JP2000506010A

JP2000506010A - Ｃ型肝炎ウイルスリボザイム

Info

Publication number: JP2000506010A
Application number: JP9531197A
Authority: JP
Inventors: ジャックアールバーバー; ピータージェイウエルチ; リチャードトリッツ; スーンペイイェイ; マンユー
Original assignee: イミューソルインコーポレイテッド
Priority date: 1996-02-29
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 2000-05-23
Also published as: WO1997032018A3; EP0914421A2; AU2064297A; US6458567B1; US6043077A; WO1997032018A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、生物体又は被検者においてＣ型肝炎ウイルス(“ＨＣＶ”)感染又は疾患を治療又は予防するのに有効なリボザイム、及びＨＣＶ感染又は疾患を治療する方法を提供する。ＨＣＶ感染又は疾患の治療又は予防方法に有効なリボザイムをコードするベクター、ホスト細胞、ＤＮＡ分子のような試薬が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ型肝炎ウイルスリボザイム技術分野本発明は、一般的には、リボザイムに関し、更に詳細には、Ｃ型肝炎ウイルス核酸を切断することができるリボザイム、及びそのリボザイムを用いる方法に関する。発明の背景Ｃ型肝炎ウイルス(“HCV”)は、非Ａ非Ｂ型肝炎の全患者の約75％に関与するＲＮＡウイルスである。疫学的調査と血清学的調査に基づいて世界の人口の少なくとも１〜２％がＣ型慢性肝炎患者であると推定されている(Davisら,“Ｃ型慢性肝炎の治療法”,北アメリカ胃腸科クリニック，pp．603-613，1995)。米国では、毎年約150,000人が急性肝炎を起こし、死亡原因の第９位となっている。その上、急性患者の約50％が更に進んで慢性の肝蔵疾患となり、そのうち25％が肝硬変を起こす。更に、世界的にみても肝細胞がんの50％がＨＣＶ感染に関係がある。ＨＣＶは、フラビウイルス科に関するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。1989年に単離確認されたこのウイルス(Chooら，Science 244:362-364，1989)は、ウイルスにコードされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって仲介される二本鎖ＲＮＡ中間体によって複製する〜9.5Kbの線状ゲノムをもっている。複製過程でのＤＮＡ中間体は既知ではない。おそらく、複製が校正活性のないＲＮＡポリメラーゼのみを介することからコード配列の変動性は個々のＨＣＶ単離物の特性である。現在、急性及び慢性ＨＣＶ患者を治療する見込みのある唯一の治療法はαインターフェロンである(Fried & Hoofnagle，肝臓疾患セミナー15(1):82-91,1995) 。しかしながら、特に慢性患者に対するαインターフェロンによる治療は一時的な結果を生じるだけである。特に、慢性ＨＣＶ感染の患者をαインターフェロンで治療するほとんどの研究では、わずかに20〜25％が持続した長期応答を維持する(上記Fried & Hoofnagle)。更に、αインターフェロンによる治療は、全身作用 (例えば、疲労、熱、頭痛、食欲不振、体重減少、吐き気、嘔吐、下痢及び脱毛) 、神経作用及び心理作用、感染症に対する感受性の増大、及び各種の自己免疫疾患を含む様々な副作用を生じることがある。本発明は、ＨＣＶ感染の有効な治療法を提供し、更に、関連の他の利点を提供する。発明の要約本発明は、生物体又は被検者においてＣ型肝炎ウイルス(“HCV”)感染又は疾患の治療又は予防に有効なリボザイム、及びＨＣＶ感染又は疾患の治療方法を提供する。ＨＣＶ感染又は疾患の治療及び予防方法に有効なリボザイムをコードするベクター、ホスト細胞、ＤＮＡ分子のような試薬も提供される。従って、本発明の態様においては、Ｃ型肝炎ウイルスの複製、感染又は遺伝子発現を阻害する能力をもつ本発明のリボザイムが提供される。ある実施態様においては、該リボザイムはハンマーヘッド又はヘアピンリボザイムである。他の実施態様においては、該リボザイムはゲノム鎖ＲＮＡ（プラス鎖か又はマイナス鎖）を切断し、その代表例としては下記表Ｉに示される配列が含まれる。他の態様においては、本発明は、かかるリボザイムをコードする核酸分子を提供し、ある実施態様においては、核酸分子はＤＮＡ又はｃＤＮＡである。好適実施態様においては、核酸分子は核酸分子を転写するプロモーターの制御下にある。他の態様においては、本発明は、本明細書に記載されるリボザイムを含むホスト細胞、本明細書に記載されるリボザイムをコードする核酸分子に作用的に結合したプロモーターを含むベクター、及びそのベクターを含むホスト細胞を提供する。ある実施態様においては、ベクターはプラスミド、ウイルスベクター、レトロトランスポゾン又はコスミドである。プロモーターの代表例としては、polIII 及びＣＭＶプロモーターが挙げられる。他の態様においては、本発明は、細胞内でＣ型肝炎ウイルス感染及び複製を阻害することができるリボザイムの作製方法であって、プロモーターの転写制御下で（例えば、ベクター内で）リボザイムをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ）を供給する工程、及び該核酸分子を転写して該リボザイムを作製する工程を含む、前記方法を提供する。該方法は、そのように作製したリボザイムを精製する工程を更に含む。該リボザイムは、試験管内、生体内又は生体外で作製される。別の態様においては、本発明は、ＨＣＶに感染した細胞においてＨＣＶ複製を妨害又は予防する方法であって、本明細書に記載されるリボザイムの有効量を細胞に導入する工程を含む、前記方法を提供する。実施態様においては、その方法は、本明細書に記載されるリボザイムをコードするＤＮＡの有効量を細胞に導入する工程及び該ＤＮＡを転写して該リボザイムを作製する工程を含む。他の態様においては、本発明は、ＨＣＶに感染しやすい細胞においてＣ型肝炎ウイルス感染を予防する方法であって、本明細書に記載されるリボザイムをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ）の有効量を該細胞に導入する工程及び該ＤＮＡを転写して該リボザイムを作製する工程を含む、前記方法を提供する。好適実施態様においては、該方法は、レトロウイルスベクターを導入した細胞を、得られた導入細胞と同じ種の哺乳動物に投与する工程を更に含む。他の好適実施態様においては、該レトロウイルスを導入した細胞は導入細胞を投与する哺乳動物から得られた。上記の方法、及び本明細書に記載される組成物は、ヒトを含む様々な温血動物又は哺乳動物のＨＣＶ感染又は疾患を治療又は予防するために用いられる。本発明のこれらの及び他の態様は、下記の詳細な説明及び添付の図面によって明らかになるであろう。更に、ある方法又は組成物（プラスミド等）を詳細に記載する種々の参考文献を本明細書に示し、各文献の記載が個別に引用されたように本願明細書に含まれるものとする。図面の簡単な説明図１は、ベクターpGem7Z(Promega，ウィスコンシン州マディソン)の模式図である。図２は、ベクターpLNT-Rzの模式図である。図３は、代表的なヘアピンリボザイム（配列番号70及び71）とテトラループヘアピンリボザイム(CR4)(配列番号73及び71)の模式図である。図４は、短い5'UTR基質を切断するCR２リボザイムの経時試験管内切断である。図５は、長い5'UTR基質を切断するCR２と種々の促進因子ＲＮＡ分子を用いる経時試験管内切断反応を示すグラフである。図６は、２つの試験管内切断実験であって、切断反応の前に90℃で１分間の予熱工程の有無を示す図である。試験したリボザイムはCR２、CR６、CR７及びCR８であり、短い5'UTR基質を用いた。図７は、ヘリックス１の８、７或いは６ヌクレオチドによるCR４リボザイム変異体を用いた試験管内切断反応を示し、短いキャプシド基質を用いた図である。図８は、ヘリックス１の８、７或いは６ヌクレオチドによるCR４リボザイム変異体を用いた試験管内切断反応を示し、長いキャプシド基質を用いた図である。図9A、図9B、図9C及び図9Dは、本明細書に記載されるベクター:pPur、pPur-HC V、pLNL6及びpLNL-Pur-HCVの模式図である。図10は、トランスフェクション後のリボザイム発現を証明するRNase保護分析である。図11、図11Ｂ及び図11Ｃは、同時トランスフェクション実験で得られたリボザイム切断を示す３種のグラフである。図12は、リボザイムの保護作用を試験するために用いられる実験用設計の模式図である。図13は、リボザイム切断及び続いてのＨＣＶ含有プラス鎖ＲＮＡウイルス侵入からの細胞の保護を示すグラフである。図14は、ＨＣＶヌクレオキャプシドタンパク質の検出を示すウェスタンブロットである。図15は、ベクターpGL3(Promega，ウィスコンシン州マディソン)の模式図である。図16は、β−ガラクトシダーゼ或いはリボザイムを発現するアデノウイルスベクターの模式図である。