FR2884522A1

FR2884522A1 - Methode d'inhibition de la traduction et/ou la replication d'une sequence d'arn par multimerisation d'une de ses regions d'arn non codant replie

Info

Publication number: FR2884522A1
Application number: FR0503883A
Authority: FR
Inventors: Larissa Balakireva
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-04-19
Filing date: 2005-04-19
Publication date: 2006-10-20
Also published as: WO2006111544A1

Abstract

La présente invention concerne une méthode d'inhibition de la fonctionnalité d'un ARN non codant replié ou de la traduction et/ou la réplication d'une séquence d'ARN comprenant un fragment d'ARN non codant replié, caractérisée en ce qu'on ajoute une quantité efficace d'une molécule induisant la multimérisation dudit ARN non codant replié ; ainsi qu'une méthode de criblage de molécules induisant l'inhibition de la fonctionnalité d'un ARN non codant replié, caractérisée en ce qu'on mesure la multimérisation de l'ARN non codant replié induite par ladite molécule. La présente invention concerne en outre l'utilisation d'au moins une molécule induisant la multimérisation d'un ARN non codant replié pour inhiber la fonctionnalité de cet ARN non codant replié, ou la traduction et/ou la réplication d'une séquence d'ARN comprenant cet ARN non codant replié, ainsi que l'utilisation d'au moins une molécule induisant la multimérisation d'un ARN non codant replié exprimé par un microorganisme pathogène pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une infection d'un mammifère par ce microorganisme pathogène.

Description

plus de 60 sous-types identifiés. Seules les régions terminales non

codantes sont très conservées avec environ 95% (5') et environ 98% (3') d'homologie observée entre les souches différentes (Gosert R et al. 2002. Trends in Molecular Medicine. Vol 8 (10): 476-482).

Les nucléotides 40-342 de la région 5' non codante et les 10 premiers nucléotides de la protéine core, soit au total les nucléotides 40-352, constituent un élément structurel et fonctionnel nommé l'IRES (pour Internai Ribosome Entry Site) qui joue un rôle primordial dans l'initiation de la traduction du VHC. Le modèle de sa structure secondaire, constituée de multiples tiges et boucles, est le résultat d'études biochimiques et de comparaisons phylogénétiques. D'après l'ensemble des résultats obtenus, la synthèse des protéines virales commence par la fixation directe et indépendante de la sous-unité ribosomale 40S sur le domaine IIIefIV et du complexe eIF3 sur le domaine Illabc de l'IRES (Sarnow P. 2003. Journal of Virology. 77(5) : 2801-2806).

La perception de l'ARN en tant que simple messager entre le patrimoine génétique qu'est l'ADN et les unités fonctionnelles que sont les protéines a été totalement révisée depuis la découverte de la fonctionnalité des ARN non codants. A ce jour la famille des ARN non codants englobe notamment les ARN ribosomaux; les ARN de transfert; les ARN cis-régulateurs de la traduction comme les régions 5' non traduites (dites régions 5' NTR) qui peuvent jouer le même rôle que les IRES; les régions 3' non traduites (dites régions 3' NTR) ; les ARN trans- régulateurs de la traduction comme les "micro RNA" ou les "small untranslated viral RNA" (petits ARN viraux non traduits) tels que les ARN associés aux virus ( virus associated RNA ) d'adénovirus et les ARN codés par le virus d'Epstein Bar (EBER = Epstein Bar virus Encoded RNA ) ; et les ARN régulateurs de l'épissage comme les "small nuclear RNA". La fonctionnalité de ces ARN est étroitement liée à leur structure secondaire et/ou tertiaire, qui est comparable à celle de protéines.

Le ciblage, ou targeting , de l'ARN représente donc une approche alternative au ciblage des protéines, se révélant très actuel quand l'exploitation de cibles protéiques devient difficile. En effet, malgré l'avancement de travaux de ciblage de protéines du virus de l'hépatite C (protéase, hélicase ou polymérase virales), cette voie de recherche est limitée par la variabilité des protéines virales entre les génotypes, alors que les deux parties non codantes 5' et 3' présentent une homologie très forte Par son rôle clé pour le cycle viral et son homologie, l'IRES représente donc une cible thérapeutique prometteuse pour le développement d'un médicament contre le VHC. Deux classes de molécules sont actuellement utilisées pour inactiver l'ARN: les RNA binders ( antisens ) et les RNA cleavers ( ribozymes et RNAi).

L'approche "antisens" est basée sur la spécificité et la haute affinité de l'interaction entre l'ARN viral ciblé et un oligonucléotide complémentaire. La dégradation de l'ARN viral par la Rnase H au sein de l'hétéroduplex ADN/ARN entraîne une inhibition de la synthèse des protéines virales. L'oligonucléotide ISIS 14803, constitué de 20 nucléotides et complémentaire à un fragment d'IRES autour du codon d'initiation est actuellement en phase clinique II.

Les RNAi sont une nouvelle approche de thérapie antivirale basée sur le phénomène de gene silencing , une forme ancestrale de l'immunité intracellulaire contre les pathogènes. Ces principes actifs sont de courts fragments d'ARN double brin formés par la digestion de l'ARN viral. Les RNAi synthétiques de 21-23 nucléotides provenant de l'IRES du VHC sont des inhibiteurs efficaces de la réplication virale et se trouvent actuellement en phase clinique.

La présente invention concerne une nouvelle technologie dénommée multimérisation des IRES ou en abrégé "MIRES".

Cette technologie permet de bloquer la traduction des séquences d'ARN portant des IRES.

A la différence des stratégies développées actuellement et qui ont été mentionnées précédemment, dans lesquelles on recherche à bloquer l'interaction des IRES ou des ARN des ligands divers ou de détruire les ARN correspondants, la présente invention entend renforcer l'interaction entre lesdits ARN en favorisant la création de multimères, notamment au niveau des IRES.

Il s'agit là d'une stratégie en rupture totale avec ce qui existe jusqu'à présent.

Les inventeurs ont mis en évidence l'existence de dimères d'IRES du virus de l'hépatite C (VHC), ainsi que la possibilité de multimériser ces IRES et par là même de réduire la traduction d'un ARN porteur de cet IRES.

En effet, l'analyse détaillée de la séquence nucléotidique de l'IRES du VHC a révélé la présence de plusieurs palindromes, donc de sites potentiels d'interactions homotypiques. Au sein de l'IRES replié ces séquences ne sont pas accessibles ou accessibles seulement en partie à cause de structures secondaires. Les inventeurs ont alors montré que l'exposition de l'un d'entre eux entraîne la multimérisation de l'IRES et peut être déclenchée notamment à l'aide d'oligonucléotides complémentaires. En outre, la multimérisation d'un ARN messager contenant l'IRES du VHC a pour conséquence l'inhibition totale de sa traduction. Un test de criblage in vitro permettant d'identifier rapidement des molécules actives capables d'induire la multimérisation de l'IRES du VHC a alors été élaboré. L'approche peut bien sûr être adaptée au criblage de molécules capables d'induire la multimérisation d'autres ARN fonctionnels souvent repliés, tels que les IRES d'autres virus, les promoteurs viraux, ou les ARN ribosomaux de microorganismes pathogènes.

La présente invention concerne donc d'abord une méthode d'inhibition de la fonctionnalité d'un ARN non codant replié, caractérisée en ce qu'on ajoute une quantité efficace d'une molécule induisant la multimérisation dudit ARN non codant replié.

L'invention concerne également une méthode d'inhibition de la traduction et/ou la réplication d'une séquence d'ARN comprenant une région d'ARN non codant replié, caractérisée en ce qu'on ajoute une quantité efficace d'une molécule induisant la multimérisation dudit ARN non codant replié.

L'invention concerne également une méthode de criblage de molécules induisant l'inhibition de la fonctionnalité d'un ARN non codant replié, caractérisée en ce qu'on mesure la multimérisation de l'ARN non codant replié induite par ladite molécule.

