JP2002509721A - 脈管形成応答に関与する分子に関連する疾病または状態の治療のための方法および試薬 - Google Patents

脈管形成応答に関与する分子に関連する疾病または状態の治療のための方法および試薬

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パヴコ，パメラ・エイ
ロバーツ，エリザベス
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リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 アリール炭化水素核運搬体（ＡＲＮＴ），インテグリンサブユニットベータ３（β３），インテグリンサブユニットアルファ６（α６）およびｔｉｅ−２ ＲＮＡからなる群より選択される脈管形成因子をコードするｍＲＮＡの合成，発現および／または安定性を調節する核酸分子。本発明はさらに，核酸分子を用いる，新脈管形成に関連する適応症の治療を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明は，新脈管形成の制御に関与する脈管形成因子およびレセプターの発現
のレベルに関連する疾病または状態の治療のための方法および試薬に関する。
【０００２】 以下は関連する技術の議論であり，これらのいずれも本発明に対する先行技術
であると認めるものではない。
【０００３】 脊椎動物における血管の形成は，２つの胚段階で記述することができる。脈管
形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）として知られる第１段階においては，卵
黄嚢内臓葉の間葉が脈管先祖細胞に，次に血島凝集物に分化する。これは，融合
した内皮先祖により囲まれた原始血液細胞である（血管芽細胞）。これらの血島
は，次に融合して脈管叢を形成し，これは胚に栄養を供給する（Ｍｅｒｅｎｍｉ
ｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ ８，３−１０）。次の脈管発生段階は，新脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅ
ｓｉｓ）として知られる。脈管形成の間に形成された血管から，新たな血管が発
芽し，伸長し，発生して内皮細胞の毛細血管わなが形成される。これは局所的基
底膜の破壊，内皮細胞増殖，移動および微少血管形態発生を伴う非常に複雑な事
象である（Ｒａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕ
ｇｓ ６，３−１８）。脳および腎臓等の臓器は，脈管形成過程により脈管化さ
れる（Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ
Ｄｙｎａｍｉｃｓ ２０３，８０−９２）。
【０００４】 新脈管形成は２つのメカニズム，すなわち脈管発芽および挿入生長により生ず
ることが記載されている。すでに存在する血管の挿入生長は，内皮細胞の増殖の
後に起こり，広い管腔を生成する。細胞外マトリックスの，毛細管を貫く柱また
は杭を用いて，管腔が裂けて２つの血管を形成する（Ｒｉｓａｕ，１９９７，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３８６，Ｅ１７１−６７４）。発芽新脈管形成はまた，すでに存在
する血管に由来し，新規血管発芽，伸長および内皮細胞の毛細血管わな形成への
発生から構成される。これは，細胞外マトリックスの破壊，内皮細胞増殖，走化
性移動および微少血管形態形成が関与する非常に複雑な事象である（Ｒａｋ，（
上掲））。新脈管形成の正および負の調節を制御する多くの因子が報告されてお
り，この過程が複雑であることを示している。
【０００５】 脈管形成因子の例は脈管内皮成長因子レセプター（ＶＥＧＦｒ）であり，これ
は内皮細胞に特異的であることが示されており，Ｐａｖｃｏ ｅｔ ａｌ．，（
国際公開ＷＯ９７／１５６６２）において議論されている。
【０００６】 脈管形成とは異なり，新脈管形成は胚発生において生ずるのみならず，生物の
寿命全体を通して，創傷治癒，骨修復，炎症および雌の月経周期等の事象の間に
生じうる。酸素および栄養の局所輸送および排泄物の除去には，組織の要求の変
化に適応する能力を有する複雑な血管のシステムが必要である。新脈管形成の制
御において多数の正および負の因子が関与していることは，この過程の複雑さを
示している。増加した新脈管形成のためにアップレギュレート因子とダウンレギ
ュレート因子との間のバランスが壊れたときに，疾病状態が生ずることが知られ
ている。
【０００７】 新脈管形成の増加に寄与する多くの因子が同定されており，例えば以下のもの
が挙げられる。
【０００８】 １）ｒｙｌ炭化水素核運搬体（ＡＲＮＴ）：ＡＲＮＴ（ＨＩＦ−１βとしても
知られる）はＨＩＦ−α等のいくつかの因子とヘテロダイマーを形成する（Ｍａ
ｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
． ＵＳＡ ９４，８１０４−８１０９）。ＨＩＦ−αおよびＡＲＮＴが一緒に
複合体化したとき，これらはＨＩＦ−１と称される複合体を形成する。ＨＩＦ−
１は，酸素欠乏に対する応答に関与する制御遺伝子であると考えられている。Ａ
ＲＮＴ−／−胚幹細胞は，低酸素症に応答してＶＥＧＦ発現を誘導することがで
きない。ＡＲＮＴ−／−マウスは，胚の１０．５日以後は生育できない。ＶＥＧ
Ｆノックアウトマウスと同様に，これらの胚は卵黄嚢の新脈管形成の欠陥を示す
（Ｍａｌｔｅｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ ３８６，４０３−
４０７）。
【０００９】 ＨＩＦ−１αとのダイマー形成に機能的欠陥を有する，ＡＲＮＴ変異を含む肝
癌細胞は，正常細胞と比較して，低酸素症に応答したＶＥＧＦ発現が非常に低い
（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１５
１１７−１５１２３）。これらの細胞に由来する腫瘍異種移植片は，減少した血
管分布および約２倍減少した腫瘍成長速度を示す（Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ
．，１９９７，（上掲））。
【００１０】 ２）Ｔｉｅ−２：Ｔｉｅ−２（Ｔｅｋとしても知られる）は，１１２２アミノ
酸から構成され，内皮（Ｍｅｒｅｎｍｉｅ， ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｅｌ
ｌ Ｇｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８，３−１０）ならびに
初期造血細胞（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ ８，１６３１−１６３７）で産生されるチロシンキナーゼ蛋白質レ
セプターである。Ｔｉｅ−２発現は，マウス，ラットおよびヒトにおいて示され
ている。ヒト遺伝子は染色体９ｐ２１に位置すると考えられている（Ｄｕｍｏｎ
ｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４， Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ８，１
８９７−１９０９）。Ｔｉｅ−２ホモ接合変異の内皮細胞が，抗−ＰＥＣＡＭモ
ノクローナル抗体を用いて試験された（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３７６，７０７４）。すべてのホモ接合変異は，１０．５日以内に
死亡し，９．５日までに存在する頭部および心臓に明確な奇形を有する。さらに
，大きな血管が小さな血管から区別されず，脳では毛細血管発芽がみられない。
これらの知見は，Ｔｉｅ−２が脈管形成よりも新脈管形成において重要な役割を
果たすことを示唆する。Ｔｉｅ−１変異と比較したＴｉｅ−２変異の初期の影響
は，２つのＲＴＫが新脈管形成において別々の役割を有することを示す。
【００１１】 Ｔｉｅ−２に対するリガンドが発見されており，アンジオポエチン１および２
（ａｎｇ１および２）と命名されている（Ｄａｖｉｓ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，１
９９３，Ｃｅｌｌ ８７，１１６１；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ． ｅ
ｔ ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，５５−６０）。いずれの因子
も，ＮＨ2−末端コイル−コイルドメインならびにＣＯＯＨ−末端フィブリノー ゲン様ドメインから構成される。Ａｎｇ１は，Ｔｉｅ−２／Ｔｅｋに結合するが
，Ｔｉｅ−１には結合せず，自己リン酸化により新脈管形成を刺激する。Ａｎｇ
２は，４９６アミノ酸のポリペプチドであり，そのヒトおよびマウス相同体は８
５％の同一性を有する。Ａｎｇ１のＴｉｅ−２レセプターへの結合により引き起
こされる自己リン酸化は，Ａｎｇ２を加えることにより遮断することができる。
Ｔｉｅ−２レセプターは，正および負の制御メカニズムの両方を使用する点にお
いて珍しい。
【００１２】 ３）インテグリン：インテグリンは，細胞接着および移動を媒介する蛋白質の
ファミリーであり，少なくとも１５個のアルファおよび８個のベータサブユニッ
トを有し，細胞表面上の非共有結合した多くの異なるヘテロダイマーとして発現
される（Ｖａｒｎｅｒ，１９９７，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇ
ｅｎｅｓｉｓ，ｅｄ．Ｄ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ＆Ｅ．Ｍ．Ｒｏｓｅｎ，３６１−３
９０；Ｂｒｏｏｋｓ，１９９６，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１４，２４２３−
２４２９）。インテグリンサブユニットのそれぞれの組み合わせは，脈管形成能
を有すると考えられており，例えば，α6β1は，毛細管形成に関与すると考えら
れている。さらに，異なるインテグリンは，多くの異なる細胞外マトリックス（
ＥＣＭ）成分，例えばフィブロネクチン，ビトロネクチン，ラミニンおよびコラ
ーゲンへの付着を可能とする（Ｓｔｒｏｍｂｌａｄ＆Ｃｈｅｒｅｓｈ，１９９６
，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３，８８１−８８５）。イ
ンテグリンの産生は，多くの刺激により誘導されることが示されている：例えば
，細胞内ｐＨ増加，カルシウム濃度，イノシトール脂質合成，病巣接触関連チロ
シンキナーゼのチロシンリン酸化，およびｐ３４／ｃｄｃ２およびサイクリンＡ
の活性化（Ｖａｒｎｅｒ＆Ｃｈｅｒｅｓｈ，１９９６，Ｃｕｒｒ Ｏｐ ｉｎ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８，７２４−７３０）。
【００１３】 １６０ｋＤａの蛋白質であるαvβ3は，インテグリンファミリーの中で最もよ
く特性決定された分子であり，新脈管形成において大きな役割を果たしていると
考えられている（Ｖａｒｎｅｒ，１９９７，（上掲））。αvβ3は，すべての既
知のヘテロダイマーの最も多数のＥＣＭ成分に結合し，このことは，細胞表面に
これらの分子を有するすべての細胞が，ほとんどすべてのＥＣＭ成分に接着また
は移動しうるかもしれないことを示す（Ｖａｒｎｅｒ，１９９７，（上掲））。
脈管内皮細胞がその静止状態にあるとき，αvβ3はほとんど発現されないが，新
生物等のいくつかの病理学的状態において高度にアップレギュレートされる。α v β3のアンタゴニストは，トリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデルおよびＳＣＩＤマウス
において新脈管形成を阻害することができ，腫瘍体積を減少させることすらでき
る。αvβ3の抗体を投与したとき，増殖している脈管においてアポトーシスが認
められる。このことから，αvβ3が脈管細胞の生存シグナルを提供し，連続増殖
を可能としていることが示唆される（Ｓｔｒｏｍｂｌａｄ＆Ｃｈｅｒｅｓｈ，１
９９６，（上掲）；Ｖａｒｎｅｒ，１９９７（上掲））。
【００１４】 他の脈管形成標的は，以下の参考文献に含まれ，その特性が定義されている（
これらのすべてを本明細書の一部としてここに引用する）：メチオニンアミノペ
プチダーゼ：（Ａｒｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ ９２，７７１
４−７７１８（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ２９６０７）；Ｓｉｎ，Ｎ．ｅｔ．ａ
ｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ ９４，６０９９−６１０３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．４（６），４６１−４７１）；転
写因子Ｅｔｓ−１：（Ｉｗａｓａｋａ，Ｃ． ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６９，５２２−５３１；Ｃｈｅｎ，Ｚ． ｅｔ ａｌ
．１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７，２０１３−２０１９；Ｈｕｌｔｇａ
ｒｄｈ−Ｎｉｌｓｓｏｎ Ａ， ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．
７８（４），５８９−５９５；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｏｎｃｏ
ｇｅｎｅ Ｒｅｓ．３（３），２３９−２４６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ１４
７９８））；血小板由来内皮細胞成長因子およびそのレセプター（ＰＤ−ＥＣＧ
ＦおよびＰＤ−ＥＣＧＦｒ）：（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，１９
９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５６，６６８；Ｍｏｇｈａｄｄａｍ，Ａ． ｅｔ ａｌ
．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．；Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ
．Ｆ． ｅｔ ａｌ．１９９６，Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８，１４０７；
Ｈｏｓｈｉｎａ，Ｔ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒ ６４，７９−８２；Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ａ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．，１
９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６７，２０３１１−２０３１６；Ｆｉｎｎ
ｉｓ ｅｔ ａｌ．，未発表（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ６３１９３）；トラン
スフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）：（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，
１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２，１２５０；Ｍａｉｏｎｅ，Ｔ．Ｅ． ａｎ
ｄ Ｓｈａｒｐｅ，Ｒ．Ｊ．，１９９０，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．
，１１，４５７−４６１；Ｎｏｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒｓ ４（４），２４７−２５５；Ｓｕｋｕｒａｉ（未発表）（Ｇｅ
ｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ００９３５６）；トランスフォーミング成長因子レセプ
ター：（Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｋ．，１９９６，Ｎｉｐｐｏｎ Ｙａｋｕｒｉｇａ
ｋｕ Ｚａｓｓｈｉ １０７，１３３−１４０；Ｍａｈｏｏｔｉ−Ｂｒｏｏｋｓ
． ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７，１４３６−
１４４６；Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓｉｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｃｅｌｌ
６７（４），７９７−８０５；Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓｉｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．
，１９９１，Ｃｅｌｌ ６７（４），７８５−７９５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号
Ｌ０７５９４）；アンジオゲニン：（Ｆｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４，５４６０−５４８６；Ｂｉｃｋｎｅｌｌ＆Ｖａｌ
ｌｅｅ，１９８８，ＰＭＡＳ ８５，５９６１−５９６５；Ｖａｌｌｅｅ＆Ｒｉ
ｏｒｄａｎ，１９８８，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ ２３４，４１−５
３；Ｓｈａｐｉｒｏ＆Ｖａｌｌｅｅ，１９８７，ＰＮＡＳ ８４，２２３８−２
２４１；Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２５，３５２７−３５３２；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．５４，４５７６−４５７９；Ｋｕｒａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１
９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４，５４９４−５４９９；Ｋｕｒａｃｈ
ｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４（２０），５４
９４−５４９９（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１１５６７））；腫瘍壊死因子レセ
プター：（Ｎａｉｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５，．Ｊ．Ｉｎｆｌａｍｍ
４７，１−７；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ ６
１，３５１−３５９；Ｈｉｍｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，ＤＮＡ Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．９，７０５−７１５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ６３１２１Ｍ
７５８６１）；内皮細胞刺激脈管形成因子（ＥＳＡＦ）：Ｂｒｏｗｎ＆Ｗｅｉｓ
ｓ，１９８８，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ，４７，８８１−８８５）；インタ
ーロイキン−８（ＩＬ−８）：（Ｅｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｍ
Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３９，９７７−９８８；Ｓｔｒｉｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．
，１９９２，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４１，１２７９−１２８４；Ｍｕｋａ
ｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３（４），１３６
６−１３７１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２８１３０））；アンジオポエチン１
：（Ｄａｖｉｓ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｅｌｌ ８７，１１６１；
Ｉｗａｍａ，Ａ． ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９５，３０１；Ｄｕｍｏｎｔ，Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａ
ｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ８，１８９７；Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ． ｅ
ｔ ａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ ３７６，７０；Ｓｕｒｉ，Ｃ． ｅｔ
ａｌ．，１９９６，Ｃｅｌｌ ８７，１１７１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ８３
