JPH11514855A

JPH11514855A - 再狭窄の処置および／または予防のためのリボザイム治療

Info

Publication number: JPH11514855A
Application number: JP9512173A
Authority: JP
Inventors: ゴールデンバーグ，ツヴィ; トリツ，リチャード
Original assignee: イミュソル，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-09-12
Filing date: 1996-09-12
Publication date: 1999-12-21
Also published as: WO1997010334A3; US5834440A; CA2231685A1; WO1997010334A2; EP0850301A2

Abstract

(57)【要約】再狭窄の有効な治療として、本発明は、血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を阻害するために有用な、リボザイムおよびリボザイム送達システムを提供する。リボザイムを産生する方法、およびこれらのリボザイムを利用する遺伝子治療もまた提供される。リボザイムは、特に、cdc2キナーゼ、PCNA、サイクリンB1、リシルオキシダーゼ、または細胞外マトリクスタンパク質に標的化される。

Description

【発明の詳細な説明】再狭窄の処置および/または予防のためのリボザイム治療技術分野本発明は、一般に、再狭窄の処置および/または予防に利用され得る治療法、およびより詳細には組成物、ならびに方法に関する。発明の背景 1992年に、300,000を超える血管形成術がアメリカ合衆国で行われた。再狭窄は、血管形成術後の主な合併症であり、30％〜60％の患者で起こる。実際に、再狭窄は、介入心臓学(interventional cardiology)におけるただ１つの最も重要な問題であり、そして保健医療システムに１年あたり10億ドルを超える費用がかかる。血管形成術後の再狭窄は、局所的な血管損傷の結果であり、そして血小板およびマクロファージの局所的な浸潤、ならびに凝固系の局所的な活性化により特徴づけられる。これらの因子は、平滑筋細胞(SMC)の移動および増殖の多くの生物学的メディエーターの生成をもたらす。これらのSMCは、血管内膜に移動し、そして増殖および細胞外マトリクス(ECM)の産生を開始し、その結果、血流を妨げ得る線維細胞塊の形成がもたらされる。さらに、損傷は、この損傷に対する細胞性応答に役割を果たすと考えられている種々のオンコジーンの発現を誘導することが示されている。従って、再狭窄を予防および処置するための有効な治療のための必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そしてさらに他の関連する利点もまた提供する。発明の要旨再狭窄の有効な治療として、本発明は、血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を阻害するために有用なリボザイムおよびリボザイム送達システムを提供する。リボザイムを産生する方法およびこれらのリボザイムを用いた遺伝子治療もまた提供される。従って、本発明の１つの局面において、リボザイムは、血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を阻害する能力を有する。好ましくは、このリボザイムは、ハンマーヘッドリボザイムまたはヘアピンリボザイムであり、これらの代表的な例は、以下および実施例において示される標的部位配列を認識する。好ましい実施態様において、本発明はまた、このようなリボザイムをコードする核酸分子（さらに好ましくは、核酸は、DNAまたはcDNAである）を提供する。なおさらに好ましくは、核酸分子は、核酸を転写するプロモーターの制御下にある。別の局面において、本発明は、本明細書中に記載のリボザイムを含む宿主細胞、本明細書中に記載のリボザイムをコードする核酸を含むベクター、およびこのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。好ましくは、ベクターは、プラスミド、レトロトランスポゾン、コスミド、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルス）である。ベクターがレトロウイルスベクターである１つの実施態様において、プロモーター（好ましくはpol IIIプロモーター、さらに好ましくはヒトtRNA^Valプロモーター、またはアデノウイルスVAlプロモーター）の制御下にあるリボザイムをコードする核酸分子は、レトロウイルスの５'長末端反復配列と３'長末端反復配列との間に挿入される。本発明はまた、このようなレトロウイルスベクターで安定に形質転換された宿主細胞を提供する。好ましくは、宿主細胞はマウスまたはヒトの細胞である。さらなる局面において、本発明は、リボザイムを産生するための方法を提供し、このリボザイムは血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を阻害し得、この方法は、プロモーターの転写制御下にあるリボザイムをコードする核酸分子(例えば、DNA)を提供する工程、およびこの核酸分子を転写してリボザイムを産生する工程を包含する。好ましくは、この方法は、産生されたリボザイムを精製する工程をさらに包含する。リボザイムは、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで産生され得る。なお別の局面において、本発明は、血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載したリボザイムの有効量を細胞に導入する工程を包含する。１つの実施態様において、このような方法は、本明細書中に記載のリボザイムをコードするDNAの有効量を細胞に導入する工程、およびこのDNAを転写してリボザイムを産生する工程を包含する。好ましくは、細胞は、ヒト細胞である。なおさらなる局面において、本発明は、血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を予防する方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載するリボザイムをコードする核酸分子(例えば、DNA)の有効量を細胞に導入する工程、およびこのDNA を転写してリボザイムを産生する工程を包含する。好ましくは、細胞はヒト細胞である。好ましい実施態様において、本方法は、レトロウイルスベクターで形質導入された細胞を、形質導入された細胞が得られた種と同一種の哺乳動物細胞に投与する工程をさらに包含する。