JP2000152793A - Ｒｎａウイルスの完全長遺伝子を発現するベクタ―及びその用途 - Google Patents
Ｒｎａウイルスの完全長遺伝子を発現するベクタ―及びその用途Info
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- JP2000152793A JP2000152793A JP11178347A JP17834799A JP2000152793A JP 2000152793 A JP2000152793 A JP 2000152793A JP 11178347 A JP11178347 A JP 11178347A JP 17834799 A JP17834799 A JP 17834799A JP 2000152793 A JP2000152793 A JP 2000152793A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 RNAウイルスの遺伝子をコードするcDNA
を含むベクターであって、該RNAウイルスの遺伝子の両
末端を正確かつ均一に転写できるように構築されている
ベクター、それを含む動物細胞及びRNAウイルス感染モ
デル動物、並びにそれらの細胞及びモデル動物を用いた
薬物のスクリーニング方法。 【効果】 RNAウイルス複製の機構およびRNAウイルス感
染症の発症機構の解明、治療薬および治療手段の開発等
に有用な手段を提供する。
を含むベクターであって、該RNAウイルスの遺伝子の両
末端を正確かつ均一に転写できるように構築されている
ベクター、それを含む動物細胞及びRNAウイルス感染モ
デル動物、並びにそれらの細胞及びモデル動物を用いた
薬物のスクリーニング方法。 【効果】 RNAウイルス複製の機構およびRNAウイルス感
染症の発症機構の解明、治療薬および治療手段の開発等
に有用な手段を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、RNAウイルスの完
全長遺伝子を発現することのできるベクター、それを含
む動物細胞及びRNAウイルス感染モデル動物、並びにそ
れらの細胞及びモデル動物を用いて薬物のスクリーニン
グ方法に関する。これらは、RNAウイルス複製の機構お
よびRNAウイルス感染症の発症機構の解明、治療薬およ
び治療手段の開発等に有用である。
全長遺伝子を発現することのできるベクター、それを含
む動物細胞及びRNAウイルス感染モデル動物、並びにそ
れらの細胞及びモデル動物を用いて薬物のスクリーニン
グ方法に関する。これらは、RNAウイルス複製の機構お
よびRNAウイルス感染症の発症機構の解明、治療薬およ
び治療手段の開発等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（以下「HCV」とい
う）は、輸血後非Ａ非Ｂ肝炎の主な原因ウイルスであり
（Saito, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
7, 6547-6549 (1990)）、このウイルスに起因する肝炎
は慢性化率が高く、肝硬変や肝がんに移行する率も高い
ことから、確実な治療手段の発見が急がれている疾患の
ひとつである。このウイルスのcDNAは1989年にChooらに
よりクローニングされ（Choo, Q. -L., et al., Scienc
e, 244, 359-362 (1989)）、フラビウイルス科に属する
一本鎖RNAウイルスであることも知られている（Kato,
N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 9524-
9528 (1990)）。これまでにいくつかの研究グループに
より全塩基配列およびアミノ酸配列の解明がなされいる
（Kato, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8
7, 9524-9528 (1990)、Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 8
8, 2451- 2455 (1991)、J. Virol., 65, 1105-1113 (19
91)、J. Gen. Virol., 72, 2697-2704 (1991)、Virolog
y, 188, 331-341 (1992)）。
う）は、輸血後非Ａ非Ｂ肝炎の主な原因ウイルスであり
（Saito, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
7, 6547-6549 (1990)）、このウイルスに起因する肝炎
は慢性化率が高く、肝硬変や肝がんに移行する率も高い
ことから、確実な治療手段の発見が急がれている疾患の
ひとつである。このウイルスのcDNAは1989年にChooらに
よりクローニングされ（Choo, Q. -L., et al., Scienc
e, 244, 359-362 (1989)）、フラビウイルス科に属する
一本鎖RNAウイルスであることも知られている（Kato,
N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 9524-
9528 (1990)）。これまでにいくつかの研究グループに
より全塩基配列およびアミノ酸配列の解明がなされいる
（Kato, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8
7, 9524-9528 (1990)、Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 8
8, 2451- 2455 (1991)、J. Virol., 65, 1105-1113 (19
91)、J. Gen. Virol., 72, 2697-2704 (1991)、Virolog
y, 188, 331-341 (1992)）。
【０００３】HCVのin vitro感染系の確立に関しては、
いくつかの報告があるが、その複製量の低さ等の問題
で、再現性のある安定な感染系で種々の機構の解明や治
療法の開発に活用できるような実用的な系はできていな
いのが実情である（Lanford, RE, et al., Virology, 2
02, 606(1994), Yoo, BJ, et al., J. Virol.,69,32(19
95), Shimizu, YK, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 89, 5477(1992), Kato, N., et al., Biochem. Bio
phys. Res. Comm., 206, 863(1995), Batolini,L., et
al., Res. Virol., 144,281(1993)）。
いくつかの報告があるが、その複製量の低さ等の問題
で、再現性のある安定な感染系で種々の機構の解明や治
療法の開発に活用できるような実用的な系はできていな
いのが実情である（Lanford, RE, et al., Virology, 2
02, 606(1994), Yoo, BJ, et al., J. Virol.,69,32(19
95), Shimizu, YK, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 89, 5477(1992), Kato, N., et al., Biochem. Bio
phys. Res. Comm., 206, 863(1995), Batolini,L., et
al., Res. Virol., 144,281(1993)）。
【０００４】一方、HCVを生成する別の手法として、対
応するcDNAから転写により、RNAウイルスゲノムを生成
させ、蛋白質合成を経てウイルスを生成させる方法があ
る（Racaniello, VR, Science, 214, 916(1981) 、ポリ
オウイルス）。この方法についてもこれまでいくつかの
研究グループにより精力的な検討が行われてきたが、上
述の感染系と同様に実用的な系はない（Mizuno, M, et
al., Gastroenterology,109, 1933(1995), Dash, S., e
t al., Am. J. Pathol., 151,363(1997) ）。また、cDN
Aを発現する小動物、たとえば、トランスジェニックマ
ウスについても、一部または全長cDNAを発現するマウス
の報告はあるが、ウイルス遺伝子に対応する全てのウイ
ルス蛋白質を効率良く発現できるようなものは知られて
いない（特開平9-9965号公報、特開平10-84813号公
報）。
応するcDNAから転写により、RNAウイルスゲノムを生成
させ、蛋白質合成を経てウイルスを生成させる方法があ
る（Racaniello, VR, Science, 214, 916(1981) 、ポリ
オウイルス）。この方法についてもこれまでいくつかの
研究グループにより精力的な検討が行われてきたが、上
述の感染系と同様に実用的な系はない（Mizuno, M, et
al., Gastroenterology,109, 1933(1995), Dash, S., e
t al., Am. J. Pathol., 151,363(1997) ）。また、cDN
Aを発現する小動物、たとえば、トランスジェニックマ
ウスについても、一部または全長cDNAを発現するマウス
の報告はあるが、ウイルス遺伝子に対応する全てのウイ
ルス蛋白質を効率良く発現できるようなものは知られて
いない（特開平9-9965号公報、特開平10-84813号公
報）。
【０００５】
【発明の解決しようとする課題】発明者らのこれまでの
研究により、有効な量のウイルス粒子あるいはウイルス
蛋白質が生成されない理由として、途中で生成されるウ
イルスゲノムの両末端が正確に転写されず、効率良く複
製可能な完全長の遺伝子が生成していないことが考えら
れた。本発明の目的は、完全長のウイルスゲノムを生成
する発現系を構築し、より本来のウイルス複製に近い発
現系を確立することであり、それを用いて、cDNAよりウ
イルスを発現する細胞あるいはモデル動物を樹立するこ
とにある。
研究により、有効な量のウイルス粒子あるいはウイルス
蛋白質が生成されない理由として、途中で生成されるウ
イルスゲノムの両末端が正確に転写されず、効率良く複
製可能な完全長の遺伝子が生成していないことが考えら
れた。本発明の目的は、完全長のウイルスゲノムを生成
する発現系を構築し、より本来のウイルス複製に近い発
現系を確立することであり、それを用いて、cDNAよりウ
イルスを発現する細胞あるいはモデル動物を樹立するこ
とにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、完全長のRNAウ
イルス遺伝子を発現することのできるベクターの構築に
成功し、更に、それを組み込んだ細胞株を樹立し、発明
を完成するに至った。すなわち、本発明の第一は、RNA
ウイルスの遺伝子をコードするcDNAを含むベクターであ
って、該RNAウイルスの遺伝子の両末端を正確かつ均一
に転写できるように構築されていることを特徴とするベ
クターである。
解決するために鋭意検討を重ねた結果、完全長のRNAウ
イルス遺伝子を発現することのできるベクターの構築に
成功し、更に、それを組み込んだ細胞株を樹立し、発明
を完成するに至った。すなわち、本発明の第一は、RNA
ウイルスの遺伝子をコードするcDNAを含むベクターであ
って、該RNAウイルスの遺伝子の両末端を正確かつ均一
に転写できるように構築されていることを特徴とするベ
クターである。
【０００７】本発明の第二は、上記のベクターを含むこ
とを特徴とする動物細胞である。本発明の第三は、その
細胞中に上記のベクターを含むことを特徴とするRNAウ
イルス感染モデル動物である。本発明の第四は、上記の
動物細胞、又は上記のRNAウイルス感染モデル動物を用
いたRNAウイルスの複製を阻害する薬物のスクリーニン
グ方法である。
とを特徴とする動物細胞である。本発明の第三は、その
細胞中に上記のベクターを含むことを特徴とするRNAウ
イルス感染モデル動物である。本発明の第四は、上記の
動物細胞、又は上記のRNAウイルス感染モデル動物を用
いたRNAウイルスの複製を阻害する薬物のスクリーニン
グ方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）第一発明（ベクター） 本発明のベクターは、RNAウイルスの遺伝子をコードす
るcDNAを含むベクターであって、該RNAウイルスの遺伝
子の両末端を正確かつ均一に転写できるように構築され
ていることを特徴とするものである。ここで、「両末端
を正確に転写できる」とは、cDNAから作られるRNAが、
ウイルス本来のゲノムRNAと全く同一かあるいは翻訳能
力に影響を与えない程度の塩基配列の差異しか存在しな
い、という意味である。また、「両末端を均一に転写で
きる」とは、一定の再現性をもって特定の塩基配列を持
つRNAを作ることができる、という意味である。
るcDNAを含むベクターであって、該RNAウイルスの遺伝
子の両末端を正確かつ均一に転写できるように構築され
ていることを特徴とするものである。ここで、「両末端
を正確に転写できる」とは、cDNAから作られるRNAが、
ウイルス本来のゲノムRNAと全く同一かあるいは翻訳能
力に影響を与えない程度の塩基配列の差異しか存在しな
い、という意味である。また、「両末端を均一に転写で
きる」とは、一定の再現性をもって特定の塩基配列を持
つRNAを作ることができる、という意味である。
【０００９】本発明に使用できるRNAウイルスとして
は、ポリオ、コクサッキー、エコーウイルス等のピコル
ナウイルス、レオウイルス、HCV 等のフラビウイルス属
を含むトガウイルス、オーソ、パラミキソウイルス、コ
ロナウイルス、あるいは、タバコモザイクウイルス等の
植物RNAウイルスなどを例示することができるが、これ
らに限定されるわけではない。好ましいRNAウイルスと
しては、HCVを挙げることができる。
は、ポリオ、コクサッキー、エコーウイルス等のピコル
ナウイルス、レオウイルス、HCV 等のフラビウイルス属
を含むトガウイルス、オーソ、パラミキソウイルス、コ
ロナウイルス、あるいは、タバコモザイクウイルス等の
植物RNAウイルスなどを例示することができるが、これ
らに限定されるわけではない。好ましいRNAウイルスと
しては、HCVを挙げることができる。
【００１０】RNAウイルスの遺伝子の両末端を正確かつ
均一に転写する手段としては、RNAウイルスの遺伝子を
コードするcDNAの5'末端の上流及び3'末端の下流のそれ
ぞれにセルフプロセッシングにより切断するリボザイム
をコードするDNAを配置する方法を例示することができ
るが、これに限定されるわけではない。
均一に転写する手段としては、RNAウイルスの遺伝子を
コードするcDNAの5'末端の上流及び3'末端の下流のそれ
