、ヒト細胞に、本明細書で提供される組換えＡＡＶベクターのうちのいずれかを導入することを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、対象に存在する。

ＦＡを有する対象のヒト細胞におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）濃度を増加させるための方法も、提供される。本方法は、対象に、治療有効量の本明細書で提供される組換えＡＡＶ粒子のうちのいずれかを投与することを含む。いくつかの方法において、ヒト細胞は、ニューロン、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、及び肝細胞からなる群から選択される。

ＦＡを有する対象のヒト細胞におけるＡＴＰ濃度を増加させるための方法も、提供される。本方法は、治療有効量の本明細書で提供される組換えＡＡＶ粒子のうちのいずれかを投与することを含む。いくつかの方法において、ヒト細胞は、ニューロン、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、及び肝細胞からなる群から選択される。

本明細書で使用される場合、増加は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％またはそれ以上の増加であり得る。ＦＡ患者の細胞内で発現されるＡＴＰのレベルの増加は、疾患の１つ以上の症状を改善し、長期生存を増加させる、及び／または他の治療に関連する副作用を低減させるのに有益であり得る。本明細書に開示される組換えＡＡＶベクターをヒトＦＡ患者に投与すると、組換えＡＡＶベクターは、増加したが調節されたレベルのＦＸＮを発現することができ、ミトコンドリアによるＡＴＰ産生は、疾患状態と比較して増加することができる。かかる組換えＡＡＶベクターが投与されるＦＡ患者における１００，０００～５００，０００個の細胞、５００，０００～１，０００，０００個の細胞、１，０００，０００～２，５００，０００個の細胞、２，５００，０００～５，０００，０００個の細胞、５，０００，０００～１０，０００，０００個の細胞、１０，０００，０００～５０，０００，０００個の細胞、５０，０００，０００～１００，０００，０００、１００，０００，０００～２５０，０００，０００個の細胞、１５０，０００，０００～３００，０００，０００個の細胞、２５０，０００，０００～５００，０００，０００個の細胞、５００，０００，０００～１，０００，０００，０００個の細胞、１，０００，０００，０００～５，０００，０００，０００個の細胞、５，０００，０００，０００～１０，０００，０００，０００個の細胞、１０，０００，０００，０００～２０，０００，０００，０００個の細胞、１５，０００，０００，０００～３０，０００，０００，０００個の細胞、３０，０００，０００，０００～５０，０００，０００，０００個の細胞、５０，０００，０００，０００～７５，０００，０００，０００個の細胞、または７５，０００，０００，０００～１００，０００，０００，０００個の細胞は、増加したが調節されたレベルのＦＸＮを発現することができ、ミトコンドリアによるＡＴＰ産生は、疾患状態と比較して増加することができる。

「有効量」という用語は、全体を通して使用されるように、所望される生理的応答を生じ、例えば、ＦＡの１つ以上の影響または症状を低減または遅延するのに必要な任意の量として定義される。本明細書に記載の組換えＡＡＶビリオンを投与するために有効な量及びスケジュールは、経験的に判断され得、このような判断を行うことは、当該技術分野の範囲内である。投与のための投与量範囲は、疾患または障害の１つ以上の症状が影響を受ける（例えば、低減または遅延する）所望の効果をもたらすために十分に多いものである。投薬量は、実質的な有害副作用（望まれない交差反応、望まれない細胞死、及び同種のもの等）を引き起こす程多量であるべきでない。概して、投薬量は、対象の種、年齢、体重、全体的な健康、性別、及び食事、投与のモード及び時間、ならびに特定の病態の重症度により変動し、当業者によって決定され得る。投薬量は、任意の禁忌の事象において個々の医師によって調整され得る。投薬量は変動し得、１回分以上の用量を投与され得る。

本明細書に記載の組換えＡＡＶビリオンのうちのいずれかの有効量は、変化し、実験及び／または臨床試験を通じて当業者によって決定され得る。例えば、インビボ注射、例えば、対象の内耳への直接注射の場合、有効用量は、約１０^６～約１０^１５個の組換えｒＡＡＶビリオン、またはこの範囲内の任意の値、例えば、約１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、または１０^１５個の組換えＡＡＶ粒子であり得る。

いくつかの実施形態において、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の数は、約１０^６～１０^１５個のベクターゲノム（ｖｇｓ）／ｍｌ、例えば、約１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、または１０^１５個のｖｇ／ｍｌの範囲のオーダーであり得る。いくつかの実施形態において、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の数は、約１０^６～１０^１５個のｖｇ／ｋｇ、またはこれらの量の間の任意の値、例えば、約１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、または１０^１５個のｖｇ／ｋｇであり得る。他の有効な投薬量は、用量反応曲線を確立する日常的な試験を通じて、当業者によって容易に確立され得る。

本明細書で提供される方法のうちのいずれかは、ＦＡを有する対象に、第２の治療剤、例えば、β遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、抗酸化剤、利尿剤、抗糖尿病薬、またはそれらの組み合わせを投与することをさらに含むことができる。

本明細書に記載の組成物は、局所的または全身的な治療が所望されるかどうかに応じて、多数の手法で投与される。組成物は、いくつかの投与経路、実質内注射、静脈内、髄腔内、筋肉内、大槽内、冠状動脈内注射、心筋内注射、経皮内、心筋内注射、またはそれらの組み合わせのうちのいずれかを介して投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、対象の後部半規管にカナロストミー（ｃａｎａｌｏｓｔｏｍｙ）を投与される。本明細書に記載の投与方法の任意のものについての有効用量は、インビトロ試験系または動物モデル試験系に由来する用量－応答曲線から推測され得る。

一般用語
本明細書で使用される場合、文法上の冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」が、場合によっては、明確に使用される場合でさえ、別段に指示されない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を含むように意図される。したがって、本明細書において、冠詞は、１つまたは１つを超える（すなわち、「少なくとも１つの」）冠詞の文法上の目的語を指すために使用される。さらに、単数の名詞の使用は、複数を含み、複数の名詞の使用は、使用の文脈が別段に必要としない限り、単数を含む。

本明細書における「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、または「ｈａｖｉｎｇ（有する）」及びこれらの変形の使用は、その後に列挙される要素及びそれらの等価物ならびに追加の要素を包含することを意味する。ある特定の要素を「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、または「ｈａｖｉｎｇ（有する）」として列挙される実施形態は、「本質的にそれらの特定の要素からなる」及び「それらからなる」としても企図される。本明細書で使用される場合、「及び／または」とは、１つ以上の関連する列挙項目のありとあらゆる可能な組み合わせ、及び代替（「または」）で解釈する場合は組み合わせの欠如を指し、また、それらを包含する。

本明細書で使用される場合、「～から本質的になる」という移行句（及び文法的互換表現）には、示されている材料または工程と、特許請求されている発明の基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない材料または工程が含まれるものと解釈することとする。Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ，５３７ Ｆ．２ｄ ５４９，５５１－５２，１９０ Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．４６１，４６３（ＣＣＰＡ １９７６）を参照のこと（原本では強調）。ＭＰＥＰ §２１１１．０３も参照のこと。したがって、本明細書で使用される「から本質的になる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されるべきではない。

本明細書で挙げられている任意の数値範囲は、挙げられた範囲内に含まれる同じ数値的精度（すなわち、指定の桁の同じ数字）のすべてのサブ範囲を記述しているものとする。例えば、「１．０～１０．０」と挙げられた範囲は、挙げられた最小値の１．０から挙げられた最大値の１０．０の間（両端の値を含む）のすべてのサブ範囲を記述しているものとし、例えば、「２．４～７．６」という範囲が明細書の本文に明示的に挙げられていない場合であっても「２．４～７．６」を記述しているものとする。また、明示的な記載がないまたは文脈により別段の要求がない限り、本明細書に記載のすべての数値パラメータ（例えば、値、範囲、量、パーセンテージなどを表現するもの）は、「約」という語が明示的に数字の前に出現しない場合であっても、「約」という語が手前に置かれているかのように読み取ってもよい。「約」は、所望の結果に影響を及ぼすことなく、所与の値がエンドポイントを「わずかに上回る」または「わずかに下回る」ことができることを提供することによって、数値範囲エンドポイントに柔軟性を提供するために使用される。

開示される方法及び組成物のために使用され得るか、それらと併用して使用され得るか、それらの調製において使用され得るか、またはそれらの産物である、材料、組成物、及び構成要素が開示される。これら及び他の材料は本明細書において開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合に、これらの化合物の各々の様々な個別の及び集合的な組み合わせ及び順列の具体的な参照が明示的に開示されなくてもよいが、各々は本明細書において具体的に企図及び記載されることが理解される。例えば、方法が開示及び検討され、当該方法中に含まれる多数の分子へ行われ得る多数の修飾が検討されるならば、当該方法の各々及びすべての組み合わせ及び順列ならびに可能な修飾は、相反することが具体的に示されない限り、具体的に企図される。同様に、任意のサブセットまたはこれらの組み合わせも具体的に企図及び開示される。この概念は、開示される組成物を使用する方法におけるステップが挙げられるがこれらに限定されない、本開示のすべての態様へ適用される。したがって、遂行され得る様々な追加のステップがあるならば、任意の具体的な方法ステップまたは開示される方法の方法ステップの組み合わせにより、これらの追加のステップのうちの各々が遂行され得ること、及び、各々のかかる組み合わせまたは組み合わせのサブセットは具体的に企図され、開示されたと判断されるべきであることが理解される。

本明細書に引用される出版物及びそれらが引用される資料は、参照によりそれらの全体が具体的に本明細書に組み込まれる。

本開示は、本発明の例示的かつ非限定的な態様を提供する以下の実施例を参照することによりさらに十分に理解されることになる。

上述のように、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）は、運動失調、心筋症、及び糖尿病を特徴とする稀なミトコンドリア障害である。現在、この疾患の治療法は存在しない。ＡＡＶベースのアプローチを開発する文脈において、カプシドを標的とする脆弱な細胞型の同定とともに、フラタキシン（ＦＸＮ）をコードする治療カセットを設計することの複雑さは、依然として分かりにくい。

以下の実施例は、ＦＡの治療のための組成物及び方法を記載する。ＦＡは、例えば、ＧＡＡトリヌクレオチド反復対立遺伝子のホモ接合細胞における増加したが調節されたＦＸＮ発現を促進するウイルスベクターを介して、ＦＸＮ遺伝子の発現を調節することによって治療され得る。ＦＸＮヌクレオチド配列は、ＦＸＮ発現を調節することができる５’ＵＴＲ ＦＸＮに作動可能に連結され得る。調節されたＦＸＮ発現は、ＦＸＮ発現の調節された生理学的レベルを達成し、上昇したレベルのＦＸＮ発現を回避するために所望される。調節されない上昇した生理学的レベルのＦＸＮは、ミトコンドリア呼吸の低下をもたらし得、これは、ミトコンドリア毒性を引き起こす。記載される組成物及び方法は、本明細書に記載及び例示されるように、ＦＡの治療のための新規の戦略を表す。

実施例１－ＦＸＮ遺伝子発現に対する５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の影響
ヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現が、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の包含によって影響を受け得るかどうかを決定するために、実験を行った。

組換えＡＡＶベクターゲノムをコードするプラスミドベクターの４つのバージョンを構築した。第１のバージョン（配列番号７）は、デスミンプロモーター配列（配列番号４）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含み、デスミンプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたデスミン５’ＵＴＲ（配列番号２２）をさらに含む。第２のバージョン（配列番号８）は、デスミンプロモーター配列（配列番号４）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含み、デスミンプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたデスミン５’ＵＴＲ（配列番号２２）及び５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）をさらに含む。第３のバージョン（配列番号９）は、ヒトＦＸＮヌクレオチド配列を有するＣ末端Ｖ５エピトープタグインフレームをさらに含むことを除いては、第１のバージョンに類似する。第４のバージョン（配列番号１０）は、ヒトＦＸＮヌクレオチド配列を有するＣ末端Ｖ５エピトープタグインフレームをさらに含むことを除いては、第２のバージョンに類似する。

Ｓａｎｇｅｒ配列決定を介して４つのプラスミドベクターバージョンの正確な構築を確認した後、４つのバージョンの各々を、製造業者の指示に従って市販のトランスフェクション試薬を使用して、別個のＨＥＫ２９３細胞集団にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に、４つの細胞集団を収集し、総タンパク質をＲＩＰＡ緩衝液中で採取した。総タンパク質（全細胞抽出物）の試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングに供した。図４に示すように、Ｖ５エピトープ（α Ｖ５）、ヒトフラタキシン（αフラタキシン）に対する市販の一次抗体、ならびに負荷対照として、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素）（α ＧＡＰＤＨ）を使用して、ブロットをプローブした。続いて、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を用いて、ブロットをプローブした。

