MXPA00009431A - Metodos y reactivos para el tratamiento de enfermedades o condiciones relacionadas con moleculas involucradas en respuestas angiogenicas - Google Patents

Abstract

Molécula deácido nucleico que modula la síntesis, expresión y/o estabilidad de un ARNm que codifica factores angiogénicos seleccionados de un transporte nuclear de hidrocarburo de arilo (ARNT) subunidad beta 3 integrin (ß3), subunidad integrin alfa 6 (alfa6) y tie-2ARN. Esta invención además proporciona un tratamiento para indicciones relacionadas con la angiogénesis usando las moléculas deácido nucleico.

Description

MÉTODOS Y REACTIVOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES O CONDICIONES RELACIONADAS CON MOLÉCULAS INVOLUCRADAS EN RESPUESTAS ANGIOGENICAS Antecedentes de la Invención Está invención se refiere a los métodos y reactivos para el tratamiento de enfermedades o condiciones relacionadas a los niveles de expresión de factores y receptores angiogénicos involucrados en la regulación de la angiogénesis. Lo siguiente es una discusión de la técnica relevante, nada de lo cual se admite que sea técnica anterior a la presente invención. La formación de vasos sanguíneos en vertebrados puede describirse en dos etapas embriónicas. Durante la primera etapa, conocida como vasculogénesis, la mesénquima de la bolsa de vitelo esplánico pleurético se distingue en células vasculares progenitoras y después en agregados de islas sanguíneas que son células sanguíneas primitivas rodeadas por progenitores endoteliales fusionados (angioblastos). Estas islas sanguíneas se funden después y van a formar un plexo vascular el cual suministra nutrientes al embrión (Merenmies et al., 1997, Gell Growth & Development 8, 3-10). La siguiente etapa de desarrollo vascular se conoce como angiogénesis. A partir de los vasos formados durante la vasculogénesis, brotan nuevos vasos sanguíneos, que se alargan y desarrollan en formaciones onduladas capilares de células endoteliales. Es un evento altamente complejo que involucra el rompimiento de la membrana basal local, la proliferación de células endoteliales, la migración y morfogénesis de microvasos (Rak et al., 1995, Anti-Cancer Drugs 6, 3-18). Órganos tales como el cerebro y el riñon se vascularizan a través del proceso angiogénico (Dumont et al., 1995, Developmental Dynamics 203, 80-92). Se ha descrito que la Angiogénesis ocurre a través de dos mecanismos, brote vascular e intususcepción. La intususcepción de vasos preexistentes ocurre después de la proliferación de células endoteliales que producen un amplio espacio. A través de la utilización de pilares o postes transcapilares de la matriz extracelular, el espacio se divide para formar dos vasos (Risau, 1997, Nature 386, 671-674). La angiogénesis que brota también se origina de vasos sanguíneos pre-existentes y consiste del brote de nuevos vasos sanguíneos, alargándose y desarrollándose en formaciones onduladas capilares de células endoteliales. Es un evento altamente complejo que involucra el rompimiento de la matriz extracelular, 1 la proliferación de células endoteliales, migración quimiotáxica y morfogénesis de microvasos (Rak, supra). Se han reportado muchos factores que regulan el control positivo y negativo de la angiogénesis demostrando la sofisticación de este proceso. Un ejemplo de un factor angiogénico es el receptor del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGFr) el cual ha demostrado ser específico a las células endoteliales y se discute en Paveo et al., Int. PCT Pub. No. WO 97/15662. A diferencia de la vasculogénesis, la angiogénesis no solamente ocurre en el desarrollo embriónico, sino también puede ocurrir durante el lapso de vida del organismo durante tales eventos como curación de heridas, reparación de huesos, inflamación, y ciclos menstruales femeninos. El suministro local de oxígeno y nutrientes y la eliminación de desechos requiere un sistema complejo de vasos sanguíneos el cual tiene la capacidad de adaptarse a medida que el tejido requiere los cambios. El envolvimiento de un gran número de factores positivos y negativos en la regulación angiogénica demuestra la complejidad de este proceso. Cuando el equilibrio entre los factores que regulan a la alta y los factores que regulan a la baja se interrumpe en favor de la angiogénesis incrementada, se conoce que ocurren los estados afectivos. Se han identificado muchos factores que contribuyen a la angiogénesis incrementada que incluyen: 1) Transportador Nuclear de Hidrocarburos de Arilo (ARNT): El ARNT (también conocido como HIF-1ß) forma heterodímeros con diversos factores que incluyen HIF-a (Maxwell et al., 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94, 8104-8109). Cuando el complejo HIF-a y ARNT en conjunto, forman un complejo llamado HIF-1. Se cree que el HIF-1 regulan los genes involucrados en la respuesta a la privación de oxígeno. Las células del tallo embriónico ARNT -/- fallan en inducir la expresión de VEGF en respuesta a la hipoxia. El ARNT -/- de ratones no son viables más allá del 10.5 días embriónicos. Al igual que el VEGF de ratones destruidos, estos embriones muestran angiogénesis defectuosa de la bolsa de vitelo (Maltepe ef al., 1997, Nature 386, 403-407). Las células del Hepatoma que contienen una mutación ARNT que es funcionalmente deficiente en la dimerización con HIF-1a muestra una expresión VEGF reducida en gran medida en respuesta a la hipoxia comparada con las células normales (Wood et al., 1996, J. Biol Chem. 271, 15117-15123). Los xenoinjertos tumorales derivados de estás células muestran vascularidad reducida y aproximadamente velocidades de crecimiento tumoral 2 veces reducidas (Maxwell et al., 1997, supra). 2) Tie-2: El Tie-2 (también conocido como Tek), es un receptor de proteína tirosina quinasa el cual consiste de 1122 aminoácidos y se produce en el endotelio, (Merenmies et al., 1997, Cell Growth & Differentiation 8, 3-10) al igual que las células tempranas hematopoyécticas (Maisonpierree et al., 1993, Oncogene 8, 1631-1637). Se ha demostrado la expresión de Tie-2 en ratones, ratas y humanos. Se piensa que el gen humano se localiza en el cromosoma 9p21 (Dumont et al., 1994, Genes & Development 8, 1897-1909). Se examinaron las células endoteliales mutantes homocigosas Tie-2 usando anticuerpo monoclonal anti-PECAM (Sato ef al., 1997, Nature 376, 70-74). Todos los mutantes homocigosos murieron dentro de los 10.5 días con deformidades obvias en la cabeza y el corazón presentes en el día 9.5. Además, no se distinguían los vasos grandes de los vasos pequeños y no se veían brotes capilares en el cerebro. Estas observaciones sugieren que el Tie-2 juega un papel importante en la angiogénesis más que en la vasculogénesis. Los efectos primeros del mutante Tie-2 comparados con el mutante Tie-1 indican papeles separados para las dos de RTK en la angiogénesis. Se han descubierto ligandos a Tie-2 y nombrado angiopoyetina 1 y 2 (angl y 2). (Davis, S. et al., 1993, Cell 87, 1161; Maisonpierree, P.C. et al., 1997, Science, 277, 55-60). Ambos factores consisten de un dominio doblemente enrollado NH2-terminal así como un dominio parecido a fibrinógeno COOH-terminal. La angl se enlaza al Tie-2/Tek pero no a Tie-1 y estimula la angiogénesis a través de la autofosforilización. La ang2 es un polipéptido de 496 aminoácidos cuyos homólogos de humano y ratón son de 85% idénticos. La autofosforilización causada por el Ang1 que enlaza al receptor Tie-2 puede bloquearse con la adición de Ang2. El receptor Tie-2 no es usual porque utiliza mecanismos de control positivos y negativos. 3) Integrinas: Las integrinas son una familia de proteínas que median la adhesión y migración de células que están comprendidas de al menos 15 subunidades alfa y 8 beta que se expresan como un número de heterodímeros enlazados no-covalentemente aß diferentes sobre las superficies celulares (Varner, 1997, Regulation of Angiogenesis, ed I. D. Goldberg & E. M. Rosen, 361-390; Brooks, 1996, Eur J Cáncer 14, 2423-2429). Se piensa que cada combinación de subunidades de integrina tiene capacidades angiogénicas, por ejemplo aßßi se ha implicado en la formación de tubos capilares. Adicionalmente, distintas integrinas permiten la unión de muchos componentes diferentes de matriz extracelular (ECM) que incluyen fibronectina, vitronectina, laminina y colágeno (Stromblad & Cheresh, 1996, Chemistry & Biochemistry 3, 881-885). Se ha demostrado que la producción de integrina se induce por un número de estímulos que incluyen incrementos del pH intracelular, concentración de calcio, síntesis de lípidos inositol, fosforilación de tirosina de un contacto focal asociado con tirosina quinasa, y la activación de p34/cdc2 y ciclina A (Varner & Cheresh, 1996, Curr Op in Cell Biol 8, 724-730). La avß3 una proteína de 160kDa es la molécula más bien caracterizada de la familia de integrina y se cree que juega un gran papel en la angiogénesis (Varner, 1997 supra). vßß enlaza el número más grande de componentes ECM de todos los heterodímeros conocidos indican que cualquier célula con estas moléculas sobre la superficie celular puede adherirse o migrar sobre casi cualquiera de los componentes ECM (Varner, 1997, supra). Cuando las células endoteliales vasculares están en su estado inactivo se expresa muy poca avß3 pero es altamente regulada hacia arriba en diversa condiciones patológicas que incluyen neoplasma. Los Antagonistas para avß3 pueden inhibir la angiogénesis en el modelo de membrana corioalantoica de pollo (CAM) y en ratones SCID y aún reducir el volumen del tumor. Cuando se administran anticuerpos para Avß3, se observa apóptosis en los vasos vasculares proliferantes. Esto ha conducido a las sugerencias de que avß3 proporciona una señal de sobrevivencia para las células vasculares permitiendo la proliferación continuada (Stromblad & Cheresh, 1996, supra; Varner, 1997 supra). Se incluyen otros objetivos angiogénicos y sus características se definen en las siguientes referencias, todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad: Methionine Aminopeptidase: (Arfin et al., 1995, PNAS 92, 7714-7718 (Genbank Accession No. U29607); Sin, N. ef al., 1997, PNAS 94, 6099-6103; Griffith et al., 1997, Chem Biol. 4(6), 461-471); Transcription factor Ets- 1: (Iwasaka, C. et al. 1996. J. 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Sci., 11, 457-461; Noma et al., l991,Grawth Factors 4 (4), 247-255; Sukurai (unpubiished) (Genbank accession No. AB009356); Transforming growth factor receptor: (Miyazono, K., 1996, Nippon Yakurigaku Zasshu 107, 133-140; Mahooti-Brooks. et al. , 1996, J. Clin. Invest. 97, 1436-1446; Lopez-Casillas et al., 1991, Cell 67 (4), 797-805; Lopez-Casillas et al., 1991, Cell 67 (4), 785-795 (Genbank Accession No. L07594); Anqioqenin: (Fett et al., 1985, Biochemistry 24, 5480-5486; Bicknell & Vallee, 1988, PNAS 85, 5961-5965; Vallee & Riordan,1988, Adv. Exp. Med. Biol 234, 41-53; Shapiro & Vallee, 1987, PNAS 84, 2238-2241; Shapiro ef al., 1986, Biochemistry 25, 3527-3532; Olson ef al., 1994, Cáncer Res. 54, 4576-4579; Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24, 5494-5499; Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24 (20), 5494-5499(Genbank Accession No. M11567)); Tumor necrosis factor receptor: (Naismith et al., 1995,. J. Inflamm 47, 1-7; Loetscher et al., 1990, Cell 61, 351-359; Himmler et al., 1990, ADN Cell Biol. 9, 705-715 (Genbank Accession No. M63121 M75861 ):Endothelial cell stimulating angioqenesis factor (ESAF): (Brown & Weiss,1988,. Ann. Rheum. Dis., 47, 881-885); lnterleukin-8 ML-8 : (Einer et al., 1991, , Am J. Pathol. 139, 977-988; Strieter et al., 1992, Am. J. Pathol. 141, 1279-1284; Mukaida et al., 1989, J. Immunol. 143-(4), 1366-1371(Genbank Accession No. M28130)); Angiopoietin 1: (Davis, S. et al. ,1996, Cell 87, 1161; Iwama, A. et al. ,1993, Biochem Biophys. Res. Commun. 195, 301; Dumont, D,J, et al. ,1995, Genes Dev 8, 1897; Sato, T.N. et al., 1995, Nature 376, 70; Suri, C. et al., 1996) Cell 87, 1171(Genbank Accession No. U83508)); Angiopoietin 2: (Maisonpierre, et al., 1997, Science, 277, 55-60;Hanahan, 1997, Science 277, 48-50; Genbank Accession NO.AF004327 (unpublished)); Insulin-like growth factor MGF-1 : (Warren, R.S. et al. ,1996, J. Biol. Chem. 271, 29483-29488; Grant et.al., 1993, Diabetologia 36, 282-291 ¡Nicosia et al., 1994, Am. J. Pathol. 145, 1023-1029; Steenbergh et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 507-514 (Genbank Accession: X57025); I nsu I i n-l i ke arowth factor receptor (IGF-1r): (Ullrich et al., 1986, EMBO J. 5, 2503-2512 (Genbank Accession No. X04434 M24599); B61: (Pandey, A. et al., 1995, Science 268, 567-569; Holzman et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 5830-5838 (Genbank Accession No. M57730 M37476); B61 receptor (Eck): (Pandey, A. et al., 1995, Science 268, 567-569; Lindberg & Hunter, 1990, Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6316-6324 (Genbank Accession No. M59371 M36395); Protein kinase C: (Morris et al., 1988, Cell Physiol. 23, C318-C322; Oikawa, T. et al., 1992, J. Antibiot. 45, 1155-1160; Finkenzeller. et al., 1992, Cáncer Res. 52, 4821-4823; Kubo et al., 1987, FEBS Lett. 223 (1), 138-142 (Genbank Accession No. X06318 M27545); ); SH2 domain (Guo, D. et al., 1995, J. Biol. Chem 270, 6729-6733) a. Phospholipase c-g: (Guo, D. at al., 1995, J. Biol. Chem 270, 6729-6733; Rhee, S.G. et al. (1992) J. Biol. Chem 267, 12393-12396; Burgess et al., 1990, Mol. Cell Biol. 10, 4770-4777 Genbank Accession No. M34667)) b.Phosphatidylinositol 3 kinase (PI-3^: (Downs, C.P.et al. ,1991, Cell Signalling 3, 501-513; Genbank accession No. Z29090; Genbank accession No. Z46973) c. Ras GTPase activating protein (GAP): (Trahey, M. et al. ,1987, Science 238, 542-545; Guo, D. et al., 1995, J. Biol. Chem 270, 6729-6733; Trahey et al., 1988, Science 242, 1697-1700 (Genbank accession No. M23612)) d. Oncoqene adaptor protein Nck:(Park & Rhee, 1992, Mol. Cell. Biol. 12, 5816-5823; Johnson, 1990, Nucleic Acids Res. 18 (4), 1048 (Genbank accession No. X17576)); Granulocvte Colony-Stimulating Factor: (Devlin et al., 1987, J. Leukoc. Biol. 41, 302-306 (Genbank accession No. M17706)); Hepatocvte growth factor: (Miyazawa et al., 1991, Eur. J. Biochem. 197 (1), 15-22 (Genbank accession No. X57574); Proliferin: (Groskopf et al., 1997, Endocrinology 138(7), 2835-2840; Jackson D, et al., 1994, Science. 266(5190), 1581-1584; Volpert et al., 1996, Endocrinology 137(9): 3871-3876); Placental growth factor: (Kodama et al., 1997, Eur J Gynaecol Oncol.; 18(6), 508-510; Ziche et al., 1997, Lab Invest. 76(4), 517-531; Relf et al., 1997, Cáncer Res. 57(5), 963-969; Genbank accession No. Y09268) Breve Descripción de la Invención La invención exhibe el uso de moléculas de ácidos nucleicos enzimáticos y los métodos para sus usos para regular hacia abajo e inhibir la expresión de factores angiogénicos. Específicamente, los ácidos nucleicos enzimáticos de la presente invención se emplean como tratamiento para indicaciones relacionadas a la angiogénesis que incluyen pero no se limitan a cáncer, de generación macular relacionada a la edad (ARMD), retinopatía diabética, inflamación, artritis, psoriasis y similares. En una modalidad preferida, la invención exhibe las moléculas de ácido nucleico enzimáticas que desdoblan los ARNs que codifican angiogénicos seleccionados de un grupo que comprende: Tie-2, subunidad ß3 de integrina, subunidad a6, y transportador nuclear de hidrocarburos de arilo (ARNT). Por "inhibir" se quiere dar a entender que la actividad del ARN desdoblado se reduce debajo de aquel observado en la ausencia de ácido nucleico. En una modalidad, la inhibición con ribozimas está preferiblemente debajo de aquel nivel observado en la presencia de una molécula de ARN enzimáticamente inactiva que es capaz de enlazarse al mismo sitio sobre el ARNm, pero es incapaz de desdoblar aquel ARN. Por "factores angiogénicos" se quiere dar a entender una molécula de péptido la cual está involucrada en un proceso o ruta necesaria para la formación de vasos sanguíneos novedosos.