５０８））；アンジオポエチン２：（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ， ｅｔ ａｌ
．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，５５−６０；Ｈａｎａｈａｎ，１９９
７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７，４８−５０；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００４
３２７（未発表））；インスリン様成長因子（ＩＧＦ１）：（Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ
．Ｓ． ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２９４８
３−２９４８８；Ｇｒａｎｔ ｅｔ．ａｌ．，１９９３，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇ
ｉａ ３６，２８２−２９１；Ｎｉｃｏｓｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｍ
．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５，１０２３−１０２９；Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｈ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７５
，５０７−５１４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５７０２５）；インスリン様成長
因子レセプター（ＩＧＦ−１ｒ）：（Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６
，ＥＭＢＯ Ｊ．５，２５０３−２５１２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０４４３
４Ｍ２４５９９）；Ｂ６１：（Ｐａｎｄｅｙ，Ａ． ｅｔ ａｌ．，１９９５，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，５６７７−５６９；Ｈｏｌｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０，５８３０−５８３８（Ｇｅｎｂ
ａｎｋ受託番号Ｍ５７７３０Ｍ３７４７６）；Ｂ６１レセプター（Ｅｃｋ）：（
Ｐａｎｄｅｙ，Ａ． ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，５６
７−５６９；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ＆Ｈｕｎｔｅｒ，１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．１０（１２），６３１６−６３２４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ５９
３７１，Ｍ３６３９５）；蛋白質キナーゼＣ：（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，
１９８８，Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３，Ｃ３１８−Ｃ３２２；Ｏｉｋａｗ
ａ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４５，１１５５−
１１６０；Ｆｉｎｋｅｎｚｅｌｌｅｒ． ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ．５２，４８２１−４８２３；Ｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．，１９８７，
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２３（１），１３８−１４２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号
Ｘ０６３１８Ｍ２７５４５）；）；ＳＨ２ドメイン（Ｇｕｏ，Ｄ． ｅｔ ａｌ
．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７０，６７２９−６７３３）。
【００１５】 ａ．ホスホリパーゼｃ−ｇ：（Ｇｕｏ，Ｄ．ａｔａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ ２７０，６７２９−６７３３；Ｒｈｅｅ，Ｓ．Ｇ． ｅｔ ａｌ
．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６７，１２３９３−１２３９６；Ｂ
ｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１−９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０
，４７７０−４７７７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３４６６７）） ｂ．ホスファチジルイノシトール３キナーゼ−（ＰＩ−３）：（Ｄｏｗｎｓ，Ｃ
．Ｐ． ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ３，５０
１−５１３；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ２９０９０；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ
４６９７３） ｃ．Ｒａｓ ＧＴＰａｓｅ活性化蛋白質（ＧＡＰ）：（Ｔｒａｈｅｙ，Ｍ． ｅ
ｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，５４２−５４５；Ｇｕｏ，Ｄ
． ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７０，６７２９−６
７３３；Ｔｒａｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，１
６９７−１７００（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２３６１２）） ｄ．オンコジンアダプター蛋白質Ｎｃｋ：（Ｐａｒｋ＆Ｒｈｅｅ，１９９２，Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，５８１６−５８２３；Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９
９０， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（４），１０４８（Ｇｅｎ
ｂａｎｋ受託番号Ｘ１７５７６））；顆粒球コロニー刺激因子：（Ｄｅｖｌｉｎ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４１，３０２−３０
６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１７７０６））；肝実質細胞成長因子．：（Ｍｉ
ｙａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７
（１），１５−２２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５７５７４）；プロリフェリン
：（Ｇｒｏｓｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
１３８（７），２８３５−２８４０；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｄ， ｅｔ ａｌ．，
１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６６（５１９０），１５８１−１５８４；Ｖｏｌ
ｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７（９
）：３８７１−３８７６）；胎盤成長因子：（Ｋｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，１
９９７，Ｅｕｒ Ｊ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ．，１８（６），５０８−
５１０；Ｚｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．７６（
４），５１７−５３１；Ｒｅｌｆ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．５７（５），９６３−９６９；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｙ０９２６８）。
【００１６】発明の概要 本発明は，酵素的核酸分子の使用，および脈管形成因子の発現をダウンレギュ
レートまたは阻害するためにそれらを使用する方法を特徴とする。詳細には，本
発明の酵素的核酸は，新脈管形成に関連する適応症の治療に用いられる。これら
には，癌，年齢関連性黄斑変性（ＡＲＭＤ），糖尿病性網膜症，炎症，関節炎，
乾癬等が含まれるがこれらに限定されない。
【００１７】 好ましい態様においては，本発明は，Ｔｉｅ−２，インテグリンサブユニット
β３，インテグリンサブユニットα６，およびアリール炭化水素核運搬体（ＡＲ
ＮＴ）からなる群より選択される，脈管形成をコードするＲＮＡを切断する酵素
的核酸分子を特徴とする。
【００１８】 "阻害する"とは，切断されたＲＮＡの活性が核酸の非存在下で観察されるより
も減少することを意味する。１つの態様においては，リボザイムによる阻害は，
好ましくは，ｍＲＮＡの同じ部位に結合しうるが，そのＲＮＡを切断することが
できない酵素的に不活性なＲＮＡ分子の存在下で観察されるレベルより低い。
【００１９】 "脈管形成因子"とは，新たな血管の形成に必要な過程または経路に関与するペ
プチド分子を意味する。
【００２０】 別の好ましい態様においては，本発明は，メチオニンアミノペプチダーゼ；Ｅ
ｔｓ−１転写因子；インテグリン；血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧ
Ｆ）；ＰＤ−ＥＣＧＦレセプター；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）
；トランスフォーミング成長因子レセプター；アンジオゲニン；内皮細胞刺激脈
管形成因子（ＥＳＡＦ）；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；アンジオポエチ
ン１および２；ＴＩＥ−１；インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）；インスリン
様成長因子レセプター（ＩＧＦ−１ｒ）；Ｂ６１；Ｂ６１レセプター（Ｅｃｋ）
；蛋白質キナーゼＣ；ＳＨ２ドメイン（例えばホスホリパーゼｃ−ｇ，ホスファ
チ新脈管形成因子ジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ−３），Ｒａｓ ＧＴＰａ
ｓｅ活性化蛋白質（ＧＡＰ）；オンコジンアダプター蛋白質Ｎｃｋ；顆粒球コロ
ニー刺激因子；肝実質細胞成長因子；プロリフェリン；および胎盤成長因子から
なる群より選択される脈管形成因子をコードするＲＮＡを切断する酵素的核酸の
使用を特徴とする。
【００２１】 "酵素的核酸"とは，他の核酸分子の部位特異的切断および／またはライゲーシ
ョン，ペプチドおよびアミド結合の切断，およびトランススプライシングを含む
がこれらに限定されない反応を触媒しうる核酸分子を意味する。そのようなエン
ドヌクレアーゼ活性を有する分子は，基質結合領域において特定の遺伝子標的に
相補性を有し，かつその標的中のＲＮＡまたはＤＮＡを特異的に切断する酵素的
活性を有する。すなわち，エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子は，分子内
でまたは分子間でＲＮＡまたはＤＮＡを切断し，このことにより，標的ＲＮＡま
たはＤＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性は，酵素的ＲＮＡ分子
と標的ＲＮＡまたはＤＮＡとの間に十分なハイブリダイゼーションが生ずるよう
に機能し，切断が生ずることを可能とする。１００％の相補性が好ましいが，５
０−７５％程度の低い相補性も本発明において有用である。核酸は，塩基，糖，
および／またはリン酸基で修飾されていてもよい。酵素的核酸との用語は，リボ
ザイム，触媒ＲＮＡ，酵素的ＲＮＡ，触媒的ＤＮＡ，触媒オリゴヌクレオチド，
ヌクレオザイム，ＤＮＡザイム，ＲＮＡ酵素，エンドリボヌクレアーゼ，エンド
ヌクレアーゼ，ミニザイム，リードザイム，オリゴザイムまたはＤＮＡ酵素等の
用語と互換可能なように用いられる。これらの用語のすべては，酵素的活性を有
する核酸分子を記述する。本明細書に記載される特定の酵素的核酸分子は，限定
することを意味するものではなく，当業者は，本発明の酵素的核酸分子において
重要なすべては，それが１またはそれ以上の標的核酸領域に相補的な特異的な基
質結合部位を有し，かつその基質結合部位の中または周辺に分子に核酸切断活性
を付与するヌクレオチド配列を有することであることを認識するであろう（Ｃｅ
ｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，９８７，０７１；Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，
１９８８，ＪＡＭＡ）。
【００２２】 "酵素的部分"または"触媒ドメイン"とは，核酸基質の切断に必須のリボザイム
の部分／領域を意味する（例えば図１を参照）。
【００２３】 "基質結合アーム"または"基質結合ドメイン"とは，その基質の一部に相補的な
（すなわち，それと塩基対形成しうる）リボザイムの部分／領域を意味する。一
般に，そのような相補性は１００％であるが，所望の場合にはより低くてもよい
。例えば，１４塩基中の１０塩基程度でも塩基対形成しうる。そのようなアーム
は，図１に一般的に示される。すなわち，これらのアームは，リボザイムと標的
ＲＮＡを相補的塩基対形成相互作用により一緒にすることが意図される配列をリ
ボザイム中に含む。本発明のリボザイムは，連続的または非連続的な，種々の長
さの結合アームを有することができる。結合アームの長さは，好ましくは４ヌク
レオチド以上；特に１２−１００ヌクレオチド；より好ましくは１４−２４ヌク
レオチドの長さである。２つの結合アームが選択される場合，その設計は，結合
アームの長さが対称的（すなわち，それぞれの結合アームが同じ長さ，例えば５
ヌクレオチドと５ヌクレオチド，６ヌクレオチドと６ヌクレオチドまたは７ヌク
レオチドと７ヌクレオチドの長さのものである）または非対称的（すなわち，結
合アームが異なる長さ，例えば６ヌクレオチドと３ヌクレオチド；３ヌクレオチ
ドと６ヌクレオチド長；４ヌクレオチドと５ヌクレオチド長；４ヌクレオチドと
６ヌクレオチド長；４ヌクレオチドと７ヌクレオチド長等）である。
【００２４】 ＤＮＡザイムとは，２’−ＯＨ基を欠失している酵素的核酸分子を意味する。
【００２５】 好ましい態様の１つにおいては，酵素的核酸分子はハンマーヘッドまたはヘア
ピンのモチーフで形成されるが，デルタ肝炎ウイルス，グループＩイントロン，
グループＩＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列を伴う
），Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡまたはＤＮＡザイムのモチーフで形成
してもよい。そのようなハンマーヘッドモチーフの例は，Ｄｒｅｙｆｕｓ，（上
掲），Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａ
ｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ８，１８３により；ヘアピンモ
チーフの例は，Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ０３６０２５７，Ｈａｍｐｅ
ｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ，１９８９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８，４９２
９，Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ８２，５３，Ｈ
ａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，４３，
Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１８，２９９により；デルタ肝炎ウイルスモチーフの例は，Ｐｅｒｒｏｔｔａ
ａｎｄ Ｂｅｅｎ，１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，１６により
；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は，Ｇｕｅｒｒｉｅｒ Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ
．，１９８３ Ｃｅｌｌ ３５，８４９；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ａｌｔｍａ
ｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，７８３；Ｌｉ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ
，１９９６， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，８３５により；Ｎ
ｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフの例は，Ｃｏｌｌｉｎｓ
（Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９０ Ｃｅｌｌ ６１，６８
５−６９６；Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９１ Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８，８８２６−８８３０；Ｃｏｌｌ
ｉｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ，１９９３Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，２７
９５−２７９９；Ｇｕｏ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．
１４，３６３）により；グループＩＩイントロンの例は，Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２，７６１；Ｍｉｃｈｅｌｓ ａｎ
ｄ Ｐｙｌｅ，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，２９６５；Ｐｙｌ
ｅ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／２２６８９により；グループＩイントロ
ンの例は，Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，９８７，０７１により；ＤＮ
Ａザイムの例は，Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／１１３０４；
Ｃｈａｒｔｒ ａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＮＡＲ ２３，４０９２；Ｂ
ｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．２，６５５；Ｓａ
ｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ ９４，４２６２により，それ
ぞれ記載されている。これらの特定のモチーフは本発明において限定的なもので
はなく，当業者は，本発明の酵素的核酸分子において重要なすべては，それが標
的遺伝子のＲＮＡ領域の１またはそれ以上に相補的な特異的基質結合部位を有し
，かつその基質結合部位の中または周辺に，分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌ
クレオチド配列を有することであることを認識するであろう（Ｃｅｃｈ ｅｔ
ａｌ．，米国特許４，９８７，０７１）。
【００２６】 Ｔｉｅ−２，インテグリンサブユニットβ３，インテグリンサブユニットα６
，またはＡＲＮＴと"同等な"ＲＮＡとは，Ｔｉｅ−２，インテグリンサブユニッ
トβ３，インテグリンサブユニットα６，またはＡＲＮＴに相同性（部分的また
は完全な）を有するか，またはヒト，齧歯類，霊長類，ウサギおよびブタを含む
種々の動物において，Ｔｉｅ−２，インテグリンサブユニットβ３，インテグリ
ンサブユニットα６またはＡＲＮＴと類似する機能を有する蛋白質をコードする
，天然に生ずるＲＮＡ分子を含むことを意味する。同等なＲＮＡ配列はまた，コ
ーディング領域に加えて，５'−非翻訳領域，３'−非翻訳領域，イントロン，イ
ントロン−エクソンジャンクション等の領域を含む。
【００２７】 "相同性"とは，２またはそれ以上の核酸分子のヌクレオチド配列が，部分的に