他の好ましい実施態様において、レトロウイルスベクターで形質導入される細胞は、形質導入された細胞を受ける哺乳動物から得られた。本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明らかになる。さらに、より詳細な特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）を記載する種々の参考文献が本明細書中に示され、従って、それぞれが個々に援用のために言及される場合は、その全体が参考として援用される。図面の簡単な説明図１は、ベクターpLNT-Rzの模式図である。図２は、代表的なヘアピンリボザイムの模式図である。図３は、ヘアピンリボザイム遺伝子を発現するアデノウイルスベクターの模式図である。図４は、バルーン損傷したラット頸動脈に対するリボザイムの効果を示すグラフである。図５は、バルーン損傷したラット頸動脈に対するリボザイムの効果を示すグラフである。図６は、ラットPCNAに対して指向されたリボザイムの模式図である。図７は、ラットcdc-2キナーゼに対して指向されたリボザイムの模式図である。発明の詳細な説明定義本発明を示す前に、この後に使用される特定の用語の定義を最初に示すことは、その理解の手助けになり得る。「リボザイム」は、特定の核酸配列を切断し得る核酸分子をいう。リボザイムは、RNA、DNA、核酸アナログ（例えば、ホスホロチオエート）、またはこれらの任意の組合せ（例えば、DNA/RNAキメラ）から構成され得る。特に好ましい実施態様において、リボザイムは、特異的な認識のためのアンチセンス配列およびRN A切断酵素活性を有するRNA分子をいうことが理解されるべきである。「リボザイム遺伝子」は、RNAに転写されるとリボザイムを生じる、リボザイム配列からなる核酸分子(例えば、DNA)をいう。「ベクター」は、目的のリボザイムを発現し得る集合体をいう。ベクターは、デオシキリボ核酸(「DNA」)またはリボ核酸(「RNA」)のいずれかから構成され得る。必要に応じて、ベクターは、ポリアデニル化配列、１つ以上の制限部位、ならびに１つ以上の選択マーカー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、またはプロマイシン-N-アセチル-トランスフェラーゼ）を含み得る。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベクターに依存して、他の遺伝子エレメント（例えば、複製起点、さらなる核酸制限部位、エンハンサー、転写の誘導性を付与する配列、および選択マーカー）はまた、本明細書中に記載のベクターに組み込まれ得る。再狭窄は主要な臨床的問題であり、そして入院、血管形成術またはバイパス手術を繰返す必要性があるために、再狭窄により、国の保健医療システムに１年あたり10億ドルを超える費用がかかる。再狭窄は、３つの重要な要素からなると考えられている。第１に、血管平滑筋細胞の筋肉膜での（myointimal）増殖およびその後のECMの沈着により、血管腔を侵入し得る線維細胞塊が生じる。第２に、急激な血管形成の後に、後に管腔容積の喪失をもたらす動脈の著しい弾性的な反動が生じ得る。最後に、血管壁に付着した血小板および血栓が経時的に線維細胞塊を形成し得る。平滑筋細胞(SMC)は、種々の増殖因子（血小板由来増殖因子(PDGF)、形質転換増殖因子(TGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、インスリン様増殖因子(IGF)、およびインターロイキンを含む）を産生し、そしてこれに応答し得る。これらの同一の因子は、ヒトの再狭窄病変部に見出されている。さらに、種々のオンコジーン (例えば、c-myc、c-fos、およびc-myb)は、平滑筋細胞の移動および増殖、ならびに血管損傷後に関連するECMの沈着に関与することが見出されている。平滑筋細胞自身は、局所的なオートクラインおよびパラクライン機構により、それ自身の増殖を調節し得る。以下により詳細に記載するように、血管損傷後のSMC増殖に関与する、増殖因子、オンコジーン、および細胞調節タンパク質の局所的産生および作用に干渉することにより、再狭窄が効果的に処置および/または予防され得る。本発明は、血管損傷後のSMC増殖に関与する、増殖因子、オンコジーン、および細胞調節タンパク質の産生を直接ブロックするリボザイムおよびこのリボザイムを用いる方法を提供することにより、これを達成する。リボザイム上記のように、本発明は、病原性の平滑筋増殖および再狭窄の形成を阻害するか、妨げるか、または遅延させる能力を有するリボザイムを提供する。いくつかの異なる型のリボザイムが、本発明の範囲内における使用のために構築され得、これらのリボザイムには、例えば、以下のものが含まれる。ハンマーヘッドリボザイム(Rossi，J．J.ら、Pharmac．Ther．50:245-254，1991)(ForsterおよびSym ons，Cell 48:211-220，1987; HaseloffおよびGerlach，Nature 328:596-600，1 988; WalbotおよびBruening，Nature 334:196，1988; HaseloffおよびGerlach, Nature 334:585，1988; Haseloffら、米国特許第5,254,678号)、ヘアピンリボザイム（Hampelら、Nucl．Acids Res．18:299-304，1990、および米国特許第5,254 ,678号)、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム(PerrottaおよびBeen，Biochem．31: 16，1992)、グループＩイントロンリボザイム(Cechら、米国特許第4,987,071号) 、RNase Pリボザイム(Takadaら、Cell 35:849，1983)；(例えば、「鎖置換による産物排出をともなうリボザイム」と題されたWO 95/29241；および「新規の酵素的RNA分子」と題されたWO 95/31551を参照のこと。 Cechら、（米国特許第4,987,071号、1991年１月22日発行）は、エンドリボヌクレアーゼ活性を有する特定の合成リボザイムの調製および使用を開示した。これらのリボザイムは、TetrahymenaリボソームRNA自己スプライシング反応の特性に基づき、そして遊離のグアノシンまたはグアノシン誘導体を要求する８塩基対の標的部位を必要とする。エンドリボヌクレアーゼ活性について50℃の最適温度が、報告されている。切断から生じるフラグメントは、5'リン酸基および3'ヒドロキシル基を含み、そして遊離のグアノシンヌクレオチドが、切断されたRNAの5 '末端に付加されている。