JP2005270096A - 特定生物種検出のためのデオキシリボザイム - Google Patents
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Abstract
【課題】少なくとも一種以上の生物種固有のＲＮＡを含有する試料において、該ＲＮＡを簡便、迅速かつ正確に検出、同定あるいは定量し、検体中の生物種を有利に解析する手段を提供する。
【解決手段】試薬として生物種に固有なＲＮＡの塩基配列部分を認識し、切断するデオキシリボザイムを使用して、ＲＮＡ含有試料に作用させ、デオキシリボザイムによる、試料中のＲＮＡ切断の有無及びその量を測定することにより、生物種に固有のＲＮＡの検出、同定、定量を行う。
【選択図】なし
【解決手段】試薬として生物種に固有なＲＮＡの塩基配列部分を認識し、切断するデオキシリボザイムを使用して、ＲＮＡ含有試料に作用させ、デオキシリボザイムによる、試料中のＲＮＡ切断の有無及びその量を測定することにより、生物種に固有のＲＮＡの検出、同定、定量を行う。
【選択図】なし
Description
本発明は、デオキシリボザイムを用いた、生物種に固有なRNAの検出、同定又は定量方法、及び同試薬に関する。
近年，ハンマーヘッドリボザイム，ヘアピンリボザイム，デオキシリボザイム（DNA酵素）と触媒機能を有する核酸分子がそれぞれ研究されている。なかでもデオキシリボザイムは構造が簡単で安定性が高く、安価であるという理由から、バイオテクノロジーにおける興味深い新たな手法として，研究が進んでいる。
デオキシリボザイムを人工的に設計し、RNAを塩基配列特異的に切断することで，細胞の遺伝子発現を自在に制御できることとなり、多くの遺伝子病やウィルス病などの克服が期待されている。実際デオキシリボザイムの医薬への応用についてはこれまでに数々の報告がある（特許文献１〜３参照）。
デオキシリボザイムを人工的に設計し、RNAを塩基配列特異的に切断することで，細胞の遺伝子発現を自在に制御できることとなり、多くの遺伝子病やウィルス病などの克服が期待されている。実際デオキシリボザイムの医薬への応用についてはこれまでに数々の報告がある（特許文献１〜３参照）。
これまでの研究においては，デオキシリボザイムの応用は遺伝子発現の制御という観点から、生物細胞内においてメッセンジャー RNA を切断する研究が大部分であった。近年になり、センサーチップ上に固定化されたデオキシリボザイムの触媒活性を利用し、標的 RNA の二次構造を解析する手法が報告された（特許文献４参照）。しかしながら、現在まで，生物種に固有な RNA 配列を標的核酸に用いることにより、試料中に存在する生物種の検出、同定、定量を行った報告はない。
また、生物種に特異的な16SrRNA配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを設けた生体分子相互作用センサーチップを用いて、試料中の生物種の同定、定量を行う方法が開発されている (非特許文献１参照)。
しかしながら、この方法は、ハイブリダイズの有無でシグナルを検出しているため，擬陽性が多く検出されるのみならず、定量性に欠けるという問題点を有していた。
しかしながら、この方法は、ハイブリダイズの有無でシグナルを検出しているため，擬陽性が多く検出されるのみならず、定量性に欠けるという問題点を有していた。
本発明の課題は、少なくとも一種以上の生物種固有のＲＮＡを含有する試料において、該ＲＮＡを簡便、迅速かつ正確に検出、同定あるいは定量できる手段を提供するものである。
本発明者らは，上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、試薬として生物種に固有なＲＮＡの塩基配列部分を認識し、切断するデオキシリボザイムを使用して、ＲＮＡ含有試料に作用させ、デオキシリボザイムによる、試料中のＲＮＡ切断の有無及びその量を測定することにより、生物種に固有のＲＮＡの検出、同定、定量を、簡便、迅速かつ正確に行うことが可能であるとともに、この手段が特定の生物種の検出、同定等において極めて有効であることを見いだし、本発明を完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１６）に示すとおりである。
（１）生物種に固有なＲＮＡの塩基配列を認識して切断するデオキシリボザイムを、少なくとも一種以上の生物種由来のＲＮＡ断片を含有する試料と接触させ、該ＲＮＡ断片の切断の有無及びその量を測定することを特徴とする、生物種に固有なＲＮＡの検出、同定又は定量方法。
（２）切断段片と未切断片の比を算出し、試料中の生物種に固有なＲＮＡを定量することを特徴とする上記（１）の方法。
（３）生物種に固有なＲＮＡの塩基配列を認識して切断するデオキシリボザイムを複数種、同時に用いることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）試料中のＲＮＡ断片が増幅されたものであることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）ＲＮＡ断片の増幅方法がNASBA法，TMA法，TRC法，3SR法のいずれかの方法である、上記（４）に記載の検出方法。
