JP2001511003A - 表皮成長因子レセプターのレベルに関連した疾患または病状の酵素的核酸治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＥＧＦＲ ＲＮＡを切断する酵素的核酸分子。

Description

【発明の詳細な説明】 表皮成長因子レセプターのレベルに関連した疾患または病状の酵素的核酸治療発明の背景 本発明は、癌の治療のための治療組成物および方法に関する。 本発明は、ＥＧＦＲ発現レベルに関連する疾患または病状、例えば癌の治療ま たは診断のための治療組成物および方法に関する。以下の概要は完全であること を意味するものではなく、その後に記載される本発明の理解のためにのみ提供さ れる。この概要は、以下に記載される研究のいずれも、本発明に対する先行技術 であると認めるものではない。 表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）は、細胞外”リガンド”結合ドメイン、 膜貫通領域およびチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインからなる１７０ ｋＤａの膜貫通糖蛋白質である（Ｋｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９４）。成長因 子がＥＧＦＲに結合すると、リガンド−レセプター複合体のダウンレギュレーシ ョンであるレセプターおよび他の蛋白質基質の自己リン酸化が生じ、最終的には ＤＮＡ合成および細胞分裂が生ずる。外部リガンド結合ドメインは、ＥＧＦによ り刺激されるが、ＴＧＦα，アンフィレグリンおよびいくつかのウイルス性成長 因子によっても刺激される（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ＆Ｄｅａｎ，１９９４）。 ＥＧＦＲ遺伝子（ｃ−ｅｒｂＢ１）は、第７染色体に位置しており、鳥類にお いて悪性腫瘍を誘導するトリ急性赤芽球症ウイルスオンコジン（ｖ−ｅｒｂＢ） とホモロジーを有する。ｖ−ｅｒｂＢ遺伝子は、細胞外リガンド結合ドメインを 欠失したトランケート型産物をコードする。ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメイ ンは、ｖ−ｅｒｂＢトランスフォーミング蛋白質と９７％のホモロジーを有する ことが見いだされている（Ｄｏｗｎｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８４）。 ＥＧＦＲは、正常組織における対応物と比較して、多くの悪性腫瘍ヒト組織中 で過剰発現されている（概要はＫｈａｚａｉｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９３を参照 ）。レセプターの遺伝子は、多くの癌細胞中において増幅されかつ過剰発現され ている。ＥＧＦＲの過剰発現はしばしば成長因子ＥＧＦおよびＴＧＦαの共発現 を伴い、このことは、成長の制御のためのオートクライン経路が腫瘍の発達の 主要な部分を担っているかもしれないことを示唆する（Ｓｐｏｒｎ＆Ｒｏｂｅｒ ｔｓ，１９８５）。 成長因子およびそのレセプターは、ヒト脳腫瘍の発達において役割を果たして いるかもしれない。脳腫瘍の生検において、ＥＧＦＲをコードする遺伝子の過剰 発現、増幅、欠失および構造的再配列の発生率が高いことが見いだされている（ Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９４）。実際、多形性神経芽細胞腫の 腫瘍におけるＥＧＦＲ遺伝子の増幅は、これまでに知られている最も一致した遺 伝的変更の１つであり、ＥＧＦＲは約４０％の悪性神経膠腫中で過剰発現されて いる（Ｂｌａｃｋ，１９９１）。また、神経芽細胞腫の５０％において、ＥＧＦ Ｒ遺伝子の増幅に伴って成長因子であるＥＧＦおよびＴＮＦαの少なくとも一方 または両方のｍＲＮＡが共発現されていることが示されている（Ｅｋｓｔｒａｎ ｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９１）。 増幅された遺伝子はしばしば再配列され、ポリモルフィズムと関連しており、 異常な蛋白質産物をもたらす（Ｗｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９４）。これまで に特徴決定された再配列は、通常は細胞外ドメインの一部の欠失を示し、このた め、より小さいサイズのＥＧＦＲ蛋白質が生成される。３種類の欠失変異体ＥＧ Ｆレセプター遺伝子が神経芽細胞腫腫瘍において同定されている。タイプＩ変異 体は、リガンド結合部位を含む外部ドメインのほとんどを欠失しており、タイプ ＩＩ変異体は、膜に隣接するドメイン中に欠失を有するが、なおリガンドに結合 することができ、最も一般的であり神経芽細胞腫の１７％に見いだされるタイプ ＩＩＩは、ＥＧＦＲのドメインＩおよびＩＩにわたる２６７アミノ酸の欠失を有 する。 神経芽細胞腫に加えて、異常なＥＧＦＲ発現はまた多くの扁平上皮癌および乳 癌で報告されている（Ｋｕｎｇｅｔａｌ，１９９４；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ＆Ｄ ｅａｎ，１９９４により概説されている）。ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍を有す る多くの患者は、そうでないものより予後が悪い（Ｋｈａｚａｉｅ， ｅｔ ａ ｌ．，１９９３）。したがって、ＥＧＦＲレセプターの異常な発現を阻害または 低下しうる治療戦略は、抗癌剤の可能性を有するものとして非常に興味深い。発明の概要 本発明は、細胞成長応答に必要なＲＮＡ種の切断に向けられたリボザイム、す なわち酵素的核酸分子に関する。特に、本発明は、表皮成長因子のレセプター（ ＥＧＦＲ）をコードするＲＮＡを切断しうるリボザイムの選択および機能を記載 する。そのようなリボザイムは、１つまたはそれ以上の癌において腫瘍細胞の過 増殖を阻害するために用いることができる。 本発明においては、ＥＧＦＲ ＲＮＡを切断するリボザイムが記載される。当 業者は、記載される例から、細胞増殖に必要な標的ＲＮＡを切断する他のリボザ イムを容易に設計することができ、これらも本発明の範囲内であることを理解す るであろう。このようなＲＮＡは、正常ＥＧＦＲ遺伝子を有するヒトにおけるＥ ＧＦＲに対して少なくとも９０％のホモロジーを有するであろう。 ”阻害”とは、ＥＧＦＲの活性またはＥＧＦＲをコードするＲＮＡのレベルが 、核酸の不在下で観察されるものより低下することを意味する。特に、リボザイ ムによる阻害は、好ましくはｍＲＮＡの同一の部位に結合しうるがそのＲＮＡを 切断できない不活性なＲＮＡ分子の存在下で観察されるレベルより低い。 “酵素的核酸分子”とは、基質結合領域において特定の遺伝子標的に対する相 補性を有し、かつその標的中のＲＮＡを特異的に切断する作用をする酵素的活性 をも有する核酸分子を意味する。すなわち、酵素的核酸分子はＲＮＡを分子間切 断し、このことにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性 は、標的ＲＮＡに酵素的核酸分子を十分にハイブリダイズさせ、切断を起こさせ るように作用する。１００％の相補性が好ましいが、５０−７５％程度の低い相 補性も本発明において有用である。 酵素的核酸との用語は、当該技術分野において用いられているように、リボザ イム、触媒的ＲＮＡ、酵素的ＲＮＡ、触媒的ＤＮＡ、ヌクレオザイム、ＤＮＡザ イム、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、ミニザイム、リードザイム、オリ ゴザイム、またはＤＮＡ酵素などの用語と交換可能なように用いられる。これら の用語のすべては、酵素的活性を有する核酸分子を記述する。 ＥＧＦＲに”均等な”ＲＮＡとは、ヒトを含む種々の動物の癌に伴う天然に生 ずるＲＮＡ分子を含むことを意味する。 ”相補性”とは、伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタイプの 塩基対相互作用（例えば、フーグスティーン型）のいずれかにより、他のＲＮＡ 配列と水素結合を形成しうる核酸を意味する。 現在のところ、天然に生ずる酵素的ＲＮＡの７個の基本的変種が知られている 。それぞれの酵素的ＲＮＡは、生理学的条件下で、トランスでＲＮＡホスホジエ ステル結合の加水分解を触媒することができる（したがって、他のＲＮＡ分子を 切断しうる）。表Ｉはこれらのリボザイムの性質のいくつかをまとめたものであ る。一般に、酵素的核酸は、まず標的ＲＮＡに結合することにより作用する。こ の結合は、酵素的核酸の、標的ＲＮＡを切断させる作用をする分子の酵素的部分 に近接して保持された標的結合部分により行われる。すなわち、酵素的核酸は、 まず標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対形成により標的ＲＮＡに結合し、 適正な部位にいったん結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そ のような標的ＲＮＡの戦略的切断は、それがコードする蛋白質の合成を指令する 能力を破壊するであろう。酵素的核酸はそのＲＮＡ標的に結合して切断させたの ち、そのＲＮＡから離脱して他の標的を探し、新たな標的に反復的に結合して切 断することができる。 治療を行うのに必要なリボザイムの濃度がより低いため、リボザイムの酵素的 性質は他の技術に比べて利点がある。この利点は、リボザイムが酵素的に作用す る能力を有することを反映している。すなわち、１個のリボザイム分子が多数の 標的ＲＮＡの分子を切断することができる。さらに、リボザイムは特異性の高い 阻害剤であり、その阻害の特異性は標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成のメカニズ ムのみならず、標的ＲＮＡの切断のメカニズムにも依存する。切断部位の近くに おける１つのミスマッチもしくは塩基置換を選択して、リボザイムの触媒活性を 完全に排除することができる。 エンドヌクレアーゼ酵素的活性を有する核酸分子は、ヌクレオチド塩基配列特 異的様式で、他の別個のＲＮＡ分子を繰り返し切断することができる。このよう な酵素的ＲＮＡ分子は、事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができ 、インビトロで有効な切断を行うことができる（Ｚａｕｇ，ｅｔ ａｌ．，３２ ４，Ｎａｔｕｒｅ ４２９，１９８６；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８７ Ｎａｔ ｕｒｅ ３２８，５９６；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．，８４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７８８，１９８７；Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８，Ｅｉ ｎｓｔｅｉｎ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，６，９２；Ｈａｓｅｌｏｆ ｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，３３４ Ｎａｔｕｒｅ ５８５，１９８８；Ｃｅ ｃｈ，２６０ ＪＡＭＡ ３０３０，１９８８；およびＪｅｆｆｅｒｉｅｓ，ｅ ｔ ａｌ．，１７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３７１ ，１９８９）。 トランス切断リボザイムは、その配列特異性のため、ヒト疾患の治療剤として 有望である（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅ ｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；ＣｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎａｎｄＭ ａｒｒ，１９９５Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７）。リボザ イムは、細胞性ＲＮＡのバックグラウンド中で特定のＲＮＡ標的を切断するよう に設計することができる。そのような切断事象は、ＲＮＡを非機能性にし、その ＲＮＡからの蛋白質発現を排除する。このようにして、疾患状態に関連する蛋白 質の合成を選択的に阻害することができる。 ＥＧＦＲ ＲＮＡ中の特定の部位を切断するリボザイムは、癌および他の病状 などの疾患を治療する新規な治療法である。本出願人は、リボザイムがＥＧＦＲ の活性を阻害しうること、および、リボザイムの触媒活性がその阻害的効果に必 要であることを示す。当業者は、ＥＧＦＲ ＲＮＡのこれらの部位を切断する他 のリボザイムを容易に設計することができ、これらも本発明の範囲内であること が、記載されている例から明らかであることを見いだすであろう。 本発明の好ましい態様の１つにおいては、酵素的核酸分子はハンマーヘッドま たはヘアピンのモチーフで形成されるが、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイン トロン、グループIIイントロン、またはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配 列に伴う）またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡのモチーフで形成されて もよい。このようなハンマーヘッドモチーフの例は、Ｄｒｅｙｆｕｓ（上掲）、 Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ，１９９２，ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈ ｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，８，１８３に記載され；ヘアピンモチー フの例は、Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ０３６０２５７，Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ，１９８９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８，４９２９， Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ８２，５３，Ｈａｓ ｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，４３および Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．１８，２９９に記載され；デルタ肝炎ウイルスモチーフの例は、Ｐｅｒｒｏｔ ｔａ ａｎｄ Ｂｅｅｎ，１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１ １６に 記載され；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ ｅ ｔ ａｌ．