Par ARN non codant replié , on entend au sens de l'invention un fragment d'acide ribonucléique (ARN) simple brin non codant formant une structure secondaire composée de boucles et de tiges du fait de l'appariement de type Watson-Crick des bases nucléotidiques complémentaire C-G et A-U et de l'appariement plus faible des bases G et U. On appelle tige une région de bases appariées, tandis qu'une boucle est constituée d'une région de bases non appariées entre elles à l'extrémité d'une tige ou entre deux tiges. Une tige avec une boucle à son extrémité forme une structure qu'on appelle une épingle à cheveux (voir Figure 1A, partie gauche). Différents exemples de boucles et de tiges peuvent également être observés sur la structure secondaire du site d'entrée interne du ribosome (IRES) du virus de l'hépatite C (VHC) représenté sur la Figure 1 C. De manière avantageuse, un ARN non codant replié comprend au moins une structure de type épingle à cheveux. Ces structures en épingle à cheveux sont formées grâce à des séquences complémentaires capables de s'apparier au sein de la molécule d'ARN non codant replié (voir Figure 1A, partie gauche). Dans le cas où l'appariement intramoléculaire, c'est-à-dire au sein du même fragment d'ARN, est perturbé, ces séquences peuvent également permettre un appariement intermoléculaire entre deux fragments d'ARN possédant ces séquences complémentaires (voir Figure 1A, partie droite).

Un ARN non codant replié selon l'invention peut également contenir, dans une partie de sa séquence qui est impliquée dans une boucle, une séquence palindrome permettant de former une interaction intermoléculaire avec la même boucle d'un autre monomère identique d'ARN non codant replié (voir Figure 1 B).

De nombreux types d'ARN non codant replié existent dans la nature. Ces ARN no codant repliés ont généralement des fonctions de type régulatrices, impliquées notamment dans le contrôle de la traduction et/ou de la réplication des ARN.Par exemple, les ARN de transfert (ARNt) et les ARN ribosomaux (ARNr) constituent des ARN non codant repliés et sont inclus dans la portée de la présente invention. D'autres ARN non codant repliés inclus dans la portée de la présente invention comprennent notamment la séquence X 3'-terminale du génome du virus VHC, les séquences 5' non codantes du génome des rétrovirus, notamment les virus de l'immunodéficience humaine (VIH), féline (VIF) et simiesque (VIS), et les séquences de cyclisation des bunyavirus, notamment du hantavirus.

Par séquences 5' non codantes du génome des rétrovirus , on entend pour chaque rétrovirus le fragment de séquence non codante situé en 5' du génome rétroviral, en amont du codon d'initiation de la première protéine virale, contenant l'élément répondant à la transactivation TAR (transactivation responsive element), le site d'initiation de la réplication virale, le site d'initiation de la dimérisation DIS et la structure de liaison de la dimérisation DLS. Ces séquences ont été décrites pour plusieurs rétrovirus.

Par exemple, pour le VIH, cette séquence correspond aux nucléotides 1-350 du génome rétroviral de l'isolat MAL (numéro d'accession GenBank X04415), correspondant à la partie 5' non codante jusqu'au codon d'initation AUG de la protéine gag, et contenant l'élément répondant à la transactivation TAR (transactivation responsive element), le site de liaison au primer PBS (primer binding site, soit le site de fixation de tRNAlys), le site d'initiation de la dimérisation DIS et la structure de liaison de la dimérisation DLS.

Pour le VIF, cette séquence correspond aux nucléotides 355-628 du génome rétroviral (numéro d'accession GenBank NC_001482), correspondant au fragment commençant au LTR jusqu'au codon d'initation AUG de la protéine gag.

Par séquence de cyclisation des bunyavirus , on entend les fragments de séquences terminaux de l'ARN viral qui permettent la cyclisation de l'ARN viral. Par exemple, pour le hantavirus, cette séquence correspond aux 23 nucléotides 5' et 3' terminaux du segment S (numéro d'accession GenBank AF063892) et aux 26 nucléotides 5' et 3' terminaux du segment L (numéro d'accession GenBank NC 006435) du génome viral.

Une catégorie particulière d'ARN non codant replié comprend les séquences dites de site interne d'entrée des ribosomes (Internal Ribosome Entry Site, soit IRES) présentes dans l'extrémité 5' d'un certain nombre d'ARN et impliquées dans un mécanisme non classique d'initiation de la traduction de l'ARN. L'IRES permet en effet à la traduction de survenir dans des conditions où la traduction classique cap- dépendante est bloquée (stress, infection virale...).

Ces séquences IRES, de structures secondaires repliées et capables d'induire une traduction cap-indépendante, ont d'abord été identifiées au sein des régions 5' non-traduites (régions 5' NTR) génomes à ARN des picornavirus. Depuis, de nombreuses séquences IRES ont été décrites au sein des régions 5' NTR des génomes des virus à ARN (Hellen CU, and Sarnow P. 2001. Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules. Genes Dev. 15(13):1593-612). Les virus à ARN possédant une séquence IRES dans leur région 5' NTR comprennent notamment: - parmi les picornavirus, les virus de la poliomyélite (PV), de l'hépatite A (HAV), de la fièvre aphteuse (FMDV), de l'encephalomyocardite (EMCV), et le rotavirus (HRV) ; - parmi les flavivirus, le virus de l'hépatite C; - parmi les pestivirus, le virus de la diarrhée virale bovine (BVDV) ou le virus classique de la fièvre porcine; ou - parmi les rétrovirus, le virus de l'immunodéficience humaine (HIV), le virus de l'immunodéficience simiesque (SIV), ou le virus T lymphotrope humain (HTLV).

Des séquences IRES ont ensuite été décrites chez les eucaryotes dans les régions 5' NTR d'ARNm cellulaires (désignées ici par IRES cellulaires). Un grand nombre de séquences IRES actuellement identifiées sont récapitulées dans un article de Hellen et Sarnow (Hellen CU, and Sarnow P. 2001. Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules. Genes Dev. 15(13):1593-612) qui est incorporé ici par référence. En particulier, parmi les ARNm cellulaires possédant une séquence IRES dans leur région 5' NTR, on trouve différents gènes connus pour être impliqués dans certains processus de tumorigénèse, tels que notamment les oncogènes c- myc, Pim-1, de la kinase p58PJTSLRe, ou les facteurs de croissances FGF2 (facteur de croissance des fibroblastes 2), PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes), ou VEGF (facteur de croissance endothélial vasculaire).

Par fonctionnalité d'un ARN non codant replié, on entend au sens de l'invention sa capacité à réguler la réplication et/ou l'initiation de la traduction d'une séquence d'ARN dont il fait partie (régulation en cis) ou d'une autre séquence d'ARN avec laquelle il interagit (régulation en trans).

Par une autre séquence d'ARN avec laquelle il interagit , on entend une séquence d'ARN distincte sur laquelle l'ARN non codant replié est capable de se fixer et dont il peut réguler la réplication et/ou l'initiation de la traduction.

Par une séquence d'ARN comprenant une région d'ARN non codant replié , on entend une séquence d'ARN dont une région, c'est-à-dire un fragment, constitue un ARN non codant replié au sens de l'invention. Ce fragment d'ARN replié joue de 10 préférence un rôle régulateur dans la transcription et/ou la réplication de la séquence globale d'ARN.

Avantageusement, la séquence d'ARN dont l'ARN non codant replié régule la réplication comprend un fragment d'un génome de virus à ARN. Avantageusement également, la séquence d'ARN dont l'ARN non codant replié régule l'initiation de la traduction est un ARN messager codant pour un polypeptide. Dans le cas où l'ARN non codant replié fait partie de la séquence d'ARN qu'il régule, l'ARN non codant replié peut être situé à tout endroit de la séquence d'ARN globale. Dans un mode de réalisation avantageux, l'ARN non codant replié faisant partie d'une séquence d'ARNm dont il régule l'initiation de la traduction est situé en 5' de la séquence d'ARN globale.