（６）デオキシリボザイムが固相単体上に固定化されていることを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）固相担体が生体分子相互作用測定用センサーのチップである上記（６）に記載の方法。
（８）生体高分子相互作用測定用センサーのチップが表面プラズモン共鳴(SPR) センサーチップである上記（７）に記載の方法。
（９）デオキシリボザイムの１または２以上のヌクレオチドが2’-O-メチル化されていることを特徴とする、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）デオキシリボザイムの１または２以上のヌクレオチドがPNA（peptide nucleic acid）を含むこと特徴とする、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１１）デオキシリボザイムの１または２以上のヌクレオチドがLNA（locked nucleic acid）を含むこと特徴とする，上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１２）デオキシリボザイムを作用させたＲＮＡ断片含有試料とデオキシリボザイムを作用させなかった同試料との電気泳動パターンを比較することを含む、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法を含むことを特徴とする、生物種の検出、同定又は定量方法。
（１４）試料中のＲＮＡにおける生物種に固有な塩基配列を認識し切断するデオキシリボザイムを含有することを特徴とする、生物種に固有なＲＮＡの検出、同定又は定量試薬。
（１５）各々認識する塩基配列が異なる複数種のデオキシリボザイムが含有されていることを特徴とする、上記（１３）に記載の試薬。
（１６）上記（１４）又は（１５）に記載のデオキシリボザイムを含有することを特徴とする、特定生物種の検出、同定又は定量試薬。
（１）生物種に固有なＲＮＡの塩基配列を認識して切断するデオキシリボザイムを、少なくとも一種以上の生物種由来のＲＮＡ断片を含有する試料と接触させ、該ＲＮＡ断片の切断の有無及びその量を測定することを特徴とする、生物種に固有なＲＮＡの検出、同定又は定量方法。
（２）切断段片と未切断片の比を算出し、試料中の生物種に固有なＲＮＡを定量することを特徴とする上記（１）の方法。
（３）生物種に固有なＲＮＡの塩基配列を認識して切断するデオキシリボザイムを複数種、同時に用いることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）試料中のＲＮＡ断片が増幅されたものであることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）ＲＮＡ断片の増幅方法がNASBA法，TMA法，TRC法，3SR法のいずれかの方法である、上記（４）に記載の検出方法。
（６）デオキシリボザイムが固相単体上に固定化されていることを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）固相担体が生体分子相互作用測定用センサーのチップである上記（６）に記載の方法。
（８）生体高分子相互作用測定用センサーのチップが表面プラズモン共鳴(SPR) センサーチップである上記（７）に記載の方法。
（９）デオキシリボザイムの１または２以上のヌクレオチドが2’-O-メチル化されていることを特徴とする、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）デオキシリボザイムの１または２以上のヌクレオチドがPNA（peptide nucleic acid）を含むこと特徴とする、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１１）デオキシリボザイムの１または２以上のヌクレオチドがLNA（locked nucleic acid）を含むこと特徴とする，上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１２）デオキシリボザイムを作用させたＲＮＡ断片含有試料とデオキシリボザイムを作用させなかった同試料との電気泳動パターンを比較することを含む、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法を含むことを特徴とする、生物種の検出、同定又は定量方法。
（１４）試料中のＲＮＡにおける生物種に固有な塩基配列を認識し切断するデオキシリボザイムを含有することを特徴とする、生物種に固有なＲＮＡの検出、同定又は定量試薬。
（１５）各々認識する塩基配列が異なる複数種のデオキシリボザイムが含有されていることを特徴とする、上記（１３）に記載の試薬。
（１６）上記（１４）又は（１５）に記載のデオキシリボザイムを含有することを特徴とする、特定生物種の検出、同定又は定量試薬。
本発明によれば、放射性同位元素や、蛍光色素による標識を必要としないため、より簡便で迅速な解析が可能となる。またそれらを測定するための特殊な機器も必要としないため、経済的にも有利である。
