KR20180027619A - 신경변성 질환에 대한 유전자 요법 - Google Patents

신경변성 질환에 대한 유전자 요법 Download PDF

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Abstract

운동 기능, 예를 들어 뇌 및/또는 척수에 대한 질병 또는 손상에 의해 영향받는 운동 기능에 영향을 주는 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 또한, 운동 뉴런 질환, 예를 들어 척수성 근 위축증, 근위축성 측삭 경화증, 척수성 연수근 위축, 척수소뇌성 실조증, 원발성 측삭 경화증 및 외상성 척수 손상의 치료를 위한 자가-상보성 아데노 연관 바이러스 벡터가 개시된다.

Description

신경변성 질환에 대한 유전자 요법{GENE THERAPY FOR NEURODEGENERATIVE DISORDERS}
<관련 출원에 대한 교차 참조>
본 출원은 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 가출원 61/174,982 (2009년 5월 2일 출원) 및 61/268,059 (2009년 6월 8일 출원)의 35 USC §119(e)(1) 하의 이익을 주장한다.
<기술분야>
본 발명은 일반적으로 유전자 전달 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 운동 기능, 예를 들어 뇌 및/또는 척수에 대한 질병 또는 손상에 의해 영향받는 운동 기능에 영향을 주는 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
유전자 요법은 중추신경계 (CNS)에 영향을 주는 질환에 대한 최근에 개발된 치료 방법이다. CNS 유전자 요법은 유사분열후 뉴런을 효과적으로 감염시킬 수 있는 바이러스 벡터의 개발에 의해 촉진되었다. 중추신경계는 척수 및 뇌로 구성된다. 척수는 감각 정보를 말초신경계로부터 뇌로 전달하고, 운동 정보를 뇌로부터 다양한 효과기로 전달한다. 중추신경계로 유전자를 전달하기 위한 바이러스 벡터의 검토에 대해서는 문헌 [Davidson et al., Nature Rev. (2003) 4:353-364]을 참고한다.
아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터는 유리한 독성 및 면역원성 프로필을 갖고 뉴런 세포에 형질도입할 수 있고 CNS에서 장기간 발현을 매개할 수 있기 때문에 CNS 유전자 요법에 유용한 것으로 고려된다 ([Kaplitt et al., Nat. Genet. (1994) 8:148-154]; [Bartlett et al., Hum.GeneTher. (1998) 9:1181-1186]; 및 [Passini et al., J. Neurosci. (2002) 22:6437-6446]).
AAV 벡터의 하나의 유용한 특성은 뉴런 세포에서 역행 및/또는 순행성 수송을 겪는 일부 AAV 벡터의 능력이다. 하나의 뇌 영역 내의 뉴런은 축색돌기에 의해 원위 뇌 영역에 상호연결되어 벡터 전달을 위한 수송 시스템을 제공한다. 예를 들어, AAV 벡터는 뉴런의 축색돌기 말단에 또는 그 부근에 투여될 수 있다. 뉴런은 AAV 벡터를 흡수하고, 이를 축색돌기를 따라 역행하는 방식으로 세포체로 수송한다. 아데노바이러스, HSV, 및 위광견병 바이러스의 유사한 특성은 유전자를 뇌 내의 원위 구조로 전달하는 것으로 밝혀졌다 ([Soudas et al., FASEB J. (2001) 15:2283-2285]; [Breakefield et al., New Biol. (1991) 3:203-218]; 및 [deFalco et al., Science (2001) 291:2608-2613]).
몇몇 실험자들은 AAV 혈청형 2 (AAV2)에 의한 뇌의 형질도입이 두개내 주사 부위로 제한됨을 보고하였다 ([Kaplitt et al., Nat. Genet. (1994) 8:148-154]; [Passini et al., J. Neurosci. (2002) 22:6437-6446]; 및 [Chamberlin et al., Brain Res. (1998) 793:169-175]). 또한, AAV 및 렌티바이러스 벡터를 포함하는 신경친화성 바이러스 벡터의 역행성 축색돌기 수송이 정상 래트 뇌의 선택된 회로에서 발생할 수 있다는 증거가 존재한다 ([Kaspar et al., Mol. Ther. (2002) 5:50-56]; [Kasper et al., Science (2003) 301:839-842] 및 [Azzouz et al., Nature (2004) 429:413-417]). 문헌 [Roaul et al., Nat. Med. (2005) 11(4):423-428] 및 [Ralph et al., Nat. Med. (2005) 11(4):429-433]은 침묵화 (silencing) 인간 Cu/Zn수퍼옥시드디스뮤타제 (SOD1) 간섭 RNA를 발현하는 렌티바이러스의 근육내 주사가 치료상 관련되는 근위축성 측삭 경화증 (ALS)의 설치류 모델에서 ALS의 발병을 지연한다고 보고하였다.
AAV 벡터에 의해 형질도입되는 세포는 세포 내에서 유익한 효과를 매개하는 치료작용의 도입유전자 (transgene) 산물, 예를 들어 효소 또는 신경친화성 인자를 발현할 수 있다. 또한, 상기 세포는 치료작용의 도입유전자 산물을 분비할 수 있고, 이는 후속적으로 그의 유익한 효과를 매개할 수 있는 원위 세포에 의해 흡수될 수 있다. 상기 과정은 교차 교정 (cross-correction)으로 설명되었다 (Neufeld et al., Science (1970) 169:141-146).
상기 설명된 재조합 AAV 벡터의 특성은 단일가닥 DNA (ssDNA) AAV 게놈이 코딩되는 도입유전자의 발현 전에 이중가닥 DNA (dsDNA)로 전환될 것을 필요로 한다는 것이다. 이 단계는 DNA 합성 또는 다중 벡터 게놈 사이의 염기 페어링을 필요로 하지 않으면서 dsDNA로 폴딩되는 도립 반복체 (inverted repeat) 게놈을 패키징 (packaging)하여 AAV-매개된 유전자 전달의 효율을 증가시키는 자가-상보성 벡터의 사용에 의해 회피될 수 있다. 자가-상보성 AAV 벡터의 검토에 대해서는 예를 들어 문헌 [McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656]을 참조한다.
척수성 근 위축증 (SMA)은 생존 운동 뉴런 1 (SMN1) 유전자의 돌연변이 및 코딩된 SMN 단백질의 손실에 의해 야기되는 상염색체 열성 신경근육계 질환이다 (Lefebvre et al., Cell (1995) 80:155-165). SMN의 결여는 척수의 전 (앞의) 각 (ventral horn)에 운동 뉴런 변성을 야기하고, 이것은 기어감, 보행, 목 조절 및 삼킴을 담당하는 근위근 및 호흡 및 기침을 조절하는 불수의근의 약화를 유발한다 (Sumner C.J., NeuroRx (2006) 3:235-245). 따라서, SMA 환자는 폐렴 및 다른 폐 문제, 예를 들어 구속성 폐 질환의 경향 증가를 보인다. 질병의 발병 및 중증도는 부분적으로는 소량의 SMN을 생성할 수 있는 표현형 변경인자 유전자 SMN2에 의해 결정된다 ([Monani et al., Hum.Mol.Genet. (1999) 8:1177-1183]; [Lorson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96:6307-6311]). 따라서, 높은 SMN2 카피수 (3-4 카피)를 갖는 환자는 덜 심각한 질병 형태 (타입 II 또는 III으로 언급됨)를 보이는 반면에, 1-2 카피의 SMN2는 일반적으로 보다 심각한 타입 I 질병을 야기한다 ([Campbell et al., Am. J. Hum.Genet.(1997) 61:40-50]; [Lefebvre et al., Nat. Genet. (1997) 16:265-269]). 현재, SMA에 대한 효과적인 요법은 존재하지 않는다.
상기 단일유전자 질환의 치료를 위한 근본적인 전략은 SMA 환자에서 SMN 수준을 증가시키는 것이다. 한가지 방법은 SMN2 프로모터를 활성화시키거나 또는 SMN2 프리 (pre)-mRNA 스플라이싱 패턴을 교정하는 소분자로 내인성 SMN2 유전자를 조정하는 것이다. 또한, SMN2 스플라이싱의 변경은 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 트랜스-스플라이싱 RNA를 사용하여 달성될 수 있다. 그러나, 시험관 내에서 SMN2의 조정이 SMN 수준을 증가시키고 SMA 세포주에서 핵 젬 (nuclear gem)을 재구성하였지만, 소분자 약물을 사용한 효능 연구는 임상에서 측정가능한 개선으로 해석되지 않았다 (Oskoui et al., Nerotherapeutics (2008) 5:499-506).
<발명의 개요>
본 발명은 통상적인 재조합 AAV (rAAV) 비리온과 재조합 자가-상보성 AAV 벡터 (scAAV) 모두가 유전자를 CNS에 전달하여, 유전자가 CNS에서 성공적으로 발현되고 신경변성 질병을 치료할 수 있다는 발견을 기초로 한다. 신경병증의 적어도 부분적인 교정을 달성하는 치료 분자를 코딩하는 유전자의 전달을 위한 상기 치료 방법은 SMA를 포함하는 다양한 신경변성 질환을 치료하기 위해 매우 바람직한 방법을 제공한다.
따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명은 운동 뉴런 질환이 있는 대상체에서 운동 기능을 조정하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자가-상보성 아데노 연관 바이러스 (scAAV) 벡터에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 운동 뉴런 질환은 척수성 근 위축증 (SMA), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 척수성 연수근 위축, 척수소뇌성 실조증, 원발성 측삭 경화증 (PLS), 및 외상성 척수 손상으로부터 선택된다.
추가의 실시양태에서, scAAV 벡터에 존재하는 폴리뉴클레오티드는 생존 운동 뉴런 (SMN) 단백질을 코딩한다. 특정 실시양태에서, SMN 단백질은 인간 SMN-1이다. 추가의 실시양태에서, SMN-1은 도 9B에 도시된 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, SMN-1은 도 9B에 도시된 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 상기한 scAAV 벡터를 포함하는 재조합 AAV 비리온에 관한 것이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 상기한 재조합 AAV 비리온 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 상기 조성물을 운동 뉴런 질환이 있는 대상체의 세포에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 운동 기능을 조정하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 세포를 형질도입하기 위해 시험관 내에서 세포에 투여되고, 형질도입된 세포가 대상체에게 투여된다. 별도의 실시양태에서, 조성물은 생체 내에서 세포에 투여된다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 상기한 AAV 벡터를 포함하는 재조합 AAV 비리온을 그를 필요로 하는 대상체의 세포에 투여하는 것을 포함하는, 척수성 근 위축증 (SMA)이 있는 대상체에게 SMN 단백질을 제공하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 세포를 형질도입하기 위해 시험관 내에서 세포에 투여되고, 형질도입된 세포가 대상체에게 투여된다. 별도의 실시양태에서, 조성물은 생체 내에서 세포에 투여된다.
각각의 상기 방법에서 조성물은 직접적인 척수 주사를 통해 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 조성물은 뇌실내 주사를 통해 투여된다. 추가의 실시양태에서, 조성물은 하나의 대뇌 측뇌실 내로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 두 개의 대뇌 측뇌실 내로 모두 투여된다. 다른 실시양태에서, 조성물은 뇌실내 주사 및 직접적인 척수 주사 둘 다를 통해 투여된다. 추가의 실시양태에서, 조성물은 수막강내 주사에 의해 투여된다.
본 발명의 이들 및 다른 실시양태는 본원의 개시내용에 비추어 당업자가 쉽게 실시할 수 있을 것이다.
도 1은 AAVhSMN1로 처리된 마우스 대 비처리된 SMA 마우스의 생존을 보여준다. AAVhSMN1 처리는 SMA 마우스의 생존을 증가시켰다. 비처리된 SMA 마우스 (n = 34, 빈 원)의 중앙 수명은 15일이었다. P0에서 AAVhSMN1로 처리된 SMA 마우스 (n = 24, 막힌 원)의 중앙 수명은 50일이었고 (p < 0.0001), 이는 수명의 +233% 증가를 나타낸다.
도 2a-2c는 척수 내의 SMN 수준에 대한 유전자 요법의 효과를 보여준다. 비처리된 SMA 및 야생형 마우스에 비해 주사된 요수 (도 2a), 흉수 (도 2b) 및 경수 (도 2c) 세그먼트 내의 hSMN 단백질 수준이 제시된다. 웨스턴 (Western) 블롯은 주사 후 16, 58-66 및 120-220일에 척수의 요수, 흉수 및 경수 세그먼트에 대해 수행하였다. 3개의 세그먼트로부터 웨스턴 블롯을 정량하고, 단백질 수준과 대조하기 위해, SMN을 β-튜불린에 대해 표준화하고, 나이 일치된 야생형의 백분율로서 그래프로 나타냈다. 약어 (및 n-값): SMA, 비처리된 낙아웃 (knockout) (n = 5, 16일); AAV, AAV8-hSMN-처리된 SMA 마우스 (n = 7, 16일, n = 5, 58-66일); scAAV, scAAV8-hSMN-처리된 SMA 마우스 (n = 5, 각 시점에). 값은 평균 ± SEM를 나타낸다.
도 3A-3J는 처리된 및 비처리된 SMA 마우스에서 hSMN 단백질의 세포 소기관 분포 및 척수의 운동 뉴런에서의 발현을 보여준다. hSMN 단백질은 형질도입된 세포의 세포질에서 풍부하게 검출되었다 (도 3A 및 3B). 또한, hSMN 단백질은 삽입도에서 확대된 젬-유사 구조 (화살촉)의 쌍에 의해 예시되는 바와 같이 핵에서 검출되었다 (도 3A). 또한, hSMN 단백질은 뉴런의 수상돌기 (도 3B 및 3C) 및 축색돌기 (도 3D)에서 검출되었다. hSMN 단백질은 비처리된 SMA 마우스로부터의 조직 절편에서 검출될 수 없었다 (도 3E). hSMN 단백질 (도 3F)과 마우스 ChAT (도 3G)의 동일 위치 존재 (co-localization)는 형질도입된 세포의 하위세트가 운동 뉴런임을 보여주었다 (도 3H 및 3I). hSMN 단백질에 대해 면역 양성인 ChAT 세포의 백분율은 16일 (백색 막대) 및 58-66일 (흑색 막대) (도 3J)에서 결정되었다. 값은 평균 ± SEM를 나타낸다.
도 4는 처리된 및 비처리된 SMA 마우스에서 척수 내의 운동 뉴런 세포 수를 보여준다. 각각의 군의 10 ㎛ 조직 절편에 대해 계수된 ChAT 면역 양성 뉴런의 평균수가 제시된다. 수는 상이한 수준의 경수, 흉수, 요수 및 천골 세그먼트로부터 10번째마다 있는 절편의 수를 나타낸다. 값은 평균 ± SEM를 나타낸다. 약어: *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.
도 5A-5C는 처리된 및 비처리된 SMA 마우스에서 근육군으로부터의 근섬유 단면적을 보여준다. 여러 근육군으로부터의 근섬유 단면적은 AAVhSMN1 치료에 의해 증가하였다. 16일 (도 5A) 및 58-66일 (도 5B)에 사두근, 비복근 및 늑간근의 적층 그래프는 근섬유 크기의 분포가 처리된 SMA와 야생형 마우스 사이에서 유사함을 보여주었다. 16일의 총 평균은 근섬유 단면적이 치료에 의해 유의하게 더 높았음을 보여주었다 (도 5C). 또한, 58-66일에 평균 면적은 비복근 및 늑간근에서 처리된 SMA 마우스와 나이 일치된 야생형 사이에서 통계적으로 유사하였다 (도 5C). 값은 평균 ± SEM를 나타낸다. 약어: WT, 비처리된 야생형; HET, 비처리된 이종접합체; SMA, 비처리된 낙아웃; AAV, AAVhSMN1 -처리된 SMA 마우스; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.
도 6A-6F는 처리된 및 비처리된 SMA 마우스에서 근육 내의 NMJ의 구조를 보여준다. 사두근, 비복근, 및 늑간근 내의 구조는 유전자 요법에 의해 개선되었다. 16일에 비처리된 SMA (도 6A), 처리된 SMA (도 6B), 및 비처리된 야생형 (도 6C) 마우스, 및 58-66일에 처리된 SMA (도 6D) 및 비처리된 야생형 (도 6E) 마우스의 사두근으로부터의 신경근 접합부 (NMJ)가 제시된다. 시냅스전 및 시냅스후 NMJ는 각각 신경미세섬유 항체 (녹색) 및 α-붕가로독소 염색 (적색)으로 표지하였다. 주 패널 내의 화살촉은 아래 삽입도에서 강조된 NMJ를 가리킨다. 적어도 100개의 NMJ가 동물 당 각각의 근육에서 무작위로 평가되었다. 정상 NMJ는 도 6A에 제시된 신경미세섬유 단백질의 비정상적인 축적을 보이지 않는 시냅스전 말단을 갖는 것으로 규정되었다. 도 6F에서의 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. 약어: WT, 비처리된 야생형; HET, 비처리된 이종접합체; SMA, 비처리된 낙아웃; AAV, AAVhSMN1 -처리된 SMA 마우스; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001. 축척 막대: 20 ㎛.
도 7A-7F는 처리된 및 비처리된 SMA 마우스에서 거동 시험의 결과를 보여준다. 처리된 SMA 마우스는 거동 시험에서 유의한 개선을 보여주었다. 처리된 SMA (별표) 및 비처리된 야생형 (WT) 마우스는 16일에 비처리된 SMA 마우스 ('x'로 표시됨)보다 실질적으로 건강하였다 (도 7A). 처리된 SMA 마우스는 또한 11일부터 계속 비처리된 SMA 대조군보다 유의하게 더 무거웠다 (도 7B). 처리된 SMA 마우스는 정위 반사 (도 7C), 부주지성 (negative geotaxis) (도 7D), 악력 (도 7E) 및 뒷다리 벌어짐 (도 7F) 시험에 대해 비처리된 SMA 마우스보다 유의하게 더 우수하게 반응하였다. 처리된 SMA 마우스는 12-16일에 정위 반사 및 부주지성 시험에 대해 야생형 및 이종접합체 마우스에서 통계적으로 동일하였다 (도 7C 및 7D). 값은 평균 ± SEM를 나타낸다. 약어: 비처리된 WT (빈 원), 비처리된 이종접합체 (빈 삼각형); 비처리된 SMA (빈 사각형); AAVhSMN1-처리된 SMA 마우스 (막힌 사각형); *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.
도 8은 scAA VhSMN1-처리된 및 비처리된 마우스의 생존을 보여준다. scAA VhSMN1 처리는 SMA 마우스의 생존을 증가시켰다. P0에서 scAA VhSMN1로 처리된 SMA 마우스 (n = 17, 막힌 삼각형)의 중앙 수명은 비처리된 SMA 마우스 (n = 47, 빈 원)에서 16일에 비해 157일이었다 (p < 0.0001).
도 9A-9B (서열 1 및 2)는 대표적인 인간 생존 운동 뉴런 (SMN1) 유전자의 코딩 DNA 서열 (도 9A) 및 대응하는 아미노산 서열 (도 9B)을 보여준다.