図17は、アデノウイルスベクターの細胞溶解物からの精製でつくられたFPLCデータを示すグラフである。図18は、ＡＶＶリボザイム発現ベクターの模式図である。図19は、（-）鎖ＨＣＶに対する２種のリボザイム（CNR3及びCNR6）による短い（<50ヌクレオチド）基質の試験管内切断の結果を示すオートラドである。図20は、（-）鎖ＨＣＶに対する２種のリボザイム（CNR3及びCNR6）による長い基質の試験管内切断の結果を示すオートラドである。図21は、ベクターpLNT-Rz、pAvC-Rz、pAvM-Rz、pAvCM-Rz及びpAAVM-Rzの模式図である。図22は、pAMFT.dBAMの模式図である。図23は、ベクターpPur-HCV、pLNL-PUR-HCV及びpGem4-HCV5'Cの模式図である。図24は、HT1080細胞にトランスフェクトした後のＨＣＶコアタンパク質の発現を示すウェスタンブロットである。図25Ａは、細胞培養内のウイルスコア発現を減少させるプロモーター／ベクターの種々の組合わせの能力を示すブロットである。pAAVM-CR4が最大の効能を示す。図25Ｂは、pAAVM-CR4の力価測定及びウイルスコア発現に対する影響を示すブロットである。図26は、ヒト肝細胞におけるリボザイムCR４の発現を測定するために行ったRN ase保護分析の結果を示す図である。図27は、βガラクトシダーゼ遺伝子を保有する組換えアデノウイルス或いは組換えアデノ随伴ウイルスによるヒト正常一次肝細胞の感染力を比較する表である。発明の詳細な説明定義本発明を示す前に、下で用いられれる用語の定義をまず示すことは本発明を理解することの助けになる。 “リボザイム”は、特定の核酸配列を切断することができる核酸分子を意味する。リボザイムは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、核酸類似体（例えば、ホスホロチオエート）、又はその組合わせ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ体）から構成される。特に好適な実施態様においては、リボザイムは特定の認識及びＲＮＡ切断酵素活性に対するアンチセンス配列を含むＲＮＡ分子を意味することが理解されるべきである。 “リボザイム遺伝子”は、ＲＮＡに転写した場合にリボザイムを生じるリボザイム配列からなる核酸分子（例えば、ＤＮＡ）を意味する。 “ベクター”は、問題のリボザイムを発現することができる構築物を意味する。該ベクターは、デオキシリボ核酸(“ＤＮＡ”)か又はリボ核酸(“ＲＮＡ”)から構成される。任意により、該ベクターはポリアデニル化配列、１種以上の制限部位、及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ又はピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼのような１種以上の選択マーカーが含まれる。更に、使用されるホスト細胞及び使用されるベクターによって、複製開始点、追加の核酸制限部位、エンハンサー、転写の誘導性を与える配列及び選択マーカーのような他の遺伝要素が本明細書に記載されるベクターに組込まれる。上述したように、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス核酸を切断することができるリボザイムを提供する。概要としては、ＨＣＶのウイルスゲノムは二本鎖ＲＮＡ中間体を介して複製する約9.5Kb線状ゲノムを有する（Chooら，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 88:2451-2455，1991；Chooら，Brit．Med．Bull．46(2):423-441，1 990；Okamotoら，Ｊ．Gen．Vir．72:2697-2704，1991;例えば遺伝子バンク受託番号第67463号，Intelligenetics(カリフォルニア州マウンテンビュー)を参照されたい）。その配列は3011アミノ酸のポリタンパク質前駆体を発現し、切断されてＣ（ヌクレオキャプシドタンパク質）E1、E2/NS1、及び非構造タンパク質NS２、NS３、NS４及びNS５を含むいくつかの異なるウイルスタンパク質を生じる(Hou ghtonら，Hepatology14:381-388，1991)。ＨＣＶ単離物の配列解析によりかなりの種類の配列が示される（総説としてHo ughtonら，Hepatology14:381-388，1991;van Doorn，Ｊ．Med．Virology43:345- 356，1994;Bukhら，Seminars in Liver Disease15:41-63，1995;Simmonds，Hepa tology21:570-583，1995を参照されたい;遺伝子バンク受託番号第D10749号、同第D10750号、同第D11168号、同第D11355号、同第D13558号、同第D30613号、同第 D90208号、同第D02836号、同第M58335号、同第M84754号、同第M96362号、同第S6 2220号、同第U01214号、同第U16362号、同第D61596号を参照されたい）。最も保存された領域（既知の単離物内の配列同一性>90%）は、5'非翻訳領域(5'UTR)及びヌクレオキャプシドのコード領域からなるゲノムの最初の1000ヌクレオチド内にある（Bukhら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA89:4942-4946，1992）。高度の配列変動性（配列ダイパージェンス50％まで）はE1及びNS２遺伝子内に見られる（上記総説を参照されたい）。その配列不均一性に基づいてＨＣＶ単離物は、少なくとも12の異なる遺伝子型に分類される(Okamotoら， Virology188:331-341，1992;Bukhら，Proc，Natl，Acad．Sci．USA90:8234-8238 ，1993)。ほとんどのＨＣＶ遺伝子型が世界中に分布されるが、ある菌株は地理的に分離している地方に見られ(Bukhら，Proc，Natl，Acad．Sci．USA90:8234-8 238，1993)、その分布はリボザイム仲介治療で役割を果たすことができる。リボザイム上述したように、本発明は、細胞においてＣ型肝炎ウイルス感染の複製、感染又は遺伝子発現を阻害する能力をもつリボザイムを提供する。ハンマーヘッドリボザイム(Rossi，J.J.ら，Pharmac．Ther．50:245-254，1991)(Foster & Symons ，Cell48:211-220，1987；Haseloff & Gerlach，Nature328:596-600，1988;Walb ot & Bruening，Nature334:196，1988;Haseloff & Gerlach，Nature334:585，19 88;Haseloffら，米国特許第5,254,678号)、ヘアピンリボザイム（Hampelら，Nuc l．Acids Res．18:299-304，1990,米国特許第5,254,678号）、肝炎δウイルスリボザイム(Perrotta & Been，Biochem．31:16，1992)、グループＩイントロンリボザイム（Cechら，米国特許第4,987,071号）及びRNase Pリボザイム(Takadaら，Cell35:849，1983);（“鎖置換による産物放出についてのリボザイム”と称する国際出願第95/29241号；“新規な酵素ＲＮＡ分子”と称する国際出願第95/292 41号を参照されたい）を含む各種のリボザイムが本発明で使用するために構築される。 Cechら（1991年１月22日発行の米国特許第4,987,071号）により、テトラヒメナリボソームＲＮＡ自己スプライシング反応の特性に基づくリボザイムの調製及び使用が開示された。そのリボザイムは８塩基対の標的部位と遊離グアノシン（又はグアノシン誘導体）を必要とする。エンドリボヌクレアーゼ活性のために50 ℃の最適温度が示されている。切断から生じる断片は、5'−リン酸基及び3'−ヒドロキシル基及び切断ＲＮＡの5'端に付加した遊離グアノシンヌクレオチドを有する。 Cechらのリボザイムと対照的に、本発明の特に好ましいリボザイムは、生理的温度において標的配列に対して効率よくハイブリッド形成し、単なる研究手段としてでなく生体内で使用するのに適する（Cechら，米国特許第4,987,071号の15 欄，18〜42行を参照されたい）。従って、本発明で使用するのに特に好ましいリボザイムとしてはヘアスピンリボザイム（例えば、Hampelら，1990年３月26日公開の欧州特許公開第0 360 257号に記載されたもの）及びハンマーヘッドリボザイムが含まれる。概要としては、ヘアピンリボザイムに要求される配列は NNNBN^*GUC(N)_x(配列番号１〜５)(ｘは６〜10の数であり、Ｎ^*Ｇは切断部位であり、ＢはＧ、Ｃ又はＵのいずれかであり、ＮはＧ、Ｕ、Ｃ又はＡのいずれかである）からなるＲＮＡ配列である。ヘアピンリボザイムの認識配列又は標的配列の代表例を下記実施例に示す。更に、ヘアピンリボザイムのバックボーン又は共通領域は未変性ヘアピンリボザイムのヌクレオチド配列を用いて設計され(Hampel ら，Nucl．Acids Res．18:299-304，1990)、安定性や触媒活性を高める“テトラループ”構造を含むように修飾もされる（実施例２及び図3;Yuら，Virology206: 381-386，1995;Cheongら，Nature346:680-682，1990;Andersonら，Nucl．