ES2903127T3 - Terapia génica para trastornos neurodegenerativos - Google Patents

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Abstract

Un virión de AAV recombinante que comprende un vector del virus adeno-asociado autocomplementario (scAAV) para uso en el tratamiento de la atrofia de la médula espinal (AME), donde el vector de scAAV comprende un polinucleótido que codifica una proteína que modula la función motora, donde la expresión de dicha proteína en el SNC resulta en al menos una corrección parcial de la neuropatología y/o estabilización del avance de AME, donde el vector de scAAV comprende proteínas de la cápside del serotipo AAV9, y donde el virión de AAV: (i) se ha de administrar a través de la administración en al menos una región de los núcleos cerebelosos profundos del cerebelo; (ii) se ha de administrar a través de inyección directa en la médula espinal; o (iii) se ha de administrar a través de inyección intracerebroventricular.

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia génica para trastornos neurodegenerativos
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 USC §119 (e) (1) de las Solicitudes Provisionales de EE.UU. N°s 61/174/982, presentada el 2 de mayo de 2009 y 61/268.059, presentada el 8 de junio de 2009.
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se relaciona, generalmente, con métodos para la inducción de genes. En particular, se describen composiciones y métodos para tratar trastornos que afectan la función motora, como la función motora afectada por una enfermedad o lesión del cerebro y/o en la médula espinal.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La terapia génica es una nueva modalidad de tratamiento para trastornos que afectan el sistema nervioso central (SNC). La terapia génica en el SNC ha sido facilitada por el desarrollo de vectores virales capaces de infectar, efectivamente, las neuronas postmitóticas. El sistema nervioso central está compuesto por la médula espinal y el cerebro. La médula espinal transmite información sensorial desde el sistema nervioso periférico hacia el cerebro e información motora desde el cerebro hacia varios efectores. Para una revisión de vectores virales para la inducción de genes al sistema nervioso central, véase Davidson et al., Nature Rev. (2003) 4:353-364.
Los vectores del virus adeno-asociado (AAV) se consideran útiles para la terapia génica en el SNC dado que tienen una toxicidad y un perfil de inmunogenicidad favorables, son capaces de transducir células neuronales y pueden mediar la expresión a largo plazo en el SNC (Kaplitt et al., Nat. Genet. (1994) 8:148-154; Bartlett et al., Hum. Gene Ther. (1998) 9:1181-1186; y Passini et al., J. Neurosci. (2002) 22:6437-6446).
Una propiedad útil de los vectores de AAV radica en la capacidad de algunos vectores de AAV de someterse a un transporte retrógrado y/o anterógrado en las células neuronales. Las neuronas en una región del cerebro están interconectadas por axones a las regiones distales del cerebro, lo que genera un sistema de transporte para la inducción del vector. Por ejemplo, un vector de AAV se puede administrar en las terminales de axón de las neuronas o cerca de ellas. Las neuronas internalizan el vector de AAV y lo transportan en forma retrógrada a lo largo del axón al cuerpo celular. Se ha demostrado que las propiedades similares de adenovirus, HSV, y virus de la pseudorrabia han transportado genes a estructuras distales en el cerebro (Soudas et al., FASEB J. (2001) 15:2283-2285; Breakefield et al., New Biol. (1991) 3:203-218; y deFalco et al., Science (2001) 291:2608-2613).
En varios experimentos se ha informado que la transducción en el cerebro por el serotipo 2 de AAV (AAV2) se limita al sitio de inyección intracraneal (Kaplitt et al., Nat. Genet. (1994) 8:148-154; Passini et al., J. Neurosci. (2002) 22:6437-6446; y Chamberlin et al., Brain Res. (1998) 793:169-175). También pruebas de que el transporte axonal retrógrado de vectores virales neurotróficos, que incluyen vectores de AAV y lentivirales, se puede producir en circuitos seleccionados del cerebro de rata normal (Kaspar et al., Mol. Ther. (2002) 5:50-56; Kasper et al., Science (2003) 301:839-842 y Azzouz et al., Nature (2004) 429:413-417. Roaul et al., Nat. Med. (2005) 11 (4):423-428 y Ralph et al., Nat. Med. (2005) 11(4):429-433 informan que la inyección intramuscular de lentivirus que expresa el silenciamiento de la superóxido dismutasa Cu/Zn humana (SOD1) que interfiere en el comienzo de la enfermedad retardadora del ARN de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en un modelo de roedor terapéuticamente relevante de ELA.
Las células transducidas por los vectores de AAV pueden expresar un producto transgénico terapéutico, como una enzima o un factor neurotrófico, para mediar los efectos beneficiosos por vía intracelular. Estas células también pueden secretar el producto transgénico terapéutico, el cual puede ser tomado, posteriormente por células distales donde pueden mediar sus efectos beneficiosos. Este proceso ha sido descrito como una corrección cruzada (Neufeld et al., Science (1970) 169:141-146).
Una propiedad de los vectores de AAV recombinantes descritos anteriormente es el requisito de que el genoma de AAV del ADN monocatenario (ssADN) debe convertirse en ADN bicatenario (dsADN) antes de la expresión del transgén codificado. Esta etapa puede ser evitarse mediante el uso de vectores autocomplementarios que empaquetan un genoma de repetición invertida que se pliega en el dsADN sin requerir la síntesis del ADN o el apareamiento de bases entre genomas de vector múltiples, lo cual permite aumentar la eficiencia de la transferencia de genes mediada por AAV. Para una revisión de los vectores de AAV autocomplementarios, véase, por ejemplo, McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656.
La atrofia muscular espinal (AME) es un trastorno neuromuscular recesivo autosómico causado por mutaciones en el gen de la neurona motora de la supervivencia (1) (SMN1) y la pérdida de proteína SMN codificada (Lefebvre et al., Cell (1995) 80:155-165). La falta de SMN resulta en la degeneración de la neurona motora en el asta ventral (anterior) de la médula espinal, que deriva en el debilitamiento de los músculos proximales que permiten gatear, caminar, controlar el cuello y de toser (Sumner C.J., NeuroRx (2006) 3:235-245). Por lo tanto, los pacientes con AME presentan mayores tendencias a sufrir neumonía y otros problemas pulmonares, como enfermedad pulmonar restrictiva. El comienzo de la enfermedad y el grado de gravedad están determinados en parte por el gen modificador fenotípico SMN2, el cual es capaz de producir una pequeña cantidad de SMN (Monani et al., Hum. Mol. Genet. (1999) 8:1177-1183; Lorson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96:6307-6311). Por lo tanto, los pacientes con un número elevado de copias de SMN2 (3-4 copias) sufren una forma menos grave de la enfermedad (denominada Tipo II o Tipo III), mientras que 1-2 copias de SMN2 resultan típicamente en la enfermedad Tipo I más grave (Campbell et al., Am. J. Hum. Genet. (1997) 61:40-50; Lefebvre et al., Nat. Genet. (1997) 16:265-269). Actualmente no existen terapias efectivas para AME.
Una estrategia fundamental para el tratamiento de este trastorno monogénico es aumentar los niveles de SMN en pacientes con AME. Un enfoque para lograr esto es modular el gen de SMN2 endógeno con moléculas pequeñas que activan el promotor de SMN2 o corrigen el patrón de empalme de pre-ARNm de SMN2. La alteración del empalme de SMN2 también puede lograrse con oligonucleótidos antisentido y ARN de empalme alternativo. Sin embargo, aunque la modulación de SMN2 in vitro aumentó los niveles de SMN y reconstituyó las gemas nucleares en líneas celulares de AME, los estudios de eficacia con fármacos de molécula pequeña no se han traducido en mejoras medibles en la clínica (Oskoui et al., Nerotherapeutics (2008) 5:499-506).
Foust et al. (2009) Nature Biotechnology 27(1):59-65 se refiere a la inyección de AAV9-GFP a través de la vena facial.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en el descubrimiento de que los viriones de AAV recombinante (rAAV) convencionales y los vectores de AAV autocomplementarios (scAAV) recombinantes, pueden proporcionar genes al SNC con expresión exitosa en el SNC y el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa. Este enfoque de la terapia para la inducción de genes que codifican moléculas terapéuticas que resultan en al menos la corrección parcial de neuropatologías brinda un método altamente deseable para tratar una variedad de trastornos neurodegenerativos, que incluyen AME.
Por lo tanto, en un caso, en la presente se describe un vector del virus adeno-asociado autocomplementario (scAAV) que comprende un polinucleótido que codifica una proteína que modula la función motora en un individuo que sufre de un trastorno neuronal motor. En algunos casos descritas en la presente, el trastorno neuronal motor se selecciona de atrofia muscular espinal (AME), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular bulbar y espinal, ataxia espinocerebelosa, esclerosis lateral primaria (ELP), o lesión traumática de la médula ósea.
En la presente invención, el trastorno neuronal motor es atrofia muscular espinal (AME). Por consiguiente, la invención proporciona un virión de AAV recombinante que comprende un vector del virus adeno-asociado autocomplementario (scAAV), para uso en el tratamiento de la atrofia muscular espinal (AME), donde el vector de scAAV comprende un polinucleótido que codifica una proteína que modula la función motora, donde la expresión de dicha proteína en el SNC resulta en al menos la corrección parcial de la neuropatología y/o estabilización del avance de AME, y donde el vector de scAAV comprende proteínas de la cápside del serotipo AAV9, y donde el virión de AAV:
(i) se ha de administrar a través de la administración en al menos una región de los núcleos cerebelosos profundos del cerebelo;
(ii) se ha de administrar a través de inyección directa en la médula espinal; o
(iii) se ha de administrar a través de inyección intracerebroventricular.
La invención proporciona también el uso de un virión de AAV recombinante en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la atrofia muscular espinal (AME), donde el virión de AAV recombinante comprende un vector del virus adeno-asociado autocomplementario (scAAV) que comprende un polinucleótido que codifica una proteína que modula la función motora, donde la expresión de dicha proteína en el SNC resulta en al menos una corrección parcial de la neuropatología y/o estabilización del progreso de la AME, donde el vector de scAAV comprende proteínas de la cápside del serotipo AAV9, y donde el virión de AAV:
(i) se ha de administrar a través de la administración en al menos una región de los núcleos cerebelosos profundos del cerebelo;
(ii) se ha de administrar a través de inyección directa en la médula espinal; o
(iii) se ha de administrar a través de inyección intracerebroventricular.
En realizaciones adicionales, el polinucleótido presente en el vector de scAAV codifica una proteína de la neurona motora de supervivencia (SMN). En algunas realizaciones, la proteína de SMN es SMN-1 humana. En otras realizaciones, la SMN-1 comprende una secuencia de aminoácido con una identidad de secuencia de al menos un 90% respecto de la secuencia descrita en la Figura 9B. En realizaciones adicionales, SMN-1 comprende una secuencia de aminoácido como se describe en la Figura 9B.
La invención se refiere a un virión de AAV recombinante, que comprende un vector de scAAV como se describió anteriormente.
También se describe en la presente una composición que comprende un virión de AAV recombinante como se describió anteriormente y a un excipiente farmacéuticamente aceptable.
También se describe en la presente un método para modular la función motora en un individuo que sufre de un trastorno neuronal motor que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición anterior a células de un sujeto. En algunos casos, la composición se administra a células in vitro para transducir las células y las células transducidas se administran al sujeto. En casos alternativos, la composición se administra en células in vivo.
También se describe en la presente un método para proporcionar una proteína de SMN a un individuo que sufre de una atrofia muscular espinal (AME), que comprende administrar un virión de AAV recombinante que comprende un vector de AAV, como se describió anteriormente, a células de un sujeto que lo necesita. En algunos casos, la composición se administra a células in vitro para transducir las células y las células transducidas se administran al sujeto. En casos alternativos, la composición se administra en células in vivo.
En cada uno de los métodos anteriores, y en realizaciones de la invención, la composición se puede administrar vía inyección directa en la médula espinal. En otras realizaciones, la composición se administra mediante inyección intracerebroventricular. En realizaciones adicionales, la composición se administra en el ventrículo cerebral lateral. En algunas realizaciones, la composición se administra en los dos ventrículos cerebrales laterales. En otras realizaciones, la composición se administra mediante una inyección intracerebroventricular y una inyección directa en la médula espinal. En realizaciones adicionales, la composición se administra mediante inyección intratecal.
Estas y otras realizaciones se le ocurrirán inmediatamente a los entendidos en la técnica en virtud de la presente divulgación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra la supervivencia de un ratón tratado con AAVhSMN1 respecto de un ratón con AME no tratado. El tratamiento con AAVhSMN1 aumentó la supervivencia en ratón con AME. El ratón con AME no tratado (n = 34, círculos abiertos) tuvo una vida media de 15 días. Ratones con AME tratados a P0 con AAVhSMN1 (n = 24, círculos cerrados) tuvieron una vida media de 50 días (p < 0,0001), que representó un aumento del 233% en la longevidad.
Las Figuras 2A-2C muestran el efecto del tratamiento de terapia génica en niveles de SMN en la médula espinal. Se muestran los niveles de proteína hSMN en los segmentos lumbar (Figura 2A), torácico (Figura 2B) y cervical (Figura 2C) en comparación con ratones con AME no tratado y ratones silvestres. Se realizaron métodos de Western blot en los segmentos lumbar, torácico y cervical de la médula ósea 16 días, entre 58 y 66 días y entre 120 y 220 días después de la inyección. Los western blot de los tres segmentos se cuantificaron y, para controlar los niveles proteicos, se normalizó la SMN en p-tubulina y se representó como un porcentaje del tipo silvestre de la misma edad. Clave (y valores n): AME, ratones inactivados no tratados (n = 5 a los 16 días); AAV, ratones con AME tratados con AAV8-hSMN (n = 7 a los 16 días, n = 5 a los 58 a 66 días); scAAV, ratones con AME tratados con scAAV8-hSMN (n = 5 en cada punto de tiempo). Los valores representan la media ± SEM.
Las Figuras 3A a 3J muestran la distribución sub-celular de la proteína hSMN y la expresión en neuronas motoras de la médula espinal en ratones con AME tratados y no tratados. La proteína hSMN se detectó en forma abundante en el citoplasma de las células transducidas (Figuras 3A y 3B). Además, se detectó proteína hSMN en el núcleo, como se ilustra mediante el par de estructuras tipo gema (punta de flecha) agrandado en el recuadro (Figura 3A). También se detectó la proteína hSMN en las dendritas (Figuras 3B y 3C) y en los axones (Figura 3D) de las neuronas. La proteína hSMN no se detectó en las secciones de tejido de ratones con AME no tratados (Figura 3E). La co-localización de la proteína hSMN (Figura 3F) con ChAT de ratón (Figura 3G) mostró que un subconjunto de células transducidas eran neuronas motoras (Figuras 3H y 3I). El porcentaje de células ChAT que eran inmunopositivas para la proteína hSMN se determinó en 16 (barras blancas) y entre 58 y 66 días (barras negras) (Figura 3J). Los valores representan la media ± SEM.
La Figura 4 muestra conteos de células neuronales motoras en la médula espinal en ratones con AME tratados y no tratados. Se muestran los números promedio de neuronas inmunopositivas para ChAT contadas en secciones de tejido de 10 pm para cada grupo. Los números representan conteos de cada décima de sección de diferentes niveles de los segmentos cervical, torácico, lumbar y sacral. Los valores representan la media ± SEM. Clave: *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.