対照的に、本発明のリボザイムは、生理的な温度で標的配列に効率的にハイブリダイズし、それらを単に研究の道具としてのみではなく、インビボでの使用に適させる(Cechら、米国特許第4,987,071号の15列、18〜 42行を参照のこと)。本発明の範囲内での使用に特に好ましいリボザイムは、ヘアピンリボザイム（例えば、1990年３月26日公開されたHampelら、欧州特許公開第0 360 257号に記載される）である。簡単には、ヘアピンリボザイムについての配列要件は、NNNB N^*GUC(N)_x(配列番号１〜５)(ここで、Xは、6から10の任意の番号であり、N^*Gは、切断部位であり、Bは、G、C、またはUのいずれかであり、そしてNは、G、U、C 、またはAのいずれかである)からなる任意のRNA配列である。ヘアピンリボザイムの認識配列または標的配列の代表的な例は、以下で実施例において示される。さらに、ヘアピンリボザイムの骨格領域または共通領域は、天然のヘアピンリボザイムのヌクレオチド配列を用いて設計され得る(Hampelら、Nucl．Acids Res. 18:299-304，1990)か、または安定性および触媒活性を増加する「テトラループ」構造を含むように改変され得る（Yuら、Virology 206:381-386，1995; Cheong ら、Nature 346:680-682，1990; Andersonら、Nucl．Acids Res．22:1096-1100 ，1994)。ハンマーヘッドリボザイムの切断部位での配列要件は、標的化され得るNUX（ここで、Nは、G、U、C、またはAのいずれかであり、そしてXは、C、U、またはAを示す）からなる任意のRNA配列である。従って、ヘアピンリーダー配列 GUC内の同一の標的は、ハンマーヘッドリボザイムに有用である。ハンマーヘッドリボザイムまたはヘアピンリボザイムのさらなるヌクレオチドは、標的に隣接するヌクレオチドおよびハンマーヘッドコンセンサス配列によって決定される(R uffnerら、Biochemistry 29:10695-10702，1990)。上記の情報、ならびに本明細書中で提供される配列および開示は、本発明のヘアピンリボザイムの産生を可能にする。リボザイムにおける適切な塩基変化は、標的配列との必要な塩基対合を維持するためになされる。１つの実施態様において、本明細書中に提供されるリボザイムは、血管組織での異常な平滑筋細胞増殖を担う増殖因子の活性を阻害する能力を有する。このような増殖因子には、血小板由来増殖因子、線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、c-myc、c-cmyb 、c-fos、cdc2キナーゼ(Genbankアクセス番号Y00272；LeeおよびNurse，Nature 327:31-35，1987)、増殖細胞核抗原（「PCNA」Genbankアクセス番号J04718；Tra vailら、G．Biol．Chem．264(13):7466-7472，1989)、サイクリンB1（Genbankアクセス番号M25753;PinesおよびHunter，Cell 58:833-846，1989)、リシルオキシターゼ(Genbankアクセス番号M94054)、TGF-αおよびTGF-βタンパク質、インターロイキン、ならびに細胞外マトリクスの成分が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される用語「異常な平滑筋細胞増殖」は、任意の、血管形成手順、ステント手順、バルーン血管形成手順、アテレクトミー手順、レーザー手術手順、血管内手順、または外科的手順にともなう血管損傷または外傷に応答して起こる任意の小さな細胞増殖および細胞外マトリクスの沈着を意味することが理解されるべきである。本発明のリボザイムならびにこのようなリボザイムをコードするDNAおよびより詳細に以下に記載される他の適切な核酸分子は、核酸分子の合成のための当該分野で周知の方法を用いて化学的に合成され得る(例えば、Heidenreichら、J．F ASEB 70(1):90-6，1993; Sproat，Curr．Opin．Biotechnol．4(1):20-28，1993 を参照のこと)。あるいは、Promega，Madison，Wis.，USAは、リボザイムのような核酸分子の産生に適切な一連のプロトコルを提供する。本発明の他の局面において、リボザイムはまた、DNA分子、またはRNAポリメラーゼプロモーター（例えば、T7 RNAポリメラーゼまたはSP6 RNAポリメラーゼのプロモーター）に作動可能に連結する他の核酸分子（これは、転写の際にRNA分子を生じる）から調製され得る。従って、本発明はまた、核酸分子（例えば、本発明のリボザイムをコードするDNAまたはcDNA）を提供する。ベクターがまた、D NA分子に作動可能に連結したRNAポリメラーゼプロモーターをも含む場合、リボザイムは、RNAポリメラーゼおよび適切なヌクレオチドとのインキュベーションの際にインビトロで産生され得る。別の実施態様において、DNAは、CottenおよびBirnstiel，EMBO J．8(12):3861-3866，1989、およびHempelら、Biochemistry 28:4929-4933，1989に記載されるような発現カセット中に挿入され得る。分子生物学方法論のより詳細な考察は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laborat ory Mannual，Cold Spring Harbor Press，1989に開示されている。合成の間、リボザイムは、リボザイムを安定化する能力を有するDNA分子への連結により改変され得、そしてRNaseに対してリボザイムを耐性にする（Rossiら、Pharmac．Ther．50:245-254，1991)。あるいは、リボザイムは、リポソーム送達システムにおける使用のためにホスホチオアナログに改変され得る。この改変はまた、リボザイムをエンドヌクレアーゼ活性に対して耐性にする。ベクター異常な平滑筋細胞増殖を処置するためのリボザイムの使用は、目的の細胞への機能的リボザイムの導入を包含する。これは、機能的リボザイムを送達前にインビトロで合成すること、またはインビボでリボザイム合成を駆動し得るDNAの送達のいずれかにより達成され得る。より詳細には、本発明の他の局面において、リボザイム遺伝子は、宿主細胞（例えば、培養内または生物の細胞内の原核細胞または真核細胞）への導入に適したベクター内に構築され得る。適切な原核細胞および真核細胞は、本発明のリボザイムをコードする核酸分子を含む適切な移入ベクターでトランスフェクトされ得る。