または完全に同一であることを意味する。
【００２８】 "相補性"とは，伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的な型（例えば
，フーグスティーン型）の塩基対形成相互作用により，別の核酸配列と水素結合
を形成しうる核酸分子を意味する。
【００２９】 好ましい態様においては，本発明は，所望の標的のＲＮＡに対して高度な特異
性を示す一群の酵素的切断剤を製造する方法を提供する。酵素的核酸分子は，好
ましくは，１つまたはいくつかの酵素的核酸のいずれかにより疾病または状態の
特異的治療が与えられるように，Ｔｉｅ−２，インテグリンサブユニットβ３，
インテグリンサブユニットα６，またはＡＲＮＴ蛋白質をコードする標的ＲＮＡ
の高度に保存された配列領域を標的とする。そのような酵素的核酸分子は，必要
に応じて，特定の細胞に外的に輸送することができる。あるいは，リボザイムは
，特定の細胞に輸送されたＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができる
。
【００３０】 "高度に保存された配列領域"とは，核酸分子中の１またはそれ以上の領域のヌ
クレオチド配列が，１世代から別の世代へ，または１つの生物系から他の系へ，
著しく変化しないことを意味する。
【００３１】 そのようなリボザイムは，癌，糖尿病性網膜症，黄斑変性，新脈管緑内障，近
視性変性，関節炎，乾癬，尋常性ゆうぜい，結節硬化症の血管線維腫，火炎状母
斑，スタージ−ウェーバー症候群，クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群，
オースラー−ウェーバー−ランデュ症候群を含む疾病または状態，および細胞ま
たは組織におけるＴｉｅ−２，インテグリンサブユニットβ３，インテグリンサ
ブユニットα６またはＡＲＮＴ活性のレベルに関連した他の任意の疾病または状
態の予防に有用である。
【００３２】 "関連する"とは，Ｔｉｅ−２，インテグリンサブユニットβ３，インテグリン
サブユニットα６および／またはＡＲＮＴ ＲＮＡの阻害が，したがって，それ
ぞれの蛋白質の活性のレベルの低下が，疾病または状態の症状をある程度軽減す
るであろうことを意味する。
【００３３】 好ましい態様においては，リボザイムは表ＩＩＩ−Ｘの標的配列に相補的な結
合アームを有する。そのようなリボザイムの例もまた，表ＩＩＩ−Ｘに示される
。表ＩＩＩおよびＩＶは，ＡＲＮＴに対する標的配列およびリボザイムを示し，
表ＶおよびＶＩは，Ｔｉｅ−２に対する標的配列およびリボザイムを示し，表Ｖ
ＩＩおよびＶＩＩＩは，インテグリンサブユニットアルファ６に対する標的配列
およびリボザイムを示し，表ＩＸおよびＸは，インテグリンサブユニットベータ
３に対する標的配列およびリボザイムを示す。そのようなリボザイムの例は，本
質的に，これらの表に規定される配列からなる。
【００３４】 "本質的に・・・からなる"とは，活性なリボザイムが，実施例におけるものと
同等の酵素的中心またはコア，および標的部位における切断が生ずるようにｍＲ
ＮＡに結合しうる結合アームを含むことを意味する。そのような切断を妨害しな
い他の配列が存在していてもよい。
【００３５】 すなわち，第１の観点においては，本発明は遺伝子発現および／または細胞増
殖を阻害するリボザイムを特徴とする。これらの化学的または酵素的に合成され
たＲＮＡ分子は，その標的ｍＲＮＡのアクセス可能領域に結合する基質結合ドメ
インを含む。ＲＮＡ分子はまた，ＲＮＡの切断を触媒するドメインを含む。ＲＮ
Ａ分子は，好ましくはハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフのリボザイムであ
る。あるいは，リボザイムはＤＮＡザイムである。リボザイムは，結合した後，
標的ｍＲＮＡを切断して，翻訳および蛋白質蓄積を防止する。標的遺伝子が発現
しないため，細胞増殖が阻害される。化学的に合成したＲＮＡ分子には，化学的
または酵素的ライゲーション法を用いてＲＮＡの種々のフラグメントが一緒に組
み立てられたＲＮＡ分子も含まれる。
【００３６】 好ましい態様においては，リボザイムは直接加えるか，またはカチオン性脂質
とともに複合体化するか，リポソーム中に封入するか，または他の方法により標
的細胞に輸送される。核酸または核酸複合体は，エクスビボで，またはインビボ
で，注射，注入ポンプまたはステントにより，バイオポリマー中に取り込むか取
り込まずに，関連する組織に局所的に投与することができる。別の好ましい態様
においては，リボザイムは，適当なリポソームベヒクル中で，Ｔｉｅ−２，イン
テグリンサブユニットβ３，インテグリンサブユニットα６，またはＡＲＮＴを
発現する部位（例えば腫瘍細胞，内皮細胞）に投与される。
【００３７】 本発明の別の観点においては，標的分子を切断し，Ｔｉｅ−２，インテグリン
サブユニットβ３，インテグリンサブユニットα６またはＡＲＮＴ活性を阻害す
るリボザイムは，ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから
発現される。組換えベクターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベ
クターである。リボザイム発現ウイルスベクターは，アデノ関連ウイルス，レト
ロウイルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築すること
ができるが，これらに限定されない。好ましくは，リボザイムを発現しうる組換
えベクターは，上述のように輸送され，標的細胞中に残留する。あるいは，リボ
ザイムの過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることができる。そのよう
なベクターは，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現され
たら，リボザイムは標的ＲＮＡを切断する。リボザイム発現ベクターの輸送は，
例えば静脈内または筋肉内投与により全身的に，または患者から外植された標的
細胞に投与した後，患者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への
導入を可能とする他の任意の手段により，行うことができる（総説については，
Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，ＴＩＧ．，１２，
５１０を参照）。本発明の別の観点においては，標的分子を切断し細胞増殖を阻
害するリボザイムは，ＤＮＡ，ＲＮＡ，またはウイルスベクター中に挿入された
転写ユニットから発現される。好ましくは，リボザイムを発現しうる組換えベク
ターを上述のように局所的に輸送し，平滑筋細胞中に過渡的に残留させる。しか
し，この目的のために，ＲＮＡの発現を指示する他の哺乳動物細胞ベクターを用
いてもよい。
【００３８】 "患者"とは，外植した細胞のドナーまたはレシピエントである生物，または細
胞それ自体を意味する。"患者"とはまた，酵素的核酸分子を投与することができ
る生物を表す。好ましくは，患者は哺乳動物または哺乳動物細胞である。より好
ましくは，患者はヒトまたはヒト細胞である。
【００３９】 "ベクター"とは，所望の核酸を輸送するために用いられる任意の核酸系および
／またはウイルス系技術を意味する。
【００４０】 これらのリボザイムは，個々に，または組み合わせて，または他の薬剤と一緒
に，上述の疾病または状態を治療するために用いることができる。例えば，当業
者には明らかなように，Ｔｉｅ−２，インテグリンサブユニットβ３，インテグ
リンサブユニットα６，またはＡＲＮＴに関連する疾病または状態を治療するた
めに，患者を処置することができ，または他の適当な細胞を処理することができ
る。
【００４１】 さらに別の態様においては，本明細書に記載されるリボザイムは，上述した状
態または疾病を治療するために，他の既知の治療剤と組み合わせて用いることが
できる。例えば，記載されるリボザイムを，１またはそれ以上の既知の治療剤と
組み合わせて，癌を治療するために用いることができる。
【００４２】 好ましい態様においては，リボザイムは，表において配列番号３９４−７８６
，８４９−９１０，１６１２−２３１２，２３８１−２４４８，３５８８−４７
２６，４８２１−４９１４，５７０２−６４８８，および６５６９−６６４８と
して示される配列に相補的な結合アームを有する。そのようなリボザイムの例は
，配列番号１−３９３，７８７−８４８，９１１−１６１１，２３１３−２３８
０，２４４９−３５８７，４７２７−４８２０．４９１５−５７０１，および６
４８９−６５６８として示される。そのような切断を妨害しない他の配列が存在
していてもよい。
【００４３】 本発明の他の特徴および利点は，以下の好ましい態様の説明および特許請求の
範囲から明らかであろう。
【００４４】好ましい態様の説明 図面 図１は，７つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを示す。矢印は
切断の部位を示す。−−−−−−−−−は標的配列を示す。点が散在する線は，
三次相互作用を示す。−は塩基対形成相互作用を示す。グループＩイントロン：
Ｐ１−Ｐ９．０は種々のステム−ループ構造を表す（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，
１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏ．，１，２７３）。ＲＮａｓｅ
Ｐ（ＭｌＲＮＡ）ＥＧＳは外部ガイド配列を表す（Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ
．１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，７８３；Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９
９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，３５８７）。グループＩＩイントロ
ン：５'ＳＳは５'スプライシング部位を意味する；３’ＳＳは３’−スプライシ
ング部位を意味する；ＩＢＳはイントロン結合部位を意味する；ＥＢＳはエクソ
ン結合部位を意味する（Ｐｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，３３，２７１６）。ＶＳ ＲＮＡ：Ｉ−ＶＩは，６つのステム−ルー
プ構造を示す；陰領域は三次相互作用を示す（Ｃｏｌｌｉｎｓ，国際公開ＷＯ９
６／１９５７７）。ＨＤＶリボザイム：Ｉ−ＩＶは４つのステム−ループ構造を
示す（Ｂｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６２５，０４７）。ハンマーヘッ
ドリボザイム：Ｉ−ＩＩＩは，３つのステム−ループ構造を示す；ステムＩ−Ｉ
ＩＩは，任意の長さであってもよく，対称でも非対称でもよい（Ｕｓｍａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．，１，５２７
）。ヘアピンリボザイム：ヘリックス１，４および５は任意の長さでありうる；
ヘリックス２は３−８塩基対の長さである；Ｙはピリミジンである；ヘリックス
２（Ｈ２）は少なくとも４塩基対で与えられ（すなわち，ｎは１，２，３または
４），ヘリックス５は任意に２塩基またはそれ以上の長さでありうる（好ましく
は３−２０塩基，すなわち，ｍは１−２０またはそれ以上）。ヘリックス２およ
びヘリックス５は，１またはそれ以上の塩基により共有結合していてもよい（す
なわち，ｒは１塩基以上）。ヘリックス１，４または５はまた，リボザイム構造
を安定化するために，２塩基対またはそれ以上長くてもよく（すなわち４−２０
塩基対），好ましくは蛋白質結合部位である。それぞれの例において，各Ｎおよ
びＮ'は，独立して，任意の正常または修飾塩基であり，各ダッシュは潜在的塩 基対相互作用を表す。これらのヌクレオチドは，糖，塩基またはリン酸で修飾さ
れていてもよい。ヘリックス中では完全な塩基対形成は必要ではないが，好まし
い。ヘリックス１および４は，ある程度の塩基対形成が保持される限り，任意の
サイズでありうる（すなわち，ｏおよびｐは，それぞれ独立して，０から任意の
数，例えば２０である）。必須塩基は，構造中に特定の塩基として示されるが，
当業者は，１またはそれ以上が化学的に修飾（脱塩基，塩基，糖および／または
リン酸修飾）されていてもよく，または著しい影響なしで他の塩基で置き換えら
れていてもよいことを認識するであろう。ヘリックス４は，２つの別々の分子か
ら，すなわち接続ループなしで形成してもよい。接続ループは，存在する場合，
その塩基，糖またはリン酸に修飾を有するかまたは有しないリボヌクレオチドで
ある。ｑは２塩基以上である。接続ループはまた，非ヌクレオチドリンカー分子
で置き換えられていてもよい。Ｈは塩基Ａ，Ｕ，またはＣを表す。Ｙはピリミジ
ン塩基を表す。"＿＿"は，共有結合を表す（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９
６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，１２９；Ｃｈｏ
ｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６３１，３５９）。
【００４５】 図２はＴｉｅ−２の１０３７位を標的とするハンマーヘッドリボザイムの図式
的描写である。
【００４６】酵素的核酸分子 これまでに，天然に生ずる酵素的ＲＮＡの７つの基本的変種が知られている。
さらに，いくつかのインビトロ選択（進化）戦略（Ｏｒｇｅｌ，１９７９，Ｐｒ
ｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ２０５，４３５）を用いて，ホスホジエス
テル結合の切断およびライゲーションを触媒しうる新たな核酸触媒が発展してき
た（Ｊｏｙｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３−８７；Ｂｅａｕｄｒｙ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ
，１９９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６７，９０−９７；
Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＴＩＢＴＥＣＨ １２，２６８；Ｂ
ａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１
４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ １７，８９−９３；Ｋｕｍａｒ
ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ
，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｓａｎｔｏｒｏ
ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４，
４２６２；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＲＮＡ ３，９１４；Ｎａｋａ
ｍａｙｅ＆Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９４，（上掲）；Ｌｏｎｇ＆Ｕｈｌｅｎｂｅ
ｃｋ，１９９４，（上掲）；Ｉｓｈｉｚａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，（上
掲）；Ｖａｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６
，６４９５；（これらのすべてを本明細書の一部としてここに引用する）。それ
ぞれは，生理学的条件下で，ホスホジエステル結合をトランスで加水分解するこ
とを含む一連の反応を触媒することができる（したがって，他のＲＮＡ分子を切
断しうる）。表Ｉは，これらのリボザイムのいくつかの特性をまとめたものであ
る。一般に，酵素的核酸は，最初に標的ＲＮＡに結合することにより作用する。
そのような結合は，標的ＲＮＡを切断する作用をする分子の酵素的部分に近接し
て保持された，酵素的核酸の標的結合部分により生ずる。すなわち，酵素的核酸
は，まず標的ＲＮＡを認識し，次に相補的塩基対形成によりこれに結合し，いっ
たん正しい部位に結合したら，酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのよ
うな標的ＲＮＡの戦略的切断は，コードされる蛋白質の合成を指示するその能力
を破壊するであろう。酵素的核酸は，そのＲＮＡ標的を結合し切断した後，その
ＲＮＡから離れて別の標的を探し，新たな標的に繰り返し結合して切断すること
ができる。
【００４７】 リボザイムの酵素的性質は，治療を行うのに必要なリボザイムの濃度が低いた
め，他の技術より有利である。この利点は，リボザイムが酵素的に作用する能力
を反映している。すなわち，１つのリボザイム分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切
断することができる。さらに，リボザイムは，高度に特異的な阻害剤であり，そ
の阻害の特異性は，標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成メカニズムのみならず，標
的ＲＮＡ切断のメカニズムにも依存する。切断の部位の近くにおける１つのミス
マッチまたは塩基置換を選択して，リボザイムの触媒活性を完全に排除すること
ができる。
【００４８】 エンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸分子は，ヌクレオチド塩基配列に特
異的な様式で他の別のＲＮＡ分子を繰り返し切断することができる。そのような
酵素的核酸分子は，事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができ，イ
ンビトロで有効な切断を達成することができる（Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，３２
４，Ｎａｔｕｒｅ ４２９ １９８６；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８７ Ｎａｔ
ｕｒｅ ３２８，５９６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，８４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ３７８８，１９８７；Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８
，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，６，９２；Ｈａｓｅ
ｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，３３４ Ｎａｔｕｒｅ ５８５，１９８８
；Ｃｅｃｈ，２６０ ＪＡＭＡ ３０３０，１９８８；Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅ
ｔ ａｌ．，１７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３７１
，１９８９；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７（上掲））。
【００４９】 その配列特異性のため，トランス切断リボザイムは，ヒトの疾病の治療剤とし
て有望である（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５ Ａｎｎ．Ｒｅｐ．
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ ａ
ｎｄ Ｍａｒｒ，１９９５ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７
）。リボザイムは，細胞性ＲＮＡのバックグラウンド中で特定のＲＮＡ標的を切
断するよう設計することができる。そのような切断事象は，ＲＮＡを非機能性に
し，そのＲＮＡからの蛋白質発現を排除する。このようにして，疾病状態に関連
する蛋白質の合成が選択的に阻害される。
【００５０】 Ｔｉｅ−２，インテグリンサブユニットβ３，インテグリンサブユニットα６
およびアリール炭化水素核運搬体（ＡＲＮＴ）のｍＲＮＡの特定の部位を切断す
るリボザイムは，癌，黄斑変性，糖尿病性網膜症，炎症，乾癬および他の疾病を
治療するための新規治療方法である。本出願人は，リボザイムが，Ｔｉｅ−２；
インテグリンサブユニットβ３；インテグリンサブユニットα６；およびアリー
ル炭化水素核運搬体（ＡＲＮＴ）の活性を阻害しうること，およびリボザイムの
触媒活性がその阻害効果に必要であることを示す。当業者は，記載される実施例
から，Ｔｉｅ−２，インテグリンサブユニットβ３，インテグリンサブユニット
α６，およびアリール炭化水素核運搬体（ＡＲＮＴ）ｍＲＮＡを切断する他のリ
ボザイムを容易に設計することができ，これらも本発明の範囲内であることが明
らかであることを理解するであろう。
【００５１】標的部位 有用なリボザイムの標的は，以下の開示にしたがって決定することができる（
Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ
ａｌ．，ＷＯ９３／２３０５７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９４
／０：２５９５；Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９５／０４８１８；ＭｃＳ
ｗｉｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，５２５，４６８（これらのすべてを