ぞれにセルフプロセッシングにより切断するリボザイム
をコードするDNAを配置する方法を例示することができ
るが、これに限定されるわけではない。
【００１１】セルフプロセッシングにより切断するリボ
ザイムとしては、δ型肝炎ウイルス（Hepatitis Delta
Virus: HDV）リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、
ヘアピンリボザイム、インビトロおよびインビボセレク
ションにより得られる人工リボザイムなどを例示するこ
とができる。各リボザイムの塩基配列に関しては、大塚
栄子等、蛋白質・核酸・酵素 40, 1400(1995) に記載さ
れている。とくに、HDVリボザイムについては、Suh, Y-
A., et al., Nucleic Acids Research, 20, 747(1992)
に、ハンマーヘッドリボザイムについては、Shimayama,
T., et al., Biochemistry, 34, 3649(1995) に塩基配
列が記載されている。ベクター中に配置するリボザイム
をコードするDNAは、これらの文献に記載されている共
通塩基配列を参考にして、使用するRNAウイルスの種
類、塩基配列に応じて決定することができる。例えば、
HCV の場合は5'末端側にハンマーヘッドリボザイムをコ
ードするDNA（具体的な配列としては配列Ｘ）、3'末端
側にHDVリボザイムをコードするDNA（具体的な配列とし
ては配列Ｙ）が好ましいものとして挙げられる。
ザイムとしては、δ型肝炎ウイルス（Hepatitis Delta
Virus: HDV）リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、
ヘアピンリボザイム、インビトロおよびインビボセレク
ションにより得られる人工リボザイムなどを例示するこ
とができる。各リボザイムの塩基配列に関しては、大塚
栄子等、蛋白質・核酸・酵素 40, 1400(1995) に記載さ
れている。とくに、HDVリボザイムについては、Suh, Y-
A., et al., Nucleic Acids Research, 20, 747(1992)
に、ハンマーヘッドリボザイムについては、Shimayama,
T., et al., Biochemistry, 34, 3649(1995) に塩基配
列が記載されている。ベクター中に配置するリボザイム
をコードするDNAは、これらの文献に記載されている共
通塩基配列を参考にして、使用するRNAウイルスの種
類、塩基配列に応じて決定することができる。例えば、
HCV の場合は5'末端側にハンマーヘッドリボザイムをコ
ードするDNA（具体的な配列としては配列Ｘ）、3'末端
側にHDVリボザイムをコードするDNA（具体的な配列とし
ては配列Ｙ）が好ましいものとして挙げられる。
【００１２】配列番号Ｘ：CTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGG
CGAAAGCCGTC（配列番号７） 配列番号Ｙ：TGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCT
GGGCAACATTCCGAGGGGACCGTCCCCTCGGTAATGGCGAATGGGAC
（配列番号８） 本発明のベクターは、上述したようなリボザイムをコー
ドする２つのDNAとRNAウイルスをコードするDNAとを含
むDNA断片をPCRなどにより作製し、このDNA断片を適当
なプロモーターとターミネーターを含むベクターに挿入
することにより作製できる。
CGAAAGCCGTC（配列番号７） 配列番号Ｙ：TGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCT
GGGCAACATTCCGAGGGGACCGTCCCCTCGGTAATGGCGAATGGGAC
（配列番号８） 本発明のベクターは、上述したようなリボザイムをコー
ドする２つのDNAとRNAウイルスをコードするDNAとを含
むDNA断片をPCRなどにより作製し、このDNA断片を適当
なプロモーターとターミネーターを含むベクターに挿入
することにより作製できる。
【００１３】本発明のベクターは、宿主細胞内に移入さ
れた後、直ちに発現するものであってもよいが、特定の
処理によりはじめて発現を開始するものの方が好まし
い。特定の処理により発現を開始させる手段としては、
宿主細胞のRNAポリメラーゼに認識されないプロモータ
ーを使用する手段、Cre/lox 発現システム（Nat sternb
erg et al. J. Molecular Biology 150. P467-486 、特
開平10-84813号公報）を使用する手段などを例示するこ
とができる。前者の手段では、ベクター中のプロモータ
ーを認識できるRNAポリメラーゼを宿主細胞内で発現さ
せることにより、目的遺伝子の発現を開始させることが
できる。後者の手段では、Cre 酵素を宿主細胞内で発現
させることにより、目的遺伝子の発現を開始させること
ができる。
れた後、直ちに発現するものであってもよいが、特定の
処理によりはじめて発現を開始するものの方が好まし
い。特定の処理により発現を開始させる手段としては、
宿主細胞のRNAポリメラーゼに認識されないプロモータ
ーを使用する手段、Cre/lox 発現システム（Nat sternb
erg et al. J. Molecular Biology 150. P467-486 、特
開平10-84813号公報）を使用する手段などを例示するこ
とができる。前者の手段では、ベクター中のプロモータ
ーを認識できるRNAポリメラーゼを宿主細胞内で発現さ
せることにより、目的遺伝子の発現を開始させることが
できる。後者の手段では、Cre 酵素を宿主細胞内で発現
させることにより、目的遺伝子の発現を開始させること
ができる。
【００１４】（２）第二発明（動物細胞） 本発明の動物細胞は、本発明のベクター（第一発明）を
含むことを特徴とするものである。本発明の動物細胞
は、本発明のベクターを宿主となる動物細胞内に移入す
ることにより作製できる。宿主動物細胞としては、IM
Y、HuH-7、HepG2、MOLT-4、MT-2、Daudi、肝プライマリ
ー細胞、その他の肝細胞、血球系細胞由来の細胞または
細胞株などを使用することができるが、これらに限定さ
れるわけではない。ベクターを宿主内に移入する方法と
しては、Lipofection Reagant 法などを例示することが
できるが、これに限定されるわけではない。
含むことを特徴とするものである。本発明の動物細胞
は、本発明のベクターを宿主となる動物細胞内に移入す
ることにより作製できる。宿主動物細胞としては、IM
Y、HuH-7、HepG2、MOLT-4、MT-2、Daudi、肝プライマリ
ー細胞、その他の肝細胞、血球系細胞由来の細胞または
細胞株などを使用することができるが、これらに限定さ
れるわけではない。ベクターを宿主内に移入する方法と
しては、Lipofection Reagant 法などを例示することが
できるが、これに限定されるわけではない。
【００１５】（３）第三発明（RNAウイルス感染モデル
動物） 本発明のRNAウイルス感染モデル動物は、その細胞中に
本発明のベクター（第一発明）を含むことを特徴とする
ものである。本発明のRNAウイルス感染モデル動物は、
本発明のベクターを受精卵に移入した後、受精卵を仮親
に移植し、前記受精卵に由来する動物を得、その中から
組み込んだRNAウイルスの遺伝子が発現している個体を
選抜することにより作製できる。
動物） 本発明のRNAウイルス感染モデル動物は、その細胞中に
本発明のベクター（第一発明）を含むことを特徴とする
ものである。本発明のRNAウイルス感染モデル動物は、
本発明のベクターを受精卵に移入した後、受精卵を仮親
に移植し、前記受精卵に由来する動物を得、その中から
組み込んだRNAウイルスの遺伝子が発現している個体を
選抜することにより作製できる。
【００１６】受精卵への移入は、マイクロインジェクシ
ョン法など常法に従って行うことができる。対象とする
動物は、トランジェニック動物の作出技術が確立されて
いる動物であればどのようなものでもよく、マウス、ラ
ット、ウサギ、ブタ、メダカ、ゼブラフィッシュなどを
使用することができる。RNAウイルスの遺伝子が発現し
ている個体の選抜は、例えば、RNAウイルスの遺伝子に
特異的に存在する塩基配列に基づいて作製されたプライ
マーを使用したPCR などにより行うことができる。
ョン法など常法に従って行うことができる。対象とする
動物は、トランジェニック動物の作出技術が確立されて
いる動物であればどのようなものでもよく、マウス、ラ
ット、ウサギ、ブタ、メダカ、ゼブラフィッシュなどを
使用することができる。RNAウイルスの遺伝子が発現し
ている個体の選抜は、例えば、RNAウイルスの遺伝子に
特異的に存在する塩基配列に基づいて作製されたプライ
マーを使用したPCR などにより行うことができる。
【００１７】（４）第四発明（薬物のスクリーニング方
法） 本発明のRNAウイルスの複製を阻害する薬物のスクリー
ニング方法は、本発明の動物細胞（第二発明）、又は本
発明のRNAウイルス感染モデル動物（第三発明）を用い
ることを特徴とするものである。動物細胞を使用する場
合には、スクリーニングは培地内に対象薬剤を添加する
ことなどにより行うことができる。モデル動物を使用す
る場合には、スクリーニングは対象薬剤を動物に静脈内
又は経口投与することなどにより行うことができる。
法） 本発明のRNAウイルスの複製を阻害する薬物のスクリー
ニング方法は、本発明の動物細胞（第二発明）、又は本
発明のRNAウイルス感染モデル動物（第三発明）を用い
ることを特徴とするものである。動物細胞を使用する場
合には、スクリーニングは培地内に対象薬剤を添加する
ことなどにより行うことができる。モデル動物を使用す
る場合には、スクリーニングは対象薬剤を動物に静脈内
又は経口投与することなどにより行うことができる。
【００１８】
【実施例】〔実施例１〕 完全長HCV遺伝子発現ベクタ
ーの構築 （１）HCVcDNAのクローニング HCV患者血清R6（genotype Ib ）からAGPC法（Chomczyns
ky. P. et al., Anal.Biochem., 162, 156 (1987)）に
よりHCV-RNAを抽出し、得られたRNA からSuperscript I
I（Gibco-BRL）キットを用いてcDNAを合成した。患者血
清R6は、チンパンジーに感染性を示し（現在のところ、
他の実験動物に対する感染性は確認されていない）、そ
の力価は10＾4.5 CID50 であり、また、PCR 価は10＾8
である。
ーの構築 （１）HCVcDNAのクローニング HCV患者血清R6（genotype Ib ）からAGPC法（Chomczyns
ky. P. et al., Anal.Biochem., 162, 156 (1987)）に
よりHCV-RNAを抽出し、得られたRNA からSuperscript I
I（Gibco-BRL）キットを用いてcDNAを合成した。患者血
清R6は、チンパンジーに感染性を示し（現在のところ、
他の実験動物に対する感染性は確認されていない）、そ
の力価は10＾4.5 CID50 であり、また、PCR 価は10＾8
である。
【００１９】これまでに発表されているHCV遺伝子配列
（genotype I）のうち、保存性の高い領域の配列を基に
プライマーをデザインし、Pfuポリメラーゼ（Stratagen
e）でPCR増幅した。これらのDNAフラグメントは常法（M
aniatis, T., "Molecular Cloning, 2nd Ed.", CHS Pre
ss(1989) ）に従って、pBMプラスミド（特開平6-225770
号公報）にサブクローニングし、塩基配列の決定を行っ
た。HCVはクローニングの工程で容易に変異を起こすの
で、３つ以上のクローンで共通する配列を本来のウイル
ス配列とみなし、そのような配列を複数つなぎ合わせ、
全長のクローンを構築した。全長クローンの構築方法
は、特開平6-225770号公報の記載に従った。
（genotype I）のうち、保存性の高い領域の配列を基に
プライマーをデザインし、Pfuポリメラーゼ（Stratagen
e）でPCR増幅した。これらのDNAフラグメントは常法（M
aniatis, T., "Molecular Cloning, 2nd Ed.", CHS Pre
ss(1989) ）に従って、pBMプラスミド（特開平6-225770
号公報）にサブクローニングし、塩基配列の決定を行っ
た。HCVはクローニングの工程で容易に変異を起こすの
で、３つ以上のクローンで共通する配列を本来のウイル
ス配列とみなし、そのような配列を複数つなぎ合わせ、
全長のクローンを構築した。全長クローンの構築方法
は、特開平6-225770号公報の記載に従った。
【００２０】（２）pCALN/HCV RBZの作製p5'RBZの作製 まずEcoRIサイト、SwaIサイト、XhoIサイト、T7 プロ
モーター、ハンマーヘッドリボザイムおよびHCVの5'端
(1-45bp)の配列を含んだDNAをPCRで合成した。PCRは検
出DNAの増幅感度と特異性を向上させるため2ステップ法
を用いた。2ステップ法とは、まず、2種類のプライマー
で1回目のPCRを行い、(1st step PCR)。次にそのPCR産
物のDNA配列両端から内側に存在する2種類のプライマー
を用いて2回目のPCRを行う方法である(2nd step PCR)。
以下に使用したPCRプライマーの塩基配列を示す。
モーター、ハンマーヘッドリボザイムおよびHCVの5'端
(1-45bp)の配列を含んだDNAをPCRで合成した。PCRは検
出DNAの増幅感度と特異性を向上させるため2ステップ法
を用いた。2ステップ法とは、まず、2種類のプライマー
で1回目のPCRを行い、(1st step PCR)。次にそのPCR産
物のDNA配列両端から内側に存在する2種類のプライマー
を用いて2回目のPCRを行う方法である(2nd step PCR)。
以下に使用したPCRプライマーの塩基配列を示す。
【００２１】ESXT7RBZ1：5'-GCC GGA ATT CAT TTA AAT
CTC G-3'（配列番号９） ESXT7RBZ2：5'-GCC GGA ATT CAT TTA AAT CTC GAG TAA
TAC GAC TCA CTA TAG GGC TGG CCC CTG ATG AGG CCG AA
A GGC CGA AAC GGC G-3'(配列番号１０） ESXT7RBZ3：5'-GGG GAG TGA TCT ATG GTG GAG TGT CGC
CCC CAA TCG GGG GCT GGC CCG ACG GCT TTC GCC GTT TC
G GCC TTT CG-3'（配列番号１１） ESXT7RBZ4：5'-GGG GAG TGA TCT ATG GTG G-3'（配列番
