JP2003501073A - 安定的にｈｃｖを形質移入したｈｅｐｇ２細胞 - Google Patents

安定的にｈｃｖを形質移入したｈｅｐｇ２細胞

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Abstract

(57)【要約】 本発明は野生型Ｃ型肝炎ウイルスを安定的に形質移入したセルライン、ならびにＣ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス変異体の研究およびＣ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス変異体の処置に有効な抗ウイルス剤の同定を容易にするための該セルラインの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願に対するクロスリファレンス 本出願は、１９９９年６月３日出願の米国仮特許出願第６０／１３７，５３１
号に基き、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ §１１９の下、部分的に優先権を主張する。
【０００２】技術分野 本発明は、分子生物学およびウイルス学ならびにウイルスの研究および有効な
抗ウイルス剤の同定を容易にするセルライン、さらに詳細には、安定的にＣ型肝
炎ウイルスを形質移入したＨｅｐＧ２細胞ならびにＣ型肝炎ウイルスまたはＣ型
肝炎ウイルス変異体の効果的な研究およびかかるウイルスまたは変異ウイルスに
有効な治療剤の同定のためのセルラインの使用に関する。
【０００３】背景技術 ＨＣＶは、世界的に、輸血後および院外感染の非Ａ非Ｂ肝炎の主な原因である
。抗ＨＣＶ試験が広く行き渡っているにも関わらず、合衆国において４００万人
近くの慢性的感染者がおり、年に２８，０００人が新たに患者となり、ＨＣＶに
関連する死者は年に８，０００〜１０，０００人である。世界中では、肝炎、肝
硬変および肝細胞癌（ＨＣＣ）を発症する高い危険性を有する慢性的感染者が推
定１．７億人いる。
【０００４】 ウイルス複製の研究、宿主−ウイルスの関係の解明、およびインビトロでの抗
ウイルス薬のスクリーニングにおける主な問題は、安定した組織培養系が無いこ
とである。本来のヒトおよびチンパンジーの肝細胞は、ＨＣＶに感染しやすく、
ウイルスを複製し易い。しかし、本来の肝細胞は入手し難く、また通常、培養に
おいて２週間未満しか生存しない。既に感染した個体から肝細胞を採取した場合
も同じ制限がはたらく。ＨＣＶ感染しやすいと思われるいくつかのセルラインは
、ウイルスの安定したベースラインレベルを一定には生じなかった。完全長のＨ
ＣＶ ＲＮＡでは、多くのセルラインへの形質移入（transfect）に成功してい
るが、複製レベルは不安定で、数週間内に検出不能になる。さらに最近、ＨＣＶ
のサブゲノム領域がクローニングされ、ミニレプリコンにおいて高レベルで発現
したが、その中でウイルス複製を維持するミニレプリコンはなかった。よって、
ＨＣＶ複製を安定して維持することができる１以上の系の開発の必要が未だ存在
している。本発明は、完全長ＨＣＶ ｃＤＮＡのクローンを安定的に形質移入し
たＨｅｐＧ２細胞に関する。
【０００５】発明の概要 本発明は野生型Ｃ型肝炎ウイルスを安定して発現するセルラインに関する。 本発明のもう一つの態様は、Ｃ型肝炎ウイルス複製の阻害または防止に有効な
治療剤の同定方法であって、上記Ｃ型肝炎ウイルスを安定して発現するセルライ
ンの上記治療剤への接触と、上記Ｃ型肝炎ウイルス複製の変化の測定とを含む方
法である。
【０００６】 本発明のさらにもう一つの態様は、Ｃ型肝炎ウイルス成熟の阻害または防止に
有効な治療剤の同定方法であって、上記Ｃ型肝炎ウイルスを安定して発現するセ
ルラインの上記治療剤への接触と、上記Ｃ型肝炎ウイルス成熟の変化の測定とを
含む方法である。
【０００７】 本発明のもう一つの態様は、クローン化治療剤の効力を同定する方法であって
、Ｃ型肝炎ウイルスを安定して生産するセルラインへの、治療遺伝子配列の挿入
と、ウイルス複製および成熟の測定とを含む方法である。
【０００８】 本発明のもう一つの態様は、変異Ｃ型肝炎ウイルスを安定して発現するセルラ
インである。
【０００９】 本発明のさらにもう一つの態様は、ウイルスの複製および成熟を研究する方法
であって、ａ）上記変異Ｃ型肝炎ウイルスが発現している上記請求項５のセルラ
インの増殖；ｂ）上記野生型Ｃ型肝炎ウイルスが発現している上記請求項１のセ