本明細書の一部としてここに引用する））。ここでは，これらの文献に与えられ
るガイダンスを繰り返さず，以下にそのような方法の特定の例を提供するが，こ
れらは当業者を限定するものではない。そのような標的に対するリボザイムを，
これらの出願に記載されるように設計し，これもまた記載されるようにインビト
ロおよびインビボで試験すべく合成した。そのようなリボザイムはまた，本明細
書に記載されるように最適化し，輸送することができる。
【００５２】 コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いて，ヒトＴｉｅ−２，インテグリン
サブユニットβ３，インテグリンサブユニットα６，およびアリール炭化水素核
運搬体（ＡＲＮＴ）のｍＲＮＡの配列を，最適リボザイム標的部位についてスク
リーニングした。ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイム切断部位を同定した
。これらの部位は表ＩＩＩ−Ｘに示される（表中，すべての配列は５’から３' 方向である）。表中，ヌクレオチド塩基の位置は，指示されたタイプのリボザイ
ムにより切断されるべき位置として示される。なお，表中の略号は次の意味を有
する：ｐｏｓｉｔｉｏｎ＝位置，Ｒｚ＝リボザイム，ｓｕｂｓｔｒａｔｅ＝基質
。
【００５３】 ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイムは，結合しうるように設計し，コン
ピュータ折り畳みにより別々に分析して（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８
９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８６，７７０６），
リボザイム配列が適当な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した。結合アーム
と触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは，考慮か
ら除外した。活性を最適化するために，種々の結合アーム長を選択することがで
きる。一般に，各アーム上の少なくとも５塩基が，標的ＲＮＡに結合することが
できるか，さもなくばそれと相互作用することができる。ハンマーヘッドまたは
ヘアピンモチーフのリボザイムをｍＲＮＡメッセージの種々の部位にアニーリン
グするように設計した。標的部位配列に相補的な結合アームは上述のとおりであ
る。
【００５４】リボザイム合成 １００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は，自動化方法を用いては困難
であり，そのような分子の治療的コストは非常に高くなる。本発明においては，
小さい核酸モチーフ（例えば，アンチセンスオリゴヌクレオチド，ハンマーヘッ
ドまたはヘアピンリボザイム）が外的輸送に用いられる。これらの分子は構造が
簡単であるため，核酸がｍＲＮＡ構造の標的領域に進入する能力が高い。しかし
，これらの核酸分子はまた，細胞中で真核生物プロモーターから発現させること
もできる（例えば，Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ ａｎｄ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，
１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３，３９９；
Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎ
ｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅ
ｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ，６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９
１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９
９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９，１０８０２，
６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４７，１２２２−１．２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９
９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９）。当業者は，真
核生物細胞中で適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから任意の核酸を発現させること
ができることを理解するであろう。そのような核酸の活性は，リボザイムによっ
てそれらを一次転写産物から放出させることにより増大させることができる（Ｄ
ｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９，Ｓｕｌｌｉｖａｎ
ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５（いずれもその全体を本明細書
の一部としてここに引用する）；Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ
ｅｔ ａｌ．，１９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５
１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．
，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５８５６）。
【００５５】 リボザイムは化学的に合成した。用いた合成の方法は，通常のＲＮＡ合成の方
法（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１
０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１
９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）に
したがい，慣用の核酸保護基およびカップリング基，例えば，５'末端にジメト キシトリチル，および３'−末端にホスホルアミダイトを用いた。非限定的例に おいては，３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で
，改変した２．５μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて，アルキルシリル保護
ヌクレオチドについては５分間のカップリング工程を，２'−Ｏ−メチル化ヌク レオチドについては２．５分間のカップリング工程を行い，小スケールの合成を
行った。表ＩＩは，合成サイクルにおいて用いた試薬の量および接触時間の概要
を示す。各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５'−ヒドロキシルに 対して６．５倍過剰（１６３μＬの０．１Ｍ＝１６．３μｍｏｌ）のホスホルア
ミダイトおよび２４倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（２３８μＬの０．２５Ｍ
＝５９．５μｍｏｌ）を用いた。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量
により決定して，９７．５−９９％であった。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下の
とおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中２％ＴＣＡ（ＡＢＩ）；キャ
ッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中
１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）；酸化溶液は，１６．９ｍ
Ｍ Ｉ2，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった 。Ｂ＆Ｊ合成等級アセトニトリルは，試薬瓶から直接用いた。Ｓ−エチルテトラ
ゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成した
。
【００５６】 ＲＮＡの脱保護は以下のように実施した。ポリマー結合オリゴリボヌクレオチ
ド（トリチルオフ）を合成カラムから４ｍＬガラスねじ蓋バイアルに移し，メチ
ルアミン（ＭＡ）の溶液中に６５℃で１０分間懸濁した。−２０℃に冷却した後
，上清をポリマー支持体から除去した。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣ
Ｎ：Ｈ2Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清 に加えた。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を
得た。
【００５７】 塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ・ＨＦ／ＮＭＰ溶液（２５０
μL溶液，１．５ｍＬ Ｎ−メチルピロリジノン，７５０μL ＴＥＡおよび１．
０ｍＬ ＴＥＡ・３ＨＦから１．４Ｍ ＨＦ濃度を得る）に再懸濁し，６５℃に
１．５時間加熱した。得られた完全に脱保護したオリゴマーを，５０ｍＭ ＴＥ
ＡＢ（９ｍＬ）で急冷し，次にアニオン交換脱塩に供した。
【００５８】 脱保護オリゴマーのアニオン交換脱塩のためには，５０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０
ｍＬ）であらかじめ洗浄したＱｉａｇｅｎ５００（登録商標）アニオン交換カー
トリッジ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）にＴＥＡＢ溶液を負荷した。負荷したカー
トリッジを５０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）で洗浄した後，２Ｍ ＴＥＡＢ（１
０ｍＬ）でＲＮＡを溶出し，乾燥して白色粉末とした。
【００５９】 Ｇ５をＵで，およびＡ１４をＵで置換することにより，不活性なハンマーヘッ
ドリボザイムを合成した（番号付けは，Ｈｅｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ
．，１９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，３２５２によ
る）。
【００６０】 平均段階カップリング収率は，＞９８％（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１
９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）で
あった。
【００６１】 ヘアピンリボザイムは，２つの部分で合成し，アニーリングして活性なリボザ
イムを再構築する（Ｃｈｏｗｒｉｒａ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ，１９９２ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，２８３５−２８４０）。リボザイムは
また，バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレート
から合成することができる（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，
１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。
【００６２】 リボザイムは，ヌクレアーゼ耐性基，例えば２’−アミノ，２'−Ｃ−アリル ，２'フルオロ，２'−Ｏ−メチル，２'−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾で修飾する ことにより，安定性を増強および／または触媒活性を増強するように修飾するこ
とができる（総説として，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２
ＴＩＢＳ１７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ，Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６，１４０９０を参照）。
【００６３】 リボザイムは，一般的方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，
国際公開ＷＯ９５／２３２２５（そのすべてを本明細書の一部としてここに引用
する）を参照）により精製し，水に再懸濁した。
【００６４】 本研究において有用な，化学的に合成したリボザイムの配列は，表ＩＩＩ−Ｘ
に示される。当業者は，これらの配列が，リボザイムの酵素的部分（結合アーム
以外のすべて）が活性に影響するように変更されているはるかに多くのそのよう
な配列の代表にすぎないことを認識するであろう。例えば，ハンマーヘッドリボ
ザイムのステム−ループＩＩ配列は，最低２塩基対のステム構造が形成しうる限
り，任意の配列を含むように変更（置換，欠失，および／または挿入）すること
ができる。同様に，ヘアピンリボザイムのステム−ループＩＶ配列は，最低２塩
基対のステム構造が形成しうる限り，任意の配列を含むように変更（置換，欠失
，および／または挿入）することができる。好ましくは，これらの位置には２０
０塩基以上は挿入しない。表ＩＩＩ−Ｘに挙げられる配列は，リボヌクレオチド
または他のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドとして形成することができる。そ
のようなリボザイム（酵素的活性を有する）は，表に示される特定のリボザイム
と同等である。
【００６５】リボザイム活性の最適化 本発明に記載されるリボザイムの触媒活性は，Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，
（上掲）に記載のように最適化することができる。詳細はここでは繰り返さない
が，例えば，リボザイム結合アームの長さの変更，または血清リボヌクレアーゼ
による分解を防ぎ，および／またはその酵素的活性を増強する修飾（塩基，糖お
よび／またはリン酸）を有するリボザイムの化学的合成が挙げられる（例えば，
Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａ
ｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅ
ｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ
ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５
１８７；Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏ
ａｔ，米国特許５，３３４，７１１；およびＢｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，（上
掲）を参照；これらはすべて酵素的ＲＮＡ分子の塩基，リン酸および／または糖
成分になしうる種々の化学修飾を記載する）。細胞中におけるその抗力を増強す
る修飾，およびＲＮＡ合成時間を短縮し化学物質の必要性を減少するためにステ
ムループ構造から塩基を除去することが望ましい（これらの刊行物のすべてを本
明細書の一部としてここに引用する）。
【００６６】 当該技術分野には，触媒活性に有意に影響することなくそのヌクレアーゼ安定
性および効力を有意に増強することができる，酵素的核酸分子に導入することが
できる糖，塩基およびリン酸修飾を記述するいくつかの例がある。リボザイムは
，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２'−フル オロ，２’−Ｏ−メチル，２'−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾で修飾することによ り，安定性を高め，および／または触媒活性を増強するために修飾する（総説に
ついては，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ ＴＩＴＢＳ
１７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１４０９０を参照）。酵素的核酸分子の糖
修飾は，当該技術分野において広く記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ
ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａ
ｔｕｒｅ １９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅ
ｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１
７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９３／１５１８７
；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２を参照，こ
れらの参考文献はすべて，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）。
このような文献は，触媒活性を阻害することなく，糖，塩基および／またはリン
酸修飾等をリボザイム中に組み込む位置を決定する一般的方法および戦略を記載
しており，本明細書の一部としてここに引用する。これらの教示に基づいて，同
様の修飾を本明細書に記載されるように用いて，本発明の核酸触媒を修飾するこ
とができる。
【００６７】 酵素的活性を維持または増強する化学的修飾を有する核酸触媒が提供される。
そのような核酸はまた，一般に，非修飾核酸よりヌクレアーゼに対して耐性が高
い。すなわち，細胞においておよび／またはインビボで，活性は有意に低下しな
いであろう。本明細書に例示されるように，そのようなリボザイムは，たとえ全
体的活性が１０倍低下しても，細胞においておよび／またはインビボで有用であ
る（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５
，１４０９０）。そのようなリボザイムは，本明細書において，全ＲＮＡリボザ
イムの酵素的活性を"維持する"と称される。
【００６８】 外的に輸送された治療用リボザイムは，最適には，望ましくない蛋白質のレベ
ルが低下するのに十分長い間標的ＲＮＡの翻訳が阻害されるまで，細胞中で安定
でなければならない。この期間は，疾病の状態により，数時間から数日まで様々
であろう。明らかに，リボザイムは，有効な細胞内治療剤として機能するために
は，ヌクレアーゼに耐性でなければならない。ＲＮＡの化学合成の改良（Ｗｉｎ
ｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２
３，２６７７；本明細書の一部としてここに引用する）は，ヌクレオチド修飾を
導入して，上述のように，そのヌクレアーゼ安定性を増強することにより，リボ
ザイムを修飾する能力を拡大した。
【００６９】 本明細書において用いる場合，"ヌクレオチド"とは，当該技術分野において認
識されているように，天然の塩基（標準），および当該技術分野において欲知ら
れる修飾塩基を含む。そのような塩基は，一般に糖成分の１’位に位置する。ヌ
クレオチドは一般に，塩基，糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは，糖，リ
ン酸および／または塩基成分において修飾されていてもされていなくてもよい（
また，ヌクレオチド類似体，修飾ヌクレオチド，非天然ヌクレオチド，非標準ヌ
クレオチド等として，互換的に称される，例えば，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳ
ｗｉｇｇｅｎ，（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２
／０７０６５；Ｕｓｍａｎｅｔ：ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；（す
べて本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。当該技術分野において知
られるいくつかの修飾核酸塩基の例があり，最近概要がまとめられている（Ｌｉ
ｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
２２，２１８３）。その触媒活性に有意に影響を与えることなく酵素的核酸中に
導入しうる塩基修飾の非限定的例としては，イノシン，プリン，ピリジン−４−
オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメ
トキシベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフ
ェニル，５−アルキルシチジン（例えば，５−メチルシチジン），５−アルキル
ウリジン（例えば，リボチミジン），５−ハロウリジン（例えば，５−ブロモウ
リジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば６−
メチルウリジン）およびその他のもの（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６
，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）が挙げられる。この観点にお