号１２）
CTC G-3'（配列番号９） ESXT7RBZ2：5'-GCC GGA ATT CAT TTA AAT CTC GAG TAA
TAC GAC TCA CTA TAG GGC TGG CCC CTG ATG AGG CCG AA
A GGC CGA AAC GGC G-3'(配列番号１０） ESXT7RBZ3：5'-GGG GAG TGA TCT ATG GTG GAG TGT CGC
CCC CAA TCG GGG GCT GGC CCG ACG GCT TTC GCC GTT TC
G GCC TTT CG-3'（配列番号１１） ESXT7RBZ4：5'-GGG GAG TGA TCT ATG GTG G-3'（配列番
号１２）
【００２２】PCR反応液は、0.5mlチューブに10X Thermo
Pol Buffer(10mM KCl、20mM Tris-HCl pH8.8、10mM (NH
4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X-100)を5μl、20mM
dNTPmixture を0.5μl、10pmol/μlのtemplate兼1st st
ep プライマー 2種(ESXT7RBZ2、 ESXT7RBZ3)を5μlず
つ、2units/μlのvent DNA polymerase(Biolabs)を0.5
μl加え滅菌水で50μlに調製した。PCRはまず96℃で30
秒間加熱した後、変性96℃30秒間、アニーリング58℃15
秒間、伸長72℃40秒間の条件で20サイクル行った。増幅
された配列を配列番号１に示す。
Pol Buffer(10mM KCl、20mM Tris-HCl pH8.8、10mM (NH
4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X-100)を5μl、20mM
dNTPmixture を0.5μl、10pmol/μlのtemplate兼1st st
ep プライマー 2種(ESXT7RBZ2、 ESXT7RBZ3)を5μlず
つ、2units/μlのvent DNA polymerase(Biolabs)を0.5
μl加え滅菌水で50μlに調製した。PCRはまず96℃で30
秒間加熱した後、変性96℃30秒間、アニーリング58℃15
秒間、伸長72℃40秒間の条件で20サイクル行った。増幅
された配列を配列番号１に示す。
【００２３】次に新しい0.5mlチューブに1st PCR反応終
了液を0.5μl、10X ThermoPol buffer(10mM KCl、20mM
Tris-HCl pH8.8、(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Ttiton
X-100)を5μl、20mM dNTP mixture を0.5μl、10pmol/
μlの2nd step プライマー 2種(ESXT7RBZ1、ESXT7RBZ4)
を2μlずつ、2units/μlのvent DNA polymerase(Biolab
s)を0.5μlを加え滅菌水で50μlに調製した。PCR反応は
先の条件で行った。このPCR反応液をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動し、特異的に増幅した目的の断片をゲル
から抽出した。目的の断片の抽出は、以下のようにして
行った。まず、チャンバーのゲルコンポーネント側に通
常の透析膜をセットし、ついでDNAコレクティング側にS
artorius透析膜をセットした。電気溶出装置のチャンバ
ーの外側に2xTBEを、内側に0.1xTBE-0.005%SDSを入れた
後、切り出しておいた目的のDNA断片を含んだゲルを、
チャンバーのゲルコンポーネント側に置き、 DNAコレク
ティングコンポーネント側にXylene cyanoleを含んだTE
を数μl加えた。150Vで1時間電気泳動を行った後、電極
を変えてさらに45秒間泳動した。泳動装置からチャンバ
ーをはずし、DNAコレクティングコンポーネント側に約3
00μl溶液が残るまでチャンバー内の溶液を除去した。
残った300μlの溶液を回収した後、DNAコレクティング
コンポーネントを100μlでwashし、その液も先の溶液に
加えた。回収した溶液についてフェノール、クロロホル
ム抽出を行い、エタノール沈殿をした後、10μlのTEに
溶解した。抽出した一部をポリアクリルアミドゲル電気
泳動し、濃度を20ng/μlと概算した。このPCR産物をESX
T7RBZ PCR productと命名した。増幅された配列は配列
番号１に示した配列と同一である。
了液を0.5μl、10X ThermoPol buffer(10mM KCl、20mM
Tris-HCl pH8.8、(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Ttiton
X-100)を5μl、20mM dNTP mixture を0.5μl、10pmol/
μlの2nd step プライマー 2種(ESXT7RBZ1、ESXT7RBZ4)
を2μlずつ、2units/μlのvent DNA polymerase(Biolab
s)を0.5μlを加え滅菌水で50μlに調製した。PCR反応は
先の条件で行った。このPCR反応液をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動し、特異的に増幅した目的の断片をゲル
から抽出した。目的の断片の抽出は、以下のようにして
行った。まず、チャンバーのゲルコンポーネント側に通
常の透析膜をセットし、ついでDNAコレクティング側にS
artorius透析膜をセットした。電気溶出装置のチャンバ
ーの外側に2xTBEを、内側に0.1xTBE-0.005%SDSを入れた
後、切り出しておいた目的のDNA断片を含んだゲルを、
チャンバーのゲルコンポーネント側に置き、 DNAコレク
ティングコンポーネント側にXylene cyanoleを含んだTE
を数μl加えた。150Vで1時間電気泳動を行った後、電極
を変えてさらに45秒間泳動した。泳動装置からチャンバ
ーをはずし、DNAコレクティングコンポーネント側に約3
00μl溶液が残るまでチャンバー内の溶液を除去した。
残った300μlの溶液を回収した後、DNAコレクティング
コンポーネントを100μlでwashし、その液も先の溶液に
加えた。回収した溶液についてフェノール、クロロホル
ム抽出を行い、エタノール沈殿をした後、10μlのTEに
溶解した。抽出した一部をポリアクリルアミドゲル電気
泳動し、濃度を20ng/μlと概算した。このPCR産物をESX
T7RBZ PCR productと命名した。増幅された配列は配列
番号１に示した配列と同一である。
【００２４】さらにHCV 5'端からcore領域の一部(26-61
3bp)までのDNAをPCRで合成した。以下に使用したPCRプ
ライマーの配列を示す。 ESXT7RBZ5：5'-CCA CCA TAG ATC ACT CCC C-3'（配列番
号１３） ESXT7RBZ6：5'-ATG CCC TCG TTG CCA TAG AG-3'（配列
番号１４）
3bp)までのDNAをPCRで合成した。以下に使用したPCRプ
ライマーの配列を示す。 ESXT7RBZ5：5'-CCA CCA TAG ATC ACT CCC C-3'（配列番
号１３） ESXT7RBZ6：5'-ATG CCC TCG TTG CCA TAG AG-3'（配列
番号１４）
【００２５】PCR反応液は0.5mlチューブに10X ThermoPo
l Buffer(10mM KCl、20mM Tris-HClpH8.8、10mM (NH4)2
SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X-100)を10μl、20mM dN
TPmixture を1μl、10pmol/μlのプライマー 2種(ESXT7
RBZ5、 ESXT7RBZ6)を4μlずつ、2units/μlのvent DNA
polymerase(Biolabs)を1μl、1μg/μlのtemplate(pT70
2R6 14-8)を1μl加え滅菌水で100μlに調製した。PCRは
96℃で30秒間加熱した後、変性96℃30秒間、アニーリン
グ58℃15秒間、伸長72℃40秒間の条件で20サイクル行っ
た。このPCR反応終了液をアガロースゲル電気泳動し、
特異的に増幅した目的の断片をQIAEX II Agarose Gel E
xtraction(QIAGEN)を用いてゲルから抽出した。目的の
断片の抽出は、以下のようにして行った。まずゲル切り
出し、その3倍量のQX1 Bufferを添加し、ついでQIAEX I
Iを10μl加え、50℃で10分間インキュベーションした。
この際2分毎に振ってQIAEX IIを混和させた。インキュ
ベーション後、遠心し、上清を除去し、その後、沈殿物
をPE Bufferで2回洗浄、約15分程度風乾し、滅菌水を20
μl加え、沈殿物を再懸濁させ、室温で5分間インキュベ
ーションし、遠心後、上清を回収した。抽出した一部を
アガロースゲル電気泳動し、濃度を200ng/μlと概算し
た。このPCR産物を5'-HCV PCR productと命名した。増
幅された配列を配列番号２に示した。
l Buffer(10mM KCl、20mM Tris-HClpH8.8、10mM (NH4)2
SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X-100)を10μl、20mM dN
TPmixture を1μl、10pmol/μlのプライマー 2種(ESXT7
RBZ5、 ESXT7RBZ6)を4μlずつ、2units/μlのvent DNA
polymerase(Biolabs)を1μl、1μg/μlのtemplate(pT70
2R6 14-8)を1μl加え滅菌水で100μlに調製した。PCRは
96℃で30秒間加熱した後、変性96℃30秒間、アニーリン
グ58℃15秒間、伸長72℃40秒間の条件で20サイクル行っ
た。このPCR反応終了液をアガロースゲル電気泳動し、
特異的に増幅した目的の断片をQIAEX II Agarose Gel E
xtraction(QIAGEN)を用いてゲルから抽出した。目的の
断片の抽出は、以下のようにして行った。まずゲル切り
出し、その3倍量のQX1 Bufferを添加し、ついでQIAEX I
Iを10μl加え、50℃で10分間インキュベーションした。
この際2分毎に振ってQIAEX IIを混和させた。インキュ
ベーション後、遠心し、上清を除去し、その後、沈殿物
をPE Bufferで2回洗浄、約15分程度風乾し、滅菌水を20
μl加え、沈殿物を再懸濁させ、室温で5分間インキュベ
ーションし、遠心後、上清を回収した。抽出した一部を
アガロースゲル電気泳動し、濃度を200ng/μlと概算し
た。このPCR産物を5'-HCV PCR productと命名した。増
幅された配列を配列番号２に示した。
【００２６】上記2種類のゲル抽出PCR産物(ESXT7RBZ PC
R product、5'-HCV PCR product)を用いてEcoRIサイ
ト、SwaIサイト、XhoIサイト、T7プロモーター、ハンマ
ーヘッドリボザイムおよびHCVの5'端からcore領域の一
部(1-613bp)までを含んだ目的のcDNAをPCRで合成した。
PCR反応液は0.5mlチューブに10X ThermoPol Buffer(10m
MKCl、20mM Tris-HCl pH8.8、10mM (NH4)2SO4、2mM MgS
O4、0.1% Triton X-100)を5μl、20mM dNTP mixture 0.
5μl、10pmol/μlのプライマー 2種(ESXT7RBZ1、ESXT7R
BZ6)を2μlずつ、2units/μlのvent DNA polymerase(Bi
olabs)を0.5μl、templateとして4ng/μlのESXT7RBZ PC
R product、5'-HCV PCR productをそれぞれ1μl加え、
滅菌水で50μlに調製した。PCRは96℃で30秒間加熱した
後、変性96℃30秒間、アニーリング58℃15秒間、伸長72
℃40秒間の条件で20サイクル行った。このPCR product
を5'-ribozyme PCR productと命名した。増幅された配
列を配列番号３に示した。
R product、5'-HCV PCR product)を用いてEcoRIサイ
ト、SwaIサイト、XhoIサイト、T7プロモーター、ハンマ
ーヘッドリボザイムおよびHCVの5'端からcore領域の一
部(1-613bp)までを含んだ目的のcDNAをPCRで合成した。
PCR反応液は0.5mlチューブに10X ThermoPol Buffer(10m
MKCl、20mM Tris-HCl pH8.8、10mM (NH4)2SO4、2mM MgS
O4、0.1% Triton X-100)を5μl、20mM dNTP mixture 0.
5μl、10pmol/μlのプライマー 2種(ESXT7RBZ1、ESXT7R
BZ6)を2μlずつ、2units/μlのvent DNA polymerase(Bi
olabs)を0.5μl、templateとして4ng/μlのESXT7RBZ PC
R product、5'-HCV PCR productをそれぞれ1μl加え、
滅菌水で50μlに調製した。PCRは96℃で30秒間加熱した
後、変性96℃30秒間、アニーリング58℃15秒間、伸長72
℃40秒間の条件で20サイクル行った。このPCR product
を5'-ribozyme PCR productと命名した。増幅された配
列を配列番号３に示した。
【００２７】5'-ribozyme PCR productに4倍量のクロロ
ホルムと3倍量のTE bufferを混和し、遠心後、その水層
を1.5mlチューブに移し、2.35倍量の100%エタノールと1
/4量の3M酢酸ナトリウムと1μg/μlのグリコーゲンを1
μl加え、エタノール沈殿(-80℃、20分間)を行い、最終
的に滅菌水20μlに溶解した。精製した5'-ribozyme PCR
product(10μl)を制限酵素反応液(10mM Tris-HCl pH7.
5、10mM MgCl2、1mM Dithiothreitol)20μl中でKpnI 1
μlで消化(37℃、1.5時間)後、1M塩化ナトリウムを2μl
を添加しさらにEcoRI 1μlで二重消化(37℃、2.5時間)
した。
ホルムと3倍量のTE bufferを混和し、遠心後、その水層
を1.5mlチューブに移し、2.35倍量の100%エタノールと1
/4量の3M酢酸ナトリウムと1μg/μlのグリコーゲンを1
μl加え、エタノール沈殿(-80℃、20分間)を行い、最終
的に滅菌水20μlに溶解した。精製した5'-ribozyme PCR
product(10μl)を制限酵素反応液(10mM Tris-HCl pH7.
