JP2002541795A

JP2002541795A - 核酸分子を用いるリプレッサー遺伝子の制御

Info

Publication number: JP2002541795A
Application number: JP2000611654A
Authority: JP
Inventors: ブラット，ローレンス; ツヴィック，マイケル; パヴコ，パメラ; マクスウィゲン，ジェームズ
Original assignee: リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1999-04-12
Filing date: 2000-04-11
Publication date: 2002-12-10
Also published as: AU4232700A; CA2364577A1; WO2000061729A2; EP1165758A2; WO2000061729A3

Abstract

(57)【要約】リプレッサー遺伝子の発現を阻害する核酸分子が記載される。また，そのような核酸分子を製造および使用する方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景本発明は，リプレッサー遺伝子を阻害する新規な方法に関する。特に，これら
のリプレッサー遺伝子の阻害により，有益な遺伝子産物の発現が増加する。有益
な遺伝子産物の発現の増加は，広範な適応症の治療的処置として有用であろう。

【０００２】以下は関連する技術の議論であり，これらのいずれも本発明に対する先行技術
であると認めるものではない。

【０００３】生物学的システムにおけるＲＮＡ合成には，多数の制御段階が関与する。例え
ば，真核生物細胞においては，ＲＮＡはＤＮＡ遺伝子から転写と称されるプロセ
スを経て合成される。ＲＮＡの転写は，精妙に制御されたプロセスである。転写
は，ＲＮＡ合成が促進される場合には正に制御され，ＲＮＡ合成が阻害される場
合には負に制御される。このＲＮＡ合成制御のレベルは，遺伝子中の特異的シス
作用要素と相互作用することにより転写に一般に影響を及ぼす１またはそれ以上
の蛋白質因子の相互作用により促進される。真核生物細胞においては遺伝子発現
の正の制御がはるかに有力であるが，負の制御は多くの遺伝子について重要な役
割を果たす。これらの負の制御に関与する蛋白質因子（"リプレッサー"）は，一
般に，通常は遺伝子の上流のシス作用性要素に結合し，その遺伝子のＲＮＡへの
転写のダウンレギュレーションを引き起こす（"抑制"）。これらのリプレッサー
がその標的から放出されたときにのみ，隠されていた遺伝子発現が生ずることが
できる。リプレッサーはまた，他のメカニズム，例えば，転写に関与する蛋白質
因子と相互作用（例えば蛋白質−蛋白質相互作用；修飾）し，このことにより転
写を妨害することを介して機能することができる。リプレッサーをコードする多
くの遺伝子が真核細胞系において同定されている。これらのリプレッサー遺伝子
のいくつかの非限定的例には，以下のものが含まれる。

【０００４】ＧＡＴＡ転写因子：現在，５つの因子が転写因子のヒトＧＡＴＡファミリーを構
成している：ｈＧＡＴＡ−１（Ｅｒｙｆｌ，ＧＦ−１，またはＮＦ−Ｅ１として
も知られる）（Ｔｒａｉｎｅｒｅｔａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ３４
３，９２−９６；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＩ７２５４）；ｈＧＡＴＡ−２（Ｄ
ｏｒｉｍａｎｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６７，１
２７９−１２８５；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ７７８１０）；ｈＧＡＴＡ−３（
Ｊｏｕｌｉｎｅｔａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯＪ．１０，１８０９−１８
１６；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５８０７２）；ｈＧＡＴＡ−４（Ｇｅｎｂａｎ
ｋ受託番号Ｌ３４３５７）；およびｈＧＡＴＡ−６（Ｈｕｇｇｏｎｅｔａｌ
．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１３５３，９８−
１０２；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ９５７０１）。ＧＡＴＡ要素またはＧＡＴＡ
蛋白質の結合領域は，エリスロポエチン（Ｅｐｏ）遺伝子の約３０ｂｐ上流に存
在する。ＱＴ６細胞をｈＧＡＴＡ−１，−２，および−３でトランスフェクショ
ンすると，３つの因子すべてがＧＡＴＡ要素に結合しうることが示されている。
さらに，３つの因子すべては，Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてエリスロポエチンの発現
をダウンレギュレートすることが示されている（Ｉｍａｇａｗａｅｔａｌ，
１９９６，ＡｃｔａＨａｅｍａｔｏｌ．９５，２４８−２５６）。

【０００５】ＥＡＲ３／ＣＯＵＰ−ＴＦ−１：ＥＡＲ３／ＣＯＵＰ−ＴＦ−１（Ｍｉｙａｊｉ
ｍａｅｔａｌ．，１９８８，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃ
ｈ１６，１１０５７−１１０７４；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ１２７９５）は
，エリスロポエチン遺伝子のプロモーター領域に結合し，その発現を負に制御す
ることが示されている。この転写因子は，Ｅｐｏ発現を正に制御すると考えられ
ている肝核因子４（ＨＮＦ−４）と競合するようである（Ｇａｌｓｏｎｅｔ
ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５，２１３５−２１４４）
。

【０００６】ＴＲ２およびＴＲ２−１１オーファンレセプター：ＴＲ２オーファンレセプター
（Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６５，７３５−７４１；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２９
９５９）およびＴＲ２−１１オーファンレセプター（Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．
，（上掲）；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２９９６０）は，Ｅｐｏ発現を負に制御
すると考えられている別の一組の転写因子である。単離されたＴＲ２ｃＤＮＡは
，６０３アミノ酸の質量６７ｋＤａの蛋白質をコードする。この蛋白質は，Ｅｐ
ｏ遺伝子の３’エンハンサー領域に結合し，Ｅｐｏの発現を抑制すると考えられ
ている（Ｌｅｅｅｔａｌ．，１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，
１０４０５−１０４１２）。

【０００７】ＣＣＡＡＴ置換（Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）蛋白質（ＣＤＰ）：ＣＤＰ（Ｎｅ
ｕｆｅｌｄｅｔａｌ．，１９９２，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．１，５０−
５５；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ７４０９９）は，多くの遺伝子，例えば，ガン
マグロビン，ＮＣＡＭ，およびｇｐ９１−ｐｈｏｘ遺伝子，好中球コラゲナーゼ
，好中球ゼラチナーゼ，および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を負に制
御することが示されている１８０−２００ｋＤａの蛋白質である（Ｋｈａｎｎａ
−Ｇｕｐｔａｅｔａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ９０，２７８４−２７９
５）。上昇したレベルのＧ−ＣＳＦは，骨髄抑制化学療法の間，ＡＩＤＳ，およ
び慢性好中球減少症の治療に有益であろう。

【０００８】ジェネシス（Ｇｅｎｅｓｉｓ）：ＨＮＦ−３／Ｆｏｒｋｈｅａｄとしても知られ
る。ジェネシスは，翼状らせん転写制御ファミリーのメンバーであり，ショウジ
ョウバエにおいて胚分化活性のリプレッサー遺伝子として機能すると考えられて
いる（Ｓｕｔｔｏｎｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１，２３１２６−２３１３３）。３２Ｄ細胞における研究は，ジェネシス遺伝子
の蛋白質産物がＧ−ＣＳＦ遺伝子発現を制御しうることを示す（Ｘｕｅｔａ
ｌ．，１９９７，Ｌｅｕｋｅｍｉａ１２，２０７−２１２）。この遺伝子のヒ
ト相同体は，ヒト細胞において同じ効果を有するかもしれず，Ｇ−ＣＳＦ遺伝子
発現を制御するようである。

【０００９】インターフェロン制御因子−２（ＩＲＦ−２）：ＩＲＦ−２（Ｉｔｏｈｅｔ
ａｌ．，１９８９，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１７，８
３７２；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＩ５９４９）は，１０を越えるメンバーが存
在するインターフェロン制御因子のメンバーである。ＩＲＦ−２は，インターフ
ェロン−ベータ，インターフェロン−アルファ，およびＭＨＣクラスＩの発現の
制御において役割を果たすと考えられている（Ｎｇｕｙｅｎｅｔ．ａｌ．，１
９９７，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＆ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｖｉｅｗｓ８
，２９３−３１２）。ＩＲＦ−２のＤＮＡ結合ドメインは，蛋白質のＮ−末端に
存在する。

【００１０】Ｉｍａｇａｗａｅｔａｌ．，（１９９７，Ｂｌｏｏｄ４，１４３０−１
４３９）は，Ｈｅｐ３Ｂ細胞において，配列ＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴ
ＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＧＣＧＧを有するアンチセンスホスホロチオエートオリゴ
デオキシヌクレオチドを用いてｈＧＡＴＡ−２転写因子発現を阻害することを記
載する。

【００１１】発明の概要本発明は，新規核酸に基づく技術（例えば，酵素的核酸分子，アンチセンス核
酸，２−５Ａアンチセンスキメラ，トリプレックスＤＮＡ，ＲＮＡ切断化学基を
含有するアンチセンス核酸）を特徴とする。

【００１２】１つの観点においては，本発明は，核酸に基づく１またはそれ以上の技術を用
いて，リプレッサー遺伝子の発現を阻害することを特徴とする。リプレッサー遺
伝子の阻害は，次に，これらのリプレッサー遺伝子により抑制されていた遺伝子
の発現を増加させることができる。

【００１３】 "リプレッサー遺伝子"とは，その発現が，直接的にまたは間接的に，他の遺伝
子の発現をダウンレギュレートまたは抑制または抑圧する遺伝子を意味する。

【００１４】 "阻害する"とは，リプレッサー遺伝子の活性またはリプレッサー遺伝子をコー
ドするｍＲＮＡもしくは同等のＲＮＡのレベルが，核酸の非存在下において観察
されるレベルより減少することを意味する。１つの態様においては，リボザイム
による阻害は，好ましくは，ｍＲＮＡ上の同じ部位に結合することができるがそ
のＲＮＡを切断することができない，酵素的に弱体化された核酸分子の存在下で
観察されるレベルより低い。別の態様においては，酵素的核酸およびアンチセン
ス分子等の核酸分子による阻害は，好ましくは，例えば，スクランブル配列を有
するオリゴヌクレオチドまたはミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの存在下
で観察される阻害より大きい。別の態様においては，本発明の核酸分子を用いる
リプレッサー遺伝子の阻害は，核酸分子の存在下において，存在しない場合より
も大きい。

【００１５】 "アンチセンス核酸"とは，ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ
−ＰＮＡ（蛋白質核酸；Ｅｇｈｏｌｍｅｌａｌ．，１９９３Ｎａｔｕｒｅ
３６５，５６６）相互作用により標的ＲＮＡに結合して，標的ＲＮＡの活性を
変化させる非酵素的核酸分子を意味する（概説については，Ｓｔｅｉｎａｎｄ
Ｃｈｅｎｇ，１９９３Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１，１００４を参照）。

【００１６】 ”２−５Ａアンチセンスキメラ”とは，５’リン酸化２’−５’結合アデニル
酸部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。これらのキメラは配
列特異的様式で標的ＲＮＡに結合し，細胞性２−５Ａ依存性リボヌクレアーゼを
活性化し，それは次に標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅｅｔａｌ．
，１９９３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，１３００
）。

【００１７】 "トリプレックスＤＮＡ"とは，二本鎖ＤＮＡに配列特異的様式で結合して，三
重螺旋を形成することができるオリゴヌクレオチドを意味する。そのような三重
らせん構造の形成は，標的とする遺伝子の転写を阻害することが示されている（
Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｃｎｔｉｎｅｔａｌ．，１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，５０４）。

【００１８】 "遺伝子"とは，ＲＮＡをコードする核酸を意味する。

【００１９】 "酵素的核酸"とは，限定されないが，他の核酸分子の部位特異的切断および／
またはライゲーション，ペプチドおよびアミド結合の切断，およびトランススプ
ライシングなどの反応を触媒しうる核酸分子を意味する。エンドヌクレアーゼ活
性を有するそのような分子は，基質結合領域において特定の遺伝子標的に対する
相補性を有しており，かつその標的中のＲＮＡまたはＤＮＡを特異的に切断する
酵素活性を有する。すなわち，エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子は，分
子内または分子間でＲＮＡまたはＤＮＡを切断し，それにより標的ＲＮＡまたは
ＤＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性は標的ＲＮＡまたはＤＮＡ
に対する酵素的ＲＮＡ分子の十分なハイブリダイゼーションを可能にし，切断が
起こることを可能にする。１００％の相補性が好ましいが，５０−７５％程度の
低い相補性もまた本発明において有用である。核酸は塩基，糖および／またはリ
ン酸基で修飾されていてもよい。酵素的核酸との用語は，リボザイム，触媒的Ｒ
ＮＡ，酵素的ＲＮＡ，触媒的ＤＮＡ，触媒的オリゴヌクレオチド，ヌクレオザイ
ム，ＤＮＡザイム，ＲＮＡ酵素，エンドリボヌクレアーゼ，エンドヌクレアーゼ
，ミニザイム，リードザイム，オリゴザイムまたはＤＮＡ酵素のような句と相互
交換的に使用される。これらすべての用語は酵素的活性を有する核酸分子を記述
する。本出願に記載されている特定の酵素的核酸分子は本発明において限定的な
ものではない。当業者は，本発明の酵素的核酸分子において重要なことは，１ま
たはそれ以上の標的核酸領域に相補的な特異的基質結合部位を有し，かつ分子に
核酸切断活性を与えるヌクレオチド配列を基質結合部位内または周辺に有するこ
とであることを認識するであろう（Ｃｅｃｈｅｔａｌ．，米国特許４，９８
７，０７１，Ｃｅｃｈｅｔａｌ．，１９８８，ＪＡＭＡ）。

【００２０】 ”酵素的部分”または”触媒ドメイン”とは，核酸基質の切断に必須であるリ
ボザイムの部分／領域を意味する（例えば図１を参照）。

【００２１】 ”基質結合アーム”または”基質結合ドメイン”とは，その基質の一部分に相
補的な（即ち，塩基対を形成できる）リボザイムの部分／領域を意味する。一般
に，そのような相補性は１００％であるが，所望の場合にはそれ未満でもよい。
例えば，１４の内の１０程度でも塩基対を形成しうる。そのようなアームは一般
に図１および図３に示される。すなわち，これらのアームは，相補的塩基対形成
相互作用によりリボザイムと標的ＲＮＡとを一緒にすることが意図される配列を
リボザイム中に含む。本発明のリボザイムは連続または非連続的な，種々の長さ
の結合アームを有していてもよい。結合アームの長さは，好ましくは４ヌクレオ
チド以上の長さであり，特に，１２−１００ヌクレオチド；より特別には１４−
２４ヌクレオチドの長さである。２つの結合アームが選択される場合，結合アー
ムの長さは対称的（即ち，各々の結合アームは同じ長さである；例えば，５およ
び５ヌクレオチド，６および６ヌクレオチドまたは７および７ヌクレオチド長）
または非対称的（即ち，結合アームは異なった長さである；例えば，６および３
ヌクレオチド；３および６ヌクレオチド長；４および５ヌクレオチド長；４およ
び６ヌクレオチド長；４および７ヌクレオチド長など）であるように設計される
。

【００２２】本発明の好ましい態様の１つにおいては，酵素的核酸分子はハンマーヘッドま
たはヘアピンのモチーフで形成されるが，デルタ肝炎ウイルス，グループＩイン
トロン，グループＩＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰＲＮＡ（ＲＮＡガイド配
列を伴う），ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡ，ＤＮＡザイム，ＮＣＨ切断
モチーフ，またはＧ−切断剤のモチーフで形成してもよい。そのようなハンマー
ヘッドモチーフの例は，Ｄｒｅｙｆｕｓ，（上掲），Ｒｏｓｓｉｅｔａｌ．
，１９９２，ＡＩＤＳＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖ
ｉｒｕｓｅｓ８，１８３により；ヘアピンモチーフの例は，Ｈａｍｐｅｌｅ
ｔａｌ．，ＥＰ０３６０２５７，ＨａｍｐｅｌａｎｄＴｒｉｔｚ，１９８
９Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８，４９２９，Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎｅｔ
ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ８２，５３，ＨａｓｅｌｏｆｆａｎｄＧｅｒ
ｌａｃｈ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，４３，Ｈａｍｐｅｌｅｔａｌ．，１
９９０ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８，２９９，Ｃｈｏｗｒｉｒ
ａ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，米国特許５，６３１，３５９により；デルタ肝炎
ウイルスモチーフの例は，ＰｅｒｒｏｔｔａａｎｄＢｅｅｎ，１９９２Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ３１，１６により；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は，Ｇｕ
ｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａｅｔａｌ．，１９８３Ｃｅｌｌ３５，８４
９；ＦｏｒｓｔｅｒａｎｄＡｌｔｍａｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４
９，７８３；ＬｉａｎｄＡｌｔｍａｎ，１９９６，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓＲｅｓ．２４，８３５により；ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡリ
ボザイムモチーフの例は，Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅａｎｄＣｏｌｌ
ｉｎｓ，１９９０Ｃｅｌｌ６１，６８５−６９６；Ｓａｖｉｌｌｅａｎｄ
Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９１Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８８，８８２６−８８３０；ＣｏｌｌｉｎｓａｎｄＯｌｉｖｅ，１９９
３Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ３２，２７９５−２７９９；ＧｕｏａｎｄＣ
ｏｌｌｉｎｓ，１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．１４，３６３）により；グループＩＩ
イントロンの例は，Ｇｒｉｆｆｉｎｅｔａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｌ．２，７６１；ＭｉｃｈｅｌｓａｎｄＰｙｌｅ，１９９５，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ３４，２９６５；Ｐｙｌｅｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９６
／２２６８９により；グループＩイントロンの例は，Ｃｅｃｈｅｔａｌ．，
米国特許４，９８７，０７１により；ＤＮＡザイムの例は，Ｕｓｍａｎｅｔ
ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／１１３０４；Ｃｈａｒｔｒａｎｄｅｔａｌ．，
１９９５，ＮＡＲ２３，４０９２；Ｂｒｅａｋｅｒｅｔａｌ．，１９９５
，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．２，６５５；Ｓａｎｔｏｒｏｅｔａｌ．，１９９７，
ＰＮＡＳ９４，４２６２により；ＮＣＨ切断モチーフの例は，Ｌｕｄｗｉｇ＆
Ｓｐｒｏａｔ，国際公開ＷＯ９８／５８０５８により；およびＧ−切断剤の例は
，Ｋｏｒｅｅｔａｌ．，１９９８，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅ
ａｒｃｈ２６，４１１６−４１２０に，それぞれ記載されている。これらの特
定のモチーフは本発明において限定的なものではなく，当業者は，本発明の酵素
的核酸分子において重要なすべては，それが標的遺伝子のＲＮＡ領域の１または
それ以上に相補的な特異的基質結合部位を有し，かつその基質結合部位の中また
は周辺に，分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することであ
ることを認識するであろう（Ｃｅｃｈｅｔａｌ，米国特許４，９８７，０７
１）。