Dans un mode de réalisation avantageux d'une méthode d'inhibition ou de criblage selon l'invention, l'ARN non codant replié est un IRES, un ARN ribosomal, la séquence X 3'-terminale du génome du virus VHC, les séquences 5' non codantes du génome des rétrovirus, notamment les virus de l'immunodéficience humaine (VIH), simiesque (VIS) et féline (FIH), ou les séquences de cyclisation des bunyavirus, notamment le hantavirus.

Avantageusement, l'ARN non codant replié est un IRES, notamment un IRES viral choisi dans le groupe comprenant les IRES des picornavirus, notamment des virus de la poliomyélite (PV), de l'hépatite A (HAV), de la fièvre aphteuse (FMDV), de l'encephalomyocardite (EMCV), du rotavirus (HRV) ; des flavivirus, notamment du virus de l'hépatite C; des pestivirus, notamment du virus de la diarrhée virale bovine (BVDV) ou du virus classique de la fièvre porcine; ou des rétrovirus, notamment du virus de l'immunodéficience humaine (HIV), du virus de l'immunodéficience simiesque (SIV), ou du virus T lymphotrope humain (HTLV).

Par multimérisation , on entend au sens de l'invention la formation de composés issus de l'union de plusieurs sous-unités identiques, appelées monomères, c'est-à-dire ici de plusieurs monomères d'ARN non codant replié. Ces composés formés de l'union de plusieurs monomères d'ARN non codant replié seront appelés multimères. Un multimère peut contenir 2 (dimère), 3 (trimère), 4 (tétramère), ou davantage de monomères. On entend donc par multimérisation la formation de multimères, différents types de multimères pouvant coexister avec des monomères résiduels.

Une molécule induisant la multimérisation d'un ARN non codant replié signifie, au sens de l'invention, une molécule dont la présence diminue significativement le pourcentage de monomères au sein des molécules d'ARN non codant replié. De manière avantageuse, en présence d'une molécule induisant la multimérisation d'un ARN non codant replié, le pourcentage de monomères d'ARN non codant replié est diminué d'un facteur au moins 1, 1; au moins 1,2; au moins 1,3, au moins 1,5; au moins 2; au moins 3; au moins 4; au moins 5 ou au moins 10 par rapport au pourcentage de monomères d'ARN non codant replié observé en absence de cette molécule.

Pour la mise en oeuvre d'une méthode de criblage selon l'invention, la mesure de la multimérisation de l'ARN non codant replié induite par la molécule testée peut être mesurée par toute technique connue de l'homme du métier.

Le poids moléculaire d'un multimère (Pmuitimère) composé de n monomères d'ARN non codant replié de poids moléculaire Pmonomère est: Pmuhimère = nx PmonomèreÉ On peut donc mesurer la multimérisation éventuelle de l'ARN non codant replié induite par la molécule testée en déterminant le poids moléculaire résultant de l'ARN non codant replié. Ainsi, dans un mode de réalisation d'une méthode de criblage selon l'invention, la mesure de la multimérisation de l'ARN non codant replié induite par ladite molécule comprend: a) la préparation par de monomères dudit ARN, b) la multimérisation des monomères dans un tampon de multimérisation, et c) la détermination du poids moléculaire résultant de l'ARN non codant replié, dans laquelle la molécule à tester est ajoutée soit au cours de l'étape a) , soit au cours de l'étape b).

La détermination du poids moléculaire résultant de l'ARN non codant replié peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier. Avantageusement, la détermination du poids moléculaire résultant de l'ARN non codant replié est réalisée par électrophorèse en conditions natives, par électrophorèse en conditions dénaturantes après réticulation des complexes formés, par spectrométrie de masse, ou par centrifugation. Une technique particulièrement appropriée pour déterminer le poids moléculaire résultant de l'ARN non codant replié est l'électrophorèse en conditions natives.

Alternativement, dans un autre mode de réalisation d'une méthode de criblage selon l'invention, la mesure de la multimérisation de l'ARN non codant replié induite par ladite molécule comprend: a) la préparation (i) de monomères dudit ARN liés à un agent permettant la fixation spécifique de ces monomères sur un support solide (monomères de type 1), (ii) de monomères dudit ARN liés à un agent permettant la détection spécifique de ces monomères (monomères de type 2), b) successivement, dans un ordre ou dans l'autre, ou simultanément: (i) le mélange des deux types de monomères et leur multimérisation dans un tampon de multimérisation, (ii) la fixation des monomères de type 1 sur un support solide, c) l'élimination par lavage des monomères de type 2 non liés à des monomères de type 1, et d) la mesure de la quantité de monomères de type 2 restant fixé sur le support solide, dans laquelle la molécule à tester est ajoutée soit au cours de l'étape a), soit au cours de l'étape b).

La préparation des monomères à l'étape a) d'une méthode de criblage selon l'invention peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier. En particulier, elle peut être réalisée soit par synthèse in vitro, notamment par transcription in vitro à partir d'une matrice d'ADN, soit par isolement des monomères d'ARN non codant replié à partir d'un échantillon contenant des fragments d'ARN transcrits in vivo. Par in vivo , on entend aussi bien au sein d'une cellule isolée ou d'une lignée cellulaire qu'au sein d'un organe, voire d'un animal. Dans un mode de réalisation avantageux, la préparation des monomères à l'étape a) est réalisée par transcription in vitro. La préparation par transcription in vitro de monomères d'ARN non codant replié peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier. Par exemple, on peut utiliser la technique décrite ici dans l'exemple 1.

Pour la préparation du monomère de type 1, on peut utiliser tout type d'agent permettant la fixation spécifique de ces monomères sur un support solide sans affecter le processus de multimérisation. Pour vérifier qu'un agent n'affecte pas le processus de multimérisation, il suffit de vérifier par analyse du poids moléculaire résultant que la proportion des monomères et des différents multimères n'est pas affectée en présence de cet agent. Par exemple, la biotine ou la streptavidine, qui se lient avec une forte affinité, peuvent indifféremment constituer l'un de ces agents si le composé complémentaire est fixé sur le support solide. Une autre technique qui peut être utilisée consiste à fixer au monomère d'ARN un haptène qui peut ensuite être fixé à un support solide à l'aide d'anticorps spécifiques dirigés contre cet haptène. Sous réserve de ne pas affecter la multimérisation de l'ARN non codant replié, la biotine ou la streptavidine ou l'haptène peuvent être fixées soit à une extrémité du monomère d'ARN, soit par incorporation d'un nucléotide lié à l'une de ces molécules. Une autre technique encore qui peut être utilisée est de fixer sur les monomères de type 1 un groupement pyrrole qui peut ensuite être greffé sur le support solide par copolymérisation (auto-assemblage) électrochimique avec du pyrrole libre, ainsi que toute autre technique connue de l'homme du métier utilisée pour la fixation de sondes d'acides nucléiques sur une puce à acides nucléiques, où la fixation est spécifique, c'est-à-dire qu'elle ne permet la fixation que d'acides nucléiques ayant une caractéristique particulière. De manière avantageuse, l'agent permettant la fixation ultérieure à un support solide des monomères de type 1 est choisi dans le groupe constitué de la biotine, la streptavidine ou les haptènes. Par haptène , on entend un petit déterminant antigénique, donc une petite molécule, qui seule ne peut pas provoquer une réponse anticorps, mais peut provoquer une telle réponse anticorps quand elle est attachée sur un porteur. Des anticorps spécifiquement dirigés contre un haptène peuvent ainsi être générés.

Pour la préparation du monomère de type 2, on peut utiliser tout type d'agent permettant la détection spécifique de ces monomères. De manière avantageuse, l'agent permettant la détection ultérieure des monomères de type 2 est choisi dans le groupe constitué des agents radioactifs, fluorescents, colorimétriques ou chimioluminescents.

Plus avantageusement encore, la préparation par transcription in vitro des monomères de type 2 comprend l'incorporation de nucléotides marqués au 32P, 33P, 3H ou 14C.