5、10mM MgCl2、1mM Dithiothreitol)20μl中でKpnI 1
μlで消化(37℃、1.5時間)後、1M塩化ナトリウムを2μl
を添加しさらにEcoRI 1μlで二重消化(37℃、2.5時間)
した。
【００２８】クローニングベクターにはpBMを用いた。H
CV遺伝子は複製時に変異が導入されやすい可能性があ
り、クローニング時にもそのことが懸念される。そこで
クローニング時に発生する人為的な変異を極力少なくす
るために構築されたベクターがpBMである。pBR322の制
限酵素EcoRVサイトからBalIサイトの間の配列を制限酵
素で欠失させ、EcoRIサイトとHindIIIサイトの間にpUC1
19のマルチクローニングサイトのEcoRIサイトからHindI
IIサイトまでを組み込み、次にpBR322のVspIサイトから
ScaIサイトの間の配列をpUC119のVspIサイトからScaIサ
イトの配列に置き換え、この間のPstIサイトを欠失させ
てpBMベクターが作製されている。
CV遺伝子は複製時に変異が導入されやすい可能性があ
り、クローニング時にもそのことが懸念される。そこで
クローニング時に発生する人為的な変異を極力少なくす
るために構築されたベクターがpBMである。pBR322の制
限酵素EcoRVサイトからBalIサイトの間の配列を制限酵
素で欠失させ、EcoRIサイトとHindIIIサイトの間にpUC1
19のマルチクローニングサイトのEcoRIサイトからHindI
IIサイトまでを組み込み、次にpBR322のVspIサイトから
ScaIサイトの間の配列をpUC119のVspIサイトからScaIサ
イトの配列に置き換え、この間のPstIサイトを欠失させ
てpBMベクターが作製されている。
【００２９】0.25μg/μlのpBM 10μlを制限酵素反応液
(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM Dithiothreit
ol)100μl中でKpnI 1μlで消化(37℃、1.5時間)後、1M
塩化ナトリウムを10μlを添加しさらにEcoRI 1μlで二
重消化(37℃、2時間)した。酵素反応終了液に22units/
μlのCIAP(子牛小腸由来、宝酒造) 5μlを添加し、37
℃、30分間反応を行い、5'末端の脱リン酸化を行った。
(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM Dithiothreit
ol)100μl中でKpnI 1μlで消化(37℃、1.5時間)後、1M
塩化ナトリウムを10μlを添加しさらにEcoRI 1μlで二
重消化(37℃、2時間)した。酵素反応終了液に22units/
μlのCIAP(子牛小腸由来、宝酒造) 5μlを添加し、37
℃、30分間反応を行い、5'末端の脱リン酸化を行った。
【００３０】KpnI、EcoRIで消化した5'-ribozyme PCR p
roductとKpnI、EcoRIで消化後アルカリフォスファター
ゼ処理を行ったpBMをアガロースゲル電気泳動し、目的
のDNA断片およびクローニングベクターをゲルから抽出
(QIAEX II)し、滅菌水20μlに溶解した。これらの一部
をアガロースゲル電気泳動し、濃度をKpnI、EcoRIで消
化した5'-ribozyme PCR product(DNA断片)は30ng/μl、
KpnI、EcoRIで消化後アルカリフォスファターゼ処理を
行ったpBM(クローニングベクター)は20ng/μlと概算し
た。5'-ribozyme PCR product(DNA断片)を1μl、pBM(ク
ローニングベクター)を1μl、DNA Ligation Kit Ver.2
(宝酒造)のsolution Iを6μl、滅菌水を4μl混和し、16
℃で1時間ライゲーション反応を行った。
roductとKpnI、EcoRIで消化後アルカリフォスファター
ゼ処理を行ったpBMをアガロースゲル電気泳動し、目的
のDNA断片およびクローニングベクターをゲルから抽出
(QIAEX II)し、滅菌水20μlに溶解した。これらの一部
をアガロースゲル電気泳動し、濃度をKpnI、EcoRIで消
化した5'-ribozyme PCR product(DNA断片)は30ng/μl、
KpnI、EcoRIで消化後アルカリフォスファターゼ処理を
行ったpBM(クローニングベクター)は20ng/μlと概算し
た。5'-ribozyme PCR product(DNA断片)を1μl、pBM(ク
ローニングベクター)を1μl、DNA Ligation Kit Ver.2
(宝酒造)のsolution Iを6μl、滅菌水を4μl混和し、16
℃で1時間ライゲーション反応を行った。
【００３１】ライゲーション反応終了液10μlを大腸菌D
H5α株(コンピテントセル)100μlに添加し、氷上に30分
間置いた後、42℃で30秒間のヒートショックを行い、再
度氷上に2分間置いた後、SOC培地900μlに加え、37℃で
1時間インキュベーションした。形質転換菌はLB-Ampプ
レート(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%塩化
ナトリウム、1.5%寒天、アンピシリン100μg/ml)上で一
夜培養した後、プレート上に出現したコロニーをそれぞ
れ4ml LB-Amp培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキ
ス、1%塩化ナトリウム、アンピシリン75μg/ml)の入っ
た13mlチューブで培養(37℃、6時間)し、培養液を遠心
して集菌し、プラスミドDNAをQIAprep Spin Plasmids K
its(QIAGEN社製)を用いてミニプレパレーションを行い2
0μlのDNA液を調製した。ミニプレパレーションは、以
下のようにして行った。まず、菌体ペレットにP1 Buffe
rを250μl加え、懸濁させ、次にP2 Bufferを250μl添加
し、混和させ室温で5分間反応させた。反応後、即座に
冷N3 Buffer 350μlを加え、氷上に5分間置いた後、遠
心を行い、上清を2mlのmicrocentrifuge tubeに置かれ
たQIAprep-spin columnに移し、再度遠心した。flowthr
ough fractionを除去し、洗浄のため750μlのPE Buffer
をQIAprep-spin columnに加え、遠心を行い、flowthrou
gh fractionを除去し、再度遠心を行い完全にPE Buffer
を除去した。QIAprep-spin columnを1.5mlチューブに移
し、TEを適当量加え、遠心し、プラスミドを溶出させ
た。
H5α株(コンピテントセル)100μlに添加し、氷上に30分
間置いた後、42℃で30秒間のヒートショックを行い、再
度氷上に2分間置いた後、SOC培地900μlに加え、37℃で
1時間インキュベーションした。形質転換菌はLB-Ampプ
レート(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%塩化
ナトリウム、1.5%寒天、アンピシリン100μg/ml)上で一
夜培養した後、プレート上に出現したコロニーをそれぞ
れ4ml LB-Amp培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキ
ス、1%塩化ナトリウム、アンピシリン75μg/ml)の入っ
た13mlチューブで培養(37℃、6時間)し、培養液を遠心
して集菌し、プラスミドDNAをQIAprep Spin Plasmids K
its(QIAGEN社製)を用いてミニプレパレーションを行い2
0μlのDNA液を調製した。ミニプレパレーションは、以
下のようにして行った。まず、菌体ペレットにP1 Buffe
rを250μl加え、懸濁させ、次にP2 Bufferを250μl添加
し、混和させ室温で5分間反応させた。反応後、即座に
冷N3 Buffer 350μlを加え、氷上に5分間置いた後、遠
心を行い、上清を2mlのmicrocentrifuge tubeに置かれ
たQIAprep-spin columnに移し、再度遠心した。flowthr
ough fractionを除去し、洗浄のため750μlのPE Buffer
をQIAprep-spin columnに加え、遠心を行い、flowthrou
gh fractionを除去し、再度遠心を行い完全にPE Buffer
を除去した。QIAprep-spin columnを1.5mlチューブに移
し、TEを適当量加え、遠心し、プラスミドを溶出させ
た。
【００３２】調製したDNA溶液20μlのうち16μlを制限
酵素反応液(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM Di
thiothreitol)18μl中でKpnI 0.5μlで消化(37℃、40分
間)後、1M塩化ナトリウムを2μl、EcoRIを0.5μlを添加
し、二重消化(37℃、40分間)した。酵素反応終了液をア
ガロースゲル電気泳動し、目的のDNA断片が挿入された
クローンを得た。このクローンをp5'RBZと命名した。
酵素反応液(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM Di
thiothreitol)18μl中でKpnI 0.5μlで消化(37℃、40分
間)後、1M塩化ナトリウムを2μl、EcoRIを0.5μlを添加
し、二重消化(37℃、40分間)した。酵素反応終了液をア
ガロースゲル電気泳動し、目的のDNA断片が挿入された
クローンを得た。このクローンをp5'RBZと命名した。
【００３３】3' RBZ PCR productの作製 HCV遺伝子の3'端(9073-9609bp)、HDV リボザイム、XbaI
サイト、SwaIサイト、HindIIIサイトを含んだDNAをPCR
で合成した。以下に使用したPCRプライマーの配列を示
す。 HDRBZ1 5'-TTG GGG TAC CAC CCT TGC G-3'（配列番号
１５） HDRBZ2 5'-ACA TGA TCT GCA GAG AGG CC-3'（配列番号
１６） HDRBZ3 5'-GGC CTC TCT GCA GAT CAT GTG GCC GGC ATG
GTC CCA G-3'（配列番号１７） HDRBZ4 5'-GCC CAA GCT TAT TTA AAT CTA GAG TCC CAT
TCG CCA TTA CCG AG-3'（配列番号１８）
サイト、SwaIサイト、HindIIIサイトを含んだDNAをPCR
で合成した。以下に使用したPCRプライマーの配列を示
す。 HDRBZ1 5'-TTG GGG TAC CAC CCT TGC G-3'（配列番号
１５） HDRBZ2 5'-ACA TGA TCT GCA GAG AGG CC-3'（配列番号
１６） HDRBZ3 5'-GGC CTC TCT GCA GAT CAT GTG GCC GGC ATG
GTC CCA G-3'（配列番号１７） HDRBZ4 5'-GCC CAA GCT TAT TTA AAT CTA GAG TCC CAT
TCG CCA TTA CCG AG-3'（配列番号１８）
【００３４】まずHCV遺伝子の3'端(9073-9609bp)の配列
を含んだcDNAをPCRで合成した。PCR反応液は0.5mlチュ
ーブに10X ThermoPol Buffer(10mM KCl、20mM Tris-HCl
pH8.8、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X-1
00)を5μl、20mM dNTP mixture 0.5μl、template(N25-
3'X+6)を0.5μl、10pmol/μlのプライマー 2種(HDRBZ
1、HDRBZ2)を2μlずつ、2units/μlのvent DNA polymer
ase(Biolabs)を0.5μlを加え滅菌水で50μl(x2)に調製
した。PCRはまず96℃で30秒間加熱した後、変性96℃30
秒間、アニーリング58℃15秒間、伸長72℃40秒間の条件
で20サイクル行った。この反応終了液を低融点アガロー
スゲル電気泳動し、特異的に増幅した目的の断片をGene
CleanIIを用いてゲルから抽出した。 Gene CleanIIを
用いた抽出は以下のようにして行った。まず目的のDNA
断片を含んだゲルを切り出し、3倍量のNaI stock solut
ionを添加し、50℃で10分間インキュベーションしてゲ
ルを融解させた後、GLSSMILK suspensionを5μl加え、
さらに50℃で5分間インキュベーションし、遠心した。
遠心後、上清を除去し、300μlのNEW WASHを加え沈殿物
を洗浄した。この操作を3回繰り返した後、沈殿物に滅
菌水を15μl添加し、DNA断片を溶出させた。抽出したDN
A断片の一部をアガロースゲル電気泳動し、濃度を20ng/
μlと概算した。このPCR産物を3' productと命名した。
増幅された配列を配列番号４に示した。
を含んだcDNAをPCRで合成した。PCR反応液は0.5mlチュ
ーブに10X ThermoPol Buffer(10mM KCl、20mM Tris-HCl
pH8.8、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X-1
00)を5μl、20mM dNTP mixture 0.5μl、template(N25-
3'X+6)を0.5μl、10pmol/μlのプライマー 2種(HDRBZ
1、HDRBZ2)を2μlずつ、2units/μlのvent DNA polymer
ase(Biolabs)を0.5μlを加え滅菌水で50μl(x2)に調製
した。PCRはまず96℃で30秒間加熱した後、変性96℃30
秒間、アニーリング58℃15秒間、伸長72℃40秒間の条件
で20サイクル行った。この反応終了液を低融点アガロー
スゲル電気泳動し、特異的に増幅した目的の断片をGene
CleanIIを用いてゲルから抽出した。 Gene CleanIIを
用いた抽出は以下のようにして行った。まず目的のDNA
断片を含んだゲルを切り出し、3倍量のNaI stock solut
ionを添加し、50℃で10分間インキュベーションしてゲ
ルを融解させた後、GLSSMILK suspensionを5μl加え、
さらに50℃で5分間インキュベーションし、遠心した。
遠心後、上清を除去し、300μlのNEW WASHを加え沈殿物
を洗浄した。この操作を3回繰り返した後、沈殿物に滅
菌水を15μl添加し、DNA断片を溶出させた。抽出したDN
A断片の一部をアガロースゲル電気泳動し、濃度を20ng/
μlと概算した。このPCR産物を3' productと命名した。
増幅された配列を配列番号４に示した。
【００３５】次にHCV遺伝子の3'端(9590-9609bp)とHDV
リボザイム、XbaIサイト、SwaIサイト、HindIIIサイト
を含んだcDNAをPCRで合成した。0.5mlチューブに10X Th
ermoPol buffer(10mM KCl、20mM Tris-HCl pH8.8、10mM
(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1%Triton X-100)を5μl、20
mM dNTP mixture 0.5μl、template(Cis-HDV-88)を0.4
μl、10pmol/μlのプライマー 2種(HDRBZ3、HDRBZ4)を2
μlずつ、2units/μlのvent DNA polymerase(Biolabs)
を0.5μlを加え滅菌水で50μl(x4)に調製した。PCRはま
ず96℃で30秒間加熱した後、変性96℃30秒間、アニーリ
ング58℃15秒間、伸長72℃40秒間の条件で20サイクル行
った。このPCR反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳
動し、特異的に増幅した目的の断片をゲルから抽出し
た。抽出したDNA断片の一部をポリアクリルアミドゲル
電気泳動し、濃度を50ng/μlと概算した。このPCR産物
をRibo productと命名した。増幅された配列を配列番号
５に示した。
リボザイム、XbaIサイト、SwaIサイト、HindIIIサイト
を含んだcDNAをPCRで合成した。0.5mlチューブに10X Th
ermoPol buffer(10mM KCl、20mM Tris-HCl pH8.8、10mM
(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1%Triton X-100)を5μl、20
mM dNTP mixture 0.5μl、template(Cis-HDV-88)を0.4
μl、10pmol/μlのプライマー 2種(HDRBZ3、HDRBZ4)を2
μlずつ、2units/μlのvent DNA polymerase(Biolabs)
を0.5μlを加え滅菌水で50μl(x4)に調製した。PCRはま
ず96℃で30秒間加熱した後、変性96℃30秒間、アニーリ
ング58℃15秒間、伸長72℃40秒間の条件で20サイクル行
った。このPCR反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳
動し、特異的に増幅した目的の断片をゲルから抽出し
た。抽出したDNA断片の一部をポリアクリルアミドゲル
電気泳動し、濃度を50ng/μlと概算した。このPCR産物
をRibo productと命名した。増幅された配列を配列番号
５に示した。
【００３６】上記2種類の抽出PCR産物(3' product、Rib
o product)を用いてHCV遺伝子3'端およびHDV リボザイ
ム、XbaIサイト、SwaIサイト、HindIIIサイトを含んだ
目的のDNAをPCRで合成した。PCR反応液は0.5mlチューブ
に10X ThermoPol Buffer(10mM KCl、20mM Tris-HCl pH
8.8、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X-100)
を5μl、20mM dNTP mixture 0.5μl、10pmol/μlのプラ
イマー 2種(HDRBZ1、HDRBZ4)を2μl、2units/μlのvent
DNA polymerase(Biolabs)を0.5μl、templateとして10
ng/μlの3' product、5ng/μlの5'-Ribo productをそれ
ぞれ2μl加え、滅菌水で50μl(x2)に調製した。PCRは96
℃で30秒間加熱した後、変性96℃30秒間、アニーリング
58℃15秒間、伸長72℃40秒間の条件で20サイクル行っ
た。PCR product(90μl)をフェノール、クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿を行い、滅菌水45μlに溶解し
た。このPCR productを3'-terminal region PCR produc
tと命名した。増幅された配列を配列番号６に示した。
o product)を用いてHCV遺伝子3'端およびHDV リボザイ
ム、XbaIサイト、SwaIサイト、HindIIIサイトを含んだ
目的のDNAをPCRで合成した。PCR反応液は0.5mlチューブ
に10X ThermoPol Buffer(10mM KCl、20mM Tris-HCl pH
8.8、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X-100)
を5μl、20mM dNTP mixture 0.5μl、10pmol/μlのプラ
イマー 2種(HDRBZ1、HDRBZ4)を2μl、2units/μlのvent
DNA polymerase(Biolabs)を0.5μl、templateとして10
ng/μlの3' product、5ng/μlの5'-Ribo productをそれ
ぞれ2μl加え、滅菌水で50μl(x2)に調製した。PCRは96
℃で30秒間加熱した後、変性96℃30秒間、アニーリング
58℃15秒間、伸長72℃40秒間の条件で20サイクル行っ
た。PCR product(90μl)をフェノール、クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿を行い、滅菌水45μlに溶解し
た。このPCR productを3'-terminal region PCR produc
tと命名した。増幅された配列を配列番号６に示した。
【００３７】この内45μlを制限酵素反応液(10mM Tris-
HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM Dithiothreitol)51.5μl
中でKpnI 1.5μlで消化(37℃、45分間)後、5M塩化ナト
リウムを0.5μlを添加しさらにHindIII 1.5μlで二重消
化(37℃、1時間)した。反応後、アガロースゲル電気泳
動し、特異的に増幅した目的の断片をQIAEX II Agarose
Gel Extraction(QIAGEN)を用いてゲルから抽出し、滅菌
水15μlに溶解した。
HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM Dithiothreitol)51.5μl
中でKpnI 1.5μlで消化(37℃、45分間)後、5M塩化ナト
リウムを0.5μlを添加しさらにHindIII 1.5μlで二重消
化(37℃、1時間)した。反応後、アガロースゲル電気泳
動し、特異的に増幅した目的の断片をQIAEX II Agarose
Gel Extraction(QIAGEN)を用いてゲルから抽出し、滅菌
水15μlに溶解した。
【００３８】p5'-3'RBZの構築 p5'RBZをKpnI、HindIIIで消化後、CIAPでアルカリフォ
スファターゼ処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、
ゲルからクローニングベクター用のDNA断片をQIAEX II
Agarose Gel Extraction(QIAGEN)を用いて抽出した。こ
の一部をアガロースゲル電気泳動し、濃度を40ng/μlと
概算した。
スファターゼ処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、
ゲルからクローニングベクター用のDNA断片をQIAEX II
Agarose Gel Extraction(QIAGEN)を用いて抽出した。こ
の一部をアガロースゲル電気泳動し、濃度を40ng/μlと
概算した。
【００３９】KpnI、HindIIIで消化後、ゲル抽出した3'-
terminal region PCR productの一部をアガロースゲル
電気泳動し、濃度を20ng/μlと概算した。8ng/μlのp5'
RBZ(クローニングベクター)を1μl、20ng/μlの3'-term
inal region PCR product(DNA断片)を1μl、DNA Ligati
on Kit Ver.2(宝酒造)のsolution Iを6μl、滅菌水を4
μl混和し、16℃で一夜ライゲーション反応を行った。
ライゲーション反応終了液10μlを大腸菌DH5α株100μl
に添加し、氷上に30分間置いた後、42℃で30秒間のヒー
トショックを行い、再度氷上に2分間置いた後、SOC培地
900μlに加え、37℃で1.5時間インキュベーションし
た。形質転換菌はLB-Ampプレート(1%バクトトリプト
ン、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、1.5%寒天、ア
ンピシリン100μg/ml)上で一夜培養した後、プレート上
に出現したコロニーをそれぞれ4ml LB-Amp培地(1%バク
トトリプトン、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、ア
ンピシリン75μg/ml)の入った13mlチューブで培養(37
℃、一夜)し、培養液を遠心して集菌し、プラスミドDNA
をQIAprep Spin Plasmids Kits(QIAGEN社製)を用いてミ
ニプレパレーションして30μlのDNA液を調製した。内20
μlを制限酵素反応液(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl
2、1mM Dithiothreitol、50mM NaCl)22.8μl中でHindII
I0.5μlで消化(37℃、40分間)後、0.5M塩化ナトリウム
を2.6μl、EcoRIを0.5μlを添加し、二重消化(37℃、40
分間)した。酵素反応終了液をアガロースゲル電気泳動
し、目的のDNA断片が挿入されたクローンを得た。
terminal region PCR productの一部をアガロースゲル
電気泳動し、濃度を20ng/μlと概算した。8ng/μlのp5'
RBZ(クローニングベクター)を1μl、20ng/μlの3'-term
inal region PCR product(DNA断片)を1μl、DNA Ligati
on Kit Ver.2(宝酒造)のsolution Iを6μl、滅菌水を4
μl混和し、16℃で一夜ライゲーション反応を行った。
ライゲーション反応終了液10μlを大腸菌DH5α株100μl
に添加し、氷上に30分間置いた後、42℃で30秒間のヒー
トショックを行い、再度氷上に2分間置いた後、SOC培地
900μlに加え、37℃で1.5時間インキュベーションし
た。形質転換菌はLB-Ampプレート(1%バクトトリプト
ン、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、1.5%寒天、ア
ンピシリン100μg/ml)上で一夜培養した後、プレート上
に出現したコロニーをそれぞれ4ml LB-Amp培地(1%バク
トトリプトン、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、ア
ンピシリン75μg/ml)の入った13mlチューブで培養(37
℃、一夜)し、培養液を遠心して集菌し、プラスミドDNA
をQIAprep Spin Plasmids Kits(QIAGEN社製)を用いてミ
ニプレパレーションして30μlのDNA液を調製した。内20
μlを制限酵素反応液(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl
2、1mM Dithiothreitol、50mM NaCl)22.8μl中でHindII
I0.5μlで消化(37℃、40分間)後、0.5M塩化ナトリウム
を2.6μl、EcoRIを0.5μlを添加し、二重消化(37℃、40
分間)した。酵素反応終了液をアガロースゲル電気泳動
し、目的のDNA断片が挿入されたクローンを得た。
【００４０】ここまで形質転換には遺伝子導入の簡便性
から大腸菌DH5α株を使用したが、これをホスト株にし
た場合、複製時にHCV遺伝子に変異が導入されやすい可
能性が考えられた。そこで目的のDNA断片が挿入された
ベクターを大腸菌JM109株に移し新たな形質転換菌を獲
得した。
から大腸菌DH5α株を使用したが、これをホスト株にし
た場合、複製時にHCV遺伝子に変異が導入されやすい可
能性が考えられた。そこで目的のDNA断片が挿入された
ベクターを大腸菌JM109株に移し新たな形質転換菌を獲
得した。
【００４１】得られたクローンについて挿入されたDNA
断片部の塩基配列をDNA sequencingkit Dye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction(PERKIN ELMER)を用
いて解析を行い決定した。Sequenceはまず、Sequence反
応溶液として、Terminator Ready Reaction Mixを8.0μ
l、0.1μg/μlのTemplate DNAを3μl、1.0pmol/μlのPr
imerを3.2μｌを混ぜ、滅菌水で20μlに調製した。反応
は96℃５分間96℃30秒間、50℃15秒間、60℃4分間の条
件で25サイクル行った。反応終了液をCENTRI-SEP COLUM
NS(Applied Biosystems)で精製後、泳動サンプルとして
用い、sequenceを行った。目的の塩基配列を有したクロ
ーンをp5'-3'RBZと命名した。
断片部の塩基配列をDNA sequencingkit Dye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction(PERKIN ELMER)を用
いて解析を行い決定した。Sequenceはまず、Sequence反
応溶液として、Terminator Ready Reaction Mixを8.0μ
l、0.1μg/μlのTemplate DNAを3μl、1.0pmol/μlのPr
imerを3.2μｌを混ぜ、滅菌水で20μlに調製した。反応
は96℃５分間96℃30秒間、50℃15秒間、60℃4分間の条
件で25サイクル行った。反応終了液をCENTRI-SEP COLUM
NS(Applied Biosystems)で精製後、泳動サンプルとして
用い、sequenceを行った。目的の塩基配列を有したクロ
ーンをp5'-3'RBZと命名した。
【００４２】pCALN/5'-3'RBZの構築 p5'-3'RBZ 24μg、pCALN/pBR 24μgをそれぞれ酵素反応
液500μl中でSwaI(Boeheringer Mannheim)4μlで消化(2
5℃、一夜)した後、TE飽和フェノール、フェノール/ク
ロロホルム及びクロロホルム処理を行い、エタノール沈
殿し、TE 400μlに溶解した。この全量をアガロースゲ
ル電気泳動し、p5'-3'RBZからは約1.3kbpのDNA断片を、
pCALN/pBRからは約8kbpのDNA断片(クローニングベクタ
ー)をQIAEXII Agarose Gel Extraction(QIAGEN)を用い
てゲルから抽出し、それぞれを滅菌水96μl、222μlに
溶解した。これらの一部をアガロースゲル電気泳動し、
それらの濃度をp5'-3'RBZのDNA断片は70ng/μl、クロー
ニングベクターpCALN/pBRは35ng/μlと概算した。クロ
ーニングベクターpCALN/pBR 40μlに10X CIAP buffer10
μl、22units/μlのCIAP 5μlを添加し、滅菌水で100μ
lにした。アルカリフォスファターゼ反応を37℃で30分
間行なった後、75℃で10分間インキュベーションし、酵
素を失活させた。その後フェノール/クロロホルム処理
を2回、クロロホルム処理を1回行い、エタノール沈殿
し、滅菌水20μlに溶解した。その一部をアガロースゲ
ル電気泳動し、その濃度を25ng/μlと概算した。
液500μl中でSwaI(Boeheringer Mannheim)4μlで消化(2
5℃、一夜)した後、TE飽和フェノール、フェノール/ク
ロロホルム及びクロロホルム処理を行い、エタノール沈
殿し、TE 400μlに溶解した。この全量をアガロースゲ
ル電気泳動し、p5'-3'RBZからは約1.3kbpのDNA断片を、
pCALN/pBRからは約8kbpのDNA断片(クローニングベクタ
ー)をQIAEXII Agarose Gel Extraction(QIAGEN)を用い
てゲルから抽出し、それぞれを滅菌水96μl、222μlに
溶解した。これらの一部をアガロースゲル電気泳動し、
それらの濃度をp5'-3'RBZのDNA断片は70ng/μl、クロー
ニングベクターpCALN/pBRは35ng/μlと概算した。クロ
ーニングベクターpCALN/pBR 40μlに10X CIAP buffer10