En otra modalidad preferida, la invención exhibe el uso de ácidos nucleicos enzimáticos que desdoblan los ARNs codificados por factores angiogénicos seleccionados de un grupo que comprende: Metionina Aminopeptidasa; factor de Transcripción Ets-1; integrina; plaquetas derivadas del factor de crecimiento de células endoteliales (PD-ECGF); receptor de PD-ECGF; Factores de Crecimiento Transformante (TGFs); receptor del factor de Crecimiento Transformante; Angiogenina; Factor de angiogénesis que estimula la célula endotelial (ESAF); lnterleucina-8 (IL-8); Angiopoyetina 1 y 2; TIE-1; factor de crecimiento parecido a insulina (IGF-1); receptor del factor de crecimiento parecido a insulina (IGF-lr); B61; receptor de B61 (Eck); Proteína quinasa C; un dominio SH2 (por ejemplo Fosfolipasa c-g, Fosfatidilinositol 3 quinasa (PI-3), Proteína que activa Ras GTPasa (GAP); Proteína Nck Adaptador de Oncogen; Factor Estimulante de Colonia de Granulosito; factor de crecimiento de Hepatosito; Proliferin; y factor de crecimiento de Placenta Por "ácido nucleico enzimático" se quiere dar a entender una molécula de ácido nucleico capaz de catalizar reacciones que incluyen, pero no se limitan a, desdoblamiento de sitio específico y/o unión de otras moléculas de ácido nucleico, desdoblamiento de enlaces de amida y péptido, y trans-empalme. Tal molécula con actividad de endonucleasa puede tener complementariedad en un sustrato que enlaza la región a un gen objetivo especificado, y también tiene una actividad enzimática que desdobla específicamente el ARN o ADN en ese objetivo. Es decir, la molécula de ácido nucleico con actividad endonucleasa es capaz de desdoblar intramolecular o intermolecularmente el ARN o ADN e inactivar con esto una molécula objetivo de ARN o ADN. Está complementariedad funciona para permitir la hibridización suficiente de la molécula de ARN enzimática en el ARN o ADN objetivo para permitir que ocurra el desdoblamiento. Se prefiere 100% de complementariedad, aunque también puede ser útil una complementariedad tan baja como de 50-75% en está invención. Los ácidos nucleicos pueden modificarse en la base, azúcar, y/o grupos fosfato. El término ácido nucleico enzimático se usa intercambiablemente con frases tales como ribozimas, ARN catalítico, ARN enzimático, ADN catalítico, oligonucleótidos catalíticos, nucleozima, ADNzima, enzima de ARN, endo-ribonucleasa, endonucleasa, minizima, zima líder, oligozima o enzima de ADN. Todas estás terminologías describen moléculas de ácido nucleico con actividad enzimática. Las moléculas de ácido nucleico enzimático específicas descritas en la solicitud actual no significa que sean limitantes y aquellos expertos en la técnica reconocerán que todo lo que es importante en una molécula de ácido nucleico enzimático de está invención es que tiene un sustrato específico que se enlaza a un sitio el cual es complementario a una o más de las regiones de ácido nucleico objetivo, y que tiene secuencias de nucleótido dentro o alrededor de aquel sustrato que enlaza al sitio que imparte un ácido nucleico que desdobla la actividad a la molécula (Cech et al., Patente Nortemericana No. 4,987,071; Cech et al., I988, JAMA). Por "porción enzimática" o "dominio catalítico" se da a entender que está es la porción/región de la ribozima esencial para el desdoblamiento de un sustrato de ácido nucleico (por ejemplo ver Figura 1). Por "brazo que enlaza al sustrato" o "dominio que enlaza al sustrato" se da a entender que está es la porción/región de una ribozima la cual es complementaria a (es decir, apta para el par de base con) una porción de su sustrato. Generalmente, tal complementariedad es 100%, pero puede ser menor si se desea. Por ejemplo, tan pocas como 10 bases de 14 pueden ser base en par. Tales brazos se muestran generalmente en la Figura 1. Es decir, estos brazos contienen secuencias dentro de una ribozima los cuales pretenden traer la ribozima y el ARN objetivo juntos a través de las interacciones complementarias de formación de acoplamientos de base. La ribozima de la invención puede tener brazos de enlace que son contiguos o no contiguos y pueden ser de diversas longitudes. La longitud del o los brazos de enlace son preferiblemente mayores que o iguales a cuatro nucleótidos; específicamente 12-100 nucleótidos; más específicamente 14-24 nucleótidos de largo. Si se seleccionan dos brazos, el diseño es tal que la longitud de los brazos de enlace son simétricos (es decir cada uno de los brazos de enlace es de la misma longitud; por ejemplo cinco y cinco nucleótidos, seis y seis nucleótidos o siete y siete nucleótidos de largo) o asimétricos (es decir, los brazos de enlace son de diferente longitud; por ejemplo seis y tres nucleótidos; tres y seis nucleótidos de largo; cuatro y cinco nucleótidos de largo; cuatro y seis nucleótidos de largo; cuatro y siete nucleótidos de largo; y similar) Por ADNzima que quiere decir, una molécula de ácido nucleico enzimática que carece de un grupo 2'-OH. En una de las modalidades preferidas, la molécula de ácido nucleico enzimática se forma en un motivo de pez martillo u horquilla, pero también puede formarse en el motivo de un virus d hepatitis, intron grupo I, intron Grupo II o RNase P ARN (en asociación con una secuencia guía de ARN) ARN o ADNzima de eurospora VS ARN o ADNzimas. Ejemplos de tales motivos de pez martillo se describen por Dreyfus, supra, Rossi et al., 1992, AIDS Research and Human Retroviruses 8, 183; of hairpin motifs by Hampel et al., EP0360257, Hampel and Tritz, 1989 Biochemistry 28, 4929, Feldstein et al., 1989, Gene 82, 53, Haseloff and Gerlach, 1989, Gene, 82, 43, and Hampel et al., 1990 Nucleic Acids Res. 18, 299; of the hepatitis d virus motif is described by Perrotta and Been, 1992 Biochemistry 31, 16; of the ARNseP motif by Guerrier-Takada et al., 1983 Cell 35, 849; Forster and AItman, 1990, Science 249, 783; Li and AItman, 1996, Nucleic Acids Res. 24, 835; Neurospora VS ARN ribozyme motif is described by Collins (Saville and Collins, 1990 Cell 61, 685-696; Saville and Collins, 1991 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 8826-8830; Collins and Olive, 1993 Biochemistry 32, 2795-2799; Guo and Collins, 1995, EMBO. J. 14, 363); Group II introns are described by Griffin et al., 1995, Chem. Biol. 2, 761; Michels and Pyle, 1995, Biochemistry 34, 2965; Pyle et al., InteARNtional PCT Publication No. | WO 96/22689; of the Group I intron by Cech et al., Patente Norteamericana 4,987,071 and of ADNzymes by Usman et al., InteARNtional PCT Publication No. WO 95/11304; Chartrand et al., 1995, NAR 23, 4092; Breaker et al., 1995, Chem. Bio. 2, 655; Santoro et al., ¡I997, PNAS 94, 4262. Estos motivos específicos no son limitantes en la invención y aquellos expertos en la técnica reconocerán que todo lo que es importante en una molécula de ácido nucleico enzimática de está invención es que tiene un sitio de enlace a sustrato específico el cual es complementario a uno o más de las regiones de ARN del gen objetivo, y que tiene secuencias de nucleótido dentro o alrededor de ese sitio de enlace a sustrato las cuales imparten una actividad de desdoblamiento de ARN a la molécula (Cech et al., Patente Norteamericana No. 4,987,071. Por ARN "equivalente" a Tie-2, subunidad ß3 de integrina, subunidad a6 de integrina, o ARNT que quiere decir que incluye aquellas moléculas de ARN que ocurren naturalmente que tiene homología (parcial o completa) a Tie-2, subunidad ß3 de ¡ntegrina, subunidad a6, o ARNT o que codifica para proteínas con función similar de Tie-2, subunidad ß3 de integrina, subunidad a6, o ARNT en diversos animales, que incluye humanos, roedores, primates, conejo y cerdo. La secuencia de ARN equivalentes también incluye además de la región que codifica, regiones tales como región 5'- no traducida, región 3'- no traducida, intrones, unión intron-exon y similares. Por "humología " que quiere decir la secuencia de nucleótido de dos o más moléculas de ácido nucleico es parcial o completamente idénticas. Por "complementariedad" que quiere decir moléculas de ácido nucleico que forman el o los enlaces de hidrógeno con otras secuencias de ácido nucleico ya sea tipos tradicionales de Watson-Crick u otros no tradicionales (por ejemplo, tipo Hoogsteen) por interacciones de pares de base. En una modalidad preferida la invención proporciona un método para producir una clase de agentes de desdoblamiento enzimático que exhiben un alto grado de especificidad por el ARN de un objetivo deseado. La molécula de ácido nucleico enzimática se selecciona preferiblemente en una región de secuencia altamente conservada de un ARNs objetivo que codifica Tie-2, subunidad ß3 de integrina, subunidad a6 de integrina, o proteínas ARNT tales que el tratamiento específico de una enfermedad o condición pueda proporcionarse con uno o diversos ácidos nucleicos enzimáticos. Tales moléculas de ácido nucleico enzimático pueden suministrarse hexogénamente a las células específicas como se requiera. Alternativamente, las ribozimas pueden expresarse de vectores de ADN/ARN que se suministran a células específicas. Por "región de secuencia altamente conservada" que quiere decir una secuencia de nucleótido en una o más regiones en una molécula de ácido nucleico que no varia significativamente de una generación a otra o de un sistema biológico a otro. Tales ribozimas son útiles para la prevención de las enfermedades y condiciones que incluyen cáncer, retinopatia diabética, degeneración muscular, glaucoma neovascular, degeneración, miope, artritis, psoriasis, verruga vulgar, angiofibroma de esclerosis tuberosa, manchas de vino oporto, síndrome de Sturge Weber síndrome Kippel-Trenaunay-Weber, síndrome de Osler-Weber, y cualesquier otras enfermedades o condiciones que se relacionan a los niveles de actividad de Tie-2, subunidad ß3 de integrina, subunidad de a6 de integrina o ARNT en una célula o tejido. Por "relacionado" que quiere decir que la inhibición de Tie-2, subunidad ß3 de integrina, subunidad de a6 de integrina, y/o ARNT y ARNs y por lo tanto reducción en el nivel de actividad de proteína respectiva aliviara hasta un grado los síntomas de la enfermedad o condición. En modalidades preferidas, las ribozimas tienen brazos de enlace que son complementarios a las secuencias objetivo en las Tablas lll-X. Ejemplos de tales ribozimas se muestran también en las Tablas lll-X. Las Tablas lll y IV exhiben secuencias objetivo y ribozimas para ARNT, las Tablas V y VI exhiben secuencias objetivo y ribozimas para Tie-2, las tablas Vil y VIII exhiben secuencias objetivo y ribozimas para la subunidad alfa 6 de integrina, y las tablas IX y X exhiben secuencia objetivo y ribozimas para la subunidad beta 3 de ¡ntegrina. Ejemplos de tales ribozimas consisten esencialmente de secuencias definidas en estás tablas. Por "consiste esencialmente de" que quiere decir que la ribozima activa contiene un centro o núcleo enzimático equivalente aquellos en los ejemplos, y brazos de enlace capaces de enlazar ARNm tal que el desdoblamiento en el sitio objetivo ocurre. Pueden presentarse otras secuencias que no interfieran con tal desdoblamiento. Así, en un primer aspecto, la invención da importancia a ribozimas que inhiben la expresión del gen y/o la proliferación celular. Estás moléculas de ARN sintetizadas químicamente o enzimáticamente contienen dominios de enlace a substrato que se enlazan a regiones accesibles de sus mRNAs objetivo. Las moléculas de ARN también contiene dominios que catalizan el desdoblamiento de ARN. Las moléculas de ARN son preferentemente ribozimas del motivo de pez martillo u horquilla. Alternativamente, las ribozimas son DNAzimas. Al enlazarse, las ribozimas desdoblan los ARNm objetivo, previniendo la traducción y acumulación de proteínas. En la ausencia de la expresión del gen objetivo, la proliferación celular se inhibe. Las moléculas de ARN químicamente sintetizadas también incluyen moléculas de ARN ensambladas juntas de diversos fragmentos de ARN usando un método de ligadura química o enzimática. En una modalidad preferida, las ribozimas se agregan directamente, o pueden formarse en complejo con lípidos catiónicos, empacados dentro de liposomas, o de otra forma suministrados a las células objetivo. El ácido nucleico o los complejos de ácido nucleico pueden administrase localmente a los tejidos relevantes ex vivo o in vivo a través de inyección, bomba de infusión o stent, con o sin su incorporación en biopolímeros. En otra modalidad preferida, la ribozima se administra al sitio de expresión de Tie-2, subunidad ß3 de integrina, subunidad a6 de integrina, o ARNT (por ejemplo células tumorales, células del endotelio) en un vehículo de liposoma apropiado. En otro aspecto de la invención, las ribozimas que desdoblan moléculas objetivo e inhiben la actividad de Tie-2, subunidad ß3 de integrina subunidad a6 de integrina, o ARNT se expresan desde unidades de transcripción insertada dentro de vectores de ADN y ARN. Los vectores recombinantes son preferentemente plásmidos de ADN o vectores virales. Los vectores virales expresan ribozimas pueden construirse basados en, pero no se limitan a, virus asociados a adeno, retrovirus, adenovirus o alfavirus. Preferentemente, los vectores recombinantes capaces de expresar las ribozimas se suministran como se describió anteriormente, y persisten en las células objetivo. Alternativamente, los vectores virales pueden usarse proporcionando la expresión transiente de las ribozimas. Tales vectores pudieran administrase repetidamente como fuese necesario. Una vez expresados, las ribozimas desdoblan el ARN objetivo. El suministro de los vectores que expresan ribozima pueden ser sistémicos, tales como por administración intravenosa o intramuscular, por administración a las células objetivo explantadas desde el paciente seguido por la reintroducción dentro del paciente, o por cualquier otro medio que permitiera la introducción dentro de las células objetivo deseada (para una revisión ver Couture and Stinchcomb, 1996, TIG., 12, 510). En otro aspecto de la invención, las ribozimas que desdoblan las moléculas objetivo e inhiben la proliferación celular se expresan desde las unidades de transcripción insertadas dentro de ADN, ARN, o vectores virales. Preferentemente, los vectores recombinantes capaces de expresar las ribozimas se suministran localmente como se describió anteriormente, y persisten transientemente en células del músculo liso. Sin embargo, otros vectores celulares de mamífero que dirigen la expresión de ARN pueden usarse para este propósito. Por "paciente" que quiere decir un organismo el cual es un donador o recipiente de células explantadas o las células en si mismas. "Paciente" también se refiere a un organismo al cual pueden administrase moléculas de ácido nucleico enzimático. Preferentemente, un paciente es un mamífero o célula de mamífero, más preferentemente, un paciente es un humano o células humanas. Por "vectores" que quiere decir cualquier ácido nucleico- y/o técnica basada en virus usada para suministrar un ácido nucleico deseada. Estos ribozimas, individualmente, o en combinación, o en relación con otros fármacos, pueden usarse para tratar enfermedades o condiciones discutidas anteriormente. Por ejemplo, para tratar una enfermedad o condición asociada con Tie-2, subunidad ß3 de integrina, subunidad a6, de integrina, o ARNT, el paciente puede tratarse, u otras células apropiadas, pueden tratarse, como es evidente para aquellos expertos en la técnica. En una modalidad adicional, las ribozimas descritas pueden usarse en combinación con otros tratamientos conocidos para tratar condiciones o enfermedades discutidas anteriormente. Por ejemplo, las ribozimas descritas pueden usarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos conocidos para tratar cáncer. En modalidades preferidas, las ribozimas tienen brazos de enlace que son complementarios a la secuencias en las tablas, mostradas como Sec. I.D. Nos. 394-786, 849-910, 1612-2312, 2381-2448, 3588-4726, 4821-4914, 5702-6488, y 7 6569-6648. Ejemplos de tales ribozimas se muestran como secuencia de identificación Sec. I. D. Nos.1-393, 787-848, 911-1611, 2313-2380, 2449-3587, 4727-4820. 4915-5701, y 6489-6568. Pueden estar presentes otras secuencias que no interfieran con tal desdoblamiento. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes de la siguiente descripción de las modalidades preferidas del mismo, y de las reivindicaciones.

Descripción de las Modalidades Preferidas Los dibujos se describirán brevemente primero. La Figura 1 muestra el modelo de estructura secundaria para siete diferentes clases de moléculas de ácido nucleico enzimático. La flecha indica el sitio de desdoblamiento. indica la secuencia objetivo. Las líneas intercaladas con puntos quieren indicar interacciones terciarias. - quiere indicar interacción de base en pares. Grupo I intron: P1-P9.0 representa diversas estructuras tallo ondulado {.Cech et al., 1994, Nature Strut. Bio., 1, 273). RNasa P (M1RNA): EGS representa secuencia de guía externa (Forster et al.' 1990, Science, 249, 783; Pace et al., 1990, J. Biol. Chem., 265, 3587). Grupo II Intron: 5'SS significa sitio de empalme 5'; 3'SS significa sitio de empalme 3'; IBS significa sitio de enlace intron; EBS significa sitio de enlace exon (Pyle et al. ,1994, Biochemistry, 33, 2716). VS ARN: I-VI significa seis estructuras de tallo ondulado; las regiones obscurecidas significan interacción terciaria (Collins, Publicación PCT Internacional No WO 96/19577). HDV Ribozima: : l-IV quieren indicar cuatro estructuras de tallo ondulado (Been et al., Patente Norteamericana No. 5,625,047). Ribozima Pez Martillo: l-lll significa indicar tres estructuras de tallo ondulado; los tallos l-lll pueden ser de cualquier longitud y pueden ser simétricos o asimétricos (Usman et al., 1996, Curr. Op. Struct. Bio., 1, 527). Ribozima Horquilla: Hélice 1, 4 y 5 puede ser de cualquier longitud, hélice 2 está entre 3 y 8 pares de bases de largo; y E es una pirinidina; hélice 2 (H2) se proporciona con al menos 4 pares de bases (es decir, n es 1, 2, 3 o 4) y hélice 5 puede proporcionarse opcionalmente de longitud 2 o más bases (preferentemente 3-20 bases, es decir, m es de 1-20 o más). La hélice 2 y hélice 5 pueden unirse covalentemente por una o más bases fes decir, r es > 1 base). Las hélices 1, 4 o 5 también pueden extenderse por 2 o más pares de bases (por ejemplo, 4-20 pares de bases) para estabilizar la estructura de ribozima, y preferentemente es un sitio de enlace de proteína. En cada caso, cada N y N' independientemente es cualquier base normal o modificada y cada guión representa una interacción potencial de pares de base. Estos nucleótidos pueden modificarse en el azúcar, la base o fosfato. No se requieren el acoplamiento de bases completo en las hélices, pero se prefiere. Las hélices 1 y 4 pueden ser de cualquier tamaño (es decir, o y p es cada una independientemente de 0 hasta cualquier número, por ejemplo 20). Siempre y cuando se mantenga algunos pares de base. Las bases esenciales se muestran como bases específicas en la estructura, pero aquellas en la técnica reconocerán que una o más pueden modificarse químicamente (modificaciones abasicas, base, azúcar y/o fosfato ) o reemplazadas con otra base sin efecto significativo. La hélice 4 puede formarse de dos moléculas separadas, es decir, sin una ondulación que conecte. Cuando está presente la ondulación que conecta puede ser un ribonucleótido con o sin modificaciones en su base, azúcar o fosfato, "q" es > 2 bases. La ondulación que conecta también puede remplazarse con una molécula enlanzante no nucleótida. H se refiere a las bases A, U, o C. Y se refiere a bases de pirimidina. " " se refiere a un enlace covalente. (Burke et al., 1996, Nucleic Acids & Mol. Biol. , 10, 129; Chowrira et al., Patente Norteamericana No. 5,631 ,359) Figura 1a: i- GRUPO I INTRON; ii- Rnasa P (m1 ARN); Figura 1b: Dominio 1 , ii-Dominio 2; iii-Dominio 3, iv-GRUPO II INTRON, iv-Dominio 4, v Dominio 5; vii-Dominio 6; viii-; Hélice 5, ix-RIBOZIMA DE HORQUILLA, x-Hélice 2, xi Hélice 1 , xii-Hélice 4, xiii-Hélice 3; xiv-RIBOZIMA DE PEZ MARTILLO, XV-RIBOZIMA HDV. La Figura 2 es una representación diagramática de una ribozima pez martillo seleccionada en contra de Tie-2 en la posición 1037. I-SITIO DE DESDOBLAMIENTO; ii-SUSTRATO DE ARNm, iii-RIBOZIMA, iv-TALLO I, v-TALLO II, vi-núcleo, vii-TALLO lll, viii-LETRA MINÚSCULA: 2'-o-Me, ix-LETRA MAYUSCULA-:RIBONUCLEOTIDO, x-B: DESOXI ABASICO INVERTIDO, xi-s:FOSFOROTIOATO, xii-u-MODIFICACION C-ALILO, xiii- ESTRUCTURA DE RIBOZIMA DIRIGIDA A LA POSICIÓN TIE-2 428 Y SU SECUENCIA DE ARN SUSTRATO. Moléculas de Acido Nucleico Enzimático Siete variedades básicas de RNAs enzimático que ocurre naturalmente se conocen actualmente. Además, diversas estrategias de selección in vifro (evolución) (Orgel, 1979, Proc. R. Soc. London, B 205, 435) para desarrollar nuevos catalizadores de ácido nucleico capaces de catalizar el desdoblamiento y ligadura de enlaces fosfodiéster. (Joyce, 1989, Gene, 82, 83-87; Beaudry et al., 1992, Science 257, 635-641 : Joyce 1992 Scientific American 267. 90-97; Breaker et al., 1994, TIBTECH 12, 268; Bartel et al. ,1993, Science 261 :1411-1418; Szostak, 1993, TIBS 17, 89-93; Kumar et al., 1995, FASEB J., 9, 1183; Breaker, 1996, Curr. Op. Biotech., 7, 442; Santoro et al., 1997, Proc. Nati. Acad. Sci., 94, 4262; Tang et al., 1997, ARN 3, 914; Nakamaye & Eckstein, 1994, supra; Long & Uhlenbeck, 1994, supra; Ishizaka et al., 1995, supra; Vaish et al., 1997, Biochemistry 36, 6495; todos estos se incorporan para referencia en la presente). Cada uno puede catalizar una serie de reacciones que incluyen la hidrólisis de enlaces fosfodiéster en trans (y así pueden desdoblar otras moléculas de ARN) bajo condiciones fisiológicas. La Tabla I resume algunas de las características de algunos de estos ribozimas. En general, los ácidos nucleicos enzimáticos actúan uniéndose primero a un ARN objetivo. Tal enlace ocurre a través de la porción que enlaza el objetivo de un ácido nucleico enzimático el cual se mantiene en cercana proximidad a una porción enzimática de la molécula que actúa para desdoblar el ARN objetivo. Así, el ácido nucleico enzimático reconoce primero después enlaza un ARN objetivo a través del acoplamiento de bases, y una vez unido al sitio correcto, actúa enzimáticamente para cortar el ARN objetivo. El desdoblamiento estratégico de tal ARN objetivo destruirá su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína codificada. Después que un ácido nucleico enzimático ha unido y desdoblado su ARN objetivo, se libera de ese ARN para buscar otro objetivo y puede enlazar y desdoblar nuevos objetivos repetidamente .

La naturaleza enzimática de una ribozima es ventajosa sobre otras tecnologías, puesto que la concentración de ribozima necesaria para efectuar un tratamiento terapéutico es menor. Está ventaja refleja la capacidad de la ribozima para actuar enzimáticamente. Así, una molécula de ribozima sencilla es capaz de desdoblar muchas moléculas de ARN objetivo. Además, la ribozima es un inhibidor altamente especifico, con la especificidad de inhibición dependiendo no solamente del mecanismo de acoplamiento de base de unión al ARN objetivo, sino también en el mecanismo de desdoblamiento del ARN objetivo. De proporciones sencillas, o sustituciones de base, cercanas al sitio de desdoblamiento pueden seleccionarse para eliminar completamente la actividad catalítica de una ribozima. Las moléculas de ácido nucleico que tiene una actividad enzimática endonucleasa son capaces de desdoblar repetidamente otras moléculas de ARN separadas en una forma específica de secuencia de bases de nucleótidos. Tales moléculas de ácido nucleico enzimáticas pueden seleccionar para virtualmente cualquier transcripción de ARN, y desdoblamiento eficiente logrado in vitro (Zaug et al., 324, Nature 429 1986; Uhlenbeck, Nature 328, 596; Kim et al., 84 :Proc. Nati. Acad. Sci. USA 8788, 1987; Dreyfus, 1988, Einstein Ouart. J. Bio. Med., 6, 92; Haseloff and Gerlach, 334 Nature 585, 1988; Cech, 260 JAMA 3030, 1988; and Jefferies et al., 17 Nucleic Acids Research 1371, 1989; Santoro et al., 1997 supra).