Acids Res．22:1096-1100，1994を参照されたい）。ハンマーヘッドリボザイムの切断部位に要求される配列は、標的にされるNUX （ＮはＧ、Ｕ、Ｃ又はＡのいずれかであり、ＸはＣＮＵ又はＡを表す）からなるＲＮＡ配列である。従って、ヘアピンリーダー配列、GUC内の同標的はハンマーヘッドリボザイムにも有効である。ハンマーヘッドリボザイム又はヘアピンリボザイムの他のヌクレオチドは、標的隣接ヌクレオチド及びハンマーヘッド共通配列によって求められる(Ruffnerら，Biochemistry29:10695-10702，1990)。その情報は、本明細書に示された配列及び開示と共に本発明のヘアピンリボザイムの作製を可能にする。リボザイム内の適切な塩基変化は、標的ＨＣＶ配列との必要な塩基の対合を維持するために行われる。下で詳述される、本発明のリボザイム、及びそのリボザイム及び他の適切な核酸分子をコードするＤＮＡは、核酸分子の合成の技術において周知の方法を用いて化学的に合成される（例えば、Heidenreichら，J．FASEB70(1):90-6，1993;Sp roat，Curr．Opin．Biotechnol．4(1):20-28，1993）。また、Promega,米国ウィスコンシン州マディソンのような販売会社からリボザイムのような核酸分子の作製に適した一連のプロトコールが供給される。本発明の態様においては、リボザイムはＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えば、T7ＲＮＡポリメラーゼ又はSP6 RNAポリメラーゼに作用可能に結合したＤＮＡ分子又は他の核酸分子（転写時にＲＮＡ分子を生じる）から調製される。従って、本発明のリボザイムをコードする核酸分子、例えばＤＮＡ又はｃＤＮＡが本発明によって提供される。ベクターがＤＮＡ分子に作用可能に結合したＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む場合、リボザイムは試験管内でＲＮＡポリメラーゼと適切なヌクレオチドをインキュベートした際に作製される。別の実施態様においては、ＤＮＡはCotten & Birnstiel，EMBO J．8(12):3861-3866，1989及びHempelら，Biochemistry28:4929-4933，1989に記載されるような発現カセットに挿入される。分子生物学方法の詳細な説明はSambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，1989に開示されている。合成中にリボザイムは、リボザイムを安定化しかつRNAaseに耐性にする能力をもつＤＮＡ分子に結合することにより修飾される(Rossiら，Pharmac．Ther．50: 245-254，1991)。また、リボザイムはリポソームデリバリーシステムに使用するためにホスホチオ類似体に修飾される。その修飾は、リボザイムをエンドヌクレアーゼ活性に対して耐性にする。ベクターＨＣＶ感染を治療するためのリボザイムの使用は、機能リボザイムを問題の感染細胞に導入することを必要とする。これは、送達前に試験管内で機能リボザイムを合成するか又は生体内でリボザイム合成を進行させることができるＤＮＡを送達することにより達成される。更に詳細には、本発明の他の態様においては、リボザイム遺伝子はホスト細胞（例えば、生物体の培養内又は細胞内の原核細胞又は真核細胞）に導入するのに適したベクター内で構築される。適切な原核細胞と真核細胞は、本発明のリボザイムをコードしている核酸分子を含む適切な導入ベクターでトランスフェクトされる。生体内でベクターによりリボザイムを作製するために、リボザイムをコードするヌクレオチド配列は好ましくはpol IIIプロモーター(例えば、アデノウイルス由来のtRNA又はVA-1)、CMVプロモーター、SV40後期プロモーター、又はSV40 初期プロモーターのような真核プロモーターの制御下に置かれる。ある実施態様においては、プロモーターはアルブミンプロモーターやαフェトプロテインプロモーターのような肝臓特異プロモーター(Feuermanら，Mol．Cell．Biol．9:4204 -12，1989;Camper & Tilghman，Genes Develop．3:537-46，1989);アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター(Felder，Proc．Natl．Acad．Sci．USA86:5903-07 ，1989);アポリポタンパク質Ｂ遺伝子プロモーター(Dasら，Ｊ．Biol．Chem．26 3:11452-8，1988);凝固プロテアーゼ因子ＶII遺伝子プロモーター(Erdmannら，J ．Biol．Chem．270:22988-96，1995);フィブリノーゲンγ遺伝子プロモーター(Z hangら，Ｊ．Biol．Chem．270:24287-91，1995);グルコキナーゼ遺伝子プロモーター(Williamsら，Biochem．Biophys.，Res．Comm．212:272-9，1995);肝臓ホスホフルクトキナーゼ遺伝子プロモーター(Levanonら，Biochem．Mol．Biol．Int ．35:729-36，1995);ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(“PEPCK”) プロモーター(Hatzogiouら，J．Biol．Chem．263:17798-808，1988;Benvenisty ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA86:1118-22，1989;Vaulontら，Mol．Cell．Bio l．9:4409-15，1989);又はリンパ系特異プロモーターのような組織特異プロモーターであってもよい。従って、リボザイムは生体内で導入遺伝子から直接作製される。プラスミド、ウイルス、レトロトランスポゾン及びコスミドを含む種々のベクターが本発明に関して用いられる。ＨＣＶが肝臓の急性又は慢性感染であることから、肝栄養性を有するベクターが特に好ましい。代表例としては、アデノウイルスベクター（例えば、国際出願第94/26914号、同第93/9191号;Yeiら，Gene Th erapy 1:192-200，1994；Kollsら，PNAS91(1):215-219，1994;Kass-Eislerら，P NAS 90(24):11498-502，1993;Guzmanら，Circulation88(6):2838-48，1993;Guzm anら，Cir．Res．73(6):1202-1207，1993;Zabnerら，Cell75(2):207-216，1993; Liら，Hum Gene Ther．4(4):403-409，1993；Caillaudら，Eur．J．Neurosci．5 (10):1287-1291，1993)，アデノ随伴ウイルス１型(“AAV-1”)又はアデノ随伴ウイルス２型(“AAV-2”)ベクター(国際出願第95/13365号；Flotteら，PNAS 90(22 ):10613-10617，1993)、肝炎δウイルスベクター、生存弱毒δウイルスベクター及びヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第 5,288,641号）、及び米国特許第5,166,320号に開示されるベクターが挙げられる。他の代表的なベクターとしては、レトロウイルスベクター（例えば、欧州特許第0 415 731号;国際出願第90/07936号;同第91/02805号;同第94/03622号;同第93/ 25698号;同第93/25234号;米国特許第5,219,740号;国際出願第93/11230号;同第93 /10218号）が挙げられる。肝親和性のないベクター（例えば、AAV又はレトロウイルス）については、細胞向性がこれらのウイルスを特異的に肝臓の標的にするように変えられる。遺伝子治療においてかかるベクターを用いる方法は、当該技術において周知である。例えば、Larrick，J.W．& Burck，K.L.，Gene Therapy: Application of Molecular Biology，Elsevier Science Publishing Co.，Inc. ，ニューヨーク，1991;Kreigler，M.，Gene Transfer and Expression:A Labora tory Manual，W.H．Freeman & Co.,ニューヨーク，1990を参照されたい。本発明のリボザイムをコードしている１を超える核酸分子を有し、各分子が別個の真核プロモーター（又は内部リボソームエントリー部位又は“IRES”）の制御下或いは単一の真核プロモーター制御下にあるベクターが本発明によって提供される。本発明のベクターによって送達される他の核酸分子の代表例としては、インターフェロン（例えば、α、β又はγ）、及び他の種々のサイトカイン又は成長因子のような治療分子、及びリボザイムを阻害する二次折りたたみを巻き戻すか又は制限することにより標的配列を切断する際にリボザイムを援助又は促進する促進因子が挙げられる（実施例４を参照されたい）。これらのベクターは、ＨＣＶ感染に対する多機能治療を、好ましくは相乗作用で一緒に使用する種々の治療法と共に施すという利点を与える。