JP2003525037A - Ｃｄ２０およびｎｏｇｏ遺伝子発現の調節および診断のための方法および試薬 - Google Patents

Ｃｄ２０およびｎｏｇｏ遺伝子発現の調節および診断のための方法および試薬

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マクスウィゲン，ジェイムズ
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ブラット，ローレンス
マクスウィゲン，ジェイムズ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は，ＣＤ２０および／またはＮＯＧＯ遺伝子の発現を調節する核酸分子，例えば，ハンマーヘッドリボザイム，ＤＮＡｚｙｍｅｓ，およびアンチセンス等のアンチセンスおよび酵素的核酸分子に関する。核酸の存在を検出するための診断システムおよび方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明は，Ｂｌａｔｔ，米国特許出願（６０／１８１，７９７）（２０００年
２月１１日出願，表題"ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＲＥＡＧＥＮＴ ＦＯＲ ＴＨ
Ｅ ＩＮＨＩＢＩＴＩＯＮ ＯＦ ＮＯＧＯ ＧＥＮＥ"，Ｂｌａｔｔ，米国特
許出願（６０／１８５，５１６）（２０００年２月２８日出願），およびＵｓｍ
ａｎ，米国特許出願（６０／１８７，１２８）（２０００年３月６日出願）に基
づく優先権を主張する。これらの特許出願は，図面を含めその全体を本明細書の
一部としてここに引用する。
【０００２】 本発明は，遺伝子，例えばＣＤ２０およびＮＯＧＯ遺伝子の調節に応答した状
態および疾病の研究，診断，および治療のための化合物，組成物，および方法に
関する。詳細には，本発明は，ＣＤ２０およびＮＯＧＯのレベルに関連する疾病
の治療のための組成物および方法を提供する。核酸の存在を検出する診断システ
ムおよび方法もまた開示される。
【０００３】 以下は，ＣＤ２０およびＮＯＧＯ，これらに対応する生物学的機能，および治
療への関連性の現在の理解の簡単な説明である。以下の議論は完全であることを
意味するものではなく，以下の本発明を理解するためにのみ提供される。この概
要は以下に記載される研究のいずれかが本発明に対する先行技術であると認める
ものではない。
【０００４】 脊椎動物の免疫システムは，侵入した病原体からの外来抗原を特異的に認識す
る多数の臓器および細胞のタイプ（例えば，抗体産生体）を含むよう進化してき
た。リンパ球により媒介される免疫応答は，侵入している外来物体を探しだし，
抗体の特異的認識およびそれに続く外来物体の破壊により，これを破壊する。リ
ンパ球は，成人ヒト循環系において白血球の総数の約３０％を占めており，主と
してリンパ系組織，胸腺，脾臓および骨髄において産生される。リンパ球の２つ
の主要なサブタイプは，Ｂ−細胞およびＴ−細胞である。
【０００５】 胸腺で発生するＴ−細胞は，細胞媒介性免疫を担う。成人骨髄（または胎児肝
臓）で発生するＢ−細胞は，抗体を産生し，体液性免疫を担う。Ｔ−細胞は，抗
原性細胞の表面の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）糖蛋白質がＴ−細胞レセプタ
ーに結合することにより活性化される。活性化されたＴ−細胞はインターロイキ
ン等の制御分子を放出し，これはＢ−細胞分化を促進することができる。活性化
されたＢ−細胞は発生して抗原に対する免疫グロブリンの産生用の粗面小胞体を
大量に含む抗体分泌細胞となる。Ｂ−細胞の多様性は，免疫系に対する有効な機
能の中心である。活性化されたＢ−細胞は所定の抗原に応答して大量の抗体を産
生することができる。通常は，この抗体産生は抗原の中和に応答して調節される
。しかし，Ｂ−細胞の産生の制御が破壊されると，そのような増殖によりＢ−細
胞リンパ腫が引き起こされうる。
【０００６】 ＣＤ２０は，成熟Ｂリンパ球においてのみ発現される３５ｋＤａの細胞表面リ
ン蛋白質である（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．，１３１，２３２−２３７；Ｓｔａｓｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，１９
８０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２５，１６７８−１６８５）。このＢ−細胞系
統特異的抗原は，ほとんどのＢ−細胞リンパ腫のすべての腫瘍細胞において見い
だされる。ＣＤ２０の発現の増加は，腫瘍細胞増殖に付随するように見えるが，
発現の程度は異なるタイプのリンパ系腫瘍により様々である。ＣＤ２０は，４つ
の貫膜ドメインを有し，Ｃ−末端およびＮ−末端の両方とも細胞質に存在する貫
膜蛋白質である。ＣＤ２０の一次構造は分子クローニングにより決定されており
（Ｅｉｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＥＭＢＯ Ｊ．，７，７１１−７
１７；Ｔｅｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，２０
８−２１２），これはイオンチャネルおよびイオントランスポーター蛋白質に似
ている。繊維芽細胞で発現させたとき，ＣＤ２０はカルシウム透過性カチオンチ
ャネルとして機能し，これはインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）レセプタ
ーにより活性化される（Ｋａｎｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，４９６４−６９）。細胞成長の調節は，ＣＤ２０を発
現する繊維芽細胞において観察される。ＣＤ２０を発現するＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３
繊維芽細胞においては，ＣＤ２０発現は，Ｇ１期の細胞サイクルの進行を加速し
，低細胞外カルシウムを含有する細胞培地中で細胞がＳ期に入ることを可能とす
る（Ｋａｎｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
７０，１３０９９−０４）。Ｂ−リンパ球においては，ＣＤ２０は，貫膜Ｃａ2+ コンダクタンスの制御において直接機能するようである（Ｂｕｂｉｅｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２１，１１２１−１１３２）
。リンパ球においては，ＣＤ２０は，ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼに付随
しており，したがって，カルモジュリン依存性蛋白質キナーゼ等の蛋白質キナー
ゼによりリン酸化されることが示されている。ＣＤ２０に結合するモノクローナ
ル抗体（ｍＡＢ）はＢ−リンパ球における細胞サイクル進行および分化を変化さ
せ，したがって，このことは，ＣＤ２０がＢ−細胞機能において必須の役割を果
たすことを示す（ＣＤ２０機能の概説については，Ｔｅｄｄｅｒ ａｎｄ Ｅｎ
ｇｅｌ，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１５（９），４５０−４を参
照）。
【０００７】 このように，ＣＤ２０は，Ｂ−細胞リンパ腫等の疾病の治療用の分子標的を提
供する可能性を有する。ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体の使用は，広
く記載されている（概説として，Ｗｅｉｎｅｒ，１９９９，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃ
ｏｌ．，２６，４３−５１；Ｇｏｐａｌ ａｎｄ Ｐｒｅｓｓ，１９９９，Ｊ．
Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１３４，４４５−４５０；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２，９５
−１０１を参照）。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）は，新たに診断された再発リン
パ腫を有する患者に対して単一の薬剤としておよび化学療法とともに広く用いら
れているキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ
．，１９９９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７，１８５１−１８５７；Ｓｏ
ｌａｌ−Ｃｅｌｉｇｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｌｏｏｄ，９４，ａｂｓ
ｔｒａｃｔ ２８０２；Ｆｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｏｎｃｏｌ．，１８，３１７−３２４）。さらに，放射性標識抗体コンジュゲー
トの使用が記載されている。Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）は，Ｉ−１３１コンジュ
ゲート化抗体であり，これはｍＡＢの免疫システム活性からのものと，ヨウ素（
Ｉ−１３１）放射性同位体の治療効果の二重の作用メカニズムで働くと考えられ
ている。トランスフォームした低悪性度リンパ腫を有する患者におけるＢｅｘｘ
ａｒの使用は，Ｚｅｌｅｎｅｔｚら（１９９９，Ｂｌｏｏｄ，９４，ａｂｓｔｒ
ａｃｔ ２８０６）に記載されている。Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）はチウキセ
タン（ｔｉｕｘｅｔａｎ）とコンジュゲートさせた抗ＣＤ２０ネズミＩｇＧ１カ
ッパモノクローナル抗体であり，画像化／線量測定用にＩｎ−１１１，または治
療用途用にイットリウム−９０のいずれかとコンジュゲートさせることができる
。Ｂ−細胞リンパ腫を有する患者についてのＺｅｖａｌｉｎとＲｉｔｕｘａｎを
比較した制御された実験がＷｉｔｚｉｇら（１９９９，Ｂｌｏｏｄ，９４，ａｂ
ｓｔｒａｃｔ ２８０５）により報告されている。
【０００８】 モノクローナル抗体およびコンジュゲートは，リンパ腫の治療に治療的価値を
提供してきたが，これらの効力および安全性は決して理想的ではない。モノクロ
ーナル抗体の使用は，種々の因子，例えば，限定されないが，毒性，免疫原性，
および腫瘍耐性により制限されうる。さらに，放射性同位体コンジュゲート化ｍ
ＡＢは，非病原性組織に障害を与えて元の病因の範囲外で悪性腫瘍を生ずる可能
性がある。これらの化合物の多くの投与経路は静脈内注入である。注入に関連す
る副作用が問題となりうる。Ｗｉｎｋｌｅｒら（１９９９，Ｂｌｏｏｄ，９４（
７），２２１７−２２２４）は，抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｒｉｔｕｘｉ
ｍａｂ）で治療した後，サイトカイン放出症候群およびＢ−細胞慢性リンパ性白
血病および高いリンパ球数を有する患者における全体的有効性が低いことを記載
する。このように，現存するリンパ腫治療戦略を置き換えるか補完するために，
安全かつ有効な治療法が必要とされている。
【０００９】 発生後のニューロンの成長の停止は，神経変性性疾患および外傷性事故により
引き起こされる中枢神経系（ＣＮＳ）の病巣に重要な意味を有する。ＣＮＳニュ
ーロンは，発生した脳においてその軸索および樹状病巣を再配列する能力を有す
るが，切断されたＣＮＳ軸索の遠距離にわたる再生は存在しない。ＣＮＳ損傷後
の軸索成長は，移植実験により示されるように，固有の因子ではなく局所的組織
環境により制限されている（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０，
Ｎａｔｕｒｅ，２８４，２６４−２６５）。稀突起神経膠細胞および星状細胞等
の，ＣＮＳの非ニューロン性グリア細胞は，培養した脊髄神経節ニューロンの軸
索成長を阻害することが示されている（Ｓｃｈｗａｂ ａｎｄ Ｔｈｏｅｎｅｎ
，１９８５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，５，２４１５−２４２３）。培養脊髄神
経節細胞は，末梢神経系からグリア細胞を横切ってその軸索を延ばすことができ
る（すなわち，シュヴァン細胞）が，ＣＮＳの稀突起神経膠細胞およびミエリン
により阻害される（Ｓｃｈｗａｂ ａｎｄ Ｃａｒｏｎｉ，１９８８，Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉ．，８，２３８１−２３９３）。
【００１０】 成人脊椎動物におけるＣＮＳ組織の非伝導性の特性は，成長因子の欠失ではな
く，阻害的因子の存在に起因すると考えられている。神経突起生長阻害的または
相反的特性を有する蛋白質の種類には，ＮＩ−３５，ＮＩ−２５０（Ｃａｒｏｎ
ｉ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｂ，１９８８，Ｎｅｕｒｏｎ，１，８５−９６），ミエ
リン付随糖蛋白質（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｍ２９２７３），テナシン−Ｒ（
Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｘ９８０８５），およびＮＧ−２（Ｇｅｎｅｂａｎｋ
受託番号Ｘ６１９４５）がある。ＮＩ−３５／２５０に対して生成したモノクロ
ーナル抗体（ｍＡｂＩＮ−１）は，ＣＮＳミエリンおよび稀突起神経膠細胞によ
る成長阻害的効果を部分的に中和することが示されている。インビボでＩＮ−１
処理を行うことにより，障害を有する成人哺乳動物ＣＮＳ組織において長距離繊
維が再生する（Ｗｅｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．
，６４２，２５９−２６６）。さらにインビボでＩＮ−１処理を行うことにより
，成人ラットにおいて脊髄損傷後に特定の反射性および運動性機能が回復する（
Ｂｒｅｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ，３７８，４９８−５
０１）。
【００１１】 最近，ＮＯＧＯ−Ａ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＪ２４２９６１），ＮＩ−
２２０／２５０をコードするラットｃＤＮＡのクローニングが報告された（Ｃｈ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０３，４３４−４３９）。Ｎ
ＯＧＯ遺伝子は，選択的プロモーター利用および選択的スプライシングの両方に
より生ずる少なくとも３個の主要な蛋白質産物（ＮＯＧＯ−Ａ，Ｂ，およびＣ）
をコードする。組換えＮＯＧＯ−Ａは，脊髄神経節からの神経突起生長および３
Ｔ３繊維芽細胞の広がりを阻害する。モノクローナル抗体ＩＮ−１はＮＯＧＯ−
Ａを認識し，インビトロで神経成長のＮＯＧＯ−Ａ阻害を中和する。ＮＯＧＯ−
Ａは精製ｂＮＩ−２２０（ラットＮＩ−２５０のウシ同等物）から得られた６個
すべてのペプチド配列を含むため，証拠はＮＯＧＯ−Ａが先に記載されているラ
ットＮＩ−２５０であるという提唱を支持する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ（前掲）
）。
【００１２】 Ｐｒｉｎｊｈａら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０３，３８３−３８４）は，
神経突起生長の強力な阻害剤である３つの異なるＮＯＧＯアイソフォームをコー
ドする，ヒトＮＯＧＯ遺伝子のクローニングを報告している。Ｐｈｒｉｎｊｈａ
ら（前掲）は，オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＮＯＧＯｃＤＮＡのオー
プンリーディングフレームの重複領域を増幅し，クローニングすることにより，
３つの蛋白質アイソフォームに対応する３つの形のｃＤＮＡを同定した。１，１
９２アミノ酸の最も長いＯＲＦはＮＯＧＯ−Ａ（受託番号ＡＪ２５１３８３）に
対応する。残基１８６−１，００４を欠失している中間的長さのスプライシング
変種はＮＯＧＯ−Ｂ（受託番号ＡＪ２５１３８４）に対応する。最も短いスプラ
イシング変種であるＮＯＧＯ−Ｃ（受託番号ＡＪ２５１３８５）は，先に記載さ
れているラットｖｐ２０（受託番号ＡＦ０５１３３５）およびフーセン（ｆｏｏ
ｃｅｎ）−ｓ（受託番号ＡＦ１３２０４８）であるようであり，これもまた残基
１８６−１，００４を欠失している。Ｐｒｉｎｊｈａら（前掲）によれば，ＮＯ
ＧＯアミノ末端領域は，既知の蛋白質のいずれとも有意なホモロジーを示さない
が，カルボキシ末端テールは神経内分泌特異的蛋白質およびレティキュロン遺伝
子ファミリーの他のメンバーに対するホモロジーを有する。さらに，カルボキシ
末端テールは，小胞体貯留領域として働くかもしれないコンセンサス配列を含む
。Ｐｒｉｎｊｈａら（前掲）は，ＮＯＧＯ蛋白質配列に基づいて，ＮＯＧＯが，
７個の予測Ｎ−結合グリコシル化部位，２または３個の貫膜ドメイン，および４
３残基の短いカルボキシ末端領域を有する１，０２４残基の大きな予測細胞外ド
メインを含む膜付随蛋白質であると仮定している。
【００１３】 Ｇｒａｎｄｐｒｅら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ）はまた，軸索再生の強力な阻
害剤としてのＮＯＧＯの単離を報告する。Ｇｒａｎｄｐｒｅら（前掲）により同
定された４．１キロベースのＮＯＧＯヒトｃＤＮＡクローンであるＫＩＡＡ０８
８６は，ランダム高分子量脳由来ｃＤＮＡを配列決定しようとする先の努力に由
来するｃＤＮＡと相同である（Ｎａｇａｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＤＮＡ
Ｒｅｓ．，３１，３５５−３６４）。このｃＤＮＡクローンは，ウシＮＯＧＯに
由来するペプチド配列の６個すべてとマッチする蛋白質をコードする。Ｇｒａｎ
ｄｐｒｅら（前掲）は，ＮＯＧＯ発現は主としてＣＮＳに付随しており，末梢神
経系（ＰＮＳ）には付随していないことを示した。ＮＯＧＯ蛋白質の細胞内局在
は，元は主として細網であるようであるが，ＮＯＧＯはある種の稀突起神経膠細
胞の表面に見いだされる。ＮＯＧＯの活性ドメインが同定されており，疎水性の
６６残基の管腔／細胞外ドメインの残基３１−５５として規定されている。この
配列に対応する合成フラグメントは，成長円錐体虚脱および生長阻害活性を示す
（Ｇｒａｎｄｐｒｅ ｅｔ ａｌ．，（前掲））。
【００１４】 ＨａｕｓｗｉｒｔｈおよびＦｌａｎｎｅｒｙ（国際公開ＷＯ９８／４８０２７
）は，網膜光レセプター細胞において蛋白質を特異的に発現させるための杆状体
または錐体オプシンプロモーターと接触するアデノ随伴ウイルスベクターからな
る物質および方法を記載する。さらに，色素性網膜炎の治療に用いるための，変
異体ｍＲＮＡを分解するリボザイムが記載される。
【００１５】 Ｆｅｃｈｔｅｌｅｒら（国際公開ＷＯ００／０３００４）は，神経変性性疾病
，例えばアルツハイマー病を治療するのに用いるための，プレセニリン−２ＲＮ
Ａを標的とするリボザイムを記載する。
【００１６】 Ｅｌｄａｄａｈら（２０００，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０，１７９−１８
６）は，小脳顆粒細胞を，カスパーゼ−３のリボザイム媒介性阻害からの血清カ
リウム欠乏により誘導されるアポトーシスから保護することを記載する。
【００１７】 Ｓｅｉｄｍａｎら（１９９９，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，９，３３３−３４０）は，神経変性性疾病の治療にア
ンチセンスおよびリボザイム構築物を用いることを一般的に記載する。
【００１８】 Ｄｅｎｍａｎら（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
，２２，２３７５−８２）は，ＣＯＳ−７細胞におけるベータ−アミロイドペプ
チド前駆体ｍＲＮＡのリボザイム媒介性分解を記載する。
【００１９】発明の概要 本発明は，核酸系の新規な手法［例えば，酵素的核酸分子（リボザイム），ア
ンチセンス核酸，２−５Ａアンチセンスキメラ，トリプレックスＤＮＡ，ＲＮＡ
切断化学基を含有するアンチセンス核酸］およびこれらを用いて，遺伝子，例え
ば神経突起成長（例えばＣＮＳにおける軸索再生）を阻害するか阻害に関与する
ある種のミエリン蛋白質をコードする遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする
。さらに，本発明はまた，核酸系の新規な手法［例えば，酵素的核酸分子（リボ
ザイム），アンチセンス核酸，２−５Ａアンチセンスキメラ，トリプレックスＤ
ＮＡ，ＲＮＡ切断化学基を含有するアンチセンス核酸］およびこれらを用いてＣ
Ｄ２０の発現を調節する方法を特徴とする。特に，本発明は，ＮＯＧＯ−Ａ（受
託番号ＡＪ２５１３８３），Ｂ（受託番号ＡＪ２５１３８４），および／または
Ｃ（受託番号ＡＪ２５１３８５），ＮＩ−３５，２２０，および／または２５０
，ミエリン随伴糖蛋白質（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｍ２９２７３），テネイシ
ン−Ｒ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｘ９８０８５），ＮＧ−２（Ｇｅｎｅｂａｎ
ｋ受託番号Ｘ６１９４５）およびＣＤ２０遺伝子（例示的ＣＤ２０配列はＧｅｎ
Ｂａｎｋ受託番号Ｘ０７２０３に見いだされる）の発現を阻害する，核酸系の手
法を特徴とする。
【００２０】 好ましい態様においては，本発明は，核酸系の１またはそれ以上の手法を，独
立してまたは組み合わせて用いて，ＮＯＧＯ−Ａ，Ｂ，および／またはＣ，ＮＩ
−３５，２２０，および／または２５０，ミエリン付随性糖蛋白質，テネイシン
−Ｒ，ＮＧ−２，および／またはＣＤ２０をコードする遺伝子の発現を阻害する
ことを特徴とする。特に，本発明は，核酸系の手法を使用して，ＮＯＧＯ遺伝子
（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２０６９３）およびＣＤ２０遺伝子（ＧｅｎＢ
ａｎｋ受託番号Ｘ０７２０３）の発現を特異的に阻害することを特徴とする。
【００２１】 以下に，例示的遺伝子であるＣＤ２０およびＮＯＧＯを参照して，種々の観点
および態様の記載が提供される。しかし，種々の観点および態様はまた，他の遺
伝子，例えば，Ｂ−細胞増殖に関与するＣＤ２０様蛋白質および神経突起生長阻
害に関与するＮＯＧＯ様蛋白質を発現する遺伝子にも向けられる。これらの追加
の遺伝子は，ＣＤ２０および／またはＮＯＧＯについて記載される方法を用いて
，標的部位について分析することができる。したがって，他の遺伝子の阻害およ
びそのような阻害の影響は，本明細書に記載されるように実施することができる
。
【００２２】 別の好ましい態様においては，本発明は，酵素的核酸分子，好ましくはハンマ
ーヘッド，ＮＣＨ（イノザイム），Ｇ−切断剤，アンバーザイム，チンザイムお
よび／またはＤＮＡｚｙｍｅモチーフのものを用いて，ＣＤ２０および／または
ＮＯＧＯ遺伝子の発現を阻害することを特徴とする。
【００２３】 "阻害する"とは，ＣＤ２０および／またはＮＯＧＯの活性またはＣＤ２０およ
び／またはＮＯＧＯの１またはそれ以上の蛋白質サブユニットをコードするＲＮ
Ａもしくは同等のＲＮＡのレベルが，本発明の核酸分子の非存在下において観察
されるレベルより減少することを意味する。１つの態様においては，酵素的核酸
分子による阻害は，好ましくは，標的ＲＮＡ上の同じ部位に結合することができ
るがそのＲＮＡを切断することができない，酵素的に不活性であるかまたは弱体
化された核酸分子の存在下で観察されるレベルより低い。別の態様においては，
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害は，好ましくは，例えば，スクラン
ブル配列またはミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの存在下で観察されるレ
ベルより低い。別の態様においては，本発明の核酸分子を用いるＣＤ２０および
／またはＮＯＧＯ遺伝子の阻害は，核酸分子の存在下において，存在しない場合
よりも大きい。
【００２４】 "酵素的核酸"とは，種々の反応を触媒しうる（速さおよび／または速度を変更
する），例えばヌクレオチド塩基配列特異的様式で他の別個の核酸分子を繰り返
し切断する（エンドヌクレアーゼ活性）かまたはライゲーションする（ライゲー
ション活性）を有する核酸分子を意味する。そのようなエンドヌクレアーゼおよ
び／またはライゲーション活性を有する分子は，基質結合領域において，特定の
遺伝子標的に対する相補性を有し，かつ，その標的中のＲＮＡまたはＤＮＡを特
異的に切断するおよび／またはライゲーションする酵素的活性を有する。エンド
ヌクレアーゼおよび／またはライゲーション活性を有する核酸分子は，分子内ま
たは分子間でＲＮＡまたはＤＮＡを切断および／またはライゲーションし，この
ことにより標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を不活性化または活性化することができ
る。このような相補性は，酵素的ＲＮＡ分子が標的ＲＮＡまたはＤＮＡに十分に
ハイブリダイズし，切断／ライゲーションが生ずることを可能にする。１００％
の相補性が好ましいが，５０−７５％程度の低い相補性もまた本発明において有
用である（例えば，Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９５，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，２０９２−２０９６；Ｈ
ａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，９，２５−３１を参照）。核酸は塩
基，糖および／またはリン酸基で修飾されていてもよい。酵素的核酸との用語は
，リボザイム，触媒的ＲＮＡ，酵素的ＲＮＡ，触媒的ＤＮＡ，アプタザイムまた
はアプタマー結合リボザイム，制御可能リボザイム，触媒的オリゴヌクレオチド
，ヌクレオザイム，ＤＮＡザイム，ＲＮＡ酵素，エンドリボヌクレアーゼ，エン
ドヌクレアーゼ，ミニザイム，リードザイム，オリゴザイムまたはＤＮＡ酵素の
ような句と互換的に使用される。これらすべての用語は酵素的活性を有する核酸
分子を記述する。本出願に記載されている特定の酵素的核酸分子は本発明におい
て限定的なものではない。当業者は，本発明の酵素的核酸分子において重要なこ
とは，これが１またはそれ以上の標的核酸領域に相補的な特異的基質結合部位を
有し，かつその基質結合部位内または周辺に分子に核酸切断および／またはライ
ゲーション活性を与えるヌクレオチド配列を有することのみであることを認識す
るであろう（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，９８７，０７１，Ｃｅｃｈ
ｅｔ ａｌ．，１９８８，２６０ ＪＡＭＡ：３０３０）。
【００２５】 本明細書において用いる場合，"核酸分子"とは，ヌクレオチドを有する分子を
意味する。核酸は，一本鎖，二本鎖または多数の鎖であることができ，修飾また
は非修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドまたはこれらの種々の混合物および
組み合わせを含むことができる。
【００２６】 "酵素的部分"または"触媒ドメイン"とは，その酵素的核酸分子の核酸基質の切
断に必須の部分／領域を意味する（例えば図１−５を参照）。
【００２７】 "基質結合アーム"または"基質結合ドメイン"とは，その基質の一部分に例えば
相補性により相互作用しうる（すなわち，塩基対を形成しうる）酵素的核酸の部
分／領域を意味する。好ましくは，そのような相補性は１００％であるが，所望
の場合にはそれ未満でもよい。例えば，１４の内の１０程度でも塩基対を形成し
うる（例えば，Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９５，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，２０９２−２０９６；Ｈａｍ
ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，９，２５−３１を参照）。そのようなア
ームの例は一般に図１−５に示される。すなわち，これらのアームは，相補的塩
基対形成相互作用により酵素的核酸と標的ＲＮＡとを一緒にすることが意図され
る配列を酵素的核酸中に含む。本発明の酵素的核酸は連続または非連続的な，種
々の長さの結合アームを有することができる。結合アームの長さは，好ましくは
４ヌクレオチド以上であり，標的ＲＮＡと安定に相互作用するのに十分な長さで
あり，好ましくは，１２−１００ヌクレオチド；より好ましくは１４−２４ヌク
レオチドの長さである（例えば，Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，
上掲；Ｈａｍｍａｎ ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ
０３６０２５７；Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，
ＥＭＢＯ Ｊ．，１２，２５６７−７３を参照）。２つの結合アームが選択され
る場合，結合アームの長さが対称的（すなわち，各々の結合アームは同じ長さで
ある；例えば，５および５ヌクレオチド，６および６ヌクレオチドまたは７およ
び７ヌクレオチド長）または非対称的（即ち，結合アームは異なった長さである
；例えば，６および３ヌクレオチド；３および６ヌクレオチド長；４および５ヌ
クレオチド長；４および６ヌクレオチド長；４および７ヌクレオチド長など）で
あるように設計される。
【００２８】 "イノザイム"または"ＮＣＨ"モチーフとは，図２において一般にＮＣＨ Ｒｚ
として記載されるモチーフを含む酵素的核酸分子を意味する。イノザイムは，切
断トリプレットＮＣＨ／（Ｎはヌクレオチドであり，Ｃはシチジンであり，Ｈは
アデノシン，ウリジンまたはシチジンであり，／は切断部位を表す；ＨはＸと互
換的に用いられる）を有するＲＮＡ基質を切断するエンドヌクレアーゼ活性を有
する。イノザイムはまた，切断トリプレットＮＣＮ／（Ｎはヌクレオチドであり
，Ｃはシチジンであり，／は切断部位を表す）を有するＲＮＡ基質を切断するエ
ンドヌクレアーゼ活性を有する。図２において"Ｉ"はイノシンヌクレオチドを表
し，好ましくはリボイノシンまたはキシロイノシンヌクレオシドである。
【００２９】 "Ｇ−切断剤"モチーフとは，図２において一般にＧ−切断剤Ｒｚとして記載さ
れるモチーフを含む酵素的核酸分子を意味する。Ｇ−切断剤は，切断トリプレッ
トＮＹＮ／（Ｎはヌクレオチドであり，Ｙはウリジンまたはシチジンであり，／
は切断部位を表す）を有するＲＮＡ基質を切断するエンドヌクレアーゼ活性を有
する。Ｇ−切断剤は，図２に一般的に示されるように化学的に修飾することがで
きる。
【００３０】 "アンバーザイム"モチーフとは，図３に一般に記載されるモチーフを含む酵素
的核酸分子を意味する。アンバーザイムは，切断トリプレットＮＧ／Ｎ（Ｎはヌ
クレオチドであり，Ｇはグアノシンであり，／は切断部位を表す）を有するＲＮ
Ａ基質を切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する。アンバーザイムは，図３に
一般的に示されるように置換によりヌクレアーゼ安定性を増加させるように化学
的に修飾することができる。さらに，異なるヌクレオシドおよび／または非ヌク
レオシドリンカーを用いて，図に示される５’−ｇａａａ−３’ループを置換す
ることができる。アンバーザイムは，活性のためにそれ自身の核酸配列中にリボ
ヌクレオチド（２’−ＯＨ）基を必要としない酵素的核酸分子の非限定的例であ
る。
【００３１】 "チンザイム"モチーフとは，図４に一般に記載されるモチーフを含む酵素的核
酸分子を意味する。チンザイムは，切断トリプレット，例えば，限定されないが
，ＹＧ／Ｙ（Ｙはウリジンまたはシチジンであり，Ｇはグアノシンであり，／は
切断部位を表す）を有するＲＮＡ基質を切断するエンドヌクレアーゼ活性を有す
る。チンザイムは，図４に一般的に示されるように置換によりヌクレアーゼ安定
性を増加させるように化学的に修飾することができる。例えば，グアノシンヌク
レオチドを２’−Ｏ−メチルグアノシンヌクレオチドで置き換えることができる
。さらに，異なるヌクレオシドおよび／または非ヌクレオシドリンカーを用いて
，図に示される５’−ｇａａａ−３’ループを置換することができる。チンザイ
ムは，活性のためにそれ自身の核酸配列中にリボヌクレオチド（２’−ＯＨ）基
を必要としない酵素的核酸分子の非限定的例である。
【００３２】 "ＤＮＡｚｙｍｅ"とは，その活性に２’−ＯＨ基の存在を必要としない酵素的
核酸分子を意味する。特定の態様においては，酵素的核酸分子は，２’−ＯＨ基
を有する１またはそれ以上のヌクレオチドを含む，結合したリンカーまたは他の
結合したまたは付随する基，成分，または鎖を有していてもよい。ＤＮＡｚｙｍ
ｅは化学的に合成してもよく，または一本鎖ＤＮＡベクターまたはその同等物を
用いてインビボで発現させてもよい。ＤＮＡｚｙｍｅの例は図５に示され，一般
に，Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／１１３０４；Ｃｈａｒｔｒ
ａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＮＡＲ ２３，４０９２；Ｂｒｅａｋｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．２，６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ ９４，４２６２；Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９９
，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４２２−４２３；および
Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ．ａｌ．，２０００，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１
２２，２４３３−３９により概説されている。これらの文献に記載されるものと
類似の手法を用いて別のＤＮＡｚｙｍｅモチーフを選択することができ，したが
ってこれらも本発明の範囲内である。
【００３３】 "十分な長さ"とは，予測される条件下で意図する機能を提供するのに十分な長
さの，３ヌクレオチド以上のオリゴヌクレオチドを意味する。例えば，酵素的核
酸の結合アームについては，"十分な長さ"とは，結合アーム配列が，予測される
結合条件下で標的部位に対して安定な結合を提供するのに十分に長いことを意味
する。好ましくは，結合アームは，有用なターンオーバーを妨害するほど長くは
ない。
【００３４】 "安定に相互作用する"とは，オリゴヌクレオチドが意図される目的（例えば，
酵素による標的ＲＮＡの切断）に十分なように標的核酸と相互作用すること（例
えば，生理学的条件下で標的中の相補的なヌクレオチドと水素結合を形成するこ
とによる）を意味する。
【００３５】 ＣＤ２０および／またはＮＯＧＯと"同等の"ＲＮＡとは，寄生体，ヒト，齧歯
類，霊長類，ウサギおよびブタ等の種々の生物において，ＣＤ２０および／また
はＮＯＧＯ蛋白質に対してホモロジー（部分的または完全）を有するか，または
ＣＤ２０および／またはＮＯＧＯと類似の機能を有する蛋白質をコードする，天