レーン１は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有しないヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第１のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の結果を示す。第１のプラスミドバージョンにはＶ５エピトープが含まれていないため、抗Ｖ５ブロットにシグナルは見られなかった。さらに、シグナルが、抗フラタキシンブロットに見られた。

レーン２は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有するヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第２のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の結果を示す。第２のプラスミドバージョンにはＶ５エピトープが含まれていないため、抗Ｖ５ブロットにシグナルは見られなかった。

さらに、シグナルが、抗フラタキシンブロットに見られた。レーン２の抗フラタキシンシグナルは、レーン１のシグナルよりも強度が低かった。

レーン３は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有さず、Ｖ５エピトープタグを有するヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第３のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の結果を示す。シグナルが、抗Ｖ５ブロットに見られ、シグナルが、抗フラタキシンブロットに見られた。

レーン４は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有し、かつＶ５エピトープタグを有するヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第４のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の結果を示す。シグナルが、抗Ｖ５ブロットに見られ、シグナルが、抗フラタキシンブロットに見られた。レーン４の抗フラタキシンシグナル及び抗Ｖ５シグナルは、レーン３の対応するシグナルよりも強度が低かった。

レーン５は、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞の結果を示す。内因性フラタキシン及びＧＡＰＤＨからのシグナルは、それぞれ、抗フラタキシン及び抗ＧＡＰＤＨブロットに見られる。

これらのデータは、ヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現が、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の包含によって調節され得るという証拠を提供する。驚くべきことに、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列は、５’ＵＴＲ配列を有しない構築物と比較して、プラスミド構築物によってコードされるフラタキシンタンパク質の発現を低下させることが見出された。

実施例２－ＦＸＮ遺伝子発現に対する５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の影響
ニューロン由来細胞におけるヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現が、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の包含によってどのように影響され得るかをさらに調査するために、実験を行った。

実施例１と同様に、別々の細胞集団を、４つのプラスミドバージョンの各々でトランスフェクトした。本実施例において、実施例１のＨＥＫ２９３細胞の代わりに、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞（神経芽腫細胞株）を使用した。トランスフェクション及び免疫ブロッティングを、実施例１に記載されるように行った。

図５を参照すると、レーン１は、トランスフェクトされていないＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞の免疫ブロットの結果を示す。内因性フラタキシン及びＧＡＰＤＨからのシグナルは、それぞれ、抗フラタキシン及び抗ＧＡＰＤＨブロットに見られる。

レーン２は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有するヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第２のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞の結果を示す。第２のプラスミドバージョンにはＶ５エピトープが含まれていないため、抗Ｖ５ブロットにシグナルは見られなかった。さらに、シグナルが、抗フラタキシンブロットに見られた。

レーン３は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有しないヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第１のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞の結果を示す。第１のプラスミドバージョンにはＶ５エピトープが含まれていないため、抗Ｖ５ブロットにシグナルは見られなかった。さらに、シグナルが、抗フラタキシンブロットに見られた。レーン２の抗フラタキシンシグナルは、レーン３のシグナルよりも強度が低かった。

レーン４は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有し、かつＶ５エピトープタグを有するヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第４のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞の結果を示す。シグナルが、抗Ｖ５ブロットに見られ、シグナルが、抗フラタキシンブロットに見られた。[０００１６０]レーン５は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有さず、Ｖ５エピトープタグを有するヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第３のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞の結果を示す。シグナルが、抗Ｖ５ブロットに見られ、シグナルが、抗フラタキシンブロットに見られた。レーン４の抗フラタキシンシグナル及び抗Ｖ５シグナルは、レーン５の対応するシグナルよりも強度が低かった。

これらのデータは、ヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現が、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の包含によって調節され得るという証拠を提供する。驚くべきことに、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列は、５’ＵＴＲ配列を有しない構築物と比較して、プラスミド構築物によってコードされるフラタキシンタンパク質の発現を低下させることが見出された。加えて、ニューロン由来細胞における影響は、実施例１において観察された影響と一致した。

実施例３－ＦＸＮ遺伝子発現に対する５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の影響
筋由来細胞におけるヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現が、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の包含によってどのように影響され得るかをさらに調査するために、実験を行った。

実施例１及び２と同様に、別々の細胞集団を、４つのプラスミドバージョンの各々でトランスフェクトした。本実施例において、実施例１のＨＥＫ２９３細胞の代わりに、Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス筋芽細胞株）を使用した。トランスフェクション及び免疫ブロッティングを、実施例１に記載されるように行った。

図６を参照すると、レーン１は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有しないヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第１のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。第１のプラスミドバージョンにはＶ５エピトープが含まれていないため、抗Ｖ５ブロットにシグナルは見られなかった。さらに、シグナルが、抗フラタキシンブロットに見られた。

レーン２は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有するヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第２のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。第２のプラスミドバージョンにはＶ５エピトープが含まれていないため、抗Ｖ５ブロットにシグナルは見られなかった。さらに、シグナルが、抗フラタキシンブロットに見られた。レーン２の抗フラタキシンシグナルは、レーン１のシグナルよりも強度が低かった。

レーン３は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有さず、Ｖ５エピトープタグを有するヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第３のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。シグナルが、抗Ｖ５ブロットに見られ、シグナルが、抗フラタキシンブロットに見られた。

レーン４は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有し、かつＶ５エピトープタグを有するヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第４のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。シグナルが、抗Ｖ５ブロットに見られ、シグナルが、抗フラタキシンブロットに見られた。レーン４の抗フラタキシンシグナル及び抗Ｖ５シグナルは、レーン３の対応するシグナルよりも強度が低かった。

レーン５は、トランスフェクトされていないＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。内因性ＧＡＰＤＨからのシグナルは、抗ＧＡＰＤＨブロットに見られる。

これらのデータは、ヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現が、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の包含によって調節され得るという証拠を提供する。驚くべきことに、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列は、５’ＵＴＲ配列を有しない構築物と比較して、プラスミド構築物によってコードされるフラタキシンタンパク質の発現を低下させることが見出された。さらに、筋肉由来細胞における影響は、実施例１及び２において観察された影響と一致した。

実施例４－ミトコンドリア機能に対する５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の影響
筋由来細胞におけるヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現が、様々なＦＸＮ構築物を発現する細胞におけるミトコンドリア機能にどのように影響され得るかをさらに調査するために、実験を行った。

実施例１～３と同様に、別々の細胞集団を、４つのプラスミドバージョンの各々でトランスフェクトした。本実施例において、実施例１のＨＥＫ２９３細胞の代わりに、Ｃ２Ｃ１２細胞を使用した。４つのプラスミドバージョンについてのトランスフェクションを、実施例１に記載されるように行った。トランスフェクションから４８時間後、４つの細胞集団を収集し、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）アッセイに供した。ＡＴＰアッセイは、細胞内のＡＴＰ含有量を測定することができ、細胞のミトコンドリアの相対的な健康状態を示すことができる。ミトコンドリア単離後、ルシフェラーゼアッセイを使用してミトコンドリアをアッセイし、各試料中のＡＴＰの量を定量化した。各試料のルシフェラーゼシグナルを、ＡＴＰ濃度の標準曲線で分析し、各試料中の総タンパク質に対して測定した。図７を参照すると、これらのプラスミドでトランスフェクトした細胞のデータを、試料１～４として示す。試料５～７は、それぞれ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするベクター、トランスフェクトされていない細胞、及びオリゴマイシンＡで処理したトランスフェクトされていない細胞でトランスフェクトした細胞についての対照データである。オリゴマイシンＡは、ＡＴＰ合成酵素の阻害剤であり、オリゴマイシンＡで処理した細胞は、ＡＴＰ産生の陰性対照として機能する。

試料１は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有し、かつＶ５エピトープタグを有するヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第４のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。試料１中のＡＴＰ濃度は、試料６のトランスフェクトされていない細胞のＡＴＰ濃度と統計的に異なっていなかった（一元配置分散分析）。

試料２は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有さず、Ｖ５エピトープタグを有するヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第３のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。試料１中のＡＴＰ濃度は、試料２中のＡＴＰ濃度と比較して増加した。

試料２中のＡＴＰ濃度は、試料６のトランスフェクトされていない対照細胞のＡＴＰ濃度と比較して低下した。＊Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析）。

試料３は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有するヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第２のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。試料３中のＡＴＰ濃度は、試料６のトランスフェクトされていない細胞のＡＴＰ濃度と統計的に異なっていなかった（一元配置分散分析）。

試料４は、５’ＵＴＲ ＦＸＮを有しないヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む、第１のバージョンのプラスミドでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。試料３中のＡＴＰ濃度は、試料４中のＡＴＰ濃度と比較して増加した。試料４中のＡＴＰ濃度は、試料６のトランスフェクトされていない対照細胞のＡＴＰ濃度と比較して低下した。＊Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析）。

試料６（トランスフェクトされていない細胞）のＡＴＰ濃度は、試料７（オリゴマイシンＡで処理した細胞）のＡＴＰ濃度よりも有意に増加させ、ＡＴＰの可用性を測定するアッセイの能力を確認した。＊＊Ｐ＜０．０１（一元配置分散分析）。

これらのデータは、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列によって修飾されないヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現が、ミトコンドリア機能に悪影響を及ぼし得るという証拠を提供する。驚くべきことに、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列を含むことは、筋肉由来細胞における悪影響を低減または排除することが見出された。

実施例５－ＦＸＮ遺伝子発現に対する５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の影響
実施例３及び４のＣ２Ｃ１２細胞におけるヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現が、様々なプロモーターとの関連において５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の包含によってどのように影響され得るかをさらに調査するために、実験を行った。

組換えＡＡＶベクターゲノムをコードする５つのプラスミドを構築した。第１のプラスミド（配列番号１１）は、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター配列（配列番号５）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含み、ＣＢＡプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたＣＢＡ ５’ＵＴＲ（配列番号２３）及び５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）をさらに含む。第２のプラスミド（配列番号１２）は、ＣＢＡプロモーター配列（配列番号５）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含み、ＣＢＡプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたＣＢＡ ５’ＵＴＲ（配列番号２３）をさらに含む。第３のプラスミド（配列番号１３）は、デスミンプロモーター配列（配列番号４）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含む。第３のプラスミドは、デスミンプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置された５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列をさらに含む。第４のプラスミド（配列番号８）は、デスミンプロモーター配列（配列番号４）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列を含み、デスミンプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたデスミン５’ＵＴＲ（配列番号２２）及び５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列（配列番号２）をさらに含む。第５のプラスミド（配列番号７）は、デスミンプロモーター配列（配列番号４）に作動可能に連結されたコドン最適化ヒトＦＸＮヌクレオチド配列（配列番号１）を含み、デスミンプロモーター配列とヒトＦＸＮヌクレオチド配列との間に作動可能に配置されたデスミン５’ＵＴＲ（配列番号２２）をさらに含む。

Ｓａｎｇｅｒ配列決定を介して５つのプラスミドの正確な構築を確認した後、５つのバージョンの各々を、製造業者の指示に従って市販のトランスフェクション試薬を使用して、別個のＣ２Ｃ１２細胞集団にトランスフェクトした。

トランスフェクションから４８時間後に、５つの細胞集団を収集し、総タンパク質をＲＩＰＡ緩衝液中で採取した。総タンパク質（全細胞抽出物）の試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングに供した。図８に示すように、ヒトフラタキシンまたはヒト及びマウスフラタキシン（α ＦＸＮ）のいずれかに対する市販の一次抗体、ならびに負荷対照として、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素）（α ＧＡＰＤＨ）を使用して、ブロットをプローブした。続いて、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を用いて、ブロットをプローブした。

図８を参照すると、レーン１は、トランスフェクトされていないＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。内因性フラタキシン及びＧＡＰＤＨからのシグナルは、それぞれ、２つの抗フラタキシンブロット及び抗ＧＡＰＤＨブロットに見られる。

レーン２は、ＣＢＡプロモーター－ＣＢＡ ５’ＵＴＲ－５’ＵＴＲ ＦＸＮ－ヒトＦＸＮヌクレオチド配列構築物を含む、第１のプラスミド（配列番号１１）でトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。レーン１と比較して、レーン２のシグナルが増加した。

レーン３は、ＣＢＡプロモーター－ＣＢＡ ５’ＵＴＲ－ヒトＦＸＮヌクレオチド配列構築物を含む、第２のプラスミド（配列番号１２）でトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。

レーン２と比較して、レーン３のシグナルが大いに増加した。

レーン４は、デスミンプロモーター－５’ＵＴＲ ＦＸＮ－ヒトＦＸＮヌクレオチド配列構築物を含む、第３のプラスミド（配列番号１３）でトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。レーン１と比較して、レーン４のシグナルが増加した。