上記のベクターを安定に保有するホスト原核細胞及びホスト真核細胞が本発明によって提供される。適切なホスト細胞としては、細菌細胞、ラット細胞、マウス細胞、及びヒト細胞、例えば、肝細胞及び血液細胞が含まれる。送達本発明のある態様においては、リボザイム分子、又はリボザイムをコードする核酸分子は、伝達体を用いて又は種々の物理的方法によってホスト細胞に導入される。かかる方法の代表例としては、リン酸カルシウム沈降を用いるトランスホーメーション(Dubenskyら，PNAS 81:7529-7533，1984)、かかる核酸分子の無傷標的細胞への直接マイクロインジェクション（Acsadiら，Nature 352:815-818， 1991）、及び導電性溶液に懸濁した細胞を強い電場に供して膜を一時的に分極し、核酸分子のエントリーを可能にするエレクトロポレーションが挙げられる。他の方法としては、不活性アデノウイルスに結合した核酸分子の使用（Cottonら， PNAS89:6094，1990）、リポフェクション(Felgnerら，Proc．Natl．Acad．Sci.U SA84:7413-7417，1989)、微小放射衝撃（Williamsら，PNAS88:2726-2730，1991 ）、ポリリシンのようなポリカチオン化合物、レセプター特異リガンド、核酸分子にからみついているリポソーム、核酸分子を含む大腸菌から細胞外壁が取り除かれ、ポリエチレングリコールを用いて動物細胞に融合するスフェロプラスト融合、ウイルス導入(Clineら，Pharmac．Ther．29:69，1985;Fiedmannら，Science 244:1275，1989)、及びＤＮＡリガンド(Wuら，J．of Biol．Chem．264:16985-16 987，1989)が挙げられる。実施態様においては、リボザイムはリポソームを用いてホスト細胞に導入される。本発明の実施態様においては、更に、他の治療分子（例えば、インターフェロン）又は促進因子が本明細書に記載された方法を用いて送達される。かかる送達は、リボザイム又はリボザイムを発現するベクターの送達と同時か以前か以後であってもよい。医薬組成物上述したのように、医薬組成物が本発明によって提供される。その組成物は、上記リボザイム、ＤＮＡ分子、ベクター又はホスト細胞のいずれかを薬学的に又は生理的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤と共に含む。一般に、かかる担体は、用いられる用量や濃度で受容個体に対して非毒性でなければならない。通常、かかる組成物の調製は治療剤と緩衝剤、アスコルビン酸のような酸化防止剤、低分子量（約10残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロース又はデキストリンを含む糖質、EDTAのようなキレート剤及び他の安定剤及び賦形剤とを混合することを必要とする。緩衝化した中性食塩水又は非特異的血清アルブミンと混合した食塩水は適切な希釈剤の具体例である。本発明の医薬組成物は、１種以上の他の治療分子（例えば、インターフェロン）又は促進因子を含有又は発現（例えば、ベクターの場合）するように調製される。更に、本発明の医薬組成物は、関節内、皮内、肝臓内、筋肉内、腹腔内、莢膜内、静脈内（例えば、門脈に）又は皮下を含む異なる種々の経路で投与するために調製される。更に、本発明の医薬組成物は、その医薬組成物の使用に関する説明書を備えている包装材料と共に容器内に配置される。通常、かかる説明書は試薬濃度、及びある実施態様においては、医薬組成物を再構成するのに必要な賦形剤成分又は希釈剤(例えば、水、食塩水又はPBS)の相対量を記載する実体的な表現が含まれる。医薬組成物は、診断用又は治療用双方に有効である。治療法ＨＣＶに感染した細胞においてＨＣＶウイルス複製、感染又は遺伝子発現を妨害又は予防する方法が本発明によって提供される。かかる方法は、該細胞と本発明のリボザイムの有効量とを接触させるか又は該細胞に該リボザイムをコードしている核酸分子を有するベクターの有効量を導入することを必要とする。有効量は、周知の方法を用いて当業者に容易に求められる。該リボザイムを外因的に送達する場合、ＲＮＡ分子は安定なＲＮＡ分子内に埋め込まれるか又はリポソームのような他の保護環境の形で埋め込まれる。また、ＲＮＡはRNase耐性ＤＮＡ相対物内に埋め込まれる。外因性リボザイムの細胞吸収は、コレステリル部分のようなＤＮＡ末端に化学基を付加することにより高められる(Letsingerら，P.N.A. S.，U.S.A.，1989)。本発明の他の態様においては、標的細胞はベクターの標的細胞への挿入及びＨＣＶ特異リボザイムをコードしている核酸の安定な発現を容易にする条件下で導入される。標的細胞としては、肝細胞及びリンパ球が含まれるがこれらに限定されない。細胞がＨＣＶ感染前に導入される場合には標的細胞又はその後代の感染が予防される。従って、その態様としては、標的ＲＮＡ配列と本発明のリボザイムとを反応させることにより細胞においてＨＣＶのウイルス感染及び／又は複製を妨害又は予防する方法が含まれる。本発明の態様の実施態様においては、肝細胞のような適切なホスト細胞を被検者、例えば、ヒト患者から当該技術において周知の方法を用いて切除される。次いで、細胞をトリプシン処理し、生体外治療のために再懸濁する。生物体の１個又は複数個の細胞においては、１種以上のリボザイムをコードしている上記の導入ベクターが１個又は複数個の細胞にLlewellynら，J．Mol．Biol．195:115-123 ，1987；Hanahan，166:557-580，1983に記載された方法を用いてトランスフェクトされる。細胞内で導入ベクターが複製し、リボザイムをコードするＤＮＡが細胞ポリメラーゼで転写されてリボザイムを生じ、ＨＣＶを不活性化する。ベクターを細胞内に挿入するためにマイクロインジェクションのような顕微操作が用いられ、導入ベクター又はその一部が細胞のゲノムに組込まれる。組込まれた物質を転写するとリボザイムが生じ、ＨＣＶを不活性化する。上記の方法は、本発明を限定するものでなく単に本発明のリボザイム治療を行う様々な手段を例示するものである。他の方法はAnderson，Science 256:808-813に詳述されている。生体外治療については、導入した細胞が肝臓に組込まれるような条件で肝動脈注入によって導入した細胞が患者に再導入される。本明細書に用いられる細胞においてＨＣＶウイルス複製を“妨害又は予防する ”という用語は、リボザイムを一時的に又は安定に導入していない細胞又はリボザイムをコードしているベクターに比べて細胞内の後代ウイルスに必要なＨＣＶ複製又はＨＣＶ成分の産生を減少させることを意味する。ＨＣＶウイルス複製が減少したかを求める簡単で便利な分析としては、被検者の血液中の抗ＨＣＶ抗体の有無又は存在の減少に対してELISA分析(Nasoffら，PNAS 88:5462-5466，1991) 、RT-PCR(Yuら，Viral Hepatitis and Liver Disease 574-477，Nishioka，Suzu ki & Mishiro(Eds.);Springer-Verlag東京，1994)又は肝機能検査が含まれる。かかる方法は当業者に周知である。また、導入及び感染した“対照”細胞由来の全ＲＮＡが単離され、ドットブロット又はノーザンブロットによって分析され、ＨＣＶ特異ＤＮＡでプローブしてＨＣＶ複製が減少したかを求める。また、ＨＣＶタンパク質発現の減少はＨＣＶ複製の指標として用いられる。典型的には、対照細胞に比べてＨＣＶ複製の50％より大きい減少がＨＣＶ複製の減少を表す。診断法ヒトにおけるＣ型肝炎感染の検出と診断は、現在までいくぶん問題があった。最も一般的に用いられる方法は、ＨＣＶ構造タンパク質に対してホストによってつくられた抗体の検出を必要とする。残念ながら、多くの患者は可変的な期間血清陰性のままであり、しばしば最終の免疫応答の検出が難しいことがある。更に、ＨＣＶゲノムのかなりの配列変化と構造タンパク質の突然変異のためにホスト生産抗体がかなり異なり、正確な検出に対して多くの抗原パネルが必要である。そのために、感染性ＨＣＶの信頼できる検出方法は患者の血清を試験するだけでなく薬剤使用のために精製された多くのヒト由来血液産物をスクリーニングするのに有用である。ＨＣＶヘアピンリボザイムは、ＨＣＶ感染の検出と診断に適用される。これを達成するために、大腸菌lacZ遺伝子の上流のＨＣＶ5'キャプシド配列を含む特殊なリポータープラスミドが作成される（ヌクレオチド1302-4358,遺伝子バンク受託番号第J01636号）。このプラスミドは、２段クローニング法によってつくられる。まず、ＨＣＶ陽性患者の血清試料から抽出されたＲＮＡから直接5'UTRとキャプシドコード領域を含むＨＣＶ配列を合成する。次に、精製したウイルスＲＮＡを逆転写し、次のプライマーでＰＣＲ増幅する:センス(5'UTRの5'端で開始する)5'-GCCAGCCCCCTGATGGGG-3'(配列番号6)及びアンチセンス（キャプシドコード領域の3'端で開始する）5'-CACCTGATAA GCGGAAGC-3'(配列番号7)。次いで、得られたブラントエンドＤＮＡをpCMVβのユニークなSma I部位(Clontech,カリフォルニア州パロアルト)に結合する。この最初に作成したプラスミドをpCMV-HCV-β と称する。次に、哺乳動物細胞にトランスフェクトした後のプラスミドの選択を可能にするために、ネオマイシン耐性遺伝子の発現を進行させるSV40初期プロモーターからなるネオマイシン耐性発現カセットを構築する。