도 10a-10f는 scAAV8-hSMN 발현이 SMA 마우스에서 운동 뉴런 수를 증가시키고 NMJ를 개선함을 보여준다. 도 10a는 주사후 16일에 흉수-요수 영역에서 hSMN 발현과 동일 위치에 존재하는 mChAT 면역 양성 세포의 백분율을 보여준다. 도 10b-10f는 요수 (도 10b), 흉수 (도 10c), 및 경수 (도 10d) 세그먼트에서 mChAT 면역 양성 세포의 평균수, 및 16, 58-66 및 214-269일에 사두근 (도 10e) 및 늑간근 (도 10f)에서 붕괴된 NMJ의 평균 백분율을 보여준다. 도 10e 및 10f를 참고로 하여, 비처리된 SMA 마우스의 사두근 및 늑간근 내의 75-90%의 NMJ는 16일에 비정상적인 붕괴된 구조 구조를 보유하였다 (도 6F 참조). 약어 및 n-값: SMA, 비처리된 낙아웃 (빈 막대, n = 8, 16일), AAV, AAV8-hSMN (빗금친 막대, n = 8, 16일; n = 5, 58-66일); scAAV, scAAV8-hSMN (막힌 막대, n = 5, 각각의 시점에서); WT, 비처리된 WT (체크무늬 막대, n = 8, 16일; n = 5, 각각 58-66 및 216-269일에). 값은 평균 ± SEM를 나타낸다. 통계적 비교는 16일에 일원 (one-way) ANOVA 및 본페로니 (Bonferroni) 다중 사후 시험을 사용하여 수행하였다 (도 10b-10f). 양측 비쌍체 스튜던트 (unpairedtwo-tailedstudent) t-시험은 1) 16일 (도 10a) 및 58-66일 (도 10b-10d)에 2개의 벡터를; 2) scAAV8-hSMN 처리를 실시한 58-66d 및 214-269d 군에서 ChAT 세포의 상대적인 수 (도 10b-10d)를; 3) 214-269일에 나이 일치된 비처리된 WT와 scAAV8-hSMN-처리된 SMA 마우스 사이의 비정상적인 NMJ의 상대적인 수 (E, F)를 비교하였다; *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001.
본 발명의 실시는 달리 지시하지 않으면, 당업계의 기술 내의 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 면역학의 통상적인 방법을 이용할 것이다. 상기 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.)]; [Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and CC. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications)];[T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)]; [A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers,Inc., currentaddition)]; [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]; [Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)]을 참조한다.
본원에서 언급되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
1. 정의
본 발명을 설명할 때, 하기 용어가 사용될 것이고, 아래에 나타낸 바와 같이 규정되고자 의도된다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 ("a', "an" 및 "the")는 내용이 명백하게 달리 지시하지 않으면 복수의 의미도 포함하는 것임을 유의하여야 한다. 예를 들어, "인터류킨 수용체"는 2종 이상의 상기 수용체를 포함한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질", 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 천연 서열, 그의 변이체 또는 그의 단편을 나타내는 단백질 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 목적하는 활성을 유지하는 한, 신호 서열이 존재하거나 존재하지 않는 전장 단백질, 및 그의 단편, 및 천연 서열에 대한 변형, 예를 들어 결실, 부가 및 치환 (특성상 보존적 또는 비-보존적)이 존재하는 단백질이 본원에서 사용하기 위해 의도된다. 상기 변형은 부위 지정 돌연변이 유발을 통해서와 같이 의도적일 수 있거나, 또는 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭에 의한 오류를 통해서와 같이 우연히 발생할 수 있다. 따라서, 모 서열에 실질적으로 상동성인 활성 단백질, 예를 들어 천연 분자의 목적하는 활성을 보유하는, 70...80...85...90...95...98...99% 등의 동일성을 갖는 단백질이 본원에서 사용하기 위해 고려된다.
"천연" 폴리펩티드, 예를 들어 생존 운동 뉴런 (SMN) 폴리펩티드는 자연에서 유래하는 대응하는 분자와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 천연 서열은 자연에서 단리될 수 있거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 용어 "천연" 서열은 구체적으로 특정 분자의 천연 생성 말단절단된 (truncated) 또는 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 폴리펩티드의 천연 생성 변이체 형태 (예를 들어, 별법으로 스플라이싱된 형태) 및 천연 생성 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 천연 분자는 첨부 도면에 제시된 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열이다. 그러나, 첨부 도면에 개시된 분자의 일부는 도면에서 아미노산 위치 1로 지정된 메티오닌 잔기로 시작하지만, 도면에서 아미노산 위치 1의 상류 또는 하류에 위치하는 다른 메티오닌 잔기도 특정 분자의 출발 아미노산 잔기로서 사용될 수 있다. 별법으로, 사용되는 발현 시스템에 따라, 본원에 설명되는 분자에는 N-말단 메티오닌이 결여될 수 있다.
"변이체"는 대응하는 전장 천연 서열과 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 본원에서 규정된 활성 폴리펩티드, 신호 펩티드가 결여된 폴리펩티드, 신호 펩티드가 존재하거나 존재하지 않는 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편을 의미한다. 그러한 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기가 전장 천연 아미노산 서열의 N- 및/또는 C-말단에서 부가되거나 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, 변이체는 대응하는 전장 천연 서열에 대해 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 81%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 82%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 83%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 84%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 85%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 86%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 87%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 88%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 89%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 90%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 91%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 92%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 93%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 94%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 95%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 96%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 97%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 98%의 아미노산 서열 동일성 및 별법으로 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 통상적으로, 변이체 폴리펩티드의 길이는 적어도 약 10개의 아미노산, 예를 들어 적어도 약 20개의 아미노산, 예를 들어, 적어도 약 30개의 아미노산, 별법으로 적어도 약 40개의 아미노산, 별법으로 적어도 약 50개의 아미노산, 별법으로 적어도 약 60개의 아미노산, 별법으로 적어도 약 70개의 아미노산, 별법으로 적어도 약 80개의 아미노산, 별법으로 적어도 약 90개의 아미노산, 별법으로 적어도 약 100개의 아미노산, 별법으로 적어도 약 150개의 아미노산, 별법으로 적어도 약 200개의 아미노산, 별법으로 적어도 약 300개의 아미노산, 또는 이보다 많은 아미노산의 길이이다.
특히 바람직한 변이체는 특성상 보존적인 치환, 즉, 그의 측쇄에 관련된 일군의 아미노산 내에서 발생하는 치환을 포함한다. 구체적으로, 아미노산은 일반적으로 다음 4개의 군으로 분류된다: (1) 산성: 아스파르테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성: 라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성: 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린 트레오닌, 타이로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 타이로신은 때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 예를 들어, 류신의 이소류신 또는 발린으로의, 아스파르테이트의 글루타메이트로의, 트레오닌의 세린으로의 교체, 또는 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 보존적 교체가 생물학적 활성에 대해 큰 효과를 갖지 않을 것임이 합리적으로 예측될 수 있다. 예를 들어, 관심있는 폴리펩티드는 목적하는 분자의 기능이 그대로 유지된다면, 약 5-10개까지의 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 또는 심지어 약 15-25 또는 50개의 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 또는 5-50개 사이의 임의의 수의 치환을 포함할 수 있다.
"상동성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 모이어티 (moiety) 사이의 동일성 백분율을 의미한다. 2개의 DNA, 또는 2개의 폴리펩티드 서열은 서열이 분자의 규정된 길이에 걸쳐서 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 보다 바람직하게는 적어도 약 80%-85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%-98%의 서열 동일성을 보일 때 서로 "실질적으로 상동성"이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 실질적으로 상동성은 또한 특정된 DNA 또는 폴리펩티드 서열에 완전한 동일성을 보이는 서열을 지칭한다.
일반적으로, "동일성"은 각각 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 일치를 의미한다. 동일성 백분율은 서열을 정렬하고, 2개의 정렬된 서열 사이에 일치하는 정확한 수를 계수하고, 더 짧은 서열의 길이로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 두 분자 사이의 서열 정보를 직접적으로 비교함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 분석을 위해 문헌 [Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981]의 국소 상동성 알고리즘을 변용한 ALIGN (Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl.3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC)과 같은 쉽게 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 분석을 도울 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 결정하기 위한 프로그램, 예를 들어 스미스 및 워터맨 (Smith and Waterman) 알고리즘도 이용하는 BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램은 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지, 버전 8 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8) (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group)으로부터 입수가능)로 이용가능하다. 상기 프로그램은 제조자에 의해 권장되고 상기 언급한 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지에 기재된 디폴트 파라미터와 함께 쉽게 이용된다. 예를 들어, 특정 뉴클레오티드 서열의 참조 서열에 대한 동일성 백분율은 디폴트 스코어링 표 (scoring table) 및 6개의 뉴클레오티드 위치의 갭 페널티 (gap penalty)와 함께 스미스 및 워터맨의 상동성 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 측면에서 동일성 백분율을 확립하는 또 다른 방법은 존 에프. 코린스 등 (John F. Collins, Shane S. Sturrok)에 의해 개발되어 에든버러 대학교 (University of Edinburgh)가 저작권을 갖고 인텔리제네틱스, 인크. (IntelliGenetics, Inc., 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)에 의해 배포되는 MPSRCH 프로그램 패키지를 사용하는 것이다. 상기 패키지 세트로부터 스미스-워터맨 알고리즘을 사용할 수 있고, 여기서 스코어링 표에 대한 디폴트 파라미터가 사용된다 (예를 들어, 갭 개방 페널티 12, 갭 연장 페널티 1, 및 갭 6). 생성된 데이타로부터, "일치" 값은 "서열 동일성"을 반영한다. 서열 사이의 동일성 또는 유사성 백분율을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 당업계에 일반적으로 공지되어 있고, 예를 들어 또 다른 정렬 프로그램은 BLAST로서 디폴트 파라미터와 함께 사용된다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP가 다음 디폴트 파라미터를 사용하여 사용될 수 있다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 이중; 컷오프 (cutoff) = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50 서열; 분류 = 높은 스코어 (HIGH SCORE); 데이타베이스 = 비-중복성 (non-redundant), GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + Swiss 단백질 + Spupdate + PIR. 상기 프로그램의 상세한 내용은 당업계에 잘 공지되어 있다.
별법으로, 상동성은 상동성 영역 사이의 안정한 이중체를 형성하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화, 이어서 단일가닥-특이적 뉴클레아제(들)에 의한 소화, 및 소화된 단편의 크기 결정에 의해 결정될 수 있다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은 예를 들어 특정 시스템에 대해 규정되는 엄격한 조건 하에 서던 (Southern) 혼성화 실험에서 확인될 수 있다. 적절한 혼성화 조건은 당업계의 기술 범위 내에서 규정된다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]; [DNA Cloning, 상기 문헌]; [Nucleic Acid Hybridization, 상기 문헌]을 참조한다.
용어 "축퇴성 (degenerate) 변이체"는, 축퇴성 변이체가 그로부터 유래되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 그의 핵산 서열에 변화를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의도한다.
"코딩 서열" 또는 선택된 폴리펩티드를 "코딩하는" 서열은 적절한 조절 서열의 제어 하에 위치할 때 생체 내에서 전사되고 (DNA의 경우) 폴리펩티드로 번역되는 (mRNA의 경우에) 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단의 출발 코돈 및 3' (카르복시) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 코딩 서열의 3'에 위치한다.
"벡터"는 적합한 제어 요소와 회합될 때 복제할 수 있고 유전자 서열을 세포로 전달할 수 있는 다른 유전자 요소, 예를 들어 플라스미드, 파지, 트랜스포존 (transposon), 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 등을 의미한다. 따라서, 이 용어는 클로닝 및 발현 비히클, 및 바이러스 벡터를 포함한다.
"재조합 벡터"는 생체 내에서 발현될 수 있는 이종성 핵산 서열을 포함하는 벡터를 의미한다.
"재조합 바이러스"는 예를 들어 이종성 핵산 구성체의 입자 내로의 부가 또는 삽입에 의해 유전적으로 변경된 바이러스를 의미한다.
용어 "도입유전자"는 세포 내로 도입되어 RNA로 전사될 수 있고, 임의로 적절한 조건 하에 번역 및/또는 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 한 측면에서, 이 유전자는 도입되는 세포에 목적하는 특성을 부여하거나, 또는 목적하는 치료 또는 진단 결과를 유도한다.
바이러스 역가에 대해 사용되는 용어 "게놈 입자 (gp)", 또는 "게놈 동등물"은 감염성 또는 기능성에 상관 없이 재조합 AAV DNA 게놈을 함유하는 비리온의 수를 의미한다. 특정 벡터 제제 내의 게놈 입자의 수는 본원의 실시예, 또는 예를 들어 문헌 [Clark et al., Hum.Gene Ther. (1999) 10:1031-1039]; 및 [Veldwijk et al., Mol. Ther. (2002) 6:272-278]에 기재된 절차에 의해 측정될 수 있다.
바이러스 역가에 대해 사용되는 용어 "감염 단위 (iu)", "감염성 입자", 또는 "복제 단위"는 예를 들어 문헌 [McLaughlin et al., J. Virol. (1988) 62:1963-1973]에 기재된 바와 같이 복제 중심 분석으로도 알려진 감염성 중심 분석에 의해 측정되는 감염성 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 의미한다.
바이러스 역가에 대해 사용되는 용어 "형질도입 단위 (tu)"는 본원의 실시예, 또는 예를 들어 문헌 [Xiao et al., Exp. Neurobiol. (1997) 144:113-124]; 또는 [Fisher et al., J. Virol. (1996) 70:520-532 (LFU 분석)]에 기재된 것과 같은 기능 분석에서 측정되는 기능성 도입유전자 산물의 생산을 유발하는 감염성 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 의미한다.
용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 나타내기 위해 사용되고, 세포는 외인성 DNA가 세포막 내로 도입될 때 "형질감염된다". 많은 형질감염 기술은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Graham et al. (1973) Virology, 52:456], [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York], [Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier], 및 [Chu et al. (1981) Gene 13:197]을 참조한다. 상기 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적합한 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다.
코딩 서열 및 제어 서열과 같은 핵산 서열에 관련될 때, 용어 "이종성"은 정상적으로는 함께 연결되지 않고/않거나 정상적으로 특정 세포와 회합되지 않는 서열을 나타낸다. 따라서, 핵산 구성체 또는 벡터의 "이종성" 영역은 자연에서 다른 분자와 회합된 상태로 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내의 또는 또 다른 핵산 분자에 부착된 핵산의 세그먼트이다. 예를 들어, 핵산 구성체의 이종성 영역은 자연에서 코딩 서열과 회합된 상태로 발견되지 않는 서열이 측면에 인접하는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이종성 코딩 서열의 또 다른 예는 코딩 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 구성체 (예를 들어, 천연 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열)이다. 유사하게, 정상적으로는 세포에 존재하지 않는 구성체로 형질전환된 세포는 본 발명의 목적을 위해 이종성으로 간주될 것이다. 대립유전자 변이 또는 천연 생성 돌연변이 사건은 본원에서 사용되는 바오 같이 이종성 DNA를 생성하지 않는다.
"핵산" 서열은 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이 용어는 임의의 DNA 및 RNA의 공지의 염기 유사체, 비제한적인 예를 들어 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록실-메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸-아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도-우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸-시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시-아미노-메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하는 서열을 포함한다.
용어 DNA "제어 서열"은 수용 세포에서 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 전체적으로 제공하는 프로모터 서열, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보좀 진입 부위 ("IRES"), 인핸서 등을 총칭하는 것이다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제되고, 전사되고, 번역될 수 있다면, 상기 제어 서열의 전부가 항상 존재할 필요는 없다.
용어 "프로모터"는 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오티드 영역을 의미하기 위해 그의 통상적인 의미로 본원에서 사용되고, 여기서 조절 서열은 RNA 중합효소에 결합하여 하류의 (3'-방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유래한다. 전사 프로모터는 "유도가능 프로모터" (프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도됨), "억제가능 프로모터" (프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 억제됨), 및 "구성적 프로모터"를 포함할 수 있다.
"작동가능하게 연결된"은 설명되는 성분이 그의 통상적인 기능을 수행할 수 있는 형태로 배열된 요소의 배열을 의미한다. 따라서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제어 서열은 코딩 서열의 발현을 유도할 수 있다. 제어 서열은 코딩 서열의 발현을 지시하도록 기능한다면 코딩 서열에 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 번역되지 않지만 전사되는 개재 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 계속 간주될 수 있다.
용어 "신경계"는 중추신경계 및 말초신경계를 모두 포함한다. 용어 "중추신경계" 또는 "CNS"는 척추동물의 뇌 및 척수의 모든 세포 및 조직을 포함한다. 용어 "말초신경계"는 뇌 및 척수 이외의 신경계의 부분의 모든 세포 및 조직을 나타낸다. 따라서, 용어 "신경계"는 뉴런 세포, 아교 세포, 성상세포, 뇌척수액 (CSF) 내의 세포, 간질 공간 내의 세포, 척수의 보호막 내의 세포, 경막외 세포 (즉, 경질막 외부의 세포), 신경 조직에 인접하거나 접촉하거나 신경이 통하는 비-신경 조직 내의 세포, 신경외막, 신경다발막, 신경내막, 섬유단, 다발 내의 세포 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 목적을 위해 "활성의" 또는 "활성"은 대응하는 천연 또는 천연 생성 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유하는 치료 단백질의 형태를 의미한다. 활성은 대응하는 천연 또는 천연 생성 폴리펩티드에서 관찰되는 것보다 크거나, 같거나 또는 작을 수 있다.
뉴클레오티드 서열을 언급할 때 "단리된"은 나타낸 분자가 동일한 종류의 다른 생물학적 거대분자의 실질적인 부재 하에 존재함을 의미한다. 따라서, "특정 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자"는 해당 폴리펩티드를 코딩하지 않는 다른 핵산 분자가 실질적으로 존재하지 않는 핵산 분자를 의미하지만; 분자는 조성물의 기본 특징에 유해한 영향을 주지 않는 몇몇의 추가의 염기 또는 모이어티를 포함할 수 있다.
본원의 전체에 걸쳐서 특정 핵산 분자 내의 뉴클레오티드 서열의 상대적인 위치를 설명하기 위해서, 예를 들어 특정 뉴클레오티드 서열이 또 다른 서열에 대해 "상류", "하류", "3-프라임 (3')" 또는 "5-프라임 (5')"에 위치하는 것으로 설명할 때, 그 위치는 당업계에서 통상적인 것으로 언급되는 DNA 분자의 "센스" 또는 "코딩" 가닥 내의 서열의 위치임이 이해되어야 한다.
특히 제시된 양에 대해 용어 "약"은 +5% 또는 -5%의 편차를 포함하는 의미이다.
용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 척추동물, 바람직하게는 포유동물을 의미한다. 포유동물은 쥐, 설치류, 유인원, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완동물을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조정하다"는 예를 들어 향상시키고, 증가시키다, 감소시키거나, 저하시키거나 또는 제거하는 효과 또는 결과의 양 또는 강도를 변경하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개선하다"는 "완화하다"와 동의어이고, 저하 또는 경감시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 질병 또는 질환의 증상은 질병 또는 질병의 증상을 덜 심각하도록 만듦으로써 개선할 수 있다.
본원에서 제시되는 조성물 또는 물질의 용어 "치료", "유효량" 또는 "치료 유효량"은 대상체에서 목적하는 반응, 예를 들어 예방, 발병의 지연 또는 증상의 개선 또는 목적하는 생물학적 결과, 예를 들어 운동 뉴런 질병과 연관된 신경병상, 예를 들어, 세포 병상, 예를 들어 척수성 근 위축증 (SMA)의 교정의 달성에 충분한 조성물 또는 물질의 양을 의미한다. 용어 "치료 교정"은 대상체에서 예방 또는 발병의 지연 또는 증상의 개선을 유도하는 교정을 의미한다. 정확한 필요량은 대상체의 종, 나이 및 일반적인 상태, 치료되는 병태의 중증도, 및 관심있는 특정 거대분자, 투여 방식 등에 따라 대상체별로 상이할 것이다. 다른 개별적인 환자에서 적절한 "효과적인" 양은 일상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
특정 질병을 "치료" 또는 "치료하는"은 다음을 포함한다: (1) 질병의 예방, 즉 질병에 노출되거나 소인이 있지만 아직 질병의 증상을 경험하지 않거나 보이지 않는 대상체에서 질병의 발생을 예방하거나 질병이 더 낮은 강도로 발생하도록 하는 것, (2) 질병의 억제, 즉, 발생의 정지 또는 질병 상태의 역전, 또는 (3) 질병의 증상 경감, 즉, 대상체가 겪는 증상의 수 감소, 및 질병과 연관된 세포 병상의 변화.