，１９８３ Ｃｅｌｌ，３５ ８４９，Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ａ ｌｔｍａｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，７８３；Ｌｉ ａｎｄ Ａｌ ｔｍａｎ，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，８３５に記 載され；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌ ｉｎｓ（Ｓｅｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９０ Ｃｅｌｌ ６１ ，６８５−６９６；Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９１ Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８８，８８２６−８８３０；Ｃ ｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ，１９９３ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ ２，２７９５−２７９９，Ｇｕｏ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９５，ＥＭＢ Ｏ．Ｊ．１４，３６３）により記載され；グループＩＩイントロンの例は、Ｇｒ ｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２，７６１；Ｍｉ ｃｈｅｌｓ ａｎｄ Ｐｙｌｅ，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４， ２９６５；Ｐｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／２２６８９により記載 され；グループＩイントロンの例は、Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４， ９８７，０７１号により記載されている。これらの特定のモチーフは本発明にお いて限定的なものではなく、当業者は、本発明の酵素的核酸分子（またはそのよ うな分子の多数のフラグメント）において重要なすべては、それが１またはそれ 以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に対して相補的な特異的基質結合部位またはアーム を有し、かつその基質結合部位内またはその周囲にその分子にＲＮＡ切断活性を 付与するヌクレオチド配列（酵素的部分）を有することであることを認識するで あろう。 ”酵素的部分”とは、ＲＮＡ基質の切断に必須のリボザイムの部分を意味する 。 ”基質結合アーム”とは、その基質の部分に相補的な（すなわち、これと塩基 対形成可能な）リボザイムの部分を意味する。一般に、そのような相補性は１０ ０％であるが、所望ならばより低くてもよい。例えば、１４塩基中の１０塩基が 塩基対形成することができる。そのようなアームは、図１−３に一般に示されて おり、以下に議論される。すなわち、これらのアームは、相補的塩基対形成相互 作用によりリボザイムと標的ＲＮＡとを一緒にすることが意図されるリボザイム 中の配列を含む。例えば、標準的ハンマーヘッドリボザイムのステムＩおよびＩ ＩＩ中のリボザイム配列は、基質結合ドメインを形成する（図１を参照）。 好ましい態様においては、本発明は、所望の標的のＲＮＡに対して高度の特異 性を示す一群の酵素的切断剤を製造する方法を提供する。酵素的核酸分子は、好 ましくは、１つまたはいくつかの酵素的核酸により疾患または病状の特異的治療 が与えられるように、ＥＧＦＲ蛋白質をコードする標的ｍＲＮＡの高度に保存さ れた配列領域を標的とする。このような酵素的核酸分子は、必要に応じて特定の 細胞に外来的に輸送することができる。あるいは、リボザイムは、特定の細胞に 輸送されるＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができる。 １００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は自動化された方法によっては 困難であり、そのような分子の療法経費は著しい。本発明においては、小型の酵 素的核酸モチーフ（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ハンマーヘッドま たはヘアピンリボザイム）を外来的輸送に用いる。これらの分子の構造が簡単で あることは、核酸がｍＲＮＡ構造の標的領域内へ侵入する能力を高める。しかし 、これらの核酸分子は、細胞内で真核生物プロモーターから発現させることもで きる（例えば、Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ ａｎｄ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９ ８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，３９９；Ｓｕｌ ｌｅｎｇｅｒ−Ｓｃａｎｌｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａ ｂｅｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２ ，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６ ６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈ ｅｎ， ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５ ８１−９；Ｓａｒｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７， １２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９）。当業者は、適当なＤＮＡ／ＲＮ Ａベクターから、任意の核酸を真核生物細胞中で発現させうることを理解するで あろう。このような核酸の活性は、リボザイムにより一次転写産物からそれらを 放出させることにより増加させることができる（Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９，およびＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣ Ｔ ＷＯ９４／０２５９５（いずれもこの内容のすべてを本明細書の一部として ここに引用する）；Ｏｈｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｅｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２７，１５−６；Ｔａｉｒａ，ｅｔ ａｌ． １９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖ ｅｎｔｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８５６）。 このような核酸は、上述の疾患および病状、ならびに細胞もしくは組織におけ るＥＧＦＲのレベルに関連する他のいずれの疾患または病状の予防にも有用であ る。 ”関連する”とは、ＥＧＦＲ ＲＮＡレベルの減少、したがってそれぞれの蛋 白質活性のレベルの減少が、疾患または病状の症状をある程度軽減させるであろ うことを意味する。 リボザイムは直接加えることもできるが、カチオン性脂質とともに複合させる か、リポソーム中に封入するか、または他の方法により標的細胞に輸送すること ができる。核酸または核酸複合体は、バイオポリマーに取り込ませてまたは取り 込ませずに、注射、注入ポンプまたはステントを用いて関連する組織にエクスビ ボまたはインビボで局所的に投与することができる。好ましい態様においては、 リボザイムは表IIIおよびIVに示される配列に相補的な結合アームを有する。こ のようなリボザイムの例も、表IIIおよびIVに示される。このようなリボザイム の例は、本質的にこれらの表において定義される配列からなる。 ”本質的に・・からなる”とは、活性なリボザイムが、標的部位における切断 が生ずるように、例に示されるものと均等な酵素的中心またはコアならびにｍＲ ＮＡに結合しうる結合アームを含むことを意味する。そのような切断を妨害しな い他の配列が存在していてもよい。 すなわち、第１の観点において、本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子から発現されたＲ ＮＡの切断により遺伝子発現および／または細胞増殖を阻害するリボザイムを特 徴とする。これらの化学的にまたは酵素的に合成されたＲＮＡ分子は、その標的 ｍＲＮＡのアクセス可能な領域に結合する基質結合ドメインを含む。ＲＮＡ分子 はまたＲＮＡの切断を触媒するドメインを含む。ＲＮＡ分子は、好ましくはハン マーヘッドまたはヘアピンモチーフのリボザイムである。リボザイムは、標的ｍ ＲＮＡに結合した際にこれを切断し、翻訳および蛋白質蓄積を防ぐ。標的遺伝子 が発現されないため、細胞増殖が阻害される。 好ましい態様においては、酵素的ＲＮＡ分子はＥＧＦＲ ｍＲＮＡを切断し、 細胞増殖を阻害する。このようなリボザイムは、癌の予防および／または治療に 有用である。リボザイムは直接加えてもよく、またはカチオン性脂質と複合させ てもよく、リポソーム中に封入してもよく、または他の方法により、平滑筋細胞 に輸送される。ＲＮＡまたはＲＮＡ複合体は、バイオポリマー中に取り込ませて または取り込ませずに、カテーテル、注入ポンプ、またはステントを用いて関連 する組織に局所的に投与することができる。同様に輸送されたリボザイムはまた 、ＥＧＦＲの上昇したレベルに関連するある種の癌、特に、多形性神経芽細胞腫 の増殖の阻害にも有用である。本明細書に記載される方法を用いて、ＥＧＦＲを 切断しこのことにより腫瘍細胞増殖を阻害する他の酵素的ＲＮＡ分子を得て、上 述のようにして用いることができる。特定の例は、以下の表および図において提 供される。 本発明の別の観点においては、標的ＲＮＡ分子を切断し、ＥＧＦＲ活性を阻害 するリボザイムは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットか ら発現される。組み換えベクターは、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイル スベクターである。リボザイムを発現するウイルスベクターは、アデノ関連ウイ ルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアルファウイルスを基に構築する ことができるが、これらに限定されない。好ましくは、リボザイムを発現しうる 組み換えベクターを上述のように輸送し、標的細胞中に存在させる。あるいは、 リボザイムを過渡的に発現させるウイルスベクターを用いることができる。この ようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現 すれば、リボザイムは標的ｍＲＮＡを切断する。リボザイム発現ベクターの輸送 は、全身投与（例えば静脈内または筋肉内投与）により、患者から外植した標的 細胞に投与した後に患者に再導入することにより、または所望の標的細胞に導入 するための他の任意の方法により行うことができる（概説は、Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，ＴＩＧ．１２，５１０を参照）。 ”患者”とは、外植された細胞のドナーまたはレシピエントである生物または 細胞それ自身を意味する。”患者”はまた、酵素的核酸分子をそれに投与するこ とができる生物を表す。好ましくは、患者は哺乳動物または哺乳動物細胞である 。より好ましくは、患者はヒトまたはヒト細胞である。 ”ベクター”とは、所望の核酸を輸送するために用いられる、核酸および／ま たはウイルスに基づく任意の技術を意味する。 これらのリボザイムは、別々に、または他の薬剤と組み合わせてもしくは結合 させて、上述した疾患または病状の治療に用いることができる。例えば、当業者 には明らかなように、ＥＧＦＲレベルに関連した疾患または病状を治療するため には、患者を治療してもよく、または他の適当な細胞を処置してもよい。 さらに別の態様においては、記載されるリボザイムは、上述した病状または疾 患を治療するために、他の既知の治療と組み合わせて用いることができる。例え ば、記載されるリボザイムは、１つまたはそれ以上の既知の治療剤と組み合わせ て用いて、癌を治療することができる。 好ましい態様においては、リボザイムは表ＩＩＩおよびＩＶ（配列番号１−８ ２３および１７５９−１８７０）の配列に相補的な結合アームを有する。そのよ うなリボザイムの例も、表ＩＩＩおよびＩＶ（配列番号８２４−１７５８）に示 されている。そのような切断を妨害しない他の配列が存在していてもよい。 本発明の他の特徴および利点は、以下の本発明の好ましい態様の記載および特 許請求の範囲から明らかであろう。好ましい態様の記載 最初に図面を簡単に説明する。図面 図１は、当該技術分野において知られているハンマーヘッドリボザイムドメイ ンの図解的描写である。ステムIIは２塩基対以上の長さでありうる。 図２ａは、当該技術分野において知られているハンマーヘッドリボザイムドメ インの図解的描写であり；図２ｂは、Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７，Ｎａｔｕ ｒｅ，３２７，５９６−６００）により基質および酵素部分に分割されたハンマ ーヘッドリボザイムの図解的描写であり；図２ｃは、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧ ｅｒｌａｃｈ（１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５−５９１）により２つ の部分に分割されたハンマーヘッドを示す同様の図解的描写であり；そして図２ ｄはＪｅｆｆｒｉｅｓ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｓ（１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ ｓ Ｒｅｓ．，１７，１３７１−１３７１）により２つの部分に分割されたハン マーヘッドを示す同様の図解的描写である。 図３は、ヘアピンリボザイムの一般的構造の図解的描写である。ヘリックス２ （Ｈ２）は少なくとも４塩基対（すなわち、ｎは１、２、３または４）にて提供 され、ヘリックス５は任意に２以上の長さの塩基（好ましくは３−２０塩基、す なわち、ｍは１−２０またはそれ以上）にて提供されうる。