Las Figuras 5A a 5C muestran el área transversal de miofibra de los grupos musculares en ratones con AME tratados y no tratados. El área transversal de miofibra de los grupos musculares múltiples aumentó con el tratamiento con AAVhSMN1. Los gráficos apilados de los músculos cuádriceps, gastrocnemio e intercostal de los días 16 (Figura 5A) y 58-66 (Figura 5B) mostraron que la distribución de los tamaños de la miofibra eran similares entre ratones con AME tratados y ratones silvestres. El promedio general a los 16 días demostró que el área transversal de miofibra fue significativamente mayor con el tratamiento (Figura 5C). Además, en los días 58 a 66, el área promedio fue estadísticamente similar entre ratones con AME tratados y ratones silvestres de la misma edad en los músculos gastrocnemio e intercostal (Figura 5C). Los valores representan la media ± SEM. Clave: WT, tipo silvestre no tratado; HET, heterocigoto no tratado; AME, inactivado no tratado; AAV, ratones con AME tratados con AAVhSMNI; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.
Las Figuras 6A a 6F muestran la estructura de NMJ en músculos en ratones con AME tratados y no tratados. La estructura en los músculos cuádriceps, gastrocnemio e intercostal mejoró con la terapia génica. Se muestra la unión neuromuscular (NMJ) de los cuádriceps de ratones con AME no tratados (Figura 6A), con AME tratados (Figura 6B), y del tipo silvestre no tratados (Figura 6C) a los 16 días, y de ratones con AME tratados (Figura 6D) y del tipo silvestre no tratados (Figura 6E) a los 58-66 días. La NMJ pre- y post-sináptica se etiquetó con anticuerpo neurofilamento (verde) y con tinción de a-bungarotoxina (roja), respectivamente. La punta de la flecha en el panel principal apunta a NMJ que se destaca en los recuadros a continuación. Se calificaron al menos 100 NMJ en forma aleatoria en cada músculo por animal. Una NMJ normal se definió como que tiene un terminal pre-sináptico que no exhibió la acumulación anormal de proteína de neurofilamento que se muestra en la Figura 6A. Los valores en la Figura 6F representan la media ± SEM. Clave: WT, tipo silvestre no tratado; HET, heterocigoto no tratado; AME, inactivado no tratado; AAV, ratones con AME tratados con AAVhSMN1; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001. Barras de escala: 20 gm.
Las Figuras 7A a 7F muestran los resultados de las pruebas de conducta en ratones con AME tratados y no tratados. Los ratones con AME tratados mostraron mejoras significativas en las pruebas de conducta. Los ratones con AME tratados (asterisco) y del tipo silvestre no tratados (WT) estaban sustancialmente más aptos que los ratones con AME no tratados (etiquetados con 'x') a los 16 días (Figura 7A). Los ratones con AME tratados eran significativamente más pesados que los controles con AME no tratados desde el día 11 en adelante (Figura 7B) Los ratones con AME tratados tuvieron un rendimiento significativamente mejor que los ratones con AME no tratados en las pruebas de reflejo (Figura 7C), geotaxis negativa (Figura 7D), fuerza de agarre (Figura 7E) y patas traseras (Figura 7F). Los ratones con AME tratados eran estadísticamente idénticos a los ratones de tipo silvestre y heterocigoto en las pruebas de reflejo y geotaxis negativa a los 12 a 16 días (Figuras 7C y 7D). Los valores representan la media ± SEM. Clave: ratones con WT no tratados (círculo abierto) heterocigotos no tratados (triángulo abierto); con AME no tratados (cuadrado abierto); con AME tratados con AAVhSMN1 (cuadrado cerrado); *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.
La Figura 8 muestra la supervivencia de ratones no tratados y tratados con scAAVhSMN1. El tratamiento con scAAVhSMN1 aumentó la supervivencia en ratón con AME. Ratones con AME tratados a P0 con scAAVhSMN1 (n = 17, triángulos cerrados) tuvieron una vida media de 157 días (p < 0,0001), en comparación con los 16 días en ratones con AME no tratados (n = 47 círculos abiertos).
Las Figuras 9A-9B (SEQ ID NO.: 1 y 2) muestran la secuencia codificante del ADN (Figura 9A) y la secuencia de aminoácido correspondiente (Figura 9B) de un gen de la neurona motora de supervivencia humana (SMN1) representativo.
Las Figuras 10A a 10F muestran que la expresión scAAV8-hSMN aumenta los conteos de la neurona motora y mejora NMJ en ratones con AME. La Figura 10A muestra el porcentaje de células inmunopositivas para mChAT que se co-localizaron con la expresión de hSMN en la región torácica-lumbar a los 16 días posteriores a la inyección. Las Figuras 10B a 10F muestran los números promedio de células inmunopositivas para mChAT en los segmentos lumbar (Figura 10B), torácico (Figura 10C) y cervical (Figura 10D), y los porcentajes promedio de NMJ colapsadas en los músculos cuádriceps (Figura 10E) e intercostal (Figura 10F) en los días 16, 58 a 66 y 214 a 269. Con referencia a las Figuras 10E y 10F, entre un 75% y un 90% de NMJ en los músculos del cuádriceps e intercostal de ratones con AME no tratados contenía una estructura colapsada anómala a los 16 días (ver Figura 6F). Clave y valores n: Inactivos no tratados con AME (barras abiertas, n = 8 a los 16 días), AAV, AAV8-hSMN (barras sombreadas, n = 8 a los 16 días, n = 5 a los 58-66 días); scAAV, scAAV8-hSMN (barras cerradas, n = 5 en cada punto de tiempo); WT, WT no tratado (barras a cuadros, n = 8 a los 16 días, n = 5 cada uno a los 58-66 días y 216-269 días). Los valores representan la media ± SEM. Las comparaciones estadísticas se realizaron con pruebas post-hoc múltiples de Bonferroni y ANOVA unidireccionales a los 16 días (Figuras 10B - 10F). La prueba t de student bilateral no apareada comparó 1) los dos vectores entre sí a los 16 días (Figura 10A) y a los 58-66 días (Figuras 10B-10D); 2) el número relativo de células para ChAT en los grupos de 58-66d y 214-269d con tratamiento con scAAV8-hSMN (Figuras 10B-10D); 3) el número relativo de NMJ anormales entre ratones con WT no tratados de la misma edad y ratones con AME tratados con scAAV8-hSMN a los 214-269 días (E, F); *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La práctica de la presente invención empleará métodos convencionales de química, bioquímica, técnicas de ADN recombinante e inmunología, dentro de la técnica, salvo que se indique lo contrario. Dichas técnicas se explican por completo en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Fundamental Virology, 2a Edición, vol. I y II (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).
1. DEFINICIONES
Al describir la presente invención se emplearán los siguientes términos, y se definirán como se indica a continuación.
Como se utiliza en la presente divulgación y en las reivindicaciones adjuntas, se debe notar que las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen los referentes en plural salvo que el contenido claramente indique lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a un “receptor de la interleucina” incluye una mezcla de dos o más de los receptores y similares.
Los términos “polipéptido” y “proteína”, utilizados indistintamente en la presente, o una secuencia nucleótida que los codifica, hacen referencia a una secuencia proteica o nucleótida, respectivamente, la cual representa una secuencia nativa, o una variante de esta, o un fragmento de esta. Las proteínas de longitud completa, con o sin la secuencia de señal, y los fragmentos de esta, así como proteínas con modificaciones, como las eliminaciones, adiciones y sustituciones (conservadoras o no conservadoras por naturaleza), a la secuencia nativa, se utilizan en la presente, en la medida en que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de la mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, como por ejemplo, mutaciones de huéspedes que producen las proteínas o los errores debido a la amplificación por PCR. Por lo tanto, las proteínas activas sustancialmente homólogas a la secuencia progenitora, por ejemplo, las proteínas con una identidad del 70, del 80, del 85, del 90, del 95, del 98, del 99%, etc., que retienen la actividad deseada de la molécula nativa, se contemplan para uso en la presente.
Un polipéptido "nativo", como un polipéptido neuronal motor de supervivencia (SMN), se refiere a un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácido que la molécula correspondiente derivada de la naturaleza. Las secuencias nativas se pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir a través de medios recombinantes o sintéticos. El término secuencia “nativa” abarca, específicamente, formas secretadas o truncadas naturales de la molécula específica (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas de variante naturales (por ejemplo, formas alternativamente empalmadas) y variantes alélicas naturales del polipéptido. En diversas realizaciones de la invención, las moléculas nativas descritas en la presente son secuencias nativas maduras o de longitud completa que comprenden las secuencias de aminoácidos de longitud completa que se muestran en las figuras adjuntas. Sin embargo, aunque algunas de las moléculas divulgadas en las figuras adjuntas comienzan con residuos de metionina designados como la posición de aminoácido 1 en las figuras, se pueden emplear otros residuos de metionina situados corriente arriba o corriente abajo de la posición de aminoácido 1 en las figuras como el residuo de aminoácido de partida para la molécula particular. De manera alternativa, dependiendo del sistema de expresión usado, las moléculas descritas aquí pueden carecer de una metionina N-terminal.
Por "variante" se entiende un polipéptido activo como se define aquí que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la correspondiente secuencia nativa de longitud completa, un polipéptido que carece del péptido señal, un dominio extracelular de un polipéptido, con o sin un péptido señal, o cualquier otro fragmento de una secuencia polipeptídica de longitud completa como se describe aquí. Dichas variantes polipeptídicas incluyen, por ejemplo, polipéptidos en los que se añaden, o eliminan, uno o más residuos de aminoácidos en la N- y/o C-terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud completa. Normalmente, una variante tendrá al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 81% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 82% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 83% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 84% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 86% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 87% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 88% de amino identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 89% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 91% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 92% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente a al menos aproximadamente un 93% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 94% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 96% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 97% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente un 98% de identidad de secuencia de aminoácidos y alternativamente al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la correspondiente secuencia nativa de larga duración. Normalmente, los polipéptidos variantes tienen al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, como por ejemplo, al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, por ejemplo, al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, o más.
Las variantes particularmente preferidas incluyen sustituciones que son de naturaleza conservadora, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Específicamente, los aminoácidos generalmente se dividen en cuatro familias: (1) ácido - aspartato y glutamato; (2) básico - lisina, arginina, histidina; (3) no polar - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polar no cargado - glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que un reemplazo aislado de leucina con isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo conservador similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, no tenga un efecto principal en la actividad biológica. Por ejemplo, el polipéptido de interés puede incluir hasta aproximadamente 5 a 10 sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, o incluso hasta aproximadamente 15 a 25 o 50 sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, o cualquier número entre 5 y 50, siempre que la función deseada de la molécula permanezca intacta.
"Homología" se refiere al porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos o dos porciones de polipéptidos. Dos secuencias de ADN o dos secuencias de polipéptidos son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando las secuencias exhiben al menos aproximadamente un 50%, preferiblemente al menos aproximadamente un 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 80%-85%, preferiblemente al menos aproximadamente un 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente un 95%-98% de identidad de secuencia a lo largo de una longitud definida de las moléculas. Como se usa en la presente, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran identidad completa con la secuencia de ADN o polipéptido especificada.
En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos, respectivamente. El porcentaje de identidad se puede determinar mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas alineando las secuencias, contando el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta, y multiplicando el resultado por 100. Se pueden utilizar programas informáticos ya disponibles para ayudar en el análisis, como ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, que se adapta al algoritmo de homología local de Smith y Waterman Advances en Appl. Math. 2:482-489, 1981 para el análisis peptídico. Los programas para determinar la identidad de secuencia nucleótida están disponibles en el Paquete de Análisis de Secuencia de Wisconsin, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, los cuales también se basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas ya están listos para su uso con los parámetros por defecto recomendados por el fabricante y descritos en el Paquete de Análisis de Secuencia de Wisconsin anteriormente mencionado. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre una secuencia nucleótida particular y una secuencia de referencia se puede determinar utilizando el algoritmo de analogía de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización de espacio de seis posiciones nucleótidas.
Otro método para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es el uso del paquete MPSRCH de programas propiedad de la University of Edinburgh, desarrollados por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuidos por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). De este conjunto de paquetes, se puede emplear el algoritmo Smith-Waterman donde se utilizan parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalidad por apertura de hueco de 12, penalidad por extensión de hueco de uno, o un hueco de seis). De los datos generados, el valor “Coincidencia” refleja la “identidad de secuencia”. Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o la similitud entre secuencias son generalmente conocidos en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, utilizado con parámetros por defecto. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP se pueden utilizar junto con los siguientes parámetros por defecto: código genético = estándar; filtro = ninguno; cadena= ambas; corte = 60; expectativa = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificado por = PUNTUACIÓN ALTA; Bases de datos = no redundante, conversiones GenBank EMBL DDBJ PDB GenBank CDS Swiss protein Spupdate PIR. En la técnica se conocen los detalles de estos programas.
De manera alternativa, la homología puede determinarse mediante hibridación de polinucleótidos en condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguido de digestión con nucleasas específicas de cadena simple y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas pueden identificarse en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones rigurosas, como se definen para ese sistema particular. La definición de condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
El término "variante degenerada" significa un polinucleótido que contiene cambios en la secuencia de ácido nucleico del mismo, que codifica un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por el polinucleótido del que se deriva la variante degenerada.
Una "secuencia codificante" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso del ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación se determinan mediante un codón de inicio en el extremo 5 '(amino) y un codón de detención de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia de terminación de la transcripción se puede ubicar 3 'a la secuencia codificante.
Por "vector" se entiende cualquier elemento genético, tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, virus, virión, etc., que es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control apropiados y que puede transferir secuencias de genes a las células. Por lo tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales.
Por "vector recombinante" se entiende un vector que incluye una secuencia de ácido nucleico heteróloga que es capaz de expresión in vivo.
Por "virus recombinante" se entiende un virus que ha sido genéticamente alterado, por ejemplo, mediante la adición o inserción de un constructo de ácido nucleico heterólogo en la partícula.
El término "transgén" se refiere a un polinucleótido que se introduce en una célula y es capaz de transcribirse en ARN y, opcionalmente, traducirse y/o expresarse en condiciones apropiadas. En un aspecto, confiere una propiedad deseada a una célula en la que se introdujo, o de lo contrario conduce a un resultado terapéutico o de diagnóstico deseado.
Los términos "partículas de genoma (gp)" o "equivalentes de genoma", como se usan en referencia a una titulación viral, se refieren al número de viriones que contienen el genoma de ADN de AAV recombinante, independientemente de la infectividad o funcionalidad. El número de partículas del genoma en una preparación particular del vector se puede medir mediante procedimientos como aquellos que se describen en los Ejemplos de la presente, por ejemplo, en Clark et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10:1031-1039; y Veldwijk et al., Mol. Ther. (2002) 6:272-278.
Los términos "unidad de infección (iu)," "partícula infecciosa," o "unidad de replicación”, como se utiliza en referencia a una titulación viral, se refieren al número de partículas del vector de AAV recombinante como se mide mediante un ensayo del centro infeccioso, también conocido como ensayo del centro de replicación, como se describe, por ejemplo, en McLaughlin et al., J. Virol. (1988) 62:1963-1973.
El término "unidad de transducción (tu)", como se utiliza en referencia a una titulación viral, se refiere al número de partículas del vector de AAV recombinante infecciosas que derivan en la producción de un producto transgén funcional como se mide a través de ensayos funcionales, como aquellos descritos en los Ejemplos de la presente, o por ejemplo, en Xiao et al., Exp. Neurobiol. (1997) 144:1 13-124; o en Fisher et al., J. Virol. (1996) 70:520-532 (Ensayo LFU).
El término "transfección" se utiliza para hacer referencia a la absorción de ADN extraño por una célula, y una célula ha sido “transfectada” cuando se introduce ADN exógeno en la membrana celular. En la técnica se conocen, generalmente, un número de técnicas de transfección. Véase, por ejemplo, Graham et al. (1973) Virology, 52 :456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu et al. (1981) Gene 13:197. Estas técnicas se pueden utilizar para introducir una o más porciones de ADN exógenas en las células huésped adecuadas.