これは、pMAMneo-LU C(Clontech，カリフォルニア州パロアルト)から得られたネオマイシンカセットを含むBamHI断片をpCMV-HCV-βのユニークなSalI部位にブラント結合することにより達成される。得られたプラスミド、pCMV-HCV-β-SV-neoは２種類の独立したＲＮＡを発現する。一方はlacZコード配列の上流のＨＣＶ標的部位を含み、もう一方は正の選択に対してネオマイシン耐性を発現する。リポーター細胞系を作成するために、ヒト肝細胞癌腫細胞系Huh7(Yooら，J．V irol．69:32-38，1995)をpCMV-HCV-β-SV-neoとＨＣＶヘアピンリボザイム発現プラスミド,pLNT-Rzで同時トランスフェクトする。次いで、Rzとリポータープラスミドの双方を含むトランスフェクトしたG418選択Huh7細胞をＨＣＶ感染診断に用いる。正常な条件下で発現したHCV Rzは、lacZ mRNAに位置するHCV 5'UTRキャプシド標的を切断し、βガラクトシダーゼ発現の阻害をもたらす。細胞に生物試料（例えば、ＨＣＶを含む患者の血清試料又は他の血液製品、又は肝臓から採取した組織又は細胞試料）を攻撃する場合、複製ＨＣＶに由来するHCV 5'UTRキャプシド配列が存在するとリボザイムと競合し、HCV-lacZ ＲＮＡを切断する能力を妨害する。このRz活性の妨害の結果としてβガラクトシダーゼの発現が増強し、その細胞が通常のlacZ染色により青に染まる。従って、Ｃ型肝炎ウイルスに陽性の患者の血清（又は他の生物試料）はそのリポーター細胞を青に変える。下記の実施例は、具体的に説明するものであり、限定するものではない。実施例実施例１ヘアピンリボザイム部位選択の基準本発明に使用するのに適したヘアピンリボザイムは、好ましくは次のＲＮＡ配列:NNNBNGUC(N)_x （配列番号１〜５）を認識し、該リボザイムは下線をひいた配列に相補的であるように構築され、ＢはＣ、Ｇ又はＵであり、Ｘは６ヌクレオチドより大きいか又は等しい（例えば、６〜10ヌクレオチド）。配列ＧＵＣは下記のヘアピンリボザイム全てに保存されなければならない。他のヌクレオチド(下線をひいた“Ｎ”)は、好ましくは異なるＨＣＶ株の中で高度の配列保存をもち、同じ標的部位に対して複数のリボザイムの要求を制限する。概要としては、ＨＣＶ-1の完全なゲノムの配列解析により、プラス鎖では112 の適切なＧＵＣヘアピンリボザイム部位及びマイナス鎖では125の適切な部位が示される。しかしながら、異なるＨＣＶ遺伝子型間にかなりの配列変動性があるためにプラス鎖では34部位及びマイナス鎖では36部位のみが既知の全株間で95％保存されるＧＵＣ部位を表す。ＧＵＣに隣接するヌクレオチド（上記“Ｎ”として表される）は、好ましくは、同じ標的部位に対して複数のリボザイムを設計する要求を制限するために高度の配列保存を含まなければならない。それを目的として、既知株の＞85％に１を超える塩基ミスマッチがない28部位がプラス鎖で及び30部位がマイナス鎖で同定された。その部位を下記の表Ｉに示す。表１（＋）鎖及び（−）鎖ＲＮＡに対向するＣ型肝炎リボザイム ^a認識配列は5'→3'に記述されている。切断は＾で起こる。 ^b位置は(+)鎖では5'端から数えた切断部位、或いは(-)鎖では3'鎖から数えた切断部位(“GUC”の“G”)のヌクレオチドの位置を示す。数字はＨＣＶ-1株を用いている。実施例２ヘアピンリボザイムの構築必須のＧＵＣ認識シグナルを含むＨＣＶゲノムの高度配列保存領域を同定することによりリボザイム遺伝子(Rz)を設計する。次に、ＧＵＣ認識シグナルに隣接したヌクレオチド配列に基づいてその部位を認識するRzを設計する。更に詳細には、２本の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを化学的に合成する。組合わせて二本鎖ＤＮＡに変換した場合、標的部位に相補的なヌクレオチドを含む全てのヘアピンリボザイムが含まれる。更に、続いてのクローニングを促進するために両末端に制限酵素認識部位が置かれる。例えば、未変性か又はテトラループヘアピンリボザイム構造(図3)中の標的配列:GAGCGGUCGCAACCUC(配列番号11;表I)を認識するリボザイムCR４を構築するために、次のオリゴヌクレオチドが調製される。センスオリゴヌクレオチド(配列番号68): BamHI 5'-GCGGATCCGGAGGTTGC AGAAGCTCACCAGAGAAACACACG-3' 普遍的アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号69): Mlul 5'-GGGACGCGTACCAGGTAATATACCACAACGTGTGTTTCTCTGGT-3' 普遍的テトラループアンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号72): MlluI 5'-GGGACGCGTACCAGGTAATATACCACGGACCGAAGTCCGTGTGTTTCTCTGGT-3' 制限酵素部位(BamH I及びMlu I)はイタリック体で示されている。ＨＣＶのCR ４標的部位に相補的な配列は下線がひかれている。センスオリゴヌクレオチドと普遍的アンチセンス或いは普遍的テトラループアンチセンスオリゴヌクレオチド間のアニーリングを可能にする相補的配列の16塩基は太字である。適切なオリゴヌクレオチドを共にアニールし、クレノウＤＮＡポリメラーゼか又はTaq ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡに変換する。得られたＤＮＡを制限酵素BamHI及びMluIで切断し、精製し、試験管内転写用(pGEM7Z,Promega, ウィスコンシン州マディソン;図1)又は哺乳動物発現用(pLNT;図2)ベクターにクローン化される。対照として使用するための欠陥リボザイム（“無能力”と呼ばれる）は、ループ２の配列ＡＡＡが図３に示されるようにＵＧＣに変わる以外は上記のように構築される。実施例３ＨＣＶリボザイム哺乳動物発現ベクターの構築 tRNA^valRNA pol 111プロモーターによって促進される抗U5 HIVリボザイムを含むプラスミドpMJT(Yuら，Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 90:6340-6344,1993;AT CC受託番号第75470号)をBamHI及びMluIで消化し、リボザイム断片からベクターを精製する。pGem7Zベクター(図1)から上記のＣ型肝炎リボザイム遺伝子をBamHI 及びMluIで切除し、精製し、中空pMJTベクターに結合する。得られたベクターは pLNT-Rz(図２参照)と称し、ネオマイシン耐性遺伝子を進行させるモロニーLTRとリボザイムの発現を進行させるtRNA^valRNA pol IIIプロモーターを含む。実施例４試験管内切断分析リボザイム遺伝子を試験管内転写ベクター(pGEM-7Z，Promega,ウィスコンシン州マディソン)にクローン化し、T7 RNAによって試験管内で転写する。転写後、反応物をDNaseで処理し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を変性することによりリボザイムを精製する。ＨＣＶ基質は次の通りである:短い5'UTR基質ＨＣＶ-1ヌクレオチド１〜185、短いキャプシド基質ＨＣＶ-1ヌクレオチド331〜698及び長い基質ＨＣＶ-1ヌクレオチド１〜698。基質を[α-³²P]UTPの存在下に試験管内で転写し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を変性することにより精製する。試験管内切断反応は、40nM リボザイムを200nM基質と37℃で０〜60分間12mM MgCl₂/2Mmスペルミジン/40mMトリス-HCl,pH7.5中でインキュベートすることにより行われる。ローディングバッファー(7M尿素／ブロモフェノールブルー／キシレンシアノール)を加えることにより反応を終結させる。切断反応産物を15％アクリルアミド／7M尿素ゲルによる電気泳動で分割し、オートラジオグラフィーで分析する。図４のデータから、CR2 Rzが時間依存方式で短い5'UTR185ヌクレオチド標的ＲＮＡを切断することが示される。おもしろいことに、同Rzは全ての5'UTR(長いＨＣＶ-1基質)を含んだ大きなHCV RNA基質を切断しない。これは短い基質には存在しない高度に折りたたまれた二次構造によると思われる。実際に、大きなＨＣＶ基質ＲＮＡは、ＲＮＡ基質が切断反応前に熱変性される場合にのみ試験管内でRz によって切断される（データは示されていない）。しばしば、標的ＲＮＡの二次構造はヘアピンリボザイムの結合活性及び切断活性を十分阻害するのに広範囲にわたる。一例は、ＲＮＡ折りたたみがCR２の活性を阻害するＨＣＶの5'UTRである。従って、“促進因子”ＲＮＡ分子は、高度に折りたたまれた構造を標的にしたリボザイムの活性を高めるように設計される。概要としては、促進因子分子はリボザイム標的部位に隣接する標的ＲＮＡの領域に相補的であるように遺伝子操作されるＲＮＡである。標的ＲＮＡに結合した場合、これらの分子は二次構造を弛緩するように援助し、リボザイムの結合を増強し、よって、活性を高める。 5'UTR内の折りたたまれた構造を破壊するように３種の促進因子を設計し、CR ２の活性を高める能力を試験した。