然に生ずるＲＮＡ分子を含むことを意味する。同等のＲＮＡ配列はまた，コーデ
ィング領域に加えて，５’−非翻訳領域，３’−非翻訳領域，イントロン，イン
トロン−エクソン接合部等の領域を含む。
【００３６】 "ホモロジーの程度"とは，２またはそれ以上の核酸分子のヌクレオチド配列が
部分的にまたは完全に同一であることを意味する。
【００３７】 "アンチセンス核酸"とは，ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ
−ＰＮＡ（蛋白質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ ｅｌ ａｌ．，１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５，５６６）相互作用により標的ＲＮＡに結合して，標的ＲＮＡの活性を
変化させる非酵素的核酸分子を意味する（概説については，Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ
Ｃｈｅｎｇ，１９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１００４および米国特許５
，８４９，９０２を参照）。典型的には，アンチセンス分子は，アンチセンス分
子の１つの連続する配列に沿って標的配列に相補的である。しかし，ある態様に
おいては，アンチセンス分子は，基質分子がループを形成するように基質に結合
することができ，および／またはアンチセンス分子はアンチセンス分子がループ
を形成するように結合することができる。すなわち，アンチセンス分子が２つの
（またはさらにそれ以上の）非連続的基質配列に相補的であってもよく，または
アンチセンス分子の２つの（またはさらにそれ以上の）非連続的配列部分が標的
配列に相補的であってもよく，その両方でもよい。現在のアンチセンス戦略の概
要については，Ｓｃｈｍａｊｕｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２７４，２１７８３−２１７８９，Ｄｅｌｉｈａｓ ｅ ｔａｌ．，
１９９７，Ｎａｔｕｒｅ，１５，７５１−７５３，Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９７，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎ．Ａ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，７，１５１，Ｃ
ｒｏｏｋｅ，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１３，３−４５
；Ｃｒｏｏｋｅ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ Ｒｅｖ．，
１５，１２１−１５７，Ｃｒｏｏｋｅ，１９９７，Ａｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
，４０，１−４９を参照。さらに，アンチセンスＤＮＡを用いてＤＮＡ−ＲＮＡ
相互作用によりＲＮＡをターゲティングして，このことによりデュープレックス
中の標的ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅＨを活性化してもよい。アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは，標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅＨ切断を活性化しうる１またはそれ
以上のＲＮＡｓｅＨ活性化領域を含んでいてもよい。アンチセンスＤＮＡは，化
学的に合成することができ，または一本鎖ＤＮＡ発現ベクターまたはその同等物
を用いて発現させることができる。
【００３８】 "ＲＮａｓｅＨ活性化領域"とは，標的ＲＮＡと結合して細胞性ＲＮａｓｅＨ酵
素により認識される非共有結合性複合体を形成しうる核酸分子の領域（一般に４
−２５ヌクレオチド以上の長さ，好ましくは５−１１ヌクレオチドの長さ）を意
味する（例えば，Ａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８４９，９０２；Ａ
ｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，９８９，９１２を参照）。ＲＮａｓｅＨ
酵素は，核酸分子−標的ＲＮＡ複合体に結合して，標的ＲＮＡ配列を切断する。
ＲＮａｓｅＨ活性化領域は，例えば，ホスホジエステル，ホスホロチオエート（
好ましくはヌクレオチド少なくとも４個がホスホロチオエート置換であり；より
好ましくは，ヌクレオチドの４−１１個がホスホロチオエート置換である）；ホ
スホロジチオエート，５’−チオリン酸，またはメチルホスホネート骨格化学ま
たはこれらの組み合わせを含む。上述の１またはそれ以上の骨格化学に加え，Ｒ
ＮａｓｅＨ活性化領域は，種々の糖化学を含んでいてもよい。例えば，ＲＮａｓ
ｅＨ活性化領域は，デオキシリボース，アラビノ，フルオロアラビノまたはこれ
らの組み合わせのヌクレオチド糖化学を含むことができる。当業者は，上述のも
のは非限定的例であり，ＲＮａｓｅＨ酵素の活性を支持する核酸のリン酸，糖お
よび塩基化学の任意の組み合わせは，ＲＮａｓｅＨ活性化領域および本発明の定
義の範囲内であることを認識するであろう。
【００３９】 "２−５Ａアンチセンスキメラ"とは，５’リン酸化２’−５’結合アデニル酸
残基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。これらのキメラは配列
特異的様式で標的ＲＮＡに結合し，細胞性２−５Ａ依存性リボヌクレアーゼを活
性化し，それは次に標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，
１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，１３００；
Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．，３１３，５２２−５３３；Ｐｌａｙｅｒ ａｎｄ Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，１
９９８，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７８，５５−１１３）。
【００４０】 "トリプレックス形成オリゴヌクレオチド"とは，二本鎖ＤＮＡに配列特異的様
式で結合して，三本鎖らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドを意味
する。そのような三重らせん構造の形成は，標的とする遺伝子の転写を阻害する
ことが示されている（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｃｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，５０４；Ｆｏｘ，２
０００，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，７，１７−３７；Ｐｒａｓｅｕｔｈ
ｅｔ．ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８
９，１８１−２０６））。
【００４１】 "遺伝子"とは，ＲＮＡをコードする核酸を意味し，例えば，限定されないが，
ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸配列である。
【００４２】 "相補性"とは，核酸が，伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタ
イプのいずれかにより，別のＲＮＡ配列と水素結合を形成しうることを意味する
。本発明の核酸分子に関して，核酸分子とその標的または相補的配列との結合自
由エネルギーは，核酸の関連する機能，例えば，酵素的核酸切断，アンチセンス
または三重らせん阻害が進行するのに十分である。核酸分子についての結合自由
エネルギーの決定は当該技術分野においてよく知られている（例えば，Ｔｕｒｎ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．Ｌ
ＩＩ ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−
３７８５を参照。相補性のパーセンテージは，核酸分子中の，第２の核酸配列と
水素結合（例えば，ワトソン−クリック塩基対形成）を形成しうる連続する残基
のパーセンテージを示す（例えば，１０塩基中の５，６，７．８，９，１０塩基
は，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，および１００％の相補性である
）。"完全な相補性"とは，核酸配列の連続する残基がすべて第２の核酸配列中の
同じ数の連続する残基と水素結合するであろうことを意味する。
【００４３】 ＲＮＡとは，少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。
"リボヌクレオチド"または"２’−ＯＨ"とは，β−Ｄ−リボ−フラノース成分の
２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。
【００４４】 "デコイＲＮＡ"とは，リガンドに対する天然の結合ドメインを模倣するＲＮＡ
分子を意味する。したがって，デコイＲＮＡは，特定のリガンドの結合について
天然の結合標的と競合する。例えば，ＨＩＶトランスアクチベーション応答（Ｔ
ＡＲ）ＲＮＡの過剰発現が，"デコイ"として作用して，ＨＩＶｔａｔ蛋白質に効
率的に結合し，このことによりこれがＨＩＶ ＲＮＡ中でコードされるＴＡＲ配
列に結合することを防止しうることが示されている（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ，６３，６０１−６０８）。これは特別の例では
なく，当業者は，当該技術分野において一般に知られる手法を用いて他の態様を
容易に生成しうることを理解するであろう。
【００４５】 いくつかのインビトロ選択（進化）戦略（Ｏｒｇｅｌ，１９７９，Ｐｒｏｃ．
Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ２０５，４３５）を用いて，ホスホジエステル結
合の切断およびライゲーションを触媒しうる新たな核酸触媒が発展してきた（Ｊ
ｏｙｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３−８７；Ｂｅａｕｄｒｙ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ，１９
９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６７，９０−９７；Ｂｒｅ
ａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＴＩＢＴＥＣＨ １２，２６８；Ｂａｒｔ
ｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８
；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ １７，８９−９３；Ｋｕｍａｒ ｅｔ
ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ，１９
９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ
ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４，４２６
２；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＲＮＡ ３，９１４；Ｎａｋａｍａｙ
ｅ＆Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９４，（上掲）；Ｌｏｎｇ＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，
１９９４，（上掲）；Ｉｓｈｉｚａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，（上掲）；
Ｖａｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ３６，６４９
５；（これらのすべてを本明細書の一部としてここに引用する）。
【００４６】 現在，天然に生ずる酵素的ＲＮＡのいくつかの変種が知られている。それぞれ
は，生理学的条件下で，ＲＮＡのホスホジエステル結合をトランスで加水分解す
ることを触媒することができる（したがって，他のＲＮＡ分子を切断しうる）。
表Ｉは，これらのリボザイムのいくつかの特性をまとめたものである。一般に，
酵素的核酸は，最初に標的ＲＮＡに結合することにより作用する。そのような結
合は，標的ＲＮＡを切断する作用をする分子の酵素的部分に近接して保持された
，酵素的核酸の標的結合部分により生ずる。すなわち，酵素的核酸は，まず標的
ＲＮＡを認識し，次に相補的塩基対形成によりこれに結合し，いったん正しい部
位に結合したら，酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮ
Ａの戦略的切断は，コードされる蛋白質の合成を指示するその能力を破壊するで
あろう。酵素的核酸は，そのＲＮＡ標的を結合し切断した後，そのＲＮＡから離
れて別の標的を探し，新たな標的に繰り返し結合して切断することができる。す
なわち，１つのリボザイム分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切断することができる
。さらに，リボザイムは，遺伝子発現の高度に特異的な阻害剤であり，その阻害
の特異性は，標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成メカニズムのみならず，標的ＲＮ
Ａ切断のメカニズムにも依存する。切断の部位の近くにおける１つのミスマッチ
または塩基置換は，リボザイムの触媒活性を完全に排除することができる。
【００４７】 ＣＤ２０特異的ＲＮＡの特定の部位を切断する酵素的核酸分子は，種々の病理
学的適応症，例えば，限定されないが，リンパ腫，白血病，および炎症性関節症
を治療する新規な治療方法である。詳細には，本発明の酵素的核酸分子を用いて
，リンパ腫，白血病，および関節症，例えば，限定されないが，Ｂ−細胞リンパ
腫，低悪性度または濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ），巨大低悪性度または
濾胞性ＮＨＬ，リンパ球性白血病，ＨＩＶ付随性ＮＨＬ，外套−細胞リンパ腫（
ＭＣＬ），免疫細胞腫（ＩＭＣ），小Ｂ−細胞リンパ性リンパ腫，免疫性血小板
減少症，および炎症性関節症を治療することができる。
【００４８】 ＮＯＧＯ特異的ＲＮＡ中の特定の部位を切断する酵素的核酸分子は，種々の病
理学的適応症，例えば，限定されないが，ＣＮＳ損傷および脳血管偶発症候（Ｃ
ＶＡ，発作），アルツハイマー病，痴呆，多発性硬化症（ＭＳ），化学療法誘導
性ニューロパシー，筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ），パーキンソン病，運動失調
，ハンチントン病，クロイツフェルト−ヤーコプ病，筋ジストロフィー，および
／またはＮＯＧＯ発現の調節に応答する他の神経変性性疾病状態を治療する新規
な治療方法である。
【００４９】 本明細書に記載される本発明の好ましい態様の１つにおいては，酵素的核酸分
子はハンマーヘッドまたはヘアピンのモチーフで形成されるが，デルタ肝炎ウイ
ルス，グループＩイントロン，グループＩＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰ Ｒ
ＮＡ（ＲＮＡガイド配列を伴う），Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ，ＤＮ
Ａｚｙｍｅ，ＮＣＨ切断モチーフ，またはＧ−切断剤のモチーフで形成してもよ
い。そのようなハンマーヘッドモチーフの例は，Ｄｒｅｙｆｕｓ，（上掲），Ｒ
ｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈ
ｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ８，１８３により記載される。ヘアピン
モチーフの例は，Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ０３６０２５７，Ｈａｍｐ
ｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ，１９８９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８，４９
２９，Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ８２，５３，
Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，４３
，Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１８，２９９，およびＣｈｏｗｒｉｒａ ＆ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，米国特
許５，６３１，３５９により記載される。デルタ肝炎ウイルスモチーフは，Ｐｅ
ｒｒｏｔｔａ ａｎｄ Ｂｅｅｎ，１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ３１，
１６により記載される。ＲＮａｓｅＰモチーフは，Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａ
ｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｃｅｌｌ ３５，８４９；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａ
ｎｄ Ａｌｔｍａｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，７８３；Ｌｉ ａｎ
ｄ Ａｌｔｍａｎ，１９９６， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，
８３５により記載される。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチ
ーフは，Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９０ Ｃｅｌｌ ６１，６８５−６９６；Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ
，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８，８８２
６−８８３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ，１９９３ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｙ ３２，２７９５−２７９９；Ｇｕｏ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１
９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．１４，３６３）により記載される。グループＩＩイント
ロンは，Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２，
７６１；Ｍｉｃｈｅｌｓ ａｎｄ Ｐｙｌｅ，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ３４，２９６５；Ｐｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／２２６８
９により記載される。グループＩイントロンは，Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国
特許４，９８７，０７１により記載される。ＤＮＡｚｙｍｅは，Ｕｓｍａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／１１３０４；Ｃｈａｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ
．，１９９５，ＮＡＲ ２３，４０９２；Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９
９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．２，６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９
７，ＰＮＡＳ ９４，４２６２により記載される。ＮＣＨ切断モチーフは，Ｌｕ
ｄｗｉｇ＆Ｓｐｒｏａｔ，国際公開ＷＯ９８／５８０５８により記載され；およ
びＧ−切断剤は，Ｋｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６，４１１６−４１２０，およびＥｃｋｓｔｅｉｎ
ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９９／１６８７１に記載されている。さらに別の
モチーフには，アプタザイム（Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９８／４３
９９３），アンバーザイム（クラスＩモチーフ；図３；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，国際公開９９／５５８５７）およびチンザイム（Ｂｅｉｇｅｌｍａ
ｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開９９／５５８５７）が含まれる。これらの文献はす
べて，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用し，本発明におい
て用いることができる。これらの特定のモチーフは本発明において限定的なもの
ではなく，当業者は，本発明の酵素的核酸分子において重要なことは，それが標
的遺伝子のＲＮＡ領域の１またはそれ以上に相補的な特異的基質結合部位を有し
，かつその基質結合部位の中または周辺に，分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌ
クレオチド配列を有することのみであることを認識するであろう（Ｃｅｃｈ ｅ
ｔ ａｌ，米国特許４，９８７，０７１）。
【００５０】 本発明の好ましい態様においては，本発明の核酸分子は，１３−１００ヌクレ
オチドの長さでありうる。本発明の例示的酵素的核酸分子は表ＩＩＩ−ＸＩＶに
示される。例えば，本発明の酵素的核酸分子は，好ましくは，１５−５０ヌクレ
オチドの長さであり，より好ましくは２５−４０ヌクレオチドの長さ，例えば，
３４，３６，または３８ヌクレオチドの長さである（例としては，Ｊａｒｖｉｓ
ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９１０７−
２９１１２を参照）。本発明の例示的ＤＮＡｚｙｍｅｓは，好ましくは１５−４
０ヌクレオチドの長さ，より好ましくは２５−３５ヌクレオチドの長さ，例えば
，２９，３０，３１，または３２ヌクレオチドの長さでありうる（例えば，Ｓａ
ｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１３
３３０−１３３４２；Ｃｈａｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，４０９２−４０９６を参照）。
本発明の例示的アンチセンス分子は，好ましくは１５−７５ヌクレオチドの長さ
，より好ましくは２０−３５ヌクレオチドの長さ，例えば，２５，２６，２７，
または２８ヌクレオチドの長さでありうる（例えば，Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．
，１９９２，ＰＮＡＳ．，８９，７３０５−７３０９；Ｍｉｌｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，５３７−
５４１を参照）。本発明の例示的トリプレックス形成オリゴヌクレオチド分子は
，好ましくは１０−４０ヌクレオチドの長さであり，より好ましくは１２−２５
ヌクレオチドの長さ，例えば，１８，１９，２０，または２１ヌクレオチドの長
さである（例えば，Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，２９，８８２０−８８２６；Ｓｔｒｏｂｅｌ ａｎｄ Ｄｅｒｖａｎ，
１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，７３−７５を参照）。当業者は，本明細書
に含まれる核酸分子について必要なことは，核酸分子が反応を触媒するのに十分
でありかつ適切である長さおよびコンフォメーションであることのみであること
を認識するであろう。本発明の核酸分子の長さは，記載される一般的限界内にお
いて限定的なものではない。
【００５１】 好ましくは，ＣＤ２０および／またはＮＯＧＯの複製をダウンレギュレートす
る核酸分子は，ＣＤ２０および／またはＮＯＧＯのＲＮＡ分子に相補的な１２−
１００塩基を含む。さらに好ましくは，ＣＤ２０および／またはＮＯＧＯの複製
をダウンレギュレートする核酸分子は，ＣＤ２０および／またはＮＯＧＯのＲＮ
Ａ分子に相補的な１４−２４塩基を含む。
【００５２】 好ましい態様においては，本発明は，所望の標的のＲＮＡに対して高い特異性
を示す，核酸系の一群の遺伝子阻害剤を製造する方法を提供する。例えば，酵素
的核酸分子は，好ましくは，本発明の１つのまたはいくつかの核酸分子により疾
病または状態の特異的治療が与えられるように，ＮＯＧＯ−Ａ，Ｂ，Ｃ，および
／またはＣＤ２０蛋白質をコードする標的ＲＮＡ（特にＮＯＧＯおよび／または
ＣＤ２０遺伝子）の高度に保存された配列領域を標的とする。そのような核酸分
子は，特定の組織または細胞標的に必要に応じて外的に輸送することができる。
あるいは，核酸分子（例えば，リボザイムおよびアンチセンス）は，特定の細胞
に輸送されるＤＮＡおよび／またはＲＮＡベクターから発現させることができる
。
【００５３】 好ましい態様においては，本発明は，本発明の核酸系の阻害剤を用いて，ＣＤ
２０および／またはＮＯＧＯ遺伝子とホモロジーを共有する遺伝子を特異的に標
的とすることを特徴とする。
【００５４】 本明細書において用いる場合，"細胞"とは，その通常の生物学的意味において
用いられ，多細胞生物全体を表さず，例えば特にヒトを表さない。細胞は，ヒト
であってもよい生物中に存在することができるが，好ましくは非ヒト多細胞生物
，例えば，鳥，植物および哺乳動物，例えばウシ，ヒツジ，無尾猿，有尾猿，ブ
タ，イヌ，およびネコに存在する。細胞は原核生物（例えば細菌細胞）または真
核生物（例えば哺乳動物または植物細胞）であってもよい。
【００５５】 "ＣＤ２０蛋白質"とは，例えば成熟Ｂリンパ球において発現される細胞表面リ
ン蛋白質を含む蛋白質またはその変異蛋白質誘導体を意味する。
【００５６】 "ＮＯＧＯ蛋白質"とは，神経阻害剤活性，好ましくはＣＮＳ神経成長阻害剤活
性を含む蛋白質またはその変異蛋白質誘導体を意味する。
【００５７】 "高度に保存された配列領域"とは，標的遺伝子中の１またはそれ以上の領域の
ヌクレオチド配列が，１つの世代と他の世代において，または１つの生物学的シ
ステムと他の生物学的システムにおいて，有意に異ならないことを意味する。
【００５８】 ＣＤ２０発現の核酸系の阻害剤は，単独で，または他の療法と組み合わせて，
疾病および状態，例えば，リンパ腫，白血病，および関節症の予防および／また
は治療に有用である。これらには，限定されないが，Ｂ−細胞リンパ腫，低悪性
度または濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ），巨大低悪性度または濾胞性ＮＨ
Ｌ，リンパ球性白血病，ＨＩＶ付随性ＮＨＬ，外套−細胞リンパ腫（ＭＣＬ），
免疫細胞腫（ＩＭＣ），小Ｂ−細胞リンパ性リンパ腫，免疫性血小板減少症，炎
症性関節症，および細胞または組織におけるＣＤ２０のレベルに関連するかまた
はこれに応答する他の任意の疾病または状態が含まれる。
【００５９】 ＮＯＧＯ発現の核酸系の阻害剤は，単独で，または他の療法と組み合わせて，
疾病および状態，例えば，ＣＮＳ損傷および脳血管偶発症候（ＣＶＡ，発作），
アルツハイマー病，痴呆，多発性硬化症（ＭＳ），化学療法誘導性ニューロパシ
ー，筋ジストロフィー，および細胞または組織におけるＮＯＧＯのレベルに関連
するかまたはこれに応答する他の任意の疾病または状態の予防および／または治
療に有用である。さらに，ＮＯＧＯ阻害は，ＣＮＳニューロン性成長阻害（損傷
または障害を受けたＣＮＳ組織を選択的に再生して特定の反射性および／または
運動性機能を回復することができる状況）を排除するための治療標的として用い
ることができる。
【００６０】 "関連する"とは，ＣＤ２０および／またはＮＯＧＯ発現（特にＣＤ２０および
／またはＮＯＧＯ遺伝子）ＲＮＡレベルの減少，したがって，それぞれの蛋白質
のレベルの減少が，疾病または状態の症状をある程度軽減させるであろうことを
意味する。
【００６１】 本発明の核酸系の阻害剤は，直接加えてもよく，またはカチオン性脂質と複合
体化して，リポソーム中に封入して，または他の方法により，標的細胞または組
織に輸送することができる。核酸または核酸複合体は，関連する組織にエクスビ
ボで，または注射，注入ポンプまたはステントを用いてインビボで，バイオポリ
マー中に取り込ませてまたは取り込ませずに，局所的に投与することができる。
好ましい態様においては，酵素的核酸阻害剤は，表ＩＩＩ−ＸＩＶの基質配列に
相補的な配列を含む。そのような酵素的核酸分子の例はまた，表ＩＩＩ−ＸＩＶ
に示される。そのような酵素的核酸分子の例は，本質的にこれらの表に記載され
る配列からなる。
【００６２】 さらに別の態様においては，本発明は，表ＩＩＩ−ＸＩＶに示される基質配列
に相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子および２−５Ａキメラを特徴とする
。そのような核酸分子は，表ＩＩＩ−ＸＩＶの酵素的核酸分子の結合アームにつ
いて示される配列を含むことができる。同様に，対応するＤＮＡ標的領域を標的
とし，標的配列または特定される標的（基質）配列に相補的な配列と同等のＤＮ
Ａを含むトリプレックス分子を提供することができる。典型的には，アンチセン
ス分子は，アンチセンス分子の１つの連続する配列に沿って標的配列に相補的で
あろう。しかし，ある態様においては，アンチセンス分子は，基質分子がループ
を形成するように基質に結合することができ，および／またはアンチセンス分子
はアンチセンス分子がループを形成するように結合することができる。すなわち
，アンチセンス分子が２つの（またはさらにそれ以上の）非連続的基質配列に相
補的であってもよく，またはアンチセンス分子の２つの（またはさらにそれ以上
の）非連続的配列部分が標的配列に相補的であってもよく，その両方でもよい。
【００６３】 "本質的に・・・からなる"とは，本発明の活性な核酸分子，例えば酵素的核酸
分子が，標的部位における切断が生ずるように，実施例に記載されるものと同等
の酵素中心，もしくはコア，およびＲＮＡに結合することができる結合アームを
含むことを意味する。そのような切断を有意に妨害しない他の配列が存在してい
てもよい。すなわち，コア領域は，例えば，酵素的活性を妨害しない１またはそ
れ以上のループまたはステム−ループ構造またはリンカーを含んでいてもよい。
表ＩＩＩ，ＩＶ，ＩＸおよびＸの配列中，下線を施した領域は，ループ，ステム
−ループ，ヌクレオチドリンカー，および／または非ヌクレオチドリンカー等で
あることができ，一般に配列"Ｘ"として表すことができる。例えば，ハンマーヘ
ッド酵素的核酸のコア配列は，配列"Ｘ"により接続されている保存配列，例えば
，５’−ＣＵＧＡＵＧＡＧ−３’および５’−ＣＧＡＡ−３’を含むことができ
，ここで，Ｘは，５’−ＧＣＣＧＵＵＡＧＧＣ−３’（配列番号９２６５），ま
たは当該技術分野において知られる任意の他のステムＩＩ領域，またはヌクレオ
チドおよび／または非ヌクレオチドリンカーであることができる。同様に，本発
明の他の核酸分子，例えば，イノザイム，Ｇ−切断剤，アンバーザイム，チンザ
イム，ＤＮＡｚｙｍｅ，アンチセンス，２−５Ａアンチセンス，トリプレックス
形成核酸，およびデコイ核酸についても，核酸分子の機能を妨害しない他の配列
または非ヌクレオチドリンカーが存在していてもよい。
【００６４】 配列Ｘは，２ヌクレオチド以上の長さのリンカーであることができ，好ましく
は，３，４，５，６，７，８，９，１０，１５，２０，２６，３０の長さであり
，ここで，ヌクレオチドは好ましくは，内部で塩基対形成して，好ましくは２塩
基対以上の長さのステムを形成することができる。あるいは，またはそれに加え
て，Ｘは，非ヌクレオチドリンカーであってもよい。さらに別の態様においては
，ヌクレオチドリンカーＸは核酸アプタマー，例えば，ＡＴＰアプタマー，ＨＩ
Ｖ Ｒｅｖアプタマー（ＲＲＥ），ＨＩＶ Ｔａｔアプタマー（ＴＡＲ）および
他のものであってもよい（概説として，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａ
ｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；およびＳｚｏｓｔａｋ＆Ｅ
ｌｌｉｎｇｔｏｎ，１９９３，Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ，ｅｄ．Ｇｅｓｔｅ
ｌａｎｄ ａｎｄ Ａｔｋｉｎｓ，ｐｐ．５１１，ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。本明細書において用いる場合，"核酸アプタマー"とは
，リガンドと相互作用しうる核酸配列を示すことを意味する。リガンドは，任意
の天然のまたは合成の分子であることができ，例えば，限定されないが，樹脂，
代謝産物，ヌクレオシド，ヌクレオチド，薬剤，トキシン，遷移状態類似体，ペ
プチド，脂質，蛋白質，アミノ酸，核酸分子，ホルモン，炭水化物，レセプター
，細胞，ウイルス，細菌および他のものでありうる。
【００６５】 さらに別の態様においては，非ヌクレオチドリンカーＸは，本明細書に記載さ
れるとおりである。本明細書において用いる場合，"非ヌクレオチド"との用語は
，無塩基ヌクレオチド，ポリエーテル，ポリアミン，ポリアミド，ペプチド，炭
水化物，脂質，またはポリ炭化水素化合物のいずれかを含む。特定の例には，以
下に記載されるものが含まれる：Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３およびＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８７，１５：３１１３；Ｃｌｏａｄ ａｎｄ Ｓｃ
ｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：６３２４；
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．１９９１，１１３：５１０９；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３，２１：２５８５およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１９９３，３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙ ｅｔ ａｌ