Debido a su especificidad de secuencia, las ribozimas trans-desdoblamiento muestran promesa como agente terapéuticos para las enfermedades humanas (Usman & McSwiggen, 1995 Ann. Rep. Med. Chem. 30, 285-294; Christoffersen and Marr, 1995 J. Med. Chem. 38, 2023-2037). Las ribozimas pueden designarse para desdoblar específicos ARN objetivos dentro del antecedente de ARN celular. Tal evento de desdoblamiento vuelve el ARN no funcional y abroga la expresión de proteínas de ARN. En está forma, la síntesis de una proteína asociada con un estado de enfermedad puede inhibirse selectivamente. Las ribozimas que desdoblan los sitios específicos en Tie-2, subunidad ß3 de integrina, subunidad a6, de integrina y los mRNAs transportadores nucleares de hidrocarburo arilo (ARNT) representa una propuesta terapéutica novedosa para tratar cáncer, de generación macular, retinopatía diabética, inflamación, psoriasis y otras enfermedades. El solicitante indica que las ribozimas son capaces de inhibir la actividad de T-2; subunidad ß3 de integrina; subunidad de a6 de integrina; y transportador nuclear de hidrocarburo arilo (ARNT) y que la actividad catalítica de las ribozimas se requiere para su efecto inhibitorio. Aquellos expertos ordinarios en la técnica encontraran que es claro de los ejemplos descritos que otras ribozimas que desdoblan T-2, subunidad ß3, de integrina, subunidad a6 de integrina, y los mRNAs transportadores nucleares de hidrocarburo arilo (ARNT) pueden diseñarse fácilmente y estar dentro del alcance de la invención.

Sitios Objetivo Los objetivos para las ribozimas útiles pueden determinarse como se describe en Draperet al., WO 93/23569; Sullivan et al., WO 93/23057; Thompson et al., WO 94/02595; Draper et al., WO 95/04818; McSwiggen et al., Patente Norteamericana No. 5,525,468 y por la presente se incorporan en su totalidad para referencia en la presente. Más que repetir la guía provista en aquellos documentos de aquí en adelante se proporcionan ejemplos específicos de tales métodos, no limitantes a aquellos en la técnica. Las ribozimas para tales objetivos se diseñan como se describió en aquellas aplicaciones y se sintetizan para hacer probados in vitro e in vivo, como también se describió. Tales ribozimas también pueden optimizarse y suministrarse como se describió en la presente. Las secuencia de T-2, subunidad ß3, de integrina, subunidad a6 de integrina, y los mRNAs transportadores nucleares de hidrocarburo arilo (ARNT) se seleccionaron para sitios objetivo de ribozima óptimos usando un algoritmo plegable de computadora. Se identificaron los sitios de desdoblamiento de ribozima de pez martillo u horquilla. Estos sitios se muestran en las tablas lll-X (todas las secuencias son 5' a 3' en las tablas) la posición de la base del nucleótido se observa en las Tablas como ese sitio al ser desdoblado por el tipo designado de ribozima. La posición de la base del nucleótido se observa en las tablas como ese sitio a ser desdoblado por el tipo designado de la ribozima. Las ribozimas de pez martillo u horquilla se diseñaron para que pudieran enlazar y se analizaron individualmente por plegamiento de computadora (Jaeger el at., 1989 Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86 7706) para valorar si las secuencias de ribozima pliegan dentro de la estructura secundaria apropiada. Aquellas ribozimas con interacciones intramoleculares desfavorables entre los brazos de enlace y el núcleo catalítico se elimina de consideración. Puede seleccionarse diversas longitudes de brazos de enlace para optimizar la actividad. Generalmente, al menos cinco bases en cada brazo son capaces de enlazarse a, o de otra manera interactuar con el ARN objetivo. Las ribozimas del motivo pez martillo u horquilla se diseñaron para fijarse a diversos sitios en el mensaje de ARNm. Los brazos de enlace son complementarios a las secuencias de sitio objetivo descritas anteriormente.

Síntesis de Ribozima La síntesis de ácidos nucleicos mayores de 100 nucleótidos de largo es difícil su uso y métodos automatizados, y el costo terapéutico de tales moléculas es prohibitivo. En esta invención, motivos de ácidos nucleicos pequeños (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, ribozimas pez martillo u horquilla) se usan para suministro exógeno. La estructura simple de estas moléculas incrementa la capacidad del ácido nucleico para invadir regiones seleccionadas de la estructura de ARNm. Sin embargo, estas moléculas de ácido nucleico también pueden expresarse dentro de las células a partir promotores eucarióticos (por ejemplo, Izant y Weintraub, 1985 Science 229, 345; McGarry y Lindquist, 1986 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83, 399; Sullenger Scanlon et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 10591-5; Kashani-Sabet et al., 1992 Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic et al., 1992 J. Virol, 66, 1432-41; Weerasinghe et al., 1991 J. Virol, 65, 5531-4; Ojwang et al., 1992 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 10802-6; Chen et al., 1992 Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Sarver et al., 1990 Science 247, 1222-1225; Thompeon et al., 1995 Nucleic Acids Res. 23, 2259). Aquellos expertos en la técnica realizan que cualquier ácido nucleico puede expresarse en células eucarióticas desde el vector ADN/ARN apropiado. La actividad de tales ácidos nucleicos puede aumentarse por su liberación desde la transcripción primaria por una ribozima (Draper et al., PCT W093/23569, y Sullivan et al., PCT W094/02595, ambas incorporadas por la presente en su totalidad para referencia; Ohkawa et al., 1992 Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 15-6; Taira et al., 1991, Nucleic Acids Res., 19, 5125-30; Ventura et al., 1993 Nucleic Acids Res., 21, 3249-55; Chowrira et al., 1994 J. Biol. Chem. 269, 25856). Las ribozimas se sintetizaron químicamente. El método de síntesis usado sigue el procedimiento para la síntesis normal de ARN como se describe en Usman et al., 1987 J. Am. Chem. Soc, 109, 7845; Scaringe et al., 1990 Nucleic Acids Res., 18, 5433; y Wincott et al., 1995 Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684 y hace uso de grupos de acoplamiento y protectores de ácido nucleicos comunes, tales como dimetoxitritil en el extremo 5' y fosfoamiditas en el extremo 3'. En un ejemplo no limitante, la síntesis de escala pequeña se condujo sobre un sintetizador 394 Applied Biosystems, Inc. utilizando una escala de protocolo 2.5 µmol modificado con una etapa de acoplamiento de 5 minutos para nucleótidos protegidos con alquilsililo y una etapa de acoplamiento de 2.5 min. para nucleótidos 2'-0-metilados. La Tabla II delinea las cantidades, y los tiempos de contacto, de los reactivos usados en el ciclo de síntesis. Un exceso de 6.5 veces (163 µL de 0.1 M = 16.3 µmol) de fosforamidita y un exceso de 24 veces de S-etil tetrazol (238 µL de 0.25 M = 59.5 µmol) relativo a 5'-hidroxilo enlazado a polímero se usó en cada ciclo de acoplamiento. Los rendimientos de acoplamiento promedio sobre el sintetizador Applied Biosystems, Inc. 394, determinados por cuantificación colorimétrica de las fracciones tritilo, fue de 97.5-99%. Otros reactivos para la síntesis de oligonucleótidos para el sintetizador 394 Applied Biosystems, Inc.: a solución de detritilación fue 2% de TCA en cloruro de metileno (ABl); el coronamiento se realizó con 16% de N-metil imidazol en THF (ABl) y 10% de anhídrido acético/10% de 2,6-lutidina en THF (ABl); la solución de oxidación fue 16.9 mM l2, 49 mM de piridina, 9% de agua en THF (Millipore).

El acetonitrilo Grado Síntesis B & J se usó directamente desde la botella de reactivo. La solución de S-etil tetrazol (0.25 M en acetonitrilo) se hizo desde el sólido obtenido de American International Chemical, Inc. La desprotección de moléculas ARN se realizó como sigue: El oligoribonucleótido enlazado a polímero, en tritilo, se transfirió desde la columna de síntesis a un frasco de vidrio con cabeza de tornillo de 4mL y se suspendió en una solución de metilamina (MA) a 65°C durante 10 min. Después de enfriar a -20°C, se eliminó el sobrenadante del soporte de polímero. El soporte se lavó tres veces con 1.0 mL de EtOH:MeCN:H20/3:1 :1 , se agitó y el sobrenadante se agregó después al primer sobrenadante. Los sobrenadantes combinados que contienen el oligoribonucleótido, se secaron hasta un polvo blanco. El oligoribonucleótido base desprotegido se resuspendió en solución anhidra de TEA HF/NMP (250 µL de una solución de 1.5 mL de N-metilpirrolidinona, 750 µL de TEA y 1.0 mL de TEA-3HF para proporcionar una concentración de HF de 1.4 M) y se calentó a 65°C durante 1.5 h. El oligómero resultante completamente desprotegido se detuvo con 50 mM TEAB (9 mL) antes de desalar por intercambio aniónico. Para el desalado por intercambio aniónico del oligómero desprotegido, la solución de TEAB se cargó en un cartucho de intercambio aniónico Qiagen 500® (Qiagen Inc.) que se pre-lavó con 50 mM TEAB (10 mL). Después de lavar el cartucho cargado con 50 mM TEAB (10 mL), el ARN se eluyó con 2 M TEAB (10 mL) y se secó hasta un polvo blanco. Las ribozimas pez martillo inactivas se sintetizaron sustituyendo un U por G5 y un U por A?4 (numerado de Hertel, K. J., et al., 1992, Nucleic Acids Res.. 20, 3252). Los rendimientos de acoplamiento en forma de etapa promedio fueron >98% (Wincott et al., 1995 Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684). Las ribozimas de horquilla se sintetizaron en dos partes y fijaron para reconstruir la ribozima activa (Chowrira y Burke, 1992 Nucleic Acids Res., 20, 2835-2840). Las ribozimas también se sintetizaron de plantillas de ADN utilizando polimerasa ARN de bacteriófago T7 (Milligan y Uhlenbeck 1989, Methods Enzymol. 180, 51). Las ribozimas se modificaron para aumentar la estabilidad y/o aumentar la actividad catalítica por modificación con grupos resistentes a nucleasa, por ejemplo, 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-flouro, 2'-0-metilo, 2'-H, modificaciones de base de nucleótido (para una revisión ver Usman y Cedergren, 1992 TIBS 17, 34; Usman et al., 1994 Nucleic Acids Symp, Ser. 31, 163; Burgin et al., 1996 Biochemistry 6, 14090). Las ribozimas se purificaron por electroforesis en gel utilizando métodos generales o se purificaron por cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC; Ver Stinchcomb et al., Publicación Internacional PCT No. WO 95/23225, se incorpora por este medio en la presente para referencia) y se resuspendió en agua. La secuencias de las ribozimas que se sintetizaron químicamente, útiles en este estudio, se muestran en las Tablas lll-X. Aquellos en la técnica reconocerán que estas secuencias son solamente representativas muchas más secuencias en donde la porción enzimática de la ribozima (todo excepto los brazos de enlace) se altero para afectar la actividad. Por ejemplo, la secuencia II de tallo ondulado de la ribozima pez martillo puede alterarse (sustitución, deleción y/o inserción) para contener cualquier secuencia con la condición de que pueda formar una estructura mínima de tallo de dos pares de vasos. Similarmente, la secuencia IV de tallo ondulado de ribozimas de horquilla, puede alterarse (sustitución, deleción y/o inserción) para contener cualquier secuencia, con la condición de que pueda formar una estructura mínima de tallo de dos pares de bases. Preferentemente, se insertan no más de 200 bases en estas ubicaciones. Las secuencias enlistadas en las Tablas lll-X pueden formarse de ribonucleótidos u otros nucleótidos o no nucleótidos. Tales ribozimas (las cuales tienen actividad enzimática) son equivalentes a las ribozimas descritas específicamente en las Tablas.

Optimización de la Actividad de Ribozima La actividad catalítica de las ribozimas descrita en la invención actual puede utilizarse como se describió por Draper et al., supra. Los detalles no se repetirán aquí, pero incluyen alterar la longitud de los brazos de enlace de la ribozima, o sintetizar químicamente ribozimas con modificaciones (base, azúcar y/o fosfato) que prevengan su degradación por ribonucleasas de suero y/o aumentar su actividad enzimática (ver por ejemplo, Eckstein et al., Publicación Internacional No. WO 92/07065; Perrault et al., 1990 Nature 344, 565; Pieken et al., 1991 Science 253, 314; Usman y Cedergren, 1992 Trends in Biochem. Sci. 17, 334; Usman et al., Publicación Internacional No. WO 93/15187; y Rossi et al., Publicación Internacional No. WO 91/03162; Sprout, Patente Norteamericana No. 5,334,711; y Burgin ef al., supra; todas estas describen diversas modificaciones químicas que pueden hacerse a las porciones de base, fosfato y/o azúcar de moléculas de ARN enzimático). Se desean las modificaciones que aumenta su eficiencia en las células, y la eliminación de bases desde las estructuras de tallo ondulado para acortar los tiempos de síntesis de ARN y reducir los requerimientos químicos. (Todas estas publicaciones se incorporan por la presente para referencia en la presente). Existen diversos ejemplos en la técnica que describen modificaciones de azúcar, base y fosfato que pueden introducirse dentro de las moléculas de ácido nucleico enzimático sin afectar significativamente la catálisis y con aumento significativo en su estabilidad y eficiencia de nucleasa. Las ribozimas se modifican para aumentar la estabilidad y/o aumentar la actividad catalítica por modificación con grupos resistentes a nucleasa, por ejemplo, 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-flour, 2'0-metilo, 2'-H, modificaciones de base de nucleótidos (para una revisión ver Usman y Cedergren, 1992 TIBS 17, 34; Usman et al., 1994 Nucleic Acids Symp. Ser. 31. 163: Buraln et al.1996 Biochemistry 35, 140901. Las modificaciones de azúcar de las moléculas de ácido nucleico enzimático se han descrito extensamente en la técnica (ver Eckstein et al., Publicación Internacional PCT No. WO 92/07065; Perrault et al. Nature 1990, 344, 565-568; Pieken et al. Science 1991, 253, 314317; Usman y Cedergren, Trends in Biocham. Sci. 1992, 17, 334-339; Usman et al. Publicación Internacional PCT No. WO 93/15187; Sprost, Patente Norteamericana No. 5,334,711 y Beigelman et al., 1995 J. Biol. Chem. 270, 25702; todas las referencias se incorporan por la presente en su totalidad para referencia en la presente. Tales publicaciones describen métodos y estrategias generales para determinar la ubicación de la incorporación de modificaciones de azúcar, base y/o fosfato y similares dentro de ribozimas sin inhibir la catálisis, y se incorporan para referencia en la presente. En vista de tales enseñanzas, pueden usarse modificaciones como se describe en la presente para modificar los catalizadores de ácido nucleico de la invención presente.

Los catalizadores de ácido nucleico que tienen modificaciones químicas las cuales mantienen o aumentan la actividad enzimática se proporcionan. Tales ácidos nucleicos son también generalmente más resistentes a las nucleasas que el ácido nucleico sin modificar. Así, en una célula y/o in vivo la actividad puede no disminuirse significativamente. Como se ejemplifica en la presente tales ribozimas son útiles en una célula y/o in vivo aún si la actividad total se reduce 10 veces (Burgin et al., 1996, Biochemistry, 35, 14090). Tales ribozimas en la presente se dice que "mantienen" la actividad enzimática en toda la ribozima ARN. Las ribozimas terapéuticas suministradas exógenamente deben ser óptimamente estables dentro de las células hasta que la traducción del ARN objetivo sea inhibido suficiente tiempo para reducir los niveles de la proteína indeseable. Este período de tiempo varía entre horas a días dependiendo del estado afectivo. Claramente, las ribozimas deben ser resistentes a las nucleasas para funcionar como agentes terapéuticos intracelulares efectivos. Las mejorías en la síntesis química de ARN (Wincott et al., 1995 Nucleic Acids Res. 23, 2677; incorporada para referencia en la presente) han expandido la capacidad para modificar ribozimas introduciendo modificaciones de nucleótido para aumentar su estabilidad de nucleasa como se describió anteriormente. Por "nucleótido" como se usa en la presente es como se reconoce en la técnica incluyendo bases naturales (estándar), y bases modificadas bien conocidas en la técnica. Tales bases se ubican generalmente en la posición 1' de una porción de azúcar. El nucleótido comprende generalmente un grupo base, azúcar y un fosfato. Los nucleótidos pueden estar sin modificar o modificados en la porción azúcar, fosfato y/o base, (también se refiere a intercambiablemente como análogos de nucleótidos, nucleótidos modificados, nucleótidos no naturales, nucleótidos no estándar y otros; (ver por ejemplo Usman y McSwiggen, supra; Eckstein et al., Publicación Internacional PCT No. WO 92/07065; Usman et al., Publicación Internacional PCT No. WO 93/15187; todo incorporado por este medio para referencia en la presente). Existen diversos ejemplos de bases modificadas de ácido nucleico conocidas en la técnica y se han resumido recientemente por Limbach et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22, 2183. Algunos de los ejemplos no limitantes de modificaciones de base que pueden introducirse dentro de los ácidos nucleicos enzimáticos sin afectar significativamente su actividad catalítica incluyen, inosina, purina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2, 4, 6-trimetoxi benceno, 3-metil uracilo, dihidroiridina, naftilo, aminofenilo, 5-alq u i Icitidinas (por ejemplo, 5 metilcitidina), 5-alquiluridinas (por ejemplo, ribotimidina), 5- halouridina (por ejemplo, 5-bromouridina) o 6-azapirimidinas ó 6-alquilpirimidinas (por ejemplo, 6-metiluridina) y otros (Burgin et al., 1996, Biochemistry, 35, 14090). Por "Bases Modificadas" en este aspecto quiere decir bases de nucleótido distintas a adenina, guanina, citosina y uracilo en la posición 1' o sus equivalentes; tales bases pueden usarse dentro del núcleo catalítico de la enzima y/o en las regiones que enlazan sustrato. Por "nucleósido sin modificar" quiere decir una de las bases adenina, citosina, guanina, uracilo unidas al carbono 1' de la b-D-ribo-furanosa. Por "nucleótido modificado" quiere decir cualquier base de nucleótido la cual contiene una modificación en la estructura química de una base de nucleótido sin modificar, azúcar y/o fosfato. Pueden hacerse diversas modificaciones a la estructura de ribozima para aumentar la utilidad de ribozimas. Tales modificaciones aumentarán la vida de almacenamiento, la vida media in vitro, la estabilidad, y la facilidad de introducir tales ribozimas en el sitio objetivo como por ejemplo, aumentar la penetración de las membranas celulares, y conferir la capacidad de reconocer y enlazarse a las células objetivo.

Administración de Ribozimas Sullivan et al., PCT WO 94/02595, describe los métodos generales para el suministro de moléculas ARN enzimáticas. Las ribozimas pueden administrase a las células por una diversidad de métodos conocidos por aquellos familiarizados con la técnica, que incluyen, pero no se restringen a, encapsulación en liposomas, por iontoforesis, o por incorporación dentro de otros vehículos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables, y microesferas bioadhesivas. Para algunas indicaciones, las ribozimas pueden suministrarse directamente a las células ex vivo o tejido con o sin los vehículos mencionados en lo anterior. Alternativamente, la combinación de ARN/vehículo se suministra localmente por inyección directa o por uso de un catéter, bomba de infusión o stent. Otras rutas de suministro incluyen, pero no se limitan a, inyección intravascular, intramuscular, subcutánea o articulación, inhalación de aerosol, oral (forma de tableta o pildora) se suministra local, sistémica, ocular, intraperitoneal y/o intratecal. Se proporcionan descripciones más detalladas de el suministro y administración de la ribozima en Sullivan et al., supra y Draper et al., PCT W093/23569 las cuales se incorporan para referencia en la presente. Las moléculas de la invención actual pueden usarse como agentes farmacéuticos. Los agentes farmacéuticos previenen, inhiben la ocurrencia, o tratan (alivian un síntoma hasta un grado, preferentemente todos los síntomas) de un estado afectivo en un paciente. Los polinucleótidos cargados negativamente de la invención pueden administrarse (por ejemplo, ARN, ADN o proteína) e introducirse dentro de un paciente por cualquier medio estándar, con o sin estabilizantes, regulares, y similares, para formar una composición farmacéutica. Cuando se desea usar un mecanismo de suministro por liposoma, pueden seguirse los protocolos estándar para la formación de liposomas. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse y usarse como tabletas, cápsulas o elixires para la administración oral; supositorios para administración rectal; soluciones estériles; suspensiones para administración inyectable; y similares. La presente invención también incluye formulaciones farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos. Estas formulaciones incluyen sales de los compuestos anteriores, por ejemplo sales de adición acida, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, bromhídrico, acético y bencensulfónico. Una composición o formulación farmacológica se refiere a una composición o formulación en una forma adecuada para administración, por ejemplo, administración sistémica dentro de una célula o paciente, preferentemente un humano. Las formas adecuadas, en parte, dependen del uso o la ruta de entrada, por ejemplo oral, transdérmica, o por inyección. Tales formas no deben prevenir que la composición o formulación alcance una célula objetivo (es decir, una célula a la cual se desea suministrar el polímero cargado negativamente). Por ejemplo, las composiciones farmacológicas inyectadas dentro de la corriente sanguínea deben ser solubles. Se conocen otros factores en la técnica, e incluyen consideraciones tales como toxicidad y formas que previenen que la composición o formulación ejerza su efecto.