Dans une méthode de criblage selon l'invention, les molécules à cribler peuvent être de différents types et sont ajoutées, en fonction du type de molécule, soit au cours de l'étape a), soit au cours de l'étape b) . Notamment, une molécule induisant la multimérisation d'un ARN non codant replié peut intervenir, soit au moment de la formation de l'ARN non codant replié, c'est-à-dire lors de sa transcription, soit lors du processus de multimérisation proprement dit. Dans un mode de réalisation avantageux d'une méthode de criblage selon l'invention, les molécules à cribler sont des analogues nucléosidiques et sont ajoutés à l'étape a), au cours de la transcription in vitro ou in vivo des monomères d'ARN non codant replié. En effet, de tels analogues nucléosidiques peuvent être incorporés dans l'ARN non codant replié au cours de la transcription et ainsi perturber le repliement de l'ARN et donc influencer sa capacité à se multimériser. De préférence, pour le criblage d'analogues nucléosidiques, la préparation des monomères d'ARN non codant replié a été réalisée par transcription in vitro.

Dans un autre mode de réalisation, les molécules à cribler sont choisies dans le groupe constitué des acides nucléiques, des molécules chimiques, et des peptides et sont ajoutées à l'étape b). Ces molécules sont en effet susceptibles d'interagir avec l'ARN non codant replié, de perturber son repliement et donc d'influencer sa capacité à se multimériser.

L'invention concerne en outre un acide nucléique comprenant un fragment d'au moins 18, au moins 20, avantageusement au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, plus avantageusement au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, voire 30 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO: 8 (IIIdrev), à titre de médicament.

L'invention concerne également un acide nucléique comprenant un fragment d'au moins 18, au moins 20, avantageusement au moins 21, au moins 22, au moins 23, plus avantageusement au moins 24, au moins 25, voire 26 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO: 12 (Ncr4), à titre de médicament.

Un acide nucléique à titre de médicament selon l'invention peut en outre avoir été modifié pour augmenter sa biodisponibilité in vivo, notamment par toute technique connue de l'homme du métier permettant d'inhiber l'action des nucléases sur ledit acide nucléique.

L'invention concerne en outre l'utilisation d'au moins une molécule induisant la multimérisation d'un ARN non codant replié pour inhiber sa capacité à réguler la réplication et/ou la traduction d'une séquence d'ARN dont il fait partie ou d'une autre séquence d'ARN avec laquelle il interagit.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une molécule induisant la multimérisation d'un ARN non codant replié pour inhiber la traduction et/ou la réplication d'une séquence d'ARN comprenant ledit ARN non codant replié.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une molécule induisant la multimérisation d'un ARN non codant replié exprimé par un microorganisme pathogène pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une infection d'un mammifère par ce microorganisme pathogène. Avantageusement, le microorganisme pathogène est un virus à ARN, notamment un picornavirus, un flavivirus, un pestivirus, ou un rétrovirus. De préférence, le virus à ARN est choisi dans le groupe constitué des virus de la poliomyélite (PV), de l'hépatite A (HAV), du rotavirus (HRV), du virus de l'hépatite C, du virus de l'immunodéficience humaine (HIV), ou du virus T lymphotrope humain (HTLV). Dans un mode de réalisation avantageux, le microorganisme pathogène est le virus HCV, l'ARN non codant replié est l'IRES du virus HCV, et le mammifère est un humain.

Dans un mode de réalisation avantageux d'une utilisation selon l'invention, au moins une molécule qui induit la multimérisation est un acide nucléique, un peptide ou un analogue nucléosidique.

Avantageusement, au moins une molécule qui induit la multimérisation est un acide nucléique comprenant un fragment d'au moins 18, au moins 20, avantageusement au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, plus avantageusement au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, voire 30 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO: 8, ou un acide nucléique comprenant un fragment d'au moins 18, au moins 20,avantageusement au moins 21, au moins 22, au moins 23, plus avantageusement au moins 24, au moins 25, voire 26 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO: 12.

Par analogue nucléosidique , on entend tout composé capable de mimer par sa structure au moins un des nucléosides naturels de l'ADN ou de l'ARN, et capable au cours de la réplication de l'ADN ou de l'ARN d'être incorporé par une polymérase à ADN ou à ARN dans la séquence néosynthétisée à la place d'au moins un nucléoside naturel tel que l'adénosine, la guanosine, l'uridine, la thymidine et la cytidine.

Les analogues nucléosidiques ont jusqu'à présent été caractérisés en tant qu'inhibiteurs de la réplication virale. La présente invention montre que, par l'induction de la multimérisation d'un ARN non codant replié, il est aussi possible de les utiliser en tant qu'inhibiteurs de la traduction d'une séquence d'ARN comprenant cet ARN non codant replié.

Dans un mode de réalisation avantageux d'une utilisation selon l'invention, l'ARN non codant replié est un IRES, un ARN ribosomal, la séquence X 3'-terminale du génome du virus VHC, les séquences 5' non codantes du génome des rétrovirus, notamment les virus de l'immunodéficience humaine (VIH), simiesque (VIS) et féline (FIH), et les séquences de cyclisation des bunyavirus, notamment le hantavirus.

Dans un mode de réalisation avantageux d'une utilisation selon l'invention, au moins une molécule induisant la multimérisation a été identifiée par une méthode de criblage selon l'invention décrite précédemment.

Les avantages de la présente invention sont illustrés dans les figures et les

exemples ci-après.

Figure 1. Interactions intramoléculaires et intermoléculaires de l'ARN. A. La présence de séquences complémentaires au sein d'un fragment d'ARN permet de générer une structure de type épingle à cheveux (tige et boucle) au sein d'une molécule d'ARN (appariement intramoléculaire), pouvant donner lieu, en cas de perturbation de l'appariement intramoléculaire, à un appariement intermoléculaire. B. La présence de séquences palindromes dans une boucle peut permettre des interactions intermoléculaires. C. Séquence et structure secondaire de l'IRES du virus VHC.

Figure 2. Mise en évidence de la dimérisation de l'IRES du virus de l'hépatite C (VHC). Analyse du pourcentage de dimères formés avec un IRES du virus VHC en fonction A. de la concentration en ARN (en M), B. de la présence de différents ions, C. du temps, et D. de la température. Les bandes d'ARN correspondant aux dimères et monomères sont localisées sur le gel par autoradiographie, découpés du gel et quantifiés par scintillation liquide.

Figure 3. Mise en évidence de trois séquences palindromes au sein de la séquence de l'IRES du virus VHC. Les séquences palindromes sont encadrées et numérotées. Le nombre de paires de base pouvant s'apparier par des liaisons de type Watson-Crick est indiqué pour chaque séquence.

Figure 4. L'exposition du palindrome 2, sous une forme courte de l'IRES du VHC avec la partie IIIf absente (nucléotides 40-313), appelée IRESAIIlf, entraine la multimérisation de l'IRES. A. Structure secondaire de la forme courte de l'IRES du VHC avec la partie IIIf absente (nucléotides 40-313), appelée IRESAIIIf. B. Analyse du poids moléculaire résultant de l'IRESAIIIf par électrophorèse en conditions natives.

La présence de monomères, dimères, trimères et tétramères de l'IRESAIIIf peut être observée.

Figure 5. Certains oligonucléotides complémentaires de parties de la séquence de l'IRES du virus VHC sont capables d'induire la multimérisation de l'IRES. A. Localisation des différents oligonucléotides par rapport à la structure secondaire de l'IRES du virus VHC. B. Analyse du poids moléculaire résultant de l'IRES en absence (t) ou en présence des différents oligonucléotides par électrophorèse en conditions natives. C. Structure de l'IRES (dIRES) tronqué des domaines II, IIIa, IIIb et IIIe. D. Analyse du poids moléculaire résultant de l'IRES tronqué dIRES en absence (t) ou en présence des différents oligonucléotides par électrophorèse en conditions natives. E. Influence de la présence des différents oligonucléotides sur la traduction in vitro de trois ARNm codant pour la luciférase, possédant sans (r luc) ou avec la séquence de l'IRES entier (IRES-luc) ou tronqué (dIRES-luc) du VHC à son extrémité 5'. L'activité luciférase, exprimée en pourcentage de l'activité observée en absence d'oligonucléotide, est représentée en absence (t) ou en présence des différents oligonucléotides.