2. 발명을 수행하는 방식
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명이 특정 제형 또는 공정 파라미터로 제한되지 않고, 이들이 변할 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 본 발명의 특정 실시양태를 설명하기 위한 것으로서, 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다.
본원에 설명되는 것에 유사하거나 동등한 많은 방법 및 물질이 본 발명의 실행시에 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 설명된다.
본 발명의 중심을 이루는 것은 인간 생존 운동 뉴런 1 (hSMN1) cDNA를 함유하는 rAAV 비리온을 척수성 근 위축증 (SMA)의 침습성 마우스 모델의 CNS에 전달하면 척수 전체에 걸친 SMN1의 발현이 유도된다는 발견이다. 처리된 SMA 마우스는 비처리된 나이 일치된 돌연변이체에 비해 보다 많은 수의 운동 뉴런을 함유하였다. 추가로, 근섬유 크기의 평가를 통해, 처리된 SMA 마우스에서 다양한 근육군으로부터의 개별적인 근섬유의 크기가 야생형 마우스에서 관찰되는 것과 유사함이 입증되었다. 또한, 처리된 SMA 마우스에서 신경근 접합부 (NMJ)의 구조는 시냅스전 말단에서 신경미세섬유 단백질의 비정상적인 축적을 보인 비처리된 SMA에 대조적으로 야생형 마우스와 유사하였다. 또한, 처리된 SMA 마우스는 일련의 거동 시험에 대해 유의한 개선을 보였고, 이것은 NMJ가 기능성임을 시사한다. 중요하게는, 재조합 AAV 처리된 마우스는 비처리된 대응 마우스에 비해 수명이 유의하게 증가하였다. 자가-상보성 rAAV 벡터로 처리된 SMA 마우스는 또한 통상적인 비-자가-상보성 rAAV 벡터를 사용한 처리에 비해서도 중앙값 생존의 현저한 개선을 보였다.
상기 결과는 CNS-지향, AAV-매개된 SMN1 유전자 증가가 SMA의 뉴런 및 근육 병상 둘 다를 처리할 때 효능이 높음을 입증하고, 뉴런 및 근육 병상, 예를 들어 SMA, 및 운동 기능에 영향을 주는 다른 질병의 치료 및 예방을 위한 치료 전략으로서 바이러스 유전자 요법의 유용성을 증명한다. 본원에 설명되는 유전자 요법 기술은 단독으로, 또는 전통적인 약물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 이해를 촉진하기 위해서, 운동 뉴런 병상 및 치료 분자, 및 본 발명과 함께 사용하기 위한 다양한 유전자 전달 방법에 대한 보다 상세한 논의를 아래에 제시한다.
운동 뉴런 병상 및 치료 분자
본 발명은 운동 뉴런 질환 또는 운동 뉴런 손상으로 고통받는 대상체에서 운동 기능을 조정하거나, 교정하거나 또는 증가시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 단지 예시를 위해, 대상체는 척수성 근 위축증 (SMA), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 척수성 연수근 위축, 척수소뇌성 실조증, 원발성 측삭 경화증 (PLS), 또는 외상성 척수 손상 중의 하나 이상으로 고통받을 수 있다. 특정 이론에 매이지 않지만, 운동 뉴런 손상에 연관된 병상은 운동 뉴런 변성, 신경아교증, 신경미세섬유 이상, 피질척수로 및 복측근 내의 수초화 섬유 (myelinated fiber)의 손실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다음과 같은 두 종류의 발병이 알려졌다 - 상부 운동 뉴런 (피질 및 뇌간 운동 뉴런)에 영향을 주고 안면 근육, 말하기, 및 삼킴에 영향을 주는 연수 발병; 및 하부 운동 뉴런 (척수 운동 뉴런)에 영향을 주고 강직, 전신 쇠약, 근육 위축, 마비, 및 호흡 부전에 의해 반영되는 사지 발병. ALS에서, 대상체는 연수 및 사지 발병을 모두 갖는다. PLS에서, 대상체는 단지 연수 발병만을 갖는다.
따라서, 특정 실시양태에서, CNS에서 그의 발현이 신경병상의 적어도 부분적인 교정 및/또는 질병 진행의 안정화, 예를 들어 대상체에서 예방, 발병의 지연 또는 증상의 개선 또는 예를 들어 상기한 운동 뉴런 질병과 연관된 세포 병상의 변화를 포함하여 목적하는 생물학적 결과의 달성을 유도하는 생물학적 활성 분자를 코딩하는 rAAV 구성체가 대상체에게 제공된다.
예로서, rAAV 구성체에 존재하는 도입유전자는 생존 운동 뉴런 단백질 (SMN1 유전자 또는 SMN2 유전자를 통한), 인슐린 성장 인자-1 (IGF-I), 칼빈딘 D28, 파르브알부민, HIF1-알파, SIRT-2, VEGF, 예를 들어 VEGF165, CNTF (섬모 신경친화성 인자), 소닉 헤지호그 (sonic hedgehog) (shh), 에리트로포이에틴 (EPO), 라이실 옥시다제 (LOX), 프로그라눌린, 프로락틴, 그렐린 (ghrelin), 뉴로세르핀, 안지오제닌, 및 태반 락토겐일 수 있고, 이로 제한되지 않는다.
SMA (상염색체 열성 신경근육계 질환)의 분자 기초는 SMN 텔로머릭 (Telomeric)으로도 알려진 생존 운동 뉴런 유전자 1 (SMN1)의 동종접합성 손실이다. SMN 센트로머릭 (Centromeric)으로도 알려지고 SMN2로 칭해지는, SMN1 유전자의 거의 동일한 카피가 인간에서 발견되고, 질병 중증도를 조정한다. 정상 SMN1 유전자의 발현은 단지 생존 운동 뉴런 (SMN) 단백질의 발현을 유도한다. SMN2 유전자의 발현은 약 10-20%의 SMN 단백질 및 80-90%의 불안정성/비-기능성 SMNdelta7 단백질을 생성시킨다. 단지 10%의 SMN2 전사체만이 SMN1과 동일한 기능성 전장 단백질을 코딩한다. 두 유전자 사이의 상기 기능적 차이는 대부분의 SMN2 전사체에서 엑손 7을 건너뛰도록 하는 엑손 스플라이싱 인핸서를 붕괴시키는 번역상 침묵 돌연변이에 기인한다. SMN 단백질은 스플라이스좀의 조립에서 잘 확립된 역할을 수행하고, 뉴런의 축색돌기 및 신경 말단에서 mRNA 이동 (trafficking)도 매개할 수 있다.
다양한 SMN1 분자 및 SMN 단백질의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 알려져 있다. 예를 들어, 도 9A-9B; NCBI 기탁 번호 NM 000344 (인간), NP 000335 (인간), NM 011420 (마우스), EU 791616 (돼지), NM 001131470 (오랑우탄), NM_131191 (제브라피쉬 (zebrafish)), BC062404 (래트), NM_001009328 (고양이), NM_001003226 (개), NM_175701 (소) 참조. 유사하게, 다양한 SMN2 서열이 공지되어 있다. 예를 들어, NCBI 기탁 번호 NM_022876, NM_022877, NM_017411, NG_008728, BC_000908, BC070242, DQ185039 (모든 인간) 참조.
인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-I)은 상이한 수준의 신경축에서 그의 많은 작용에 의해 운동 뉴런 질환을 포함하는 신경변성 질환의 치료를 위한 치료 단백질이다 ([Dore et al., Trends Neurosci (1997) 20:326-331] 참조). 예를 들어, 뇌에서, 이것은 뉴런 및 아교세포 세포자멸을 모두 감소시키고, 철, 콜히친, 칼슘 탈안정화제, 퍼옥시드, 및 시토킨에 의해 유발되는 독성에 대해 뉴런을 보호하는 것으로 생각된다. 또한, 이것은 신경전달물질인 아세틸콜린 및 글루타메이트의 방출을 조정하고 신경미세섬유, 튜불린, 및 미엘린 염기성 단백질의 발현을 유도하는 것으로 보인다. 척수에서, IGF-I은 ChAT 활성을 조정하고 콜린성 표현형의 감소를 완화시키고, 운동 뉴런 발아 (sprouting)를 향상시키고, 수초화를 증가시키고, 탈수초화를 억제하고, 전구체 세포로부터 운동 뉴런 증식 및 분화를 자극하고, 슈반 (Schwann) 세포 분할, 성숙, 및 성장을 촉진하는 것으로 생각된다. 근육에서, IGF-I은 신경근 접합부에서 아세틸콜린 수용체 클러스터 형성을 유도하고, 신경근 기능 및 근육 강도를 증가시키는 것으로 보인다.
IGF-I 유전자는 당업계에 잘 공지된 복합체 구조를 갖는다. 이것은 유전자 전사체로부터 발생하는 적어도 2개의 교대로 스플라이싱된 mRNA 산물을 갖는다. IGF-IA 또는 IGF-IEa를 포함하는 여러 명칭으로 알려진 153개 아미노산의 펩티드, 및 IGF-IB 또는 IGF-IEb를 포함하는 여러 명칭으로 알려진 195개 아미노산의 펩티드가 존재한다. 또한, Eb 형태는 인간에서 Ec로서 알려져 있다. 성숙 형태의 IGF-I은 70개 아미노산의 폴리펩티드이다. IGF-IEa 및 IGF-IEb 둘 다는 70개 아미노산의 성숙 펩티드를 함유하지만, 그의 카르복실-말단 연장부의 서열 및 길이에서 상이하다. IGF-I 단백질, 및 IGF-IEa 및 IGF-IEb의 펩티드 서열은 알려져 있고, 예를 들어 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 국제 특허 출원 공개 WO 2007/146046에 기재되어 있다. 인간 IGF-I의 게놈 및 기능성 cDNA, 및 IGF-I 유전자 및 그의 산물에 대한 추가의 정보는 Unigene 기탁 번호 NM_000618에서 입수할 수 있다.
칼빈딘 D28K (칼빈딘 D28로도 언급됨) 및 파르브알부민은 칼슘 완충에 관여하는 것으로 생각되는 칼슘-결합 단백질이다. 특정 이론에 매이지 원하지 않지만, 칼슘 항상성은 운동 뉴런 질환 (예를 들어, ALS)이 있는 대상체에서 변경되는 것으로 보이고, 낮은 수준의 칼빈딘-D28K 및/또는 파르브알부민은 증가된 칼슘 로드 (load)를 처리하는 운동 뉴런의 능력을 감소시킴으로써 운동 뉴런의 취약성을 증가시킬 수 있다. 상기 감소는 세포 손상 및 궁극적인 운동 뉴런 사멸을 유발할 수 있다. 추가의 증거는 칼슘-결합 단백질, 예를 들어 칼빈딘 D28K 및 파르브알부민이 풍부한 뉴런은 변성에 저항성임을 제안한다.
HIF-I은 다음과 같은 2개의 하위단위로 이루어진 이종이량체 단백질이다: (i) 아릴 탄화수소 핵 이동제 (ARNT)로도 알려진 구성적으로 발현되는 β 하위단위 (다른 관련 전사 인자 (예를 들어, 디옥신/아릴 탄화수소 수용체 (DR/AhR)에 의해 공유됨); 및 (ii) α 하위단위 (예를 들어, HIF-Iα의 최근의 친화도 정제 및 분자 클로닝을 설명하고 있는 국제 특허 출원 공개 WO 96/39426 참조). 두 하위단위는 전사 인자의 기본적인 나선-루프-나선 (bHLH)-PAS 패밀리의 구성원이다. 상기 도메인은 DNA 결합 및 이량체화를 조절한다. 전이활성화 (transactivation) 도메인은 단백질의 C-말단에 위치한다. 기본적인 영역은 직접적인 DNA 결합을 책임지는 약 15개의 우세하게 염기성인 아미노산으로 구성된다. 상기 영역은 패밀리 구성원 사이의 1차 이량체화 계면을 형성하는 가변 길이의 루프에 의해 분리된 2개의 양친매성 α 나선에 인접한다 (Moore, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:10436-10441). PAS 도메인은 PAS A 및 PAS B로 지정된 2개의 약하게 보존된, 주로 소수성의 영역 (약 50개 아미노산)을 함유하는 200-300 아미노산을 포함한다. HIF-Iα 하위단위는 정상 산소 농도 (normoxic) 조건 동안 불안정하고, 정상 산소 수준 하에서 배양된 세포에서 상기 하위단위의 과다발현은 정상적으로는 저산소증에 의해 유도되는 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 저산소증-유도가능 인자 단백질의 C 말단 (또는 전이활성화) 영역을 전사 활성제 단백질, 예를 들어, 단순 포진 바이러스 (HSV) VP16, NFκB 또는 효모 전사 인자 GAL4 및 GCN4로부터의 강력한 전이활성화 도메인으로의 교체는 정상 산소 농도 하에서 단백질을 안정화하고 강력한 구성적 전사 활성화를 제공하기 위해 설계된다. 예를 들어, HIF-Iα로부터의 DNA-결합 및 이량체화 도메인 및 HSV VP16 단백질로부터의 전이활성화 도메인으로 구성된 하이브리드/키메라 (chimera) 융합 단백질인 대표적인 안정화된 저산소증-유도가능 인자 단백질의 설명 및 서열에 대해서는 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 국제 특허 출원 공개 WO 2008/042420을 참조한다. 또한, 구성적으로 안정한 하이브리드 HIF-Iα의 설명에 대해서는 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,432,927 및 7,053,062를 참조한다.
혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 패밀리의 구성원은 혈관 생물학의 가장 강력한 조정인자에 속한다. 이들은 혈관생성, 혈관신생, 및 혈관 유지를 조절한다. VEGF의 4개의 상이한 분자 변이체가 설명되었다. 165개 아미노산의 변이체가 정상 세포 및 조직에서 발견되는 우세한 분자 형태이다. 위치 116 및 159 사이의 44개의 아미노산이 결실된, 덜 풍부한 보다 짧은 형태 (VEGF121), 위치 116에 24개의 염기성 잔기가 삽입된 보다 긴 형태 (VEGF189), 및 VEGF189에서 발견되는 24개의 아미노산 삽입을 포함하는 41개의 아미노산이 삽입된 또 다른 보다 긴 형태 (VEGF206)도 알려져 있다. VEGF121 및 VEGF165는 가용성 단백질이다. VEGF189 및 VEGF206은 주로 세포에 결합된 것으로 보인다. VEGF의 모든 버전은 생물학적 활성을 갖는다. 예를 들어, VEGF165 (또한, GenBank 기탁 번호 AB021221 참조), VEGF121 (또한, GenBank 기탁 번호 AF214570 참조) 및 VEGF189의 서열을 설명하는 문헌 [Tischer et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:11947-11954]; 및 VEGF206의 서열을 설명하는 [Houck et al., Mol. Endocrinol. (1991) 5:1806-1814]을 참조한다.
CNTF (섬모 신경친화성 인자)는 말초 신경계 및 중추신경계 내의 아교 세포에 의해 발현되는 뉴로시토킨 (neurocytokine)이다. CNTF는 일반적으로 비-뉴런 및 뉴런 세포 종류의 지지 및 생존에서 그의 기능에 대해 인정되고 있다. 예를 들어, 문헌 [Vergara, C and Ramirez, B; Brain Res, Brain Res. Rev. (2004) 47: 161-73]을 참조한다.
소닉 헤지호그 (Shh)는 뉴런 및 아교 세포 생존을 포함하는 중요한 발달 과정을 제어한다.
에리트로포이에틴 (EPO)은 적혈구 전구 세포의 주요 조절인자이다. 그러나, 이것은 신경계에서 기능적으로 발현되고, 신경보호 효과를 갖는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Bartesaghi, S., 2005. Neurotoxicology, 26:923-8]을 참조한다. 인간 및 다른 포유동물 EPO를 코딩하는 유전자가 클로닝, 서열결정 및 발현되었고, 여러 종들에 걸쳐 코딩 영역에서 고도의 서열 상동성을 보인다 (Wen et al., Blood (1993) 82: 1507-1516). 천연 인간 EPO를 코딩하는 유전자의 서열, 및 이를 얻는 방법은 예를 들어 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 4,954,437 및 4,703,008, 및 문헌 [Jacobs et al. (1985) Nature 313:806-810]; [Lin et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7580]; 국제 특허 출원 공개 WO 85/02610; 및 유럽 특허 출원 공개 232,034 B1에 기재되어 있다. 추가로, 천연 고양이, 개 및 돼지 EPO를 코딩하는 유전자의 서열은 공지되어 있고 쉽게 이용가능하고 (각각 GenBank 기탁 번호: L10606; L13027; 및 L10607), 및 원숭이 (마카카 물라토 (Macaca mulatto))EPO를 코딩하는 유전자의 서열도 공지되어 있고 이용가능하다 (GenBank 기탁 번호: L10609).
라이실 옥시다제 (LOX)는 펩티딜 라이신의 측쇄를 산화시켜 특정 라이신 잔기를 알파-아미노아디프산-델타-세미알데히드로 전환시킨다. 이것은 예를 들어 콜라겐 및 엘라스틴의 성분 사슬의 공유 가교결합을 가능하게 하는 번역후 변화이다. 이것은 세포외 기질 내에 상기 단백질의 섬유상 침적물을 안정화시킨다. 또한, LOX는 다양한 양이온성 단백질 내의 라이신을 산화시킬 수 있고, 이것은 그의 기능이 안정화 또는 세포외 기질보다 더 넓음을 시사한다. LOX는 프리단백질 (preprotein)로서 합성되고; 세포로부터 proLOX로서 나타나고, 단백질 분해에 의해 활성 효소로 처리된다 (예를 들어, 문헌 [Lucero, HA and Kagan, HM, Cell Mol. Life Sci. (2006) 63:2304-2316] 참조).
프로그라눌린 (PGRN)은 다면발현성 단백질이다. 유전자 내의 돌연변이는 전두측두엽 변성을 야기한다. CNS 내의 PGRN은 미세아교세포 및 뉴런에 의해 발현되고, 뇌 발달에서 일정 역할을 수행한다. 또한, PGRN은 발생, 상처 치유 및 종양형성을 포함하는 여러 "조직 모델링 (modeling)" 과정에 관여한다. PGRN은 엘라스타제 효소에 의해 그라눌린 (GRN)으로 전환된다. 프로그라눌린은 영양성 (trophic) 특성을 갖지만, GRN은 염증 매개제에 보다 유사하다. CNS 질병의 동물 모델로부터의 유전자 발현 연구는 미세 아교 세포 활성화 및 염증과 함께 PRGN의 차별적인 증가를 보여준다. PGRN 발현의 증가는 미세 아교 세포 활성화 및 신경염증에 밀접하게 관련될 수 있다. 또한, PGRN 발현은 운동 뉴런 질병 및 알츠하이머 병을 포함하는 많은 신경변성 질병에서 활성화된 미세아교세포에서 증가한다. 연구는 신경변성 질병의 원인으로서 PGRN 내의 돌연변이를 확인하였고, 이것은 뉴런 생존에 대한 PGRN 기능의 중요성을 나타낸다.
CNS의 수초화 세포인 희소돌기아교세포는 성인 기간 내내 희소돌기아교세포 전구체 세포 (OPC)에 의해 계속 생성되고, 성인 CNS의 미엘린 손상의 본질적인 회복에 필요하다. 성인 CNS에서 OPC 증식 및 새로운 수초화 희소돌기아교세포의 생성을 조정하는 생리학적 사건은 널리 공지되어 있다. 최근에, 탈수초화 질병인 다발 경화증 (MS)이 있는 환자는 임신 제3분기 동안 재발률 감소를 보인다고 보고되었고, 이것은 호르몬이 희소돌기아교세포 생성에 영향을 줌을 시사한다. MS 환자의 완화는 활성 백색질 병변의 수 및 크기의 감소와 상호관련된다. 마우스에서 임신은 모체 CNS 내의 새로운 희소돌기아교세포의 생성 및 수초화된 축색돌기의 수의 증가를 야기한다 (Gregg et al., J. Neurosci. (2007) 27:1812-1823). 임신 말기 동안 안정 수준에 도달하는 호르몬인 프로락틴은 임신 동안 OPC 증식을 조절하고 동정 (virgin) 암컷 마우스에서 백색질 회복을 촉진하는 것으로 밝혀졌다 (Gregg et al., J. Neurosci. (2007) 27:1812-1823).