本発明においてデオキシリボザイムとは、一本鎖RNAに対して配列特異的切断活性を有するDNAを意味しているが、そのサイズは特に限定されない。
本発明に特に好適に利用可能なデオキシリボザイムとしては、例えば図１に示した8-17 DNA enzymeや10-23 DNA enzymeをあげることができる (Santro, S. W., and Joyce, G. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4262-4266)。これらデオキシリボザイムは、ループ部分に触媒活性部位が存在しており、その前後の塩基配列（認識部位）で標的RNAにハイブリダイズして，二価の陽イオン存在下で標的RNAの図１に示された矢印の位置で切断することができる。
本発明に特に好適に利用可能なデオキシリボザイムとしては、例えば図１に示した8-17 DNA enzymeや10-23 DNA enzymeをあげることができる (Santro, S. W., and Joyce, G. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4262-4266)。これらデオキシリボザイムは、ループ部分に触媒活性部位が存在しており、その前後の塩基配列（認識部位）で標的RNAにハイブリダイズして，二価の陽イオン存在下で標的RNAの図１に示された矢印の位置で切断することができる。
本発明で使用するデオキシリボザイムのサイズは触媒活性を有するものであれば特に限定はされないが、基質RNA配列の認識の特異性を向上させる上で、認識部位は１０〜３０塩基であることが好ましい。上記標的RNAとはデオキシリボザイムを酵素としてみた場合の基質に相当するRNAである。
本発明においては、使用するデオキシリボザイムは、解析対象の生物種のＲＮＡにおいて、該生物種に固有な塩基配列部分に基づき設計する。標的ＲＮＡの塩基配列が全て明らかになっている必要はない。また、分析対象となる試料中のＲＮＡがどのような生物種由来のものか明らかでなくとも、該試料に上記のように設計されたデオキシリボザイムを作用させることにより、試料中に分析対象のＲＮＡが存在すれば、その切断断片の存在の有無から、これを保有している生物種の存在を確認でき、さらにこれらの同定、定量も行うことができる。
本発明においては、使用するデオキシリボザイムは、解析対象の生物種のＲＮＡにおいて、該生物種に固有な塩基配列部分に基づき設計する。標的ＲＮＡの塩基配列が全て明らかになっている必要はない。また、分析対象となる試料中のＲＮＡがどのような生物種由来のものか明らかでなくとも、該試料に上記のように設計されたデオキシリボザイムを作用させることにより、試料中に分析対象のＲＮＡが存在すれば、その切断断片の存在の有無から、これを保有している生物種の存在を確認でき、さらにこれらの同定、定量も行うことができる。
すなわち、本発明の手法によれば、試料中のＲＮＡの精製の有無を問わず、試料中に種々のＲＮＡが混在していてもよい。例えば複合微生物系（複数微生物のRNAもしくは遺伝子DNAの混在系，土壌中の核酸，遺伝子など）における測定を目的とした試料、あるいは細菌、ウィルスなどのRNAが含まれる血清、尿、各種生体細胞や生体組織の培養液などを試料として用いても、使用したデオキシリボザイムの作用に基づき切断されたＲＮＡ断片の解析を行うことにより、分析対象の標的ＲＮＡの存在を正確に検出し、同定、定量でき、これにより生物種の解析を行うことができる。
本発明においては、試料中に存在する各生物種固有のＲＮＡのうち、単一の生物種固有のＲＮＡのみを検出しようとする場合においては、通常、解析対象の生物種に固有の塩基配列部分に基づき設計したデオキシリボザイムを一種類用いればよいが、さらにその確度を上げるためには、一種類の標的RNAに塩基配列の異なった複数部位を切断するデオキシリボザイムを使用することもできる。
本発明において複数種の標的RNAが存在する場合は、一種類以上のデオキシリボザイムを同時に用いることができ、これにより解析効率が向上する。
また、例えば、互いに類似する一群の生物種を検出する場合においては、これら一群の生物種のＲＮＡに共通に存在する配列を切断するように設計したデオキシリボザイムを用いてもよい。
本発明において複数種の標的RNAが存在する場合は、一種類以上のデオキシリボザイムを同時に用いることができ、これにより解析効率が向上する。
また、例えば、互いに類似する一群の生物種を検出する場合においては、これら一群の生物種のＲＮＡに共通に存在する配列を切断するように設計したデオキシリボザイムを用いてもよい。
本発明に使用されるデオキシリボザイムは、オリゴデオキシリボヌクレオチドから構成されるが，これらは化学修飾を受けたものでも良い。具体的にはデオキシリボースの2’位の水素をO-メチル基に置換（2’-O-メチル化）したものが用いられる。またデオキシリボース全体を置換したLNA (locked nucleic acid)を用いても良い。
本発明において使用されるデオキシリボザイムは、核酸骨格の骨格構造であるデオキシリボース-リン酸骨格をグリシンに置換した骨格を持つPNA (peptide nucleic acid) を用いても良い。
本発明において使用されるデオキシリボザイムは、核酸骨格の骨格構造であるデオキシリボース-リン酸骨格をグリシンに置換した骨格を持つPNA (peptide nucleic acid) を用いても良い。
