JPH09510101A - 再狭窄のためのリボザイム療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 再狭窄の有効な治療法として、本発明は、血管組織内での異常な平滑筋細胞増殖を阻害するのに有用なリボザイム及びリボザイム・デリバリー・システムを提供する。リボザイムの製造方法及びこれらのリボザイムを使用した遺伝子治療をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 再狭窄のためのリボザイム療法 発明の背景 1992年、300,000を超える血管形成手術が米国内で行われた。再狭窄（resteno sis）は、患者の30〜60％において生じる、血管形成手術後の主要な合併症であ る。事実、再狭窄は、介入的心臓病学(interventional cardiology)における単 一の最も重要な問題であり、そしてヘルス・ケア制度に毎年10億ドルを超えるも のを費やさせている。 血管形成手術後の再狭窄は、血小板、マクロファージの局所的浸潤及び血液凝 固系の局所的活性化を特徴とする、局所的血管損傷の結果である。これらの要因 は、平滑筋（smooth muscle cell(SMC)）転移及び増殖の多数の生物学的メデア ター(mediators)の合成(elaboration)をもたらす。中膜SMCsは、血管内膜に転移 して増殖し、そして細胞外マトリックス（extracellular matrix(ECM)）を作り 出し、血流を妨害することができる繊維細胞の塊の形成をもたらす。 SMC転移及び増殖のメディアターの成長因子及びサイトカインの役割について 広く注目された。さらに、損傷が、この損傷に対する細胞応答において役割を演 じると信じられているさまざまなオンコジーンの発現を誘発することが示された 。従って、再狭窄を予防し、そして治療するために有効な療法についての必要性 が存在する。本発明は、この必要性を満足させ、そして関連の利点をも提供する 。 発明の要約 再狭窄のための有効な療法として、本発明は、血管組織内での異常な平滑筋細 胞増殖を阻止するのに有用なリボザイム及びリボザイム・デリバリー・システム を提供する。リボザイムの製造方法及びこれらのリボザイムを使用した遺伝子治 療法をも提供する。 発明の詳細な説明 再狭窄は、大きな臨床的問題であり、繰り返しの入院、繰り返しの血管形成手 術又はバイパス手術の必要性の結果として、再狭窄は、国家のヘルス・ケア制度 に毎年10億ドルを超えるものを費やさせている。現在、再狭窄は、３つの重要な 要素を含んで成ると理解されている。第１に、血管平滑筋細胞の筋内膜増殖及び その後のECM沈着は、その血管管腔上に侵略（encroach）することができる繊維 細胞塊をもたらす。第２に、急性の血管形成後に、管腔寸法の遅い減損に寄与す る動脈のかなり弾性のあとずさり（recoil）が存在することができる。最後に、 その血管壁に接着した血小板及び血栓は、時間の経過とともに、繊維細胞の塊り に組織化される。 平滑筋細胞（Smooth muscle cells(SMCs)）は、血小板由来成長因子（PDGF） 、トランスフォーミング成長因子(TGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、インスリン −様成長因子(IGF)、及びインターロイキンを含むさまざまな成長因子を産生し 、そして応答することができることが立証されている。これらと同一の因子が、 ヒト再狭窄病変において発見されている。さらに、さまざまな癌遺伝子(オンコ ジーン)(例えば、c-myc，c-fos、及びc-myb)が、平滑筋の転移及び増殖並びに血 管損傷後に関連するECMの沈着に関係することが発見されている。平滑筋細胞そ れ自体は、局所的オートクリン(autocrine)及びパラクリン(paracrine)メカニズ ムによりそれら自身の 成長を調節することができる。 それ故、血管損傷後のSMC成長に関係する成長因子、オンコジーン及び細胞調 節タンパク質の局所産生及び作用を妨害することにより、ある者は、再狭窄を有 効に治療及び予防することができる。