El término "heterólogo" en su relación con secuencias de ácidos nucleicos tales como secuencias codificantes y secuencias de control, denota secuencias que normalmente no están unidas, y/o que no están normalmente asociadas con una célula particular. Por lo tanto, una región "heteróloga" de un constructo de ácido nucleico o un vector es un segmento de ácido nucleico dentro de o unido a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentra, naturalmente, en asociación con la otra molécula. Por ejemplo, una región heteróloga de un constructo de ácido nucleico podría incluir una secuencia codificante flanqueada por secuencias que no se encuentran en asociación con la secuencia codificante natural. Otro ejemplo de una secuencia codificante heteróloga es un constructo en el que la propia secuencia codificante no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo). De forma similar, una célula transformada con un constructo que normalmente no está presente en la célula se consideraría heteróloga para los fines de esta invención. La variación alélica o los eventos mutacionales naturales no dan lugar al ADN heterólogo, como se usa en la presente.
Una secuencia de "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ADN o ARN. El término secuencias de captura incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos de ADN y ARN como por ejemplo, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxil-metil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudo-uracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanina, 2 metiladenina, 2-metilguanina, 3-metil-citosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxi-amino-2-metil tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracilo-5-oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracilo-5-oxiacético, uracilo-5-o ácido xiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.
El término "secuencias de control" de ADN se refiere colectivamente a secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores cadena arriba, orígenes de replicación, sitios internos de entrada al ribosoma («IRES"), potenciadores y similares, que proporcionan colectivamente la replicación, transcripción y traducción de una secuencia de codificación en una célula receptora. No es necesario que todas estas secuencias de control estén siempre presentes, en la medida en que la secuencia de codificación seleccionada pueda replicarse, transcribirse y traducirse en una célula huésped apropiada.
El término "promotor" se usa en la presente en su sentido ordinario para referirse a una región nucleótida que comprende una secuencia reguladora de ADN, en donde la secuencia reguladora se deriva de un gen que es capaz de unirse a ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante (dirección 3') cadena abajo. Los promotores de la transcripción pueden incluir "promotores inducibles" (donde la expresión de una secuencia de polinucleótidos operativamente ligada al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), "promotores reprimibles" (donde la expresión de una secuencia polinucleótida operativamente ligada al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.) y "promotores constitutivos".
"Ligado operativamente" se refiere a una disposición de elementos en la que los componentes así descritos están configurados para realizar su función habitual. Por lo tanto, las secuencias de control ligadas operativamente a una secuencia de codificación son capaces de efectuar la expresión de la secuencia de codificación. Las secuencias de control no necesitan estar contiguas a la secuencia codificante, siempre que funcionen para dirigir su expresión. De este modo, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias interpuestas transcritas pero no traducidas entre una secuencia promotora y la secuencia codificante y la secuencia promotora todavía se puede considerar "ligada operativamente" a la secuencia codificante.
El término "sistema nervioso" incluye tanto el sistema nervioso central como el sistema nervioso periférico. El término "sistema nervioso central" o "SNC" incluye todas las células y tejidos del cerebro y la médula espinal de un vertebrado. El término "sistema nervioso periférico" se refiere a todas las células y tejido de la porción del sistema nervioso fuera del cerebro y la médula espinal. Por lo tanto, el término "sistema nervioso" incluye, a modo no taxativo, células neuronales, células gliales, astrocitos, células en el líquido cefalorraquídeo (LCR), células en los espacios intersticiales, células en las cubiertas protectoras de la médula espinal, células epidurales (es decir, células fuera de la duramadre), células en tejidos no neuronales adyacentes o en contacto con o inervadas por tejido neuronal, células en el epineuro, perineuro, endoneuro, funículo, fascículo, y similares.
"Activo" o "actividad" a los efectos de la presente invención se refiere a formas de una proteína terapéutica que retienen una actividad biológica del polipéptido nativo o natural correspondiente. La actividad puede ser mayor, igual o menor que la observada con el polipéptido nativo o natural correspondiente.
Por "aislado", cuando se hace referencia a una secuencia nucleótida, se entiende que la molécula indicada está presente en la ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. Por lo tanto, una "molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido particular" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido en cuestión; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o porciones adicionales que no afecten negativamente las características básicas de la composición.
Con el fin de describir la posición relativa de las secuencias nucleótidas en una molécula de ácido nucleico particular a lo largo de la presente solicitud, tal como cuando una secuencia nucleótida particular se describe como situada "cadena arriba", "cadena abajo", "en imprimación 3 ( 3 ')" o "en imprimación 5 (5')" en relación a otra secuencia, Se deberá entender que es la posición de las secuencias en la hebra "sentido” o "codificación" de una molécula de ADN a la que se refiere como es convencional en la técnica.
El término "aproximadamente", particularmente en referencia a una cantidad dada, pretende abarcar desviaciones de más o menos un cinco por ciento.
Los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" se utilizan indistintamente en este documento y se refieren a un vertebrado, preferiblemente un mamífero. Los mamíferos incluyen, a modo no taxativo, murinos, roedores, simios, humanos, animales de granja, animales para deporte y mascotas.
El término "modular" como se utiliza en la presente significa variar la cantidad o intensidad de un efecto o resultado, por ejemplo, para potenciar, aumentar, disminuir, reducir o eliminar.
Como se utiliza en la presente, el término "mejorar" es sinónimo de "aliviar" y significa reducir o aclarar. Por ejemplo, uno puede aliviar los síntomas de una enfermedad o trastorno haciendo que la enfermedad o los síntomas de la enfermedad sean menos graves.
Los términos "terapéutico", "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" de una composición o agente, como se proporciona en la presente, se refieren a una cantidad suficiente de la composición o agente para proporcionar la respuesta deseada, tal como la prevención, el retraso del inicio o el alivio de los síntomas en un sujeto o un logro de un resultado biológico deseado, tal como la corrección de la neuropatología, por ejemplo, patología celular asociada con una enfermedad neuronal motora tal como atrofia muscular espinal (AME). El término "corrección terapéutica" se refiere a ese grado de corrección que da como resultado la prevención o el retraso del inicio o el alivio de los síntomas en un sujeto. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la afección que se está tratando y la macromolécula particular de interés, el modo de administración y similares. Una cantidad "efectiva" apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada por un entendido en la técnica mediante el uso de experimentación rutinaria.
"El tratamiento de" o "tratar" una enfermedad particular incluye: (1) prevenir la enfermedad, es decir, prevenir el desarrollo de la enfermedad o hacer que la enfermedad se produzca con menos intensidad en un sujeto que puede estar expuesto o predispuesto a la enfermedad pero que aún no experimenta o muestra síntomas de la enfermedad, (2) inhibir la enfermedad, es decir, detener el desarrollo o revertir el estado de enfermedad, o (3) aliviar los síntomas de la enfermedad, es decir, disminuir el número de síntomas experimentados por el sujeto, así como cambiar la patología celular asociada con la enfermedad.
2. MODOS DE APLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Aunque se puede utilizar un cierto número de métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente, en la presente se describen los métodos y materiales preferidos.
Para la presente invención es fundamental el descubrimiento de que el suministro de viriones de rAAV que contienen el ADNc de la neurona motora 1 de supervivencia humana (hSMN1) al SNC de un modelo de ratón agresivo de atrofia muscular espinal (EMA) produjo la expresión de SMN1 a lo largo de la médula espinal. Los ratones con AME tratados contenían un mayor número de neuronas motoras en comparación con los mutantes no tratados y de la misma edad. Además, la evaluación del tamaño de miofibras demostró que el tamaño de miofibras individuales de una variedad de grupos musculares en ratones con AME tratados se aproximaba a los observados en ratones de tipo salvaje. Además, la estructura de la unión neuromuscular (NMJ) en ratones con AME tratados fue similar a la de ratones de tipo salvaje, que contrastaba con la de ratones con AME no tratados que mostraba una acumulación anormal de proteína de neurofilamentos en los extremos presinápticos. Los ratones con AME tratados también mostraron mejoras significativas en una batería de pruebas de comportamiento que sugieren que la NMJ era funcional. De manera importante, los ratones tratados con AAV recombinante tuvieron una esperanza de vida significativamente mayor en comparación con sus contrapartes no tratadas. Los ratones con AME tratados con un vector de VAAr autocomplementario también mostraron una mejora notable en la supervivencia media, incluso en comparación con el tratamiento con vectores de VAAr convencionales, no autocomplementarios.
Estos resultados demuestran que el aumento del gen SMN1 mediado por AAV dirigido al SNC es altamente eficaz para abordar tanto las patologías neuronales como musculares de la AME y evidencia la utilidad de la terapia génica viral como estrategia terapéutica para tratar y prevenir patologías neuronales y musculares, tales como AME, así como otras enfermedades que afectan la función motora. Las técnicas de terapia génica descritas pueden usarse solas, o en conjunto con fármacos tradicionales.
Para comprender mejor la invención, a continuación se proporciona una discusión más detallada con respecto a patologías neuronales motoras y moléculas terapéuticas, así como con respecto a diversos métodos de administración de genes para uso con la presente invención.
Patologías neuronales motoras y moléculas terapéuticas
La divulgación proporciona composiciones y métodos para modular, corregir o aumentar la función motora en un sujeto afectado con un trastorno neuronal motor o con daño neuronal motor. A efectos ilustrativos únicamente, el sujeto puede sufrir uno o más de atrofia muscular espinal (AME), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular bulbar y espinal, ataxia espinocerebelosa, esclerosis lateral primaria (ELP), o lesión traumática de la médula ósea. Sin estar limitados por una teoría particular, la patología asociada con el daño neuronal motor puede incluir la degeneración de la neurona motora, la gliosis, las anomalías del neurofilamento, la pérdida de fibras mielinizadas en los tractos corticoespinales y las raíces ventrales. Por ejemplo, se han reconocido dos tipos de inicio: el inicio bulbar, que afecta a las neuronas motoras superiores (corteza y neuronas motoras del tronco del encéfalo), afecta los músculos faciales, el habla y la deglución; y el inicio en la extremidad, que afecta a las neuronas motoras inferiores (neuronas motoras de la médula espinal), se refleja por espasticidad, debilidad generalizada, atrofia muscular, parálisis e insuficiencia respiratoria. En ELA, los sujetos tienen inicio bulbar y en las extremidades. En ELP, los sujetos solo tienen inicio bulbar. La presente invención se refiere al tratamiento de la AME.
Por lo tanto, en ciertos casos, el sujeto está provisto de constructos de rAAV que codifican una molécula biológicamente activa, cuya expresión en el SNC da como resultado una corrección al menos parcial de la neuropatología y/o la estabilización de la progresión de la enfermedad, como la prevención, el retraso de inicio o alivio de los síntomas en un sujeto o un logro de un resultado biológico deseado, que incluye, por ejemplo, un cambio en la patología celular asociada con una enfermedad neuronal motora descrita anteriormente.
A modo ejemplificativo, el transgén presente en el constructo de rAAV puede ser, a modo no taxativo, una proteína de la neurona motora de la supervivencia (mediante el gen SMN1 o el gen SMN2), el factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF- 1), calbindina D28, parvalbumina, HIF1 -alfa, SIRT-2, V eGf como VEGF165, CNTF (factor neurotrófico derivado del cerebro), sonic hedgehog (shh), eritropoietína (EPO), lisil oxidasa (LOX), progranulina, prolactina, ghrelina, neuroserpina, angiogenina, y lactógeno placentario.
La base molecular de AME, un trastorno neuromuscular autosómico recesivo, es la pérdida homocigótica del gen de la neurona motora de supervivencia 1 (SMN1), que también se conoce como SMN Telomérico. Una copia casi idéntica del gen SMN1, llamado SMN2, que también se conoce como SMN centromérico, se encuentra en humanos y modula la gravedad de la enfermedad. La expresión del gen SMN1 normal resulta únicamente en la expresión de la proteína de la neurona motora de supervivencia (SMN). La expresión del gen SMN2 da como resultado aproximadamente entre un 10 y un 20% de la proteína SMN y entre un 80 y un 90% de una proteína SMNdelta7 inestable/no funcional. Solo el 10% de las transcripciones de SMN2 codifica una proteína funcional de longitud completa idéntica a SMN1. Esta diferencia funcional entre ambos genes resulta de una mutación traduccionalmente silenciosa que, sin embargo, interrumpe al potenciador de empalme exónico que causa la omisión del exón 7 en la mayoría de las transcripciones de SMN2. La proteína SMN desempeña un papel bien establecido en el ensamblaje del espliceosoma y también puede mediar el tráfico de ARNm en el axón y el extremo nervioso de las neuronas.
Se conocen las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de diversas moléculas SMN1 y proteínas SMN. Véase, por ejemplo, las Figuras 9A-9B; Números de acceso NCBI NM_000344 (humano), NP_000335 (humano), NM_11420 (ratón), EU 791616 (porcino), NM_001131470 (orangután), n M_131191 (pez cebra), BC062404 (rata), NM_001009328 (gato), NM_001003226 (perro), NM_175701 (vaca). De manera similar, se conocen varias secuencias de s Mn 2. Véase, por ejemplo, los números de acceso NCBI NM_022876, NM_022877, NM_017411, NG_008728, BC_000908, BC070242, DQ185039 (todos humanos).
El factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-I) es una proteína terapéutica para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, que incluyen trastornos neuronales motores debido a sus muchas acciones a niveles de neuraxis diferentes (véase Dore et al., Trends Neurosci (1997) 20:326-331). Por ejemplo, se cree que en el cerebro reduce la apoptosis neuronal y glial, protege a las neuronas contra la toxicidad inducida por desestabilizantes del hierro, de la colchicina y del calcio, peróxidos y citocinas. Aparentemente, modula la liberación de neurotransmisores, acetilcolina y glutamato, e induce la expresión de la proteína básica del neurofilamento, tublina y mielina. En la médula espinal, se cree que IFG-I modula la actividad de ChAT y atenúa la pérdida del fenotipo colinérgico, mejora el brote de la neurona motora, mejora la mielinización, inhibe la desmielinización, estimula la proliferación de la neurona motora y la diferenciación de las células precursoras, y promueve la división, la maduración y el crecimiento de la célula de Schwann. En el músculo, IFG-I induce la formación de grupos receptores de acetilcolina en la unión neuromuscular y aumenta la función neuromuscular y la resistencia del músculo.
El gen del IGF-1 tiene una estructura compleja, la cual es bien conocida en la técnica. Tiene al menos dos productos de ARNm alternativamente empalmados que surgen de la transcripción del gen. Hay un péptido-aminoácido 153, conocido por varias denominaciones que incluyen IGF-IA o IGF-IEa, y un péptido-aminoácido 195, conocido por varias denominaciones que incluyen IGF-IB o IGF-IEb. La forma Eb también es conocida como Ec en seres humanos. La forma madura de IGF-1 es un polipéptido-aminoácido 70. Tanto IFG-IEa como IFG-IEb contienen el péptido-aminoácido maduro 70, pero difieren en la secuencia y en la longitud de sus extensiones con terminal carboxilo. Las proteínas de IGF-1, así como las secuencias peptídicas de IFG-IEa y IFG-IEb son conocidas y se describen en, por ejemplo, la publicación internacional No. WO 2007/146046.
Los ADNc genómicos y funcionales de IFG-I humano, así como la información adicional respecto del gen de IFG-I y sus productos están disponibles en el No. de acceso de Unigene NM_000618.
Calbindin D28K (también denominada calbindina D28) y parvalbúmina son proteínas ligadoras de calcio, las cuales se cree están involucradas en el regulador de calcio. Sin estar limitados por una teoría particular, la homeostasis del calcio parece estar alterada en sujetos con trastornos neuronales motores (por ejemplo, ELA) y niveles bajos de calbindin-D28K y/o parvalbúmina pueden aumentar la vulnerabilidad de las neuronas motoras reduciendo su capacidad para manejar una mayor carga de calcio. Esta reducción puede derivar en la lesión celular y eventual muerte de la neurona motora. Nueva evidencia sugiere que las neuronas ricas en proteínas ligadoras de calcio, como calbindin D28K y parvalbúmina, son resistentes a la degeneración.