μl、22units/μlのCIAP 5μlを添加し、滅菌水で100μ
lにした。アルカリフォスファターゼ反応を37℃で30分
間行なった後、75℃で10分間インキュベーションし、酵
素を失活させた。その後フェノール/クロロホルム処理
を2回、クロロホルム処理を1回行い、エタノール沈殿
し、滅菌水20μlに溶解した。その一部をアガロースゲ
ル電気泳動し、その濃度を25ng/μlと概算した。
【００４３】70ng/μlのp5'-3'RBZ DNA断片を2μl、25n
g/μlのクローニングベクターpCALN/pBRを1.5μl、滅菌
水を4.5μl混ぜ、70℃、5分間インキュベーションした
後、氷冷水で急冷し、即座に5X DNA dilution buffer(B
oeheringer Mannheim、RapidDNA Ligation Kit)を2μ
l、2X T4 DNA ligation buffer(Boeheringer Mannhei
m、Rapid DNA Ligation Kit)を10μl、5units/μlのT4
DNA ligase(BoeheringerMannheim、Rapid DNA Ligation
Kit)を1μl添加し、室温で1.5時間ライゲーション反応
を行った。この反応終了液2μlを大腸菌DH5α株100μl
に添加し、氷上に30分間置いた後、42℃で45秒間のヒー
トショックを行い、再度氷上に2分間置いた後、SOC培地
400μlに加え、37℃で1時間インキュベーションした。
形質転換菌はLB-Ampプレート(1%バクトトリプトン、0.5
%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、1.5%寒天、100μg/m
l)上で一夜培養した後、プレート上に出現したコロニー
をそれぞれ4mlのLB-Amp培地(1%バクトトリプトン、0.5%
酵母エキス、1%塩化ナトリウム、75μg/ml)の入った13m
lチューブで培養(37℃、6.5時間)し、培養液を遠心して
集菌し、プラスミドDNAをQIAprep Spin Plasmids Kits
(QIAGEN社製)を用いてミニプレパレーションし、TEで50
μlのDNA液を調製した。この内15μlを制限酵素反応液
(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM Dithiothreit
ol、50mM NaCl、0.01% BSA)20μl中でXbaIで消化(37
℃、30分間)し、これをアガロースゲル電気泳動し、目
的のDNA断片が挿入されたクローンを得た。これらのク
ローンについて挿入されたDNA断片部の塩基配列をDNA s
equencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Read
y Reaction(PERKIN ELMER)を用いて解析し、決定した。
目的の塩基配列を有したクローンをpCALN/5'-3'RBZと命
名した。
g/μlのクローニングベクターpCALN/pBRを1.5μl、滅菌
水を4.5μl混ぜ、70℃、5分間インキュベーションした
後、氷冷水で急冷し、即座に5X DNA dilution buffer(B
oeheringer Mannheim、RapidDNA Ligation Kit)を2μ
l、2X T4 DNA ligation buffer(Boeheringer Mannhei
m、Rapid DNA Ligation Kit)を10μl、5units/μlのT4
DNA ligase(BoeheringerMannheim、Rapid DNA Ligation
Kit)を1μl添加し、室温で1.5時間ライゲーション反応
を行った。この反応終了液2μlを大腸菌DH5α株100μl
に添加し、氷上に30分間置いた後、42℃で45秒間のヒー
トショックを行い、再度氷上に2分間置いた後、SOC培地
400μlに加え、37℃で1時間インキュベーションした。
形質転換菌はLB-Ampプレート(1%バクトトリプトン、0.5
%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、1.5%寒天、100μg/m
l)上で一夜培養した後、プレート上に出現したコロニー
をそれぞれ4mlのLB-Amp培地(1%バクトトリプトン、0.5%
酵母エキス、1%塩化ナトリウム、75μg/ml)の入った13m
lチューブで培養(37℃、6.5時間)し、培養液を遠心して
集菌し、プラスミドDNAをQIAprep Spin Plasmids Kits
(QIAGEN社製)を用いてミニプレパレーションし、TEで50
μlのDNA液を調製した。この内15μlを制限酵素反応液
(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM Dithiothreit
ol、50mM NaCl、0.01% BSA)20μl中でXbaIで消化(37
℃、30分間)し、これをアガロースゲル電気泳動し、目
的のDNA断片が挿入されたクローンを得た。これらのク
ローンについて挿入されたDNA断片部の塩基配列をDNA s
equencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Read
y Reaction(PERKIN ELMER)を用いて解析し、決定した。
目的の塩基配列を有したクローンをpCALN/5'-3'RBZと命
名した。
【００４４】pCALN/HCV RBZの構築 1μg/μlのpCALN・R6・CR8を4μl、制限酵素反応液(10m
M Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM Dithiothreitol)3
0μl中でKpnI 2μlで消化(37℃、一夜)し、その酵素反
応終了液28μlに0.5M塩化ナトリウムを４μl、HindIII
を2μl添加し、滅菌水で40μlにしてさらに消化(37℃、
3.5時間)を行った。反応後、フェノール処理、フェノー
ル/クロロホルム処理、クロロホルム処理を行い、エタ
ノール沈殿し、TE 30μlに溶解した。この一部をアガロ
ースゲル電気泳動し、約8.5kbpのDNA断片をQIAEX II Ag
arose Gel Extraction(QIAGEN)を用いてゲルから抽出
し、滅菌水20μlに溶解した。そして再度フェノール処
理、フェノール/クロロホルム処理、クロロホルム処理
を行い、エタノール沈殿し、滅菌水20μlに溶解した。
M Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM Dithiothreitol)3
0μl中でKpnI 2μlで消化(37℃、一夜)し、その酵素反
応終了液28μlに0.5M塩化ナトリウムを４μl、HindIII
を2μl添加し、滅菌水で40μlにしてさらに消化(37℃、
3.5時間)を行った。反応後、フェノール処理、フェノー
ル/クロロホルム処理、クロロホルム処理を行い、エタ
ノール沈殿し、TE 30μlに溶解した。この一部をアガロ
ースゲル電気泳動し、約8.5kbpのDNA断片をQIAEX II Ag
arose Gel Extraction(QIAGEN)を用いてゲルから抽出
し、滅菌水20μlに溶解した。そして再度フェノール処
理、フェノール/クロロホルム処理、クロロホルム処理
を行い、エタノール沈殿し、滅菌水20μlに溶解した。
【００４５】同様に2μg/μlのpCALN/5'-3'RBZを5μl、
制限酵素反応液(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、1m
M Dithiothreitol)30μl中でKpnI 2μlで消化(37℃、一
夜)し、その反応終了液をフェノール処理、フェノール/
クロロホルム処理、クロロホルム処理を行い、エタノー
ル沈殿し、TE 30μlに溶解した。これをアガロースゲル
電気泳動し、約9.2kbpのクローニングベクターをQIAEX
II Agarose Gel Extraction(QIAGEN)を用いてゲルから
抽出し、滅菌水27μlに溶解した。次いでこのクローニ
ングベクター 27μlに10X CIAP bufferを5μl、22units
/μlのCIAPを2μl加え、滅菌水で50μlにし、50℃、30
分間インキュベーションしてアルカリフォスファターゼ
処理を行った。反応後、75℃、10分間の加熱で酵素を失
活させ、フェノール/クロロホルム処理を2回、クロロホ
ルム処理を1回行い、エタノール沈殿し、滅菌水20μlに
溶解した。pCALN・R6・CR8から回収したDNA断片とクロ
ーニングベクターpCALN/5'-3'RBZの一部をアガロースゲ
ル電気泳動し、それらの濃度を共に約20ng/μlと概算し
た。
制限酵素反応液(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、1m
M Dithiothreitol)30μl中でKpnI 2μlで消化(37℃、一
夜)し、その反応終了液をフェノール処理、フェノール/
クロロホルム処理、クロロホルム処理を行い、エタノー
ル沈殿し、TE 30μlに溶解した。これをアガロースゲル
電気泳動し、約9.2kbpのクローニングベクターをQIAEX
II Agarose Gel Extraction(QIAGEN)を用いてゲルから
抽出し、滅菌水27μlに溶解した。次いでこのクローニ
ングベクター 27μlに10X CIAP bufferを5μl、22units
/μlのCIAPを2μl加え、滅菌水で50μlにし、50℃、30
分間インキュベーションしてアルカリフォスファターゼ
処理を行った。反応後、75℃、10分間の加熱で酵素を失
活させ、フェノール/クロロホルム処理を2回、クロロホ
ルム処理を1回行い、エタノール沈殿し、滅菌水20μlに
溶解した。pCALN・R6・CR8から回収したDNA断片とクロ
ーニングベクターpCALN/5'-3'RBZの一部をアガロースゲ
ル電気泳動し、それらの濃度を共に約20ng/μlと概算し
た。
【００４６】ライゲーション反応は、 pCALN・R6・CR8
から回収したDNA断片4μlとクローニングベクターpCALN
/5'-3'RBZ 4μlを混ぜ80℃、3分間インキュベーション
した後、氷冷水につけ、即座に5X DNA dilution buffer
2μl、2X DNA ligation buffer 10μl、5units/μlのT
4 DNA ligase 1μlを添加し、室温で1.5時間行った。反
応液2μlを大腸菌DH5α株100μlに添加し、氷上に30分
間置いた後、42℃で45秒間のヒートショックを行い、再
度氷上に2分間置いた後、SOC培地400μlに加え、37℃で
1時間インキュベーションした。形質転換菌はLB-Ampプ
レート(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%塩化
ナトリウム、1.5%寒天、アンピシリン100μg/ml)上で一
夜培養した後、プレート上に出現したコロニーをそれぞ
れ4mlのLB-Amp培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキ
ス、1%塩化ナトリウム、アンピシリン75μg/ml)の入っ
た13mlチューブで培養(37℃、6時間)し、培養液を遠心
して集菌し、プラスミドDNAをQIAprep Spin Plasmids K
its(QIAGEN社製)を用いてミニプレパレーションし、TE
で100μlのDNA液を調製した。この内12.5μlを制限酵素
反応液(50mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM Dithio
threitol、100mM NaCl)15μl中でEcoRI 1μlで消化(37
℃、30分間)した後、アガロースゲル電気泳動し、目的
のDNA断片の挿入されたクローンを得た。
から回収したDNA断片4μlとクローニングベクターpCALN
/5'-3'RBZ 4μlを混ぜ80℃、3分間インキュベーション
した後、氷冷水につけ、即座に5X DNA dilution buffer
2μl、2X DNA ligation buffer 10μl、5units/μlのT
4 DNA ligase 1μlを添加し、室温で1.5時間行った。反
応液2μlを大腸菌DH5α株100μlに添加し、氷上に30分
間置いた後、42℃で45秒間のヒートショックを行い、再
度氷上に2分間置いた後、SOC培地400μlに加え、37℃で
1時間インキュベーションした。形質転換菌はLB-Ampプ
レート(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%塩化
ナトリウム、1.5%寒天、アンピシリン100μg/ml)上で一
夜培養した後、プレート上に出現したコロニーをそれぞ
れ4mlのLB-Amp培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキ
ス、1%塩化ナトリウム、アンピシリン75μg/ml)の入っ
た13mlチューブで培養(37℃、6時間)し、培養液を遠心
して集菌し、プラスミドDNAをQIAprep Spin Plasmids K
its(QIAGEN社製)を用いてミニプレパレーションし、TE
で100μlのDNA液を調製した。この内12.5μlを制限酵素
反応液(50mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM Dithio
threitol、100mM NaCl)15μl中でEcoRI 1μlで消化(37
℃、30分間)した後、アガロースゲル電気泳動し、目的
のDNA断片の挿入されたクローンを得た。
【００４７】HCV遺伝子の複製時における変異を極力抑
える目的で得られたクローンのホスト株を大腸菌DH5α
株からJM109株に変え、新たな形質転換菌を得た。また
細胞へのtransfectionやtgm作製といった本発明のベク
ターの応用性を考慮して、以降のプラスミド調製はTrit
on法を用いた。まずSuper broth(3.3%バクトトリプト
ン、2%酵母エキス、0.75% 塩化ナトリウム、10N水酸化
ナトリウム1/1000量)でクローンを大量培養し、遠心(50
00rpm、10分間)で菌体を回収した。そこに冷TE Sucrose
(25% Sucrose、50mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA)を培養
量の1/20量加え、チューブに移し、以後氷上で20mg/ml
lysozymeを培養量の1/100量加え5分間インキュベーショ
ン、0.5M EDTA pH8.0を培養量の1/50量加え10分間イン
キュベーション、Tyiton-lytic mixture(0.1% TritonX-
100、50mM Tris-HCl pH8.0、62.5mM EDTA)を培養量の2/
25量加え15分間インキュベーションといった操作を行っ
た。インキュベーション後、超遠心(Beckmanrotor 45T
i、30krpm 30分間、4℃)を行い、上清をビーカーに移し
た。上清の重量の1/10量(w/w)のPEG 6000と1/10量(v/w)
の5M塩化ナトリウムを加え攪拌して完全に溶解させ、溶
解後、氷上で1,5時間インキュベーションした。その
後、遠心チューブに移し、8000rpm、10分間、4℃で遠心
を行った。沈殿物にTE-Sarkosyl(0.4% Sarkosyl、10mM
Tris-HCl pH7.5、1mM EDTA)を培養量の3/200量加え、塩
化セシウムを培養量の3/200量(w/v)加え、10mg/mlのエ
チレンブロマイドを3/8000量加え、チューブに移して遠
心(8000rpm、10分間、15℃)した。遠心後、液体表面上
に形成されたタンパクの膜を除去し、上清をチューブに