本発明は、血管損傷後にSMC成長に関係す る成長因子、オンコジーン及び細胞調節タンパク質の産生を直接的に妨害するリ ボザイム及びリボザイムの使用方法を提供することにより、これを達成する。 本明細書中に使用するとき、“リボザイム(ribozymes)”は、特異的認識のた めのアンチ−センス配列、及びRNA−解裂酵素活性を含むRNA分子を含むと意図さ れる。この触媒的ストランドは、化学量論濃度よりも高い濃度において標的RNA 内の特異的部位を解裂する。２つの“タイプ”のリボザイム、ハンマーヘッド（ hammerhead）リボザイム（引用により本明細書中に取り込むRossi，J.J．et al. ，Pharmac.Ther． 50：245-254(1991)）及びヘアピン・リボザイムが、本発明に おいて特に有用である。（各々引用により本明細書中に取り込むHampel et al. ，Nucl.Acids Res． 18：299-304(1990)及び1993年10月19日に付与された米国特 許第5,254,678号）ハンマーヘッドとヘアピン・リボザイムの両方が、アンチセ ンスとエンドリボヌクレオチダーゼ活性をもつ触媒分子であるため；リボザイム 技術は、そのアンチセンス・アプローチから遺伝子失活への潜在的に強力な拡張 として始まった。 従って、本発明は、病的平滑筋増殖及び再狭窄を阻止する能力をもつリボザイ ムを提供する。本リボザイムは、再狭窄の原因となり得る因子を特異的に標的と し、解裂し、そして失活させる能力をもつ、（例えば、各々引用により本明細書 中に取り込むForster and Symons（1987）Cell 48：211-220；Haseloff and Ger lach（1988）Nature 328：596-600；Walbot and Bruening（1988）Nature 34 4：196；Haseloff and Gerlach（1988）Nature 334：585により記載されたよう な）ハンマーヘッド又は（例えば、各々引用により本明細書中に取り込むHaselo ff et al.，1993年10月19日に付与された米国特許第5,254,678号及び1990年３月 26日に公表されたHampel et al.，欧州特許公開第0 360 257号により記載された ような）ヘアピン・リボザイムであることができる。１の態様においては、本リ ボザイムは、血管組織内での異常な平滑筋細胞増殖の原因である成長因子の活性 を阻害する能力をもつ。このような成長因子は、非限定的に、血小板由来成長因 子、繊維芽細胞成長因子、インスリン−様成長因子、c-myc，c-myb，c-fos、cdc 2キナーゼ、TGF-α、TGF-β、インターロイキン、及び細胞外マトリックスの成 分を含む。本明細書中に使用するとき、用語“異常な平滑筋細胞増殖”は、血管 形成手術、ステント、バルーン血管形成手術、アテローム切除、レーザー外科手 術、血管内又は外科手術のいずれかに関連する血管損傷又は外傷に応答して生じ る、いずれかの小さな細胞の増殖及び細胞外マトリックスの沈着を意味するであ ろう。ヘアピン・リボザイムのために必要な配列は、NNNG／CN^* GUCNNNNNNNN(こ こで、N^* Gは、解裂部位であり、そしてＮは、Ｇ，Ｕ，Ｃ、又はＡのいずれかで ある。)から成るいずれかのRNA配列である。上記ハンマーヘッド・リボザイムの ための解裂部位において必要な配列は、NUX(ここで、Ｎは、Ｇ，Ｕ，Ｃ、又はＡ のいずれかであり、そしてＸは、Ｃ，Ｕ又はＡを表す。)から成るいずれかのRNA 配列であり、これが標的とされることができる。従って、上記ヘアピン・リーダ ー配列内の同一標的、GUCが、上記ハンマーヘッド・リボザイムのために有用で ある。ハンマーヘッド・リボザイム又はヘアピン・リボザイムの追加のヌクレオ チドが、標的フランキング・ヌクレオチド及びハンマーヘッド・コンセンサス配 列により決定される。この 情報、並びに、c-myc，c-myb，c-fos、cdc2キナーゼ、TGF-α及びTGF-βタンパ ク質をコードする核酸の公表された配列が、本発明のリボザイムの製造を可能に する。本リボザイム内の適当な塩基変更が、その標的RNA配列との必要な塩基対 合を維持するために、行われる。 