レーン５は、デスミンプロモーター－デスミン５’ＵＴＲ－５’ＵＴＲ ＦＸＮ－ヒトＦＸＮヌクレオチド配列構築物を含む、第４のプラスミド（配列番号８）でトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。レーン４と比較して、レーン５のシグナルが減少した。レーン１と比較して、レーン５のシグナルは、同様のレベルのシグナルであった。

レーン６は、デスミンプロモーター－デスミン５’ＵＴＲ－ヒトＦＸＮヌクレオチド配列構築物を含む、第５のプラスミド（配列番号７）でトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の結果を示す。レーン６のシグナルは、レーン１、４、または５のうちのいずれか１つと比較して増加した。

これらのデータは、ヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現が、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の包含によって調節され得るという証拠を提供する。驚くべきことに、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列は、５’ＵＴＲ配列を有しない構築物と比較して、プラスミド構築物によってコードされるフラタキシンタンパク質の発現を低下させることが見出された。さらに、ＦＸＮ発現に対する５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の影響が、種々のプロモーターで一貫しているという証拠が提供される。

実施例６－ＦＸＮ遺伝子発現に対する５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の影響
ヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現が、様々なプロモーターとの関連において５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の包含によってどのように影響され得るかをさらに調査するために、実験を行った。本実験では、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて転写レベルで発現を調べた。

実施例５でトランスフェクトして採取した細胞も、ＲＮＡ試料を抽出するために使用した。次いで、ＲＮＡ試料を逆転写に供し、得られたｃＤＮＡ試料をｑＰＣＲに供した。実施例５に記載されるように、同じ５つのプラスミドを、本実施例において使用した。図９を参照すると、ベータアクチン（Ａｃｔｂ）及びＦＸＮ（Ｆｘｎ）の両方の相対発現を決定した。

トランスフェクトされていない細胞から抽出したＲＮＡに基づいた試料１は、基礎レベルのＡｃｔｂ発現及びＦＸＮ発現の両方を示した。

試料２は、ＣＢＡプロモーター－ＣＢＡ ５’ＵＴＲ－ヒトＦＸＮヌクレオチド配列構築物を含む、第２のプラスミド（配列番号１２）でトランスフェクトした細胞から抽出したＲＮＡに基づいていた。試料２は、トランスフェクトされていない細胞と比較して、基礎レベルのＡｃｔｂ発現及び増加したレベルのＦＸＮ発現を示した。

試料３は、ＣＢＡプロモーター－ＣＢＡ ５’ＵＴＲ－５’ＵＴＲ ＦＸＮ－ヒトＦＸＮヌクレオチド配列構築物を含む、第１のプラスミド（配列番号１１）でトランスフェクトした細胞から抽出したＲＮＡに基づいていた。試料３は、トランスフェクトされていない細胞と比較して、基礎レベルのＡｃｔｂ発現及び増加したレベルのＦＸＮ発現を示したが、試料２と比較して、低下したレベルのＦＸＮ発現を示した。

試料４は、デスミンプロモーター－５’ＵＴＲ ＦＸＮ－ヒトＦＸＮヌクレオチド配列構築物を含む、第３のプラスミド（配列番号１３）でトランスフェクトした細胞から抽出したＲＮＡに基づいていた。試料４は、トランスフェクトされていない細胞と比較して、基礎レベルのＡｃｔｂ発現及び増加したレベルのＦＸＮ発現を示した。

試料５は、デスミンプロモーター－デスミン５’ＵＴＲ － ５’ＵＴＲ ＦＸＮ －ヒトＦＸＮヌクレオチド配列構築物を含む、第４のプラスミド（配列番号８）でトランスフェクトした細胞から抽出したＲＮＡに基づいていた。試料５は、基礎レベルのＡｃｔｂ発現及び基礎レベルのＦＸＮ発現を示した。

試料６は、デスミンプロモーター－デスミン５’ＵＴＲ－ヒトＦＸＮヌクレオチド配列構築物を含む、第５のプラスミド（配列番号７）でトランスフェクトした細胞から抽出したＲＮＡに基づいていた。試料６は、トランスフェクトされていない細胞、試料４、及び試料５と比較して、基礎レベルのＡｃｔｂ発現及び増加したレベルのＦＸＮ発現を示した。

これらのデータは、ヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現が、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の包含によって調節され得るという証拠を提供する。驚くべきことに、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列は、５’ＵＴＲ配列を有しない構築物と比較して、プラスミド構築物によってコードされるフラタキシンタンパク質の発現を低下させることが見出された。さらに、ＦＸＮ発現に対する５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の影響が、種々のプロモーターで一貫しているという証拠が提供される。

試料６は、デスミンプロモーター－デスミン５’ＵＴＲ－ヒトＦＸＮヌクレオチド配列構築物を含む、第５のプラスミド（配列番号７）でトランスフェクトした細胞から抽出したＲＮＡに基づいていた。試料６は、トランスフェクトされていない細胞、試料４、及び試料５と比較して、基礎レベルのＡｃｔｂ発現及び増加したレベルのＦＸＮ発現を示した。

これらのデータは、ヒトＦＸＮヌクレオチド配列の発現が、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の包含によって調節され得るという証拠を提供する。驚くべきことに、５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列は、５’ＵＴＲ配列を有しない構築物と比較して、プラスミド構築物によってコードされるフラタキシンタンパク質の発現を低下させることが見出された。さらに、ＦＸＮ発現に対する５’ＵＴＲ ＦＸＮ配列の影響が、種々のプロモーターで一貫しているという証拠が提供される。

実施例７
実施例１～６において得られた結果と一致して、１）組織制限プロモーターまたはユビキタスプロモーター、及び２）ＦＸＮの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の有無にかかわらずＦＸＮを含有するカセットを設計し、試験した。５’ＵＴＲ領域は、この領域の固有の構造及び翻訳開始への影響（すなわち、遺伝子発現の転写後制御）に基づいて、調節発現要素として選択された。インビトロ実験は、自己相補的末端反復（ＴＲ）プラスミドにおいて、改変されたデスミン（ＤＥＳ）またはニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターによって駆動されるフラタキシンの５’ＵＴＲ領域の有無にかかわらず、トランスフェクションを媒介するフラタキシンの過剰発現の影響を実証した。ＡＡＶ－Ｄｅｓ駆動型５’ＵＴＲ－ＦＸＮ（ＡＡＶ－Ｄｅｓ５’）過剰発現のインビボ評価を行って、ＡＡＶを媒介する５’ＵＴＲ－ＦＸＮの過剰発現が、それぞれ、大槽及び筋肉内（脛骨前筋；ＴＡ）を介して投与される、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び骨格筋を標的とする静脈内注射または二重注射経路後の野生型（すなわち、正常）マウスにおいて毒性をもたらすかどうかを決定した。

ＦＡに対する遺伝子治療を開発する際には、ＦＸＮの過剰発現が毒性につながるかどうかを決定し、発現が毒性を制限し、全体的な治療的利益を増強するように調節され得るかどうかを決定することが重要である。以前の研究では、ＦＸＮ毒性は、翻訳開始（すなわち、遺伝子発現の転写後制御）に影響を及ぼすための調節発現要素として機能する非翻訳領域（ＵＴＲ）を含まない遺伝子のコード領域を使用したことが報告されていた。したがって、ＦＸＮの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含むことによって、遺伝子発現を制御することができるかどうかを試験した。

加えて、ヒト線維芽細胞株を用いたインビトロでの翻訳効率の評価のために、２つの異なるプロモーター、改変ヒトデスミン（ＤＥＳ）プロモーター（Ｐａｃａｋ ｅｔ ａｌ．“Ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｒａ－ｖａｓｃｕｌａｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｍｉｃｅ，” Ｇｅｎｅｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｔｈｅｒ ６，１３（２００８））及びニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター（Ｓｈｅｖｔｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ：ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，９０：５３－５９（２００５））を試験して、ＦＸＮの発現を駆動した。ＤＥＳは、心筋、骨格筋、及びＣＮＳにおけるその高い形質導入で知られているが、ＣＢＡは、すべての細胞型における高い形質導入につながる強力な遍在性プロモーターである。２つの異なるプロモーターを比較することにより、ＦＸＮ毒性を誘発することなく、ＦＸＮレベルの翻訳効率を最適化することを目的とした。インビボでのＦＸＮの過剰発現を評価するために、野生型マウス（ＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮ）（プラスミドＬＰ１００１）におけるＤＥＳ駆動型５’ＵＴＲ－ＦＸＮの送達に、ＡＡＶ８トリプルカプシド変異体、ＡＡＶ８ＴＭ（配列番号６１）を使用した（Ｇｉｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．“Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ＩＩＩＢ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｎｅｏｎａｔａｌ ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＡＡＶ８ ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｙ ５， ９ ｏｒ ｒｈ１０．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１６；２３（３）：２６３－２７１）。これをインビトロ研究と並行して行い、ＦＸＮの過剰発現後の潜在的な毒性を評価した。

薬剤
ヒトコドン最適化フラタキシン（６３０ｂｐ）３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲヒトフラタキシン（それぞれ、１４９０ｂｐ及び２２１ｂｐ）を、自己相補ｐＴＲプラスミド中でクローニングした。目的となる遺伝子（ＧＯＩ）を、改変ヒトデスミン（ＤＥＳ）プロモーターまたはニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターによって駆動した（表２を参照のこと）。プラスミドマップを、図１０Ａ～Ｅに示す。各プラスミドの核酸配列についての配列番号も、表２に提供する。

ＧＯＩを、統合ＤＮＡ技術（ＩＤＴ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）によって合成し、制限酵素によってｐＴＲ－プラスミドにクローニングした。ｐＬＰ１００１を、制限酵素ＫｐｎＩ及びＳａｃＩを使用して、「ＥｎｈＤｅｓＰｒｏ－イントロン－５’ＵＴＲｃｏＦＸＮｖ１」断片をｐｄｓ ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＥＧＦＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：受託番号ＭＫ２２５６７２（配列番号２９））をクローニングすることによって生成した。ｐＬＰ１００４を、制限酵素部位ＫｐｎＩ及びＳａｃＩを使用して、「ＥｎｈＤｅｓＰｒｏ－イントロン－ｃｏＦＸＮｖ１」をｐｄｓ ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＥＧＦＰにクローニングすることによって合成した。ｐＬＰ１００２を、ｃｏＦＸＮｖ１をＡｇｅ１及びＳａｃ１制限酵素部位と合成することによって完了し、次いで、ｐｄｓ－ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＥＧＦＰにクローニングした。ｐＬＰ１００３を、５’ＵＴＲ－イントロンを合成し、ＳａｌＩ及びＳｐｅＩを使用して、それをＬＰ１００２にクローニングすることによって完了した。（Ｌａｃｅｒｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｌａｂ ｎｏｔｅｂｏｏｋｓ ＬＢＮ２４ ＬＢＮ２５，ＬＢＮ０８）

すべてのプラスミドを、クローニングし、形質転換し、制限酵素消化物Ｓｍａ ＩによってＬａｃｅｒｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ，ＵＳＡ）で検証した。配列検証（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）後、プラスミドを、大規模なプラスミド産生のためにＡｌｄｅｖｒｏｎ（Ｆａｒｇｏ，ＮＤ，ＵＳＡ）に送った。ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮ（ＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮ）を発現するＡＡＶ８ＴＭウイルスを、フロリダ大学のパウエル遺伝子治療センター（ＰＧＴＣ）、ベクターコアラボラトリー（Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，ＦＬ，ＵＳＡ）の接着ＨＥＫ２９３細胞におけるトリプルトランスフェクションによって２つの細胞スタック（参照番号７０４７及び７０４８）で産生した。２つの細胞スタックをプールし、ウイルスを、イオジキサノール勾配遠心分離、続いてＡＡＶＸカラムによって精製し、ＰＧＴＣでドットブロットによって力価化した（表３）。ベクター力価はまた、ＬａｃｅｒｔａにおけるデジタルドロップＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によっても決定された。しかしながら、ドットブロットは、デジタルドロップＰＣＲと比較した場合、力価の上昇及び精度の低下を示すことが報告されている。したがって、インビボ投与を、ｄｄＰＣＲ力価によって計算した。

投与及び曝露
ＬＴＸ４０１．３：正常な野生型マウスにおけるＦＸＮの過剰発現からの潜在的毒性を評価するためのＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮの静脈内投与
各動物（ｎ＝３）は、最終体積１００μＬの５Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮの単回ボーラス注射を、頸静脈を通して受けた。ウイルスを、ＰＢＳ＋０．００１％のプルロン酸（賦形剤）中で希釈することによって調製して、最終用量製剤を得た。この研究において、未処置の年齢を適合させた対照動物も使用した。