Por "administración sistémica" quiere decir absorción o acumulación sistémica in vivo de fármacos en la corriente sanguínea seguida por la distribución a través del cuerpo completo. Las rutas de administración que conducen a la absorción sistémica incluyen, sin limitaciones: intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, inhalación, oral, intrapulmonar e intramuscular. Cada una de estas rutas de administración expone los polímeros deseados cargados negativamente, por ejemplo ácidos nucleicos, a un tejido accesible enfermo. La velocidad de entrada de un fármaco dentro de la circulación ha demostrado ser una función del peso molecular o tamaño. El uso de un liposoma u otro portador de fármaco que comprende los compuestos de la invención actual puede localizar potencialmente el fármaco, por ejemplo, en ciertos tipos de tejido, tales como los tejidos del sistema endotelial reticular (RES). Una formulación de liposoma la cual puede facilitar la asociación del fármaco con la superficie de las células, tales como, linfocitos y macrófagos es también útil. Esta propuesta puede proporcionar el suministro mejorado del fármaco a las células objetivo tomando ventaja de la especificidad del reconocimiento inmune de macrófago y linfocito de células anormales, tales como células cancerosas. La invención también da importancia al uso de una composición que comprende liposomas superficie modificados que contienen polil ípidos (etilen glicol) (PEG-modificados, o liposomas de larga circulación o liposomas furtivos). Estas formulaciones ofrecen un método para ¡ncrementar la acumulación de fármacos en tejidos objetivo. Esta clase de portadores de fármaco resisten la opsonización y eliminación por el sistema fagocítico mononuclear (MPS o RES), permitiendo con eso tiempos de circulación sanguínea más largos y mejorar la exposición del tejido al fármaco encapsulado (Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). Se ha mostrado que tales liposomas se acumulan selectivamente en tumores, presumiblemente por extravasación y captura en los tejidos objetivo neovascularizados (Lasic et al., Science 1995, 267, 1215-1276; Oku et al. ,1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Los liposomas de larga circulación mejoran la farmacocinética y farmacodinámica del ADN y ARN, comparados particularmente con los liposomas catiónicos convencionales los cuales se conoce que se acumulan en los tejidos del MPS (Liar et al., J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; Choi et al., Publicación Internacional PCT No. WO 96/10391; Ansell et al., Publicación Internacional PCT No. WO 96/10390; Holly et al., Publicación Internacional PCT No. WO 96/10392; todas estas se incorporan para referencia en la presente). También es posible que los liposomas de larga circulación protejan los fármacos de degradación por nucleasa en un grado mayor comparado con los liposomas catiónicos, basados en su capacidad para evitar su acumulación en tejidos MPS metabólicamente agresivos tales como el hígado y vaso. Todas estas referencias se incorporan para referencia en la presente. La presente invención también incluye composiciones preparadas para almacenamiento o administración las cuales incluyen una cantidad farmacéuticamente efectiva de los compuestos deseados en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985) incorporado por este medio para referencia en la presente. Por ejemplo, pueden proporcionarse conservadores, estabilizadores, colorantes y agentes saborizantes. Id. en 1449. Estos incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y esteres del ácido p-hidroxibenzoico. Además, pueden usarse agentes antioxidantes y de suspensión. /c Una dosis farmacéuticamente efectiva es esa dosis requerida para prevenir, inhibir la ocurrencia, o el tratamiento (aliviar un síntoma hasta cierto grado, preferiblemente todos los síntomas) de una condición afectiva. La dosis farmacéuticamente efectiva depende en el tipo de enfermedad, la composición usada, la ruta de administración, el tipo de mamífero que se trate, las características físicas del mamífero específico bajo consideración, la medicación actual, y otros factores que aquellos expertos en las técnicas médicas reconocerán. Generalmente, una cantidad entre 0.1 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal/día de ingredientes activos se administra dependiendo de la potencia del polímero cargado negativamente. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico enzimáticas de la presente invención pueden expresarse dentro de células de promotores eucarióticos (por ejemplo, Izant y Weintraub, 1985 Science 229, 345; McGarry y Lindquist, 1986 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83, 399; Scanlon et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 10591-5; Kashani-Sabet et al., 1992 Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic et al., 1992 J. Virol, 66, 1432-41; Weerasinghe et al., 1991 J. Virol, 65, 5531-4; Ojwang et al., 1992 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 10802-6 Chen et al., 1992 Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Sarver ef al., 1990 Science 247, 1222-1225 Thompson et al., 1995 Nucleic Acids Res. 23, 2259; Good et al., 1997, Gene Therapy, 4, 45; todas las referencias se incorporan por este medio en su totalidad para referencia en la presente). Aquellos expertos en la técnica realizan cualquier ácido nucleico que puede ser expresado en células eucarióticas del vector ADN/ARN del vector apropiado. La actividad de tales ácidos nucleicos puede ser aumentada por su liberación de transcripción primaria por una ribozima (Draper et al., PCT WO 93/23569 y Sullivan et al., PCT WO 94/02595; Ohkawa et al., 1992 Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 15-6; Taira et al., 1991, Nucleic Acids Res., 19, 5125-30; Ventura et al., 1993 Nucleic Acids Res., 21, 3249-55; Chowrira et al., 1994 J. Biol.

Chem. 269, 25856; todas las referencias se incorporan por este medio en su totalidad para referencia en la presente). En otro aspecto de la invención, las moléculas de ácido nucleico enzimático que desdoblan las moléculas objetivo se expresan desde unidades de transcripción (ver por ejemplo Couture et al., 1996, TIG., 12, 510) insertadas dentro de vectores ADN o ARN. Los vectores recombinantes son preferentemente plásmidos de ADN o vectores virales. Los vectores virales que expresan ribozima pueden construirse basados en, pero no se limitan a, virus asociados a adeno, retrovirus, adenovirus o alfavirus. Preferentemente, los vectores recombinantes capaces de expresar las ribozimas se suministran como se describió anteriormente, y persisten en las células objetivo. Alternativamente, pueden usarse vectores virales que proporcionan la expresión transiente de las ribozimas. Tales vectores pueden administrarse repetidamente como sea necesario. Una vez expresados, las ribozimas desdoblan el ARN objetivo. La ribozima activa contiene un centro o núcleo enzimático equivalente a aquellos en los ejemplos, y brazos de unión capaces de unir moléculas de ácido nucleico objetivo tales que ocurre el desdoblamiento en el sitio objetivo. Pueden presentarse otras secuencias que no interfieran con tales doblamientos. El suministro de los vectores que expresan ribozimas puede ser sistémica, tal como por administración intravenosa o intramuscular, por administración a células objetivo ex-plantadas desde el paciente, o la reintroducción dentro del paciente, o por cualquier otro medio que permitiera la introducción dentro de la célula objetivo deseada (para una revisión ver Couture et al., 1996, TIG., 12, 510). En un aspecto la invención da importancia, a un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos uno de los catalizadores de ácido nucleico de la presente invención se describe. La secuencia de ácido nucleico que codifica el catalizador de ácido nucleico de la presente invención se une operablemente en una forma que permite la expresión de esa molécula de ácido nucleico. En otro aspecto la invención da importancia, al vector de expresión que comprende: a) una región de iniciación de transcripción (por ejemplo, región iniciadora eucariótica pol I, II ó lll); b) una región de terminación de transcripción (por ejemplo, región de terminación eucariótica pol I, II ó lll; c) un gen que codifica al menos uno de los catalizadores de ácido nucleico de la presente invención; y en donde el gen se une operablemente a la región de iniciación y la región de terminación, en una forma que permite la expresión y/o suministro de la molécula de ácido nucleico. El vector puede incluir opcionalmente una estructura de lectura abierta (ORF) para una proteína unida operablemente en el lado 5' o el lado 3' del gen que codifica el catalizador de ácido nucleico de la invención; y/o un intron (secuencias de intervención).

La transcripción de las secuencias de ribozima se manejan desde un promotor para ARN polimerasa I eucariótica (pol I), ARN polimerasa II (pol II), o ARN polimerasa lll (pol lll). Las transcripciones de promotores pol II o pol lll se expresaran a niveles elevados en todas las células; los niveles de un promotor pol II dado en un tipo de célula dada dependerá de la naturaleza de las secuencias regulatorias del gen (mejoradores, silenciadores, etc). por cercanía en la presente. También se usan promotores de ARN polimerasa procarióticos, con la condición de que la enzima ARN polimerasa procariótica se exprese en las células apropiadas (Elroy-Stein y Moss, 1990 Proc. Nati. Acad. Sci. U S A, 87, 6743-7; Gao y Huang 1993 Nucleic Acids Res., 21, 2867-72; Lieber et al., 1993 Methods Enzymol., 217, 47-66Í Zhou et al., 1990 Mol. Cell. Biol., 10, 4529-37). Diversos investigadores han demostrado que las ribozimas expresadas de tales promotores pueden funcionar en células de mamífero (por ejemplo. Kashani-Sabet et al., 1992 Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Ojwang et al., 1992 Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A, 89, 10802-6; Chen et al., 1992 Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Yu et al., 1993 Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A, 90, 6340-4; L'Huillier et al., 1992 EMBO J. 11, 4411-8; Lisziewicz et al., 1993 Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 90, 8000-4; Thompson et al., 1995 Nucleic Acids Res. 23, 2259; Sullenger & Cech, 1993, Science, 262, 1566). Más específicamente, las unidades de transcripción tales como las derivadas de genes que codifican U6 pequeño nuclear (RNAsn), ARN de transferencia (RNAt) y adenovirus VA ARN son útiles para generar altas concentraciones de moléculas ARN deseadas tales como ribozimas en células (Thompson et al., supra; Couture y Stinchcomb, 1996, supra; Noonberg et al., 1994, Nucleic Acid Res., 22, 2830; Noonberg et al., Patente Norteamericana No. 5,624,803; Good et al., 1997, Gene Ther. 4, 45; Beigelman et al., Publicación Internacional PCT No. WO 96/18736; todas estas publicaciones se incorporan para referencia en la presente. Las unidades de transcripción de ribozima anteriores pueden incorporarse dentro de una diversidad de vectores para su introducción dentro de células de mamífero, que incluyen pero no se restringen a, vectores ADN de plásmido, vectores ADN virales (tales como vectores adenovirus o virus asociados a adeno) o vectores ARN virales (tales como vectores retrovirales o alfavirus) (para una revisión ver Couture y Stinchcomb, 1996, supra). En aún otro aspecto la invención da importancia a un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una de las moléculas de ácido nucleico catalítico de la invención, en una forma que permite la expresión de esa molécula de ácido nucleico. El vector de expresión comprende en una modalidad: a) una región de iniciación de transcripción; b) una región de terminación de transcripción; c) un gen que codifica al menos una de las moléculas de ácido nucleico; y en donde el gen se une operablemente a la región de iniciación y la región de terminación, en una forma que permite la expresión y/o suministro de la molécula de ácido nucleico. En otra modalidad preferida el vector de expresión comprende: a) una región de iniciación de transcripción; b) una región de terminación de transcripción; c) una estructura de lectura abierta; d) un gen que codifica al menos una de las moléculas de ácido nucleico, en donde el gen se une operablemente al extremo 3' de la estructura de lectura abierta; y en donde el gen se une operablemente a la región de iniciación, la estructura de lectura abierta y la región de terminación, en una forma que permite la expresión y/o suministro de la molécula de ácido nucleico. En aún otra modalidad el vector de expresión comprende: a) una región de iniciación de transcripción; b) una región de terminación de transcripción; c) un intron; d) un gen que codifica al menos una de las moléculas de ácido nucleico; y en donde el gen se une operablemente a la región de iniciación, el intron y la región de terminación, en una forma que permite la expresión y/o suministro de la molécula de ácido nucleico. En otra modalidad, el vector de expresión comprende; a) una región de iniciación de transcripción; b) una región de terminación de transcripción; c) un intron; d) una estructura de lectura abierta; e) un gen que codifica al menos una de las moléculas de ácido nucleico, en donde el gen se une operablemente al extremo 3' y la estructura de lectura abierta; y en donde el gen se une operablemente a la región de iniciación, el intron, la estructura de lectura abierta y la región de terminación, en una forma que permite al expresión y/o suministro de la molécula de ácido nucleico.

Ejemplos Los siguientes son ejemplos no limitantes que muestran la selección aislamiento, síntesis y actividad de los ácidos nucleicos enzimáticos de la presente invención. Los siguientes ejemplos demuestran la selección de ribozima que desdobla Tie-2, subunidad b3 de integrina, subunidad a6 de integrina, y transportador nuclear de hidrocarburo arilo (ARNT). Los métodos descritos en la presente representan un esquema por el cual las ribozimas pueden derivarse para desdoblar otros objetivos ARN requeridos para la angiogénesis. También se proporciona una descripción de como tales ribozimas pueden suministrarse a las células. Los ejemplos demuestran que a el suministro, las ribozimas inhiben la proliferación celular en cultivo y modulan la expresión del gen in vivo. Además, se observa inhibición significativamente reducida si se aplican ribozinas mutadas que están catalíticamente inactivos a las células. Así, la inhibición requiere la actividad catalítica de las ribozimas.

Ejemplo 1: Identificación de Sitios Potenciales de Desdoblamiento de Ribozima en TIE-2 La secuencia de Tie-2 humana se seleccionó por sitios accesibles usando un algoritmo de plegamiento de computadoras. Se identificaron regiones de ARNm que no formaron estructuras de plegamiento secundarias y que no contienen sitios de desdoblamiento de ribozima pez martillo y/o horquilla potenciales. Las secuencias de estos sitios de desdoblamiento se muestran en las tablas V-VI .

Ejemplo 2: Selección de Sitios de Desdoblamiento de Ribozima en TIE-2 ARN Humano Para probar si los sitios predichos por la computadora basados en el algoritmo de plegamiento de ARN corresponden a sitios accesibles en Tie-2 ARN, se seleccionaron 20 sitios pez martillo para análisis. Los sitios objetivo de ribozima se escogieron analizando las secuencias genómicas de Tie-2 (Ziegler et al., 1993, Oncogene 8 (3), 663-670 (Genbank sequence HUMTEKRPTK número de acceso: M69238) y anticipando los sitios sobre la base de plegamiento. Las ribozimas pez martillo se diseñaron de manera que pudieran enlazarse a cada objetivo (ver Figura 1) y se analizaron individualmente por plegamiento de computadora (Christoffersen et al., 1994 J. Mol. Strut. Theachem, 311, 273; Jaeger et al., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 7706) para volver si las secuencias de ribozima se pliegan en la estructura secundaria apropiada. Aquellas ribozimas con interacciones intramoleculares desfavorables entre los brazos de enlace y el núcleo catalítico se eliminaron de consideración. Como se observó anteriormente, pueden seleccionarse diversas longitudes de brazo de enlace para optimizar la actividad. Generalmente, al menos 5 bases en cada brazo son capaces de enlazarse a, o de otra forma interactuar con, el ARN objetivo. Un ejemplo de una ribozima objetivo para Tie-2 se muestra en la figura 2.

Ejemplo 3: Síntesis Química y Purificación de Ribozimas para el Desdoblamiento eficiente de TIE-2 ARN Las ribozimas del motivo pez martillo u horquilla se diseñaron para fijarse a diversos sitios en el mensaje de ARN. Los brazos de enlace son complementarios a las secuencias del sitio objetivo descritas anteriormente. Las ribozimas se sintetizaron químicamente. El método de síntesis siguió el procedimiento para la síntesis normal de ARN como se describe en Usman et al., (1987 J. Am. Chem. Sot., 109, 7845), Scaringe et al., (1990 Nucleic Acids Res. 18. 5433) y Wincott et al., supra, y hace uso de grupos de acoplamiento y protectores de ácido nucleico común, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5', y fosforamiditas en el extremo 3'. Los rendimientos de acoplamiento en forma de etapa promedio fueron >98%. Las ribozimas inactivas se sintetizaron sustituyendo un U por G5 y un U por A14 (numeración de Hertel et al., I992 Nucleic Acids Res., 20, 3252). Las ribozimas de horquilla se sintetizaron en dos partes y fijaron para reconstruir la ribozima activa (Chowrira y Burke, 1992 Nucleic Acids Res., 20, 2835-2840). Las ribozimas también se sintetizaron de plantillas ADN usando ARN polimerasa de bacteriófagos T7 (Milligan y Uhlenbeck, 1989, Methods Enzymol. 180, 51). Las ribozimas se modificaron para mejorar la estabilidad por modificación con grupos resistentes a nucleasa, por ejemplo, 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-flour, 2'-0-metilo, 2'-H (para una revisión ver Usman y Cedergren, 1992 TIBS 17, 34). Las ribozimas se purificaron por electroforesis en gel usando métodos generales o se purificaron por cromatrografía de líquidos de alta presión (HPLC; Ver Wincott et al., supra; la totalidad de lo cual se incorpora por este medio en la presente para referencia) y se resuspendieron en agua. Las secuencias de las ribozimas químicamente sintetizadas usadas en este estudio se muestran posteriormente en las Tablas V-VI.

Ejemplo 4: Desdoblamiento de Ribozima de Objetivo TIE-2 ARN in vitro Las ribozinas seleccionadas para el Tie-2 ARN se designaron y sintetizaron como se describió anteriormente. Estas ribozimas pueden probarse por actividad de desdoblamiento in vitro, por ejemplo usando el siguiente procedimiento. Las secuencias objetivo y la ubicación de nucleótidos dentro del Tie-2 ARNm se dan en la Tabla V.

Reacciones de Desdoblamiento: Se preparó ARN objetivo internamente marcado de longitud completa o de longitud completa parcial, para prueba de desdoblamiento de ribozima por transcripción in vitro en la presencia de [a"32p] CTP, pasados sobre una columna de G 50 Sephadex por cromatografía de espiral y se uso como sustrato ARN sin purificación adicional. Alternativamente, los sustratos se marcan 5'-32P-extremo usando enzima polinucleótida quinasa T4. Las pruebas se realizan pre-calentando una concentración 2X de ribozima purificada en regulador de desdoblamiento de ribozima (50 mM Tris-HCl, pH 7.5 a 37° C, 10 mM MgCI2) y la reacción de desdoblamiento se inició agregando la mezcla de ribozima 2X en un volumen igual de sustrato ARN (máximo de 1-5 nM) que también se pre-calentó en un regulador de desdoblamiento. Como una selección inicial, los ensayos se llevaron a cabo durante 1 hora a 37°C usando una concentración final de 40 nM ó 1 mM de ribozima, es decir, exceso de ribozima. La reacción se detiene por la adición de un volumen igual de 95% de formamida, 20 mM de EDTA, 0.05% de azul de bromofenol y 0.05% de xileno cianol después de lo cual la mezcla se calentó a 95°C durante 2 minutos, se enfría rápidamente y se carga sobre un gel de poliacrilamida desnaturalizante. El sustrato ARN y los productos de desdoblamiento de ARN específicos generados por el desdoblamiento de ribozima se visualizan en una autoradiografía del gel. El porcentaje de desdoblamiento se determina por la cuantificación de bandas Phosphor Imager® que representan el sustrato intacto y los productos de desdoblamiento.

Uso de Ribozimas que Seleccionan TIE-2 Se cree que la velocidad de crecimiento tumoral es una función de la sangre suministrada y por lo tanto una función de la angiogénesis (Rak, Supra; Blood & Zetter, 1990, Biochimica et Biophysica Acta 1032, 89-118). Niveles elevados de un número de estos factores angiogénicos incluyen Tie-2; subunidad ß3 de integrina; subunidad a6 de integrina; y transportador nuclear de hidrocarburo arilo se han reportado en un número de cánceres. Así, la inhibición de la expresión de estos factores angiogénicos (por ejemplo usando ribozimas) reducirían potencialmente la velocidad de crecimiento de estos tumores. El uso de la ribozima sería deseable sobre tales terapias como quimioterapéuticos, puesto que, los compuestos quimioterapéuticos tales como doxorubicina debido a su altamente específica inhibición y reducción de la probabilidad de efectos secundarios. Las ribozimas, con su actividad catalítica e incrementada especificidad de sitio (ver anteriormente), es probable que represente una molécula terapéutica potente y segura para el tratamiento de cáncer. La angiogénesis tumoral y otras indicaciones se discute posteriormente.