또한 임신 제3분기 동안 최고치에 도달하는 호르몬인 인간 태반 락토겐 (hPL)은 희소돌기아교세포 생성에 대해 유사한 영향을 가질 수 있다. hPL은 인간 성장 호르몬 (hGH) 및 프로락틴에 정성적으로 유사한 많은 생물학적 활성을 갖고 IGF-I 생산의 주요 조절제인 것으로 보인다. hGH와 IGF-I 둘 다는 성인 CNS에서 수초화의 자극제인 것으로 밝혀졌다 ([Carson et al., Neuron (1993) 10:729-740]; [Peltwon et al., Neurology (1977) 27:282-288]). 따라서, MS, ALS, 뇌졸중 및 척수 손상과 같은 탈수초화를 수반하는 CNS 질병의 치료는 예를 들어 rhPRL 또는 hPL 발현 바이러스 벡터의 심실내 주사에 의해 PRL- 또는 hPL-기반 요법으로부터 잇점을 얻을 수 있다.
그렐린은 성장 호르몬 방출의 매개제인 위장 호르몬이다 (예를 들어, 문헌 [Wu, et al., Ann. Surg.(2004) 239:464] 참조).
뉴로세르핀은 세르핀 프로테아제 억제제 패밀리 구성원이다. 특정 CNS 병태에서, 뉴로세르핀은 tPA 효과의 차단을 통해 신경보호 기능을 효과적으로 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Galliciotti, G and Sonderegger, P, Front Biosci (2006) 11:33]; [Simonin, et al., (2006) 26:10614]; [Miranda, E and Lomas, DA, Cell Mol. Life Sci (2006) 63:709]을 참조한다.
안지오제닌은 RNAse 수퍼패밀리의 구성원이다. 이것은 정상적인 순환 구성분이지만, 운동 뉴런 질환에서 위험 인자로도 관련되었다.
본 발명의 특정 조성물 및 방법에서, 상기한 1종 초과의 치료 분자를 코딩하는 1종 초과의 도입유전자가 전달될 수 있고, 여기서 각각의 도입유전자는 단일 AAV 벡터로부터 도입유전자의 발현을 가능하게 하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 추가의 방법에서, 도입유전자는 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 각각의 도입유전자는, CNS에서 그의 발현이 신경병상의 적어도 부분적인 교정을 유도하는 생물학적 활성 분자를 코딩한다. 추가로, 1종 초과의 도입유전자가 전달되는 경우에, 도입유전자는 1종 초과의 AAV 벡터를 통해 전달될 수 있고, 여기서 각각의 AAV 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 도입유전자를 포함한다.
본원에서 추가로 설명되는 것을 비롯한 임의의 다양한 분석 및 동물 모델에서 측정시에 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 천연 분자, 및 그의 활성 단편 및 유사체는 본 발명에서 사용하기 위한 것으로 의도된다.
본 발명에서 사용하기 위한 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 분자생물학의 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기한 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 방법을 사용하여, 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터 cDNA 및 게놈 라이브러리를 스크리닝하거나, 또는 유전자를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 유전자를 유도함으로써 얻을 수 있다. 또한, 관심있는 유전자는 공지의 서열을 기초로 하여 클로닝보다는 합성에 의해 생산될 수 있다. 분자는 특정 서열에 대한 적절한 코돈을 사용하여 설계될 수 있다. 이어서, 완전한 서열은 표준 방법에 의해 제조된 중복되는 올리고뉴클레오티드로부터 조립되고 완전한 코딩 서열로 조립된다 (예를 들어, 문헌 [Edge, Nature (1981) 292:756]; [Nambair et al., Science (1984) 223:1299]; 및 [Jay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311]을 참조한다.
따라서, 특정 뉴클레오티드 서열은 목적하는 서열을 보유하는 벡터로부터 얻을 수 있거나 또는 적절한 경우, 당업계에 공지된 다양한 올리고뉴클레오티드 합성 기술, 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook, 상기 문헌] 참조). 목적하는 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 얻기 위한 한 방법은 통상적인 자동 폴리뉴클레오티드 합성기로 생산된 중복되는 합성 올리고뉴클레오티드의 상보성 세트를 어닐링하고, 적절한 DNA 리가제를 사용하여 라이게이션하고, 라이게이션된 뉴클레오티드 서열을 PCR을 통해 증폭하는 것이다 (예를 들어, 문헌 [Jayaraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:4084-4088] 참조). 추가로, 올리고뉴클레오티드-지정 합성 (Jones et al., Nature (1986) 54:75-82), 기존재하는 뉴클레오티드 영역의 올리고뉴클레오티드 지정 (directed) 돌연변이 유발 ([Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327] 및 [Verhoeyen et al., Science (1988) 239:1534-1536]), 및 T4 DNA 중합효소를 사용한, 갭 존재 올리고뉴클레오티드의 효소에 의한 충전 (filling-in) (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:10029-10033)이 본 방법에 사용하기 위한 분자를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
일단 생산되면, 구성체는 아래에서 추가로 설명되는 바와 같이 재조합 바이러스 벡터를 사용하여 전달된다.
AAV 유전자 전달 기술
상기 설명한 구성체는 임의의 몇몇의 rAAV 유전자 전달 기술을 사용하여 해당 대상체에 전달된다. 몇몇의 유전자 전달을 위한 AAV-매개된 방법은 당업계에 공지되어 있다. 아래에서 추가로 설명되는 바와 같이, 유전자는 대상체에 직접 전달되거나, 또는 별법으로 생체 외에서 적절한 세포, 예를 들어 대상체로부터 유래한 세포에 전달되고, 세포는 대상체에 재이식될 수 있다.
다양한 AAV 벡터 시스템이 유전자 전달을 위해 개발되었다. AAV 벡터는 당업계에 잘 공지된 기술을 사용하여 쉽게 제작할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,173,414 및 5,139,941; 국제 특허 출원 공개 WO 92/01070 (1992년 1월 23일 공개) 및 WO 93/03769 (1993년 3월 4일 공개); 문헌 [Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol. (1988) 8:3988-3996]; [Vincent et al., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; [Carter, B.J. CurrentOpinion in Biotechnology (1992) 3:533-539]; [Muzyczka, N. CurrentTopics in Microbiol, and Immunol. (1992) 158:97-129]; [Kotin, R.M. HumanGene Therapy (1994) 5:793-801]; [Shelling and Smith, Gene Therapy (1994) 1:165-169]; 및 [Zhou et al., J. Exp. Med. (1994) 179:1867-1875] 참조). 또한, AAV 벡터 시스템은 아래에서 보다 상세하게 설명된다.
AAV 게놈은 약 4681개의 뉴클레오티드를 함유하는 선형의 단일가닥 DNA 분자이다. AAV 게놈은 일반적으로 도립 말단 반복체 (ITR)가 각각의 말단 상의 측면에 인접하는 내부 비반복 게놈을 포함한다. ITR의 길이는 약 145개 염기쌍 (bp)이다. ITR은 DNA 복제 기점, 및 바이러스 게놈에 대한 패키징 신호의 제공을 포함하는 다중 기능을 갖는다. 게놈의 내부 비반복부는 AAV 복제 (rep) 및 캡시드 (cap) 유전자로 알려진 2개의 큰 개방 해독 프레임을 포함한다. rep 및 cap 유전자는 바이러스의 복제 및 비리온으로의 패키징을 가능하게 하는 바이러스 단백질을 코딩한다. 특히, 겉보기 분자량에 따라 명명된 Rep 78, Rep 68, Rep 52, 및 Rep 40의 적어도 4개의 바이러스 단백질의 패밀리가 AAV rep 영역으로부터 발현된다. AAV cap 영역은 적어도 3종의 단백질, 즉 VP1, VP2, 및 VP3을 코딩한다.
AAV는 AAV 게놈의 내부 비반복부 (즉, rep 및 cap 유전자)를 삭제하고 ITR 사이에 이종성 유전자를 삽입함으로써 관심있는 유전자를 전달하도록 조작되었다. 이종성 유전자는 일반적으로 적절한 조건 하에 환자의 표적 세포에서 유전자 발현을 유도할 수 있는 이종성 프로모터 (구성적, 세포-특이적, 또는 유도가능)에 기능적으로 연결된다. 각각의 종류의 프로모터의 예는 당업계에 잘 공지되어 있다. 종결 신호, 예를 들어 폴리아데닐화 부위도 포함될 수 있다.
AAV는 헬퍼 (helper)-의존성 바이러스이다; 즉, 이것은 AAV 비리온을 형성하기 위해 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 우두)의 동시 감염을 필요로 한다. 헬퍼 바이러스의 동시감염이 없는 경우, AAV는 바이러스 게놈이 숙주 세포 염색체 내로 삽입되지만 감염성 비리온은 생산되지 않는 잠복기를 확립한다. 헬퍼 바이러스에 의한 후속 감염은 통합된 게놈을 "구제하고", 복제 및 그의 게놈의 감염성 AAV 비리온으로의 패키징을 가능하게 한다. AAV는 상이한 종으로부터의 세포를 감염시킬 수 있지만, 헬퍼 바이러스는 숙주 세포와 동일한 종의 바이러스이어야 한다. 따라서, 예를 들어, 인간 AAV는 개 아데노바이러스와 동시감염된 개 세포에서 복제될 것이다.
관심있는 유전자를 포함하는 재조합 AAV 비리온은 아래에서 보다 상세하게 설명되는 다양한 당업계에서 인정되는 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 야생형 AAV 및 헬퍼 바이러스는 rAAV 비리온의 생산을 위해 필요한 복제 기능을 제공하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,139,941 참조). 별법으로, 공지의 헬퍼 바이러스 중의 하나의 감염과 함께 헬퍼 기능 유전자를 함유하는 플라스미드는 복제 기능의 공급원으로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,622,856 및 미국 특허 5,139,941 참조). 유사하게, 보조 기능 유전자를 함유하는 플라스미드는 필요한 복제 기능을 제공하기 위해 야생형 AAV의 감염과 함께 사용될 수 있다. 이들 3가지 방법은 rAAV 벡터와 조합하여 사용될 때 rAAV 비리온을 생산하기에 각각 충분하다. 당업계에 잘 공지된 다른 방법도 rAAV 비리온을 생산하기 위해 당업자에 의해 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 삼중 형질감염 방법 (그 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,001,650에 상세하게 설명됨)이 rAAV 비리온을 생산하기 위해 사용되고, 그 이유는 상기 방법이 감염성 헬퍼 바이러스의 사용을 필요로 하지 않고, rAAV 비리온이 다른 검출가능한 헬퍼 바이러스의 부재 하에 생산될 수 있기 때문이다. 이것은 다음과 같은 rAAV 비리온 생산을 위한 3개의 벡터의 사용에 의해 달성된다: AAV 헬퍼 기능 벡터, 보조 기능 벡터, 및 rAAV 발현 벡터. 그러나, 당업자는 상기 벡터에 의해 코딩되는 핵산 서열이 2종 이상의 벡터 상에 다양한 조합으로 제공될 수 있음이 이해할 것이다.
본원에서 설명되는 바와 같이, AAV 헬퍼 기능 벡터는 생산성 AAV 복제 및 캡시드로 감싸기 (encapsidation)를 위해 트랜스로 (in trans) 기능하는 "AAV 헬퍼 기능" 서열 (즉, rep 및 cap)을 코딩한다. 바람직하게는, AAV 헬퍼 기능 벡터는 다른 검출가능한 wt AAV 비리온 (즉, 기능성 rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 비리온)을 생성하지 않으면서 효율적인 AAV 벡터 생산을 지지한다. 상기 벡터의 일례인 pHLP19가 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,001,650에 기재되어 있다. AAV 헬퍼 기능 벡터의 rep 및 cap 유전자는 상기 설명된 바와 같이 임의의 공지의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, AAV 헬퍼 기능 벡터는 AAV-2로부터 유래된 rep 유전자 및 AAV-6으로부터 유래된 cap 유전자를 가질 수 있고; 당업자는 다른 rep 및 cap 유전자 조합이 가능함을 알 것이고, 그를 규정하는 특징은 rAAV 비리온 생산을 지지하는 능력이다.
보조 기능 벡터는 AAV가 복제를 위해 그에 대해 의존하는 비-AAV-유래 바이러스 및/또는 세포 기능 (즉, "보조 기능")을 위한 뉴클레오티드 서열을 코딩한다. 보조 기능은 AAV 복제에 필요한 기능, 비제한적인 예를 들어 AAV 유전자 전사의 활성화에 관여하는 모이어티, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 발현 산물의 합성, 및 AAV 캡시드 조립을 포함한다. 바이러스 기반 보조 기능은 임의의 공지의 헬퍼 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 , 및 우두 바이러스로부터 유래될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 보조 기능 플라스미드 pLadeno5가 사용된다 (pLadeno5에 대한 상세한 내용은 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,004,797에 기재되어 있다). 상기 플라스미드는 AAV 벡터 생산을 위한 아데노바이러스 보조 기능의 완전한 세트를 제공하지만, 복제능을 갖는 아데노바이러스의 형성에 필요한 성분은 결여되어 있다.
AAV를 추가로 이해하기 위해, 재조합 AAV 발현 벡터 및 AAV 헬퍼 및 보조 기능에 대한 보다 상세한 논의를 아래에 제공한다.
재조합 AAV 발현 벡터
재조합 AAV (rAAV) 발현 벡터는 전사 방향으로 작동가능하게 연결된 성분으로서 전사 개시 영역을 포함하는 제어 요소, 관심있는 폴리뉴클레오티드 및 전사 종결 영역을 적어도 제공하기 위해 공지의 기술을 사용하여 제작된다. 제어 요소는 관심있는 세포, 예를 들어 포유동물 세포에서 기능성이 되도록 선택된다. 작동가능하게 연결된 성분을 함유하는 생성되는 구성체는 기능성 AAV ITR 서열과 (5' 및 3') 결합된다.
AAV ITR 영역의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, AAV-2 서열에 대해서는 문헌 [Kotin, R.M. (1994) HumanGene Therapy 5:793-801]; [Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" in FundamentalVirology, 2nd Edition, (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.)]을 참조한다. 본 발명의 벡터에 사용되는 AAV ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요가 없고, 예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 추가로, AAV ITR은 임의의 몇몇의 AAV 혈청형, 비제한적인 예를 들어 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9 등으로부터 유래될 수 있다. 또한, AAV 발현 벡터 내의 선택된 뉴클레오티드 서열의 측면에 인접하는 5' 및 3' ITR은 의도되는 기능을 수행한다면, 즉 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터 관심있는 서열을 절제 및 구조할 수 있고, AAV Rep 유전자 산물이 세포 내에 존재할 때 DNA 분자의 수용 세포 게놈 내로의 통합을 가능하게 한다면 반드시 동일하거나 동일한 AAV 혈청형 또는 단리물로부터 유래될 필요는 없다.
전통적인 AAV 벡터에 사용하기 적합한 폴리뉴클레오티드 분자의 크기는 약 5 킬로베이스 (kb) 이하일 것이다. 선택된 폴리뉴클레오티드 서열은 생체 내에서 대상체에서 그의 전사 또는 발현을 지시하는 제어 요소에 작동가능하게 연결된다. 상기 제어 요소는 선택된 유전자와 정상적으로 회합되는 제어 서열을 포함할 수 있다. 별법으로, 이종성 제어 서열이 사용될 수 있다. 유용한 이종성 제어 서열은 일반적으로 포유동물 또는 바이러스 유전자를 코딩하는 서열로부터 유래되는 것을 포함한다. 프로모터의 비제한적인 예는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (Kaplitt et al., Nat. Genet. (1994) 8:148-154), CMV/인간 β3-글로빈 프로모터 (Mandel et al., J. Neurosci. (1998) 18:4271-4284), GFAP 프로모터 (Xu et al., Gene Ther. (2001) 8:1323-1332), 1.8-kb 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터 (Klein et al., Exp. Neurol. (1998) 150:183-194), 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터 (Miyazaki, Gene (1989) 79:269-277), β-글루쿠로니다제 (GUSB) 프로모터 (Shipley et al., Genetics (1991) 10:1009-1018), 및 유비퀴틴 프로모터, 예를 들어 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,667,174에 기재된 인간 유비퀴틴 A, 인간 유비퀴틴 B, 및 인간 유비퀴틴 C로부터 단리된 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 발현을 연장하기 위해, 다른 조절 요소, 예를 들어 마멋 간염 바이러스 후-조절요소 (Woodchuck Hepatitis Virus Post-Regulatory Element (WPRE)) (Donello et al., J. Virol. (1998) 72:5085-5092) 또는 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 부위가 도입유전자에 추가로 작동가능하게 연결될 수 있다. 추가로, 비바이러스 유전자, 예를 들어 쥐 메탈로티오네인 유전자로부터 유래된 서열도 본원에서 유용할 것이다. 상기 프로모터 서열은 예를 들어 스트라타젠 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 샌디에고)으로부터 상업적으로 입수가능하다.
일부 CNS 유전자 요법 적용을 위해, 전사 활성을 제어하는 것이 필요할 수 있다. 이를 위해, 바이러스 벡터를 사용한 유전자 발현의 약물학상 조절은 예를 들어 문헌 [Habermaet al., Gene Ther. (1998) 5:1604-16011]; 및 [Ye et al., Science (1995) 283:88-91]에 기재된 바와 같은 다양한 조절 요소 및 약물-반응성 프로모터를 포함함으로써 달성할 수 있다.
AAV ITR이 결합된 관심있는 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 AAV 발현 벡터는 그로부터 주요 AAV 개방 해독 프레임 ("ORF")이 절제된 AAV 게놈 내로 선택된 서열(들)을 직접 삽입함으로써 제작될 수 있다. 또한, ITR의 충분한 부분이 복제 및 패키징 기능을 허용한다면 AAV 게놈의 다른 부분은 삭제될 수 있다. 상기 구성체는 당업계에 잘 공지된 기술을 사용하여 설계될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,173,414 및 5,139,941; 국제 특허 출원 공개 WO 92/01070 (1992년 1월 23일 공개) 및 WO 93/03769 (1993년 3월 4일 공개); 문헌 [Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996]; [Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; [Carter (1992) CurrentOpinion in Biotechnology 3:533-539]; [Muzyczka (1992) CurrentTopics in Microbiol, and Immunol. 158:97-129]; [Kotin (1994) HumanGene Therapy 5:793-801]; [Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169]; 및 [Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875] 참조).
별법으로, AAV ITR은 바이러스 게놈으로부터 또는 그를 함유하는 AAV 벡터로부터 절제되고, 표준 라이게이션 기술, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 기술을 사용하여 또 다른 벡터에 존재하는 선택된 핵산 구성체의 5' 및 3'에 융합될 수 있다. 예를 들어, 라이게이션은 20 mM Tris-Cl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 ㎍/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, 및 0℃의 40 μM ATP, 0.01-0.02 (바이스 (Weiss)) 단위 T4 DNA 리가제 ("스티키 (sticky) 말단" 라이게이션의 경우) 또는 14℃의 1 mM ATP, 0.3-0.6 (바이스) 단위 T4 DNA 리가제 ("블런트 (blunt) 말단" 라이게이션의 경우)에서 수행될 수 있다. 분자간 "스티키 말단" 라이게이션은 대체로 30-100 ㎍/ml의 총 DNA 농도 (5-100 nM의 총 말단 농도)에서 수행된다. ITR을 함유하는 AAV 벡터는 예를 들어 미국 특허 5,139,941에 기재되어 있다. 특히, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type CultureCollection, "ATCC")으로부터 기탁 번호 53222, 53223, 53224, 53225 및 53226로 입수할 수 있는 몇몇 AAV 벡터가 설명되어 있다.