ＬＴＸ４０１．４：正常な野生型マウスにおけるＦＸＮの過剰発現からの潜在的な毒性を評価するための、大槽内及び筋肉内注射によるＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮの二重投与
大槽内（ＩＣＭ）注射に関して、雌マウスは、１Ｅ＋１１ｖｇ（ｎ＝３）の単回注射を受け、雄は、１０μｌの最終体積で合計１．５Ｅ＋１１ｖｇ（ｎ＝３）を受けた。ウイルスを、賦形剤中で希釈して、最終用量製剤を得た。加えて、これらのマウスは、３つの異なる用量（３．７０Ｅ＋８、８．２Ｅ＋８、または１．９２Ｅ＋９ｖｇ／ｍｇの前脛骨筋（ＴＡ））で筋肉内注射（ＩＭ）を受けた。各用量を、１匹の雄及び１匹の雌マウスの右及び左のＴＡに注入した。投薬量を計算するために、ＴＡ筋肉重量は、全体重の１０％であると仮定した。すべてのＩＭ注射を、賦形剤中の十分な希釈量により、最終体積５μｌまで調製した。１匹の動物に、１０μＬの賦形剤を処置対照として注入した。さらに、比較のために、未処置の年齢を適合させた対照動物が含まれた。

研究目的及び論理的根拠
この一連の実験の全体的な目標は、ＦＸＮの過剰発現の潜在毒性を決定することであった。加えて、ヒト線維芽細胞株を用いたインビトロ実験を実施して、ＦＸＮの上流に５’非翻訳領域を添加することにより、遺伝子発現が調節され、以前に報告されたように、任意の潜在的な毒性が低減するという仮説を試験した。インビボ実験は、複数の投与経路及び投薬量を使用して、正常な野生型マウスにおける生体内分布及び潜在毒性を評価した。合わせて、このデータは、遺伝子発現、潜在毒性、及びカプシド生体内分布の調節の支援を提供する。

研究設計
ヒト線維芽細胞毒性分析
２つの健常な対照及び２つの患者線維芽細胞株（表４）を、表２に列挙したフラタキシンプラスミドでトランスフェクトした。プラスミドトランスフェクション後、細胞毒性（ＤＮＡ含有量によって測定）、ＡＴＰ定量（ミトコンドリア状態）、及びヒトＦＸＮのウエスタン免疫ブロット及びＥＬＩＳＡについてアッセイを行った。

ＬＴＸ４０１．３：正常な野生型マウスにおけるＦＸＮ過剰発現からの潜在的毒性を評価するためのＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮの静脈内投与
ＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮ（ＡＡＶ－ＤＥＳ５’）の静脈内投与のための実験的設計を、表５に概説する。野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＪＡＸ、０００６６４）を、注射から２８～３２日後に採取し、以下の表８に記載するように組織を収集した。組織を組織学またはＥＬＩＳＡによるＦＸＮ検出のために処理して、生体内分布、ヒトフラタキシンタンパク質発現、またはベクター投与後の明らかな毒性を決定した。

ＬＴＸ４０１．４：正常な野生型マウスにおけるＦＸＮの過剰発現からの潜在的な毒性を評価するための、大槽内及び筋肉内注射によるＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮの二重投与
各性別の３匹の動物に、表６に概説される実験的設計に従って、単一のＩＣＭ用量に加えて、３つのＩＭ用量のＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮ（ＡＡＶ－ＤＥＳ５’）のうちの１つを注射した。対照組織については、各性別の１匹の動物にのみ賦形剤を注射し、各性別の１匹の動物を未処置（野生型）とした。動物を、ＡＡＶ投与から２８～３２日後に採取した。組織を、セクション４．５．１、表９に従って採取した。組織を、組織学及びＥＬＩＳＡによってヒトＦＸＮについて分析した。

ミトコンドリア機能の毒性及び潜在的な破壊に対するそれらの影響を理解するためのヒト線維芽細胞株におけるフラタキシンの過剰発現の分析
ヒト線維芽細胞の細胞培養
フリードライヒ運動失調症患者（識別番号ＧＭ０４０７８及びＧＭ０３８１６）及び健常なドナー（識別番号ＧＭ００９６９及びＧＭ０３６５１）からのヒト線維芽細胞株を、Ｃｏｒｉｅｌｌｅ研究所（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ；表７）から入手し、２０％ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓ１１１５０Ｈ）、５０単位／ｍｌのペニシリン、及び５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，１５１４０－１２２）を含む線維芽細胞増殖培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ， Ｃ－２３０１０）中で培養した。

ヒト線維芽細胞のトランスフェクション
トランスフェクションの約２４時間前、細胞を６ウェルプレートに、ウェル当たり２．５ｍｌの完全増殖培地中、０．８～３．０×１０５細胞／ｍｌの密度で播種した。細胞を、５％ ＣＯ２、３７℃で一晩維持し、翌日、製造業者のプロトコルに従って、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、ＭＩＲ ２３００）を使用して、滴定実験のための１．２５、２．５、または５μｇのプラスミド、及びすべての他のインビトロ実験（表２に列挙される）における５μｇのプラスミドでトランスフェクトした。

増殖アッセイによるヒト線維芽細胞における細胞毒性の測定
細胞を、細胞リフターでトランスフェクションした２４時間後に採取し、次いで計数し、５，０００細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルプレートに播種した。翌日、ＣｙＱＵＡＮＴ（商標）細胞増殖アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ７０２６）を、製造業者のプロトコルに従って実施した。

ヒト線維芽細胞のミトコンドリア画分におけるＡＴＰ含有量の測定
Ｐｒｅｂｌｅらに言及されているように、細胞を採取し、ミトコンドリア単離のために処理した（“Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，” Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１４；（９１）：ｅ５１６８２）。ミトコンドリア画分のタンパク質濃度を、ＤＣアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、５０００１１２）によって測定した。ＡＴＰ含有量を、ＡＴＰｌｉｔｅ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、６０１６９４３）で測定した。このアッセイでは、発光は、試料中のＡＴＰ濃度に比例する。簡言すれば、単離されたミトコンドリア（１０μｌ）を、９６ウェルプレートに播種し、次いで哺乳動物細胞溶解液（５０μｌ）で溶解し、ミトコンドリアを溶解し、ＡＴＰを放出した。発光は、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して測定した。標準曲線を、製造業者のプロトコルに従って生成し、各試料のＡＴＰ濃度を線形回帰分析によって得た。ＡＴＰ含有量を、ミトコンドリアタンパク質濃度に対して正規化した。Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ．“Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ＰＹＲＯＸＤ１ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ Ｓａｕｄｉ Ａｒａｂｉａ ａｎｄ Ｓｕｄａｎ，” Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１８；５０（１１）：９２９－９３９を参照のこと。

ヒト線維芽細胞のミトコンドリア画分におけるヒトＦＸＮの定量化
タンパク質濃度を、洗剤適合性（ＤＣ）タンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって決定した。ウエスタン免疫ブロットについては、２００μｇの総タンパク質量のミトコンドリア抽出物を、４～１２％のトリシン－ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分解し、次いでニトロセルロース膜（２０μｍ）上に移した。膜を５％乳／ＴＢＳＴ（０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、８ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｂａｓｅ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１５４ｍＭ ＮａＣｌ）でブロックし、次いで、１：１０００の希釈で一次マウス抗フラタキシン抗体（上清）、及び１：１０００の希釈で抗ＧＡＰＤＨ（２１１８Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でプローブした。膜を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体とともにインキュベートし、ｉＢｒｉｇｈｔ ＣＬ１０００上で化学発光（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって可視化した。培養線維芽細胞におけるヒトフラタキシンレベルを決定するために、ミトコンドリア抽出物を、製造業者の指示に従ってヒトフラタキシンＥＬＩＳＡキット（ａｂ１７６１１２）を使用してアッセイした。

密度分析
ウエスタンブロット画像の定量化は、ＩｍａｇｅＪ（Ｇａｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．“Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓ：Ｐｉｔｆａｌｌｓ ｏｆ ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ．ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＳＩＳ，３０：１８４５－１８５５．ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｌｐｓ．２００８００７２０）を使用して実施した。ＦＸＮレベルを、ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。

患者の線維芽細胞の間接免疫染色
線維芽細胞を、示されるように、プラスミドでトランスフェクションした後、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ番号＃３ＭＴ１００１３ＣＶ）中の１０％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＢ－４０２３４Ａ）で処理したチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１２－５６５－８）に播種した。４日目に、成長培地を除去した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いでＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドで１０分間室温で固定し、ＰＢＳ中で３回連続して洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中の０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１０分間透過させ、ＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清の添加によって６０分間ブロックした。１：１００の希釈のマウス抗ヒトＦＸＮ（Ｐｕｃｃｉｏ）、及び１：１５０の希釈のウサギ抗Ｔｏｍｍ２０（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈ，４２４０６Ｓ）とともに４℃で一晩インキュベートした後、細胞を広範囲に洗浄し、ヤギ抗マウス４８８及びヤギ抗ウサギ５９４（各１：１０００）の二次抗体と共にさらにインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩを有するＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）Ｖｉｂｒａｎｃｅ包埋剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈ－１２００－１０）を使用して、カバースリップを顕微鏡スライドに取り付けた。顕微鏡解析は、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８１０蛍光顕微鏡を使用して行った。免疫染色も未処理の対照線維芽細胞で行って、フラタキシンシグナルの特異性を決定し、抗体媒介性ＦＸＮ検出を最適化した。

野生型マウスにおけるＦＸＮの過剰発現のインビボ評価
ウイルス力価
ＡＡＶ８ｔｍ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮの力価（ｖｇ／ｍＬ）を、ＰＧＴＣでのドットブロット、及びＢｉｏ－ＲａｄからのＱＸ２００ドロップレットデジタルＰＣＲシステム（ＱＸ２００ドロップレットジェネレータ及びＱＸ２００ドロップレットリーダーＢｉｏ－Ｒａｄ）によって決定した。ｄｄＰＣＲについて、試料をヌクレアーゼフリー水中で１Ｅ３～１Ｅ２ｖｇ／ウェルに連続希釈し、試料が分析の最大範囲（１Ｅ４ｖｇ／ウェル）を下回っていることを確認した。液滴形成に十分な体積を確保するために、２５μＬのマスターミックス及び試料の総体積を調製した。反応混合物は、プローブ用の１×ｄｄＰＣＲスーパーミックス（ｄＵＴＰなし；Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１８６３０２４）、９００ｎＭのＢＧＨ順方向フォワード５’ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＴ ＣＴＧ ＴＴＧ Ｔ ３’（ＩＤＴ）（配列番号３０）及び逆５’ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＣＡ ＣＣＴ ＴＣＣ Ａ ３’（ＩＤＴ）（配列番号３１）プライマー、２５０ｎＭのＢＧＨプローブ５’ＦＡＭ／ＴＣＣ ＣＣＣ ＧＴＧ／ＺＥＮ／ ＣＣＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＣＣ／ＡＢｋＦＱ ３’（ＩＤＴ）（配列番号３２）、ならびにヌクレアーゼフリー水中で希釈した５μＬの試料を含む。液滴調製前に、混合物をボルテックスした。ＱＸ２００ドロップレットジェネレータ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、２０μＬの試料混合物をＤＧ８カートリッジ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１８６４００８）の中心ウェルに添加し、続いて７０μＬのプローブ用の液滴生成油（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１８６３００５）をカートリッジの適切なウェルに添加することによって、液滴を形成した。カートリッジをＤＧ８ガスケット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１８６３００９）で覆い、ドロップレットジェネレータに入れた。新たに形成された液滴（４０μＬ）を慎重にピペットし、ｄｄＰＣＲ ９６ウェルプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１２００１９２５）に移し、貫通可能な箔ヒートシール（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１８１４０４０）で覆い、ＰＸ１ ＰＣＲプレートシーラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に入れ、１８０℃で５秒間熱シールした。プレートを直ちに除去し、９５℃で１０分間、Ｃ１０００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に入れ、次いで９５℃で３０秒間、５７．４℃で１分間、及び７２℃で１５秒間、４２サイクル、続いて９８℃で１０分間、及び実行が停止するまで１２℃の無期限の保持状態にした。ＰＣＲが完了した後、プレートをＱＸ２００ドロップレットリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移し、絶対定量分析を行った。結果を濃度として報告し、２０μＬのウェル当たりにコピーした。１ｍＬ当たりのベクターゲノム数を決定するために、式｛（（濃度＊総体積初期反応）／μＬの試料）＊１０００＊希釈係数｝］を使用した。