いて，"修飾塩基"とは，１’位に存在するアデニン，グアニン，シトシンおよび
ウラシル以外のヌクレオチド塩基，またはその同等物を意味する。そのような塩
基は，酵素の触媒コア中でおよび／または基質結合領域中で用いることができる
。
【００７０】 "非修飾ヌクレオシド"とは，ｂ−Ｄ−リボ−フラノースの１'炭素に結合した ，アデニン，シトシン，グアニン，ウラシルのいずれかの塩基を意味する。
【００７１】 "修飾ヌクレオシド"とは，非修飾ヌクレオチド塩基，糖および／またはリン酸
の化学構造中に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を意味する。
【００７２】 リボザイム構造に対する種々の修飾を作成して，リボザイムの有用性を高める
ことができる。そのような修飾は，貯蔵寿命，インビトロでの半減期，安定性，
およびそのようなリボザイムの標的部位への導入の容易性を増強して，例えば，
細胞膜への浸透を高め，および標的細胞の認識およびそれへの結合の能力を付与
するであろう。
【００７３】リボザイムの投与 Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５は，酵素性
ＲＮＡ分子を輸送するための一般的な方法を記載する。リボザイムは当業者に知
られる種々の方法によって細胞に投与することができ，これにはリポソームへの
封入，イオントホレシス，または他のベヒクル，例えば，ヒドロゲル，シクロデ
キストリン，生分解性ナノカプセル，および生体接着性小球体への組み込みが含
まれるが，これらに制限されない。ある適応症に対しては，リボザイムをエクス
ビボで，上記ビヒクルを用いてまたは用いずに，細胞または組織に直接輸送する
ことができる。あるいは，ＲＮＡ／ビヒクルの組み合わせを，直接注入により，
またはカテーテル，注入ポンプもしくはステントを用いることにより局所的に輸
送する。他の輸送経路には，静脈内，筋肉内，皮下または関節注射，エアロゾル
吸入，経口（錠剤またはピル形態），局所，全身，眼，腹腔内および／またはく
も膜下腔内輸送が含まれるが，これらに限定されない。リボザイムの輸送および
投与のより詳細な説明はＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）およびＤｒ
ａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９に提供されており，こ
れらを本明細書の一部としてここに引用する．。
【００７４】 本発明の分子は医薬として用いることができる。医薬は患者の疾病状態を予防
し，発症を阻害し，またはそれを治療する（症状をある程度，好ましくは全ての
症状を緩和する）。
【００７５】 本発明の負に荷電したポリヌクレオチド（例えば，ＲＮＡ，ＤＮＡまたは蛋白
質）は，医薬組成物を形成するために安定化剤，緩衝剤等を用いて，または用い
ることなく，任意の標準的手段により患者に投与および導入することができる。
リポソーム輸送メカニズムを用いることが望ましい場合，リポソームの形成のた
めの標準的プロトコルに従うことができる。本発明の組成物はまた，経口投与用
の錠剤，カプセルまたはエリキシル；直腸投与用の座剤；無菌溶液；注射投与用
の懸濁液等として，処方して用いることもできる。
【００７６】 本発明はまた，記載される化合物の薬学的に許容しうる処方を含む。これらの
処方には，上述の化合物の塩，例えば，酸付加塩（例えば，塩酸，シュウ酸，酢
酸およびベンゼンスルホン酸の塩）が含まれる。
【００７７】 医薬組成物または処方は，細胞または患者への投与（例えば全身投与），好ま
しくはヒトへの投与に適当な形態の組成物または処方を表す。適当な形態は，部
分的には，使用する投与経路（例えば経口，経皮，または注射）に依存する。そ
のような形態は，組成物または処方が標的細胞（すなわち，負に荷電したポリマ
ーが輸送されることが望まれる細胞）に到達することを妨害してはならない。例
えば，血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子は
当該技術分野において知られており，例えば，毒性，および組成物または処方が
その効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。
【００７８】 "全身投与"とは，インビボでの全身吸収，または血流中における薬剤の蓄積の
後に全身に分配されることを意味する。全身的吸収をもたらす投与経路には，静
脈内，皮下，腹腔内，吸入，経口，肺内および筋肉内が含まれるが，これらに限
定されない。これらの投与経路のそれぞれは，所望の負に荷電したポリマー（例
えば核酸）をアクセス可能な疾病組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は，
分子量またはサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリ
ポソームまたは他の薬剤担体を使用することにより，薬剤を，例えば，あるタイ
プの組織（例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織）に配置することができる。薬剤
と細胞（例えば白血球およびマクロファージ）の表面との会合を容易にすること
ができるリポソーム処方もまた有用である。この方法は，マクロファージおよび
白血球による異常な細胞（例えば癌細胞）の免疫認識の特異性を利用することに
より，薬剤の標的細胞への輸送を増強するであろう。
【００７９】 本発明はまた，ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ−修飾，または長期
間循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む，表面修飾リポソームを含
む組成物の使用を特徴とする。これらの処方は，標的組織における薬剤の蓄積を
増加させる方法を提供する。この種類の薬剤担体は，単核食細胞システム（ＭＰ
ＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および排除に抵抗性であり，したがって
，封入された薬剤の血流循環時間を長くし，組織への暴露を増強する（Ｌａｓｉ
ｃ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉ
ｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，
４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームは，おそらくは脈管新生標
的組織における溢出および捕獲のため，腫瘍中に選択的に蓄積することが示され
ている（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６７，１２
７５−１２７６；Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期間循環リポソームは，特に，
ＭＰＳの組織で蓄積することが知られている慣用のカチオン性リポソームと比べ
て，ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態学および薬力学を増強する（Ｌｉｕ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；
Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ
ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，国
際公開ＷＯ９６／１０３９２；これらをすべて本明細書の一部としてここに引用
する）。長期間循環リポソームはまた，代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織（例えば肝
臓および脾臓）における蓄積を回避する能力に基づいて，カチオン性リポソーム
と比較して，ヌクレアーゼ分解から薬剤をより高い程度で保護するであろう。こ
れらの参考文献はすべて本明細書の一部としてここに引用する。
【００８０】 本発明はまた，薬学的に有効量の所望の化合物を薬学的に許容しうる担体また
は希釈剤中に含む，保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用
いるための許容しうる担体または希釈剤は，医薬の技術分野においてよく知られ
ており，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ ｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａ
ｒｏｅｄｉｔ．１９８５）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載され
ている。例えば，保存剤，安定剤，染料，および風味剤を用いることができる（
同上，１４４９）。これらには，安息香酸ナトリウム，ソルビン酸，およびｐ−
ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに，抗酸化剤および懸濁剤を用
いてもよい（同上）。
【００８１】 薬学的に有効な用量とは，疾病状態の予防，発症の阻害または治療（症状をあ
る程度緩和し，好ましくはすべての症状を緩和する）に必要な用量である。薬学
的に有効な用量は，疾病の種類，用いる組成物，投与の経路，治療する哺乳動物
の種類，考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性，同時投与される薬剤，および
医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に，負に
荷電したポリマーの効力に依存して，０．１ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ体重
／日の活性成分を投与する。
【００８２】 あるいは，本発明の酵素的核酸分子は，細胞中で真核生物プロモーターから発
現させることができる（例えば，Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１
９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ ａｎｄ Ｌｉｎｄ
ｑｕｉｓｔ，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８
３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａ
ｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２
，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６
６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９，１０８０２−６；Ｃｈ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０
，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，
１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５；すべての参考文献は，その全
体を本明細書の一部としてここに引用する））。当業者は，真核生物細胞中で任
意の核酸を適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができることを認
識するであろう。そのような核酸の活性は，それらをリボザイムにより一次転写
産物から放出させることにより増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ
ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ＣＴ ＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５１
２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，
１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５８５６；すべての参考文献は
その全体を本明細書の一部としてここに引用する）。
【００８３】 本発明の別の観点においては，標的分子を切断する酵素的核酸分子は，ＤＮＡ
またはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される（例えばＣｏ
ｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。組換
えベクターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。リ
ボザイムを発現するウイルスベクターは，アデノ関連ウイルス，レトロウイルス
，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができるが
，これらに限定されない。好ましくは，リボザイムを発現しうる組換えベクター
は，上述のように輸送され，標的細胞中に残留する。あるいは，リボザイムの過
渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクター
は，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，リボ
ザイムは標的ＲＮＡを切断する。活性なリボザイムは，実施例に記載されるもの
と同等の酵素的中心またはコア，および標的部位における切断が生ずるように標
的核酸分子に結合しうる結合アームを含む。そのような切断を妨害しない他の配
列が存在していてもよい。リボザイムを発現するベクターの輸送は，全身的（例
えば，静脈内または筋肉内投与により），患者から外植された標的細胞に投与し
た後，患者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能と
する他のいずれかの手段により行うことができる（総説については，Ｃｏｕｔｕ
ｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。
【００８４】 本発明の１つの観点においては，本発明の核酸触媒の少なくとも１つをコード
する核酸配列を含む発現ベクターが開示される。本発明の核酸触媒をコードする
核酸配列は，その核酸分子の発現を可能とする様式で動作可能なように連結され
ている。
【００８５】 本発明の別の観点においては，発現ベクターは，転写開始領域（例えば真核生
物ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核
生物ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの終止領域）；ｃ）本発明の核酸触媒の少な
くとも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現およ
び／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域および前記終止領域に動作可
能なように連結されている。ベクターは，任意に，本発明の核酸触媒をコードす
る遺伝子の５'側または３’側に動作可能なように連結された蛋白質のオープン リーディングフレーム（ＯＲＦ）；および／またはイントロン（介在配列）を含
んでいてもよい。
【００８６】 リボザイム配列の転写は，真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ），Ｒ
ＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ），またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐ
ｏｌ ＩＩＩ）のプロモーターにより推進される。ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ
ＩＩＩプロモーターからの転写産物は，すべての細胞において高いレベルで発現
されるであろう。所定の細胞タイプ中における所定のｐｏｌ ＩＩプロモーター
のレベルは，近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー，サイレンサー等）
の性質に依存するであろう。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞中で
発現される限り，原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた用いられる（
Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａ
ｎｇ １９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７
２；Ｌｉｅｂｅｒｅｔ．ａｌ．，１９９３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．
，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。何人かの研究者が，そのようなプロモ
ーターから発現したリボザイムが哺乳動物細胞中で機能しうることを示している
（例えば，Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１
９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８９，１０８０
２−６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，９０，６３４０−４；Ｌ'Ｈｕｉｌｌｉ ｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚ
ｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１
９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎ
ｇｅｒ＆Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より詳細
には，転写ユニット，例えばＵ６小核（ｓｎＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）
およびアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものは，細胞
中において高濃度の所望のＲＮＡ分子（例えばリボザイム）を生成するのに有用
である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）；Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ
Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ
．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏ
ｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，１６２４，８０３；Ｇｏｏｄ ｅｔ
ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４，４５；Ｂｅｉｃｒｅｌｍａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６１１８７３６；（これらのすべての刊行物を本明
細書の一部としてここに引用する）。上述のリボザイム転写ユニットは，哺乳動
物細胞中に導入するために種々のベクター中に組み込むことができる。ベクター
としては，プラスミドＤＮＡベクター，ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノ
ウイルスまたはアデノ関連ウイルスベクター），またはウイルスＲＮＡベクター
（例えばレトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）が挙げられるが，こ
れらに限定されない（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈ
ｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）を参照）。
【００８７】 本発明のさらに別の観点は，本発明の触媒的核酸分子の少なくとも１つをコー
ドする核酸配列を，その核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクターを
特徴とする。１つの態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）
転写終止領域；ｃ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み；
前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前
記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。別の好まし
い態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ
）オープンリーディングフレーム；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコード
する遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３'− 末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現お