ルラインの増殖；ｃ）工程ａ）におけるウイルス複製および成熟の量の測定；ｄ
）工程ｂ）におけるウイルス複製および成熟の量の測定；およびｅ）工程ｃ）で
測定した上記変異Ｃ型肝炎ウイルスの上記ウイルス複製および成熟を工程ｄ）で
測定した野生型Ｃ型肝炎ウイルスのものと比較することによる上記変異Ｃ型肝炎
ウイルスにおける変異の効果の分析、を含む方法である。
【００１０】発明の開示 ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ［＋］細胞の構築および性質決定 ３’末端９８塩基対配列をＨＣＶ ｃＤＮＡのほぼ完全長のクローン（ｐＲｃ
／ＣＭＶ／ＨＣＶ９．４、Takehara. T.ら、Hepatology 21:746-751、1995年）
に付加して、完全長とし、ついで全ｃＤＮＡ配列を確認した。このプラスミドに
おいて、ＨＣＶ発現はＣＭＶ初期〜中間プロモーターの調節下にある。内在性プ
ロモーターからＨＣＶを発現させるため、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて、完全長ＨＣ
Ｖ ｃＤＮＡをｐＲｃ／ＣＭＶ／ＨＣＶから取り出した。つづいて、ＣＭＶプロ
モーターを欠くベクターであるｐＺＥｒＯ−１．１（InVitrogen社）に、その挿
入断片（９．６ｋｂ）をサブクローニングした。ＨＣＶクローンの配列は既に報
告されているものと同一だった（Takehara. T.ら、Hepatology 21:746-751、199
5年）。つづいて、ｐＲｃ／ＣＭＶ／ＨＣＶまたはｐＺＥｒＯ−１．１中の完全
長クローンをＨｅｐＧ２細胞内へ安定的に形質移入し（図１）、培養物を各々Ｇ
４１８またはゼオシン（zeocin）中で３週間選択した。ゼオシン耐性コロニーは
回収されなかった。Ｇ４１８耐性培養物を、ＨＣＶ生産の存在に関してアッセイ
した。
【００１１】鎖特異的ＰＣＲはマイナス鎖ＲＮＡの検出を識別する 完全長ＨＣＶ ｃＤＮＡを鋳型として用いて、インビトロ転写によりプラス鎖
ＲＮＡまたはマイナス鎖ＲＮＡを生産した（図２）。つづいて、各反応物をＲＮ
アーゼ除去ＤＮアーゼで処理した。等量の各ＲＮＡを逐次的に１０倍希釈した。
ＲＮＡの各希釈物を用い、プラス鎖「タグ付き（tagged）」プライマーＴＡＧ−
ＭＦ７（５’ＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＡＴＡＡ 92ＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡ
ＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴ118 ３’、配列番号１）の添加により逆転写工
程を開始した。「タグ」はＨＣＶ配列に無関係の１６ヌクレオチド（配列番号１
中の下線を付した配列）なので、逆転写後に生じたｃＤＮＡは５’末端にタグ配
列を有する。ＲＮアーゼ消化後、プラス鎖「タグ付き」プライマーおよびマイナ
ス鎖プライマーＭＦ８（５’360ＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＡＣＴＣＧ
ＣＡＡＧＣＡＣＣＣ331 ３’、配列番号２）を各反応物に添加してＰＣＲを行
った。その結果は、臭化エチジウム着色に十分な生産物を形成するためには、約
１０７コピーのプラス鎖ＨＣＶ ＲＮＡが必要であるが（図２Ａ）、必要なマイ
ナス鎖は１０コピーのみであることを示す（図２Ｂ）。これらの結果は、鎖特異
的ＰＣＲが、プラス（非特異）鎖の約１００万倍のマイナス（特異）鎖の検出を
識別することを示す。逆転写工程においてマイナス鎖タグ付きプライマーを用い
た逆さまの実験は、同様の結果を示す。
【００１２】ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞溶解物中のＨＣＶについての鎖特異的ＲＴ／ＰＣＲ ＨｅｐＧ２細胞からＲＮＡを抽出し、ついでオリゴｄＴカラムを用いてさらに
ｍＲＮＡを精製した。ついで、単離ｍＲＮＡをＲＮアーゼフリーＤＮａｓｅで処
理し、つづいてＲＴ／ＰＣＲを行った。ＲＴ／ＰＣＲに関し、高温（５５℃）で
の非対称一本鎖合成のため、最初は特異的マイナス（配列番号２）センスプライ
マーまたは５’非翻訳領域（ｎｔｓ９２〜１１８）内のプラスセンスプライマー
ＭＦ７（５’92ＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴ11 8 ３’、配列番号３）を用いた。ＨＣＶ特異的配列に加えて、このプライマー