．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９１，１０：２８
７；Ｊｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９
３，３４：３０１；Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９
１，３０：９９１４；Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ８９／０２４
３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／０６７３１；Ｄｕｄｙｃ
ｚ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／１１９１０およびＦｅｒｅｎｔｚ ａｎ
ｄ Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：４００
０（すべて本明細書の一部としてここに引用する）。"非ヌクレオチド"はさらに
，１またはそれ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖中に組み込むことがで
き，糖および／またはリン酸置換を含んでいてもよく，残りの塩基がその酵素的
活性を示すことを可能とする任意の基または化合物を意味する。基または化合物
は，一般的に認識されるヌクレオチド塩基，例えば，アデニン，グアニン，シト
シン，ウラシルまたはチミンを含まない場合，無塩基である。すなわち，好まし
い態様においては，本発明は，１またはそれ以上の非ヌクレオチド成分を有し，
ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を切断する酵素的活性を有する酵素的核酸分子を特徴と
する。
【００６６】 本発明の別の観点においては，標的ＲＮＡ分子と相互作用しＣＤ２０および／
またはＮＯＧＯ（特にＣＤ２０および／またはＮＯＧＯ遺伝子）活性を阻害する
酵素的核酸またはアンチセンス分子は，ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入さ
れた転写ユニットから発現される。組換えベクターは，好ましくはＤＮＡプラス
ミドまたはウイルスベクターである。酵素的核酸またはアンチセンスを発現する
ウイルスベクターは，限定されないが，アデノ随伴ウイルス，レトロウイルス，
アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができる。好
ましくは，酵素的核酸またはアンチセンスを発現しうる組換えベクターは，上述
のように輸送され，標的細胞中に残留する。あるいは，酵素的核酸またはアンチ
センスの過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのよう
なベクターは，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現され
れば，酵素的核酸またはアンチセンスは標的ＲＮＡに結合し，その機能または発
現を阻害する。酵素的核酸またはアンチセンスを発現するベクターの輸送は，全
身的（例えば，静脈内または筋肉内投与により），患者から外植された標的細胞
に投与した後，患者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入
を可能とする他のいずれかの手段により行うことができる。アンチセンスＤＮＡ
は，一本鎖ＤＮＡ細胞内発現ベクターを使用することにより発現させることがで
きる。
【００６７】 "ベクター"とは，所望の核酸を輸送するために用いられる任意の核酸系および
／またはウイルス系技術を意味する。
【００６８】 "患者"とは，外植した細胞のドナーまたはレシピエントである生物，または細
胞それ自体を意味する。"患者"とはまた，本発明の核酸分子を投与することがで
きる生物を表す。好ましくは，患者は哺乳動物または哺乳動物細胞である。より
好ましくは，患者はヒトまたはヒト細胞である。
【００６９】 "増強された酵素活性"とは，細胞内および／またはインビボで測定された活性
を含むことを意味し，ここで，活性は，本発明の核酸分子の触媒活性および安定
性の両方を反映する。本発明においては，これらの特性の積を，インビボで全Ｒ
ＮＡ酵素的核酸または全ＤＮＡ酵素と比較して増加させることができる。場合に
よっては，核酸分子の活性または安定性は減少（すなわち，１０倍以下）しても
よいが，核酸分子の全体的活性はインビボで増強される。
【００７０】 本発明の核酸分子は，個別に，または他の薬剤と組み合わせるか結合させて，
上述した疾病または状態を治療するために用いることができる。例えば，ＣＤ２
０および／またはＮＯＧＯのレベルに関連する疾病または状態を治療するために
は，当業者には明らかなように，治療に適した条件下で，個別にまたは１または
それ以上の薬剤と組み合わせて，患者を治療するかまたは他の適当な細胞を処理
することができる。
【００７１】 さらに別の態様においては，記載される分子，例えばアンチセンスまたは酵素
的核酸を，他の既知の治療と組み合わせて用いて，上述した病気または疾病を治
療することができる。例えば，記載される分子を１またはそれ以上の既知の治療
剤と組み合わせて用いて，ＣＮＳ損傷および脳血管偶発症候（ＣＶＡ，発作），
アルツハイマー病，痴呆，多発性硬化症（ＭＳ），化学療法誘導性ニューロパシ
ー，筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ），パーキンソン病，運動失調，ハンチントン
病，クロイツフェルト−ヤーコプ病，筋ジストロフィー，リンパ腫，白血病，お
よび関節症を治療することができる。例としては，限定されないが，Ｂ−細胞リ
ンパ腫，低悪性度または濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ），巨大低悪性度ま
たは濾胞性ＮＨＬ，リンパ球性白血病，ＨＩＶ付随性ＮＨＬ，外套−細胞リンパ
腫（ＭＣＬ），免疫細胞腫（ＩＭＣ），小Ｂ−細胞リンパ性リンパ腫，および免
疫性血小板減少症，炎症性関節症，および／またはＣＤ２０および／またはＮＯ
ＧＯ発現の調節に応答する他の疾病または状態が含まれる。
【００７２】 別の好ましい態様においては，本発明は，核酸系の阻害剤（例えば，酵素的核
酸分子（リボザイム），アンチセンス核酸，２−５Ａアンチセンスキメラ，トリ
プレックスＤＮＡ，ＲＮＡ切断化学基を含むアンチセンス核酸），およびこれら
を用いてリンパ腫，白血病，および関節症の進行および／または維持をすること
ができる遺伝子（例えばＣＤ２０）の発現をダウンレギュレートまたは阻害する
方法を特徴とする。そのような疾病には，例えば，限定されないが，Ｂ−細胞リ
ンパ腫，低悪性度または濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ），巨大低悪性度ま
たは濾胞性ＮＨＬ，リンパ球性白血病，ＨＩＶ付随性ＮＨＬ，外套−細胞リンパ
腫（ＭＣＬ），免疫細胞腫（ＩＭＣ），小Ｂ−細胞リンパ性リンパ腫，および免
疫性血小板減少症，炎症性関節症，および／またはＣＤ２０発現の調節に応答す
る他の疾病状態または病気が含まれる。
【００７３】 別の好ましい態様においては，本発明は，核酸系の阻害剤（例えば，酵素的核
酸分子（例えばリボザイム），アンチセンス核酸，２−５Ａアンチセンスキメラ
，トリプレックスＤＮＡ，ＲＮＡ切断化学基を含有するアンチセンス核酸）およ
びこれらを用いて，ＣＮＳ損傷および脳血管偶発症候（ＣＶＡ，発作），アルツ
ハイマー病，痴呆，多発性硬化症（ＭＳ），化学療法誘導性ニューロパシー，筋
萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ），パーキンソン病，運動失調，ハンチントン病，ク
ロイツフェルト−ヤーコプ病，筋ジストロフィー，および／またはＮＯＧＯ発現
の調節に応答する他の神経変性性疾病状態を進行および／または維持しうる遺伝
子（例えばＮＯＧＯ）の発現をダウンレギュレートまたは阻害する方法を特徴と
する。
【００７４】 別の観点においては，本発明は，１またはそれ以上の本発明の核酸分子および
／または発現ベクターを含む哺乳動物細胞を提供する。１またはそれ以上の核酸
分子は，独立して，同じまたは異なる部位を標的とすることができる。
【００７５】 "・・を含む"とは，"・・を含む"の単語の前にあるものを含むがそれには限定
されないことを意味する。すなわち，"・・を含む"との用語の使用は，挙げられ
る要素が必要または強制的なものであるが，他の要素は任意であり，存在しても
存在しなくてもよいことを示す。"・・からなる"とは，"・・からなる"の語句の
前にあるものをすべて含みかつそれに限定されることを意味する。すなわち，"
・・からなる"との語句は，挙げられる要素が必要または強制的なものであり，
他の要素は存在しないことを示す。
【００７６】 本発明の他の特徴および利点は，以下の本発明の好ましい態様の説明および特
許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００７７】好ましい態様の説明 最初に図面を簡単に説明する。 図面： 図１は，７つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを示す。矢印は
切断の部位を示す。−−−−−−−−−は標的配列を示す。点が散在する線は，
三次相互作用を示す。−は塩基対形成相互作用を示す。グループＩイントロン：
Ｐ１−Ｐ９．０は種々のステム−ループ構造を表す（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，
１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏ．，１，２７３）。ＲＮａｓｅ
Ｐ（Ｍ１ＲＮＡ）ＥＧＳは外部ガイド配列を表す（Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ
．１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，７８３；Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９
９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，３５８７）。グループＩＩイントロ
ン：５'ＳＳは５'スプライシング部位を意味する；３’ＳＳは３’−スプライシ
ング部位を意味する；ＩＢＳはイントロン結合部位を意味する；ＥＢＳはエクソ
ン結合部位を意味する（Ｐｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｙ，３３，２７１６）。ＶＳ ＲＮＡ：Ｉ−ＶＩは，６つのステム−ループ
構造を示す；陰領域は三次相互作用を示す（Ｃｏｌｌｉｎｓ，国際公開ＷＯ９６
／１９５７７）。ＨＤＶリボザイム：Ｉ−ＩＶは４つのステム−ループ構造を示
す（Ｂｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６２５，０４７）。ハンマーヘッド
リボザイム：Ｉ−ＩＩＩは，３つのステム−ループ構造を示す；ステムＩ−ＩＩ
Ｉは，任意の長さであってもよく，対称でも非対称でもよい（Ｕｓｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．，１，５２７）
。ヘアピンリボザイム：ヘリックス１，４および５は任意の長さでありうる；ヘ
リックス２は３−８塩基対の長さである；Ｙはピリミジンである；ヘリックス２
（Ｈ２）は少なくとも４塩基対で与えられ（すなわち，ｎは１，２，３または４
），ヘリックス５は任意に２塩基またはそれ以上の長さでありうる（好ましくは
３−２０塩基，すなわち，ｍは１−２０またはそれ以上）。ヘリックス２および
ヘリックス５は，１またはそれ以上の塩基により共有結合していてもよい（すな
わち，ｒは１塩基以上）。ヘリックス１，４または５はまた，リボザイム構造を
安定化するために，２塩基対またはそれ以上長くてもよく（すなわち４−２０塩
基対），好ましくは蛋白質結合部位である。それぞれの例において，各Ｎおよび
Ｎ'は，独立して，任意の正常または修飾塩基であり，各ダッシュは潜在的塩基
対相互作用を表す。これらのヌクレオチドは，糖，塩基またはリン酸で修飾され
ていてもよい。ヘリックス中では完全な塩基対形成は必要ではないが，好ましい
。ヘリックス１および４は，ある程度の塩基対形成が保持される限り，任意のサ
イズでありうる（すなわち，ｏおよびｐは，それぞれ独立して，０から任意の数
，例えば２０である）。必須塩基は，構造中に特定の塩基として示されるが，当
業者は，１またはそれ以上が化学的に修飾（無塩基，塩基，糖および／またはリ
ン酸修飾）されていてもよく，または著しい影響なしで他の塩基で置き換えられ
ていてもよいことを認識するであろう。ヘリックス４は，２つの別々の分子から
，すなわち接続ループなしで形成してもよい。接続ループは，存在する場合，そ
の塩基，糖またはリン酸に修飾を有するかまたは有しないリボヌクレオチドであ
りうる。ｑは２塩基以上である。接続ループはまた，非ヌクレオチドリンカー分
子で置き換えられていてもよい。Ｈは塩基Ａ，Ｕ，またはＣを表す。Ｙはピリミ
ジン塩基を表す。"＿＿"は，共有結合を表す（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９
９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，１２９；Ｃｈ
ｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６３１，３５９）。
【００７８】 図２は，化学的に安定化されたリボザイムモチーフの例を示す。ＨＨ Ｒｚは
ハンマーヘッドリボザイムモチーフを表す（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９
６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．，１，５２７）；ＮＣＨ Ｒｚは
ＮＣＨリボザイムモチーフを表す（Ｌｕｄｗｉｇ＆Ｓｐｒｏａｔ，国際公開９８
／５８０５８）；Ｇ−切断剤はＧ−切断剤リボザイムモチーフを表す（Ｋｏｒｅ
ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
２６，４１１６−４１２０）。Ｎまたはｎは，独立して，ヌクレオチドを表し，
これらは同じでも異なっていてもよく，互い相補性を有していてもよい；ｒＩは
リボ−イノシンヌクレオチドを表す；矢印は標的中の切断の部位を表す。ＨＨ
ＲｚおよびＮＣＨ Ｒｚの位置４は，２’−Ｃ−アリル修飾を有するものとして
示されているが，当業者は，修飾がリボザイムの活性を有意に阻害しない限り，
この位置を当該技術分野においてよく知られる他の修飾で修飾することができる
ことを認識するであろう。
【００７９】 図３は，化学的に安定化されたアンバーザイム酵素的核酸モチーフ（例えば，
Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開９９／５５８５７を参照，本明細
書の一部としてここに引用する；クラスＩモチーフとも称される）の例を示す。
アンバーザイムモチーフは，その活性にリボヌクレオチド（２’−ＯＨ）基の存
在を必要としない一群の酵素的核酸分子である。
【００８０】 図４は，化学的に安定化されたチンザイムＡ酵素的核酸モチーフ（Ｂｅｉｇｅ
ｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開９９／５５８５７を参照，本明細書の一部と
してここに引用する；クラスＡモチーフまたはクラスＩＩモチーフとも称される
）の例を示す。チンザイムモチーフは，その活性にリボヌクレオチド（２’−Ｏ
Ｈ）基の存在を必要としない一群の酵素的核酸分子である。
【００８１】 図５は，Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ，９４，４２６
２により記載されるＤＮＡｚｙｍｅモチーフの例を示す。
【００８２】 図６は，ハンマーヘッドに基づくシスブロッキング配列戦略を用いる標的配列
の検出の非限定的例を示す。この場合，エフェクター分子は，標的の非存在下で
は，分子内折り畳みにより不活性化される。標的配列を加えると，エフェクター
分子／標的複合体はレポーター配列にハイブリダイズすることができる。活性化
標的／エフェクター分子複合体によるレポーター分子の同時切断により，蛍光団
と消光分子の分離による蛍光シグナルが得られる。
【００８３】 この同じ概念を，本発明の他の酵素的核酸モチーフ，例えば，限定されないが
，イノザイム，Ｇ−切断剤，ＤＮＡｚｙｍｅ，チンザイム，アンバーザイム，お
よびヘアピンに適用することができる。さらに，ブロッキング配列のコンフィギ
ュレーションは，種々の配列位置とシスおよびトランスの両方で（例えば，分子
間結合および／または分子内結合），かつエフェクター分子の種々の異なる位置
で，ハイブリダイズすることができる。別の非限定的コンフィギュレーションは
図８−１４にまとめられている。
【００８４】 図７は，シス作用性診断エフェクター分子の２つの主要なコンフィギュレーシ
ョンを示す概略図を示す。分子は，標的配列に結合していてもよく（Ａ），結合
せずしたがってそれ自身に結合していてもよい（Ｂ）。
【００８５】 図８は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の潜在的二次構造を
示す。
【００８６】 図９は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の潜在的二次構造を
示す。
【００８７】 図１０は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の潜在的二次構造
を示す。
【００８８】 図１１は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の潜在的二次構造
を示す。
【００８９】 図１２は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の潜在的二次構造
を示す。
【００９０】 図１３は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の潜在的二次構造
を示す。
【００９１】 図１４は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の潜在的二次構造
を示す。
【００９２】 図１５は，本発明の診断システムの固有の増幅能力を示す。
【００９３】 図１６は，本発明の診断システムの構造を示す。
【００９４】 図１７は，切断アッセイにおいて酵素的核酸／阻害剤の組み合わせを試験した
結果を示す棒グラフである。基質分子を３２Ｐ−リン酸で５’末端標識し，（１
）緩衝液のみ（５０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．５，１０ｍＭＭｇＣｌ２），または
（２）１０ｎＭ酵素的核酸，（３）１０ｎＭ酵素的核酸＋２０ｎＭ阻害剤，（４
）１０ｎＭ酵素的核酸＋２００ｎＭ阻害剤，または（５）１０ｎＭ酵素的核酸＋
２０ｎＭ阻害剤および５００ｎＭ標的の存在下で１２または６０分間インキュベ
ートする。インキュベートの終わりに，反応液をＰＡＧＥゲルに負荷して，切断
された産物を未切断基質から分離する。ゲルをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍ
ｉｃｓホスホイメージャーで画像化し定量して，各条件の組において切断された
基質のパーセントを決定する。対照反応を実施して，阻害剤または標的配列を加
え，酵素的核酸を加えないと基質切断が生じないことを確認する。これらの条件
下ではわずか０．２−０．４％の基質が切断された。
【００９５】本発明の核酸分子の作用のメカニズム アンチセンス ：アンチセンス分子は，修飾されたまたは修飾されていないＲＮＡ
，ＤＮＡ，または混合ポリマーのオリゴヌクレオチドであることができ，主とし
て，マッチする配列に特異的に結合することにより機能し，ペプチド合成を阻害
する（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，Ｎｏｖ １９９４，Ｂｉｏ Ｐｈａｒｍ，２０−３３）
。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，標的ＲＮＡにワトソンクリック塩基対形
成により結合し，立体的障害によりまたはＲＮａｓｅＨ酵素を活性化することに
より，結合した配列のリボソーム翻訳を防止することにより遺伝子発現を妨害す
る。アンチセンス分子はまた，ＲＮＡのプロセシングまたは核から細胞質への輸
送を妨害することにより蛋白質合成を変化させることができる（Ｍｕｋｈｏｐａ
ｄｈｙａｙ＆Ｒｏｔｈ，１９９６，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
ｓｉｓ ７，１５１−１９０）。
【００９６】 さらに，一本鎖ＤＮＡのＲＮＡへの結合により，ヘテロデュープレックスがヌ
クレアーゼ分解される（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，（上掲），Ｃｒｏｏｋｅ，（上掲））
。これまでのところ，ＲＮａｓｅＨの基質として作用する，主鎖を化学的に修飾
したＤＮＡは，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートおよびボロントリフ
ルオリデートのみである。最近，２’−アラビノおよび２’−フルオロアラビノ
含有オリゴもまたＲＮａｓｅＨ活性を活性化することが報告された。
【００９７】 化学的に修飾されたヌクレオチドの新規なコンフィギュレーション，二次構造
，および／またはＲＮａｓｅＨ基質ドメインを利用する多数のアンチセンス分子
が記載されている（Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａ ｌ；国際公開ＷＯ９８／１３５２６
；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，国際公
開９９／５４４５９；Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願６０／１
０１，１７４，１９９８年９月２１日出願）（これらはその全体を本明細書の一
部としてここに引用する）。
【００９８】 さらに，アンチセンスデオキシオリゴリボヌクレオチドを用いて，ＤＮＡ−Ｒ
ＮＡ相互作用によりＲＮＡを標的化して，このことによりデュープレックス中の
標的ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅＨを活性化することができる。アンチセンスＤ
ＮＡは，一本鎖ＤＮＡの細胞内発現ベクターまたはその同等物を用いて発現させ
ることができる。
【００９９】トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ） ：配列特異的様式でゲノムＤ
ＮＡに結合するように一本鎖ＤＮＡを設計することができる。ＴＦＯは，フーグ
スティーン塩基対形成を介してＤＮＡらせんに結合するピリミジンリッチオリゴ
ヌクレオチドから構成される（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，（上掲））。得られる三重らせ
んは，ＤＮＡセンス，ＤＮＡアンチセンス，およびＴＦＯからなり，ＴＦＯはＲ
ＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成を破壊する。結合が不可逆的であるため，Ｔ
ＦＯメカニズムにより遺伝子発現または細胞死が生ずることができる（Ｍｕｋｈ
ｏｐａｄｈｙａｙ＆Ｒｏｔｈ，（上掲））。
【０１００】２’−５’アンチセンスキメラ ：２−５Ａシステムは，高等脊椎動物に見いださ
れるＲＮＡ分解のインターフェロン媒介性メカニズムである（Ｍｉｔｒａ ｅｔ
ａｌ；１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３，６７
８０−６７８５）。ＲＮＡ切断には，２種類の酵素，すなわち，２−５Ａシンセ
ターゼおよびＲＮａｓｅＬが必要である。２−５Ａシンセターゼは，二本鎖ＲＮ
Ａが２’−５’オリゴアデニル酸（２−５Ａ）を形成することを必要とする。次
に，２−５Ａは，一本鎖ＲＮＡを切断する能力を有するＲＮａｓｅＬを利用する
ためのアロステリックエフェクターとして作用する。二本鎖ＲＮＡとともに２−
５Ａ構造を形成する能力のため，このシステムはウイルス複製の阻害に特に有用
である。
【０１０１】 （２’−５’）オリゴアデニル酸構造は，アンチセンス分子に共有結合で結合
して，ＲＮＡ切断が可能なキメラオリゴヌクレオチドを形成することができる（
Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，（上掲））。これらの分子は，おそらくは，２−５Ａ依存性
ＲＮａｓｅに結合してこれを活性化し，次にオリゴヌクレオチド／酵素複合体が
標的ＲＮＡ分子に結合し，これは次にＲＮａｓｅ酵素により切断されることがで
きる。
【０１０２】酵素的核酸： 現在，天然に生ずる酵素的ＲＮＡの７つの基本的変種が知られてい
る。さらに，いくつかのインビトロ選択（進化）戦略（Ｏｒｇｅｌ，１９７９，
Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ２０５，４３５）を用いて，ホスホジ
エステル結合の切断およびライゲーションを触媒しうる新たな核酸触媒が発展し
てきた（Ｊｏｙｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３−８７；Ｂｅａｕｄｒｙ
ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙ
ｃｅ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６７，９０−９
７；Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＴＩＢＴＥＣＨ １２，２６８
；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１
−１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ １７，８９−９３；Ｋｕｍ
ａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋ
ｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｓａｎｔｏ
ｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９
４，４２６２；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＲＮＡ ３，９１４；Ｎａ
ｋａｍａｙｅ＆Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９４，（上掲）；Ｌｏｎｇ＆Ｕｈｌｅｎ
ｂｅｃｋ，１９９４，（上掲）；Ｉｓｈｉｚａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，
（上掲）；Ｖａｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ３
６，６４９５；（これらのすべてを本明細書の一部としてここに引用する）。そ
れぞれは，生理学的条件下で，ホスホジエステル結合をトランスで加水分解する
ことを含む一連の反応を触媒することができる（したがって，他のＲＮＡ分子を
切断しうる）。
【０１０３】 本発明の核酸分子は，ＣＤ２０，ＮＯＧＯ−Ａ，Ｂ，および／またはＣ蛋白質
の発現をある程度ブロックすることができ，ＣＤ２０，ＮＯＧＯ−Ａ，Ｂ，およ
び／またはＣのレベルに関連する疾病の治療または疾病の診断に用いることがで
きる。
【０１０４】 酵素的核酸の酵素的性質は，治療を行うのに必要な酵素的核酸の濃度がより低
い等の著しい利点を有する。この利点は，酵素的核酸が酵素的に作用する能力を
反映している。すなわち，１つの酵素的核酸分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切断
することができる。さらに，酵素的核酸は，高度に特異的な阻害剤であり，その
阻害の特異性は，標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成メカニズムのみならず，標的
ＲＮＡ切断のメカニズムにも依存する。切断の部位の近くにおける１つのミスマ
ッチまたは塩基置換を選択して，酵素的核酸の触媒活性を完全に排除することが
できる。
【０１０５】 エンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸分子は，ヌクレオチド塩基配列特異
的様式で他の別のＲＮＡ分子を繰り返し切断することができる。そのような酵素
的核酸分子は，事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができ，インビ
トロで有効な切断を達成することができる（Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，３２４，
Ｎａｔｕｒｅ ４２９ １９８６；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８７ Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２８，５９６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，８４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７８８，１９８７；Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８，Ｅ
ｉｎｓｔｅｉｎ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，６，９２；Ｈａｓｅｌｏ
ｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，３３４ Ｎａｔｕｒｅ ５８５，１９８８；Ｃ
ｅｃｈ，２６０ ＪＡＭＡ ３０３０，１９８８；Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅｔ
ａｌ．，１７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３７１，１
９８９；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７（上掲）））。
【０１０６】 その配列特異性のため，トランス切断酵素的核酸は，ヒトの疾患の治療剤とし
て有望である（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５ Ａｎｎ．Ｒｅｐ．
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ ａ
ｎｄ Ｍａｒｒ，１９９５ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７
）。酵素的核酸は，細胞性ＲＮＡのバックグラウンド中で特定のＲＮＡ標的を切
断するよう設計することができる。そのような切断事象は，ＲＮＡを非機能性に
し，そのＲＮＡからの蛋白質発現を排除する。このようにして，疾患状態に関連
する蛋白質の合成を選択的に阻害することができる（Ｗａｒａｓｈｉｎａ ｅｔ
ａｌ．，１９９９，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ．６，２３
７−２５０）。
【０１０７】 本発明の核酸分子は，ＧｅｎｅＢｌｏｃ（登録商標）試薬とも称され，これは
本質的に，遺伝子発現をダウンレギュレートしうる核酸分子（例えば，リボザイ
ム，アンチセンス）である。
【０１０８】 ＧｅｎｅＢｌｏｃｓは，修飾オリゴヌクレオチドであり，特定のｍＲＮＡ分子
に結合してこれを標的化するリボザイムおよび修飾アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを含む。ＧｅｎｅＢｌｏｃｓは任意の特定のｍＲＮＡを標的とするよう設計
することができるため，その潜在的用途は非常に広い。伝統的アンチセンス方法
は，生物学的試料における安定性を増強するために，ホスホロチオエート修飾の
使用に非常に依存してきており，非特異的蛋白質結合および一般的細胞毒性に由
来する，特異性に関する無数の問題点が導かれてきた（Ｓｔｅｉｎ，１９９５，
Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１，１１１９）。これに対し，ＧｅｎｅＢｌ
ｏｃｓはホスホロチオエート結合の使用を最小にしながらヌクレアーゼ耐性を付
与する多数の修飾を含み，このことにより，伝統的アンチセンスオリゴヌクレオ
チドと比較して，毒性が減少し，結合親和性が増加し，非特異的影響が最小にな
る。最近類似の試薬が種々の細胞培養系（Ｖａｓｓａｒ， ｅｔ ａｌ．，１９
９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，７３５），およびインビボ（Ｊａｒｖｉｓ ｅ
ｔ ａｌ．，投稿準備中）で用いられて成功している。さらに，新規なカチオン
性脂質を用いて，血清の存在下で細胞による取り込みを増強させることができる
。リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは遺伝子発現をＲＮＡレベ
ルで制御するため，ＧｅｎｅＢｌｏｃの定常状態用量を数日間にわたり維持する
ことが可能であることが，標的蛋白質および表現型分析に重要であった。ヌクレ
アーゼ分解に対する耐性およびインビトロでの活性の持続に関する進歩は，標的
を確認する用途におけるＧｅｎｅＢｌｏｃｓの使用を支持してきた。
【０１０９】標的部位 有用な酵素的核酸およびアンチセンス核酸の標的は，Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９３／２
３０５７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９４／０２５９５；Ｄｒａｐ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９５／０４８１８；ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ
．，米国特許５，５２５，４６８（すべて本明細書の一部としてここに引用する
）に開示されるように決定することができる。他の例には，以下のＰＣＴ出願が
含まれ，これらは疾病に関連する遺伝子の発現の不活性化に関連する：ＷＯ９５
／２３２２５，ＷＯ９５／１３３８０，ＷＯ９４／０２５９５（すべて本明細書
の一部としてここに引用する）。ここでは，これらの文献に提供される指針を繰
り返さずに，以下にそのような方法の特定の例を提供するが，これらは当業者に
とって限定ではない。そのような標的に対する酵素的核酸およびアンチセンスは
，これらの出願に記載のように設計し，合成して，やはり記載されるようにイン
ビトロおよびインビボで試験する。ヒトＣＤ２０およびＮＯＧＯ ＲＮＡの配列
を，コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いて，最適な酵素的核酸およびアン
チセンス標的部位についてスクリーニングした。アンチセンス，ハンマーヘッド