Figure 6. Efficacité de la traduction et réplication virale. A. Organisation du réplicon I3891uc-ubi-neo/NS3-3'/ET. B. Activité luciférase, exprimée en pourcentage de l'activité observée en absence d'oligonucléotide, après culture des cellules Huhluc/ubi/neo, transfectées de façon permanente par le réplicon I3891uc-ubi-neo/NS3- 3'/ET, en absence (t) ou en présence des différents oligonucléotides.

Figure 7. Influence de la présence d'analogues nucléosidiques lors de la transcription in vitro des monomères d'IRES du virus VHC sur la multimérisation ultérieure de l'IRES ainsi obtenu et sur la traduction d'un ARNm comprenant l'IRES. A. Structure chimique de différents analogues nucléosidiques testés. B. Analyse du poids moléculaire résultant de l'IRES en absence (t) ou en présence des différents analogues nucléosidiques en conditions natives, ou en conditions dénaturantes (Dénaturant). C. Efficacité de la traduction in vitro de deux ARNm codant pour la luciférase, possédant (r IRES-luc) ou non (r lue) la séquence de l'IRES du VHC à son extrémité 5' en absence (t) ou en présence des différents analogues nucléosidiques pendant la transcription de l'ARN messager.

Figure 8. Procédé de quantification de la multimérisation de l'IRES et de recherche de molécules actives par criblage à haut débit. A. Schéma représentant la capacité de composés à inhiber la dimérisation de l'IRES du virus VHC (triangle), conduisant à la formation de monomères, ou au contraire à induire la multimérisation de l'IRES du virus VHC (double hexagone). B. Analyse du poids moléculaire résultant de l'IRES en absence (t) ou en présence des oligonucléotides IIIA et ncr4 par électrophorèse en conditions natives puis mesure de la quantité d'[32P] IRES restant fixé sur support solide.

EXEMPLES

Exemple 1

Analyse de la conformation de l'IRES du VHC par électrophorèse dans des conditions natives Méthodes Toutes les expériences réalisées ont été faites à partir d'une souche de VHC 15 issue d'un patient infecté par un virus VHC du génotype 3a.

L'ARN de PIRES (nucléotides 40-363) a été synthétisé par transcription in vitro à l'aide de polymérase T7 (Megascript, Ambion) et de PCR-matrice, purifié dans des conditions dénaturantes (7M urée, 10% acrylamide, 1 xTBE) et précipité. Pour préparer l'IRES radiomarqué, la transcription est effectuée en présence de [a- 32P]UTP.

Pour étudier l'influence de la concentration en ARN de l'IRES et des conditions ioniques (Figure 2 A et B), les culots d'ARN purifiés sur gel d'acrylamide sont repris dans l'eau (concentration en ARN: 250 ng/ l), chauffés à 90 C pendant 2 min et laissés refroidir à température ambiante. La dimérisation est initiée par l'ajout de 1/3 de volume de tampon de dimérisation et continuée pendant 2h à température ambiante. Les échantillons sont analysés par électrophorèse sur gel en conditions natives (45mM Tris, 45mM Borate, 5mM MgC12, 6% acrylamide) à 50-100V à 4 C, pendant 1-3h. Les gels fixés sont séchés et exposés. Les bandes d'ARN correspondant aux dimères et monomères sont localisées sur un gel sec par autoradiographie, découpées du gel et quantifiées par scintillation liquide.

Pour étudier le temps nécessaire à la dimérisation de l'IRES du VHC, celle-ci a été déclenchée comme indiqué précédemment par l'ajout dans l'ARN préchauffé de 1/3 de tampon de dimérisation (150mM Cacodylate, pH 7, 4, 1M KC1, 15mM MgCl2) et les aliquots de solution ont été pris avec les intervalles de temps de 2, 7, 12, 18, 28 et 38 minutes et immédiatement déposés sur gel. Les résultats ont été quantifiés par la scintillation liquide comme décrit précédemment.

Pour étudier la thermostabilité des dimères de l'IRES du VHC, ceux-ci ont été préformés dans le tampon de dimérisation (concentration finale de 50mM Cacodylate, pH 7,4, 300mMKC1, 5mM MgC12) pendant 2h à 25 C, puis la température a été augmentée graduellement de 5 C. Les aliquots pris à l'issue de 5 min d'incubation à la température indiquée, ont été déposés sur gel immédiatement. Les résultats ont été quantifiés par la scintillation liquide comme décrit précédemment.

Résultats Comme illustré sur la Figure 2, dans des conditions natives, l'IRES du VHC apparaît sur gel d'acrylamide comme deux bandes distinctes correspondant d'après leur poids moléculaire aux formes mono-et dimériques de l'IRES. La dimérisation est le résultat d'une interaction homotypique impliquant un site unique et dépend de la concentration de l'ARN avec un Kd 0,3 M.

Le processus de dimérisation est progressif et le pourcentage de dimères ( 50% au maximum) atteint un plateau en moins d'une heure. L'étude de la dépendance vis-à- vis des conditions ioniques montre que la dimérisation est un phénomène modulable, en particulier par la présence d'ions mono- ou bivalents.

L'ensemble de ces résultats montrent que le phénomène de dimérisation de l'IRES, qui est un cas particulier de multimérisation, peut exister dans une échelle de temps assez courte et dans des conditions physiologiques (sels, température). En outre, la compartimentalisation de la réplication de l'ARN du VHC lors du cycle viral sur les membranes cellulaires (Gosert R et al. 2002. Trends in Molecular Medicine. Vol 8 (10): 476-482) et la forte concentration locale d'ARN viral dans ces sites rendent probable la dimérisation de l'IRES à l'intérieur des cellules infectées. La thermostabilité (Tm, température de fusion = 45 C) est suffisamment haute pour que ces dimères soit stables à la température physiologique.

Exemple 2

L'exposition d'un site supplémentaire de dimérisation entraîne la multimérisation de l'IRES du virus VHC Pour le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), il a été montré que la dimérisation de l'ARN viral se fait par l'intermédiaire de séquences palindromes. La séquence de l'IRES du VHC a été étudiée pour la présence de palindromes à l'aide du logiciel Oligo 6.1.

La Figure 3 montre la présence de trois séquences palindromes et leur localisation dans le domaine II (palindrome 1), le domaine tracte polypyrimidine (palindrome 2) et le domaine IIId (palindrome 3). Sous forme simple brin, ces séquences pourraient être impliquées dans des interactions homotypiques IRES-IRES, mais au sein de l'IRES structuré, elles sont totalement inaccessibles (palindromes 2 et 3) ou exposées seulement en partie (palindrome 1).

D'après le modèle actuel de structure secondaire de l'IRES du VHC, le palindrome 2 (nucléotides 124-133) est apparié aux nucléotides 316-322 de pseudonoeud IIIf. Afin d'exposer le palindrome 2, une forme courte de l'IRES avec la partie IIIf absente (nucléotides 40-313), appelée IRESAIIIf, a été produite (Figure 4A).

L'analyse de l'IRES sauvage et de l'IRESAIIIf par électrophorèse en conditions natives montre que, outre les dimères observés pour l'IRES complet, l'IRESAIIIf, suite à l'exposition d'un site de dimérisation supplémentaire, se présente sous forme de multimères (dimères et trimères, Figure 4B).

Cela suggère que la multimérisation de l'IRES peut être provoquée par l'exposition du palindrome 2, suite aux ré-organisations structurales de l'IRES.

Exemple 3

Déclenchement de la multimérisation de l'IRES du virus VHC par des oligonucléotides Principe et méthodes L'appariement d'un oligonucléotide complémentaire à l'ARN de l'IRES produit au sein de celui-ci des changements conformationels.