【００２３】本発明の好ましい態様においては，核酸分子，例えば，アンチセンス分子，ト
リプレックスＤＮＡ，またはリボザイムは，１３−１００ヌクレオチドの長さで
あり，例えば，特定の態様においては，３５，３６，３７，または３８ヌクレオ
チドの長さ（例えば特定のリボザイムについて）である。特定の態様においては
，核酸分子は，１５−１００，１７−１００，２０−１００，２１−１００，２
３−１００，２５−１００，２７−１００，３０−１００，３２−１００，３５
−１００，４０−１００，５０−１００，６０−１００，７０−１００，または
８０−１００ヌクレオチドの長さである。上で特定された長さの範囲においては
その上限は１００ヌクレオチドであるが，長さの範囲の上限は，例えば，３０，
４０，５０，６０，７０，または８０ヌクレオチドでありうる。すなわち，長さ
の範囲の任意のものについて，特定の態様についての長さの範囲は，特定された
下限，および，下限より大きい上限を有する。例えば，特定の態様においては，
長さの範囲は３５−５０ヌクレオチドの長さでありうる。そのような範囲の全て
が明示的に含まれる。また，特定の態様においては，核酸分子は，上で特定され
た長さの任意の長さ，例えば２１ヌクレオチドの長さを有することができる。

【００２４】リプレッサー遺伝子と"同等の"ＲＮＡとは，リプレッサー遺伝子に相同性（部
分的なまたは完全な）を有するか，または種々の動物，例えばヒト，齧歯類，霊
長類，ウサギおよびブタにおいてリプレッサー遺伝子と類似の機能を有する蛋白
質をコードする，天然に生ずるＲＮＡ分子を含むことを意味する。同等のＲＮＡ
配列はまた，コーディング領域に加えて，５’−非翻訳領域，３’−非翻訳領域
，イントロン，イントロン−エクソン接合部等の領域を含む。

【００２５】 "相補性"とは，核酸が，伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタ
イプのいずれかにより，別のＲＮＡ配列と水素結合を形成することができること
を意味する。本発明の核酸に関して，核酸分子とその標的または相補的配列との
結合自由エネルギーは，核酸の関連する機能，例えば，リボザイム切断，アンチ
センスまたは三重らせん阻害が進行するのに十分である。核酸分子についての結
合自由エネルギーの決定は当該技術分野においてよく知られている（例えば，Ｔ
ｕｒｎｅｒｅｔａｌ．，１９８７，ＣＳＨＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏ
ｌ．ＬＩＩｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒｅｔａｌ，１９８６，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒ
ｎｅｒｅｔａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７
８３−３７８５を参照。相補性のパーセンテージは，核酸分子中の，第２の核酸
配列と水素結合（例えば，ワトソン−クリック塩基対形成）を形成しうる連続す
る残基のパーセンテージを示す（例えば，１０塩基中の５，６，７．８，９，１
０塩基は，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，および１００％の相補性
である）。"完全な相補性"とは，核酸配列の連続する残基がすべて第２の核酸配
列中の同じ数の連続する残基と水素結合するであろうことを意味する。

【００２６】本発明の好ましい態様においては，リプレッサー遺伝子の発現の阻害は疾病ま
たは状態の治療に関連する。"関連する"とは，リプレッサー遺伝子ＲＮＡの阻害
が，したがって，蛋白質活性のそれぞれのレベルの減少が，疾病または状態の症
状をある程度緩和するであろうことを意味する。

【００２７】別の好ましい態様においては，本発明は，核酸に基づく技術（例えば，酵素的
核酸分子（リボザイム），アンチセンス核酸，２−５Ａアンチセンスキメラ，ト
リプレックスＤＮＡ，ＲＮＡ切断化学基含有アンチセンス核酸），およびこれを
用いてインターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）を抑制しうる遺伝子の発現を
ダウンレギュレートまたは阻害する方法を特徴とする。ＩＦＮ−αのリプレッサ
ーには，限定されないが，ＩＲＦ−２（Ｌｏｐｅｚｅｔａｌ．，１９９７，
Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ２７２，２２７８８−２２７９９）が含まれる。

【００２８】別の好ましい態様においては，本発明は，核酸技術（例えば，酵素的核酸分子
（リボザイム），アンチセンス核酸，２−５Ａアンチセンスキメラ，トリプレッ
クスＤＮＡ，ＲＮＡ切断化学基を含有するアンチセンス核酸），およびこれを用
いて顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を抑制しうる遺伝子の発現をダウン
レギュレートまたは阻害する方法を特徴とする。これらのリプレッサー遺伝子に
は，限定されないが，ＣＣＡＡＴ置換蛋白質（ＣＤＰ）（Ｋｈａｎｎａ−Ｇｕｐ
ｔａｅｔａｌ，１９９７，Ｂｌｏｏｄ９０，２７８４−２７９５）および
ジェネシス（Ｘｕｅｔａｌ，１９９８，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１２，２０７−
２０１２）が含まれる。

【００２９】別の好ましい態様においては，本発明は，エリスロポエチン（Ｅｐｏ）の発現
を抑制しうるリプレッサー遺伝子によりコードされるＲＮＡを切断する酵素的核
酸（例えばリボザイム）の使用を特徴とする。Ｅｐｏを阻害しうる遺伝子のリス
トには，限定されないが，ＴＲ２オーファンレセプター（Ｌｅｅｅｔａｌ．
．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
，２７１，１０４０５−１０４１２），ＥＡＲ３／ＣＯＵＰ−ＴＦ−１（Ｇａｌ
ｓｏｎｅｔａｌ．，１９９５，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１５，２１３５−２１４４），およびＧＡＴＡ転写因子（
Ｉｍａｇａｗａｅｔａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ，８９，１４３０−１４
３９）が含まれる。これらの抑制因子の１またはそれ以上の阻害は，細胞におけ
るＥｐｏの産生を増加させ，このことは，限定されないが，化学療法のアジュバ
ント治療および腎臓透析中の治療等の応用に有用である。

【００３０】好ましい態様においては，本発明のリボザイムは，表ＩＩＩ−ＶＩＩ（すなわ
ち，表ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ，およびＶＩＩ）の標的配列に相補的な結合アー
ムを有する。そのようなリボザイムの例はまた，表ＩＩＩ−ＶＩＩＩに示される
。表ＩＩＩは，ＧＡＴＡ転写因子（１，２，３，４，６）の標的配列およびこれ
を標的とするリボザイムを示す。表ＩＶは，ＴＲ２およびＴＲ２−１１オーファ
ンレセプターの標的配列およびこれを標的とするリボザイムを示し，表Ｖは，Ｅ
ＡＲ３／ＣＯＵＰ−ＴＦ−１の標的配列およびリボザイムを示し，表ＶＩはＩＲ
Ｆ−２の標的配列およびリボザイムを示し，表ＶＩＩは，ＣＤＰの標的配列およ
びリボザイムを示す。そのようなリボザイムの例は，本質的にこれらの表に規定
される配列からなる。

【００３１】さらに別の態様においては，本発明は，表ＩＩＩ−ＶＩＩに示される標的配列
に相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子および２−５Ａキメラを特徴とする
。そのような核酸分子は，表ＩＩＩ−ＶＩＩにおいてリボザイムの結合アームに
ついて示される配列を含むことができる（すなわち，"ＲＺ"のカラムの最も左お
よび最も右の配列部分）。同様に，対応するＤＮＡ標的領域を標的とし，標的配
列または特定された標的（基質）配列に相補的な配列のＤＮＡ等価物を含むトリ
プレックス分子を提供することができる。典型的には，アンチセンス分子は，ア
ンチセンス分子の単一の連続した配列に沿って，標的配列に相補的であろう。し
かし，ある態様においては，アンチセンス分子は，基質分子がループを形成する
ように基質に結合することができ，および／またはアンチセンス分子は，アンチ
センス分子がループを形成するように結合することができる。すなわち，アンチ
センス分子は，２つの（またはさらに多くの）非連続的基質配列に相補的であっ
てもよく，またはアンチセンス分子の２つの（またはさらに多くの）非連続的配
列部分が標的配列に相補的であってもよく，あるいはその両方でもよい。

【００３２】リボザイム配列に関して，"本質的に・・・からなる"とは，活性なリボザイム
が，標的部位における切断が生ずるように，実施例に記載されるものと同等の酵
素中心，もしくはコア，およびＲＮＡに結合することができる結合アームを含む
ことを意味する。そのような切断を有意に妨害しない他の配列が存在していても
よい。すなわち，コア領域は，例えば，酵素的活性を妨害しない１またはそれ以
上のループまたはステム−ループ構造を含んでいてもよい。表ＩＩＩ−ＶＩＩの
配列中の"Ｘ"は，そのようなループでありうる。

【００３３】すなわち，１つの観点においては，本発明は，リプレッサー遺伝子発現を阻害
するリボザイムを特徴とする。これらの化学的または酵素的に合成されたリボザ
イム分子は，その標的ＲＮＡのアクセス可能な領域に結合する基質結合ドメイン
を含む。リボザイムはまた，標的ＲＮＡの切断を触媒するドメインを含む。酵素
的核酸分子は，好ましくは，ハンマーヘッドまたはハンマーヘッド様モチーフ（
Ｋｏｒｅｅｔａｌ．，１９９８，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａ
ｒｃｈ２６，４１１６−４１２０；Ｌｕｄｗｉｇ＆Ｓｐｒｏａｔ，国際公開ＷＯ
９８／５８０５８），またはヘアピンモチーフのリボザイムである。あるいは，
リボザイムはＤＮＡザイムでありうる。化学的に合成されたリボザイム分子には
また，化学的または酵素的ライゲーション法を用いて核酸の種々のフラグメント
から一緒に組み立てられたリボザイムが含まれる。リボザイムは，結合した後に
，標的ＲＮＡを切断し，翻訳および蛋白質蓄積を妨害する。リプレッサー遺伝子
により抑制されている遺伝子（"抑制された遺伝子"）の発現は，リプレッサー遺
伝子の非存在下または減少したレベルの下で上昇することができる。抑制された
遺伝子のこの上昇したレベルは，細胞および標的生物に有益でありうる。好まし
い態様においては，リボザイムは直接加えるか，またはカチオン性脂質と複合体
を形成するか，リポソーム中に封入するか，または他の方法を用いて，標的細胞
に輸送することができる。核酸または核酸複合体は，エクスビボで，またはイン
ビボで，バイオポリマー中に取り込ませるかまたは取り込ませずに，注射，注入
ポンプもしくはステントを用いることにより，関連する組織に局所的に輸送する
ことができる。別の好ましい態様においては，リボザイムは，適当なリポソーム
ベヒクル中で，ＴＲ２オーファンレセプター，ＴＲ２−１１オーファンレセプタ
ー，ＥＡＲ３／ＣＯＵＰ−ＴＦ−１，およびＧＡＴＡ転写因子，ＣＤＰ，または
ＩＲＦ−２発現の部位（例えば，肝細胞，癌細胞）に投与する。

【００３４】本発明の別の観点においては，標的分子およびＴＲ２オーファンレセプター，
ＴＲ２−１１オーファンレセプター，ＥＡＲ３／ＣＯＵＰ−ＴＦ−１，およびＧ
ＡＴＡ転写因子，ＣＤＰまたはＩＲＦ−２活性を切断するリボザイムは，ＤＮＡ
またはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組換えベク
ターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。リボザイ
ム発現ウイルスベクターは，限定されないが，アデノ随伴ウイルス，レトロウイ
ルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができ
る。好ましくは，リボザイムを発現しうる組換えベクターは，上述のように輸送
され，標的細胞中に残留する。あるいは，リボザイムの過渡的発現を与えるウイ
ルスベクターを用いることができる。そのようなベクターは，必要に応じて繰り
返し投与することができる。いったん発現されたら，リボザイムは標的ＲＮＡを
切断する。リボザイム発現ベクターの輸送は，例えば静脈内または筋肉内投与に
より全身的に，または患者から外植された標的細胞に投与した後，患者に再導入
することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能とする他の任意の手段
により，行うことができる（総説については，ＣｏｕｔｕｒｅａｎｄＳｔｉ
ｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。本発明の別の観
点においては，標的分子を切断して細胞増殖を阻害するリボザイムは，ＤＮＡ，
ＲＮＡ，またはウイルスベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。
好ましくは，リボザイムを発現しうる組換えベクターを上述のように局所的に輸
送し，平滑筋細胞中に過渡的に残留させる。しかし，この目的のために，ＲＮＡ
の発現を指示する他の哺乳動物細胞ベクターを用いてもよい。

【００３５】 "患者"とは，外植した細胞のドナーまたはレシピエントである生物，または細
胞それ自体を意味する。"患者"とはまた，酵素的核酸分子を投与することができ
る生物を表す。好ましくは，患者は哺乳動物または哺乳動物細胞である。より好
ましくは，患者はヒトまたはヒト細胞である。

【００３６】 "ベクター"とは，所望の核酸を輸送するために用いられる任意の核酸系および
／またはウイルス系技術を意味する。

【００３７】別の観点においては，本発明の核酸分子は，個々に，または他の薬剤と組み合
わせてまたは一緒に投与して，疾患または状態を治療するために用いることがで
きる。例えば，当業者には明らかなように，癌に関連する疾患または状態を治療
するために，患者を処置することができ，または他の適当な細胞を処理すること
ができる。

【００３８】 "・・を含む"とは，"・・を含む"の単語の前にあるものを含むがそれには限定
されないことを意味する。すなわち，"・・を含む"との用語の使用は，挙げられ
る要素が必要または強制的なものであるが，他の要素は任意であり，存在しても
存在しなくてもよいことを示す。"・・からなる"とは，"・・からなる"の語句の
前にあるものをすべて含みかつそれに限定されることを意味する。すなわち，"
・・からなる"との語句は，挙げられる要素が必要または強制的なものであり，
他の要素は存在しないことを示す。"本質的に・・からなる"とは，この語句の前
に挙げられるすべての要素を含み，挙げられる要素についての開示において特定
される活性または作用を妨害せずまたはそれに貢献する他の要素に限定されるこ
とを意味する。すなわち，"本質的に・・からなる"との語句は，挙げられる要素
は必要または強制的なものであるが，他の要素は任意であり，それらが挙げられ
る要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かによって，存在しても存在しなく
てもよいことを示す。

【００３９】本発明の他の特徴および利点は，以下の好ましい態様の説明および特許請求の
範囲から明らかであろう。

【００４０】好ましい態様の説明まず，図面を簡単に説明する。

【００４１】図１は，７つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを示す。矢印は
切断の部位を示す。−−−−−−−−−は標的配列を示す。点が散在する線は，
三次相互作用を示す。−は塩基対形成相互作用を示す。グループＩイントロン：
Ｐ１−Ｐ９．０は種々のステム−ループ構造を表す（Ｃｅｃｈｅｔａｌ．，
１９９４，ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃ．Ｂｉｏ．，１，２７３）。ＲＮａｓｅ
Ｐ（Ｍ１ＲＮＡ）ＥＧＳは外部ガイド配列を表す（Ｆｏｒｓｔｅｒｅｔａｌ
．１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，７８３；Ｐａｃｅｅｔａｌ．，１９
９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，３５８７）。グループＩＩイントロ
ン：５'ＳＳは５'スプライシング部位を意味する；３’ＳＳは３’−スプライシ
ング部位を意味する；ＩＢＳはイントロン結合部位を意味する；ＥＢＳはエクソ
ン結合部位を意味する（Ｐｙｌｅｅｔａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｙ，３３，２７１６）。ＶＳＲＮＡ：Ｉ−ＶＩは，６つのステム−ループ
構造を示す；陰領域は三次相互作用を示す（Ｃｏｌｌｉｎｓ，国際公開ＷＯ９６
／１９５７７）。ＨＤＶリボザイム：Ｉ−ＩＶは４つのステム−ループ構造を示
す（Ｂｅｅｎｅｔａｌ．，米国特許５，６２５，０４７）。ハンマーヘッド
リボザイム：Ｉ−ＩＩＩは，３つのステム−ループ構造を示す；ステムＩ−ＩＩ
Ｉは，任意の長さであってもよく，対称でも非対称でもよい（Ｕｓｍａｎｅｔ
ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．，１，５２７）
。ヘアピンリボザイム：ヘリックス１，４および５は任意の長さでありうる；ヘ
リックス２は３−８塩基対の長さである；Ｙはピリミジンである；ヘリックス２
（Ｈ２）は少なくとも４塩基対で与えられ（すなわち，ｎは１，２，３または４
），ヘリックス５は任意に２塩基またはそれ以上の長さでありうる（好ましくは
３−２０塩基，すなわち，ｍは１−２０またはそれ以上）。ヘリックス２および
ヘリックス５は，１またはそれ以上の塩基により共有結合していてもよい（すな
わち，ｒは１塩基以上）。ヘリックス１，４または５はまた，リボザイム構造を
安定化するために，２塩基対またはそれ以上長くてもよく（すなわち４−２０塩
基対），好ましくは蛋白質結合部位である。それぞれの例において，各Ｎおよび
Ｎ'は，独立して，任意の正常または修飾塩基であり，各ダッシュは潜在的塩基
対相互作用を表す。これらのヌクレオチドは，糖，塩基またはリン酸で修飾され
ていてもよい。ヘリックス中では完全な塩基対形成は必要ではないが，好ましい
。ヘリックス１および４は，ある程度の塩基対形成が保持される限り，任意のサ
イズでありうる（すなわち，ｏおよびｐは，それぞれ独立して，０から任意の数
，例えば２０である）。必須塩基は，構造中に特定の塩基として示されるが，当
業者は，１またはそれ以上が化学的に修飾（脱塩基，塩基，糖および／またはリ
ン酸修飾）されていてもよく，または著しい影響なしで他の塩基で置き換えられ
ていてもよいことを認識するであろう。ヘリックス４は，２つの別々の分子から
，すなわち接続ループなしで形成してもよい。接続ループは，存在する場合，そ
の塩基，糖またはリン酸に修飾を有するかまたは有しないリボヌクレオチドであ
りうる。ｑは２塩基以上である。接続ループはまた，非ヌクレオチドリンカー分
子で置き換えられていてもよい。Ｈは塩基Ａ，Ｕ，またはＣを表す。Ｙはピリミ
ジン塩基を表す。"＿＿"は，共有結合を表す（Ｂｕｒｋｅｅｔａｌ．，１９
９６，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，１２９；Ｃｈ
ｏｗｒｉｒａｅｔａｌ．，米国特許５，６３１，３５９）。