リボザイムをベクターでインビボで産生させるために、リボザイムをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、pol III（例えば、tRNA）プロモーター、C MVプロモーター、SV40後期プロモーター、またはSV40初期プロモーターのような真核生物プロモーターの制御下に配置される。特定の実施態様において、プロモーターは、例えば、以下のような組織特異的プロモーターであり得る：アルブミンプロモーターおよびアルファフェトタンパク質プロモーター(Feuermanら、Mol ．Cell．Biol．9:4204-12，1989; CamperおよびTilghman，Genes Develop．3:53 7-46，1989)；アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター(Felder，Proc．Natl. Acad．Sci．USA 86:5903-07，1989)；アポリポタンパクＢ遺伝子プロモーター(D asら、J．Biol．Chem．263:11452-8，1988)；凝固プロテアーゼ第VII因子遺伝子プロモーター(Erdmannら、J．Biol．Chem．270:22988-96，1995)；フィブリノーゲンγ遺伝子プロモーター(Zhangら、J．Biol．Chem．270:24287-91，1995)；グルコキナーゼ遺伝子プロモーター(Williamsら、Biochem．Biophys.，Res．Comm ．212:272-9，1995)；肝臓ホスホフルクトキナーゼ遺伝子プロモーター(Levanon ら、Biochem．Mol．Biol．Int．35:729-36，1995)；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（「PEPCK」）プロモーター(Hatzogiouら、J．Biol．Chem． 263:17798-808，1988; Benvenistyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:1118-22 ，1989; Vaulontら、Mol．Cell．Biol．9:4409-15，1989)；またはリンパ特異的プロモーター。従って、リボザイムは、移入ベクターからインビボで直接産生され得る。広範な種々のベクターが、本発明の文脈において利用され得る。これらのベクターには、例えば、プラスミド、ウイルス、レトロトランスポゾン、およびコスミドが含まれる。代表的な例には、アデノウイルスベクター（例えば、WO94/269 14、WO93/9191；Yeiら、Gene Therapy 1:192-200，1994; Kollsら、PNAS 91(1): 215-219，1994; Kass-Eislerら、PNAS 90(24):11498-502，1993; Guzmanら、Cir culation 88(6):2838-48，1993; Guzmanら、Cir．Res．73(6):1202-1207，1993; Zabnerら、Cell 75(2):207-216，1993; Liら、Hum Gene Ther．4(4):403-409， 1993; Caillaudら、Eur．J．Neurosci．5(10):1287-1291，1993)、アデノ随伴１型（「AAV-1」）またはアデノ随伴２型（「AAV-2」）ベクター(WO95/13365; Flo tteら、PNAS 90(22):10613-10617，1993を参照のこと)、デルタ肝炎ベクター、活性の弱毒デルタウイルスおよびヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第5,288,641号)、ならびに米国特許第5,166,320号において開示されるベクターが含まれる。他の代表的なベクターには、レトロウイルスベクター（例えば、EP 0 415 731; WO90/07936; WO91/02805; WO94/03622; WO93/25698; WO93/25234; 米国特許第5,219,740号；WO93/11230; WO93/10218）が含まれる。遺伝子治療においてこのようなベクターを用いる方法は、当該分野において周知である。例えば、Larrick，J．W.およびBurck，K．L.，Gene Therapy: Application of Molec ular Biology，Elsevier Science Publishing Co.，Inc.，New York，New York, 1991およびKreigler，M.，Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manu al，W．H．Freeman and Company，New York，1990を参照のこと。本発明により、本発明のリボザイムをコードする１つより多い核酸分子を有するベクターが、その各々が分離した真核生物プロモーターの制御下で、あるいは単一の真核生物プロモーターの制御下でさらに提供される。本発明のベクターにより送達され得る他の治療分子の代表的な例には、インターフェロン（例えば、 α、β、またはγ）、および広範な種々の他のサイトカインまたは増殖因子が含まれる。これらのベクターは、異常な平滑筋細胞増殖に対する多機能治療を、好ましくは種々の治療が相乗作用的に一緒に作用しながら、提供するという利点を提供する。上記のリボザイム、核酸、および/またはベクターを含む宿主細胞はまた、本発明の範囲内にある。これらの宿主細胞は、例えば細菌細胞のような原核細胞、または哺乳動物細胞、ヒト細胞、ラット細胞、もしくはマウス細胞のような真核細胞であり得る。リボザイムをコードする核酸を形質導入された宿主細胞は、リボザイムを組換え的に産生するために有用である。従って、本発明により、インビトロまたはインビボでリボザイム（異常な平滑筋細胞増殖を血管組織において阻害し得るリボザイム）を産生する方法がまた提供される。リボザイムをコードするDNAは、細胞に提供され、このDNAは、当業者に周知の方法を用いてプロモーターの転写制御下にある。本明細書中で参考として援用されるSambrookら、Mole cular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989) を参照のこと。次いで、DNAは、細胞において転写されてリボザイムを産生する。インビトロで産生される場合には、リボザイムは、当該分野で周知の方法を用いて細胞から精製または単離され得る。送達本発明の特定の局面において、リボザイム分子、またはリボザイムをコードする核酸分子は、ビヒクルを利用して、または種々の物理的な方法により宿主細胞に導入され得る。