ヘリックス２および ヘリックス５は１つまたはそれ以上の塩基により共有結合していてもよい（すな わち、ｒは１塩基以上）。また、ヘリックス１、４または５を２以上の塩基対に より延長することにより（例えば、４−２０塩基対）リボザイム構造を安定化し てもよく、好ましくはこれは蛋白質結合部位である。各々の例においては、各Ｎ およびＮ’は独立にいずれかの通常の塩基または修飾塩基であり、そして各ダッ シュは潜在的塩基対相互作用を表す。これらのヌクレオチドは、糖、塩基または リン酸部分で修飾されていてもよい。完全な塩基対形成はヘリックス内において 必要ではないが、これが好ましい。ヘリックス１および４は、いくつかの塩基対 形成が維持される限り任意の大きさであってよい（すなわち、ｏおよびｐは各々 独立に０から任意の数、例えば２０である）。必須塩基は構造中において特定の 塩基として示されるが、当業者は１つまたはそれ以上が顕著な影響なしに化学的 に修飾（脱塩基、塩基、糖および／またはリン酸修飾）または他の塩基により置 換されていてもよいことを認識するであろう。ヘリックス４は２つの別々の分子 から、すなわち接続ループを用いずに形成することができる。接続ループが存在 する場合には、これは、塩基、糖またはリン酸が修飾されていてもいなくてもよ いリボヌクレオチドでありうる。”ｑ”は２塩基以上である。接続ループは非ヌ クレオチドリンカー分子で置き換えられていてもよい。Ｈは塩基Ａ、Ｕ、または Ｃを意味する。Ｙはピリミジン塩基を意味する。” ”は共有結合を意味す る。 図４は、当該技術分野において知られているデルタ肝炎ウイルスリボザイムド メインの一般的構造の描写である。 図５は、自己切断ＶＳ ＲＮＡリボザイムドメインの一般的構造の描写である 。 図６は、ＥＧＦＲ ＲＮＡを標的とするアミノリボザイムのインビトロＲＮＡ 切断活性を示す。 ａ：切断反応のオートラジオグラフ。反応は、以下に記載されるように、５０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂の存在下で３７℃ で実施した。反応時間（分）がレーンの上に示されている。Ｓ０は、時間０にお けるリボザイムを加えないＴｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液中の無傷の基質を表す。Ｓ１ は、時間６０分におけるＴｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液中の無傷の基質を表す。＋Ｃは 、切断産物のみの陽性対象を示す。バンドＳは無傷の基質、バンドＰは切断産物 、バンドＤは分解を表す。 ｂ：切断の時間経過。オートラジオグラフィーからのバンドは、スキャニングデ ンシトメトリーで定量化し、残存基質の割合を時間に対してプロットした。 差込：半対数プロットを用いて、基質の半減期を求めた（ｔ_1/2＝０．６９３／ ｋ）。 ｃ：非相補的基質ＲＮＡに対するＥＧＦＲリボザイムの反応を示すオートラジオ グラフ。４０ｎＭのリボザイムを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５） ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂の存在下で３７℃で１ｎＭの基質に加えた。バンドＳは 無傷の基質、バンドＰは切断産物を表す。反応時間は分で与えられる（特にこと わらない限り）。Ｃはリボザイムを加えない無傷の基質を表す。＋Ｃは切断産物 を 表す。 図７は、ＥＧＦＲリボザイムが、多数ターンオーバー反応において、その標的 基質に対して示した切断反応の時間経過を示すオートラジオグラフの代表的な例 である。 ａ：３００ｎＭの５’［³²Ｐ］標識基質ＲＮＡを用いた、１０ｎＭのリボザイム のインビトロ活性。 ｂ：１μＭの５’［³²Ｐ］標識基質ＲＮＡを用いた、１０ｎＭのリボザイムのイ ンビトロ活性。反応は、以下に記載されるように、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂の存在下で３７℃で実施した。反応時間 （分）は、レーンの上に示される。Ｃはリボザイムを加えないＴｒｉｓ・ＨＣｌ 緩衝液中の無傷の基質を表す。バンドＳは無傷の基質、バンドＰは切断産物を表 す。 ｃ：ＥＧＦＲリボザイムにより示されたハンマーヘッド切断反応の速度論。反応 の初速（Ｖｏ，ｎＭ／ｍｉｎ）が基質濃度に対してプロットされている。リボザ イム濃度は１０ｎＭであり、一方、基質濃度は指示されるように変化させた。 差込：このデータのイーディー・ホフステー・プロット。 図８は化学的に修飾されたアミノハンマーヘッドリボザイムの一般的構造を示 す。 図９は、化学的に修飾されたＣ−アリルハンマーヘッドリボザイムの一般的構 造を示す。標的部位 有用なリボザイムの標的は、Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９３／２３５ ６９；Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９３／２３０５７；Ｔｈｏｍｐｓ ｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９４／０２５９５；Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｗ ０９５／０４８１８；ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，５２５ ，４６８（この内容のすべてを本明細書の一部としてここに引用する）に開示さ れているようにして決定することができる。本明細書ではこれらの文書で提供さ れているガイドラインを繰り返さずに、以下にこれらの方法の特定の例を提供す るが、これは当業者を制限するものではない。このような標的に対するリボザイ ム は、これらの出願において記載されているように設計し、そして記載されている ように合成して、インビトロおよびインビボで試験する。また、そのようなリボ ザイムを、これらの出願において記載されているように最適化し、輸送すること ができる。 コンピューター折りたたみアルゴリズムを使用して、ヒトＥＧＦＲ ＲＮＡの 配列を、最適リボザイム標的部位についてスクリーニングした。ハンマーヘッド またはヘアピンリボザイム切断部位を同定した。これらの部位は表IIIおよびIV に示される（これらの表中、全ての配列は５’から３’である。表中、ヌクレオ チド塩基位置は、示されるタイプのリボザイムにより切断されるべき部位として 示されている。 ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイムを、結合しうるように設計し、コン ピューター折りたたみ（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７７０６）により別々に分析して、 リボザイム配列が適切な二次構造に折りたたまれるかどうかを評価した。結合ア ームと触媒コアとの間に好ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは考慮 から除外する。種々の結合アームの長さを選択して活性を最適化することができ る。一般に、各アームに少なくとも５塩基あれば、標的ＲＮＡに結合するか、さ もなくばそれと相互作用することができる。 ハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフのリボザイムを、ｍＲＮＡメッセージ 中の種々の部位にアニーリングするように設計した。結合アームは上述の標的部 位配列に相補的である。リボザイムは化学的に合成した。用いた合成方法は、Ｕ ｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．，１０９， ７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３およびＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９ ９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４に記載 される通常のＲＮＡ合成の方法にしたがい、慣用の核酸保護基およびカップリン グ基、例えば５’末端にジメトキシトリチル、および３’末端にホスホルアミダ イトを用いる。小スケール合成は、３９４合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）で、改変した２．５μｍｏｌスケールプロトコルを用い て、アルキルシリル保護ヌクレオチドについては５分間のカップリング工程を、 ２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程を用 いて行った。表IIは、合成サイクルにおいて用いた試薬の量および接触時間の概 要を示す。ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して６．５倍過剰（０．１Ｍを １６３μＬ＝１６．３μｍｏｌ）のホスホルアミダイトおよび２４倍過剰のＳ− エチルテトラゾール（０．２５Ｍを２３８μＬ＝５９．５μｍｏｌ）をそれぞれ のカップリングサイクルにおいて用いた。３９４合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）での平均カップリング収率は、トリチル画分の比 色定量により決定して、９７．５−９９％であった。３９４合成機（Ａｐｐｌｉ ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）での他のオリゴヌクレオチド合成試薬 ：脱トリチル化溶液は、塩化メチレン中２％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であり；キャッピ ングはＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％ 無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）で行った；酸化溶液は、ＴＨＦ中 １６．９ｍＭ Ｉ₂，４９ｍＭピリジン，９％水（ミリポア）である。Ｂ＆Ｊ合 成等級アセトニトリルは試薬瓶から直接用いた。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（ アセトニトリル中０．２５Ｍ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ ａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成した。 ＲＮＡの脱保護は以下のようにして行った。ポリマー結合オリゴリボヌクレオ チド（トリチルオフ）を合成カラムから４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し、 メチルアミン（ＭＡ）の溶液に６５℃で１０分間懸濁した。−２０℃に冷却した 後、上清をポリマー支持体から除去した。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：Ｍｅ ＣＮ：Ｈ₂Ｏ／３：１：１で３回洗浄し、ボルテックスし、次に上清を最初の上 清に加えた。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して白色粉末と した。 塩基を脱保護したオリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ・ＨＦ／ＮＭＰ溶液（ １．５ｍＬ Ｎ−メチルピロリドン、７５０μＬ ＴＥＡおよび１．０ｍＬ Ｔ ＥＡ・３ＨＦで１．４Ｍ ＨＦ濃度とした溶液２５０μＬ）に懸濁し、６５℃に １．５時間加熱した。得られた、完全に脱保護されたオリゴマーを、５０ｍＭ ＴＥＡＢ（９ｍＬ）で急冷し、次に陰イオン交換脱塩した。 脱保護したオリゴマーの陰イオン交換脱塩のためには、予め５０ｍＭ ＴＥＡ Ｂ（１０ｍＬ）で洗浄したＱｉａｇｅｎ５００（登録商標）陰イオン交換カート リッジ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）にＴＥＡＢ溶液を負荷した。負荷したカート リッジを５０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）で洗浄した後、ＲＮＡを２Ｍ ＴＥＡ Ｂ（１０ｍＬ）で溶出し、乾燥して白色粉末とした。 不活性ハンマーヘッドリボザイムは、Ｇ₅をＵで、Ａ₁₄をＵで置き換えること により合成した（番号は、Ｈｅｒｔｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，３２５２による）。 平均段階カップリング収率は＞９８％であった（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８ ４）。 ヘアピンリボザイムは２つの部分で合成し、アニーリングして活性リボザイム を再構築する（Ｃｈｏｗｒｉｒａ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ，１９９２，Ｎｕｃｌｅ ｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，２８３５−２８４０）。リボザイムはまた 、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートか ら合成される（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８９，Ｍ ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。 リボザイムは、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリ ル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈヌクレオチド塩基修飾で修飾 することにより、安定性を高めるようにおよび／または触媒活性を高めるように 修飾する（総説については、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９ ２，ＴＩＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａ ｌ．，１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６，１４０９０を参照されたい） 。リボザイムは一般的な方法を使用してゲル電気泳動で精製するか、または高速 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔら（上掲）（このすべてを 本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい）で精製し、そして水に 再懸濁する。 本研究において有用な、化学的に合成したリボザイムの配列は、表IIIおよびI V に示される。当業者は、これらの配列が、活性に影響を及ぼすためにリボザイム の酵素的部分（結合アームを除くすべて）が変更されているはるかに多くのその ような配列の代表例にすぎないことを理解するであろう。