Cech et al.(1991年１月22日に付与された米国特許第4,987,071号)は、エンド リボヌクレアーゼ活性をもつ特定の合成リボザイムの生産及び使用について開示 している。これらのリボザイムは、テトラヒメナ（Tetrahymena）のリボソームR NAの自己スプライシング反応の特性に基づき、そして８塩基対の標的部位を必要 とする。50℃の最適温度が、そのエンドリボヌクレアーゼ活性について報告され ている。解裂から生じる断片は、５′リン酸及び３′ヒドロキシル基を含み、遊 離のグアノシン・ヌクレオチドがその解裂されたRNAの５′末端に付加されてい る。これに反し、本発明のリボザイムは、それらを単に実験道具としてではなく インビボにおける使用に好適なものとする生理学的温度において標的配列に効率 的にハイブリダイズする（Cech et al.，米国特許第4,987,071号の15カラム、18 −42行を参照のこと。）。 以下、より詳細に説明する、本発明のリボザイム及び本リボザイムをコードす るDNAは、本分野においてよく知られた方法を使用して化学的に合成されること ができる。（例えば、引用により本明細書中に取り込む、Promega，Madison，Wi s.，USAの推奨プロトコールに従う。）。これらのリボザイムは、RNAポリメラー ゼ・プロモーター、例えば、T7 RNAポリメラーゼ又はSP6 RNAポリメラーゼのた めのプロモーターに作用可能な状態で連絡された(転写の間に、RNA分子を作り出 す)DNA分子から調製されることもできる。従って、本発明によって、本発明のリ ボザイムをコードする、核酸分子、 すなわち、DNA又はcDNAも提供される。また、そのベクターが、そのDNA分子に作 用可能な状態で連結されたRNAポリメラーゼ・プロモーターを含むとき、本リボ ザイムは、RNAポリメラーゼ及びヌクレオチドとのインキュベーションの間にイ ンビトロにおいて製造されることができる。別の態様においては、DNAが、各々 引用により本明細書中に取り込むCotten and Birnstiel（1989）EMBO J． 8（12 ）：3861-3866及びHempel et al.，Biochemistry 28：4929-4933(1989)中に記載 されたように発現カセット内に挿入される。分子生物学の方法論のより詳細な討 議は、引用により本明細書中に取り込む、Sambrook et al.(1989)Molecular Clo ning：A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Press中に開示されている。 合成後、そのRNA分子を、そのリボザイムを安定化し、そしてそれをRNaseに対し て耐性とする能力をもつDNA分子への連絡により修飾されることができる。ある いは、そのリボザイムを、リポソーム・デリバリー・システム内での使用のため にホスホチオ・アナログに修飾されることができる。この修飾も、そのリボザイ ムに、エンドヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与する。 このDNA分子は、培養における宿主原核又は真核細胞内又は生物の細胞内に存 在することもできる。適当な原核及び真核細胞が、本発明のリボザイムをコード するDNA分子を含む適当な伝達ベクターによりトランスフェクトされることがで きる。DNA分子が、RNA転写のためのプロモーターに作用可能な状態で連絡される とき、そのRNAは、その宿主細胞がそのDNA分子の転写に好ましい好適条件下で培 養されるときにその宿主細胞内で作られることができる。ベクターは、非限定的 に、プラスミド、ウイルス、レトロトランスポゾン又はコスミドであることがで きる。このようなベクターの例は、引用により本明細書中に取り込む米国特許第 5,166,320号中に開示 されている。好適なアデノウイルス・ベクター、例えば、腺−関連１型ベクター (“AAV-1”)又は腺−関連２型ベクター(“AAV-2”)(引用により本明細書中に取 り込むChatterjee et al.，(1992)Science Vol.258：1485-1488を参照のこと)が 、特に有用である。