【００４２】図２は，ｈＧＡＴＡ−２を標的とする，配列番号２８１に含まれる配列を有す
るハンマーヘッドリボザイムの二次構造の例である。

【００４３】図３は，本発明の核酸分子による作用のメカニズムを示す概略図である。転写
開始の制御は，一緒に作用する１またはそれ以上の転写因子により生ずることが
できる。２以上の因子が関与する場合，転写因子はホモダイマーまたはヘテロダ
イマーとして存在することができる。場合によっては，ヘテロダイマーの形成に
より転写が抑制され，一方，ホモダイマーは不活性な転写複合体を形成すること
ができる。ヘテロダイマーの１つのサブユニットの発現を妨害することにより，
平衡がより多くのホモダイマーの形成にシフトし，このため活性なリプレッサー
の形成が減少し，転写が増強されるであろう。

【００４４】図４は，コバルト誘導し，ＧＡＴＡ転写因子２，ＴＲ２オーファンレセプター
およびＥＡＲ３／ＣＯＵＰ−ＴＲ１を標的とするリボザイムを投与した後に，Ｈ
ｅｐ３Ｂ細胞においてエリスロポエチン合成が無関係対照（ＩＲ１およびＩＲ２
）と比較して増加することを示すグラフである。

【００４５】図５は，コバルト誘導せずに，ＧＡＴＡ転写因子２，ＴＲ２オーファンレセプ
ターおよびＥＡＲ３／ＣＯＵＰ−ＴＲ１を標的とするリボザイムを投与した後に
，Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてエリスロポエチン合成が無関係対照（ＩＲ１およびＩ
Ｒ２）と比較して増加することを示すグラフである。

【００４６】図６は，ｈＧＡＴＡ−２転写因子ＲＮＡを標的とするリボザイムの連続輸送後
に，Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてＥｐｏ発現が無関係対照と比較して増加することを
示す棒グラフである。

【００４７】図７は，ＥＡＲ３／Ｃｏｕｐ−ＴＲ１ＲＮＡを標的とするリボザイムの連続輸
送後に，Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてＥｐｏ発現が無関係対照と比較して増加するこ
とを示す棒グラフである。

【００４８】図８は，ｈＧＡＴＡ−２転写因子ＲＮＡを標的とするリボザイムのパルス輸送
後に，Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてＥｐｏ発現が無関係対照と比較して増加すること
を示す棒グラフである。

【００４９】図９は，ＥＡＲ３／Ｃｏｕｐ−ＴＲ１ＲＮＡを標的とするリボザイムのパルス
輸送後に，Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてＥｐｏ発現が無関係対照と比較して増加する
ことを示す棒グラフである。

【００５０】真核生物の遺伝子抑制遺伝子の転写のためには，遺伝子発現およびその調節に多くの転写因子が必要
である。真核生物中で最も一般的なタイプのレギュレータ遺伝子は，遺伝子発現
の開始においてＲＮＡポリメラーゼを助けるよう機能するものであるようである
。しかし，負の制御下にある遺伝子の多くの例が存在する。この重要な因子の群
は，負のレギュレータまたはリプレッサーとして知られている。これらのトラン
ス作用蛋白質因子（リプレッサー蛋白質）は，一般に遺伝子の特定の部位に結合
することにより転写の速度を調節する。結合部位は，典型的には，標的遺伝子の
上流の，しばしばプロモータ中にあるシス要素であり，多くの場合１０ヌクレオ
チド未満の長さである。負の制御下の遺伝子は，一般にリプレッサー蛋白質によ
り止められるまで構成的に発現される遺伝子である。

【００５１】ある状況下においては，抑制された遺伝子の発現が非常に望ましい。したがっ
て，リプレッサー遺伝子の発現を阻害することにより，抑制された遺伝子の発現
を促進することは，種々の疾病の治療において有益な効果を有するであろう。細
胞または患者にそのような有益な効果を有するであろう多くの蛋白質および／ま
たはペプチドが存在する。いくつかの非限定的例が以下に記載される。当業者は
，その発現の増加から生物が有益な影響を受けるであろう他の遺伝子が存在する
ことを認識するであろう。

【００５２】エリスロポエチン：エリスロポエチンは，低酸素症に応答して腎臓および胎児肝
臓において産生される３０．４ｋＤＡの糖蛋白質ホルモンである（Ｇａｌｓｏｎ
ｅｔａｌ．，（上掲））。このホルモンは赤血球産生を制御し，骨髄におい
て赤血球の前駆体の生存因子として機能する（Ｍａｘｗｅｌｌ＆Ｒａｄｃｌｉｆ
ｆｅ，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎＨｅｍａｔｏｌ．５，１６６−１
７０）。Ｅｐｏを産生する細胞中に存在するヘモグロビン様センサーが酸素分子
のレセプターとして作用すると考えられている（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｔａｌ
．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２，１４１２−１４１５）。酸素のレベルが
正しく制御されているパラメータより低下すると，エリスロポエチン合成が誘導
される。

【００５３】Ｅｐｏを用いて多くの適応症を治療することができる。例えば，腎臓疾病を有
する患者は，血液中に赤血球が存在しないことにより定義される貧血を発症する
かもしれない。組換えＥｐｏを用いる治療は，これらの赤血球の産生を顕著に促
進することができる（Ｍａｘｗｅｌｌ＆Ｒａｄｃｌｉｆｆｃ，（上掲））。Ｅｐ
ｏリプレッサーの産生を阻害することにより，腎臓または肝臓および身体の他の
部分がエリスロポエチンを合成するよう誘導されて，貧血を阻止することができ
る。本発明の別の適用は，化学療法のアジュバントとしての用途である。化学療
法の間，患者は大量の赤血球を失うであろう。エリスロポエチンのリプレッサー
遺伝子を阻害することにより，腎臓または肝臓でＥｐｏ蛋白質を増加した量で発
現することができ，これは次により多くの赤血球の産生を刺激する。

【００５４】顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）：顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ
）は，関連する先祖細胞からの好中球の産生および機能を制御する造血細胞成長
因子である。これはインビボで単球，繊維芽細胞および内皮細胞により産生され
る。組換えＧ−ＣＳＦは，化学療法に伴う好中球減少症を減少させるために，な
らびに先天性疾患，例えば重症慢性好中球減少症の治療として臨床的に投与され
ている。外からＧ−ＣＳＦを加える代わりに，より多くの内因性Ｇ−ＣＳＦを産
生させ，このことにより治療用蛋白質の注入に伴う限界および合併症を回避する
ことが可能となるであろう。Ｇ−ＣＳＦの産生または活性の間接的または直接的
リプレッサーとして作用する可能性のあるいくつかの分子標的がある。ＣＤＰま
たはＣＣＡＡＴ置換蛋白質は，負の制御要素に結合して遺伝子発現を妨害する既
知の転写リプレッサーである。これはショウジョウバエｃｕｔ蛋白質に広範なホ
モロジーを有する。報告は，ＣＤＰがラクトフェリン遺伝子に結合して基底プロ
モーター活性を抑制することを示す。ＣＤＰの過剰発現は，培養骨髄幹細胞にお
いてＧ−ＣＳＦ誘導性好中球変異を妨害する（Ｂｌｏｏｄ９０，２７８４−９
５，１９９７）。可能性のある別の標的はジェネシスであり，これは骨髄細胞の
顆粒球分化を妨害する転写的リプレッサーである（Ｌｅｕｋｅｍｉａ１２，２
０７−２１２，１９９８）。ジェネシスは，"翼状らせん"転写因子制御ファミリ
ーのメンバーである。ジェネシスを過剰発現している３２Ｄ骨髄細胞は，Ｇ−Ｃ
ＳＦにより刺激されたときに，成熟することができない。ジェネシスは，ほぼ胚
性幹細胞および胚性癌腫細胞においてのみ発現される。ＣＤＰおよびジェネシス
は両方とも発生の制御に関与しているようであり，これらのダウンレギュレーシ
ョンは幹細胞成熟における妨害を救済するかもしれない。

【００５５】インターフェロン−アルファ：インターフェロンは，抗ウイルス，抗増殖性，免
疫調節性およびサイトカイン刺激の機能を有する蛋白質をコードする３０個を越
える遺伝子の誘導を通じて多数の生物学的効果を示す。アルファインターフェロ
ン（ＩＦＮ−Ａ）は重要な免疫系調節剤である。ＩＦＮ−Ａは，構造的に関連し
た遺伝子の大きなファミリーによりコードされる。インターフェロン治療は，細
胞増殖疾患（癌）およびウイルス感染（ＨＢＶ，ＨＣＶ）に用いられている。イ
ンターフェロン−アルファは，シス作用ＤＮＡ制御領域と対応するトランス作用
因子との間の複雑な相互作用により，異なる遺伝子発現が生じている。インター
フェロン−アルファ遺伝子の発現を制限している１つの可能性は，リプレッサー
転写因子ＩＲＦ−２（ＪＢＣ２７２，２２７８８−９９，１９９７）である。
また，トランス作用リプレッサーがまだ同定されていないが本発明の核酸分子に
よる阻害の追加の標的でありうる別の負の制御領域がある。この転写性リプレッ
サーの発現を阻害することにより，産生される内因性インターフェロン−アルフ
ァのレベルが増加するかもしれない。また，トランス作用リプレッサーがまだ同
定されていないが本発明の核酸分子による阻害の追加の標的でありうる別の負の
制御領域がある。この方法の利点は，外因性インターフェロンに対する抗体の産
生を回避しうること，ならびに外因性インターフェロン−アルファ投与にしばし
ば見られる自己免疫合併症を回避しうることであろう。

【００５６】本発明の核酸分子の作用のメカニズムアンチセンス：アンチセンス分子は，修飾されたまたは修飾されていないＲＮ
Ａ，ＤＮＡ，または混合ポリマーのオリゴヌクレオチドであることができ，主と
して，マッチする配列に特異的に結合することにより機能し，ペプチド合成を阻
害する（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，Ｎｏｖ１９９４，ＢｉｏＰｈａｒｍ，２０−３３
）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，標的ＲＮＡにワトソンクリック塩基対
形成により結合し，立体的障害によりまたはＲＮａｓｅＨ酵素を活性化すること
により結合した配列のリボソーム翻訳を防止することにより遺伝子発現を妨害す
る。アンチセンス分子はまた，ＲＮＡのプロセシングまたは核から細胞質への輸
送を妨害することにより蛋白質合成を変化させることができる（Ｍｕｋｈｏｐａ
ｄｈｙａｙ＆Ｒｏｔｈ，１９９６，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎＯｎｃｏｇｅｎｅ
ｓｉｓ７，１５１−１９０）。

【００５７】さらに，一本鎖ＤＮＡのＲＮＡへの結合により，ヘテロデュープレックスがヌ
クレアーゼ分解される（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，（上掲），Ｃｒｏｏｋｅ，（上掲））
。これまでのところ，ＲＮａｓｅＨの基質として作用する，主鎖を化学的に修飾
したＤＮＡは，ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートのみである。最
近，２’−アラビノおよび２’−フルオロアラビノ含有オリゴもまたＲＮａｓｅ
Ｈ活性を活性化することが報告された。

【００５８】化学的に修飾されたヌクレオチドの新規なコンフィギュレーション，二次構造
，および／またはＲＮａｓｅＨ基質ドメインを利用する多数のアンチセンス分子
が記載されている（Ｗｏｏｌｆｅｔａｌ；国際公開ＷＯ９８／１３５２６
；Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，米国特許出願６０／０８２，４０４（１９
９８年４月２０日出願）；Ｈａｒｔｍａｎｎｅｔａｌ．，米国特許出願６０
／１０１，１７４（１９９８年９月２１日出願）（これらはその全体を本明細書
の一部としてここに引用する）。

【００５９】トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）：配列特異的様式でゲノムＤ
ＮＡに結合するように一本鎖ＤＮＡを設計することができる。ＴＦＯは，フーグ
スティーン塩基対形成を介してＤＮＡらせんに結合するピリミジンリッチオリゴ
ヌクレオチドから構成される（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，（上掲））。得られるＤＮＡセ
ンス，ＤＮＡアンチセンス，およびＴＦＯからなる三重らせんは，ＲＮＡポリメ
ラーゼによるＲＮＡ合成を破壊する。結合が不可逆的であるため，ＴＦＯメカニ
ズムにより遺伝子発現または細胞死が生ずることができる（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈ
ｙａｙ＆Ｒｏｔｈ，（上掲））。

【００６０】２−５Ａアンチセンスキメラ：２−５Ａシステムは，高等脊椎動物に見いだされ
るＲＮＡ分解のインターフェロン媒介性メカニズムである（Ｍｉｔｒａｅｔ
ａｌ；１９９６，ＰｒｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３，６７８
０−６７８５）。ＲＮＡ切断には，２種類の酵素，すなわち，２−５Ａシンセタ
ーゼおよびＲＮａｓｅＬが必要である。２−５Ａシンセターゼは，二本鎖ＲＮＡ
が２’−５’オリゴアデニル酸（２−５Ａ）を形成することを必要とする。次に
，２−５Ａは，一本鎖ＲＮＡを切断する能力を有するＲＮａｓｅＬを利用するた
めのアロステリックエフェクターとして作用する。二本鎖ＲＮＡとともに２−５
Ａ構造を形成する能力のため，このシステムはウイルス複製の阻害に特に有用で
ある。

【００６１】（２’−５’）オリゴアデニル酸構造は，アンチセンス分子に共有結合で結合
して，ＲＮＡ切断が可能なキメラオリゴヌクレオチドを形成することができる（
Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，（上掲））。これらの分子は，おそらくは，２−５Ａ依存性
ＲＮａｓｅに結合してこれを活性化し，次にオリゴヌクレオチド／酵素複合体が
標的ＲＮＡ分子に結合し，これは次にＲＮａｓｅ酵素により切断されることがで
きる。

【００６２】酵素的核酸：現在，天然に生ずる酵素的ＲＮＡの７つの基本的変種が知られてい
る。さらに，いくつかのインビトロ選択（進化）戦略（Ｏｒｇｅｌ，１９７９，
Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ２０５，４３５）を用いて，ホスホジ
エステル結合の切断およびライゲーションを触媒しうる新たな核酸触媒が発展し
てきた（Ｊｏｙｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３−８７；Ｂｅａｕｄｒｙ
ｅｔａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙ
ｃｅ，１９９２，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ２６７，９０−９
７；Ｂｒｅａｋｅｒｅｔａｌ．，１９９４，ＴＩＢＴＥＣＨ１２，２６８
；Ｂａｒｔｅｌｅｔａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１４１１
−１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ１７，８９−９３；Ｋｕｍ
ａｒｅｔａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢＪ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋ
ｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｓａｎｔｏ
ｒｏｅｔａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９
４，４２６２；Ｔａｎｇｅｔａｌ．，１９９７，ＲＮＡ３，９１４；Ｎａ
ｋａｍａｙｅ＆Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９４，（上掲）；Ｌｏｎｇ＆Ｕｈｌｅｎ
ｂｅｃｋ，１９９４，（上掲）；Ｉｓｈｉｚａｋａｅｔａｌ．，１９９５，
（上掲）；Ｖａｉｓｈｅｔａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ３
６，６４９５；（これらのすべてを本明細書の一部としてここに引用する）。そ
れぞれは，生理学的条件下で，ホスホジエステル結合をトランスで加水分解する
ことを含む一連の反応を触媒することができる（したがって，他のＲＮＡ分子を
切断しうる）。表Ｉは，これらのリボザイムのいくつかの特性をまとめたもので
ある。一般に，酵素的核酸は，最初に標的ＲＮＡに結合することにより作用する
。そのような結合は，標的ＲＮＡを切断する作用をする分子の酵素的部分に近接
して保持された，酵素的核酸の標的結合部分により生ずる。すなわち，酵素的核
酸は，まず標的ＲＮＡを認識し，次に相補的塩基対形成によりこれに結合し，い
ったん正しい部位に結合したら，酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。その
ような標的ＲＮＡの戦略的切断は，コードされる蛋白質の合成を指示するその能
力を破壊するであろう。酵素的核酸は，そのＲＮＡ標的を結合し切断した後，そ
のＲＮＡから離れて別の標的を探し，新たな標的に繰り返し結合して切断するこ
とができる。

【００６３】リボザイムの酵素的性質は，治療を行うのに必要なリボザイムの濃度がより低
い等の著しい利点を有する。この利点は，リボザイムが酵素的に作用する能力を
反映している。すなわち，１つのリボザイム分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切断
することができる。さらに，リボザイムは，高度に特異的な阻害剤であり，その
阻害の特異性は，標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成メカニズムのみならず，標的
ＲＮＡ切断のメカニズムにも依存する。切断の部位の近くにおける１つのミスマ
ッチまたは塩基置換を選択して，リボザイムの触媒活性を完全に排除することが
できる。