例えば、ハンマーヘッ ドリボザイムのステムーループII配列を、最小で２つの塩基対形成したステム構 造を形成しうる限り任意の配列を含むように変更（置換、削除、および／または 挿入）することができる。同様に、表IVに挙げられるヘアピンリボザイムのステ ムーループIV配列（５’−ＣＡＣＧＵＵＧＵＧ−３’）は、最小で２つの塩基対 形成したステム構造を形成しうる限り、任意の配列を含むように変更（置換、削 除、および／または挿入）することができる。好ましくは、これらの位置には２ ００塩基未満が挿入される。表IIIおよびIVに挙げられる配列は、リボヌクレオ チドまたは他のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドで形成することができる。そ のようなリボザイム（酵素活性を有するもの）は、表に具体的に記載されるリボ ザイムと均等である。リボザイム活性の最適化 リボザイム活性はＤｒａｐｅｒら（上掲）に記載されているようにして最適化 することができる。ここでは詳細は繰り返さないが、これらには、リボザイム結 合アーム（ステムＩおよびIII、図２ｃを参照されたい）の長さの変更、または 血清リボヌクレアーゼによる分解を防止し、および／またはその酵素活性を増強 させる修飾（塩基、糖および／またはリン酸）を有するリボザイムの化学的合成 （例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５； Ｐｅｒｒａｕｌｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４４，５６５； Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４；Ｕ ｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ ９３／１５１８７；Ｒｏｓｓｉ，ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２ ；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１；ならびにＢｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（上掲）を参照されたい：これらはすべて酵素的ＲＮＡ分子の塩基 、リン酸および／または糖部分に行うことができる種々の化学修飾を記載しする ）が含まれる。細胞におけるこれらの活性を増強させる修飾、およびステムII塩 基 の除去によるＲＮＡの合成時間の短縮および化学物質の必要性の減少が望ましい （これらの刊行物のすべてを本明細書の一部としてここに引用する）。 ”増強された酵素的活性”とは、その活性が触媒的活性およびリボザイム安定 性の両方の反映であるような、細胞および／またはインビボで測定された活性を 含むことを意味する。本発明においては、これらの性質の積は、インビボで全Ｒ ＮＡリボザイムと比較して、増加するかまたは顕著に（１０倍未満）減少してい ない。 酵素的活性を維持または増強する化学的修飾を有する酵素的核酸が提供される 。このような核酸はまた、一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対して耐性が高 い。この観点において、”修飾された塩基”とは、１’位のアデニン、グアニン 、シトシン、およびウラシルまたはこれらの均等物以外のヌクレオチド塩基を意 味する。このような塩基は、酵素の触媒的コアにおいて、ならびに基質結合領域 において用いることができる。特に、本発明は、ピリジン−４−オン、ピリジン −２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン 、３−メチルウラシル、ジヒドロウラシル、ナフチル、６−メチルウラシルおよ びアミノフェニルから選択される塩基置換を有する修飾されたリボザイムを特徴 とする。上述したように、コアにおける置換はインビトロ活性を減少させるかも しれないが、安定性を高める。すなわち、細胞および／またはインビボにおいて 、活性は顕著に低下しないであろう。本明細書において例示されるように、その ようなリボザイムは、全体の活性が１０倍減少したとしても、細胞および／また はインビボにおいて有用である。そのようなリボザイムは、本明細書においては 、全ＲＮＡリボザイムの酵素的活性を”維持”するといわれる。 Ｓｕｌｌｉｖａｎら（上掲）は、酵素的ＲＮＡ分子の輸送の一般的な方法を記 載する。リボザイムは、当業者に知られている種々の方法によって細胞に投与す ることができる。例えば、リポソーム中への封入、イオントホレシス、またはヒ ドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセルおよび生物接着性微小 球のような他のベヒクル中への取り込みが挙げられるが、これらに限定されない 。適応症によっては、リボザイムは、上述のベヒクルとともにもしくはベヒクル なしで、エクスビボで直接細胞または組織に輸送することができる。あるいは、 Ｒ ＮＡ／ベヒクルの組合せ物を、直接注射、またはカテーテル、注入ポンプもしく はステントの使用により局所的に輸送する。別の輸送経路には、静脈内、筋肉内 、皮下もしくは関節注射、エアゾール吸入、経口（錠剤または丸剤形態）、局所 、全身、眼、腹腔内および／または鞘内輸送が含まれるが、これらに限定されな い。リボザイム輸送および投与のさらに詳細な説明は、Ｓｕｌｌｉｖａｎら（上 掲）およびＤｒａｐｅｒら（上掲）に提供されており、これらを本明細書の一部 としてここに引用する。 細胞内に高濃度のリボザイムを蓄積させるもう１つの手段は、リボザイムをコ ードする配列をＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター中に取り込ませることである。 リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）、ＲＮＡ ポリメラーゼII（ｐｏｌII）またはＲＮＡポリメラーゼIII（ｐｏｌIII）のプロ モーターから行われる。ｐｏｌIIもしくはｐｏｌIIIプロモーターからの転写産 物は、全ての細胞で高レベルで発現されるであろう；あるタイプの細胞中のある ｐｏｌIIプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサ ー、サイレンサー等）の性質に依存するであろう。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ 酵素が適当な細胞内で発現する限り、原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーター も使用される（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９９０，Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ ａｎ ｄ Ｈｕａｎｇ，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２ ８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎ ｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｏ ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。数人の研究者は、このよ うなプロモーターから発現されたリボザイムが咄乳動物細胞で機能しうることを 示している（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９２， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１ ０８０２−６；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ’Ｈｕｉｌｌ ｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗ ｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ．Ｓ．Ａ．，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ ＆Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。上記のリボザイ ム転写ユニットは、哺乳動物細胞中に導入するために、種々のベクター中に組み 込ませることができる。例えば、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベ クター（例えば、アデノウイルスまたはアデノ関連ウイルスベクター）またはウ イルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルスまたはアルファウイルスベクタ ー）が挙げられるが、これらに限定されない（概説については、Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６（上掲）を参照）。 本発明の好ましい態様においては、ＥＧＦＲをコードするｍＲＮＡを切断する リボザイムを発現する転写ユニットを、プラスミドＤＮＡベクターまたはアデノ ウイルスもしくはアデノ関連ウイルスＤＮＡウイルスベクターまたはレトロウイ ルスＲＮＡベクター中に挿入する。ウイルスベクターは遺伝子を伝達するために 用いられており、過渡的または長期遺伝子発現をもたらしている（Ｚａｂｎｅｒ ，ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｅｌｌ ７５，２０７；Ｃａｒｔｅｒ，１９９２ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，５３３）。アデノウイルスベクター は組換えアデノウイルス粒子として輸送される。ＤＮＡは、単独でまたはベヒク ル（ＲＮＡについて上記で説明したような）と複合体を形成させて輸送すること ができる。組み換えアデノウイルスまたはＡＡＶ粒子は、例えば、インビボでの インキュベーションまたは吸入により、またはエクスビボで細胞もしくは組織に 直接適用することにより、治療部位に局所的に投与される。レトロウイルスベク ターもまた、哺乳動物細胞においてリボザイムを発現させるために用いられてい る（Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２（上掲）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５（上掲）；Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ，１９９６（上掲））。 別の好ましい態様においては、リボザイムは適当なリポソームベヒクル中で、 ＥＧＦＲ発現の部位（例えば腫瘍細胞）に投与される。実施例 実施例１：ヒトＥＧＦＲ ＲＮＡ中の潜在的リボザイム切断部位の同定 コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いて、ヒトＥＧＦＲ ＲＮＡの配列を 、アクセス可能部位についてスクリーニングした。二次折り畳み構造を形成しな いｍＲＮＡ領域およびハンマーヘッドおよび／またはヘアピンリボザイム切断の 可能性のある部位を同定した。これらの切断部位の配列は表ＩＩＩおよびＩＶに 示される。実施例２：ヒトＥＧＦＲ ＲＮＡ中のリボザイム切断部位の選択 コンピュータに基づくＲＮＡ折り畳みアルゴリズムにより予測された部位が、 ＥＧＦＲ ＲＮＡのアクセス可能部位と対応するか否かを試験するため、２０個 のハンマーヘッド部位を選択して分析した。リボザイム標的部位は、ヒトＥＧＦ Ｒのゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ００５８８） を分析することにより選択し、折り畳みに基づいて部位に優先順位をつけた。各 標的（図２Ｃを参照）に結合することができるハンマーヘッドリボザイムを設計 し、コンピュータフォールディングにより個々に分析して（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆ ｅｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｔｈｅｏｃｈ ｅｍ，３１１，２７３；Ｊａｅｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７７０６））、リボザイム配列が適 当な二次構造に折り畳まれるかどうかを評価した。結合アームと触媒的コアとの 間に望ましくない分子間相互作用を有するリボザイムは考慮から除外した。以下 に記載されるように、活性の最適化のために結合アームの長さを変化させること を選択することができる。一般に、各アームに少なくとも５塩基あれば標的ＲＮ Ａと結合するかさもなくば相互作用することができる。実施例３：ＥＧＦＲ ＲＮＡの有効な切断のためのリボザイムの化学合成および 精製 ハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフのリボザイムを、ｍＲＮＡメッセージ 中の種々の部位にアニーリングするように設計した。結合アームは上述の標的部 位配列に相補的である。リボザイムは化学的に合成した。用いた合成方法は、Ｕ ｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．，１０９， ７８４５およびＳｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３およびＷｉｎｃｏｔｔら（上掲）に記載 される通常のＲＮＡ合成の方法にしたがい、慣用の核酸保護基およびカップリン グ基、例えば５’末端にジメトキシトリチル、および３’末端にホスホルアミダ イトを用いた。平均段階カップリング収率は＞９８％であった。不活性リボザイ ムは、Ｇ₅をＵで、およびＡ₁₄をＵで置き換えることにより合成した（番号は、 Ｈｅｒｔｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．，２０，３２５２による）。ヘアピンリボザイムは２つの部分で合成し、アニ ーリングして活性なリボザイムを再構築した（Ｃｈｏｗｒｉｒａ ａｎｄ Ｂｕ ｒｋｅ，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，２８３５−２８４ ０）。リボザイムはまた、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用い てＤＮＡテンプレートから合成した（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂ ｅｃｋ，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。