このような方法の代表的な例には、リン酸カルシウム沈澱を用いる形質転換(Dubenskyら、PNAS 81:7529-7533，1984)、インタクトな標的細胞中へのこのような核酸分子の直接的マイクロインジェクション（Acsadiら、Natu re 352:815-818，1991)、および伝導溶液中に懸濁される細胞が、一過的に膜を穿孔するために強力な電場に供され、核酸分子の侵入を可能にするエレクトロポレーションが含まれる。他の手順は、不活性なアデノウイルスに連結された核酸分子(Cottonら、PNAS 89:6094，1990)、リポフェクション(Felgnerら、Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 84:7413-7417，1989)、マイクロプロジェクタイルボンバードメント(Williamsら、PNAS 88:2726-2730，1991)、ポリリジンのようなポリカチオン化合物、レセプター特異的リガンド、核酸分子を包含するリポソーム、核酸分子を含むE．coliが、ポリエチレングリコール、ウイルスの形質導入を用いてその外細胞壁をはぎ取られ、そして動物細胞に融合されるスフェロプラスト融合（Clineら、Pharmac．Ther．29:69，1985;およびFriedmannら、Science 244:1 275，1989)、およびDNAリガンド（Wuら、J．of Biol．Chem．264:16985-16987， 1989）の使用を含む。１つの実施態様において、リボザイムは、リポソームを用いて宿主細胞中に導入される。薬学的組成物上記のように、薬学的組成物がまた本発明により提供される。これらの組成物は、任意の上記のリボザイム、DNA分子、ベクター、または宿主細胞、ならびに薬学的もしくは生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈物を含む。一般に、このようなキャリアは、使用される投薬量および濃度ではレシピエントに対して非毒性でなければならない。通常、このような組成物の調製は、治療剤と、緩衝液、アスコルビン酸のような酸化防止剤、低分子量（約10残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物(グルコース、スクロース、またはデキストリンを含む)、EDTAのようなキレート剤、グルタチオン、ならびに他の安定化剤および賦形剤との組合せを必要とする。中性の緩衝化生理食塩水または非特異的な血清アルブミンと混合された生理食塩水が、例として適切な希釈液である。さらに、本発明の薬学的組成物は、種々の異なる経路による投与のために調製され得る。それらの経路には、例えば、関節内、頭蓋内、皮内、肝臓内、筋肉内、眼内、腹腔内、くも膜下腔内、静脈内（例えば、門脈中へ）、または皮下が含まれる。さらに、本発明の薬学的組成物は、容器内に、このような薬学的組成物の使用に関する説明を提供するパッケージング材料とともに配置され得る。一般に、このような説明は、試薬濃度、および特定の実施態様においては、薬学的組成物を再構成するために必要であり得る賦形剤成分または希釈物（例えば、水、生理食塩水、またはPBS）の相対的な量を記載する明確な表現を含む。治療学的方法異常な平滑細胞血管組織の増殖または再狭窄を干渉、防止、または阻害する方法がまた、本発明によって提供される。このような方法は、細胞を本発明の有効量のリボザイムに接触させるか、あるいは、細胞をリボザイムをコードする核酸分子を有する有効量のベクターで形質導入することが必要である。有効量は、周知の方法論を用いて当業者により容易に決定される。リボザイムを外因的に送達する場合、RNA分子は、安定なRNA分子内に、または保護環境の別の形態（例えば、リポソーム）に埋め込まれ得る。あるいは、RNAは、RNase耐性DNA相対物内に埋め込まれ得る。外因性リボザイムの細胞の取り込みは、化学基（例えば、コレステロール部分）をDNA末端に付着させることによって増大され得る（Letsinger ら、P.N.A.S.,U.S.A.,1989）。本発明の別の局面において、標的細胞は、ベクターの標的細胞への挿入およびリボザイムをコードする核酸の安定な発現を好む条件下で形質導入される。標的細胞には、血管平滑筋細胞または細胞外マトリクスの形成に関与するタンパク質の沈着を担う細胞が挙げられ得るが、これらに限定されない。従って、本発明の別の局面は、標的RNA配列と本発明のリボザイムとを反応させることによって、適切な細胞中の異常な平滑筋増殖を干渉または防止する方法を提供する。細胞内または生物の細胞内で、１つ以上のリボザイムをコードする上記の移入ベクターは、Llewwllynら、(1987)J．Mol．Biol．195:115-123および Hanahanら、（1983）166:557-580（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）に記載された方法を用いて細胞にトランスフェクトされる。細胞の内側において、移入ベクターは複製し、そしてリボザイムをコードするDNAは、細胞性ポリメラーゼによって転写されて、その後に異常な平滑筋細胞増殖、異常な細胞外マトリクス沈着、および再狭窄を担う因子を不活化するリボザイムを産生する。マイクロインジェクションのような極微操作はまた、ベクターを細胞に挿入するために使用され得、その結果移入ベクターまたはその一部は、細胞のゲノムに組み込まれる。組み込まれた物質の転写物は、その後に標的タンパク質を不活化するリボザイムを生じる。本明細書中で使用されるように、用語「不活化する」は、上記で議論されるようなタンパク質産物（例えば、c-mycまたはTGF- β）の産生の干渉を意味することが意図される。血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を阻害する別の方法は、リボザイムを産生するためのDNAの転写を好む条件下で、上記のリボザイムをコードする有効量のDNAを細胞に導入する工程からなる。この方法はまた、異常なSMCおよび異常な細胞外マトリクス沈着を防止し、従って、再狭窄を防止するために有用である。DNAは、キャリアまたはキャリア中のベクターに多くの方法によって移入され得る。例えば、DNAは、血管壁への管腔貫通的（transluminal）送達によるかまたは管腔外的に（exoluminally）投与され得る。別の局面において、活性DNAは、生分解性ポリマーまたは生分解性スフェア（sphere）中に埋め込まれ、そして血管ステントによって投与され得る。あるいは、それは、側板ゲル（pleuronic gel）中に送達され得る。被験体（例えば、ヒトのような温血動物）中の血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を阻害または防止する方法がまた本発明によって提供され、この方法は、血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を阻害する能力を有する有効量のリボザイムを被験体に投与する工程を包含する。