移し、再度10mg/mlのエチレンブロマイドを3/4000量加
えた後、超遠心チューブ(polyallomer Quick-seal 1x3
1/2 in)に移し、超遠心(Beckman rotor Vti50、4.8krp
m、一夜、15℃)を行った。遠心終了後、プラスミドを回
収し、再度超遠心チューブ(polyallomer Quick-seal 1x
3 1/2 in)に移し、超遠心(Beckman rotor Vti80、6.5kr
pm、3.5時間、20℃)を行った。遠心終了後、プラスミド
を回収し、5M塩化ナトリウム飽和イソプロパノールで6
回抽出を行い、エチレンブロマイドを除去した。回収し
たサンプル量の3倍量のTEを添加後、エタノール沈殿を
行い、適当量のTEに溶解した。このプラスミドに挿入さ
れたHCV遺伝子の塩基配列をDNA sequencing kitDye Ter
minator Cycle Sequencing Ready Reaction(PERKIN ELM
ER)を用いて決定した。目的の塩基配列を有したプラス
ミドベクターをpCALN/HCV RBZと命名した（図１）。こ
のプラスミドを導入した大腸菌は工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている（FERM BP-6763、寄託
日：平成９年10月31日）。
える目的で得られたクローンのホスト株を大腸菌DH5α
株からJM109株に変え、新たな形質転換菌を得た。また
細胞へのtransfectionやtgm作製といった本発明のベク
ターの応用性を考慮して、以降のプラスミド調製はTrit
on法を用いた。まずSuper broth(3.3%バクトトリプト
ン、2%酵母エキス、0.75% 塩化ナトリウム、10N水酸化
ナトリウム1/1000量)でクローンを大量培養し、遠心(50
00rpm、10分間)で菌体を回収した。そこに冷TE Sucrose
(25% Sucrose、50mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA)を培養
量の1/20量加え、チューブに移し、以後氷上で20mg/ml
lysozymeを培養量の1/100量加え5分間インキュベーショ
ン、0.5M EDTA pH8.0を培養量の1/50量加え10分間イン
キュベーション、Tyiton-lytic mixture(0.1% TritonX-
100、50mM Tris-HCl pH8.0、62.5mM EDTA)を培養量の2/
25量加え15分間インキュベーションといった操作を行っ
た。インキュベーション後、超遠心(Beckmanrotor 45T
i、30krpm 30分間、4℃)を行い、上清をビーカーに移し
た。上清の重量の1/10量(w/w)のPEG 6000と1/10量(v/w)
の5M塩化ナトリウムを加え攪拌して完全に溶解させ、溶
解後、氷上で1,5時間インキュベーションした。その
後、遠心チューブに移し、8000rpm、10分間、4℃で遠心
を行った。沈殿物にTE-Sarkosyl(0.4% Sarkosyl、10mM
Tris-HCl pH7.5、1mM EDTA)を培養量の3/200量加え、塩
化セシウムを培養量の3/200量(w/v)加え、10mg/mlのエ
チレンブロマイドを3/8000量加え、チューブに移して遠
心(8000rpm、10分間、15℃)した。遠心後、液体表面上
に形成されたタンパクの膜を除去し、上清をチューブに
移し、再度10mg/mlのエチレンブロマイドを3/4000量加
えた後、超遠心チューブ(polyallomer Quick-seal 1x3
1/2 in)に移し、超遠心(Beckman rotor Vti50、4.8krp
m、一夜、15℃)を行った。遠心終了後、プラスミドを回
収し、再度超遠心チューブ(polyallomer Quick-seal 1x
3 1/2 in)に移し、超遠心(Beckman rotor Vti80、6.5kr
pm、3.5時間、20℃)を行った。遠心終了後、プラスミド
を回収し、5M塩化ナトリウム飽和イソプロパノールで6
回抽出を行い、エチレンブロマイドを除去した。回収し
たサンプル量の3倍量のTEを添加後、エタノール沈殿を
行い、適当量のTEに溶解した。このプラスミドに挿入さ
れたHCV遺伝子の塩基配列をDNA sequencing kitDye Ter
minator Cycle Sequencing Ready Reaction(PERKIN ELM
ER)を用いて決定した。目的の塩基配列を有したプラス
ミドベクターをpCALN/HCV RBZと命名した（図１）。こ
のプラスミドを導入した大腸菌は工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている（FERM BP-6763、寄託
日：平成９年10月31日）。
【００４８】〔実施例２〕 完全長HCV遺伝子発現の確
認 （１）ノーザンブロッテイングによる確認 pCALN/HCV RBZをIMY細胞（Itoh, T. et al., submitte
d）にLipofectin Reagant(GIBCO-BRL)の方法（Felgner,
PL, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413
(1987) ）に従いトランスフェクトし、T7-RNAポリメラ
ーゼを持つ組み換えワクチニアウイルス（文献:Yasui,
K. et al., J.Virol. in press）を感染させ、HCV-RNA
を発現させた。具体的には、IMY細胞、6cm dish当た
り、Rz-DNA4μgを用い、Lipofectinを18％の割合になる
ようにOpti-MEMで希釈したものを混合し、室温で15分間
放置後、Opti-MEM 1.6mlを加え静かに混合し、dish上に
まく。その後37℃で5時間インキュベートし、MOI=10でT
7ポリメラーゼを持つ組換えワクチニアウイルスを1時間
吸着させた。その後、37℃で、12時間培養し、感染細胞
を集め、HCVの発現を検討した。Isogen（ニッポンジー
ン）を用いてRNAを抽出し、そのうちのトータルRNA４μ
gをホルムアルデヒトゲルで電気泳動し、ナイロン膜
（アマシャム）に転写して10％Dextran sulfate,1％SDS
溶液でノーザンンブロットを行った。HCV遺伝子の5'UTR
からcoreの領域に相当する600bpのcDNAをpdCTPでラベル
しプローブとし、発現されたHCV-RNAを検出した。ま
た、対照として、pCALN/HCV RBZをin vitroで発現させ
た場合、及びリボザイムをコードするDNA を含まないT7
02X を発現させた場合についても同様にHCV-RNAの検出
を試みた。この結果を図２に示す。
認 （１）ノーザンブロッテイングによる確認 pCALN/HCV RBZをIMY細胞（Itoh, T. et al., submitte
d）にLipofectin Reagant(GIBCO-BRL)の方法（Felgner,
PL, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413
(1987) ）に従いトランスフェクトし、T7-RNAポリメラ
ーゼを持つ組み換えワクチニアウイルス（文献:Yasui,
K. et al., J.Virol. in press）を感染させ、HCV-RNA
を発現させた。具体的には、IMY細胞、6cm dish当た
り、Rz-DNA4μgを用い、Lipofectinを18％の割合になる
ようにOpti-MEMで希釈したものを混合し、室温で15分間
放置後、Opti-MEM 1.6mlを加え静かに混合し、dish上に
まく。その後37℃で5時間インキュベートし、MOI=10でT
7ポリメラーゼを持つ組換えワクチニアウイルスを1時間
吸着させた。その後、37℃で、12時間培養し、感染細胞
を集め、HCVの発現を検討した。Isogen（ニッポンジー
ン）を用いてRNAを抽出し、そのうちのトータルRNA４μ
gをホルムアルデヒトゲルで電気泳動し、ナイロン膜
（アマシャム）に転写して10％Dextran sulfate,1％SDS
溶液でノーザンンブロットを行った。HCV遺伝子の5'UTR
からcoreの領域に相当する600bpのcDNAをpdCTPでラベル
しプローブとし、発現されたHCV-RNAを検出した。ま
た、対照として、pCALN/HCV RBZをin vitroで発現させ
た場合、及びリボザイムをコードするDNA を含まないT7
02X を発現させた場合についても同様にHCV-RNAの検出
を試みた。この結果を図２に示す。
【００４９】pCALN/HCV RBZをin vitroで発現させた場
合、HCV-RNA は完全にトリミングされず、約11kbのRNA
が検出された。一方、pCALN/HCV RBZを細胞内で発現さ
せた場合、完全長（9.6kb ）のHCV-RNA のみが検出され
た。また、T702X を用いた場合、完全長のHCV-RNA は検
出されたが、そのRNA 量はpCALN/HCV RBZを用いた場合
に比べ著しく少なかった。
合、HCV-RNA は完全にトリミングされず、約11kbのRNA
が検出された。一方、pCALN/HCV RBZを細胞内で発現さ
せた場合、完全長（9.6kb ）のHCV-RNA のみが検出され
た。また、T702X を用いた場合、完全長のHCV-RNA は検
出されたが、そのRNA 量はpCALN/HCV RBZを用いた場合
に比べ著しく少なかった。
【００５０】（２）5'-Race 及び3'-Race による確認 pCALN/HCV RBZをトランスフェクトしたIMY細胞からHCV-
RNA を抽出し、その両末端の塩基配列を調べた（図３及
び図４）。5'末端のクローニング及びシークエンス 発現したHCV-RNA の5'末端配列の確認は、5'Race Syste
m（Gibco-BRL）を用いて、5'Race法により行った。抽出
したHCV-RNA からA5'-IRプライマーとSuperscriptII（G
ibco-BRL）を用いてcDNAを合成した。合成されたcDNA
を、TdTでdA tailingし、これを鋳型とし、sense プラ
イマー：CAC-T35、antisense プライマー：A5'-IIとし
てPCRを行った。得られた増幅産物を鋳型とし、sense
プライマー：KM2、antisense プライマー：CAC-T35とし
て再度PCRを行った。増幅されたDNAフラグメントはpGEM
-Tベクター（プロメガ）にクローニングし、塩基配列の
決定を行った。
RNA を抽出し、その両末端の塩基配列を調べた（図３及
び図４）。5'末端のクローニング及びシークエンス 発現したHCV-RNA の5'末端配列の確認は、5'Race Syste
m（Gibco-BRL）を用いて、5'Race法により行った。抽出
したHCV-RNA からA5'-IRプライマーとSuperscriptII（G
ibco-BRL）を用いてcDNAを合成した。合成されたcDNA
を、TdTでdA tailingし、これを鋳型とし、sense プラ
イマー：CAC-T35、antisense プライマー：A5'-IIとし
てPCRを行った。得られた増幅産物を鋳型とし、sense
プライマー：KM2、antisense プライマー：CAC-T35とし
て再度PCRを行った。増幅されたDNAフラグメントはpGEM
-Tベクター（プロメガ）にクローニングし、塩基配列の
決定を行った。
【００５１】3'末端のクローニング及びシークエンス 抽出したHCV-RNAにpoly A Polymerase（タカラ）でA ta
ilingを行い、これからCAC-T35プライマーでcDNA合成を
行った（Superscript II、Gibco-BRL）。このcDNAを鋳
型として、CAC-T35プライマー、Takara Taqで１回目のP
CRを、続いて3'-X-R6H3とCAC-T35で２回目のPCRを行
い、得られたフラグメントを5'末端の場合と同様に配列
決定した。
ilingを行い、これからCAC-T35プライマーでcDNA合成を
行った（Superscript II、Gibco-BRL）。このcDNAを鋳
型として、CAC-T35プライマー、Takara Taqで１回目のP
CRを、続いて3'-X-R6H3とCAC-T35で２回目のPCRを行
い、得られたフラグメントを5'末端の場合と同様に配列
決定した。
【００５２】以下に使用したプライマーの塩基配列を示
す。 CAC-T35 ：CAC(T)35(配列番号１９） KM2：5'-CTGTACGACACTCATACTAA-3'（配列番号２０） 3'-XR6H3：5'-TTTTTGGTGGCTCCATCTTAGCC-3'（配列番号
２１） A5'-IR:5'-GGGTTTGGGATTTGTGCTCATGAT,（配列番号２
２） A5'-II:5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT,（配列番号２
３）
す。 CAC-T35 ：CAC(T)35(配列番号１９） KM2：5'-CTGTACGACACTCATACTAA-3'（配列番号２０） 3'-XR6H3：5'-TTTTTGGTGGCTCCATCTTAGCC-3'（配列番号
２１） A5'-IR:5'-GGGTTTGGGATTTGTGCTCATGAT,（配列番号２
２） A5'-II:5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT,（配列番号２
３）
【００５３】以上のシークエンスの結果をHCV 遺伝子の
両末端の塩基配列と比較したところ、3'末端については
完全な一致がみられたが、5'末端については、得られた
シークエンスは、HCV 遺伝子の配列にG が一つ付加した
ものであった。このG はpCALN/HCV RBZ中に挿入したcDN
Aに含まれていないものなので、mRNAの5'末端のキャッ
プ構造に由来するものと考えられた。
両末端の塩基配列と比較したところ、3'末端については
完全な一致がみられたが、5'末端については、得られた
シークエンスは、HCV 遺伝子の配列にG が一つ付加した
ものであった。このG はpCALN/HCV RBZ中に挿入したcDN
Aに含まれていないものなので、mRNAの5'末端のキャッ
プ構造に由来するものと考えられた。
【００５４】（３）HCV蛋白質発現の確認 pCALN/HCV RBZをトランスフェクトしたIMY細胞について
ウエスタンブロッティング法（新生化学実験講座タンパ
ク質Ｉ、東京化学同人（1990））により、構成蛋白質の
発現を解析した。IMY細胞をRIPAバッファー（1%SDS、0.
5%NP40、0.15MNaCl、10mMTris-HCl(pH7.4)）で可溶化
し、SDS-PAGEで電気泳動し、Immobilon-P（ミリポア）
に転写溶液(25mM Tris, 192mM Glycine, 20％メタノー
ル）で転写した。その後、抗core、E1、E2、NS3、NS4A/
4B 、NS4B、NS5A、NS5Bの各ビオチン化モノクローナル
抗体（１−２μg/ml）と37℃で反応させ、アビジン化-H
RPO(Vector stein:1:1500)で反応後、ECL(アマシャム)
でHCV蛋白質を検出した。対照として、pCALN/HCV RBZを
トランスフェクトしなかったIMY細胞についても同様に
構成蛋白質の発現を解析した。この結果を図５に示す
（図中の2-18がトランスフェクトした場合、Mockがトラ
ンスフェクトしなかった場合を示す）。図に示すように
作製したすべてのモノクローナル抗体について特異的に
結合する蛋白質が検出された。これより、pCALN/HCV RB
Zは、全HCV蛋白質を発現できるものと考えられる。
ウエスタンブロッティング法（新生化学実験講座タンパ
ク質Ｉ、東京化学同人（1990））により、構成蛋白質の
発現を解析した。IMY細胞をRIPAバッファー（1%SDS、0.