Indicaciones 1) Angiogénesis Tumoral: Se ha demostrado que la angiogénesis es necesaria para que los tumores crezcan en tamaño patológico (Folkman, 1971, PNAS 76, 5217-5221; Wellstein & Czubayko, 1996, Breast Cáncer Res y Treatment 38, 109-119). Además, permite a las células tumorales viajar a través del sistema circulatorio durante la metástasis. Niveles incrementados de expresión gen de un número de factores angiogénicos tales como factor de crecimiento endoteliales vascular (VEGF) se han reportado en tumores cerebrales vascularizados y asociados con edema (Berkman et al., 1993 J. Clini. Invest. 91, 153). Una demostración más directa del papel de VEGF en la angiogénesis tumoral se demostró por Jim Kim et al., 1993 Nature 362,841 en donde, se usaron exitosamente anticuerpos monoclonales en contra de VEGF para inhibir el crecimiento de células de rabdomiosarcoma, glioblastoma multiforme en ratones desnudos. Similarmente, la expresión de una forma mutada negativa dominada del receptor de fit-1 VEGF inhibe la vascularización inducida por células de glioblastoma humanas en ratones desnudos (Millauer et al., 1994, Nature 367, 576). 2) Enfermedades Oculares: Se ha demostrado que la neovascularización causa o exacerba las enfermedades oculares que incluyen pero no se limitan a, degeneración macular, glaucoma neovascular, retinopatia diabética, degeneración miopica, y tracoma (Norrby, 1997, APMIS 105, 417-437). Aiello et al., 1994 New Engl, J. Med, 331, 1480 mostraron que el fluido ocular, de una mayoría de pacientes que sufren de retinopatía diabética y otros desordenes de la retina, contiene una elevada concentración de VEGF. Miller et al., 1994 Am. J. Pathol. 145, 574, reportaron niveles elevados de VEGF ARNm en pacientes que sufren de isquemia retinal. Estas observaciones apoyan un papel directo de VEGF en las enfermedades oculares. Otros factores que incluyen aquellos que estimulan la síntesis de VEGF también pueden contribuir a estas indicaciones. 3) Desordenes Dermatológicos: Se han identificado muchas indicaciones que pueden ser dependientes de la angiogénesis que incluyen pero no se limitan a psoriasis, verruga vulgar, angiofibroma de esclerosis tuberosa, manchas de vino oporto, síndrome de Sturge Weber, síndrome de Kippel-Trenaunay-Weber y síndrome de Osler-Weber-Rendu (Norrby, supra). La inyección intradérmica del factor angiogénico b-FGF demostró angiogénesis en ratones desnudos (Weckbecker et al., 1992, Angiogénesis: Key principles-Science-Technology-Medicine, ed R. Steiner) Detmar et al., 1994 J. Exp. Med. 180, 1141 reporto que el VEGF y sus receptores estaban sobre-expresados en piel psoriática y microvasos dérmicos psoriáticos, sugiriendo que el VEGF juega un papel significativo en psoriasis. 4) Artritis reumatoide: Estudios de inmunohistoquímica e hibridización in situ en tejidos de las articulaciones de pacientes que sufren de artritis reumatoide muestran un nivel incrementado de VEGF y sus receptores (Fava et al., 1994 J. Exp. Med. 180, 341). Adicionalmente, Koch et al., 1994 J. Immunol. 152, 4149, encontraron que los anticuerpos específicos para VEGF eran capaces de reducir significativamente la actividad mitogénica de tejidos sinoviales de pacientes que sufren de artritis reumatoide. Estas observaciones apoyan un papel directo del VEGF en la artritis reumatoide. Otros factores angiogénicos que incluyen aquellos de ia presente invención también pueden involucrarse en la artritis.

Modelos Animales Existen diversos modelos animales en los cuales el efecto anti-angiogénesis de ácidos nucleicos de la presente invención, tales como ribozimas, dirigidos en contra de las ARNT ARNs pueden probarse. Típicamente se ha usado un modelo de cornea para estudiar la angiogénesis en rata y conejo puesto que la constricción de vasos puede seguirse fácilmente en este tejido normalmente a vascular (Pyey et al,, 1995 Science 268: 567-569). En estos modelos, un pequeño disco de Teflón o Hydron pretratado con un compuesto angiogénico se inserta dentro de una bolsa quirúrgicamente creada en la cornea. La angiogénesis se monitorea de 3 a 5 días después. Las ribozimas dirigidas en contra de ARNT, Tie-2 o las subunidades ARNs de integrina se suministrarían en el disco también, o por goteo al ojo durante el curso de tiempo del experimento. En otro modelo de ojo, se ha mostrado que la hipoxia causa la expresión incrementada de VEGF y la neovascularización en la retina (Pierce ef al., 1995 Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 92: 905-909; Shweiki et al., 1992 J. Clin. Invest. 91: 2235-2243J. Otro modelo animal que se dirige a la neovascularización involucra Matrigel, un extracto de membrana basal que se vuelve un gel sólido cuando se inyecta subcutáneamente (Passaniti et al. 1992 Lab. Invest. 67 519-528). Cuando el Matrigel se suplementa con factores de angiogénesis, los vasos crecen en el Matrigel durante un período de 3 a 5 días y puede valorarse la angiogénesis. De nuevo, las ribozimas dirigidas en contra de ARNT, Tie-2 o subunidades de ARN integrina se suministrarían en el Matrigel. Diversos modelos animales existen para la selección de agentes anti-angiogénicos. Estos incluyen formación de vasos de la cornea después de lesión de la córnea (Burger et al., 1985 Cornea 4: 35-41; Lepri, et al., 1994 J. Ocular Pharmacol. 10: 273-280; Ormerod et al., 1990 Am. J. Pathol. 137: 1243-1252) o factor de implante de crecimiento intracorneal (Grant et al., 1993 Diebetalogia 36: 282-291; Pyey et al. 1995 supra; Zieche et al., 1992 Lab. Invest; 67: 711-715), crecimiento de vasos en matriz Matrigel que contiene factores de crecimiento (Passaniti et al., 1992 supra), neovascularización del órgano reproductivo femenino después de manipulación hormonal (ShweiLi ef al., 1993 Clin.

Invest. 91- 2235-2243), diversos modelos que involucran la inhibición del crecimiento tumoral en tumores sólidos altamente vascularizados (O' Reilly et al., 1994 Cell 79: 315-328; Senger et al., 1993 Cáncer y Metas. Rev. 12: 303-324; Takahasi et al., 1994 Cáncer Res. 54: 4233-4237; Kim et al., 1993 supra), y neovascularización inducida por hipoxia transiente en la retina de ratón (Pierce et al., 1995 Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 92: 905-909). El modelo de cornea, descrito en Pandey et al. supra, es el modelo más común y mejor caracterizado de selección de eficiencia de agente anti-angiogénico. Este modelo involucra un tejido avascular dentro del cual los vasos se conscriben por un agente estimulante (factor de crecimiento, quemadura térmica o alkalai, endotoxina). El modelo de cornea utilizaría la implantación intrastromal de la córnea de un granulo de Teflon remojado en una solución de solución Hydron para reclutar vasos sanguíneos hacia el granulo lo cual puede cuantificarse usando técnicas de análisis microscópica y de imagen estándar. Para evaluar su eficiencia anti-angiogénica, las ribozimas se aplican localmente al ojo o se enlazan dentro del Hydron en el granulo de Teflon en sí mismo. Esta córnea vascular así como el Matrigel (ver posteriormente) proporcionan pruebas de bajo antecedente. Mientras que el modelo de córnea se ha realizado extensamente en el conejo, también se han conducido estudios en la rata.

El modelo de ratón (Passaniti et al., supra) es un modelo de no tejido el cual utiliza Matrigel, un extracto de membrana basal (Kleinman et al., 1986) o disco de filtro Millipore®, el cual puede impregnarse con factores de crecimiento y agentes anti-angiogénicos en una forma líquida antes de la inyección. En la administración subcutánea a temperatura corporal, el Matrigel o el disco de filtro Millipore® forma un implante sólido. Un compuesto angiogénico se embebería en el Matrigel o en el disco de filtro Millipore® el cual se usaría para reclutar vasos dentro de la matriz del Matrigel o el disco de filtro Millipore® que puede procesarse histológicamente para inmunohistoquímica vWF (factor VIII antígeno) específico de células endoteliales, tinción Trichrome-Masson, o contenido de hemoglobina. Como la córnea, el Matrigel o el disco de filtro Millipore® zona vasculares; sin embargo, no es tejido. En el Matrigel o modelo de disco de filtro Millipore® la ribozima se administran dentro de la matriz del Matrigel o el disco de filtro Millipore® para probar su eficiencia anti-angiogénica. Así, los asuntos de suministro en este modelo, así como con el suministro de ribozima por los granulos de Teflon remojados en Hydron en el modelo de córnea de rata, pueden ser menos problemáticos debido a la presencia homogénea de la ribozima dentro de la matriz respectiva. Estos modelos ofrecen una ventaja distinta sobre diversos otros modelos angiogénicos enlistados previamente. La capacidad para usar VEGF como un estímulo pro-angiogénico en ambos modelos es altamente deseable puesto que las ribozimas seleccionarán solamente VEGFr ARN. En otras palabras, la involucración de otros tipos no específicos de estímulos en los modelos de córnea y Matrigel no es ventajoso desde el punto de vista de entendimiento el mecanismo farmacológico por el cual las ribozimas anti-VEGFr ARN producen sus efectos. Además, los modelos permitirán probar la especificidad de las ribozimas anti-VEGFr ARN al usar ya sea a- o bFGF como un factor pro-angiogénico. La conscripción de vasos usando FGF no debe efectuarse en cualquier modelo por ribozimas anti-VEGFr ARN. Otros modelos de angiogénesis que incluyen formación de vasos en el sistema reproductivo femenino usando manipulación hormonal (Shweiki et al., I993 supra); una diversidad de modelos de tumor sólidos vasculares que involucran correlaciones directas con angiogenésis (O'Reilly et al., 1994., supra; Senger et al., 1993 supra; Takahasi ef al., 1994 supra; Kim et al., 1993 supra); y neovascularización de la retina después de hipoxia transiente (Pierce et al. 1995 supra) no se seleccionaron por eficiencia de selección debido a su naturaleza no específica, aunque existe una correlación entre VEGF y angiogénesis en estos modelos. Otros sistemas de modelo para estudiar angiogénesis tumoral se revisan por Folkman, 1985 Adv. Cáncer. Res.. 43, 175.

Uso de modelos de murino Para un estudio sistémico típico que involucra 10 ratones (20 g cada uno) por grupo de dosis, 5 dosis (1, 3, 10, 30 y 100 mg/kg diariamente durante 14 días de administración continua) se usarían aproximadamente 400 mg de ribozima, formulada en solución salina. Un estudio similar en ratas adulto jóvenes (200 g) requeriría sobre 4 g. Estudios farmacocinéticos paralelos que pueden involucrar el uso de cantidades similares de ribozimas justificando adicionalmente el uso de modelos de murino.

Ribozimas y modelos de carcinoma de pulmón Lewis y melanoma B-16 de murino. El identificar un modelo animal común para la prueba de eficiencia sistémica de las ribozimas es una forma eficiente de seleccionar ribozimas para su eficiencias sistémica. Los modelos de carcinoma de pulmón de Lewis y melanoma B-16 de murino son modelos bien aceptados de cáncer primario y metastático y se usan para la selección inicial de anti-cáncer. Estos modelos de murino no son dependientes del uso de ratones inmunodeficientes, son relativamente baratos, y minimizan las preocupaciones de alojamiento. Ambos modelos de pulmón de Lewis y melanoma B-16 involucran la implantación subcutánea de aproximadamente 10 células tumorales de líneas de células tumorales metastáticamente agresivas (línea de pulmón de Lewis 3LL o D122, LLc-LN7; melanoma B-16-BL6) en ratones C57BL/6J. Alternativamente, el modelo de pulmón de Lewis puede producirse por el implante quirúrgico de esferas tumorales (aproximadamente 0.8 mm de diámetro). La metástasis también puede modelarse inyectando células tumorales directamente i.v.. En el modelo de pulmón de Lewis, la metástasis microscópica puede observarse aproximadamente 14 días después del implante con tumores metastásicos macroscópicos cuantificables desarrollándose dentro de 21-25 días. El melanoma B-16 exhibe un curso de tiempo similar con neovascularización tumoral comenzando 4 días después del implante. Puesto que ambos tumores primario y metastásico existen en estos modelos después de 21-25 días en el mismo animal, pueden tomarse múltiples mediciones como índices de eficiencia. Pueden cuantificarse volumen de tumor primario y latencia de crecimiento así como el número de fósil de pulmón metastásico micro y macroscópico o número de animales que exhibe metástasis. El porcentaje de incremento en el intervalo de vida también puede medirse. Así, estos modelos proporcionarían pruebas de eficiencia primaria adecuada para seleccionar formulaciones sistémicamente administradas de ribozimas/ribozima. En los modelos de pulmón de Lewis y melanoma B-16, la farmacoterapia sistémica con una amplia diversidad de agentes comienza usualmente 1-7 días después del implante/inoculación del tumor con ya sea la administración de regímenes continuos o múltiples. Los estudios farmacocinéticos actuales pueden realizarse para determinar si pueden lograrse niveles suficientes de ribozima para esperar el efecto farmacodinámico. Además, los tumores primarios y la metástasis pulmonar secundaria pueden eliminarse y someterse a una diversidad de estudios in vitro (es decir reducción del ARN objetivo).

Suministro de formulaciones de ribozimas y ribozima en el modelo de pulmón de Lewis Diversas formulaciones de ribozimas, que incluyen complejos de lípidos catiónicos que pueden ser útiles para enfermedades inflamatorias (por ejemplo, DIMRIE/DOPE, etc.) y liposomas que evaden RES que pueden usarse para mejorar la exposición vascular de las ribozimas, son de interés en modelos de cáncer debido a su presumida biodistribución en el pulmón. Así, las formulaciones de liposoma pueden usarse para suministrar ribozimas a sitios de patología enlazados a una respuesta angiogénica.

Usos diagnósticos Las ribozimas de esta invención pueden usarse como herramientas de diagnóstico para examinar las mutaciones y variación genética dentro de las células afectadas o para detectar la presencia de Tie-2; subunidad ß3 de ¡ntegrina; subunidad a6 integrina; y/o ARN transportador nuclear de hidrocarburo arilo en una célula. La relación cercana entre la actividad de ribozima y la estructura del ARN objetivo permite la detección de mutaciones en cualquier región de la molécula que altera la formación de pares de base y la estructura tridimensional del ARN objetivo. Al usar los ribosimas múltiples descritos en esta invención, uno puede hacer mapas de los cambios nucleótidos que son importantes para la estructura y función del ARN in vitro, así como en células y tejidos. El desdoblamiento de los ARN objetivo con ribozima puede usarse para inhibir la expresión del gen y definir el papel (esencialmente) de productos gen especificados en la progresión de la enfermedad. De esta forma, otros objetivos genéticos pueden definirse como mediadores importantes de la enfermedad. Estos experimentos conducirán a un mejor tratamiento de la progresión de la enfermedad permitiendo la posibilidad de terapias de combinación (por ejemplo ribozimas múltiples seleccionados para genes diferentes, ribozimas acopladas con inhibieres de molécula pequeña conocidos, o tratamiento intermitente con combinaciones de ribozima y/u otros químicos o moléculas biológicas). Otros usos in vitro de las ribozimas de esta invención son bien conocidos en la técnica, e incluyen la detección de la presencia de los ARNs asociados con Tie-2; subunidad ß3 de integrina; subunidad a6 integrina; y/o condición relacionada al transportador nuclear de hidrocarburo arilo. Tal ARN se detecta determinando la presencia de un producto de desdoblamiento después del tratamiento con una ribozima usando metodología estándar. En un ejemplo específico, se usan para la prueba ribozimas que pueden desdoblar solamente formas mutantes o de tipo silvestre del ARN objetivo. La primera ribozima se usa para identificar ARN tipo silvestre presente en la muestra y la segunda ribozima se usará para identificar ARN mutante en la muestra. Conforme se controla la reacción, substratos sintéticos de tipo silvestre y mutante de ARN se desdoblarán por ambas ribozimas para demostrar las eficiencias relativas de ribozima en las reacciones y la ausencia de desdoblamiento de las especies de ARN "no seleccionadas". Los productos de desdoblamiento de los substratos sintéticos servirán también para generar marcadores de tamaño para el análisis del ARN de tipo silvestre y mutante en la muestra de población. Así, cada análisis requerirá dos ribozimas, dos substratos y una muestra desconocida, la cual se combinará dentro de seis reacciones. La presencia de productos de desdoblamiento se determinará usando una prueba de protección de ARNasa de manera que puedan analizarse los fragmentos de longitud completa y desdoblamiento de cada ARN en una línea de gel de poliacrilamida. No se requiere cuantificar absolutamente los resultados para ganar conocimiento dentro de la expresión de los ARN mutantes y el riesgo putativo en los cambios fenotípicos deseados en las células objetivo. La expresión de ARNm cuyo producto de proteína está implicado en el desarrollo del fenotipo (es decir, Tie-2; subunidad ß3 de integrina; subunidad a6 integrina; ARNT) es adecuado para establecer riesgo. Si se usan sondas de actividad específica comparable, ambas transcripciones, entonces una comparación cualitativa de los niveles de ARN serán adecuados y disminuirá el costo del diagnóstico inicial. Las relaciones de tipo silvestre a la forma del mutante elevado se correlacionarán con un alto riesgo si, los niveles de ARN se comparan cualitativamente o cuantitativamente.

Usos Adicionales La utilidad potencial de moléculas de ácido nucleico enzimáticas específicas de secuencia de la presente invención pudieran tener muchas de las mismas aplicaciones para el estudio de ARN que las endonucleasas de restricción de ADN tienen para el estudio de ADN (Nathans et al., 1975 Ann. Rev. Biochem. 44:273). Por ejemplo, el patrón de fragmentos de restricción puede usarse para establecer las relaciones de secuencia entre dos ARN relacionados, y los ARN grandes podrían desdoblarse específicamente en fragmentos de un tamaño más útil para el estudio. La capacidad para diseñar la especificidad de la secuencia de la ribozima es ideal para el desdoblamiento de los ARNs de secuencia desconocida.

Otras modalidades están dentro de las reivindicaciones siguientes.

TABLA 1 Características de las ribozimas que ocurren naturalmente Grupo I Intrones • Tamaño: -150 a >1000 nucleótidos. • Requiere un U en la secuencia objetivo inmediatamente 5' del sitio de desdoblamiento. • Enlaza 4-6 nucleótidos en el lado 5' del sitio de desdoblamiento. • Mecanismo de reacción: ataque por el 3'-OH de guanosina para generar productos de desdoblamiento con 3'-OH y 5'-guanosina. • Cofactores de proteína adicionales requeridos en algunos casos para ayudar al plegamiento y mantenimiento de la estructura activa. • Sobre 300 miembros conocidos de esta clase. Encontrado como secuencia de intervención en ARNr de Tetrahimena Thermophila, mitocondria de hingo, cloroplastos, fago T4, alga verdeazul, y otras.

• Características estructurales principales principalmente establecidas a través de comparaciones filogenéticas, mutagénesis, y estudios bioquímicos I1,2-] • Estructura cinética completa establecida para una ribozimal3-,1,5-,*]. 1 Michel, Francois; Westhof, Eric. Slippery substrates. Nat. Struct. Biol. (1994), 1(1), 5-7. 2 Lisacek, Frederique; Diaz, Yolande; Michel, Francois. Automatic identification of group I intron cores in genomic ADN sequences. J. Mol. Biol. (1994), 235(4), 1206-17. 3 Herschlag, Daniel; Cech, Thomas R.. Catalysis of ARN cleavage by the Tetrahymena thermophila ribozyme. 1. Kinetic description of the • Estudios en marcha de plegamiento de ribozima y amarre de substrato t1,8-,9-]. reaction of an ARN substrate complementary to the active site. Biochemistry (1990), 29(44), 10159-71. 4 Herschlag, Daniel; Cech, Thomas R.. Catalysis of ARN cleavage by the Tetrahymena thermophila ribozyme. 2. Kinetic description of the reaction of an ARN substrate that forms a mismatch at the active site. Biochemistry (1990), 29(44), 10172-80. 5_ Knitt, Deborah S.; Herschlag, Daniel. pH Dependencies of the Tetrahymena Ribozyme Reveal an Unconventional Origin of an Apparent pKa. Biochemistry (1996), 35(5), 1560-70. 6. Bevilacqua, Philip C; Sugimoto, Naoki; Turner, Douglas H.. A mechanistic framework for the second step of spiicing catalyzed by the Tetrahymena ribozyme. Biochemistry (1996), 35(2), 648-58. 7 Li, Yi; Bevilacqua, Philip C; Mathews, David; Turner, Douglas H..