遺伝子治療の方法は、本分野においてよく知られている。例 えば、各々引用により本明細書中に取り込むLarrick，J.W．and Burck，K.L．Ge ne Therapy：Application of Molecular Biology ，Elsevier Science Publishin g Co.，Inc．New York，New York（1991）及びKreigler，M．Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual ，W.H.Freeman and Company，New York(1990 )を参照のこと。 ベクターを用いて本リボザイムを作るために、リボザイムをコードするヌクレ オチド配列を、強力なプロモーター、例えば、lac、SV40後期、SV40初期、又は ラムダ・プロモーターの制御下に置く。次にリボザイムを、インビボにおいて上 記伝達ベクターから直接的に作り出す。 別の態様においては、ウイルス・ベクターは、レトロウイルス、例えば、非ビ ルレントなワクシニア・ベースのウイルス・ベクター、Moloneyネズミ白血病ウ イルス、又は引用により本明細書中に取り込むLever，A．（1989）J.Virol. 63 ：4085-4087中に記載されたようなHIVベクターである。レトロウイルス・ベクタ ーは、再狭窄の遺伝子治療のために特に有用である。このような遺伝子治療のた めに適当なレトロウイルス・ベクターは、プロモーター、例えば、レトロウイル スLTR又は挿入polIIIプロモーター、例えば、ヒトtRNA^valプロモーター又はアデ ノウイルスVA１プロモーターの制御下、外来核酸(DNA又はcDNA)配列を、そのレ トロウイルスの５′と３′ロング・ターミナル・リピート(LTR)領域間に挿入さ れている自己複製レトロウイルスである。このレトロウイルス・ベクターは 、次に、宿主細胞内でそのリボザイムを安定して発現する。 本発明によりさらに提供されるものは、別個のpolIIIプロモーターの制御下、 あるいは、単一のpolIIIプロモーター又はレトロウイルスのLTRの制御下、本発 明のリボザイムをコードする１以上の核酸分子の各々を５′と３′LTR間に挿入 されているレトロウイルス・ベクターである。これらのレトロウイルス・ベクタ ーは、各々の特定の療法がシナジーにおいて働きながら、再狭窄に対する多機能 の療法を提供する利点を提供する。さらに、限定された数のベクターだけが使用 されるため、その宿主細胞内の組込み部位の数が、減少され、それにより、その 挿入されたレトロウイルス・ベクターによる宿主細胞DNA配列の活性化の可能性 を減少させる。 上記のベクターにより安定して形質導入された宿主原核及び真核細胞も、本発 明により提供される。好適な宿主細胞は、バクテリア細胞、マウス細胞、ラット 細胞、及びヒト細胞、例えば、血管平滑筋細胞を含む。 異常平滑筋細胞の血管組織増殖又は再狭窄の阻害方法が、本発明により提供さ れる。本法は、有効量の本発明のリボザイムと好適な細胞又は組織を接触させる こと、あるいは、本リボザイムをコードする核酸分子をもつ有効量のベクターを 用いてその細胞を形質導入することを必要とする。有効量は、よく知られた方法 論を使用して当業者により容易に決定される。リボザイムを外因的にデリバリー するとき、そのRNA分子は、好適なRNA分子内に埋め込まれ、又は保護的環境の他 の形態、例えばリポソームの形態にあることができる。あるいは、RNAは、RNase 耐性DNA相手内に埋め込まれることができる。外因性リボザイムの細胞取り込み は、そのDNA末端に化学基、例えば、コレステリル部分を付着させることにより 、増強されることができる(引用により本明細書中に取り込む、Letsinger et al.，P.N.A.S.，U.S.A．(1989))。 別の態様においては、標的細胞は、その標的細胞内へのベクターの挿入及び特 定のリボザイムをコードする核酸の安定した発現に好ましい条件下で、形質導入 される。標的細胞は、非限定的に血管平滑筋細胞又は細胞外マトリックスの形成 に関連するタンパク質の沈着の原因となる細胞を含むことができる。このような 細胞は、当業者によく知られている。