全ての リボザイムは、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル 、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈで修飾することにより安定性を 高めるように修飾した（総説については、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒ ｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ １７，３４を参照されたい）。リボザイムは一般的 な方法を使用してゲル電気泳動で精製するか、または高速液体クロマトグラフィ ー（ＨｐＬｃ；ｗｉｎｃｏｔｔら（上掲）（この全内容を本明細書の一部として ここに引用する）を参照されたい）で精製し、そして水に再懸濁した。本研究に おいて用いた化学的に合成されたリボザイムの配列は以下の表ＩＩＩおよびＩＶ に示される。実施例４：ＥＧＦＲ ＲＮＡ標的のリボザイム切断 ヒトＥＧＦＲ ＲＮＡを標的とした２０個のハンマーヘッド型リボザイムを設 計し、合成して、インビトロで切断活性を試験した。標的配列およびＥＧＦＲｍ ＲＮＡ中のヌクレオチドの位置は表ＩＩＩに示される。すべてのハンマーヘッド リボザイムは、７ヌクレオチド長さの結合アーム（ステムＩおよびＩＩＩ；図２ Ｃを参照）を有するように合成した。ＨＨリボザイムがヒトＥＧＦＲ ＲＮＡを 切断する相対的能力は、図６および７にまとめられている。 リボザイム切断アッセイのための、完全長または部分的完全長の、内部標識し た標的ＲＮＡは、［α−³²Ｐ］ＣＴＰの存在下でのインビトロ転写により調製し 、スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し、さらに 精製することなく基質ＲＮＡとして用いた。あるいは、基質は、Ｔ４ポリヌクレ オチドキナーゼ酵素を用いて５’−³²Ｐ−末端標識した。アッセイは、リボザイ ム切断緩衝液（５ＯｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ７．５（３７℃），１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中の２Ｘ濃度の精製リボザイムをあらかじめ暖めることにより実 施し、切断反応は２Ｘリボザイムミックスを、やはり切断緩衝液中であらかじめ 暖めた等量の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ）に加えることにより開始させた。初 期スクリーニングとして、アッセイは、最終濃度４０ｎＭまたは１ｍＭのリボザ イム、すなわち、リボザイム過剰条件を用いて３７℃で１時間実施した。等量の ９５％ホルムアミド，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルー および０．０５％キシレンシアノールを加えることにより、反応を停止させ、次 に試料を９５℃で２分間加熱し、急冷し、変性ポリアクリルアミドゲルに負荷し た。基質ＲＮＡおよびリボザイム切断により生じた特定のＲＮＡ切断産物は、ゲ ルのオートラジオグラフィーにより可視化した。切断のパーセンテージは、無傷 の基質を表すバンドおよび切断産物を表すバンドのＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅ ｒ（登録商標）による定量により判定した。 １回ターンオーバ一反応：別法として、切断反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｈ ＣｌｐＨ７．５および１０Ｍ ＭｇＣｌ₂中で３７℃で実施した。保存の間に形 成しうる集塊を破壊するため、非標識リボザイムおよび５’末端標識基質を、標 準的な切断緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ７．５）中で９０℃に２ 分間加熱し、３７℃の反応温度に１５分間平衡化することにより、別々に変性さ せ再生させた。次に、各ＲＮＡ溶液を最終濃度１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂に調節し、 ３７℃でさらに１５分間インキュベートした。切断反応は、リボザイムと基質試 料を最終容量１００μｌ中で必要な濃度となるように混合することにより開始し た。リボザイム濃度は４０ｎＭであり、基質濃度は１ｎＭであった。また、２倍 （２ｎＭ）および半分（０．５ｎＭ）の基質濃度を用いて反応を繰り返し、反応 が実際に１回ターンオーバー条件下で行われたことを確認した。１０μｌのアリ コートを０−１２０分間の間の適当な時間間隔で取り出し、等量のホルムアミド 負荷緩衝液（９：１（ｖ：ｖ）ホルムアミド：１ｘＴＢＥ）を加えることにより 反応を停止し、ドライアイス上で凍結した。生成物および基質を変性２０％ポリ アクリルアミド（７Ｍ尿素）ゲル電気泳動で分離した。切断の割合を判定するた めに、基質および生成物のバンドを湿潤ゲルのオートラジオグラフィーにより位 置決定し、これらのオートラジオグラムのデンシトメトリにより定量した。オー トラジオグラフィーは、マッキントッシュコンピュータに接続したＡＧＦＡフォ ーカススキャナを用いてスキャンし、画像はＴＩＦＦファイルとして保存した。 Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．５８（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎ ＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＵＳＡ）を用いて、バンド強度をプロットし定量した 。さらに、適切なバンドをゲルから切り出し、ゲルから切り出した断片のシンチ レーション計数により定量した（Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｒｉｃａｒｂ ２０００Ｃ Ａ液体シンチレーション分析器）。 反応速度定数（ｋ）は、残存基質の量の時間に対する半対数プロットの傾きか ら求めた。活性の半減期ｔ_1/2は、０．６９３／ｋと計算された。各速度定数は 、二重の実験から決定した。 上述の条件下で示された切断の特異性を示すために、ヒトＥＧＦＲ ｍＲＮＡ 上の別の部位に関連する異なる基質を用いて実験を繰り返した。すべての条件は 上述したとおりであったが、ただし、試料をより長い時間、すなわち、２時間で はなく２４時間にわたって間隔的に取り出した。 多数ターンオーバー反応：リボザイムＲＰＩ．４７８２の速度論的性質を、５ ’３２Ｐ標識基質を用いる多数ターンオーバーの初期速度から求めたイーディー ・ホフステープロットから判定した。切断反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ，ｐＨ７．５および１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂中で３７℃で行った。１００ｎＭのリ ボザイムの保存溶液および５００ｎＭ−２μＭの基質ＲＮＡは、５０ｍＭ Ｔｒ ｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ７．５中で調製し、別々に０℃で２分間あらかじめ加熱し、 ３７℃で１５分間冷却した。これらの各溶液に最終濃度１０ｍＭでＭｇＣｌ₂を 加えた後、さらに３７℃で１５分間インキュベートした。切断反応は、最終容量 １００μｌ、１０ｎＭのリボザイム濃度および１００ｎＭ−１μＭの基質濃度で 実施した。リボザイム保存溶液を基質に加えることにより反応を開始させた。０ −１２０分間の間の一定の時間間隔で１０μｌのアリコートを取り出し、等量の ホルムアミド負荷緩衝液を加えることにより反応を停止し、ドライアイス上で凍 結した。無傷の基質および切断の生成物を２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素 変性ゲルで電気泳動により分離し、オートラジオグラフィーにより検出した。各 時点における切断の程度は、得られたオートラジオグラムのスキャニングデンシ トメトリーにより定量化した。８つの基質濃度で反応の初期速度を測定し、イー ディー・ホフステープロットを用いてＫｃａｔ値およびＫｍ値を求めた。 図６および７に示されるように、ＥＧＦＲ ＲＮＡを標的とするアミノハンマ ーヘッドリボザイム（ＲＰＩ．４７８２）は、その標的ＲＮＡを配列特異的様式 で切断し、切断速度は基質濃度に関して飽和速度論に適合しているようであった 。切断速度は、低い基質濃度において一次であったが、基質の濃度が増加するに つれて、反応速度は横ばいになり、このことはリボザイムが有効に基質で飽和し たことを示唆する。これらの結果は、切断反応が真に触媒的であり、したがって 、ミカエリス・メンテン速度式を用いる分析が可能であることを示す。イーディ ー・ホフステープロットから、速度論パラメータＫｍおよびＫｃａｔを求めた。 リボザイムは、８７ｎＭのＫｍ値および１．２ｍｉｎ^-1のＫｃａｔ値を示した。 １回ターンオーバー条件下において、リボザイムＲＰＩ．４７８２は、その標 的配列の急速な切断を示し、基質の半減期はわずか７分間であった。このリボザ イムの高い活性は、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら（１９９５ｃ）の知見と一致する。彼 らは、ＲＰＩ．４７８２と同様の様式で修飾したリボザイムが、ほぼ野生型と同 じ活性を示し、基質の半減期がわずか３分間であったことを報告している。切断 はＢｅｉｇｅｌｍａｎら（１９９５ｃ）により示されたものよりわずかに遅かっ たが、これらの知見は、リボザイムＲＰＩ．４７８２がその標的を非常に効率的 に切断しうることを明確に示す。 異なる、非相補的基質配列を用いて実験を繰り返したところ、切断産物は認め られず（図３．３）、この分子の配列特異性が示された。 アミノリボザイム（ＲＰＩ．４７８２）の活性をより精密に評価するために、 速度論パラメータであるＫｍおよびｋｃａｔを多数ターンオーバー条件下で測定 した。結果は、切断反応が真に触媒的であり、ターンオーバー速度（Ｋｃａｔ） が１．２ｍｉｎ^-1であり、Ｋｍ値が８７ｎＭであることを示した（図６および７ ）。これらの結果は、ハンマーヘッドリボザイムについて報告されている典型的 な値、すなわち１−２ｍｉｎ^-1のＫｃａｔおよび、２０−２００ｎＭのＫｍ（Ｋ ｕｍａｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９６）の範囲内に入る。しかし、多くの因子、例 えば塩基配列、基質結合アームの長さおよび種々の化学的修飾がこれらの速度論 パラメータに影響しうるため、直接の比較は困難である（Ｆｅｄｏｒ＆Ｕｈｌｅ ｎｂｅｃｋ，１９９２）。実施例５：ＥＧＦＲリボザイムのウシ胎児血清中における安定性 化学的に修飾されたリボザイムの安定性を評価するために、１００％ウシ胎児 血清（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｕ．Ｋ．）中で３７℃で比較安定性実験を 行った。５’および内部［³²Ｐ］標識リボザイムの分解プロファイルを、５’− 末端［３２Ｐ］標識ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）オ リゴデオキシヌクレオチドおよび非修飾ＲＮＡのものと比較した。 合成／標識： ３７ｍｅｒのＰＯおよびＰＳオリゴヌクレオチドは、自動化ＤＮＡ合成機（モ デル３９２，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｕ．Ｋ．）で標準的なホスホルアミド化学（２．２．１節）を用いて合成した。 化学的に修飾した３７ｍｅｒのリボザイム（アミノハンマーヘッドリボザイム； 図８）および１５ｍｅｒの非修飾全ＲＮＡ基質は、上述のように合成した。リボ ザイムおよびオリゴヌクレオチドは、先に記載したように、［³²Ｐ］ＡＴＰで放 射性標識し、２０％ポリアクリルアミドゲルで精製した。 分解実験条件： 放射性標識リボザイム／オリゴヌクレオチドは、１００μｌのＦＣＳ中で最終 濃度２００ｎＭで３７℃でインキュベートした。１０μｌのアリコートを一定時 間間隔で取り出し、８０％ホルムアミド，１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）， ０．２５％キシレンシアノール，０．２５％ブロモフェノールブルーを含む負荷 緩衝液と混合し、ゲルに負荷する前に−２０℃で凍結した。分解プロファイルは 、 ２０％ポリアクリルアミド（７Ｍ尿素）ゲル電気泳動およびオートラジオグラフ ィーにより分析した。 １００％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）において比較安定性実験を行って、５’末端 標識および内部標識アミノリボザイムの分解プロファイルを、５’末端標識非修 飾ＲＮＡ基質、ホスホジエステル（ＰＯ）およびホスホロチオエート（ＰＳ）オ リゴデオキシヌクレオチドのものと比較した。アミノリボザイムの化学的修飾に より、非修飾基質に比べてヌクレアーゼ耐性が実質的に増加した。内部標識リボ ザイムの半減期（ｔ_50%）は約２０時間であるのに対し、基質は、ＲＮＡを血清 に加え、混合し、反応を停止するのに要した時間の間に完全に分解した（ｔ_50% ＜１分間）。内部標識リボザイム（図３．６ａ）と５’末端標識リボザイムでは 分解のパターンが明らかに異なるにもかかわらず、分解の速度論が著しく類似し ていたことは興味深い（いずれもｔ_50%は約２０時間）。 リボザイム分解とオリゴデオキシヌクレオチド分解の比較も行った。化学的に 修飾したリボザイムは、ＦＣＳ中において、ＰＯオリゴヌクレオチドまたはＰＳ オリゴヌクレオチドのいずれよりもより安定であるように見えた。およその半減 期はそれぞれ１０分間および５時間であった。しかし、見かけ上の分解産物は、 遊離リン酸の位置に移動したことに注目すべきである。このことは、脱リン酸化 （［³²Ｐ］標識の除去）が生じ、時間とともに遊離リン酸濃度が累進的に増加し たことを示唆する。 しかし、この実験の知見が、リボザイムに適用された化学的修飾がきわめて安 定な構造を生じたことを示していることは疑いがない。この実験の条件下におい ては、アミノリボザイムはウシ胎児血清中におけるヌクレアーゼ媒介性分解に対 して最も安定であることが立証された。実施例６：リボザイム取り込み実験 細胞培養技術： Ｕ８７−ＭＧ細胞株は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ ｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｕ．Ｋ．から購入した。これらの ヒト神経芽細胞腫星状腫瘍細胞は、元々等級３の悪性神経膠腫から外植技術によ り誘導されたものである（Ｐｏｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．，１９６８）。Ａ４３１細 胞は、外陰癌腫から誘導され、ＥＧＦＲを他の細胞株より１０−５０倍高いレベ ルで発現する（Ｕｌｌｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８４）。 細胞株Ｕ８７−ＭＧおよびＲａｗ２６４．