よび／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記オープンリーディン
グフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。さらに別の
態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）
イントロン；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み；前
記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記
開始領域，前記イントロンおよび前記終止領域に動作可能なように連結されてい
る。別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領
域；ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；ｅ）前記核酸分子の
少なくとも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーデ
ィングフレームの３'−末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は ，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，
前記イントロン，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作
可能なように連結されている。
【００８８】実施例 以下は，本発明の酵素的核酸の選択，同定，合成および活性を示す非限定的例
である。
【００８９】 以下の実施例は，Ｔｉｅ−２，インテグリンサブユニットβ３，インテグリン
サブユニットα６，およびアリール炭化水素核運搬体（ＡＲＮＴ）を切断するリ
ボザイムの選択を記載する。本明細書に記載される方法は，新脈管形成に必要な
他のＲＮＡ標的を切断するリボザイムを誘導することができるスキームである。
また，そのようなリボザイムをどのようにして細胞に輸送するかの記載も提供さ
れる。実施例は，リボザイムが，輸送された後に培養物中で細胞増殖を阻害し，
インビボで遺伝子発現を調節することを示す。さらに，触媒的に不活性な変異リ
ボザイムを細胞に適用したとき，有意に低下した阻害が観察される。すなわち，
阻害にはリボザイムの触媒活性が必要である。
【００９０】実施例１：ＴＩＥ−２中の潜在的リボザイム切断部位の同定 ヒトＴｉｅ−２の配列を，コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いて，アク
セス可能部位についてスクリーニングした。二次折り畳み構造を形成せず，潜在
的ハンマーヘッドおよび／またはヘアピンリボザイム切断部位を含むｍＲＮＡの
領域を同定した。これらの切断部位の配列は，表Ｖ−ＶＩに示される。
【００９１】実施例２：ヒトＴＩＥ−２ＲＮＡ中のリボザイム切断部位の選択 コンピュータに基づくＲＮＡ折り畳みアルゴリズムにより推定された部位が，
Ｔｉｅ−２ ＲＮＡ中のアクセス可能部位に対応するか否かを試験するため，２
０個のハンマーヘッド部位を選択して分析した。リボザイム標的部位は，Ｔｉｅ
−２のゲノム配列（Ｚｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ ８（３），６６３−６７０（Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＨＵＭＴＥＫＲＰＴＫ，受
託番号：Ｍ６９２３８）を分析し，折り畳みに基づいて部位に優先順位をつける
ことにより選択した。ハンマーヘッドリボザイムを各標的（図１を参照）に結合
しうるように設計し，コンピュータ折り畳みにより別々に分析して（Ｃｈｒｉｓ
ｔｏｆｆｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｔｈｅ
ｏｃｈｅｍ，３１１，２７３；Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８６，７７０６），リボザイム
配列が適切な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した。結合アームと触媒コア
との間に望ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは考慮から除外した。
以下に記載するように，結合アームの長さを変化させることにより活性を最適化
した。一般に，各アーム上の少なくとも５塩基が，標的ＲＮＡと結合しうるか，
さもなくばそれと相互作用することができる。Ｔｉｅ−２を標的とするリボザイ
ムの例は図２に示される。
【００９２】実施例３：ＴＩＥ−２ ＲＮＡの効率的な切断のためのリボザイムの化学合成お よび精製 ハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフのリボザイムを，ＲＮＡメッセージの
種々の部位にアニーリングするよう設計した。結合アームは，上述した標的部位
配列に相補的である。リボザイムは化学的に合成した。用いた合成方法は，通常
のＲＮＡ合成の方法に従い（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７ Ｊ．Ａｍ
．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５），Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．
，（１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３）；Ｗ
ｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（上掲）），慣用的な核酸保護基およびカップリ
ング基，例えば５’末端にジメトキシトリチル，および３’−末端にホスホルア
ミダイトを用いた。平均段階カップリング収率は＞９８％であった。
【００９３】 Ｇ５をＵで，Ａ１４をＵで置換することにより不活性リボザイムを合成した（
番号付けはＨｅｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．，２０，３２５２に従う）。ヘアピンリボザイムは，２つの部分で
合成し，アニーリングして活性リボザイムを再構築した（Ｃｈｏｗｒｉｒａ ａ
ｎｄ Ｂｕｒｋｅ，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，
２８３５−２８４０）。リボザイムはまた，バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリ
メラーゼを用いてＤＮＡテンプレートから合成した（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ａｎｄ
Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９３９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，
５１）。リボザイムは，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２'−アミノ，２'−Ｃ−
アリル，２'−フルオロ，２'−Ｏ−メチル，２'−Ｈで修飾することにより，安 定性を増強するよう修飾した（総説については，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅ
ｒｇｒｅｎ，１９９２ ＴＩＢＳ １７，３４を参照）。リボザイムは，一般的
方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィ
ーにより精製し（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照；
その全体を本明細書の一部としてここに引用する），水に再懸濁した。この研究
で用いた化学的に合成したリボザイムの配列は以下の表Ｖ−ＶＩに示される。
【００９４】実施例４：インビトロでのＴＩＥ−２ＲＮＡ標的のリボザイム切断 ヒトＴｉｅ−２ ＲＮＡを標的とするリボザイムを設計し，上述のように合成
する。これらのリボザイムは，例えば以下の方法を用いてインビトロで切断活性
を試験することができる。Ｔｉｅ−２ ｍＲＮＡ中の標的配列およびヌクレオチ
ドの位置は表Ｖに示される。
【００９５】 切断反応：リボザイム切断アッセイのための，完全長または部分的完全長の，
内部標識された標的ＲＮＡを，［ａ−32ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写に
より調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム
を通し，さらに精製することなく基質ＲＮＡとして用いる。あるいは，Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて基質を５’−32Ｐ−末端標識してもよい。ア
ッセイは，リボザイム切断緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，
３７℃，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2）中で２Ｘ濃度の精製リボザイムを予熱すること により実施し，切断反応は，２Ｘリボザイムミックスを，やはり切断緩衝液中で
予熱した等量の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ）に加えることにより開始した。最
初のスクリーニングとして，アッセイは，最終濃度４０ｎＭまたは１ｍＭのリボ
ザイム，すなわちリボザイム過剰を用いて３７℃で１時間行う。等量の９５％ホ
ルムアミド，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０
．０５％キシレンシアノールを加えることにより反応を停止し，次に試料を９５
℃に２分間加熱し，急冷し，変性ポリアクリルアミドゲルに負荷した。基質ＲＮ
Ａおよびリボザイム切断により生成した特異的ＲＮＡ切断生成物は，ゲルのオー
トラジオグラフィーで可視化した。切断のパーセントは，ホスファーイメージャ
ー（登録商標）を用いて，無傷の基質と切断生成物を表すバンドを定量すること
により決定した。
【００９６】ＴＩＥ−２を標的とするリボザイムの使用 腫瘍成長の速度は，供給される血液の関数であり，したがって新脈管形成の関
数であると考えられている（Ｒａｋ，（上掲）；Ｂｌｏｏｄ＆Ｚｅｔｔｅｒ，１
９９０，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １０３
２，８９−１１８）。これらの脈管形成因子の多く，例えばＴｉｅ−２；インテ
グリンサブユニットβ３；インテグリンサブユニットα６；およびアリール炭化
水素核運搬体の上昇したレベルが多くの癌で報告されている。すなわち，これら
の脈管形成因子の発現の阻害（例えばリボザイムを用いる阻害）は，これらの腫
瘍の成長の速度を減少させる可能性がある。リボザイムは，その高度に特異的な
阻害および副作用が生ずる可能性が低いため，その使用は，化学療法化合物（例
えばドキソルビシン）による化学療法等の治療法より望ましい。触媒活性および
高い部位特異性を有するリボザイムは（上述を参照），癌の治療用の強力かつ安
全な治療用分子でありそうである。腫瘍新脈管形成および他の適応症は以下に議
論される。
【００９７】適応症 １）腫瘍新脈管形成：新脈管形成は，腫瘍が成長して病理学的サイズになるのに
必要であることが示されている（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９７１，ＰＭＡＳ ７６，
５２１７−５２２１；Ｗｅｌｌｓｔｅｉｎ＆Ｃｚｕｂａｙｋｏ，１９９６，Ｂｒ
ｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ３８，１０９
−１１９）。さらに，これは，腫瘍細胞が転移の間に循環系を通じて移動するこ
とを可能とする。多くの脈管形成因子（例えば脈管内皮成長因子（ＶＥＧＦ））
の遺伝子発現のレベルの増加が，脈管形成された浮腫関連脳腫瘍において報告さ
れている（Ｂｅｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｊ．Ｃｌｉｎｉ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．９１，１５３）。ＶＥＧＦの腫瘍新脈管形成における役割のより直接的
な証明は，Ｊｉｍ Ｋｉｍら（１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６２，８４１）によ
り行われた。ここでは，ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体を用いて，ヌード
マウスにおいて横紋筋肉腫，神経膠芽細胞腫多形細胞の増殖を阻害することに成
功した。同様に，ｆｌｔ−１ ＶＥＧＦレセプターの優性負変異型の発現は，ヌ
ードマウス中でヒト神経膠芽細胞により誘導される脈管形成を阻害する（Ｍｉｌ
ｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６７，５７６）。
【００９８】 ２）眼疾病：新脈管形成は，眼疾病を引き起こすかまたは悪化させることが示さ
れている。これらには，黄斑変性，脈管新生緑内障，糖尿病性網膜症，近視性変
性およびトラコーマが含まれるが，これらに限定されない（Ｎｏｒｒｂｙ，１９
９７，ＡＰＭＩＳ １０５，１１１７−４３７）。Ａｉｅｌｌｏら（１９９４
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１，１４８０）は，糖尿病性網膜症および
他の網膜疾患を患う大部分の患者の眼液体が，高濃度のＶＥＧＦを含むことを示
している。Ｍｉｌｌｅｒら（１９９４ Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５，５７
４）は，網膜虚血を患う患者において，ＶＥＧＦ ｍＲＮＡのレベルが上昇して
いることを報告している。これらの知見は，眼疾病におけるＶＥＧＦの直接的な
役割を裏付ける。ＶＥＧＦ合成を刺激する因子等の他の因子もまた，これらの適
応症に寄与しているかもしれない。
【００９９】 ３）皮膚疾患：新脈管形成に依存性であるかもしれない多くの適応症が同定され
ており，これらには，乾癬，尋常性ゆうぜい，結節硬化症の血管線維腫，火炎状
母斑，スタージ−ウェーバー症候群，クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群
およびオースラー−ウェーバー−ランデュ症候群（Ｎｏｒｒｂｙ，（上掲））が
含まれるが，これらに限定されない。脈管形成因子ｂ−ＦＧＦの皮下注射は，ヌ
ードマウスにおいて新脈管形成を示した（Ｗｅｃｋｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．
，１９９２，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｋｅｙ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ−Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｅｄ Ｒ．Ｓｔｅｉｎ
ｅｒ）。Ｄｅｔｍａｒら（１９９４ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，１１４１）
は，ＶＥＧＦおよびそのレセプターが乾癬の皮膚および乾癬の皮膚微少血管にお
いて過剰発現していることを報告しており，ＶＥＧＦが乾癬において有意な役割
を有することを示唆する。
【０１００】 ４）慢性関節リウマチ：慢性関節リウマチを患う患者の関節からの組織の免疫組
織化学およびインサイチオハイブリダイゼーション研究は，ＶＥＧＦおよびその
レセプターのレベルが増加していることを示す（Ｆａｖａ ｅｔ ａｌ．，１９
９４ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，３４１）。さらに，Ｋｏｃｈら（１９９４
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，４１４９）は，ＶＥＧＦ−特異的抗体が慢性関
節リウマチを患う患者からの滑液組織の有糸分裂促進活性を有意に減少させうる
ことを見いだした。これらの知見は，ＶＥＧＦの慢性関節リウマチにおける直接
的な役割を裏付ける。本発明のものを含む脈管形成因子もまた関節炎に関与して
いるかもしれない。
【０１０１】動物モデル ＡＲＮＴ ＲＮＡに対する本発明の核酸（例えばリボザイム）の抗新脈管形成
効果を試験することができるいくつかの動物モデルが存在する。典型的には，ラ
ットおよびウサギにおける新脈管形成の研究には角膜モデルが用いられてきた。
この通常は無血管である組織においては，血管の補充を容易に追跡することがで
きるためである（Ｐａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
６８：５６７−５６９）。これらのモデルにおいては，脈管形成化合物で前処理
した小さいテフロンまたはハイドロン（Ｈｙｄｒｏｎ）のディスクを角膜中に外
科的に形成したポケット中に挿入する。新脈管形成は，３から５日後に監視する
。ＡＲＮＴ，Ｔｉｅ−２またはインテグリンサブユニットＲＮＡに対するリボザ
イムを，同様にディスク中で輸送するか，または実験の経過期間にわたって眼に
滴下する。他の眼のモデルにおいては，低酸素症がＶＥＧＦの増加した発現およ
び網膜における新脈管形成の両方を引き起こすことが示されている（Ｐｉｅｒｃ
ｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ．９２：９０５−９０９；Ｓｈｗｅｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２３５−２２４３）。
【０１０２】 新脈管形成を扱う他の動物モデルにはマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）が含ま
れ，これは皮下に注入したときに固体ゲルになる基底膜の抽出物である（Ｐａｓ
ｓａｎｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６７：５１９
−５２８）。マトリゲルに脈管形成因子を補充すると，血管は３から５日間かけ
てマトリゲル中に成長し，新脈管形成を評価することができる。この場合も，Ａ
ＲＮＴ，Ｔｉｅ−２またはインテグリンサブユニットＲＮＡに対するリボザイム
をマトリゲル中に輸送することができる。
【０１０３】 抗脈管形成剤のスクリーニングのためのいくつかの動物モデルが存在する。こ
れらには，角膜創傷後の角膜血管形成（Ｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８５
Ｃｏｒｎｅａ ４：３５−４１；Ｌｅｐｒｉ， ｅｔ ａｌ．，１９９４Ｊ．Ｏ
ｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０：２７３２８０；Ｏｒｍｅｒｏｄ ｅｔ
ａｌ．，１９９０ Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３７：１２４３−１２５２）
または角膜内増殖因子移植（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｄｉａｂｅ
ｔｏｌｏｇｉａ ３６：２８２−２９１；Ｐａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ．１９９５
（上掲）；Ｚｉｅｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６７
：７１１−７１５），成長因子を含むマトリゲルマトリックス内への血管の成長
（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２（上掲）），ホルモン操作後の
雌生殖器新脈管形成（Ｓｈｗｅｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．９１：２２３５−２２４３），高度に脈管化した固形腫瘍における
腫瘍成長の阻害を含むいくつかのモデル（Ｏ'Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１ ９９４Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８；Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９
３ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓ．Ｒｅｖ．１２：３０３−３２４；Ｔａ
ｋａｈａｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：４２３
３−４２３７；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３（上掲）），およびマウス網膜
における過渡的低酸素症誘導性新脈管形成（Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９
９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ．９２：９０５−９０
９）が含まれる。
【０１０４】 Ｐａｎｄｅｙら（上掲）により記載された角膜モデルは，最も一般的かつよく
特徴づけられた抗脈管形成剤の効力スクリーニングモデルである。このモデルは
無血管組織を含み，刺激剤（増殖因子，熱またはアルカリ火傷，エンドトキシン
）によりこの組織内に血管が補充される。角膜モデルは脈管形成化合物−ハイド
ロン溶液に浸漬したテフロンペレットの間質内角膜移植を利用して，ペレットに