前記のLNAは公知の方法 (Wengel, J. (1998) Acc. Chem. Res. 32, 301-310) で合成できる。2’-O-メチル化はほとんどのDNA受託合成会社に受注が可能である。またPNAはグライナージャパンが受託合成を行っているので容易に入手できる。このような化学修飾を、オリゴヌクレオチドに施すことにより，標的核酸との親和性が高まり、デオキシリボザイムと標的RNAのハイブリダイゼーションが安定化し、切断効率が増加する。
本発明におけるＲＮＡ含有試料及び生物種の解析は、例えば以下のように行うことができる。ある環境から採取した少なくとも一種以上の生物種を含む検体から、ＲＮＡを抽出し、少なくとも一種以上のＲＮＡを含む試料を調製する。ついで、このRNAを含む試料に、解析対象の生物種におけるＲＮＡの固有の塩基配列部分に基づき設計したデオキシリボザイムを作用させる。この場合、好ましくは、RNA含有試料を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液中で、より好ましくはマグネシウムイオンを添加した前記溶液中で上記デオキシリボザイムを作用させると良い。
反応後、試料中のRNAをゲル電気泳動によって分離し、核酸染色試薬によってそれらのゲル上の位置を確認する。デオキシリボザイムを作用させた場合の試料の電気泳動パターンと、デオキシリボザイムを作用させない場合の試料の電気泳動パターンを比較して、前者の電気泳動パターンと後者の電気泳動パターンに差がなければ、上記生物種の検体には、解析対象の生物種は含まれていないと判断できる。また、後者の電気泳動パターンにおいて、前者の電気泳動パターンにないバンドが検出されれば、上記検体には解析対象の生物種が含まれていたことが分かり、検体中の生物種の検出、同定が行える。さらに、該バンドのＲＮＡ塩基配列を調べれば、作用させたデオキシリボザイムによる切断物であることも確認できる。また、この場合において、前者の電気パターンより、後者の戦記泳動パターンのバンドにおいてその濃度が低いかあるいは消滅したものがあれば、該バンドに対応するＲＮＡが切断されたことが分かる。
本発明においてRNAの切断片を解析する装置は、バンドの大きさ、濃度を測定できればどのような装置でも良いが、例えばGel Doc (BIO-RAD) を挙げることができる。また分離、解析を迅速に行う装置として2100 bioanalyzer (Agilent Technologies) を特に好適なものとして挙げることができる。
本発明において、これら装置を用いることにより、複数種の標的RNAが存在する場合において、単一種のデオキシリボザイムを作用させた後、未切断片と切断片の比を計算することにより、試料中の全RNA断片に占める，デオキシリボザイムで設計された任意の配列を保有するRNA断片の割合を計算することができる。この割合は上記検体中の解析対象の生物種の割合を反映するので、これにより、解析対象の生物種の定量も行える。
本発明において、これら装置を用いることにより、複数種の標的RNAが存在する場合において、単一種のデオキシリボザイムを作用させた後、未切断片と切断片の比を計算することにより、試料中の全RNA断片に占める，デオキシリボザイムで設計された任意の配列を保有するRNA断片の割合を計算することができる。この割合は上記検体中の解析対象の生物種の割合を反映するので、これにより、解析対象の生物種の定量も行える。
本発明の前記の解析方法及びその解析試薬は、医学、分子生物学、農学等の各分野で利用できる。また、複合微生物系，共生微生物系といわれ，各種微生物が混在するか，もしくは少なくとも一種類以上の微生物が他の動物、植物由来の細胞と共に混在して相互に単離できない微生物等に好適に利用できる。
また、本発明のデオキシリボザイムの合成においては、複合微生物系または共生微生物系における特定菌株の5S rRNA, 16S rRNA, もしくは23S rRNA，さらにそれら rRNA 配列のスペーサー領域の配列に基づきその塩基配列を設計することができる。このデオキシリボザイムを使用することにより，当該系における特定菌株の検出、同定及び存在量を測定することができる。
また、本発明のデオキシリボザイムの合成においては、複合微生物系または共生微生物系における特定菌株の5S rRNA, 16S rRNA, もしくは23S rRNA，さらにそれら rRNA 配列のスペーサー領域の配列に基づきその塩基配列を設計することができる。このデオキシリボザイムを使用することにより，当該系における特定菌株の検出、同定及び存在量を測定することができる。
デオキシリボザイムの標的RNAの切断に基づいて発生するシグナルの変化を測定することによっても、任意のRNA配列の存在量を解析することもできる。シグナル変化を測定するための手段としては、例えば表面プラズモン共鳴 (SPR)法，水晶発振子マイクロバランス (QCM) 法があげられるが、これらの手段に限定されることはない。
RNAの切断片の検出，定量を簡便に行うために生体高分子相互作用測定用センサーチップにデオキシリボザイムを固定してもよい。なおこの場合，標的RNAの標識は一般的には不要である。