【００６４】エンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸分子は，ヌクレオチド塩基配列に特
異的な様式で他の別のＲＮＡ分子を繰り返し切断することができる。そのような
酵素的核酸分子は，事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができ，イ
ンビトロで有効な切断を達成することができる（Ｚａｕｇｅｔａｌ．，３２
４，Ｎａｔｕｒｅ４２９１９８６；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８７Ｎａｔ
ｕｒｅ３２８，５９６；Ｋｉｍｅｔａｌ．，８４Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７８８，１９８７；Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８
，ＥｉｎｓｔｅｉｎＱｕａｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，６，９２；Ｈａｓｅ
ｌｏｆｆａｎｄＧｅｒｌａｃｈ，３３４Ｎａｔｕｒｅ５８５，１９８８
；Ｃｅｃｈ，２６０ＪＡＭＡ３０３０，１９８８；Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓｅ
ｔａｌ．，１７ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１３７１
，１９８９；Ｓａｎｔｏｒｏｅｔａｌ．，１９９７（上掲）））。

【００６５】その配列特異性のため，トランス切断リボザイムは，ヒトの疾患の治療剤とし
て有望である（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５Ａｎｎ．Ｒｅｐ．
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎａ
ｎｄＭａｒｒ，１９９５Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７
）。リボザイムは，細胞性ＲＮＡのバックグラウンド中で特定のＲＮＡ標的を切
断するよう設計することができる。そのような切断事象は，ＲＮＡを非機能性に
し，そのＲＮＡからの蛋白質発現を排除する。このようにして，疾患状態に関連
する蛋白質の合成が選択的に阻害される。

【００６６】核酸分子の合成１００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は，自動化方法を用いては困難
であり，そのような分子の治療的コストは非常に高くなる。本発明においては，
好ましくは，小さい核酸モチーフ（"小さい"とは，１００ヌクレオチド以下の長
さ，好ましくは８０ヌクレオチド以下の長さ，最も好ましくは５０ヌクレオチド
以下の長さの核酸モチーフ，例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド，ハンマー
ヘッドまたはヘアピンリボザイムを表す）が外的輸送に用いられる。これらの分
子は構造が簡単であるため，核酸がＲＮＡ構造の標的領域に進入する能力が高い
。本発明の例示的分子は化学的に合成したが，他の分子も同様に合成することが
できる。オリゴデオキシリボヌクレオチド分子は，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓｅｔ
ａｌ．（１９９２，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｍｙｍｏｌｏｇｙ２１１，３
−１９；本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるように，標準的な
プロトコルを用いて合成した。

【００６７】ある種の酵素的核酸分子を含む通常のＲＮＡについて用いられる合成方法は，
Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９
，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅｅｔａｌ．，１９９０ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＲｅｓ．，１８，５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔｅｔａｌ．，１９９
５ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，２６７７−２６８４；に記載
の方法にしたがい，慣用の核酸保護基およびカップリング基，例えば，５’末端
にジメトキシトリチル，および３’末端にホスホルアミダイトを用いる。非限定
的例においては，小スケールの合成は，３９４ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で，改変した０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを
用いて，アルキルシリル保護ヌクレオチドについては７．７５分間のカップリン
グ工程を，２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリン
グ工程を行った。表ＩＩは，合成サイクルにおいて用いた試薬の量および接触時
間の概要を示す。あるいは，０．２μｍｏｌスケールでの合成は，９６ウエルプ
レート合成機，例えば，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）によ
り製造される装置で，サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。各カッ
プリングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して１５倍過
剰（３１μＬの０．１Ｍ＝３．１μｍｏｌ）のホスホルアミダイトおよび３８．
７倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（３１μＬの０．２５Ｍ＝７．７５μｍｏｌ
）を用いた。３９４ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機
における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して，９
７．５−９９％であった。３９４ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉ
ｎｃ．合成器で用いた他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：
脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ(ＡＢＩ）であり；キャッピング
は，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無
水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は，１６．９ｍ
ＭＩ₂，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商
標））であった。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは，
試薬瓶から直接用いた。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２
５Ｍ）は，ＡｍｅｒｉｃａｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｈｅｍｉｃａｌ
，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成した。

【００６８】ＲＮＡの脱保護は，２ポットプロトコルまたは１ポットプロトコルのいずれか
を用いて行った。２ポットプロトコルについては，ポリマー結合トリチルオンオ
リゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，４０％水性メチ
ルアミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁した。−２０℃に冷却した
後，上清をポリマー支持体から除去した。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：Ｍｅ
ＣＮ：Ｈ₂Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上
清に加えた。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末
を得た。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（
１．５ｍＬＮ−メチルピロリジノン，７５０μＬＴＥＡおよび１．０ｍＬ
ＴＥＡ・３ＨＦの溶液３００μＬ，ＨＦ濃度１．４Ｍ）に再懸濁し，６５℃に加
熱した。１．５時間後，オリゴマーを１．５ＭＮＨ₄ＨＣＯ₃で急冷した。

【００６９】あるいは，１ポットプロトコルのためには，ポリマー結合トリチルオンオリゴ
リボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，３３％エタノール性
メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）の溶液中で，６５℃で１５分間
懸濁した。バイアルを室温にした。ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を加え，バイ
アルを６５℃で１５分間加熱した。試料を−２０℃に冷却し，次に１．５ＭＮ
Ｈ₄ＨＣＯ₃で急冷した。

【００７０】トリチルオンオリゴマーの精製のためには，急冷したＮＨ₄ＨＣＯ₃溶液を，ア
セトニトリル，続いて５０ｍＭＴＥＡＡで予備洗浄したＣ−１８含有カートリ
ッジに負荷した。負荷したカートリッジを水で洗浄した後，ＲＮＡを０．５％Ｔ
ＦＡで１３分間脱トリチル化した。次にカートリッジを水で再び洗浄し，１Ｍ
ＮａＣｌで塩交換し，再び水で洗浄した。次に，３０％アセトニトリルでオリゴ
ヌクレオチドを溶出した。

【００７１】不活性ハンマーヘッドリボザイムまたは減弱結合対照（ＢＡＣ）オリゴヌクレ
オチド）は，Ｇ５をＵで，Ａ１４をＵで置換することにより合成した（番号付け
は，Ｈｅｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，３２５２による）。

【００７２】平均段階カップリング収率は，＞９８％であった（Ｗｉｎｃｏｔｔｅｔａ
ｌ．，１９９５ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，２６７７−２６
８４）。当業者は，合成のスケールは，上述の例より大きくまたは小さく，例え
ば，限定されないが，９６ウエルのフォーマットに適合させることができること
，および，重要なすべては，反応において用いられる化学物質の比率であること
を認識するであろう。

【００７３】あるいは，本発明の核酸分子は，別々に合成して，ライゲーションにより一緒
につなげてもよい（Ｍｏｏｒｅｅｔａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ２
５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒｅｔａｌ．国際公開ＷＯ９３／２３５６９；
Ｓｈａｂａｒｏｖａｅｔａｌ．，１９９１，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ１９，４２４７）。

【００７４】核酸分子の投与核酸分子の輸送の方法は，Ａｋｈｔａｒｅｔａｌ．，（１９９２，Ｔｒｅ
ｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏ．，２，１３９）およびＤｅｌｉｖｅｒｙＳｔｒａ
ｔｅｇｉｅｓｆｏｒＡｎｔｉｓｅｎｓｅＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５（いずれも本明細
書の一部としてここに引用する）に記載されている。Ｓｕｌｌｉｖａｎｅｔ
ａｌ．，ＰＣＴＷＯ９４／０２５９５は，さらに，酵素的ＲＮＡ分子を輸送す
るための一般的な方法を記載する。これらのプロトコルを用いて，事実上いかな
る核酸分子も輸送することができる。核酸分子は当業者に知られる種々の方法に
よって細胞に投与することができ，これにはリポソームへの封入，イオントホレ
シス，または他のベヒクル，例えば，ヒドロゲル，シクロデキストリン，生分解
性ナノカプセル，および生体接着性小球体への組み込みが含まれるが，これらに
限定されない。ある適応症に対しては，核酸分子をエクスビボで，上述のベヒク
ルを用いてまたは用いずに，細胞または組織に直接輸送することができる。ある
いは，核酸／ベヒクルの組み合わせを，直接注入により，またはカテーテル，注
入ポンプもしくはステントを用いることにより局所的に輸送する。他の輸送経路
には，静脈内，筋肉内，皮下または関節注射，エアロゾル吸入，経口（錠剤また
はピル形態），局所，全身，眼，腹腔内および／またはくも膜下腔内輸送が含ま
れるが，これらに限定されない。核酸の輸送および投与のより詳細な説明はＳｕ
ｌｌｉｖａｎｅｔａｌ．，（上掲）およびＤｒａｐｅｒｅｔａｌ．，Ｐ
ＣＴＷＯ９３／２３５６９に提供されており，これらを本明細書の一部として
ここに引用する。

【００７５】本発明の分子は医薬として用いることができる。医薬は患者の疾患状態を予防
し，発症を阻害し，またはそれを治療する（症状をある程度，好ましくは全ての
症状を緩和する）。

【００７６】本発明の負に荷電したポリヌクレオチド（例えば，ＲＮＡ，ＤＮＡまたは蛋白
質）は，医薬組成物を形成するために安定化剤，緩衝剤等を用いて，または用い
ることなく，任意の標準的手段により患者に投与および導入することができる。
リポソーム輸送メカニズムを用いることが望ましい場合，リポソームの処方のた
めの標準的プロトコルに従うことができる。本発明の組成物はまた，経口投与用
の錠剤，カプセルまたはエリキシル；直腸投与用の座剤；無菌溶液；注射投与用
の懸濁液等として，処方して用いることもできる。

【００７７】本発明はまた，記載される化合物の薬学的に許容しうる処方を含む。これらの
処方には，上述の化合物の塩，例えば，酸付加塩（例えば，塩酸，シュウ酸，酢
酸およびベンゼンスルホン酸の塩）が含まれる。

【００７８】医薬組成物または処方は，細胞または患者への投与（例えば全身投与），好ま
しくはヒトへの投与に適当な形態の組成物または処方を表す。適当な形態は，部
分的には，使用する投与経路（例えば経口，経皮，または注射）に依存する。そ
のような形態は，組成物または処方が標的細胞（すなわち，負に荷電したポリマ
ーが輸送されることが望まれる細胞）に到達することを妨害してはならない。例
えば，血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子は
当該技術分野において知られており，例えば，毒性，および組成物または処方が
その効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。

【００７９】 "全身投与"とは，インビボでの全身吸収，または血流中における薬剤の蓄積の
後に全身に分配されることを意味する。全身的吸収をもたらす投与経路には，静
脈内，皮下，腹腔内，吸入，経口，肺内および筋肉内が含まれるが，これらに限
定されない。これらの投与経路のそれぞれは，所望の負に荷電したポリマー（例
えば核酸）をアクセス可能な疾患組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は，
分子量またはサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリ
ポソームまたは他の薬剤担体を使用することにより，薬剤を，例えば，あるタイ
プの組織（例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織）に局在化させることが可能であ
る。薬剤と細胞（例えば白血球およびマクロファージ）の表面との会合を容易に
することができるリポソーム処方もまた有用である。この方法は，マクロファー
ジおよび白血球による異常な細胞（例えば癌細胞）の免疫認識の特異性を利用す
ることにより，薬剤の標的細胞への輸送を増強するであろう。

【００８０】本発明はまた，ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ−修飾，または長期
間循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む，表面修飾リポソームを含
む組成物の使用を特徴とする。これらの処方は，標的組織における薬剤の蓄積を
増加させる方法を提供する。この種類の薬剤担体は，単核食細胞システム（ＭＰ
ＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および排除に抵抗性であり，したがって
，封入された薬剤の血流循環時間を長くし，組織への暴露を増強する（Ｌａｓｉ
ｃｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉ
ｓｈｉｗａｔａｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，
４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームは，おそらくは脈管新生標
的組織における溢出および捕獲のため，腫瘍中に選択的に蓄積することが示され
ている（Ｌａｓｉｃｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９５，２６７，１２
７５−１２７６；Ｏｋｕｅｔａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期間循環リポソームは，特に，
ＭＰＳの組織で蓄積することが知られている慣用のカチオン性リポソームと比べ
て，ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態学および薬力学を増強する（Ｌｉｕｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；
Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌｅｔ
ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄｅｔａｌ．，国
際公開ＷＯ９６／１０３９２；これらをすべて本明細書の一部としてここに引用
する）。長期間循環リポソームはまた，代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織，例えば肝
臓および脾臓における蓄積を回避するその能力に基づいて，カチオン性リポソー
ムと比較して薬剤をヌクレアーゼ分解からより強く保護するようである。これら
の参考文献はすべて，本明細書の一部としてここに引用する。

【００８１】本発明はまた，薬学的に有効量の所望の化合物を薬学的に許容しうる担体また
は希釈剤中に含む，保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用
いるための許容しうる担体または希釈剤は，医薬の技術分野においてよく知られ
ており，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃ
ｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａ
ｒｏｅｄｉｔ．１９８５）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載さ
れている。例えば，保存剤，安定剤，染料，および風味剤を用いることができる
（同，１４４９）。これらには，安息香酸ナトリウム，ソルビン酸，およびｐ−
ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに，抗酸化剤および懸濁剤を用
いてもよい（同）。

【００８２】薬学的に有効な用量とは，疾患状態の予防，発症の阻害または治療（症状をあ
る程度緩和し，好ましくはすべての症状を緩和する）に必要な用量である。薬学
的に有効な用量は，疾患の種類，用いる組成物，投与の経路，治療する哺乳動物
の種類，考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性，同時投与される薬剤，および
医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に，負に
荷電したポリマーの効力に依存して，０．１ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ体重
／日の活性成分を投与する。

【００８３】本発明の核酸分子はまた，全体の治療効果を増加させるため，他の治療化合物
と組み合わせて患者に投与してもよい。適応症を処置するための多数の化合物の
使用は有益な効果を増加させ，一方副作用を減少させるであろう。

【００８４】あるいは，本発明の核酸分子（例えばリボザイムおよびアンチセンス分子）は
，細胞中で真核生物プロモーターから発現させることもできる（例えば，Ｉｚａ
ｎｔａｎｄＷｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９，３４
５；ＭｃＧａｒｒｙａｎｄＬｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎｅｔａ
ｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，
１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔｅｔａｌ．，１９９２Ａｎ
ｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃｅｔ
ａｌ．，１９９２Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎ
ｇｈｅｅｔａｌ．，１９９１Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊ
ｗａｎｇｅｔａｌ．，１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，１９９２Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒｅｔ
ａｌ．，１９９０Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐ
ｓｏｎｅｔａｌ．，１９９５ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３
，２２５９；Ｇｏｏｄｅｔａｌ１９９７ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，４
，４５（これらの文献はその内容の全てを本明細書の一部としてここに引用する
））。当業者は，真核生物細胞中で適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから任意の核
酸を発現させることができることを理解するであろう。そのような核酸の活性は
，リボザイムによってそれらを一次転写産物から放出させることにより増大させ
ることができる（Ｄｒａｐｅｒｅｔａｌ．，ＰＣＴＷＯ９３／２３５６９
，Ｓｕｌｌｉｖａｎｅｔａｌ．，ＰＣＴＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａ
ｗａｅｔａｌ．，１９９２ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍｐ．Ｓｅ
ｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａｅｔａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａｅｔａ
ｌ．，１９９３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１，３２４９−５
５；Ｃｈｏｗｒｉｒａｅｔａｌ．，１９９４Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６９，２５８５６（いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する）
）。

【００８５】本発明の別の観点においては，標的分子を切断する酵素的核酸分子は，ＤＮＡ
またはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される（例えばＣｏ
ｕｔｕｒｅｅｔａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。組換
えベクターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。リ
ボザイムを発現するウイルスベクターは，限定されないが，アデノ随伴ウイルス
，レトロウイルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築す
ることができる。好ましくは，リボザイムを発現しうる組換えベクターは，上述
のように輸送され，標的細胞中に残留する。あるいは，リボザイムの過渡的発現
を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは，必要
に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，リボザイムは
標的ＲＮＡを切断する。活性なリボザイムは，標的部位における切断が生ずるよ
うに，実施例におけるものと同等の酵素中心もしくはコア，および標的核酸分子
に結合することができる結合アームを含む。そのような切断を妨害しない他の配
列が存在してもよい。リボザイムを発現するベクターの輸送は，全身的（例えば
，静脈内または筋肉内投与により），患者から外植された標的細胞に投与した後
，患者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能とする
他のいずれかの手段により行うことができる（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ
ｅｔａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。

【００８６】本発明の１つの観点においては，少なくとも１つの本発明の核酸分子（リボザ
イム，アンチセンス）をコードする核酸配列を含む発現ベクターが開示される。
本発明の核酸分子をコードする核酸配列は，その核酸分子の発現を可能とする様
式で，動作可能なように連結されている。

【００８７】本発明の別の観点においては，発現ベクターは，転写開始領域（例えば真核生
物ｐｏｌＩ，ＩＩまたはＩＩＩの開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核
生物ｐｏｌＩ，ＩＩまたはＩＩＩの終止領域）；ｃ）本発明の核酸触媒の少な
くとも１つをコードする遺伝子を含む。ここで，前記遺伝子は，前記核酸分子の
発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域および前記終止領域
に動作可能なように連結されている。ベクターは，任意に，本発明の核酸触媒を
コードする遺伝子の５'側または３’側に動作可能なように連結された蛋白質の
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；および／またはイントロン（介在配
列）を含んでいてもよい。

