JP2002541795A - 核酸分子を用いるリプレッサー遺伝子の制御 - Google Patents

核酸分子を用いるリプレッサー遺伝子の制御

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Abstract

(57)【要約】 リプレッサー遺伝子の発現を阻害する核酸分子が記載される。また,そのような核酸分子を製造および使用する方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】発明の背景 本発明は,リプレッサー遺伝子を阻害する新規な方法に関する。特に,これら
のリプレッサー遺伝子の阻害により,有益な遺伝子産物の発現が増加する。有益
な遺伝子産物の発現の増加は,広範な適応症の治療的処置として有用であろう。
【0002】 以下は関連する技術の議論であり,これらのいずれも本発明に対する先行技術
であると認めるものではない。
【0003】 生物学的システムにおけるRNA合成には,多数の制御段階が関与する。例え
ば,真核生物細胞においては,RNAはDNA遺伝子から転写と称されるプロセ
スを経て合成される。RNAの転写は,精妙に制御されたプロセスである。転写
は,RNA合成が促進される場合には正に制御され,RNA合成が阻害される場
合には負に制御される。このRNA合成制御のレベルは,遺伝子中の特異的シス
作用要素と相互作用することにより転写に一般に影響を及ぼす1またはそれ以上
の蛋白質因子の相互作用により促進される。真核生物細胞においては遺伝子発現
の正の制御がはるかに有力であるが,負の制御は多くの遺伝子について重要な役
割を果たす。これらの負の制御に関与する蛋白質因子("リプレッサー")は,一
般に,通常は遺伝子の上流のシス作用性要素に結合し,その遺伝子のRNAへの
転写のダウンレギュレーションを引き起こす("抑制")。これらのリプレッサー
がその標的から放出されたときにのみ,隠されていた遺伝子発現が生ずることが
できる。リプレッサーはまた,他のメカニズム,例えば,転写に関与する蛋白質
因子と相互作用(例えば蛋白質−蛋白質相互作用;修飾)し,このことにより転
写を妨害することを介して機能することができる。リプレッサーをコードする多
くの遺伝子が真核細胞系において同定されている。これらのリプレッサー遺伝子
のいくつかの非限定的例には,以下のものが含まれる。
【0004】GATA転写因子 :現在,5つの因子が転写因子のヒトGATAファミリーを構
成している:hGATA−1(Eryfl,GF−1,またはNF−E1として
も知られる)(Trainer et al.,1990,Nature 34
3,92−96;Genbank受託番号XI7254);hGATA−2(D
oriman et al.,1992,J.Biol.Chem.167,1
279−1285;Genbank受託番号M77810);hGATA−3(
Joulin et al.,1991,EMBO J.10,1809−18
16;Genbank受託番号X58072);hGATA−4(Genban
k受託番号L34357);およびhGATA−6(Huggon et al
.,1997,Biochim.Biophys.Acta 1353,98−
102;Genbank受託番号X95701)。GATA要素またはGATA
蛋白質の結合領域は,エリスロポエチン(Epo)遺伝子の約30bp上流に存
在する。QT6細胞をhGATA−1,−2,および−3でトランスフェクショ
ンすると,3つの因子すべてがGATA要素に結合しうることが示されている。
さらに,3つの因子すべては,Hep3B細胞においてエリスロポエチンの発現
をダウンレギュレートすることが示されている(Imagawa et al,
1996,Acta Haematol.95,248−256)。
【0005】EAR3/COUP−TF−1 :EAR3/COUP−TF−1(Miyaji
ma et al.,1988,Nucleic Acids Researc
h 16,11057−11074;Genbank受託番号X12795)は
,エリスロポエチン遺伝子のプロモーター領域に結合し,その発現を負に制御す
ることが示されている。この転写因子は,Epo発現を正に制御すると考えられ
ている肝核因子4(HNF−4)と競合するようである(Galson et
al.,1995,Mol.Cell Biol.15,2135−2144)
【0006】TR2およびTR2−11オーファンレセプター :TR2オーファンレセプター
(Chang et al.,1989,Biochem.Biophys.R
es.Commun.165,735−741;Genbank受託番号M29
959)およびTR2−11オーファンレセプター(Chang et al.
,(上掲);Genbank受託番号M29960)は,Epo発現を負に制御
すると考えられている別の一組の転写因子である。単離されたTR2cDNAは
,603アミノ酸の質量67kDaの蛋白質をコードする。この蛋白質は,Ep
o遺伝子の3’エンハンサー領域に結合し,Epoの発現を抑制すると考えられ
ている(Lee et al.,1996.J.Biol.Chem.271,
10405−10412)。
【0007】CCAAT置換(Displacement)蛋白質(CDP) :CDP(Ne
ufeld et al.,1992,Nature Genet.1,50−
55;Genbank受託番号M74099)は,多くの遺伝子,例えば,ガン
マグロビン,NCAM,およびgp91−phox遺伝子,好中球コラゲナーゼ
,好中球ゼラチナーゼ,および顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)を負に制
御することが示されている180−200kDaの蛋白質である(Khanna
−Gupta et al.,1997,Blood 90,2784−279
5)。上昇したレベルのG−CSFは,骨髄抑制化学療法の間,AIDS,およ
び慢性好中球減少症の治療に有益であろう。
【0008】ジェネシス(Genesis) :HNF−3/Forkheadとしても知られ
る。ジェネシスは,翼状らせん転写制御ファミリーのメンバーであり,ショウジ
ョウバエにおいて胚分化活性のリプレッサー遺伝子として機能すると考えられて
いる(Sutton et al.,1996,J.Biol.Chem.27
1,23126−23133)。32D細胞における研究は,ジェネシス遺伝子
の蛋白質産物がG−CSF遺伝子発現を制御しうることを示す(Xu et a
l.,1997,Leukemia 12,207−212)。この遺伝子のヒ
ト相同体は,ヒト細胞において同じ効果を有するかもしれず,G−CSF遺伝子
発現を制御するようである。
【0009】インターフェロン制御因子−2(IRF−2) :IRF−2(Itoh et
al.,1989,Nucleic Acids Research 17,8
372;Genbank受託番号XI5949)は,10を越えるメンバーが存
在するインターフェロン制御因子のメンバーである。IRF−2は,インターフ
ェロン−ベータ,インターフェロン−アルファ,およびMHCクラスIの発現の
制御において役割を果たすと考えられている(Nguyen et.al.,1
997,Cytokine&Growth Factor Reviews 8
,293−312)。IRF−2のDNA結合ドメインは,蛋白質のN−末端に
存在する。
【0010】 Imagawa et al.,(1997,Blood 4,1430−1
439)は,Hep3B細胞において,配列CGGGCGCCACCTCCAT
GGCCGGCCGGGCGGを有するアンチセンスホスホロチオエートオリゴ
デオキシヌクレオチドを用いてhGATA−2転写因子発現を阻害することを記
載する。
【0011】発明の概要 本発明は,新規核酸に基づく技術(例えば,酵素的核酸分子,アンチセンス核
酸,2−5Aアンチセンスキメラ,トリプレックスDNA,RNA切断化学基を
含有するアンチセンス核酸)を特徴とする。
【0012】 1つの観点においては,本発明は,核酸に基づく1またはそれ以上の技術を用
いて,リプレッサー遺伝子の発現を阻害することを特徴とする。リプレッサー遺
伝子の阻害は,次に,これらのリプレッサー遺伝子により抑制されていた遺伝子
の発現を増加させることができる。
【0013】 "リプレッサー遺伝子"とは,その発現が,直接的にまたは間接的に,他の遺伝
子の発現をダウンレギュレートまたは抑制または抑圧する遺伝子を意味する。
【0014】 "阻害する"とは,リプレッサー遺伝子の活性またはリプレッサー遺伝子をコー
ドするmRNAもしくは同等のRNAのレベルが,核酸の非存在下において観察
されるレベルより減少することを意味する。1つの態様においては,リボザイム
による阻害は,好ましくは,mRNA上の同じ部位に結合することができるがそ
のRNAを切断することができない,酵素的に弱体化された核酸分子の存在下で
観察されるレベルより低い。別の態様においては,酵素的核酸およびアンチセン
ス分子等の核酸分子による阻害は,好ましくは,例えば,スクランブル配列を有
するオリゴヌクレオチドまたはミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの存在下
で観察される阻害より大きい。別の態様においては,本発明の核酸分子を用いる
リプレッサー遺伝子の阻害は,核酸分子の存在下において,存在しない場合より
も大きい。
【0015】 "アンチセンス核酸"とは,RNA−RNAまたはRNA−DNAまたはRNA
−PNA(蛋白質核酸;Egholm el al.,1993 Nature
365,566)相互作用により標的RNAに結合して,標的RNAの活性を
変化させる非酵素的核酸分子を意味する(概説については,Stein and
Cheng,1993 Science 261,1004を参照)。
【0016】 ”2−5Aアンチセンスキメラ”とは,5’リン酸化2’−5’結合アデニル
酸部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。これらのキメラは配
列特異的様式で標的RNAに結合し,細胞性2−5A依存性リボヌクレアーゼを
活性化し,それは次に標的RNAを切断する(Torrence et al.
,1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,1300
)。
【0017】 "トリプレックスDNA"とは,二本鎖DNAに配列特異的様式で結合して,三
重螺旋を形成することができるオリゴヌクレオチドを意味する。そのような三重
らせん構造の形成は,標的とする遺伝子の転写を阻害することが示されている(
Duval−Valcntin et al.,1992 Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 89,504)。
【0018】 "遺伝子"とは,RNAをコードする核酸を意味する。
【0019】 "酵素的核酸"とは,限定されないが,他の核酸分子の部位特異的切断および/
またはライゲーション,ペプチドおよびアミド結合の切断,およびトランススプ
ライシングなどの反応を触媒しうる核酸分子を意味する。エンドヌクレアーゼ活
性を有するそのような分子は,基質結合領域において特定の遺伝子標的に対する
相補性を有しており,かつその標的中のRNAまたはDNAを特異的に切断する
酵素活性を有する。すなわち,エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子は,分
子内または分子間でRNAまたはDNAを切断し,それにより標的RNAまたは
DNA分子を不活性化することができる。この相補性は標的RNAまたはDNA
に対する酵素的RNA分子の十分なハイブリダイゼーションを可能にし,切断が
起こることを可能にする。100%の相補性が好ましいが,50−75%程度の
低い相補性もまた本発明において有用である。核酸は塩基,糖および/またはリ
ン酸基で修飾されていてもよい。酵素的核酸との用語は,リボザイム,触媒的R
NA,酵素的RNA,触媒的DNA,触媒的オリゴヌクレオチド,ヌクレオザイ
ム,DNAザイム,RNA酵素,エンドリボヌクレアーゼ,エンドヌクレアーゼ
,ミニザイム,リードザイム,オリゴザイムまたはDNA酵素のような句と相互
交換的に使用される。これらすべての用語は酵素的活性を有する核酸分子を記述
する。本出願に記載されている特定の酵素的核酸分子は本発明において限定的な
ものではない。当業者は,本発明の酵素的核酸分子において重要なことは,1ま
たはそれ以上の標的核酸領域に相補的な特異的基質結合部位を有し,かつ分子に
核酸切断活性を与えるヌクレオチド配列を基質結合部位内または周辺に有するこ
とであることを認識するであろう(Cech et al.,米国特許4,98
7,071,Cech et al.,1988,JAMA)。
【0020】 ”酵素的部分”または”触媒ドメイン”とは,核酸基質の切断に必須であるリ
ボザイムの部分/領域を意味する(例えば図1を参照)。
【0021】 ”基質結合アーム”または”基質結合ドメイン”とは,その基質の一部分に相
補的な(即ち,塩基対を形成できる)リボザイムの部分/領域を意味する。一般
に,そのような相補性は100%であるが,所望の場合にはそれ未満でもよい。
例えば,14の内の10程度でも塩基対を形成しうる。そのようなアームは一般
に図1および図3に示される。すなわち,これらのアームは,相補的塩基対形成
相互作用によりリボザイムと標的RNAとを一緒にすることが意図される配列を
リボザイム中に含む。本発明のリボザイムは連続または非連続的な,種々の長さ
の結合アームを有していてもよい。結合アームの長さは,好ましくは4ヌクレオ
チド以上の長さであり,特に,12−100ヌクレオチド;より特別には14−
24ヌクレオチドの長さである。2つの結合アームが選択される場合,結合アー
ムの長さは対称的(即ち,各々の結合アームは同じ長さである;例えば,5およ
び5ヌクレオチド,6および6ヌクレオチドまたは7および7ヌクレオチド長)
または非対称的(即ち,結合アームは異なった長さである;例えば,6および3
ヌクレオチド;3および6ヌクレオチド長;4および5ヌクレオチド長;4およ
び6ヌクレオチド長;4および7ヌクレオチド長など)であるように設計される
【0022】 本発明の好ましい態様の1つにおいては,酵素的核酸分子はハンマーヘッドま
たはヘアピンのモチーフで形成されるが,デルタ肝炎ウイルス,グループIイン
トロン,グループIIイントロンまたはRNaseP RNA(RNAガイド配
列を伴う),Neurospora VS RNA,DNAザイム,NCH切断
モチーフ,またはG−切断剤のモチーフで形成してもよい。そのようなハンマー
ヘッドモチーフの例は,Dreyfus,(上掲),Rossi et al.
,1992,AIDS Research and Human Retrov
iruses 8,183により;ヘアピンモチーフの例は,Hampel e
t al.,EP0360257,Hampel and Tritz,198
9 Biochemistry 28,4929,Feldstein et
al.,1989,Gene 82,53,Haseloff and Ger
lach,1989,Gene,82,43,Hampel et al.,1
990 Nucleic Acids Res.18,299,Chowrir
a & McSwiggen,米国特許5,631,359により;デルタ肝炎
ウイルスモチーフの例は,Perrotta and Been,1992 B
iochemisty 31,16により;RNasePモチーフの例は,Gu
errier−Takada et al.,1983 Cell 35,84
9;Forster and Altman,1990,Science 24
9,783;Li and Altman,1996, Nucleic Ac
ids Res.24,835により;Neurospora VS RNAリ
ボザイムモチーフの例は,Collins(Saville and Coll
ins,1990 Cell 61,685−696;Saville and
Collins,1991 Proc.Natl.Acad.Sci. US
A 88,8826−8830;Collins and Olive,199
3 Biochemisty 32,2795−2799;Guo and C
ollins,1995,EMBO.J.14,363)により;グループII
イントロンの例は,Griffin et al.,1995,Chem.Bi
ol.2,761;Michels and Pyle,1995,Bioch
emistry 34,2965;Pyle et al.,国際公開WO96
/22689により;グループIイントロンの例は,Cech et al.,
米国特許4,987,071により;DNAザイムの例は,Usman et
al.,国際公開WO95/11304;Chartrand et al.,
1995,NAR 23,4092;Breaker et al.,1995
,Chem.Bio.2,655;Santoro et al.,1997,
PNAS 94,4262により;NCH切断モチーフの例は,Ludwig&
Sproat,国際公開WO98/58058により;およびG−切断剤の例は
,Kore et al.,1998,Nucleic Acids Rese
arch 26,4116−4120に,それぞれ記載されている。これらの特
定のモチーフは本発明において限定的なものではなく,当業者は,本発明の酵素
的核酸分子において重要なすべては,それが標的遺伝子のRNA領域の1または
それ以上に相補的な特異的基質結合部位を有し,かつその基質結合部位の中また
は周辺に,分子にRNA切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することであ
ることを認識するであろう(Cech et al,米国特許4,987,07
1)。
【0023】 本発明の好ましい態様においては,核酸分子,例えば,アンチセンス分子,ト
リプレックスDNA,またはリボザイムは,13−100ヌクレオチドの長さで
あり,例えば,特定の態様においては,35,36,37,または38ヌクレオ
チドの長さ(例えば特定のリボザイムについて)である。特定の態様においては
,核酸分子は,15−100,17−100,20−100,21−100,2
3−100,25−100,27−100,30−100,32−100,35
−100,40−100,50−100,60−100,70−100,または
80−100ヌクレオチドの長さである。上で特定された長さの範囲においては
その上限は100ヌクレオチドであるが,長さの範囲の上限は,例えば,30,
40,50,60,70,または80ヌクレオチドでありうる。すなわち,長さ
の範囲の任意のものについて,特定の態様についての長さの範囲は,特定された
下限,および,下限より大きい上限を有する。例えば,特定の態様においては,
長さの範囲は35−50ヌクレオチドの長さでありうる。そのような範囲の全て
が明示的に含まれる。また,特定の態様においては,核酸分子は,上で特定され
た長さの任意の長さ,例えば21ヌクレオチドの長さを有することができる。
【0024】 リプレッサー遺伝子と"同等の"RNAとは,リプレッサー遺伝子に相同性(部
分的なまたは完全な)を有するか,または種々の動物,例えばヒト,齧歯類,霊
長類,ウサギおよびブタにおいてリプレッサー遺伝子と類似の機能を有する蛋白
質をコードする,天然に生ずるRNA分子を含むことを意味する。同等のRNA
配列はまた,コーディング領域に加えて,5’−非翻訳領域,3’−非翻訳領域
,イントロン,イントロン−エクソン接合部等の領域を含む。
【0025】 "相補性"とは,核酸が,伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタ
イプのいずれかにより,別のRNA配列と水素結合を形成することができること
を意味する。本発明の核酸に関して,核酸分子とその標的または相補的配列との
結合自由エネルギーは,核酸の関連する機能,例えば,リボザイム切断,アンチ
センスまたは三重らせん阻害が進行するのに十分である。核酸分子についての結
合自由エネルギーの決定は当該技術分野においてよく知られている(例えば,T
urner et al.,1987,CSH Symp.Quant.Bio
l.LII pp.123−133;Frier et al,1986,Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA 83:9373−9377;Tur
ner et al.,1987,J.Am.Chem.Soc.109:37
83−3785を参照。相補性のパーセンテージは,核酸分子中の,第2の核酸
配列と水素結合(例えば,ワトソン−クリック塩基対形成)を形成しうる連続す
る残基のパーセンテージを示す(例えば,10塩基中の5,6,7.8,9,1
0塩基は,50%,60%,70%,80%,90%,および100%の相補性
である)。"完全な相補性"とは,核酸配列の連続する残基がすべて第2の核酸配
列中の同じ数の連続する残基と水素結合するであろうことを意味する。
【0026】 本発明の好ましい態様においては,リプレッサー遺伝子の発現の阻害は疾病ま
たは状態の治療に関連する。"関連する"とは,リプレッサー遺伝子RNAの阻害
が,したがって,蛋白質活性のそれぞれのレベルの減少が,疾病または状態の症
状をある程度緩和するであろうことを意味する。
【0027】 別の好ましい態様においては,本発明は,核酸に基づく技術(例えば,酵素的
核酸分子(リボザイム),アンチセンス核酸,2−5Aアンチセンスキメラ,ト
リプレックスDNA,RNA切断化学基含有アンチセンス核酸),およびこれを
用いてインターフェロン−アルファ(IFN−α)を抑制しうる遺伝子の発現を
ダウンレギュレートまたは阻害する方法を特徴とする。IFN−αのリプレッサ
ーには,限定されないが,IRF−2(Lopez et al.,1997,
J.Biol Chem 272,22788−22799)が含まれる。
【0028】 別の好ましい態様においては,本発明は,核酸技術(例えば,酵素的核酸分子
(リボザイム),アンチセンス核酸,2−5Aアンチセンスキメラ,トリプレッ
クスDNA,RNA切断化学基を含有するアンチセンス核酸),およびこれを用
いて顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)を抑制しうる遺伝子の発現をダウン
レギュレートまたは阻害する方法を特徴とする。これらのリプレッサー遺伝子に
は,限定されないが,CCAAT置換蛋白質(CDP)(Khanna−Gup
ta et al,1997,Blood 90,2784−2795)および
ジェネシス(Xu et al,1998,Leukemia,12,207−
2012)が含まれる。
【0029】 別の好ましい態様においては,本発明は,エリスロポエチン(Epo)の発現
を抑制しうるリプレッサー遺伝子によりコードされるRNAを切断する酵素的核
酸(例えばリボザイム)の使用を特徴とする。Epoを阻害しうる遺伝子のリス
トには,限定されないが,TR2オーファンレセプター(Lee et al.