向けて血管を補充させ，これを標準的な顕微鏡および画像分析技術により定量す
ることができる。その抗脈管形成効力を評価するために，リボザイムを眼に局所
的に適用するか，またはテフロンペレットそれ自体の上のハイドロン中に結合さ
せる。この無血管角膜ならびにマトリゲル（下記を参照）は，低いバックグラウ
ンドのアッセイを提供する。角膜モデルはウサギで広範に実施されてきたが，ラ
ットでの研究もまた行われてきた。
【０１０５】 マウスモデル（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，（上掲））は，マトリゲ
ル，すなわち基底膜の抽出物（Ｋｌｅｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）ま
たはミリポア（登録商標）フィルターディスクを用いる非組織モデルであり，こ
れを注入前に液体形態の成長因子および抗脈管形成剤に浸漬することができる。
体温で皮下投与すると，マトリゲルまたはミリポア（登録商標）フィルターディ
スクは固体移植片を形成する。マトリゲルまたはミリポア（登録商標）フィルタ
ーディスク内に埋め込まれた脈管形成化合物を用いて，マトリゲルまたはミリポ
ア（登録商標）フィルターディスクのマトリックス中で血管を補充させ，これを
内皮細胞特異的ｖＷＦ（第ＶＩＩＩ因子抗原）について組織学的に，免疫組織化
学的に，トリクローム−マッソン染色で，またはヘモグロビン含量について処理
する。角膜と同様に，マトリゲルまたはミリポア（登録商標）フィルターディス
クは無血管であるが，これは組織ではない。マトリゲルまたはミリポア（登録商
標）フィルターディスクモデルにおいては，リボザイムをマトリゲルまたはミリ
ポア（登録商標）フィルターディスクのマトリックス内に投与して，その抗脈管
形成効力を試験する。すなわち，このモデルにおける輸送の問題は，ラット角膜
モデルにおけるハイドロン被覆テフロンペレットへのリボザイムの輸送の問題と
同様に，それぞれのマトリックス中にリボザイムが均一に存在するため，より問
題が少ないであろう。
【０１０６】 これらのモデルは，上で挙げたいくつかの他の新脈管形成のモデルに比べて明
確な利点を提供する。両方のモデルにおいてＶＥＧＦをプロ脈管形成刺激剤とし
て用いることが可能であることは非常に望ましい。これは，リボザイムがＶＥＧ
Ｆｒ ｍＲＮＡのみを標的とするであろうからである。すなわち，角膜およびマ
トリゲルモデル中の他の非特異的タイプの刺激剤の関与は，抗ＶＥＧＦｒ ＲＮ
Ａリボザイムがその効果を生む薬理学的メカニズムの理解という観点からは有利
ではない。さらに，このモデルにより，ａ−ＦＧＦまたはｂ−ＦＧＦをプロ脈管
形成因子として用いることにより，抗ＶＥＧＦｒ ＲＮＡリボザイムの特異性を
試験することが可能となるであろう。ＦＧＦを用いる血管補充は，いずれのモデ
ルにおいても，抗ＶＥＧＦｒ ＲＮＡリボザイムにより影響されないはずである
。新脈管形成の他のモデル，例えば，ホルモン操作を用いる雌生殖系における血
管の形成（Ｓｈｗｅｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３（上掲））；新脈管形成と
間接的に相関する種々の血管固形腫瘍モデル（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．
，１９９４（上掲）；Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３（上掲）；Ｔａｋ
ａｈａｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４（上掲）；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９
３（上掲））；および過渡的酸素欠乏症後の網膜血管新生（Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ
ａｌ．，１９９５（上掲））は，これらの非特異的性質のため効力スクリーニ
ング用には選択しなかったが，これらのモデルにおいて，ＶＥＧＦと新脈管形成
との間には相関がある。
【０１０７】 腫瘍新脈管形成を研究する他のモデル系は，Ｆｏｌｋｍａｎ（１９８５ Ａｄ
ｖ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．．４３，１７５）により論評されている。
【０１０８】ネズミモデルの使用 用量群あたり１０匹のマウス（それぞれ２０ｇ）および５種類の用量（１日に
１，３，１０，３０および１００ｍｇ／ｋｇ，１４日間毎日投与）を含む典型的
な全身研究のためには，食塩水中に処方された約４００ｍｇのリボザイムを用い
る。若成年ラット（２００ｇ）における同様の研究には４ｇ以上が必要であろう
。平行的薬物動態学的研究には，同様の量のリボザイムの使用が含まれ，ネズミ
モデルの使用の正当性をさらに証明する。
【０１０９】リボザイムおよびルイス肺癌腫およびＢ−１６悪性腫瘍ネズミモデル リボザイムの全身的効力の試験のための一般的な動物モデルを同定することは
，リボザイムを全身的効力についてスクリーニングするための有効な方法である
。
【０１１０】 ルイス肺癌腫およびＢ−１６ネズミ悪性腫瘍モデルは，原発性および転移癌の
よく認められているモデルであり，抗癌剤の初期スクリーニングに用いられてい
る。これらのネズミモデルは，免疫不全マウスの使用に依存せず，比較的安価で
あり，飼育場所の問題が少ない。ルイス肺およびＢ−１６悪性腫瘍の両方のモデ
ルは，活発に転移する腫瘍細胞株（ルイス肺株３ＬＬまたはＤ１２２，ＬＬｃ−
ＬＮ７；Ｂ−１６−ＢＬ６悪性腫瘍）からの約１０6個の腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ ／６Ｊマウス中に皮下移植することを含む。あるいは，ルイス肺モデルは，腫瘍
範囲（直径約０．８ｍｍ）の外科的移植により生成することができる。転移はま
た，腫瘍細胞を直接静脈内に注射することによりモデル化することができる。ル
イス肺モデルにおいては，移植の約１４日後に微視的な転移を観察することがで
き，２１−２５日以内に定量化しうる巨視的な転移腫瘍が発達する。Ｂ−１６悪
性腫瘍は，同様な時間経過を示し，腫瘍新脈管形成は移植の４日後に始まる。こ
れらのモデルにおいては，２１−２５日後には，同じ動物中に原発性および転移
性腫瘍のいずれも存在するため，効力の指標として多くの測定値をとることがで
きる。原発性腫瘍体積および成長潜伏期間，ならびに微視的および巨視的転移肺
病巣の数，または転移を示す動物の数を定量化することができる。寿命の増加の
パーセンテージもまた測定することができる。すなわち，これらのモデルは，全
身投与されたリボザイム／リボザイム処方のスクリーニングのための，適当な一
次効力アッセイを提供するであろう。
【０１１１】 ルイス肺およびＢ−１６悪性腫瘍モデルにおいては，広範な種類の薬剤を用い
る全身薬物療法は，通常は腫瘍移植／播種の１−７日後に連続または多数回投与
計画により始める。同時薬物動態学の研究を行って，薬力学的効果を期待するの
に十分なリボザイムの組織内レベルが達成されるか否かを決定することができる
。さらに，原発性腫瘍および二次的肺転移を除去して，種々のインビトロ研究に
供することができる（すなわち標的ＲＮＡ減少）。
【０１１２】ルイス肺モデルにおけるリボザイムの輸送およびリボザイム処方 炎症性疾病に有用であるかもしれないいくつかのリボザイム処方（例えばカチ
オン性脂質複合体）（例えばＤＩＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ等）およびリボザイムの脈
管暴露を増強するために用いることができるＲＥＳ回避リポソームは，それらの
推定される肺への生体分配のため，癌モデルにおいて興味深い。すなわち，病理
学的に脈管形成応答に関連する部位にリボザイムを輸送するためにリポソーム処
方を用いることができる。
【０１１３】診断用途 本発明のリボザイムは，診断道具として用いて，疾患細胞内の遺伝的浮動およ
び突然変異を試験するか，または細胞内におけるＴｉｅ−２；インテグリンサブ
ユニットβ３；インテグリンサブユニットα６および／またはアリール炭化水素
核運搬体ＲＮＡの存在を検出するために用いることができる。リボザイム活性と
標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係により，分子の任意の領域において，標的
ＲＮＡの塩基対形成および三次構造を変化させる突然変異の検出が可能となる。
本発明に記載される多重リボザイムを用いることにより，ＲＮＡの構造，および
インビトロでのならびに細胞および組織における機能に重要なヌクレオチド変化
を位置づけることができる。リボザイムによる標的ＲＮＡの切断を用いて，遺伝
子発現を阻害し，疾病の進行における特定の遺伝子産物の役割（本質的な）を特
定することができる。このようにして，疾病の重要な媒介物として他の遺伝的標
的を特定することができる。このような実験は，組み合わせ治療（例えば，異な
る遺伝子を標的とする多重リボザイム，既知の小分子阻害剤と結合させたリボザ
イム，またはリボザイムおよび／または他の化学的もしくは生物学的分子の組合
せによる断続的治療）の可能性を与えることにより，疾病進行のよりよい治療を
もたらすであろう。本発明のリボザイムの他のインビトロの用途は当該技術分野
においてよく知られており，これにはＴｉｅ−２；インテグリンサブユニットβ
３；インテグリンサブユニットα６；および／またはアリール炭化水素核運搬体
に関連する状態に関連するＲＮＡの存在の検出が含まれる。そのようなＲＮＡは
，リボザイムにより処理した後に，切断生成物の存在を標準的方法論を用いて決
定することにより検出することができる。
【０１１４】 特定の例においては，野生型または突然変異型の標的ＲＮＡのみを切断しうる
リボザイムをアッセイに用いる。第１のリボザイムを用いて試料中に存在する野
生型ＲＮＡを同定し，第２のリボザイムを用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定す
る。反応対照として，野生型および変異型ＲＮＡの両方の合成基質を両方のリボ
ザイムで切断して，反応における相対的なリボザイム効率および”非標的”ＲＮ
Ａ種の切断がないことを示すことができる。合成基質からの切断生成物はまた，
試料集団中の野生型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーを生成す
るためにも役立つ。すなわち，各分析は，２つのリボザイム，２つの基質および
１つの未知の試料を必要とし，これらを組み合わせて６つの反応とする。切断生
成物の存在は，各ＲＮＡの完全長および切断フラグメントがポリアクリルアミド
ゲルの１つのレーンで分析することができるように，ＲＮＡｓｅ保護アッセイを
用いて決定される。変異ＲＮＡの発現および標的細胞における所望の発現型の変
化の推定リスクを見抜くためには，結果を定量することは必ずしも必要ではない
。その蛋白質生成物が発現型（すなわち，Ｔｉｅ−２；インテグリンサブユニッ
トβ３；インテグリンサブユニットα６；ＡＲＮＴ）の発生に関与していると考
えられるｍＲＮＡが発現していることは，リスクの確立に適当である。匹敵する
特異的活性を有するプローブを両方の転写産物について用いれば，ＲＮＡレベル
の定量的比較が適当であり，初期診断のコストを下げるであろう。ＲＮＡレベル
を定性的に比較しようと定量的に比較しようと，野生型に対する変異型の比率が
より高いことは，よりリスクが高いことと相関しているであろう。
【０１１５】追加の用途 本発明の配列特異的酵素的核酸分子の潜在的有用性は，ＤＮＡ制限エンドヌク
レアーゼがＤＮＡの研究に対して有していたものと同じ用途の多くを，ＲＮＡの
研究に対しても有するであろう（Ｎａｔｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９７５ Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：２７３）。例えば，制限酵素フラグメン
トのパターンを用いて，２つの関連するＲＮＡの配列の関係を確立し，大きいＲ
ＮＡをより研究に有用なフラグメントに特異的に切断することができる。リボザ
イムの配列特異性を遺伝子工学的に処理することが可能であることは，未知の配
列のＲＮＡの切断に理想的である。
【０１１６】 他の態様は特許請求の範囲の範囲内である。 表１ 天然に存在するリボザイムの特徴グループＩイントロン ・サイズ：約１５０〜１０００以上のヌクレオチド。 ・標的配列中の切断部位の５’側に隣接してＵを必要とする。 ・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：グアノシンの３’−ＯＨによって攻撃し，３’−ＯＨおよび
５’グアノシンを有する切断産物を生成する。 ・活性構造の折り畳みおよび維持を助けるために，場合により，蛋白質の補因子
をさらに必要とする。 ・このクラスには３００以上の種類が知られている。テトラヒメナ・サーモフィ
ラのｒＲＮＡ，真菌ミトコンドリア，葉緑体，ファージＴ４，らん藻類，その他
において，介在配列として見出されている。 ・主要な構造上の特徴は，系統発生比較，突然変異原性および生化学的研究によ
ってほぼ確立されている［１，２］。 ・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが立証されている［３
，４，５，６］。 ・リボザイムの折り畳みおよび基質ドッキングに関する研究が進行中［７，８，
９］。 ・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている［１０，１１］。 ・このリボザイムは，結合部位が小さい（４〜６ヌクレオチド）ため，標的ＲＮ
Ａ切断に対して非常に非特異的になる場合があるが，テトラヒメナのグループＩ
イントロンは，「欠損」β−ガラクトシダーゼのメッセージに新たなβ−ガラク
シダーゼ配列を結合することによってこのメッセージを修復するのに利用されて
いる［１２］。ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（Ｍ１ＲＮＡ） ・サイズ：約２９０〜４００のヌクレオチド。 ・偏在するリボ核蛋白質酵素のＲＮＡ部分。 ・ｔＲＮＡ前駆体を切断し，成熟ｔＲＮＡを形成する［１３］。 ・反応メカニズム：恐らくはＭ2+−ＯＨによって攻撃し，３’−ＯＨおよび５’
リン酸を有する切断産物を生成する。 ・ＲＮａｓｅＰは原核生物および真核生物全体に見出されている。このＲＮＡサ
ブユニットは，細菌，酵母，げっ歯類および霊長類から配列決定されている。 ・外部ガイド配列（ＥＧＳ）と標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって，
内因性ＲＮａｓｅＰを治療応用に活用することが可能である［１４，１５］。 ・リン酸と２’ＯＨとの接触の重要性が最近判明した［１６，１７］。グループＩＩイントロン ・サイズ：１０００以上のヌクレオチド。 ・標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［１８，１９］。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：内部アデノシンの２’−ＯＨが３’−ＯＨ，および３’−５
’および２’−５’分岐点を含む「ラリアット（ｌａｒｉａｔ）」ＲＮＡを有す
る切断産物を生成する。 ・ＲＮＡの切断および結合に加えて，ＤＮＡ切断への関与が実証された［２０，
２１］唯一の天然リボザイムである。 ・主要な構造上の特徴は，系統発生比較によってほぼ確立されている［２２］。 ・２’ＯＨ接触の重要性が判明しはじめている［２３］。 ・力学的フレームワークは検討中である［２４］。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ ・サイズ：約１４４ヌクレオチド。 ・ヘアピン標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［２５］。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨが切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’，３’
−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。 ・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていない。 ・このクラスは１種しか知られていない。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ
に見出されている。ハンマーヘッド・リボザイム （本文を参照のこと） ・サイズ：約１３〜４０ヌクレオチド。 ・切断部位の５’に隣接した標的配列ＵＨを必要とする。 ・切断部位の両側で可変数のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’
，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する
。 ・このクラスには１４種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する多くの
植物病原体（ウィルソイド）において見出されている。 ・２つの結晶構造を含め，本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている。［２
６，２７］ ・（インビトロ選択による工学的処理に対し）ごくわずかなライゲーション活性
が実証された。［２８］ ・２つまたはそれ以上のリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立
されている。［２９］ ・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている。［３０］ヘアピンリボザイム ・サイズ：約５０ヌクレオチド。 ・切断部位の３’に隣接した標的配列ＧＵＣを必要とする。 ・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと，切断部位の３’側で可変数のヌ
クレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’
，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する
。 ・このクラスには３種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する３種の植
物病原体（タバコ・リングスポット・ウィルス，アラビス・モザイク・ウィルス
およびチコリー黄色斑ウィルスのサテライトＲＮＡ）に見出されている。 ・本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている［３１，３２，３３，３４］。 ・（切断活性に加えて）ライゲーション活性があるためにこのリボザイムはイン
ビトロ選択による工学処理が可能である［３５］。 ・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている［３
６］。 ・重要な残基の化学修飾検討が着手された［３７，３８］。デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム ・サイズ：約６０ヌクレオチド。 ・標的ＲＮＡのトランス切断であることが実証されている［３９］。 ・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていないが，切断部位の５
’側の配列は要求されない。折りたたまれたリボザイムはシュードノット構造を
含む［４０］。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’
，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する
。 ・このクラスは２種しか知られていない。ヒトＨＤＶに見出されている。 ・環状のＨＤＶは活性があり，ヌクレアーゼ安定性が増加している［４１］。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【表３７】
【表３８】
【表３９】
【表４０】
【表４１】
【表４２】
【表４３】
【表４４】
【表４５】
【表４６】
【表４７】
【表４８】
【表４９】
【表５０】
【表５１】
【表５２】
【表５３】
【表５４】
【表５５】
【表５６】
【表５７】
【表５８】
【表５９】
【表６０】
【表６１】
【表６２】
【表６３】
【表６４】
【表６５】
【表６６】
【表６７】
【表６８】
【表６９】
【表７０】
【表７１】
【表７２】
【表７３】
【表７４】
【表７５】
【表７６】
【表７７】
【表７８】
【表７９】
【表８０】
【表８１】
【表８２】
【表８３】
【表８４】
【表８５】
【表８６】
【表８７】
【表８８】
【表８９】
【表９０】
【表９１】
【表９２】
【表９３】
【表９４】
【表９５】
【表９６】
【表９７】
【表９８】
【表９９】
【表１００】
【表１０１】
【表１０２】
【表１０３】
【表１０４】
【表１０５】
【表１０６】
【表１０７】
【表１０８】
【表１０９】
【表１１０】
【表１１１】
【表１１２】
【表１１３】
【表１１４】
【表１１５】
【表１１６】
【表１１７】
【表１１８】
【表１１９】
【表１２０】
【表１２１】
【表１２２】
【表１２３】
【表１２４】
【表１２５】
【表１２６】
【表１２７】
【表１２８】
【表１２９】
【表１３０】
【表１３１】
【表１３２】
【表１３３】
【表１３４】
【表１３５】
【表１３６】
【表１３７】
【表１３８】
【表１３９】
【表１４０】
【表１４１】
【表１４２】
【表１４３】
【表１４４】
【表１４５】
【表１４６】
【表１４７】
【表１４８】
【表１４９】
【表１５０】
【表１５１】
【表１５２】
【表１５３】
【表１５４】
【表１５５】
【表１５６】
【表１５７】