はＨＣＶに無関係の（タグ）配列（１６ｎｔ）の５’伸展部を有するので、生成
した単鎖ｃＤＮＡは５’末端にタグ配列を有した。ついで、該ｃＤＮＡの１０％
を相補ＨＣＶプライマーの入った新しい試験管に移した。プラスセンスＲＮＡ（
配列番号３）用プラスセンスプライマーＭＦ７およびマイナスセンスＲＮＡ（配
列番号２）用マイナスセンスプライマーＭＦ８ならびにタグ配列（５’ＴＣＡＴ
ＧＧＴＧＧＣＧＡＡＴＡＡ ３’、配列番号４）のみを含有するプライマー。後
者のプライマーを用いて単鎖ｃＤＮＡに対して排他的にＰＣＲ増幅を指示した。
つづいて、ＨＣＶ特異的（５’−ＧＡＴＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧ
ＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣ−３’、配列番号５）プローブを用いて、これ
らの試料をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動およびサザンブロットハイブ
リダイゼーションによって分析した（図３）。レーン１は逆転写酵素を用いずに
マイナス鎖プライマーで開始する反応である。レーン２は逆転写酵素を用いた同
じ反応である。この結果はプラス鎖ＨＣＶ ＲＮＡの存在を反映する。逆転写工
程でタグ付きプラス鎖プライマーを用いて同じ実験を行った場合、逆転写酵素不
使用の結果（図３、レーン３）または逆転写酵素を用た結果（図３、レーン４）
は、ＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡの存在を反映するＲＴ／ＰＣＲ産物を生じた。これ
らの反応をＨＣＶ陰性ＨｅｐＧ２細胞で行った場合、プラスまたはマイナス鎖Ｈ
ＣＶ ＲＮＡは検出されなかった。レーン５における結果はプラス鎖反応につい
てのものである。鎖特異性は、ＨＣＶ ＲＮＡの数個の領域に由来するプライマ
ーを用いてセルフプライミングまたはランダムプライミングを減少させることで
確かめられた。結局、これらの結果はＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞におけるＨＣＶマ
イナスおよびプラス鎖ＲＮＡの存在を示す。逆転写を欠く場合生産物は検出され
ないので、これらはまた、ＰＣＲ産物が導入遺伝子増幅の結果でもランダムプラ
イミングの結果でもないことを示す（図３、レーン１）。
【００１３】ＨＣＶ ｃＤＮＡで安定的に形質移入したＨｅｐＧ２細胞 ダウンス（Dounce）ホモゲナイゼーションを用いた穏やかな破壊により、等数
のＨＣＶプラス［＋］およびマイナス［−］ＨｅｐＧ２細胞細胞から溶解物を調
製した。該溶解物を５ｍｌのヒートシールできる試験管中に予め形成したＣｓＣ
ｌ勾配（１．０５〜１．４０ｇｍｓ／ｍｌ）の上に積層し、卓上超遠心機（Beck
man社）で１０℃、７０時間、６８，０００ｒｐｍで遠心分離した（図４）。各
画分の一部からＲＮＡを抽出し、ヌクレオチド６２〜９１（ＭＦ１６：５’62Ｃ
ＣＡＴＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴ91 ３’、配列番号６
）および４３１〜４１４（ＭＦ１７：５’431ＴＴＡＡＣＧＴＣＣＴＧＴＧＧＧ
ＣＧＧＣＧＧＴＴＧＧＴＧ414 ３’、配列番号７）にわたる５’非翻訳領域由
来のプライマーを用いたＲＴ／ＰＣＲに付した。つづいて、生産物をアガロース
ゲル電気泳動および５’非翻訳領域単位複製配列内の配列にわたるＨＣＶ ＤＮ
Ａプローブ（配列番号５）を用いたストリンジェントな条件下でのサザンブロッ
トハイブリダイゼーションによって分析した。該プローブは、生産物内へビオチ
ニル化塩基を取り込むＰＣＲによって作成した。ストレプトアビジンを共役させ
た西洋ワサビペルオキシダーゼの添加、および最終的な増強化学ルミネッセンス
（ＥＣＬ）試薬（Amersham社）の添加により、ハイブリダイゼーションを検出し
た（図４）。
【００１４】ＨＣＶ ＲＮＡをキャプシド形成する キャプシド化ＨＣＶ ＲＮＡについて試験するため、０．１％ ＮＰ４０＋０
．１％ツイーン２０を含有する非イオン緩衝液中で細胞溶解物を調製し、遠心分
離で清澄にし、つづいて上記のようにＣｓＣｌ勾配中で平衡になるまで遠心分離
した。ＲＴ／ＰＣＲによってＨＣＶ ＲＮＡについて勾配画分をアッセイした場
合、ＨＣＶの濃度性質（１．１ｇｍｓ／ｍｌ）でのみシグナルが観察され、キャ
プシド化を示した（図４）。これらの画分におけるＨＣＶ ＲＮＡはＲＮアーゼ