従って、本発明の他の局面は、本発明のリ ボザイムと標的RNAを反応させることにより好適な細胞内での異常な平滑筋増殖 を妨害し又は予防する方法である。細胞又は生物の細胞においては、１以上のリ ボザイムをコードする上記のような伝達ベクターが、各々引用により本明細書中 に取り込む、Llwewllyn et al.，（1987）J.Mol.Biol． 195：115-123及びHanah an et al．（1983）中に記載される方法を使用して細胞（単複）内に、トランス フェクトされる。細胞内で、この伝達ベクターは、複製し、そしてそのリボザイ ムをコードするDNAが、細胞のポリメラーゼにより転写されてリボザイムが作ら れ、これが次に、異常な平滑筋細胞増殖、異常な細胞外マトリックス沈着及び再 狭窄の原因となる因子を失活させる。マイクロマニピュレーション技術、例えば 、マイクロインジェクションも、伝達ベクター又はその部分が細胞のゲノム内に 組み込まれるように、その細胞内にそのベクターを挿入するために使用されるこ とができる。この組み込まれた材料の転写がリボザイムを作り出し、これが次に 標的タンパク質を失活させる。本明細書中に使用するとき、用語“失活させる” は、タンパク質生成物、例えば、c-myc又はTGF-βの産生を妨害することを意味 すると意図される。 組成物も、本発明により提供される。これらの組成物は、上記のリボザイム、 DNA分子、ベクター又は宿主細胞のいずれかを含む。 本発明の１の態様については、その組成物は、医薬として許容される担体をも含 む。本明細書中に使用するとき、用語“医薬として許容される担体”は、標準的 な医薬担体のいずれか、例えば、リン酸塩緩衝化生理食塩水溶液、水、及びエマ ルジョン、例えば、油／水又は水／油エマルジョン、並びに各種タイプの水和剤 を包含する。 上記のリボザイム、核酸及び／又はベクターを含む宿主細胞も本発明の範囲内 にある。これらの宿主細胞は、原核細胞、例えば、バクテリア細胞又は真核細胞 、例えば、哺乳類、ヒト、ラット、又はマウス細胞であることができる。本リボ ザイムをコードする核酸により形質導入された宿主細胞が、そのリボザイムを組 換えにより作り出すために有用である。従って、本発明によって、血管組織内で の異常な平滑筋細胞増殖を阻止することができるリボザイムの、インビトロ又は インビボにおける製造方法をも提供される。リボザイムをコードするDNAであっ て、プロモーターの転写制御下にあるものを、当業者によく知られた方法を使用 して、上記細胞に提供される。引用により本明細書中に取り込む、Sambrook et al．Molecular Cloning：A Laboratory Manual ， Cold Spring Harbor Labora tory(1989)を参照のこと。次にDNAは、リボザイムを作るために細胞内で転写さ れる。インビトロにおいて作られるとき、リボザイムは、本分野においてよく知 られた方法を使用することにより細胞から精製又は単離されることができる。DN Aは、多数の方法で、担体内又は担体内のベクター内に伝達されることができる 。例えば、DNAは、血管壁への経管腔デリバリーにより又は管腔外に投与される ことができる。他の態様においては、活性成分は、生物学的分解性ポリマー又は 球内に埋め込まれ、そして血管ステントにより投与されることができる。あるい は、それは、胸膜ゲル(pleuronic gel)内にデリバリーされることができる。 さらに本発明によって、SMC増殖又は異常細胞外マトリックス沈着を阻止する のに有効な量において、１以上の上記リボザイムを細胞内に導入することによる 、血管組織内での異常な平滑筋細胞増殖の阻止方法をも提供される。 血管組織内での異常な平滑筋細胞増殖の他の阻止方法は、本リボザイムを作り 出すためにDNAの転写に好ましい条件下、上記のリボザイムをコードする有効量 のDNAを細胞内に導入することから成る。本方法も、異常SMC及び異常細胞外マト リックス沈着を防止し、そしてこれ故、再狭窄を防止するのに有用である。 また、本発明によって、被験体において血管組織内の異常な平滑筋細胞増殖の 阻止又は予防方法であって、血管組織内での異常な平滑筋細胞増殖を阻止する能 力をもつリボザイムの有効量をその被験体に投与することを含んで成るような方 法をも提供される。