특정 실시양태에서, rAAV 발현 벡터는 자가-상보성 rAAV 구성체로서 제공된다. 일반적으로, rAAV DNA는 바이러스 캡시드 내에 약 4600 뉴클레오티드 길이의 단일가닥 DNA (ssDNA) 분자로서 패키징된다. 바이러스에 의한 세포의 감염 후에, 단일 DNA 가닥은 이중가닥 DNA (dsDNA) 형태로 전환된다. dsDNA만이, 함유된 유전자(들)을 RNA로 전사하는 세포의 단백질에 유용하다. 따라서, AAV의 통상적인 복제 방식은 상보성 DNA 가닥의 신규 (de novo) 합성을 필요로 한다. 발현 전에 ssDNA AAV 게놈을 dsDNA로 전환하는 상기 단계는 자가-상보성 (sc) 벡터의 사용에 의해 회피될 수 있다.
자가-상보성 벡터는 2개의 감염 바이러스로부터의 상보성 가닥의 염기 페어링에 의해 생산되고, 이것은 DNA 합성을 필요로 하지 않는다 (예를 들어, 문헌 [Nakai et al., J. Virol. (2000) 74:9451-9463] 참조). 상기 가닥간 염기 페어링, 또는 가닥 어닐링 (SA)이 가능하고, 그 이유는 AAV가 + 또는 - DNA 가닥을 동등한 효율로 패키징하기 때문이다 (Berns, K.I., Microbiol. Rev. (1990) 54:316-329).
따라서, 이론에 제한되지 않으면서, SA 또는 DNA 합성에 의한 dsDNA 전환 필요성은 두 가닥을 단일 분자로서 패키징함으로써 완전히 회피될 수 있다. 이것은 AAV 복제 주기 동안 이량체성 도립 반복체 게놈을 생산하는 AAV의 경향을 이용함으로써 달성될 수 있다. 상기 이량체가 충분히 작으면, 이들은 통상적인 AAV 게놈과 동일한 방식으로 패키징될 수 있고, ssDNA 분자의 2개의 1/2체가 폴딩되고 염기 페어링하여 길이가 1/2인 dsDNA 분자를 형성할 수 있다. dsDNA 전환은 숙주세포 DNA 합성 및 벡터 농도와는 무관하다 (McCarty et al., Gene Ther. (2001) 8:1248-1254).
scAAV 바이러스 구성체는 약 4.6 kb를 포함하고, 정상적인 AAV 캡시드 내로 패키징될 수 있다. 각각의 공지의 AAV 혈청형은 유사한 효율로 scAAV 게놈을 패키징할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sipo et al., Gene Ther. (2007) 14:1319-1329] 참조). 따라서, 본 발명의 특정 실시양태에서, scAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 또는 AAV9 혈청형으로부터 선택된 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 그러나, scAAV 벡터는 임의의 공지된 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 또는 당업계에 공지된 변형된 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 상기 scAAV 벡터는 제2 AAV 혈청형의 캡시드에 하나의 AAV 혈청형의 게놈을 함유하는 슈도타입형 (pseudotyped) 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 예를 들어 AAV2 캡시드 및 AAV1 게놈을 함유하는 AAV 벡터 또는 AAV5 캡시드 및 AAV2 게놈을 함유하는 AAV 벡터를 포함할 수 있다 (Auricchio et al., (2001) Hum.Mol. Genet., 10(26):3075-81).
초기에, scAAV 벡터 내의 도입유전자 서열은 약 2.2 kb만을 포함할 수 있는 것으로 생각되었다. 그러나, 이전에 생각된 것보다 더 큰 범위의 패키징 용량이 존재하는 것으로 보인다. 예를 들어, 문헌 [Wu et al., HumanGene Ther. (2007) 18:171-182]에서는 3,300 bp를 초과하는 scAAV-2 구성체를 성공적으로 패키징하였고, 완전히 DNase 저항성인 이량체성 도립 반복체 게놈을 제시하였다. 상기 벡터는 배양된 세포에 대해 시험될 때 ssAAV보다 예상된 형질도입 효율의 증가를 보였다.
scAAV 벡터는 감염성 이중 가닥 형태의 선택적 정제와 함께 통상적인 게놈 크기의 약 1/2인 벡터 플라스미드를 생성하거나, 또는 이중가닥 바이러스의 합성을 제공하는 AAV 바이러스의 말단 분해 서열의 하나에 돌연변이를 갖는 게놈의 약 1/2 크기의 벡터 플라스미드를 사용함으로써 생산될 수 있다. 두 전략은 모두 한 말단 반복체에서 공유 연결된 + 및 - 가닥 바이러스 게놈을 생성한다.
특히, 정상적인 단량체성 AAV 게놈의 생성은 각각의 라운드의 DNA 합성과 함께 2개의 ITR의 효율적인 분해에 의존한다. 상기 반응은 AAV Rep의 2개의 보다 큰 이소형의 ssDNA 엔도뉴클레아제 활성에 의해 매개된다. 말단 분해 부위에서 ITR의 닉 (nick) 형성 후에 숙주 DNA 중합효소에 의해 닉으로부터 DNA 신장이 발생한다. 이량체성 게놈은 다른 말단부에서 개시되는 복제 복합체가 도달하기 전에 Rep가 말단 분해 부위에 닉을 형성하지 못할 때 형성된다.
scAAV 제제에서 이량체성 게놈의 생산량은 한 말단 반복체에서 분해를 억제함으로써 크게 증가될 수 있다. 이것은 Rep 단백질이 필수적인 ssDNA 닉을 생성할 수 없도록 한 ITR로부터 말단 분해 부위 서열을 삭제함으로써 쉽게 달성된다 (예를 들어, 문헌 [McCarty et al., Gene Ther. (2003) 10:2112-2118] 및 [Wang et al., Gene Ther. (2003) 10:2105-2111] 참조)). 다른 ITR에서 개시한 복제 복합체는 헤어핀 (hairpin)을 통해 복제하고 개시 말단부로 복귀한다. 복제는 주형 분자의 말단부로 진행하고, 각각의 말단부에 야생형 ITR 및 중앙에 돌연변이된 ITR을 갖는 dsDNA 도립 반복체를 생성시킨다. 이어서, 상기 이량체성 도립 반복체는 2개의 야생형 ITR 말단부로부터 정상적인 라운드의 복제를 겪을 수 있다. 각각의 대체된 딸 (daughter) 가닥은 각각의 말단부에 완전한 ITR 및 중앙에 돌연변이된 ITR을 갖는 ssDNA 도립 반복체를 포함한다. AAV 캡시드 내로의 패키징은 대체된 가닥의 3' 말단부에서 시작한다. 하나의 돌연변이된 ITR을 갖는 구성체로부터 scAAV의 생산은 일반적으로 90% 초과의 이량체성 게놈을 생성한다.
돌연변이된 ITR 구성체로부터 scAAV 벡터의 생산 및 정제는 아래에서 추가로 설명되는 바와 같이 통상적인 ssAAV와 동일하다. 그러나, 도트 (dot) 블롯 또는 서던 블롯이 사용될 경우, 벡터 DNA는 바람직하게는 상보성 가닥의 재어닐링을 방지하기 위해서 알칼리성 조건 하에서 혼성화 막에 적용된다. 추가로, 말단 분해 및 단량체 게놈의 생성이 가능하도록 가짜 (spurious) Rep-닉 형성 부위가 돌연변이된 ITR에 충분히 근접하여 생산될 수 있다. 이것은 일반적으로 돌연변이체 및 야생형 말단 반복체에 대해 도입유전자 카세트를 회전시킴으로써 방지될 수 있다.
예를 들어, scAAV 구성체의 생산 방법에 대해서는 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 문헌 [McCarty, D.M., Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656]; [McCarty et al., Gene Ther. (2001) 8:1248-1254]; [McCarty et al., Gene Ther. (2003) 10:2112-2118]; [Wang et al., Gene Ther. (2003) 10:2105-2111)]; [Wu et al., Human Gene Ther. (2007) 18:171-182]; 미국 특허 출원 공개 2007/0243168 및 2007/0253936; 및 본원의 실시예를 참고한다.
본 발명의 목적을 위해, AAV 발현 벡터 (통상적인 또는 sc 벡터)로부터 rAAV 비리온을 생산하기 적합한 숙주 세포는 이종성 DNA 분자의 수용자로서 사용될 수 있거나 사용되고 있고 예를 들어 현탁 배양, 생물반응기 등에서 성장할 수 있는 미생물, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 포함한다. 이 용어는 형질감염된 본래의 세포의 자손체를 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 의미한다. 안정한 인간 세포주인 293 (예를 들어 기탁 번호 ATCC CRL1573 하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션을 통해 쉽게 이용가능함)으로부터의 세포가 본 발명의 실시에 바람직하다. 특히, 인간 세포주 293은 아데노바이러스 타입-5 DNA 단편으로 형질전환된 인간 배아 신장 세포주이고 (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59), 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자를 발현한다 (Aiello et al. (1979) Virology 94:460). 293 세포주는 쉽게 형질감염되고, rAAV 비리온을 생산하기 위한 특히 편리한 기반을 제공한다.
AAV 헬퍼 기능
상기한 AAV 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포는 rAAV 비리온을 생산하기 위해 AAV ITR이 측면에 인접하는 뉴클레오티드 서열을 복제하고 캡시드로 감싸기 위해서 AAV 헬퍼 기능을 제공할 수 있도록 만들어야 한다. AAV 헬퍼 기능은 일반적으로 생산성 AAV 복제를 위해 트랜스로 기능하는 AAV 유전자 산물을 제공하기 발현될 수 있는 AAV-유래 코딩 서열이다. AAV 헬퍼 기능은 본원에서 AAV 발현 벡터로부터 상실된 필요한 AAV 기능을 보완하기 위해 사용된다. 따라서, AAV 헬퍼 기능은 주요 AAV ORF, 즉 rep 및 cap 코딩 영역, 또는 그의 기능성 상동체 중의 하나 또는 둘 다를 포함한다.
"AAV rep 코딩 영역"은 복제 단백질 Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40을 코딩하는 AAV 게놈의 당업계에서 인정되는 영역을 의미한다. 상기 Rep 발현 산물은 AAV DNA 복제 기점의 인식, 결합 및 닉 형성, DNA 헬리카제 활성 및 AAV (또는 다른 이종성) 프로모터로부터 전사의 조정을 포함하는 많은 기능을 갖는 것으로 밝혀졌다. Rep 발현 산물들은 AAV 게놈의 복제에 전체적으로 필요하다. AAV rep 코딩 영역에 대한 설명에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Muzyczka, N. (1992) CurrentTopics in Microbiol, and Immunol. 158:97-129]; 및 [Kotin, R.M. (1994) HumanGene Therapy 5:793-801]을 참조한다. AAV rep 코딩 영역의 적합한 상동체는 AAV-2 DNA 복제를 매개하는 것으로도 알려진 인간 헤르페스바이러스 6 (HHV-6) rep 유전자를 포함한다 (Thomson et al. (1994) Virology 204:304-311).
"AAV cap 코딩 영역"은 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3, 또는 그의 기능성 상동체를 코딩하는 AAV 게놈의 당업계에서 인정되는 영역을 의미한다. 상기 Cap 발현 산물은 바이러스 게놈의 패키징에 전체적으로 필요한 패키징 기능을 제공한다. AAV cap 코딩 영역의 설명에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Muzyczka, N. and Kotin, R.M. (상기 문헌)]을 참조한다.
AAV 헬퍼 기능은 AAV 발현 벡터의 형질감염 전에 또는 이와 동시에 숙주 세포를 AAV 헬퍼 구성체로 형질감염시킴으로써 숙주 세포 내로 도입된다. 따라서, AAV 헬퍼 구성체는 생산성 AAV 감염을 위해 필요한 상실된 AAV 기능을 보완하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 적어도 일시적인 발현을 제공하기 위해 사용된다. AAV 헬퍼 구성체에는 AAV ITR이 결여되고, 그 자체로 복제하거나 패키징할 수 없다.
상기 구성체는 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스, 또는 비리온의 형태일 수 있다. 많은 AAV 헬퍼 구성체, 예를 들어 Rep 및 Cap 발현 산물을 모두 코딩하는 통상적으로 사용되는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45가 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828]; 및 [McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945] 참조). Rep 및/또는 Cap 발현 산물을 코딩하는 많은 다른 벡터가 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,139,941 참조).
AAV 보조 기능
숙주 세포 (또는 패키징 세포)는 또한 rAAV 비리온을 생산하기 위해 비AAV-유래 기능, 또는 "보조 기능"을 제공할 수 있도록 만들어야 한다. 보조 기능은 AAV가 그의 복제를 위해 의존하는 비AAV-유래 바이러스 및/또는 세포 기능이다. 따라서, 보조 기능은 적어도 AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, Cap 발현 산물의 합성 및 AAV 캡시드 조립에 관여하는 것을 비롯하여 AAV 복제에 필요한 비AAV 단백질 및 RNA를 포함한다. 바이러스-기반 보조 기능은 임의의 공지의 헬퍼 바이러스로부터 유래될 수 있다.
특히, 보조 기능은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입되고 발현될 수 있다. 일반적으로, 보조 기능은 숙주 세포의 관련되지 않은 헬퍼 바이러스 감염에 의해 제공된다. 아데노바이러스; 헤르페스바이러스, 예를 들어 단순 포진 바이러스 타입 1 및 2; 및 우두 바이러스를 비롯하여 많은 적합한 헬퍼 바이러스가 알려져 있다. 또한, 임의의 다양한 공지의 물질을 사용한 세포 동기화 (synchronization)에 의해 제공되는 것과 같은 비바이러스 보조 기능이 본원에서 유용할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Buller et al. (1981) J. Virol. 40:241-247]; [McPherson et al. (1985) Virology 147:217-222]; [Schlehofer et al. (1986) Virology 152:110-117] 참조).
별법으로, 보조 기능은 상기 정의된 바와 같은 보조 기능 벡터를 사용하여 제공될 수 있다 (예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,004,797 및 국제 특허 출원 공개 WO 01/83797 참조). 보조 기능을 제공하는 핵산 서열은 천연 공급원으로부터, 예를 들어 아데노바이러스 입자의 게놈으로부터 얻을 수 있거나, 또는 당업계에 공지된 재조합 또는 합성 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, 아데노바이러스 유전자의 완전한 보완은 보조 헬퍼 기능에 필요하지 않음이 입증되었다. 특히, DNA 복제 및 후기 유전자 합성이 불가능한 아데노바이러스 돌연변이체는 AAV 복제를 허용하는 것으로 밝혀졌다 ([Ito et al., (1970) J. Gen. Virol. 9:243]; [Ishibashi et al., (1971) Virology 45:317]). 유사하게, E2B 및 E3 영역 내의 돌연변이체는 AAV 복제를 지지하는 것으로 밝혀졌고, 이것은 E2B 및 E3 영역이 아마도 보조 기능 제공에 관련되지 않음을 나타낸다 (Carter et al., (1983) Virology 126:505). 그러나, E1 영역이 결함이 있거나 또는 E4 영역이 결실된 아데노바이러스는 AAV 복제를 지지할 수 없다. 따라서, E1A 및 E4 영역은 직접 또는 간접적으로 AAV 복제를 위해 필요할 것으로 보인다 ([Laughlin et al., (1982) J. Virol. 41:868]; [Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925]; [Carter et al., (1983) Virology 126:505]). 다른 특성화된 Ad 돌연변이체는 다음을 포함한다: E1B ([Laughlin et al. (1982), 상기 문헌]; [Janik et al. (1981), 상기 문헌]; [Ostrove et al., (1980) Virology 104:502]); E2A ([Handa et al., (1975) J. Gen. Virol. 29:239]; [Strauss et al., (1976) J. Virol. 17:140]; [Myers et al., (1980) J. Virol. 35:665]; [Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927]; [Myers et al., (1981) J. Biol. Chem. 256:567]); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions,in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter et al. (1983), 상기 문헌); 및 E4 ([Carter et al.(1983), 상기 문헌]; [Carter (1995)]). E1B 코딩 영역에 돌연변이를 갖는 아데노바이러스에 의해 제공되는 보조 기능에 대한 연구가 모순되는 결과를 야기하였지만, 문헌 [Samulski et al., (1988) J. Virol. 62:206-210]에서는 E1B55k가 AAV 비리온 생산에 필요하지만 E1B19k는 필요하지 않다고 보고되었다. 추가로, 국제 특허 출원 공개 WO 97/17458 및 문헌 [Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938-945]에는 다양한 Ad 유전자를 코딩하는 보조 기능 벡터가 기재되어 있다. 특히 바람직한 보조 기능 벡터는 아데노바이러스 VA RNA 코딩 영역, 아데노바이러스 E4 ORF6 코딩 영역, 아데노바이러스 E2A 72 kD 코딩 영역, 아데노바이러스 E1A 코딩 영역, 및 무손상 E1B55k 코딩 영역이 결여된 아데노바이러스 E1B 영역을 포함한다. 상기 벡터는 국제 특허 출원 공개 WO 01/83797에 기재되어 있다.
숙주 세포의 헬퍼 바이러스 감염, 또는 숙주 세포의 보조 기능 벡터 형질감염의 결과로, AAV Rep 및/또는 Cap 단백질을 생산하기 위해 AAV 헬퍼 구성체를 전이활성화시키는 보조 기능이 발현된다. Rep 발현 산물은 AAV 발현 벡터로부터 재조합 DNA (관심있는 DNA 포함)를 절제한다. 또한, Rep 단백질은 AAV 게놈을 복제하는 작용을 수행한다. 발현된 Cap 단백질은 캡시드로 조립되고, 재조합 AAV 게놈은 캡시드 내에 패키징된다. 따라서, 생산성 AAV 복제가 뒤이어 일어나고, DNA가 rAAV 비리온 내에 패키징된다. "재조합 AAV 비리온", 또는 "rAAV 비리온"은 AAV ITR이 양 측면에 인접하는 관심있는 이종성 뉴클레오티드 서열을 캡시드로 감싸는 AAV 단백질 외피를 포함하는 감염성 복제-결함 바이러스로서 본원에서 규정된다.
재조합 AAV 복제 후에, rAAV 비리온은 다양한 통상적인 정제 방법, 예를 들어 컬럼 크로마토그래피, CsCl 구배 등을 사용하여 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 복수의 컬럼 정제 단계, 예를 들어 음이온 교환 컬럼, 친화도 컬럼 및/또는 양이온 교환 컬럼을 통한 정제를 사용할 수 있다 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 02/12455 참조). 또한, 감염이 보조 기능을 발현시키기 위해 사용될 경우, 잔여 헬퍼 바이러스는 공지의 방법을 사용하여 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 약 60℃의 온도로, 예를 들어 20분 이상 동안 가열함으로써 불활성화될 수 있다. 상기 처리는 헬퍼 바이러스만을 효과적으로 불활성화시킬 수 있고, 그 이유는 AAV가 매우 열에 안정한 반면, 헬퍼 아데노바이러스는 열에 불안정하기 때문이다.
관심있는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 생성되는 rAAV 비리온은 이어서 아래에서 설명되는 기술을 사용한 유전자 전달을 위해 사용될 수 있다.
조성물 및 전달
A. 조성물
일단 생산되면, 관심있는 유전자를 코딩하는 rAAV 비리온은 전달에 적합한 조성물로 제형화될 것이다. 조성물은 치료 유효량의 관심있는 유전자, 즉 (1) 질병에 노출되거나 소인이 있을 수 있지만 아직 질병의 증상을 경험하거나 보이지 않는 대상체에서 질병의 발생을 예방하거나 질병이 더 낮은 강도로 발생하도록 하거나, (2) 질병을 억제하는, 즉, 발생을 정지시키거나 또는 질병 상태를 역전시키거나, 또는 (3) 질병의 증상을 경감하는, 즉, 대상체가 겪는 증상의 수를 감소시키고 질병과 연관된 세포 병상을 변경하기에 충분한 양을 생산하기에 충분한 유전 물질을 포함할 것이다.