リボザイムは、管腔外的に、管腔貫通的に、ステントによって、生分解性ポリマーもしくは生分解性スフェアによって、または側板ゲルにおいて平滑筋細胞に送達される。以下の実施例は、例示のために提供され、そして制限のために提供されない。実施例実施例１リボザイム部位選択のための基準Ａ．ヘアピンリボザイム部位の選択本発明の特定の実施態様内で、以下のRNA配列：NNNBNGUCNNNNNNNN（配列番号３）を認識する本発明の範囲内での使用に適切なヘアピンリボザイムを提供する。ここで、リボザイムを、下線の配列に相補的であるように構築し、ここで、B は、C、G、またはUである。配列GUCは、以下に記載の全てのヘアピンリボザイムのために保存されなければならない。他のヌクレオチド（上記で下線の「N」）は、好ましくは、同じ標的部位に対する多数のリボザイムの必要性を制限するために高度の配列保存性を有する。種々の遺伝子の代表的なGUCヘアピンリボザイム認識部位を、以下の表１〜４に提供する。Ｂ．ハンマーヘッドリボザイムの切断部位の選択本発明の範囲内での使用に適切なハンマーヘッドリボザイムは、好ましくは、配列NUXを認識する。ここで、Nは、G、U、C、またはAのいずれかであり、そして XはC、U、またはAである。代表的なハンマーヘッド標的部位は、以下を含む：実施例２ヘアピンリボザイムの構築２つの１本鎖DNAオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、その結果それらは、結合し、そして２本鎖DNAに変換する場合、標的部位に相補的なヌクレオチドを含む完全なヘアピンリボザイムを含有する。さらに、制限酵素認識部位を、引き続くクローニングを促進するためにいずれかの末端に位置し得る。より詳細には、オリゴヌクレオチドを共にハイブリダイズし、そしてクレノウDNAポリメラーゼまたはTaq DNAポリメラーゼのいずれかを用いて２本鎖DNAに変換した。得られたDNAを、制限酵素BamHIおよびMluIで切断し、精製し、そしてインビトロ転写のためのベクター（pGEM、ProMega,Madison，Wis）またはレトロウイルス産生および哺乳動物発現のためのベクター（pLNL/MJT骨格）にクローン化した。代表的なヘアピンリボザイムを、以下に示す（下線の配列は、リボザイムが標的配列に結合する部位を示すことに留意のこと）。図２に示すように配列AAAをUGCに換えることを除いて、コントロールとしての使用のための欠失リボザイムを、上記のように構築し得る。実施例３ハンマーヘッドリボザイムの構築キメラハンマーヘッドリボザイム（すなわち、RNA/DNAハイブリッド）を、リボザイム切断のための適切なNUX配列を有するように設計する。簡単に述べれば、リボザイムをラットCDC2キナーゼ遺伝子（-30〜-14までのヌクレオチド配列）、ラットPCNA（-17〜＋2までのヌクレオチド配列）の標的配列について化学的に合成する。（図６および７を参照のこと。）さらに、以下のヒトハンマーリボザイムを合成する。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの同じ組成を含む、スクランブル化（scrambled）配列のポリヌクレオチドをまた、触媒活性を有さないコントロールとして作用させるために各々のリボザイムについて合成する。リポフェクチンを利用して、細胞中へのリボザイムの取り込みを増大させ得る。実施例４リボザイム哺乳動物発現ベクターの構築プラスミドpMJT（Yuら、Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 90:6340-6344，1993）（これは、tRNA^valRNA pol IIIプロモーターにより駆動される抗U5 HIVリボザイムを含む）をBamHIおよびMluIで消化し、そしてリボザイムフラグメントからベクターを精製する。上記のようなヘアピン（hairpin）リボザイムをpGemベクターからBamHIおよびMluIを用いて切り出し、精製し、そして空のpMJTベクターに連結する。得られたベクターをpLNT-Rz（図１を参照）と名付け、そしてこれは、Moloney LTR駆動性ネオマイシン耐性遺伝子およびリボザイムの発現を駆動するtRNA^val RNA pol IIIプロモーターを含む。実施例５アデノウイルスベクターの構築Ａ．レポーター遺伝子としてβ-ガラクトシダーゼを発現するアデノウイルスベクターの構築（AvCLacZ）。以下により詳細に記載するように、シャトルプラスミドpAvCLacZはアデノウイルスベクター（AV）の作製を必要とする。簡潔には、pAvCLacZ（pBR322ベースのプラスミド）を以下を含むように構築した：Ad5ゲノム（Genebankアクセス番号M 73260）のヌクレオチド塩基（nt）１〜452、構成的なCMV即時初期／遺伝子エンハンサーおよびプロモータースプライシングドナーおよびアクセプターシグナルからなるレポーター発現カセット（pCMVβ由来、Clontech）、E．coli β-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）、ならびにSV40 poly A、ならびに相同組換えフラグメントとしてAd5ゲノムのnt3328〜5788。このプラスミド中のレポーターは、ヒトpCNAまたはCDC2キナーゼmRNAのヘアピンリボザイム遺伝子のような任意の目的の遺伝子と置き換えられ得る。組換えアデノウイルスベクターをpAVシャトルプラスミドおよびpJM17（Bicrobix Biosystems，Ontario，Canada）で同時トランスフェクトされた293細胞中で作製する。293細胞単層上のAVプラークを選択し、ゲノム組成についてチェックし、そして日常的に行われるように少なくとも２回以上プラーク精製した（Yeiら、Human Gene Therapy 5:731-744，1994）。得られたアデノウイルスベクターをAvCLacZと名付ける。AvCLacZを293細胞中で増殖させ、そして他（Yeiら、Human Gene Therapy 5:731-744，1994）に記載されるように精製した。次いで、アデノウイルスベクター調製物を力価測定し、そして形質導入効率および毒性実験のために使用した。日常的には、組換えAvベクター調製物の力価は、293細胞上でのプラークアッセイによって測定される場合10¹ ¹ から10¹²pfu/mlの間である。Ｂ．ヒトPCNAまたはcdc2キナーゼ遺伝子の不活化に特異的なヘアピンリボザイム遺伝子を発現するアデノウイルスベクターの作製。