【表１５８】
【表１５９】
【表１６０】
【表１６１】
【表１６２】
【表１６３】
【表１６４】
【表１６５】
【表１６６】
【表１６７】
【表１６８】
【表１６９】
【表１７０】
【表１７１】
【表１７２】
【表１７３】
【表１７４】
【表１７５】
【表１７６】
【表１７７】
【表１７８】
【表１７９】
【表１８０】
【表１８１】
【表１８２】
【表１８３】
【表１８４】
【表１８５】
【表１８６】
【表１８７】
【表１８８】
【表１８９】
【表１９０】
【表１９１】
【表１９２】
【表１９３】
【表１９４】
【表１９５】
【表１９６】
【表１９７】
【表１９８】
【表１９９】
【表２００】
【表２０１】
【表２０２】
【表２０３】
【表２０４】
【表２０５】
【表２０６】
【表２０７】
【表２０８】
【表２０９】
【表２１０】
【表２１１】
【表２１２】
【表２１３】
【表２１４】
【表２１５】
【表２１６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は，７つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを
示す。
【図２】 図２はＴｉｅ−２の１０３７位を標的とするハンマーヘッドリボ
ザイムの図式的描写である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 29/00 ４Ｃ０８７ 29/00 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 35/76 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 35/76 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ジャーヴィス，テール アメリカ合衆国コロラド州80303，ボウル ダー，スマグラー・プレイス3720 (72)発明者 コースホット，クレア アメリカ合衆国コロラド州80209，デンバ ー，ジョセフィン・ストリート875エス (72)発明者 マクスウィゲン，ジェームズ アメリカ合衆国コロラド州80301，ボウル ダー，フランクリン・ドライブ4866 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA07 CA03 CA05 DA02 GA11 HA17 4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 LL03 4B065 AA90X AA90Y AA93Y AB01 AC14 BA01 CA27 CA44 CA46 4C084 AA13 NA14 ZA332 ZA962 ZB112 ZB262 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA33 ZA96 ZB11 ZB26 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA33 ZA96 ZB11 ZB26

Claims (59)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＲＮＡ切断活性を有する酵素的核酸分子であって，前記酵素
    的核酸分子はアリール炭化水素核運搬体（ＡＲＮＴ）遺伝子によりコードされる
    ＲＮＡを特異的に切断することを特徴とする酵素的核酸分子。
  2. 【請求項２】 ＲＮＡ切断活性を有する酵素的核酸分子であって，前記酵素
    的核酸分子はインテグリンサブユニットベータ３（β３）遺伝子によりコードさ
    れるＲＮＡを特異的に切断することを特徴とする酵素的核酸分子。
  3. 【請求項３】 ＲＮＡ切断活性を有する酵素的核酸分子であって，前記酵素
    的核酸分子はインテグリンサブユニットアルファ６（α６）遺伝子によりコード
    されるＲＮＡを切断することを特徴とする酵素的核酸分子。
  4. 【請求項４】 ＲＮＡ切断活性を有する酵素的核酸分子であって，前記酵素
    的核酸分子は，Ｔｉｅ−２遺伝子によりコードされるＲＮＡを切断することを特
    徴とする酵素的核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記酵素的核酸分子がハンマーヘッドのコンフィギュレーシ
    ョンのものである，請求項１−４のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
  6. 【請求項６】 前記酵素的核酸分子が２塩基対以上の長さのステムＩＩ領域
    を含む，請求項５記載の酵素的核酸分子。
  7. 【請求項７】 前記酵素的核酸分子がヘアピンのコンフィギュレーションの
    ものである，請求項１−４のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
  8. 【請求項８】 前記酵素的核酸が，デルタ肝炎ウイルス，グループＩイント
    ロン，グループＩＩイントロン，ＶＳ核酸またはＲＮａｓｅＰ核酸のコンフィギ
    ュレーションのものである，請求項１−４のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
  9. 【請求項９】 前記酵素的核酸分子がＤＮＡザイムである，請求項１−４の
    いずれかに記載の酵素的核酸分子。
  10. 【請求項１０】 前記酵素的核酸分子が３−７塩基対の長さのステムＩＩ領
    域を含む，請求項７記載の酵素的核酸分子。
  11. 【請求項１１】 前記酵素的核酸分子が，前記ＲＮＡに相補的な１２−１０
    ０塩基を含む，請求項１−４のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
  12. 【請求項１２】 前記酵素的核酸分子が，前記ｍＲＮＡに相補的な１４−２
    ４塩基を含む，請求項１−４のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
  13. 【請求項１３】 前記酵素的核酸分子が，本質的に配列番号１−３９３，９
    １１−１６１１，２４４９−３５８７，および４９１５−５７０１に規定される
    いずれかの配列からなる，請求項５記載の酵素的核酸分子。
  14. 【請求項１４】 前記酵素的核酸分子が，本質的に配列番号７８７−８４８
    ，２３１３−２３８０，４７２７−４８２０および６４８９−６５６８に規定さ
    れるいずれかの配列からなる，請求項７記載の酵素的核酸分子。
  15. 【請求項１５】 請求項１−４のいずれかに記載の酵素的核酸分子を含む哺
    乳動物細胞。
  16. 【請求項１６】 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項１５記載の哺
    乳動物細胞。
  17. 【請求項１７】 請求項１−４のいずれかに記載の酵素的核酸分子の少なく
    とも１つをコードする核酸配列を，該酵素的核酸分子の発現を可能とする様式で
    含む発現ベクター。
  18. 【請求項１８】 請求項１７記載の発現ベクターを含む哺乳動物細胞。
  19. 【請求項１９】 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項１８記載の哺
    乳動物細胞。
  20. 【請求項２０】 癌，糖尿病性網膜症，年齢関連性黄斑変性（ＡＲＭＤ），
    炎症，および関節炎を治療する方法であって，患者に請求項１−４のいずれかに
    記載の酵素的核酸分子を投与する工程を含む方法。
  21. 【請求項２１】 癌を治療する方法であって，患者に請求項１７記載の発現
    ベクターを投与する工程を含む方法。
  22. 【請求項２２】 癌，糖尿病性網膜症，年齢関連性黄斑変性（ＡＲＭＤ），
    炎症，および関節炎を治療する方法であって，患者に請求項１７記載の発現ベク
    ターを投与する工程を含む方法。
  23. 【請求項２３】 癌を治療する方法であって：ａ）患者から細胞を単離し；
    ｂ）前記細胞に請求項１−４のいずれかに記載の酵素的核酸分子を投与し；そし
    てｃ）前記細胞を前記患者中に再導入する， の各工程を含む方法。
  24. 【請求項２４】 請求項１−４のいずれかに記載の酵素的核酸分子を含む医
    薬組成物。
  25. 【請求項２５】 アリール炭化水素核運搬体（ＡＲＮＴ）の上昇したレベル
    に関連する状態を有する患者を治療する方法であって，前記患者に請求項１記載
    の酵素的核酸分子を投与する工程を含む方法。
  26. 【請求項２６】 Ｔｉｅ−２のレベルに関連する状態を有する患者を治療す
    る方法であって，前記患者に請求項２記載の酵素的核酸分子を投与する工程を含
    む方法。
  27. 【請求項２７】 インテグリンサブユニットアルファ６のレベルに関連する
    状態を有する患者を治療する方法であって，前記患者に請求項３記載の酵素的核
    酸分子を投与する工程を含む方法。
  28. 【請求項２８】 インテグリンサブユニットベータ３のレベルに関連する状
    態を有する患者を治療する方法であって，前記患者に請求項４記載の酵素的核酸
    分子を投与する工程を含む方法。
  29. 【請求項２９】 アリール炭化水素核運搬体（ＡＲＮＴ）のレベルに関連す
    る状態を有する患者を治療する方法であって，（ａ）前記患者の細胞を請求項１
    記載の酵素的核酸分子と接触させ；そして（ｂ）前記患者に１またはそれ以上の
    別の薬剤を投与する の各工程を含む方法。
  30. 【請求項３０】 Ｔｉｅ−２のレベルに関連する状態を有する患者を治療す
    る方法であって，（ａ）前記患者の細胞を請求項２記載の酵素的核酸分子と接触
    させ；そして（ｂ）前記患者に１またはそれ以上の別の薬剤を投与する の各工程を含む方法。
  31. 【請求項３１】 インテグリンサブユニットアルファ６のレベルに関連する
    状態を有する患者を治療する方法であって，（ａ）前記患者の細胞を請求項３記
    載の酵素的核酸分子と接触させ；そして（ｂ）前記患者に１またはそれ以上の別
    の薬剤を投与する の各工程を含む方法。
  32. 【請求項３２】 インテグリンサブユニットベータ３のレベルに関連する状
    態を有する患者を治療する方法であって，（ａ）前記患者の細胞を請求項４記載
    の酵素的核酸分子と接触させ；そして（ｂ）前記患者に１またはそれ以上の別の
    薬剤を投与する の各工程を含む方法。
  33. 【請求項３３】 前記酵素的核酸分子が，少なくとも５つのリボース残基，
    ５’末端ヌクレオチドの少なくとも３つにおけるホスホロチオエート結合，前記
    核酸の４位における２'−Ｃ−アリル修飾，少なくとも１０個の２'−Ｏ−メチル
    修飾，および３'末端修飾を含む，請求項５記載の酵素的核酸分子。
  34. 【請求項３４】 前記酵素的核酸が前記３'末端に３'−３'連結反転リボー ス成分を含む，請求項３３記載の酵素的核酸。
  35. 【請求項３５】 前記酵素的核酸分子が，少なくとも５つのリボース残基；
    ５’末端ヌクレオチドの少なくとも３つにおけるホスホロチオエート結合；前記
    酵素的核酸分子の４位および／または７位における２'−アミノ修飾；少なくと も１０個の２’−Ｏ−メチル修飾；および３'−末端修飾を含む，請求項５記載 の酵素的核酸分子。
  36. 【請求項３６】 前記酵素的核酸分子が，少なくとも５つのリボース残基；
    ５'末端ヌクレオチドの少なくとも３つにおけるホスホロチオエート結合，前記 酵素的核酸分子の４位および／または７位における脱塩基置換；少なくとも１０
    個の２'−Ｏ−メチル修飾；および３'−末端修飾を含む，請求項５記載の酵素的
    核酸分子。
  37. 【請求項３７】 前記酵素的核酸分子が，少なくとも５つのリボース残基；
    ５’末端ヌクレオチドの少なくとも３つにおけるホスホロチオエート結合；前記
    酵素的核酸分子の４位および／または７位における６−メチルウリジン置換；少
    なくとも１０個の２'−Ｏ−メチル修飾；および３'末端修飾を含む，請求項５記
    載の酵素的核酸分子。
  38. 【請求項３８】 哺乳動物細胞においてＡＲＮＴ遺伝子の発現を調節する方
    法であって，前記細胞に，請求項１記載の酵素的核酸分子を投与する工程を含む
    方法。
  39. 【請求項３９】 哺乳動物細胞においてインテグリンサブユニットベータ３
    の発現を調節する方法であって，前記細胞に請求項２記載の酵素的核酸分子を投
    与する工程を含む方法。
  40. 【請求項４０】 哺乳動物細胞においてインテグリンサブユニットアルファ
    ６の発現を調節する方法であって，前記細胞に請求項３記載の酵素的核酸分子を
    投与する工程を含む方法。
  41. 【請求項４１】 哺乳動物細胞においてＴｉｅ−２の発現を調節する方法で
    あって，前記細胞に請求項４記載の酵素的核酸分子を投与する工程を含む方法。
  42. 【請求項４２】 ＡＲＮＴ ＲＮＡ分子を切断する方法であって，請求項１
    記載の酵素的核酸分子を，前記ＡＲＮＴ ＲＮＡ分子の切断に適当な条件下で，
    前記ＡＲＮＴ ＲＮＡ分子と接触させる工程を含む方法。
  43. 【請求項４３】 インテグリンサブユニットベータ３ ＲＮＡ分子を切断す
    る方法であって，請求項２記載の酵素的核酸分子を，前記インテグリンサブユニ
    ットベータ３ ＲＮＡ分子の切断に適当な条件下で，前記インテグリンサブユニ
    ットベータ３ ＲＮＡ分子と接触させる工程を含む方法。
  44. 【請求項４４】 インテグリンサブユニットアルファ６ ＲＮＡ分子を切断
    する方法であって，請求項３記載の酵素的核酸分子を，前記インテグリンサブユ
    ニットアルファ６ ＲＮＡ分子の切断に適当な条件下で，前記インテグリンサブ
    ユニットアルファ６ ＲＮＡ分子と接触させる工程を含む方法。
  45. 【請求項４５】 Ｔｉｅ−２ ＲＮＡ分子を切断する方法であって，請求項
    ４記載の酵素的核酸分子を，前記Ｔｉｅ−２ ＲＮＡ分子の切断に適当な条件下
    で，前記Ｔｉｅ−２ ＲＮＡ分子と接触させる工程を含む方法。
  46. 【請求項４６】 前記切断が２価カチオンの存在下で実施される，請求項４
    ２−４５のいずれかに記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記２価カチオンがＭｇ2+である，請求項４６記載の方法
    。
  48. 【請求項４８】 前記酵素的核酸分子が化学的に合成されたものである，請
    求項１−４のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
  49. 【請求項４９】 前記発現ベクターが， ａ）転写開始領域； ｂ）転写終止領域； ｃ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子；を含み， 前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で前記
    開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている，請求項１７記
    載の発現ベクター。
  50. 【請求項５０】 前記発現ベクターが， ａ）転写開始領域； ｂ）転写終止領域； ｃ）オープンリーディングフレーム； ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み， 前記遺伝子は前記オープンリーディングフレームの３’末端に動作可能なように
    連結されており；かつ 前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前
    記開始領域，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作可能
    なように連結されている，請求項１７記載の発現ベクター。
  51. 【請求項５１】 前記発現ベクターが， ａ）転写開始領域； ｂ）転写終止領域； ｃ）イントロン； ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み； 前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前
    記開始領域，前記イントロンおよび前記終止領域に動作可能なように連結されて
    いる，請求項１７記載の発現ベクター。
  52. 【請求項５２】 前記ベクターが， ａ）転写開始領域； ｂ）転写終止領域； ｃ）イントロン； ｄ）オープンリーディングフレーム； ｅ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み， 前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３'末端に動作可能なよう に連結されており，かつ 前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前
    記開始領域，前記イントロン，前記オープンリーディングフレームおよび前記終
    止領域に動作可能なように連結されている，請求項１８記載の発現ベクター。
  53. 【請求項５３】 前記酵素的核酸が，配列番号３９４−７８６および８４９
    −９１０に規定される配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項１記載の酵
    素的核酸分子。
  54. 【請求項５４】 前記酵素的核酸が，配列番号５７０２−６４８８および６
    ５６９−６６４８に規定される配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項２
    記載の酵素的核酸分子。
  55. 【請求項５５】 前記酵素的核酸が，配列番号３５８８−４７２６および４
    ８２１−４９１４に規定される配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項３
    記載の酵素的核酸分子。
  56. 【請求項５６】 前記酵素的核酸が，配列番号１６１２−２３１２および２
    ３８１−２４４８に規定される配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項４
    記載の酵素的核酸分子。
  57. 【請求項５７】 前記酵素的核酸が，少なくとも１つの２'−糖修飾を含む ，請求項１−４のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
  58. 【請求項５８】 前記酵素的核酸が，少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む
    ，請求項１−４のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
  59. 【請求項５９】 前記酵素的核酸が，少なくとも１つのホスホロチオエート
    修飾を含む，請求項１−４のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
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US6037176A (en) * 1999-06-25 2000-03-14 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of integrin beta 3 expression
AU781151B2 (en) * 1999-10-26 2005-05-12 Immusol Incorporated Ribozyme therapy for the treatment of proliferative skin and eye diseases
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US7618947B2 (en) * 2004-08-25 2009-11-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of HIF-1 beta expression
US10470446B2 (en) 2014-05-22 2019-11-12 Baylor College Of Medicine Engineered cell comprising a recombinant pro-methylation cis-element construct that resides in a regulatory region of a target gene
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5378822A (en) * 1993-04-08 1995-01-03 Wisconsin Alumni Research Nucleic acids encoding murine and human Ah receptors
FR2733913B1 (fr) * 1995-05-09 1997-08-01 Sanofi Sa Sequence d'adn a titre de medicament, et compositions pharmaceutiques en contenant
US6346398B1 (en) * 1995-10-26 2002-02-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for the treatment of diseases or conditions related to levels of vascular endothelial growth factor receptor

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