L'effet de plusieurs oligonucléotides complémentaires aux différentes régions de l'IRES (représentés sur la Figure 5A) sur sa multimérisation a été étudié : des culots secs d'ARN d'IRES complet sauvage (nucléotides 40363, 2 M) ont été dissous dans de l'eau, pré-chauffés, incubés avec plusieurs oligonucléotides (1 M) complémentaires aux différentes régions de l'IRES à température ambiante pendant 2h, puis analysés par électrophorèse en conditions natives.

Les caractéristiques de ces oligonucléotides sont résumées dans le Tableau 1 suivant.

Tableau 1. Caractéristiques des oligonucléotides complémentaires aux différentes régions de l'IRES étudiés Nom Séquence nucléique 5'-3' Taille Nucléotides complémentaires dans l'IRES IIarev ctgcgtgaagacagtagttcc 21 71-51 (SEQ ID N 1) IICfwd aagcgtctagccatggcgtta 21 73-93 (SEQ ID N 2) IlCrev taacgccatggctagacgctt 21 93 -73 (SEQ ID N 3) IIrev gtcctggtggctgcaggacactcatac 27 120 - 94 (SEQ ID N 4) Marey ttccggtgtactcaccggttcca 23 173 - 151 (SEQ ID N 5) IIlcrev _ 21 252 -232 tagcagtctcgcgggggcacg (SEQ ID N 6) IIIcfwd cgtgcccccgcgagactgcta 21 232 252 (SEQ ID N 7) IIIdrev gtaccacaaggcctttcgcgacccaacact 30 289 - 260 (SEQ ID N 8) IIIdfwd agtgttgggtcgcgaaaggccttgtggtac 30 260 - 289 (SEQ ID N 9) IRES8 gtttttctttgaggtttagg 20 354 - 363 (SEQ ID N 10) Ncr2 catggtgcacggtctacgagacct 24 344 - 321 (SEQ ID N 11) Ncr4 cactcgcaagcaccctatcaggcagt 26 313 - 288 (SEQ ID N 12) Résultats Les oligonucléotides IIIdrev et NCR4 se sont avérés les inducteurs les plus forts de la multimérisation de l'IRES (Figure 5B).

Exemple 4

Efficacité de la traduction d'un ARN messager contenant l'IRES du virus VHC Afin de tester l'influence de la multimérisation de l'IRES sur sa capacité à être traduit, deux ARN messager codant pour la luciférase, possédant ou non à son extrémité 5' une séquence de l'IRES du VHC ont été utilisés. L'influence des oligonucléotides complémentaires aux différentes régions de l'IRES décrits à l'exemple 3 (voir Tableau 1) sur la traduction de chacun de ces ARNm a été étudiée.

Méthodes Deux ARNm codant pour la luciférase, possédant ou non la séquence de l'IRES du VHC à son extrémité 5', ont été synthétisés in vitro à l'aide de polymérase SP6 (Megascript, Ambion) et des plasmides SPluc+ (Promega) et pSP(IRES)luc+ linéarisés par l'enzyme de restriction Xhol.

Les ARNm (0,125 M), pré-incubés avec les différents oligonucléotides (2 M) dans le tampon de dimérisation pendant 16h, ont ensuite été traduits dans un lysat de réticulocytes de lapin (Ambion) pendant 90 minutes à 30 C. L'activité luciférase est alors mesurée à l'aide d'un luminomètre Lumat LB9507 (Berthold).

Résultats Les deux oligonucléotides NCR4 et IIID sont les inhibiteurs les plus puissants de la traduction de l'ARNm portant l'IRES (Figure 5E). L'effet est IRES-spécifique, car ces oligonucléotides n'ont pas d'effet sur la traduction de l'ARN de luciférase seul.

La forte corrélation observée entre la multimérisation de l'IRES et l'inhibition de la traduction de l'ARNm IRES-luciférase suggère que la traduction de l'ARN du virus de l'hépatite C pourrait être bloquée par des agents déstabilisant la conformation de l'IRES et conduisant à sa multimérisation.

Exemple 5

Efficacité de la traduction d'un ARN messager contenant l'IRES du virus VHC tronqué Principe Pour prouver que l'inhibition par certains oligonucléotides de la traduction d'un ARN contenant l'IRES du VHC est lié à la multimérisation de cet ARN et non à une inhibition par simple fixation des oligonucléotides sur l'IRES de sa capacité à initier la traduction (inhibition de type antisens), un IRES tronqué, privé des 248 premiers nucléotides de l'IRES, a été synthétisé et cloné en amont du gène de la luciférase.

Il est connu que la délétion d'un fragment aussi important de l'IRES rend impossible l'initiation par l'IRES de la traduction par le recrutement direct de ribosomes sur le codon d'initiation AUG. Dans ce cas, la traduction débute par scanning (c'est-à-dire la fixation de ribosomes à l'extrémité 5' de l'ARN et la recherche du codon d'initiation) avec une efficacité -10 fois inférieure.

La capacité de multimérisation de la construction contenant l'IRES tronqué a été étudiée, ainsi que l'efficacité de traduction du gène de la luciférase dans la construction contenant l'IRES tronqué en absence ou en présence des oligonucléotides complémentaires. Les résultats obtenus ont été comparés à ceux obtenus avec l'IRES entier.

Méthodes Une construction contenant l'IRES tronqué cloné en amont du gène de la luciférase (dIRES-luc) a été préparée par la digestion d'un ADN plasmidique de pSPIRESIuc contenant l'IRES entier par l'enzyme de restriction Nhel, ce qui permet l'excision d'un fragment contenant les nucléotides 40-248 de l'IRES, suivie de la ligation du plasmide coupé.

L'ARN dIRES-luc a été synthétisé in vitro à l'aide de polymérase SP6 30 (Megascript, Ambion), puis le plasmide a été linéarisé par les enzymes de restriction Nde I et Xhol.

Les mesures de la multimérisation de l'IRES tronqué dIRES et de l'efficacité de traduction de la construction contenant l'IRES tronqué en absence ou en présence des oligonucléotides complémentaires ont été réalisées tel que décrit précédemment.

Résultats L'IRES tronqué dIRES a conservé sa capacité de dimérisation, et l'oligonucléotide NCR4 permet toujours d'induire une multimérisation de l'IRES tronqué (Figure 5D).

De plus, les deux oligonucléotides NCR4 et IIID restent les inhibiteurs les plus puissants de la traduction de l'ARNm contenant l'IRES tronqué dIRES (Figure 5E). L'effet est toujours dIRES-spécifique, car ces oligonucléotides n'ont pas d'effet sur la traduction de l'ARN de luciférase seul.

Les résultats obtenus avec la construction contenant l'IRES tronqué dIRESluc sont donc en parfaite corrélation avec ceux obtenus avec la construction contenant l'IRES entier IRES-luc.

La forte corrélation observée entre la multimérisation de l'IRES tronqué et l'inhibition de la traduction de l'ARNm dIRES-luciférase contenant cet IRES tronqué fournit une preuve supplémentaire que la multimérisation d'un fragment d'ARN non codant replié en amont d'un gène entraîne l'inhibition de sa traduction, et montre que le phénomène de multimérisation peut être utilisé pour bloquer la traduction.

Exemple 6

Efficacité de la traduction et réplication virale Principe Le virus de l'hépatite C ne se propage pas en culture cellulaire, ni chez des animaux de laboratoire autres que les chimpanzés. Il est donc nécessaire d'utiliser des modèles cellulaires de substitution de la traduction et la réplication virale, tels que notamment le réplicon .

Ici, la lignée cellulaire Huh-luc/ubi/neo, qui est transfectée de façon permanente par le réplicon I3891uc-ubi-neo/NS3-3'/ET, a donc été utilisée pour étudier l'effet de la multimérisation de l'IRES sur la traduction et la réplication du virus.