HIF-I es una proteína heterodimérica compuesta por dos subunidades: (i) una subunidad p constitutivamente expresada también conocida como translocador nuclear de hidrocarburo de arilo (ARNT) (que es compartido por otros factores de transcripción relacionados (por ejemplo, el receptor de dioxina/aril hidrocarburo (DR/AhR)); y (ii) una subunidad a (Véase, por ejemplo, la publicación internacional No. WO 96/39426, que describe la purificación de afinidad reciente y la clonación molecular de HIF-Ia. Ambas subunidades son miembros de la familia hélice-bucle-hélice (bHLH)-PAS de los factores de transcripción. Estos dominios regulan la unión y dimerización del ADN. El dominio de transactivación reside en el extremo C-terminal de la proteína. La región básica consiste de aproximadamente 15 aminoácidos predominantemente básicos responsables de la unión directa de ADN. Esta región es adyacente a dos hélices a anfipáticas, separadas por un bucle de longitud variable, el cual forma la interfaz de dimerización primaria entre miembros de la familia (Moore, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:10436-10441). El dominio PAS abarca entre 200 y 300 aminoácidos que contienen dos regiones altamente hidrófobas, ligeramente conservadas, aproximadamente 50 aminoácidos designados como PAS A y PAS B. Esta subunidad de HIF-Ia es inestable durante condiciones normóxicas, la sobreexpresión de esta subunidad en células cultivadas en niveles de oxígeno normales es capaz de inducir la expresión de genes normalmente inducidos por hipoxia. El reemplazo de la región C-terminal (o de transactivación) de la proteína del factor inducible por hipoxia con un dominio de transactivación fuerte de una proteína activadora transcripcional como por ejemplo, el virus del herpes simple (HSV) VP 16, NFkB o factores de transcripción en levadura GAL4 y GCN4 está diseñado para estabilizar a la proteína en condiciones normóxicas y brindar una activación fuerte, constitutiva y transcripcional. Véase, por ejemplo, la publicación internacional No. WO 2008/042420 para una descripción y secuencia de una proteína del factor inducible por hipoxia estabilizado representativo que es una proteína de fusión híbrida/quimérica que consiste de los dominios de unión de ADN y dimerización a partir de HIF-Ia y el dominio de transactivación de la proteína HSV VP16. Véase también, las patentes de Estados Unidos No. 6,432,927 y 7,053,062 para una descripción de un híbrido de HIF-Ia constitutivamente estable.
Los miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) están dentro de los modulares más poderosos de la biología vascular. Regulan la vasculogénesis, la angiogénesis y el mantenimiento vascular. Se han descrito cuatro variantes moleculares diferentes de VEGF. La variante de aminoácido 165 es la forma molecular predominante encontrada en células y tejidos normales. También se conocen una forma más corta y menos abundante con una eliminación de 44 aminoácidos entre las posiciones 116 y 159 (VEGF121), una forma más larga de 24 residuos básicos en la posición 116 (VEGF189), y otra forma más larga con una inserción de 41 aminoácidos (VEGF206), que incluye la inserción de aminoácido 24 que se encuentra en VEGF189. VEGF121 y VEGF165 son proteínas solubles. VEGF189 y VEGF206 parecen estar mayormente asociadas por células. Todas las versiones de VEGF son biológicamente activas. Véase, por ejemplo, Tischer et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:11947-11954, que describe la secuencia de VEGF165 (véase también, No. de acceso a GenBank AB021221), VEGF121 (véase también, No. de acceso a GenBank AF214570) y VEGF189; y Houck et al., Mol. Endocrinol. (1991) 5:1806-1814, que describe la secuencia de VEGF206.
CNTF (factor neurotrófico ciliar) es una neurocitocina expresada por las células gliales en nervios periféricos y el sistema nervioso central. CNTF se reconoce generalmente por su función en apoyo y supervivencia de los tipos de células no neuronales y neuronales. Véase, por ejemplo, Vergara, C y Ramirez, B; Brain Res, Brain Res. Rev. (2004) 47: 161-73.
Sonic hedgehog (Shh) controla procesos de desarrollo importantes, que incluyen la supervivencia de la célula neuronal y glial.
La eritropoyetina (EPO) es un regulador principal de las células progenitoras eritroides. Sin embargo, se expresa, funcionalmente, en el sistema nervioso y se ha informado que tiene efectos neuroprotectores. Véase, por ejemplo, Bartesaghi, S., 2005. Neurotoxicology, 26:923-8. Los genes que codifican la EPO humana y otra EPO mamífera han sido clonados, secuenciados y expresados y muestran un alto grado de homología de secuencia en la región de codificación entre las especies. Wen et al., Blood (1993) 82:1507-1516. La secuencia del gen que codifica la EPO humana nativa, así como los métodos para obtenerla, se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos No. 4,954,437 y 4,703,008, así como en Jacobs et al. (1985) Nature 313:806-810; Lin et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7580; Número de publicación internacional WO 85/02610; y número de publicación de patente europea 232,034 B1. Asimismo, se conocen las secuencias de los genes que codifican EPO nativa felina, canina y porcina y ya están disponibles (No. De acceso a GenBank: L10606; L13027; y L10607, respectivamente), y también se conoce la secuencia del gen codificador del mono (Macaca mulatta) y está disponible (No. de acceso a GenBank: L10609).
La lisil oxidasa (LOX) oxida la cadena lateral de peptidil-lisina convirtiendo algunos residuos de lisina en alfa-aminoadípico-delta-semialdehído. Este es un cambio pos-translacional que, por ejemplo, permite la reticulación covalente de las cadenas de componente de colágeno y elastina. Estabiliza los depósitos fibrosos de estas proteínas en la matriz extracelular. LOX también puede oxidar lisina en una variedad de proteínas catiónicas, lo que sugiere que sus funciones son más amplias que la estabilización o la matriz extracelular. LOX se sintetiza como una preproteína; emerge de la célula como proLOX y se procesa proteolíticamente en la enzima activa. Véase, por ejemplo, Lucero, HA y Kagan, HM, Cell MoI. Life Sci. (2006) 63:2304-2316.
Progranulina (PGRN) es una proteína pleitrópica. Las mutaciones en el gen causan degeneración lobular frontotemporal. PGRN en el SNC se expresa mediante microglía y neuronas y tiene participación en el desarrollo del cerebro. PGRN también participa en procesos de “modelado de tejido” múltiples que incluyen desarrollo, reparación de heridas y tumorogénesis. PGRN se convierte en granulina (GRN) mediante las enzimas elastasa. Si bien la progranulina tiene propiedades tróficas, las GRN se asemejan más a los mediadores inflamatorios. Los estudios de expresión génica de modelos animales de enfermedad del SNC muestran un aumento diferencial en la PRGN combinada con activación e inflamación microglial. El aumento en la expresión de PGRN puede estar estrechamente relacionado con la activación microglial y la neuroinflamación. Además, la expresión de PGRN aumenta en la microglía activada en muchas enfermedades neurodegenerativas, que incluyen la enfermedad de la neurona motora y la enfermedad de Alzheimer. Los estudios han identificado mutaciones en PGRN como causa de enfermedad neurodegenerativa e indican la importancia de la función de PGRN para la supervivencia neuronal.
Los oligodendrocitos, las células mielinizantes del SNC, continúan siendo generados por células precursoras de oligodendrocitos (OPC) durante la edad adulta y son necesarios para la reparación intrínseca del daño a la mielina en el SNC adulto. Los eventos fisiológicos que modulan la proliferación de OPC y la generación de nuevos oligodendrocitos mielinizantes en el SNC adulto son ampliamente conocidos. Recientemente se ha informado que los pacientes con esclerosis múltiple (EM), una enfermedad de desmielinización, tienen una tasa de recaída reducida durante el tercer trimestre del embarazo, lo que sugiere que las hormonas influyen en la generación de oligodendrocitos. La remisión en pacientes con EM se correlaciona con una disminución en el número y el tamaño de las lesiones activas de la sustancia blanca. El embarazo en ratones deriva en un aumento en la generación de nuevos oligodendrocitos y en el número de axones mielinizados en el SNC maternal (Gregg et al., J. Neurosci. (2007) 27:1812-1823). Se ha demostrado que la prolactina, una hormona que se estabiliza durante la etapa final del embarazo, regula la proliferación de OPC durante el embarazo y promueve la reparación de sustancia blanca en ratones hembra vírgenes. (Gregg et al., J. Neurosci. (2007) 27:1812-1823).
El lactógeno de la placenta humana (hPL), una hormona que también alcanza su punto máximo durante el tercer trimestre del embarazo, puede tener una influencia similar en la generación de oligodendrocitos. El hPL tiene una serie de actividades biológicas que son cualitativamente similares a la hormona de crecimiento humana (hGH) y la prolactina y parece ser un importante regulador de la producción de IGF-I. Se ha demostrado que hGH y IGF-I son estimuladores de la mielinización en el SNC adulto (Carson et al., Neuron (1993) 10:729-740; Peltwon et al., Neurology (1977) 27:282-288). Por lo tanto, el tratamiento de enfermedades del SNC que involucran la desmielinización como, EM, ELA, ACV, lesión de la médula espinal se pueden beneficiar de las terapias a base de PRL o hPL, como, por ejemplo, mediante la inyección intraventricular de un vector viral que expresa rhPRL o hPL.
La ghrelina es una hormona gástrica que actúa como mediadora de la liberación de la hormona de crecimiento. Véase, por ejemplo, Wu, et al., Ann. Surg. (2004) 239:464.
La neuroserpina es miembro de la familia del inhibidor de la serín-proteasa. En algunas afecciones al SNC, la neuroserpina puede tener un rol neuroprotector potencialmente a través del bloqueo de los efectos de tPA. Véase, por ejemplo, Galliciotti, G y Sonderegger, P, Front Biosci (2006) 11:33; Simonin, et al., (2006) 26:10614; Miranda, E y Lomas, DA, Cell Mol Life Sci (2006) 63:709.
La angiogenina es miembro de la superfamilia de ARNsa. Es un constituyente normal de circulación, pero también ha estado implicada como factor de riesgo en trastornos neuronales motores.
En ciertas composiciones y métodos descritos en la presente, se puede administrar más de un transgén que codifica más de una de las moléculas terapéuticas descritas anteriormente, en el que cada transgén está operativamente unido a un promotor para permitir la expresión de los transgenes a partir de un único vector de AAV. En métodos adicionales, los transgenes pueden estar operativamente unidos al mismo promotor. Cada transgén codifica una molécula biológicamente activa, cuya expresión en el SNC da como resultado una corrección al menos parcial de la neuropatología. Además, en los casos en que se administra más de un transgén, los transgenes pueden administrarse a través de más de un vector de AAV, en el que cada vector de AAV comprende un transgén operativamente unido a un promotor.
Las moléculas nativas, así como los fragmentos activos y análogos de los mismos, que retienen la actividad biológica deseada, tal como se mide en cualquiera de los diversos ensayos y modelos animales que incluyen los descritos en la presente, están destinados a su uso con la presente invención.
Los polinucleótidos que codifican la proteína deseada para uso con la presente invención, pueden prepararse usando técnicas estándar de biología molecular. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos que codifican las moléculas descritas anteriormente se pueden obtener usando métodos recombinantes, tales como el cribado de cADN y bibliotecas genómicas de células que expresan el gen, o derivando el gen de un vector que se sabe que lo incluye. El gen de interés también se puede producir sintéticamente, en lugar de clonarse, en base a las secuencias conocidas. Las moléculas se pueden diseñar con codones apropiados para la secuencia particular. La secuencia completa luego se ensambla a partir de oligonucleótidos solapantes preparados por métodos estándar y ensamblados en una secuencia codificante completa. Véase, por ejemplo, Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al., Science (1984) 223:1299; y Jay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.
Por lo tanto, las secuencias nucleótidas particulares se pueden obtener de vectores que albergan las secuencias deseadas o sintetizarse completamente o en parte utilizando diversas técnicas de síntesis de oligonucleótidos conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuando sea apropiado. Véase, por ejemplo, Sambrook, supra. Un método para obtener secuencias nucleótidas que codifican las secuencias deseadas es hibridar conjuntos complementarios de oligonucleótidos sintéticos solapantes producidos en un sintetizador de polinucleótidos automático convencional, seguido del ligado con una ADN ligasa apropiada y amplificación de la secuencia de nucleótidos ligada mediante PCR. Véase, por ejemplo, Jayaraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:4084-4088. Asimismo, se puede utilizar la síntesis dirigida a oligonucleótidos (Jones et al., Nature (1986) 54:75-82), mutagénesis dirigida a oligonucleótidos de regiones nucleótidas preexistentes (Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327 y Verhoeyen et al., Science (1988) 239:1534-1536), y relleno enzimático de oligonucleótidos separados utilizando ADN polimerasa T4 (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:10029-10033) para proporcionar moléculas para uso en los métodos en cuestión.
Una vez producidos, se proporcionan constructos utilizando vectores virales recombinantes como se describe a continuación.
Técnicas de administración génica del AAV
Constructos descritos anteriormente se pueden administrar al sujeto en cuestión usando cualquiera de varias técnicas de administración de genes de rAAv. En la técnica se conocen varios métodos mediados por AAV para la administración de genes. Como se describe adicionalmente a continuación, los genes pueden administrarse directamente al sujeto o, De manera alternativa, administrarse ex vivo, a células apropiadas, tales como células derivadas del sujeto, y las células reimplantadas en el sujeto.
Se han desarrollado diversos sistemas de vectores de AAV para la administración génica Los vectores de AAV se pueden construir fácilmente utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos No. 5,173,414 y 5,139,941; las publicaciones internacionales No. w O 92/01070 (publicada el 23 de enero de 1992) y w O 93/03769 (publicada el 4 de marzo de 1993); Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol. (1988) 8:3988-3996; Vincent et al., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. Current Opinion in Biotechnology (1992) 3:533-539; Muzyczka, N. Current Topics in Microbiol. and Immunol. (1992) 158:97-129; Kotin, R.M. Human Gene Therapy (1994) 5:793-801; Shelling and Smith, Gene Therapy (1994) 1:165-169; y Zhou et al., J. Exp. Med. (1994) 179:1867-1875. Los sistemas del vector de AAV también se describen con más detalle a continuación.
El genoma de AAV es una molécula de ADN monocatenaria lineal que contiene aproximadamente 4681 nucleótidos. El genoma de AAV generalmente comprende un genoma interno no repetitivo flanqueado en cada extremo por repeticiones terminales invertidas (ITR). Las ITR tienen aproximadamente 145 pares de bases (pb) de longitud. Las ITR tienen múltiples funciones, que incluyen proporcionar orígenes de la replicación del ADN y señales de empaquetamiento para el genoma viral. La parte interna no repetida del genoma incluye dos grandes marcos de lectura abiertos, conocidos como los genes de replicación de AAV (rep) y cápside (cap). Los genes rep y cap codifican proteínas virales que permiten que el virus se replique y empaquete en un virión. En particular, se expresa una familia de al menos cuatro proteínas virales a partir de la región rep de AAV, Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40, nombradas de acuerdo con su peso molecular aparente. La región cap de AAV codifica al menos tres proteínas, VPI, VP2 y VP3.
El AAV se ha diseñado para liberar genes de interés eliminando la parte interna no repetitiva del genoma de AAV (es decir, los genes rep y cap) e insertando un gen heterólogo entre las ITR. El gen heterólogo típicamente está unido funcionalmente a un promotor heterólogo (constitutivo, específico de célula o inducible) capaz de dirigir la expresión génica en las células diana del paciente en condiciones apropiadas. Los ejemplos de cada tipo de promotor son bien conocidos en la técnica. Las señales de terminación, como los sitios de poliadenilación, también se pueden incluir.