Thermodynamic and activation parameters for binding of a pyrene-labeled substrate by the Tetrahymena ribozyme: docking is not diffusion controlled and is driven by a favorable entropy change.

Biochemistry (1995), 34(44), 14394-9. 8. Banerjee, Aloke Raj; Turner, Douglas H.. The time dependence of chemical modification reveáis slow steps ¡n the folding of a group I ribozyme. Biochemistry (1995), 34(19), 6504 12. 9 Zarrinkar, Patrick P.; Williamson, James R.. The P9.1-P9.2 peripheral extensión helps guide folding of the Tetrahymena ribozyme.

Nucleic Acids Res. (1996), 24(5), 854-8. • Investigación de la modificación química de residuos importantes bien establecidos f12-,— ]. • El sitio de enlace (4-6 nt) pequeño puede hacer de esta ribozima demasiado no específica para el desdoblamiento de ARN objetivo, sin embargo, el intron grupo I Tetrahimena se ha usado para reparar un "defectuoso" mensaje de ß-galactosidasa por la ligadura de nuevas secuencias de ß-galactosidasa en el mensaje defectuoso^].

ARNasa P ARN (M1 ARN) • Tamaño: -290 a 400 nucleótidos. • Porción de ARN de una enzima ribonucleoproteína ubicua. • Desdobla los precursores de ARNt maduro I11]. • Mecanismo de reacción: posible ataque por M2+-OH para generar productos de desdoblamiento con 3'-OH y 5'-fosfato.

Strobel, Scott A.; Cech, Thomas R.. Minor groove recognition of the conserved G. cntdot. U pair at the Tetrahymena ribozyme reaction site. Science (Washington, D. C.) (1995), 267(5198), 675-9. 11 Strobel, Scott A.; Cech, Thomas R. Exocyclic Amine of the Conserved G. cntdot. U Pair at the Cleavage Site of the Tetrahymena Ribozyme Contributes to 5'-Splice Site Selection and Transition State Stabilization. Biochemistry (1996), 35(4), 1201-11. 12 Sullenger, Bruce A.; Cech, Thomas R.. Ribozyme-mediated repair of defective ARNm by targeted trans-splicing. Nature (London) (1994), 371(6498), 619-22. 13 Robertson, H.D.; AItman, S.; Smith, J.D. J. Biol. Chem., 247. 52435251 (1972).

• La ARNsa P se encuentra a través de procarióticos y eucarióticos. La subunidad de ARN se ha secuenciado de bacterias, levaduras, roedores, y primates. • La conscripción de ARNsa endógena P para aplicaciones terapéuticas es posible a través de la hibridización de una Secuencia de Guía Externa (EGS) con el ARN objetivo!1 ,15]. • Contactos importantes de fosfato y 2' OH recientemente identificados^,1^.

Intrones Grupo II • Tamaño: >1000 nucleótidos. • Trans desdoblamiento de los ARNs objetivo recientemente demostrados [ *]. 14 Forster, Anthony C; AItman, Sidney. External guide sequences for an ARN enzyme. Science (Washington, D. C, 1883-) (1990), 249(4970), 783-6. 15 Yuan, Y.; Hwang, E. S.; AItman, S. Targeted cleavage of ARNm by human RNase P. Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89, 8006-10. 16 Harris, Michael E.; Pace, Norman R.. Identification of phosphates involved in catalysis by the ribozyme RNase P ARN. ARN (1995), 1(2), 210-18. 17 Pan, Tao; Loria, Andrew; Zhong, Kun. Probing of tertiary interactions in ARN: 2'-hydroxyl-base contacts between the RNase P ARN and pre-tRNA. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. (1995), 92(26), 12510-14. 13. Pyle, Anna Marie; Green, Justin B.. Building a Kinetic Framework for Group II Intron Ribozyme Activity: Quantitation of Interdomain Binding and Reaction Rate. Biochemistry (1994), 33(9), 2716-25.

• Requerimientos de secuencia no completamente determinados • Mecanismo de reacción: el 2'-OH de una adenosina interna genera productos de desdoblamiento con 3'-OH y un "lariat" ARN que contiene un punto de ramificación 3'-5' y un 2'-5'.

• Solo ribosimas naturales con participación demostrada en el desdoblamiento de ADN[— ,21] además de desdoblamiento y ligadura de ARN. • Características estructurales principales establecidas principalmente a través de comparaciones filogenéticas t22-]. • Comienzan a identificarse contactos importantes 2' OH p]. 19 Michels, William J. Jr.; Pyle, Anna Marie. Conversión of a Group II Intron into a New Multiple-Turnover Ribozyme that Selectively Cleaves Oligonucleotides: Elucidation of Reaction Mechanism and Structure/Function Relationships. Biochemistry (1995), 34(9), 2965-77.

Zimmerly, Steven; Guo, Huatao; Eskes, Robert; Yang, Jian; Perlman, Philip S.; Lambowitz, Alan M.. A group II intron ARN is a catalytic component of a ADN endonuclease involved in intron mobility. Cell (Cambridge, Mass.) (1995), 83(4), 529-38. 21 Griffin, Edmund A., Jr.; Qin, Zhifeng; Michels, Williams J., Jr.; Pyle, Anna Marie. Group II intron ribozymes that cleave ADN and ARN linkages with similar efficiency, and lack contacts with substrate 2'-hydroxyl groups. Chem. Biol. (1995), 2(11), 761-70. 22 Michel, Francois; Ferat, Jean Luc. Structure and activities of group II introns. Annu. Rev. Biochem. (1995), 64, 435-61. 23 Abramovitz, Dana L.; Friedman, Richard A.; Pyle, Anna Marie. Catalytic role of 2'-hydroxyl groups within a group II intron active site. Science (Washington, D.C.) (1996), 271(5254), 1410-13. • Estructura cinética bajo desarrollo t24-].

Neurospora VS ARN • Tamaño: -144 nucleótidos. • Trans desdoblamiento de los ARN objetivo de horquilla recientemente demostrado I25-]. • Requerimientos secuenciales no completamente determinados. • Mecanismos de reacción: ataque por 2'-OH 5' al enlace de escisión para generar productos de desdoblamiento con 2', 3'-fosfato cíclico y extremos 5'-OH.

• Sitios de enlace y requerimientos estructurales no completamente determinados. • Solamente un miembro conocido de esta clase. Encontrado en Neurospora VS ARN.

Ribozima de Pez martillo (ver texto para referencia) • Tamaño: -13 a 40 nucleótidos. • Requiere la secuencia objetivo UH inmediatamente a 5' del sitio de desdoblamiento. • Enlaza un número variable de nucleótidos en ambos lados del sitio de desdoblamiento. • Mecanismo de reacción: ataque por 2'-OH 5' al enlace escisión para generar productos de desdoblamiento con 2', 3'-fosfato cíclico y extremos 5'-OH. 24 Daniels, Danette L.; Michels, William J., Jr.; Pyle, Anna Marie. Two competing pathways for self-splicing by group II introns: a quantitative analysis of in vitro reaction rates and products. J. Mol. Biol. (1996), 256(1), 31-49. 25 Guo, Hans C. T.; Collins, Richard A.. Efficient trans-cleavage of a stem-loop ARN substrate by a ribozyme derived from Neurospora VS ARN. EMBO J. (1995), 14(2), 368-76. • 14 miembros conocidos de esta clase. Encontrados en un número de plantas patógenas (virusoides) que usan ARN como el agente infeccioso. • Características estructurales esenciales considerablemente definidas, incluyendo 2 estructuras cristalinas I2*.21]. • Demostrar actividad de ligadura mínima (para diseño a través de la selección in vitro) l23-]. • Estructura cinética completa establecida para dos o más ribozimas f2^]. • Investigación de la modificación química de residuos importantes bien establecida [^j.

Ribozima de Horquilla Tamaño: -50 nucleótidos. 26 Scott, W.G., Finch, J.T., Aaron.K. The crystal structure of an all ARN hammerhead ribozyme:Aproposed mechanism for ARN catalytic cleavage. Cell, (1995), 81, 991-1002. 22. McKay, Structure and function of the hammerhead ribozyme: an unfinished story. ARN, (1996), 2, 395-403. 28 Long, D., Uhlenbeck, O., Hertel, K. Ligation with hammerhead ribozymes. Patente Norteamericana No.5,633,133. 29 Hertel, K.J., Herschlag, D., Uhlenbeck, O. A kinetic and thermodynamic framework for the hammerhead ribozyme reaction. Biochemistry, (1994) 33, 3374-3385. Beigelman, L., et al., Chemical modifications of hammerhead ribozymes. J. Biol. Chem., (1995) 270, 25702-25708. 30 Beigelman, L., et al., Chemical modifications of hammerhead ribozymes. J. Biol. Chem., (1995) 270, 25702-25708. • Se requiere la secuencia GUC objetivo inmediatamente a 3' del sitio de desdoblamiento. • Enlaza 4-6 nucleótidos en el lado 5' del sitio de desdoblamiento y un número variable al lado 3' del sitio de desdoblamiento. • Mecanismo de reacción: ataque por 2'-OH 5' al enlace escisión para generar productos de desdoblamiento con 2', 3'-fosfato cíclico y extremos 5'-OH. • 3 miembros conocidos de esta clase. Encontrados en tres plantas patógenas (los ARN satélite del virus mancha en anillo del tabaco, virus de mosaico arabis y virus moteado amarillo de chicoria) las cuales usan ARN como el agente infeccioso. • Características estructurales esenciales considerablemente definidas Ia1, ^.^.^j. 31 Hampel, Arnold; Tritz, Richard; Hicks, Margaret; Cruz, Phillip. 'Hairpin' catalytic ARN model: evidence for helixes and sequence requirement for substrate ARN. Nucleic Acids Res. (1990), 18(2), 299-304. 32 Chowrira, Bharat M.; Berzal Herranz, Alfredo; Burke, John M.. Novel guanosine requirement for catalysis by the hairpin ribozyme. Nature (London) (1991), 354(6351), 320-2. 33 Berzal Herranz, Alfredo; Joseph, Simpson; Chowrira, Bharat M.; Butcher, Samuel E.; Burke, John M.. Essential nucleotide sequences and secondary structure elements of the hairpin ribozyme. EMBO J. (1993), 12(6), 2567-73. 34. Joseph, Simpson; Berzal-Herranz, Alfredo; Chowrira, Bharat M.; Butcher, Samuel E.. Substrate selection rules for the hairpin ribozyme determined by in vitro selection, mutation, and analysis of mismatched substrates. Genes Dev. (1993), 7(1), 130-8. • Actividad de ligadura (además de actividad de desdoblamiento) hace a la ribozima sujeta a diseño a través de selección in vitro Ia5-]. • Estructura cinética completa establecida por una ribozima [— ]. • Comenzó la investigación de modificaciones químicas de residuos importantes [ai,a¿].

Ribozima (HDV) del Virus Delta Hepatitis • Tamaño: -60 nucleótidos.

Trans desdoblamiento de los ARNs objetivo demostrado [**-] . Berzal Herranz, Alfredo; Joseph, Simpson; Burke, John M.. In vitro selection of active hairpin ribozymes by sequential ARN-catalyzed cleavage and ligation reactions. Genes Dev. (1992), 6(1), 129-34. 36 Hegg, Lisa A.; Fedor, Martha J.. Kinetics and Thermodynamics of Intermolecular Catalysis by Hairpin Ribozymes. Biochemistry (1995), 34(48), 15813-28. 3 L Grasby, Jane A.; Mersmann, Karin; Singh, Mohinder; Gait, Michael J.. Purine Functional Groups in Essential Residues of the Hairpin Ribozyme Required for Catalytic Cleavage of ARN. Biochemistry (1995), 34(12), 4068-76. 38 Schmidt, Sabine; Beigelman, Leonid; Karpeisky, Alexander; Usman, Nassim; Sorensen, Ulrik S.; Gait, Michael J. Base and sugar requirements for ARN cleavage of essential nucleoside residues in internal loop B of the hairpin ribozyme: implications for secondary structure. Nucleic Acids Res. (1996), 24(4), 573-81. 39 Perrotta, Anne T.; Been, Michael D.. Cleavage of oligoribonucleotides by a ribozyme derived from the hepatitis .delta. virus ARN sequence. Biochemistry (1992), 31(1), 16-21. • Requerimientos estructurales y sitios de enlace no completamente determinados, aunque no se requieren secuencias 5' de sitio de desdoblamiento. La ribozima plegada contiene una estructura de pseudonudo [^j. • Mecanismo de reacción: ataque por 2'-OH 5' al enlace de escisión para generar productos de desdoblamiento con 2', 3'-fosfato cíclico y extremos 5'-OH. • Solo 2 miembros conocidos de esta clase. Encontrados en HDV humano. • La forma celular de HDV es activa y muestra incrementada estabilidad de nucleasa Ia1]. 40 Perrotta, Anne T.; Been, Michael D. A pseudoknot-like structure required for efficient self cleavage of hepatitis delta virus ARN. Nature (London) (1991), 350(6317), 434-6. 41 Puttaraju, M.; Perrotta, Anne T.; Been, Michael D.. A circular trans-acting hepatitis delta virus ribozyme. Nucleic Acids Res. (1993), 21(18), 4253-8. Tabla II: 2.5 µmoles de ARN ciclo de síntesis Reactivo Equivalente Cantidad Tiempo Fosforamiditas 6.5 163 µL 2.5 S-Etil Tatrazol 23.8 238 µL 2.5 Anhídrido acético 100 233 µL 5 seg ?/-Metil Imidazol 186 233 µL 5 seg TCA 83.2 1.73 mL 21 seg Yodo 8.0 1.18 mL 45 seg Acetonitrilo NA 6.67 mL NA * El tiempo de espera no incluye el tiempo de contacto durante el suministro.

TABLA lll:RIBOZIMADEPEZMARTILLOY LA SECUENCIA DE SITIO PARA ARNT TABLA IV: SECUENCIAS DE RIBOZMA DE HORQUILLA Y SITIOS OBJETIVOS PARAARNT sec. sec. RZ I.D. No. sustrato I.D. No l 1345 UUCUUA AGAA GGAA ACCAGAGAAACA 818 lUUCCG GUC UAAGAA 880 ¡X GUACAUUACCUGGUA 1380 ¡UAAAGG AGAA GGUU ACCAGAGAAACA 819 lAACCA GCU CCUUUA 881 |x GUACAUUACCUGGUA 1409 AAUUUC AGAA GAGU ACCAGAGAAACA 820 [ACUCA GAU GAAAUU 882 X GUACAUUACCUGGUA 1431 UGUUGG AGAA GAUG ACCAGAGAAACA 821 ICAUCU GUA CCAACA 8B3 |X GUACAUUACCUGGUA 1471 UGUA AGAA GUGG ACCAGAGAAACA 822 ICCACG GCC UACACU 884 < GUACAUUACCUGGUA 1549 GGUGCC AGAA GUCC ACCAGAGAAACA 823 IGGACA GCU GGCACC 885 X GUACAUUACCUGGUA 1642 [GUCACA AGAA GAAC ACCAGAGAAACA 824 IGUUCA GCC UGUGAC 886 |X GUACAUÜACCUGGUA 1691 UAAACC AGAA GACU ACCAGAGAAACA 825 lAGUCA GAU GGUUUA 887 X GUACAUUACCUGGUA 1754 JACUCUG AGAA GCAU ACCAGAGAAACA 826 |AUGCG GAU CAGAGU 888 |X GUACAUUACCUGGUA 1784 GGCAGG AGAA GUGC ACCAGAGAAACA 827 IGCACU GUC CCUGCC 889 X GUACAUUACCUGGUA 1840 IUCUGCC AGAA GGGG ACCAGAGAAACA 828 ICCCCG GCC GGCAGA 890 ÍX GUACAUUACCUGGUA 1901 UGCAGA AGAA GAUG ACCAGAGAAACA 829 ÍCAUCA GCU ÜCUGCA 891 X GUACAUUACCUGGUA 1915 GCCAAC AGAA GUCC ACCAGAGAAACA 830 |GGACA GAU GUUGGC 892 X GUACAUUACCUGGUA 1927 iCGGGAA AGAA GGGC ACCAGAGAAACA 831 IGCCCA GAU ÜUCCCG 893 |? GUACAUUACCUGGUA 1986 AGCCUG AGAA GGUA ACCAGAGAAACA 832 UACCC GCU CAGGCU 894 X GUACAUUACCUGGUA 2000 CUGCUG AGAA GAAA ACCAGAGAAACA 833 lUUUCU GCC CAGCAG 895 X GUACAUUACCUGGUA TABLA V: RIBOZEVÍA DE PEZ MARTILLO Y SI?O OBJETO PARA TIE Sec. I. D. Sec. I. D.

Posición RZ No. Sustrato No. 3722 AGGUGAGG CUGAUGAG 1502 CAUUÜUAUC 2203 X CGAA AUAAAAUG CCUCACCU 3726 CUACAGGU CUGAUGAG 1503 UUAUCCCUC 2204 X CGAA AGGGAUAA ACCÜGUAG 3733 ÜGGCAUGC CUGAUGAG 1504 UCACCUGUA 2205 X CGAA ACAGGUGA GCAUGCCA 3744 UGAAACGG CUGAUGAG 1505 AUGCCAGUC 2206 X CGAA ACUGGCAU CCGUUUCA 3749 CUAAAUGA CÜGAÜGAG 1506 AGUCCCGUU 2207 X CGAA ACGGGACU UCAUUÜAG 3750 ACUAAAUG CÜGAÜGAG 1507 GUCCCGUUU 2208 X CGAA AACGGGAC CAUÜUAGÜ 3751 GACUAAAU CUGAUGAG 1508 UCCCGUUUC 2209 X CGAA AAACGGGA AUUUAGUC 3754 CAUGACUA CUGAUGAG 1509 CGÜUUCAUÜ 2210 X CGAA AUGAAACG UAGUCAUG 3755 ACAUGACU CÜGAUGAG 1510 GUUÜCAUÜU 2211 X CGAA AAUGAAAC AGUCAUGU 3756 CACAUGAC CÜGAUGAG 1511 UUUCAUÜUA 2212 X CGAA AAAUGAAA GUCAUGÜG 3759 GGUCACAU CUGAUGAG 1512 CAUUUAGUC 2213 X CGAA ACUAAAUG AUGUGACC 3771 ACAAGACA CUGAUGAG 1513 UGACCACUC 2214 X CGAA AGUGGUCA UGUCUUGU 3775 AAACACAA CUGAUGAG 1514 CACÜCUGUC 2215 X CGAA ACAGAGUG UÜGUGUUU 3777 GGAAACAC CUGAUGAG 1515 CUCUGUCUU 2216 X CGAA AGACAGAG GUGUUUCC 3782 GCUGUGGA CUGAUGAG 1516 UCUUGUGUU 2217 X CGAA ACACAAGA UCCACAGC 3783 GGCUGUGG CUGAUGAG 1517 CUUGUGUUU 2218 X CGAA AACACAAG CCACAGCC TABLA VI: RIBOZÍMAS DE HORQUILLA Y SITIOS OBJETIVO PARA TIE-2 TABLA Vil: RIBOZIMA DE PEZ MARTILLO Y SECUENCIAS DE SITIO OBJETIVO PARA SUBUNIDAD DE ALFA 6 INTEGRINA Sec. I. D. Sec. I. D.