RNAの切断片の検出，定量を簡便に行うために生体高分子相互作用測定用センサーチップにデオキシリボザイムを固定してもよい。なおこの場合，標的RNAの標識は一般的には不要である。
表面プラズモン共鳴 (SPR) 法で用いるセンサーチップとしては，通常の表面プラズモン共鳴装置用基板を用いることができ、市販されているものを用いることができる。
本発明において、デオキシリボザイムを固相担体に固定化する方法は特に限定されず、固定化触媒の製造に利用可能な固定化手段であればいかなるものを用いても良い。
本方法で標的RNAをセンサーチップに固定化したデオキシリボザイムに接触させる方法は特に限定されない．本方法の各工程は，市販の表面プラズモン共鳴装置、例えばBIAcore3000 (Pharmacia Biosensor) などを用いて行うことができる。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本発明において、デオキシリボザイムを固相担体に固定化する方法は特に限定されず、固定化触媒の製造に利用可能な固定化手段であればいかなるものを用いても良い。
本方法で標的RNAをセンサーチップに固定化したデオキシリボザイムに接触させる方法は特に限定されない．本方法の各工程は，市販の表面プラズモン共鳴装置、例えばBIAcore3000 (Pharmacia Biosensor) などを用いて行うことができる。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
標的RNA配列としてEscherichia coli K-12 MG1655 株（以下 MG1655 株）とPseudomonas putida KT2440株（以下 KT2440 株）由来の全RNAを用い、デオキシリボザイムを作用させ、特異的に切断した。
標的RNA配列としてEscherichia coli K-12 MG1655 株（以下 MG1655 株）とPseudomonas putida KT2440株（以下 KT2440 株）由来の全RNAを用い、デオキシリボザイムを作用させ、特異的に切断した。
（１）KT2440 株の16S rRNAを特異的に切断するデオキシリボザイムを設計した。表１にその配列を示す。太線で示した配列は触媒活性部位である。オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成、精製は外部受託により行った。なお、表１の各塩基配列を有するデオキシリボザイムの標的RNAにおける切断部位を図２に示した。
（２）MG1655株と KT2440株をLB培地で培養し、Fast RNA Pro Blue Kit (Qbiogene) を用いて培養液から16S rRNAを含む全RNAを抽出し、これを試料とした。
（３）デオキシリボザイムによる標的配列切断反応は50 mM Tris-Cl (pH 8.0) 及び20 mM MgCl2を含む緩衝液中で500 ngの標的RNA及び 5 μMデオキシリボザイムの条件下、37 ℃にて１時間反応を行った。100 mM EDTA 及び 8M 尿素を混合して切断反応を終結させた。
（３）デオキシリボザイムによる標的配列切断反応は50 mM Tris-Cl (pH 8.0) 及び20 mM MgCl2を含む緩衝液中で500 ngの標的RNA及び 5 μMデオキシリボザイムの条件下、37 ℃にて１時間反応を行った。100 mM EDTA 及び 8M 尿素を混合して切断反応を終結させた。
（４）標的 RNA 及び切断産物を 5% ポリアクリルアミド／8M 尿素変性ゲル上で電気泳動することによって分離した。各レーンの反応系を以下の表２に示す。
影装置 Gel Doc (BIO-RAD) を用いて染色したポリアクリルアミドゲルを撮影した。
その結果を図３に示した。予測される位置に切断片が観察され，目的の位置で標的 RNA を切断できることが示された。また MG1655 株由来の全 RNA を標的 RNA として用いた場合には切断片が観察されなかった。
その結果を図３に示した。予測される位置に切断片が観察され，目的の位置で標的 RNA を切断できることが示された。また MG1655 株由来の全 RNA を標的 RNA として用いた場合には切断片が観察されなかった。
実施例２
標的 RNA 配列として MG1655と KT2440株由来の 16S rRNA 断片を用い、デオキシリボザイムの触媒活性について定量的解析を行った。
（１）MG1655と KT2440株を LB 寒天培地で培養し、１白金耳を滅菌蒸留水中に懸濁した。
標的 RNA 配列として MG1655と KT2440株由来の 16S rRNA 断片を用い、デオキシリボザイムの触媒活性について定量的解析を行った。
（１）MG1655と KT2440株を LB 寒天培地で培養し、１白金耳を滅菌蒸留水中に懸濁した。
（２）菌体懸濁液中に含まれる16S rRNA 遺伝子 (16S rDNA) を鋳型とし、PCR により各菌株由来の 16S rDNA 断片を増幅した。PCR は以下の条件で行った。装置は icycler （BIO-RAD）を使用した。用いたプライマーの配列を表３にしめす。
・ 変性 95 ℃, 1 min