.The Journal of Biological Chemistry
,271,10405−10412),EAR3/COUP−TF−1(Gal
son et al.,1995,Molecular and Cellul
arBiology,15,2135−2144),およびGATA転写因子(
Imagawa et al.,1997,Blood,89,1430−14
39)が含まれる。これらの抑制因子の1またはそれ以上の阻害は,細胞におけ
るEpoの産生を増加させ,このことは,限定されないが,化学療法のアジュバ
ント治療および腎臓透析中の治療等の応用に有用である。
【0030】 好ましい態様においては,本発明のリボザイムは,表III−VII(すなわ
ち,表III,IV,V,VI,およびVII)の標的配列に相補的な結合アー
ムを有する。そのようなリボザイムの例はまた,表III−VIIIに示される
。表IIIは,GATA転写因子(1,2,3,4,6)の標的配列およびこれ
を標的とするリボザイムを示す。表IVは,TR2およびTR2−11オーファ
ンレセプターの標的配列およびこれを標的とするリボザイムを示し,表Vは,E
AR3/COUP−TF−1の標的配列およびリボザイムを示し,表VIはIR
F−2の標的配列およびリボザイムを示し,表VIIは,CDPの標的配列およ
びリボザイムを示す。そのようなリボザイムの例は,本質的にこれらの表に規定
される配列からなる。
【0031】 さらに別の態様においては,本発明は,表III−VIIに示される標的配列
に相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子および2−5Aキメラを特徴とする
。そのような核酸分子は,表III−VIIにおいてリボザイムの結合アームに
ついて示される配列を含むことができる(すなわち,"RZ"のカラムの最も左お
よび最も右の配列部分)。同様に,対応するDNA標的領域を標的とし,標的配
列または特定された標的(基質)配列に相補的な配列のDNA等価物を含むトリ
プレックス分子を提供することができる。典型的には,アンチセンス分子は,ア
ンチセンス分子の単一の連続した配列に沿って,標的配列に相補的であろう。し
かし,ある態様においては,アンチセンス分子は,基質分子がループを形成する
ように基質に結合することができ,および/またはアンチセンス分子は,アンチ
センス分子がループを形成するように結合することができる。すなわち,アンチ
センス分子は,2つの(またはさらに多くの)非連続的基質配列に相補的であっ
てもよく,またはアンチセンス分子の2つの(またはさらに多くの)非連続的配
列部分が標的配列に相補的であってもよく,あるいはその両方でもよい。
【0032】 リボザイム配列に関して,"本質的に・・・からなる"とは,活性なリボザイム
が,標的部位における切断が生ずるように,実施例に記載されるものと同等の酵
素中心,もしくはコア,およびRNAに結合することができる結合アームを含む
ことを意味する。そのような切断を有意に妨害しない他の配列が存在していても
よい。すなわち,コア領域は,例えば,酵素的活性を妨害しない1またはそれ以
上のループまたはステム−ループ構造を含んでいてもよい。表III−VIIの
配列中の"X"は,そのようなループでありうる。
【0033】 すなわち,1つの観点においては,本発明は,リプレッサー遺伝子発現を阻害
するリボザイムを特徴とする。これらの化学的または酵素的に合成されたリボザ
イム分子は,その標的RNAのアクセス可能な領域に結合する基質結合ドメイン
を含む。リボザイムはまた,標的RNAの切断を触媒するドメインを含む。酵素
的核酸分子は,好ましくは,ハンマーヘッドまたはハンマーヘッド様モチーフ(
Kore et al.,1998,Nucleic Acids Resea
rch26,4116−4120;Ludwig&Sproat,国際公開WO
98/58058),またはヘアピンモチーフのリボザイムである。あるいは,
リボザイムはDNAザイムでありうる。化学的に合成されたリボザイム分子には
また,化学的または酵素的ライゲーション法を用いて核酸の種々のフラグメント
から一緒に組み立てられたリボザイムが含まれる。リボザイムは,結合した後に
,標的RNAを切断し,翻訳および蛋白質蓄積を妨害する。リプレッサー遺伝子
により抑制されている遺伝子("抑制された遺伝子")の発現は,リプレッサー遺
伝子の非存在下または減少したレベルの下で上昇することができる。抑制された
遺伝子のこの上昇したレベルは,細胞および標的生物に有益でありうる。好まし
い態様においては,リボザイムは直接加えるか,またはカチオン性脂質と複合体
を形成するか,リポソーム中に封入するか,または他の方法を用いて,標的細胞
に輸送することができる。核酸または核酸複合体は,エクスビボで,またはイン
ビボで,バイオポリマー中に取り込ませるかまたは取り込ませずに,注射,注入
ポンプもしくはステントを用いることにより,関連する組織に局所的に輸送する
ことができる。別の好ましい態様においては,リボザイムは,適当なリポソーム
ベヒクル中で,TR2オーファンレセプター,TR2−11オーファンレセプタ
ー,EAR3/COUP−TF−1,およびGATA転写因子,CDP,または
IRF−2発現の部位(例えば,肝細胞,癌細胞)に投与する。
【0034】 本発明の別の観点においては,標的分子およびTR2オーファンレセプター,
TR2−11オーファンレセプター,EAR3/COUP−TF−1,およびG
ATA転写因子,CDPまたはIRF−2活性を切断するリボザイムは,DNA
またはRNAベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組換えベク
ターは,好ましくはDNAプラスミドまたはウイルスベクターである。リボザイ
ム発現ウイルスベクターは,限定されないが,アデノ随伴ウイルス,レトロウイ
ルス,アデノウイルス,またはアルファウイルスに基づいて構築することができ
る。好ましくは,リボザイムを発現しうる組換えベクターは,上述のように輸送
され,標的細胞中に残留する。あるいは,リボザイムの過渡的発現を与えるウイ
ルスベクターを用いることができる。そのようなベクターは,必要に応じて繰り
返し投与することができる。いったん発現されたら,リボザイムは標的RNAを
切断する。リボザイム発現ベクターの輸送は,例えば静脈内または筋肉内投与に
より全身的に,または患者から外植された標的細胞に投与した後,患者に再導入
することにより,または所望の標的細胞中への導入を可能とする他の任意の手段
により,行うことができる(総説については,Couture and Sti
nchcomb,1996,TIG.,12,510を参照)。本発明の別の観
点においては,標的分子を切断して細胞増殖を阻害するリボザイムは,DNA,
RNA,またはウイルスベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。
好ましくは,リボザイムを発現しうる組換えベクターを上述のように局所的に輸
送し,平滑筋細胞中に過渡的に残留させる。しかし,この目的のために,RNA
の発現を指示する他の哺乳動物細胞ベクターを用いてもよい。
【0035】 "患者"とは,外植した細胞のドナーまたはレシピエントである生物,または細
胞それ自体を意味する。"患者"とはまた,酵素的核酸分子を投与することができ
る生物を表す。好ましくは,患者は哺乳動物または哺乳動物細胞である。より好
ましくは,患者はヒトまたはヒト細胞である。
【0036】 "ベクター"とは,所望の核酸を輸送するために用いられる任意の核酸系および
/またはウイルス系技術を意味する。
【0037】 別の観点においては,本発明の核酸分子は,個々に,または他の薬剤と組み合
わせてまたは一緒に投与して,疾患または状態を治療するために用いることがで
きる。例えば,当業者には明らかなように,癌に関連する疾患または状態を治療
するために,患者を処置することができ,または他の適当な細胞を処理すること
ができる。
【0038】 "・・を含む"とは,"・・を含む"の単語の前にあるものを含むがそれには限定
されないことを意味する。すなわち,"・・を含む"との用語の使用は,挙げられ
る要素が必要または強制的なものであるが,他の要素は任意であり,存在しても
存在しなくてもよいことを示す。"・・からなる"とは,"・・からなる"の語句の
前にあるものをすべて含みかつそれに限定されることを意味する。すなわち,"
・・からなる"との語句は,挙げられる要素が必要または強制的なものであり,
他の要素は存在しないことを示す。"本質的に・・からなる"とは,この語句の前
に挙げられるすべての要素を含み,挙げられる要素についての開示において特定
される活性または作用を妨害せずまたはそれに貢献する他の要素に限定されるこ
とを意味する。すなわち,"本質的に・・からなる"との語句は,挙げられる要素
は必要または強制的なものであるが,他の要素は任意であり,それらが挙げられ
る要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かによって,存在しても存在しなく
てもよいことを示す。
【0039】 本発明の他の特徴および利点は,以下の好ましい態様の説明および特許請求の
範囲から明らかであろう。
【0040】好ましい態様の説明 まず,図面を簡単に説明する。
【0041】 図1は,7つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを示す。矢印は
切断の部位を示す。−−−−−−−−−は標的配列を示す。点が散在する線は,
三次相互作用を示す。−は塩基対形成相互作用を示す。グループIイントロン:
P1−P9.0は種々のステム−ループ構造を表す(Cech et al.,
1994,Nature Struc.Bio.,1,273)。RNase
P(M1RNA)EGSは外部ガイド配列を表す(Forster et al
.1990,Science,249,783;Pace et al.,19
90,J.Biol.Chem.,265,3587)。グループIIイントロ
ン:5'SSは5'スプライシング部位を意味する;3’SSは3’−スプライシ
ング部位を意味する;IBSはイントロン結合部位を意味する;EBSはエクソ
ン結合部位を意味する(Pyle et al.,1994,Biochemi
sty,33,2716)。VS RNA:I−VIは,6つのステム−ループ
構造を示す;陰領域は三次相互作用を示す(Collins,国際公開WO96
/19577)。HDVリボザイム:I−IVは4つのステム−ループ構造を示
す(Been et al.,米国特許5,625,047)。ハンマーヘッド
リボザイム:I−IIIは,3つのステム−ループ構造を示す;ステムI−II
Iは,任意の長さであってもよく,対称でも非対称でもよい(Usman et
al.,1996,Curr.Op.Struct.Bio.,1,527)
。ヘアピンリボザイム:ヘリックス1,4および5は任意の長さでありうる;ヘ
リックス2は3−8塩基対の長さである;Yはピリミジンである;ヘリックス2
(H2)は少なくとも4塩基対で与えられ(すなわち,nは1,2,3または4
),ヘリックス5は任意に2塩基またはそれ以上の長さでありうる(好ましくは
3−20塩基,すなわち,mは1−20またはそれ以上)。ヘリックス2および
ヘリックス5は,1またはそれ以上の塩基により共有結合していてもよい(すな
わち,rは1塩基以上)。ヘリックス1,4または5はまた,リボザイム構造を
安定化するために,2塩基対またはそれ以上長くてもよく(すなわち4−20塩
基対),好ましくは蛋白質結合部位である。それぞれの例において,各Nおよび
N'は,独立して,任意の正常または修飾塩基であり,各ダッシュは潜在的塩基
対相互作用を表す。これらのヌクレオチドは,糖,塩基またはリン酸で修飾され
ていてもよい。ヘリックス中では完全な塩基対形成は必要ではないが,好ましい
。ヘリックス1および4は,ある程度の塩基対形成が保持される限り,任意のサ
イズでありうる(すなわち,oおよびpは,それぞれ独立して,0から任意の数
,例えば20である)。必須塩基は,構造中に特定の塩基として示されるが,当
業者は,1またはそれ以上が化学的に修飾(脱塩基,塩基,糖および/またはリ
ン酸修飾)されていてもよく,または著しい影響なしで他の塩基で置き換えられ
ていてもよいことを認識するであろう。ヘリックス4は,2つの別々の分子から
,すなわち接続ループなしで形成してもよい。接続ループは,存在する場合,そ
の塩基,糖またはリン酸に修飾を有するかまたは有しないリボヌクレオチドであ
りうる。qは2塩基以上である。接続ループはまた,非ヌクレオチドリンカー分
子で置き換えられていてもよい。Hは塩基A,U,またはCを表す。Yはピリミ
ジン塩基を表す。"__"は,共有結合を表す(Burke et al.,19
96,Nucleic Acids&Mol.Biol.,10,129;Ch
owrira et al.,米国特許5,631,359)。
【0042】 図2は,hGATA−2を標的とする,配列番号281に含まれる配列を有す
るハンマーヘッドリボザイムの二次構造の例である。
【0043】 図3は,本発明の核酸分子による作用のメカニズムを示す概略図である。転写
開始の制御は,一緒に作用する1またはそれ以上の転写因子により生ずることが
できる。2以上の因子が関与する場合,転写因子はホモダイマーまたはヘテロダ
イマーとして存在することができる。場合によっては,ヘテロダイマーの形成に
より転写が抑制され,一方,ホモダイマーは不活性な転写複合体を形成すること
ができる。ヘテロダイマーの1つのサブユニットの発現を妨害することにより,
平衡がより多くのホモダイマーの形成にシフトし,このため活性なリプレッサー
の形成が減少し,転写が増強されるであろう。
【0044】 図4は,コバルト誘導し,GATA転写因子2,TR2オーファンレセプター
およびEAR3/COUP−TR1を標的とするリボザイムを投与した後に,H
ep3B細胞においてエリスロポエチン合成が無関係対照(IR1およびIR2
)と比較して増加することを示すグラフである。
【0045】 図5は,コバルト誘導せずに,GATA転写因子2,TR2オーファンレセプ
ターおよびEAR3/COUP−TR1を標的とするリボザイムを投与した後に
,Hep3B細胞においてエリスロポエチン合成が無関係対照(IR1およびI
R2)と比較して増加することを示すグラフである。
【0046】 図6は,hGATA−2転写因子RNAを標的とするリボザイムの連続輸送後
に,Hep3B細胞においてEpo発現が無関係対照と比較して増加することを
示す棒グラフである。
【0047】 図7は,EAR3/Coup−TR1RNAを標的とするリボザイムの連続輸
送後に,Hep3B細胞においてEpo発現が無関係対照と比較して増加するこ
とを示す棒グラフである。
【0048】 図8は,hGATA−2転写因子RNAを標的とするリボザイムのパルス輸送
後に,Hep3B細胞においてEpo発現が無関係対照と比較して増加すること
を示す棒グラフである。
【0049】 図9は,EAR3/Coup−TR1RNAを標的とするリボザイムのパルス
輸送後に,Hep3B細胞においてEpo発現が無関係対照と比較して増加する
ことを示す棒グラフである。
【0050】真核生物の遺伝子抑制 遺伝子の転写のためには,遺伝子発現およびその調節に多くの転写因子が必要
である。真核生物中で最も一般的なタイプのレギュレータ遺伝子は,遺伝子発現
の開始においてRNAポリメラーゼを助けるよう機能するものであるようである
。しかし,負の制御下にある遺伝子の多くの例が存在する。この重要な因子の群
は,負のレギュレータまたはリプレッサーとして知られている。これらのトラン
ス作用蛋白質因子(リプレッサー蛋白質)は,一般に遺伝子の特定の部位に結合
することにより転写の速度を調節する。結合部位は,典型的には,標的遺伝子の
上流の,しばしばプロモータ中にあるシス要素であり,多くの場合10ヌクレオ
チド未満の長さである。負の制御下の遺伝子は,一般にリプレッサー蛋白質によ
り止められるまで構成的に発現される遺伝子である。
【0051】 ある状況下においては,抑制された遺伝子の発現が非常に望ましい。したがっ
て,リプレッサー遺伝子の発現を阻害することにより,抑制された遺伝子の発現
を促進することは,種々の疾病の治療において有益な効果を有するであろう。細
胞または患者にそのような有益な効果を有するであろう多くの蛋白質および/ま
たはペプチドが存在する。いくつかの非限定的例が以下に記載される。当業者は
,その発現の増加から生物が有益な影響を受けるであろう他の遺伝子が存在する