또한, 적절한 용량은 다른 요인 중에서 치료되는 포유동물 (예를 들어, 인간 또는 비인간 영장류 또는 다른 포유동물), 치료되는 대상체의 연령 및 전반적인 상태, 치료되는 병태의 중증도, 투여 방식에 의해 결정될 것이다. 적절한 유효량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 대표적인 양이 아래에서 제시된다.
조성물은 또한 제약상 허용되는 부형제를 함유할 것이다. 상기 부형제는 조성물이 투여되는 개체에 유해한 항체의 생산을 그 자체로 유도하지 않고 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 다른 제약 물질을 포함한다. 제약상 허용되는 부형제는 소르비톨, 임의의 다양한 트윈 (TWEEN) 화합물, 및 액체, 예를 들어 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 제약상 허용되는 염, 예를 들어 무기산 염, 예를 들어 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등; 및 유기산의 염, 예를 들어 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 부형제에 포함될 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 상기 부형제에 존재할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제에 대한 상세한 논의는 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 입수할 수 있다.
제형은 액체 또는 고체, 예를 들어, 동결건조된 것일 수 있다. 제형은 또한 에어로졸로서 투여될 수 있다.
특히 유용한 하나의 제형은 관심있는 rAAV 비리온을 하나 이상의 이가 또는 다가 알콜, 및, 임의로, 세제, 예를 들어 소르비탄 에스테르와 조합하여 포함한다 (예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,764,845 참조).
B. 전달
일반적으로, 재조합 비리온은 생체 내 또는 시험관 내 형질도입 기술을 사용하여 대상체 내로 도입된다. 시험관 내에서 형질도입될 경우, 목적하는 수용 세포는 대상체로부터 제거되어 재조합 벡터로 형질도입된 후, 대상체 내로 재도입될 것이다. 별법으로, 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않는 동계 (syngeneic) 또는 이종 (xenogeneic) 세포가 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 동물 내로 전달에 적합한 세포는 장기, 종양으로부터의 포유동물 세포 종류 또는 세포주를 포함한다. 예를 들어, 인간, 쥐, 염소, 양, 소, 개, 고양이, 및 돼지 세포가 사용될 수 있다. 사용하기 적합한 세포 종류는 섬유모세포, 간세포, 내피세포, 각질세포, 조혈세포, 상피세포, 근세포, 뉴런 세포, 및 줄기 세포를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 추가로, 신경 전구 세포가 시험관 내에서 형질도입된 후, CNS로 전달될 수 있다.
세포는 적절한 배지 내에서 재조합 비리온을 목적하는 세포와 조합함으로써 시험관 내에서 형질도입될 수 있고, 세포는 통상적인 기술, 예를 들어 서던 블롯 및/또는 PCR을 사용하여, 또는 선택가능한 마커를 사용하여 관심있는 DNA를 보유하는 세포에 대해 스크리닝될 수 있다. 이어서, 형질도입된 세포는 상기한 바와 같이 제약 조성물로 제형화되고, 조성물은 아래에서 설명되는 바와 같은 다양한 기술에 의해, 하나 이상의 용량으로 대상체 내로 도입된다.
생체 내 전달을 위해, 재조합 비리온을 제약 조성물로 제형화하고, 하나 이상의 투여량을 표시된 방식으로 직접 투여할 수 있다. 인간 뇌에서 구조의 확인에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [The HumanBrain: Surface,Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply,2nd ed., eds. Deuteron et al., Springer Vela, 1999]; [Atlas of the HumanBrain, eds. Mai et al., Academic Press; 1997]; 및 [Co-Planar Sterotaxic Atlas of the HumanBrain: 3-Dimensional Proportional System: An Approach to Cerebral Imaging, eds. Tamarack et al., Thyme Medical Pub.,1988]을 참조한다. 마우스 뇌에서 구조의 확인에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates, 2nd ed., Academic Press, 2000]을 참조한다. 원하는 경우에, 인간 뇌 구조는 다른 동물의 뇌에서 유사한 구조와 상호관련될 수 있다. 예를 들어, 인간 및 설치류를 포함한 대부분의 포유동물은 내후각뇌-해마 돌출부의 유사한 국소해부학적 구성을 보여주고, 여기서 외측 및 내측 내후각뇌 피질 둘 다의 외측부 내의 뉴런은 해마의 등쪽 (dorsal) 부분 또는 중격극 (septal pole)으로 돌출하는 반면, 배쪽 (ventral) 해마로의 돌출부는 일차적으로 내후각뇌 피질의 내측부의 뉴런으로부터 시작된다 ([Principles of Neural Science, 4th ed., eds Kandel et al., McGraw-Hill, 1991]; [The Rat Nervous System, 2nd ed., ed. Paxinos, Academic Press, 1995]). 또한, 내후각뇌 피질의 층 II 세포는 치상회로 돌출하고, 치상회의 분자층의 외부쪽의 2/3에서 끝난다. 층 III 세포로부터의 축색돌기는 해마의 암몬각 (cornu ammonis) 영역 CA1 및 CA3으로 양측으로 돌출하고, 스트라툼 라쿠노스 (stratum lacunose) 분자층에서 끝난다.
벡터를 특이적으로 중추신경계의 특정 영역, 특히 뇌의 특정 영역에 전달하기 위해서, 벡터는 정위적 미세주사에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 수술 일에, 환자에게 정위적 프레임 베이스가 적절하게 고정될 것이다 (두개골 내로 고정됨). 정위적 프레임 베이스 (기준 마커와 MRI-상용성임)가 고정된 뇌는 고해상도 MRI를 사용하여 영상화될 것이다. 이어서, MRI 영상은 정위 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터로 이송될 것이다. 벡터 주사의 표적 부위, 및 경로를 결정하기 위해 일련의 관상 (coronal), 시상 (sagittal) 및 축상 (axial) 영상을 사용할 것이다. 소프트웨어는 경로를 정위 프레임에 적절한 3차원 좌표로 직접 번역할 것이다. 천두공을 도입 부위 위에 뚫고, 정위 장치를 제시된 깊이에서 이식된 바늘로 배치한다. 이어서, 제약상 허용되는 담체 내의 벡터를 주사할 것이다. 이어서, 벡터는 직접 주사에 의해 일차 표적 부위에 투여하고, 축색돌기를 통해 원위 표적 부위로 역행 수송된다. 추가의 투여 경로, 예를 들어 직접적인 가시화 하에서의 표면 피질 적용, 또는 다른 비-정위 적용이 사용될 수 있다.
다른 혈청형의 재조합 AAV가 본 발명에서 사용될 수 있고, 여기서 재조합 AAV는 자가-상보성 AAV 또는 비-자가 상보성 AAV일 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서 사용되는 바이러스 벡터의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9로 이루어지는 군 중에서 선택된다 (예를 들어, 문헌 [Gao et al. (2002) PNAS, 99:11854-11859]; 및 [Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, HumanaPress, 2003] 참조). 본원에서 나열된 것 이외의 다른 혈청형도 사용될 수 있다. 또한, 슈도타입형 AAV 벡터가 본원에 설명되는 방법에 이용될 수 있다. 슈도타입형 AAV 벡터는 제2 AAV 혈청형의 캡시드에 하나의 AAV 혈청형의 게놈을 함유하는 것; 예를 들어, AAV2 캡시드 및 AAV1 게놈을 함유하는 AAV 벡터 또는 AAV5 캡시드 및 AAV2 게놈을 함유하는 AAV 벡터이다 (Auricchio et al., (2001) Hum.Mol. Genet., 10(26):3075-81).
시험관 내에서 형질도입된 재조합 비리온 또는 세포는 신경 조직, 예를 들어 말초 신경, 망막, 후근절, 신경근 접합부, 및 CNS에 직접, 예를 들어 심실 영역, 예를 들어 측뇌실의 하나 또는 둘 다 내로 주사에 의해, 및 당업계에 공지된 신경외과 기술을 사용하여, 예를 들어 정위 주사에 의해 선조체 (예를 들어, 미상핵 또는 선조체의 피각), 소뇌, 척수, 및 신경근 접합부에 바늘, 카테테르 또는 관련된 장치를 사용하여 전달될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999]; [Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000]; [Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993]; 및 [Alisky and Davidson, Hum.Gene Ther. 11:2315-2329, 2000] 참조). 예시적인 실시양태에서, 전달은 고역가 벡터 용액의 대상체 또는 환자의 척수 내로의 직접 주사에 의해 달성된다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, 도입유전자를 대상체의 척수 및/또는 뇌간 영역에 전달하는 방법은 도입유전자를 함유하는 재조합 AAV 벡터를 대상체의 뇌의 소뇌의 심부 소뇌핵 (DCN) 영역의 적어도 하나의 영역에 투여함으로써 수행된다. 소뇌 내의 심부에 내측 (꼭지) 핵, 개재하는 (중간위치) 핵 및 외측 (치상) 핵으로 불리는 심부 소뇌핵으로 칭해지는 회백질이 존재한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "심부 소뇌핵"은 집합적으로 이들 3개의 영역을 지칭하고, 이들 3개의 영역 중의 하나 이상이 표적화될 수 있다. 바이러스 전달은 대상체의 척수의 적어도 하나의 하위 부분에서 도입유전자의 척수 및/또는 뇌간 영역에서의 발현에 유리한 조건 하에 이루어진다. 상기 하위 부분은 경수, 흉수, 요수 또는 천골 중의 하나 이상을 포함한다.
이론에 제한되지 않으면서, 본 발명의 한 실시양태는 치료 분자 (예를 들어, 단백질 또는 펩티드)를 척수의 각각의 부분에 제공하는 능력이다. 이것은 scAAV 벡터를 포함하는 AAV 벡터를 DCN 내로 주사함으로써 달성될 수 있다. 또한, 각각의 척수 부분 내의 개별적인 층판 (lamina)을 표적화하는 것이 중요할 수 있다. 층판은 뇌 및 척수의 영역 내의 특이적인 하위-영역이다. 특정 실시양태에서, 특정 척수 부분 내의 특이적인 층판을 표적화하는 것이 바람직할 수 있다. 운동 뉴런 손상은 상부 운동 뉴런 내에서도 발생할 수 있기 때문에, 치료 분자 (예를 들어, 단백질 또는 펩티드)를 뇌간의 부분에 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 일부의 또는 모든 하위 부분을 포함하는 척수에 및 일부의 또는 모든 하위 부분을 포함하는 뇌간에 치료 분자를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명은 척수 영역(들) 및/또는 뇌간에 대한 치료 분자의 상기 설명한 전달을 달성하기 위해 AAV 벡터의 DCN 내로의 도입을 이용한다.
척수 (예를 들어, 아교세포)를 표적화하기 위한 또 다른 방법은 척수 조직 자체 내로보다는 수막강내 전달에 의한 것이다. 상기 전달은 많은 잇점을 제시한다. 표적화된 단백질은 주위 CSF 내로 방출되고, 바이러스와 달리, 방출된 단백질은 급성 수막강내 주사 후에 그런 것처럼 척수 실질 내로 관통할 수 있다. 실제로, 바이러스 벡터의 수막강내 전달은 발현을 국소로 유지할 수 있다. 수막강내 유전자 요법의 추가의 잇점은 수막강내 경로가 인간에서 이미 일상적으로 사용되는 요추 천자 투여 (즉, 척추 천자)를 모방한다는 것이다.
재조합 벡터 또는 형질도입된 세포를 투여하기 위한 또 다른 방법은 후근절 (DRG) 뉴런으로의 전달에 의해, 예를 들어 경막외 공간 내로의 주사 및 DRG로의 후속적인 확산에 의해 수행된다. 예를 들어, 재조합 벡터 또는 형질도입된 세포는 단백질이 DRG로 확산되는 조건 하에서 수막강내 삽관 (cannulation)을 통해 전달될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Chiang et al., Acta Anaesthesiol. Sin. (2000) 38:31-36]; [Jain, K.K., Expert Opin. Investig. Drugs (2000) 9:2403-2410] 참조).
CNS에 대한 또 다른 투여 방식은 벡터의 다른 비-수동 전달인 전달 (convection)-강화 전달 (CED) 시스템을 사용한다. CED의 한 실시양태에서, 압력 구배는 비-수동 전달 시스템의 사용을 통해 생성된다. CED를 사용함으로써, 재조합 벡터는 CNS의 넓은 영역에 걸쳐서 많은 세포에 전달될 수 있다. 또한, 전달된 벡터는 CNS 세포 (예를 들어, 아교 세포)에서 도입유전자를 효율적으로 발현한다. 다른 전달-강화 전달 장치가 재조합 벡터의 전달에 적절할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 장치는 삼투 펌프 또는 주입 펌프이다. 삼투 및 주입 펌프는 모두 다양한 공급사, 예를 들어 알제트 코퍼레이션 (Alzet Corporation), 해밀턴 코퍼레이션 (Hamilton Corporation), 알자 인크. (Alza, Inc., 미국 캘리포니아주 팔로 알토)로부터 상업적으로 입수가능하다. 일반적으로, 재조합 벡터는 다음과 같이 CED 장치를 통해 전달된다. 카테테르, 캐눌라 또는 다른 주사 장치가 선택된 대상체 내의 CNS 조직 내로 삽입된다. 정위 지도 및 위치 결정 장치는 예를 들어 에이에스아이 인스트루먼츠 (ASI Instruments, 미국 미시건주 워런)로부터 입수할 수 있다. 또한, 위치 결정은 선택된 표적에 대한 주사 장치의 유도를 돕기 위해 CT 및/또는 MRI 영상화에 의해 얻은 해부학적 지도를 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 본원에서 설명되는 방법은 대상체의 비교적 넓은 영역이 재조합 벡터를 흡수하도록 실시될 수 있기 때문에, 더 적은 수의 주입 캐뉼라가 필요하다. 수술 합병증이 종종 관통 횟수에 관련되기 때문에, 상기 전달 방식은 통상적인 전달 기술에서 관찰되는 부작용을 감소시킬 수 있다. CED 전달에 관한 상세한 설명은 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,309,634를 참조한다.
재조합 AAV 벡터의 뇌실내 또는 심실내 전달은 뇌척수액 (CSF)으로 채워진 다른 하나 이상의 뇌의 뇌실에서 수행할 수 있다. CSF는 뇌실을 채우고 지주막하 공간에 존재하고 뇌 및 척수를 둘러싸는 투명한 유체이다. CSF는 맥락막총에 의해 생산되고, 뇌에 의한 조직액의 삼출 (weeping) 또는 전달을 통해 뇌실 내로 도입된다. 맥락막총은 측뇌실의 기부 및 제3 및 제4 뇌실의 상부를 덮는 구조이다. 특정 연구는 이들 구조가 중추신경계 공간을 매일 4회 채우는 양과 일치하는, 1일당 400-600 cc의 유체를 생산할 수 있음을 제시하였다. 성인 인간에서, 상기 유체의 부피는 125 내지 150 ml (4-5 oz)로 계산되었다. CSF는 연속적으로 형성, 순환 및 흡수된다. 특정 연구는 약 430 내지 450 ml (거의 2컵)의 CSF가 매일 생산될 수 있음을 제시하였다. 특정 계산은 생산량이 성인에서 분당 약 0.35 ml이고, 인간 유아에서 분당 0.15 ml인 것으로 추정한다. 측뇌실의 맥락막총이 대부분의 CSF를 생산한다. CSF는 몬로공 (foramina of Monro)을 통해 제3 뇌실로 유동하고, 제3 뇌실로부터 생산된 CSF가 추가되고, 실비우스 (Sylvius) 도관을 통해 제4 뇌실로 내려간다. 제4 뇌실은 보다 많은 CSF를 추가하고; 유체는 마겐디 및 루쉬카 공 (foramina of Magendie and Luschka)을통해 지주막하 공간 내로 이동한다. 이어서, CSF는 뇌의 기부 전체에 걸쳐서 순환하고, 척수 아래쪽으로 및 대뇌 반구 위쪽으로 순환한다. CSF는 지주막융모 및 두개내 혈관동을 통해 혈관 내로 이동한다.
한 측면에서, 개시된 방법은 치료 산물을 코딩하는 도입유전자를 보유하는 rAAV 비리온을 고통받는 대상체의 CNS에 투여하고, 발현된 단백질이 CSF를 통해 CNS 전체에 걸쳐 수송되기 때문에 치료 효과를 발휘하기에 충분한 수준으로 투여 부위 부근의 CNS 내에서 발현되도록 하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 도입유전자 산물이 CNS 원위 내의 제1 부위에서 치료 수준으로 발현되도록 치료작용의 도입유전자를 보유하는 고 역가 비리온 조성물을 발현된 산물의 최종 작용 부위에 투여하는 것을 포함한다.
실험 마우스에서, 주사된 AAV 용액의 총 부피는 예를 들어 1 내지 20 ㎕이다. 인간을 포함하는 다른 포유동물의 경우, 부피 및 전달 속도는 적절하게 조정할 수 있다. 처리는 표적 부위당 단일 주사로 이루어질 수 있거나, 또는 하나 이상의 부위에서 반복될 수 있다. 다중 주사 부위를 사용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 투여 부위 이외에, 도입유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 함유하는 조성물은 제1 투여 부위의 반대측 또는 동측일 수 있는 또 다른 부위에 투여된다. 주사는 단일 또는 다수, 단측 또는 양측일 수 있다.
투약 치료는 단일 용량 계획, 연속 또는 간헐, 또는 다중 용량 계획일 수 있다. 또한, 대상체에게 적절한 만큼 많은 용량이 투여될 수 있다. 다중 용량이 투여될 경우, 투여되는 제1 제형은 후속 제형과 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 제1 투여는 AAV 벡터의 형태일 수 있고, 제2 투여는 아데노바이러스 벡터, 플라스미드 DNA, 단백질 조성물 등일 수 있다. 또한, 후속 전달은 제2 전달 방식과 동일하거나 상이할 수 있다.
추가로, 대상체에게 본원에 개시된 전달 방법의 조합에 의해 본 발명의 rAAV 벡터를 투여할 수 있다. 따라서, 대상체에게 뇌실내 주사, 직접적인 척수 주사, 수막강내 주사, 및 실질내 뇌 주사 (예를 들어, 선조체, 심부 소뇌핵을 포함하는 소뇌)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 주사 부위에서 AAV 벡터가 주사될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 대상체에게 1) 적어도 하나의 뇌실내 주사, 및 적어도 하나의 직접적인 척수 주사 또는 2) 적어도 하나의 뇌실내 주사 및 적어도 하나의 수막강내 주사 또는 3) 적어도 하나의 뇌실내 주사 및 적어도 하나의 실질내 뇌 주사, 또는 4) 적어도 하나의 직접적인 척수 주사 및 적어도 하나의 수막강내 주사 또는 5) 적어도 하나의 직접적인 척수 주사 및 적어도 하나의 실질내 뇌 주사, 또는 6) 적어도 하나의 수막강내 주사 및 적어도 하나의 실질내 뇌 주사를 통해 rAAV 벡터를 투여할 수 있다.
1종 초과의 도입유전자가 전달된 재조합 비리온에 의해 발현될 수 있음이 이해되어야 한다. 별법으로, 각각 하나 이상의 상이한 도입유전자를 발현하는 별개의 벡터가 본원에 설명되는 바와 같이 대상체에 전달될 수 있다. 따라서, 다수의 도입유전자가 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 전달되는 벡터가 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합될 수 있음이 의도된다. 추가로, 단백질 및 핵산 치료의 조합이 사용될 수 있다.