耐性であった。予期した勾配画分からの抗ＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２免疫沈降物質、お
よび増幅に基き、ＨＣＶについてのＲＴ／ＰＣＲが得られた。これらの実験はヒ
ト肝臓細胞がＨＣＶ ＲＮＡを適当な濃度および免疫化学性質で、ビリオン中に
キャプシド化することを示す。細胞内ウイルス生産物は、１〜５×１０４ウイル
スゲノム等量／１０６細胞のレベルで一年以上一定であり、ＨＣＶ生産の安定し
たベースラインを示す（図５）。
【００１５】ＨｅｐＧ２細胞中のＨＣＶ ＲＮＡの経時的な安定生産 ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞の培養物を４〜５日毎に継代した。細胞溶解物を３、
６、９および１２ヵ月に調製し（図５）、ゲノムの５’非翻訳領域由来のプライ
マー（配列番号１および２）を用いて等量の抽出ＲＮＡをＨＣＶについてのＲＴ
／ＰＣＲに付した。等量のＲＮＡを、１００ｂｐの内部欠失（ヌクレオチド１６
３〜４１４に融合したヌクレオチド６２〜１６２のＨＣＶ配列にわたる）を除い
て同じ配列を単位複製配列として含有する増加既知量鋳型（スパイク）を用いて
増幅した。後者が、アガロースゲル電気泳動により試料由来の単位複製配列（上
のバンド）をスパイク（下のバンド）の単位複製配列から分離することを可能に
する（図５）。図５は培養の３、６、９および１２ヵ月に回収した試料の競合Ｒ
Ｔ／ＰＣＲ分析を、臭化エチジウム染色ゲル（下図）、およびゲルスキャン後の
グラフ形式（上図）で示す。この結果は、ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ培養における安定
レベルのＨＣＶ ＲＮＡの一定の生産を示す。本発明はこれらの安定生産Ｈｅｐ
Ｇ２−ＨＣＶ培養物由来のセルラインを提供する。これらの細胞におけるウイル
ス生産の安定なベースラインは、抗ウイルス化合物のスクリーニングのための重
要なツールを提供する。これらの結果はまた、組込ＨＣＶ ｃＤＮＡクローンが
ウイルスの一定生産のための鋳型として働くことも示す。
【００１６】ＳＣＩＤマウス血清中のＨＣＶ ＲＮＡの証明 ＳＣＩＤマウスにＨｅｐＧ２−ＨＣＶまたは等数のＨｅｐＧ２−ベクター形質
移入細胞を皮下注入した。マウスを注入後各１０日間飼育し、半定量的ＲＴ／Ｐ
ＣＲにより血清試料をＨＣＶ ＲＮＡについて試験した（図６）。無作為に選択
した陽性および陰性対照試料を上記のようにＣｓＣｌ密度平衡遠心分離によって
分析した。この結果は、ＨＣＶプラス［＋］でＨＣＶマイナス［−］ではない細
胞を注入した動物におけるおよそ１．１ｇｍ／ｍｌの密度（Ｄ）でのＨＣＶ Ｒ
ＮＡの存在を示す。このシグナルはＲＮアーゼでの予めの処理に耐性である。全
体として、これらの結果は、ＨｅｐＧ２−ＨＣＶを注入したＳＣＩＤマウスの血
液中にＨＣＶビリオンが分泌されることを示す。
【００１７】ＨＣＶ ＲＮＡは分泌される。 ウイルス分泌を試験するため、組織培養上清の一部をＲＴ／ＰＣＲ増幅によっ
て分析したが、最初の結果は堅実に陽性ではなかった。しかし、細胞を免疫不全
マウスに注入した場合、それらが皮下腫瘍として増殖したところでは、注入され
た６匹中６匹のマウスが、血液中ＨＣＶ ＲＮＡについてＲＴ／ＰＣＲ陽性にな
った（図６）。これは、ＨＣＶについてのＣｓＣｌ勾配における適切な密度の１
．１ｇｍ／ｍｌを有した。ＲＴ／ＰＣＲによる半定量は、インビボのＨＣＶの濃
度が、注入４０日後までに個々のマウス血液中、１０５〜１０６ウイルスゲノム
等量／ｍｌに達することを示した（表１）。これらのシグナルはＲＮアーゼおよ
びＤＮａｓｅ前処理に耐性であった。推定上のウイルスポリメラーゼ、ＮＳ５Ｂ
は抗−ＮＳ５Ｂを用いた放射標識細胞溶解物の免疫沈降によって検出された。し
たがって、ＨＣＶはＨｅｐＧ２中で安定して複製され、広範な基礎および応用研
究に適したＨＣＶの長期培養物を提供する。
【００１８】定常レベルのＨＣＶ ＲＮＡにおけるアクチノマイシンＤの影響 ０．４、０．７または１．０μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤにより、７×１
０６ ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞の培養物を７２時間処理した（図７）。つづいて
、全細胞ＲＮＡを抽出し、半定量ＨＣＶ特異的ＲＴ／ＰＣＲに付した（図７Ａ）
。Ｇ３ＰＤＨ特異的プローブを用いて同じ抽出物由来のＲＮＡをノザンブロット