AAV es un virus dependiente de un auxiliar; es decir, requiere la co-infección con un virus auxiliar (por ejemplo, adenovirus, herpesvirus o vacuna), para formar viriones de AAV. Ante la ausencia de co-infección con un virus auxiliar, el AAV establece un estado latente en el que el genoma viral se inserta en el cromosoma de una célula huésped, pero no se producen viriones infecciosos. La infección subsiguiente por un virus auxiliar "rescata" el genoma integrado, lo que le permite replicar y empaquetar su genoma en un virión infeccioso de AAV. Mientras que AAV puede infectar células de diferentes especies, el virus auxiliar debe ser de la misma especie que la célula huésped. Por lo tanto, por ejemplo, el AAV humano se replicará en células caninas coinfectadas con un adenovirus canino.
Los viriones de AAV recombinantes que comprenden el gen de interés se pueden producir utilizando una variedad de técnicas reconocidas descritas con más detalle a continuación. Los virus de AAV del tipo silvestre y auxiliar se pueden utilizar para brindar las funciones de replicación necesarias para producir viriones de rAAV (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5,139,941).
De manera alternativa, un plásmido, que contiene los genes de función auxiliar, en combinación con una infección por uno de los virus auxiliares conocidos, se puede utilizar como la fuente de las funciones de replicación (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5,622,856 y la patente de Estados Unidos No. 5,139,941). De manera similar, un plásmido, que contiene genes de función accesoria se pueden utilizar en combinación con infección por AAV del tipo silvestre para brindar las funciones de replicación necesarias. Estos tres enfoques, cuando se utilizan en combinación con un vector de rAAV, son suficientes para producir viriones de rAAV. También el entendido en la técnica puede emplear otros enfoques, bien conocidos en la técnica, para producir viriones de rAAV.
En un caso de la presente divulgación, se utiliza un método de triple transfección (descrito en detalle en la patente de Estados Unidos No. 6,001,650) para producir viriones de rAAV porque este método no requiere el uso de un virus auxiliar infeccioso, permitiendo que los viriones de rAAV se produzcan sin ningún virus auxiliar detectable presente. Esto se logra mediante el uso de tres vectores para la producción de viriones de rAAV: un vector de función auxiliar de AAV, un vector de función accesoria y un vector de expresión de rAAV. Un entendido en la técnica apreciará, sin embargo, que las secuencias de ácido nucleico codificadas por estos vectores pueden proporcionarse en dos o más vectores en diversas combinaciones.
Como se explica en la presente, el vector de función auxiliar de AAV codifica las secuencias de "función auxiliar de AAV" (es decir, rep y cap), que funcionan in trans para la replicación y encapsidación productivas de AAV. Preferiblemente, el vector de función auxiliar del AAV soporta la producción eficiente de vector de AAV sin generar ningún virión de AAV wt detectable (es decir, viriones de AAV que contienen genes rep y cap funcionales). Un ejemplo del vector, pHLP19, se describe en la patente de Estados Unidos No. 6,001,650.
Los genes rep y cap del vector de función auxiliar de AAV pueden derivarse de cualquiera de los serotipos de AAV conocidos, como se explicó anteriormente. Por ejemplo, el vector de función auxiliar de AAV puede tener un gen rep derivado de AAV-2 y un gen cap derivado de a AV-6; un entendido en la técnica reconocerá que son posibles otras combinaciones de genes rep y cap, siendo la característica definitoria la capacidad de soportar la producción de viriones de rAAV.
El vector de función accesoria codifica secuencias nucleótidas para funciones virales y/o celulares no derivadas de AAV de las cuales AAV es dependiente para la replicación (es decir, "funciones accesorias"). Las funciones accesorias incluyen aquellas funciones requeridas para la replicación de AAV, que incluyen, a modo no taxativo, aquellas porciones implicadas en la activación de la transcripción del gen de AAV, empalme de ARNm de AAV específico de la etapa, replicación del ADN de AAV, síntesis de productos de expresión cap y ensamblaje de cápside de AAV. Las funciones accesorias basadas en virus pueden derivarse de cualquiera de los virus auxiliares bien conocidos, como adenovirus, herpesvirus y virus vacuna. En una ocasión, se usa el plásmido de función accesoria pLadeno5 (los detalles con respecto a pLadeno5 se describen en la patente de Estados Unidos No. 6,004,797). Este plásmido proporciona un conjunto completo de funciones accesorias de adenovirus para la producción de vectores de AAV, pero carece de los componentes necesarios para formar adenovirus competente para la replicación.
Con el fin de comprender mejor el AAV, a continuación se proporciona una discusión más detallada sobre los vectores de expresión de AAV recombinante y las funciones auxiliares y accesorias de AAV.
Vectores de expresión de AAV recombinante
Los vectores de expresión de AAV recombinante (rAAV) se construyen usando técnicas conocidas para proporcionar al menos como componentes enlazados operativamente en la dirección de la transcripción, elementos de control que incluyen una región de iniciación transcripcional, el polinucleótido de interés y una región de terminación transcripcional. Los elementos de control se seleccionan para que sean funcionales en la célula de interés, tal como en una célula de mamífero. El constructo resultante que contiene los componentes unidos operativamente está limitada (5 'y 3') con secuencias funcionales de ITR de AAV.
Las secuencias nucleótidas de las regiones de ITR de AAV son conocidas. Véase, por ejemplo, Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2da. Edición, (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.) para la secuencia de AAV-2. Las ITR de AAV utilizadas en los vectores de la invención no necesitan tener una secuencia nucleótida silvestre, y se pueden alterar, por ejemplo, por la inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos. Además, las ITR de AAV pueden derivarse de cualquiera de varios serotipos de AAV, que incluyen, a modo no taxativo, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, a Av -7, AAV-8, AAV-9, etc. Además, las ITR 5 'y 3' que flanquean una secuencia nucleótida seleccionada en un vector de expresión de AAV no necesitan ser necesariamente idénticas o derivarse del mismo serotipo o aislarse de AAV, siempre que funcionen como se desea, es decir, que permitan la escisión y el rescate de la secuencia de interés del genoma o vector de la célula huésped, y que permitan la integración de la molécula de ADN en el genoma de la célula receptora cuando los productos del gen Rep de AAV están presentes en la célula.
Las moléculas de polinucleótidos adecuadas para uso en vectores de AAV tradicionales tendrán un tamaño menor o de aproximadamente 5 kilobases (kb). La secuencia polinucleótida seleccionada está operativamente unida a elementos de control que dirigen la transcripción o expresión de los mismos en el sujeto in vivo. Dichos elementos de control pueden comprender secuencias de control normalmente asociadas con el gen seleccionado. De manera alternativa, se pueden emplear secuencias de control heterólogas. Las secuencias de control heterólogas útiles incluyen generalmente las derivadas de secuencias que codifican genes de mamíferos o virales. Los ejemplos no limitantes de promotores incluyen, a modo no taxativo, el promotor del citomegalovirus (CMV) (Kaplitt et al., Nat. Genet. (1994) 8:148-154), promotor de CMV/ p3-globina humana (Mandel et al., J. Neurosci. (1998) 18:4271-4284), promotor de GFAP (Xu et al., Gene Ther. (2001) 8:1323-1332), el promotor de la enolasa específica neuronal de 1,8-kb (NSE) (Klein et al., Exp. Neurol. (1998) 150:183-194), promotor de beta-actina de pollo (CBA) (Miyazaki, Gene (1989) 79:269-277), el promotor de la p-glucuronidasa (Gu SB) (Shipley et al., Genetics (1991) 10:1009-1018), y promotores de ubiquitina tales como los aislados de ubiquitina A humana, ubiquitina B humana, y ubiquitina C humana, como se describe en la patente de Estados Unidos No. 6,667,174. Para prolongar la expresión, otros elementos reguladores, como el elemento post-regulador del virus de la hepatitis de marmota, (WPRE) se pueden unir al transgén, en forma operativa y adicional, (Donello et al., J. Virol. (1998) 72:5085-5092) o el sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH). Asimismo, las secuencias derivas de los genes no virales, como el gen murino de la metalotioneína, también encontrará uso en la presente. Las secuencias promotoras están disponibles comercialmente de, por ejemplo, Stratagene (San Diego, CA).
Para algunas aplicaciones de la terapia génica en el SNC, puede ser necesario controlar la actividad transcripcional. A dicho fin, la regulación farmacológica de la expresión génica con vectores virales se puede obtener incluyendo varios elementos reguladores y promotores que responden a fármacos como se describe, por ejemplo, en Habermaet al., Gene Ther. (1998) 5.1604-16011; y Ye et al., Science (1995) 283:88-91.
El vector de expresión de AAV que aloja la molécula polinucleótida de interés unida por ITR de AAV, se puede construir mediante la inserción directa de las secuencias seleccionadas en un genoma de AAV, el cual ha tenido los marcos de lectura abiertos (ORF) de AAV principales. Otras porciones del genoma de AAV también se pueden eliminar, en la medida que la porción suficiente de las ITR siga permitiendo las funciones de replicación y de empaquetado. Los constructos se pueden diseñar utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos No. 5,173,414 y 5,139,941; las publicaciones internacionales No. WO 92/01070 (publicada el 23 de enero de 1992) y W o 93/03769 (publicada el 4 de marzo de 1993); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka (1992) Current Topics in Microbiol and Immunol.
158:97-129; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling y Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; y Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.
De manera alternativa, las ITR de AAV pueden extirparse del genoma viral o de un vector de AAV que contiene el mismo y fusionarse en los extremos 5 'y 3' de un constructo de ácido nucleico seleccionado que está presente en otro vector utilizando técnicas de unión estándar, tales como las descritas en Sambrook et al. al., supra. Por ejemplo, las uniones se pueden lograr en 20 mM de Tris-Cl pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, 33 pg/ml de BSA, 10 mM-50 mM de NaCl, y 40 pM de ATP, 0,01-0,02 unidades (Weiss) de ADN ligasa de T4 a 0°C (para ligadura de "extremo adhesivo") o 1 mM de ATP, 0,3-0,6 unidades (Weiss) de ADN ligasa de T4 a 14°C (para ligadura de "extremo romo"). Las uniones intermoleculares de "extremo adhesivo" se realizan generalmente a concentraciones de ADN total de 30 a 100 pg/ml (concentración final total de 5-100 nM). Los vectores de AAV que contienen ITR han sido descritos en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5,139,941. En particular, se describen varios vectores de AAV que están disponibles en la American Type Culture Collection ("ATCC") con los números de acceso 53222, 53223, 53224, 53225 y 53226.
De acuerdo con la invención, los vectores de expresión de rAAV se proporcionan como constructos de rAAV autocomplementarios. Típicamente, el ADN de rAAV se empaqueta en la cápside viral como una molécula de ADN monocatenario (ssDNA) de aproximadamente 4600 nucleótidos de longitud. Después de la infección de la célula por el virus, la única cadena de ADN se convierte en una forma de ADN bicatenario (dsADN). Solo el dsADN es útil para las proteínas de la célula que transcriben el gen o los genes contenidos en ARN. Por lo tanto, el esquema de replicación convencional de AAV requiere una síntesis de novo de una cadena de ADN complementario. Esta etapa de conversión del genoma de AAV de ssADN en dsADN antes de la expresión se puede eludir mediante el uso de vectores autocomplementarios (sc).
Los vectores autocomplementarios se producen por apareamiento base de cadenas complementarias de dos virus infecciosos, que no requieren síntesis de ADN (véase, por ejemplo, Nakai et al., J. Virol. (2000) 74:9451-9463). Este emparejamiento base entre cadenas, o apareamiento de cadenas (SA), es posible porque el AAV empaquete la cadena de ADN positivo o negativo con igual eficacia (Berns, K.I., Microbiol. Rev. (1990) 54:316-329).
De este modo y sin estar limitados en cuanto a la teoría, la necesidad de conversión de dsADN, bien por síntesis de SA o de ADN, puede eludirse por completo empaquetando ambas cadenas como una sola molécula. Esto se puede lograr aprovechando la tendencia de AAV a producir genomas de repeticiones invertidas diméricas durante el ciclo de replicación de AAV. Si estos dímeros son lo suficientemente pequeños, se pueden empaquetar de la misma manera que los genomas de AAV convencionales, y las dos mitades de la molécula de ssADN pueden plegarse y formar pares de base para formar una molécula de dsADN de la mitad de longitud. La conversión de dsADN es independiente de la síntesis de ADN de la célula huésped y la concentración del vector (McCarty et al., Gene Ther. (2001) 8:1248-1254).
Los constructos víricos de scAAV incluyen aproximadamente 4,6 kb y pueden empaquetarse en la cápside de AAV normal. Cada uno de los serotipos de AAV conocidos es capaz de empaquetar genomas de scAAV con una eficacia similar (véase, por ejemplo, Sipo et al., Gene Ther. (2007) 14:1319-1329). Por lo tanto, en ciertos casos descritos en la presente, el vector de scAAV comprende proteínas de la cápside de serotipos seleccionados entre los serotipos AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9. Sin embargo, un vector de scAAV puede comprender proteínas de la cápside de cualquiera de los serotipos conocidos o proteínas de la cápside modificada conocidas en la técnica. Estos vectores de scAAV también pueden ser vectores de pseudotipo que comprenden los que contienen el genoma de un serotipo de AAV en la cápside de un segundo serotipo de AAV. Dichos vectores pueden comprender, por ejemplo, un vector de AAV que contiene la cápside de AAV2 y el genoma de AAV1 o un vector de AAV que contiene la cápside de AAV5 y el genoma de AAV2 (Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-81). De acuerdo con la invención, el vector de scAAV comprende proteínas de la cápside de serotipo AAV9.
Inicialmente, se creía que la secuencia del transgén en un vector de scAAV solo podría comprender aproximadamente 2,2 kb. Sin embargo, parece haber una latitud mayor en la capacidad de empaquetado que lo que se creía anteriormente. Por ejemplo, Wu et al., Human Gene Ther. (2007) 18:171-182 empaquetó exitosamente constructos de scAAV-2 que exceden 3.300 pb y mostró genomas de repetición invertida diméricos que fueron totalmente resistentes al ADNsa. Estos vectores produjeron los aumentos esperados en la eficiencia de la transducción sobre ssAAV con pruebas de células cultivadas.
Los vectores de scAAV se pueden producir generando plásmidos vectoriales que son aproximadamente la mitad del tamaño del genoma convencional combinados con la purificación selectiva de la forma infecciosa bicatenaria, o mediante el uso de plásmidos vectoriales de aproximadamente medio genoma con una mutación en una de las secuencias de resolución terminal del virus AAV que proporciona la síntesis del virus bicatenario. Ambas estrategias generan y - genomas virales de cadena que están unidos en forma covalente a una repetición de terminal.
En particular, la generación de genomas de AAV monoméricos normales se basa en la resolución eficiente de las dos ITR a su vez, con cada ronda de síntesis de ADN. Esta reacción está mediada por la actividad de ADNss endonucleasa de las dos isoformas más grandes de repetición de AAV. El nickeado de la ITR en el sitio de resolución terminal es seguido por el alargamiento del ADN del nick por el ADN polimerasa del huésped.
Los genomas diméricos se forman cuando la repetición falla al cortar el sitio de resolución terminal antes de que sea alcanzado por el complejo de replicación iniciado en el otro extremo.