外科手術室の設定
外科的処置前に、動物準備領域、外科領域、及び回復／術後領域の３つの指定されたステーションで手術空間を準備した（Ｇａｋｕｂａ ｅｔ ａｌ．， “Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ “Ｇｌｙｍｐｈａｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ”，” Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，８（３），７１０－７２２（２０１８））。動物準備領域：滅菌された手術野の微生物汚染の可能性を低減するために、動物準備領域を外科領域から離れた指定されたテーブル上に配置した。２％イソフルラン（１Ｌ Ｏ２）を使用してマウスを麻酔した（Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ＡＡＶ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｕｌｔ Ｐｏｍｐｅ ｍｉｃｅ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，２０１５，１５００７，ＩＳＳＮ ２３２９－０５０１，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１５．７）を、気化器システムを使用してチャンバーを介して投与し、動物を計量し、その毛髪をクリップした。次いで、動物を、外科領域に移動した。

外科領域
外科領域の装置は、ステンレス鋼製のテーブル、移動式気化器麻酔システム、ガラス製のビーズ滅菌器、定位デバイス、及び注入ポンプで構成され、すべての表面は、手術前に７０％のアルコールで洗浄した。ステレオタックスの下に滅菌ドレープを配置した。デジタル読み出しを有する加熱パッドを、動物を配置するステレオタックス上に配置し、動物が加熱パッドに直接接触するのを防ぐために、子犬用パッドを加熱パッドに一度巻き付けた。クロルヘキシジン外科用洗浄液を含む検体カップ及び滅菌生理食塩水を検体カップである２つの検体カップは、オートクレーブした外科用器具と同様に滅菌ドレープの上に置かれた。外科用器具を石鹸及び水で洗浄し、乾燥させ、動物の間にあるガラスビーズ滅菌器で滅菌した。オートクレーブした器具を使用し、新しいオートクレーブした器具のセットに切り替える前に最大１０回洗浄した。

手術後の回復領域
外科的処置が完了すると、動物は、モニタリング及び術後ケアのために清潔なケージに移動した。このケージは、ケージの半分が回復する動物の低体温を最小限に抑えるためにデジタル読み出しを備えた加熱パッド上に置かれるように設置された。ケージと加熱パッドの間には、直接接触を防ぐための子犬用パッドがあった。回復ステーションは、外科医／助手と十分な距離があり、回復状況を監視することができた。動物が単独で正常に動くことができ、苦痛または痛みの兆候を示さず、それ以外は明るく、警戒心が強く、応答性があり、動物は、ケージラックに戻された。術後最初の５日間、毎日動物を観察し、その後、合併症を監視するため、採取まで少なくとも１日おきに動物を確認した。

ＬＴＸ－４０１．３：野生型マウスへのＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮの静脈内注射
術前マウス調製
調製ステーションでは、承認されたＩＡＣＵＣプロトコルに概説されているように気化したイソフルランを使用して、動物を麻酔し、次いで鎮痛剤（リマジル）投与を計算するために体重（ｇ）を測定した。脱毛クリーム（Ｎａｉｒ（商標））を使用して、首／喉の領域から慎重に毛髪を除去し、動物を外科領域に移した。

外科的設定
手術前に、動物に、１ｍＬの乳酸リンガー（術中の液体損失を置き換えるため）及び１０ｍｇ／ｋｇ用量の鎮痛剤（リマジル）を皮下投与した。外科的処置を開始するために、動物を仰臥位で定位ステージに置き、顔を麻酔フェイスマスクに上向きに配置した。麻酔フェイスマスクを使用して頭部を上向きの位置に保持し、前足を緩やかに下向きに引き、テープで所定の位置に固定して、動物の首を露出させ、汚染された足を外科領域から遠ざけた。気化したイソフルランの流れを術前ステーションの誘導チャンバーから麻酔マスクに移した。麻酔面は、呼吸及び足先ペダル応答を観察することによって手術中に頻繁に評価され、イソフルランレベルは、それに応じて調整された。

動物の適切な位置決め後、毛髪を除去した領域の中心から開始し、末梢に向かって外側に働くクロルヘキシジン及び０．９％の滅菌生理食塩水の交互にらせん状の外向きスクラブを使用して、外科的部位を無菌的に調製し、これを少なくとも３回繰り返し、または綿棒にゴミが見られなくなるまで繰り返した。領域を滅菌した後、滅菌した外科用ハサミ及び鉗子を用いて皮膚を２ｃｍ切開し、頸静脈を露出させた。頸静脈は、動物の頸部の切開部分から表層結合組織及び脂肪組織をそっと取り除くことによって位置を確認した。次いで、動物に注射する準備が整った。

注射
頸静脈を外科医に曝露すると、プライミングされ、予め充填された２９ゲージのインスリン注射器１００μｌの希釈されたウイルスを、針のベベルを上向きにして静脈に挿入した。任意のウイルスを注入する前に注射器を吸引し、血流が注射器に逆流していないことを確認した。注射器に血液が吸い込まれていない場合は、この針を再配置し、再度確認した。それでも返り血がない場合は、針を外し、新たに試みた。過度の出血が生じた場合は、滅菌綿棒を使用して、止血するまで静脈を圧迫した。万が一、注射前に静脈が使用できないようであれば、その部位を縫合し、外科医は反対側の頸部に注射を行ったので、このことを手術記録に記載した。注入が完了したら、注射器をゆっくり戻し、逆流及び出血を防ぐために滅菌綿棒で注入部位を圧迫し、洗浄し、縫合した。

イソフルランの送達を停止し、動物を定位固定デバイスから取り外した。手術段階で初期回復を確認した後、回復ケージにマウスを移動させた。

ＬＴＸ－４０１．４：野生型マウスへのＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮの大槽内及び筋肉内注射
術前マウス調製
術前調製後に、頭部をイヤバーで固定し、鼻を一体型の麻酔用マスクに入れることにより、動物を定位固定デバイスに設置した。気化したイソフルランの流れを、誘導チャンバーから定位固定麻酔マスクに移した。麻酔面は、呼吸及び足先ペダル応答を観察することによって手術中に頻繁に評価され、イソフルランレベルは、それに応じて調整された。呼吸困難の可能性を最小限に抑えるために、加熱パッドの下にガーゼを置き、背骨がイヤバーの水平線に対して下向き１５°の角度を形成するようにマウスを持ち上げた。次いで、顔面が定位固定アームの垂直線に対して１５°の角度を形成するように麻酔マスクを調整し、これにより、背骨に対する頭部の角度が約９０°になるようにした。この位置では、大槽は動物の体の最も高いところにあり、硬膜は穿刺を可能にし、ウイルスの逆流を防ぐために張られていた。動物の適切な位置決め後、剃髪した領域の中心から開始し、末梢に向かって外側に働くクロルヘキシジン及び０．９％の滅菌生理食塩水の交互にらせん状の外向きスクラブを使用して、外科的部位を無菌的に調製し、これを少なくとも３回繰り返し、または綿棒にゴミが見られなくなるまで繰り返した。領域を滅菌した後、滅菌した外科用ハサミ及び鉗子を用いて皮膚を２ｃｍ切開し、大槽を覆う後頭下筋を露出させた。これらの筋肉は、鉗子を用いて静かに分離し（筋肉の損傷を最小限に抑えるため）、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ Ｓｅｒｒｅｆｉｎｅ血管クランプで横に固定し、硬膜の表面を露出させた。次いで、動物に１ｍＬの乳酸リンガー（手術中に失われた水分を置き換えるために）と、１０ｍｇ／ｋｇ用量の鎮痛剤（リマジル）を皮下投与した。次いで、動物に注射する準備が整った。

外科的設定
３３ゲージの４５°のベベル針を取り付けた２５μｌのハミルトン注射器に、１２μｌの希釈ウイルス（１０μｌを送達するのに十分な体積を確保する）を予め充填し、定位固定アームに取り付けた注入ポンプに入れた。その後、定位固定アームを９０°の垂直角度から外科医に向かって４５°の角度まで移動させた。これにより、針は硬膜に対して垂直になるように位置決めした。次いで、注射器針をマイクロマニピュレータのダイヤルを使って硬膜に触れるように（いかなる血管も避けて）位置決めし、定位固定デバイスのデジタル読み出しをゼロにして硬膜の開始点をマークする。背側ダイヤルを素早く小さく回転させると、硬膜を突き刺した。次いで、針をダイヤルを使用して硬膜から引き戻し、脳脊髄液（ＣＳＦ）を流出させて陰圧にし、ウイルスを入れるスペースを確保した。また、ＣＳＦの流出により、外科医が正しい位置にいることも確認した。ＣＳＦの流れが外科医によって確認されると、ダイヤルを使用して針を再び挿入し、記録された硬膜の位置から約１ｍｍの深さで、針のベベルがちょうど大槽の内側に位置するようにした。針が正しい位置にきたら、脳へのウイルスの下方流れを促進するために、定位固定フレーム全体がテーブル面と３０°の角度を形成するようにゆっくりと上昇させた。少量の滅菌ワセリンを、注入部位の注射針の周囲及び露出した硬膜に塗布し、ウイルス及びＣＳＦの逆流を防ぐのに役立てた。次いで、１０００ｎｌ／分に設定した注入ポンプを開始し、１０μｌの希釈ウイルスを正確に送達した。

ウイルス負荷が送達されると、タイマーを１分間設定し、ウイルスがＣＳＦとともにくも膜下腔を流れるようにし、大槽から針を取り出すときにウイルスが逆流する可能性を低減した。針は、背腹ダイヤルを使用して慎重に後退させる。針を後退させた後、定位固定デバイスを慎重にテーブルの高さに戻し、外科領域を、洗浄し、縫合した。

ＩＣＭ注入後、麻酔をかけた動物（定位固定したまま）に前脛骨筋注射を左右の脚に行った。Ｎａｉｒｅｄ領域の中心から開始し、末梢に向かって外側に働くクロルヘキシジン及び０．９％の滅菌生理食塩水の交互にらせん状の外向きスクラブを使用して、注入部位を無菌的に調製し、これを少なくとも３回繰り返し、または綿棒にゴミが見られなくなるまで繰り返した。前脛骨筋の中央部分に、プライミングした０．５ｍｌのツベルクリン注射器及び２９ゲージの４５°ベベル針を使用して、注入を行った。針は、ベベルを上にして、皮膚の平面とほぼ平行になるように皮膚に刺した。外科医は、筋肉に針を刺す位置が決まったら、ウイルス負荷をゆっくりと注入した。注射器の内容物が完全に注入されると、針をゆっくりと後退させて、ウイルスの逆流を低減させた。針を後退させた直後に注射部位に圧力をかけ、逆流を防止した。

注射
調製ステーションでは、承認されたＩＡＣＵＣプロトコルに概説されているように気化したイソフルランを使用して、動物を麻酔し、次いで、必要な鎮痛剤（リマジル）の量を計算するために体重（ｇ）を測定した。その後、電気クリッパーを使用して、目のすぐ後ろから首の付け根に伸びる頭部の後ろから毛髪を除去した。次いで、両下肢の毛髪をＮａｉｒを使用して慎重に除去し、前脛骨筋を露出させた。次いで、動物を外科領域に移した。

組織収集
動物を、気化したイソフルランの過剰摂取を使用して安楽死させた。呼吸が停止したら、動物を採取台の上に置き、発泡スチロールの板にピンで固定した。腹部及び胸腔を開き、臓器を露出させた。直接心臓穿刺によって血液を採取した。採血した後（行った場合）、動物を１Ｘ ＰＢＳで灌流した。灌流が完了すると、臓器は慎重に採取され、組織学または生物学的アッセイのために切片に分割した（表８及び９）。アッセイに使用した切片は、エッペンドルフチューブに入れ、直ちに液体窒素中に浸漬した。組織学用に保存した切片は、予めラベルを貼ったカセットに入れ、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に浸した。２４時間後、ＰＦＡを１Ｘ ＰＢＳに交換し、カセットは、処理のために送り返された。

組織からのミトコンドリア単離
ミトコンドリア単離を、Ｐｒｅｂｌｅらに記載されるように行った。要約すると、均質化緩衝液の調製後、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、新鮮な試料を均質化した。ホモジネートを、４０μｍフィルター、続いて１０μｍフィルターに通過させた。溶出液を９，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。ペレットを回収し、タンパク質推定、免疫ブロット、及びＥＬＩＳＡのためのＥＬＩＳＡ緩衝液中に再懸濁した。

組織由来のミトコンドリア画分におけるヒトフラタキシンのＥＬＩＳＡ定量化
ヒト及びマウスフラタキシンレベルを、製造業者の指示に従ってヒトフラタキシンＥＬＩＳＡキット（ａｂ１７６１１２）及びマウスフラタキシンＥＬＩＳＡキット（ａｂ１９９０７８）を使用して、マウス組織から単離したミトコンドリア画分中で分析した。