分析に付した（図７Ｂ）。その結果は、Ｇ３ＰＤＨにおいてはおよそ１０倍の減
少を示したが、ＨＣＶ ＲＮＡでは減少は検出されなかった。細胞に由来するＧ
３ＰＤＨ ｍＲＮＡは、アクチノマイシンＤによる阻害に感受性である。ＨＣＶ
ＲＮＡの相対的耐性は、いくつかのウイルスＤＮＡがＨＣＶポリメラーゼの作
用に由来し、アクチノマイシンＤに耐性であることを示す。
【００１９】ＳＣＩＤマウスの血清中でのＲＮアーゼＡからのＨＣＶ ＲＮＡの防御 ＳＣＩＤマウスに５×１０６ ＨｅｐＧ２−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＣＶ細胞また
は対照ＨｅｐＧ２−ｐＲｃ／ＣＭＶ細胞を各々注入した。注入後、１０日間に１
回、全部で３０日間、マウスから採血した。いくつかの血清試料は、ＲＮアーゼ
で前処理して不活性化した後に、ＲＮＡを抽出し、ＲＴ／ＰＣＲに付し、最終的
に１．４％アガロースゲルで分析した（図８）。ＲＴ／ＰＣＲ直前に加えたスパ
イク（１×１０５コピー）は内部欠失を有するＨＣＶ配列からなり、それにより
アガロースゲル上でウイルス単位複製配列よりも速く移動した。指示された試料
を含むゲルを臭化エチジウム染色した。
【００２０】 ＨｅｐＧ２−ＨＣＶを注入したＳＣＩＤマウスの血清中のＨＣＶについてのＲＮ
Ａ検出 注入後採血前にＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞４０を注入したＳＣＩＤマウスから得
た血清試料を用いてＣｓＣｌ密度平衡遠心分離を実施した。ＲＮＡを各勾配画分
から抽出し、ＨＣＶの５’非翻訳領域（図９、上図のゲル）にわたるプライマー
（配列番号１および２）または完全長ＨＣＶ ｃＤＮＡをクローニングしたｐＲ
ｃ／ＣＭＶプラスミド中の下流ｎｅｏ遺伝子を増幅するプライマーを用いるＲＴ
／ＰＣＲに付した。その結果は、密度１．１ｇｍ／ｍｌでＨＣＶの存在を示すが
、ｎｅｏ配列の存在は示しておらず、下流プラスミドを除くウイルス配列を転写
し、パッケージすることを示す。
【００２１】ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞におけるＮＳ５Ｂの発現 ＨｅｐＧ２−ｐＲｃ／ＣＭＶおよびＨｅｐＧ２−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＣＶ細胞
を各々、１００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを加えた３５Ｓ−システイン
で３時間放射標識した。細胞溶解物を標準ＲＩＰＡ緩衝液中（４℃、１０分間）
で調製し、清澄にし、および抗ＮＳ５Ｂまたは対照血清で免疫沈降させ、つづい
てタンパク質Ｇ−アガロースビーズ（Santa Cruz Biotech社）で処理した。その
結果得られた物質を４回洗浄し、遠心分離（１０００×ｇ、５分間、４℃）で回
収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー（図１０）によって分析
した。その結果は、ＨＣＶ［＋］では予期した６８ｋＤａにバントを示している
が、ＨＣＶ［−］では示しておらず、感染細胞のみにおけるＨＣＶ ＲＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼの存在を示す。この観察はウイルス複製と一致する。
【００２２】ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞の使用 本発明は、ＨＣＶのＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞への安定な取り込みに関する。そ
れにより、Ｃ型肝炎ウイルスの安定生産を可能にする。本発明の具体例の１つで
は、この安定ＨＣＶ生産セルラインを用いてウイルス複製および成熟を研究する
。
【００２３】 元の野生型Ｃ型肝炎ウイルスクローンにおけるゲノム変異は当業者に周知の方
法論を用いてなされる。つづいて、これらの変異ウイルスを上記のようにして細
胞に取り込み、それにより、変異ウイルスゲノムを安定発現する細胞を生産する
。本発明の具体例の１つでは、特異的ウイルスタンパク質における変異をウイル
スゲノムへ導入し、ウイルス粒子の複製または成熟におけるそのウイルスタンパ
ク質の役割を決定する。本発明は、特に限定されるものではないが、酵素（例え
ばＮＳ５ＴポリメラーゼまたはＮＳ３プロテアーゼ）の活性部位における変異を