가장 효과적인 투여 수단 및 치료 유효 투여량은 당업자에게 공지되어 있고, 벡터, 치료 조성물, 표적 세포, 및 치료받는 대상체에 따라 상이할 것이다. 치료 유효 용량은 예를 들어 관심있는 특정 질병의 하나 이상의 동물 모델을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다. "치료 유효량"은 임상 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 해당할 것이다. 예를 들어, rAAV 비리온의 생체내 주사를 위해, 용량은 거의 약 106 내지 1015개 게놈 입자의 재조합 바이러스, 보다 바람직하게는 108 내지 1014개 게놈 입자의 재조합 바이러스, 또는 목적하는 효과의 제공에 충분한 상기 범위 내의 다른 용량일 것이다. 특정 실시양태에서, 조성물 내의 벡터의 농도 또는 역가는 적어도 (a) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 50 (x 1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 50 (x109 tu/ml); 또는 (c) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 50 (x1010 iu/ml)이다.
시험관 내 형질도입을 위해, 세포에 전달되는 유효량의 rAAV 비리온은 거의 108 내지 1013의 재조합 바이러스일 것이다. 다시, 제약 조성물 내의 형질도입된 세포의 양은 약 104 내지 1010 세포, 보다 바람직하게는 105 내지 108 세포일 것이다. 다른 효과적인 투여량은 용량 반응 곡선을 확립하는 일상적인 시험을 통해 당업자에 의해 쉽게 확립될 수 있다.
일반적으로, 1 ㎕ 내지 1 ml의 조성물이 전달될 것이고, 예를 들어 0.01 내지 약 0.5 ml, 예를 들어 약 0.05 내지 약 0.3 ml, 예를 들어 0.08, 0.09, 0.1, 0.2 등 및 상기 범위 내의 다른 수치의 조성물이 전달될 것이다.
동물 모델
상기 설명된 바와 같은 도입유전자를 포함하는 AAV 비리온을 사용하는 치료 유효성 및 안정성은 적절한 동물 모델에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 인간 질병에 가장 유사한 것으로 보이는 동물 모델은 특정 질병이 높은 발생률로 자연 발생하는 동물종 또는 그와 같이 발생하도록 유도된 동물종을 포함한다.
특히, SMA에 대한 몇몇 동물 모델이 공지되어 있고, 생성된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Sumner C.J., NeuroRx (2006) 3:235-245]; [Schmid et al., J. Child Neurol. (2007) 22: 1004-1012]을 참조한다. 상기 설명한 바와 같이, SMA (상염색체 열성 신경근 질환)의 분자적 기초는 생존 운동 뉴런 유전자 1 (SMN1)의 동종접합성 손실이다. SMN2로 불리는, SMN1 유전자의 거의 동일한 카피는 인간에서 발견되고, 질병 중증도를 조정한다. 인간과 대조적으로, 마우스는 SMN1에 동등한 단일 유전자 (SMN)를 갖는다. 상기 유전자의 동종접합성 손실은 배아에 치명적이고, 대규모 세포 사멸을 야기하고, 이것은 SMN 유전자 산물이 세포 생존 및 기능에 필요함을 나타낸다. SMN이 결여된 마우스 내로 2 카피의 SMN2를 도입하면 배아 치사로부터 마우스를 구제하고, SMA 표현형을 갖는 마우스가 생성된다 (Monani et al., Hum. Mol. Genet. (2000) 9:333-339). 고카피수의 SMN2는 충분한 SMN 단백질이 운동 뉴런에서 생산되기 때문에 마우스를 구제한다. 또한, 인간 SMN2를 발현하는 트랜스제닉 (transgenic) 마우스 주의 생산을 보고하는 문헌 [Hsieh-Li et al., Nat. Genet. (2000) 24:66-70]을 참조한다. 특히, SMN-/- 배경에서 SMN2를 보유하는 트랜스제닉 마우스는 SMA 환자와 유사한 척수 및 골격근의 병리학적 변화를 보인다. 이들 마우스에서 병리학적 변화의 중증도는 엑손 7에 의해 코딩되는 영역을 함유한 SMN 단백질의 양과 상호관련된다. 상기 마우스 모델의 표현형은 운동 뉴런 세포 손실, 골격근 위축, 비정상적인 신경근 접합부 (NMJ), 행동 결핍, 마비, 및 약 2주의 단축된 수명을 포함한다 (Le et al., Hum.Mol. Genet. (2005) 14:845-857).
유사하게, ALS의 동물 모델이 알려져 있다. ALS는 피질, 뇌간 및 척수 내의 운동 뉴런의 선택적인 손실을 특징으로 하는 치명적인 신경변성 질병이다. 질병의 진행은 사지, 축성 (axial) 및 호흡 근육의 위축을 야기할 수 있다. 운동 뉴런 세포 사멸에는 반응성 신경아교증, 신경미세섬유 이상, 및 피질척수로 및 복측근 내의 굵은 수초화 섬유의 유의한 손실이 수반된다. ALS의 병인에 대한 이해는 부족한 상태이지만, 축적되는 증거는 산발성 (SALS) 및 가족성 (FALS) ALS가 많은 유사한 병리학적 특징을 공유함을 나타내고; 따라서, 어느 형태의 연구가 통상적인 치료법을 제시할 것이라는 희망을 제시한다. FALS는 약 10%의 진단된 환자를 차지하고, 그 중 20%는 Cu/Zn수퍼옥시드 디스뮤타제 (SODI)의 우성 유전 돌연변이와 연관된다. 돌연변이체 인간 SODI 단백질 (예를 들어, SODIG93A 마우스)를 발현하는 트랜스제닉 마우스는 ALS의 많은 병리학적 특징을 반복하고, ALS를 연구하기 위한 이용가능한 동물 모델이다. SALS의 경우, 글루타메이트 유도 흥분독성, 독소 노출, 프로테아좀 기능장애, 미토콘드리아 손상, 신경미세섬유 해체 (disorganization) 및 신경친화성 지지체의 상실을 포함하는 많은 병리학적 메카니즘이 근원적인 원인으로서 관련된다.
실험적 알레르기성 뇌척수염으로도 불리는 실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE)은 MS에 대한 동물 모델을 제공한다. EAE는 다양한 형태 및 병기의 MS와 매우 밀접하게 유사하다. EAE는 급성 또는 만성-재발성, 후천적 염증 및 탈수초화 자가면역 질병이다. 질병을 생성시키기 위해서, 동물에 뉴런을 둘러싸는 절연초 (insulating sheath)인 미엘린을 구성하는 단백질을 주사한다. 상기 단백질은 주사된 동물에서 자가면역 반응을 유도하여 인간에서 MS와 밀접하게 유사한 질병 과정을 발생시킨다. EAE는 마우스, 래트, 기니 피그, 토끼, 짧은꼬리원숭이, 붉은털원숭이 및 마모셋 (marmoset)을 포함하여 많은 상이한 동물 종에서 유도되었다.
척수성 및 연수근 위축 (SBMA)은 안드로겐 수용체 (AR) 유전자의 엑손 1 내의 트리뉴클레오티드 반복체 (TNR)의 팽창에 의해 야기되는 성인-발병 운동 뉴런 질병이다. 상기 질환은 운동 및 감각 뉴런의 변성, 근위근 위축, 및 내분비 이상, 예를 들어 여성형 유방증 및 생식능력 감소를 특징으로 한다. 수컷에서만 증상이 발생하고, 암컷 보유자는 대체로 무증상이다. SBMA의 분자적 기초는 안드로겐 수용체 (AR) 유전자의 제1 엑손 내의 폴리글루타민 (폴리Q) 트랙을 코딩하는 트리뉴클레오티드 CAG 반복체의 팽창이다. 병리학적 특질은 뇌간 및 척수 및 일부 다른 내장 장기에서 잔여 운동 뉴런 내의 팽창된 폴리Q가 존재하는 돌연변이체 및 말단절단된 AR을 함유하는 핵내 봉입체 (NI)이다. 몇몇의 트랜스제닉 마우스 모델이 SBMA의 발병기전을 연구하기 위해 생성되었다. 예를 들어, 문헌 [Katsuno et al., Cytogen. and Genome Res. (2003) 100:243-251]을 참조한다. 예를 들어, 인간 AR 프로모터 하에 순수한 239 CAG를 보유하는 트랜스제닉 마우스 모델 및 팽창된 CAG를 갖는 말단절단된 AR을 보유하는 또 다른 모델은 운동 손상 및 척수 운동 뉴런 내의 핵 NI를 보인다. 팽창된 폴리Q를 갖는 전장 인간 AR을 보유하는 트랜스제닉 마우스는 진행성 운동 손상 및 신경성 병상 및 표현형의 성적 차이를 보인다. 이들 모델은 SBMA에서 관찰되는 표현형 발현을 반복한다.
척수소뇌성 실조증 타입 3으로도 불리는 마카도-조셉 (Machado-Joseph) 병 (MJD)은 폴리글루타민 팽창을 갖는 돌연변이체 아탁신-3에 의해 야기된다. MJD, 및 다른 폴리글루타민 척수소뇌성 실조증의 마우스 모델이 생성되었다. 이들 모델에 대한 검토는 예를 들어 문헌 [Gould, V.F.C. NeuroRX (2005) 2:480-483]을 참조한다.
따라서, 당업계의 표준 동물 모델이 운동 뉴런 질환의 치료를 위한 본 발명의 방법 및 조성물의 활성 및/또는 유효성의 스크리닝 및/또는 평가를 위해 이용할 수 있다.
본 발명의 키트
본 발명은 또한 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 키트는 관심있는 단백질을 코딩하는 재조합 벡터를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 키트는 본원에 설명되는 임의의 방법에 대한 벡터의 사용에 관한 적합한 세트의 설명서, 일반적으로 서면 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 다른 편리한 적절한 포장 내에 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 벡터가 건조 제형 (예를 들어, 동결건조된 또는 건조 분말)으로 제공될 경우, 탄성 마개를 통해 유체를 주사함으로써 벡터가 쉽게 재현탁될 수 있도록 탄성 마개가 있는 바이알이 통상 사용된다. 비-탄성의 제거가능한 밀봉부 (예를 들어, 밀봉 유리) 또는 탄성 마개가 있는 앰퓰은 액체 제형에 대해 가장 편리하게 사용된다. 또한, 특수 장치, 예를 들어 주사기 또는 주입 장치, 예를 들어 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 포장도 고려된다.
용도 또는 재조합 벡터에 대한 설명서는 일반적으로 투여량, 투여 계획, 및 의도되는 사용 방법에 대한 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 포장 (예를 들어, 다중-용량 포장) 또는 하위 단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 제공되는 설명서는 일반적으로 라벨 또는 포장 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상의 서면 지시이지만, 기기에 의해 판독가능한 설명서 (예를 들어, 자성 또는 광학 저장 디스크에 저장된 설명서)도 허용된다.
2. 실험
본 발명을 수행하기 위한 구체적인 실시양태를 아래에 제시한다. 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제시되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하려고 의도되지 않는다.
사용된 수치 (예를 들어, 양, 온도 등)에 관하여 정확도를 보장하기 위해 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차 및 편차는 물론 허용되어야 한다.
물질 및 방법
AAV 벡터. 예시적인 인간 SMN1 유전자의 개방 해독 프레임 (개방 해독 프레임 서열을 도 9A에 제시하고; 대응하는 아미노산 서열을 도 9B에 제시하고; 완전한 뉴클레오티드 서열은 GenBank 기탁 번호 NM_000344로 찾을 수 있다)을 AAV2 도립 말단 반복체 (ITR) 및 1.6 kb 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 β-액틴 (CBA) 프로모터 또는 scAAV2 ITR 및 0.4 kb 인간 β-글루쿠로니다제 (GUSB) 프로모터를 함유하는 셔틀 (shuttle) 플라스미드 내로 클로닝하였다. scAAV 패키징 반응에서 재조합 게놈의 크기 제한은 작은 프로모터의 사용을 요구하였다 (McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656). 따라서, 0.4 kb GUSB 프로모터가 척수의 운동 뉴런을 포함한 CNS 전체에서 보편적으로 발현되기 때문에 이를 선택하였다 (Passini et al., J. Virol. (2001) 75:12382-12392). 재조합 플라스미드를 인간 293 세포의 삼중-플라스미드 동시형질감염에 의해 AAV 혈청형-8 캡시드 내로 각각 패키징하고 (예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,001,650 참조), 비리온을 이전에 보고된 바와 같이 컬럼-정제하였다 (O'Riordan et al., J. Gene Med. (2000) 2:444-454). 생성되는 벡터 AAV2/8-CBA-hSMN1 (AAV-hSMN1) 및 scAAV2/8-GUSB-hSMN1 (scAAV-hSMN1)는 각각 1 ml 당 8.3 e12 및 2.8 e12 게놈 카피의 역가를 가졌다.
동물 및 절차. 이종접합체 (SMN+/-, hSMN2+/+, SMNΔ7+/+) 사육 쌍을 교배시키고, 출생일 (P0)에 신생 새끼에게 양 대뇌 반구의 대뇌 측뇌실 및 상부 요수 내로 각각 2 ㎕을 총 3회 주사하였다. 바이러스 벡터의 총 용량은 AAV-hSMN1 및 scAAV-hSMN1에 대해 각각 5.0 e10 및 1.7 e10 게놈 카피이었다. 모든 주사는 설명된 바와 같이 미세하게 취한 유리 마이크로피펫 바늘로 수행하였다 (Passini et al., J. Virol. (2001) 75:12382-12392). 주사 후에, 새끼들을 발가락을 클리핑하고 유전자형을 결정하여 (Le et al., Hum.Mol. Genet. (2005) 14:845-857), SMA (SMN-/-, hSMN2+/+, SMNΔ7+/+), 이종접합체 및 야생형 (SMN+/+, hSMN2+/+, SMNΔ7+/+) 마우스를 확인하였다. 생존 시에 한배 새끼 크기에 대해 제어하기 위해 모든 한배 새끼들을 7마리 새끼로 선별하였다. 비처리된 대조군을 생성하기 위해 일부 한배 새끼에게는 주사하지 않았다.
웨스턴 블롯. 생화학적 분석을 위해, 처리된 및 비처리된 마우스를 16 및 58-66일에 치사시키고 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 관류시키고, 척수를 절개하고 요수, 흉수 및 경수 세그먼트로 나누고, 액체 질소 내에서 급속 동결시켰다. T-Per 용해 버퍼 및 프로테아제 억제제 칵테일 (피어스 (Pierce, 미국 일리노이주 록포드))을 사용하여, 조직을 50 mg/mL의 농도로 균질화시켰다. 균질물을 10,000 RCF에서 6분 동안 원심분리하여 청정화하고, 단백질 농도를 BCA 분석 (피어스, 미국 일리노이주 록포드)에 의해 측정하였다. 10-20 ㎍의 균질 단백질을 4-12% SDS-PAGE 상에서 분해시키고, 니트로셀룰로스 막에 옮기고, 마우스 모노클로날 항-SMN (1:5,000, 비디 바이오사이언시스 (BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 산 호세)) 및 토끼 폴리클로날 항-β-튜불린 (1:750, 산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology, 미국 캘리포니아주 산타크루즈)) 항체로 프로빙하였다. 막을 적외선 2차 항체 (1:20,000, LI-COR 바이오사이언시스 (LI-COR Biosciences, 미국 네브라스카주 링컨))와 함께 인큐베이팅하고, 단백질 밴드는 Odyssey (LI-COR 바이오사이언시스)을 이용하여 정량적 형광에 의해 가시화하였다. 분자량 마커는 밴드의 크기를 확인하였다.
면역조직화학. 조직학적 분석을 위해, 처리된 및 비처리된 마우스를 16 및 58-66일에 치사시키고 4% 파라포름알데히드 (pH 7.4)를 관류시키고, 척수를 제거하고 30% 수크로스 내에 48-72시간 동안 넣고, OCT 내에 포매시키고, 냉동미세절단기 (cryostat)로 10 ㎛ 동결 절편으로 절단하였다. 척수 절편을 1 h 동안 실온 (RT)에서 차단시킨 후, AAV-유도된 hSMN 발현을 확인하기 위해 마우스 모노클로날 항-SMN 항체 (1:200 희석), 또는 척수의 층판 8 및 9 (전각)의 운동 뉴런을 확인하기 위해 염소 폴리클로날 항-콜린 아세틸 트랜스퍼라제 (ChAT) 항체 (밀리포어 (Millipore; 미국 매사추세츠주 벌링턴); 1:100 희석), 또는 성상세포를 검출하기 위해 토끼 폴리클로날 항-아교 섬유 산성 단백질 (GFAP) 항체 (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich), 1:2,500 희석)와 함께 인큐베이팅하였다. 1차 항체를 1 h 동안 RT에서 인큐베이팅한 후 항습 챔버에서 4℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 이어서, 척수 절편을 1 h 동안 RT에서 FITC-접합된 항-토끼 2차 항체 또는 Cy3-접합된 항-염소 2차 항체 (잭슨 이뮤노리써치 (Jackson ImmunoResearch; 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브); 1:250 희석)와 함께 인큐베이팅하였다. SMN 및 ChAT 면역 양성 신호를 증가시키기 위해, TSA 신호 증폭 키트 (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer, 미국 매사추세츠주 월담)) 또는 시트르산 항원 부활 프로토콜 (벡터 랩스 (Vector Labs, 미국 캘리포니아주 벌링에임))을 각각 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 절편을 벡타쉴드 (Vectashield) 장착 매체 (벡터 랩스; 미국 캘리포니아주 벌링에임)로 커버-슬립을 덮었다.
운동 뉴런 계수. ChAT 면역 양성 세포의 수를 경수, 흉수, 및 요수 세그먼트에서 계수하였다. 양측 계수를 3개의 척수 세그먼트의 전후축을 따라 전각 내에서 100x 배율로 수행하였다. 동일한 세포의 이중 계수를 방지하기 위해 인접 절편들을 적어도 100 마이크로미터 떨어뜨렸다. 상이한 동물들 사이에서 해부학상 일치된 절편들을 비교하기 위해 특별히 주의하였고, 모든 세포 수를 단일 관찰자가 맹검으로 평가하였다. 배경을 현저하게 넘는 형광 ChAT 신호를 보이는 척수의 층판 8 및 9 내에 위치하는 세포가 운동 뉴런으로 생각되었다.
근섬유 크기. 말초의 조직학적 분석을 위해, 각각의 마우스의 우측면으로부터 고정된 사두근, 비복근 및 늑간근을 파라핀으로 처리하고, 헤마톡실린-에오신에 대해 염색하여 보고된 바와 같이 근섬유 크기를 결정하였다 (Avila et al., J. Clin. Invest. (2007) 117:659-671). 동물마다 각각의 근육으로부터 약 500 비-겹치는 근섬유를 무작위로 선택하고, 60X 배율로 사진을 찍었다. 각각의 근섬유의 단면적을 Metamorph 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일))를 이용하여 측정하였다.
신경근 접합부 염색 (NMJ). 각각의 마우스의 좌측면으로부터 고정된 근육군을 NMJ 분석을 위해 PBS 내에 저장하였다. 사두근, 비복근 및 늑간근으로부터 정돈한 근육 섬유에 대한 완전 염색을 보고된 바와 같이 수행하였다 (Lesbordes et al., Hum.Mol. Genet. (2003) 12:1233-1239). 시냅스전 신경 말단을 4℃에서 150 kD 신경미세섬유 이소형에 대한 토끼 폴리클로날 항체 (NF-M, 밀리포어 (Millipore, 미국 매사추세츠주 빌레리카, 1:200 희석)에 이어 비오티닐화 항-토끼 2차 항체 (잭슨 이뮤노리써치, 1:200 희석)와 함께 철야 인큐베이팅하여 표지하였다. 근육 종말판 상의 아세틸콜린 수용체를 Alexa 555-접합된 α-붕가로독소 (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes, 미국 오레곤주 유진))로 1:5000으로 3 h 동안 RT에서 표지하였다. 염색된 근육 섬유를 슬라이드 상에 장착하고, 벡타쉴드로 커버-슬립을 덮고, 에피형광 하에 관찰하였다. NMJ 정량을 위해, 동물마다 각각의 근육으로부터 최소 100 NMJ를 무작위로 선택하고 현미경 하에 평가하였다. 공초점 영상을 Zeiss LSM 510-META 현미경을 이용하여 포착하였다.