，ＤＮＡｚｙｍｅ，ＮＣＨ，アンバーザイム，チンザイムまたはＧ−切断剤酵素
的核酸の結合／切断部位を同定した。これらの部位は表ＩＩＩ−ＸＩＶに示され
る（表中，すべての配列は５’から３’方向である；下線を施した領域には任意
の配列またはリンカーＸであることができ，実際の配列はここでは重要ではない
）。表中，ヌクレオチド塩基の位置は，示される種類の酵素的核酸分子により切
断されるべき部位として示される。ヒト配列をスクリーニングし，その後に酵素
的核酸分子および／またはアンチセンスを設計することができるが，Ｓｔｉｎｃ
ｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９５／２３２２５に議論されているように，マ
ウスを標的とする酵素的核酸も，ヒトで試験する前に酵素的核酸分子および／ま
たはアンチセンスの作用の有効性を試験するのに有用であろう。
【０１１０】 アンチセンス，ハンマーヘッド，ＤＮＡｚｙｍｅ，ＮＣＨ，アンバーザイム，
チンザイムまたはＧ−切断剤リボザイムの結合／切断部位は，上述したように同
定した。核酸分子はコンピュータ折り畳みにより個々に分析して（Ｊａｅｇｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８６，７７０６），配列が適切な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した。例
えば結合アームと触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有する核酸分
子は考慮から除外した。結合アームの長さを変化させて最適活性を選択すること
ができる。
【０１１１】 アンチセンス，ハンマーヘッド，ＤＮＡｚｙｍｅ，ＮＣＨ，アンバーザイム，
チンザイムまたはＧ−切断剤リボザイムの結合／切断部位を同定し，ＲＮＡ標的
中の種々の部位にアニーリングするよう設計した。結合アームは，上述の標的部
位配列に相補的である。核酸分子は化学的に合成した。用いた合成方法は，以下
に，およびＵｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．
，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４
；ａｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９に記載される通常のＤＮＡ／ＲＮＡ
合成の方法にしたがう。
【０１１２】核酸分子の合成 １００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は，自動化方法を用いては困難
であり，そのような分子の治療的コストは非常に高くなる。本発明においては，
好ましくは，小さい核酸モチーフ（"小さい"とは，１００ヌクレオチド以下の長
さ，好ましくは８０ヌクレオチド以下の長さ，最も好ましくは５０ヌクレオチド
以下の長さの核酸モチーフ，例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド，ハンマー
ヘッドまたはＮＣＨ酵素的核酸を表す）が外的輸送に用いられる。これらの分子
は構造が簡単であるため，核酸がＲＮＡ構造の標的領域に進入する能力が高い。
本発明の例示的分子を化学的に合成したが，他の分子も同様に合成することがで
きる。
【０１１３】 オリゴヌクレオチド（例えば，アンチセンスＧｅｎｅＢｌｏｃｓ（登録商標）
）は，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，
国際公開９９／５４４５９，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ
ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９，Ｂ
ｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ
．，６１，３３−４５，およびＢｒｅｎｎａｎ，米国特許６，００１，３１１に
記載されるような，当該技術分野において知られるプロトコルを用いて合成する
。これらの文献はすべて本明細書の一部としてここに引用する。オリゴヌクレオ
チドの合成には，一般の核酸保護基およびカップリング基，例えば５’−末端に
ジメトキシトリチル，および３’−末端にホスホルアミダイトを用いる。非限定
的例においては，３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合
成器で，０．２μｍｏｌスケールのプロトコルで，２’−Ｏ−メチル化ヌクレオ
チドについては２．５分間のカップリング工程，および２’−デオキシヌクレオ
チドについては４５秒間のカップリング工程で，小スケールの合成を行う。表Ｉ
Ｉは，合成サイクルで用いる試薬の量および接触時間の概要を示す。あるいは，
０．２μｍｏｌスケールでの合成は，９６ウエルプレート合成機，例えば，Ｐｒ
ｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造される装置で，サイク
ルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリ
ングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（
６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイ
トおよび１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５
μｍｏｌ）を用いることができる。デオキシ残基の各カップリングサイクルにお
いて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して２２倍過剰（４０μＬの０．１
１Ｍ＝４．４μｍｏｌ）のデオキシホスホルアミダイトおよび７０倍過剰のＳ−
エチルテトラゾール（４０μＬの０．２５Ｍ＝１０μｍｏｌ）を用いることがで
きる。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機におけ
る平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して，典型的に
は９７．５−９９％である。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔeｍｓ，
Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである
：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ(ＡＢＩ）であり；キャッピン
グは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％
無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は，１６．９
ｍＭ Ｉ2，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録
商標））である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは，
試薬瓶から直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２
５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成する。あるいは，ホスホロチオエート結合
の導入のために，Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３
−オン１，１−ジオキシド，アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
【０１１４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドの脱保護は以下のように行う：ポリマー結合
トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，
４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁する。−２
０℃に冷却した後，上清をポリマー支持体から除去する。支持体を１．０ｍＬの
ＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に
上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥
して，白色粉末を得る。
【０１１５】 ある種の酵素的核酸分子を含む通常のＲＮＡについて用いられる合成方法は，
Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９
，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９
５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４；Ｗｉｎ
ｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４
，５９；に記載の方法にしたがい，慣用の核酸保護基およびカップリング基，例
えば，５’末端にジメトキシトリチル，および３’末端にホスホルアミダイトを
用いる。非限定的例においては，小スケールの合成は，３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で，改変した０．２μｍｏｌスケール
のプロトコルを用いて，アルキルシリル保護ヌクレオチドについては７．５分間
のカップリング工程を，２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間
のカップリング工程を行った。表ＩＩは，合成サイクルにおいて用いた試薬の量
および接触時間の概要を示す。あるいは，０．２μｍｏｌスケールでの合成は，
９６ウエルプレート合成機，例えば，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ
，ＣＡ）により製造される装置で，サイクルに最少の改変を加えて行うことがで
きる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合
５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏ
ｌ）のホスホルアミダイトおよび７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μ
Ｌの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いた。リボ残基の各カップリングサイクル
において，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して６６倍過剰（１２０μＬの
０．１１Ｍ＝１３．２μｕｍｏｌ）のアルキルシリル（リボ）保護ホスホルアミ
ダイトおよび１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（１２０μＬの０．２５Ｍ
＝３０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の
比色定量により決定して，９７．５−９９％であった。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いた他のオリゴヌクレオチド合成
試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ(Ａ
ＢＩ）であり；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢ
Ｉ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行
い；酸化溶液は，１６．９ｍＭ Ｉ2，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（Ｐ
ＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））であった。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ
合成等級アセトニトリルは，試薬瓶から直接用いた。Ｓ−エチルテトラゾール溶
液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成した。あるい
は，ホスホロチオエート結合の導入のために，Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１
，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド，アセトニトリル中０．
０５Ｍ）を用いる。
【０１１６】 ＲＮＡの脱保護は，２ポットプロトコルまたは１ポットプロトコルのいずれか
を用いて行う。２ポットプロトコルについては，ポリマー結合トリチルオンオリ
ゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，４０％水性メチル
アミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後
，上清をポリマー支持体から除去する。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣ
Ｎ：Ｈ2Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清
に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を
得る。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（１
．５ｍＬ Ｎ−メチルピロリジノン，７５０μＬ ＴＥＡおよび１．０ｍＬ Ｔ
ＥＡ・３ＨＦの溶液３００μＬ，ＨＦ濃度１．４Ｍ）に再懸濁し，６５℃に加熱
する。１．５時間後，オリゴマーを１．５Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3で急冷する。
【０１１７】 あるいは，１ポットプロトコルのためには，ポリマー結合トリチルオンオリゴ
リボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，３３％エタノール性
メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）の溶液中で，６５℃で１５分間
懸濁する。バイアルを室温にする。ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を加え，バイ
アルを６５℃で１５分間加熱する。試料を−２０℃に冷却し，次に１．５Ｍ Ｎ
Ｈ4ＨＣＯ3で急冷する。
【０１１８】 トリチルオンオリゴマーの精製のためには，急冷したＮＨ4ＨＣＯ3溶液を，ア
セトニトリル，続いて５０ｍＭ ＴＥＡＡで予備洗浄したＣ−１８含有カートリ
ッジに負荷する。負荷したカートリッジを水で洗浄した後，ＲＮＡを０．５％Ｔ
ＦＡで１３分間脱トリチル化する。次にカートリッジを水で再び洗浄し，１Ｍ
ＮａＣｌで塩交換し，再び水で洗浄する。次に，３０％アセトニトリルでオリゴ
ヌクレオチドを溶出する。
【０１１９】 不活性ハンマーヘッドリボザイムまたは減弱結合対照（ＢＡＣ）オリゴヌクレ
オチド）は，Ｇ５をＵで，Ａ１４をＵで置換することにより合成する（番号付け
は，Ｈｅｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，１９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，３２５２による）。同様に，他の酵素的核酸分子
に１またはそれ以上のヌクレオチド置換を導入して分子を不活性化することがで
き，そのような分子は負の対照として働く。
【０１２０】 平均段階カップリング収率は，典型的には＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ
ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７
７−２６８４）。当業者は，合成のスケールは，上述の例より大きくまたは小さ
く，例えば，限定されないが，９６ウエルのフォーマットに適合させることがで
きること，および，重要なことは，反応において用いられる化学物質の比率のみ
であることを認識するであろう。
【０１２１】 あるいは，本発明の核酸分子は，別々に合成して，合成後に例えばライゲーシ
ョンにより一緒に連結してもよい（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９３
／２３５６９；Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ
．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５
１；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈ
ｅｍ．８，２０４）。
【０１２２】 本発明の核酸分子は，広範囲に修飾して，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’
−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｈに
よる修飾により安定性を高める（概説としてはＵｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒ
ｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９
９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を参照）
。酵素的核酸は，一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（上
掲）を参照，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）により精製し，
水に再懸濁する。
【０１２３】 化学的に合成した，本研究で有用な酵素的核酸およびアンチセンス構築物の配
列は，表ＩＩＩ−ＸＶに示される。当業者は，これらの配列が酵素的核酸の酵素
的部分（結合アーム以外のすべて）が活性を生ずるように変更されている多くの
他のそのような配列の代表例にすぎないことを認識するであろう。表ＩＩＩ−Ｘ
Ｖに挙げられる酵素的核酸およびアンチセンス構築物の配列は，リボヌクレオチ
ドまたは他のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドから構成されてもよい。酵素的
活性を有するそのようなリボザイムは，表に特に記載されるリボザイムの同等物
である。
【０１２４】本発明の核酸分子の活性の最適化 血清リボヌクレアーゼによる分解を防止する修飾（塩基，糖および／またはリ
ン酸）を有する，化学的に合成された核酸分子は，その抗力が高まるであろう（
例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐ
ｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４，５６５；Ｐ
ｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４；Ｕｓ
ｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９
３／１５１８７；Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２；
Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１；およびＢｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ
．，（上掲）を参照；これらはすべて本明細書に記載される核酸分子の塩基，リ
ン酸および／または糖成分になしうる種々の化学修飾を記載し，そのすべてを本
明細書の一部としてここに引用する）。細胞中におけるその抗力を増強する修飾
，およびオリゴヌクレオチドの合成時間を短縮し化学物質の必要性を減少するた
めに核酸分子から塩基を除去することが望ましい。
【０１２５】 当該技術分野には，ヌクレアーゼ安定性および効力を有意に増強することがで
きる，核酸分子中に導入することができる糖，塩基およびリン酸修飾を記述する
いくつかの例がある。例えば，オリゴヌクレオチドは，ヌクレアーゼ耐性基，例
えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２'−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，
２'−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾で修飾することにより，安定性を高め，および
／または生物学的活性を増強するために修飾される（総説については，Ｕｓｍａ
ｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ ＴＩＴＢＳ １７，３４；Ｕｓｍ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅ
ｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｙ ３５，１４０９０を参照）。酵素的核酸分子の糖修飾は，当該技術分野
において広く記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ
９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９０，
３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９
１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒ
ｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７，３３４−３３９；
Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ，米国
特許５，３３４，７１１，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．
，国際公開ＷＯ９７／２６２７０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特
許５，７１６，８２４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６２７，０５
３；Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９８／１３５２６；Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願６０／０８２，４０４（１９９８年４月２０
日出願）；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１；Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ，１
９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ），４８，３９−５５；Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４；およびＢｕｒｌｉ
ｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９
９９−２０１０；を参照，これらの参考文献はすべて，その全体を本明細書の一
部としてここに引用する）。これらの刊行物は，触媒活性を阻害することなく，
糖，塩基および／またはリン酸修飾等をリボザイム中に組み込む位置を決定する
一般的方法および戦略を記載する。これらの教示に基づいて，同様の修飾を本明
細書に記載されるように用いて，本発明の核酸触媒を修飾することができる。
【０１２６】 オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合をホスホロチオエート，ホスホロチ
オエート，および／または５’−メチルホスホネート結合で化学的に修飾すると
安定性が増加するが，これらの修飾が多すぎると毒性を引き起こすかもしれない
。したがって，核酸分子の設計においては，これらのヌクレオチド間結合の量は
最小限にすべきである。これらの結合の濃度の減少は，これらの分子の毒性を低
下させ，したがって効力を増加させ，特異性を高めるはずである。
【０１２７】 活性を維持または増強する化学修飾を有する核酸分子が提供される。そのよう
な核酸分子はまた，一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対して耐性が高い。す
なわち，細胞および／またはインビボにおいて，活性は有意に低下しない。外的
に輸送された治療用核酸分子は，最適には，望ましくない蛋白質のレベルが減少
するのに十分長い間標的ＲＮＡの翻訳が阻害されるまで，細胞中で安定でなけれ
ばならない。この期間は疾病状態により，数時間から数日まで様々である。明ら
かに，有効な細胞内治療剤として機能するためには，これらの核酸分子はヌクレ
アーゼに対して耐性でなければならない。ＲＮＡおよびＤＮＡの化学合成の改良
（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．２３，２６７７；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９（すべて本明細書の
一部としてここに引用する）は，上述したように，ヌクレオチド修飾を導入して
そのヌクレアーゼ安定性を高めることにより核酸分子を修飾する能力を拡大した
。
【０１２８】 本発明の核酸系の分子の使用は，組み合わせ治療（例えば，異なる遺伝子を標
的とする多数のアンチセンスまたは酵素的核酸分子，既知の小分子阻害剤とカッ
プリングさせた核酸分子，または分子（異なるモチーフを含む）および／または
他の化学的または生物学的分子と組み合わせた間欠的治療）の可能性を提供する
ことにより，疾病の進行のよりよい治療につながるであろう。核酸分子を用いる
患者の治療はまた，異なる種類の核酸分子の組み合わせを含んでいてもよい。
【０１２９】 外的に輸送された治療用核酸分子（例えば，酵素的核酸分子およびアンチセン
ス核酸分子）は，最適には，望ましくない蛋白質のレベルが減少するのに十分長
い間標的ＲＮＡの翻訳が阻害されるまで，細胞中で安定でなければならない。こ
の期間は疾病状態により，数時間から数日まで様々である。特に，有効な細胞内
治療剤として機能するためには，これらの核酸分子はヌクレアーゼに対して耐性
でなければならない。本発明におよび当該技術分野において記載される核酸分子
の化学合成の改良は，上述したように，ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレ
アーゼ安定性を高めることにより核酸分子を修飾する能力を拡大した。
【０１３０】 さらに別の好ましい態様においては，化学修飾を有し，酵素的活性が維持また
は増強されている核酸触媒が提供される。そのような核酸はまた，一般に，非修
飾核酸よりもヌクレアーゼに対する耐性が高い。すなわち，細胞中および／また
はインビボにおいて，活性は有意に低下しないであろう。本明細書に例示される
ように，そのような酵素的核酸は，全体の活性が１０倍低下しても細胞および／
またはインビボで有用である（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）。そのようなリボザイムは，本明細書
において，全ＲＮＡ酵素的核酸の酵素的活性"を維持する"と言われる。
【０１３１】 別の観点においては，核酸分子は５’および／または３’−キャップ構造を含
む。
【０１３２】 "キャップ構造"とは，オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれてい
る化学修飾を意味する（例えば，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９７／２
６２７０を参照，本明細書の一部としてここに引用する）。これらの末端修飾は
，核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し，輸送および／または細胞中の
局在化を助けるであろう。キャップは，５’−末端（５’−キャップ）または３
’−末端（３’−キャップ）のいずれに存在していてもよく，両末端に存在して
いてもよい。非限定的例においては，５’−キャップは，反転無塩基残基（成分
）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシ
ル）ヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−
アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオ
チド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ−ペントフラ
ノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；非環状３，４−ジ
ヒドロキシブチルヌクレオチド；非環状３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオ
チド，３’−３’反転ヌクレオチド成分；３’−３’−反転無塩基成分；３’−
２’−反転ヌクレオチド成分；３’−２’−反転無塩基成分；１，４−ブタンジ
オールリン酸；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリ
ン酸；３’−リン酸；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；また
は架橋または非架橋メチルホスホネート成分からなる群より選択される（詳細に
ついては，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，国際公開９７／２６２７０を参照，
本明細書の一部としてここに引用する）。
【０１３３】 さらに別の好ましい態様においては，３’−キャップは，４’，５’−メチレ
ンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’
−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；
１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミ
ノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸
；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ
ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオ−ペント
フラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒ
ドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５
’−５’−反転ヌクレオチド成分；５’−５’−反転無塩基成分；５’−ホスホ
ルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールリン酸；５
’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミデート，ホスホロチ
オエートおよび／またはホスホロジチオエート，架橋または非架橋メチルホスホ
ネートおよび５’−メルカプト成分からなる群より選択される（詳細については
，Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
４９，１９２５を参照；本明細書の一部としてここに引用する）。
【０１３４】 "非ヌクレオチド"との用語は，１またはそれ以上のヌクレオチドユニットの代
わりに核酸鎖中に組み込むことができ，糖および／またはリン酸置換のいずれか
を含み，残りの塩基がその酵素的活性を示すことを可能とする任意の基または化
合物を意味する。基または化合物は，一般的に認識されるヌクレオチド塩基，例
えば，アデニン，グアニン，シトシン，ウラシルまたはチミンを含まない場合，
無塩基である。
【０１３５】 "アルキル"基とは，飽和脂肪族炭化水素を表し，直鎖，分枝鎖，および環状ア
ルキル基が含まれる。好ましくは，アルキル基は１−１２個の炭素を有する。よ
り好ましくは，これは１−７個の炭素，より好ましくは１−４個の炭素を有する
低級アルキルである。アルキルは置換されていてもされていなくてもよい。置換
されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，
＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2，アミノ，またはＳＨである。この用語
は，また，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化水素基である
アルケニル基を含み，直鎖，分枝鎖，および環状基を含む。好ましくは，アルケ
ニル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素原
子，より好ましくは１−４個の炭素原子の低級アルケニルである。アルケニルは
置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ま
しくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ2，ハロゲン，
Ｎ（ＣＨ3）2，アミノ，またはＳＨから選択される。"アルキル"との用語はまた
，少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む不飽和の炭化水素基を有するアル
キニル基を含み，直鎖，分枝鎖，および環状基でありうる。好ましくは，アルキ
ニル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素，
より好ましくは１−４個の炭素を有する低級アルキニルである。アルキニル基は
，置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好
ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ2またはＮ（
ＣＨ3）2，アミノまたはＳＨから選択される。
【０１３６】 そのようなアルキル基はまた，アリール，アルキルアリール，炭素環式アリー
ル，複素環アリール，アミドおよびエステル基を含むことができる。"アリール"
基とは，共役したパイ電子系を有する少なくとも１つの環を有する芳香族基を表
し，炭素環式アリール，複素環アリールおよび二アリール基が含まれる。これら
はすべて任意に置換されていてもよい。アリール基の好ましい置換基は，ハロゲ
ン，トリハロメチル，ヒドロキシル，ＳＨ，ＯＨ，シアノ，アルコキシ，アルキ
ル，アルケニル，アルキニル，およびアミノ基である。"アルキルアリール"基は
，アリール基（上述）に共有結合したアルキル基（上述）を表す。炭素環式アリ