包含する。該ＨＣＶポリメラーゼはウイルスゲノムの複製に必要であり、該プロ
テアーゼは成熟した、生物学的に活性なタンパク質へのポリタンパク質のプロセ
ッシングに必要である。ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞における野生型ウイルスの複製
および成熟を、野生型Ｃ型肝炎ウイルスの複製能力および成熟についてのベース
ラインとして用いる。ついで、安定して取り込まれたＣ型肝炎ウイルスの複製能
力および成熟を測定し、野生型と比較する。ウイルス粒子の複製および／または
成熟における特異的変異の影響の評価から、各ウイルスタンパク質の役割を明ら
かにする。本発明は、どのタンパク質、およびこれらのタンパク質のどの部位が
抗ウイルス干渉に関して最も適切な標的であるかを同定する。
【００２４】 Ｃ型肝炎ウイルスを安定して発現するセルラインにおけるＣ型肝炎ウイルス複
製を、当業者に周知のように、精製細胞内コア粒子から抽出したウイルスＲＮＡ
のノザンブロット分析によって決定する。同じ技術を用いて、変異ＲＮＡゲノム
を発現するセルラインにおける変異Ｃ型肝炎ウイルス複製を測定する。
【００２５】 Ｃ型肝炎ウイルスまたは遺伝子に変異を有するＣ型肝炎ウイルスを安定して発
現する細胞に、ＴＮＥ、１％ノニデットＰ−４０（ＮＰ４０）およびプロテアー
ゼ阻害剤（Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.）を含む混合物５
００μｌを添加することにより４℃で溶解させる。１０，０００×g、１分間の
遠心分離により、細胞溶解物から各および細胞片を除去する。細胞溶解物をラエ
ムリ（Laemmli）試料緩衝液と混合し、５分間煮沸し、１５％ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル（Protogel, National Diagnostics, Atlanta, Ga.）で電気泳動し
た。つづいて、分離タンパク質をインモビロン（Immobilon）−ＰＴ．ＴＭ．膜
（Millipore Co., Bedford, Mass.）（Harlow and Lane, Antibodies: A Labora
tory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, N.Y. 1988）。標準的
な方法論で、特異的ウイルスタンパク質に対して生じたペプチド抗血清を用いて
Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質を検出した。この抗体をタンパク質の免疫沈降に用
い、つづいてウエスタンブロット分析によって分析した。免疫沈降とウエスタン
ブロット分析に同じ抗体を用いた。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサ
ギまたは抗マウスＩｇＧ抗体を用いた化学ルミネッセンス法により、結合抗体を
、明らかにした（SuperSignal. TM., Pierce, Rockford, Ill.）。
【００２６】抗ウイルス化合物のスクリーニング Ｃ型肝炎ウイルス発現セルラインを用いて、Ｃ型肝炎感染における治療上の価
値を有する抗体、ペプチド、またはその他の分子を評価する。Ｃ型肝炎ウイルス
発現セルラインを用いた組織またはペプチドライブラリーのスクリーニングは、
ウイルス複製および／またはウイルス成熟を阻害または防止して機能する治療上
の分子の同定に有用である。当業者にとって慣用的であると思われる多くの方法
により、合成的および天然に存在する生産物をスクリーニングする。通常、これ
らの方法論は治療剤をＣ型肝炎ウイルス発現セルラインに接触させることおよび
ウイルス複製または成熟の阻害または防止の効力を測定することを含む。
【００２７】 本発明のもう一つの具体例では、ウイルス、詳細には、レトロウイルス、アデ
ノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに基く発現系を用いる。アデノウイルス
を発現ベクターとして用いる場合、クローニングした治療剤、特に限定するもの
ではないが、あらゆるサイトカイン（インターフェロンまたはインターロイキン
のような）、アンチセンス分子、リボザイムまたは抗ウイルス抗体断片（ｓＦｖ
）をアデノウイルス転写／翻訳調節複合体（例、後期プロモーターおよび３分割
リーダー配列）へ連結する。つづいて、組換えにより、このキメラ遺伝子をアデ
ノウイルスゲノムに挿入する。Ｃ型肝炎ウイルスを安定して生産するセルライン