5%NP40、0.15MNaCl、10mMTris-HCl(pH7.4)）で可溶化
し、SDS-PAGEで電気泳動し、Immobilon-P（ミリポア）
に転写溶液(25mM Tris, 192mM Glycine, 20％メタノー
ル）で転写した。その後、抗core、E1、E2、NS3、NS4A/
4B 、NS4B、NS5A、NS5Bの各ビオチン化モノクローナル
抗体（１−２μg/ml）と37℃で反応させ、アビジン化-H
RPO(Vector stein:1:1500)で反応後、ECL(アマシャム)
でHCV蛋白質を検出した。対照として、pCALN/HCV RBZを
トランスフェクトしなかったIMY細胞についても同様に
構成蛋白質の発現を解析した。この結果を図５に示す
（図中の2-18がトランスフェクトした場合、Mockがトラ
ンスフェクトしなかった場合を示す）。図に示すように
作製したすべてのモノクローナル抗体について特異的に
結合する蛋白質が検出された。これより、pCALN/HCV RB
Zは、全HCV蛋白質を発現できるものと考えられる。
【００５５】〔実施例３〕HCV 遺伝子発現細胞株の樹立 HepG2、IMY細胞、６cm dish１枚当たり、プラスミドDNA
4μgとLipofectin(GIBCO-BRL)をOpti-MEM(GIBCO-BRL)に
約18％の割合で溶解したものを、混合し、室温で15分放
置後、Opti-MEMを1.6ml加え、静かに混合し、予めOpti-
MEMで洗浄した細胞の上にまいた。37℃でCO2インキュベ
ーター内に5時間置いた後、上清を10％FCS-DMEM（細胞
培養液）と置換した。37℃、48時間後、細胞を1:5の割
合で継代し、G418を800μg/ml(Bioactive)で加えた。約
3週間後、形成されたコロニーをピックアップした。
4μgとLipofectin(GIBCO-BRL)をOpti-MEM(GIBCO-BRL)に
約18％の割合で溶解したものを、混合し、室温で15分放
置後、Opti-MEMを1.6ml加え、静かに混合し、予めOpti-
MEMで洗浄した細胞の上にまいた。37℃でCO2インキュベ
ーター内に5時間置いた後、上清を10％FCS-DMEM（細胞
培養液）と置換した。37℃、48時間後、細胞を1:5の割
合で継代し、G418を800μg/ml(Bioactive)で加えた。約
3週間後、形成されたコロニーをピックアップした。
【００５６】ピックアップした細胞にcre-adenovirusを
感染させ（感染量：moi=100 ）、ウエルあたりのcore蛋
白質の発現量を調べた。特に発現量の多かった3 系統に
ついての結果を図６に示す。次に、cre-adenovirusの感
染量をmoi=1から100 まで変化させ、その際の発現量を
調べた。この結果を図７に示す。図７に示すように、mo
i=30でほぼプラトーに達した。このことから全細胞でHC
V が発現するためにはある程度のcre 酵素が必要である
と考えられた。なお、図７では、最も発現の高い2-18系
統のみ示したが、2-8 系統及び2-22系統でも同様の反応
性を示した。
感染させ（感染量：moi=100 ）、ウエルあたりのcore蛋
白質の発現量を調べた。特に発現量の多かった3 系統に
ついての結果を図６に示す。次に、cre-adenovirusの感
染量をmoi=1から100 まで変化させ、その際の発現量を
調べた。この結果を図７に示す。図７に示すように、mo
i=30でほぼプラトーに達した。このことから全細胞でHC
V が発現するためにはある程度のcre 酵素が必要である
と考えられた。なお、図７では、最も発現の高い2-18系
統のみ示したが、2-8 系統及び2-22系統でも同様の反応
性を示した。
【００５７】
【発明の効果】本発明は、RNAウイルスの完全長遺伝子
を発現することのできるベクター等を提供する。これら
は、RNAウイルス複製の機構およびRNAウイルス感染症の
発症機構の解明、治療薬および治療手段の開発等に有用
である。
を発現することのできるベクター等を提供する。これら
は、RNAウイルス複製の機構およびRNAウイルス感染症の
発症機構の解明、治療薬および治療手段の開発等に有用
である。
【００５８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA TOKYO METROPOLITAN ORGANIZATION FOR MEDICAL RESEARCH <120> A vector which expresses an entire gene of RNA virus and uses of t he same <130> P99-0351 <160> 23 <170> Patent In version 2.0 <210> 1 <211> 135 <212> DNA <213> HCV <400> 1 gccggaattc atttaaatct cgagtaatac gactcactat agggctggcc cctgatgagg 60 ccgaaaggcc gaaacggcga aagccgtcgg gccagccccc gattgggggc gacactccac 120 catagatcac tcccc 135 <210> 2 <211> 587 <212> DNA <213> HCV <400> 2 ccaccataga tcactcccct gtgaggaact actgtcttca cgcagaaagc gtctagccat 60 ggcgttagta tgagtgtcgt gcagcctcca ggaccccccc tcccgggaga gccatagtgg 120 tctgcggaac cggtgagtac accggaattg ccaggacgac cgggtccttt cttggatcaa 180 cccgctcaat gcctggagat ttgggcgtgc ccccgcgaga ctgctagccg agtagtgttg 240 ggtcgcgaaa ggccttgtgg tactgcctga tagggtgctt gcgagtgccc cgggaggtct 300 cgtagaccgt gcatcatgag cacaaatcct aaaccccaaa gaaaaaccaa acgtaacacc 360 aaccgccgcc cacaggacgt caagttcccg ggtggtggtc agatcgttgg tggagtttac 420 ctgttgccgc gcaggggccc caggttgggt gtgcgcgcga ctaggaagac ttccgagcgg 480 tcacaacctc gtggaaggcg acaacctatc cccaaggctc gccagcccga gggcagggcc 540 tgggctcagc ccgggtaccc ttggcccctc tatggcaacg agggcat 587 <210> 3 <211> 703 <212> DNA <213> HCV <400> 3 gccggaattc atttaaatct cgagtaatac gactcactat agggctggcc cctgatgagg 60 ccgaaaggcc gaaacggcga aagccgtcgg gccagccccc gattgggggc gacactccac 120 catagatcac tcccctgtga ggaactactg tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg 180 ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac cccccctccc gggagagcca tagtggtctg 240 cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag gacgaccggg tcctttcttg gatcaacccg 300 ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc gcgagactgc tagccgagta gtgttgggtc 360 gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta 420 gaccgtgcat catgagcaca aatcctaaac cccaaagaaa aaccaaacgt aacaccaacc 480 gccgcccaca ggacgtcaag ttcccgggtg gtggtcagat cgttggtgga gtttacctgt 540 tgccgcgcag gggccccagg ttgggtgtgc gcgcgactag gaagacttcc gagcggtcac 600 aacctcgtgg aaggcgacaa cctatcccca aggctcgcca gcccgagggc agggcctggg 660 ctcagcccgg gtacccttgg cccctctatg gcaacgaggg cat 703 <210> 4 <211> 537 <212> DNA <213> HCV <400> 4 ttggggtacc acccttgcga gtctggagac atcgggccag aagtgtccgc gctaagctgc 60 tgtcccaggg ggggagggct gccacttgtg gtaagtacct cttcaactgg gcagtaagga 120 ccaagctcaa actcactcca atcccggcag cgtcccagtt ggacttgtcc agctggttcg 180 tggctggtta cagcggggga gacatatatc acagcctgtc tcgtgcccga ccccgctggt 240 tcatgttgtg cctactccta ctttcagtag gggtaggcat ctacctgctc cccaaccgat 300 aaacggggag ctaaacactc caggccaata ggccatttct tttttttttt tttttttttt 360 ttcttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttcttt cttttgtttt 420 tttttttttt cttctttttg gtggctccat cttagcccta gtcacggcta gctgtgaaag 480 gtccgtgagc cgcatgactg cagagagtgc tgatactggc ctctctgcag atcatgt 537 <210> 5 <211> 127 <212> DNA <213> HCV <400> 5 ggcctctctg cagatcatgt ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg 60 caacattccg aggggaccgt cccctcggta atggcgaatg ggactctaga tttaaataag 120 cttgggc 127 <210> 6 <211> 644 <212> DNA <213> HCV <400> 6 ttggggtacc acccttgcga gtctggagac atcgggccag aagtgtccgc gctaagctgc 60 tgtcccaggg ggggagggct gccacttgtg gtaagtacct cttcaactgg gcagtaagga 120 ccaagctcaa actcactcca atcccggcag cgtcccagtt ggacttgtcc agctggttcg 180 tggctggtta cagcggggga gacatatatc acagcctgtc tcgtgcccga ccccgctggt 240 tcatgttgtg cctactccta ctttcagtag gggtaggcat ctacctgctc cccaaccgat 300 aaacggggag ctaaacactc caggccaata ggccatttct tttttttttt tttttttttt 360 ttcttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttcttt cttttgtttt 420 tttttttttt cttctttttg gtggctccat cttagcccta gtcacggcta gctgtgaaag 480 gtccgtgagc cgcatgactg cagagagtgc tgatactggc ctctctgcag atcatgtggc 540 cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa cattccgagg ggaccgtccc 600 ctcggtaatg gcgaatggga ctctagattt aaataagctt gggc 644 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Unknown <400> 7 ctgatgaggc cgaaaggccg aaacggcgaa agccgtc 37 <210> 8 <211> 85 <212> DNA <213> Unknown <400> 8 tggccggcat ggtcccagcc tcctcgctgg cgccggctgg gcaacattcc gaggggaccg 60 tcccctcggt aatggcgaat gggac 85 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 gccggaattc atttaaatct cg 22 <210> 10 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 gccggaattc atttaaatct cgagtaatac gactcactat agggctggcc cctgatgagg 60 ccgaaaggcc gaaacggcg 79 <210> 11 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 ggggagtgat ctatggtgga gtgtcgcccc caatcggggg ctggcccgac ggctttcgcc 60 gtttcggcct ttcg 74 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 ggggagtgat ctatggtgg 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ccaccataga tcactcccc 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 atgccctcgt tgccatagag 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 ttggggtacc acccttgcg 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 acatgatctg cagagaggcc 20 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 ggcctctctg cagatcatgt ggccggcatg gtcccag 37 <210> 18 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 gcccaagctt atttaaatct agagtcccat tcgccattac cgag 44 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 cacttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttt 38 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 ctgtacgaca ctcatactaa 20 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 tttttggtgg ctccatctta gcc 23 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 22 gggtttggga tttgtgctca tgat 24 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 23 cactcgcaag caccctatca ggcagt 26
【図１】CALN/HCV RBZ の構造を示す図である。
【図２】CALN/HCV RBZ からの転写産物に対するノーザ
ンブロットの結果を示す写真である。
ンブロットの結果を示す写真である。
【図３】5'-Race 法の概要を示す図である。
【図４】3'-Race 法の概要を示す図である。
【図５】CALN/HCV RBZ からの翻訳産物に対するウェス
タンブロットの結果を示す写真である。
タンブロットの結果を示す写真である。
【図６】HCV 遺伝子発現細胞株のCore蛋白質の発現量を
示す図である。
示す図である。
【図７】HCV 遺伝子発現細胞株のCore蛋白質の発現量と
cre-adenovirus感染量との関係を示す図である。
cre-adenovirus感染量との関係を示す図である。
フロントページの続き (72)発明者 多比良 和誠 茨城県つくば市東２−４−29 (72)発明者 松崎 淳一 静岡県御殿場市駒門１−135 中外製薬株 式会社内 (72)発明者 大森 寛 静岡県御殿場市駒門１−135 中外製薬株 式会社内
Claims (9)
- 【請求項１】 RNAウイルスの遺伝子をコードするcDNA
を含むベクターであって、該RNAウイルスの遺伝子の両
末端を正確かつ均一に転写できるように構築されている
ことを特徴とするベクター。 - 【請求項２】 RNAウイルスの遺伝子をコードするcDNA
の5'末端の上流及び3'末端の下流のそれぞれにセルフプ
ロセッシングにより切断するリボザイムをコードするDN
Aが配置されていることを特徴とする請求項１記載のベ
クター。 - 【請求項３】 RNAウイルスがＣ型肝炎ウイルスである
ことを特徴とする請求項１又は２記載のベクター。 - 【請求項４】 請求項１又は２記載のベクターを含むこ
とを特徴とする動物細胞。 - 【請求項５】 請求項３記載のベクターを含むことを特
徴とする動物細胞。 - 【請求項６】 その細胞中に請求項１又は２記載のベク
ターを含むことを特徴とするRNAウイルス感染モデル動
物。 - 【請求項７】 RNAウイルスがＣ型肝炎ウイルスである
ことを特徴とする請求項６記載のRNAウイルス感染モデ
ル動物。 - 【請求項８】 請求項４記載の動物細胞、又は請求項６
記載のRNAウイルス感染モデル動物を用いることを特徴
とするRNAウイルスの複製を阻害する薬物のスクリーニ
ング方法。 - 【請求項９】 請求項５記載の動物細胞、又は請求項７
記載のRNAウイルス感染モデル動物を用いることを特徴
とするＣ型肝炎ウイルスの複製を阻害する薬物のスクリ
ーニング方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11178347A JP2000152793A (ja) | 1998-06-24 | 1999-06-24 | Ｒｎａウイルスの完全長遺伝子を発現するベクタ―及びその用途 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10-177820 | 1998-06-24 | ||
| JP17782098 | 1998-06-24 | ||
| JP11178347A JP2000152793A (ja) | 1998-06-24 | 1999-06-24 | Ｒｎａウイルスの完全長遺伝子を発現するベクタ―及びその用途 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009242735A Division JP2010046083A (ja) | 1998-06-24 | 2009-10-21 | Ｒｎａウイルスの完全長遺伝子を発現するベクター及びその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000152793A true JP2000152793A (ja) | 2000-06-06 |
Family
ID=26498219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11178347A Pending JP2000152793A (ja) | 1998-06-24 | 1999-06-24 | Ｒｎａウイルスの完全長遺伝子を発現するベクタ―及びその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000152793A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002028174A1 (fr) * | 2000-10-03 | 2002-04-11 | Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research | Procedes d'infection par le virus de l'hepatite c |
| JPWO2003037081A1 (ja) * | 2001-10-30 | 2005-02-17 | 財団法人 東京都医学研究機構 | Ｈｃｖ遺伝子トランスジェニック動物 |
-
1999
- 1999-06-24 JP JP11178347A patent/JP2000152793A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002028174A1 (fr) * | 2000-10-03 | 2002-04-11 | Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research | Procedes d'infection par le virus de l'hepatite c |
| JPWO2003037081A1 (ja) * | 2001-10-30 | 2005-02-17 | 財団法人 東京都医学研究機構 | Ｈｃｖ遺伝子トランスジェニック動物 |
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