Posición RZ No. Sustrato No. 4899 U'JAAAAAA CUGAUGAG X 3392 AAGCUGAUU 453 ] CGAA AUCAGCUU UUUUUUAA 4900 AUUAAAAA CUGAUGAG X 3393 AGCUGAUUU 4532 '•GAA AAUCAGCU UUUUUAAU 4901 AAUUAAAA CUGAUGAG X 3394 ? UGAUUUU 4533 CGAA AAAUCAGC U'JUUAAUU 4902 UAAUUAAA CUGAUGAG X i 3395 CUGAUUUUU 4534 CGAA AAAAUCAG J'JUAAUUA 490: 3UAAUUAA CUGAUGAG X 3396 UGAUUUUUU 4535 CGAA AAAAAUCA UUAAUUAC 4904 GGUAAUUA CUGAUGAG X 3397 GAUUUUUUU 4536 CGAA AAAAAAUC UAAÜUACC 490: ;3GUAAUU CÜGAUGAG X 3398 AUUUUUUUU 4537 :SAA AAAAAAAU AAUUACCA 4906 AÜGGUAAU CUGAUGAG X 3399 UUUUUUUÜA 4538 CGAA AAAAAAAA AUUACCAU 490S AGCAUGGU CUGAUGAG X 3400 UUUUÜAAÜU 4539 GAA AUUAAAAA ACCAUGCU 491 C AAGCAUGG CUGAUGAG X 3401 UU'JUAAUÜA 4540 rGAA AAUÜAAAA CCAUGCUü 491B ACAUUGUG CÜGAUGAG X 3402 ACCAUGCUU 454 1 CGAA AGCAUGGÜ CACAAUGÜ 4919 AACAUUGU CUGAUGAG X 3403 CAUGCUÜC 4542 CGAA AAGCAUGG ACAAUGÜU 4921 UAUAACUU CUGAUGAG X 3404 ACAAUGÜU 4543 CGAA ACAUUGUG AAGUUAUA 4926 A'JAUAACU CUGAUGAG X 3405 ACAAUGUUA 4544 GAA AACAUÜGU AGUUAUAU 4932 CCCCAÜAU CUGAUGAG X 3406 UGUUAAGUU 4545 CGAA ACUUAACA AUAUGGGG 4933 CCCCCAUA CUGAUGAG X 3407 GUUAAGUUA 4546 C3AA AACUUAAC UAUGGGGA TABLA VIII: RIBOZIMA DE HORQUILLA Y SECUENCIA OBJETIVO PARA LA SUBUNIDAD DE ALFA 6 INTEGRINA TABLA IX: RIBOZIMA DE PEZ MARTILLO Y SECUENCIAS OBJETIVO PARA LA SUBUNIDAD BETA 3 DE INTEGRINA Sec. I. D. Sec. I. D.

Posición RZ No. Sustrato 985 NCACCCC-C CUGAUGAG X CGAA 4994 GCGCGCGUC 5782 ACGCGCGC GCGGGUGN 995 CCGACCAG CUGAUGAG X CGAA 4995 CGGGUGNUC 5782 ANCACCCG CUGG'JCGG LOO: CUUGGNCC CUGAUGAG X CGAA 4996 NUCC'JGGUC 578 : ACCAGGAN GGNCCAAG 1048 ACCCCCGG CÜGAUGAG X CGAA. l 4997 GUGGGGCU'J 5784 AGCCCCAC CCG33GGU L0 5 AACCCC G CUGAUC-AG X CGAA 4998 UGGGGCUUC 5785 AAGCCCCA CGGGGGüü 1057 GCGGGAAC CÜGAÜGAG X CGAA 4999 CCGGGGGÜÜ 5786 ACCCCCGG GÜUCCCGC 106 GGGGCGC-G CUGAUGAG X CGAA 5000 GGGG'JUGUÜ 5787 ACAACCCC CCCGCCCC 1061 AGGGGCGG CUGAUGAG X CGAA 5001 GGGUUGUUC 5783 AACAACCC CCGCCCCU 1070 CCUCUGCC CUGAUGAG X CGAA 5002 CCGCCCCUU 57 e 5 AGGGGCGG GGCAGAGG 1065 CAGGAAG'J CUGAUGAG X CGAA 5003 UGCCCUGUA 5750 ACAGGGCA ACU'JCCUG ios: CACCCAGG CUGAÜGAG X CGAA 5004 CUGVAACU'J 5791 AGUÜACAG CCUGGGUG 1054 UCACCCAG CUGAUC-AG X CGAA 5005 UGCAACUUC 5752 AAGUUACA CUGGGUGA 1123 GAAAÜGUA CUGAUC-AC- X CGAA 5006 GCGCGGGUL' 57S3 ACCCGC3C ÜACAUUUC 1124 GGAAAUG CUGAUGAG X CGAA 5007 CGCC-GGUÜU 5754 AACCCGCG ACAUÜUCC 1125 GGGAAA'JG CUGAÜGAG X CGAA 5008 GCGGG'JUUA 5755 AAACCCGC CAÜ'JCCCC 1129 ÜGUGGGGA CUGAUGAG X CGAA 5009 GU ACAU'J 57 S6 AUGUAAAC UCCCCACA TABLA X: RIBOZIMA DE HORQUILLA Y SECUENCIAS OBJETIVO PARA LA SUBUNIDAD BETA 3 INTEGRINA LISTA DE SECUENCIA <110> Wycoff , eith L . Jaiswal , Sudhir . <120> NETODO Y REACTIVOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES O CONDICIONES RELACIONADAS CON MOLÉCULAS INVOLUCRADAS EN RESPUESTAS ANGIOGENICAS <130> _, 4 :5142000100 <140> No asignada <141> con la presente -DS <222> (11)....(718) <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Versión 3. 0 <210> 1 <211> 721 <712> DNA <213> Homo sapiens <220 > <221> CDS <222> (11)....(718) <40C> 1 ggatctaacc atg gga tct aaa cct ttt ttg tct ett ett tea ttg tea 49 Met Gly Ser Lys Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ser Leu Ser 5 10 ttg ett tto ttt acá tct act agt ttg gca gac att gtg atg acc cag 97 Leu Leu e Phe Thr Ser Thr Ser Leu Ala Asp He Val Met Thr Gln 15 20 25 tct cea gca atc atg tct gca tet cea ggg gag aag gtc acc ata acc 145 Ser Pro Ala He Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr He Thr 30 35 40 45 tgc agt ccc age tea agt gta agt tac atg cac 'tgg ttc*cag cag aag 193 Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys 50 55 60 cea ggc act tct ccc aaa ctc tgg ett tat age acá tcc aac ctg get 241 Pro Gly Tr.r Ser Pro Lys Leu Trp Leu Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala 65 70 75 tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg acc tct tac 289 Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Giy Thr Ser Tyr 8C 85 90 tet ctc acá ate age cga atg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac 337 Ser Leu Thr He Ser Arg Met 31u Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 95 10C 105 tge cat ca= =gg act age tae cea tac acá ttc gga ggg ggg acc aag 385 Cys His Gl.-. Arg Thr Ser Tyr Pro Tyr Tr.r Phe Giy Gly Gly Thr Lys 110 115 " 120 125 ett gag at; aaa cga act gtg gct eea cea tct gtc ttc atc tte ceg 433 Leu Glu He lys Arg Thr Val Ala .Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro 130 135 140 cea tct ga gag cag ttg aaa tct gea act gcc tet gtt gtg tgc ctg 481 Pro Ser Ase Glj Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 et? aat aa: ttc tat ccc aga gag ?ec aa.a gta eag tgg aac gtg gat 529 Leu Asn Asr. Pne Tyr Pro Arg Giu Aia Lys Val Gir. Trp Lys Val Asp l í : 165 170 aac gcc ct: esa teg ggt aae tcc eag aag agt gt: acá gag cag gac 5~7 Asr. Ala L 31.i Ser Gly Asr. Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 175 1S0 185 age aag ga; age acc tac age ctc age age acc ctg acg ctg age aaa 625 Ser Lys Asr Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 190 195 200 205 gca gac ta: gag aaa cac aaa gtc tac gee tgc gaa gtc acc cat cag 673 Ala Asp Tyr C-lu Lys His Lye Val Tyr Ala Cys Gl- Val Thr His Gln 210 215 220 ggc ctg ac: teg ccc gtc aea aag age tte aac aeg gga gag tgt 718 Giy Leu Ser Ser Pro Val Tr.r Lys Ser F e Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 " 235 tga 721 <21C> 2 <21i> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <40C> 2 Met Gly Ser Lys Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Phe Thr Ser Thr Ser Leu Ala Asp He Val Met Thr Gln Ser Pro Ala 20 25 30 He Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr He Thr Cys Ser Ala 3? 40 45 Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Pr.e Gln Glr. Lys Pro Gly Thr 50 55 " 6C Ser Pro Lys Leu Trp Leu Tyr Ser Tr.r Ser Asn Leu Ala Ser Giy Val 65 70 75 80 Pro Ala Arg Fhe Ser Gly Ser Giy Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 85 9 * 95 He Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln 100 105 ' 110 Arg Thr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Tr.r Lys Leu Glu He 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ais ?rc Ser Val Phe He ?r.e Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Tr.r Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Gl? Gir. Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 20C 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 2 Ir 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asr. Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> i <211> 1476 <212> 3NA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> ;24) ... (1472! <400> 3 gsatctatcg attceegggt aee atg gga tct aaa cet ttt ttg tct ett ett 53 Met Giy Ser Lys Pr: Phe Leu Ser Leu Leu 1 5 10 tea ttg tea ttg ett ttg ttt acá tct act agt ::: gca ggg gtc cag 101 Ser Leu Ser Leu Leu Leu =he Thr Ser Thr Ser Leu Aia Gly Val Glr. 15 20 25 ett cag cag tea gga cct gae ctg gtg aaa cct ggg gcc tea gtg aag 149 Leu Gln Gln Ser Gly Pro Ase Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 30 35 40 ata tcc tgc aag gct tct ?ga tac acá ttc act gac tac aac ata cac 197 He Ser Cys Lys Ala Ser Giy Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn He His 45 50 55 tgg gtg aag cag age cgt gga aag age ett gag tgg att gga tat att 245 Trp Val Lys Gln Ser Arg Gly Lys Ser Leu Glu Trp He Gly Tyr He 60 ' 6= 70 tat cct tac aat ggt aat aet tae tac aac cag aag ttc aag aac aag 293 Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glr. Lys Phe Lys Asn Lys 75 80 85 50 gcc acá ttg act gta gac a=t tee tcc acc tea gr: tac atg gao ctc 341 Ala Thr Leu Thr Vai Asp Asn Ser Ser Thr Ser Ala Tyr Met Glu Leu 95 100 105 cgc age etg aea tet gag gac tct gca gtc tat tac tgt gca ac: tac 389 Arg Ser Leu Tr.r Ser Giu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr HC 115 120 ttt gac tac tgg ggc caá ggc aec act ctc acá gtg age tea gca tcc 437 Phe Asp Tyr Tre Gly Glr. Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser 125 130 135 ceg acc age ce: aag gtc ttc ceg ctg age ctc gac age acc ccc eaa 485 Pro Thr Ser Pro Lye Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr Pro Gin 140 145 15C gat ggg aac gtg gte gtc gca tgc ctg gtc cag ?gc ttc ttc cce eag 533 Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe Pro Gln 155 16? 165 1~0 gag cea ctc act gtg ace tgg age gaa age gga cag aac gtg acc gcc 581 Glu Pro Leu Ser Vai Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val Thr Ala 175 180 185 aga aac ttc cea cct age cag gat gcc tcc ggg cae ctg tac acc aeg 629 Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Aso Leu Tyr Thr Tnr 150 195 200 age age cag ctg ace cte ceg gcc acá cag tgc cea gac ggc aag tec 677 Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Aia Thr Gln Cys Pro Asp Gly Lys Ser 205 210 215 gtg acá tgc ca: gtg aag cac tac aeg aat tcc age cag gat gtg aet 725 Val Thr Cys H s Val Lys His Tyr Thr Asn Ser Ser Gln sp Val Thr 220 225 23C gtg ccc tgc cga gtt ce: cea cet ecc cea tgc fgc cac ccc cga etg 13 Val Pro Cys Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro Are Leu 235 240 245 " 150 teg ctg cac cga ceg gcc ctc gag gac ctg ctc tta ggt tea gas geg 821 Ser Leu His Arg Pro Aia Leu Giu sp Leu Leu Leu Gly Ser Gl.: .Ala 255 260 26: aac ctc acg tg: acá ctg acc ggc ctg aga gat cce tct ggt gcc =cc 669 Asn Leu Thr Cys Thr Le Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Ala Tnr 270 275 280 ttc acc tgg acg ccc tea agt ggg aag age gct gtt caá gga cea :et 917 Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pre Pro 285 290 295 gag cgt gac ct: tgt gge tgc tac age gtg tcc aaa gta ett cct ggc 965 Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser r Val Leu Prc Gly 300 305 31C tgt gcc cag cea tgg aac cat ggg gag acc ttc acc tg: act gct gcc 1013 Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr Ala Aia 315 320 325 330 cac ccc gag ttg aag acc cea cta acc gcc aac atc aea aaa tcc gsa 1061 His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn He Thr Lys Ser Gly 335 340 345 aac acá ttc cgg ccc gag gtc cac ctg ctg ceg ceg eeg teg gag gag 1105 Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Giu 350 355 260 ctg gcc ctg aac gag ctg gtg acg ctg acg tgc ctg gea cgt ggc tte 115" Leu Aia Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr C s Leu Ala Arg Gly Phe 365 370 275 age ccc aag gat gtg ctg gtt cgc tgg ctg ca? ggg tea cag gag ctg 12C5 Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Glr. Gly Ser Gln Glu Leu 380 385 390 ccc cgc gag aag tac ctg act tgg gca tcc cgg cag gag cee age cag 1253 Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gin 395 400 405 410 ggc acc acc acc tat gct gtg acc age ata ctg cgc gtg gca gcc gag 13C1 Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Val Thr Ser He Leu Arg Val Ala Ala Glu 415 420 425 gac tgg aag aag ggg gag acc ttc tcc tgc atg gtg ege cae gag gec 134? Asp Trp Lys Lys Gly Glu Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Aia 430 435 440 ctg ceg ctg gcc ttc acá cag aag acc atc gac cgc ttg gcg ggt aaa 13?" Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr He Asp Arg Leu Aia Gly Lys 445 450 ' 455 ccc acc cat atc aat gtg tct gtt gtc atg gcg gag gcg gac ggc acc 1445 Pro Thr His He Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Ala Asp Gly Thr 460 465 470 tgc tac aga tct gaa aag gat gaa ett taga 1476 Cys Tyr Arg Ser Glu Lys Asp Glu Leu 475 480 <210> 4 <211> 483 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gly Ser Lys Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Phe Thr Ser Thr Ser Leu Ala Gly Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro 25 30 Asp Leu Val Lys Fro Gly Ala Ser Val Lys He Ser Cys Lys Ala Ser 40 45 Giy Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn He His Trp Val Lys Gln Ser Arg 50 55 60 Gly Lys Ser Leu Glu Trp He Gly Tyr He Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp 85 90 95 Asn Ser Ser Thr Ser Aia Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu 100 105 110 Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 ' 125 Giy Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ser Prb Thr Ser Pro Lys Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val 145 150 155 160 Ala Cys Leu Val Gln Giy Phe Phe Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr 165 170 175 Trp Ser Glu Ser Gly Gin Asn Val Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser 180 185 190 Gin Asp Ala Ser Giy Asp Leu Tyr Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu 195 200 205 Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys 210 215 220 His Tyr Thr Asn Ser Ser Gln Asp Val Thr Val Pro Cys Arg Val Pro 225 230 235 240 Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala 245 250 255 Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu 260 265 270 Tr.r Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser 275 " 280 285 Ser Gly Lys Ser Aia Vai Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly 290 295 300 Cys Tyr Ser Val Ser Arg Val Leu Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn 305 310 315 320 His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr 325 330 335 Pro Leu Thr Ala 7. n lie Thr Lys Ser Gly Asn Th'r Phe Arg Pro Glu 340 345 250 Vai His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu 355 360 365 Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg' Giy Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu 370 375 380 Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu 385 390 395 400 Thr Trp Ala Ser Arg Gin Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala 405 410 415 Val Thr Ser He Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu 420 425 430 Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu .Ala Phe Thr 435 440 445 Gln Lys Thr He Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro Thr His He Asn Val 450 455 460 Ser Val Val Met Ala Glu Ala Asp Gly Thr Cys Tyr Arg Ser Glu Lys 465 470 475 480 Asp Glu Leu <210> 5 <211> 504 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (25* ... ,501) <400> 5 aggatctatc gatteecgeg tace atg gag aac cat ttg ett ttc tgg gga 51 Met Glu Asn His Leu Leu Phe Trp Gly 1 5 gtc ctg gcg gtt ttt att aag gct gtt cat gtg aaa gcc caá gaa gat 99 Val Leu Ala Vai Phe He Lys Ala Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp 10 15 20 25 gaa agg att gtt ett gtt gac aac aaa tgt aag tgt gcc cgg att act 147 Glu Arg He Val Leu Val Asp Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg He Thr 3C 35 40 tcc agg atc ate cgt tct tcc gaa gat cct aat gag gac att gtg gag 195 Ser Arg He He Arg Ser Ser Giu Asp Pro Asn Glu Asp He Val Glu 45 50 55 aga aac atc cga att att gtt cct ctg aac aac agg gag aat atc tct 243 Arg Asn He Arg He He Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu Asn He Ser 60 65 70 gat ccc acc tea cea ttg aga acc aga ttt gtg tac cat ttg tct gac 291 Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp 75 80 85 etc tgt aaa aaa tgt gat cct acá gaa gtg gag ctg gat aat cag ata 339 Leu Cys Lys Lys Cye Asp Pro Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln He 90 95 100 105 gtt act gct acc cag age aat atc tgt gat gaa gac agt gct acá gag 387 Val Thr Ala Thr Glr. Ser Asn He Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu 110 115 120 acc tgc tac act tat gac aga aac aag tgc tac acá gct gtg gtc cea 435 Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro 125 130 135 ctc gta tat ggt ggt gag acc aaa atg gtg gaa acá gcc tta acc cea 83 Leu Val Tyr Gly Giy Glu Thr Lys Met Val Glu Thr Ala Leu Pro 140 145 150 gat gcc tgc ta: cet gac tga 504 Asp Ala Cys Ty: Pro Asp 155 <210> 6 <211> 159 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Glu Asn Hie Leu Leu Phe Trp Gly Vai Leu Ala Vai Phe He Lys 1 5 10 15 Aia Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp Glu Arg He Val Leu Vai Asp 20 25 30 Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg He Thr Ser Arg He He Arg Ser Ser 35 40 45 Glu Asp Pro Asn Giu Asp He Val Glu Arg Asn He Arg He He Val 50 55 60 Pro Leu Asn Asr. Arg Glu Asn He Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg 65 70 75 80 Thr Arg Phe Vai Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro 85 90 95* Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln He Val Thr Ala Thr Glr. Ser Asn 10C 105 110 He Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr ep Arg 115 120 125 Asn Lys Cys Tyr Thr Aia Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr 130 135 140 Lys Met Val Gl Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp 145 150 155 <210> 7 <211> 1841 <212> DNA <213> Hc.Tio sapiens <220> <221> CDS <222> (18) ... (1838) <400> 7 gtcgattccc gggtace atg gtg ctc ttc gtg ctc acc tgc ctc ctg gcg 50 Met Val Leu Phe Val Leu Thr Cys Leu Leu Ala 1 5 10 gtc ttc cea gee atc tcc acg aag agt ccc ata ttt ggt cce gag gag 98 Val Phe Pro Ala He Ser Thr Lys Ser Pro He Phe Gly Pro Glu Glu 15 20 25 gtg aat agt gtg gaa ggt aac tea gtg tcc atc acg tgc tae tac cea 146 Val Asn Ser Val Glu Gly Asn Ser Val Ser He Thr Cye rvr Tvr Pro 30 35 40 cec acc tct gtc aac cgg cac ace egg aag tac tgg tcc cgg cag gga 194 Pro Thr Ser Val Asn Arg His Thr Arg Lys Tyr Trp Cys Arg Gln Gly 45 50 ' 55 get aga ggt ggc tgc ata aec cte ate tcc teg gag ggc tac gtc tcc 242 A.la Arg Gly Gly Cys He Thr Leu He Ser Ser Glu Giy Tyr Val Ser 60 65 70 75 age aaa tat gca ggc agg gct aac etc acc aac ttc ceg gag aac ggc 290 Ser Lys Tyr Ala Gly Arg Ala Asr. Leu Thr Asn Phe Pre Glu Asn Gly 80 85 90 aea ttt gtg etg aac att gcc cag ctg age cag gat gae tcc ggg cgc Tr.r Phe Val .'al Asn He Ala Gin Leu Ser Gln Asp Asr Ser Giv Ara 95 100 105 tac aag tgt ggc ctg ggc atc aat age cga ggc ctg tce ttt gat gtc 386 Tyr Lys Cys Gly Leu Gly He Asr. Ser Arg Gly Leu Ser Phe Asp Val 110 115 120 age ctg gag gtc age cag ggt cet ggg ctc cta aat gae act aaa gtc 434 Ser Leu Glu Val Ser Gln Gly Pro Giy Leu Leu Asn Asp Thr Lys Val 125 130 135 tac acá gtg gac ctg ggc aga acg gtg acc atc aac tgc cct ttc aag 482 Tyr Thr Val Asp Leu Gly Arg Thr Val Thr He Asn Cys Pro Phe Lys 140 145 150 155 act gag aat gct caá aag agg aae tee ttg tac aag cag ata gge ctg 530 T r Glu Asn Ala Gln Lys Arg Lys Ser Leu Tyr Lys Glr. He Giy Leu 160 165 170 tac cct gtg etg gtc atc cae tce agt ggt tat gtg aat ecc aac tat 578 Tyr Pro Val Leu Val He Asp Ser Ser Gly Tyr 'Val Asr. Pro Asn Tyr 175 180 185 acá gga aga ata cgc ett gat att cag ggt act ggc cae tta etg ttc 626 Thr Gly Arg lie Arg Leu Asp He Gln Gly Thr Gly Gin Leu Leu Phe 190 195 20C age gtt gtc atc aac caá etc agg cte age gat gct ggg eag tat ctc 674 Ser Val Val He Asn Gln Leu Arg Leu Ser Asp Ala Giy Gin Tyr Leu 205 210 215 tgc cag gct ggg gat gat tec aat agt aat aag aag aat gct gae ctc '22 Cys Gln Ala Giy Asp Asp Ser Asr. Ser Asn Lys Lys Asr. .Aia sp Leu 220 225 230 235 caá gtg cta aag ccc gag eec gag ctg gtt tat gaa gae etg agg ggc no Gin Val Leu Lys Pro Glu Pro Giu Leu Val Tyr Glu Asp Leu Arg Gly 240 245 * 250 tea gtg acc ttc cac tgt gcc ctg ggc cct gag gtc gca aac gtg gcc 5i8 Ser Val Thr Phe His Cys Ala Leu Gly Pro Glu Vai Aia Asn Val Ala 255 260 265 aaa ttt ctg tgc cga cag age act ggg gaa aac tgt gac gtg gtc gtc 566 Lys Phe Leu Cys Arg Gir. Ser Ser Gly Glu Asn Cys Asp Val Val Vai 270 273 280 aac acc ctg ggg aag agg gcc cea gcc ttt gag ggc agg atc ctg ctc 914 A.sn Thr Leu Gly Lys Arg Ala Pre Ala Phe Glu Gl Arg He Leu Leu 285 290 295 aae ccc cag gac aag gat ggc tc= tte agt gtg gtg atc acá gge ctg 362 Asn Pro Gln Asp Lys Asp Giy Se: Phe Ser Vfel Val He Thr Gly Leu 300 305 310 315 agg aag gag gat gca ggg cgc ta: etg tgt gga gcc eat teg gat ggt .:?o Arg Lys Glu Asp Ala Gly Arg Ty: Leu Cys Gly Ala His Ser Asp Gly 320 325 330 cag ctg cag gaa ggc teg cct a: eag gcc tgg caá etc ttc gte aat H58 Glr. Leu Gln Glu Gly Ser Pro i: Glp Ala Trp Glr. Leu Phe Val Asn 335 340 345 gag gag tcc acg att czc cgc age ccc act gtg gtg aag ggg gtg gca 1106 Glu Glu Ser Thr He Pro Arg Se: Pro Thr Val Vai Lys Gly Vai Ala 350 35: 360 gga age tct gtg gcc gtg ctc t: ecc tac aac cgt aag gaa age aaa 1154 Giy Ser Ser Val Ala Vai Leu C\ Prs Tyr Asn Are Lys Glu Ser Lys 365 370 375 age atc aag tac tgg tgt ctc t: gaa ggg gcc cae »- ggc ege tgc .202 Ser He Lys Tyr Trp Cys Leu T: Glu Gly Ala Glr. =n Gly Arg Cys 330 385 390 • 395 ccc ctg ctg gtg gac age gag ge: tsg gtt aag gcc eag tac gag ggc 1250 Pro Leu Leu Val Asp Ser Glu Gl\ Trp Val Lys Ala Gin Tyr Giu Gly 400 405 410 cgc ctc tcc ctg ctg gag gag ce= ggc aac ggc acc ttc act gtc atc 1298 Arg Leu Ser Leu Leu Glu Glu Pr: Gly Asn Gly Th: Phe Thr Vai He 415 420 425 ctc aac cag ctc acc age cgg ga: gcc ggc ttc tac tgg tgt ctg acc 1346 Leu Asn Gln Leu Thr Ser Arg As: Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr 430 43= 440 aac ggc gat act ctc tgg agg ae: acc gtg gag ate aag att atc gaa ?94 Asn Gly Asp Thr Leu Trp Arg Tr.: Thr Val Glu He Lvs He He Giu 445 450 455 gga gaa cea aac ctc aag gtt ce: ggg aat gtc acg gct gtg ctg gga 1442 C-iy Glu Pro Asn Leu Lys Val Pro Gly Asr. Val Thr Ala Val Leu Gly 460 465 470 475 cag aet ctc aag gtc ccc tgt cac ttt cea tgc aaa ttc tcc teg tac 1490 Giu Thr Leu Lys Val Prc Cys His Phe Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr 480 485 490 gag aaa tac tgg tgc aag tgg aat aac acg ggc tgc eag gcc ctg ccc 1538 Giu Lys Tyr Trp Cys Lys Trp Asn Asn Thr Gly Cys Gln Ala Leu Pro 495 500 505 age caá gac gaa ggc ccc age aag gcc ttc gtg aac tgt gac gag aac 1?36 Ser Gln Asp Glu Gly Pro Ser Lys Ala Phe Val Asr. Cys Asp Glu Asn 510 515 ' 520 age cgg ett gtc tcc ctg acc ctg aac etg gtg acc agg gct gat gag 1£34 Ser Arg Leu Val Ser Leu Thr Leu Asn Leu Val Thr .Arg Ala Asp Glu 525 530 535 cgc tgg tac tgg tgt gga gtg aag cag ggc cac tte tat gga gag aet 1632 Gly Trp Tyr Trp Cys Gly Val Lys Gln Gly His Phe Tyr Gly Giu Thr 540 545 550 555 gea scc gtc tat gtg gca gtt gaa gag agg aag gca gcg ggg tce ege 1730 Ala Ala Val Tyr Val Ala Val Glu Glu Arg Lys Ala Ala Gly Ser Arg 560 565 570 gat gtc age cta gcg aag gca gac gct gct cct gat gag aag gtg eta 1778 .Asp Val Ser Leu Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu 575 580 585 gac tct ggt ttt cgg gag att gag aac aaa gcc att eag gat eee agg 1:26 .Asp Ser Gly Phe Arg Glu He Glu Asn Lys Ala He Gln Asp Pro .Arg 590 595 600 ett ttt gca gag tga • 1:41 Leu Phe Ala Glu 605 <210> 8 <211> 607 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Val Leu Phe Val Leu Thr Cys Leu Leu Ala Val Phe Pro Aia He 1 5 10 15 Ser Thr Lys Ser Pro He Phe Gly Pro Glu Glu Val sn Ser Val Glu 20 25 30 Giy Asn Ser Val Ser He Thr Cys Tyr Tyr Pro Prc Thr Ser Val Asn 35 40 45 .Arg His Thr Arg Lys Tyr Trp Cys Arg Gln Gly Aia .Arg Gly Giy Cys 50 55 60 He Thr Leu He Ser Ser Glu Gly Tyr Val Ser Ser Lys Tyr Ala Gly 65 70 75 80 Arg Ala Asn Leu Thr Asn Phe Pro Glu Asn Gly Thr Phe Val Vai Asn 85 50 95 He Ala Gln Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Cys Gly Leu 100 105 110 Giy He Asn Ser Arg Gly Leu Ser Phe Asp Val Ser Leu Glu Vai Ser 115 120 125 Gln Gly Pro Gly Leu Leu Asn Asp Thr Lys Val Tyr Thr Val Asp Leu 130 135 140 Gly Arg Thr Val Thr He Asn Cys Prc Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gln 145 150 155 160 Lys Arg Lys Ser Leu Tyr Lys Gln He Giy Leu Tyr Pro Val Leu Val 165 170 175 He Asp Ser Ser Gly Tyr Val sn Prc .Asn T r Thr Gly Arg He Arg 180 185 " 190 Leu Asp He Gln Gly Thr Gly Gln Leu Leu Phe Ser Val Val He Asn 195 200 205 Glr. Leu Arg Leu Ser Asp Ala Gly Glr. lyr Leu Cys Gln Ala Gly Asp 210 215 220 Asp Ser Asn Ser Asn Lys Lys A.sn Ala .Asp Leu Gln Val Leu Lys Pro 225 230 235 240 Glu Pro Glu Leu Val Tyr Glu Asp Leu .Arg Gly Ser Val Thr Phe His 245 250 255 Cys Ala Leu Gly Pro Glu Val Ala Asn Val Ala Lys Phe Leu Cys Arg 260 265 270 Gln Ser Ser Gly Glu Asn Cys Asp Val Val Val Asn Thr Leu Gly Lys 275 280 285 Arg Ala Pro Ala Phe Glu Gly Arg He Leu Leu Asn Pro Gln Asp Lys 290 295 300 Asp Gly Ser Phe Ser Val Val He Thr Gly Leu Arg Lys Glu Asp Ala 305 310 315 ' 320 Giy Arg Tyr Leu Cys Gly Ala His Ser Asp Gly Gln Leu Gln Glu Gly 325 230 335 Ser Pro He Gln Ala Trp Gln Leu Phe Val Asn Glu Glu Ser Thr He 340 • 345 ' 350 Pro Arg Ser Pro Thr Val Val Lys Gly Val Ala Gly Ser Ser Val Ala 355 360 365 Val Leu Cys Pro Tyr Asn Arg Lys Glu Ser Lys Ser He Lys Tyr Trp 370 375 3.80 Cys Leu Trp Glu Gly Ala Gln Asn Gly .Arg Cys Pro Leu Leu Val Asp 385 390 395 400 Ser Glu Gly Trp Val Lys Ala Gln Tyr C-iu Gly Arg Leu Ser Leu Leu 405 410 415 Glu Glu Pro Gly Asn Gly Thr Phe Thr Val He Leu Asn Gln Leu Thr 420 425 430 Ser Arg Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr Asn Gly Asp Thr Leu 435 440 445 Trp Arg Thr Thr Val Glu He Lys He He Glu Gly Glu Pro Asr. Leu 450 455 460 Lys Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Lys Val 465 470 475 480 Pro Cys His Phe Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr Glu Lys Tyr Trp Cys 485 490 49? Lys Trp Asn Asn Thr Gly Cys Gln Ala Leu Pro Ser Gln Asp Glu Gly Pro Ser Lys Ala Phe Val Asn Cys Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Ser 515 520 525 Leu Thr Leu Asn Leu Val Thr Arg Aia Asp Glu Gly Trp Tyr Trp Cys 530 535 540 Gly Val Lys Gln Gly His Phe Tyr Gly Glu Thr Ala Ala Val Tyr Val 545 550 555 560 Ala Val Glu Glu Arg Lys Ala Ala Gly Ser Arg Asp Val Ser Leu Ala 565 570 575 Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gl Phe Arg 580 585 590 Glu He Glu Asn Lys Ala He Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu 595 600 605