【００８８】リボザイムまたはアンチセンス配列の転写は，真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ
（ｐｏｌＩ），ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ），またはＲＮＡポリ
メラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）のプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ
ＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターからの転写産物は，すべての細胞におい
て高いレベルで発現されるであろう。所定の細胞タイプ中における所定のｐｏｌ
ＩＩプロモーターのレベルは，近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー
，サイレンサー等）の性質に依存するであろう。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵
素が適当な細胞中で発現される限り，原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーター
もまた用いられる（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎａｎｄＭｏｓｓ，１９９０Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７；Ｇａ
ｏａｎｄＨｕａｎｇ１９９３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，
２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒｅｔ．ａｌ．，１９９３Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，１９９０
Ｍｏｌ．細胞．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。何人かの研究者が，そ
のようなプロモーターから発現したリボザイムが哺乳動物細胞中で機能しうるこ
とを示している（例えば，Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔｅｔａｌ．，１９９
２ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇｅ
ｔａｌ．，１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，１９９２Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕｅｔａｌ．，１９９３
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ
'Ｈｕｉｌｌｉｅｒｅｔａｌ．，１９９２ＥＭＢＯＪ．１１，４４１１
−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚｅｔａｌ．，１９９３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅ
ｔａｌ．，１９９５ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，２２５９
；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ＆Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６
６）。より詳細には，転写ユニット，例えばＵ６小核（ｓｎＲＮＡ），転移ＲＮ
Ａ（ｔＲＮＡ）およびアデノウイルスＶＡＲＮＡをコードする遺伝子に由来す
るものは，細胞中において高濃度の所望のＲＮＡ分子（例えばリボザイム）を生
成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，（上掲）；Ｃｏｕｔ
ｕｒｅａｎｄＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒ
ｇｅｔａｌ．，１９９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，２２，２
８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，米国特許５，１６２４，８０３；Ｇ
ｏｏｄｅｔａｌ．，１９９７，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．４，４５；Ｂｅｉｃｒ
ｅｌｍａｎｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１８７３６；（これらのすべて
の刊行物を本明細書の一部としてここに引用する）。上述のリボザイム転写ユニ
ットは，哺乳動物細胞中に導入するために種々のベクター中に組み込むことがで
きる。ベクターとしては，限定されないが，プラスミドＤＮＡベクター，ウイル
スＤＮＡベクター（例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター）
，またはウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルスまたはアルファウイル
スベクター）が挙げられる（総説については，ＣｏｕｔｕｒｅａｎｄＳｔｉ
ｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）を参照）。

【００８９】さらに別の観点においては，本発明は，本発明の核酸分子の少なくとも１つを
コードする核酸配列を，その核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクタ
ーを特徴とする。１つの態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；
ｂ）転写終止領域；ｃ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含
み；前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で
，前記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。別の好
ましい態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域
；ｃ）オープンリーディングフレーム；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコ
ードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３
'末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現
および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記オープンリーディ
ングフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。さらに別
の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ
）イントロン；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み；
前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前
記開始領域，前記イントロンおよび前記終止領域に動作可能なように連結されて
いる。別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止
領域；ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；ｅ）前記核酸分子
の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリー
ディングフレームの３'末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は
，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，
前記イントロン，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作
可能なように連結されている。

【００９０】別の観点においては，本発明は，細胞において標的蛋白質のレベルを増加させ
る方法を特徴とする。該方法は，細胞を，細胞における標的蛋白質のレベルの増
加に適した条件下で，標的蛋白質の発現を抑制するリプレッサー蛋白質の発現を
特異的に阻害しうる核酸分子と接触させる工程を含む。

【００９１】別の観点においては，本発明は，細胞において標的蛋白質のレベルを増加させ
る方法を特徴とする。該方法は，患者から細胞を単離し，標的蛋白質のリプレッ
サーの発現を阻害しうる核酸分子（合成またはベクター）を導入し，標的蛋白質
の発現を増加させる条件下で，細胞を同じまたは異なる患者に導入する，の各工
程を含む。

【００９２】リボザイム活性の最適化本明細書に記載されるリボザイムの触媒活性は，Ｄｒａｐｅｒｅｔａｌ．
，（上掲）に記載されるように最適化することができる。詳細はここでは繰り返
さないが，リボザイム結合アームの長さを変更すること，または，血清リボヌク
レアーゼによる分解を防ぎ，および／またはその酵素的活性を増強させる修飾（
塩基，糖および／またはリン酸）を有するリボザイムを化学的に合成することが
含まれる（例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７
０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔｅｔａｌ．，１９９０Ｎａｔｕｒｅ３４４，
５６５；Ｐｉｅｋｅｎｅｔａｌ．，１９９１Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３，３
１４；ＵｓｍａｎａｎｄＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２Ｔｒｅｎｄｓｉ
ｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，国際
公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｒｏｓｓｉｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０
３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１；およびＢｕｒｇｉｎ
ｅｔａｌ．，（上掲）を参照；これらはすべて酵素的ＲＮＡ分子の塩基，リン
酸および／または糖成分になしうる種々の化学修飾を記載する）。細胞中におけ
るその抗力を増強する修飾，およびオリゴヌクレオチドの合成時間を短縮し化学
物質の必要性を減少するためにステムループ構造から塩基を除去することが望ま
しい（これらの刊行物のすべてを本明細書の一部としてここに引用する）。

【００９３】当該技術分野には，触媒活性に有意に影響を与えることなくそのヌクレアーゼ
安定性および効力を有意に増強することができる，酵素的核酸分子中に導入する
ことができる糖，塩基およびリン酸修飾を記述するいくつかの例がある。リボザ
イムは，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２'
−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２'−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾で修飾するこ
とにより，安定性を高め，および／または触媒活性を増強するために修飾される
（総説については，ＵｓｍａｎａｎｄＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ＴＩ
ＴＢＳ１７，３４；Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，１９９４Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＳｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎｅｔａｌ．，
１９９６Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ３５，１４０９０を参照）。酵素的核酸分
子の糖修飾は，当該技術分野において広く記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ
ｅｔａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔｅｔａｌ
．Ｎａｔｕｒｅ１９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎｅｔａ
ｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎａｎｄ
Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９
２，１７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．国際公開ＷＯ９３／１５
１８７；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎｅ
ｔａｌ．，１９９５Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２；を参照
，これらの参考文献はすべて，その全体を本明細書の一部としてここに引用する
）。これらの刊行物は，触媒活性を阻害することなく，糖，塩基および／または
リン酸修飾等をリボザイム中に組み込む位置を決定する一般的方法および戦略を
記載しており，本明細書の一部としてここに引用する。これらの教示に基づいて
，同様の修飾を本明細書に記載されるように用いて，本発明の核酸触媒を修飾す
ることができる。

【００９４】酵素的活性を維持または増強する化学的修飾を有する核酸触媒が提供される。
そのような核酸はまた，一般に，非修飾核酸よりヌクレアーゼに対して耐性が高
い。すなわち，細胞においておよび／またはインビボで，活性は有意に低下しな
いであろう。本明細書に例示されるように，そのようなリボザイムは，たとえ全
体的活性が１０倍低下しても，細胞においておよび／またはインビボで有用であ
る（Ｂｕｒｇｉｎｅｔａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，３５，
１４０９０）。そのようなリボザイムは，本明細書において，全ＲＮＡリボザイ
ムの酵素的活性を"維持する"と称される。

【００９５】外的に輸送された治療用リボザイムは，最適には，望ましくない蛋白質のレベ
ルが低下するのに十分長い間標的ＲＮＡの翻訳が阻害されるまで，細胞中で安定
でなければならない。この期間は，疾患の状態により，数時間から数日まで様々
であろう。明らかに，リボザイムは，有効な細胞内治療剤として機能するために
は，ヌクレアーゼに耐性でなければならない。ＲＮＡの化学合成の改良（Ｗｉｎ
ｃｏｔｔｅｔａｌ．，１９９５ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２
３，２６７７；本明細書の一部としてここに引用する）は，上述のように，ヌク
レオチド修飾を導入して，そのヌクレアーゼ安定性を増強することにより，リボ
ザイムを修飾する能力を拡大した。

【００９６】 "増強された酵素的活性"とは，細胞および／またはインビボで測定した活性を
含むことを意味し，ここで，活性は，触媒活性とリボザイム安定性との両方を反
映する。本発明においては，全ＲＮＡリボザイムと比較して，インビボでこれら
の特性の積が増加するかまたは有意に減少しない（１０倍未満）。

【００９７】さらに別の好ましい態様においては，酵素的活性を維持または増強する化学修
飾を有する核酸触媒が提供される。そのような核酸はまた一般に，未修飾核酸よ
りに対してよりヌクレアーゼ耐性が高い。すなわち，細胞および／またはインビ
ボで，活性は有意に低下しないであろう。本明細書に例示されるように，そのよ
うなリボザイムは，全体の活性が１０倍低下したとしても，細胞および／または
インビボにおいて有用である（Ｂｕｒｇｉｎｅｔａｌ，１９９６，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）。本発明のそのようなリボザイムは，全
ＲＮＡリボザイムの酵素的活性"維持する"と言われる。

【００９８】これらの分子の使用は，組み合わせ治療（例えば，異なる遺伝子を標的とする
多数のリボザイム，既知の小分子阻害剤と組み合わせたリボザイム，またはリボ
ザイム（異なるリボザイムモチーフを含む）および／または他の化学的または生
物学的分子）との組み合わせを用いた間欠的治療）の可能性を提供することによ
り，疾病進行のより優れた治療につながるであろう。核酸分子を用いる患者の治
療はまた，異なるタイプの核酸分子の組み合わせを含んでいてもよい。．１また
はそれ以上の標的に対するリボザイム（異なるリボザイムモチーフを含む），ア
ンチセンスおよび／または２−５Ａキメラ分子の混合物を含む治療を工夫して，
疾病の症状を軽減することができる。

【００９９】動物モデルＥｐｏ合成のリプレッサーを標的とする核酸の治療上の可能性を評価するため
には，２つの慢性貧血の動物モデルが存在する。これらのモデルは，１）マウス
における化学療法誘導性貧血，および２）マウスにおける慢性腎不全誘導性貧血
である。これらのネズミのモデルは両方とも，ヒト患者における対応する疾病の
病態生理学を密接に模倣する。

【０１００】（１）Ｃ５７／Ｂ１６マウスにおける化学療法誘導性貧血：これらの実験の主な
目的は，赤血球を産生する身体の能力を増加させ，このことにより，化学療法誘
導性の重症の貧血を妨げることを標的とする核酸治療の有効性を評価することで
ある。

【０１０１】癌患者を治療するために用いられている多くの薬剤（細胞毒性化合物）は，骨
髄に有害な影響を及ぼし，循環赤血球の数を著しく減少させる。これは，主とし
て，赤血球の産生を刺激するホルモンであるエリスロポエチン（Ｅｐｏ）の減少
のためである。多くのタイプの化学療法はまた，溶血性貧血を誘導する。多くの
型の化学療法により生ずる重症の貧血は，患者の生活の質（運動，仕事の遂行等
）に著しい影響力を有し，通常の日常活動を行うことが困難である。

【０１０２】Ｅｐｏのリプレッサーを標的とする核酸分子を，Ｃ５７／Ｂ１６マウスにおい
て，化学療法に伴う循環赤血球の重度の喪失（貧血）を改善する（Ｅｐｏ産生の
増強を示す）能力について評価する。

【０１０３】実験方法：すべての実験は，病原体を含まない，２０−２５ｇの雌Ｃ５７／Ｂ
１６マウスを用いて実施する。マウスは病原体を含まない環境下で飼育し，食物
および水を自由に与える。貧血の誘導のために，すべての動物に３．５ｍｇ／ｋ
ｇのシスプラチン（ＣＤＤＰ）を２００μＬの容量で腹膜内注入する（第０日）
。

【０１０４】全血試料採取のためには，動物をＣＯ₂窒息により安楽死させる。化学療法を
開始する前（第０日）に，血液学的および生化学的分析のために，心臓穿刺によ
りベースラインの血液試料を得る。第１日から始めて，週に３回，２７日間，１
０匹のＣＤＤＰ処置動物の群から心臓穿刺により得た血液試料，体重および脾臓
の重さを得る。１回投与の化学療法後１日以内に顕著な尿毒症（ＢＵＮの上昇）
および貧血を伴う急性腎不全が明らかとなる。それぞれの終了時点において，各
群の１０匹の動物からのプールした全血試料（ＥＤＴＡ中）について，Ｃｌａｙ
Ａｄａｍｓマイクロヘマトクリット遠心分離器を用いてヘマトクリットを三重
に測定する。さらに，全血から完全な血液細胞計数を得る。残りの試料は遠心分
離し，血漿試料を−７０℃で保存し，後に血漿エリスロポエチンのレベルを決定
する。

【０１０５】血漿Ｅｐｏレベルは，市販のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅ
ａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）により製造元のプロトコルを用いて決定する。

【０１０６】化合物の有効性実験：薬剤１種類あたり４群の動物を試験する。群１には活性
な核酸分子（例えばリボザイム）を与える。群２には，スクランブル弱体化対照
核酸分子を療法として与え，群３にはベヒクルを療法として与える。群４は正の
治療対照として働き，組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈｕ−Ｅｐｏ；２５００
Ｕ／ｋｇ，週３回）を与える。各時点について１群あたり１０匹の動物を用い，
群１および２については１群あたり３用量までの核酸分子を用いる。各実験にお
いて１３の時点を設ける（第０，１，３，５，８，１０，１２，１５，１７，１
９，２２，２４，２６日）。各群，各時点，各用量について１０匹の動物を安楽
死させ，血液試料を採取し，上述のように試験する。試験薬剤は，ＡＬＺＥＴ（
登録商標）浸透圧ポンプ（ＡｌｚａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓ
）により皮下または静脈内に，皮下ボーラスで，直接腹腔内注入でまたは尾部血
管から静脈内に輸送する。

【０１０７】（２）Ｃ５７／Ｂ１６マウスにおける慢性腎不全誘導性貧血（Ｚｈａｎｇｅｔ
ａｌ．，１９９６，Ｎｅｐｈｒｏｎ７２：６５４−６６１）：これらの実験
の主な目的は，赤血球を産生する身体の能力を増加させ，このことにより慢性腎
不全誘導性の重症の貧血を妨げることを標的とする核酸治療の有効性を評価する
ことである。

【０１０８】慢性腎不全（ＣＲＦ）は，血液を濾過する腎臓の能力（糸球体濾過速度；ＧＦ
Ｒ）の進行性かつ不可逆的な減少を特徴とする機能的臨床診断である。この状態
は，多くの原発性疾病，例えば，限定されないが，糸球体腎炎，心臓血管疾病お
よび高血圧，糖尿病，腎臓感染および尿路疾病に伴う。ＣＲＦは米国のみで３７
０，０００人以上の患者を苦しめている。これらの患者の疾病のほとんどは，終
末腎臓疾患（ＥＳＲＤ）に進行し，生存には腎臓交換治療（血液透析，腹膜透析
，腎臓移植）が必要である。機能的腎臓組織の喪失および透析処置の両方が，こ
れらの患者の赤血球細胞数の深刻な減少を引き起こす。これは主として，赤血球
の産生を刺激するホルモンであるエリスロポエチン（Ｅｐｏ）の減少のためであ
る。重症の慢性貧血は，患者の生活の質（運動，仕事の遂行等）に著しい影響力
を有し，通常の日常活動を行うことが困難である。

【０１０９】実験方法：すべての実験は，病原体を含まない，２０−２５ｇの雌Ｃ５７Ｂ／
１６で実施する。マウスは，病原体を含まない環境で飼育し，食物および水を自
由に与える。これらの動物にＣＲＦを樹立するために，２週間の快復期間により
分けられた２回の外科的処置が必要である。

【０１１０】１回目の外科的処置のためには，動物をケタミン／キシラジンカクテル（１．
２ｍｇ／ｋｇおよび０．１４ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し，右側面の側腹切開を行う。
門の周囲の２ｍｍの縁を除いて右腎臓の全表面をディスポーザブルの焼灼迷走神
経切除（２２５０°Ｆ）を用いて電気凝固する。腎臓を腎臓窩にもどし，創傷は
４−０絹縫合糸および外科用クリップで無菌的に縫合し，動物を２週間快復させ
た後，２回目の外科手術を実施する。２回目の処置のためには，動物をケタミン
／キシラジンカクテル（１．２ｍｇ／ｋｇおよび０．１４ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し
，左外側の側腹切開を行う。左の腎臓を除去し，創傷は４−０絹縫合糸で無菌的
に縫合する。各外科処置の後，すべての動物にペニシリンＧ（Ｄｕｒａｐｅｎ，
３０，０００Ｕ，ＩＭ）を投与する。

【０１１１】全血試料を採取するためには，動物をＣＯ₂窒息により安楽死させる。疾病進
行の評価のために，２回目の手術後第１週から始めて毎週，Ｎｘ後１４週まで，
１群あたり８匹の動物から，血液試料，体重および脾臓の重さを得る。対照の血
液学および生化学的測定のために，８匹の正常動物の群を安楽死させて血液試料
を得る。したがって，対照群を含め，１２回の安楽死の時点がある。文献の報告
から，顕著な尿毒症（ＢＵＮの持続的上昇）および貧血を有するＣＲＦが，Ｎｘ
後８週間以内に生ずるであろう。剖検において，心臓穿刺により臨床化学（ＢＵ
Ｎおよびクレアチニン）用に血液試料を得る。血液学的試験（ＷＢＣ，Ｄｉｆｆ
．，血小板計数）は外部実験室（ＩＤＥＸＸ，Ｉｎｃ．）で行う。

【０１１２】化合物の有効性実験：試験する薬剤１種類あたり４群の動物を用いる。群１に
は本発明の活性な核酸分子（例えばリボザイム）を与える。群２にはスクランブ
ル弱体化核酸を療法として与え，群３にはベヒクルを療法として与える。群４は
正の治療対照として働き，組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈｕ−Ｅｐｏ；２５
０Ｕ／ｋｇ；週３回）を与える。１群あたり８匹の動物，および群１および２に
ついては，１群あたり３用量までの核酸を用いる。

【０１１３】試験薬剤は，ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプ（ＡｌｚａＳｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓ）により皮下または静脈内に，皮下ボーラスで，直
接腹腔内注入でまたは尾部血管から静脈内に輸送することができる。