거동 시험. 정위 반사 시험에서, 각각의 마우스를 배와위 (supine position)로 놓고, 마우스가 4개의 모든 발로 서는 자세로 바꾸기 위해 소요된 시간을 측정하였다. 각각의 동물에 대해 절차를 3회 반복하고, 3개의 점수의 평균을 정위 점수로 지정하였다. 마우스가 60초 내에 반응하지 않으면, 시험을 종료하였다. 부주지성 시험에서, 각각의 마우스를 하방으로 향하는 45°-플랫폼 상에 놓았다. 마우스가 "머리를 든 (head up)" 자세로 180° 회전하면 시험을 성공으로 간주하였다. 각각의 마우스를 180초 이내에 완수하도록 3회 시도하였다. 악력 시험에서, 앞다리 및 뒷다리를 와이어 망 (wire grid) 상에 함께 놓고, 망을 따라 부드럽게 수평으로 끌어당겼다. 저항을 힘 변환기 (force transducer)에 의해 그람 단위로 기록하였다. 뒷다리 벌어짐 시험에서, 각각의 마우스를 그의 꼬리로 5초 동안 매달고, 결과의 벌어짐을 자의적 시스템에 기초하여 스코어링하였다. 야생형 마우스에서 관찰된 것과 유사한 두 뒷다리의 건강한 벌어짐에 4의 점수를 주었다. 두 뒷다리의 예각 벌어짐 또는 "약한 벌어짐"은 3의 점수였다. 한쪽 다리 벌어짐에 2의 점수를 매겼다. 벌어짐을 보이지 않는 마우스에게 1의 점수를 주었다. 마지막으로, 0의 점수는 새끼가 두 뒷다리를 함께 당겨 서로 실질적으로 교차시킬 때 매겼다.
통계. 거동 시험, 운동 뉴런의 수, 단면 근섬유 면적 및 NMJ를 일원 ANOVA 및 본페로니 다중 사후 비교를 이용하여 및 양측 비쌍체 스튜던트 t-시험을 이용하여 분석하였다. 카플란-메이어 (Kaplan-Meier) 생존 곡선을 맨틀-핸즐 (Mantel-Haenszel) 시험과 동등한 로그-순위 (log-rank) 검정을 이용하여 분석하였다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism v4.0 (그래패드 소프트웨어 (GraphPad Software, 미국 캘리포니아주샌디에고))을 이용하여 수행하였다. p < 0.05인 값을 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1
AAV-매개된 SMN1 전달을 이용한 처리에서 생존의 유의한 증가
출생후 0일 (P0)의 SMA 마우스에게 AAV-hSMN1을 양쪽 대뇌 측뇌실 내로 뇌실내 주사하고 마우스 당 5.0 e10 게놈 카피의 총 용량에 대해 상부 요수 내로 직접적인 척수 주사에 의해 주사하였다. 처리된 및 비처리된 SMA 마우스를 모든 마우스를 방해받지 않고 유지되고 인도적 실험종료 시점에 희생시키는 생존 코호트 (cohort), 또는 모든 마우스를 말기 비처리된 SMA 마우스와의 나이 일치된 비교를 위해 16일에 희생시키는 나이 일치된 코호트로 무작위로 나누었다.
생존 코호트에서, AAV-hSMN1로 처리된 SMA 마우스는 비처리된 SMA 대조군의 15일에 비해 50일로 중앙 수명의 유의한 증가를 보였다 (p < 0.0001) (도 1). 모든 처리된 SMA 마우스는 15일에 생존하고, 비처리된 SMA에서 0%에 비해 처리된 SMA 마우스의 87.5%가 19일에 생존하였다. 카플란-메이어 곡선은 처리 시에 바이모드 (bimodal) 생존 분포를 보여주었고, 여기서 제1군은 17-27일에 죽었고, 제2군은 58-66일에 죽었다 (도 1). 제1군에서, 대부분의 처리된 SMA 마우스는 보행을 보였지만, 마우스는 성장이 저해되었고 결국 케이지 내에서 죽은 채 발견되었다. 58-66일에서 제2군의 처리된 SMA 마우스는 보행 및 체중 증가를 보였지만, 결국 중증 뒷다리 괴사를 발병하여 동물을 안락사시켰다. 따라서, 58-66일에 마우스를 16-일 나이 일치된 코호트와 평행으로 분석하였다.
실시예 2
척수에서 SMN의 AAV-매개된 발현 및 운동 뉴런 계수
hSMN 단백질의 수준은 AAV-hSMN1의 CNS 투여 후에 척수 전체에서 증가하였다. 16일에 AAV-처리된 SMA 마우스에서, 비처리된 SMA 및 야생형 마우스에 비해 각각 주사된 요수 세그먼트 내에서 hSMN 단백질 수준의 대략 34.0배 및 3.6배 증가가 존재하였다 (도 2a). hSMN 단백질 발현의 증가는 다른 세그먼트 내로 연장하였고, 이는 16일에 흉수 및 경수 척수에서 야생형 수준에 비해 >2.0배 증가를 포함하였다 (도 2b 및 2c). 제2군에서, hSMN 단백질 발현은 AAV-처리된 SMA 마우스에서 58-66일에 지속되었다. 주사된 요수 및 이웃하는 흉수 및 경수 영역은 각각 나이 일치된 WT 대조군보다 약 2.5-, 2.2- 및 1.2배 더 높았다.
조직 절편의 면역염색은 16 및 58-66일에 처리된 SMA 마우스에서 척수의 후각 및 전각 내의 hSMN 단백질을 보여주었다 (도 3). 형질도입된 세포를 보다 철저하게 검사하면, 벡터-유래된 hSMN 발현은 세포액 전체에서 반점 (punctate) 패턴, 및 핵 내에서 젬-유사 구조로 검출되었다 (도 3A). 또한, hSMN 단백질은 수상돌기 및 축색돌기의 길이에 걸쳐지게 보일 수 있는 구별된 과립-유사 구조로 신경돌기에 위치하였다 (도 3B-3D). SMA 마우스에서 내인성 hSMN 단백질의 매우 낮은 수준은 세포 내에서 면역검출 역치 미만이었다 (도 3E).
ChAT와 hSMN의 동일 위치 존재에 의해 형질도입된 세포의 하위세트는 실제로 운동 뉴런임이 확인되었다 (도 3F-3I). 16일에, 척수의 요수, 흉수 및 경수 세그먼트 내의 ChAT-양성 세포의 약 18-42%가 AAV-hSMN1에 의해 형질도입되었다 (도 3J). 상기 백분율은 58-66일에서 더 높았고, 이때 60-70%의 운동 뉴런이 3개의 척수 세그먼트 내에서 외인성 hSMN을 발현하였다 (도 3J). 비처리된 돌연변이체에 비해 처리된 SMA 마우스에서 운동 뉴런의 수의 전체적인 증가가 있었다 (도 4). 그러나, 16 및 58-66일에 야생형 마우스에 비해 처리된 SMA 마우스에서 유의하게 더 적은 운동 뉴런이 존재하였다 (도 4).
비처리된, 뇌실내 (ICV)로만 주사된, 및 요수에만 주사된 이종접합체 마우스로부터의 경수 조직 절편의 hSMN 면역염색을 수행하였다. ICV 주사는 단독으로 뇌 내의 뚜렷한 AAV 형질도입 패턴에 기여하지 않았지만, 그럼에도 불구하고 요수에만 주사 시에 달성가능하지 않았던 경수의 실질적인 표적화를 생성하였다. 특히, ICV로만 주사하면 hSMN의 경수 발현을 일으켰다. 이것은 아마도 주사 부위로부터 원위 근접성 때문에 경수의 매우 적은 형질도입을 보인 요수 세그먼트의 실질내 주사에 대조적이었다. 때때로, 젬-유사 외관을 갖는 SMN 면역 양성 신호가 비처리된 이종접합체 및 야생형 마우스의 핵에서 관찰되었다. 그러나, 상기 면역염색 패턴은 비처리된 SMA 마우스의 핵에서는 관찰되지 않았다.
따라서, P0 마우스에서 ICV 및 요수 주사의 조합은 척수의 넓은 광범위한 형질도입을 제공하였다. AAV8-hSMN의 ICV 주사는 형질도입을 위해 경수를 표적화하였다.
실시예 3
근섬유 크기, NMJ, 및 거동에 대한 AAV 처리의 효과
현저한 변성을 보이기 때문에 사두근 (근위), 비복근 (원위) 및 늑간근 (호흡) 근육을 분석을 위해 선택하였다. 16일에 비처리된 SMA 마우스에서, 근섬유는 작고, 대부분의 개별 세포는 단면적이 < 100 ㎛2이었다 (도 5A). 비처리된 SMA 마우스로부터 근섬유의 10% 미만이 단면적이 200 ㎛2를 초과하였다. 이와 반대로, AAV-hSMN1 처리된 SMA 마우스에서 근섬유 크기의 분포는 야생형과 유사하였고, 많은 세포는 단면적이 16 및 58-66일에 각각 200 ㎛2를 초과하고 400 ㎛2를 초과하였다 (도 5A 및 5B). 16일의 총 평균은 처리된 SMA 마우스로부터의 근섬유가 비처리된 SMA 마우스보다 2배 더 큼을 보여주었다 (도 5C). 또한, 58-66일에 처리된 SMA 마우스에서 평균 근섬유 단면적은 사두근, 비복근 및 늑간근에서 각각 야생형 마우스의 67%, 76% 및 82%이었다 (도 5C).
16일에 비처리된 SMA 마우스로부터의 신경근 접합부 (NMJ)의 분석은 시냅스전 말단에서 신경미세섬유 단백질의 비정상적인 축적을 보여주었다 (도 6A). 비처리된 SMA 마우스에서 사두근, 비복근 및 늑간근으로부터의 시냅스전 말단의 약 75-90%가 상기 특질 병상을 보였다 (도 6F). 이와 반대로, AAV-hSMN1로 처리한 SMA 마우스로부터의 시냅스전 말단의 대부분은 상기 붕괴된 구조를 포함하지 않았다 (도 6B, 6D). 처리된 SMA 마우스로부터의 시냅스전 말단의 10-25% 및 5%만이 각각 16일 및 58-66일에 상기 특질 병상을 보였다 (도 6F). 그러나, 처리는 야생형에 비해 시냅스전 말단에서 보다 많은 가지를 생성시켰다 (도 6B-6E). 처리된 SMA 및 야생형 마우스로부터의 시냅스후 NMJ에 대해, α-붕가로독소 염색은 아세틸콜린 수용체의 기능성 네트워크를 표시하는 '프레첼 (pretzel)-유사' 구조를 생성시켰다 (도 6B-6E).
처리된 및 비처리된 마우스를 이 동물 모델에 대해 검증된 주기적인 거동 시험으로 시험하였다 ([Butchbach et al., Neurobiol. Dis. (2007) 27:207-219]; [El-Khodar et al., Exp. Neurol. (2008) 212:29-43]). 처리된 SMA 마우스는 우수한 신체 점수 및 보행 기술을 가진 반면, 비처리된 SMA 마우스는 해방되고 마비되었다 (도 7A). 처리된 SMA 마우스는 비처리된 SMA 대조군보다 유의하게 더 무거웠지만, 이들은 야생형 크기에 도달하지 않았다 (도 7B). 처리된 SMA 마우스는 정위 잠복 (latency)에서 유의한 개선을 보였다 (도 7C). 처리된 SMA 마우스에서 또한 공간 이동 거동을 측정하는 부주지성 시험을 완료하는데 유의한 개선이 있었다 (도 7D). 또한, 처리된 SMA 마우스는 악력 및 뒷다리를 벌리는 능력에서 유의한 개선을 보였다 (도 7E, 7F).
실시예 4
자가-상보성 AAV를 사용한 수명에 대한 효과
이론에 제한되지 않으면서, 자가-상보성 AAV (scAAV) 벡터는 이중가닥 재조합 게놈 때문에 보다 빠른 발현 운동학을 갖는 것으로 예측된다 (문헌 [McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16: 1648-1656]에서 검토됨). 이러한 신속한 발현 증가는 시술의 시간창이 작은 고도로 공격적인 질병 또는 병태에 유익할 수 있다. 따라서, 보다 이른 발현이 효능을 개선할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, scAAV 벡터 (scAAV-hSMN1)를 조작하고 시험하였다. 실시예 1에서 수행된 바와 동일한 주사 부위를 이용하여, scAAV-hSMN1의 1.7 e10 게놈 카피의 용량을 P0 SMA 마우스에 투여하였다.
scAAV-hSMN1으로 처리하면 157일의 중앙값 생존의 두드러지고 현저한 개선을 일으켰고 (p <0.0001), 이것은 AAV-hSMN1-처리된 마우스 및 비처리된 SMA 마우스에 비해 각각 +214% 및 +881% 증가였다 (도 8). scAAV-처리된 마우스의 약 42%는 중앙값 생존의 1000% 초과의 증가 (로그-배수 증가)를 보였다. 또한, scAAV2/8-GUSB-hSMN1 처리는 SMA 마우스의 88%가 66일을 지나 생존시켰고, 이와 반대로 AAV2/8-CBA-hSMN1을 사용할 때는 0%이었다. scAAV-처리된 SMA 마우스는 건강한 신체 점수를 갖고, 단정하고, 체중이 증가하고, 생애 내내 보행을 유지하였다. 흥미롭게도, scAAV-처리된 SMA 마우스는 단지 중증 표현형으로 결코 진행되지 않는 경증 뒷다리 괴사를 발병하였다. 대부분의 scAAV-처리된 SMA 마우스는 숨 쉴 때 들리는 헐떡거림과 호흡율 감소를 포함한 예기치 않은 돌발적인 호흡 곤란 발생 때문에 희생시켰다.
scAAV8-hSMN을 사용한 생존의 관찰된 증가에 대한 기초를 더 잘 이해하기 위해, 추가의 SMA 마우스를 P0에서 처리하고, 주사 후 16 또는 64 (58-66d)일에 희생시키고, 생존 곡선으로부터 장기 생존하는 scAAV8-처리된 마우스를 분석하였다 (도 8). 16일에, scAAV8-hSMN 군으로부터의 SMN 발현 수준은 WT 동물에서 관찰된 것에 약 60-90%이었다. 이들 수준은 이 시점에 AAV8-hSMN 처리를 이용하여 달성되는 것보다 실질적으로 더 적었다. scAAV8-hSMN-처리된 SMA 마우스에서, 요수 및 흉수 세그먼트 모두 내의 SMN 수준은 58-66 및 120-220일에 각각 WT 수준 이상이거나 유사하였다 (도 2a 및 2b). 이와 반대로, 경수 내의 SMN 수준은 모든 시점에 비교적 낮게 유지되었다.
요수 내의 AAV 벡터 향성 (tropism)의 비교는 주사 후 16일 및 157일에 비처리된 SMA, AAV8-hSMN-처리된 SMA, 및 scAAV8-hSMN-처리된 SMA 마우스로부터의 동결된 조직 절편에 대한 hSMN 면역염색을 이용하여 검사하였다. 아교 세포 형태학과 일치하는 확산된 hSMN 면역염색 패턴이 AAV8-hSMN에서 16일에 관찰되었다. hSMN 및 mGFAP의 이중 면역표지를 통해 AAV8-hSMN-형질도입된 세포의 하위세트는 성상세포임을 확인하였다. 이와 반대로, scAAV8 처리는 GFAP와 동일 위치에 존재하지 않는 뉴런 형태를 갖는 구분된 세포체에서만 hSMN 발현을 일으켰다. hSMN 및 운동 뉴런 마커 mChAT의 이중 면역표지를 통해 scAAV8-hSMN 및 AAV8-hSMN에 의해 형질도입된 세포의 하위세트가 운동 뉴런임을 확인하였다. hSMN 발현은 157일에 scAAV8-hSMN로 예시되는 바와 같이, 두 바이러스 벡터를 사용할 때 척수의 뉴런간 세포층 내에서 또한 관찰되었다. 따라서, AAV8-hSMN과 반대로, scAAV8-hSMN-처리된 SMA 마우스의 조직학적 분석은 hSMN 발현이 뉴런에 크게 제한됨을 보여주었다.
또한, hSMN 및 mChAT를 사용한 이중 면역염색은 AAV8-hSMN에 비해 scAAV8-hSMN로 형질도입된 운동 뉴런의 백분율의 유의한 증가를 보여주었다 (도 10a). scAAV를 사용한 운동 뉴런의 보다 효율적인 표적화는 ChAT-양성 세포의 수의 유의한 증가와 상호관련되었다 (도 10b-10d). 16일에 사두근 및 늑간근에서 NMJ의 분석은 또한 AAV8-hSMN에 비해 scAAV-hSMN를 사용할 때 붕괴된 구조의 수의 유의한 감소를 보였다 (도 10e 및 10f). 그러나, scAAV-hSMN 군에서 운동 뉴런 세포 수의 급감이 수반되면서, 216-269일에 비정상적인 NMJ의 수가 증가하였다 (도 10b-10f).
요약하면, SMA의 마우스 모델의 CNS 내로 출생 시에 AAV8-hSMN을 주사하면 척수 전체에서 SMN의 광범위한 발현을 일으켰고, 이것은 골격근 생리학의 확고한 개선으로 번역되었다. 처리된 SMA 동물은 또한 거동 시험에서 유의한 개선을 보였고, 이것은 신경근 접합부가 기능성임을 나타낸다. 중요하게는, AAV8-hSMN을 사용한 처리는 비처리된 대조군에 대해 15일에 비해 SMA 마우스의 중앙 수명을 50일로 증가시켰다. 또한, 자가-상보성 AAV 벡터를 주사한 SMA 마우스는 157일로 중앙값 생존의 유의한 연장을 포함하여 개선된 효능을 얻었다. 이들 데이타는 CNS-지향, AAV-매개된 SMN 증가가 SMA의 중증 마우스 모델의 뉴런 및 근육 병상 둘 다를 처리할 때 효능이 높음을 증명한다.
따라서, 척수 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 본 발명의 바람직한 실시양태를 일부 상세히 설명하였지만, 본원에 규정된 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 명백한 변이가 이루어질 수 있음이 이해된다.
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Claims (12)

  1. 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 척수성 연수근 위축, 척수소뇌성 실조증, 원발성 측삭 경화증 (PLS) 또는 외상성 척수 손상이 있는 대상체에서 운동 기능을 조정하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자가-상보성 아데노 연관 바이러스 (scAAV) 벡터를 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스 (AAV) 비리온.
  2. 제1항에 있어서, scAAV 벡터가 AAV8 캡시드를 포함하는 것인 재조합 AAV 비리온.
  3. 제1항에 있어서, scAAV 벡터가 AAV2 도립 말단 반복체 (ITR)를 포함하는 것인 재조합 AAV 비리온.
  4. 제1항에 있어서, scAAV 벡터가 AAV8 도립 말단 반복체 (ITR)를 포함하는 것인 재조합 AAV 비리온.
  5. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 비리온 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 척수성 연수근 위축, 척수소뇌성 실조증, 원발성 측삭 경화증 (PLS) 또는 외상성 척수 손상이 있는 대상체에게 운동 기능을 조정하는 단백질을 제공하기 위한 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 비리온을 포함하는, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 척수성 연수근 위축, 척수소뇌성 실조증, 원발성 측삭 경화증 (PLS) 또는 외상성 척수 손상이 있는 대상체에게 운동 기능을 조정하는 단백질을 제공하기 위한 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 소뇌의 심부 소뇌핵의 적어도 하나의 영역 내 투여를 통해 투여되는 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 직접적인 척수 주사를 통해 투여되는 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 뇌실내 주사를 통해 투여되는 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 적어도 하나의 대뇌 측뇌실 내에 투여되는 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 뇌실내 주사 및 직접적인 척수 주사 둘 다를 통해 투여되는 조성물.
  12. 제6항에 있어서, 수막강내 주사를 통해 투여되는 조성물.
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