Le réplicon I3891uc-ubi-neo/NS3-3'/ET est un plasmide comprenant les nucléotides 1-389 de l'ARN viral du VHC (correspondant à la région 5' non codante, qui contient l'IRES, et aux 16 premiers acides aminés de la protéine core du VHC), en fusion avec la luciférase firefly (Ff-luc), l'ubiquitine (ubi) et la néomycine phosphotransférase (neo), suivis de la séquence de l'IRES de EMCV contrôlant les gènes de la polyprotéine virale NS3, NS4B, NS5A et NS5B avec les mutations adaptives E1202G, T1280I et S2197P (Figure 6A).

Méthodes La lignée cellulaire Huh-luc/ubi/neo a été cultivée dans le milieu DMEM contenant 250 g/ml d'antibiotique G418. Les cellules, réparties dans des plaques de culture à 12 puits ( 105 cellules/puits) ont été incubée avec les oligonucléotides ncr2, ncr4, IIIdfwd et IIIdrev (1 M) en présence d'Oligofectamin (Invitrogen) pendant 4h puis lavées et laissées en culture pendant 24h.

L'activité luciférase est alors mesurée dans des lysats cellulaires à l'aide d'un luminomètre Lumat LB9507 (Berthold).

Résultats Les oligonucléotides complémentaires de l'IRES du VHC (ncr2, ncr4, IlIcrev et IIIdrev) inhibent l'expression de la luciférase à 28%, 64%, 30% et 66%, respectivement. Les oligonucléotides ncr4 et IIIdrev montrent une activité supérieure aux autres oligonucléotides (Figure 6B).

La forte corrélation des résultats obtenus dans ce modèle cellulaire de l'infection par le virus de l'hépatite C avec ceux obtenus in vitro concernant l'induction de la multimérisation de l'IRES et l'inhibition de la traduction d'un ARNm par multimérisation de l'IRES, montre que l'approche de l'induction de la multimérisation de l'IRES du VHC peut être utilisée pour développer de nouveaux médicaments contre ce virus.

Exemple 7

Multimérisation de l'IRES du virus VHC suite à l'incorporation de nucléotides modifiés Principe Les oligonucléotides complémentaires de différentes régions de l'IRES du VHC étudiés dans les exemples 3 et 4 (voir Tableau 1) permettent de modifier de l'extérieur la conformation de l'IRES et d'induire dans certains cas une multimérisation de l'IRES.

- Une autre approche, l'utilisation d'analogues nucléosidiques, offre un moyen de perturber la structure de l'IRES de l'intérieur .

Méthodes Des IRES modifiés incorporant un des différents analogues nucléosidiques usuellement utilisés pour le marquage de l'ARN (Biotin-UTP, digoxygenin-UTP, 5-(3-aminoallyl)-UTP, Alexa-fluor-488-5-UTP, Texas Red 5-UTP et Fluorescein-12-UTP, voir Figure 7A) ont donc été synthétisés par transcription in vitro et leur capacité de multimérisation a été mesurée par électrophorèse en conditions natives.

Résultats Les résultats montrent que l'incorporation de digoxigenine-UTP et de Texas Red 5-UTP provoquent la multimérisation de l'IRES quant ils sont présents dans un rapport de 1/20 par rapport aux uridines non modifiées (Figure 7B).

De plus, l'incorporation de ces nucléotides modifiés (1:50) a pour conséquence 25 l'inhibition spécifique de la traduction de l'ARN IRESluciférase (Figure 7C). Conclusions Les analogues nucléosidiques ne sont développés actuellement en tant qu'antiviraux que pour bloquer la croissance de la chaîne nucléotidique. Les résultats précédents montrent qu'il est possible de les utiliser pour provoquer la multimérisation de séquences d'ARN régulatrices fortement repliées telles que l'IRES du VHC.

En outre, les analogues nucléosidiques possèdent les atouts suivants: pénétration efficace dans les cellules, bonnes propriétés pharmacologiques, et - chimie développée et maîtrisée.

Exemple 8

Procédé de quantification de la multimérisation de l'IRES du virus VHC et de recherche de molécules actives par criblage à haut débit Principe (Figure 8A) Deux types de monomères de l'IRES du VHC sont préparés par transcription in vitro tel que décrit précédemment. Les monomères de type 1 de l'IRES sont biotinylés, ce qui permet de les fixer sur une plaque couverte de streptavidine. Les monomères de type 2 de l'IRES sont radiomarqués, ce qui permet leur détection.

Les deux types de monomères sont mélangés, les monomères de type 2 étant en excès, dans des conditions permettant la multimérisation.

Le mélange est ensuite réparti dans les puits d'une plaque dont la surface est couverte de streptavidine ce qui permet de fixer sur la plaque les monomères de type 1 (biotinylés), ainsi que les monomères de type 2 (radiomarqués) qui forment un multimère avec un monomère de type 1.

Les monomères de type 2 (radiomarqués) non multimérisés avec un monomère de type 1 sont éliminés par lavage, puis la radioactivité résultante, proportionnelle à la capacité de multimérisation de l'IRES, est mesurée.

Une molécule bloquant le site naturel d'interaction homotypique de l'IRES du VHC conduira à l'inhibition de la dimérisation (Figure 8A, partie gauche), tandis qu'une molécule induisant un changement conformationel libérant une séquence palindrome et créant un deuxième site d'interaction homotypique conduit au phénomène de multimérisation (Figure 8A, partie droite).

L'influence d'une molécule particulière sur la multimérisation de l'IRES peut être testée à deux niveaux: 1) soit en l'ajoutant dans la réaction de synthèse de l'IRES par transcription in vitro (modification directe de l'IRES aboutissant à une ou plusieurs modifications conformationelles), 2) soit en l'ajoutant dans la réaction de multimérisation (modification indirecte de la conformation de l'IRES sauvage par interaction avec une autre molécule).

Dans cet exemple, les oligonucléotides complémentaires NCR4 (augmente la multimérisation, voir Figure 5B) et IIIA (inhibe la multimérisation, voir Figure 5B) déjà testés à l'exemple 3 ont été analysés par ce procédé (modification indirecte de la conformation de l'IRES sauvage par interaction avec l'oligonucléotide complémentaire).

Méthodes L'IRES biotinylé et l'IRES radiomarqué sont préparés séparément par incorporation lors de la transcription in vitro de UTP biotynilé ou de UTP[a-32P] respectivement, puis purifiés sur gel dénaturant.

Le mélange de l'IRES biotinylé et radiomarqué est incubé dans le tampon de dimérisation pendant 16h en présence ou absence de l'un des oligonucléotides NCR4 et IIIA, et transféré sur la plaque couverte par streptavidine. La solution est aspirée 30 minutes plus tard, les puits sont lavés, puis la radioactivité associée est quantifiée à l'aide d'un compteur de plaque Microbeta (PerkinElmer).

Résultats Une diminution de la quantité de [32P]IRES immobilisé est observée en présence d'oligonucléotide IIIA qui, d'après les résultats d'analyse sur gel natif, bloque la dimérisation d'IRES, alors que la quantité de [32P]IRES immobilisé devient 3 fois plus importante en présence d'oligonucléotide ncr4 qui déclenche sa multimérisation (Figure 8B).

Conclusions Ce procédé peut être utilisé en format de 96-puits ou plus pour identifier par criblage à haut débit des molécules actives qui induisent des changements suffisamment importants dans la structure de l'IRES pour provoquer sa multimérisation.

Un grand nombre de méthodes ont été déjà développées pour détecter la capacité de molécules de se lier à l'ARN (gels à retardement, spectrométrie de masse, RMN, FRET et anisotropie de fluorescence) qui ont permis d'identifier un certain nombre de molécules- RNA binders . Cependant, l'inefficacité de ces molécules à affecter les fonctions d'ARN a démontré que la fixation d'une molécule sur l'ARN n'est pas suffisante pour l'inactiver.

En plus de son coût bas, le procédé de criblage selon l'invention décrit dans cet exemple, basé sur le phénomène de multimérisation, a l'avantage d'offrir la possibilité d'identifier des molécules qui vont bloquer la fonctionnalité de l'IRES et IRES- containing ARN.