ール基は，芳香族環の環原子がすべて炭素原子である基である。炭素原子は任意
に置換されていてもよい。複素環アリール基は，芳香族環中の環原子として１−
３個の複素原子を有し，環原子の残りが炭素原子である基である。適当な複素原
子には，酸素，イオウ，および窒素が含まれ，例えば，フラニル，チエニル，ピ
リジル，ピロリル，Ｎ−低級アルキルピロロ，ピリミジル，ピラジニル，イミダ
ゾリル等が挙げられる。これらはすべて任意に置換されていてもよい。"アミド"
とは，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ（式中，Ｒはアルキル，アリール，アルキルアリー
ルまたは水素のいずれかである）を表す。"エステル"とは，−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’
（式中，Ｒはアルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素のいずれかであ
る）を表す。
【０１３７】 "ヌクレオチド"とは，リン酸化された糖を有し，Ｎ−グリコシル結合した複素
環窒素塩基を意味する。ヌクレオチドは，天然の塩基（標準的な），および当該
技術分野においてよく知られる修飾塩基を含むことが当該技術分野において認識
されている。そのような塩基は，一般に，ヌクレオチド糖成分の１’位に位置す
る。ヌクレオチドは，一般に，塩基，糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは
，糖，リン酸および／または塩基成分において，修飾されていても修飾されてい
なくてもよい（ヌクレオチド類似体，修飾ヌクレオチド，非天然ヌクレオチド，
非標準的ヌクレオチドおよび他のものとして互換的に称される。例えば，Ｕｓｍ
ａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ
．，国際公開９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開９３／１
５１８７；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲）を参照，すべて本明細書の一
部としてここに引用する）。修飾核酸塩基のいくつかの例が当該技術分野におい
て知られており，Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３にまとめられている。核酸分子中に導入す
ることができる塩基修飾の非限定的例には，イノシン，プリン，ピリジン−４−
オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメ
トキシベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフ
ェニル，５−アルキルシチジン（例えば，５−メチルシチジン），５−アルキル
ウリジン（例えば，リボチミジン），５−ハロウリジン（例えば，５−ブロモウ
リジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば，６
−メチルウリジン），プロピン，ケソシン，２−チオウリジン，４−チオウリジ
ン，ワイブトシン，ワイブトキソシン，４−アセチルシチジン，５−（カルボキ
シヒドロキシメチル）ウリジン，５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チ
オウリジン，５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン，ベータ−Ｄ−ガラク
トシルケオシン，１−メチルアデノシン，１−メチルイノシン，２，２−ジメチ
ルグアノシン，３−メチルシチジン，２−メチルアデノシン，２−メチルグアノ
シン，Ｎ６−メチルアデノシン，７−メチルグアノシン，５−メトキシアミノメ
チル−２−チオウリジン，５−メチルアミノメチルウリジン，５−メチルカルボ
ニルメチルウリジン，５−メチルオキシウリジン，５−メチル−２−チオウリジ
ン，２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン，β−Ｄ−マンノシルケ
オシン，ウリジン−５−オキシ酢酸，２−チオシチジン，トレオニン誘導体およ
び他のものが含まれる（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲））。
この観点において"修飾塩基"とは，１’位またはその同等の位置に存在するアデ
ニン，グアニン，シトシンおよびウラシル以外のヌクレオシド塩基を意味する。
そのような塩基は，任意の位置で，例えば，酵素的核酸分子の触媒コア中でおよ
び／または核酸分子の基質結合領域中で用いることができる。
【０１３８】 "ヌクレオシド"とは，リン酸化された糖を有し，Ｎ−グリコシル結合した複素
環窒素塩基を意味する。ヌクレオシドは，天然の塩基（標準的な），および当該
技術分野においてよく知られる修飾塩基を含むことが当該技術分野において認識
されている。そのような塩基は，一般に，ヌクレオシド糖成分の１’位に位置す
る。ヌクレオシドは，一般に，塩基，糖およびリン酸基を含む。ヌクレオシドは
，糖，リン酸および／または塩基成分において，修飾されていても修飾されてい
なくてもよい（ヌクレオシド類似体，修飾ヌクレオシド，非天然ヌクレオシド，
非標準的ヌクレオシドおよび他のものとして互換的に称される。例えば，Ｕｓｍ
ａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ
．，国際公開９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開９３／１
５１８７；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲）を参照，すべて本明細書の一
部としてここに引用する）。修飾核酸塩基のいくつかの例が当該技術分野におい
て知られており，Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３にまとめられている。核酸分子中に導入す
ることができる塩基修飾の非限定的例には，イノシン，プリン，ピリジン−４−
オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメ
トキシベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフ
ェニル，５−アルキルシチジン（例えば，５−メチルシチジン），５−アルキル
ウリジン（例えば，リボチミジン），５−ハロウリジン（例えば，５−ブロモウ
リジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば，６
−メチルウリジン），プロピン，ケソシン，２−チオウリジン，４−チオウリジ
ン，ワイブトシン，ワイブトキソシン，４−アセチルシチジン，５−（カルボキ
シヒドロキシメチル）ウリジン，５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チ
オウリジン，５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン，ベータ−Ｄ−ガラク
トシルケオシン，１−メチルアデノシン，１−メチルイノシン，２，２−ジメチ
ルグアノシン，３−メチルシチジン，２−メチルアデノシン，２−メチルグアノ
シン，Ｎ６−メチルアデノシン，７−メチルグアノシン，５−メトキシアミノメ
チル−２−チオウリジン，５−メチルアミノメチルウリジン，５−メチルカルボ
ニルメチルウリジン，５−メチルオキシウリジン，５−メチル−２−チオウリジ
ン，２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン，β−Ｄ−マンノシルケ
オシン，ウリジン−５−オキシ酢酸，２−チオシチジン，トレオニン誘導体およ
び他のものが含まれる（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲））。
この観点において"修飾塩基"とは，１’位またはその同等の位置に存在するアデ
ニン，グアニン，シトシンおよびウラシル以外のヌクレオシド塩基を意味する。
そのような塩基は，任意の位置で，例えば，酵素的核酸分子の触媒コア中でおよ
び／または核酸分子の基質結合領域中で用いることができる。
【０１３９】 好ましい態様においては，本発明はリン酸骨格修飾を有する修飾酵素的核酸を
特徴とし，これは１またはそれ以上のホスホロチオエート，ホスホロジチオエー
ト，メチルホスホネート，モルホリノ，アミデート，カルバメート，カルボキシ
メチル，アセトアミデート，ポリアミド，スルホネート，スルホンアミド，スル
ファメート，ホルムアセタール，チオホルムアセタール，および／またはアルキ
ルシリル置換を含む。オリゴヌクレオチド骨格修飾の概説については，Ｈｕｎｚ
ｉｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｍａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａ
ｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｍｏ
ｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７，お
よびＭｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏ
ｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照。これらの参考文献は
本明細書の一部としてここに引用する。
【０１４０】 "無塩基"とは，１’位において塩基を欠失しているか，または塩基の代わりに
他の化学基を有する糖成分を意味する（詳細については，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ
ａｌ．，国際公開９７／２６２７０を参照）。
【０１４１】 "非修飾ヌクレオシド"とは，ベータ−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合
した塩基，アデニン，シトシン，グアニン，チミン，ウラシルの１つを意味する
。
【０１４２】 "修飾ヌクレオシド"とは，非修飾ヌクレオチドの塩基，糖および／またはリン
酸の化学構造中に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を意味する。
【０１４３】 本発明において記載される２’−修飾ヌクレオチドに関して，"アミノ"とは，
２’−ＮＨ2または２’−Ｏ−ＮＨ2を意味し，これは修飾されていてもされてい
なくてもよい。そのような修飾基は，例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．
，米国特許５，６７２，６９５およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａ
ｌ．，ＷＯ９８／２８３１７（いずれもその全体を本明細書の一部としてここに
引用する）に記載されている。
【０１４４】 核酸（例えば，アンチセンスおよび酵素的核酸）構造に対する種々の修飾を作
成して，これらの分子の有用性を高めることができる。このような修飾は，製品
寿命，インビトロの半減期，安定性，およびそのようなオリゴヌクレオチドを標
的部位に導入する容易さを高め，例えば，細胞膜の透過性を高め，標的とする細
胞を認識し結合する能力を付与するであろう。
【０１４５】 これらの分子の使用は，組み合わせ療法の可能性を提供することにより，疾病
の進行のよりよい治療につながるであろう（例えば，異なる遺伝子を標的とする
多重酵素的核酸，既知の小分子阻害剤とカップリングさせた酵素的核酸，または
酵素的核酸（異なる酵素的核酸モチーフを含む）および／または他の化学的また
は生物学的分子の組み合わせによる間欠的治療）。核酸分子を用いる患者の治療
にはまた，異なる種類の核酸分子の組み合わせが含まれる。１またはそれ以上の
標的に対する酵素的核酸（異なる酵素的核酸モチーフを含む），アンチセンスお
よび／または２−５Ａキメラ分子の混合物を含む療法を案出して，疾病の症状を
軽減することができる。
【０１４６】核酸分子の投与 核酸分子の輸送の方法は，Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２，Ｔｒｅ
ｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２，１３９）およびＤｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａ
ｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５（いずれも本明細
書の一部としてここに引用する）に記載されている。Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ
ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５は，さらに，酵素的ＲＮＡ分子を輸送す
るための一般的な方法を記載する。これらのプロトコルを用いて，事実上いかな
る核酸分子も輸送することができる。核酸分子は当業者に知られる種々の方法に
よって細胞に投与することができ，これにはリポソームへの封入，イオントホレ
シス，または他のベヒクル，例えば，ヒドロゲル，シクロデキストリン，生分解
性ナノカプセル，および生体接着性小球体への組み込みが含まれるが，これらに
限定されない。あるいは，核酸／ベヒクルの組み合わせを，直接注入により，ま
たは注入ポンプを用いることにより局所的に輸送する。他の輸送経路には，経口
（錠剤またはピル形態）および／またはくも膜下腔内輸送が含まれるが，これら
に限定されない（Ｇｏｌｄ，１９９７，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７６，１１
５３−１１５８）。核酸の輸送および投与のより詳細な説明はＳｕｌｌｉｖａｎ
ｅｔ ａｌ．，（上掲）；Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／
２３５６９；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９９／０５０９
４，およびＫｌｉｍｕｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９９／０４８１９に提供
されており，これらはすべて本明細書の一部としてここに引用する。
【０１４７】 本発明の分子は医薬品として用いることができる。医薬品は患者の疾患状態を
予防し，発症を阻害し，またはそれを治療する（症状をある程度，好ましくは全
ての症状を緩和する）。
【０１４８】 本発明の負に荷電したポリヌクレオチド（例えば，ＲＮＡ，ＤＮＡまたは蛋白
質）は，医薬組成物を形成するために安定化剤，緩衝剤等を用いて，または用い
ることなく，任意の標準的手段により患者に投与および導入することができる。
リポソーム輸送メカニズムを用いることが望ましい場合，リポソームの処方のた
めの標準的プロトコルに従うことができる。本発明の組成物はまた，経口投与用
の錠剤，カプセルまたはエリキシル；直腸投与用の座剤；無菌溶液；注射投与用
の懸濁液および当該技術分野において知られる組成物等として，処方して用いる
こともできる。
【０１４９】 本発明はまた，記載される化合物の薬学的に許容しうる処方を含む。これらの
処方には，上述の化合物の塩，例えば，酸付加塩（例えば，塩酸，シュウ酸，酢
酸およびベンゼンスルホン酸の塩）が含まれる。
【０１５０】 医薬組成物または処方は，細胞または患者への投与（例えば全身投与），好ま
しくはヒトへの投与に適当な形態の組成物または処方を表す。適当な形態は，部
分的には，使用する投与経路（例えば経口，経皮，または注射）に依存する。そ
のような形態は，組成物または処方が標的細胞（すなわち，負に荷電したポリマ
ーが輸送されることが望まれる細胞）に到達することを妨害してはならない。例
えば，血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子は
当該技術分野において知られており，例えば，毒性，および組成物または処方が
その効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。
【０１５１】 "全身投与"とは，インビボでの全身吸収，または血流中における薬剤の蓄積の
後に全身に分配されることを意味する。全身的吸収をもたらす投与経路には，静
脈内，皮下，腹腔内，吸入，経口，肺内および筋肉内が含まれるが，これらに限
定されない。これらの投与経路のそれぞれは，所望の負に荷電したポリマー（例
えば核酸）をアクセス可能な疾患組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は，
分子量またはサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリ
ポソームまたは他の薬剤担体を使用することにより，薬剤を，例えば，あるタイ
プの組織（例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織）に局在化させることが可能であ
る。薬剤と細胞（例えば白血球およびマクロファージ）の表面との会合を容易に
することができるリポソーム処方もまた有用である。この方法は，マクロファー
ジおよび白血球による異常な細胞（例えば癌細胞）の免疫認識の特異性を利用す
ることにより，薬剤の標的細胞への輸送を増強するであろう。
【０１５２】 薬学的に許容しうる処方とは，本発明の核酸分子をその所望の活性に最も適し
た物理学的位置に有効に分布させることができる組成物または処方を意味する。
【０１５３】 本発明はまた，ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ−修飾，または長期
間循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む，表面修飾リポソームを含
む組成物の使用を特徴とする。これらの処方は，標的組織における薬剤の蓄積を
増加させる方法を提供する。この種類の薬剤担体は，単核食細胞システム（ＭＰ
ＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および排除に抵抗性であり，したがって
，封入された薬剤の血流循環時間を長くし，組織への暴露を増強する（Ｌａｓｉ
ｃ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉ
ｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，
４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームは，おそらくは脈管新生標
的組織における溢出および捕獲のため，腫瘍中に選択的に蓄積することが示され
ている（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６７，１２
７５−１２７６；Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期間循環リポソームは，特に，
ＭＰＳの組織で蓄積することが知られている慣用のカチオン性リポソームと比べ
て，ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態学および薬力学を増強する（Ｌｉｕ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；
Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ
ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，国
際公開ＷＯ９６／１０３９２；これらをすべて本明細書の一部としてここに引用
する）。長期間循環リポソームはまた，代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織，例えば肝
臓および脾臓における蓄積を回避するその能力に基づいて，カチオン性リポソー
ムと比較して薬剤をヌクレアーゼ分解からより強く保護するようである。
【０１５４】 ＮＯＧＯに対して向けられる本発明の核酸分子に関しては，当該技術分野にお
ける多くの例がオリゴヌクレオチドのＣＮＳ輸送方法を記載する。ＣＮＳへの直
接投与は，浸透圧ポンプ（Ｃｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２５７，１３５−１３８，Ｄ’Ａｌｄｉｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５，１５１−
１６４，Ｄｒｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．
，１５７，１６９−１７５，Ｇｈｉｒｎｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２４７，２１−２４）または直接注
入（Ｂｒｏａｄｄｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｆｏｃ
ｕｓ，３，ａｒｔｉｃｌｅ４）によるものが記載されている。ＣＮＳ輸送を広く
カバーする薬剤輸送戦略の包括的概説については，Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９
９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１，３３６−３４３およびＪａ
ｉｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
ａｎｄ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ，Ｄｅｃｉｓｉ
ｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，１９９８およびＧｒｏｏｔｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．
，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ Ｖｉｒｏｌ．，３，３８７−４００を参照された
い。本発明の核酸分子とともに処方するのに適当な薬剤の非限定的例には，以下
のものが含まれる：Ｐ−糖蛋白質阻害剤（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５），
これは薬剤がＣＮＳ中に入ることを促進することができる（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒ
ｉａｎｔ ａｎｄ Ｔｉｌｌｅｍｅｎｔ，１９９９，Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ．
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３，１６−２６）；生物分解性ポリマー，例えば大脳
内移植後の持続放出輸送のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）微
小球（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐ
ｌａｎｔ，８，４７−５８）Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，
ＭＡ；および薬剤を血液脳関門を越えて輸送し，神経の取り込みメカニズムを変
更しうる，ポリブチルシアノアクリレートから作成されるもの等の充填ナノ粒子
（Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃ
ｈｉａｔｒｙ，２３，９４１−９４９，１９９９）。本発明の核酸分子のＣＮＳ
輸送を含む輸送戦略の他の非限定的例には，Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９
８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，１３０８−１３１５；Ｔｙｌｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２１，２８０−２８４；Ｐａｒ
ｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９２，５５９２
−５５９６；Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒ
ｅｖ．，１５，７３−１０７；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ ｅｔ ａｌ．
，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６，４９１０−４９１
６；およびＴｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９６，
７０５３−７０５８（すべての参考文献は本明細書の一部としてここに引用する
）に記載される材料が含まれる。
【０１５５】 本発明はまた，薬学的に有効量の所望の化合物を薬学的に許容しうる担体また
は希釈剤中に含む，保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用
いるための許容しうる担体または希釈剤は，医薬の技術分野においてよく知られ
ており，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａ
ｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載さ
れている。例えば，保存剤，安定剤，染料，および風味剤を用いることができる
。これらには，安息香酸ナトリウム，ソルビン酸，およびｐ−ヒドロキシ安息香
酸のエステルが含まれる。さらに，抗酸化剤および懸濁剤を用いてもよい。
【０１５６】 薬学的に有効な用量とは，疾患状態の予防，発症の阻害または治療（症状をあ
る程度緩和し，好ましくはすべての症状を緩和する）に必要な用量である。薬学
的に有効な用量は，疾患の種類，用いる組成物，投与の経路，治療する哺乳動物
の種類，考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性，同時投与される薬剤，および
医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に，負に
荷電したポリマーの効力に依存して，０．１ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ体重
／日の活性成分を投与する。
【０１５７】 本発明の核酸分子はまた，全体の治療効果を増加させるため，他の治療化合物
と組み合わせて患者に投与してもよい。適応症を処置するための多数の化合物の
使用は有益な効果を増加させ，一方副作用を減少させるであろう。
【０１５８】 あるいは，本発明のある種の核酸分子は，細胞中で真核生物プロモーターから
発現させることもできる（例えば，Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，
１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ ａｎｄ Ｌｉｎ
ｄｑｕｉｓｔ，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ
８３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓ
ａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，
２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，
６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｊ
．Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９，１０８０２−６；Ｃ
ｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２
０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ
１９９７ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５（これらの文献はその内容の全
てを本明細書の一部としてここに引用する））。当業者は，真核生物細胞中で適
当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから任意の核酸を発現させることができることを理
解するであろう。そのような核酸の活性は，リボザイムによってそれらを一次転
写産物から放出させることにより増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ
ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，
ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ
ｅｔ ａｌ．，１９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５
１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．
，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５８５６（いずれもその全体
を本明細書の一部としてここに引用する））。
【０１５９】 特に，ＮＯＧＯに対して向けられる本発明の核酸分子に関して，ＣＮＳに特異
的な遺伝子治療方法は，Ｂｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｒｕｇ Ｎ
ｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，１３，２６９−２８０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，２０００，Ｃｅｎｔ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．Ｄｉｓ．，４８５−５０
８；Ｐｅｅｌ ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ，２０００，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ，９８，９５−１０４；Ｈａｇｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００，
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７，７５９−７６３；およびＨｅｒｒｌｉｎｇｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，３５，２８７−３
１２に記載されている。さらに，神経系の細胞への核酸のＡＡＶ媒介性輸送がＫ
ａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ６，１８０，６１３に記載されている。
【０１６０】 本発明の別の観点においては，本発明のＲＮＡ分子は，好ましくは，ＤＮＡま
たはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される（例えばＣｏｕ
ｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。組換え
ベクターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。リボ
ザイムを発現するウイルスベクターは，限定されないが，アデノ随伴ウイルス，
レトロウイルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築する
ことができる。好ましくは，核酸分子を発現しうる組換えベクターは，上述のよ
うに輸送され，標的細胞中に残留する。あるいは，核酸分子の過渡的発現を与え
るウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは，必要に応じ
て繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，核酸分子は標的ｍＲ
ＮＡに結合する。核酸分子を発現するベクターの輸送は，全身的（例えば，静脈
内または筋肉内投与により），患者から外植された標的細胞に投与した後，患者
に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能とする他のい
ずれかの手段により行うことができる（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ ｅｔ
ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。
【０１６１】 本発明の１つの観点においては，少なくとも１つの本発明の核酸分子をコード
する核酸配列を含む発現ベクターが開示される。本発明の核酸分子をコードする
核酸配列は，その核酸分子の発現を可能とする様式で，動作可能なように連結さ
れている。
【０１６２】 本発明の別の観点においては，発現ベクターは，転写開始領域（例えば真核生
物ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核
生物ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの終止領域）；ｃ）本発明の核酸触媒の少な
くとも１つをコードする核酸配列を含む。ここで，前記配列は，前記核酸分子の
発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域および前記終止領域
に動作可能なように連結されている。ベクターは，任意に，本発明の核酸触媒を
コードする遺伝子の５'側または３’側に動作可能なように連結された蛋白質の
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；および／またはイントロン（介在配
列）を含んでいてもよい。
【０１６３】 核酸分子配列の転写は，真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ），ＲＮ
ＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ），またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏ
ｌ ＩＩＩ）のプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ Ｉ
ＩＩプロモーターからの転写産物は，すべての細胞において高いレベルで発現さ
れるであろう。所定の細胞タイプ中における所定のｐｏｌ ＩＩプロモーターの
レベルは，近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー，サイレンサー等）の
性質に依存するであろう。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞中で発