【０１１４】（３）Ｃ５７／Ｂ１６マウスにおける化学療法誘導性骨髄抑制（Ｍｉｓａｋｉｅ
ｌａｌ．，１９９８，ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ
７７：８８４−８８９）：これらの実験の主な目的は，白血球細胞を産生する身
体の能力を増加させ，このことにより化学療法誘導性好中球減少症を妨げること
を標的とする治療の有効性を評価することである。これらの核酸分子が化学療法
に伴う循環白血球細胞の重篤な喪失（好中球減少症）を改善する能力をＢａｌｂ
／ｃマウスにおいて試験する。Ｍｉｓａｋｉ，ｅｔａｌ．（１９９８）のプ
ロトコルを改変したプロトコルを用いる。

【０１１５】実験方法：すべての実験は，病原体を含まない，２５−３０ｇの雌Ｂａｌｂ／
ｃマウスで実施する。マウスを病原体を含まない環境下で飼育し，食物および水
を自由に与える。骨髄抑制誘導のために，すべての動物に２００μＬ容量中の２
００ｍｇ／ｋｇシクロホスファミド（ＣＰＡ）を腹膜内注入する（第０日）。

【０１１６】血液サンプリングは１６の時点で行う。試料を得て，血漿Ｇ−ＣＳＦレベルお
よびＣＢＣを評価する。すべてのリボザイム処方の試験プロトコルについて１つ
のベヒクル対照群およびｒｈｕＧ−ＣＳＦ群を用いる。体重及び脾臓の重さを記
録する。

【０１１７】すべての血液試料を採取するために，動物をＣＯ₂窒息により安楽死させる。
化学療法を開始する前に（第０日），心臓穿刺により血液学的分析のためのベー
スラインの血液試料を得る。１０匹の動物の１群を，ＣＰＡ前，ＣＰＡの４日後
（６ａｍ，正午および６ｐｍ），およびその後毎日安楽死させる。完全な血液細
胞計数のために２ｍｌの全血をＩＤＥＸＸ獣医学実験室に送る。残りの試料を遠
心分離し，血漿試料を−７０℃で保存し，後に血漿Ｇ−ＣＳＦレベルを決定する
。血漿Ｇ−ＣＳＦレベルは，市販のＥＬＩＳＡにより実験室で決定する。残りの
血漿試料はさらなる分析のために凍結する。

【０１１８】化合物の有効性実験：試験する薬剤１種類あたり４群の動物を用いる。群１に
は本発明の活性な核酸分子（例えばリボザイム）を与える。群２にはスクランブ
ル弱体化核酸を療法として与え，群３にはベヒクルを療法として与える。群４は
正の治療対照として働き，組換えヒトｒｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ（５μｇ／ｋｇ，毎日
）を与える。１群の１時点あたり１０匹の動物を用い，群１および２については
１群あたり３用量までのリボザイムを用いる。第０日に，動物にシクロホスファ
ミド（ＣＰＡ；２００ｍｇ／ｋｇ，ＩＰ）を投与する。第４日に核酸治療を開始
する。治療は第１６日まで毎日続ける。各実験には１６の時点（０−１７日）が
ある。１群，１時点，１用量あたり１０匹の動物を安楽死させ，血液試料を採取
する。ＣＰＡ前，ＣＰＡ４日後，核酸投与の６および１２時間後，およびその後
毎日，１群の１０匹の動物を安楽死させる。２ｍｌの全血を完全な血液細胞計数
のためにＩＤＥＸＸ獣医学研究室に送る。残りの試料は遠心分離し，血漿試料を
−７０℃で保存し，後に血漿エリスロポエチンレベルを決定する。血漿Ｇ−ＣＳ
Ｆレベルは，市販のＥＬＩＳＡにより実験室で測定する。残りの血漿試料はさら
なる分析のために凍結する。試験薬剤は，ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプ
（ＡｌｚａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓ）で皮下または静脈内に
，皮下ボーラスで，直接腹腔内注入でまたは尾部血管から静脈内に輸送すること
ができる。

【０１１９】（４）ラットにおける慢性再発性実験自己免疫脳炎：多発性硬化症は，その原因
が不明の疾患であり，脊髄の周囲の保護組織（ミエリン）の破壊に起因する多く
の症状（衰弱，しびれ，協調の喪失，頭痛）を有する。免疫系の問題および／ま
たは感染性物質の両方の可能性を支持する多くの研究が公表されている。これは
兆候から死亡まで約３５年間の臨床経過を有する慢性衰弱疾病である。ＭＳの自
然発生的な動物モデルはないが，齧歯類においてＭＳと似た自己免疫疾患を誘導
することができる。これは，粗脳混合物または脳から得た精製蛋白質のいずれか
を皮下に注入することにより行う。このモデルの目的は，動物モデルにおいてこ
の疾病に伴う症状を改善することに対する，インターフェロン−リプレッサーを
標的とする核酸を用いる治療の有効性を評価することである。

【０１２０】実験方法：すべての実験は，Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｃ．から入手した，病原体を
含まない，７−９週齢の雄のＤａｒｋＡｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラットを用いて行
う。ラットは，病原体を含まない環境で飼育し，実験の開始前１週間，食物およ
び水を自由に与える。すべての動物は，不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ
）中の同系脊髄（ＳＳＣ）で免疫する。脊髄乳濁液の調製のためには，ドナーＤ
Ａラットからの脊髄を除去し，よくすりつぶす。ＩＦＡ（ｖ／Ｗ）１部に対して
脊髄１部を用いて乳濁液を調製する。乳濁液のおよその用量はパイロット実験か
ら決定する。第０日に，０．２ｍｌのホモジネート（ＳＳＣおよびＩＦＡ）を尾
部根元の背側基部に注射する。すべての動物に７５ｍｇ／ｋｇの同系脊髄を投与
する。これらの実験の主な終点は臨床スコアである。臨床的な評点システムは以
下のとおりである：

【０１２１】０．０＝正常０．５＝尾部の活動の部分的な喪失１．０＝尾部の活動の完全な喪失２．０＝後肢の虚弱または一方の後肢のひきずり３．０＝両後肢の麻痺４．０＝両後肢の麻痺および前肢の虚弱５．０＝瀕死脱髄の組織病理学的証拠が二次的終点である。臨床的評点および体重は２１日
間毎日測定し，その後ＥＯＤを第９０日まで測定する。この実験の終了時（免疫
後９０日）に動物を安楽死させる。剖検において，脳および脊髄を除去し，１０
％緩衝化ホルマリンで固定し，組織病理学分析を行う。次に，最大の再現性およ
びヒトの臨床疾病を最も密接に模倣する病態生理学を与える実験方法（ＳＳＣの
用量）を選択し，化合物の有効性実験において用いる。

【０１２２】化合物の有効性実験：この実験は，インターフェロン−アルファリプレッサー
遺伝子を標的とする核酸分子の，臨床的評点およびこれらの動物の脊髄および脳
における組織病理学的変化の重篤度に対する有効性を評価する。試験する薬剤１
種類あたり２つの主群の動物を用いる。一方には予防的処置を施し（免疫の３日
後に開始），他方には治療的処置を施す（最初の麻痺の発現（免疫後約１５日）
後）。各主群は４つの亜群を有する。群１にはベヒクルを療法として与える。群
２には，スクランブル弱体化核酸対照を療法として与える。群３には，活性な核
酸（例えばリボザイム）を与え，群４には組換えヒトインターフェロン−ａ（８
Ｍ．Ｕ．，ＳＣ，１匹あたり，ＥＯＤ，９０日間）を与える。核酸分子は，３０
ｍｇ／ｋｇ，ＥＯＤ，ＳＣで９０日間投与する。１亜群あたり１０匹の動物を用
い，用量／応答実験のためには１亜群あたり３用量までを用いる。

【０１２３】試験試薬は，ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプ（ＡｌｚａＳｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓ）により皮下または静脈内に，皮下ボーラスで，直
接腹腔内注入でまたは尾部血管から静脈内に輸送することができる。

【０１２４】（６）Ｃ５７／Ｂ１６マウスにおけるＢ１６黒色腫（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａｅｔ
ａｌ．，１９８５，ＣｌｉｎＥｘｐＭｅｔａｓｔａｓｉｓ３，２９５−
３０４）：これらの実験の主な目的は，インターフェロン−アルファを産生する
身体の能力を増加させ，このことにより免疫応答を増大させて細胞増殖を阻害す
ることを標的とする核酸治療の有効性を評価することである。２つの同系黒色腫
細胞株であるＢ１６／Ｂ１６およびＢ１６／Ｆ１０を用いる。

【０１２５】実験方法：すべての実験は，病原体を含まない２５−３０ｇの雌Ｃ５７／Ｂ１
６マウスで実施する。マウスは病原体を含まない環境下で飼育し，食物および水
を自由に与える。

【０１２６】Ｂ１６／Ｂ１６：第０日に，動物に，１００μｌの通常の食塩水中のＢ１６／
Ｂ１６細胞（５ｘ１０⁵）を肩胛骨領域の背部中央の皮下に注入する。原発性腫
瘍体積をマイクロカリパスを用いて測定する。週３日，各腫瘍から３回測定した
長さおよび幅の測定値を得る。腫瘍体積は腫瘍の長さおよび幅の測定値から次の
式にしたがって求める：

【０１２７】腫瘍体積＝０．５ａｂ² 式中，ａ＝腫瘍の最長軸，ｂ＝腫瘍の最短軸１組の動物（群１）においては，原発性腫瘍を２５日まで成長させる。この群
の治療上の終点は原発性腫瘍体積，転移および生存である。第２組の動物（群Ｉ
Ｉ）においては，Ｂ１６ＢＬ６の腫瘍成長が５００ｍｍ³に達したとき，原発性
腫瘍を除去する。この群の治療上の終点は転移および生存である。死亡したとき
または第２５日（実験の最終日）に肺における転移性成長を観察する。実験の終
了時に，肺を秤量し，２５Ｘの倍率でマクロ転移を計数することにより，肺にお
ける転移を観察する。マクロ転移が存在しない場合には，肺をホルマリン中で潅
流固定し，次に切片を作成してミクロ転移を組織学的に調べ，生存時間を記録す
る。

【０１２８】化合物の有効性実験：群ＩおよびＩＩについては試験する薬剤１種類あたり４
亜群の動物を用いる。亜群Ａには本発明の核酸分子を与える。亜群Ｂにはスクラ
ンブル弱体化核酸対照を療法として与え，亜群Ｃにはベヒクルを療法として与え
る。亜群Ｄは陽性治療対照として働き，組換えヒトＴＦＮ−アルファＡ／Ｄ（８
Ｍ．Ｕ．，ＳＣ，１匹あたり，ＥＯＤ，３０日間）を投与する。１群あたり１５
匹の動物，および群ＡおよびＢについては１群あたり３用量までの核酸を用いる
。治療は第３日に始め，第２５日まで毎日続ける。剖検において，心臓穿刺によ
り血液試料を採取し，遠心分離し，血漿試料をさらなる分析のために−７０℃で
保存する。

【０１２９】試験薬剤は，ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプ（ＡｌｚａＳｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて皮下または静脈内に，皮下ボーラスで，
直接腹腔内注入でまたは尾部血管から静脈内に輸送することができる。

【０１３０】Ｂ１６／Ｆ１０：第０日に，Ｂ１６／Ｆ１０（５ｘ１０⁴）を１００μｌの通
常の食塩水中で動物に静脈内注入する。この群の治療上の終点は転移および生存
である。死亡したときまたは第２５日（実験の最終日）に肺における転移性成長
を観察する。実験の終了時に，肺を秤量し，マクロ転移を２５Ｘの倍率で計数す
ることにより，肺における転移を観察する。マクロ転移が存在しない場合には，
肺をホルマリン中で潅流固定し，次に切片を作成してミクロ転移について組織学
的に調べ，生存時間を記録する。

【０１３１】化合物の有効性実験：試験する薬剤１種類あたり４群の動物を用いる。群１に
は活性な核酸分子（例えばリボザイム）を投与する。群２にはスクランブル弱体
化核酸対照を療法として投与し，群３にはベヒクルを療法として投与する。群４
は正の治療対照として働き，組換えヒトＥＦＮ−アルファＡ／Ｄ（８Ｍ．Ｕ．，
ＳＣ，１匹あたり，ＥＯＤ，３０日間）を投与する。１群あたり１５匹の動物お
よび群１および２については１群あたり３用量までの核酸分子を用いる。治療は
第３日に開始し，第２５日まで毎日続ける。剖検においては，心臓穿刺により血
液試料を採取し，遠心分離し，血漿試料はさらなる分析のために−７０℃で保存
する。

【０１３２】試験薬剤は，ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプ（ＡｌｚａＳｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓ）で皮下にまたは静脈内に，皮下ボーラスで，直接
腹腔内注入でまたは尾部血管から静脈内に輸送することができる。

【０１３３】（７）Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける結腸直腸癌腫（ＣＯＬＯＮ−２６）（Ｓａｎ
ａｄａｅｔａｌ．，１９９０，ＡｃｔａＭｅｄＯｋａｙａｍａ４４，
２１７−２２２，Ｒａｍａｎｉｅｔａｌ．，１９８９，ＩｎｔＪＣａｎ
ｃｅｒ４３．１４０−１４６，１９８９）：これらの実験の主な目的は，インタ
ーフェロン−アルファを産生する身体の能力を増加させ，このことにより，免疫
応答を増強して細胞増殖を阻害することを標的とする核酸治療の有効性を評価す
ることである。この実験は，ＩＦＮ−アルファのリプレッサーを標的とする核酸
分子が，ＣＯＬＯＮ−２６癌腫を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおいて生存を改善
し転移を減少させる能力を評価する。

【０１３４】実験方法：すべての実験は，病原体を含まない１８−２０ｇの雌Ｂａｌｂ／ｃ
マウスで行う。マウスを病原体を含まない環境で飼育し，食物および水を自由に
与える。第０日において，動物の脾臓被膜に通常の食塩水１００μｌ中のＣＯＬ
ＯＮ−２６細胞（１ｘ１０⁶）を注入する。

【０１３５】腫瘍細胞移植から第５日に，原発性腫瘍を除去する。治療上の終点は転移およ
び生存である。死亡したときまたは第４０日（実験の最終日）に肺および肝臓に
おける転移性成長を観察する。実験の終了時に，臓器を秤量し，マクロ転移を２
５Ｘの倍率で計数することにより，肺および肝臓における転移を観察する。これ
らの組織にマクロ転移が存在しない場合には，臓器をホルマリン中で潅流固定し
，次に切片を作成してミクロ転移を組織学的に調べ，生存時間を記録する。

【０１３６】化合物効力実験：試験する薬剤１種類あたり４群の動物を用いる。群１には，
本発明の活性な核酸分子（例えばリボザイム）を投与し，群２には，スクランブ
ル弱体化核酸対照を療法として投与し，群３にはベヒクルを療法として投与する
。群４は，正の治療対照として働き，組換えヒトＩＦＮ−アルファＡ／Ｄ（８Ｍ
．ＬＬ，ＳＣ，１匹あたり，ＥＯＤ，３０日間）を投与する。１群あたり１５匹
の動物を用い，群１および２については１群あたり３用量までの核酸分子を用い
る。治療は第３日に開始し，第４０日まで毎日続ける。剖検において，心臓穿刺
により血液試料を採取し，遠心分離し，血漿試料はさらなる分析のために−７０
℃で保存する。試験薬剤は，ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプ（Ａｌｚａ
ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて，皮下または静脈内に，皮
下ボーラスで，直接腹腔内注入でまたは尾部血管から静脈内に投与することがで
きる。

【０１３７】実施例以下は，本発明の酵素的核酸の選択，単離，合成および活性を示す非限定的例
である。以下の実施例は，ＴＲ２オーファンレセプター，ＥＡＲ３／ＣＯＵＰ−
ＴＦ−１，ＧＡＴＡ転写因子，ＩＲＦ−２，ジェネシス，およびＣＤＰを切断す
るリボザイムの選択を示す。本明細書に記載される方法は，リプレッサー遺伝子
から発現される他のＲＮＡ標的を切断するリボザイムを誘導するスキームである
。当業者は，ハンマーヘッド以外のモチーフを有する他のリボザイムも同様にし
て誘導することができ，これらも本発明の範囲内であることを理解するであろう
。

【０１３８】実施例１：ＧＡＴＡ転写因子２（ｈＧＡＴＡ−２）における潜在的リボザイム切断部位の同定ヒトＧＡＴＡ転写因子２（ＨＵＭＧＡＴＡ２Ａ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ
７７８１０（Ｄｏｒｆｍａｎｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ，２６７，１２７９−１２８５）の配列を，コンピュータ折り畳みアルゴリズ
ムを用いてアクセス可能性についてスクリーニングした。二次折り畳み構造を形
成せず，潜在的ハンマーヘッド切断部位を含むＲＮＡの領域を同定した。これら
の切断部位の配列は表ＩＩＩに示される。

【０１３９】実施例２：ヒトＧＡＴＡ転写因子におけるリボザイム切断部位の選択コンピュータに基づくＲＮＡ折り畳みアルゴリズムにより推定された部位がＧ
ＡＴＡ転写因子のアクセス可能部位に対応するか否かを試験するために，７０個
のハンマーヘッド部位を分析のために選択した。リボザイム標的部位は，ｈＧＡ
ＴＡ−２（Ｄｏｒｆｍａｎ，（上掲））のゲノム配列を分析することにより選択
し，折り畳みに基づいて優先順位を付けた。各標的に結合することができるハン
マーヘッドリボザイムを設計し（図１を参照），コンピュータ折り畳みにより個
別に分析して（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎｅｔａｌ．，１９９４Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｔｈｅｏｃｈｅｍ，３１１，２７３；Ｊａｅｇｅｒｅｔ
ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，
７７０６），リボザイム配列が適切な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した
。結合アームと触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有するリボザイ
ムは考慮から除外した。以下に示されるように，種々の結合アーム長さを選択し
て活性を最適化することができる。一般に，各アームの少なくとも５塩基が標的
ＲＮＡと結合するか，またはこれと相互作用することができる。ｈＧＡＴＡ−２
を標的とするリボザイムの例が図２に示される。