において、必須でないウイルスゲノムの領域（領域Ｅ１またはＥ３）における挿
入は結果として生存可能で、クローン化治療剤を発現できる組換えウイルスを生
じる（例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A. 81:3655
-3659）。Ｃ型肝炎ウイルスを安定して生産するセルラインへの治療遺伝子配列
の挿入は、遺伝子治療の治療効力を測定することを可能にする。クローン化治療
剤の有効性は、ウイルスの複製および成熟によって評価される。ついで、有効な
薬剤を遺伝子治療として用いて、Ｃ型肝炎感染個体を処置する。
【００２８】 ウイルスｍＲＮＡの翻訳を阻害して作用するアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ
分子ならびリボザイムを包含するオリゴヌクレオチド配列は、本発明の範囲内で
ある。本明細書で用いる「アンチセンス」なる用語は、ある程度の配列相補性に
よってＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の一部にハイブリダイズ
できる核酸をいう。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は標的ｍＲＮＡへの結
合およびタンパク質翻訳の防止により直接的にｍＲＮＡの翻訳をブロックして作
用する。アンチセンスＤＮＡに関しては、翻訳開始部位（例えば、Ｃ型肝炎ウイ
ルスヌクレオチド配列の−１０〜＋１０領域が好ましい）からオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドを得た。本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスｍＲＮＡにハイブリダイズ
できる、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質配列のコード配列の少なくとも一部に相補
的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス分子を提供する。本発明はまた非コー
ド配列の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス分子も
提供する。
【００２９】 リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒できる酵素的なＲＮＡ分子である。
リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハ
イブリダイゼーションと、それに続くヌクレオチド鎖切断開裂を含む。ＨＣＶ
ＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断開裂を特異的かつ有効に触媒する、分子設計さ
れたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は本発明の範囲内である。
【００３０】 任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム開裂部位は、次の配列：ＧＵＡ
、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム開裂部位についての標的分子のスキャン
によってまず同定される。一旦同定されると、開裂部位を含む標的遺伝子の領域
に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレ
オチド配列を不適当にする、予測された構造的特徴について評価される。候補標
的の適切さはまた、リボヌクレアーゼ防御アッセイの使用による、相補的オリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのし易さを試験することによっても評
価される。
【００３１】 治療剤の、Ｃ型肝炎ウイルス複製または成熟の阻害または防止における、それ
らの有効性についてのスクリーニングは、Ｃ型肝炎ウイルス安定生産細胞へ添加
した治療剤の力価検定によって実施される。ウイルスの複製および／または成熟
を様々な公知方法によって測定する。ついで、これらの方法は、特に限定されな
いが、ウイルスＲＮＡ転写における変化の測定、分泌されたウイルス粒子のレベ
ル、またはウイルスタンパク質レベルの変化を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ［＋］細胞の構築および性質決定。