このリボザイムは、管腔外に、経管腔により、ステントによ り、生物学的分解性ポリマー又は球、あるいはpleuronicゲルにおいて、その平 滑筋細胞にデリバリーされる。 “有効量”が投与されることは、当業者に理解されるはずである。これらの量 は、当業者によく知られた方法により容易に決定される。 本発明を、目下、好ましい態様を参照しながら説明してきたが、さまざまな修 正が本発明の本質から逸脱せずに行われることができることが理解されるべきで ある。従って、本発明は、以下のクレームによってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 15/09 9282−4Ｂ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血管組織内での異常平滑筋細胞増殖を阻害する能力をもつリボザイム。 ２．リボザイムが、血管組織内での異常な平滑筋細胞増殖の原因である成長因 子の活性を阻害する能力をもつ、請求項１に記載のリボザイム。 ３．成長因子が、血小板由来成長因子、繊維芽細胞成長因子、TGF-α，TGF-β ，c-myc，c-fos，c-myb、cdc-2-キナーゼ、インスリン様成長因子又はインター ロイキンである、請求項２に記載のリボザイム。 ４．リボザイムが、細胞外マトリックス・タンパク質の産生の原因であるタン パク質を特異的に解裂する、請求項２に記載のリボザイム。 ５．リボザイムが、血管組織内での細胞外マトリックスの異常沈着を防止する 能力をもつ、請求項１に記載のリボザイム。 ６．請求項１に記載のリボザイムをコードする核酸分子。 ７．核酸が、DNA又はcDNAである、請求項６に記載の核酸分子。 ８．核酸を転写するためのプロモーターの制御下にある、請求項６に記載の核 酸分子。 ９．請求項１に記載のリボザイムを含んで成る宿主細胞。 10．請求項６に記載の核酸を含んで成るベクター。 11．請求項10に記載のベクターを含んで成る宿主細胞。 12．ベクターが、プラスミド、ウイルス、レトロトランスポゾン又はコスミド である、請求項10に記載のベクター。 13．ベクターが、アデノウイルス・ベクター又はAAVである、請求項12に記載 のベクター。 14．請求項13に記載のベクターにより安定して形質転換された宿主細胞。 15．宿主細胞が、ヒト細胞である、請求項９又は14に記載の宿主細胞。 16．血管組織内での異常な平滑筋細胞増殖を阻害することができるリボザイム の製造方法であって、プロモーターの転写制御下にそのリボザイムをコードする DNAを提供し、そのDNAを転写してそのリボザイムを作り出すことを含んで成る方 法。 17．リボザイムが、インビトロにおいて作られる、請求項16に記載の方法。 18．作られたリボザイムを精製することをさらに含んで成る、請求項17に記載 の方法。 19．リボザイムが、インビボにおいて作られる、請求項16に記載の方法。 20．血管組織内での異常な平滑筋細胞増殖の阻害方法であって、請求項１に記 載のリボザイムの有効量をその細胞内に導入することを含んで成る方法。 21．血管組織内での異常な平滑筋細胞増殖の阻害方法であって、リボザイムを 作り出すためのそのDNAの転写に好ましい条件下、請求項６に記載のDNAの有効量 をその細胞内に導入することを含んで成るような方法。 22．細胞が、ヒト細胞である、請求項20又は21に記載の方法。 23．血管組織内での異常な平滑筋細胞増殖を防止する方法であって、リボザイ ムを作り出すためのそのDNAの転写に好ましい条件下、請求項６に記載のDNAの有 効量をその細胞内に導入することを含んで成るような方法。 24．細胞が、ヒト細胞である、請求項23に記載の方法。 25．被験体における血管組織内の異常な平滑筋細胞増殖の阻害又は防止方法で あって、請求項１に記載のリボザイムの有効量をその被験体に投与することを含 んで成る方法。 26．リボザイムが、管腔外に、経管腔的に、ステントにより、生物学的分解性 ポリマー又は球によりあるいはpleuronicゲルにおいて、平滑筋細胞にデリバリ ーされる、請求項25に記載の方法。