ことを認識するであろう。
【0052】エリスロポエチン :エリスロポエチンは,低酸素症に応答して腎臓および胎児肝
臓において産生される30.4kDAの糖蛋白質ホルモンである(Galson
et al.,(上掲))。このホルモンは赤血球産生を制御し,骨髄におい
て赤血球の前駆体の生存因子として機能する(Maxwell&Radclif
fe,1998,Curr.Opin.in Hematol.5,166−1
70)。Epoを産生する細胞中に存在するヘモグロビン様センサーが酸素分子
のレセプターとして作用すると考えられている(Goldberg et al
.,1988,Science242,1412−1415)。酸素のレベルが
正しく制御されているパラメータより低下すると,エリスロポエチン合成が誘導
される。
【0053】 Epoを用いて多くの適応症を治療することができる。例えば,腎臓疾病を有
する患者は,血液中に赤血球が存在しないことにより定義される貧血を発症する
かもしれない。組換えEpoを用いる治療は,これらの赤血球の産生を顕著に促
進することができる(Maxwell&Radcliffc,(上掲))。Ep
oリプレッサーの産生を阻害することにより,腎臓または肝臓および身体の他の
部分がエリスロポエチンを合成するよう誘導されて,貧血を阻止することができ
る。本発明の別の適用は,化学療法のアジュバントとしての用途である。化学療
法の間,患者は大量の赤血球を失うであろう。エリスロポエチンのリプレッサー
遺伝子を阻害することにより,腎臓または肝臓でEpo蛋白質を増加した量で発
現することができ,これは次により多くの赤血球の産生を刺激する。
【0054】顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF) :顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF
)は,関連する先祖細胞からの好中球の産生および機能を制御する造血細胞成長
因子である。これはインビボで単球,繊維芽細胞および内皮細胞により産生され
る。組換えG−CSFは,化学療法に伴う好中球減少症を減少させるために,な
らびに先天性疾患,例えば重症慢性好中球減少症の治療として臨床的に投与され
ている。外からG−CSFを加える代わりに,より多くの内因性G−CSFを産
生させ,このことにより治療用蛋白質の注入に伴う限界および合併症を回避する
ことが可能となるであろう。G−CSFの産生または活性の間接的または直接的
リプレッサーとして作用する可能性のあるいくつかの分子標的がある。CDPま
たはCCAAT置換蛋白質は,負の制御要素に結合して遺伝子発現を妨害する既
知の転写リプレッサーである。これはショウジョウバエcut蛋白質に広範なホ
モロジーを有する。報告は,CDPがラクトフェリン遺伝子に結合して基底プロ
モーター活性を抑制することを示す。CDPの過剰発現は,培養骨髄幹細胞にお
いてG−CSF誘導性好中球変異を妨害する(Blood 90,2784−9
5,1997)。可能性のある別の標的はジェネシスであり,これは骨髄細胞の
顆粒球分化を妨害する転写的リプレッサーである(Leukemia 12,2
07−212,1998)。ジェネシスは,"翼状らせん"転写因子制御ファミリ
ーのメンバーである。ジェネシスを過剰発現している32D骨髄細胞は,G−C
SFにより刺激されたときに,成熟することができない。ジェネシスは,ほぼ胚
性幹細胞および胚性癌腫細胞においてのみ発現される。CDPおよびジェネシス
は両方とも発生の制御に関与しているようであり,これらのダウンレギュレーシ
ョンは幹細胞成熟における妨害を救済するかもしれない。
【0055】インターフェロン−アルファ :インターフェロンは,抗ウイルス,抗増殖性,免
疫調節性およびサイトカイン刺激の機能を有する蛋白質をコードする30個を越
える遺伝子の誘導を通じて多数の生物学的効果を示す。アルファインターフェロ
ン(IFN−A)は重要な免疫系調節剤である。IFN−Aは,構造的に関連し
た遺伝子の大きなファミリーによりコードされる。インターフェロン治療は,細
胞増殖疾患(癌)およびウイルス感染(HBV,HCV)に用いられている。イ
ンターフェロン−アルファは,シス作用DNA制御領域と対応するトランス作用
因子との間の複雑な相互作用により,異なる遺伝子発現が生じている。インター
フェロン−アルファ遺伝子の発現を制限している1つの可能性は,リプレッサー
転写因子IRF−2(JBC 272,22788−99,1997)である。
また,トランス作用リプレッサーがまだ同定されていないが本発明の核酸分子に
よる阻害の追加の標的でありうる別の負の制御領域がある。この転写性リプレッ
サーの発現を阻害することにより,産生される内因性インターフェロン−アルフ
ァのレベルが増加するかもしれない。また,トランス作用リプレッサーがまだ同
定されていないが本発明の核酸分子による阻害の追加の標的でありうる別の負の
制御領域がある。この方法の利点は,外因性インターフェロンに対する抗体の産
生を回避しうること,ならびに外因性インターフェロン−アルファ投与にしばし
ば見られる自己免疫合併症を回避しうることであろう。
【0056】本発明の核酸分子の作用のメカニズム アンチセンス:アンチセンス分子は,修飾されたまたは修飾されていないRN
A,DNA,または混合ポリマーのオリゴヌクレオチドであることができ,主と
して,マッチする配列に特異的に結合することにより機能し,ペプチド合成を阻
害する(Wu−Pong,Nov 1994,Bio Pharm,20−33
)。アンチセンスオリゴヌクレオチドは,標的RNAにワトソンクリック塩基対
形成により結合し,立体的障害によりまたはRNaseH酵素を活性化すること
により結合した配列のリボソーム翻訳を防止することにより遺伝子発現を妨害す
る。アンチセンス分子はまた,RNAのプロセシングまたは核から細胞質への輸
送を妨害することにより蛋白質合成を変化させることができる(Mukhopa
dhyay&Roth,1996,Crit.Rev.in Oncogene
sis 7,151−190)。
【0057】 さらに,一本鎖DNAのRNAへの結合により,ヘテロデュープレックスがヌ
クレアーゼ分解される(Wu−Pong,(上掲),Crooke,(上掲))
。これまでのところ,RNaseHの基質として作用する,主鎖を化学的に修飾
したDNAは,ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートのみである。最
近,2’−アラビノおよび2’−フルオロアラビノ含有オリゴもまたRNase
H活性を活性化することが報告された。
【0058】 化学的に修飾されたヌクレオチドの新規なコンフィギュレーション,二次構造
,および/またはRNaseH基質ドメインを利用する多数のアンチセンス分子
が記載されている(Woolf et a l;国際公開WO98/13526
;Thompson et al.,米国特許出願60/082,404(19
98年4月20日出願);Hartmann et al.,米国特許出願60
/101,174(1998年9月21日出願)(これらはその全体を本明細書
の一部としてここに引用する)。
【0059】トリプレックス形成オリゴヌクレオチド(TFO) :配列特異的様式でゲノムD
NAに結合するように一本鎖DNAを設計することができる。TFOは,フーグ
スティーン塩基対形成を介してDNAらせんに結合するピリミジンリッチオリゴ
ヌクレオチドから構成される(Wu−Pong,(上掲))。得られるDNAセ
ンス,DNAアンチセンス,およびTFOからなる三重らせんは,RNAポリメ
ラーゼによるRNA合成を破壊する。結合が不可逆的であるため,TFOメカニ
ズムにより遺伝子発現または細胞死が生ずることができる(Mukhopadh
yay&Roth,(上掲))。
【0060】2−5Aアンチセンスキメラ :2−5Aシステムは,高等脊椎動物に見いだされ
るRNA分解のインターフェロン媒介性メカニズムである(Mitra et
al;1996,Proc Nat Acad Sci USA 93,678
0−6785)。RNA切断には,2種類の酵素,すなわち,2−5Aシンセタ
ーゼおよびRNaseLが必要である。2−5Aシンセターゼは,二本鎖RNA
が2’−5’オリゴアデニル酸(2−5A)を形成することを必要とする。次に
,2−5Aは,一本鎖RNAを切断する能力を有するRNaseLを利用するた
めのアロステリックエフェクターとして作用する。二本鎖RNAとともに2−5
A構造を形成する能力のため,このシステムはウイルス複製の阻害に特に有用で
ある。
【0061】 (2’−5’)オリゴアデニル酸構造は,アンチセンス分子に共有結合で結合
して,RNA切断が可能なキメラオリゴヌクレオチドを形成することができる(
Torrence,(上掲))。これらの分子は,おそらくは,2−5A依存性
RNaseに結合してこれを活性化し,次にオリゴヌクレオチド/酵素複合体が
標的RNA分子に結合し,これは次にRNase酵素により切断されることがで
きる。
【0062】酵素的核酸: 現在,天然に生ずる酵素的RNAの7つの基本的変種が知られてい
る。さらに,いくつかのインビトロ選択(進化)戦略(Orgel,1979,
Proc.R.Soc.London,B205,435)を用いて,ホスホジ
エステル結合の切断およびライゲーションを触媒しうる新たな核酸触媒が発展し
てきた(Joyce,1989,Gene,82,83−87;Beaudry
et al.,1992,Science 257,635−641;Joy
ce,1992,Scientific American 267,90−9
7;Breaker et al.,1994,TIBTECH 12,268
;Bartel et al.,1993,Science 261:1411
−1418;Szostak,1993,TIBS 17,89−93;Kum
ar et al.,1995,FASEB J.,9,1183;Break
er,1996,Curr.Op.Biotech.,7,442;Santo
ro et al.,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.,9
4,4262;Tang et al.,1997,RNA 3,914;Na
kamaye&Eckstein,1994,(上掲);Long&Uhlen
beck,1994,(上掲);Ishizaka et al.,1995,
(上掲);Vaish et al.,1997,Biochemisty 3
6,6495;(これらのすべてを本明細書の一部としてここに引用する)。そ
れぞれは,生理学的条件下で,ホスホジエステル結合をトランスで加水分解する
ことを含む一連の反応を触媒することができる(したがって,他のRNA分子を
切断しうる)。表Iは,これらのリボザイムのいくつかの特性をまとめたもので
ある。一般に,酵素的核酸は,最初に標的RNAに結合することにより作用する
。そのような結合は,標的RNAを切断する作用をする分子の酵素的部分に近接
して保持された,酵素的核酸の標的結合部分により生ずる。すなわち,酵素的核
酸は,まず標的RNAを認識し,次に相補的塩基対形成によりこれに結合し,い
ったん正しい部位に結合したら,酵素的に作用して標的RNAを切断する。その
ような標的RNAの戦略的切断は,コードされる蛋白質の合成を指示するその能
力を破壊するであろう。酵素的核酸は,そのRNA標的を結合し切断した後,そ
のRNAから離れて別の標的を探し,新たな標的に繰り返し結合して切断するこ
とができる。
【0063】 リボザイムの酵素的性質は,治療を行うのに必要なリボザイムの濃度がより低
い等の著しい利点を有する。この利点は,リボザイムが酵素的に作用する能力を
反映している。すなわち,1つのリボザイム分子が多くの標的RNA分子を切断
することができる。さらに,リボザイムは,高度に特異的な阻害剤であり,その
阻害の特異性は,標的RNAへの結合の塩基対形成メカニズムのみならず,標的
RNA切断のメカニズムにも依存する。切断の部位の近くにおける1つのミスマ
ッチまたは塩基置換を選択して,リボザイムの触媒活性を完全に排除することが
できる。
【0064】 エンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸分子は,ヌクレオチド塩基配列に特
異的な様式で他の別のRNA分子を繰り返し切断することができる。そのような
酵素的核酸分子は,事実上すべてのRNA転写産物を標的とすることができ,イ
ンビトロで有効な切断を達成することができる(Zaug et al.,32
4,Nature 429 1986;Uhlenbeck,1987 Nat
ure 328,596;Kim et al.,84 Proc.Natl.
Acad.Sci. USA 8788,1987;Dreyfus,1988
,Einstein Quart.J.Bio.Med.,6,92;Hase
loff and Gerlach,334 Nature 585,1988
;Cech,260 JAMA 3030,1988;Jefferies e
t al.,17 Nucleic Acids Research 1371
,1989;Santoro et al.,1997(上掲)))。
【0065】 その配列特異性のため,トランス切断リボザイムは,ヒトの疾患の治療剤とし
て有望である(Usman&McSwiggen,1995 Ann.Rep.
Med.Chem.30,285−294;Christoffersen a
nd Marr,1995 J.Med.Chem.38,2023−2037
)。リボザイムは,細胞性RNAのバックグラウンド中で特定のRNA標的を切
断するよう設計することができる。そのような切断事象は,RNAを非機能性に
し,そのRNAからの蛋白質発現を排除する。このようにして,疾患状態に関連
する蛋白質の合成が選択的に阻害される。
【0066】核酸分子の合成 100ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は,自動化方法を用いては困難
であり,そのような分子の治療的コストは非常に高くなる。本発明においては,
好ましくは,小さい核酸モチーフ("小さい"とは,100ヌクレオチド以下の長
さ,好ましくは80ヌクレオチド以下の長さ,最も好ましくは50ヌクレオチド
以下の長さの核酸モチーフ,例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド,ハンマー
ヘッドまたはヘアピンリボザイムを表す)が外的輸送に用いられる。これらの分
子は構造が簡単であるため,核酸がRNA構造の標的領域に進入する能力が高い
。本発明の例示的分子は化学的に合成したが,他の分子も同様に合成することが
できる。オリゴデオキシリボヌクレオチド分子は,Caruthers et
al.(1992, Methods in Emymology 211,3
−19;本明細書の一部としてここに引用する)に記載されるように,標準的な
プロトコルを用いて合成した。
【0067】 ある種の酵素的核酸分子を含む通常のRNAについて用いられる合成方法は,
Usman et al.,1987 J.Am.Chem.Soc.,109
,7845;Scaringe et al.,1990 Nucleic A
cids Res.,18,5433;Wincott et al.,199
5 Nucleic Acids Res.23,2677−2684;に記載
の方法にしたがい,慣用の核酸保護基およびカップリング基,例えば,5’末端
にジメトキシトリチル,および3’末端にホスホルアミダイトを用いる。非限定
的例においては,小スケールの合成は,394 Applied Biosys
tems,Inc.合成機で,改変した0.2μmolスケールのプロトコルを
用いて,アルキルシリル保護ヌクレオチドについては7.75分間のカップリン
グ工程を,2’−O−メチル化ヌクレオチドについては2.5分間のカップリン
グ工程を行った。表IIは,合成サイクルにおいて用いた試薬の量および接触時
間の概要を示す。あるいは,0.2μmolスケールでの合成は,96ウエルプ
レート合成機,例えば,Protogene(Palo Alto,CA)によ
り製造される装置で,サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。各カッ
プリングサイクルにおいて,ポリマー結合5’−ヒドロキシルに対して15倍過
剰(31μLの0.1M=3.1μmol)のホスホルアミダイトおよび38.