【０１４０】実施例３：ＧＡＴＡ転写因子２ＲＮＡの効率的な切断用のリボザイムの化学合成および精製ハンマーヘッドおよび／またはハンマーヘッド様モチーフのリボザイムを，Ｒ
ＮＡメッセージ中の種々の部位にアニーリングするよう設計した。結合アームは
上述の標的部位配列に相補的である。リボザイムは化学的に合成した。用いた合
成の方法は，Ｕｓｍａｎｅｔａｌ．，（１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．，１０９，７８４５），Ｓｃａｒｉｎｇｅｅｔａｌ．，（１９９０
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１８，５４３３）およびＷｉｎｃｏｔ
ｔｅｔａｌ．，（上掲）に記載される，通常のＲＮＡ合成の方法に従い，慣
用の核酸保護基およびカップリング基，例えば５’−末端にジメトキシトリチル
，および３’末端にホスホルアミダイトを用いた。平均段階カップリング収率は
＞９８％であった。

【０１４１】不活性リボザイムは，Ｇ５をＵで，およびＡ１４をＵで置き換えることにより
合成した（番号付けはＨｅｒｔｅｌｅｔａｌ．，１９９２Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，３２５２による）。ヘアピンリボザイムは，２
つの部分で合成し，アニーリングして活性なリボザイムを再構築した（Ｃｈｏｗ
ｒｉｒａａｎｄＢｕｒｋｅ，１９９２ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．，２０，２８３５−２８４０）。リボザイムはまた，バクテリオファージＴ
７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートから合成する（Ｍｉｌｌｉｇ
ａｎａｎｄＵｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９３９，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏ
ｌ．１８０，５１）。リボザイムは，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２'−アミ
ノ，２'−Ｃ−アリル，２'−フルオロ，２'−Ｏ−メチル，２'−Ｈで修飾するこ
とにより，安定性を増強するよう修飾した（総説については，Ｕｓｍａｎａｎ
ｄＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ＴＩＢＳ１７，３４を参照）。リボザイ
ムは，一般的方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロ
マトグラフィーにより精製し（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔｅｔａｌ．，（上
掲）を参照；その全体を本明細書の一部としてここに引用する），水に再懸濁し
た。この実験で用いた化学的に合成したリボザイムの配列は以下の表ＩＩＩ−Ｖ
Ｉに示される。

【０１４２】実施例４：ｈＧＡＴＡ−２ＲＮＡ標的のインビトロでのリボザイム切断ヒトｈＧＡＴＡ−２ＲＮＡを標的とするリボザイムを，上述のように設計し合
成した。これらのリボザイムは，例えば以下の方法を用いて，インビトロで切断
活性について試験することができる。ｈＧＡＴＡ−２ｍＲＮＡ中の標的配列お
よびヌクレオチドの位置は表ＩＩＩに示される。

【０１４３】切断反応：リボザイム切断アッセイのための，完全長または部分的完全長の，
内部標識した標的ＲＮＡは，［α−³²Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写によ
り調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し
，さらに精製することなく基質ＲＮＡとして用いる。あるいは，Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ酵素を用いて基質を５’−³²Ｐ−末端標識する。アッセイは，リ
ボザイム切断緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，３７℃，１０
ｍＭＭｇＣｌ₂）中で２Ｘ濃度の精製リボザイムを予熱することにより実施し
，切断反応は，２Ｘリボザイムミックスを，やはり切断緩衝液中で予熱した等量
の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ）に加えることにより開始した。最初のスクリー
ニングとして，アッセイは，最終濃度４０ｎＭまたは１ｍＭのリボザイム，すな
わちリボザイム過剰を用いて３７℃で１時間行う。等量の９５％ホルムアミド，
２０ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシ
レンシアノールを加えることにより反応を停止し，次に試料を９５℃に２分間加
熱し，急冷し，変性ポリアクリルアミドゲルに負荷する。基質ＲＮＡおよびリボ
ザイム切断により生成した特異的ＲＮＡ切断生成物は，ゲルのオートラジオグラ
フィーで可視化する。切断のパーセントは，ホスファーイメージャー（登録商標
）を用いて，無傷の基質と切断生成物を表すバンドを定量することにより決定す
る。

【０１４４】実施例５：エリスロポエチンのリプレッサーの阻害によるエリスロポエチンの発現の増加Ｅｐｏレベルを上昇させるために，エリスロポエチン遺伝子の転写的リプレッ
サーをリボザイムで標的化した。ｈＧＡＴＡ−２，ＴＲ−２，およびＥＡＲ３／
Ｃｏｕｐ−ＴＦ１を標的とするリボザイムを合成した。リボザイムのスクリーニ
ングは，脂質とともに複合体化させ，適当な細胞株に輸送し，Ｅｐｏ産生につい
てモニターすることにより行った。これらのリボザイムが誘導化（ＣｏＣｌ₂に
より）および非誘導化細胞の両方においてＥｐｏ発現を増加させる能力もまた試
験した。エリスロポエチン（Ｅｐｏ）は，低酸素症およびＣｏＣｌ₂に応答して
成人腎臓および胎児肝臓で産生される。２つのヒト肝癌細胞株，ＨｅｐＧ２およ
びＨｅｐ３Ｂは，低酸素症およびＣｏＣｌ₂に応答した制御されたＥｐｏの発現
を示す。リボザイムを非誘導および誘導条件下で試験して，いずれかまたは両方
の条件下でＥｐｏレベルが増加しうるか否かを判定した。

【０１４５】Ｈｅｐ３Ｂ細胞を，ウエルあたり１．８ｘ１０⁴個の細胞で９６ウエルプレー
トに播種した。次にプレート播種の２４時間後，リボザイムをカチオン性脂質を
用いて細胞にトランスフェクトした。５または７．５μｇ／ｍｌのカチオン性脂
質を用いて，２種類の濃度の各リボザイム（１００および４００ｎｍ）を試験し
た。リボザイムおよび無関係対照（ＩＲ１＆ＩＲ２）の配列は表ＶＩＩＩに示さ
れる。次に，ＣｏＣｌ₂（５０ｎＭ）を含む細胞培養液を適用することにより，
細胞がエリスロポエチンを発現するよう誘導した。２４時間後，プレートウエル
から１００ｍｌの培地を除去し，ＥＬＩＳＡアッセイ用のプレートに加えた。残
りの培地を吸引除去し，細胞を−７０℃で凍結し，その後，ＣＹＱＵＡＮＴ（登
録商標）アッセイにより製造元のプロトコルを用いてアッセイした。エリスロポ
エチンの定量のためのＥＬＩＳＡは，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐ
ｏｌｉｓ，ＭＮ）から販売されているＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥＩＶＤ（登録商標
）キットを用いて，製造元のプロトコルにしたがって行った。データは，多くの
リボザイムがこれらの細胞において，不活性対照と比較して，Ｅｐｏの上昇した
発現をもたらすことができたことを示した。コバルト誘導ありまたはコバルト誘
導なしについての結果がそれぞれ図４および５に示される。

【０１４６】実施例６：ＥＰＯリプレッサーを標的とするリボザイムを用いる，時間とともに上昇したエリスロポエチンの発現Ｈｅｐ３Ｂ細胞を実施例５に記載されるように調製した。リボザイム（ＲＰＩ
Ｎｏ．１４２６０（ｈＧＡＴＡ−２を標的とする）および１４４５２１（ＥＡＲ
３／ＣＯＵＰ−ＴＲ１を標的とする；表ＶＩＩＩ）を，１００ｎｍの濃度で，５
μｇ／ｍｌのカチオン性脂質を用いて，Ｈｅｐ３Ｂ細胞にトランスフェクトした
。これらの細胞におけるＥｐｏ発現を，連続輸送については３６および４８時間
，およびパルス輸送については１２，２４，および３６時間において，実施例５
のＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。データを２つの無関係対照および未処
理対照（Ｕｎｔ）と比較した。リボザイムおよび無関係対照（ＩＲ−１およびＩ
Ｒ−２）の配列は表ＶＩＩＩに示される。リボザイムは，インキュベーション期
間の間連続的に輸送するか，または４時間のみ加え，次に新鮮な培地で置き換え
た（パルス輸送）。データは図６−９に示され，これは，ｈＧＡＴＡ−２または
ＥＡＲ３／Ｃｏｕｐ−ＴＲ１を標的とするリボザイムの連続輸送またはパルス輸
送のいずれによっても，Ｈｅｐ３Ｂ細胞において，無関係および未処理対象と比
較して，Ｅｐｏの発現が上昇することを示す。

【０１４７】診断用途本発明の核酸分子を診断手段として使用し，疾病に罹患した細胞内の遺伝的浮
動および変異を検査するか，または細胞において特定のＲＮＡの存在を検出する
ことができる。例えば，リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係
により，分子のいずれの領域においても，標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元
構造を変更する変異を検出することができる。本発明に記載されるリボザイムを
複数使用することにより，インビトロならびに細胞および組織におけるＲＮＡの
構造および機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。リボ
ザイムによる標的ＲＮＡの切断を使用して，遺伝子の発現を阻害し，疾病の進行
における特定の遺伝子産物の役割を（本質的に）明らかにすることができる。こ
のようにして，他の遺伝子標的を疾病の重要な介在物として明らかにすることが
できる。本発明のリボザイムの他のインビトロにおける使用は当該技術分野にお
いてよく知られており，これには，関連する状態に関係するｍＲＮＡの存在の検
出が含まれる。そのようなＲＮＡは，標準的な方法論を使用してリボザイムで処
理した後，切断産物の存在を判定することにより検出する。

【０１４８】特定の例においては，標的ＲＮＡの野生型または変異型のみしか切断できない
リボザイムをアッセイに使用する。第１のリボザイムを用いて試料中の野生型Ｒ
ＮＡの存在を同定し，第２のリボザイムを用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定す
る。反応対照として野生型および変異型の両方のＲＮＡの合成基質を両方のリボ
ザイムで切断し，反応におけるリボザイムの相対効率および“非標的”ＲＮＡ種
を切断しないことを明らかにする。合成基質からの切断産物は，試料集団中の野
生型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーの生成にも役立つ。従っ
てそれぞれの分析は２つのリボザイム，２つの基質，および１つの未知の試料を
必要とし，これらを組み合わせて６つの反応を行う。切断産物の存在をＲＮａｓ
ｅ・プロテクション・アッセイを使用して確認し，各ＲＮＡの完全長および切断
フラグメントをポリアクリルアミドゲルの１レーンで分析できるようにする。標
的細胞における変異体ＲＮＡの発現および所望の表現型の変化の推定されるリス
クへの洞察を得るために，必ずしも結果を定量する必要はない。その蛋白質産物
が表現型の発生に関与することが示唆されるｍＲＮＡの発現はリスクを確立する
のに十分である。同等の比活性のプローブを両方の転写産物に使用すれば，ＲＮ
Ａレベルの定性的比較で十分であり，初期の診断のコストが低減する。ＲＮＡレ
ベルを定性的に比較するにしても定量的に比較するにしても，より高い変異型と
野生型の比率はより高いリスクと相関関係があるであろう。

【０１４９】さらなる用途本発明の配列特異的酵素的核酸分子の潜在的な有用性は，ＤＮＡ制限エンドヌ
クレアーゼがＤＮＡの研究のために有するもの同様の多くの適用をＲＮＡの研究
のために有する（Ｎａｔｈａｎｓｅｔａｌ．，１９７５Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：２７３）。例えば，制限フラグメントのパターンを使用
して２つの関連するＲＮＡ間の配列の関係を確立することができ，大型のＲＮＡ
を研究のためにより有用なサイズのフラグメントに特異的に切断できる。リボザ
イムの配列特異性を操作できることは未知の配列のＲＮＡの切断に理想的である
。

【０１５０】本発明の核酸分子はまた，蛋白質の小または大スケール合成に用いることがで
きる。核酸，例えば酵素的核酸およびアンチセンス分子を培養細胞に投与して，
エリスロポエチン，Ｇ−ＣＳＦ，またはインターフェロン−アルファ等の抑制さ
れた蛋白質のインビトロ合成を開始させることができる。該方法は，リプレッサ
ー蛋白質のレベルが減少することにより，細胞における標的蛋白質の発現が促進
されるように，標的蛋白質（抑制された蛋白質）の発現を抑制するリプレッサー
蛋白質の発現をダウンレギュレート（阻害）しうる核酸分子（例えばリボザイム
またはアンチセンス）を細胞と接触させるかまたはこれを細胞中に導入する工程
を含む。次に，当該技術分野において知られる標準的な技術を用いて，標的蛋白
質を細胞から精製する。当業者は，この方法はまた，上述した蛋白質に加えて，
他の抑制された蛋白質の発現を増加させるために用いることもできることを認識
するであろう。

【０１５１】核酸を用いるリプレッサー転写因子の発現の阻害はまた，非ヒト生物において
も用いることができる。特に，遺伝子の負の制御が植物において示されている（
Ｐｒｅｓｔｏｎｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０，
４５３２−４５３７）。例えば，植物および真菌は，阻害されたときに，収穫量
の増加，疾病耐性，および所望のアミノ酸，油等の合成の増加のために有益な蛋
白質の発現が増加するであろうリプレッサー転写因子を有するであろう。Ｌａｄ
ｎｅｒ＆Ｂｉｒｄ，国際公開ＷＯ８８／０６６０１は，遺伝子を抑制してウイル
スの増殖を阻害することを記載する。この出願人は，細菌，微生物，真菌，ウイ
ルス，および真核生物系，例えば植物または哺乳動物細胞において，リプレッサ
ーの遺伝子発現をダウンレギュレートするために核酸分子を用いることを記載す
る。

【０１５２】本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技
術分野の技術者のレベルを示す。本明細書において引用されるすべての参考文献
は，それぞれの参考文献が個々にその全体が本明細書の一部としてここに引用さ
れることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。

【０１５３】当業者は，本発明が，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならび
に本明細書に固有のものを得るためによく適合していることを容易に理解するで
あろう。本明細書に記載される方法および組成物は，現在のところ好ましい態様
の代表的なものであり，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを
意図するものではない。当業者は，特許請求の範囲において定義される本発明の
精神の中に包含される変更および他の用途をなすであろう。

【０１５４】当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示さ
れる本発明に対して種々の置換および改変をなすことが可能であることを容易に
理解するであろう。すなわち，そのような追加の態様は，本発明および特許請求
の範囲の範囲内である。

【０１５５】本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されてい
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として
用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては
，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図
するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が
可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により
本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更
および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義さ
れる本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。

【０１５６】さらに，発明の特徴および局面がマーカッシュグループまたは他の代替グルー
プの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループま
たは他のグループの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載され
ていることを認識するであろう。

【０１５７】従って他の態様も本発明および特許請求の範囲の範囲内である。

【０１５８】表１天然に存在するリボザイムの特徴グループＩイントロン・サイズ：約１５０〜１０００以上のヌクレオチド。・標的配列中の切断部位の５’側に隣接してＵを必要とする。・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと結合する。・反応メカニズム：グアノシンの３’−ＯＨによって攻撃し，３’−ＯＨおよび
５’グアノシンを有する切断産物を生成する。・活性構造の折り畳みおよび維持を助けるために，場合により，蛋白質の補因子
をさらに必要とする。・このクラスには３００以上の種類が知られている。テトラヒメナ・サーモフィ
ラのｒＲＮＡ，真菌ミトコンドリア，葉緑体，ファージＴ４，らん藻類，その他
において，介在配列として見出されている。・主要な構造上の特徴は，系統発生比較，突然変異原性および生化学的研究によ
ってほぼ確立されている［１，２］。・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが立証されている［３
，４，５，６］。・リボザイムの折り畳みおよび基質ドッキングに関する研究が進行中［７，８，
９］。・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている［１０，１１］。・このリボザイムは，結合部位が小さい（４〜６ヌクレオチド）ため，標的ＲＮ
Ａ切断に対して非常に非特異的になる場合があるが，テトラヒメナのグループＩ
イントロンは，「欠損」β−ガラクトシダーゼのメッセージに新たなβ−ガラク
シダーゼ配列を結合することによってこのメッセージを修復するのに利用されて
いる［１２］。ＲＮａｓｅＰＲＮＡ（Ｍ１ＲＮＡ）・サイズ：約２９０〜４００のヌクレオチド。・偏在するリボ核蛋白質酵素のＲＮＡ部分。・ｔＲＮＡ前駆体を切断し，成熟ｔＲＮＡを形成する［１３］。・反応メカニズム：恐らくはＭ²⁺−ＯＨによって攻撃し，３’−ＯＨおよび５’
リン酸を有する切断産物を生成する。・ＲＮａｓｅＰは原核生物および真核生物全体に見出されている。このＲＮＡサ
ブユニットは，細菌，酵母，げっ歯類および霊長類から配列決定されている。・外部ガイド配列（ＥＧＳ）と標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって，
内因性ＲＮａｓｅＰを治療応用に活用することが可能である［１４，１５］。・リン酸と２’ＯＨとの接触の重要性が最近判明した［１６，１７］。グループＩＩイントロン・サイズ：１０００以上のヌクレオチド。・標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［１８，１９］。・配列要求性は完全には決定されていない。・反応メカニズム：内部アデノシンの２’−ＯＨが３’−ＯＨ，および３’−５
’および２’−５’分岐点を含む「ラリアット（ｌａｒｉａｔ）」ＲＮＡを有す
る切断産物を生成する。・ＲＮＡの切断および結合に加えて，ＤＮＡ切断への関与が実証された［２０，
２１］唯一の天然リボザイムである。・主要な構造上の特徴は，系統発生比較によってほぼ確立されている［２２］。
・２’ＯＨ接触の重要性が判明しはじめている［２３］。・力学的フレームワークは検討中である［２４］。ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡ・サイズ：約１４４ヌクレオチド。・ヘアピン標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［２５］。・配列要求性は完全には決定されていない。・反応メカニズム：２’−ＯＨが切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’，３’
−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていない。・このクラスは１種しか知られていない。ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡ
に見出されている。ハンマーヘッド・リボザイム（本文を参照のこと）・サイズ：約１３〜４０ヌクレオチド。・切断部位の５’に隣接した標的配列ＵＨを必要とする。・切断部位の両側で可変数のヌクレオチドと結合する。・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’
，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する
。・このクラスには１４種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する多くの
植物病原体（ウィルソイド）において見出されている。・２つの結晶構造を含め，本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている。［２
６，２７］・（インビトロ選択による工学的処理に対し）ごくわずかなライゲーション活性
が実証された。［２８］・２つまたはそれ以上のリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立
されている。［２９］・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている。［３０］ヘアピンリボザイム・サイズ：約５０ヌクレオチド。・切断部位の３’に隣接した標的配列ＧＵＣを必要とする。・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと，切断部位の３’側で可変数のヌ
クレオチドと結合する。・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’
，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する
。・このクラスには３種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する３種の植
物病原体（タバコ・リングスポット・ウィルス，アラビス・モザイク・ウィルス
およびチコリー黄色斑ウィルスのサテライトＲＮＡ）に見出されている。・本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている［３１，３２，３３，３４］。
・（切断活性に加えて）ライゲーション活性があるためにこのリボザイムはイン
ビトロ選択による工学処理が可能である［３５］。・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている［３
６］。・重要な残基の化学修飾検討が着手された［３７，３８］。デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム・サイズ：約６０ヌクレオチド。・標的ＲＮＡのトランス切断であることが実証されている［３９］。・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていないが，切断部位の５
’側の配列は要求されない。折りたたまれたリボザイムはシュードノット構造を
含む［４１］。・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’
，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する
。・このクラスは２種しか知られていない。ヒトＨＤＶに見出されている。・環状のＨＤＶは活性があり，ヌクレアーゼ安定性が増加している［４２］。