７は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血 清（ＦＢＳ），１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％（ｖ／ｖ）Ｌ− グルタミン（すべてＧｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｕ．Ｋ．から供給された）を 補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。安定性および 取り込み実験においては、ウシ胎児血清を加えない同じ培地を用いた。Ａ４３１ 細胞は、グルタミンを最終濃度２％（ｖ／ｖ）で加えた以外は同じ条件で維持し た。ＣａＣｏ−２細胞は、ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１％非必須アミノ酸，１％ ペニシリン／ストレプトマイシン，および１％Ｌ−グルタミン中で、Ｖａｎｅｓ ｓａ Ｍｏｏｒｅにより培養およびプレートされた。 細胞は、７５ｃｍ³プラスチック組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，Ｕ．Ｋ． ）中で２５ｍｌのそれぞれの培地で培養した。培養物は空気中５％ＣＯ₂の加湿 （９５％）雰囲気下で３７℃でインキュベートした。保存培養物は、培地を４８ 時間ごとに交換し、コンフルエントになった時（約４日後）に継代（１：５）す ることにより維持した。継代は、以下の方法を用いて行った。 培地を除去し、細胞を１０ｍｌのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。 次に、５ｍｌの２ｘトリプシン／ＥＤＴＡ（ＰＢＳ中、０．２５％（ｗ／ｖ）ト リプシン，０．２％エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム，ｐＨ７．２）を加え 、フラスコを３７℃で５分間インキュベートした。フラスコをたたいて細胞単層 を底から移動させ、新鮮な培地を加えてトリプシンを中和した。細胞を必要に応 じて分割し、最終容量２５ｍｌとなるように培地を加えた。 長期保存のためには、以下のようにして凍結保存培養物を調製した。 保存培養物を上述したようにトリプシン処理し、１０ｍｌのＤＭＥＭ培地を加 えて中和した。次に細胞懸濁液を１５ｍｌ万能管（Ｆａｌｃｏｎ，Ｕ．Ｋ．）に 移し、３５０回転／分で３分間遠心分離した。上清をデカントし、細胞ペレット を１ｍｌの凍結培地（１０％ＤＭＳＯ，９０％熱不活性化ウシ胎児血清）に再懸 濁し、２ｍｌのねじ蓋クリオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）（Ｃｏｓｔａｒ，Ｕ ．Ｋ．）に移した。次にアンプルを液体窒素フリーザーの凍結先端部中に４−６ 時 間置き、その後液体窒素（−１９６℃）細胞バンクに移した。必要な場合には、 ３７℃で急速に解凍し、ＤＭＥＭ培地で漸次希釈した後、２５ｃｍ³のフラスコ （Ｆａｌｃｏｎ，Ｕ．Ｋ．）中に播種することにより、細胞を回収した。 保存培養物の生存細胞密度は、トリパンブルー排除試験を用いて、血球計数器 により測定した。１００μｌのトリパンブルー（４ｍｇ／ｍｌ）を４００μｌの 細胞懸濁液と混合した（１：１．２５希釈）。少量のトリパンブルー細胞懸濁液 をＮｅｕｂａｕｅｒ血球計数器（Ｗｅｂｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｔｅ ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ，Ｕ．Ｋ．）の深さ０．１ｍｍ、面積１／４００ｍ ｍ²の計数チャンバに移した。細胞は、血球計数器の５つの大きな升目中で光学 顕微鏡を用いて計数した。生存細胞はトリパンブルー染料を取り込まないが、死 亡細胞は取り込むため、生存（非染色）細胞の数を計数した。細胞密度は、次の 等式を用いて計算した。 細胞／ｍｌ＝平均計数／升目×１０⁴×１．２５（トリパンブルーの希釈率） 細胞結合（ｃｅｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）実験： リボザイムのＵ８７−ＭＧ神経芽細胞腫細胞株中への取り込みのメカニズムを 調べるために、一連の実験を行った。特に記載しない限り、これらの実験ではす べて以下の一般的実験方法を用いた。 合成／標識： 取り込み実験において用いる前に、３７ｍｅｒのリボザイムを先に記載したよ うに（２．３．２節）³²Ｐで内部標識し、２０％非変性ポリアクリルアミドゲル 電気泳動で精製した。［１４Ｃ］マンニトール（比活性５６ｍＣｉ／ｍｍｏｌ） は、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）から購入した。 取り込み実験方法： Ｕ８７−ＭＧ細胞はプラスチックの２４−ウエルプレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｕ ．Ｋ．）で培養した。コンフルエントの保存培養物をトリプシン処理し、保存懸 濁液の細胞密度をＤＭＥＭ培地で０．５ｘ１０⁵細胞ｍｌ^-1に希釈した。各ウエ ルに２ｍｌの希釈細胞懸濁液を播種して、最終濃度を１ｘ１０⁵／ウエルとした 。プレートを空気中５％ＣＯ₂の加湿（９５％）雰囲気下で３７℃でインキュベ ートした。約２０−２４時間後、細胞単層はコンフルエントに達し、取り込み実 験 に使用可能であった。次に培地を除去し、単層をＰＢＳで２回注意深く洗浄して （２ｘ１ｍｌｘ５ｍｉｎ）、血清の痕跡を除去した。洗浄液を吸引し、放射性標 識リボザイムを含む２００μｌの無血清ＤＭＥＭ培地で置き換えた。ＰＢＳおよ び無血清培地はともに、使用前に３７℃で１時間平衡化した。実験の間、プレー トは、特に記載しない限り、３７℃で乾燥雰囲気下でインキュベートした。所望 の時間インキュベートした後、頂部の培地を注意深く回収し、その放射活性含有 量を液体シンチレーション計数（ＬＳＣ）により評価した。次に細胞を氷冷ＰＢ Ｓ／アジ化ナトリウム（０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃／ＰＢＳ）で３回洗浄し て（３ｘ０．５ｍｌｘ５ｍｉｎ）、それ以後の細胞代謝を阻害し、細胞表面にゆ るく会合しているリボザイムを除去した。洗浄液を回収し、その放射活性含有量 をＬＳＣにより判定した。蒸留水中の３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ， ＵＫ）０．５ｍｌとともに室温で１時間振盪することにより、細胞単層を可溶化 した。ウエルをＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でさらに２回洗浄して（２ｘ０．５ｍ ｌ）、すべての細胞が回収されたことを確実にし、細胞画分の放射活性含有量を ＬＳＣにより判定した。特に指示しない限り、すべての実験は最終濃度０．０１ μＭの³²Ｐ内部標識リボザイムで実施し、６０分間インキュベートした。 アミノリボザイムの取り込みを、異なる細胞株において比較した。結果は、こ れらのリボザイムの細胞結合は、腸上皮細胞における０．３２５±０．０２１ｎ ｇ／１０⁵細胞からマクロファージ細胞株における１．０９±０．２０７ｎｇ／ １０⁵細胞の範囲であったことを示す。 リボザイムが細胞膜を貫通する能力および侵入のメカニズムは、リボザイムを 治療剤として開発するうえで重要な問題である。オリゴデオキシヌクレオチドが 細胞に入るメカニズムはよく証明されており（概要についてはＡｋｈｔａｒ＆Ｊ ｕｌｉａｎｏ，１９９１を参照）、液相、吸着性およびレセプター媒介性エンド サイトーシスの関与が含まれる。取り込みのメカニズムおよび程度は、多くの因 子、例えばオリゴヌクレオチドのタイプおよび長さおよび試験する細胞株に依存 する。しかし、これに対し、リボザイムおよびリボヌクレオチドについては、細 胞取り込みのメカニズムはこれまでに記載されていない。リボザイムＲＰＩ．４ ７８２の神経膠腫細胞中への取り込みの手段を調べるために、ヒト神経膠腫由来 細胞株Ｕ８７−ＭＧにおいて、一連の細胞結合実験を行った。 リボザイムＲＰＩ．４７８２のＵ８７−ＭＧ細胞への細胞結合は、約２時間継 続する急速な初期相、および続くより遅い第二相の、二相性であるように見えた 。オリゴヌクレオチドの細胞結合は、取り込みプロセスおよび発散プロセスの両 方を表す動的プロセスであることが示されている（Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ＆Ｃ ｏｈｅｎ，１９９０）。したがって、第二相で見られたプラトーは、リボザイム の取り込みとエキソサイトーシスとの平衡を表しているのかもしれない。リボザ イムＲＰＩ．４７８２の取り込みは温度に強く依存し、これは活性（ａｃｔｉｖ ｅ）プロセスが関与していることを示唆する。さらに、代謝阻害剤であるアジ化 ナトリウムおよび２−デオキシグルコースは、細胞結合を有意に６６％阻害し、 リボザイム取り込みがまたエネルギー依存性でもあることを示した。 このリボザイムのＵ８７−ＭＧ細胞における細胞結合のエネルギーおよび温度 依存性は、活性プロセスに特徴的なものであり、取り込みのメカニズムがエンド サイトーシスを介するものであることを示す。しかし、これらの知見は、液相エ ンドサイトーシスが関与しているかまたはレセプター媒介性エンドサイトーシス が関与しているかを区別できない。これは、いずれのメカニズムもこれらのパラ メータに影響されるからである（Ｂｅｌｔｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９４ ）。内在化の経路を評価するために、液相マーカーである［１４Ｃ］マンニトー ルの取り込みを測定して、Ｕ８７−ＭＧ細胞におけるピノサイトーシスの程度を 判定した。これらの細胞におけるピノサイトーシスの基底速度は、試験した時間 の全体にわたりきわめて低いままであり、したがって、この細胞株におけるリボ ザイム取り込みの有意な割合を占めることはありそうにない。 リボザイムＲＰＩ．４７８２がレセプター媒介性エンドサイトーシスによりＵ ８７−ＭＧ細胞に取り込まれるか否かを調べるために、自己競合実験を行った。 リボザイム取り込みは、非標識リボザイムとの競合により有意に阻害されること がわかった。このことは、細胞結合が濃度依存性であることを示し、主要な取り 込みメカニズムはレセプター媒介性エンドサイトーシスを介するものであること を示唆する。 レセプター媒介性エンドサイトーシスには、特異的膜蛋白質である細胞表面レ セプターを介する分子の内在化が関与する。したがって、トリプシンまたはプロ ナーゼ（登録商標）等の蛋白質分解酵素を用いて、膜蛋白質が取り込みを媒介す る程度を判定することができる（Ｂｅｃｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｈｏｊ ｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｗｕ−ｐｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９４）。腸 ＣａＣｏ−２細胞におけるオリゴヌクレオチドの細胞結合を調べる研究において 、Ｂｅｃｋら（１９９６）は、細胞表面をプロナーゼで洗浄すると取り込みが５ ０％低下することを報告しており、一方、Ｒａｕｓｃｈｅｒ Ｒｅｄ ５−１． ５赤白血病細胞においては、オリゴヌクレオチド取り込みの60％がトリプシン感 受性であることが報告されている（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９４） 。リボザイム取り込みをさらに特性決定するためには、エンドサイトーシス阻害 剤であるフェニルアルシンオキシドおよびエンドソームアルカリ化剤であるクロ ロキンおよびモネンシンの影響を研究することができる（Ｌｏｋｅ，ｅｔ ａｌ ．，１９８９；Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９４）。 特異的結合部位がリボザイムＲＰＩ．４７８２のＵ８７−ＭＧ細胞中への取り 込みに関与しているか否かを判定するためには、競合剤、例えばオリゴヌクレオ チド、ＡＴＰおよび、硫酸デキストランおよびヘパリン等の他のポリアニオンが リボザイム取り込みに及ぼす影響を評価するための競合実験が必要である。リボ ザイムＲＰＩ．４７８２のＵ８７−ＭＧ細胞への細胞結合はまた、ｐＨ依存性で あることが判明した。実際、ｐＨを８から５に下げると、細胞結合が有意に増加 した。低ｐＨ条件下において、細胞結合の増加がリボザイムの分配係数の増加に よるものであるか否かを決定するために、ｐＨがリボザイム分配係数に及ぼす影 響を調べることはこれまでに行われていない。低ｐＨにおける細胞結合の増加は 、Ｇｏｏｄａｒｚｉら（１９９１）およびＫｉｔａｊｉｍａら（１９９２）の研 究と一致する。彼らは、オリゴヌクレオチドの細胞結合もまた酸性条件下で増加 することを見いだした。増強された結合は、ｐＨ４．５付近で機能する３４ｋＤ ａの膜蛋白質レセプターの存在のためであろうと仮定されている（Ｇｏｏｄａｒ ｚｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９１）。さらに、リジンのα−アミノ基、アルギニン のグアニジウム基およびヒスチジンのプロトン化イミダゾールが、潜在的オリゴ ヌ クレオチド結合部位であることが示唆されている（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ｐＫａ６．５を有するヒスチジンは、ｐＨ７．２−５．０ の範囲にわたってプロトン化が可能である。したがって、ｐＨ５．０におけるリ ボザイムＲＰＩ．４７８２のＵ８７−ＭＧ細胞に対する増強された親和性は、結 合部位に存在するヒスチジン残基のプロトン化のためでありうる。 一般に、これらの観察は、リボザイムの細胞取り込みの経路には活性な細胞プ ロセスが関与することを示唆しており、取り込みの主要なメカニズムがレセプタ ー媒介性エンドサイトーシスを介するものであることを示す。実施例７：Ｕ８７−ＭＧ細胞におけるリボザイムの安定性 取り込み実験から得られた結果が、無傷の３７ｍｅｒリボザイムの細胞結合を 表し、分解されたリボザイムまたは遊離［³²Ｐ］標識を表すものでないことを確 実にするために、Ｕ８７細胞とともにインキュベートしたときのこのリボザイム の安定性を試験した。 先に記載したように、Ｕ８７−ＭＧ細胞を２４ウエルプレート上に播種し、播 種の約２４時間後に用いた。内部［³²Ｐ］標識リボザイムＲＰＩ．４７８２を２ ００μｌの無血清培地に加えて、最終濃度を１０ｎＭとした。４時間の間の種々 の時点で頂部溶液の１０μｌのアリコートを回収し、等量のホルムアミド負荷緩 衝液（９：１（ｖ／ｖ）ホルムアミド：１ｘＴＢＥ）と混合し、−２０℃で保存 した。ゲルに負荷する前に、試料を１００℃で５分間加熱し、７Ｍ尿素／２０％ アクリルアミドゲルで分離した。バンドは湿潤ゲルのオートラジオグラフィーに より検出した。 比較の目的で、５’標識リボザイムＲＰＩ．４７８２、５’末端標識全ＲＮＡ １５ｍｅｒ基質および５’末端標識３７ｍｅｒＰＯおよびＰＳオリゴデオキシヌ クレオチドの安定性プロファイルもまた同じ条件下で測定した。 