7倍過剰のS−エチルテトラゾール(31μLの0.25M=7.75μmol
)を用いた。394 Applied Biosystems,Inc.合成機
における平均カップリング収率は,トリチル画分の比色定量により決定して,9
7.5−99%であった。394 Applied Biosystems,I
nc.合成器で用いた他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである:
脱トリチル化溶液は塩化メチレン中3%TCA(ABI)であり;キャッピング
は,THF中16%N−メチルイミダゾール(ABI)およびTHF中10%無
水酢酸/10%2,6−ルチジン(ABI)中で行い;酸化溶液は,16.9m
M I2,49mMピリジン,THF中9%水(PERSEPTIVE(登録商
標))であった。Burdick&Jackson合成等級アセトニトリルは,
試薬瓶から直接用いた。S−エチルテトラゾール溶液(アセトニトリル中0.2
5M)は,American International Chemical
,Inc.から入手した固体から作成した。
【0068】 RNAの脱保護は,2ポットプロトコルまたは1ポットプロトコルのいずれか
を用いて行った。2ポットプロトコルについては,ポリマー結合トリチルオンオ
リゴリボヌクレオチドを4mLのガラスねじ蓋バイアルに移し,40%水性メチ
ルアミン(1mL)の溶液中で65℃で10分間懸濁した。−20℃に冷却した
後,上清をポリマー支持体から除去した。支持体を1.0mLのEtOH:Me
CN:H2O/3:1:1で3回洗浄し,ボルテックスし,次に上清を最初の上
清に加えた。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して,白色粉末
を得た。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水TEA/HF/NMP溶液(
1.5mL N−メチルピロリジノン,750μL TEAおよび1.0mL
TEA・3HFの溶液300μL,HF濃度1.4M)に再懸濁し,65℃に加
熱した。1.5時間後,オリゴマーを1.5M NH4HCO3で急冷した。
【0069】 あるいは,1ポットプロトコルのためには,ポリマー結合トリチルオンオリゴ
リボヌクレオチドを4mLのガラスねじ蓋バイアルに移し,33%エタノール性
メチルアミン/DMSO:1/1(0.8mL)の溶液中で,65℃で15分間
懸濁した。バイアルを室温にした。TEA・3HF(0.1mL)を加え,バイ
アルを65℃で15分間加熱した。試料を−20℃に冷却し,次に1.5M N
4HCO3で急冷した。
【0070】 トリチルオンオリゴマーの精製のためには,急冷したNH4HCO3溶液を,ア
セトニトリル,続いて50mM TEAAで予備洗浄したC−18含有カートリ
ッジに負荷した。負荷したカートリッジを水で洗浄した後,RNAを0.5%T
FAで13分間脱トリチル化した。次にカートリッジを水で再び洗浄し,1M
NaClで塩交換し,再び水で洗浄した。次に,30%アセトニトリルでオリゴ
ヌクレオチドを溶出した。
【0071】 不活性ハンマーヘッドリボザイムまたは減弱結合対照(BAC)オリゴヌクレ
オチド)は,G5をUで,A14をUで置換することにより合成した(番号付け
は,Hertel,K.J., et al.,1992, Nucleic
Acids Res.,20,3252による)。
【0072】 平均段階カップリング収率は,>98%であった(Wincott et a
l.,1995 Nucleic Acids Res.23,2677−26
84)。当業者は,合成のスケールは,上述の例より大きくまたは小さく,例え
ば,限定されないが,96ウエルのフォーマットに適合させることができること
,および,重要なすべては,反応において用いられる化学物質の比率であること
を認識するであろう。
【0073】 あるいは,本発明の核酸分子は,別々に合成して,ライゲーションにより一緒
につなげてもよい(Moore et al.,1992,Science 2
56,9923;Draper et al.国際公開WO93/23569;
Shabarova et al.,1991,Nucleic Acids
Research 19,4247)。
【0074】核酸分子の投与 核酸分子の輸送の方法は,Akhtar et al.,(1992,Tre
nds Cell Bio.,2,139)およびDelivery Stra
tegies for Antisense Oligonucleotide
Therapeutics,ed.Akhtar,1995(いずれも本明細
書の一部としてここに引用する)に記載されている。Sullivan et
al.,PCT WO94/02595は,さらに,酵素的RNA分子を輸送す
るための一般的な方法を記載する。これらのプロトコルを用いて,事実上いかな
る核酸分子も輸送することができる。核酸分子は当業者に知られる種々の方法に
よって細胞に投与することができ,これにはリポソームへの封入,イオントホレ
シス,または他のベヒクル,例えば,ヒドロゲル,シクロデキストリン,生分解
性ナノカプセル,および生体接着性小球体への組み込みが含まれるが,これらに
限定されない。ある適応症に対しては,核酸分子をエクスビボで,上述のベヒク
ルを用いてまたは用いずに,細胞または組織に直接輸送することができる。ある
いは,核酸/ベヒクルの組み合わせを,直接注入により,またはカテーテル,注
入ポンプもしくはステントを用いることにより局所的に輸送する。他の輸送経路
には,静脈内,筋肉内,皮下または関節注射,エアロゾル吸入,経口(錠剤また
はピル形態),局所,全身,眼,腹腔内および/またはくも膜下腔内輸送が含ま
れるが,これらに限定されない。核酸の輸送および投与のより詳細な説明はSu
llivan et al.,(上掲)およびDraper et al.,P
CT WO93/23569に提供されており,これらを本明細書の一部として
ここに引用する。
【0075】 本発明の分子は医薬として用いることができる。医薬は患者の疾患状態を予防
し,発症を阻害し,またはそれを治療する(症状をある程度,好ましくは全ての
症状を緩和する)。
【0076】 本発明の負に荷電したポリヌクレオチド(例えば,RNA,DNAまたは蛋白
質)は,医薬組成物を形成するために安定化剤,緩衝剤等を用いて,または用い
ることなく,任意の標準的手段により患者に投与および導入することができる。
リポソーム輸送メカニズムを用いることが望ましい場合,リポソームの処方のた
めの標準的プロトコルに従うことができる。本発明の組成物はまた,経口投与用
の錠剤,カプセルまたはエリキシル;直腸投与用の座剤;無菌溶液;注射投与用
の懸濁液等として,処方して用いることもできる。
【0077】 本発明はまた,記載される化合物の薬学的に許容しうる処方を含む。これらの
処方には,上述の化合物の塩,例えば,酸付加塩(例えば,塩酸,シュウ酸,酢
酸およびベンゼンスルホン酸の塩)が含まれる。
【0078】 医薬組成物または処方は,細胞または患者への投与(例えば全身投与),好ま
しくはヒトへの投与に適当な形態の組成物または処方を表す。適当な形態は,部
分的には,使用する投与経路(例えば経口,経皮,または注射)に依存する。そ
のような形態は,組成物または処方が標的細胞(すなわち,負に荷電したポリマ
ーが輸送されることが望まれる細胞)に到達することを妨害してはならない。例
えば,血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子は
当該技術分野において知られており,例えば,毒性,および組成物または処方が
その効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。
【0079】 "全身投与"とは,インビボでの全身吸収,または血流中における薬剤の蓄積の
後に全身に分配されることを意味する。全身的吸収をもたらす投与経路には,静
脈内,皮下,腹腔内,吸入,経口,肺内および筋肉内が含まれるが,これらに限
定されない。これらの投与経路のそれぞれは,所望の負に荷電したポリマー(例
えば核酸)をアクセス可能な疾患組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は,
分子量またはサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリ
ポソームまたは他の薬剤担体を使用することにより,薬剤を,例えば,あるタイ
プの組織(例えば網状内皮系(RES)の組織)に局在化させることが可能であ
る。薬剤と細胞(例えば白血球およびマクロファージ)の表面との会合を容易に
することができるリポソーム処方もまた有用である。この方法は,マクロファー
ジおよび白血球による異常な細胞(例えば癌細胞)の免疫認識の特異性を利用す
ることにより,薬剤の標的細胞への輸送を増強するであろう。
【0080】 本発明はまた,ポリ(エチレングリコール)脂質(PEG−修飾,または長期
間循環リポソームまたはステルスリポソーム)を含む,表面修飾リポソームを含
む組成物の使用を特徴とする。これらの処方は,標的組織における薬剤の蓄積を
増加させる方法を提供する。この種類の薬剤担体は,単核食細胞システム(MP
SまたはRES)によるオプソニン作用および排除に抵抗性であり,したがって
,封入された薬剤の血流循環時間を長くし,組織への暴露を増強する(Lasi
c et al.Chem.Rev.1995,95,2601−2627;I
shiwata et al.,Chem.Pharm.Bull.1995,
43,1005−1011)。そのようなリポソームは,おそらくは脈管新生標
的組織における溢出および捕獲のため,腫瘍中に選択的に蓄積することが示され
ている(Lasic et al.,Science 1995,267,12
75−1276;Oku et al.,1995,Biochim.Biop
hys.Acta,1238,86−90)。長期間循環リポソームは,特に,
MPSの組織で蓄積することが知られている慣用のカチオン性リポソームと比べ
て,DNAおよびRNAの薬物動態学および薬力学を増強する(Liu et
al.,J.Biol.Chem.1995,42,24864−24870;
Choi et al.,国際公開WO96/10391;Ansell et
al.,国際公開WO96/10390;Holland et al.,国
際公開WO96/10392;これらをすべて本明細書の一部としてここに引用
する)。長期間循環リポソームはまた,代謝的に攻撃的なMPS組織,例えば肝
臓および脾臓における蓄積を回避するその能力に基づいて,カチオン性リポソー
ムと比較して薬剤をヌクレアーゼ分解からより強く保護するようである。これら
の参考文献はすべて,本明細書の一部としてここに引用する。
【0081】 本発明はまた,薬学的に有効量の所望の化合物を薬学的に許容しうる担体また
は希釈剤中に含む,保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用
いるための許容しうる担体または希釈剤は,医薬の技術分野においてよく知られ
ており,例えばRemington's Pharmaceutical Sc
iences,Mack Publishing Co.(A.R.Genna
ro edit.1985)(本明細書の一部としてここに引用する)に記載さ
れている。例えば,保存剤,安定剤,染料,および風味剤を用いることができる
(同,1449)。これらには,安息香酸ナトリウム,ソルビン酸,およびp−
ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに,抗酸化剤および懸濁剤を用
いてもよい(同)。
【0082】 薬学的に有効な用量とは,疾患状態の予防,発症の阻害または治療(症状をあ
る程度緩和し,好ましくはすべての症状を緩和する)に必要な用量である。薬学
的に有効な用量は,疾患の種類,用いる組成物,投与の経路,治療する哺乳動物
の種類,考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性,同時投与される薬剤,および
医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に,負に
荷電したポリマーの効力に依存して,0.1mg/kg−100mg/kg体重
/日の活性成分を投与する。
【0083】 本発明の核酸分子はまた,全体の治療効果を増加させるため,他の治療化合物
と組み合わせて患者に投与してもよい。適応症を処置するための多数の化合物の
使用は有益な効果を増加させ,一方副作用を減少させるであろう。
【0084】 あるいは,本発明の核酸分子(例えばリボザイムおよびアンチセンス分子)は
,細胞中で真核生物プロモーターから発現させることもできる(例えば,Iza
nt and Weintraub,1985 Science 229,34
5;McGarry and Lindquist,1986 Proc.Na
tl.Acad.Sci. USA 83,399;Scanlon et a
l.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci. USA ,88,
10591−5;Kashani−Sabet et al.,1992 An
tisense Res.Dev.,2,3−15;Dropulic et
al.,1992 J.Virol,66,1432−41;Weerasin
ghe et al.,1991 J.Virol,65,5531−4;Oj
wang et al.,1992 Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 89,10802−6;Chen et al.,1992 Nuc
leic Acids Res.,20,4581−9;Sarver et
al.,1990 Science 247,1222−1225;Thomp
son et al.,1995 Nucleic Acids Res.23
,2259;Good et al 1997 Gene Therapy,4
,45(これらの文献はその内容の全てを本明細書の一部としてここに引用する
))。当業者は,真核生物細胞中で適当なDNA/RNAベクターから任意の核
酸を発現させることができることを理解するであろう。そのような核酸の活性は
,リボザイムによってそれらを一次転写産物から放出させることにより増大させ
ることができる(Draper et al.,PCT WO93/23569
,Sullivan et al.,PCT WO94/02595;Ohka
wa et al.,1992 Nucleic Acids Symp.Se
r.,27,15−6;Taira et al.,1991, Nuclei
c Acids Res.,19,5125−30;Ventura et a
l.,1993 Nucleic Acids Res.,21,3249−5
5;Chowrira et al.,1994 J.Biol.Chem.2
69,25856(いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する)
)。
【0085】 本発明の別の観点においては,標的分子を切断する酵素的核酸分子は,DNA
またはRNAベクター中に挿入された転写ユニットから発現される(例えばCo
uture et al.,1996,TIG.,12,510を参照)。組換
えベクターは,好ましくはDNAプラスミドまたはウイルスベクターである。リ
ボザイムを発現するウイルスベクターは,限定されないが,アデノ随伴ウイルス
,レトロウイルス,アデノウイルス,またはアルファウイルスに基づいて構築す
ることができる。好ましくは,リボザイムを発現しうる組換えベクターは,上述
のように輸送され,標的細胞中に残留する。あるいは,リボザイムの過渡的発現
を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは,必要
に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば,リボザイムは
標的RNAを切断する。活性なリボザイムは,標的部位における切断が生ずるよ
うに,実施例におけるものと同等の酵素中心もしくはコア,および標的核酸分子
に結合することができる結合アームを含む。そのような切断を妨害しない他の配
列が存在してもよい。リボザイムを発現するベクターの輸送は,全身的(例えば
,静脈内または筋肉内投与により),患者から外植された標的細胞に投与した後
,患者に再導入することにより,または所望の標的細胞中への導入を可能とする
他のいずれかの手段により行うことができる(総説については,Couture
et al.,1996,TIG.,12,510を参照)。
【0086】 本発明の1つの観点においては,少なくとも1つの本発明の核酸分子(リボザ
イム,アンチセンス)をコードする核酸配列を含む発現ベクターが開示される。
本発明の核酸分子をコードする核酸配列は,その核酸分子の発現を可能とする様
式で,動作可能なように連結されている。
【0087】 本発明の別の観点においては,発現ベクターは,転写開始領域(例えば真核生
物pol I,IIまたはIIIの開始領域);b)転写終止領域(例えば真核
生物pol I,IIまたはIIIの終止領域);c)本発明の核酸触媒の少な
くとも1つをコードする遺伝子を含む。ここで,前記遺伝子は,前記核酸分子の
発現および/または輸送を可能とする様式で,前記開始領域および前記終止領域
に動作可能なように連結されている。ベクターは,任意に,本発明の核酸触媒を
コードする遺伝子の5'側または3’側に動作可能なように連結された蛋白質の
オープンリーディングフレーム(ORF);および/またはイントロン(介在配
列)を含んでいてもよい。
【0088】 リボザイムまたはアンチセンス配列の転写は,真核生物RNAポリメラーゼI
(pol I),RNAポリメラーゼII(pol II),またはRNAポリ
メラーゼIII(pol III)のプロモーターにより駆動される。pol
IIまたはpol IIIプロモーターからの転写産物は,すべての細胞におい
て高いレベルで発現されるであろう。所定の細胞タイプ中における所定のpol
IIプロモーターのレベルは,近くに存在する遺伝子制御配列(エンハンサー
,サイレンサー等)の性質に依存するであろう。原核生物RNAポリメラーゼ酵
素が適当な細胞中で発現される限り,原核生物RNAポリメラーゼプロモーター
もまた用いられる(Elroy−Stein and Moss,1990 P
roc.Natl.Acad.Sci. USA ,87,6743−7;Ga
o and Huang 1993 Nucleic Acids Res.,
21,2867−72;Lieberet.al.,1993 Methods
Enzymol.,217,47−66;Zhou et al.,1990
Mol.細胞.Biol.,10,4529−37)。何人かの研究者が,そ
のようなプロモーターから発現したリボザイムが哺乳動物細胞中で機能しうるこ
とを示している(例えば,Kashani−Sabet et al.,199
2 Antisense Res.Dev.,2,3−15;Ojwang e
t al.,1992 Proc.Natl.Acad.Sci. USA ,
89,10802−6;Chen et al.,1992 Nucleic
Acids Res.,20,4581−9;Yu et al.,1993
Proc.Natl.Acad.Sci. USA ,90,6340−4;L
'Huillier et al.,1992 EMBO J.11,4411
−8;Lisziewicz et al.,1993 Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.,90,8000−4;Thompson e
t al.,1995 Nucleic Acids Res.23,2259
;Sullenger&Cech,1993,Science,262,156
6)。より詳細には,転写ユニット,例えばU6小核(snRNA),転移RN
A(tRNA)およびアデノウイルスVA RNAをコードする遺伝子に由来す
るものは,細胞中において高濃度の所望のRNA分子(例えばリボザイム)を生
成するのに有用である(Thompson et al.,(上掲);Cout
ure and Stinchcomb,1996,(上掲);Noonber
g et al.,1994,Nucleic Acid Res.,22,2
830;Noonberg et al.,米国特許5,1624,803;G
ood et al.,1997,Gene Ther.4,45;Beicr
elman et al.,国際公開WO96/18736;(これらのすべて
の刊行物を本明細書の一部としてここに引用する)。上述のリボザイム転写ユニ
ットは,哺乳動物細胞中に導入するために種々のベクター中に組み込むことがで
きる。ベクターとしては,限定されないが,プラスミドDNAベクター,ウイル
スDNAベクター(例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター)
,またはウイルスRNAベクター(例えばレトロウイルスまたはアルファウイル
スベクター)が挙げられる(総説については,Couture and Sti
nchcomb,1996,(上掲)を参照)。
【0089】 さらに別の観点においては,本発明は,本発明の核酸分子の少なくとも1つを
コードする核酸配列を,その核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクタ
ーを特徴とする。1つの態様においては,発現ベクターは,a)転写開始領域;
b)転写終止領域;c)前記核酸分子の少なくとも1つをコードする遺伝子を含
み;前記遺伝子は,前記核酸分子の発現および/または輸送を可能とする様式で
,前記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。別の好
ましい態様においては,発現ベクターは,a)転写開始領域;b)転写終止領域
;c)オープンリーディングフレーム;d)前記核酸分子の少なくとも1つをコ
ードする遺伝子を含み,前記遺伝子は,前記オープンリーディングフレームの3
'末端に動作可能なように連結されており,前記遺伝子は,前記核酸分子の発現
および/または輸送を可能とする様式で,前記開始領域,前記オープンリーディ
ングフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。さらに別
の態様においては,発現ベクターは,a)転写開始領域;b)転写終止領域;c
)イントロン;d)前記核酸分子の少なくとも1つをコードする遺伝子を含み;
前記遺伝子は,前記核酸分子の発現および/または輸送を可能とする様式で,前
記開始領域,前記イントロンおよび前記終止領域に動作可能なように連結されて
いる。別の態様においては,発現ベクターは,a)転写開始領域;b)転写終止
領域;c)イントロン;d)オープンリーディングフレーム;e)前記核酸分子
の少なくとも1つをコードする遺伝子を含み,前記遺伝子は,前記オープンリー
ディングフレームの3'末端に動作可能なように連結されており,前記遺伝子は
,前記核酸分子の発現および/または輸送を可能とする様式で,前記開始領域,
前記イントロン,前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作
可能なように連結されている。
【0090】 別の観点においては,本発明は,細胞において標的蛋白質のレベルを増加させ
る方法を特徴とする。該方法は,細胞を,細胞における標的蛋白質のレベルの増
加に適した条件下で,標的蛋白質の発現を抑制するリプレッサー蛋白質の発現を
特異的に阻害しうる核酸分子と接触させる工程を含む。
【0091】 別の観点においては,本発明は,細胞において標的蛋白質のレベルを増加させ
る方法を特徴とする。該方法は,患者から細胞を単離し,標的蛋白質のリプレッ
サーの発現を阻害しうる核酸分子(合成またはベクター)を導入し,標的蛋白質
の発現を増加させる条件下で,細胞を同じまたは異なる患者に導入する,の各工
程を含む。
【0092】リボザイム活性の最適化 本明細書に記載されるリボザイムの触媒活性は,Draper et al.