【図２】 インビトロ生成ＨＣＶ ＲＮＡ鋳型および鎖特異的プライマーを
用いたＲＴ／ＰＣＲ。
【図３】 ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞溶解物中のＨＣＶについての鎖特異的Ｒ
Ｔ／ＰＣＲ。
【図４】 ＨＣＶ ｃＤＮＡを安定的に形質移入したＨｅｐＧ２細胞由来の
塩化セシウム濃度勾配画分中のＨＣＶ ＲＮＡ。
【図５】 ＨｅｐＧ２細胞中のＨＣＶ ＲＮＡの経時的な安定生産。
【図６】 ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞または対照細胞を注入した免疫不全マウ
スの血液中のＨＣＶ ＲＮＡの存在。
【図７】 細胞性ＲＮＡと比較した、定常レベルのＨＣＶ ＲＮＡにおける
アクチノマイシンＤ処置の効果。
【図８】 ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞を注入した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ
）マウスの血清中のＲｎアーゼからの推定ＨＣＶ ＲＮＡの防御。
【図９】 ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞を注入した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ
）マウスの血清由来の勾配画分中のＨＣＶまたはｎｅｏについてのＲＮＡの検出
。
【図１０】 ＨｅｐＧ２−ＨＣＶ細胞におけるＮＳ５Ｂポリメラーゼの発現
の証明。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/576 Ｚ 33/576 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/09 15/00 ＺＮＡＡ ＺＮＡ Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA77 4B024 AA01 AA12 CA04 CA12 DA03 HA11 4B063 QA01 QQ08 QQ10 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR77 QR79 QS16 QX02 4B065 AA93X AA96X AB01 CA44 CA46 4C080 AA05 AA07 BB02 BB05 CC12 HH05 JJ04 JJ06 KK08 LL03 MM04 NN24 NN26

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 野生型Ｃ型肝炎ウイルスを安定して発現するセルライン。
  2. 【請求項２】 Ｃ型肝炎ウイルス複製を阻害または防止に有効な治療剤の同
    定方法であって、 ａ）上記Ｃ型肝炎ウイルスを安定して発現するセルラインの上記治療剤への接触
    と、 ｂ）上記Ｃ型肝炎ウイルス複製の変化の測定とを含む方法。
  3. 【請求項３】 Ｃ型肝炎ウイルス成熟を阻害または防止に有効な治療剤の同
    定方法であって、 ａ）上記Ｃ型肝炎ウイルスを安定して発現するセルラインの上記治療剤への接触
    と、 ｂ）上記Ｃ型肝炎ウイルスの成熟の変化の測定とを含む方法。
  4. 【請求項４】 クローン化治療剤の効力を同定する方法であって、 ａ）Ｃ型肝炎ウイルスを安定して生産するセルラインへの、治療遺伝子配列の挿
    入と、 ｂ）ウイルス複製および成熟の測定とを含む方法。
  5. 【請求項５】 変異Ｃ型肝炎ウイルスを安定して発現するセルライン。
  6. 【請求項６】 ウイルス複製および成熟を研究する方法であって、 ａ）上記変異Ｃ型肝炎ウイルスが発現している上記請求項５のセルラインの増殖
    、 ｂ）上記野生型Ｃ型肝炎ウイルスが発現している上記請求項１のセルラインの増
    殖、 ｃ）工程ａ）におけるウイルス複製および成熟の量の測定、 ｄ）工程ｂ）におけるウイルス複製および成熟の量の測定、および、 ｅ）工程ｃ）で測定した上記変異Ｃ型肝炎ウイルスの上記ウイルス複製および成
    熟を工程ｄ）で測定した野生型Ｃ型肝炎ウイルスのものと比較することによる上
    記変異Ｃ型肝炎ウイルスにおける変異の効果の分析を含む方法。
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