現される限り，原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた用いられる（Ｅ
ｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａｎ
ｇ １９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２
；Ｌｉｅｂｅｒｅｔ．ａｌ．，１９９３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，
２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７；これらの参考文献はすべて本明細書の一部
としてここに引用する）。
【０１６４】 何人かの研究者が，そのようなプロモーターから発現した核酸分子，例えばリ
ボザイムが哺乳動物細胞中で機能しうることを示している（例えば，Ｋａｓｈａ
ｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄ
ｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８
１−９；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ，９０，６３４０−４；Ｌ'Ｈｕｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，
１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ ｅｔ
ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９
０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ＆Ｃｅｃｈ，１
９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より詳細には，転写ユニット，
例えばＵ６小核（ｓｎＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノウイルス
ＶＡ ＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものは，細胞中において高濃度の所
望のＲＮＡ分子（例えばリボザイム）を生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）；Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍ
ｂ，１９９６，（上掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａ
ｌ．，米国特許５，１６２４，８０３；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４，４５；Ｂｅｉｃｒｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開
ＷＯ９６／１８７３６；（これらのすべての刊行物を本明細書の一部としてここ
に引用する）。上述のリボザイム転写ユニットは，哺乳動物細胞中に導入するた
めに種々のベクター中に組み込むことができる。ベクターとしては，限定されな
いが，プラスミドＤＮＡベクター，ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイ
ルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター），またはウイルスＲＮＡベクター（例
えばレトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）が挙げられる（総説につ
いては，Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）
を参照）。
【０１６５】 さらに別の観点においては，本発明は，本発明の核酸分子の少なくとも１つを
コードする核酸配列を，その核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクタ
ーを特徴とする。１つの態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；
ｂ）転写終止領域；ｃ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含
み；前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で
，前記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。
【０１６６】 別の好ましい態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写
終止領域；ｃ）オープンリーディングフレーム；ｄ）前記核酸分子の少なくとも
１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレ
ームの３'末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は，前記核酸分
子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記オープン
リーディングフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。
【０１６７】 さらに別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終
止領域；ｃ）イントロン；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝
子を含み；前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする
様式で，前記開始領域，前記イントロンおよび前記終止領域に動作可能なように
連結されている。
【０１６８】 別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域
；ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；ｅ）前記核酸分子の少
なくとも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーディ
ングフレームの３'末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は，前
記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記
イントロン，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作可能
なように連結されている。
【０１６９】実施例 以下は，本発明の核酸の選択，単離，合成および活性を示す非限定的例である
。
【０１７０】 以下の実施例は，アンチセンス，ハンマーヘッド，ＤＮＡｚｙｍｅ，イノザイ
ム，アンバーザイム，チンザイム，またはＧ−切断剤酵素的核酸分子の選択およ
び設計，およびＣＤ２０およびＮＯＧＯ ＲＮＡ中の結合／切断部位を示す。
【０１７１】ＮＯＧＯ標的ＲＮＡの核酸阻害 成人ＣＮＳにおける軸索再生能力の欠如は，ＣＮＳ損傷および脳血管偶発症候
（ＣＶＡ，発作），化学療法誘導性ニューロパシー，およびおそらくは神経変性
性疾病，例えばアルツハイマー病，痴呆，多発性硬化症（ＭＳ），化学療法誘導
性ニューロパシー，筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ），パーキンソン病，運動失調
，ハンチントン病，クロイツフェルト−ヤーコプ病，および／または筋ジストロ
フィーの治療における制限因子として現れる。ニューロン成長阻害は，グリア瘢
痕により付与される物理学的障壁，神経栄養性因子の欠如，およびミエリンに付
随する成長阻害的分子に起因する。神経突起成長阻害の排除は，現在，決定的な
医学的介在が存在しない状態を治療する可能性をもたらす。これらの研究におい
ては，ＮＯＧＯ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２０６９３）の阻害を調べる
。
【０１７２】実施例１：ヒトＣＤ２０およびＮＯＧＯ ＲＮＡにおける潜在的標的部位の同定 ヒトＣＤ２０およびＮＯＧＯの配列を，コンピュータ折り畳みアルゴリズムを
用いてアクセス可能な部位についてスクリーニングする。二次折り畳み構造を形
成しないＲＮＡの領域を同定する。これらの領域は，潜在的酵素的核酸および／
またはアンチセンス結合／切断部位を含む。これらの結合／切断部位の配列は表
ＩＩＩ−ＸＩＶに示される。
【０１７３】実施例２：ヒトＣＤ２０およびＮＯＧＯ ＲＮＡにおける酵素的核酸の切断部位 の選択 酵素的核酸の標的部位は，ヒトＣＤ２０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ０７２
０３）およびヒトＮＯＧＯ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＢ０２０６９３）の配
列を分析し，折り畳みに基づいて部位に優先順位をつけることにより選択する。
各標的に結合することができるリボザイムを設計し，コンピュータ折り畳みによ
り個々に分析して（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｔｈｅｏｃｈｅｍ，３１１，２７３；Ｊａｅｇｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６
，７７０６），酵素的核酸配列が適切な二次構造に折り畳まれるか否かを評価す
る。結合アームと触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有するリボザ
イムは考慮から除外する。以下に示されるように，種々の結合アームの長さを選
択して，活性を最適化することができる。一般に，各アームに少なくとも５塩基
あれば，標的ＲＮＡに結合するか，さもなくば相互作用することができる。
【０１７４】実施例３：ＣＤ２０およびＮＯＧＯ ＲＮＡの有効な切断および／またはブロッ クのための酵素的核酸およびアンチセンスの化学合成および精製 酵素的核酸およびアンチセンス構築物は，ＲＮＡメッセンジャーの種々の領域
にアニーリングするよう設計した。酵素的核酸の結合アームは，上述の標的部位
配列に相補的であるが，アンチセンス構築物は上述の標的部位配列に完全に相補
的である。酵素的核酸およびアンチセンス構築物は化学的に合成した。用いた合
成の方法は，上述し，Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５），Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９
９０Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３）およびＷｉｎｃ
ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（上掲）に記載される，通常のＲＮＡ合成の方法にした
がい，一般的な核酸保護基およびカップリング基，例えば５’−末端にジメトキ
シトリチル，および３’−末端にホスホルアミダイトを用いた。平均段階カップ
リング収率は，＞９８％であった。
【０１７５】 酵素的核酸およびアンチセンス構築物はまた，バクテリオファージＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートから合成する（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ａ
ｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８
０，５１）。酵素的核酸およびアンチセンス構築物は，一般的な方法を用いてゲ
ル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィーにより精製し
（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照；その全体を本明
細書の一部としてここに引用する），水に再懸濁する。
【０１７６】実施例４：酵素的核酸によるＣＤ２０およびＮＯＧＯ ＲＮＡ標的のインビトロ での切断 ヒトＣＤ２０およびＮＯＧＯ ＲＮＡを標的とする酵素的核酸を上述のように
設計し合成する。これらの酵素的核酸は，インビトロで，例えば以下の方法を用
いて切断活性を試験することができる。ＣＤ２０ＲＮＡ中の標的配列およびヌク
レオチド位置は表ＩＸ−ＸＩＶに示される。ＮＯＧＯ ＲＮＡ中の標的配列およ
びヌクレオチド位置は表ＩＩＩ−ＶＩＩＩに示される。
【０１７７】 切断反応：リボザイム切断アッセイ用の全長または部分全長の，内部標識した
標的ＲＮＡは，［α−32Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し，ス
ピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックス（登録商標）カラムを通し
，さらに精製することなく，基質ＲＮＡとして用いた。あるいは，Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼ酵素を用いて基質を５’−32Ｐ−末端標識した。アッセイは，
以下のように行った。１５μｌの２Ｘ濃度の精製リボザイムをリボザイム切断緩
衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，３７℃，１０ｍＭＭｇＣｌ2）
中であらかじめ暖め，２Ｘリボザイム混合物を，これもあらかじめ暖めた緩衝液
中の等量（１５μｌ）の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ）に加えることにより切断
反応を開始した。最初のスクリーニングとして，アッセイは，４０ｎＭまたは１
ｍＭ酵素的核酸の最終濃度を用いて，すなわち酵素的核酸過剰で，３７℃で１時
間行った。等量（３０μｌ）の９５％ホルムアミド，２０ｍＭＥＤＴＡ，０．０
５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンシアノールを加えること
により反応を急冷し，その後，試料を９５℃で２分間加熱し，急冷し，変性ポリ
アクリルアミドゲルに負荷した。基質ＲＮＡおよびリボザイム切断により生成し
た特異的ＲＮＡ切断生成物は，ゲルのオートラジオグラフィーにより可視化した
。切断のパーセントは，無傷の基質および切断産物を示すバンドをホスファーイ
メージャー（登録商標）で定量することにより決定した。
【０１７８】実施例５：インビボでのＣＤ２０標的ＲＮＡの核酸阻害 ヒトＣＤ２０ＲＮＡを標的とする核酸分子を設計し上述のように合成する。こ
れらの核酸分子は，例えば，以下に記載される方法を用いて，切断活性について
インビボで試験することができる。ＣＤ２０ＲＮＡ中の標的配列およびヌクレオ
チドの位置は表ＩＸ−ＸＩＶに示される。
【０１７９】培養細胞 Ｓｔａｃｃｈｉｎｉら（１９９９，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２３（２），１２７
−１２６）は，プロリンパ球様トランスフォーメーションにおけるＢ−慢性リン
パ性白血病に由来するＭＥＣ１およびＭＥＣ２細胞株の樹立を記載する。Ｍａｔ
ｓｕｏら（１９９９，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２３（６），５５９−５６８）は，
抗ＩｇＭによるアポトーシス誘導および骨髄間質細胞によるアポトーシスの阻害
の研究において，新規ＡＬＬ−Ｌ３細胞株（ＢＡＬＭ−１８）を樹立し特性決定
したことを記載する。Ｓｃｈｍｅｔｚｅｒら（１９９８，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇ
ｉａ，２９（３），１９５−２０５）は，急性リンパ系白血病（ＡＬＬ）を有す
る患者からの骨髄細胞の寒天培養物におけるクローニングおよび特性決定を記載
する。これらの細胞株は，成熟Ｂ細胞マーカー，例えばＣＤ２０を発現しており
，本発明の核酸分子を用いるＣＤ２０発現の調節を研究するために用いることが
できる。
【０１８０】 Ｂｒａｎｄｌら（１９９９，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（Ｎ．Ｙ．），２７（
８），１２６４−１２７０）は，ＣＤ２０ｘＣＤ２８特異性を有する二重特異性
抗体フラグメントを用いて，Ｂ−細胞系統白血病およびリンパ腫を有する患者か
らの末梢血および骨髄培養物において悪性細胞に対する有効な自己由来および同
種異系Ｔ−細胞活性化が得られることを記載する。抗体フラグメントの代わりに
本発明の核酸分子を用いる類似の研究を用いて，ＣＤ２０を標的とする核酸分子
の効力を評価することができる。
【０１８１】動物モデル 抗ＣＤ２０酵素的核酸の治療上の効力を評価するために，齧歯類，ウサギおよ
び非ヒト霊長動物のいくつかの発癌モデルを用いることができる。
【０１８２】免疫無防備マウスおよび／またはラットにおけるヒト異種移植片モデル ： これらの研究の主たる目的は，Ｂ−細胞由来リンパ腫を有する動物において，
腫瘍荷重の減少および／または生存の改良に及ぼす抗ＣＤ２０酵素的核酸療法の
有効性を評価することである。種々のヒトリンパ腫細胞株は，操作していない免
疫無防備マウスまたは致死量以下の放射性照射を受けたヌードマウス中で皮下固
形腫瘍としてよく成長する。このことにより，腫瘍体積を容易に測定することが
できる。用いることができる細胞株の例には，限定されないが，ＪｅＫｏ−１（
外套細胞リンパ腫），Ｈｓ４５５（ホジキンリンパ腫），Ｈｓ６０２（子宮頚部
リンパ腫）またはヒト患者から得たＣＤ２０＋細胞が含まれる。ヒトＢリンパ系
細胞（ＢＬ２）もまた，ヌードラットに原発性中枢神経系リンパ腫を誘導するた
めに用いることができる（Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａ
ｅｍａｔｏｌ．，１０２（５），１３２３−１３２６；Ｓａｉｎｉ ｅｔ ａｌ
．，１９９９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．，４３（２），１４３−１６０）。
【０１８３】リンパ腫のウイルス誘導 ： これらの研究は，動物の悪性リンパ腫における腫瘍荷重の減少および／または
生存の改良に及ぼす抗ＣＤ２０酵素的核酸療法の有効性を評価する。エプスタイ
ンバーウイルス（ＥＢＶ）関連リンパ腫の誘導には２つの動物モデルが利用可能
である。ウサギに培養Ｓｉ−ＩＩＡ細胞からの無細胞ペレットを経口的に摂取さ
せることができる。これらの細胞は，ＥＢＶを産生するＨＴＬＶ−ＩＩ−トラン
スフォーム白血球細胞株である。長期間後に悪性リンパ腫が発生する。ＥＢＶに
感染したヒト胎児鼻咽頭粘膜を皮下移植したＢａｌｂ／ｃマウスは，固形腫瘍を
発生させることができる。ただし，腫瘍プロモーターを同時に投与する。そのよ
うな動物に由来する腫瘍細胞の部分集団はＣＤ２０＋である。腫瘍成長は，摂取
後１５週間まで追跡することができる（Ｋｏｉｒａｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９
７，Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．，４７（７），４４２−４４８；Ｌｉｕ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２４
（１０），５４１−５４８）。
【０１８４】マウスにおける同系リンパ腫モデル ： 種々の同系マウスリンパ腫細胞株が利用可能であり，免疫応答性マウスにおい
て成長することができる。用いることができる細胞株には，限定されないが，Ｖ
３８Ｃ１３（Ｂ細胞リンパ腫），ＷＥＨＩ−２７９または２３１（非分泌性Ｂ−
細胞リンパ腫）またはＰ３８８Ｄ１（リンパ腫）が含まれる。エンドポイントは
，腫瘍荷重および生存率であろう。
【０１８５】 リンパ芽球性リンパ腫を自発的に発生させる遺伝子工学的に改変されたマウス
を用いて，抗ＣＤ２０酵素的核酸の活性を確認することもできる。Ｎ：ＮＩＨ（
Ｓ）−ｂｇ−ｎｕ−ｘｉｄマウスは，８月齢までに広汎性リンパ増殖性疾患を発
生する。リンパ節がＢ−細胞起源の新生物リンパ芽球で充溢する（Ｗｅｉｎｅｒ
，１９９２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．，７，６３−６６；Ｗａ
ｇｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｌａｂ Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，４２（２）
，３７５−３７７）。
【０１８６】適応症 ＣＤ２０発現調節に関連しうる特定の病気および疾病状態には，限定されない
が，リンパ腫，白血病，および関節症が含まれる。特に，本発明の核酸分子を用
いて，リンパ腫，白血病，および関節症，例えば，限定されないが，Ｂ−細胞リ
ンパ腫，低悪性度または濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ），巨大低悪性度ま
たは濾胞性ＮＨＬ，リンパ球性白血病，ＨＩＶ関連性ＮＨＬ，外套−細胞リンパ
腫（ＭＣＬ），免疫細胞腫（ＩＭＣ），小Ｂ−細胞リンパ性リンパ腫，免疫性血
小板減少症，および炎症性関節症を治療することができる。
【０１８７】 ＣＤ２０研究における現在の知識は，ＣＤ２０活性をアッセイする方法，およ
び研究，診断，および治療用途のために，ＣＤ２０発現を制御しうる化合物が必
要であることを示す。
【０１８８】 モノクローナル抗体およびコンジュゲート，例えばＢｅｘｘａｒ，Ｒｉｔｕｘ
ａｎ，およびＺｅｖａｌｉｎ，化学療法剤，例えばＣＨＯＰ（シクロホスファミ
ド，ドキソルビシン，ビンクリスチン，およびプレドニゾン），免疫調節剤，お
よび放射線照射治療は，本発明の核酸分子（例えば，酵素的核酸およびアンチセ
ンス分子）と組み合わせるかまたは一緒に用いることができる化合物および／ま
たは方法の非限定的例である。当業者は，同様にかつ容易に他の薬剤化合物およ
び療法を本発明の核酸分子（例えば，酵素的核酸およびアンチセンス分子）と組
み合わせることができることを理解するであろう。したがってこれらも本発明の
範囲内である。
【０１８９】実施例６：ＮＯＧＯ標的ＲＮＡを用いるインビボでの核酸阻害 ヒトＮＯＧＯ ＲＮＡを標的とする核酸分子を上述のように設計し合成する。
これらの核酸分子は，例えば以下に記載する方法を用いて，インビボで切断活性
について試験することができる。ＮＯＧＯ ＲＮＡ中の標的配列およびヌクレオ
チドの位置は表ＩＩＩ−ＶＩＩＩに示される。
【０１９０】培養細胞 Ｓｐｉｌｌｍａｎｎら（１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１９
２８３−１９２９３）は，ＮＧＦプライミングＰＣ１２細胞および雛ＤＲＧ細胞
の神経突起生長の強力な阻害を示す，ウシ脊髄ミエリン（ｂＮＩ−２２０）の高
分子量蛋白質の精製および生化学的特性決定を記載する。この蛋白質を用いて，
３Ｔ３繊維芽細胞の広がりを阻害し，雛ＤＲＧ成長円錐の虚脱を誘導することが
できる。モノクローナル抗体，ｍＡｂＩＮ−１を用いて，予測されるＮＯＧＯ遺
伝子産物であるｂＮＩ−２２０の阻害的活性を完全に中和することができる。こ
のように，ＮＯＧＯ発現の阻害に向けられる本発明の核酸分子を，Ｓｐｉｌｌｍ
ａｎｎら（前掲）により詳述される細胞培養実験におけるｂＮＩ−２２０の阻害
の研究において，ｍＡｂＩＮ−１の代わりに用いることができる。これらの実験
に用いる基準には，３Ｔ３繊維芽細胞の広がり挙動，ＰＣ１２細胞のニューライ
ト生長応答，および雛ＤＲＧ成長円錐の成長円錐運動性の評価が含まれる。
【０１９１】動物モデル Ｂｒｅｇｍａｎら（１９９５，Ｎａｔｕｒｅ，３７８，４９８−５０１）は，
ミエリン付随神経突起成長阻害的蛋白質のインビボでの役割を評価するための，
ラットに基づくシステムを記載する。若年成年ルイスラットに中部胸郭の顕微外
科脊髄病巣を形成した。次に，これらの動物をｍＡｂＩＮ−１を分泌するハイブ
リドーマ細胞の外植で処置した。対照集団には，西洋ワサビペルオキシダーゼ（
ＨＲＰ）抗体を分泌するハイブリドーマを外植した。治療期間の間にシクロスポ
リンを用いることによりハイブリドーマを生存させた。別の対照ラットには，脊
髄病巣を形成してさらなる処置を行わないか，または病巣を形成しなかった。４
−６週間の回復期間の後，反射性および運動性機能の定量的分析により行動訓練
を追跡した。ＩＮ−１処置動物は，病巣部位の周囲および脊髄内における皮質脊
髄軸索の成長を示し，これは分析の最長の時点（１２週）を越えて持続した。さ
らに，ＩＮ−１処置動物では，反射性および運動性機能の両方が回復した。この
ように，Ｂｒｅｇｍａｎら（前掲）により記載される頑健動物モデルを用いて，
本発明の核酸分子をｍＡｂＩＮ−１の代わりに，またはこれとともに用いた場合
の，神経突起成長阻害剤機能（例えばＮＯＧＯ）のインビボでの調節剤としての
使用について評価することができる。
【０１９２】適応症 ＮＯＧＯ発現調節に関連しうる特定の変性性および疾病状態には，限定されな
いが，ＣＮＳ損傷および脳血管偶発症候（ＣＶＡ，発作），アルツハイマー病，
痴呆，多発性硬化症（ＭＳ），化学療法誘導性ニューロパシー，筋萎縮性側索硬
化症（ＡＬＳ），パーキンソン病，運動失調，ハンチントン病，クロイツフェル
ト−ヤーコプ病，筋ジストロフィー，および／またはＮＯＧＯ発現の調節に応答
した他の神経変性性疾病状態が含まれる。
【０１９３】 ＮＯＧＯ研究における現在の知識は，ＮＯＧＯ活性をアッセイする方法，およ
び研究，診断，および治療用途のための，ＮＯＧＯ発現を制御しうる化合物が必
要であることを示す。
【０１９４】 モノクローナル抗体（例えばｍＡｂＩＮ−１）治療の使用は，本発明の核酸分
子（例えば，酵素的核酸およびアンチセンス分子）と組み合わせることができる
か一緒に用いることができる方法の非限定的例である。当業者は，同様にして他
の薬剤化合物および治療剤を本発明の核酸分子（例えば，酵素的核酸およびアン
チセンス分子）と容易に組み合わせることができ，したがって，これらも本発明
の範囲内であることを認識するであろう。
【０１９５】実施例７：核酸分子の検出 好ましい態様においては，本発明は，酵素的核酸構築物を用いて核酸分子を検
出するための新規な方法に関する。本発明はさらに，前記プロセスを，患者にお
ける特定の遺伝子型および／または表現型，例えば，疾病状態，感染，または関
連する状態を示す遺伝子および／または遺伝子産物の存在を同定するための診断
用途に用いることに関する。
【０１９６】 核酸の検出は，疾病または医療疾患の診断に非常に有益でありうる。特定の核
酸配列の存在を判定することにより，研究者は，ウイルス，細菌，遺伝的変異，
および疾病に関連するかもしれない他の状態の存在を確認することができる。核
酸配列のアッセイには，検出のための単純な方法，例えば放射性標識または蛍光
プローブを用いるノザンブロットハイブリダイゼーションにより核酸分子の存在
を検出することから，ハイブリダイゼーション手法により配列の検出に用いるこ
とができる点までポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて少量の特定の核酸を
増幅すること等の種々の範囲のものが含まれる。ポリメラーゼ連鎖反応は，ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いて，予め作成したプライマーを用いて所望の配列を対数関
数的に増幅して特定の配列の位置を決定する（米国特許４，６８３，１９５；米
国特許．４，６８３，２０２）。ヌクレオチドプローブは，市販の染料，蛍光，
化学発光，放射性，または酵素的標識を用いて標識することができる。これらの
プローブを用いて，ハイブリダイゼーションにより遺伝子が正常な成分である細
胞または組織試料において遺伝子または関連する配列の発現を検出することがで
き，ならびに生物による感染により生ずる疾患を有すると疑われるヒトからの血
清または組織試料をスクリーニングするか，または腫瘍発生性細胞に見いだされ
るかもしれない新規なまたは変更された遺伝子を検出することができる。リバー
ストランスクリプターゼまたはＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲを用いて，組織
または体液中に非常に少量で存在する核酸分子の検出に用いることができる核酸
プライマーを製造することもできる。
【０１９７】 ＰＣＲは，蛋白質酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて特定のヌクレオチド配
列を検出する。ＰＣＲは，信頼性のためには高度の技術的能力が必要であること
，および夾雑物に対して非常に感受性が高いために擬陽性を生ずること等の，い
くつかの欠点を有する。
【０１９８】 診断目的のために用いられている別の種類の酵素は核酸触媒（酵素的核酸）で
ある。核酸分子はまた触媒活性を有することが示されているため，これらは診断
用途にも用いることができる。
【０１９９】 酵素的核酸の酵素的性質は，治療を行うのに必要な酵素的核酸の濃度がより低
い等の著しい利点を有する。この利点は，酵素的核酸が酵素的に作用する能力を
反映している。すなわち，１つの酵素的核酸分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切断
することができる。さらに，酵素的核酸は，高度に特異的な阻害剤であり，その
阻害の特異性は，標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成メカニズムのみならず，標的
ＲＮＡ切断のメカニズムにも依存する。切断の部位の近くにおける１つのミスマ
ッチまたは塩基置換を選択して，酵素的核酸の触媒活性を完全に排除することが
できる。
【０２００】 エンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸分子は，ヌクレオチド塩基配列に特
異的な様式で他の別のＲＮＡ分子を繰り返し切断することができる。そのような
酵素的核酸分子は，事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができ，イ
ンビトロで有効な切断を達成することができる（Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，３２
４，Ｎａｔｕｒｅ ４２９ １９８６；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８７ Ｎａｔ
ｕｒｅ ３２８，５９６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，８４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７８８，１９８７；Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８
，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，６，９２；Ｈａｓｅ
ｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，３３４ Ｎａｔｕｒｅ ５８５，１９８８
；Ｃｅｃｈ，２６０ ＪＡＭＡ ３０３０，１９８８；Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅ
ｔ ａｌ．，１７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３７１
，１９８９；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７（上掲）））。
【０２０１】 その配列特異性のため，トランス切断酵素的核酸は，ヒトの疾患の治療剤とし
て有望である（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５ Ａｎｎ．Ｒｅｐ．
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ ａ
ｎｄ Ｍａｒｒ，１９９５ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７
）。酵素的核酸は，細胞性ＲＮＡのバックグラウンド中で特定のＲＮＡ標的を切
断するよう設計することができる。そのような切断事象は，ＲＮＡを非機能性に
し，そのＲＮＡからの蛋白質発現を排除する。このようにして，疾患状態に関連
する蛋白質の合成が選択的に阻害される。
【０２０２】 Ｇｅｏｒｇｅら（米国特許５，８３４，１８６および５，７４１，６７９）は
，リガンド結合ＲＮＡ配列および別個の標的ＲＮＡ配列を切断しうる酵素的核酸
配列を含む，制御可能なＲＮＡ分子を記載する。ここでは，リガンドがリガンド
結合ＲＮＡ配列と結合すると，標的とするＲＮＡ配列に対する酵素的核酸配列の
活性が変化する。
【０２０３】 Ｓｈｉｈら（米国特許５，５８９，３３２）は，酵素的核酸を用いて高分子，
例えば蛋白質および核酸を検出する方法を記載する。
【０２０４】 Ｎａｔｈａｎら（米国特許５，８７１，９１４）は，検出アンサンブルとＲＮ
Ａ増幅アンサンブルとを含む２成分酵素的核酸システムに基づいて，アッセイさ
れる核酸の存在を検出する方法を記載する。
【０２０５】 本発明は，特定の標的分子，例えば，核酸分子，蛋白質，多糖類，糖，金属，
および有機および無機分子を検出する方法に関する。本発明の核酸検出の方法は
，当該技術分野において知られる他の方法とは区別される。本発明はさらに，前
記方法を診断用途として用いて，特定の遺伝子型および／または表現型，例えば
，疾病状態，感染，または患者中の関連する状態を示す標的分子，例えば遺伝子
および／または遺伝子産物の存在を同定することに関する。本発明はまた，例え
ば，ウイルス，細菌または細胞性ＲＮＡおよびＤＮＡの発現に関連する疾病状態
または生理学的異常を診断する方法に関する。
【０２０６】 好ましい態様においては，本発明は，システムにおいて，酵素的核酸分子を用
いて，特定の標的分子を検出および／または増幅する方法を特徴とする。特に，
本発明は，少なくとも１つのレポーター分子，少なくとも１つの標的分子，およ
びリンカーにより１またはそれ以上の阻害剤成分に連結されている酵素的核酸成
分から構成される診断エフェクター分子を用いることを特徴とする。ここで，阻
害剤成分は，例えば，酵素的核酸成分中の１またはそれ以上の配列に相補的であ
る。診断エフェクター分子において，酵素的核酸成分が反応を触媒する能力は，
１またはそれ以上の阻害剤成分の相互作用により阻害される。しかし，１または
それ以上の別の標的分子の存在下においては，阻害剤成分はそのそれぞれの標的
分子と優先的に相互作用し，酵素的核酸分子がレポーター分子と相互作用して反
応を触媒することが可能となる。次にレポーター分子上で触媒反応，例えばレポ
ーター分子の切断またはライゲーションが生じ，次に当該技術分野においてよく
知られる標準的アッセイによりその速度を測定することができる。
【０２０７】 別の好ましい態様においては，本発明は，システムにおいて，少なくとも１つ
のレポーター分子，少なくとも１つの標的分子，および酵素的核酸成分および少
なくとも１つの別個の阻害剤成分を含む診断エフェクター分子を用いて，特定の
標的分子を検出および／または増幅する方法を特徴とする。ここで，阻害剤成分
は核酸触媒中の１またはそれ以上の配列と相互作用する。診断エフェクター分子
において酵素的核酸成分が反応を触媒しうる能力は，少なくとも１つの阻害剤成
分の相互作用により阻害される。しかし，標的分子の存在下では，阻害剤成分は