,(上掲)に記載されるように最適化することができる。詳細はここでは繰り返
さないが,リボザイム結合アームの長さを変更すること,または,血清リボヌク
レアーゼによる分解を防ぎ,および/またはその酵素的活性を増強させる修飾(
塩基,糖および/またはリン酸)を有するリボザイムを化学的に合成することが
含まれる(例えば,Eckstein et al.,国際公開WO92/07
065;Perrault et al.,1990 Nature 344,
565;Pieken et al.,1991 Science 253,3
14;Usman and Cedergren,1992 Trends i
n Biochem.Sci.17,334;Usman et al.,国際
公開WO93/15187;Rossi et al.,国際公開WO91/0
3162;Sproat,米国特許5,334,711;およびBurgin
et al.,(上掲)を参照;これらはすべて酵素的RNA分子の塩基,リン
酸および/または糖成分になしうる種々の化学修飾を記載する)。細胞中におけ
るその抗力を増強する修飾,およびオリゴヌクレオチドの合成時間を短縮し化学
物質の必要性を減少するためにステムループ構造から塩基を除去することが望ま
しい(これらの刊行物のすべてを本明細書の一部としてここに引用する)。
【0093】 当該技術分野には,触媒活性に有意に影響を与えることなくそのヌクレアーゼ
安定性および効力を有意に増強することができる,酵素的核酸分子中に導入する
ことができる糖,塩基およびリン酸修飾を記述するいくつかの例がある。リボザ
イムは,ヌクレアーゼ耐性基,例えば,2’−アミノ,2’−C−アリル,2'
−フルオロ,2’−O−メチル,2'−H,ヌクレオチド塩基修飾で修飾するこ
とにより,安定性を高め,および/または触媒活性を増強するために修飾される
(総説については,Usman and Cedergren,1992 TI
TBS 17,34;Usman et al.,1994 Nucleic
Acids Symp.Ser.31,163;Burgin et al.,
1996 Biochemisty 35,14090を参照)。酵素的核酸分
子の糖修飾は,当該技術分野において広く記載されている(Eckstein
et al.,国際公開WO92/07065;Perrault et al
.Nature 1990,344,565−568;Pieken et a
l.Science 1991,253,314−317;Usman and
Cedergren,Trends in Biochem.Sci.199
2,17,334−339;Usman et al.国際公開WO93/15
187;Sproat,米国特許5,334,711,Beigelman e
t al.,1995 J.Biol.Chem.270,25702;を参照
,これらの参考文献はすべて,その全体を本明細書の一部としてここに引用する
)。これらの刊行物は,触媒活性を阻害することなく,糖,塩基および/または
リン酸修飾等をリボザイム中に組み込む位置を決定する一般的方法および戦略を
記載しており,本明細書の一部としてここに引用する。これらの教示に基づいて
,同様の修飾を本明細書に記載されるように用いて,本発明の核酸触媒を修飾す
ることができる。
【0094】 酵素的活性を維持または増強する化学的修飾を有する核酸触媒が提供される。
そのような核酸はまた,一般に,非修飾核酸よりヌクレアーゼに対して耐性が高
い。すなわち,細胞においておよび/またはインビボで,活性は有意に低下しな
いであろう。本明細書に例示されるように,そのようなリボザイムは,たとえ全
体的活性が10倍低下しても,細胞においておよび/またはインビボで有用であ
る(Burgin et al.,1996,Biochemisty,35,
14090)。そのようなリボザイムは,本明細書において,全RNAリボザイ
ムの酵素的活性を"維持する"と称される。
【0095】 外的に輸送された治療用リボザイムは,最適には,望ましくない蛋白質のレベ
ルが低下するのに十分長い間標的RNAの翻訳が阻害されるまで,細胞中で安定
でなければならない。この期間は,疾患の状態により,数時間から数日まで様々
であろう。明らかに,リボザイムは,有効な細胞内治療剤として機能するために
は,ヌクレアーゼに耐性でなければならない。RNAの化学合成の改良(Win
cott et al.,1995 Nucleic Acids Res.2
3,2677;本明細書の一部としてここに引用する)は,上述のように,ヌク
レオチド修飾を導入して,そのヌクレアーゼ安定性を増強することにより,リボ
ザイムを修飾する能力を拡大した。
【0096】 "増強された酵素的活性"とは,細胞および/またはインビボで測定した活性を
含むことを意味し,ここで,活性は,触媒活性とリボザイム安定性との両方を反
映する。本発明においては,全RNAリボザイムと比較して,インビボでこれら
の特性の積が増加するかまたは有意に減少しない(10倍未満)。
【0097】 さらに別の好ましい態様においては,酵素的活性を維持または増強する化学修
飾を有する核酸触媒が提供される。そのような核酸はまた一般に,未修飾核酸よ
りに対してよりヌクレアーゼ耐性が高い。すなわち,細胞および/またはインビ
ボで,活性は有意に低下しないであろう。本明細書に例示されるように,そのよ
うなリボザイムは,全体の活性が10倍低下したとしても,細胞および/または
インビボにおいて有用である(Burgin et al,1996,Bioc
hemistry,35,14090)。本発明のそのようなリボザイムは,全
RNAリボザイムの酵素的活性"維持する"と言われる。
【0098】 これらの分子の使用は,組み合わせ治療(例えば,異なる遺伝子を標的とする
多数のリボザイム,既知の小分子阻害剤と組み合わせたリボザイム,またはリボ
ザイム(異なるリボザイムモチーフを含む)および/または他の化学的または生
物学的分子)との組み合わせを用いた間欠的治療)の可能性を提供することによ
り,疾病進行のより優れた治療につながるであろう。核酸分子を用いる患者の治
療はまた,異なるタイプの核酸分子の組み合わせを含んでいてもよい。.1また
はそれ以上の標的に対するリボザイム(異なるリボザイムモチーフを含む),ア
ンチセンスおよび/または2−5Aキメラ分子の混合物を含む治療を工夫して,
疾病の症状を軽減することができる。
【0099】動物モデル Epo合成のリプレッサーを標的とする核酸の治療上の可能性を評価するため
には,2つの慢性貧血の動物モデルが存在する。これらのモデルは,1)マウス
における化学療法誘導性貧血,および2)マウスにおける慢性腎不全誘導性貧血
である。これらのネズミのモデルは両方とも,ヒト患者における対応する疾病の
病態生理学を密接に模倣する。
【0100】(1)C57/B16マウスにおける化学療法誘導性貧血 :これらの実験の主な
目的は,赤血球を産生する身体の能力を増加させ,このことにより,化学療法誘
導性の重症の貧血を妨げることを標的とする核酸治療の有効性を評価することで
ある。
【0101】 癌患者を治療するために用いられている多くの薬剤(細胞毒性化合物)は,骨
髄に有害な影響を及ぼし,循環赤血球の数を著しく減少させる。これは,主とし
て,赤血球の産生を刺激するホルモンであるエリスロポエチン(Epo)の減少
のためである。多くのタイプの化学療法はまた,溶血性貧血を誘導する。多くの
型の化学療法により生ずる重症の貧血は,患者の生活の質(運動,仕事の遂行等
)に著しい影響力を有し,通常の日常活動を行うことが困難である。
【0102】 Epoのリプレッサーを標的とする核酸分子を,C57/B16マウスにおい
て,化学療法に伴う循環赤血球の重度の喪失(貧血)を改善する(Epo産生の
増強を示す)能力について評価する。
【0103】 実験方法:すべての実験は,病原体を含まない,20−25gの雌C57/B
16マウスを用いて実施する。マウスは病原体を含まない環境下で飼育し,食物
および水を自由に与える。貧血の誘導のために,すべての動物に3.5mg/k
gのシスプラチン(CDDP)を200μLの容量で腹膜内注入する(第0日)
【0104】 全血試料採取のためには,動物をCO2窒息により安楽死させる。化学療法を
開始する前(第0日)に,血液学的および生化学的分析のために,心臓穿刺によ
りベースラインの血液試料を得る。第1日から始めて,週に3回,27日間,1
0匹のCDDP処置動物の群から心臓穿刺により得た血液試料,体重および脾臓
の重さを得る。1回投与の化学療法後1日以内に顕著な尿毒症(BUNの上昇)
および貧血を伴う急性腎不全が明らかとなる。それぞれの終了時点において,各
群の10匹の動物からのプールした全血試料(EDTA中)について,Clay
Adamsマイクロヘマトクリット遠心分離器を用いてヘマトクリットを三重
に測定する。さらに,全血から完全な血液細胞計数を得る。残りの試料は遠心分
離し,血漿試料を−70℃で保存し,後に血漿エリスロポエチンのレベルを決定
する。
【0105】 血漿Epoレベルは,市販のELISA(R&DSystems,Minne
apolis,MN)により製造元のプロトコルを用いて決定する。
【0106】 化合物の有効性実験:薬剤1種類あたり4群の動物を試験する。群1には活性
な核酸分子(例えばリボザイム)を与える。群2には,スクランブル弱体化対照
核酸分子を療法として与え,群3にはベヒクルを療法として与える。群4は正の
治療対照として働き,組換えヒトエリスロポエチン(rhu−Epo;2500
U/kg,週3回)を与える。各時点について1群あたり10匹の動物を用い,
群1および2については1群あたり3用量までの核酸分子を用いる。各実験にお
いて13の時点を設ける(第0,1,3,5,8,10,12,15,17,1
9,22,24,26日)。各群,各時点,各用量について10匹の動物を安楽
死させ,血液試料を採取し,上述のように試験する。試験薬剤は,ALZET(
登録商標)浸透圧ポンプ(Alza Scientific Products
)により皮下または静脈内に,皮下ボーラスで,直接腹腔内注入でまたは尾部血
管から静脈内に輸送する。
【0107】(2)C57/B16マウスにおける慢性腎不全誘導性貧血 (Zhang et
al.,1996,Nephron 72:654−661):これらの実験
の主な目的は,赤血球を産生する身体の能力を増加させ,このことにより慢性腎
不全誘導性の重症の貧血を妨げることを標的とする核酸治療の有効性を評価する
ことである。
【0108】 慢性腎不全(CRF)は,血液を濾過する腎臓の能力(糸球体濾過速度;GF
R)の進行性かつ不可逆的な減少を特徴とする機能的臨床診断である。この状態
は,多くの原発性疾病,例えば,限定されないが,糸球体腎炎,心臓血管疾病お
よび高血圧,糖尿病,腎臓感染および尿路疾病に伴う。CRFは米国のみで37
0,000人以上の患者を苦しめている。これらの患者の疾病のほとんどは,終
末腎臓疾患(ESRD)に進行し,生存には腎臓交換治療(血液透析,腹膜透析
,腎臓移植)が必要である。機能的腎臓組織の喪失および透析処置の両方が,こ
れらの患者の赤血球細胞数の深刻な減少を引き起こす。これは主として,赤血球
の産生を刺激するホルモンであるエリスロポエチン(Epo)の減少のためであ
る。重症の慢性貧血は,患者の生活の質(運動,仕事の遂行等)に著しい影響力
を有し,通常の日常活動を行うことが困難である。
【0109】 実験方法:すべての実験は,病原体を含まない,20−25gの雌C57B/
16で実施する。マウスは,病原体を含まない環境で飼育し,食物および水を自
由に与える。これらの動物にCRFを樹立するために,2週間の快復期間により
分けられた2回の外科的処置が必要である。
【0110】 1回目の外科的処置のためには,動物をケタミン/キシラジンカクテル(1.