・ アニーリング 55 ℃, 1 min
・ 伸長 72 ℃, 1 min
・ Taq ポリメラーゼ：Taq Ampli Gold (Roche Applied Biotech.), 5 U
・ プライマー添加濃度：1 μM
・ dNTP 添加濃度：200 nM
・ 鋳型核酸：菌体懸濁液 1 μl
（３）増幅産物を QIA quick PCR purification Kit (QIAGEN) を用いて精製した。
（４）T7 RiboMaxTM Express Large Scale RNA Production System (Promega) を使用して 37 ℃で 30 分間 In vitro 転写反応を行い，16S rRNA 断片を得た。反応は以下の条件で行った。
・ 鋳型 DNA：1 μg
・ Ribomax T7 Express buffer：10 μl
・ Ribomax T7 Enzyme Mix：2 μl
（５）転写産物をPurification with RNeasy MinElute Cleanup Kit を用いて精製し，これを標的 RNA とした．
（６）KT2440 株と MG1655 株の 16S rRNA を合計で 1000 ng になるように表４の割合で混合し、デオキシリボザイム切断反応を行った。
・ アニーリング 55 ℃, 1 min
・ 伸長 72 ℃, 1 min
・ Taq ポリメラーゼ：Taq Ampli Gold (Roche Applied Biotech.), 5 U
・ プライマー添加濃度：1 μM
・ dNTP 添加濃度：200 nM
・ 鋳型核酸：菌体懸濁液 1 μl
（３）増幅産物を QIA quick PCR purification Kit (QIAGEN) を用いて精製した。
（４）T7 RiboMaxTM Express Large Scale RNA Production System (Promega) を使用して 37 ℃で 30 分間 In vitro 転写反応を行い，16S rRNA 断片を得た。反応は以下の条件で行った。
・ 鋳型 DNA：1 μg
・ Ribomax T7 Express buffer：10 μl
・ Ribomax T7 Enzyme Mix：2 μl
（５）転写産物をPurification with RNeasy MinElute Cleanup Kit を用いて精製し，これを標的 RNA とした．
（６）KT2440 株と MG1655 株の 16S rRNA を合計で 1000 ng になるように表４の割合で混合し、デオキシリボザイム切断反応を行った。
（６）デオキシリボザイムによる標的配列切断反応は50 mM Tris-Cl (pH 8.0) 及び20 mM MgCl2を含む緩衝液中で 1000 ng の標的RNA及び 10 μMデオキシリボザイム (KT629) の条件下、37 ℃にて１時間反応を行った。100 mM EDTA を混合して切断反応を終結させた。
（７）標的 RNA 及び切断産物を 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies) を用いて分離、定量を行った。
図４には，標的 RNAである KT2440 が 0 % の反応系の電気泳動結果を示した。基質である 16S rRNA のピーク S のみが観察された。図５に KT2440 を 75 % の割合で混合した反応系の電気泳動結果を示した。基質である 16S rRNA のピーク S の他に切断片 P1 と P2 が観察された。
図４には，標的 RNAである KT2440 が 0 % の反応系の電気泳動結果を示した。基質である 16S rRNA のピーク S のみが観察された。図５に KT2440 を 75 % の割合で混合した反応系の電気泳動結果を示した。基質である 16S rRNA のピーク S の他に切断片 P1 と P2 が観察された。
デオキシリボザイムの切断効率は下記式を用いて計算した．
切断効率 (%) = （P1 + P2） /（ P1 + P2 + S）
（ここで，P1, P2, S はそれぞれのピークの面積を示す）
それぞれの混合比率で行った反応の電気泳動結果より、切断片の定量を行った．これらの結果を、横軸が実験開始時に混合した標的 RNA のうち、KT2440 株由来 16S rRNA の存在比，縦軸が測定を行った後の解析結果より計算された KT2440株由来 16S rRNA の存在比を表すグラフにプロットした。図６に示すように，良好な相関関係が得られた。
切断効率 (%) = （P1 + P2） /（ P1 + P2 + S）
（ここで，P1, P2, S はそれぞれのピークの面積を示す）
それぞれの混合比率で行った反応の電気泳動結果より、切断片の定量を行った．これらの結果を、横軸が実験開始時に混合した標的 RNA のうち、KT2440 株由来 16S rRNA の存在比，縦軸が測定を行った後の解析結果より計算された KT2440株由来 16S rRNA の存在比を表すグラフにプロットした。図６に示すように，良好な相関関係が得られた。
〔実施例３〕