組織学
組織処理及びＨ＆Ｅ
採取時に、各組織の一部を直ちに４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ ７．４）で固定した後、パラフィン包埋及び切片化を行った。スライドを脱蝋し、キシレン、続いてエタノール勾配を使用して再水和した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ＣｏｒｅにおいてＬｅｉｃａ自動着色剤を使用して行った。

フラタキシン免疫蛍光
スライドを再水和したら、クエン酸抗原回復をスチーマー内で行い、続いて、ストレプトアビジン／ビオチンブロックを行った（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＰ－２００２）。１：３００で一次マウス抗フラタキシン抗体（精製）を４℃で一晩塗布する前に、抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＫＢ－２２１３－１）及び血清ブロックも、行った。ビオチン化ウマ抗マウス抗体（ＢＡ－２０００）を、１：３００で１０分間、室温で組織切片に適用し、次いで、１：２００で１０分間、室温で適用する前に、蛍光Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８コンジュゲートストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＡ－５４８８－１）を洗浄した。最後に、スライドをＤＡＰＩで対比染色し、製造業者のプロトコル（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＰ－８４００－１５）に従って、自己蛍光バックグラウンドについて処理した。最後に、スライドを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｖｉｂｒａｎｃｅ包埋剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈ－１７００－１０）を使用して取り付けた。

顕微鏡検査
画像取得は、Ｋｅｙｅｎｃｅオールインワン顕微鏡（ＢＺ－Ｘ８１０）を使用して行った。すべてのＨ＆Ｅスライドを、明視野設定を用いて１０倍の倍率でスキャンした。フラタキシンを画像化するために、４０１．３からの心臓及び大腿四頭筋、及び４０１．４からの大腿四頭筋及び前脛骨筋を、２０倍でスキャンした。すべての心臓及び骨格筋切片を、同じ設定を使用してスキャンし、心臓を高分解能でスキャンし、筋肉を標準分解能でスキャンした。すべての蛍光スキャンは、対比のため、及び陽性染色の決定のためのバックグラウンド補正を決定するために赤色チャネルを含んだ。

病理組織学
すべての群において、免疫浸潤について脳または脊髄を慎重に検査した。筋肉における免疫毒性は、壊死線維の存在、鉱物化、空胞化、線維化、及び中心核の存在によって、０から重度の範囲のスケール（０～３）でスコア化した。ＩＶ投与動物において、肝臓を、免疫細胞浸潤の数及びサイズによって、フィールドごとに、０から重度の範囲のスケール（０～３）でスコア化した。

画像分析
すべての画像は、同じ方法及び設定を使用して編集した。赤色チャネル及び緑色チャネルをマージし、ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）を使用してバックグラウンドを削除した。シグナル対ノイズは低かったため、従来の閾値法を使用して定量分析を行うことはできなかった。処置した動物からの染色組織を、偽注射動物または未処置動物からの染色組織と比較した。

統計分析
すべてのデータは、示されるように、平均±標準誤差または標準偏差として表された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、統計分析を行った。

結果
フラタキシン発現プラスミドへの５’非翻訳領域の添加は、インビトロでのフラタキシンタンパク質の形質導入及び発現を増強しつつ、毒性を低減する。
健常な個体（対照）及びフリードライヒ運動失調症患者（ＦＡ）からの線維芽細胞を、５’ＵＴＲの有無にかかわらずＣＢＡまたはＤＥＳプロモーターの制御下で、ＦＸＮを発現するプラスミド構築物で処理した（表１）。細胞を、異なる構築物でのトランスフェクション後の細胞蜜集度の視覚化のために２４ウェルプレート中で画像化した（図１１Ａ～Ｂ）。細胞の生存を定量化するために、ＤＮＡ含有量を、ＣｙＱＵＡＮＴ増殖アッセイによって測定した（図１１Ｃ）。未処理細胞及びＤＥＳプロモーターの制御下でデュアルレポータープラスミド（ルシフェラーゼフリン２ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）でトランスフェクトした細胞を、それぞれ、陰性及びトランスフェクション対照として使用した。正常な未処置線維芽細胞におけるＤＮＡ含有量によって決定されるように、図１１Ｃの青色線は、毒性が観察されなかった値を表す。すべてのＦＸＮ発現プラスミドは、正常な線維芽細胞及びＦＡ線維芽細胞の両方においてある程度の毒性を示した。患者の線維芽細胞では、このレベルの毒性は、すべてのＦＸＮプラスミドトランスフェクションにわたって相対的に一定のままであった。しかしながら、対照線維芽細胞株において、５’ＵＴＲを含有するプラスミドで処理した細胞において、より高いＤＮＡ含有量が観察され、この領域がＦＸＮ発現を調節し、細胞毒性を低減することが示唆された。

ＡＴＰレベルに対するプラスミドトランスフェクションの影響を決定するために、ミトコンドリアを、未処理及びプラスミドトランスフェクションした線維芽細胞から、健常及びＦＡに影響を受けた細胞から単離した（図１１Ｄ）。全体として、５’ＵＴＲを含有するプラスミドで処理した線維芽細胞培養物において、５’ＵＴＲを有しないプラスミドと比較して、ＡＴＰ含有量が高かった。加えて、５’ＵＴＲを含有するプラスミドは、未処理のＦＡ線維芽細胞と比較して、疾患線維芽細胞におけるミトコンドリアＡＴＰ含有量を有意に増加させ、ＦＸＮの過剰発現が、疾患細胞株におけるＡＴＰ含有量を回復させたことを示した。５’ＵＴＲ調節ＦＸＮ発現は、未処理の健常な線維芽細胞と比較して、正常な線維芽細胞におけるＡＴＰ含有量を減少させた。これは、正常な線維芽細胞におけるＦＸＮの高い過剰発現が毒性につながることを示唆している。このデータは、毒性アッセイからの結果と一致している。

ウエスタンブロット（図１２Ａ～Ｂ）及びＥＬＩＳＡ（図１２Ｃ）アッセイを、トランスフェクト対照及び疾患線維芽細胞の細胞溶解物上で行い、ヒトＦＸＮを検出した。両方のアッセイにおいて、４つのＦＸＮ発現プラスミドがすべて、細胞を首尾よく形質導入した。ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮは、ＦＡ線維芽細胞におけるウエスタンブロットによるＤＥＳ－ＦＸＮと比較して、より低いＦＸＮ発現を有するようである。これらの結果を確認し、ＥＬＩＳＡによって定量化し、ＤＥＳ－ＦＸＮと比較して、ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮにおいて６０％高い発現を示した。ＥＬＩＳＡは、健常な線維芽細胞の対照で同様の結果を示したが、疾患線維芽細胞と比較して、倍率差は無視できるほどであった。全体的に、すべての細胞株にわたって、ＥＬＩＳＡで定量化された発現レベルは、５’ＵＴＲを有するプラスミド（ＣＢＡ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮ及びＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮ）と比較して、５’ＵＴＲを欠くプラスミド（ＣＢＡ－ＦＸＮ及びＤＥＳ－ＦＸＮ）でトランスフェクトされた細胞においてより高かった。このデータは、５’ＵＴＲ要素がＦＸＮの過剰発現を十分に制御し、毒性を低減させることができることを示唆している。

インビトロにおけるフラタキシンプラスミドの５’非翻訳領域と３’非翻訳領域との比較
健常な（対照）及びＦＡ患者からの線維芽細胞を、ＣＢＡプロモーターの制御下で、ＵＴＲの有無にかかわらず５μｇのＦＸＮを発現するプラスミドでトランスフェクトした（表２）。トランスフェクトしなかった細胞（プラスミドなし）及びＣＢＡ－ＧＦＰでトランスフェクトした細胞を、それぞれ、陰性対照及びトランスフェクション対照として使用した。細胞を、構築物のトランスフェクション後の細胞蜜集度の視覚化のために２４ウェルプレート中で画像化した（図１３Ａ）。ＣｙＱＵＡＮＴアッセイによってトランスフェクション後に、細胞生存率を測定した（図１３Ｂ）。毒性分析は、ＣＢＡ－５’－ＦＸＮと比較した場合、対照線維芽細胞におけるＣＢＡ－ＦＸＮが細胞生存率を低下させたことを示した。しかしながら、ＦＡ線維芽細胞は、毒性の同じ分布を示さない（図１３Ｃ）。同様に、非トランスフェクト細胞及びトランスフェクト細胞におけるＡＴＰ含有量を測定した（図１３Ｄ）。ＥＬＩＳＡによるフラタキシン過剰発現の検出は、ＣＢＡ－ＦＸＮでトランスフェクトした対照線維芽細胞において、内因性フラタキシンレベルを上回って約１６倍高かった。ＣＢＡ－５’－ＦＸＮ及びＣＢＡ－３’－ＦＸＮは、内因性フラタキシン発現（ＣＢＡ－ＧＦＰ）と比較して、発現において約１０倍高かった。フラタキシン及びＧＡＰＤＨに対するウエスタンブロット後に、密度分析を行った（図１３Ｅ～１３Ｇ）。フラタキシン及びｔｏｍｍ２０の免疫細胞化学的検出は、ミトコンドリア内でのフラタキシンの共局在化を確認し（図１３Ｈ）（１９）、各条件下での対照及び疾患細胞の染色は、タンパク質発現を反映したものであった（図１３Ｉ）。インビトロでの毒性を低減させるために、プラスミド含有量の滴定を行った（図１４Ａ～Ｂ）。

ＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮのインビボ投与後の生体内分布及び関連しない毒性
フラタキシンレベルは、野生型マウスの心臓、脳、脊髄、骨格筋、肝臓、及び脾臓で測定した。注射されていない動物のＥＬＩＳＡアッセイの後に、マウスフラタキシンタンパク質の正常範囲を決定した（図１５）。正常な動物におけるフラタキシンの過剰発現から生じる潜在的な毒性を判定するために、別々のセットの野生型マウスに、９週齢でＡＡＶ８ＴＭ－ＤＥＳ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮの静脈内注射を施した。ＡＡＶ投与後の正常なマウスの心臓、骨格筋、肝臓、及び脳におけるヒトフラタキシンの定量化（ＥＬＩＳＡ）は、ＦＸＮ発現の超生理学的レベルをもたらす（図１６）。炎症または毒性が心臓、骨格筋、肝臓、及び脳に明らかであるかどうかを判定するために、ヘマトキシリン及びエオシン染色を行った。染色は、注射された動物の組織において無毒性からごくわずかな毒性を示した。

ＩＣＭによるＡＡＶ送達後、野生型マウスの脳をヒトフラタキシン（ＥＬＩＳＡ）について評価した。ヒトフラタキシンの検出は、各用量において脳及び脊髄において観察された。予想外にも、動物のサブセット（２／３）において、フラタキシンの検出が観察されなかった（図１７Ａ～Ｂ）。同じ動物はまた、右前脛骨筋及び左前脛骨筋（ＴＡ）に、３回の漸増用量で直接筋肉内注入を介して用量を受けた。筋肉内投与後のＴＡ溶解物におけるフラタキシンの評価（ＥＬＩＳＡ）は、有意な発現を示したが、フラタキシンの検出は、大腿四頭筋においても観察された。これは、筋肉内注射（ＴＡ）が循環系への漏出、または大腿四頭筋がフラタキシンを呈する代替の機構をもたらし得ることを示唆している（図１７Ｃ）。脳領域の代表的な画像及び組織化学分析は、フラタキシンの陽性検出を示す（図１７Ｄ）。

インビトロＦＸＮ毒性：ヒト線維芽細胞
これらの結果は、フラタキシンを有するフラタキシン５’ＵＴＲの包含が、フラタキシンＯＲＦ単独と比較して、より低い毒性をもたらすことを示唆している。５’ＵＴＲの存在は、線維芽細胞内の所望のＡＴＰ含有量に正の影響を及ぼすか、または維持し、このことは、毒性に対するリスクの低減をさらに支持する。結果は、５’ＵＴＲ対照なしでのフラタキシンの過剰発現が、正常な線維芽細胞株に対して非常に毒性があることを示す。また、５’ＵＴＲの包含は、トランスフェクト細胞株において、より正規化されたミトコンドリアＡＴＰ含有量ももたらした。５’ＵＴＲフラタキシン発現は、非５’ＵＴＲ含有フラタキシンカセットと比較した場合、ＤＥＳ及びＣＢＡプロモーター駆動カセットの両方において、より低かった。これらの結果は、カセットにおいてフラタキシンを有するフラタキシン５’ＵＴＲの包含が、インビトロ（正常線維芽細胞及び患者線維芽細胞）でのＦＸＮの過剰発現に関連する毒性を有意に低減させることを示す。また、５’ＵＴＲ要素を有するフラタキシンの投与は、原発性疾患に関連する組織のミトコンドリア呼吸も改善する。統計分析は、５μｇのプラスミドでトランスフェクトした場合、ＣＢＡ－ＦＸＮ（約１６倍）またはＣＢＡ－５’－ＦＸＮ（約１０倍）でトランスフェクションした後のフラタキシンの有意な上昇を示す。より低いＤＮＡトランスフェクションレベルでは、ＣＢＡ－５’－ＦＸＮは、もはや対照線維芽細胞内に毒性を示さないが、ＣＢＡ－ＦＸＮは、依然として細胞生存率の低下をもたらす。さらに、これらの結果は、トランスフェクション後のフラタキシン及びミトコンドリアの共局在化を介したフラタキシンの適切なトラフィッキングを示す。