2mg/kgおよび0.14mg/kg)で麻酔し,右側面の側腹切開を行う。
門の周囲の2mmの縁を除いて右腎臓の全表面をディスポーザブルの焼灼迷走神
経切除(2250°F)を用いて電気凝固する。腎臓を腎臓窩にもどし,創傷は
4−0絹縫合糸および外科用クリップで無菌的に縫合し,動物を2週間快復させ
た後,2回目の外科手術を実施する。2回目の処置のためには,動物をケタミン
/キシラジンカクテル(1.2mg/kgおよび0.14mg/kg)で麻酔し
,左外側の側腹切開を行う。左の腎臓を除去し,創傷は4−0絹縫合糸で無菌的
に縫合する。各外科処置の後,すべての動物にペニシリンG(Durapen,
30,000U,IM)を投与する。
【0111】 全血試料を採取するためには,動物をCO2窒息により安楽死させる。疾病進
行の評価のために,2回目の手術後第1週から始めて毎週,Nx後14週まで,
1群あたり8匹の動物から,血液試料,体重および脾臓の重さを得る。対照の血
液学および生化学的測定のために,8匹の正常動物の群を安楽死させて血液試料
を得る。したがって,対照群を含め,12回の安楽死の時点がある。文献の報告
から,顕著な尿毒症(BUNの持続的上昇)および貧血を有するCRFが,Nx
後8週間以内に生ずるであろう。剖検において,心臓穿刺により臨床化学(BU
Nおよびクレアチニン)用に血液試料を得る。血液学的試験(WBC,Diff
.,血小板計数)は外部実験室(IDEXX,Inc.)で行う。
【0112】 化合物の有効性実験:試験する薬剤1種類あたり4群の動物を用いる。群1に
は本発明の活性な核酸分子(例えばリボザイム)を与える。群2にはスクランブ
ル弱体化核酸を療法として与え,群3にはベヒクルを療法として与える。群4は
正の治療対照として働き,組換えヒトエリスロポエチン(rhu−Epo;25
0U/kg;週3回)を与える。1群あたり8匹の動物,および群1および2に
ついては,1群あたり3用量までの核酸を用いる。
【0113】 試験薬剤は,ALZET(登録商標)浸透圧ポンプ(Alza Scient
ific Products)により皮下または静脈内に,皮下ボーラスで,直
接腹腔内注入でまたは尾部血管から静脈内に輸送することができる。
【0114】(3)C57/B16マウスにおける化学療法誘導性骨髄抑制 (Misakie
lal.,1998,British Journal of Cancer
77:884−889):これらの実験の主な目的は,白血球細胞を産生する身
体の能力を増加させ,このことにより化学療法誘導性好中球減少症を妨げること
を標的とする治療の有効性を評価することである。これらの核酸分子が化学療法
に伴う循環白血球細胞の重篤な喪失(好中球減少症)を改善する能力をBalb
/cマウスにおいて試験する。Misaki, et al.(1998)のプ
ロトコルを改変したプロトコルを用いる。
【0115】 実験方法:すべての実験は,病原体を含まない,25−30gの雌Balb/
cマウスで実施する。マウスを病原体を含まない環境下で飼育し,食物および水
を自由に与える。骨髄抑制誘導のために,すべての動物に200μL容量中の2
00mg/kgシクロホスファミド(CPA)を腹膜内注入する(第0日)。
【0116】 血液サンプリングは16の時点で行う。試料を得て,血漿G−CSFレベルお
よびCBCを評価する。すべてのリボザイム処方の試験プロトコルについて1つ
のベヒクル対照群およびrhuG−CSF群を用いる。体重及び脾臓の重さを記
録する。
【0117】 すべての血液試料を採取するために,動物をCO2窒息により安楽死させる。
化学療法を開始する前に(第0日),心臓穿刺により血液学的分析のためのベー
スラインの血液試料を得る。10匹の動物の1群を,CPA前,CPAの4日後
(6am,正午および6pm),およびその後毎日安楽死させる。完全な血液細
胞計数のために2mlの全血をIDEXX獣医学実験室に送る。残りの試料を遠
心分離し,血漿試料を−70℃で保存し,後に血漿G−CSFレベルを決定する
。血漿G−CSFレベルは,市販のELISAにより実験室で決定する。残りの
血漿試料はさらなる分析のために凍結する。
【0118】 化合物の有効性実験:試験する薬剤1種類あたり4群の動物を用いる。群1に
は本発明の活性な核酸分子(例えばリボザイム)を与える。群2にはスクランブ
ル弱体化核酸を療法として与え,群3にはベヒクルを療法として与える。群4は
正の治療対照として働き,組換えヒトrhu−G−CSF(5μg/kg,毎日
)を与える。1群の1時点あたり10匹の動物を用い,群1および2については
1群あたり3用量までのリボザイムを用いる。第0日に,動物にシクロホスファ
ミド(CPA;200mg/kg,IP)を投与する。第4日に核酸治療を開始
する。治療は第16日まで毎日続ける。各実験には16の時点(0−17日)が
ある。1群,1時点,1用量あたり10匹の動物を安楽死させ,血液試料を採取
する。CPA前,CPA4日後,核酸投与の6および12時間後,およびその後
毎日,1群の10匹の動物を安楽死させる。2mlの全血を完全な血液細胞計数
のためにIDEXX獣医学研究室に送る。残りの試料は遠心分離し,血漿試料を
−70℃で保存し,後に血漿エリスロポエチンレベルを決定する。血漿G−CS
Fレベルは,市販のELISAにより実験室で測定する。残りの血漿試料はさら
なる分析のために凍結する。試験薬剤は,ALZET(登録商標)浸透圧ポンプ
(Alza Scientific Products)で皮下または静脈内に
,皮下ボーラスで,直接腹腔内注入でまたは尾部血管から静脈内に輸送すること
ができる。
【0119】(4)ラットにおける慢性再発性実験自己免疫脳炎 :多発性硬化症は,その原因
が不明の疾患であり,脊髄の周囲の保護組織(ミエリン)の破壊に起因する多く
の症状(衰弱,しびれ,協調の喪失,頭痛)を有する。免疫系の問題および/ま
たは感染性物質の両方の可能性を支持する多くの研究が公表されている。これは
兆候から死亡まで約35年間の臨床経過を有する慢性衰弱疾病である。MSの自
然発生的な動物モデルはないが,齧歯類においてMSと似た自己免疫疾患を誘導
することができる。これは,粗脳混合物または脳から得た精製蛋白質のいずれか
を皮下に注入することにより行う。このモデルの目的は,動物モデルにおいてこ
の疾病に伴う症状を改善することに対する,インターフェロン−リプレッサーを
標的とする核酸を用いる治療の有効性を評価することである。
【0120】 実験方法:すべての実験は,Harlan,Inc.から入手した,病原体を
含まない,7−9週齢の雄のDark Agouti(DA)ラットを用いて行
う。ラットは,病原体を含まない環境で飼育し,実験の開始前1週間,食物およ
び水を自由に与える。すべての動物は,不完全フロインドアジュバント(IFA
)中の同系脊髄(SSC)で免疫する。脊髄乳濁液の調製のためには,ドナーD
Aラットからの脊髄を除去し,よくすりつぶす。IFA(v/W)1部に対して
脊髄1部を用いて乳濁液を調製する。乳濁液のおよその用量はパイロット実験か
ら決定する。第0日に,0.2mlのホモジネート(SSCおよびIFA)を尾
部根元の背側基部に注射する。すべての動物に75mg/kgの同系脊髄を投与
する。これらの実験の主な終点は臨床スコアである。臨床的な評点システムは以
下のとおりである:
【0121】 0.0=正常 0.5=尾部の活動の部分的な喪失 1.0=尾部の活動の完全な喪失 2.0=後肢の虚弱または一方の後肢のひきずり 3.0=両後肢の麻痺 4.0=両後肢の麻痺および前肢の虚弱 5.0=瀕死 脱髄の組織病理学的証拠が二次的終点である。臨床的評点および体重は21日
間毎日測定し,その後EODを第90日まで測定する。この実験の終了時(免疫
後90日)に動物を安楽死させる。剖検において,脳および脊髄を除去し,10
%緩衝化ホルマリンで固定し,組織病理学分析を行う。次に,最大の再現性およ
びヒトの臨床疾病を最も密接に模倣する病態生理学を与える実験方法(SSCの
用量)を選択し,化合物の有効性実験において用いる。
【0122】 化合物の有効性実験:この実験は,インターフェロン−アルファリプレッサー
遺伝子を標的とする核酸分子の,臨床的評点およびこれらの動物の脊髄および脳
における組織病理学的変化の重篤度に対する有効性を評価する。試験する薬剤1
種類あたり2つの主群の動物を用いる。一方には予防的処置を施し(免疫の3日
後に開始),他方には治療的処置を施す(最初の麻痺の発現(免疫後約15日)
後)。各主群は4つの亜群を有する。群1にはベヒクルを療法として与える。群
2には,スクランブル弱体化核酸対照を療法として与える。群3には,活性な核
酸(例えばリボザイム)を与え,群4には組換えヒトインターフェロン−a(8
M.U.,SC,1匹あたり,EOD,90日間)を与える。核酸分子は,30
mg/kg,EOD,SCで90日間投与する。1亜群あたり10匹の動物を用
い,用量/応答実験のためには1亜群あたり3用量までを用いる。
【0123】 試験試薬は,ALZET(登録商標)浸透圧ポンプ(Alza Scient
ific Products)により皮下または静脈内に,皮下ボーラスで,直
接腹腔内注入でまたは尾部血管から静脈内に輸送することができる。
【0124】(6)C57/B16マウスにおけるB16黒色腫 (Nishimura et
al.,1985,Clin Exp Metastasis 3,295−
304):これらの実験の主な目的は,インターフェロン−アルファを産生する
身体の能力を増加させ,このことにより免疫応答を増大させて細胞増殖を阻害す
ることを標的とする核酸治療の有効性を評価することである。2つの同系黒色腫
細胞株であるB16/B16およびB16/F10を用いる。
【0125】 実験方法:すべての実験は,病原体を含まない25−30gの雌C57/B1
6マウスで実施する。マウスは病原体を含まない環境下で飼育し,食物および水
を自由に与える。
【0126】 B16/B16:第0日に,動物に,100μlの通常の食塩水中のB16/
B16細胞(5x105)を肩胛骨領域の背部中央の皮下に注入する。原発性腫
瘍体積をマイクロカリパスを用いて測定する。週3日,各腫瘍から3回測定した
長さおよび幅の測定値を得る。腫瘍体積は腫瘍の長さおよび幅の測定値から次の
式にしたがって求める:
【0127】 腫瘍体積=0.5ab2 式中,a=腫瘍の最長軸,b=腫瘍の最短軸 1組の動物(群1)においては,原発性腫瘍を25日まで成長させる。この群
の治療上の終点は原発性腫瘍体積,転移および生存である。第2組の動物(群I
I)においては,B16BL6の腫瘍成長が500mm3に達したとき,原発性
腫瘍を除去する。この群の治療上の終点は転移および生存である。死亡したとき
または第25日(実験の最終日)に肺における転移性成長を観察する。実験の終
了時に,肺を秤量し,25Xの倍率でマクロ転移を計数することにより,肺にお
ける転移を観察する。マクロ転移が存在しない場合には,肺をホルマリン中で潅
流固定し,次に切片を作成してミクロ転移を組織学的に調べ,生存時間を記録す
る。
【0128】 化合物の有効性実験:群IおよびIIについては試験する薬剤1種類あたり4
亜群の動物を用いる。亜群Aには本発明の核酸分子を与える。亜群Bにはスクラ
ンブル弱体化核酸対照を療法として与え,亜群Cにはベヒクルを療法として与え
る。亜群Dは陽性治療対照として働き,組換えヒトTFN−アルファA/D(8
M.U.,SC,1匹あたり,EOD,30日間)を投与する。1群あたり15
匹の動物,および群AおよびBについては1群あたり3用量までの核酸を用いる
。治療は第3日に始め,第25日まで毎日続ける。剖検において,心臓穿刺によ
り血液試料を採取し,遠心分離し,血漿試料をさらなる分析のために−70℃で
保存する。
【0129】 試験薬剤は,ALZET(登録商標)浸透圧ポンプ(Alza Scient
ific Products)を用いて皮下または静脈内に,皮下ボーラスで,
直接腹腔内注入でまたは尾部血管から静脈内に輸送することができる。
【0130】 B16/F10:第0日に,B16/F10(5x104)を100μlの通
常の食塩水中で動物に静脈内注入する。この群の治療上の終点は転移および生存
である。死亡したときまたは第25日(実験の最終日)に肺における転移性成長
を観察する。実験の終了時に,肺を秤量し,マクロ転移を25Xの倍率で計数す
ることにより,肺における転移を観察する。マクロ転移が存在しない場合には,
肺をホルマリン中で潅流固定し,次に切片を作成してミクロ転移について組織学
的に調べ,生存時間を記録する。
【0131】 化合物の有効性実験:試験する薬剤1種類あたり4群の動物を用いる。群1に
は活性な核酸分子(例えばリボザイム)を投与する。群2にはスクランブル弱体
化核酸対照を療法として投与し,群3にはベヒクルを療法として投与する。群4
は正の治療対照として働き,組換えヒトEFN−アルファA/D(8M.U.,
SC,1匹あたり,EOD,30日間)を投与する。1群あたり15匹の動物お
よび群1および2については1群あたり3用量までの核酸分子を用いる。治療は
第3日に開始し,第25日まで毎日続ける。剖検においては,心臓穿刺により血
液試料を採取し,遠心分離し,血漿試料はさらなる分析のために−70℃で保存
する。
【0132】 試験薬剤は,ALZET(登録商標)浸透圧ポンプ(Alza Scient
ific Products)で皮下にまたは静脈内に,皮下ボーラスで,直接
腹腔内注入でまたは尾部血管から静脈内に輸送することができる。
【0133】(7)Balb/cマウスにおける結腸直腸癌腫(COLON−26) (San
ada et al.,1990,Acta Med Okayama 44,
217−222,Ramani et al.,1989,Int J Can
cer43.140−146,1989):これらの実験の主な目的は,インタ
ーフェロン−アルファを産生する身体の能力を増加させ,このことにより,免疫
応答を増強して細胞増殖を阻害することを標的とする核酸治療の有効性を評価す
ることである。この実験は,IFN−アルファのリプレッサーを標的とする核酸
分子が,COLON−26癌腫を有するBalb/cマウスにおいて生存を改善
し転移を減少させる能力を評価する。
【0134】 実験方法:すべての実験は,病原体を含まない18−20gの雌Balb/c
マウスで行う。マウスを病原体を含まない環境で飼育し,食物および水を自由に
与える。第0日において,動物の脾臓被膜に通常の食塩水100μl中のCOL
ON−26細胞(1x106)を注入する。
【0135】 腫瘍細胞移植から第5日に,原発性腫瘍を除去する。治療上の終点は転移およ
び生存である。死亡したときまたは第40日(実験の最終日)に肺および肝臓に
おける転移性成長を観察する。実験の終了時に,臓器を秤量し,マクロ転移を2
5Xの倍率で計数することにより,肺および肝臓における転移を観察する。これ
らの組織にマクロ転移が存在しない場合には,臓器をホルマリン中で潅流固定し
,次に切片を作成してミクロ転移を組織学的に調べ,生存時間を記録する。
【0136】 化合物効力実験:試験する薬剤1種類あたり4群の動物を用いる。群1には,
本発明の活性な核酸分子(例えばリボザイム)を投与し,群2には,スクランブ
ル弱体化核酸対照を療法として投与し,群3にはベヒクルを療法として投与する
。群4は,正の治療対照として働き,組換えヒトIFN−アルファA/D(8M
.LL,SC,1匹あたり,EOD,30日間)を投与する。1群あたり15匹
の動物を用い,群1および2については1群あたり3用量までの核酸分子を用い
る。治療は第3日に開始し,第40日まで毎日続ける。剖検において,心臓穿刺
により血液試料を採取し,遠心分離し,血漿試料はさらなる分析のために−70
℃で保存する。試験薬剤は,ALZET(登録商標)浸透圧ポンプ(Alza
Scientific Products)を用いて,皮下または静脈内に,皮
下ボーラスで,直接腹腔内注入でまたは尾部血管から静脈内に投与することがで
きる。
【0137】実施例 以下は,本発明の酵素的核酸の選択,単離,合成および活性を示す非限定的例
である。以下の実施例は,TR2オーファンレセプター,EAR3/COUP−
TF−1,GATA転写因子,IRF−2,ジェネシス,およびCDPを切断す
るリボザイムの選択を示す。本明細書に記載される方法は,リプレッサー遺伝子
から発現される他のRNA標的を切断するリボザイムを誘導するスキームである
。当業者は,ハンマーヘッド以外のモチーフを有する他のリボザイムも同様にし
て誘導することができ,これらも本発明の範囲内であることを理解するであろう
【0138】実施例1:GATA転写因子2(hGATA−2)における潜在的リボザイム切 断部位の同定 ヒトGATA転写因子2(HUMGATA2A,Genbank 受託番号M
77810(Dorfman et al.,1997,J.Biol.Che
m,267,1279−1285)の配列を,コンピュータ折り畳みアルゴリズ
ムを用いてアクセス可能性についてスクリーニングした。二次折り畳み構造を形
成せず,潜在的ハンマーヘッド切断部位を含むRNAの領域を同定した。これら
の切断部位の配列は表IIIに示される。
【0139】実施例2:ヒトGATA転写因子におけるリボザイム切断部位の選択 コンピュータに基づくRNA折り畳みアルゴリズムにより推定された部位がG
ATA転写因子のアクセス可能部位に対応するか否かを試験するために,70個
のハンマーヘッド部位を分析のために選択した。リボザイム標的部位は,hGA
TA−2(Dorfman,(上掲))のゲノム配列を分析することにより選択
し,折り畳みに基づいて優先順位を付けた。各標的に結合することができるハン
マーヘッドリボザイムを設計し(図1を参照),コンピュータ折り畳みにより個
別に分析して(Christoffersen et al.,1994 J.