標的RNA配列として日和見感染の起因菌である Escherichia coli（以下E. coli），Pseudomonas aeruginosa（以下 P. aeruginosa），Enterobacter cloacae（以下 E. cloacae），Klebsiella pneumoniae（以下K. pneumoniae），Enterococcus faecalis（以下 E. faecalis），Staphylococcus aureus（以下S. aureus），Staphylococcus epidermidis（以下 S. epidermidis），Staphylococcus haemolyticus（以下S. haemolyticus），Staphylococcus hominis（以下 S. hominis）由来の全RNAを用い、以下の（１）〜（４）の手順により、それぞれの生物種に特異的なデオキシリボザイムによる切断実験を行った。
標的RNA配列として日和見感染の起因菌である Escherichia coli（以下E. coli），Pseudomonas aeruginosa（以下 P. aeruginosa），Enterobacter cloacae（以下 E. cloacae），Klebsiella pneumoniae（以下K. pneumoniae），Enterococcus faecalis（以下 E. faecalis），Staphylococcus aureus（以下S. aureus），Staphylococcus epidermidis（以下 S. epidermidis），Staphylococcus haemolyticus（以下S. haemolyticus），Staphylococcus hominis（以下 S. hominis）由来の全RNAを用い、以下の（１）〜（４）の手順により、それぞれの生物種に特異的なデオキシリボザイムによる切断実験を行った。
（１）各種菌株の 16S rRNA を特異的に切断するデオキシリボザイムを設計した。表５にその配列を示す。太線で示した配列は触媒活性部位である。
Eco，Pae，Ecl，Kpn，Efa，Sau，Sep，Sha，Sho はそれぞれ E. coli，P. aeruginosa，E. cloacae，K. pneumoniae，E. faecalis，S. aureus，S. epidermidis，S. haemolyticus，S. hominisを特異的に切断するデオキシリボザイムである。これらオリゴヌクレオチドの合成，精製は外部受託により行った。
Eco，Pae，Ecl，Kpn，Efa，Sau，Sep，Sha，Sho はそれぞれ E. coli，P. aeruginosa，E. cloacae，K. pneumoniae，E. faecalis，S. aureus，S. epidermidis，S. haemolyticus，S. hominisを特異的に切断するデオキシリボザイムである。これらオリゴヌクレオチドの合成，精製は外部受託により行った。
（２）各菌株を NB 培地で培養し，Fast RNA Pro Blue Kit(Qbiogene)を用いて培養液から 16S rRNA を含む全 RNA を抽出し、これを試料とした。
（３）デオキシリボザイムによる標的配列切断反応は 50 mM Tris-Cl (pH8.0)及び 20 mM MgCl2 を含む緩衝液中で 1 ug の全 RNA 及び10 μMデオキシリボザイムの条件下、37 ℃ にて１ 時間反応を行った。100 mM EDTA を混合して切断反応を終結させた。
（４）標的 RNA 及び切断産物を 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies)を用いて分離した。表６にそれらの結果を示す。各生物種に上記特異的なデオキシリボザイムを作用させた結果、生物種に特異的な切断片が得られた。また、これらの結果から明らかなように、本発明の手段により、試料中に含まれる病原菌を特定することが可能となる。
（３）デオキシリボザイムによる標的配列切断反応は 50 mM Tris-Cl (pH8.0)及び 20 mM MgCl2 を含む緩衝液中で 1 ug の全 RNA 及び10 μMデオキシリボザイムの条件下、37 ℃ にて１ 時間反応を行った。100 mM EDTA を混合して切断反応を終結させた。
（４）標的 RNA 及び切断産物を 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies)を用いて分離した。表６にそれらの結果を示す。各生物種に上記特異的なデオキシリボザイムを作用させた結果、生物種に特異的な切断片が得られた。また、これらの結果から明らかなように、本発明の手段により、試料中に含まれる病原菌を特定することが可能となる。
〔実施例４〕
標的 RNA として複数種の生物種由来の全 RNA を用い、複数種のデオキシリボザイムを作用させ、切断片の解析を行った。表７に使用した標的ＲＮＡとデオキシリボザイムの組合せを示す。
解析手順は、以下の（１）〜（３）に示されるとおりである。
標的 RNA として複数種の生物種由来の全 RNA を用い、複数種のデオキシリボザイムを作用させ、切断片の解析を行った。表７に使用した標的ＲＮＡとデオキシリボザイムの組合せを示す。