再狭窄の２つの標的（ヒトPCNAおよびcdc2キナーゼmRNA）に特異的なリボザイム遺伝子を含む組換え複製欠損（E1欠失）アデノウイルスベクター（Av）をpJM1 7（Bicrobix Biosystems，Ontario，Canada）を用いるシャトルプラスミド（pAv CRz；図３）の相同組換えによって構築した。上記のシャトルプラスミドpAvCLac Zは、以下のエレメントを含む：(1)Ad5配列１〜452（Genebankアクセス番号M732 60；左逆方向末端反復配列、カプシド化シグナル、およびElaエンハンサー）、人工のXbaI、BamHI、およびXhoI部位、(2)CMV即時／初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサー（pCMVβ発現ベクター由来、Clontech; Boshartら、Cell 41:5 21-530，1985）、人工のBamHIおよびXhoI部位、SV40スプライスドナー／スプライスアクセプター配列（pCMVβ発現ベクター由来、Clontech）、連続に配置されたBamHI、NotI、BglII、EcoRV、AscI、NotI、BamHI部位を含む人工のマルチクローニング部位、SV40ポリアデニル化（pCMVβ発現ベクター由来、Clontech）、人工のBamHI、SalI、およびClaI部位；ならびに(3)相同組換えのために用いられる Ad5配列（Ad5配列3328〜5788）。特異的なリボザイム遺伝子（実施例１および２を参照）を、BglIIおよびAscIクローニング部位を介してシャトルプラスミドにクローン化した。 293細胞を、シャトルプラスミドおよびpJM17の両方で、CaPO₄またはリポフェクチン法を用いて同時トランスフェクトした。組換えアデノウイルスベクターはプラークを形成し、そしてそれをトランスフェクトした293単層から精製した。得られたAVを、日常的に行われるように少なくとも２回以上さらにプラーク精製した（Yeiら、Human Gene Therapy 5:731-744，1994）。AVを293細胞中で増殖させ、そしてCsCl精製して高力価調製物とし、その後、抗PCNAまたはcdc2キナーゼ Rzの機能を評価した。実施例６インビトロ切断アッセイヘアピンリボザイムをインビトロ転写ベクター（pGEM-7Z，ProMega，Madison, Wis.）中にクローン化し、そしてT7 RNAポリメラーゼによってインビトロで翻訳させる。転写後、反応物をDNaseで処理し、そしてリボザイムを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製する。次いで、基質を[α-³²P]UTPの存在下でインビトロで翻訳させ、そして変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する。40nMのリボザイムを200nMの基質とともに、12mM MgCl₂／２mMスペルミジン／40mM Tris-HCl，pH7.5中で37℃で０〜60分間インキュベートすることによって、インビトロの切断反応を行う。反応をローディング緩衝液（７Ｍ尿素／ブロモフェノールブルー／キシレンシアノール）の添加により停止させる。切断反応の生成物を、15％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上での電気泳動により分離し、そしてオートラジオグラフィーによって解析する。実施例７リボザイムのインビボでの使用Ａ．実験プロトコル全ての動物をAmerican Physiological Societyのガイドラインに従って処置する。簡潔には、#2 Fr fogartyカテーテルを用いて雄性Sprague-Dawleyラット（体重400〜500g）に脈管損傷を誘導する。ラットを麻酔し、そしてカニューレを、外頸動脈を介して左総頸動脈に導入する。次いで、総頸動脈を、膨らませたfo gartyカテーテルを３回引くことによって傷つける。100匹の動物を実験し、そして６つの異なる群に分類する：総頸動脈の脈管損傷後、損傷したセグメントを仮結紮することにより一時的に単離する。簡潔には、リポフェクチンとハンマーヘッドリボザイム（40μg）との組み合わせの200マイクロリットルを、単離したセグメント中で15分間インキュベートする。15分間のインキュベーション後、結紮を除去する。外頸動脈を結紮し、そして総頸動脈および内頸動脈における血流を回復させる。次いで、皮膚創傷を修復し、そして動物をそれらの飼育ケージに移す。次いで、動物を２週間後に安楽死させ、そして動脈を回収する。これをホルマリン中で灌流固定し、そして組織病理学に供した。続いて、組織病理学的切片を定量的な組織学によって分析する。コンピューターにより容易化された面積測定を用いて、管腔の面積、内膜の面積、および中膜の面積を測定し、そして中膜の面積に対する内膜の面積の比を計算する。全ての値を、平均±標準偏差および平均±平均の標準誤差として表す。これらのパラメーターのそれぞれについての統計学的な比較を、全ての群の間で行う。定量的な組織学の結果を図４および５に示し、そして表10にまとめる。簡潔には、内膜の断面積および中膜の面積に対する内膜の面積の比の両方が、スクランブル化配列ポリヌクレオチドまたは通常の生理食塩水で処理したリボザイムと比較して、リボザイムにおいて有意に減少していた。内膜の過形成はCDC-2キナーゼリボザイム、PCNAリボザイム、およびそれらの組み合わせによって阻害された。組み合わせによるさらなる効果は示されなかった。Ｂ．さらなるアッセイ１．組織培養プロトコル平滑筋細胞（SMC）をラット大動脈から単離し、そしてDMEM培地および10％ FB S中で維持する。MMT アッセイ：これは、細胞増殖および生存についての定量的な比色定量アッセイである。ラットSMC（４〜８継代物）を、処理の１日前に96ウェルプレート（1500細胞／ウェル）に播種する。次いで細胞を、２mMのCDC-2キナーゼ／PCNAリボザイム、および４mMリポフェクチンで１時間処理する。リボザイム（４mM）の２回目の用量を２日目に添加する。３日目に、10mLのMTTを各ウェルに４時間添加する。細胞内の色素を、ウェルからあらゆる上清色素を洗浄した後にDMSO中で抽出する。マイクロプレートリーダーを用いて、590mMにてODを測定する。 PCNAリボザイムを用いるMTTアッセイは、MTTの取り込みによって測定する場合、スクランブル化した配列で処理した細胞およびコントロール細胞と比較して、細胞培養物中の細胞増殖の顕著な阻害を示す。２．mRNA の定量 SMC（４〜８継代物）を処理の１日前に培養ディッシュに播種する。リボザイム、スクランブル化配列ポリヌクレオチド、10％ FBS、または血清非含有培地で２〜６時間処理した後に、RNAを細胞から抽出する。次いで、RT-PCRを、Perkin ElmerのRNA-PCRキットを利用して行う。CDC-2キナーゼまたはPCNAについて適切なプライマー配列を分析のために使用する。