優先的に標的分子と相互作用し，このことにより酵素的核酸分子はレポーター分
子と相互作用することができ，機能的となる。次に，レポーター分子上で触媒反
応，例えばレポーター分子の切断またはライゲーションが生じる。次に，当該技
術分野においてよく知られる標準的アッセイによりその速度を測定することがで
きる。
【０２０８】 好ましい態様においては，本発明は，システムにおいて，少なくとも１つのレ
ポーター分子，少なくとも１つの標的分子，および酵素的核酸成分を含む診断エ
フェクター分子を用いて，特定の標的分子を検出および／または増幅する方法を
特徴とする。エフェクター分子は，標的分子との相互作用によってのみ触媒活性
を有するように選択される。標的分子の非存在下では，診断エフェクター分子は
不活性である。標的分子の存在下では，診断エフェクター分子は活性なコンフォ
メーションをとることができ，機能的となる。次にレポーター分子上で触媒反応
，例えばレポーター分子の切断またはライゲーションが生じ，次に当該技術分野
においてよく知られる標準的アッセイによりその速度を測定する。あるいは，診
断エフェクター分子は，標的との相互作用により診断エフェクター分子が不活性
コンフォメーションをとり，不活性となるように，標的分子との相互作用により
阻害されるように選択することができる。
【０２０９】 好ましい態様においては，本発明のレポーター分子中の診断エフェクター分子
の酵素的核酸成分により触媒される反応は，触媒活性，例えば，切断活性，ライ
ゲーション活性，増幅活性，および／またはポリメラーゼ活性を特徴とする。
【０２１０】 さらに別の好ましい態様においては，診断エフェクター分子の酵素的核酸成分
は，好ましくは，ハンマーヘッド，ＮＣＨ（イノザイム），Ｇ−切断剤，アンバ
ーザイム，チンザイムおよび／またはＤＮＡｚｙｍｅモチーフであることを特徴
とする。
【０２１１】 "標的分子"とは，診断エフェクター分子の阻害剤成分と優先的に相互作用しう
る，精製されたまたは精製されていない形の分子を意味する。標的分子は，核酸
（ＲＮＡ，ＤＮＡまたはそれらの類似体），小分子，ペプチド，蛋白質，抗体，
炭水化物，有機または無機化合物，金属，または診断エフェクター分子の阻害剤
成分と相互作用しうる他のいずれかの分子でありうる。
【０２１２】 診断エフェクター分子の"阻害剤成分"とは，診断エフェクター分子の酵素的核
酸成分の１またはそれ以上の領域と相互作用して，酵素的核酸の触媒活性を阻害
しうる分子，例えば核酸配列（例えば，ＲＮＡまたはＤＮＡまたはそれらの類似
体），ペプチド，または他の化学成分を意味する。阻害剤成分は，診断エフェク
ター分子と共有結合していてもよく，または非共有結合的に会合していてもよい
。当業者は，必要なことは，阻害的成分が診断エフェクター分子の酵素的核酸成
分の活性を選択的に阻害しうることのみであることをを認識するであろう。
【０２１３】 "システム"とは，生物学的または非生物学的起源からの精製されたまたは精製
されていない形の物質，例えば，限定されないが，ヒト，動物，植物，細菌，ウ
イルス，真菌，土壌，水，または，検出または増幅すべき標的分子を含むその他
のものを意味する。
【０２１４】 本明細書において用いる場合，"生物学的システム"は，真核生物システムまた
は原核生物システムであることができ，細菌細胞，植物細胞または哺乳動物細胞
であってもよく，または植物起源，哺乳動物起源，酵母起源，ショウジョウバエ
起源または古代細菌起源の細胞であってもよい。
【０２１５】 "レポーター分子"とは，診断エフェクター分子の酵素的核酸成分と安定に相互
作用することができ，酵素的核酸分子の基質として機能する分子，例えば，核酸
配列（例えば，ＲＮＡまたはＤＮＡまたはそれらの類似体）またはペプチドおよ
び／または他の化学成分を意味する。レポーター分子はまた，化学成分，例えば
，限定されないが，蛍光，発色性，放射性，酵素的および／または化学発光また
は他の検出可能な標識を含み，これは次に当該技術分野において知られる標準的
アッセイを用いて検出することができる。
【０２１６】 別の好ましい態様においては，本発明のレポーター分子は，オリゴヌクレオチ
ドプライマー，テンプレート，またはプローブであり，これらを用いて別の核酸
配列，例えば，レポーター分子，標的分子，エフェクター分子，阻害剤分子，お
よび／または本発明の別の酵素的核酸分子を含む配列の増幅を調節することがで
きる。
【０２１７】 "非修飾ヌクレオチド"とは，β−Ｄ−リボフラノースの１’炭素に結合してい
る塩基であるアデニン，シトシン，グアニン，チミン，ウラシルの１つを有する
ヌクレオチドを意味する。
【０２１８】 "修飾ヌクレオチド"とは，非修飾ヌクレオチド塩基，糖および／またはリン酸
の化学構造中に修飾を含むヌクレオチドを意味する。
【０２１９】 好ましい態様においては，リンカー領域が診断エフェクター分子中に存在する
場合，これはさらにヌクレオチド，非ヌクレオチド化学成分またはこれらの組み
合わせから構成される。
【０２２０】 別の態様においては，非ヌクレオチドリンカー（Ｌ）は本明細書において定義
されるとおりである。本明細書において用いる場合，"非ヌクレオチド"には，無
塩基ヌクレオチド，ポリエーテル，ポリアミン，ポリアミド，ペプチド，炭水化
物，脂質，またはポリ炭化水素化合物のいずれかが含まれる。非ヌクレオチドの
特定の例には，Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１９８７，１５：３１１３；Ｃｌｏａｄ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：６３２４；Ｒｉｃｈａｒｄｓ
ｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，
１１３：５１０９；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１９９３，２１：２５８５およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３，３２
：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１９９０，１８：６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙ ｅ ｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏ
ｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１９９１，１０：２８７；Ｊｓｃｈｋｅ
ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９３，３４：３０１；
Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９１，３０：９９１４；
Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ８９／０２４３９；Ｕｓｍａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／０６７３１；Ｄｕｄｙｃｚ ｅｔ ａｌ．，国
際公開ＷＯ９５／１１９１０およびＦｅｒｅｎｔｚ ａｎｄ Ｖｅｒｄｉｎｅ，
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：４０００（すべて本明細書の
一部としてここに引用する）に記載されるものが含まれる。すなわち，好ましい
態様においては，本発明は，１またはそれ以上の非ヌクレオチド成分を有し，Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡ分子を切断する酵素的活性を有する酵素的核酸分子を特徴とす
る。"非ヌクレオチド"との用語は，１またはそれ以上のヌクレオチドユニットの
代わりに核酸鎖中に組み込むことができ，糖および／またはリン酸置換のいずれ
かを含み，残りの塩基がその酵素的活性を示すことを可能とする任意の基または
化合物を意味する。基または化合物は，一般的に認識されるヌクレオチド塩基，
例えば，アデニン，グアニン，シトシン，ウラシルまたはチミンを含まない場合
，無塩基である。本明細書において用いる場合，"無塩基"または"無塩基ヌクレ
オチド"との用語は，塩基を欠失しているか，１’位置にヌクレオチド塩基の代
わりに他の化学基を有する糖成分を包含する。
【０２２１】 好ましい態様においては，本発明は，標的分子に対して高い程度の特異性を示
す一群の核酸系診断剤を製造する方法を提供する。
【０２２２】 別の態様においては，本発明は，インビトロおよびインビボ用途の両方で標的
ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを検出する方法を特徴とする。インビトロ診断用途
は，当該技術分野において一般的に用いられているような，固体支持体系および
溶液系チップの両方，多チップアレイ，マイクロウエルプレート，およびマイク
ロビーズ由来の用途を含むことができる。インビボ診断用途には，限定されない
が，培養細胞および動物モデルに基づく用途が含まれ，例えば，ディファレンシ
ャル遺伝子発現アレイ，ＦＡＣＳ系アッセイ，診断イメージング等が含まれる。
【０２２３】 好ましい態様においては，本発明は，システム，好ましくは哺乳動物システム
において，標的分子を検出および／または増幅する方法を特徴とし，ここで，前
記標的分子は核酸配列，例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡである。該方法は，
（１）システムを，標的分子が試料中に存在する場合にはエフェクター分子の酵
素的核酸成分がレポーター分子と相互作用して反応を触媒することができるよう
に標的分子がエフェクター分子の阻害剤分子成分と相互作用するのに適当な条件
下で，診断エフェクター分子およびレポーター分子と接触させ；そして（２）エ
フェクター分子の酵素的核酸成分により触媒される，標的分子を示す反応の程度
を測定する，の各工程を含む。標的分子が試料中に存在しない場合には，バック
グラウンドより高い反応は検出されないであろう。レポーター分子は，システム
を診断エフェクター分子と相互作用させた後にシステムと接触させてもよい。
【０２２４】 別の好ましい態様においては，本発明は，システム中で標的分子を検出および
／または増幅する方法を特徴とし，ここで，標的分子はウイルス，細菌，真菌，
マイコプラズマまたは他の感染性疾病の病原体に由来するＲＮＡ配列であり，シ
ステムは患者，動物，血液，食物，水，および／または感染性疾病の病原体の他
の潜在的起源からの生物学的試料である。該方法は，（１）システムを，阻害剤
成分とシステム中に存在するかもしれない標的分子との優先的相互作用に適当な
条件下で診断エフェクター分子と接触させ，ここで，エフェクター分子は，阻害
剤成分および酵素的核酸成分を含み；（２）システムを，診断エフェクター分子
の酵素的核酸成分がレポーター分子との反応を触媒するのに適当な条件下でレポ
ーター分子と接触させ；そして（３）工程（２）において触媒される反応を測定
することにより標的分子を検出する，の各工程を含む。
【０２２５】 別の好ましい態様においては，本発明は，システムにおいて標的分子を検出お
よび／または増幅する方法を特徴とし，ここで，標的分子はウイルス，細菌，真
菌，マイコプラズマまたは他の感染性疾病の病原体に由来するＲＮＡ配列であり
，システムは，患者，動物，血液，食物，水，および／または感染性疾病の病原
体の他の潜在的起源からの生物学的試料である。該方法は，（１）レポーター分
子を，診断エフェクター分子の酵素的核酸成分の活性なコンフィギュレーション
がレポーター分子と相互作用して反応を触媒するのに適当な条件下でシステムお
よび診断エフェクター分子を含む混合物と接触させ；そして，（２）工程（１）
において触媒された反応を測定することにより標的分子を検出する，の各工程を
含む。標的分子がシステム中に存在しない場合には，酵素的核酸成分はレポータ
ー分子との反応を触媒することができず，測定すべきシグナルが存在しないであ
ろう。
【０２２６】核酸配列の検出 １つの態様においては，本発明は，適切な機能のために，少なくとも３つのオ
リゴヌクレオチド配列：診断エフェクター分子，レポーター分子，および標的分
子を用いる。診断エフェクター分子は，阻害剤成分，酵素的核酸成分，およびこ
れらの間のリンカーから構成され，リンカーは存在しても存在しなくてもよい。
診断エフェクター分子（図７）は，阻害剤成分が酵素的核酸成分中の核酸触媒に
結合しているときは，不活性状態にある。阻害剤成分は，酵素的核酸成分の二次
構造または三次構造に寄与する基質結合領域またはヌクレオチドに結合すること
ができる。例えば，阻害剤成分は酵素的核酸コア中に位置するヌクレオチドに結
合することができ，これは触媒活性を破壊することができる。レポーター分子は
診断エフェクター分子に結合することができるが，分子は構造的に不活性である
ため，触媒活性は阻害される。あるいは，阻害剤成分は，酵素的核酸成分の基質
結合領域に結合することができ，これはレポーター分子が診断エフェクター分子
に結合することを防止することができる。切断部位は切断を防止する化学的修飾
または不適切な配列のいずれかを含むため，阻害剤成分は切断されない。例えば
，ハンマーヘッドリボザイムは，正しい切断のためには切断すべき分子中にＮＵ
Ｈモチーフ（Ｈは，アデノシン，シチジン，またはウリジンである）を有するこ
とが必要である。切断すべきＲＮＡのＨ位置にグアノシンを加えることにより，
切断が阻害される。
【０２２７】 標的分子の存在下では，阻害剤は，酵素的核酸成分から解離して，標的分子に
優先的に結合することができる。阻害剤領域は標的分子に優先的に結合すること
ができ，このことにより，より安定な複合体が形成される。例えば，阻害剤領域
は，診断エフェクター分子上のヌクレオチドより多くの標的分子上のヌクレオチ
ドに結合することができる。より多数のヌクレオチドに結合することにより化学
的安定性を増加させることができ，したがって，より少数のヌクレオチドに結合
するより好ましい。
【０２２８】 阻害剤領域が標的分子に結合し，レポーター分子が診断エフェクター分子に結
合すると，レポーター分子上で酵素的核酸成分により反応が触媒される。例えば
，レポーター分子が切断されうる。次に，多くのアッセイを用いて切断事象を検
出することができる。例えば，ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動は，全長レ
ポーターオリゴヌクレオチドのみならず，機能的診断エフェクター分子により作
成されるあらゆる切断産物を検出する。これらの切断産物の検出は，標的分子の
存在を示す。さらに，レポーター分子は，蛍光分子を一方の端に含むことができ
，この蛍光シグナルはレポーター分子の他方の端に結合した別の分子により消光
される。この場合，レポーター分子の切断により蛍光分子と消光分子が解離し，
その結果シグナルが生ずる。このシグナルは，当該技術分野において知られる方
法により検出および／または定量することができる（例えば，Ｎａｔｈａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，米国特許５，８７１，９１４，Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒ，米国特許
５，４２７，９３０，およびＬｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６５
２，１０７，Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８３４，１８６および
５，７４１，６７９，およびＳｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，５８９，３
３２を参照）。
【０２２９】 あるいは，エフェクター分子の阻害的領域は，例えば図１２，システムＭに示
されるように，別個のオリゴヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【０２３０】診断スクリーニング トランスで作用する阻害的配列を有する一連の酵素的核酸を設計した。表ＸＶ
は，この試験で用いた配列を示す。Ｓ−で始まる名前を有する配列は，この実験
で用いた基質配列であり，Ｒｚ−で始まる配列は酵素的核酸である。Ｉ−で始ま
る配列は，酵素的核酸配列の一部に結合して（種々の程度で），酵素的核酸が基
質に結合しこれを切断することを防止するよう設計された阻害的配列である。こ
れらの配列は，結合親和性を増加させるために２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを
用いて合成したため，小文字で示されている。Ｔ−２ａと表示される１つの配列
は，これらが酵素的核酸活性を阻害することを防止するように，阻害的配列に結
合するよう設計された標的配列である。システムの構築は図１６に示される。
【０２３１】 図１７は，これらの酵素的核酸／阻害剤の組み合わせのいくつかを切断アッセ
イにおいて試験した結果を示す。基質分子は３２Ｐ−リン酸で５’末端標識し，
（１）緩衝液単独（５０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．５，１０ｍＭＭｇＣｌ２），ま
たは（２）１０ｎＭ酵素的核酸，（３）１０ｎＭ酵素的核酸＋２０ｎＭ阻害剤，
（４）１０ｎＭ酵素的核酸＋２００ｎＭ阻害剤，または（５）１０ｎＭ酵素的核
酸＋２０ｎＭ阻害剤および５００ｎＭ標的の存在下で，１２または６０分間イン
キュベートした。インキュベート終了後に反応をＰＡＧＥゲルに負荷して，切断
された産物を未切断基質から分離した。ゲルをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍ
ｉｃｓホスホイメージャーで画像化し，定量して，各条件の組における切断され
た基質のパーセントを求めた。対照反応を実施して，酵素的核酸なしで阻害剤ま
たは標的配列を加えた場合に基質切断が生じないことを確実にした。これらの条
件下では，基質のわずか０．２−０．４％しか切断されなかった。
【０２３２】 図１７は，これらの３つの酵素的核酸について，酵素的核酸単独で１分後に基
質の４０−６０％，６０分後に８５％を切断することを示す。２０ｎＭの阻害剤
を反応に加えると，切断活性は３０−７０％減少する。２００ｎＭの阻害剤を加
えると，切断活性は５０−９９％減少する。最後に，１０ｎＭの酵素的核酸およ
び２０ｎＭの標的を含む反応に５００ｎＭの標的を加えると，切断活性がほぼ完
全に，酵素的核酸単独で観察されるレベルまで回復する。
【０２３３】診断用途 本発明の核酸分子（例えばリボザイム）を診断手段として使用し，疾病に罹患
した細胞内の遺伝的浮動および変異を検査するか，または細胞においてＣＤ２０
および／またはＮＯＧＯ ＲＮＡの存在を検出することができる。酵素的核酸の
活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係により，分子の任意の領域において
，標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を変更する変異を検出することがで
きる。本発明に記載される酵素的核酸分子を複数使用することにより，インビト
ロならびに細胞および組織におけるＲＮＡの構造および機能に重要なヌクレオチ
ド変化をマッピングすることができる。酵素的核酸分子による標的ＲＮＡの切断
を使用して，遺伝子の発現を阻害し，疾病の進行における特定の遺伝子産物の役
割を（本質的に）明らかにすることができる。このようにして，他の遺伝子標的
を疾病の重要な介在物として明らかにすることができる。これらの実験は，組み
合わせ療法の可能性を提供することにより，疾病進行のよりよい治療につながる
であろう（例えば，異なる遺伝子を標的とする多数の酵素的核酸，既知の小分子
阻害剤とカップリングさせた酵素的核酸，酵素的核酸および／または他の化学的
または生物学的分子と組み合わせた放射性または間欠的治療）。本発明の酵素的
核酸の他のインビトロにおける使用は当該技術分野においてよく知られており，
これには，ＣＤ−２０に関連する状態に関係するｍＲＮＡの存在の検出が含まれ
る。そのようなＲＮＡは，酵素的核酸分子で処理した後，標準的な方法論を使用
して切断産物の存在を判定することにより検出する。
【０２３４】 特定の例においては，標的ＲＮＡの野生型または変異型のみしか切断できない
酵素的核酸をアッセイに使用する。第１の酵素的核酸を用いて試料中の野生型Ｒ
ＮＡの存在を同定し，第２の酵素的核酸を用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定す
る。反応対照として野生型および変異型の両方のＲＮＡの合成基質を両方の酵素
的核酸で切断し，反応における酵素的核酸の相対効率および"非標的"ＲＮＡ種を
切断しないことを明らかにする。合成基質からの切断産物は，試料集団中の野生
型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーの生成にも役立つ。従って
それぞれの分析は２つの酵素的核酸，２つの基質，および１つの未知の試料を必
要とし，これらを組み合わせて６つの反応を行う。切断産物の存在をＲＮａｓｅ
保護アッセイを使用して確認し，各ＲＮＡの完全長および切断フラグメントをポ
リアクリルアミドゲルの１レーンで分析できるようにする。標的細胞における変
異体ＲＮＡの発現および所望の表現型の変化の推定されるリスクへの洞察を得る
ために，必ずしも結果を定量する必要はない。その蛋白質産物が表現型（すなわ
ちＣＤ２０）の発生に関与することが示唆されるｍＲＮＡの発現はリスクを確立
するのに十分である。同等の比活性のプローブを両方の転写産物に使用すれば，
ＲＮＡレベルの定性的比較で十分であり，初期の診断のコストが低減する。ＲＮ
Ａレベルを定性的に比較するにしても定量的に比較するにしても，より高い変異
型と野生型の比率はより高いリスクと相関関係があるであろう。
【０２３５】追加の用途 本発明の配列特異的酵素的核酸分子の潜在的な有用性は，ＤＮＡ制限エンドヌ
クレアーゼがＤＮＡの研究のために有するものと同様の多くの適用をＲＮＡの研
究のために有する（Ｎａｔｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９７５ Ａｎｎ．Ｒｅｖ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：２７３）。例えば，制限フラグメントのパターンを使
用して２つの関連するＲＮＡ間の配列の関係を確立することができ，大型のＲＮ
Ａを研究のためにより有用なサイズのフラグメントに特異的に切断することがで
きる。酵素的核酸分子の配列特異性を工学的に操作できることは未知の配列のＲ
ＮＡの切断に理想的である。出願人は，細菌，微生物，真菌，ウイルス，および
真核生物系，例えば植物または哺乳動物細胞において，標的遺伝子の遺伝子発現
をダウンレギュレートするために核酸分子を用いることを記載する。
【０２３６】 本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技
術分野の技術者のレベルを示す。本明細書において引用されるすべての参考文献
は，それぞれの参考文献が個々にその全体が本明細書の一部としてここに引用さ
れることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。
【０２３７】 当業者は，本発明が，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならび
に本明細書に固有のものを得るためによく適合していることを容易に理解するで
あろう。本明細書に記載される方法および組成物は，現在のところ好ましい態様
の代表的なものであり，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを
意図するものではない。当業者は，特許請求の範囲において定義される本発明の
精神の中に包含される変更および他の用途をなすであろう。
【０２３８】 当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示さ
れる本発明に対して種々の置換および改変をなすことが可能であることを容易に
理解するであろう。すなわち，そのような追加の態様は，本発明および特許請求
の範囲の範囲内である。
【０２３９】 本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されてい
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として
用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては
，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図
するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が
可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により
本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更
および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義さ
れる本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０２４０】 さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループまたは他の代替グルー
プの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループま
たは他のグループの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載され
ていることを認識するであろう。
【０２４１】 他の態様も本発明および特許請求の範囲の範囲内である。
【０２４２】表１ 天然に存在するリボザイムの特徴グループＩイントロン ・サイズ：約１５０〜１０００以上のヌクレオチド。 ・標的配列中の切断部位の５’側に隣接してＵを必要とする。 ・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：グアノシンの３’−ＯＨによって攻撃し，３’−ＯＨおよび
５’グアノシンを有する切断産物を生成する。 ・活性構造の折り畳みおよび維持を助けるために，場合により，蛋白質の補因子
をさらに必要とする。 ・このクラスには３００以上の種類が知られている。テトラヒメナ・サーモフィ
ラのｒＲＮＡ，真菌ミトコンドリア，葉緑体，ファージＴ４，らん藻類，その他
において，介在配列として見出されている。 ・主要な構造上の特徴は，系統発生比較，突然変異原性および生化学的研究によ
ってほぼ確立されている［１，２］。 ・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが立証されている［３
，４，５，６］。 ・リボザイムの折り畳みおよび基質ドッキングに関する研究が進行中［７，８，
９］。 ・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている［１０，１１］。 ・このリボザイムは，結合部位が小さい（４〜６ヌクレオチド）ため，標的ＲＮ
Ａ切断に対して非常に非特異的になる場合があるが，テトラヒメナのグループＩ
イントロンは，「欠損」β−ガラクトシダーゼのメッセージに新たなβ−ガラク
シダーゼ配列を結合することによってこのメッセージを修復するのに利用されて
いる［１２］。
【０２４３】ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（Ｍ１ＲＮＡ） ・サイズ：約２９０〜４００のヌクレオチド。 ・偏在するリボ核蛋白質酵素のＲＮＡ部分。 ・ｔＲＮＡ前駆体を切断し，成熟ｔＲＮＡを形成する［１３］。 ・反応メカニズム：恐らくはＭ2+−ＯＨによって攻撃し，３’−ＯＨおよび５’
リン酸を有する切断産物を生成する。 ・ＲＮａｓｅＰは原核生物および真核生物全体に見出されている。このＲＮＡサ
ブユニットは，細菌，酵母，げっ歯類および霊長類から配列決定されている。 ・外部ガイド配列（ＥＧＳ）と標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって，
内因性ＲＮａｓｅＰを治療応用に活用することが可能である［１４，１５］。 ・リン酸と２’ＯＨとの接触の重要性が最近判明した［１６，１７］。
【０２４４】グループＩＩイントロン ・サイズ：１０００以上のヌクレオチド。 ・標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［１８，１９］。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：内部アデノシンの２’−ＯＨが３’−ＯＨ，および３’−５
’および２’−５’分岐点を含む「ラリアット（ｌａｒｉａｔ）」ＲＮＡを有す
る切断産物を生成する。 ・ＲＮＡの切断および結合に加えて，ＤＮＡ切断への関与が実証された［２０，
２１］唯一の天然リボザイムである。 ・主要な構造上の特徴は，系統発生比較によってほぼ確立されている［２２］。
・２’ＯＨ接触の重要性が判明しはじめている［２３］。 ・力学的フレームワークは検討中である［２４］。
【０２４５】Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ ・サイズ：約１４４ヌクレオチド。 ・ヘアピン標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［２５］。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨが切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’，３’
−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。 ・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていない。 ・このクラスは１種しか知られていない。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ
に見出されている。
【０２４６】ハンマーヘッド・リボザイム （本文を参照のこと） ・サイズ：約１３〜４０ヌクレオチド。 ・切断部位の５’に隣接した標的配列ＵＨを必要とする。 ・切断部位の両側で可変数のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’
，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する
。 ・このクラスには１４種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する多くの
植物病原体（ウィルソイド）において見出されている。 ・２つの結晶構造を含め，本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている。［２
６，２７］ ・（インビトロ選択による工学的処理に対し）ごくわずかなライゲーション活性
が実証された。［２８］ ・２つまたはそれ以上のリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立
されている。［２９］ ・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている。［３０］
【０２４７】ヘアピンリボザイム ・サイズ：約５０ヌクレオチド。 ・切断部位の３’に隣接した標的配列ＧＵＣを必要とする。 ・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと，切断部位の３’側で可変数のヌ
クレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’
，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する
。 ・このクラスには３種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する３種の植
物病原体（タバコ・リングスポット・ウィルス，アラビス・モザイク・ウィルス
およびチコリー黄色斑ウィルスのサテライトＲＮＡ）に見出されている。 ・本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている［３１，３２，３３，３４］。 ・（切断活性に加えて）ライゲーション活性があるためにこのリボザイムはイン
ビトロ選択による工学処理が可能である［３５］。 ・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている［３
６］。 ・重要な残基の化学修飾検討が着手された［３７，３８］。
【０２４８】デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム ・サイズ：約６０ヌクレオチド。 ・標的ＲＮＡのトランス切断であることが実証されている［３９］。 ・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていないが，切断部位の５
’側の配列は要求されない。折りたたまれたリボザイムはシュードノット構造を
含む［４１］。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’
，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する
。 ・このクラスは２種しか知られていない。ヒトＨＤＶに見出されている。 ・環状のＨＤＶは活性があり，ヌクレアーゼ安定性が増加している［４２］。
【０２４９】
【表１】
【０２５０】
【表２】
【０２５１】
【表３】
【０２５２】
【表４】
【０２５３】
【表５】
【０２５４】
【表６】
【０２５５】
【表７】
【０２５６】
【表８】
【０２５７】
【表９】
【０２５８】
【表１０】
【０２５９】
【表１１】
【０２６０】
【表１２】
【０２６１】
【表１３】
【０２６２】
【表１４】
【０２６３】
【表１５】
【０２６４】
【表１６】 下線を施した領域は、本明細書に先に記載されるように任意のＸ配列またはリン
カーであることがことができる。
【０２６５】
【表１７】
【０２６６】
【表１８】
【０２６７】
【表１９】
【０２６８】
【表２０】
【０２６９】
【表２１】
【０２７０】
【表２２】
【０２７１】
【表２３】
【０２７２】
【表２４】
【０２７３】
【表２５】
【０２７４】
【表２６】
【０２７５】
【表２７】
【０２７６】
【表２８】
【０２７７】
【表２９】
【０２７８】
【表３０】
【０２７９】
【表３１】
【０２８０】
【表３２】
【０２８１】
【表３３】
【０２８２】
【表３４】
【０２８３】
【表３５】
【０２８４】
【表３６】
【０２８５】
【表３７】
【０２８６】
【表３８】
【０２８７】
【表３９】
【０２８８】
【表４０】
【０２８９】
【表４１】
【０２９０】
【表４２】
【０２９１】
【表４３】
【０２９２】
【表４４】
【０２９３】
【表４５】
【０２９４】
【表４６】
【０２９５】
【表４７】
【０２９６】
【表４８】
【０２９７】
【表４９】
【０２９８】
【表５０】
【０２９９】
【表５１】
【０３００】
【表５２】
【０３０１】
【表５３】
【０３０２】
【表５４】
【０３０３】
【表５５】
【０３０４】
【表５６】
【０３０５】
【表５７】
【０３０６】
【表５８】
【０３０７】
【表５９】