取り込み実験から得られた知見が無傷の３７ｍｅｒリボザイムの細胞結合を表 し、ｔｈａｔｏｆより短い分解されたフラグメントまたは遊離の［³²Ｐ］標識を 表すものではないことを確実にするために、Ｕ８７−ＭＧ細胞に暴露したときの ５’一末端および内部［³²Ｐ］標識リボザイムの分解を試験した。比較の目的で 、非修飾ＲＮＡ基質の安定性プロファイルも同じ条件下で測定した。化学的 に修飾したリボザイムは、４時間のインキュベーションの間、ほぼ無傷で残った 。内部標識試料からは分解が明らかではなかったのに対し、５’−末端標識リボ ザイムは１２０分後にある程度の分解を示した。このことは、後者の場合には５ ’脱リン酸化が生じたことを示す。しかし、これに対し、非修飾ＲＮＡ基質は、 Ｕ８７−ＭＧ細胞単層とともにインキュベーションしたとき１０分間以内に完全 に分解された。リボザイムは、上述した化学的修飾により、細胞ヌクレアーゼか ら明らかに保護された。リボザイム活性の最適化 Ｓｕｌｌｉｖａｎら（上掲）は、酵素的ＲＮＡ分子の輸送のための一般的な方 法を記載する。上述の実施例に示されるデータは、多様なカチオン性脂質が活性 なリボザイムを平滑筋細胞に輸送しうることを示す。上述の実施例において実施 された実験と類似した実験を用いて、いずれの脂質がリボザイムの特定の細胞へ の最適な輸送を与えるかを判定する。他のそのような輸送方法が当該技術分野に おいて知られており、本発明において用いることができる。 平滑筋細胞の増殖はまた、化学的に安定化させたリボザイムの直接添加により 阻害することができる。おそらく、取り込みは、細胞膜を横切る陰イオン性核酸 の受動的拡散を介する。この場合、リガンドをリボザイムに直接カップリングさ せることにより効率は非常に高まるであろう。次に、レセプター媒介性取り込み によりリボザイムを細胞に輸送する。このようなコンジュゲートされた外転（ａ ｂｄｕｃｔｓ）を用いて、リボザイム切断活性に必要なホスホジエステル結合を 変更することなく、細胞取り込みを数桁増加させることができる。 あるいは、リボザイムは、当業者に知られる種々の方法により細胞に投与する ことができ、これにはリポソーム中への封入、イオントホレシス、またはヒドロ ゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生物接着性微小球等 の他のベヒクル中への取り込みが含まれるが、これらに限定されない。 ＲＮＡ／ベヒクルの組み合わせ物を、直接注入により、またはカテーテル、注 入ポンプまたはステントの使用により、局所的に輸送する。輸送の別の経路とし ては、筋肉内注射、エアロゾル吸入、経口（錠剤または丸薬の形態）、局所、全 身、眼、腹膜内および／または鞘内輸送が挙げられるが、これらに限定されない 。リボザイムの輸送および投与のより詳細な記載は、Ｓｕｌｌｉｖａｎら（上掲 ）およびＤｒａｐｅｒら（上掲）（本明細書の一部としてここに引用されている ）に提供されている。 本明細書において記載される化学的修飾、リボザイム配列およびリボザイムモ チーフは、非限定的例を意味するものであり、当業者は、標準的な技術を用いて リボザイムのヌクレアーゼ安定性を増強させるために他の修飾（塩基、糖および リン酸修飾）を容易に生成することができ、したがってこれらも本発明の範囲内 であることを容易に理解するであろう。ＥＧＦＲを標的とするリボザイムの使用 多くの癌においてＥＧＦＲの過剰発現が報告されている（上述を参照）。すな わち、ＥＧＦＲ発現の阻害（例えば、リボザイムを用いて）は、多くの癌の細胞 増殖をインビトロおよびインビボで減少させることができ、その増殖可能性を減 少させることができる。 リボザイムはその触媒的活性および増加した部位特異性（上述を参照）を有し ており、癌の治療のための強力かつ安全な治療的分子であるようである。本発明 においては、リボザイムが平滑筋細胞増殖およびストロメリシン遺伝子発現を阻 害することが示される。記載される実施例から、同じリボザイムを同様の様式で 癌細胞に輸送してその増殖を妨害しうることが当業者には明らかであろう。これ らのリボザイムを現存する癌治療とともに用いることができる。 神経膠腫は、脳から発生する最も一般的な原発性腫瘍であり、実際、悪性神経 膠腫は毎年癌による死亡の約２．５％を占める（Ｂｒｕｎｅｒ，１９９４）。こ れらの神経膠腫は、形態学的におよび生物学的に異質であり、いくつかの細胞タ イプに由来する新生物を含む。星状細胞腫は原発性腫瘍のうち最も大きな単一の 群を形成し（７５−９０％）、これはまた乏突起神経膠腫、脳室上衣細胞腫およ び混合神経膠腫を含む（Ｂｒｕｎｅｒ，１９９４）。区別しうる組織学的特性の ため、星状細胞腫は未分化のレベルに分類される。今日最も広く用いられている ものは、３層の分類システムを含み（Ｒｉｎｇｅｒｔｚ，１９５０）、星状細胞 腫は小分類の星状細胞腫、未分化星状細胞腫および神経芽細胞腫に分けられる。 最も悪性でありしばしば発生する形態である多形性神経芽細胞腫（ＧＢＭ）は 、すべての原発性脳腫瘍の約３分の１を占める（Ｗｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９ ９４）。この腫瘍は、元の細胞が不明瞭なままであるほど未分化であるが、細胞 の細胞質中で星状細胞の組織学的マーカーであるグリア繊維性酸性蛋白質（ＧＦ ＡＰ）を同定することができるため、ほとんどの例は一般に星状細胞から生ずる と考えられている。 神経芽細胞腫の組織学的形態は、高度に可変性であることができ、”多形性” との名前が確認される。 多形性神経芽細胞腫の特徴は腫瘍壊死である。個々の細胞は高い核／細胞質比 を有する小さいものであるか、または非常に大きくかつ豊富な好酸性細胞質を有 する奇怪なものであるかもしれない。小さい細胞は、より増殖性であり、より攻 撃的な進行を示す。実際、ある神経芽細胞腫は、小さい未分化細胞の集団が髄芽 細胞腫等の初期神経板外胚葉腫瘍を刺激するほど、非常に高度に細胞性である。 これらの小さい細胞はしばしば腫瘍壊死形成の領域のまわりに凝縮して、特徴的 な”偽観兵式状配列（ｐｓｅｕｄｏｐａｌｉｓａｄｅｓ）”を形成するように見 える。これらはまた、脳に広範囲に浸透して、多病巣性神経膠腫の外観を与える 傾向を有する。 癌研究および治療の多くの分野での進歩にもかかわらず、多形性神経芽細胞腫 はほとんど常に致命的なものであることが判明しており、中央生存率は１年未満 であり、５年生存率は５．５％またはそれ以下である（Ｍａｒｔｕｚａ，ｅｔ ａｌ．，１９９１）。現在のところ、神経芽細胞腫を有する患者の結果を実質的 に変化させる治療様式はない。このタイプの腫瘍の特徴、例えばその侵襲性、免 疫系に認識されることを回避しながら局所的および遠所に広がる能力、放射線に 対して比較的耐性であること、および高い局所再発率は、慣用的な治療の成功を 制限している。したがって、多形性神経芽細胞腫の有効な治療は大きな挑戦であ る。 悪性神経膠腫の治療技術において用いられている現在の治療の方法を簡単に概 説する。 外科手術： 多形性神経芽細胞腫腫瘍の治療の基本は外科手術である。顕微手術技術、手術 中超音波吸弘電気生理学的モニタリングおよびレーザーの使用により、外科手術 方法は安全かつ正確になった（Ｋｏｒｎｂｌｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９３） 。外科手術は多形性神経芽細胞腫を有する患者の生存率を向上させるが、腫瘍に 陥入された大脳皮質を表現する（ｅｌｏｑｕｅｎｔ）領域を外科的に除去できな いことが、そのような切除技術の価値を低くしている。 放射線療法： 悪性神経膠腫、例えば多形性神経芽細胞腫は、放射線療法に対して驚くべき耐 性を示し、したがって、この形の治療の有効性は限定されている。周囲の影響さ れていない脳の感受性が、安全に加えることができる用量を６0Ｇｙに制限する （Ｌｅｉｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９４）。この用量は、大部分の患者におい て原発性腫瘍を完全に根絶するのに必要なレベルよりかなり低い。さらに、全脳 放射線療法は、局所的腫瘍再発を予防しない。より局所的な形の放射線療法、例 えば放射性増感剤および放射線外科手術の技術の有効な使用が現在のところ検討 されている。 化学療法： 化学療法は、癌の治療において外科手術および放射線治療に加えて有効である ことが示されている。しかし、残念ながら、化学療法は大分類の星状細胞腫を有 する患者の生存率には限定された影響しか有しなかった。１９９３年に発行され た報告は、外科手術および放射線に化学療法を加えることがこれらの患者におい て中央生存期間を９．４から１２か月に改善したと判定した（Ｆｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９３）。 一般に、比較的脂肪溶解性でありイオン化していないニトロソウレア薬剤；例 えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチンおよびニムスチンは、悪性星状細 胞腫の治療のための最も活性の高い単一化学療法剤であることが証明されている （Ｌｅｓｓｅｒ＆Ｇｒｏｓｓｍａｎ，１９９４）。新たな薬剤が次々に神経芽細 胞腫を有する患者での臨床試験に入っているが、これまでのところいずれも患者 の寿命を実質的に延長していない。無数の生理学的および生物学的因子、例えば 血液脳関門、異種でありかつ耐性の腫瘍細胞集団、および許容しえない毒性が、 これらの薬剤の有効性を制限している。 血管脳関門の透過不可能を克服するために多様な投与経路が用いられてきた。 化学療法剤を含浸した生分解性ポリマーを組み込んだ独特の輸送系が報告されて いる（Ｂｒｅｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９１）。これらのポリマーは切除部位に局 所的に配置され、ポリマーが分解するにつれて薬剤がゆっくり放出される。また 、腫瘍内への直接注入も、全身への暴露なしに最も高い用量を腫瘍部位に輸送す る手段として有用であろう。 免疫治療： 多形性神経芽細胞腫は、免疫学的指向性療法の適当な標的である。これまでの 研究により、ＧＢＭを有する患者からの血清は、体液性応答をほとんどまたは全 く刺激しないことが示されている。したがって、現実的なアプローチは、神経芽 細胞腫患者においてより強い免疫応答を刺激することである。このアプローチは 理論的には有望であるように見えるが、これまでに臨床的に免疫応答を刺激する 有効な手段は同定されていない。最も有望な達成手段は、リンホカイン活性化キ ラー（ＬＡＫ）細胞およびインターロイキン２を使用するものであるが、これは 腫瘍特異的細胞回帰がないことおよびＬＡＫ細胞の輸送の困難さおよび毒性によ り制限されている。 癌の分子的基礎の理解の前進は、今や癌細胞と特異的に相互作用する分子を設 計することを可能とした。したがって、ＧＢＭの治療のための最も有望な治療様 式は、特定の細胞の性質または挙動を変更するために遺伝的介入を利用する、分 子に基づいた技術とともに存在するであろう。 実際、多形性神経芽細胞腫腫瘍は、ほとんど転移せず、直接輸送技術によりア クセス可能であり、ＭＲＩおよびＣＴスキャンにより精密に監視することができ るため、このタイプの治療の理想的な候補である。また、腫瘍細胞は急速に分裂 し、このため、レトロウイルス等の薬剤が細胞に感染して遺伝子を合成し、腫瘍 細胞の破壊をひきおこすことが可能である（Ｋｏｒｎｂｌｉｔｈ，ｅｔ ａｌ． ，１９９３）。 悪性神経膠腫に関する多くの詳細な細胞遺伝学研究が行われてきており、一般 に生ずる異常性を明らかにした（Ｂｉｇｎｅｒ＆Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９９ ０）。例えば、約８０％の悪性神経膠腫は、第７染色体の１つまたはそれ以上の コピーを獲得しており、約６０％は第１０染色体の欠失を示す。さらに、最も共 通する遺伝的異常の１つは、ＤＭ染色体の存在である。ＤＭ染色体とは、対にな っているがセントロメアを欠失している染色体の小部分を表す。これは、遺伝子 増幅の核型の現れである。そのようなＤＭの存在は、５０％以上の神経芽細胞腫 に見いだされており、いくつかの腫瘍は細胞あたり５０−１００コピーのＤＭを 有する（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９４）。このことは、癌細胞 における遺伝子増幅がある量の蛋白質を増加させる鍵となる方法であることを示 す。 研究は、多くの遺伝子、例えば表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）；ｃ−ｍ ｙｃ，ｒｏｓ−１，ｍｙｂ，およびｇｌｉの遺伝子が神経芽細胞腫腫瘍において 増幅されていることを示す（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，１−９９４； Ｗｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９４）。したがって、多形性神経芽細胞腫の治療 における新規な形態の治療の将来の開発のための多くの標的領域が存在する。 診断用途 本発明のリボザイムは、診断道具として用いて、疾患細胞内の遺伝的浮動およ び突然変異を試験するか、または細胞内におけるＥＧＦＲ ＲＮＡの存在を検出 するために用いることができる。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間の密 接な関係により、分子の任意の領域において、標的ＲＮＡの塩基対形成および三 次構造を変化させる突然変異の検出が可能である。本発明に記載される多重リボ ザイムを用いることにより、ＲＮＡの構造およびインビトロでのならびに細胞お よび組織における機能に重要なヌクレオチド変化を位置づけることができる。リ ボザイムによる標的ＲＮＡの切断を用いて、遺伝子発現を阻害し、疾患の進行に おける特定の遺伝子産物の役割（本質的な）を特定することができる。このよう にして、他の遺伝的標的を疾患の重要な媒介物として特定することができる。こ のような実験は、コンビナトリアル治療（例えば、異なる遺伝子を標的とする多 重リボザイム、既知の小分子阻害剤と結合させたリボザイム、またはリボザイム および／または他の化学的もしくは生物学的分子の組合せによる断続的治療）の 可能性を与えることにより、疾患進行のよりよい治療をもたらすであろう。本発 明のリボザイムの他のインビトロの用途は当該技術分野においてよく知られてお り、これにはＥＧＦＲ関連病状に関連するｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。こ のようなＲＮＡは、標準的な方法論を用いてリボザイムで処理した後の切断生成 物の存在を判定することにより検出される。 特定の例においては、野生型または突然変異型の標的ＲＮＡのみを切断しうる リボザイムをアッセイに用いる。第１のリボザイムを用いて試料中に存在する野 生型ＲＮＡを同定し、第２のリボザイムを用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定す る。