【０１５９】

【表１】

【０１６０】

【表２】

【０１６１】

【表３】

【０１６２】

【表４】

【０１６３】

【表５】

【０１６４】

【表６】

【０１６５】

【表７】

【０１６６】

【表８】

【０１６７】

【表９】

【０１６８】

【表１０】

【０１６９】

【表１１】

【０１７０】

【表１２】

【０１７１】

【表１３】

【０１７２】

【表１４】

【０１７３】

【表１５】

【０１７４】

【表１６】

【０１７５】

【表１７】

【０１７６】

【表１８】

【０１７７】

【表１９】

【０１７８】

【表２０】

【０１７９】

【表２１】

【０１８０】

【表２２】

【０１８１】

【表２３】

【０１８２】

【表２４】

【０１８３】

【表２５】

【０１８４】

【表２６】

【０１８５】

【表２７】

【０１８６】

【表２８】

【０１８７】

【表２９】

【０１８８】

【表３０】

【０１８９】

【表３１】

【０１９０】

【表３２】

【０１９１】

【表３３】

【０１９２】

【表３４】

【０１９３】

【表３５】

【０１９４】

【表３６】

【０１９５】

【表３７】

【０１９６】

【表３８】

【０１９７】

【表３９】

【０１９８】

【表４０】

【０１９９】

【表４１】

【０２００】

【表４２】

【０２０１】

【表４３】

【０２０２】

【表４４】

【０２０３】

【表４５】

【０２０４】

【表４６】

【０２０５】

【表４７】

【０２０６】

【表４８】

【０２０７】

【表４９】

【０２０８】

【表５０】

【０２０９】

【表５１】

【０２１０】

【表５２】

【０２１１】

【表５３】

【０２１２】

【表５４】

【０２１３】

【表５５】

【０２１４】

【表５６】

【０２１５】

【表５７】

【０２１６】

【表５８】

【０２１７】

【表５９】

【０２１８】

【表６０】

【０２１９】

【表６１】

【０２２０】

【表６２】

【０２２１】

【表６３】

【０２２２】

【表６４】

【０２２３】

【表６５】

【０２２４】

【表６６】

【０２２５】

【表６７】

【０２２６】

【表６８】

【０２２７】

【表６９】

【０２２８】

【表７０】

【０２２９】

【表７１】

【０２３０】

【表７２】

【０２３１】

【表７３】

【０２３２】

【表７４】

【０２３３】

【表７５】

【０２３４】

【表７６】

【０２３５】

【表７７】

【０２３６】

【表７８】

【０２３７】

【表７９】

【０２３８】

【表８０】

【０２３９】

【表８１】

【０２４０】

【表８２】

【０２４１】

【表８３】

【０２４２】

【表８４】

【０２４３】

【表８５】

【０２４４】

【表８６】

【０２４５】

【表８７】

【０２４６】

【表８８】

【０２４７】

【表８９】

【０２４８】

【表９０】

【０２４９】

【表９１】

【０２５０】

【表９２】

【０２５１】

【表９３】

【０２５２】

【表９４】

【０２５３】

【表９５】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は，７つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを
示す。

【図２】図２は，ｈＧＡＴＡ−２を標的とする，配列番号２８１に含まれ
る配列を有するハンマーヘッドリボザイムの二次構造の例である。

【図３】図３は，本発明の核酸分子による作用のメカニズムを示す概略図
である。

【図４】図４は，コバルト誘導し，ＧＡＴＡ転写因子２，ＴＲ２オーファ
ンレセプターおよびＥＡＲ３／ＣＯＵＰ−ＴＲ１を標的とするリボザイムを投与
した後に，Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてエリスロポエチン合成が無関係対照（ＩＲ１
およびＩＲ２）と比較して増加することを示すグラフである。

【図５】図５は，コバルト誘導せずに，ＧＡＴＡ転写因子２，ＴＲ２オー
ファンレセプターおよびＥＡＲ３／ＣＯＵＰ−ＴＲ１を標的とするリボザイムを
投与した後に，Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてエリスロポエチン合成が無関係対照（Ｉ
Ｒ１およびＩＲ２）と比較して増加することを示すグラフである。

【図６】図６は，ｈＧＡＴＡ−２転写因子ＲＮＡを標的とするリボザイム
の連続輸送後に，Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてＥｐｏ発現が無関係対照と比較して増
加することを示す棒グラフである。

【図７】図７は，ＥＡＲ３／Ｃｏｕｐ−ＴＲ１ＲＮＡを標的とするリボザ
イムの連続輸送後に，Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてＥｐｏ発現が無関係対照と比較し
て増加することを示す棒グラフである。

【図８】図８は，ｈＧＡＴＡ−２転写因子ＲＮＡを標的とするリボザイム
のパルス輸送後に，Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてＥｐｏ発現が無関係対照と比較して
増加することを示す棒グラフである。

【図９】図９は，ＥＡＲ３／Ｃｏｕｐ−ＴＲ１ＲＮＡを標的とするリボザ
イムのパルス輸送後に，Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてＥｐｏ発現が無関係対照と比較
して増加することを示す棒グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＨＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 31/711 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 31/711 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者パヴコ，パメラアメリカ合衆国コロラド州80026，ラファイエット，バーベリー・サークル705 (72)発明者マクスウィゲン，ジェームズアメリカ合衆国コロラド州80301，ボウルダー，フランクリン・ドライブ4866 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA21 BA23 BA30 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 HA01 4B064 AG06 AG09 AG18 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA99Y AB01 AC14 BA01 CA24 CA44 4C084 AA07 AA13 DB56 NA14 ZB21 ZC20 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 NA14 ZA36 ZA42 ZA81 ZB26 ZC35 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＴＲ２オーファンレセプターをコードする遺伝子の発現を特異的に阻害しうる核酸分子。
【請求項２】前記核酸分子が酵素的核酸分子である，請求項１記載の核酸
分子。
【請求項３】前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である，請求項１記載
の核酸分子。
【請求項４】前記核酸分子の結合アームが，配列番号４１７２−４９５０
の配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項２記載の核酸分子。
【請求項５】核酸分子が配列番号４１７２−４９５０の配列のいずれかに
相補的な配列を含む，請求項３記載の核酸分子。
【請求項６】前記核酸分子がハンマーヘッドモチーフのものである，請求
項２記載の核酸分子。
【請求項７】前記核酸分子が，ヘアピン，デルタ肝炎ウイルス，グループ
Ｉイントロン，ＶＳ核酸またはＲＮａｓｅＰ核酸モチーフのものである，請求項
２記載の核酸分子。
【請求項８】前記核酸分子が，ＴＲ２オーファンレセプターをコードする
ＲＮＡに相補的な１２−１００塩基を含む，請求項２または３に記載の核酸分子
。
【請求項９】前記核酸分子が，ＴＲ２オーファンレセプターをコードする
ＲＮＡに相補的な１４−２４塩基を含む，請求項２または３に記載の核酸分子。
【請求項１０】前記核酸分子が，配列番号３３９３−４１７１のいずれか
の配列を含む，請求項６記載の核酸分子。
【請求項１１】前記核酸分子が酵素的ＤＮＡ分子である，請求項２記載の
核酸分子。
【請求項１２】前記ＴＲ−２オーファンレセプターがＴＲ２−１１オーフ
ァンレセプターである，請求項１記載の核酸分子。
【請求項１３】前記ＴＲ−２オーファンレセプターがＴＲ２−９オーファ
ンレセプターである，請求項１記載の核酸分子。
【請求項１４】ＥＡＲ３／ＣＯＵＰ−ＴＦ−１をコードする遺伝子の発現
を特異的に阻害しうる核酸分子。
【請求項１５】前記核酸分子が酵素的核酸分子である，請求項１４記載の
核酸分子。
【請求項１６】前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である，請求項１４
記載の核酸分子。
【請求項１７】前記核酸分子の結合アームが，配列番号５２４８−５５４
４の配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項１５記載の核酸分子。
【請求項１８】核酸分子が，配列番号５２４８−５５４４の配列のいずれ
かに相補的な配列を含む，請求項１６記載の核酸分子。
【請求項１９】前記核酸分子が，ハンマーヘッドモチーフのものである，
請求項１５記載の核酸分子。
【請求項２０】前記核酸分子が，ヘアピン，デルタ肝炎ウイルス，グルー
プＩイントロン，ＶＳ核酸またはＲＮａｓｅＰ核酸モチーフのものである，請求
項１５記載の核酸分子。
【請求項２１】前記核酸分子が，ＥＡＲ３／ＣＯＵＰ−ＴＦ−１をコード
するＲＮＡに相補的な１２−１００塩基を含む，請求項１５または１６に記載の
核酸分子。
【請求項２２】前記核酸分子が，ＥＡＲ３／ＣＯＵＰ−ＴＦ−１をコード
するＲＮＡに相補的な１４−２４塩基を含む，請求項１５または１６に記載の核
酸分子。
【請求項２３】前記核酸分子が，配列番号４９５１−５２４７の配列のい
ずれかを含む，請求項１９記載の核酸分子。
【請求項２４】前記核酸分子が酵素的ＤＮＡ分子である，請求項１５記載
の核酸分子。
【請求項２５】ＲＮＡ切断活性を有する核酸分子であって，ＧＡＴＡ転写
因子遺伝子によりコードされるＲＮＡを切断することを特徴とする核酸分子。
【請求項２６】前記ＧＡＴＡ転写因子遺伝子がＧＡＴＡ転写因子２遺伝子
である，請求項２５記載の核酸分子。
【請求項２７】前記ＧＡＴＡ転写因子遺伝子がＧＡＴＡ転写因子３遺伝子
である，請求項２５記載の核酸分子。
【請求項２８】前記ＧＡＴＡ転写因子遺伝子がＧＡＴＡ転写因子４遺伝子
である，請求項２５記載の核酸分子。
【請求項２９】前記ＧＡＴＡ転写因子遺伝子がＧＡＴＡ転写因子６遺伝子
である，請求項２５記載の核酸分子。
【請求項３０】前記核酸分子が酵素的核酸分子である，請求項２５記載の
核酸分子。
【請求項３１】前記核酸分子の結合アームが，配列番号１−１６９６の配
列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項３０記載の核酸分子。
【請求項３２】ＧＡＴＡ転写因子遺伝子の発現を特異的に阻害しうるアン
チセンス核酸分子であって配列番号１−１６９６の配列のいずれかに相補的な配
列を含むことを特徴とするアンチセンス核酸分子。
【請求項３３】前記核酸分子が，ハンマーヘッドモチーフのものである，
請求項３０記載の核酸分子。
【請求項３４】前記核酸分子が，ヘアピン，デルタ肝炎ウイルス，グルー
プＩイントロン，ＶＳ核酸またはＲＮａｓｅＰ核酸モチーフのものである，請求
項３０記載の核酸分子。
【請求項３５】前記核酸分子が，ＧＡＴＡ転写因子をコードするＲＮＡに
相補的な１２−１００塩基を含む，請求項３０または３２に記載の核酸分子。
【請求項３６】前記核酸分子が，ＧＡＴＡ転写因子をコードするＲＮＡに
相補的な１４−２４塩基を含む，請求項３０または３２に記載の核酸分子。
【請求項３７】前記核酸分子が，配列番号１６９７−３３９２の配列のい
ずれかを含む，請求項３３記載の核酸分子。
【請求項３８】前記核酸分子が酵素的ＤＮＡ分子である，請求項３０記載
の核酸分子。
【請求項３９】ＩＲＦ−２をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害しう
る核酸分子。
【請求項４０】前記核酸分子が酵素的核酸分子である，請求項３９記載の
核酸分子。
【請求項４１】前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である，請求項３９
記載の核酸分子。
【請求項４２】前記核酸分子の結合アームが，配列番号５９６７−６３８
８の配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項４０記載の核酸分子。
【請求項４３】核酸分子が，配列番号５９６７−６３８８の配列のいずれ
かに相補的な配列を含む，請求項４１記載の核酸分子。
【請求項４４】前記核酸分子が，ハンマーヘッドモチーフのものである，
請求項４０記載の核酸分子。
【請求項４５】前記核酸分子が，ヘアピン，デルタ肝炎ウイルス，グルー
プＩイントロン，ＶＳ核酸またはＲＮａｓｅＰ核酸モチーフのものである，請求
項４０記載の核酸分子。
【請求項４６】前記核酸分子が，ＩＲＦ−２をコードするＲＮＡに相補的
な１２−１００塩基を含む，請求項４０または４１に記載の核酸分子。
【請求項４７】前記核酸分子が，ＩＲＦ−２をコードするＲＮＡに相補的
な１４−２４塩基を含む，請求項４０または４１に記載の核酸分子。
【請求項４８】前記核酸分子が，配列番号５５４５−５９６６の配列のい
ずれかを含む，請求項４４記載の核酸分子。
【請求項４９】前記核酸分子が酵素的ＤＮＡ分子である，請求項４０記載
の核酸分子。
【請求項５０】ＣＡＡＴＴ置換蛋白質（ＣＤＰ）をコードする遺伝子の発
現を特異的に阻害しうる核酸分子。
【請求項５１】前記核酸分子が酵素的核酸分子である，請求項５０記載の
核酸分子。
【請求項５２】前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である，請求項５０
記載の核酸分子。
【請求項５３】前記核酸分子の結合アームが，配列番号６９２９−７４６
８の配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項５１記載の核酸分子。
【請求項５４】核酸分子が，配列番号６９２９−７４６８の配列のいずれ
かに相補的な配列を含む，請求項５２記載の核酸分子。
【請求項５５】前記核酸分子がハンマーヘッドモチーフのものである，請
求項５１記載の核酸分子。
【請求項５６】前記核酸分子が，ヘアピン，デルタ肝炎ウイルス，グルー
プＩイントロン，ＶＳ核酸またはＲＮａｓｅＰ核酸モチーフのものである，請求
項５１記載の核酸分子。
【請求項５７】前記核酸分子が，ＣＤＰをコードするＲＮＡに相補的な１
２−１００塩基を含む，請求項５１または５２に記載の核酸分子。
【請求項５８】前記核酸分子が，ＣＤＰをコードするＲＮＡに相補的な１
４−２４塩基を含む，請求項５１または５２に記載の核酸分子。
【請求項５９】前記核酸分子が，配列番号６３８９−６９２８の配列のい
ずれかを含む，請求項５５記載の核酸分子。
【請求項６０】前記核酸分子が酵素的ＤＮＡ分子である，請求項５１記載
の核酸分子。
【請求項６１】請求項１，１４，２５，３２，３９，または５０のいずれ
かに記載の核酸分子を含む細胞。
【請求項６２】前記細胞が哺乳動物細胞である，請求項６１記載の細胞。
【請求項６３】請求項１，１４，２５，３２，３９，または５０のいずれ
かに記載の核酸分子をコードする核酸配列を，該核酸分子の発現および／または
輸送を可能とする様式で含む発現ベクター。
【請求項６４】エリスロポエチン蛋白質を合成する方法であって，（ａ）
細胞を，前記エリスロポエチン蛋白質の合成に適した条件下で，請求項１，１４
，２５または３２のいずれかに記載の核酸分子と接触させ；そして（ｂ）エリス
ロポエチン蛋白質を前記細胞から精製する，の各工程を含む方法。
【請求項６５】顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）蛋白質を合成する
方法であって，（ａ）細胞を，前記Ｇ−ＣＳＦ蛋白質の合成に適した条件下で，
請求項３９記載の核酸分子と接触させ；そして（ｂ）Ｇ−ＣＳＦ蛋白質を前記細
胞から精製する，の各工程を含む方法。
【請求項６６】インターフェロンアルファ蛋白質を合成する方法であって
，（ａ）細胞を，前記インターフェロンアルファ蛋白質の合成に適した条件下で
，請求項５０記載の核酸分子と接触させ；そして（ｂ）インターフェロンアルフ
ァ蛋白質を前記細胞から精製する，の各工程を含む方法。
【請求項６７】細胞においてエリスロポエチン蛋白質のレベルを増加させ
る方法であって，細胞を，前記エリスロポエチン蛋白質のレベルの増加を達成す
るのに適した条件下で，請求項１，１４，２５または３２のいずれかに記載の核
酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項６８】細胞においてＧ−ＣＳＦ蛋白質のレベルを増加させる方法
であって，細胞を，前記Ｇ−ＣＳＦ蛋白質のレベルの増加を達成するのに適した
条件下で，請求項３９記載の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項６９】細胞においてインターフェロンアルファ蛋白質のレベルを
増加させる方法であって，細胞を，前記インターフェロンアルファ蛋白質のレベ
ルの増加を達成するのに適した条件下で，請求項５０記載の核酸分子と接触させ
る工程を含む方法。