【０３０８】
【表６０】
【０３０９】
【表６１】
【０３１０】
【表６２】
【０３１１】
【表６３】
【０３１２】
【表６４】
【０３１３】
【表６５】
【０３１４】
【表６６】
【０３１５】
【表６７】
【０３１６】
【表６８】
【０３１７】
【表６９】
【０３１８】
【表７０】
【０３１９】
【表７１】
【０３２０】
【表７２】
【０３２１】
【表７３】
【０３２２】
【表７４】
【０３２３】
【表７５】
【０３２４】
【表７６】
【０３２５】
【表７７】
【０３２６】
【表７８】
【０３２７】
【表７９】
【０３２８】
【表８０】
【０３２９】
【表８１】
【０３３０】
【表８２】
【０３３１】
【表８３】
【０３３２】
【表８４】
【０３３３】
【表８５】
【０３３４】
【表８６】
【０３３５】
【表８７】
【０３３６】
【表８８】
【０３３７】
【表８９】
【０３３８】
【表９０】
【０３３９】
【表９１】
【０３４０】
【表９２】
【０３４１】
【表９３】
【０３４２】
【表９４】
【０３４３】
【表９５】
【０３４４】
【表９６】
【０３４５】
【表９７】
【０３４６】
【表９８】
【０３４７】
【表９９】
【０３４８】
【表１００】
【０３４９】
【表１０１】
【０３５０】
【表１０２】
【０３５１】
【表１０３】
【０３５２】
【表１０４】
【０３５３】
【表１０５】
【０３５４】
【表１０６】
【０３５５】
【表１０７】
【０３５６】
【表１０８】
【０３５７】
【表１０９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は，７つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを
示す。
【図２】 図２は，化学的に安定化されたリボザイムモチーフの例を示す。
【図３】 図３は，化学的に安定化されたアンバーザイム酵素的核酸モチー
フの例を示す。
【図４】 図４は，化学的に安定化されたチンザイムＡ酵素的核酸モチーフ
の例を示す。
【図５】 図５は，ＤＮＡｚｙｍｅモチーフの例を示す。
【図６】 図６は，ハンマーヘッドに基づくシスブロッキング配列戦略を用
いる標的配列の検出の非限定的例を示す。
【図７】 図７は，シス作用性診断エフェクター分子の２つの主要なコンフ
ィギュレーションを示す概略図を示す。
【図８】 図８は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の潜在
的二次構造を示す。
【図９】 図９は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の潜在
的二次構造を示す。
【図１０】 図１０は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の
潜在的二次構造を示す。
【図１１】 図１１は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の
潜在的二次構造を示す。
【図１２】 図１２は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の
潜在的二次構造を示す。
【図１３】 図１３は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の
潜在的二次構造を示す。
【図１４】 図１４は，非限定的例における診断エフェクター分子の多数の
潜在的二次構造を示す。
【図１５】 図１５は，本発明の診断システムの固有の増幅能力を示す。
【図１６】 図１６は，本発明の診断システムの構造を示す。
【図１７】 図１７は，切断アッセイにおいて酵素的核酸／阻害剤の組み合
わせを試験した結果を示す棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/23 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８４ 45/00 Ａ６１Ｐ 7/04 ４Ｃ０８６ 48/00 9/00 Ａ６１Ｐ 7/04 19/02 9/00 21/04 19/02 25/00 21/04 25/28 25/00 31/18 25/28 35/00 31/18 35/02 35/00 43/00 １０５ 35/02 １１１ 43/00 １０５ １２１ １１１ Ｃ１２Ｎ 9/00 １２１ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 9/00 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 33/58 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/566 5/00 Ｂ 33/58 Ａ６１Ｋ 37/30 (31)優先権主張番号 ６０／１８７，１２８ (32)優先日 平成12年３月６日(2000．3．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 チョーリラ，バラット・エム アメリカ合衆国 80020 コロラド州，ブ ルームフィールド，クラブハウス ドクタ ー 1138 (72)発明者 ブラット，ローレンス アメリカ合衆国 80304 コロラド州，ボ ウルダー， リバーサイド レイン 2176 (72)発明者 マクスウィゲン，ジェイムズ アメリカ合衆国 80301 コロラド州，ボ ウルダー，フランクリン ドライブ 4866 (72)発明者 チョーリラ，バラット・エム アメリカ合衆国 80020 コロラド州，ブ ルームフィールド，クラブハウス ドクタ ー 1138 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 CB01 CB17 CB20 CB21 DA12 DA13 DA14 FB02 FB07 FB08 FB12 FB13 4B024 AA01 AA11 BA11 BA80 CA01 CA05 CA11 DA02 GA11 HA12 HA19 4B050 CC01 CC03 CC04 EE10 LL01 LL03 4B063 QA01 QA08 QA18 QQ42 QQ52 QR32 QR35 4B065 AA90X AB01 CA23 CA31 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 AA17 BA01 BA08 BA19 BA44 CA18 DB31 MA02 NA14 ZA011 ZA021 ZA151 ZA161 ZA361 ZA531 ZA941 ZA961 ZB261 ZB271 ZC412 ZC752 4C086 AA01 AA02 EA16 FA05 MA01 MA02 MA04 NA14 ZA01 ZA02 ZA15 ZA16 ZA36 ZA53 ZA94 ZA96 ZB26 ZB27 ZC41 ZC75

Claims (137)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 システム中で標的分子を検出する方法であって，ここで前記
    標的分子は核酸配列であり， ａ． システムを診断エフェクター分子と接触させ，ここで，診断エフェクター
    分子は，（ｉ）基質結合領域および触媒領域を含む酵素的核酸成分；および（ｉ
    ｉ）酵素的核酸成分中の配列に相補的な配列を含む核酸系阻害剤成分，ここで阻
    害剤成分は酵素的核酸成分中のその相補的配列と相互作用して，酵素的核酸成分
    の活性を阻害し；および診断エフェクター分子の酵素的核酸成分の基質結合領域
    に相補的な配列を含む核酸系レポーター分子を含み，ここで，レポーター分子と
    診断エフェクター分子の酵素的核酸成分中のその相補的配列との相互作用は，標
    的分子がシステム中に存在する場合には診断エフェクター分子の酵素的核酸成分
    がレポーター分子と相互作用してレポーター分子の切断を触媒するように標的分
    子が診断エフェクター分子の阻害剤成分と相互作用するのに適当な条件下でレポ
    ーター分子の切断を引き起こし；そして ｂ． 標的分子の存在下で診断エフェクター分子の酵素的核酸成分によるレポー
    ター分子の切断の程度を標的分子の非存在下におけるレポーター分子の切断と比
    較して測定することにより標的分子を検出する， の各工程を含む方法。
  2. 【請求項２】 システム中の標的分子を検出する方法であって，ここで前記
    標的分子は核酸配列であり， ａ． システムを診断エフェクター分子と接触させ，ここで，診断エフェクター
    分子は，（ｉ）基質結合領域および触媒領域を含む酵素的核酸成分；および（ｉ
    ｉ）酵素的核酸成分中の配列に相補的な配列を含む核酸系阻害剤成分，ここで，
    阻害剤成分は酵素的核酸成分中のその相補的配列と相互作用して酵素的核酸成分
    の活性を阻害し；および診断エフェクター分子の酵素的核酸成分の基質結合領域
    に相補的な配列を含む核酸系レポーター分子を含み，ここで，レポーター分子と
    診断エフェクター分子の酵素的核酸成分中のその相補的配列との相互作用は，診
    断エフェクター分子の酵素的核酸成分がレポーター分子と相互作用してレポータ
    ー分子の切断を触媒するのに適当な条件下でレポーター分子の切断を引き起こし
    ；そして ｂ． 標的分子の存在下で診断エフェクター分子の酵素的核酸成分によるレポー
    ター分子の切断の程度を標的分子の非存在下におけるレポーター分子の切断と比
    較して測定することにより標的分子を検出する， の各工程を含む方法。
  3. 【請求項３】 前記システムがインビトロシステムである，請求項１または
    ２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記インビトロシステムが，患者，植物，水，飲料，食物，
    および土壌からなる群に由来する試料である，請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記標的分子が，ＲＮＡ，ＤＮＡ，ＲＮＡの類似体またはＤ
    ＮＡの類似体である，請求項１または２記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記標的分子が，細菌，ウイルス，真菌，植物または哺乳動
    物の遺伝子に由来するＲＮＡである，請求項１または２記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記診断エフェクター分子の酵素的核酸成分が，ハンマーヘ
    ッド，ヘアピン，イノザイム，Ｇ−切断剤，チンザイム，ＲＮａｓｅＰ，ＥＧＳ
    核酸，およびアンバーザイムモチーフからなる群より選択される，請求項１また
    は２記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記診断エフェクター分子の酵素的核酸成分がＤＮＡｚｙｍ
    ｅである，請求項１または２記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記レポーター分子検出可能標識が，発色性基質，蛍光標識
    ，化学発光標識，および放射性標識からなる群より選択される，請求項１または
    ２記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記レポーター分子が固体支持体に固定化されている，請
    求項１または２記載の方法。
  11. 【請求項１１】 診断エフェクター分子の前記阻害剤成分が，ＲＮＡ，ＤＮ
    Ａ，ＲＮＡの類似体またはＤＮＡの類似体である，請求項１または２記載の方法
    。
  12. 【請求項１２】 診断エフェクター分子の前記阻害剤成分が，リンカーによ
    り診断エフェクター分子に共有結合している，請求項１または２記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記リンカーが，１またはそれ以上の，ヌクレオチド，無
    塩基成分，ポリエーテル，ポリアミン，ポリアミド，ペプチド，炭水化物，脂質
    ，およびポリ炭化水素化合物を含む群より選択される，請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 診断エフェクター分子の前記阻害剤成分が診断エフェクタ
    ー分子に共有結合していない，請求項１または２記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記レポーター分子が，ＲＮＡ，ＤＮＡ，ＲＮＡ類似体，
    またはＤＮＡ類似体である，請求項１または２記載の方法。
  16. 【請求項１６】 システム中で標的分子を検出するためのキットであって，
    前記標的分子は核酸配列であり， ａ． 診断エフェクター分子，ここで，診断エフェクター分子は，（ｉ）基質結
    合領域および触媒領域を含む酵素的核酸成分；および（ｉｉ）酵素的核酸成分中
    の配列に相補的な配列を含む核酸系阻害剤成分を含み，ここで，阻害剤成分は，
    酵素的核酸成分中のその相補的配列と相互作用して，酵素的核酸成分の活性を阻
    害し；および ｂ． 診断エフェクター分子の酵素的核酸成分の基質結合領域に相補的な配列を
    含む核酸系レポーター分子，ここで，レポーター分子と診断エフェクター分子の
    酵素的核酸成分中のその相補的配列との相互作用は，標的分子の存在下でレポー
    ター分子の切断を引き起こし，ここでレポーター分子は，検出可能なシグナルを
    放出しうる化学成分で標識されている， を含むことを特徴とするキット。
  17. 【請求項１７】 前記標的分子が，細菌，ウイルス，真菌，植物または哺乳
    動物の遺伝子に由来するＲＮＡである，請求項１６記載のキット。
  18. 【請求項１８】 前記診断エフェクター分子の酵素的核酸成分が，ハンマー
    ヘッド，ヘアピン，イノザイム，Ｇ−切断剤，チンザイム，ＲＮａｓｅＰＥＧＳ
    核酸およびアンバーザイムモチーフからなる群より選択される，請求項１６記載
    のキット。
  19. 【請求項１９】 前記診断エフェクター分子の酵素的核酸成分がＤＮＡｚｙ
    ｍｅである，請求項１６記載のキット。
  20. 【請求項２０】 レポーター分子中の前記検出可能標識が，発色性基質，蛍
    光標識，化学発光標識，および放射性標識からなる群より選択される，請求項１
    ６記載のキット。
  21. 【請求項２１】 前記レポーター分子が固体支持体に固定化されている，請
    求項１６記載のキット。
  22. 【請求項２２】 診断エフェクター分子の前記阻害剤成分が，ＲＮＡ，ＤＮ
    Ａ，ＲＮＡの類似体またはＤＮＡの類似体である，請求項１６記載のキット。
  23. 【請求項２３】 診断エフェクター分子の前記阻害剤成分が，リンカーによ
    り診断エフェクター分子に共有結合されている，請求項１６記載のキット。
  24. 【請求項２４】 前記リンカーが，１またはそれ以上の，ヌクレオチド，無
    塩基成分，ポリエーテル，ポリアミン，ポリアミド，ペプチド，炭水化物，脂質
    ，およびポリ炭化水素化合物を含む群より選択される，請求項２３記載のキット
    。
  25. 【請求項２５】 診断エフェクター分子の前記阻害剤成分が診断エフェクタ
    ー分子に共有結合していない，請求項１６記載のキット。
  26. 【請求項２６】 前記レポーター分子が，ＲＮＡ，ＤＮＡ，ＲＮＡ類似体，
    またはＤＮＡ類似体である，請求項１６記載のキット。
  27. 【請求項２７】 ＣＤ２０遺伝子の発現をダウンレギュレートする核酸分子
    。
  28. 【請求項２８】 前記核酸分子が，リンパ腫，白血病，関節症，Ｂ−細胞リ
    ンパ腫，低悪性度または濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ），巨大低悪性度ま
    たは濾胞性ＮＨＬ，リンパ球性白血病，ＨＩＶ関連ＮＨＬ，外套−細胞リンパ腫
    （ＭＣＬ），免疫細胞腫（ＩＭＣ），小Ｂ−細胞リンパ性リンパ腫，免疫性血小
    板減少症，および炎症性関節症からなる群より選択される状態を治療するために
    用いられる，請求項２７記載の核酸。
  29. 【請求項２９】 前記核酸分子が，１またはそれ以上の結合アームを有する
    酵素的核酸分子である，請求項２７記載の核酸分子。
  30. 【請求項３０】 前記酵素的核酸分子の結合アームが，配列番号２７０２−
    ３７９３からなる群より選択される配列に相補的な配列を含む，請求項２９記載
    の核酸。
  31. 【請求項３１】 前記酵素的核酸分子が，配列番号７７５８−９２５４から
    なる群より選択される配列を含む，請求項２９記載の核酸分子。
  32. 【請求項３２】 前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である，請求項２７
    記載の核酸分子。
  33. 【請求項３３】 前記アンチセンス核酸分子が，配列番号２７０２−３７９
    ３からなる群より選択される配列に相補的な配列を含む，請求項３２記載の核酸
    分子。
  34. 【請求項３４】 前記酵素的核酸分子がハンマーヘッド（ＨＨ）モチーフの
    ものである，請求項２９記載の核酸分子。
  35. 【請求項３５】 前記酵素的核酸分子が，ヘアピン，デルタ肝炎ウイルス，
    グループＩイントロン，ＶＳ核酸，アンバーザイム，チンザイム，またはＲＮＡ
    ｓｅＰ核酸モチーフのものである，請求項２９記載の核酸分子。
  36. 【請求項３６】 前記酵素的核酸分子がイノザイムモチーフのものである，
    請求項２９記載の核酸分子。
  37. 【請求項３７】 前記酵素的核酸分子がＧ−切断剤モチーフのものである，
    請求項２９記載の核酸分子。
  38. 【請求項３８】 前記酵素的核酸分子がＤＮＡｚｙｍｅである，請求項２９
    記載の核酸分子。
  39. 【請求項３９】 前記酵素的核酸分子がＣＤ２０遺伝子のＲＮＡに相補的な
    １２−１００塩基を含む，請求項２９記載の核酸分子。
  40. 【請求項４０】 前記酵素的核酸分子がＣＤ２０遺伝子のＲＮＡに相補的な
    １４−２４塩基を含む，請求項２９記載の核酸。
  41. 【請求項４１】 前記核酸が化学的に合成されたものである，請求項２７記
    載の核酸分子。
  42. 【請求項４２】 前記核酸が少なくとも１つの２’−糖修飾を含む，請求項
    ２７記載の核酸分子。
  43. 【請求項４３】 前記核酸が少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む，請求項
    ２７記載の核酸分子。
  44. 【請求項４４】 前記核酸が少なくとも１つのリン酸骨格修飾を含む，請求
    項２７記載の核酸分子。
  45. 【請求項４５】 請求項２７記載の核酸分子を含む哺乳動物細胞。
  46. 【請求項４６】 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項４５記載の哺
    乳動物細胞。
  47. 【請求項４７】 細胞においてＣＤ２０活性を減少させる方法であって，前
    記細胞をＣＤ２０活性の前記減少に適当な条件下で請求項２７記載の核酸分子と
    接触させる工程を含む方法。
  48. 【請求項４８】 ＣＤ２０のレベルに関連する状態を有する患者を治療する
    方法であって，前記患者の細胞を前記治療に適当な条件下で請求項２７記載の核
    酸分子と接触させることを含む方法。
  49. 【請求項４９】 １またはそれ以上の治療剤を前記治療に適当な条件下で使
    用することをさらに含む，請求項４８記載の方法。
  50. 【請求項５０】 ＣＤ２０遺伝子のＲＮＡを切断する方法であって，請求項
    ２９記載の核酸分子を前記ＲＮＡの切断に適当な条件下で前記ＲＮＡと接触させ
    ることを含む方法。
  51. 【請求項５１】 前記切断が二価カチオンの存在下で行われる，請求項５０
    記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記二価カチオンがＭｇ2+である，請求項５１記載の方法
    。
  53. 【請求項５３】 前記核酸がキャップ構造を含み，キャップ構造は５’末端
    または３’末端，または５’末端および３’末端の両方に存在する，請求項２７
    記載の核酸分子。
  54. 【請求項５４】 前記ハンマーヘッドモチーフが，配列番号２７０２−３０
    ４９からなる群より選択される配列に相補的な配列を含む，請求項３４記載の酵
    素的核酸分子。
  55. 【請求項５５】 前記ＮＣＨモチーフが，配列番号３０５０−３３８５から
    なる群より選択される配列に相補的な配列を含む，請求項３６記載の酵素的核酸
    分子。
  56. 【請求項５６】 前記Ｇ−切断剤モチーフが，配列番号３３８６−３４４９
    からなる群より選択される配列に相補的な配列を含む，請求項３７記載の酵素的
    核酸分子。
  57. 【請求項５７】 前記ＤＮＡｚｙｍｅが，表ＸＩＩＩにおいて基質配列とし
    て示されるいずれかの配列に相補的な配列を含む，請求項３８記載の酵素的核酸
    分子。
  58. 【請求項５８】 前記チンザイムが，表ＸＩＩにおいて基質配列として示さ
    れるいずれかの配列に相補的な配列を含む，請求項３５記載の酵素的核酸分子。
  59. 【請求項５９】 前記アンバーザイムが，表ＸＩＶにおいて基質配列として
    示されるいずれかの配列に相補的な配列を含む，請求項３５記載の酵素的核酸分
    子。
  60. 【請求項６０】 少なくとも１つの請求項２７記載の核酸分子をコードする
    核酸配列を，その核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクター。
  61. 【請求項６１】 請求項６０記載の発現ベクターを含む哺乳動物細胞。
  62. 【請求項６２】 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項６１記載の哺
    乳動物細胞。
  63. 【請求項６３】 前記核酸分子が酵素的核酸分子である，請求項６０記載の
    発現ベクター。
  64. 【請求項６４】 前記発現ベクターが，ＣＤ２０遺伝子のＲＮＡに相補的な
    アンチセンス核酸分子の配列をさらに含む，請求項６０記載の発現ベクター。
  65. 【請求項６５】 前記発現ベクターが請求項２７記載の少なくとも２つの核
    酸分子をコードする配列を含み，これは同じでも異なっていてもよい，請求項６
    ０記載の発現ベクター。
  66. 【請求項６６】 前記発現ベクターが，ＣＤ２０遺伝子のＲＮＡに相補的な
    アンチセンス核酸分子をコードする配列をさらに含む，請求項６５記載の発現ベ
    クター。
  67. 【請求項６７】 前記発現ベクターが，ＣＤ２０遺伝子のＲＮＡに相補的な
    酵素的核酸分子をコードする配列をさらに含む，請求項６５記載の発現ベクター
    。
  68. 【請求項６８】 リンパ腫を治療する方法であって，患者に請求項２７記載
    の核酸分子を前記治療に適当な条件下で投与する工程を含む方法。
  69. 【請求項６９】 白血病を治療する方法であって，患者に請求項２７記載の
    核酸分子を前記治療に適当な条件下で投与する工程を含む方法。
  70. 【請求項７０】 ＣＤ２０遺伝子に由来するＲＮＡを切断する酵素的核酸分
    子。
  71. 【請求項７１】 前記酵素的核酸分子が，ハンマーヘッド，ヘアピン，イノ
    ザイム，Ｇ−切断剤，ＤＮＡｚｙｍｅ，アンバーザイムおよびチンザイムからな
    る群より選択される，請求項７０記載の酵素的核酸分子。
  72. 【請求項７２】 前記方法が，前記患者に，請求項１記載の核酸分子を１ま
    たはそれ以上の他の治療剤とともに投与することをさらに含む，請求項６８また
    は６９記載の方法。
  73. 【請求項７３】 他の治療が，放射線照射，化学療法，およびシクロスポリ
    ン治療からなる群より選択される，請求項７２記載の方法。
  74. 【請求項７４】 前記核酸分子が，少なくとも５つのリボース残基；少なく
    とも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾，および３’末端修飾を含む，請求項３２記
    載の核酸分子。
  75. 【請求項７５】 前記核酸分子が，３’および５’末端修飾の両方を有する
    ホスホロチオエートコアをさらに含む，請求項７４記載の核酸分子。
  76. 【請求項７６】 前記３’および／または５’末端修飾が３’−３’反転無
    塩基成分である，請求項７４または７５記載の核酸分子。
  77. 【請求項７７】 前記核酸分子が，少なくとも５つのリボース残基；少なく
    とも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾，および３’末端修飾を含む，請求項２９記
    載の核酸分子。
  78. 【請求項７８】 前記核酸分子が，５’末端ヌクレオチドの少なくとも３つ
    においてホスホロチオエート結合をさらに含む，請求項７７記載の核酸分子。
  79. 【請求項７９】 前記３’末端修飾が３’−３’反転無塩基成分である，請
    求項７７記載の核酸分子。
  80. 【請求項８０】 前記ＤＮＡｚｙｍｅが，少なくとも１０個の２’−Ｏ−メ
    チル修飾および３’末端修飾を含む，請求項３８記載の酵素的核酸分子。
  81. 【請求項８１】 前記ＤＮＡｚｙｍｅが，５’末端ヌクレオチドの少なくと
    も３つにおいてホスホロチオエート結合をさらに含む，請求項８０記載の酵素的
    核酸分子。
  82. 【請求項８２】 前記３’末端修飾が３’−３’反転無塩基成分である，請
    求項８０記載の酵素的核酸分子。
  83. 【請求項８３】 神経突起成長阻害剤遺伝子の発現をダウンレギュレートす
    る核酸分子。
  84. 【請求項８４】 前記神経突起成長阻害剤遺伝子がＮＯＧＯ遺伝子である，
    請求項８３記載の核酸分子。
  85. 【請求項８５】 前記核酸分子が，ＣＮＳ損傷および脳血管偶発症候からな
    る群より選択される状態を治療するのに用いるのに適合されている，請求項８３
    記載の核酸。
  86. 【請求項８６】 前記核酸分子が，１またはそれ以上の結合アームを有する
    酵素的核酸分子である，請求項８３または８４記載の核酸分子。
  87. 【請求項８７】 前記酵素的核酸分子が，前記ＮＯＧＯ遺伝子によりコード
    されるＲＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する，請求項８６記載の核
    酸分子。
  88. 【請求項８８】 前記酵素的核酸分子の結合アームが，配列番号１−２７０
    １からなる群より選択される配列に相補的な配列を含む，請求項８３記載の核酸
    。
  89. 【請求項８９】 配列番号３７９４−７７５７からなる群より選択される配
    列を含む酵素的核酸分子。
  90. 【請求項９０】 前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である，請求項８３
    記載の核酸分子。
  91. 【請求項９１】 配列番号１−２７０１からなる群より選択されるいずれか
    の配列に相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子。
  92. 【請求項９２】 前記酵素的核酸分子がハンマーヘッド（ＨＨ）モチーフの
    ものである，請求項８６記載の酵素的核酸分子。
  93. 【請求項９３】 前記酵素的核酸分子が，ヘアピン，デルタ肝炎ウイルス，
    グループＩイントロン，ＶＳ核酸，アンバーザイム，チンザイムまたはＲＮＡｓ
    ｅＰ核酸モチーフのものである，請求項８６記載の酵素的核酸分子。
  94. 【請求項９４】 前記チンザイムモチーフが，配列番号５５７２−５９８７
    からなる群より選択される配列を含む，請求項９３記載の酵素的核酸分子。
  95. 【請求項９５】 前記アンバーザイムモチーフが，配列番号６８４１−７７
    ５７からなる群より選択される配列を含む，請求項９３記載の酵素的核酸分子。
  96. 【請求項９６】 前記酵素的核酸分子がＮＣＨモチーフのものである，請求
    項８６記載の酵素的核酸分子。
  97. 【請求項９７】 前記酵素的核酸分子がＧ−切断剤モチーフのものである，
    請求項８６記載の酵素的核酸分子。
  98. 【請求項９８】 前記酵素的核酸分子がＤＮＡｚｙｍｅである，請求項８６
    記載の酵素的核酸分子。
  99. 【請求項９９】 前記核酸分子が，ＮＯＧＯ遺伝子のＲＮＡに相補的な１２
    −１００塩基を含む，請求項８４記載の核酸分子。
  100. 【請求項１００】 前記核酸分子が，ＮＯＧＯ遺伝子のＲＮＡに相補的な１
    ４−２４塩基を含む，請求項８４記載の核酸。
  101. 【請求項１０１】 前記核酸が化学的に合成されたものである，請求項８３
    記載の核酸分子。
  102. 【請求項１０２】 前記核酸が少なくとも１つの２’−糖修飾を含む，請求
    項８３記載の核酸分子。
  103. 【請求項１０３】 前記核酸が少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む，請求
    項８３記載の核酸分子。
  104. 【請求項１０４】 前記核酸が少なくとも１つのリン酸骨格修飾を含む，請
    求項８３記載の核酸分子。
  105. 【請求項１０５】 請求項８３記載の核酸分子を含む哺乳動物細胞であって
    ，生きているヒトではない哺乳動物細胞。
  106. 【請求項１０６】 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項１０５記載
    の哺乳動物細胞。
  107. 【請求項１０７】 細胞においてＮＯＧＯ活性を低下させる方法であって，
    前記細胞を前記阻害に適当な条件下で請求項８４記載の核酸分子と接触させる工
    程を含む方法。
  108. 【請求項１０８】 ＮＯＧＯのレベルに関連する状態を有する患者を治療す
    る方法であって，前記患者の細胞を前記治療に適当な条件下で請求項８４記載の
    核酸分子と接触させることを含む方法。
  109. 【請求項１０９】 前記治療に適当な条件下で１またはそれ以上の薬剤治療
    を使用することをさらに含む，請求項１０８記載の方法。
  110. 【請求項１１０】 ＮＯＧＯ遺伝子のＲＮＡを切断する方法であって，請求
    項８４記載の核酸分子を前記ＲＮＡの切断に適当な条件下で前記ＲＮＡと接触さ
    せることを含む方法。
  111. 【請求項１１１】 前記切断が二価カチオンの存在下で行われる，請求項１
    １０記載の方法。
  112. 【請求項１１２】 前記二価カチオンがＭｇ2+である，請求項１１１記載の
    方法。
  113. 【請求項１１３】 前記核酸がキャップ構造を含み，キャップ構造は５’末
    端，または３’末端，または５’末端および３’末端の両方に存在する，請求項
    ８３記載の核酸分子。
  114. 【請求項１１４】 前記ハンマーヘッドモチーフが，配列番号３９７４−４
    ５２３からなる群より選択される配列を含む，請求項９２記載の酵素的核酸分子
    。
  115. 【請求項１１５】 前記ＮＣＨモチーフが，配列番号４５２４−５３３７か
    らなる群より選択される配列を含む，請求項９６記載の酵素的核酸分子。
  116. 【請求項１１６】 前記Ｇ−切断剤モチーフが，配列番号５３３８−５５７
    １からなる群より選択される配列を含む，請求項９７記載の酵素的核酸分子。
  117. 【請求項１１７】 前記ＤＮＡｚｙｍｅが，配列番号５９８８−６８４０か
    らなる群より選択される配列を含む，請求項９８記載の酵素的核酸分子。
  118. 【請求項１１８】 前記核酸分子がハンマーヘッドモチーフのものである，
    請求項１０７記載の方法。
  119. 【請求項１１９】 前記核酸分子がＤＮＡｚｙｍｅである，請求項１０７記
    載の方法。
  120. 【請求項１２０】 少なくとも１つの請求項８３記載の核酸分子をコードす
    る核酸配列を，その核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクター。
  121. 【請求項１２１】 請求項１２０記載の発現ベクターを含む哺乳動物細胞で
    あって，生きているヒトではない，哺乳動物細胞。
  122. 【請求項１２２】 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項１２１記載
    の哺乳動物細胞。
  123. 【請求項１２３】 前記核酸分子がハンマーヘッドモチーフのものである，
    請求項１２０記載の発現ベクター。
  124. 【請求項１２４】 前記発現ベクターが，ＮＯＧＯ遺伝子のＲＮＡに相補的
    なアンチセンス核酸分子の配列をさらに含む，請求項１２０記載の発現ベクター
    。
  125. 【請求項１２５】 前記発現ベクターが少なくとも２つの請求項８３記載の
    核酸分子をコードする配列を含み，これは同じであっても異なっていてもよい，
    請求項１２０記載の発現ベクター。
  126. 【請求項１２６】 前記発現ベクターが，ＮＯＧＯ遺伝子のＲＮＡに相補的
    なアンチセンス核酸分子をコードする配列をさらに含む，請求項１２５記載の発
    現ベクター。
  127. 【請求項１２７】 ＣＮＳ損傷および脳血管偶発症候からなる群より選択さ
    れる状態を治療する方法であって，患者に請求項８３記載の核酸分子を前記治療
    に適当な条件下で投与する工程を含む方法。
  128. 【請求項１２８】 ＣＮＳ損傷の前記治療が脊髄損傷の治療である，請求項
    １２７記載の方法。
  129. 【請求項１２９】 ＣＮＳ損傷および脳血管偶発症候（ＣＶＡ，発作）から
    なる群より選択される状態を治療する方法であって，患者に，請求項９１記載の
    アンチセンス核酸分子を前記治療に適当な条件下で投与する工程を含む方法。
  130. 【請求項１３０】 前記核酸分子がハンマーヘッドモチーフのものである，
    請求項１２７記載の方法。
  131. 【請求項１３１】 前記方法が，前記患者に核酸分子を１またはそれ以上の
    他の治療剤とともに投与することをさらに含む，請求項１２７記載の方法。
  132. 【請求項１３２】 前記核酸分子が，少なくとも５つのリボース残基；少な
    くとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾，および３’末端修飾を含む，請求項８３
    記載の核酸分子。
  133. 【請求項１３３】 前記核酸分子が，５’末端ヌクレオチドの少なくとも３
    つにおいてホスホロチオエート結合をさらに含む，請求項１３２記載の核酸分子
    。
  134. 【請求項１３４】 前記３’末端修飾が３’−３’反転無塩基成分である，
    請求項１３２記載の核酸分子。
  135. 【請求項１３５】 前記ＤＮＡｚｙｍｅが，少なくとも１０個の２’−Ｏ−
    メチル修飾および３’末端修飾を含む，請求項９８記載の酵素的核酸分子。
  136. 【請求項１３６】 前記ＤＮＡｚｙｍｅが，５’末端ヌクレオチドの少なく
    とも３つにホスホロチオエート結合をさらに含む，請求項１３５記載の酵素的核
    酸分子。
  137. 【請求項１３７】 前記３’末端修飾が３’−３’反転無塩基成分である，
    請求項１３５記載の酵素的核酸分子。
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