Mol.Struc.Theochem,311,273;Jaeger et
al.,1989,Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,
7706),リボザイム配列が適切な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した
。結合アームと触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有するリボザイ
ムは考慮から除外した。以下に示されるように,種々の結合アーム長さを選択し
て活性を最適化することができる。一般に,各アームの少なくとも5塩基が標的
RNAと結合するか,またはこれと相互作用することができる。hGATA−2
を標的とするリボザイムの例が図2に示される。
【0140】実施例3:GATA転写因子2RNAの効率的な切断用のリボザイムの化学合成 および精製 ハンマーヘッドおよび/またはハンマーヘッド様モチーフのリボザイムを,R
NAメッセージ中の種々の部位にアニーリングするよう設計した。結合アームは
上述の標的部位配列に相補的である。リボザイムは化学的に合成した。用いた合
成の方法は,Usman et al.,(1987 J.Am.Chem.S
oc.,109,7845),Scaringe et al.,(1990
Nucleic Acids Res.,18,5433)およびWincot
t et al.,(上掲)に記載される,通常のRNA合成の方法に従い,慣
用の核酸保護基およびカップリング基,例えば5’−末端にジメトキシトリチル
,および3’末端にホスホルアミダイトを用いた。平均段階カップリング収率は
>98%であった。
【0141】 不活性リボザイムは,G5をUで,およびA14をUで置き換えることにより
合成した(番号付けはHertel et al.,1992 Nucleic
Acids Res.,20,3252による)。ヘアピンリボザイムは,2
つの部分で合成し,アニーリングして活性なリボザイムを再構築した(Chow
rira and Burke,1992 Nucleic Acids Re
s.,20,2835−2840)。リボザイムはまた,バクテリオファージT
7RNAポリメラーゼを用いてDNAテンプレートから合成する(Millig
an and Uhlenbeck,1939,Methods Enzymo
l.180,51)。リボザイムは,ヌクレアーゼ耐性基,例えば,2'−アミ
ノ,2'−C−アリル,2'−フルオロ,2'−O−メチル,2'−Hで修飾するこ
とにより,安定性を増強するよう修飾した(総説については,Usman an
d Cedergren,1992 TIBS 17,34を参照)。リボザイ
ムは,一般的方法を用いてゲル電気泳動により精製するか,または高速液体クロ
マトグラフィーにより精製し(HPLC;Wincott et al.,(上
掲)を参照;その全体を本明細書の一部としてここに引用する),水に再懸濁し
た。この実験で用いた化学的に合成したリボザイムの配列は以下の表III−V
Iに示される。
【0142】実施例4:hGATA−2RNA標的のインビトロでのリボザイム切断 ヒトhGATA−2RNAを標的とするリボザイムを,上述のように設計し合
成した。これらのリボザイムは,例えば以下の方法を用いて,インビトロで切断
活性について試験することができる。hGATA−2 mRNA中の標的配列お
よびヌクレオチドの位置は表IIIに示される。
【0143】 切断反応:リボザイム切断アッセイのための,完全長または部分的完全長の,
内部標識した標的RNAは,[α−32P]CTPの存在下でインビトロ転写によ
り調製し,スピンクロマトグラフィーによりG50セファデックスカラムを通し
,さらに精製することなく基質RNAとして用いる。あるいは,T4ポリヌクレ
オチドキナーゼ酵素を用いて基質を5’−32P−末端標識する。アッセイは,リ
ボザイム切断緩衝液(50mM Tris−HCl,pH7.5,37℃,10
mM MgCl2)中で2X濃度の精製リボザイムを予熱することにより実施し
,切断反応は,2Xリボザイムミックスを,やはり切断緩衝液中で予熱した等量
の基質RNA(最大1−5nM)に加えることにより開始した。最初のスクリー
ニングとして,アッセイは,最終濃度40nMまたは1mMのリボザイム,すな
わちリボザイム過剰を用いて37℃で1時間行う。等量の95%ホルムアミド,
20mM EDTA,0.05%ブロモフェノールブルーおよび0.05%キシ
レンシアノールを加えることにより反応を停止し,次に試料を95℃に2分間加
熱し,急冷し,変性ポリアクリルアミドゲルに負荷する。基質RNAおよびリボ
ザイム切断により生成した特異的RNA切断生成物は,ゲルのオートラジオグラ
フィーで可視化する。切断のパーセントは,ホスファーイメージャー(登録商標
)を用いて,無傷の基質と切断生成物を表すバンドを定量することにより決定す
る。
【0144】実施例5:エリスロポエチンのリプレッサーの阻害によるエリスロポエチンの発 現の増加 Epoレベルを上昇させるために,エリスロポエチン遺伝子の転写的リプレッ
サーをリボザイムで標的化した。hGATA−2,TR−2,およびEAR3/
Coup−TF1を標的とするリボザイムを合成した。リボザイムのスクリーニ
ングは,脂質とともに複合体化させ,適当な細胞株に輸送し,Epo産生につい
てモニターすることにより行った。これらのリボザイムが誘導化(CoCl2
より)および非誘導化細胞の両方においてEpo発現を増加させる能力もまた試
験した。エリスロポエチン(Epo)は,低酸素症およびCoCl2に応答して
成人腎臓および胎児肝臓で産生される。2つのヒト肝癌細胞株,HepG2およ
びHep3Bは,低酸素症およびCoCl2に応答した制御されたEpoの発現
を示す。リボザイムを非誘導および誘導条件下で試験して,いずれかまたは両方
の条件下でEpoレベルが増加しうるか否かを判定した。
【0145】 Hep3B細胞を,ウエルあたり1.8x104個の細胞で96ウエルプレー
トに播種した。次にプレート播種の24時間後,リボザイムをカチオン性脂質を
用いて細胞にトランスフェクトした。5または7.5μg/mlのカチオン性脂
質を用いて,2種類の濃度の各リボザイム(100および400nm)を試験し
た。リボザイムおよび無関係対照(IR1&IR2)の配列は表VIIIに示さ
れる。次に,CoCl2(50nM)を含む細胞培養液を適用することにより,
細胞がエリスロポエチンを発現するよう誘導した。24時間後,プレートウエル
から100mlの培地を除去し,ELISAアッセイ用のプレートに加えた。残
りの培地を吸引除去し,細胞を−70℃で凍結し,その後,CYQUANT(登
録商標)アッセイにより製造元のプロトコルを用いてアッセイした。エリスロポ
エチンの定量のためのELISAは,R&D Systems(Minneap
olis,MN)から販売されているQUANTIKINE IVD(登録商標
)キットを用いて,製造元のプロトコルにしたがって行った。データは,多くの
リボザイムがこれらの細胞において,不活性対照と比較して,Epoの上昇した
発現をもたらすことができたことを示した。コバルト誘導ありまたはコバルト誘
導なしについての結果がそれぞれ図4および5に示される。
【0146】実施例6:EPOリプレッサーを標的とするリボザイムを用いる,時間とともに 上昇したエリスロポエチンの発現 Hep3B細胞を実施例5に記載されるように調製した。リボザイム(RPI
No.14260(hGATA−2を標的とする)および144521(EAR
3/COUP−TR1を標的とする;表VIII)を,100nmの濃度で,5
μg/mlのカチオン性脂質を用いて,Hep3B細胞にトランスフェクトした
。これらの細胞におけるEpo発現を,連続輸送については36および48時間
,およびパルス輸送については12,24,および36時間において,実施例5
のELISAアッセイを用いて測定した。データを2つの無関係対照および未処
理対照(Unt)と比較した。リボザイムおよび無関係対照(IR−1およびI
R−2)の配列は表VIIIに示される。リボザイムは,インキュベーション期
間の間連続的に輸送するか,または4時間のみ加え,次に新鮮な培地で置き換え
た(パルス輸送)。データは図6−9に示され,これは,hGATA−2または
EAR3/Coup−TR1を標的とするリボザイムの連続輸送またはパルス輸
送のいずれによっても,Hep3B細胞において,無関係および未処理対象と比
較して,Epoの発現が上昇することを示す。
【0147】診断用途 本発明の核酸分子を診断手段として使用し,疾病に罹患した細胞内の遺伝的浮
動および変異を検査するか,または細胞において特定のRNAの存在を検出する
ことができる。例えば,リボザイム活性と標的RNAの構造との間の密接な関係
により,分子のいずれの領域においても,標的RNAの塩基対形成および3次元
構造を変更する変異を検出することができる。本発明に記載されるリボザイムを
複数使用することにより,インビトロならびに細胞および組織におけるRNAの
構造および機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。リボ
ザイムによる標的RNAの切断を使用して,遺伝子の発現を阻害し,疾病の進行
における特定の遺伝子産物の役割を(本質的に)明らかにすることができる。こ
のようにして,他の遺伝子標的を疾病の重要な介在物として明らかにすることが
できる。本発明のリボザイムの他のインビトロにおける使用は当該技術分野にお
いてよく知られており,これには,関連する状態に関係するmRNAの存在の検
出が含まれる。そのようなRNAは,標準的な方法論を使用してリボザイムで処
理した後,切断産物の存在を判定することにより検出する。
【0148】 特定の例においては,標的RNAの野生型または変異型のみしか切断できない
リボザイムをアッセイに使用する。第1のリボザイムを用いて試料中の野生型R
NAの存在を同定し,第2のリボザイムを用いて試料中の変異型RNAを同定す
る。反応対照として野生型および変異型の両方のRNAの合成基質を両方のリボ
ザイムで切断し,反応におけるリボザイムの相対効率および“非標的”RNA種
を切断しないことを明らかにする。合成基質からの切断産物は,試料集団中の野
生型および変異型RNAの分析のためのサイズマーカーの生成にも役立つ。従っ
てそれぞれの分析は2つのリボザイム,2つの基質,および1つの未知の試料を
必要とし,これらを組み合わせて6つの反応を行う。切断産物の存在をRNas
e・プロテクション・アッセイを使用して確認し,各RNAの完全長および切断
フラグメントをポリアクリルアミドゲルの1レーンで分析できるようにする。標
的細胞における変異体RNAの発現および所望の表現型の変化の推定されるリス
クへの洞察を得るために,必ずしも結果を定量する必要はない。その蛋白質産物
が表現型の発生に関与することが示唆されるmRNAの発現はリスクを確立する
のに十分である。同等の比活性のプローブを両方の転写産物に使用すれば,RN
Aレベルの定性的比較で十分であり,初期の診断のコストが低減する。RNAレ
ベルを定性的に比較するにしても定量的に比較するにしても,より高い変異型と
野生型の比率はより高いリスクと相関関係があるであろう。
【0149】さらなる用途 本発明の配列特異的酵素的核酸分子の潜在的な有用性は,DNA制限エンドヌ
クレアーゼがDNAの研究のために有するもの同様の多くの適用をRNAの研究
のために有する(Nathans et al.,1975 Ann.Rev.
Biochem.44:273)。例えば,制限フラグメントのパターンを使用
して2つの関連するRNA間の配列の関係を確立することができ,大型のRNA
を研究のためにより有用なサイズのフラグメントに特異的に切断できる。リボザ
イムの配列特異性を操作できることは未知の配列のRNAの切断に理想的である
【0150】 本発明の核酸分子はまた,蛋白質の小または大スケール合成に用いることがで
きる。核酸,例えば酵素的核酸およびアンチセンス分子を培養細胞に投与して,
エリスロポエチン,G−CSF,またはインターフェロン−アルファ等の抑制さ
れた蛋白質のインビトロ合成を開始させることができる。該方法は,リプレッサ
ー蛋白質のレベルが減少することにより,細胞における標的蛋白質の発現が促進
されるように,標的蛋白質(抑制された蛋白質)の発現を抑制するリプレッサー
蛋白質の発現をダウンレギュレート(阻害)しうる核酸分子(例えばリボザイム
またはアンチセンス)を細胞と接触させるかまたはこれを細胞中に導入する工程
を含む。次に,当該技術分野において知られる標準的な技術を用いて,標的蛋白
質を細胞から精製する。当業者は,この方法はまた,上述した蛋白質に加えて,
他の抑制された蛋白質の発現を増加させるために用いることもできることを認識
するであろう。
【0151】 核酸を用いるリプレッサー転写因子の発現の阻害はまた,非ヒト生物において
も用いることができる。特に,遺伝子の負の制御が植物において示されている(
Preston et al.,1998,J.Bacteriol.180,
4532−4537)。例えば,植物および真菌は,阻害されたときに,収穫量
の増加,疾病耐性,および所望のアミノ酸,油等の合成の増加のために有益な蛋
白質の発現が増加するであろうリプレッサー転写因子を有するであろう。Lad
ner&Bird,国際公開WO88/06601は,遺伝子を抑制してウイル
スの増殖を阻害することを記載する。この出願人は,細菌,微生物,真菌,ウイ
ルス,および真核生物系,例えば植物または哺乳動物細胞において,リプレッサ
ーの遺伝子発現をダウンレギュレートするために核酸分子を用いることを記載す
る。
【0152】 本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は,本発明の属する技
術分野の技術者のレベルを示す。本明細書において引用されるすべての参考文献
は,それぞれの参考文献が個々にその全体が本明細書の一部としてここに引用さ
れることと同じ程度に,本明細書の一部として引用される。
【0153】 当業者は,本発明が,その目的を実施し,記載される結果および利点,ならび
に本明細書に固有のものを得るためによく適合していることを容易に理解するで
あろう。本明細書に記載される方法および組成物は,現在のところ好ましい態様
の代表的なものであり,例示的なものであって,本発明の範囲を限定することを
意図するものではない。当業者は,特許請求の範囲において定義される本発明の
精神の中に包含される変更および他の用途をなすであろう。
【0154】 当業者は,本発明の範囲および精神から逸脱することなく,本明細書に開示さ
れる本発明に対して種々の置換および改変をなすことが可能であることを容易に
理解するであろう。すなわち,そのような追加の態様は,本発明および特許請求
の範囲の範囲内である。
【0155】 本明細書に例示的に記載されている発明は,本明細書に特定的に開示されてい
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち,例
えば,本明細書における各例において,"・・・を含む","・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は,他の2つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いられる用語および表現は,説明の用語として
用いるものであり,限定ではない。そのような用語および表現の使用においては
,示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図
するものではなく,特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が
可能であることが理解される。すなわち,好ましい態様および任意の特徴により
本発明を特定的に開示してきたが,当業者には本明細書に記載される概念の変更
および変種が可能であり,そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義さ
れる本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【0156】 さらに,発明の特徴および局面がマーカッシュグループまたは他の代替グルー
プの用語で記載されている場合,当業者は,本発明が,マーカッシュグループま
たは他のグループの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載され
ていることを認識するであろう。
【0157】 従って他の態様も本発明および特許請求の範囲の範囲内である。
【0158】表1 天然に存在するリボザイムの特徴グループIイントロン ・サイズ:約150〜1000以上のヌクレオチド。 ・標的配列中の切断部位の5’側に隣接してUを必要とする。 ・切断部位の5’側で4〜6のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム:グアノシンの3’−OHによって攻撃し,3’−OHおよび
5’グアノシンを有する切断産物を生成する。 ・活性構造の折り畳みおよび維持を助けるために,場合により,蛋白質の補因子
をさらに必要とする。 ・このクラスには300以上の種類が知られている。テトラヒメナ・サーモフィ
ラのrRNA,真菌ミトコンドリア,葉緑体,ファージT4,らん藻類,その他
において,介在配列として見出されている。 ・主要な構造上の特徴は,系統発生比較,突然変異原性および生化学的研究によ
ってほぼ確立されている[1,2]。 ・1つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが立証されている[3
,4,5,6]。 ・リボザイムの折り畳みおよび基質ドッキングに関する研究が進行中[7,8,
9]。 ・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている[10,11]。 ・このリボザイムは,結合部位が小さい(4〜6ヌクレオチド)ため,標的RN
A切断に対して非常に非特異的になる場合があるが,テトラヒメナのグループI
イントロンは,「欠損」β−ガラクトシダーゼのメッセージに新たなβ−ガラク
シダーゼ配列を結合することによってこのメッセージを修復するのに利用されて
いる[12]。RNaseP RNA(M1RNA) ・サイズ:約290〜400のヌクレオチド。 ・偏在するリボ核蛋白質酵素のRNA部分。 ・tRNA前駆体を切断し,成熟tRNAを形成する[13]。 ・反応メカニズム:恐らくはM2+−OHによって攻撃し,3’−OHおよび5’
リン酸を有する切断産物を生成する。 ・RNasePは原核生物および真核生物全体に見出されている。このRNAサ
ブユニットは,細菌,酵母,げっ歯類および霊長類から配列決定されている。 ・外部ガイド配列(EGS)と標的RNAのハイブリダイゼーションによって,
内因性RNasePを治療応用に活用することが可能である[14,15]。 ・リン酸と2’OHとの接触の重要性が最近判明した[16,17]。グループIIイントロン ・サイズ:1000以上のヌクレオチド。 ・標的RNAのトランス切断であることが最近実証された[18,19]。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム:内部アデノシンの2’−OHが3’−OH,および3’−5
’および2’−5’分岐点を含む「ラリアット(lariat)」RNAを有す
る切断産物を生成する。 ・RNAの切断および結合に加えて,DNA切断への関与が実証された[20,
21]唯一の天然リボザイムである。 ・主要な構造上の特徴は,系統発生比較によってほぼ確立されている[22]。
・2’OH接触の重要性が判明しはじめている[23]。 ・力学的フレームワークは検討中である[24]。Neurospora VS RNA ・サイズ:約144ヌクレオチド。 ・ヘアピン標的RNAのトランス切断であることが最近実証された[25]。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム:2’−OHが切れやすい結合の5’側を攻撃し,2’,3’
−サイクリックリン酸および5’−OH末端を有する切断産物を生成する。 ・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていない。 ・このクラスは1種しか知られていない。Neurospora VS RNA