El rendimiento de los genomas diméricos en una preparación de scAAV puede aumentarse drásticamente inhibiendo la resolución en una repetición terminal. Esto se logra fácilmente eliminando la secuencia del sitio de resolución terminal de una ITR, de forma que la proteína Rep no puede generar el corte de ADNss esencial (véase, por ejemplo, McCarty et al., Gene Ther. (2003) 10:2112-2118 y Wang et al., Gene Ther. (2003) 10:2105-2111). El complejo de replicación iniciado en la otra ITR se copia, posteriormente, a través de la horquilla y de regreso hacia el extremo iniciador. La replicación avanza hasta el final de la molécula modelo, dejando una repetición invertida de dsADN con una ITR de tipo salvaje en cada extremo y la ITR mutada en el medio. Esta repetición dímera invertida puede experimentar rondas de replicación normales desde los dos extremos de ITR de tipo salvaje. Cada recombinación comprende una repetición invertida de ADNss con una ITR completa en cada extremo y una ITR mutada en el medio. El empaquetado en la cápside de AAV comienza en el extremo 3’ de la cadena desplazada. La producción de scAAV a partir de constructos con una ITR mutada típicamente produce más del 90% de genomas diméricos.
La producción y la purificación del vector de scAAV a partir de constructos de ITR mutados es el mismo que el de ssAAV convencional, como se describe más adelante. Sin embargo, si se usa dot blot o Southern blot, el vector de ADN se aplica preferiblemente a las membranas de hibridación en condiciones alcalinas para evitar la renaturalización de las cadenas complementarias. Además, es posible que se produzca un sitio falso de nickeado de rep lo suficientemente cerca de la ITR mutada para permitir la resolución terminal y la generación de genomas de monómero. Esto puede evitarse típicamente girando el casete transgén con respecto a las repeticiones terminales mutantes y de tipo salvaje.
Véase, por ejemplo, McCarty, D.M., Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656; McCarty et al., Gene Ther. (2001) 8:1248-1254; McCarty et al., Gene Ther. (2003) 10:2112-2118; Wang et al., Gene Ther. (2003) 10:2105-2111); Wu et al., Human Gene Ther. (2007) 18:171-182; publicaciones de patente de Estados Unidos No. 2007/0243168 y 2007/0253936, así como los ejemplos en la presente, para métodos para producir constructos de scAAV.
A los fines de la invención, las células huésped adecuadas para producir viriones de rAAV a partir de los vectores de expresión de AAV (vectores convencionales o sc) incluyen microorganismos, células de levadura, células de insectos y células de mamífero, que pueden usarse o han sido utilizadas como receptores de una molécula de ADN heteróloga y que son capaces de crecer en, por ejemplo, cultivo en suspensión, un biorreactor o similar. El término incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Por lo tanto, una "célula huésped", como se usa en la presente, generalmente se refiere a una célula que ha sido transfectada con una secuencia de ADN exógeno. En la práctica de la presente invención, se prefieren las células de la línea celular humana estable 293 (fácilmente disponible a través de, por ejemplo, la American Type Culture Collection bajo el Número de Acceso ATCC CRL1573). Particularmente, la línea celular humana 293 es una línea celular embrionaria humana de riñón que ha sido transformada con fragmentos de ADN del adenovirus tipo 5 (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59), y expresa los genes E1 a y E1b adenovirales (Aiello et al. (1979) Virology 94:460). La línea celular 293 ya está transfectada y brinda una plataforma particularmente conveniente en donde producir viriones de rAAV.
Funciones auxiliares de AAV
Las células huésped que contienen los vectores de expresión de AAV descritos anteriormente deben ser capaces de proporcionar funciones auxiliares de AAV con el fin de replicar y encapsidar las secuencias nucleótidas flanqueadas por las ITR de AAV para producir viriones de rAAV. Las funciones auxiliares de AAV son generalmente secuencias de codificación derivadas de AAV que pueden expresarse para proporcionar productos génicos de AAV que, a su vez, funcionan en trans para la replicación productiva de AAV. Las funciones auxiliares de AAV se usan en la presente invención para complementar las funciones de AAV necesarias que faltan en los vectores de expresión de AAV. De este modo, las funciones auxiliares de AAV incluyen uno o ambos de los principales ORF de AAV, concretamente las regiones de codificación rep y cap, o sus homólogos funcionales.
Por “región de codificación de rep de AAV” se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de replicación Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40. Se ha demostrado que estos productos de expresión de Rep poseen muchas funciones, que incluyen reconocimiento, unión y nickeado del origen de AAV de la replicación de ADN, actividad de ADN helicasa y modulación de la transcripción de promotores de AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión Rep se requieren colectivamente para replicar el genoma de AAV. Para una descripción de la región codificante rep de AVV, véase, por ejemplo Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; y Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801. Los homólogos adecuados de la región codificante rep de a Av incluyen el gen rep del herpesvirus 6 (HHV-6), el cual también se conoce por mediar la replicación de ADN de AAV-2 (Thomson et al. (1994) Virology 204:304-311).
Por “región de codificación cap de AAV” se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de replicación de la cápside VP1, VP2, y VP3 u homólogos funcionales de estas. Estos productos de expresión Cap suministran las funciones de empaquetado que son requeridas, colectivamente para el empaquetado del genoma viral. Para una descripción de la región de codificación cap de AAV, véase, por ejemplo, Muzyczka, N. y Kotin, R.M. (supra).
Las funciones auxiliares de AAV se introducen en la célula huésped mediante la transfección de la célula huésped con un constructo auxiliar de AAV antes de o simultáneamente con la transfección del vector de expresión de AAV. Los constructos auxiliares de AAV se usan, por lo tanto, para proporcionar al menos una expresión transitoria de los genes rep y/o cap de AAV para complementar las funciones faltantes de AAV que son necesarias para la infección productiva por AAV. Los constructos auxiliares de AAV carecen de ITR de AAV y no pueden replicarse ni empaquetarse por sí solos.
Estos constructos pueden estar en forma de un plásmido, fago, transposón, cósmido, virus o virión. Se han descrito varios constructos auxiliares de AAV, tales como los plásmidos comúnmente utilizados pAAV / Ad y pIM29+45 que codifican los productos de expresión tanto Rep como Cap. Véase, por ejemplo, Samulski et al. (1989) J. Virol.
63:3822-3828; y McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945. Se ha descrito un número de otros vectores que codifican los productos de expresión Rep y/o Cap. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5,139,941.
Funciones accesorias de AAV
La célula huésped (o la célula de empaquetamiento) también debe ser capaz de proporcionar funciones no derivadas de AAV, o "funciones accesorias", para producir viriones de rAAV. Las funciones accesorias son funciones virales y/o celulares no derivadas de AAV de las cuales AAV es dependiente para su replicación. Por lo tanto, las funciones accesorias incluyen al menos aquellas proteínas no de AAV y ARN que se requieren en la replicación de AAV, incluidos aquellos implicados en la activación de la transcripción del gen de AAV, empalme de ARNm de AAV específico de etapa, replicación de ADN de AAV, síntesis de productos de expresión de Cap y ensamblaje de cápside de AAV. Las funciones accesorias basadas en virus pueden derivarse de cualquiera de los virus auxiliares conocidos.
En particular, las funciones accesorias pueden introducirse y luego expresarse en células huésped utilizando métodos conocidos por los entendidos en la técnica. Normalmente, las funciones accesorias se proporcionan mediante la infección de las células huésped con un virus auxiliar no relacionado. Se conocen varios virus auxiliares adecuados, que incluyen adenovirus; herpesvirus tales como virus del herpes simple tipo 1 y 2; y virus vacuna. Las funciones accesorias no virales también encontrarán uso aquí, tales como las proporcionadas por sincronización celular utilizando cualquiera de varios agentes conocidos. Véase, por ejemplo, Buller et al. (1981) J. Virol.
40:241-247; McPherson et al. (1985) Virology 147:217-222; Schlehofer et al. (1986) Virology 152:110-117.
En forma alternativa, se pueden proporcionar funciones accesorias utilizando un vector de función accesoria como se define a continuación. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 6,004,797 y la publicación internacional No. WO 01/83797.
Las secuencias de ácido nucleico que proporcionan las funciones accesorias pueden obtenerse de fuentes naturales, tales como del genoma de una partícula de adenovirus, o construirse utilizando métodos recombinantes o sintéticos conocidos en la técnica. Como se explicó anteriormente, se ha demostrado que no se requiere el complemento completo de genes de adenovirus para las funciones auxiliares accesorias. En particular, se ha demostrado que los mutantes de adenovirus incapaces de replicación de ADN y síntesis genética tardía son permisivos para la replicación de AAV. Ito et al., (1970) J. Gen. Virol. 9:243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45:317. De manera similar, los mutantes dentro de las regiones E2B y E3 han demostrado que apoyan la replicación de AAV, e indican que las regiones E2B y E3 probablemente no están involucradas en brindar funciones accesorias. Carter et al., (1983) Virology 126:505. Sin embargo, los adenovirus defectuosos en la región E1, o que tienen una región E4 eliminada, no pueden apoyar la replicación de AAV. Por lo tanto, las regiones E1A y E4 probablemente sean necesarias para la replicación de AAV, ya sea en forma directa o indirecta. Laughlin et al., (1982) J. Virol. 41:868; Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter et al., (1983) Virology 126:505. Otros mutantes Ad caracterizados incluyen: E1B (Laughlin et al. (1982), supra; Janik et al. (1981), supra; Ostrove et al., (1980) Virology 104:502); E2A (Handa et al., (1975) J. Gen. Virol. 29:239; Strauss et al., (1976) J. Virol. 17:140; Myers et al., (1980) J. Virol. 35:665; Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers et al., (1981) J. Biol. Chem. 256:567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter et al. (1983), supra); y E4 (Carter et al.(1983), supra; Carter (1995)). Aunque los estudios de las funciones accesorias proporcionadas por los adenovirus que tienen mutaciones en la región codificante E1B han producido resultados conflictivos, Samulski et al., (1988) J. Virol. 62:206-210, se ha informado que se requiere E1B55k para la producción de viriones de AAV, mientras que no sucede lo mismo con E1 B19k. Asimismo, la publicación internacional WO 97/17458 y Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938-945, describen los vectores de la función accesoria que codifican varios genes Ad. Los vectores de función accesoria particularmente preferidos comprenden una región codificante de ARN asociado en forma viral al adenovirus, una región codificante E4 de adenovirus ORF6, una región codificante E2A de adenovirus 72 kD, una región codificante E1A de adenovirus, y una región E1B de adenovirus que carece de una región de codificación E1B55k intacta. Estos vectores se describen en la publicación internacional No. WO 01/83797.
Como consecuencia de la infección de la célula huésped con un virus auxiliar, o la transfección de la célula huésped con un vector de función accesoria, se expresan funciones accesorias que transcriben el constructo auxiliar de AAV para producir proteínas Rep y/o Cap de AAV. Los productos de expresión Rep extirpan el ADN recombinante (incluido el ADN de interés) del vector de expresión de AAV. Las proteínas Rep también sirven para duplicar el genoma de AAV. Las proteínas Cap expresadas se ensamblan en cápsides, y el genoma de AAV recombinante se empaqueta en las cápsides. Por lo tanto, se produce la replicación productiva de AAV y el ADN se empaqueta en viriones de rAAV. Un ''virión de AAV recombinante" o ''virión de rAAV" se define en la presente como un virus infeccioso con defectos de replicación que incluye una cubierta de proteína de AAV, que encapsula una secuencia nucleótida heteróloga de interés flanqueada en ambos lados por ITR de AAV.
Después de la replicación de AAV recombinante, los viriones de rAAV se pueden purificar a partir de la célula huésped utilizando una variedad de métodos de purificación convencionales, tales como cromatografía en columna, gradientes de CsCl y similares. Por ejemplo, puede usarse una pluralidad de etapas de purificación de columna, tales como purificación sobre una columna de intercambio aniónico, una columna de afinidad y/o una columna de intercambio catiónico. Véase, por ejemplo, la publicación internacional No. WO 02/12455. Además, si se emplea una infección para expresar las funciones accesorias, el virus auxiliar residual puede inactivarse, utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, el adenovirus se puede inactivar calentándose a temperaturas de aproximadamente 60°C durante, por ejemplo, 20 minutos o más. Este tratamiento inactiva de forma efectiva solo el virus auxiliar ya que el AAV es extremadamente estable al calor mientras que el adenovirus auxiliar es termolábil.
Los viriones de rAAV resultantes que contienen la secuencia nucleótida de interés pueden usarse entonces para la administración génica que utiliza las técnicas descritas a continuación.
Composiciones y administración
A. Composiciones
Una vez producidos, los viriones de rAAV que codifican el gen de interés se formularán en composiciones adecuadas para el suministro. Las composiciones comprenderán material génico suficiente para producir una cantidad terapéuticamente efectiva del gen de interés, es decir, una cantidad suficiente para (1) prevenir el desarrollo de la enfermedad o hacer que la enfermedad se produzca con menos intensidad en un sujeto que puede estar expuesto o predispuesto a la enfermedad pero que aún no experimenta o muestra síntomas de la enfermedad, (2) inhibir la enfermedad, es decir, detener el desarrollo o revertir el estado de enfermedad, o (3) aliviar los síntomas de la enfermedad, es decir, disminuir el número de síntomas experimentados por el sujeto, así como cambiar la patología celular asociada con la enfermedad.
Las dosis adecuadas también dependerán del mamífero en tratamiento (por ejemplo, un ser humano o un primate no humano u otro mamífero), de la edad y la condición general del sujeto que se tratará, la gravedad de la afección bajo tratamiento, el modo de administración, entre otros factores. Un entendido en la técnica puede determinar fácilmente una cantidad eficaz apropiada y a continuación se proporcionan cantidades representativas.
Las composiciones también contendrán un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos excipientes incluyen cualquier agente farmacéutico que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición, y que puede administrarse sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sorbitol, cualquiera de los diversos compuestos TWEEN, y líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables en el mismo, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares, pueden estar presentes en tales vehículos. Una discusión detallada de los excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
Las formulaciones pueden ser líquidas o sólidas, por ejemplo, liofilizadas. Las formulaciones también se pueden administrar como aerosoles.
Una formulación particularmente útil comprende el virión de VAAr de interés en combinación con uno o más alcoholes dihídricos o polihídricos, y, opcionalmente, un detergente, tal como un éster de sorbitán. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 6,764,845.
B. Administración
En general, los viriones recombinantes se introducen en el sujeto usando técnicas de transducción in vivo o in vitro. Si se transduce in vitro, la célula receptora deseada se eliminará del sujeto, se transducirá con el vector recombinante y se reintroducirá en el sujeto. De manera alternativa, se pueden usar células singénicas o xenogénicas donde esas células no generarán una respuesta inmune inapropiada en el sujeto. Las células adecuadas para el suministro a mamíferos huésped incluyen tipos celulares de mamífero provenientes de órganos, tumores o líneas celulares. Por ejemplo, se pueden usar células humanas, murinas, de cabra, ovinos, bovinos, de perro, de gato y porcinas. Los tipos de células adecuadas para su uso incluyen, a modo no taxativo, fibroblastos, hepatocitos, células endoteliales, queratinocitos, células hematopoyéticas, células epiteliales, miocitos, células neuronales y células madre. Asimismo, las células progenitoras neuronales se pueden transducir in vitro y se pueden suministrar al SNC.
Las células se pueden transducir in vitro combinando viriones recombinantes con la célula deseada en medios apropiados, y las células se pueden cribar para aquellas células que albergan el ADN de interés utilizando técnicas convencionales tales como Southern blots y/o PCR, o usando marcadores seleccionables. Las células transducidas pueden luego formularse en composiciones farmacéuticas, como se describe anteriormente, y la composición introducirse en el sujeto mediante diversas técnicas como se describe a continuación, en una o más dosis.