反応対照として、野生型および変異型ＲＮＡの両方の合成基質を両方のリボ ザイムで切断して、反応における相対的なリボザイム効率および”非標的”ＲＮ Ａ種の切断がないことを示すことができる。合成基質からの切断生成物はまた、 試料集団中の野生型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーを生成す るためにも役立つ。すなわち、それぞれの分析は、２つのリボザイム、２つの基 質および１つの未知試料を必要とし、これらを組み合わせて６つの反応とする。 切断生成物の存在は、ＲＮＡｓｅ保護アッセイを用いて判定し、それぞれのＲＮ Ａの全長および切断フラグメントをポリアクリルアミドゲルの１つのレーンで分 析することができる。標的細胞における変異型ＲＮＡの発現および所望の表現型 の変化の推定上のリスクを見抜くためには、結果を定量することが絶対的に必要 というわけではない。その蛋白質生成物が表現型（すなわちＥＧＦＲ）の発現に 関与すると示唆されるｍＲＮＡの発現はリスクの確立に適切である。類似した比 活性のプローブを両方の転写産物用に用いる場合には、ＲＮＡレベルの質的比較 が適切であり、初期診断費用を軽減するであろう。ＲＮＡレベルを質的に比較し ようと量的に比較しようと、突然変異型対野生型の比がより高いことはリスクが より高いことと相関関係があろう。 他の態様は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。表１ 天然に存在するリボザイムの特徴グループＩイントロン ・サイズ：約１５０〜１０００以上のヌクレオチド。 ・標的配列中の切断部位の５’側に隣接してＵを必要とする。 ・切断部位の５’側で４〜６個のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：グアノシンの３’−ＯＨによって攻撃し、３’−ＯＨおよび ５’ グアノシンを有する切断産物を生成する。 ・活性構造の折り畳みおよび維持を助けるために、ある場合には、蛋白質の 補因子がさらに必要とされる［１］。 ・このクラスには３００以上の種類が知られている。テトラヒメナ・サーモフィ ラのｒＲＮＡ、真菌ミトコンドリア、葉緑体、ファージＴ４、らん藻類、その 他において、介在配列として見出されている。 ・主要な構造上の特徴は、系統発生比較、突然変異原性および生化学的研究によ っ てほぼ確立されている［２，３］。 ・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが立証されている［４ ，５，６，７］。 ・リボザイムの折り畳みおよび基質ドッキングに関する研究が進行中である［８ ，９，１０］。 ・重要な残基の化学修飾の検討は十分確立されている［１１，１２］。 ・このリボザイムは、結合部位が小さい（４〜６ヌクレオチド）ために標的ＲＮ Ａ切断に対して非特異的になる場合があるが、テトラヒメナのグループＩイン トロンを用いて、「欠損」β−ガラクトシダーゼのメッセージに新しいβ−ガ ラクシダーゼ配列を結合することによってこの欠損が修復されている［１３］ 。ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＭＩＲＮＡ） ・サイズ：約２９０〜４００のヌクレオチド。 ・偏在するリボ核蛋白質酵素のＲＮＡ部分。 ・ｔＲＮＡ前駆体を切断し、成熟ｔＲＮＡを形成する［１４］。 ・反応メカニズム：恐らくはＭ²⁺−ＯＨによって攻撃し、３’−ＯＨおよび５’ リン酸を有する切断産物を生成する。 ・ＲＮａｓｅＰは原核生物および真核生物全体に見出されている。このＲＮＡサ ブ ユニットは、細菌、酵母、げっ歯類および霊長類から配列決定されている。 ・内因性ＲＮａｓｅＰを治療応用に活用することは、外部ガイド配列（ＥＧＳ） と標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって可能である［１５，１６］。 ・リン酸と２’ＯＨとの接触の重要性が最近判明した［１７，１８］。グループＩＩイントロン ・サイズ：１０００以上のヌクレオチド。 ・標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［１９，２０］。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：内部アデノシンの２’−ＯＨが３’−ＯＨ、および ３’−５’および２’−５’分岐点（ｂｒａｎｃｈ ｐｏｉｎｔ）を含む 「ラリアット（ｌａｒｉａｔ）」ＲＮＡを有する切断産物を生成する。 ・ＲＮＡの切断および結合に加えてＤＮＡ切断への関与が実証された唯一の天然 リボザイム［２１，２２］。 ・主要な構造上の特徴は、系統発生比較によってほぼ確立されている［２３］。 ・２’ＯＨ接触の重要性が判明しはじめている［２４］。 ・力学的フレームワークは検討中である［２５］。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ ・サイズ：約１４４ヌクレオチド。 ・ヘアピン標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［２６］。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨが切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’，３’ −サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。 ・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていない。 ・このクラスは１種しか知られていない。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ に見出 されている。ハンマーヘッド・リボザイム（参考文献については本文を参照のこと） ・サイズ：約１３〜４０ヌクレオチド。 ・切断部位の５’側に隣接した標的配列ＵＨを必要とする。 ・切断部位の両側で可変数のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’ ，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成す る。 ・このクラスには１４種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する多くの 植物病原体（ウィルソイド：ｖｉｒｕｓｏｉｄｓ）に見出されている。 ・２つの結晶構造を含め、本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている。 ・（インビトロ選択による工学的処理に対し）ごくわずかなライゲーション活性 が示された。 ・２つ又はそれ以上のリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立さ れている。 ・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている。ヘアピン・リボザイム ・サイズ：約５０ヌクレオチド。 ・切断部位の３’側に隣接した標的配列ＧＵＣを必要とする。 ・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと、切断部位の３’側で可変数のヌ クレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’ ，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成す る。 ・このクラスには３種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する３種の植 物病原体（タバコ・リングスポット・ウィルス，アラビス・モザイク・ウィル スおよびチコリー黄色斑ウィルスのサテライトＲＮＡ）に見出されている。 ・本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている［２７，２８，２９，３０］。 ・（切断活性に加えて）ライゲーション活性があるためにこのリボザイムはイン ビトロ選択による工学処理が可能である［３１］。 ・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている ［３２］。 ・重要な残基の化学修飾検討が着手された［３３，３４］。デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム ・サイズ：約６０ヌクレオチド。 ・標的ＲＮＡのトランス切断であることが実証されている［３５］。 ・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていないが、切断部位の５ ’ 側の配列は要求されない。折りたたまれたリボザイムはシュードノット構造を 含む［３６］。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’ ，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成す る。 ・このクラスは２種しか知られていない。ヒトＨＤＶに見出されている。 ・環状のＨＤＶは活性があり、ヌクレアーゼ安定性が増加している［３７］。 表２ ２．５μｍｏｌＲＮＡ合成サイクル ＊待ち時間には輸送の間の接触時間を含めない。 表III：ヒトＥＧＦ−Ｒハンマーヘッドリボザイムおよび標的配列 ”Ｘ”は、ＨＨリボザイムのステムII領域を表す(Hertel et al.,1992 Nucleic Acids Res.20,3252)。ステムIIの長さは≧２塩基対でありうる。 表IV：ヒトＥＧＦ−Ｒヘアピンリボザイムおよび標的配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，Ｍ Ｘ (72)発明者 フェル，パトリシア イギリス国バーミンガム ビー47・６エイ チジー，ワイトホール，スリー・オーク ス・ロード 41 (72)発明者 マクスウィゲン，ジェームズ・エイ アメリカ合衆国コロラド州80301，ボール ダー，フランクリン・ドライブ 4866

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）遺伝子に由来するＲＮＡを特異的に切 断する酵素的核酸分子。 ２．前記核酸分子がヘアピンモチーフのものである、請求項１記載の酵素的核酸 分子。 ３．前記核酸分子がハンマーヘッドモチーフのものである、請求項１記載の酵素 的核酸分子。 ４．前記核酸分子が２塩基対以上の長さのステムＩＩ領域を含む、請求項３記載 の酵素的核酸分子。 ５．前記核酸分子の結合アームが配列番号１−８２３のいずれかに相補的な配列 を含む、請求項３記載の酵素的核酸分子。 ６．前記核酸分子の結合アームが配列番号１７５９−１８７０のいずれかに相補 的な配列を含む、請求項２記載の酵素的核酸分子。 ７．前記核酸ヘアピンモチーフが、配列番号１６４７−１７５８として示される リボザイム配列のいずれかから本質的になる、請求項２記載の酵素的核酸分子。 ８．前記核酸ハンマーヘッドモチーフが、配列番号８２４−１６４６として示さ れるリボザイム配列のいずれかから本質的になる、請求項３記載の酵素的核酸分 子。 ９．前記核酸分子が、デルタ肝炎ウイルス、ＶＳ核酸、グループＩイントロン、 グループＩＩイントロン、またはＲＮａｓｅＰ核酸のモチーフのものである、請 求項１記載の酵素的核酸分子。 １０．前記核酸が、前記ＲＮＡに相補的な１２−１００塩基を含む、請求項１記 載の酵素的核酸分子。 １１．前記核酸が、前記ｍＲＮＡに相補的な１４−２４塩基を含む、請求項１記 載の酵素的核酸分子。 １２．請求項１記載の酵素的核酸分子を含む哺乳動物細胞。 １３．前記細胞がヒト細胞である、請求項１２記載の細胞。 １４．請求項１記載の酵素的核酸分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を 、 該酵素的核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクター。 １５．請求項１４記載の発現ベクターを含む哺乳動物細胞。 １６．前記細胞がヒト細胞である、請求項１５記載の細胞。 １７．患者に請求項１記載の酵素的核酸分子を投与する工程を含む、癌の治療方 法。 １８．患者に請求項１４記載の発現ベクターを投与する工程を含む、癌の治療方 法。 １９．癌を治療する方法であって、 ａ） 患者から細胞を単離し； ｂ） 前記細胞に請求項１または１４記載の酵素的核酸分子を投与し；そして ｃ） 前記細胞を前記患者に再導入する の各工程を含む方法。 ２０．請求項１記載の酵素的核酸分子を含む医薬組成物。 ２１．ＥＧＦＲのレベルに関連する病状を有する患者を治療する方法であって、 前記患者に請求項１記載の酵素的核酸分子を投与することを含む方法。 ２２．ＥＧＦＲのレベルに関連する病状を有する患者を治療する方法であって、 前記患者の細胞を請求項１記載の核酸分子と接触させることを含み、かつ１つま たはそれ以上の薬剤治療の使用をさらに含むことを特徴とする方法。 ２３．前記核酸分子が少なくとも５個のリボース残基を含み、前記核酸が５’末 端ヌクレオチドの少なくとも３つにおいてホスホロチオエート結合を含み、前記 核酸が前記核酸の４位に２’−Ｃ−アリル修飾を含み、前記核酸が少なくとも１ ０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ前記核酸が３’末端修飾を含む、請求 項３記載の酵素的核酸分子。 ２４．前記核酸が前記３’末端に３’−３’結合反転リボース部分を含む、請求 項２２記載の酵素的核酸。 ２５．前記核酸分子が、少なくとも５個のリボース残基を含み、前記核酸分子が ５’末端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合を含み 、前記核酸が前記核酸分子の４位および／または７位において２’−アミノ修飾 を 含み、前記核酸分子が少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ前 記核酸が３’末端修飾を含む、請求項３記載の酵素的核酸分子。 ２６．前記核酸分子が少なくとも５個のリボース残基を含み、前記核酸分子が５ ’末端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合を含み、 前記核酸分子が前記核酸分子の４位および／または７位において脱塩基置換を含 み、前記核酸が少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ前記核酸 分子が３’−末端修飾を含む、請求項３記載の酵素的核酸分子。 ２７．前記核酸分子が少なくとも５個のリボース残基を含み、前記核酸が５’末 端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合を含み、前記 核酸分子が前記核酸分子の４位および／または７位において６−メチルウリジン 置換を含み、前記核酸分子が少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、 かつ前記核酸分子が３’末端修飾を含む、請求項３記載の酵素的核酸分子。