Claims (54)

1. REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ácido nucleico enzimático con actividad de desdoblamiento de ARN, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático desdobla específicamente ARN codificado por un gen (ARNT) transportador nuclear de hidrocarburo arilo.
2. 2. Una molécula de ácido nucleico enzimático con actividad de desdoblamiento de ARN, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático desdoblan específicamente ARN codificado por un gen subunidad beta 3 (ß3) de integrina.
3. 3. Una molécula de ácido nucleico enzimático con actividad de desdoblamiento de ARN, caracterizado porque las moléculas de ácido nucleico enzimático desdoblan ARN codificado por un gen de subunidad alfa 6 (a6) de integrina.
4. 4. Una molécula de ácido nucleico enzimático con actividad de desdoblamiento de ARN, caracterizado porque las moléculas de ácido nucleico enzimático desdoblan ARN codificado por un gen Tie-2.
5. 5. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático está en una configuración de pez martillo.
6. 6. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático comprende una región tallo II de mayor longitud que o igual a 2 pares de base.
7. 7. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático está en una configuración de horquilla.
8. 8. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el ácido nucleico enzimático está en una configuración de virus delta hepatitis, intron grupo I, intron grupo II, ácido nucleico VS o RNasa P de ácido nucleico.
9. 9. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la molécula nucleica enzimática es una ADNzima.
10. 10. El ácido nucleico de enzimático de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático comprende una región tallo II de longitud entre tres y siete pares de base.
11. 11. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático comprende entre 12 y 100 bases complementarias para ARN.
12. 12. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático comprende entre 14 y 24 bases complementarias para ARNm.
13. 13. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático consiste esencialmente de cualquier secuencia definida como Sec. I.D. Nos. 1-393, 911-1611, 2449-3587, y 4915-5701.
14. 14. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático consiste esencialmente de cualquier secuencia definida como Sec. I.D. 787-848, 2313-2380, 4727-4820 y 6489-6568.
15. 15. La célula de mamífero caracterizado porque incluye una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
16. 16. La célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula humana.
17. 17. El vector de expresión caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en una forma que permite la expresión de esa molécula de ácido nucleico enzimático.
18. 18. La célula de mamífero caracterizado porque incluye un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 17.
19. 19. La célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula humana.
20. 20. El método para el tratamiento de cáncer, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada a la edad (ARMD), inflamación y artritis caracterizado porque comprende la etapa de administrar a un paciente una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
21. 21. El método para el tratamiento de cáncer caracterizado porque comprende la etapa de administrar a un paciente, un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 17.
22. 22. El método para el tratamiento de cáncer, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada a la edad (ARMD), inflamación, y artritis caracterizado porque comprende la etapa de administrar a un paciente un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 17.
23. 23. El método para el tratamiento de cáncer, caracterizado porque comprende las etapas de: a) aislar células de un paciente; b) administrar a las células una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y c) introducir las células de regreso dentro del paciente.
24. 24. La composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
25. 25. El método de tratamiento de un paciente que tiene una condición asociada con un nivel elevado de transportador nuclear de hidrocarburo arilo (ARNT), caracterizado porque comprende la etapa de administración al paciente de una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 1.
26. 26. El método de tratamiento de un paciente que tiene una condición asociada con el nivel de Tie-2, caracterizado porque comprende la etapa de administración al paciente de una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 2.
27. 27. El método de tratamiento de un paciente que tiene una condición asociada con el nivel de subunidad alfa 6 de ¡ntegrina, caracterizado porque comprende la etapa de administración al paciente de una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 3.
28. 28. El método de tratamiento de un paciente que tiene una condición asociada con el nivel de subunidad beta 3 de integrina, caracterizado porque comprende la etapa de administración al paciente de una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 4.
29. 29. El método de tratamiento de un paciente que tiene una condición asociada con el nivel de transportador nuclear de hidrocarburo arilo (ARMT), caracterizado porque comprende la etapa de: (a) poner en contacto las células del paciente con una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 1; y (b) administrar al paciente uno o más fármacos adicionales.
30. 30. El método de tratamiento de un paciente que tiene una condición asociada con el nivel de Tie-2, caracterizado porque comprende la etapa de: (a) poner en contacto las células del paciente con una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 2; y (b) administrar al paciente uno o más fármacos adicionales.
31. 31. El método de tratamiento de un paciente que tiene una condición asociada con el nivel de subunidad alfa 6 de integrina, caracterizado porque comprende la etapa de: (a) poner en contacto las células del paciente con una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 3; y (b) administrar al paciente uno o más fármacos adicionales.
32. 32. El método de tratamiento de un paciente que tiene una condición asociada con el nivel de subunidad beta 3 de integrina, caracterizado porque comprende la etapa de: (a) poner en contacto las células del paciente con una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 4; y (b) administrar al paciente uno o más fármacos adicionales.
33. 33. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático comprende al menos cinco residuos de ribosa, enlaces fosforotioato en al menos tres de los nucleótidos 5' terminal, una modificación 2'-C-alilo en la posición No. 4 del ácido nucleico, al menos diez modificaciones 2'-C-metilo, y una modificación extremo 3'-.
34. 34. El ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el ácido nucleico enzimático comprende una porción de ribosa invertida unida a 3'-3' en el extremo 3'.
35. 35. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático comprende al menos cinco residuos de ribosa; enlaces fosforotioato en al menos tres de los nucleótidos 5' terminal, modificación 2'-amino en la posición No. 4 y/o en la posición No. 7 de la molécula de ácido nucleico enzimático; al menos diez modificaciones de 2'-0-metilo; y una modificación de extremo 3'-.
36. 36. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático comprende al menos cinco residuos de ribosa, enlaces fosforotioatos en al menos tres de los nucleótidos 5' terminal, sustitución abásica en la posición No. 4 y/o en la posición No. 7 de la molécula de ácido nucleico enzimático; al menos diez modificaciones 2'-0-metilo, que comprende una modificación extremo 3'-.
37. 37. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático comprende al menos cinco residuos de ribosa, enlaces fosforotioato en al menos tres de los nucleótidos 5' terminal, una sustitución 6-metiluridina en la posición No. 4 y/o en la posición No. 7 de la molécula de ácido nucleico enzimático; al menos diez modificaciones 2'-0-metilo, y comprende una modificación extremo 3'-.
38. 38. El método para modular la expresión del gen ARNT en una célula de mamífero caracterizado porque comprende la etapa de administrar a la célula una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 1.
39. 39. El método para modular la expresión de subunidad beta 3 de integrina en una célula de mamífero caracterizado porque comprende la etapa de administrar a la célula una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 2.
40. 40. El método para modular la expresión de subunidad alfa 6 de integrina en una célula de mamífero caracterizado porque comprende la etapa de administrar a la célula una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 3.
41. 41. El método para modular la expresión de Tie-2 en una célula de mamífero caracterizado porque comprende la etapa de administrar a la célula una molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 4. 42. El método para desdoblar una molécula de ARNT
42. ARN caracterizado porque comprende la etapa de, poner en contacto la molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 1 con la molécula ARNT ARN bajo condiciones adecuadas para el desdoblamiento de la molécula de ARNT ARN.
43. 43. El método para desdoblar una molécula de ARN subunidad beta 3 de integrina caracterizado porque comprende la etapa de, poner en contacto la molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 2 con la molécula ARN subunidad beta 3 de integrina bajo condiciones adecuadas para el desdoblamiento de la molécula de ARN subunidad beta 3 de integrina.
44. 44. El método para desdoblar una molécula de ARN subunidad alfa 6 de integrina caracterizado porque comprende la etapa de, poner en contacto la molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 3 con la molécula ARN subunidad alfa 6 de integrina bajo condiciones adecuadas para el desdoblamiento de la molécula de ARN subunidad alfa 6 de integrina.
45. 45. El método para desdoblar una molécula de Tie-2 ARN caracterizado porque comprende la etapa de, poner en contacto la molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 4 con la molécula Tie-2 ARN bajo condiciones adecuadas para el desdoblamiento de la molécula de Tie-2 ARN.
46. 46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42-45, caracterizado porque el desdoblamiento se lleva a cabo en la presencia de un catión divalente.
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el catión divalente es Mg2+.
48. 48. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicación 1-4, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico enzimático se sintetiza químicamente.
49. 49. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el vector de expresión comprende: a) una transcripción de la región de iniciación; b) una transcripción de la región de terminación; c) un gen que codifica al menos una molécula de ácido nucleico; y en donde el gen se une operablemente a la región de iniciación, y la región de terminación, en una forma que permite la expresión y/o suministro de la molécula de ácido nucleico.
50. 50. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el vector de expresión comprende: a) una región de iniciación de transcripción; b) una región de terminación de transcripción; c) una estructura de lectura abierta; d) un gen que codifica al menos una molécula de ácido nucleico, caracterizado porque el gen se une operablemente al extremo 3' de la estructura de lectura abierta; y en donde el gen se une operablemente a la región de iniciación, la estructura de lectura abierta y la región de terminación, en una forma que permite la expresión y/o suministro de la molécula de ácido nucleico.
51. 51. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el vector de expresión comprende: a) una región de iniciación de transcripción; b) una región de terminación de transcripción; c) un intron; d) un gen que codifica al menos una molécula de ácido nucleico; y en donde el gen se une operablemente a la región de iniciación, el intron y la región de terminación, en una forma que permite la expresión y/o suministro de la molécula de ácido nucleico.
52. 52. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el vector de expresión comprende: a) una región de iniciación de transcripción; b) una región de terminación de transcripción; c) un intron; d) una estructura de lectura abierta; e) un gen que codifica al menos una molécula de ácido nucleico, en donde el gen se une operablemente al extremo 3'- de la estructura de lectura abierta; y en donde el gen se une operablemente a la región de iniciación, el intron, la estructura de lectura abierta y la región de terminación, en una forma que permite la expresión y/o suministro de la molécula de ácido nucleico.
53. 53. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico enzimático comprende secuencias que son complementarias a cualquiera de las secuencias definidas como Sec. ID Nos 934-786 y 849-910.
54. 54. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el ácido nucleico enzimático comprende secuencias que son complementarias a cualquiera de las secuencias definidas como Sec. ID Nos 5702-6488 y 6569-6648. 55 La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el ácido nucleico enzimático comprende secuencias que son complementarias a cualquiera de las secuencias definidas como Sec. ID Nos 3588-4726 y 4821-4914. 56. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el ácido nucleico enzimático comprende secuencias que son complementarias a cualquiera de las secuencias definidas como Sec. ID Nos 1612-2312 y 2381-2448. 57. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el ácido nucleico enzimático comprende al menos una modificación 2'-azúcar. 58. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el ácido nucleico enzimático comprende al menos una modificación de base de ácido nucleico. 59. La molécula de ácido nucleico enzimático de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el ácido nucleico enzimático comprende al menos una modificación fosforotioato.