インビボＦＸＮ毒性：正常な野生型マウスにおける静脈内投与
この研究の目的は、野生型マウスにおける静脈内注射（５Ｅ＋１３ ｖｇ／ｋｇ）後の毒性を理解することであった。組織学的Ｈ＆Ｅ検査では、心臓、肝臓、骨格筋、脳、または脊髄において、明らかな毒性は認められなかった。ＥＬＩＳＡによるヒトフラタキシンの検出は、末梢組織における発現の有意な増加を示した。この研究の結果は、５Ｅ＋１３ ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－Ｄｅｓ５’が、ヒトフラタキシンの過剰発現が観察された検査した組織において毒性を誘導しないことを示す。

インビボＦＸＮ毒性：正常な野生型マウスにおけるＩＣＭ＋ＩＭ投与
この研究の目的は、ＡＡＶ－Ｄｅｓ５’の二重投与経路（ＩＣＭ＋ＩＭ）に続いて毒性－用量関係が観察されるかどうかを判定することであった。組織学的検査時に、脳または骨格筋において、明らかな毒性は観察されなかった。ＩＭ注射（ＴＡ）はまた、大腿四頭筋におけるフラタキシン発現の検出ももたらした。３Ｅ＋１１ ｖｇ／ｇの脳におけるＩＣＭ ＡＡＶ投与は、最も高いフラタキシン発現をもたらし、より高い用量に起因し得る。この研究の結果は、ＡＡＶ－Ｄｅｓ５’が毒性のない標的組織においてフラタキシンを発現することができるという仮説を支持する。

ＡＴＰ含有量測定には新たに単離された組織が必要であり、同じコホート内でフラタキシン発現の変動が観察されるため、ヒトＦＸＮ ６５ｐｇ／ｕｇが発現され、心臓では正常なマウスフラタキシンが１０２ｐｇ／ｕｇ、ヒトＦＸＮが６０ｐｇ／ｕｇ、骨格筋では正常なマウスフラタキシンが１０９ｐｇ／ｕｇ、ヒトＦＸＮが３６ｐｇ／ｕｇ、脳では正常なマウスフラタキシンが１０３ｐｇ／ｕｇ、及びヒトＦＸＮが９．２ｐｇ／ｕｇ、脊髄では正常なマウスフラタキシンが２６．６ｐｇ／ｕｇが発現された。［上記の実験についてはさらに詳しく説明のこと。］

ＦＡ遺伝子療法との関連でＡＡＶベクターに対する免疫原性応答の限られた可能性を支持するＡＡＶ注射動物において、ＡＡＶ５’Ｄｅｓ誘導毒性は、観察されなかった。表１０は、Ｂａｍｂｏｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（国際特許出願公開第ＷＯ２０１７０７７４５１号を参照のこと）と比較した、ＡＡＶ送達後のフリードライヒ運動失調症のＭＣＫ－Ｃｒｅマウスモデルにおける心臓、骨格筋、及び肝臓におけるフラタキシン発現を概説する。Ｂａｍｂｏｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、３週齢のＭＣＫ Ｆｘｎ－／－マウスにおいて、１×１０^１３ ｖｇ／ｋｇの用量でＡＡＶ２ｉ８－ＨＡ－ＦＸＮを静脈内に使用した。

ＡＡＶ構築物中のイントロン配置の影響
図１８に示すように、ＡＡＶ構築物中の要素の順序は、ＦＸＮ発現に影響を及ぼす。５’ＵＴＲを含まない構築物は、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞において非常に有意な発現（レーン３及び６、図１８）をもたらす。イントロンとＦＸＮとの間の５’ＵＴＲの包含は、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞において低いＦＮＸ発現（レーン５、図１８）をもたらす。しかしながら、５’ＵＴＲ、イントロン、及びＦＸＮをその順序で含めると、所望のＦＸＮ発現レベルがもたらされる。

要約すると、毒性は、正常、対照、またはＦＡ患者線維芽細胞株において、超生理学的ＦＸＮ発現レベルで用量依存的に観察された。脳、脊髄または骨格筋におけるＡＡＶ－５’ＵＴＲ－ＦＸＮの送達後、正常なマウスにおいて、毒性は、観察されなかった。５’ＵＴＲ－ＦＸＮの過剰発現は、インビボで明らかな毒性をもたらさないが、細胞生存率の低下は、ＦＸＮの過剰発現の非常に有意なレベルにおいてインビトロで検出される。５’ＵＴＲ領域の包含によるＦＸＮ発現の調節は、過剰発現を誘発する細胞毒性の可能性を低下させる。

実施例８
すべてのプラスミド構築物のタンパク質発現及び定量化
ヒトＦＸＮプロモーター－イントロンコドン最適化フラタキシンを、ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢＡ）及びＣＭＶエンハンサーを含有するｐｄｓＡＡＶ－ＣＢ－ＥＧＦＰ（ＭＫ２２５６７２）中でクローニングする。成功したクローニングは、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を通じて確認される。確認後、プラスミドは、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒａｎｓ－ＩＴ（Ｍｉｒｕｓｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて過剰発現される。以下の構築物を試験する。
ＣＢＡ－５ＵＴＲ－イントロン－ＦＸＮ：ＣＢＡプロモーターを有するｓｖ４０イントロンの上流に５ＵＴＲフラタキシンを含有する構築物
ＣＢＡ ＦＸＮ：ＣＢＡプロモーターを有するフラタキシンを含有する構築物
ＣＢＡ－イントロン－５ＵＴＲ－ＦＸＮ：ＣＢＡプロモーターを有するｓｖ４０イントロンの下流に５ＵＴＲフラタキシンを含有する構築物
ＣＢＡ－ｈＦＸＮプロモーター－ＦＸＮ：Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞株における一過性トランスフェクションを介した内因性ヒトフラタキシンプロモーター及びコドン最適化フラタキシンを含有する構築物

これらの細胞株のトランスフェクション後、細胞ペレットを収集し、ＲＩＰＡ緩衝液によってタンパク質を単離する。タンパク質を分離するために、１６％トリシンＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを実行する。ＳＤＳ ＰＡＧＥ後、ｉ－ブロット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）モジュールを使用して、分離したタンパク質をニトロセルロース膜上に転写する。ニトロセルロース膜を、ＴＢＳＴ緩衝液中の５％の乳で２時間ブロックし、次いで、一次抗体及びＨＲＰコンジュゲート二次抗体でそれぞれプローブする。次いで、ウエスタンブロットを、化学発光溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で５分間インキュベートした後、ｉ－Ｂｒｉｇｈｔデバイスで視覚化する。

過剰発現したヒトフラタキシンタンパク質を、特異的抗体α－フラタキシン抗体（Ａｂｃａｍ）でプローブする。Ｇａｐｄｈ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、各レーンにおける等量のタンパク質負荷を確認するための負荷制御である。５’ＵＴＲ ＦＸＮ、ｓｖ４０イントロン、及びＣＢＡプロモーターを含む構築物から、その順序で、フラタキシンの首尾よく調節された発現が予想される。

すべてのプラスミド構築物のＲＮＡ転写産物
ヒトＦＸＮプロモーター－イントロンコドン最適化フラタキシンを、ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢＡ）及びＣＭＶエンハンサーを含有するｐｄｓＡＡＶ－ＣＢ－ＥＧＦＰ（ＭＫ２２５６７２）中でクローニングする。成功したクローニングは、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を通じて確認される。確認後、プラスミドは、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒａｎｓ－ＩＴ（Ｍｉｒｕｓｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて過剰発現される。以下の構築物を試験する。
ＣＢＡ－５ＵＴＲ－イントロン－ＦＸＮ：ＣＢＡプロモーターを有するｓｖ４０イントロンの上流に５ＵＴＲフラタキシンを含有する構築物
ＣＢＡ ＦＸＮ：ＣＢＡプロモーターを有するフラタキシンを含有する構築物
ＣＢＡ－イントロン－５ＵＴＲ－ＦＸＮ：ＣＢＡプロモーターを有するｓｖ４０イントロンの下流に５ＵＴＲフラタキシンを含有する構築物
ＣＢＡ－ｈＦＸＮプロモーター－ＦＸＮ：Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞株における一過性トランスフェクションを介した内因性ヒトフラタキシンプロモーター及びコドン最適化フラタキシンを含有する構築物

トランスフェクション後、細胞を収集して、ＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＮＡを単離する。ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡから生成し、ｑＰＣＲを実施して、各条件におけるヒトフラタキシンコピーを検証する。

Ｌ２領域をサイレンシングすることによるタンパク質発現の調節
ｓｉＲＮＡは、５’ＵＴＲ（配列番号３３）のＬ２領域を特異的に標的とするように設計される。Ｃ２Ｃ１２細胞を、上記のプラスミド及びｓｉＲＮＡと共トランスフェクトする。

これらの細胞株のトランスフェクション後、細胞ペレットを収集し、ＲＩＰＡ緩衝液によってタンパク質を単離する。タンパク質を分離するために、１６％トリシンＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを実行する。ＳＤＳ ＰＡＧＥ後、ｉ－ブロット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）モジュールを使用して、分離したタンパク質をニトロセルロース膜上に転写する。ニトロセルロース膜を、ＴＢＳＴ緩衝液中の５％の乳で２時間ブロックし、次いで、一次抗体及びＨＲＰコンジュゲート二次抗体でそれぞれプローブする。次いで、ウエスタンブロットを、化学発光溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で５分間インキュベートした後、ｉ－Ｂｒｉｇｈｔデバイスで視覚化する。

過剰発現したヒトフラタキシンタンパク質を、特異的抗体α－フラタキシン抗体（Ａｂｃａｍ）でプローブする。Ｇａｐｄｈ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、各レーンにおける等量のタンパク質負荷を確認するための負荷制御である。結果は、上述の細胞株におけるｓｉＲＮＡの処理なしの細胞と比較して、ｓｉＲＮＡ標的細胞が高レベルのフラタキシンを産生することを示す。また、５’ＵＴＲを有しないフラタキシンは、５’ＵＴＲを有するフラタキシンよりも相対的に発現する。

実施例９
フリードライヒ運動失調症の心臓マウスモデルにおけるＡＡＶ８ＴＭ－ＣＢＡ－５’－ＦＸＮの治療有効性
以下の実験は、調節されていない（５’ＵＴＲなし）ＦＸＮと比較した調節された５’ＵＴＲ－ＦＸＮの有効性を試験するために実施される。心臓特異的ＦＸＮ ＫＯ（Ｆｘｎｆｌｏｘ／ヌル：：ＭＣＫ－Ｃｒｅ（Ｊａｘ：０２９７２０））マウスモデルは、治療的介入なしで約９～１０週間の寿命を有する。ＡＡＶ８ＴＭ－ＣＢＡ－５’－ＦＸＮ、５ｅ１３ ｖｇ／ｋｇウイルスは、出生後０日目（ＰＮＤ０）または５週齢で静脈内投与される；それぞれ、前症候性及び中等度の疾患段階である。動物は、９週齢で心臓機能及び形態測定を決定するために、心臓ＭＲ（１１Ｔ）を受ける。目的は、ＡＡＶ８ＴＭ－ＣＢＡ－５’－ＦＸＮ送達後の心機能障害の発症を減弱させることである。