特に、次の促進因子が用いられ:ＨＣＶ269、ＨＣＶ269B及びＨＣＶ236、各々ＨＣＶ-1の5'UTRの塩基245〜268、242〜268及び 217〜235に相補的である。促進因子ＲＮＡは試験管内で合成され、40nMの濃度で CR２及び長いＨＣＶ−１基質を含む試験管内切断反応物に添加され、切断反応物を３時間かけてモニターする（図５）。促進因子の存在しないときは１％未満の長いＨＣＶ-1基質が３時間かかって切断され（図５、黒い四角）、前の結果と一致した。促進分子のＨＣＶ269か又はＨＣＶ269Bを添加すると対照より３〜3.5倍基質切断が増大する（図５、黒い三角と黒いダイヤ形）。いずれかの単一促進因子で見られる刺激は、リボザイムと基質を90℃で１分間加熱した後に37℃でインキュベートした場合に促進因子の存在しない反応に見られるものと似ている（図５、黒い丸）。促進因子ＨＣＶ269BとＨＣＶ236を組合わせて添加する場合、反応は対照反応より９倍促進され（図５、白い四角）、相乗作用の添加物が示された。これらの結果から、基質（CR２のような）の二次構造によって阻害されたリボザイムは適切に設計された促進因子分子と用いる場合に全長基質に対して活性になることが示される。 HCV 5'UTRに対向する他の３種のRz(CR6、CR７及びCR８)を185ヌクレオチドの短い5'UTR基質について試験する。図６のデータに示されるように、これらのRz は熱変性される場合に短い5'UTRのみ切断するが、前のように短い5'UTR基質のCR 2 Rzによる切断は熱変性と無関係である。Rz切断に対するＲＮＡの利用可能性における二次構造の役割と一致して、CR６、CR７及びCR８の標的配列は短い5'UTR 基質でさえ広範囲にわたる二次構造を可能にする位置にある。次に、5'UTRほど二次構造を含まないＨＣＶキャプシドタンパク質の高度に保存された領域の潜在的Rz切断部位を試験する。前に試験したCR2 Rzと同様に、キャプシド標的CR４〜８Rzは熱変性を存在させずに試験管内で短いＨＣＶキャプシド基質ＲＮＡを切断する(図7)。Rzの触媒効率が解離定数によって制限されて標的配列のサイズが認識されるので、CR４〜８と同じ部位を切断するリボザイムが作成及び試験されるが、CR４〜８Rzと比べて１ヌクレオチド(CR4〜７)又は２ヌクレオチド(CR4〜６)を欠く標的配列を認識する。これは、ヘリックス1(図3)の長さを変えることにより達成される。図７のデータから、CR4〜７とCR4〜６はCR ４〜８より活性でないことが示され、実際にCR４〜８による切断の効率がよい。図８のデータに示されるように、CR-4は熱変性を存在させずに広範囲の二次構造を含む長いＨＣＶ基質ＲＮＡを切断することができる。図８のオートラジオグラムは、低分子量の切断産物を示すために露光過度にするが、強い露光により予想される高分子量の断片が現れる（追加の露光は示されていない）。短い基質のように、CR4〜８による切断はCR4〜７か又はCR4〜６と同じか又はわずかに有効である。実施例５ベクターの構築、及び組織培養内遺伝子発現の試験下記に詳述されるように、リポーター系を開発してHCV Rz標的配列を含む遺伝子の発現に対するRz発現の影響を評価する。 A．ベクターの構築数種の発現ベクターの構築を本明細書に記載する(図9)。ＨＣＶリポータープラスミドpPur-ＨＣＶ（図9B）を次のように構築する。ＨＣＶ陽性患者の血清試料から抽出されるＲＮＡから直接5'UTRとキャプシドコード領域を含むＨＣＶ配列を合成する。次に、精製したウイルスＲＮＡを逆転写し、次のプライマーを用いてＰＣＲ増幅する:センス(5'UTRの5'端で開始する)5'-GCCAGCCCCC TGATGGGG-3 '(配列番号６)及びアンチセンス（キャプシドコード領域の3'端で開始する）5'- CACCTGATAAGCGGAAGC-3'(配列番号7)。次に、得られたブラントエンドＤＮＡを、 XbaIで消化しクレノウＤＮＡポリメラーゼでブラントエンドしたプラスミドpPur (Clontech,カリフォルニア州パロアルト;図9A)に結合する。SV40初期プロモーター、ピューロマイシン耐性コード領域及びＨＣＶ 5'UTRとキャプシド配列を含む pPur-HCV由来の2065 bp PvuII/XbaI断片を精製することにより、ＨＣＶリポーターレトロウイルスベクターpLNL-Pur-HCV(図9D)を構築する。その断片をクレノウでブラントエンドし、HindIIIで消化しクレノウでブラントエンドしたプラスミドpLNL6(Benderら，J．Virol．61:1639-1646，1987;図9C)にクローン化する。次に、共に得られたＨＣＶリポータープラスミドがSV40初期プロモーターによってピューロマイシン耐性のコード領域と同じＲＮＡ転写物上にHCV 5'UTRとキャプシド配列を含むＲＮＡ転写物を作製する。各ＨＣＶリボザイムはtRNA^valpolIII プロモーターによって別個のレトロウイルスベクター（pLNT-Rz）上で発現する。活性ＨＣＶリボザイムは、Pur-HCV RNAを切断し、ピューロマイシンに感受性の細胞を生じる。 B. リボザイムの同時トランスフェクションと分析 Rz発現プラスミド(pLNT-Rz)とＨＣＶ標的配列を含みかつピューロマイシン耐性をコードするmRNAを発現するプラスミド(pPur-HCV)との同時トランスフェクションによって求める。概要としては、HeLa又はHT1080細胞をpPur-HCVと種々のpLNT-Rz構築物でリン酸カルシウム標準法を用いて同時トランスフェクトする。ＨＣＶ：Rz同時トランスフェクションのＤＮＡモルは、1:10であり、全ＤＮＡを20μgに維持するために中空pLNTベクターを用いる。リボザイムは、２種の抗ＨＣＶリボザイム:CR2(5 'UTRに対向する)及びCR4(キャプシドに対向する)を含め、無能力の抗体ＨＢＶリボザイム、dBR1は負の対照として含めた。細胞を１μg/mlピューロマイシンで選択し、トランスフェクションの24時間後に開始し、２週間まで続ける。ピューロマイシン耐性コロニーをクリスタルバイオレット染色で可視化し、計数する。トランスフェクトした細胞内のリボザイム発現はRNase保護により証明される。RNase保護プローブとして放射能標識アンチセンスCR4ＲＮＡを用いて予想された断片はCR４の64nt、CR２の42nt及びdCR4の32ntである（図10;RNase保護分析キットはPromega,ウィスコンシン州マディソンから市販されている）。 Rz CR2か又はRz CR4の発現により、dBR1負の対照に比べてピューロマイシン耐性コロニーの70〜90％低下が生じる（図11）。結果は、２種のヒト細胞系:Hela( 図11A)とHT1080(図11B)では同様である。リボザイムがＨＣＶ配列によってその効果を示すことを証明するために、同様の同時トランスフェクションがＨＣＶ標的配列を欠くpPurプラスミドで行われる。これらの条件下、CR２又はCR４の同時発現は、ピューロマイシン耐性コロニーの数に対する影響がなく（データは示されていない）、リボザイムはＨＣＶ配列の標的になっていることが示される。 CR４の活性が用量依存性であるかを求めるために、種々の量のpLNT-CR4を用いて同時トランスフェクションを行う。HCV：Rz同時トランスフェクションのＤＮＡモル比は１：１〜１：10であり、全ＤＮＡを20μgで維持するために中空pLNT ベクターを用いる。負の対照として、無能力CR４(dCR4)を各モル比で同時トランスフェクトする。また、細胞を１μg/mlピューロマイシンで選択し、トランスフェクションの24時間後に開始し、２週間まで続ける。ピューロマイシン耐性コロニーをクリスタルバイオレット染色によって可視化し、計数する。 dCR4ではなくCR４の発現により、HT1080細胞におけるピューロマイシン耐性コロニー数の用量依存性の減少がもたらされた(図11C)。同時に、図11に示される結果からHCV Rzの同時発現はピューロマイシン耐性マーカーの発現を妨害しかつＨＣＶ標的部位の切断によってその効果が見えてくることが示される。 C. 保護分析ＨＣＶの特性のいくつかを共有する関連ウイルスによる感染から細胞を防御することができるかを求めるためにHCV Rzの安定な発現を試験する。ＨＣＶと同様に、レトロウイルスはプラスの一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。従って、レトロウイルスベクター、pLNL-Pur-HCV(図9D)はHCV Rz標的配列をピューロマイシン耐性遺伝子と並んで含むように構築される。tRNA^valプロモーターによってリボザイムの各々を安定に発現するポリクローナル細胞系は、ヒト肝細胞がん細胞系、 HepG2においてレトロウイルスベクター、pLNT-Rz(図2)で導入し、続いてG418で選択することにより樹立される。次に、(+)鎖ＲＮＡゲノム内にHCV 5'UTRとキャプシド配列を含むpLNL-Pur-HCV(図9D)を用いてPA317細胞においてヘルパーを含まない両種性レトロウイルスベクターを作製する。次に、ＨＣＶ配列含有レトロウイルスベクターを導入することによりHepG2-Rz細胞系を“攻撃”する。導入レベルを求めるために、細胞を１μg/mlピューロマイシンで選択して導入の24時間後に開始し、２週間まで続ける。ピューロマイシン耐性コロニーを染色し、計数する（実験の模式図については図12を参照されたい）。 CR2 Rz又はCR4 Rz双方の安定な発現により、無能力Rz対照dCR4に比べてHCV Rz 標的配列を含むレトロウイルスベクターの侵入から細胞が防御された（図13）。