解析手順は、以下の（１）〜（３）に示されるとおりである。
（１）各菌株を NB 培地で培養し、Fast RNA Pro Blue Kit(Qbiogene)を用いて培養液から 16S rRNA を含む全 RNA を抽出し、これを試料とした。
（２）デオキシリボザイムによる標的配列切断反応は 50 mM Tris-Cl (pH8.0)及び 20 mM MgCl2 を含む緩衝液中で合計 1 ug の全 RNA 及び10 μMデオキシリボザイムの条件下、37 ℃ にて １ 時間反応を行った。100mM EDTA を混合して切断反応を終結させた。
（３）標的 RNA 及び切断産物を 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies)を用いて分離した。
図７、図８にそれらの結果を示す。生物種特異的なデオキシリボザイムを複数種、同時に用いることにより、複数種の標的 RNA が混在している試料中において、複数の生物種固有のピークが検出された。
（２）デオキシリボザイムによる標的配列切断反応は 50 mM Tris-Cl (pH8.0)及び 20 mM MgCl2 を含む緩衝液中で合計 1 ug の全 RNA 及び10 μMデオキシリボザイムの条件下、37 ℃ にて １ 時間反応を行った。100mM EDTA を混合して切断反応を終結させた。
（３）標的 RNA 及び切断産物を 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies)を用いて分離した。
図７、図８にそれらの結果を示す。生物種特異的なデオキシリボザイムを複数種、同時に用いることにより、複数種の標的 RNA が混在している試料中において、複数の生物種固有のピークが検出された。
本発明の前記の解析方法は医学，分子生物学，農学等の各分野で利用できる。複合微生物系、共生微生物系といわれ，各種微生物が混在するかもしくは少なくとも一種類以上の微生物が他の動物，植物由来の細胞と共に混在して相互に単離できない微生物等に好適に利用できる。また，臨床微生物の分野において、病原性細菌の迅速検出に利用できる。
Claims (16)
- 生物種に固有なＲＮＡの塩基配列を認識して切断するデオキシリボザイムを、少なくとも一種以上の生物種由来のＲＮＡ断片を含有する試料と接触させ、該ＲＮＡ断片の切断の有無及びその量を測定することを特徴とする、生物種に固有なＲＮＡの検出、同定又は定量方法。
- 切断段片と未切断片の比を算出し、試料中の生物種に固有なＲＮＡを定量することを特徴とする請求項１の方法。
- 生物種に固有なＲＮＡの塩基配列を認識して切断するデオキシリボザイムを複数種、同時に用いることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
- 試料中のＲＮＡ断片が増幅されたものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかの方法。
- ＲＮＡ断片の増幅方法がNASBA法，TMA法，TRC法，3SR法のいずれかの方法である、請求項４に記載の検出方法。
- デオキシリボザイムが固相単体上に固定化されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 固相担体が生体分子相互作用測定用センサーのチップである請求項６に記載の方法。
- 生体高分子相互作用測定用センサーのチップが表面プラズモン共鳴(SPR)センサーチップである請求項７に記載の方法。
- デオキシリボザイムの１または２以上のヌクレオチドが2’-O-メチル化されていることを特徴とする，請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
- デオキシリボザイムの１または２以上のヌクレオチドがPNA（peptide nucleic acid）を含むこと特徴とする，請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
- デオキシリボザイムの１または２以上のヌクレオチドがLNA（locked nucleic acid）を含むこと特徴とする，請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
- デオキシリボザイムを作用させたＲＮＡ断片含有試料とデオキシリボザイムを作用させなかった同試料との電気泳動パターンを比較することを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
- 請求項１〜１２のいずれかに記載の方法を含むことを特徴とする、生物種の検出、同定又は定量方法。
- 試料中のＲＮＡにおける生物種に固有な塩基配列を認識し切断するデオキシリボザイムを含有することを特徴とする、生物種に固有なＲＮＡの検出、同定又は定量試薬。
- 各々認識する塩基配列が異なる複数種のデオキシリボザイムが含有されていることを特徴とする、請求項１３に記載の試薬。
- 請求項１４又は１５に記載のデオキシリボザイムを含有することを特徴とする、生物種の検出、同定又は定量試薬。
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