研究戦略
ＡＡＶ８ＴＭ－ＣＢＡ－５’－ＦＸＮウイルスは、フロリダ大学パウエル遺伝子治療センターベクターコアで作製され、デジタルドロップＰＣＲを介した注入のために滴定される。４週齢のＦｘｎｆｌｏｘ／ヌル：：ＭＣＫ－Ｃｒｅマウスに、５×１０１３ ｖｇ／ｋｇ用量を注入する。各群の動物の動員に続いて、静脈内（ＩＶ）注射を介して被験物質を単回ボーラス投与する。体重は、週単位で記録される。投与から２８日後、心臓マウスモデルにおける臨床的に関連する心臓エンドポイントを観察するために、ＭＲＩイメージングを実施する。左心室１回拍出量、左心室駆出分画率、左心室短縮率、及び心拍出量を測定する（Ｓｅｇｍｅｎｔソフトウェア；Ｍｅｄｖｉｓｏ）。心臓イメージング後、動物は、殺処分され、剖検には、全血、脳、脊髄、背根神経節、脳脊髄液、心臓、左右の大腿四頭筋、左右の前脛骨筋（ＴＡ）、肝臓及び脾臓の収集が含まれる。新たに採取した組織を、即座にミトコンドリア単離し、続いてＡＴＰ分析（ＡＴＰｌｉｔｅ発光アッセイ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を行う。残りの組織片は、毒性の組織学的分析、線維症、鉄沈着、及び脂質滴分析に供される。ＥＬＩＳＡアッセイ（Ａｂｃａｍ）及びウエスタンブロットによってヒトフラタキシンの定量化のために、ミトコンドリアを凍結組織から単離する。血清は、潜在的に臨床的に関連する評価のために収集される；ＧＤＦ－１５血清レベル及び心臓トロポニンＩは、Ｆｘｎヌルマウスにおいて増加することが報告されている。研究の計画は、表１１に詳述されている。表１２については、Ｅ１０．５の妊娠中の雌を注文し、Ｐ０（出生後０日目）の同腹仔に、側頭静脈注射により５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量を注射する。注射から４週間後、上記のようにそれらの表現型を観察するために、ＭＲＩイメージングを行った。注射から８週間後、疾患の進行及びＡＡＶ８ＴＭ－ＣＢＡ－５’－ＦＸＮの治療効果を理解するために、ＭＲＩイメージングを行った。

予備データに基づいて、疾患の進行は、群における心臓モデルで停止されることが予想される。注射された疾患動物の心臓重量は、正常に近い。組織内のＡＴＰレベルの増加も予想される。組織学的指標は、ＡＡＶ８ＴＭ－ＣＢＡ－５’－ＦＸＮを受ける動物における線維症、鉄沈着、及び脂質滴の減少を示し得る。ＡＡＶ８ＴＭ－ＣＢＡ－ＦＸＮとＡＡＶ８ＴＭ－ＣＢＡ－５’－ＦＸＮとの比較は、過剰なフラタキシンの過剰発現が動物において毒性であるかどうかを解明する。

フリードライヒ運動失調症のニューロンマウスモデルにおけるＡＡＶ８ＴＭ－ＣＢＡ－５’－ＦＸＮの治療有効性
ＣＮＳにおけるＡＡＶ８ＴＭ－ＣＢＡ－５’－ＦＸＮの有効性を試験するために、４週齢または１２週齢のＦｘｎｆｌｏｘ／ヌル：：ＰＶ－Ｃｒｅ（Ｊａｘ：０２９７２１）動物は、１．５ｅ１１ｖｇ／ｇの脳の用量で、大槽内（ＩＣＭ）注射を介して脳脊髄液中のベクター送達を受ける。動物は、８週齢～２０週齢で毎月行動評価を受ける。目的は、ＡＡＶ８ＴＭ－ＣＢＡ－５’－ＦＸＮ送達後の神経機能障害及び神経筋機能障害の発達を減衰させることである。

研究戦略
４～５週齢のＦｘｎｆｌｏｘ／ヌル：：ＰＶ－Ｃｒｅマウスを、これらの研究のために動員する。Ｆｘｎｆｌｏｘ（ｆｌｏｘｅｄエクソン２）マウスは、実験の対照として使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９生成のＣｒｅ条件付きフラタキシン対立遺伝子を有する。群１～４のマウスは、大槽内（ＩＣＭ）注射により、単回ボーラスの賦形剤または被験物質（１．５ｅ１１ｖｇ／ｇ脳）を受ける。体重は、週単位で記録される。Ｒｏｔａｒｏｄ、神経スコア、ワイヤーハング、及び前肢グリップ強度試験を使用した行動試験は、表３に記載される投与後４、８、１０、１２、６、１８、及び２０週間、ならびに（群５～８）に記載される投与後１２、１４、１６、２０週間で評価する［１４、１５］。投与後２０週間の剖検には、全血、脳、脊髄、背根神経節、脳脊髄液、心臓、左右の大腿四頭筋、左右の前脛骨筋（ＴＡ）、肝臓及び脾臓の収集が含まれる。主要な組織から新たに単離されたミトコンドリアを、ＡＴＰ分析に供する。組織の残りの部分は、直ちに液体窒素で凍結されるか、または組織学的分析（毒性－ＧＦＡＰ染色、カルビンジン染色－プルキンエニューロン及びコハク酸デヒドロゲナーゼＡ－ミトコンドリア複合体ＩＩの救援）のために固定される（４％ ＰＦＡ）。凍結した組織を、ミトコンドリア単離し、続いて、ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）及びウエスタンブロットによるヒトＦＸＮの定量化のための分子解析を行う。研究の計画は、表１３に詳述されている。

これらの実験は、ＡＡＶ８ＴＭ－５’－ＦＸＮのＣＳＦ送達後の生体内分布及び治療効果を判定する。我々の生物学的分布研究は、この用量範囲がＣＮＳにおける標的細胞集団において堅牢な形質導入を提供することを示唆している。これにより、ＡＡＶ８ＴＭ－Ｆｘｎｆｌｏｘ／ヌル：：ＰＶ－Ｃｒｅ動物における運動失調の発生の減衰または予防をもたらす。毒性は、脳、後根神経節、または脊髄には期待されない。ＡＡＶ８ＴＭ－ＣＢＡ－５’－ＦＸＮで処置したＦｘｎｆｌｏｘ／ヌル：：ＰＶ－Ｃｒｅ動物において、ＡＴＰ含量（生化学的）及びコハク酸デヒドロゲナーゼＡ（ＩＨＣ）が、増加する。

Claims (41)

1. 核酸構築物であって、
   ヒトフラタキシン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ ＦＸＮ）を含む核酸配列と、
   ヒトフラタキシン（ＦＸＮ）をコードする核酸配列と、を含み、前記ヒトＦＸＮをコードする核酸配列が、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、前記核酸構築物。
2. 前記５’ＵＴＲ ＦＸＮが、配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の核酸構築物。
3. 前記ヒトＦＸＮをコードする核酸配列が、コドン最適化されている、請求項１または２に記載の核酸構築物。
4. 前記５’ＵＴＲ ＦＸＮが、配列番号２を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
5. 前記５’ＵＴＲ ＦＸＮが、前記ヒトＦＸＮをコードする核酸配列の上流に位置する、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
6. イントロンをさらに含み、前記イントロンが、前記５’ＵＴＲ ＦＸＮの下流及び前記ヒトＦＸＮをコードする核酸の上流に配置される、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
7. 前記５’ＵＴＲ ＦＸＮが、ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）結合部位を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
8. 前記ＣＴＣＦ結合部位が、配列番号３または１６～２１のうちのいずれか１つを含む、請求項７に記載の核酸構築物。
9. ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む核酸配列をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
10. 核酸構築物であって、以下の順序で、
    （ａ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む核酸配列、
    （ｂ）５’ＵＴＲ ＦＸＮを含む核酸配列、及び
    （ｃ）ヒトＦＸＮをコードする核酸配列、を含み、
    前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、フラタキシンプロモーターではなく、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、前記５’ＵＴＲ ＦＸＮ及び前記ヒトＦＸＮをコードする核酸配列に作動可能に連結される、前記核酸構築物。
11. 前記ヒトＦＸＮをコードする核酸配列が、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１０に記載の核酸構築物。
12. 前記ヒトＦＸＮが、配列番号６０を含む、請求項１０または１１に記載の核酸構築物。
13. 前記核酸構築物が、以下の順序で、
    （ａ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む核酸配列、
    （ｂ）５’ＵＴＲ ＦＸＮを含む核酸配列、及び
    （ｃ）ヒトＦＸＮをコードする核酸配列、を含み、
    前記ヒトＦＸＮをコードする核酸配列が、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、前記５’ＵＴＲ ＦＸＮ及び前記ヒトＦＸＮをコードする核酸配列に作動可能に連結される、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
14. 核酸構築物であって、以下の順序で、
    （ａ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む核酸配列、
    （ｂ）５’ＵＴＲ ＦＸＮを含む核酸配列、
    （ｃ）イントロン、及び
    （ｄ）ヒトＦＸＮをコードする核酸配列、を含み、
    前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、前記５’ＵＴＲ ＦＸＮ及び前記ヒトＦＸＮをコードする核酸配列に作動可能に連結される、前記核酸構築物。
15. 前記ヒトＦＸＮをコードする核酸配列が、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１４に記載の核酸構築物。
16. 前記ヒトＦＸＮが、配列番号６０を含む、請求項１４または１５に記載の核酸構築物。
17. 前記核酸構築物が、以下の順序で、
    （ａ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む核酸配列、
    （ｂ）５’ＵＴＲ ＦＸＮを含む核酸配列、
    （ｃ）イントロン、及び
    （ｄ）ヒトＦＸＮをコードする核酸配列、を含み、
    前記ヒトＦＸをコードする核酸配列が、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、前記５’ＵＴＲ ＦＸＮ及び前記ヒトＦＸＮをコードする核酸配列に作動可能に連結される、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
18. 前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、デスミンプロモーターまたはＣＢＡプロモーターである、請求項９～１７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
19. 前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、配列番号４または配列番号５を含む、請求項１８に記載の核酸構築物。
20. 前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、空間的に制限されたプロモーターである、請求項９～１７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
21. 前記空間的に制限されたプロモーターが、ニューロン特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、骨格筋特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、星状細胞特異的プロモーター、ミクログリア特異的プロモーター、及びオリゴデンドロサイト特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項２０に記載の核酸構築物。
22. 一対の逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含み、前記核酸構築物が、前記ＩＴＲによって各々に隣接する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
23. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、組換えウイルスベクター。
24. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２３に記載の組換えウイルスベクター。
25. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１血清型ベクター、ＡＡＶ２血清型ベクター、ＡＡＶ３血清型ベクター、ＡＡＶ４血清型ベクター、ＡＡＶ５血清型ベクター、ＡＡＶ６血清型ベクター、ＡＡＶ７血清型ベクター、ＡＡＶ８血清型ベクター、ＡＡＶ９血清型ベクター、ＡＡＶ Ｒｈ７４血清型ベクター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４に記載の組換えＡＡＶベクター。
26. 前記組換えＡＡＶベクターが、一本鎖または自己相補的ＡＡＶベクターである、請求項２４または２５に記載の組換えＡＡＶベクター。
27. 前記組換えＡＡＶベクターが、配列番号６～８、１３～１５、または２４～２８のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
28. 前記組換えＡＡＶベクターが、配列番号６～８、１３～１５、または２４～２８のうちのいずれか１つを含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
29. 請求項２４～２８のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む、核酸。
30. 前記核酸が、プラスミドである、請求項２９に記載の核酸。
31. 請求項２３～２８のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクターを含む、組換えＡＡＶ粒子。
32. 請求項３１に記載の粒子を含む、薬学的組成物。
33. 前記組成物が、複数の粒子を含む、請求項３２に記載の薬学的組成物。
34. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の核酸構築物、または請求項２３～２８のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクターを含む、遺伝子改変細胞。
35. 前記遺伝子改変細胞が、ヒト幹細胞、ヒトニューロン、ヒト心筋細胞、ヒト平滑筋細胞、ヒト骨格筋細胞、及びヒト肝細胞からなる群から選択される、請求項３４に記載の遺伝子改変細胞。
36. フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）を有する患者を治療する方法であって、治療有効量の請求項３１に記載の組換えＡＡＶ粒子を前記患者に投与することを含む、前記方法。
37. ヒト細胞におけるＦＸＮの発現を調節する方法であって、前記ヒト細胞に、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを導入することを含む、前記方法。
38. ヒト細胞におけるＦＸＮの発現を調節する方法であって、前記ヒト細胞に、請求項２９または３０に記載の核酸を導入することを含む、前記方法。
39. ＦＡを有する対象のヒト細胞におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）濃度を増加させる方法であって、治療有効量の請求項３１に記載の組換えＡＡＶ粒子を前記患者に投与することを含む、前記方法。
40. ＦＡを有する対象のヒト細胞におけるＡＴＰ濃度を増加させる方法であって、治療有効量の請求項３１に記載の組換えＡＡＶ粒子を前記患者に投与することを含む、前記方法。
41. 前記ヒト細胞が、ニューロン、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、及び肝細胞からなる群から選択される、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。

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