β-アクチンプライマーを用いて各ウェルにロードされるRNAの量がほぼ等量であることを確実にする。 CDC-2キナーゼリボザイムを用いるRT-PCR研究は、コントロールと比較して２時間でCDC-2キナーゼのmRNAの減少を示し、そして６時間でさらなる減少を示す。等量のRNAをそれぞれのウェルにロードすることを確実にするために、各群の βアクチンmRNAの同様のレベルを示すβアクチンのプライマーを用いて、RT-PCR を行う。３．タンパク質発現３つの型のタンパク質アッセイをまた達成し得、これらは以下のアッセイを包含する：ａ）ウェスタンブロッティング；ｂ）35S標識メチオニンでの生合成的な標識化後の、新たに合成した標的タンパク質の測定としての放射性標識タンパク質の免疫沈降；およびｃ）CDC-2キナーゼについてのヒストンH1キナーゼアッセイ。ヒストンH1キナーアッセイはCDC-2キナーゼについての機能的アッセイであり、そしてATPからヒストンH1に転移されたp32標識化リン酸の量を測定する。４．抗PCNAおよびCDC2のウェスタンブロッティング細胞を１×SDSサンプル緩衝液中で煮沸することにより溶解させた。細胞溶解物のタンパク質濃度をBradfordアッセイ（USB）によって決定した。次いで、25 μgの全タンパク質を14％Tris-glycineゲル（Novex）にロードし、そして電気泳動によって互いに分離した。次いで、タンパク質ゲルをPVDF Immobilonメンブレン（Millipore）にセミドライで移した。アミドブラック染色および写真撮影を行い、等量のタンパク質のローディングを確認した。メンブレンを５％ミルクでブロックし、そして特異的な一次抗体（抗ラットPCNAモノクローナル抗体、Immu notech、または抗ヒトcdc-2モノクローナル抗体、Pharmingen）とともに、５％ミルク／１×PBS中の１μg/mlで４時間、室温でインキュベートした。ブロットを、１×PBS／0.05％ Tween-20で完全に洗浄し、そしてHRP結合ヤギ抗マウスIgG （Chemicon）とともに１時間インキュベートした。次いで、ブロットをECL（Ame rsham）によって発光させ、そしてフィルムに感光させた。PCNAは36kDのバンドを生じ、一方cdc2キナーゼは34kDのバンドを生じた。上記から、本発明の特定の実施態様が例示の目的のために本明細書中に記載されるが、種々の改変が本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得ることが明らかである。従って、本発明は添付の請求の範囲により限定される場合を除いては限定されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】１．血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を阻害する能力を有するヘアピンリボザイムまたはハンマーヘッドリボザイム。２．前記リボザイムが、血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を担う増殖因子の活性を阻害する能力を有する、請求項１に記載のリボザイム。３．前記リボザイムが、cdc2キナーゼ、PCNA、サイクリンB1、またはリシルオキシダーゼの活性を阻害する、請求項１に記載のリボザイム。４．前記リボザイムが、細胞外マトリクスタンパク質の産生を担うタンパク質を特異的に切断する、請求項２に記載のリボザイム。５．前記リボザイムが、血管組織における細胞外マトリクスの異常な沈着を予防する能力を有する、請求項１に記載のリボザイム。６．請求項１に記載のリボザイムをコードする核酸分子。７．前記核酸がDNAまたはcDNAである、請求項６に記載の核酸分子。８．前記核酸を転写するためのプロモーターの制御下にある、請求項６に記載の核酸分子。９．請求項１に記載のリボザイムを含む宿主細胞。１０．請求項６に記載の核酸を含むベクター。１１．請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。１２．前記ベクターが、プラスミド、ウイルス、レトロトランスポゾン、またはコスミドである、請求項１０に記載のベクター。１３．前記ベクターがアデノウイルスベクターまたはAAVである、請求項１２に記載のベクター。１４．請求項１３に記載のベクターで安定に形質転換された宿主細胞。１５．前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項９または１４に記載の宿主細胞。１６．リボザイムを産生するための方法であって、該リボザイムは血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を阻害し得、該方法は、プロモーターの転写制御下でリボザイムをコードするDNAを提供する工程、該DNAを転写して該リボザイムを産生する工程を包含する、方法。１７．前記リボザイムがインビトロで産生される、請求項１６に記載の方法。１８．産生された前記リボザイムを精製する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。１９．前記リボザイムがインビボで産生される、請求項１６に記載の方法。２０．血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を阻害する方法であって、請求項１に記載のリボザイムの有効量を細胞に導入する工程を包含する、方法。２１．血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を阻害する方法であって、DNAの転写に好ましい条件下で請求項６に記載のDNAの有効量を細胞に導入して、リボザイムを産生する工程を包含する、方法。２２．前記細胞がヒト細胞である、請求項２０または２１に記載の方法。２３．血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を予防する方法であって、DNAの転写に好ましい条件下で請求項６に記載のDNAの有効量を細胞に導入して、リボザイムを産生する工程を包含する、方法。２４．前記細胞がヒト細胞である、請求項２３に記載の方法。２５．被験体の血管組織における異常な平滑筋細胞増殖を阻害または予防する方法であって、請求項１に記載のリボザイムの有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。２６．前記リボザイムが、管腔貫通的に(transluminally)、管腔外的に(exolumi nally)、ステントにより、生分解性ポリマーまたはスフェアーにより、あるいは側板(pleuronic)ゲルにおいて、前記平滑筋細胞に送達される、請求項２５に記載の方法。