同様の結果がHeLa細胞にも示される（データは示されていない）。同時に、これらの結果から、ＨＣＶリボザイムがヒト肝細胞内で機能することができるという以前の結果が確認される。更に、これらの結果からHCV Rzの安定な発現によりプラス鎖ＲＮＡゲノムを含むウイルスによる“感染”を阻害することができることが示される。実施例６他のＨＣＶリボザイム標的部位の組織培養内試験ここまで記載したリポーター系は、ＨＣＶの5'UTRとキャプシド領域を標的にしたリボザイムの分析にのみ適切である。表Ｉに示された他の標的部位を試験するために、(+)又は(-)鎖ＲＮＡ内の部位のリボザイムによって切断を試験することができる生体内分析系が設計される。 A. (+) 鎖内のリボザイム切断の分析ＨＣＶの(+)ＲＮＡ鎖は、3011アミノ酸ポリタンパク質の翻訳に関与するオープンリーディングフレームを含む。トランスフェクトした細胞中のヌクレオキャプシド（又はキャプシド）の翻訳を検出するためにＨＣＶ感染患者由来のヒト抗血清を用いてウェスタンブロット分析が展開される（図14）。概要としては、HT 1080細胞をpPUR-HCV（図9B）でトランスフェクトするとＨＣＶ 5'UTR配列とキャプシド配列を含むmRNAの転写が生じる。ＨＣＶの5'UTRが、タンパク質の翻訳をＲＮＡの中から開始させる内部リボザイムエントリー部位(IRES)として作用することができることは以前に証明されている（Wangら，J．Virology 67:3338-3344 ,1993）。従って、トランスフェクトした細胞はキャプシド配列を翻訳し、21kD キャプシドタンパク質はウェスタンブロッティングにより可視化される（図14）。本実験においては、ＨＣＶの最初の1000ヌクレオチドのみがmRNAに存在し、ちょうどキャプシドタンパク質の翻訳を生じる。しかしながら、それ以上のＨＣＶ配列が含まれる場合（いずれかに合計9500塩対まで）、より大きなポリタンパク質が翻訳され、得られたウェスタンブロット分析により検出されたタンパク質は対応して大きい（示されていない）。キャプシドコード領域が翻訳されるべきＨＣＶポリタンパク質の最初の領域であるので、その検出は任意の長さポリタンパク質、ほぼ350kDの全サイズＨＣＶポリタンパク質までの翻訳を可視化するために用いられる。(+)鎖ＲＮＡ上のいずれかを標的にしたリボザイムはHCV mRNAを切断し、リボザイムの存在しないときに翻訳されるものより小さいポリタンパク質の翻訳を生じる。本分析はリボザイム活性を検出することができるだけでなく、(+)鎖上のいずれかの異なる部位を標的にした種々のリボザイムの活性を量的に比べるために用いられる。 B. (-) 鎖内のリボザイム切断の分析ＨＣＶ複製、よってＨＣＶ(-)鎖ＲＮＡの作製を支持する細胞培養系が現在ないので、(-)鎖を標的にしたリボザイムの影響を分析するためにルシフェラーゼリポーター系が展開される。概要としては、(-)鎖の断片がpGL3ベクターのルシフェラーゼコード領域の上流のユニークなHindIII部位にクローン化される（図1 5;Promega,ウィスコンシン州マディソン）。これらのベクターは、哺乳動物細胞にトランスフェクトされた場合にルシフェラーゼコード領域の上流の(-)鎖ＲＮＡの断片を含むSV40初期プロモーターによってmRNAを転写する。(-)鎖ＲＮＡに対向するリボザイムはまずpLNT-Rz(図２参照)にクローン化され、次にＨＣＶルシフェラーゼリポータープラスミドで同時トランスフェクトされる。従って、生体内で(-)鎖を切断することができるリボザイムは、トランスフェクション後にルシフェラーゼ活性の低下が生じる。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼ分析系(Promega，ウィスコンシン州マディソン)によって測定される。上記の (+)鎖についてリボザイムを試験する分析系と同様に本ルシフェラーゼ系分析はリボザイム活性を検出することができるだけでなく、(-)鎖上のいずれかの異なる部位を標的にした種々のリボザイムの活性を量的に比べるために用いられる。実施例７アデノウイルスの作製とAAVリボザイムデリバリーベクター A. アデノウイルスデリバリーベクターの構築と精製ＨＣＶ特異リボザイム遺伝子を含む組換え複製欠失(E1欠失)アデノウイルスベクター(Av)は、シャトルプラスミド（pAvCRz.SY;図16）とAd dl-327との相同的組換えによって構築される(Jones & Shenk，Cell 13:181-188，1978)。概要としては、シャトルプラスミドは次の要素からなるpBR322系プラスミドである:(1)Ad 5配列１〜452(遺伝子バンク受託番号第M73260号;左逆方向末端反復、包膜シグナル及びE1aエンハンサーを含む）、人工XbaI、BamHI及びXhoI部位、(2)CMV即時型遺伝子プロモーターとエンハンサー(pCMVβ発現ベクター，Clontech，カリフォリニア州パロアルト;Boshartら，Cell 41:521-530，1985)、人工BamHI及びXhoI 部位、SV40スプライス供与／スプライス受容配列（pCMVβ発現ベクターから，Cl ontech，カリフォルニア州パロアルト）、人工多重クローニング部位としては、相接する配列内にBamHI、NotI、BgIII、EcoRI、AscI、NotI、BamHI部位、SV40ポリアデニル化（pCMVβ発現ベクターから，Clontech，カリフォルニア州パロアルト）、人工BamHI、SalI及びClaI部位が含まれる;及び(3)相同的組換えに用いられるAd5配列(Ad5配列3328〜5788)。ＨＣＶ特異リボザイム遺伝子(CR2及びCR４等）又はリポーター遺伝子（pCMVβ発現ベクター，Clontech，カリフォルニア州パロアルトからの大腸菌βガラクトシダーゼ遺伝子のような）は多重クローニング部位によってシャトルプラスミドにクローン化される（図16）。組換えアデノウイルスベクターを、d1327のシャトルプラスミドと大きなClaI断片の双方で同時トランスフェクトした293個の細胞からプラーク及び精製する。得られたAvを、通常行われるように少なくとも２回以上プラーク精製する(Yeiら，1994，Human Gene Therapy 5:731-744)。Avは293個の細胞で増殖され、抗HCVRzの機能を評価するのに使用する前に高力価標晶まで精製される。本発明のある実施態様においては、動物における静脈内使用には多量の高度に精製したベクター（例えば、アデノウイルスベクター標品）の標品が必要であるので、FPLCは適切なウイルスベクターを精製するために用いられる。例えば、図 17に示されるようにアデノウイルスベクターのモデルとしてここに用いられる野生型アデノウイルスはイオン交換カラムクロマトグラフィーの塩勾配溶離により清澄化細胞溶解物から精製される。感染力分析によって測定されるウイルスは約 14〜15mlで鋭いピークとして溶離した。ウイルスは少なくとも90％純粋であり、 CsCI勾配遠心分離のような他の秤量できない精製法に匹敵する収量で得ることが推定される。 B. AAV デリバリーベクターの構築ＨＣＶ特異リボザイムを含む組換えAAV(rAAV)ベクターが構築される。潜在的なリボザイムとしては、CR２及びCR４が含まれるがこれらに限定されない。概要としては、好適実施態様においては、リボザイムはＣＭＶプロモーターの制御下に置かれ、ネオマイシン耐性のような選択マーカーがSV40初期マーカーの制御下に置かれる（図18）。リボザイムはウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナルを含むことができ、リボザイム分子の50％を非ポリアデニル化することができる切断カセットを含むことができる。ネオmRNAは、SV40ポリアデニル化シグナルによってアデニル化される。全てのカセットにAAV ITRが隣接してAAV粒子にパッケージングされることが可能である（図18）。AAVベクターをパッケージングするために、ポリ−１−リシンがアデノウイルス５型の表面に架橋され、正荷電したウイルスはrAAVとAAVヘルパープラスミドpAAV/AdのDNAに結合される(pAAV/A dはAAVゲノムのパッケージングに必要なAAV相補性機能を全て含む;Samulskiら， J．Virology 63:3822-3828，1989)。引き続き、HeLa細胞に感染させるためにアデノウイルスポリリシン複合体を用い、感染約48時間後に細胞を収集し、凍結解凍によりパッケージングしたrAAVを放出する。次に、細胞溶解物を56℃に加熱して複製コンピテントアデノウイルスを不活性化し、rAAVを精製するか又は未精製物を用いて肝細胞を力価測定及び導入する。実施例８リボザイムによるＨＣＶマイナスゲノム鎖ＲＮＡの試験管内切断標識ＨＣＶ(-)鎖ＲＮＡをコードするリボザイム遺伝子を合成し、実施例２に記載された試験管内転写ベクター(pGEM-7Z，Promega,ウィスコンシン州マディソン)にクローン化した。pGem7Z(-)リボザイムと称する得られたプラスミドをNsiI （クローン化した遺伝子のすぐ下流）で線状にし、T7(Welchら，Gene Therapy 3 :994-1001，1996)により試験管内で転写した。反応物を製造業者(Promega)によって示された情報に従ってRQ1 DNaseで処理し、転写物をゲル精製した。