Claims

REVENDICATIONS

1. Méthode d'inhibition in vitro de la fonctionnalité d'un ARN non codant 5 replié, caractérisée en ce qu'on ajoute une quantité efficace d'une molécule induisant la multimérisation dudit ARN non codant replié.

2. Méthode d'inhibition in vitro de la traduction et/ou la réplication d'une séquence d'ARN comprenant une région d'ARN non codant replié, caractérisée en ce 10 qu'on ajoute une quantité efficace d'une molécule induisant la multimérisation dudit ARN non codant replié.

3. Méthode de criblage de molécules induisant l'inhibition de la fonctionnalité d'un ARN non codant replié, caractérisée en ce qu'on mesure la multimérisation de 15 l'ARN non codant replié induite par ladite molécule.

4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'ARN non codant replié est un IRES, un ARN ribosomal, la séquence X 3'-terminale du génome du virus VHC, les séquences 5' non codantes du génome des rétrovirus, notamment les virus de l'immunodéficience humaine (VIH), simiesque (VIS) et féline (FIH), et les séquences de cyclisation des bunyavirus, notamment le hantavirus.

5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'ARN non codant replié est un IRES, notamment un IRES viral choisi dans le groupe comprenant les IRES des picornavirus, notamment des virus de la poliomyélite (PV), de l'hépatite A (HAV), de la fièvre aphteuse (FMDV), de l'encephalomyocardite (EMCV), du rotavirus (HRV) ; des flavivirus, notamment du virus de l'hépatite C; des pestivirus, notamment du virus de la diarrhée virale bovine (BVDV) ou du virus classique de la fièvre porcine; ou des rétrovirus, notamment du virus de l'immunodéficience humaine (HIV), du virus de l'immunodéficience simiesque (SIV), ou du virus T lymphotrope humain (HTLV).

6. Méthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que la mesure de la multimérisation de l'ARN non codant replié induite par ladite molécule comprend: a) la préparation de monomères dudit ARN, b) la multimérisation des monomères dans un tampon de multimérisation, et c) la détermination du poids moléculaire des complexes obtenus, et dans laquelle la molécule à tester est ajoutée soit au cours de l'étape a), soit au cours de l'étape b).

7. Méthode de criblage selon la revendication 6, caractérisée en ce que la détermination du poids moléculaire des complexes obtenus est réalisée par électrophorèse en conditions natives, par électrophorèse en conditions dénaturantes après réticulation des complexes formés, par spectrométrie de masse, ou par centrifugation.

8. Méthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que la mesure de la multimérisation de l'ARN non codant replié induite par ladite molécule comprend: a) la préparation (i) de monomères dudit ARN liés à un agent permettant la fixation spécifique de ces monomères sur un support solide (monomères de type 1), (ii) de monomères dudit ARN liés à un agent permettant la détection spécifique de ces monomères (monomères de type 2), b) successivement, dans un ordre ou dans l'autre, ou simultanément: (i) le mélange des deux types de monomères et leur multimérisation dans un tampon de multimérisation, (ii) la fixation des monomères de type 1 sur un support solide, c) l'élimination par lavage des monomères de type 2 non liés à des monomères de type 1, et d) la mesure de la quantité de monomères de type 2 restant fixé sur le support solide, et dans laquelle la molécule à tester est ajoutée soit au cours de l'étape a), soit au cours de l'étape b).

9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'agent permettant la fixation ultérieure à un support solide des monomères de type 1 est choisi dans le 10 groupe constitué de la biotine, la streptavidine et les haptènes.

10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisée en ce que l'agent permettant la détection ultérieure des monomères de type 2 est choisi dans le groupe constitué des agents radioactifs, fluorescents, colorimétriques ou chimioluminescents.

11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'agent permettant la détection ultérieure des monomères de type 2 est choisi dans le groupe constitué du 32P, 33P, 3H ou 14C, et qu'il est incorporé aux monomères de type 2 au cours de leur préparation par transcription in vitro.

12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 11, caractérisée en ce que les molécules à cribler sont des analogues nucléosidiques et sont ajoutées à l'étape a).

13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à i 1, caractérisée en ce que les molécules à cribler sont choisies dans le groupe constitué des acides nucléiques, des molécules chimiques, et des peptides et sont ajoutées à l'étape b).

14. Acide nucléique comprenant un fragment d'au moins 18 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO: 8 (Illdrev), à titre de médicament.

15. Acide nucléique comprenant un fragment d'au moins 18 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO: 12 (Ncr4), à titre de médicament.

16. Utilisation in vitro d'au moins une molécule induisant la multimérisation d'un ARN non codant replié pour inhiber sa capacité à réguler la réplication et/ou la traduction d'une séquence d'ARN dont il fait partie ou d'une autre séquence d'ARN avec laquelle il interagit.

17. Utilisation in vitro d'au moins une molécule induisant la multimérisation 10 d'un ARN non codant replié pour inhiber la traduction et/ou la réplication d'une séquence d'ARN comprenant ledit ARN non codant replié.

18. Utilisation d'au moins une molécule induisant la multimérisation d'un ARN non codant replié pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber sa capacité à 15 réguler la réplication et/ou la traduction d'une séquence d'ARN dont il fait partie ou d'une autre séquence d'ARN avec laquelle il interagit.

19. Utilisation d'au moins une molécule induisant la multimérisation d'un ARN non codant replié pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la traduction 20 et/ou la réplication d'une séquence d'ARN comprenant ledit ARN non codant replié.

20. Utilisation d'au moins une molécule induisant la multimérisation d'un ARN non codant replié exprimé par un microorganisme pathogène pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une infection d'un mammifère par ce microorganisme pathogène.

21. Utilisation selon la revendication 20, caractérisée en ce que le microorganisme pathogène est un virus à ARN, notamment un picornavirus, un flavivirus, un pestivirus, ou un rétrovirus.

22. Utilisation selon la revendication 21, caractérisée en ce que le virus à ARN est choisi dans le groupe constitué des virus de la poliomyélite (PV), de l'hépatite A (HAV), du rotavirus (HRV), du virus de l'hépatite C, du virus de l'immunodéficience humaine (HIV), ou du virus T lymphotrope humain (HTLV).

23. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 18 à 22, caractérisée 5 en ce qu'au moins une molécule qui induit la multimérisation est un acide nucléique, un peptide ou un analogue nucléosidique.

24. Utilisation selon la revendication 20 caractérisée en ce que le microorganisme pathogène est le virus HCV, l'ARN non codant replié est l'IRES du 10 virus HCV, et le mammifère est un humain.

25. Utilisation selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'au moins une molécule qui induit la multimérisation est un acide nucléique comprenant un fragment d'au moins 18 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 12.

26. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 18 à 23, caractérisée en ce que l'ARN non codant replié est un IRES, un ARN ribosomal, la séquence X 3'-terminale du génome du virus VHC, les séquences 5' non codantes du génome des rétrovirus, notamment les virus de l'immunodéficience humaine (VIH), simiesque (VIS) et féline (FIH), et les séquences de cyclisation des bunyavirus, notamment le hantavirus.

27. Utilisation selon la revendication 26, caractérisée en ce que l'ARN non codant replié est un IRES, notamment un IRES viral choisi dans le groupe comprenant les IRES des picornavirus, notamment des virus de la poliomyélite (PV), de l'hépatite A (HAV), de la fièvre aphteuse (FMDV), de l'encephalomyocardite (EMCV), du rotavirus (HRV) ; des flavivirus, notamment du virus de l'hépatite C; des pestivirus, notamment du virus de la diarrhée virale bovine (BVDV) ou du virus classique de la fièvre porcine; ou des rétrovirus, notamment du virus de l'immunodéficience humaine (HIV), du virus de l'immunodéficience simiesque (SIV), ou du virus T lymphotrope humain (HTLV).

28. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 16 à 27, caractérisée en ce qu'au moins une molécule induisant la multiinérisation a été identifiée par une méthode selon l'une quelconque des revendications 3 à 13.