に見出されている。ハンマーヘッド・リボザイム (本文を参照のこと) ・サイズ:約13〜40ヌクレオチド。 ・切断部位の5’に隣接した標的配列UHを必要とする。 ・切断部位の両側で可変数のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム:2’−OHによって切れやすい結合の5’側を攻撃し,2’
,3’−サイクリックリン酸および5’−OH末端を有する切断産物を生成する
。 ・このクラスには14種が知られている。RNAを感染体として利用する多くの
植物病原体(ウィルソイド)において見出されている。 ・2つの結晶構造を含め,本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている。[2
6,27] ・(インビトロ選択による工学的処理に対し)ごくわずかなライゲーション活性
が実証された。[28] ・2つまたはそれ以上のリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立
されている。[29] ・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている。[30]ヘアピンリボザイム ・サイズ:約50ヌクレオチド。 ・切断部位の3’に隣接した標的配列GUCを必要とする。 ・切断部位の5’側で4〜6のヌクレオチドと,切断部位の3’側で可変数のヌ
クレオチドと結合する。 ・反応メカニズム:2’−OHによって切れやすい結合の5’側を攻撃し,2’
,3’−サイクリックリン酸および5’−OH末端を有する切断産物を生成する
。 ・このクラスには3種が知られている。RNAを感染体として利用する3種の植
物病原体(タバコ・リングスポット・ウィルス,アラビス・モザイク・ウィルス
およびチコリー黄色斑ウィルスのサテライトRNA)に見出されている。 ・本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている[31,32,33,34]。
・(切断活性に加えて)ライゲーション活性があるためにこのリボザイムはイン
ビトロ選択による工学処理が可能である[35]。 ・1つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている[3
6]。 ・重要な残基の化学修飾検討が着手された[37,38]。デルタ肝炎ウィルス(HDV)リボザイム ・サイズ:約60ヌクレオチド。 ・標的RNAのトランス切断であることが実証されている[39]。 ・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていないが,切断部位の5
’側の配列は要求されない。折りたたまれたリボザイムはシュードノット構造を
含む[41]。 ・反応メカニズム:2’−OHによって切れやすい結合の5’側を攻撃し,2’
,3’−サイクリックリン酸および5’−OH末端を有する切断産物を生成する
。 ・このクラスは2種しか知られていない。ヒトHDVに見出されている。 ・環状のHDVは活性があり,ヌクレアーゼ安定性が増加している[42]。
【0159】
【表1】
【0160】
【表2】
【0161】
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【0162】
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【0251】
【表93】
【0252】
【表94】
【0253】
【表95】
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は,7つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを
示す。
【図2】 図2は,hGATA−2を標的とする,配列番号281に含まれ
る配列を有するハンマーヘッドリボザイムの二次構造の例である。
【図3】 図3は,本発明の核酸分子による作用のメカニズムを示す概略図
である。
【図4】 図4は,コバルト誘導し,GATA転写因子2,TR2オーファ
ンレセプターおよびEAR3/COUP−TR1を標的とするリボザイムを投与
した後に,Hep3B細胞においてエリスロポエチン合成が無関係対照(IR1
およびIR2)と比較して増加することを示すグラフである。
【図5】 図5は,コバルト誘導せずに,GATA転写因子2,TR2オー
ファンレセプターおよびEAR3/COUP−TR1を標的とするリボザイムを
投与した後に,Hep3B細胞においてエリスロポエチン合成が無関係対照(I
R1およびIR2)と比較して増加することを示すグラフである。
【図6】 図6は,hGATA−2転写因子RNAを標的とするリボザイム
の連続輸送後に,Hep3B細胞においてEpo発現が無関係対照と比較して増
加することを示す棒グラフである。
【図7】 図7は,EAR3/Coup−TR1RNAを標的とするリボザ
イムの連続輸送後に,Hep3B細胞においてEpo発現が無関係対照と比較し
て増加することを示す棒グラフである。
【図8】 図8は,hGATA−2転写因子RNAを標的とするリボザイム
のパルス輸送後に,Hep3B細胞においてEpo発現が無関係対照と比較して
増加することを示す棒グラフである。
【図9】 図9は,EAR3/Coup−TR1RNAを標的とするリボザ
イムのパルス輸送後に,Hep3B細胞においてEpo発現が無関係対照と比較
して増加することを示す棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 5/10 C12P 21/02 H C12P 21/02 A61K 31/711 C12R 1:91 C12N 15/00 ZNAA // A61K 31/711 5/00 B (C12N 5/10 A61K 37/02 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:91) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT,AU, AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,C N,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EE ,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR, HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,K P,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU ,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX, NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,S G,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ ,UA,UG,UZ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 パヴコ,パメラ アメリカ合衆国コロラド州80026,ラファ イエット,バーベリー・サークル705 (72)発明者 マクスウィゲン,ジェームズ アメリカ合衆国コロラド州80301,ボウル ダー,フランクリン・ドライブ4866 Fターム(参考) 4B024 AA20 BA21 BA23 BA30 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 HA01 4B064 AG06 AG09 AG18 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA99Y AB01 AC14 BA01 CA24 CA44 4C084 AA07 AA13 DB56 NA14 ZB21 ZC20 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 NA14 ZA36 ZA42 ZA81 ZB26 ZC35 【要約の続き】

Claims (69)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 TR2オーファンレセプターをコードする遺伝子の発現を特 異的に阻害しうる核酸分子。
  2. 【請求項2】 前記核酸分子が酵素的核酸分子である,請求項1記載の核酸
    分子。
  3. 【請求項3】 前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である,請求項1記載
    の核酸分子。
  4. 【請求項4】 前記核酸分子の結合アームが,配列番号4172−4950
    の配列のいずれかに相補的な配列を含む,請求項2記載の核酸分子。
  5. 【請求項5】 核酸分子が配列番号4172−4950の配列のいずれかに
    相補的な配列を含む,請求項3記載の核酸分子。
  6. 【請求項6】 前記核酸分子がハンマーヘッドモチーフのものである,請求
    項2記載の核酸分子。
  7. 【請求項7】 前記核酸分子が,ヘアピン,デルタ肝炎ウイルス,グループ
    Iイントロン,VS核酸またはRNaseP核酸モチーフのものである,請求項
    2記載の核酸分子。
  8. 【請求項8】 前記核酸分子が,TR2オーファンレセプターをコードする
    RNAに相補的な12−100塩基を含む,請求項2または3に記載の核酸分子
  9. 【請求項9】 前記核酸分子が,TR2オーファンレセプターをコードする
    RNAに相補的な14−24塩基を含む,請求項2または3に記載の核酸分子。
  10. 【請求項10】 前記核酸分子が,配列番号3393−4171のいずれか
    の配列を含む,請求項6記載の核酸分子。
  11. 【請求項11】 前記核酸分子が酵素的DNA分子である,請求項2記載の
    核酸分子。
  12. 【請求項12】 前記TR−2オーファンレセプターがTR2−11オーフ
    ァンレセプターである,請求項1記載の核酸分子。
  13. 【請求項13】 前記TR−2オーファンレセプターがTR2−9オーファ
    ンレセプターである,請求項1記載の核酸分子。
  14. 【請求項14】 EAR3/COUP−TF−1をコードする遺伝子の発現
    を特異的に阻害しうる核酸分子。
  15. 【請求項15】 前記核酸分子が酵素的核酸分子である,請求項14記載の
    核酸分子。
  16. 【請求項16】 前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である,請求項14
    記載の核酸分子。
  17. 【請求項17】 前記核酸分子の結合アームが,配列番号5248−554
    4の配列のいずれかに相補的な配列を含む,請求項15記載の核酸分子。
  18. 【請求項18】 核酸分子が,配列番号5248−5544の配列のいずれ
    かに相補的な配列を含む,請求項16記載の核酸分子。
  19. 【請求項19】 前記核酸分子が,ハンマーヘッドモチーフのものである,
    請求項15記載の核酸分子。
  20. 【請求項20】 前記核酸分子が,ヘアピン,デルタ肝炎ウイルス,グルー
    プIイントロン,VS核酸またはRNaseP核酸モチーフのものである,請求
    項15記載の核酸分子。
  21. 【請求項21】 前記核酸分子が,EAR3/COUP−TF−1をコード
    するRNAに相補的な12−100塩基を含む,請求項15または16に記載の
    核酸分子。
  22. 【請求項22】 前記核酸分子が,EAR3/COUP−TF−1をコード
    するRNAに相補的な14−24塩基を含む,請求項15または16に記載の核
    酸分子。
  23. 【請求項23】 前記核酸分子が,配列番号4951−5247の配列のい
    ずれかを含む,請求項19記載の核酸分子。
  24. 【請求項24】 前記核酸分子が酵素的DNA分子である,請求項15記載
    の核酸分子。
  25. 【請求項25】 RNA切断活性を有する核酸分子であって,GATA転写
    因子遺伝子によりコードされるRNAを切断することを特徴とする核酸分子。
  26. 【請求項26】 前記GATA転写因子遺伝子がGATA転写因子2遺伝子
    である,請求項25記載の核酸分子。
  27. 【請求項27】 前記GATA転写因子遺伝子がGATA転写因子3遺伝子
    である,請求項25記載の核酸分子。
  28. 【請求項28】 前記GATA転写因子遺伝子がGATA転写因子4遺伝子
    である,請求項25記載の核酸分子。
  29. 【請求項29】 前記GATA転写因子遺伝子がGATA転写因子6遺伝子
    である,請求項25記載の核酸分子。
  30. 【請求項30】 前記核酸分子が酵素的核酸分子である,請求項25記載の
    核酸分子。
  31. 【請求項31】 前記核酸分子の結合アームが,配列番号1−1696の配
    列のいずれかに相補的な配列を含む,請求項30記載の核酸分子。
  32. 【請求項32】 GATA転写因子遺伝子の発現を特異的に阻害しうるアン
    チセンス核酸分子であって配列番号1−1696の配列のいずれかに相補的な配
    列を含むことを特徴とするアンチセンス核酸分子。
  33. 【請求項33】 前記核酸分子が,ハンマーヘッドモチーフのものである,
    請求項30記載の核酸分子。
  34. 【請求項34】 前記核酸分子が,ヘアピン,デルタ肝炎ウイルス,グルー
    プIイントロン,VS核酸またはRNaseP核酸モチーフのものである,請求
    項30記載の核酸分子。
  35. 【請求項35】 前記核酸分子が,GATA転写因子をコードするRNAに
    相補的な12−100塩基を含む,請求項30または32に記載の核酸分子。
  36. 【請求項36】 前記核酸分子が,GATA転写因子をコードするRNAに
    相補的な14−24塩基を含む,請求項30または32に記載の核酸分子。
  37. 【請求項37】 前記核酸分子が,配列番号1697−3392の配列のい
    ずれかを含む,請求項33記載の核酸分子。
  38. 【請求項38】 前記核酸分子が酵素的DNA分子である,請求項30記載
    の核酸分子。
  39. 【請求項39】 IRF−2をコードする遺伝子の発現を特異的に阻害しう
    る核酸分子。
  40. 【請求項40】 前記核酸分子が酵素的核酸分子である,請求項39記載の
    核酸分子。
  41. 【請求項41】 前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である,請求項39
    記載の核酸分子。
  42. 【請求項42】 前記核酸分子の結合アームが,配列番号5967−638
    8の配列のいずれかに相補的な配列を含む,請求項40記載の核酸分子。
  43. 【請求項43】 核酸分子が,配列番号5967−6388の配列のいずれ
    かに相補的な配列を含む,請求項41記載の核酸分子。
  44. 【請求項44】 前記核酸分子が,ハンマーヘッドモチーフのものである,
    請求項40記載の核酸分子。
  45. 【請求項45】 前記核酸分子が,ヘアピン,デルタ肝炎ウイルス,グルー
    プIイントロン,VS核酸またはRNaseP核酸モチーフのものである,請求
    項40記載の核酸分子。
  46. 【請求項46】 前記核酸分子が,IRF−2をコードするRNAに相補的
    な12−100塩基を含む,請求項40または41に記載の核酸分子。
  47. 【請求項47】 前記核酸分子が,IRF−2をコードするRNAに相補的
    な14−24塩基を含む,請求項40または41に記載の核酸分子。
  48. 【請求項48】 前記核酸分子が,配列番号5545−5966の配列のい
    ずれかを含む,請求項44記載の核酸分子。
  49. 【請求項49】 前記核酸分子が酵素的DNA分子である,請求項40記載
    の核酸分子。
  50. 【請求項50】 CAATT置換蛋白質(CDP)をコードする遺伝子の発
    現を特異的に阻害しうる核酸分子。
  51. 【請求項51】 前記核酸分子が酵素的核酸分子である,請求項50記載の
    核酸分子。
  52. 【請求項52】 前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である,請求項50
    記載の核酸分子。
  53. 【請求項53】 前記核酸分子の結合アームが,配列番号6929−746
    8の配列のいずれかに相補的な配列を含む,請求項51記載の核酸分子。
  54. 【請求項54】 核酸分子が,配列番号6929−7468の配列のいずれ
    かに相補的な配列を含む,請求項52記載の核酸分子。
  55. 【請求項55】 前記核酸分子がハンマーヘッドモチーフのものである,請
    求項51記載の核酸分子。
  56. 【請求項56】 前記核酸分子が,ヘアピン,デルタ肝炎ウイルス,グルー
    プIイントロン,VS核酸またはRNaseP核酸モチーフのものである,請求
    項51記載の核酸分子。
  57. 【請求項57】 前記核酸分子が,CDPをコードするRNAに相補的な1
    2−100塩基を含む,請求項51または52に記載の核酸分子。
  58. 【請求項58】 前記核酸分子が,CDPをコードするRNAに相補的な1
    4−24塩基を含む,請求項51または52に記載の核酸分子。
  59. 【請求項59】 前記核酸分子が,配列番号6389−6928の配列のい
    ずれかを含む,請求項55記載の核酸分子。
  60. 【請求項60】 前記核酸分子が酵素的DNA分子である,請求項51記載
    の核酸分子。
  61. 【請求項61】 請求項1,14,25,32,39,または50のいずれ
    かに記載の核酸分子を含む細胞。
  62. 【請求項62】 前記細胞が哺乳動物細胞である,請求項61記載の細胞。
  63. 【請求項63】 請求項1,14,25,32,39,または50のいずれ
    かに記載の核酸分子をコードする核酸配列を,該核酸分子の発現および/または
    輸送を可能とする様式で含む発現ベクター。
  64. 【請求項64】 エリスロポエチン蛋白質を合成する方法であって,(a)
    細胞を,前記エリスロポエチン蛋白質の合成に適した条件下で,請求項1,14
    ,25または32のいずれかに記載の核酸分子と接触させ;そして(b)エリス
    ロポエチン蛋白質を前記細胞から精製する,の各工程を含む方法。
  65. 【請求項65】 顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)蛋白質を合成する
    方法であって,(a)細胞を,前記G−CSF蛋白質の合成に適した条件下で,
    請求項39記載の核酸分子と接触させ;そして(b)G−CSF蛋白質を前記細
    胞から精製する,の各工程を含む方法。
  66. 【請求項66】 インターフェロンアルファ蛋白質を合成する方法であって
    ,(a)細胞を,前記インターフェロンアルファ蛋白質の合成に適した条件下で
    ,請求項50記載の核酸分子と接触させ;そして(b)インターフェロンアルフ
    ァ蛋白質を前記細胞から精製する,の各工程を含む方法。
  67. 【請求項67】 細胞においてエリスロポエチン蛋白質のレベルを増加させ
    る方法であって,細胞を,前記エリスロポエチン蛋白質のレベルの増加を達成す
    るのに適した条件下で,請求項1,14,25または32のいずれかに記載の核
    酸分子と接触させる工程を含む方法。
  68. 【請求項68】 細胞においてG−CSF蛋白質のレベルを増加させる方法
    であって,細胞を,前記G−CSF蛋白質のレベルの増加を達成するのに適した
    条件下で,請求項39記載の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
  69. 【請求項69】 細胞においてインターフェロンアルファ蛋白質のレベルを
    増加させる方法であって,細胞を,前記インターフェロンアルファ蛋白質のレベ
    ルの増加を達成するのに適した条件下で,請求項50記載の核酸分子と接触させ
    る工程を含む方法。
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