長い基質合成(長さが471bp)用プラスミドpGEM7-HCV5'を用いて試験管内転写によりＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡ基質を得た。１つが切断部位を含み１つはT7プロモーターを含む２種のオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより短い基質をつくり、以前に記載されたようにT4 DNAポリメラーゼを挿入した（上記Welch ら，1996）。試験管内分析を実質的に上記のように行った。結果を図19及び図20に示す。概要としては、図19及び図20のブロットからCNR 3Rzが短い(19)及び長い(20)マイナス鎖ＨＣＶRNA基質を切断することが明らかに示される。実施例９種々のプロモーターによるアデノウイルスベクター及びAAVリボザイムデリバリーベクターの構築Ａ. アデノウイルスベクターの構築実質的に実施例７に記載されるように、種々のプロモーターによって促進される実施例５で同定された触媒活性Rz(CR4)を発現する複製欠失アデノウイルスべクターを構築してtRNA^valプロモーター(Yuら，PNAS 84:1005，1993)又はＣＭＶプロモーター又は双方を含めた。得られたプラスミドを図21に示す: pAvC-RzはＣＭＶプロモーターによってRzを発現し、pAvM-RzはtRNA^valプロモーターの制御下でRzを発現し、pAvCM-RzはＣＭＶプロモーターとtRNA^valプロモーター双方からRzを発現する。 B. AAV ベクターの構築 CR4 Rz遺伝子をpAMFT.dBamプラスミドにクローン化してtRNA^valプロモーターからCR４を発現するrAVVを作成した。概要としては、pAMFT.dBam（図22）は1)アデノ随伴ウイルスゲノムの5'及び3'逆方向末端反復(ITR);2)tRNA^valプロモーターによるRz遺伝子の転写用カセット;3）MMLV LTRによって進行されるネオマイシン耐性マーカーを保有する組換えプラスミドである。tRNA^valプロモーターの制御下でCR４リボザイムを発現するAAVベクターを作成するために得られたプラスミドをpAAVM-CR4と称する（図21）。実施例10 ＨＣＶ遺伝子発現を減少させるCR4 Rzの影響ＨＣＶ遺伝子発現を減少させる際のCR4 Rz活性を組織培養内で試験した。概要としては、CR４リボザイムを実施例９に記載されるpAvC-CR4から発現した。ＨＣＶコア抗原を検出するウェスタンブロットを用いて組織培養内でＨＣＶキャプシドの細胞内合成を阻止する際のリボザイムの有効性を評価した。特に、HT1080細胞にpPur-HCV(図23参照)とpAvC-CR4でモル比1:10と1:20のモル比で実施例５に記載される方法を用いて同時トランスフェクトした。試験したリボザイムは、CR４と無能力CR4(dCR4)を含めた。トランスフェクションの24時間後に細胞を収集し、ＨＣＶコアウェスタンブロットのために処理した。図24に示されるように、pAvC-CR4を試験したモル比（1:10と1:20）で同時トランスフェクトすると、ＨＣＶコア発現のほぼ完全な停止がもたらされ、CR4(dCR4 )の無能力形は効果がなかった（図24）。実施例11 ＨＣＶ遺伝子発現を低下させる際のプロモーター／ベクターの種々の組合わせの影響ＨＣＶ遺伝子発現を減少させる際のCR4 Rz活性に対するプロモーター／ベクターの種々の組合わせの影響を組織培養内で試験した。概要としては、CR4 Rzがプロモーター／ベクター構築物から発現された以外は実施例10に記載された方法と同様に実験を行った。実施例10に見られるように、CR４を異なる構築物から発現すると全てＨＣＶコア発現の減少がもたらされた(図25、パネルA)。しかしながら、pAAVM-CR4(CR4 Rzを発現するtRNA^valpol IIIプロモーターを含むアデノ随伴ウイルスDNAバックボーン）は最大の効能を示す(図25A)。 pAAVM-CR4の活性についてHCV:Rz比1:0、1:0.5、1:1、1:5、1:10及び1:20で細胞を同時トランスフェクトしたウイルスコア発現の減少を力価測定した。1 :1比でさえコアタンパク質発現の完全な阻害が見られた。1:0.5比で顕著な減少が見られた(図25、パネルB)。実施例12 肝細胞におけるRz CR4の生体内発現ヒト肝細胞においてリボザイム遺伝子を送達及び発現する組換えアデノウイルスの能力を実質的に次のように評価した。概要としては、CMVプロモーター(AvC- CR4)によって促進されるCR４遺伝子を保有するアデノウイルスを作成した。ヒト肝がん細胞(Huh7)にベクターをm.o.i．O、１、５、10又は50で導入し、細胞性ＲＮＡを導入の１又は３日後に収集した。次に、RNase保護分析(Promega，ウィスコンシン州マディソン)を行ってリボザイムの発現を測定した。概要としては、図26に示されるように、CR４リボザイムは導入の１日及び３日後に同様に発現し、発現レベルはウイルスの導入量に依存した用量応答を示した。これらの結果からアデノウイルスはヒト肝細胞においてリボザイム遺伝子を送達及び直接発現するために用いられることが示される。実施例13 アデノウイルスベクター或いはアデノ随伴ウイルスベクターによるヒト正常一次肝細胞の感染 AV及びAAVベクター構築物に対するヒト正常一次肝細胞の感染力を実質的に下記のように試験した。概要としては、ヒト正常一次肝細胞にβガラクトシダーゼ遺伝子を種々のMOIで保有するAV或いはAAVを感染した。感染の24時間後に、細胞をlacZ染色のために処理した。ベクターの導入のために青色に染色した細胞数を計数した。結果を図27に示す。概要としては、AV及びAAVは共に培養内の一次肝細胞を感染100%で効率よく感染及び導入させることができる。本発明の個々の実施態様を例示のために本明細書に記載してきたが、前述のことから本発明の真意と範囲から逸脱することなく種々の変更が行われることは理解される。従って、本発明は下記の請求項の範囲を除いては制限されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者トリッツリチャードアメリカ合衆国カリフォルニア州 92121 サンディエゴジェネシーアベニュー 9515―＃127 (72)発明者イェイスーンペイアメリカ合衆国カリフォルニア州 92009 カールスバドシトロミュージカ 7707 (72)発明者ユーマンアメリカ合衆国カリフォルニア州 92122 サンディエゴカーラブリアコート 7155 ビー

Claims

【特許請求の範囲】 1. Ｃ型肝炎ウイルスの複製、感染又は遺伝子発現を阻害する能力をもつリボザイム。 2. 前記リボザイムがＨＣＶマイナス鎖ゲノムＲＮＡを切断する、請求項１記載のリボザイム。 3. 前記リボザイムがヘアピンリボザイムである、請求項１又は２記載のリボザイム。 4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のリボザイムをコードする核酸分子。 5. 該核酸分子がＤＮＡ又はｃＤＮＡである、請求項４記載の核酸分子。 6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のリボザイム又は核酸分子を含むホスト細胞。 7. 請求項４又は５記載の核酸分子に作用可能に結合したプロモーターを含む、ベクター。 8. 前記プロモーターがpolIIIプロモーター又はＣＭＶプロモーターである、請求項７記載のベクター。 9. 前記ベクターがプラスミド、ウイルスベクター、レトロトランスポゾン又はコスミドである、請求項７記載のベクター。 10．前記ウイルスベクターが組換えアデノウイルス又はレトロウイルスベクターである、請求項７記載のベクター。 11．請求項７〜10のいずれか１項に記載のベクターを含むホスト細胞。 12．細胞においてＣ型肝炎ウイルスの感染、複製又は遺伝子発現を阻害することができるリボザイムの製造方法であって、プロモーターの転写制御下で請求項１〜３のいずれか１項に記載のリボザイムをコードするＤＮＡを提供する工程、及び該ＤＮＡを転写して前記リボザイムを作製する工程を含む方法。 13．該リボザイムを精製する工程を更に含む、請求項12記載の方法。 14．前記リボザイムが試験管内で製造される、請求項12記載の方法。 15．前記リボザイムが生体内で製造される、請求項12記載の方法。 16．ＨＣＶに感染した又は感染しやすい細胞においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製又は遺伝子発現を妨害又は予防する方法であって、請求項１〜３のいずれか１項に記載のリボザイムの有効量を該細胞に導入する工程を含む、前記方法。 17．ＨＣＶに感染した又は感染しやすい細胞においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製又は遺伝子発現を妨害又は予防する方法であって、請求項７記載のベクターの有効量を該細胞に導入する工程を含む、前記方法。 18．前記細胞がヒト細胞である、請求項16又は17記載の方法。 19．前記ベクターが組換えアデノウイルス又はレトロウイルスベクターである、請求項17記載の方法。 20．請求項１〜３のいずれか１項に記載のリボザイムを薬学的に許容しうる担体又は希釈剤と共に含む、医薬組成物。 21．請求項４又は５記載の核酸分子を薬学的に許容しうる担体又は希釈剤と共に含む、医薬組成物。 22．請求項７〜１０のいずれかに記載のベクターを薬学的に許容しうる担体又は希釈剤と共に含む、医薬組成物。