Para la administración in vivo, los viriones recombinantes se formularán en composiciones farmacéuticas y una o más dosificaciones se pueden administrar directamente de la manera indicada. Para la identificación de estructuras en el cerebro humano, véase, por ejemplo, The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI, y Blood Supply, 2da. ed., eds. Deuteron et al., Springer Vela, 1999; Atlas of the Human Brain, eds. Mai et al., Academic Press; 1997; y Co-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional Proportional System: An Approach to Cerebral Imaging, eds. Tamarack et al., Thyme Medical Pub., 1988. Para una identificación de estructuras en el cerebro de un ratón, véase, por ejemplo The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates, 2da. ed., Academic Press, 2000. Si se desea, la estructura cerebral humana se puede correlacionar con estructuras similares en el cerebro de otro mamífero. Por ejemplo, la mayoría de los mamíferos, que incluyen seres humanos y roedores, muestran una organización topográfica similar de las proyecciones entorrinal - del hipocampo, con neuronas en la parte lateral de la corteza entorrinal lateral y medial que se proyectan en la parte dorsal o polo septal del hipocampo, mientras que la proyección al hipocampo ventral se origina principalmente de neuronas en partes medias de la corteza entorrinal (Principles of Neural Science, 4ta ed., eds Kandel et al., McGraw-Hill, 1991; The Rat Nervous System, 2da ed., ed. Paxinos, Academic Press, 1995). Además, las células de la capa II de la corteza entorrinal se proyectan hacia el giro dentado y pueden terminar en los dos tercios externos de la capa molecular del giro dentado. Los axones de las células de la capa III se proyectan bilateralmente a las áreas del cornu ammonis CA1 y CA3 del hipocampo, y terminan en la capa molecular stratum lacunosum.
El vector se puede administrar, específicamente, a una región particular del sistema nervioso central, especialmente a una región particular del cerebro, mediante microinyección esterotáxica. Por ejemplo, el día de la cirugía, los pacientes tendrán fijada la base del marco estereotáxico (atornillada al cráneo). El cerebro con una base de marco estereotáxica (compatible con IRM con marcaciones fiduciarias) se fotografiará mediante una IRM de alta resolución. Las imágenes de la IRM se transferirán a una computadora que ejecuta software estereotáxico. Se usará una serie de imágenes coronales, sagitales y axiales para determinar el sitio diana de la inyección vectorial y la trayectoria. El software traduce directamente la trayectoria en coordenadas tridimensionales apropiadas para el marco estereotáxico. Los orificios se taladran por encima del sitio de entrada y el aparato estereotáxico se localiza con la aguja implantada a la profundidad dada. El vector en un vehículo farmacéuticamente aceptable se inyectará a continuación. El vector se administra, posteriormente mediante inyección directa en el sitio diana principal y se transporta, retrógradamente, a los sitios diana distales mediante axones. Se pueden utilizar rutas adicionales, por ejemplo, la aplicación córtica superficial en visualización directa u otra aplicación no estereotáxica.
El AAV recombinante de un serotipo se puede utilizar en los métodos descritos, donde el AAV recombinante puede ser un AAV auto complementario o un AVV no autocomplementario. El serotipo del vector viral utilizado en ciertos casos se selecciona del grupo que consiste de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, y AAV9 (véase, por ejemplo, Gao et al. (2002) PNAS, 99:11854 11859; y Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Se pueden utilizar otros serotipos además de los enumerados aquí. Además, los vectores de AAV pseudotipados también se pueden utilizar en los métodos aquí descritos. Los vectores de AAV pseudotipados son aquellos que contienen el genoma de un serotipo de AAV en la cápside de un segundo serotipo de AAV; por ejemplo, un vector de AAV que contiene la cápside de AAV2 y el genoma de AAV1 o un vector de AAV que contiene la cápside de AAV5 y el genoma de AAV2 (Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-81). El vector de scAAV utilizado en la invención comprende proteínas de la cápside de AAV9.
Los viriones o células recombinantes transducidos in vitro pueden administrarse directamente al tejido neuronal como los nervios periféricos, la retina, los ganglios de la raíz dorsal, la unión neuromuscular, así como el SNC, mediante inyección en, por ejemplo, la región ventricular, como uno o ambos de los ventrículos laterales, así como del cuerpo estriado (p. ej., el núcleo caudado o putamen del cuerpo estriado), el cerebelo, la médula espinal y la unión neuromuscular, con una aguja, catéter o dispositivo relacionado, utilizando técnicas neuroquirúrgicas conocidas en la técnica, como por inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000 ; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; y Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000). En una realización ilustrativa, la administración se realiza por inyección directa de una solución de vector de titulación alta en la médula espinal de un sujeto o paciente.
En otra realización ilustrativa, se muestra la administración de un transgén a la médula espinal y/o la región del tronco del encéfalo de un sujeto mediante la administración de un vector de AAV recombinante que contiene el transgén a al menos una región de la región de los núcleos cerebelosos profundos (DCN) del cerebelo del cerebro del sujeto. En lo profundo del cerebelo se encuentra la materia gris llamada núcleos cerebelosos profundos denominados núcleo medial (fastigial), núcleo interpuesto (interpositus) y núcleo lateral (dentado). Como se utiliza en la presente, el término "núcleos cerebelosos profundos" se refiere colectivamente a estas tres regiones, en las que una o más de estas tres regiones pueden ser un objetivo. La administración viral se realiza en condiciones que favorecen la expresión del transgén en la médula espinal y/o en la región del tronco del encéfalo, en al menos una subdivisión de la médula espinal del sujeto. Estas subdivisiones incluyen una o más de cervical, torácica, lumbar o sacra.
Sin estar limitados por la teoría, una realización de la invención reside en la capacidad de proporcionar una molécula terapéutica (por ejemplo, una proteína o péptido) a cada división de la médula espinal. Esto se puede lograr inyectando un vector de AAV, que incluye un vector de scAAV en el DCN. Además, puede ser importante apuntar a la lámina individual dentro de cada división de la médula espinal. Las láminas son sub-regiones específicas dentro de las regiones del cerebro y la médula espinal. En determinadas realizaciones, puede ser deseable dirigirse a una lámina específica dentro de una determinada división de la médula espinal. Dado que el daño de la neurona motora también puede ocurrir dentro de las neuronas motoras superiores, también puede ser deseable proporcionar una molécula terapéutica (por ejemplo, una proteína o péptido) a las divisiones del tronco encefálico. En una realización, puede ser deseable proporcionar la molécula terapéutica a la médula espinal, que incluye algunas o todas las subdivisiones, así como al tallo cerebral, incluyendo algunas o todas las subdivisiones. La invención utiliza la introducción de un vector de AAV en el DCN para llevar a cabo la administración de una molécula terapéutica descrita anteriormente a la(s) región(es) de la médula espinal y/o tronco encefálico.
Otro método para dirigirse a la médula espinal (por ejemplo, la glía) es por administración intratecal, en lugar de la administración en el propio tejido de la médula espinal. Esta administración presenta muchas ventajas. La proteína diana se libera al CSF circundante y, a diferencia de los virus, las proteínas liberadas pueden penetrar en el parénquima de la médula espinal, tal como lo hacen después de las inyecciones intratecales agudas. De hecho, la administración intratecal de vectores virales puede mantener la expresión local. Una ventaja adicional de la terapia génica intratecal es que la ruta intratecal imita la administración de punción lumbar (es decir, punción espinal) ya en uso rutinario en humanos.
Otro método para administrar los vectores recombinantes o las células transducidas es por administración a las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG), por ejemplo, por inyección en el espacio epidural con posterior difusión a DRG. Por ejemplo, los vectores recombinantes o las células transducidas se pueden suministrar mediante cánula intratecal en condiciones en donde la proteína se difunde al DRG. Véase, por ejemplo, Chiang et al., Acta Anaesthesiol. Sin. (2000) 38:31-36; Jain, K.K., Expert Opin. Investig. Drugs (2000) 9:2403-2410.
Incluso otro modo de administración al SNC utiliza un sistema de entrega potenciada por convección (CED), que es una administración no manual del vector. En una realización del CED, se crea un gradiente de presión mediante el uso de un sistema de entrega no manual. Al utilizar CED, los vectores recombinantes se pueden suministrar a muchas células en áreas grandes del SNC. Además, los vectores suministrados expresan, eficientemente, transgenes en las células del SNC (por ejemplo, las células gliales). Cualquier dispositivo de entrega potenciada por convección puede ser adecuado para el suministro de vectores recombinantes. En una realización preferida, el dispositivo es una bomba osmótica o una bomba de infusión. Tanto la bomba osmótica como la bomba de infusión están disponibles comercialmente de una variedad de proveedores, por ejemplo, Alzet Corporation, Hamilton Corporation, Alza Inc., Palo Alto, California. Típicamente, se suministra un vector recombinante mediante dispositivos de CED de la siguiente manera. Se inserta un catéter, una cánula u otro dispositivo de inyección en el tejido del SNC en el sujeto elegido. Los mapas estereotácticos y los dispositivos de posicionamiento están disponibles de, por ejemplo, ASI Instruments, Warren, MI. El posicionamiento también se puede producir utilizando mapas anatómicos obtenidos por TC y/o IRM para ayudar a guiar al dispositivo de inyección hacia el objetivo elegido. Además, dado que los métodos aquí descritos se pueden practicar de forma tal que áreas relativamente grandes del sujeto toman los vectores recombinantes, se necesitan menos cánulas de infusión. Como las complicaciones quirúrgicas suelen estar relacionadas con el número de penetraciones, este modo de administración sirve para reducir los efectos secundarios vistos en técnicas de administración convencionales. Para una descripción detallada respecto de la administración de CED, véase la patente de Estados Unidos No. 6,309,634.
La administración intracerebroventricular o intraventricular de un vector de AAV recombinante se puede realizar en uno o más ventrículos del cerebro, los cuales se llenan con líquido encefalorraquídeo (LCR). El LCR es un fluido transparente que llena los ventrículos, está presente en el espacio subaracnoideo, y rodea el cerebro y la médula espinal. El LCR se produce por plexos coroideos y mediante la supuración o transmisión de líquido tisular por el cerebro hacia los ventrículos. El plexo coroideo es una estructura que recubre el piso del ventrículo lateral y la parte superior del tercer y cuarto ventrículo. Algunos estudios han indicado que estas estructuras son capaces de producir entre 400 y 600 ccs de líquido por día consistentes con una cantidad para llenar los espacios del sistema nervioso central cuatro veces por día. En humanos adultos, el volumen de este fluido ha sido calculado entre 125 y 150 ml (4-5 oz). El LCR está en formación, circulación y absorción continuas. Algunos estudios han indicado que se pueden producir aproximadamente entre 430 y 450 ml (cerca de 2 tazas) de LCR por día. Algunos cálculos estiman que la producción es igual a aproximadamente 0,35 ml por minuto en adultos y 0,15 por minuto en menores. Los plexos coroideos de los ventrículos laterales producen la mayoría del LCR. Fluye a través del agujero de Monro hacia el tercer ventrículo donde se agrega por producción del tercer ventrículo y continúa hacia abajo a través del acueducto del mesencéfalo, hacia el cuarto ventrículo. El cuarto ventrículo agrega más LCR; el fluido viaja hacia el espacio subaracnoideo a través de los agujeros de Magendie y Luschka. Luego circula por la base del cerebro, hacia abajo alrededor de la médula espinal y hacia arriba sobre los hemisferios cerebrales. El LCR se vacía en la sangre a través de vellosidades aracnoideas y senos vasculares intracraneales.
En un caso, los métodos divulgados incluyen la administración al SNC de un sujeto afectado de un virión de rAAV que transporta un transgén que codifica un producto terapéutico y permitir que se exprese en el SNC cerca del sitio de administración a un nivel suficiente para ejercer un efecto terapéutico ya que la proteína expresada se transporta mediante el LCR a través del SNC. En algunos casos, los métodos comprenden la administración de una composición de virión de alta titulación que transporta un transgén terapéutico para que el producto transgénico se exprese a un nivel terapéutico en un primer sitio en el SNC distal del sitio final de acción del producto expresado.
En ratones experimentales, el volumen total de la solución de AAV inyectada oscila, por ejemplo, entre 1 y 20 gl. Para otros mamíferos, que incluyen humanos, los volúmenes y las tasas de administración son adecuados. El tratamiento puede consistir de una sola inyección por sitio diana o se puede repetir en uno o más sitios. Se pueden utilizar sitios de inyección múltiples. Por ejemplo, en algunos casos, además del primer sitio de administración, se administra una composición que contiene un vector viral que transporta un transgén a otro sitio que puede ser contralateral o ipsilateral al primer sitio de administración. Las inyecciones pueden ser únicas o múltiples, unilaterales o bilaterales.
El tratamiento de dosificación puede ser un esquema de una sola dosis, continuo o intermitente, o un esquema de dosis múltiples. Además, el sujeto puede recibir tantas dosis como sea adecuado. Si se administran múltiples dosis, la primera formulación administrada puede ser la misma o diferente de las formulaciones posteriores. Por lo tanto, por ejemplo, la primera administración puede ser en la forma de un vector de AAV y la segunda administración en la forma de un vector de adenovirus, ADN plasmídico, una composición proteica o similar. Además, la administración posterior puede ser igual o diferente que el segundo modo de administración.
Por otra parte, el sujeto puede recibir el vector de rAAV de la presente invención mediante una combinación de métodos de administración allí divulgados. Por lo tanto, un sujeto puede recibir inyecciones de un vector de AAV en al menos dos sitios de inyección seleccionados del grupo que consiste de inyecciones intracerebroventriculares, inyecciones directas a la médula espinal, inyecciones intratecales e inyecciones intraparenquimales (por ejemplo, el cuerpo estriado, el cerebelo, que incluye el núcleo cerebeloso profundo). En una realización, el sujeto puede recibir un vector de rAAV mediante 1) al menos una inyección intracerebroventricular, y al menos una inyección espinal directa, o 2) al menos una inyección intracerebroventricular y al menos una inyección intratecal, o 3) al menos una inyección intracerebroventricular y al menos una inyección intraparanquimal cerebral, o 4) al menos una inyección directa en la médula espinal y al menos una inyección intratecal o 5) al menos una inyección directa en la médula espinal y al menos una inyección intraparenquimal cerebral, o 6) al menos una inyección intratecal y al menos una inyección intraparenquimal cerebral.
Se deberá entender que se puede expresar más de un transgén mediante el virión recombinante administrado. De manera alternativa, también se pueden administrar vectores independientes, cada uno de los cuales expresa uno o más transgenes diferentes, en el sujeto como se describe en la presente. Por lo tanto, se pueden administrar múltiples transgenes en forma concurrente o secuencial. Además, también se pretende que los vectores administrados por la presente invención se combinen con otras composiciones o terapias adecuadas. Asimismo, se pueden utilizar combinaciones de tratamientos con proteína y ácido nucleico.
Los métodos para determinar el medio más efectivo de administración y las dosis terapéuticamente efectivas son bien conocidos en la técnica y variarán con el vector, la composición de la terapia, las células diana, y el sujeto en tratamiento. Las dosis terapéuticamente efectivas se pueden determinar en forma inmediata utilizando, por ejemplo, uno o más modelos de animales de la enfermedad particular en cuestión. Una “cantidad terapéuticamente efectiva” recaerá en un rango relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos clínicos. Por ejemplo, para una inyección in vivo de viriones de rAAV, una dosis estará en el orden de aproximadamente 106 a 1015 de partículas genómicas del virus recombinante, más preferentemente entre 108 y 1014 partículas genómicas del virus recombinante, o una dosis dentro de estos rangos que es suficiente para generar el efecto deseado. En algunas realizaciones, que incluyen algunas realizaciones, la concentración o titulación del vector en la composición es al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 9,10,15, 20, 25, o 50 (x 1012 gp/ml); (b) 56, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, o 50 (x 109 tu/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, o 50 (x 1010 iu/ml).
Para una transducción in vitro, una cantidad efectiva de viriones de rAAV que se deben administrar a las células estarán en el orden de 108 a 1013 del virus recombinante La cantidad de células transducidas en las composiciones farmacéuticas, por el contrario, estarán en el orden de 104 a 1010 células, más preferentemente entre 105 y 108 células. Otras dosificaciones efectivas pueden ser establecidas de inmediato por un entendido en la técnica a través de ensayos rutinarios que establecen curvas de respuesta a la dosis.
En general, se administrará de 1 gl a 1 ml de composición, como por ejemplo, entre 0,01 y aproximadamente 0,5 ml, por ejemplo entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 0,3 ml, como por ejemplo, 0,08, 0,09, 0,1,0,2, etc. y se administrará cualquier cantidad de composición dentro de estos intervalos.
Modelos de animales
La efectividad terapéutica y la seguridad del uso de los viriones de AAV que incluyen transgenes como se describió anteriormente se pueden probar en un modelo de animal adecuado. Por ejemplo, los modelos de animales que parecen ser muy similares a la enfermedad humana incluyen especies animales que desarrollan, en forma espontánea, una alta incidencia de la enfermedad particular o aquellos que han sido inducidos a hacerlo.
En particular, se conocen y se han generado los diferentes modelos de animales para AME. Véase, por ejemplo Sumner C.J., NeuroRx (2006) 3:235-245; Schmid et al., J. Child Neurol. (2007) 22:1004-1012. Como se explicó anteriormente, la base molecular de AME, un trastorno neuromuscular autosómico recesivo, es la pérdida homocigótica del gen de la neurona motora de supervivencia 1 (SMN1). Una copia casi idéntica del gen SMN1, llamado SMN2, se encuentra en humanos y modula la gravedad de la enfermedad. A diferencia de los seres humanos, los ratones tienen un gen único (SMN) que es equivalente a SMN1. La pérdida homocigótica de este gen es letal para embriones y resulta en la muerte celular masiva, lo que indica que el producto génico SMN es necesario para la supervivencia y función celular. La introducción de 2 copias de SMN2 en el ratón que carece de SMN rescata la letalidad embriónica, lo que resulta en ratones con el fenotipo AME (Monani et al., Hum. Mol. Genet. (2000) 9:333-339. Un número de copias alta de SMN2 rescata los ratones porque se produce suficiente proteína SMN en neuronas motoras. Véase, por ejemplo, Hsieh-Li, et al., Nat. Genet. (2000) 24:66-70, que reportan la producción de las líneas transgénicas de ratón que expresan SMN2 humano. En particular, los ratones transgénicos que albergan SMN2 en la base de SMN-/- muestran cambios patológicos en la médula espinal y músculos esqueléticos similares a aquellos de pacientes con AME. La gravedad de los cambios patológicos en estos ratones se correlaciona con la cantidad de proteína SMN que contenía la región codificada por el exón 7. Los fenotipos en el modelo de ratón incluyen pérdida de célula neuronal motora, atrofia muscular esquelética, uniones neuromusculares (NMJ), déficits de comportamiento, parálisis y una vida útil de aproximadamente dos semanas. Le et al., Hum. Mol. Genet. (2005) 14:845-857.
De manera similar, se conocen los modelos de animales para ELA. ELA es una enfermedad neurodegenerativa fatal que se caracteriza por una pérdida selectiva de neuronas motoras en el córtex, tronco encefálico y médula espinal. El avance de la enfermedad puede derivar en atrofia de extremidades, músculos axial y respiratorio. La muerte de la célula neuronal motora está acompañada por gliosis reactiva, anomalías del neurofilamento, y una pérdida significativa de fibras mielinizadas grandes en los tractos corticoespinales y raíces ventrales. Aunque la etiología de ELA no se entiende correctamente, la acumulación de evidencia indica que ELA esporádica (SALS) y ELA familiar (FALS) comparten muchas características patológicas similares; lo que da esperanza que el estudio de cualquiera de las formas derivará en un tratamiento común. FALS representa aproximadamente un 10% de los casos diagnosticados, de los cuales un 20% están asociados con mutaciones dominantemente heredadas en la superóxido dismutasa Cu/Zn (SODI). Los ratones transgénicos que expresan la proteína SODI humana mutante (por ejemplo, ratones con SODIG93A) recapitulan muchas características patológicas de ELA y son un modelo de animales disponible para estudiar ELA. Para SALS, se ha implicado un sinfín de mecanismos patológicos como la causa subyacente, que incluye excitotoxicidad inducida, exposición a la toxina, disfunción de proteasoma, daño mitrocóndrico, desorganización del neurofilamento y pérdida del apoyo neurotrófico.
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), también denominada encefalomielitis alérgica experimental, brinda un modelo animal para MS. EAE se asemeja, muy estrechamente, a varias formas y etapas de MS. EAE es una enfermedad autoinmune desmielinizante e inflamatoria, adquirida, aguda o con recaída crónica. Para crear la enfermedad, los animales recibieron proteínas que constituyen mielina, la capa aislante que rodea a las neuronas. Estas proteínas inducen una respuesta autoinmune en los animales inyectados que desarrollan un proceso de enfermedad que se asemeja, estrechamente, a MS en seres humanos. EAE ha sido inducida en un número de especies animales diferentes que incluyen ratones, ratas, conejillos de india, conejos, macacos, monos rheusus, y titís.
La atrofia muscular espinobulbar (SBMA) es una enfermedad neuronal motora que se inicia en adultos, causada por la expansión de una repetición de trinucleótidos (TNR) en exón 1 del gen receptor androgénico (AR). Este trastorno se caracteriza por la degeneración de las neuronas motora y sensorial, la atrofia muscular próxima y las anomalías endocrinas, como ginecomastía y fertilidad reducida. Solo los machos desarrollan síntomas, mientras que las portadoras hembras suelen ser asintomáticas. La base molecular de SBMA es la expansión de una repetición CAG trinucleótida, que codifica el tracto de poliglutamina (polyQ), en el primer exón del gen del receptor androgénico (AR). El sello patológico constituye inclusiones nucleares (Ni) que contienen AR mutante y truncado con polyQ expandido en las neuronas motoras residuales en el tronco encefálico y la médula espinal así como en otros órganos viscerales. Los distintos modelos de ratón transgénicos han sido creados para estudiar la patogénesis de SBMA. Véase, por ejemplo, Katsuno et al., Cytogen. y Genome Res. (2003) 100:243-251. Por ejemplo, un modelo de ratón transgénico que transporta CAG 239 puros en un promotor AR humano y otro modelo que transporta AR truncado con CAG expandido muestran deterioro y NI nucleares en las neuronas motoras espinales. Ratones transgénicos que transportan AR humano de longitud completa con polyQ expandido demuestran deterioro motor progresivo y patología neurogénica así como diferencia sexual de fenotipos. Estos modelos recapitulan la expresión fenotípica observada en SBMA.
La enfermedad de Machado-Joseph (MJD), también llamada ataxia espinocerebelosa de tipo 3, es causada por ataxina-3 mutante con una expansión de poliglutamina. Se han generado los modelos de ratón de MJD así como otras ataxias espinocerebelosas. Para una revisión de estos modelos, véase, por ejemplo, Gould, V.F.C. NeuroRX (2005) 2:480-483.
Por lo tanto, los modelos de animales estándar en la técnica están disponibles para cribado y/o evaluación de actividad y/o efectividad de los métodos y las composiciones de la divulgación para el tratamiento de trastornos neuronales motores.
Kits de la divulgación
La invención también proporciona kits. En algunos casos, los kits de la invención comprenden uno o más contenedores que comprenden vectores recombinantes que codifican la proteína de interés. Los kits pueden comprender un conjunto adecuado de instrucciones, generalmente instrucciones escritas, relacionadas con el uso de los vectores para cualquiera de los métodos aquí descritos.
Los kits pueden comprender los componentes en cualquier empaquetado conveniente, adecuado. Por ejemplo, si los vectores recombinantes se proporcionan como una formulación seca (por ejemplo, polvo seco o liofilizado), se utiliza normalmente un vial con un tapón elástico, para que los vectores se puedan volver a suspender fácilmente inyectando líquido a través del tapón elástico. Las ampollas con cierres removibles no elásticos (por ejemplo, vidrio sellado) o tapones elásticos se usan más convenientemente para formulaciones líquidas. También se contemplan paquetes para uso en combinación con un dispositivo específico, tal como una jeringa o un dispositivo de infusión tal como una minibomba.
Las instrucciones relacionadas con el uso o los vectores recombinantes generalmente incluyen información en cuanto a la dosificación, el programa de dosificación y la vía de administración para el método de uso previsto. Los recipientes pueden ser dosis unitarias, envases a granel (por ejemplo, paquetes de dosis múltiples) o dosis de subunidades. Las instrucciones suministradas en los kits de la divulgación son típicamente instrucciones escritas en una etiqueta o prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero las instrucciones legibles por máquina (por ejemplo, instrucciones llevadas en un disco de almacenamiento magnético u óptico) también son aceptables.
2. EXPERIMENTAL
Se han realizado esfuerzos por garantizar la precisión respecto de los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero se debería prever algún error o desviación experimental.
Materiales y métodos
Vectores de AAV. El marco de lectura abierto de un gen SMN1 humano ejemplar (la secuencia de marco de lectura abierta se muestra en la Figura 9A, la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en la Figura 9B, la secuencia nucleótida completa se encuentra en el número de acceso de GenBank NM_000344) se clonó en un plásmido transbordador que contiene las repeticiones terminales invertidas de AAV2 (ITR) y el potenciador de citomegalovirus de 1,6 kb / promotor de p-actina de pollo (CBA) o la ITR de scAAV2 y el promotor de p-glucuronidasa humana (GUSB) de 0,4 kb. El límite de tamaño del genoma recombinante en la reacción de empaquetado de scCAAV requirió el uso de un promotor pequeño (McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656). Por lo tanto, se eligió el promotor GUSB de 0,4 kb dado que se expresó de manera omnipresente en el SNC que incluye neuronas motoras de la médula espinal (Passini et al., J. Virol. (2001) 75:12382-12392). Los plásmidos recombinantes se empaquetaron en cápside de serotipo-8 de AAV mediante la cotransfección del plásmido triple de 293 células (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 6,001,650) y los viriones se purificaron en columna como se informó anteriormente (O'Riordan et al., J. Gene Med. (2000) 2:444-454.). Los vectores resultantes AAV2/8-CBA-hSMN1 (AAV-hSMN1) y scAAV2/8-GUSB-hSMN1 (scAAV-hSMN1) poseían titulaciones de copias genómicas 8,3 e12 y 2,8 e12 por ml, respectivamente.
Animales y procedimientos. Las parejas reproductoras heterocigotas (SMN+/-, hSMN2+/+, SMNA7+/+) se emparejaron y, en el día del nacimiento (P0) los cachorros recién nacidos recibieron 3 inyecciones en total de 2 pl cada una en los ventrículos laterales cerebrales de los dos hemisferios y la médula espinal lumbar superior. Las dosis totales de vectores virales fueron copias genómicas 5,0 e10 y 1,7 eI0 para AAV-hSMN1 y scAAV-hSMN1, respectivamente. Todas las inyecciones se administraron con una aguja de micropipeta finamente dibujada como se describe (Passini et al, J. Virol. (2001) 75:12382-12392). Tras las inyecciones, se sujetaron los dedos de las patas de los cachorros y se genotipificaron (Le et al., Hum. Mol. Genet. (2005) 14:845-857) para identificar AME (SMN-/-, hSMN2+/+, SMNA7+/+), heterocigota, y ratones del tipo silvestre (SMN+/+, hSMN2+/+, SMNA7+/+). Se escogieron 7 cachorros de todas las camadas para controlar el tamaño de la camada sobre la supervivencia. Algunas de las camadas no recibieron inyecciones para generar grupos de control no tratados.
Western blots. Para el análisis bioquímico, los ratones tratados y no tratados se sacrificaron a los 16 días y a los 58-66 días se perfundieron con tampón fosfato salino (PBS), las médulas espinales se disecaron y se separaron en los segmentos lumbar, torácico y cervical, y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Los tejidos se homogeneizaron a una concentración de 50 mg/mL utilizando tampón de lisis T-Per y un cóctail inhibidor de la proteasa (Pierce, Rockford, IL). Los homogeneizados se limpiaron mediante centrifugación a 10.000 RCF durante 6 minutos y la concentración de proteína se midió mediante el ensayo de BCA (Pierce, Rockford, IL). Se disolvieron entre 10 y 20 jug de proteína homogeneizada en SDS-PAGE de un 4 a 12% transferida a una membrana nitrocelulosa y se probó con anticuerpos anti-SMN monoclonal de ratón (1:5,000 BD Biosciences, San Jose, CA) y anti-p-tubulina policlonal de ratón (1:750, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios infrarrojos (1:20,000, LI-COR Biosciences, Lincoln NB), y se visualizaron bandas de proteína mediante fluorescencia cuantitativa utilizando Odyssey (LI-COR Biosciences). Los marcadores de peso molecular confirmaron los tamaños de las bandas.
Immunohistoquímica. Para el análisis histológico, se sacrificaron ratones tratados y no tratados a los 16 días y a los 58-66 días se perfundieron con un 4% de paraformaldehído (pH 7.4), se extrajeron las médulas espinales y se colocaron en un 30% de sacarosa durante 48 a 72 horas, se incorporaron en OCT y se cortaron en secciones congeladas de 10 qm con criostatos. Las secciones de la médula espinal se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) y se incubaron con un anticuerpo anti-SMN monoclonal de ratón (dilución 1:200) para identificar una expresión de hSMN derivada de AAV, o un anticuerpo de anti-colina acetiltransferasa (ChAT) policlonal de cabra (Millipore; Burlington, MA; dilución 1:100) para identificar neuronas motoras de láminas 8 y 9 (asta ventral) de la médula espinal o un anticuerpo de la proteína ácida fibrilar anti-glial policlonal de conejo (GFAP) (Sigma-Aldrich, dilución 1:2.500) para detectar astrocitos. Los anticuerpos principales se incubaron durante 1 hora a RT seguido de una incubación durante la noche a 4°C en una cámara humidificada. Las secciones de la médula espinal se incubaron posteriormente durante 1 hora RT con anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con FITC o un anticuerpo secundario anti-cabra conjugado con Cy3 (Jackson ImmunoResearch; West Grove, PA; dilución 1:250). Para aumentar la señal inmuno-positiva de s Mn y ChAT, se proporcionó un kit de amplificación de señal TSA (Perkin Elmer; Waltham, MA) o se llevó a cabo un protocolo de recuperación del antigén ácido cítrico (Vector Labs; Burlingame, CA) de conformidad con la instrucción del fabricante, respectivamente. Las secciones se cubrieron con medios de montaje Vectashield (Vector Labs; Burlingame, CA).
Conteo de la neurona motora. El número de células inmuno-positivas de ChAT se contaron en los segmentos cervical, torácico y lumbar. Los conteos bilaterales se realizaron con un aumento de 100x en las astas ventrales a lo largo del eje rostro-caudal de los tres segmentos de la médula espinal. Las secciones adyacentes estaban separadas al menos por 100 micrones para evitar el conteo doble de la misma célula. Se dio especial atención a la comparación a secciones anatómicamente emparejadas entre animales diferentes, y todos los conteos celulares fueron evaluados en ciego por un solo observador. Las células ubicadas en las láminas 8 y 9 de la médula espinal que exhibieron una señal ChAT fluorescente notablemente por encima de la base se consideraron neuronas motoras.
Tamaño de la miofibra. Para el análisis histológico de la periferia, se procesaron los músculos cuádriceps, gastrocnemio, e intercostal fijos del lado derecho de cada ratón con parafina y se tiñeron con hematoxilina-eosina para determinar el tamaño de la miofibra como se informó (Avila et al., J. Clin. Invest. (2007) 117:659-671). Aproximadamente 500 miofibras no solapantes de cada músculo por animal se seleccionaron aleatoriamente y fotografiaron con un aumento de 60x. Las áreas transversales de cada miofibra se midieron utilizando un software Metamorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Tinción de uniones neuromusculares (NMJ). Los grupos musculares fijos del lado izquierdo de cada ratón se almacenaron en PBS para el análisis de NMJ. La tinción in toto de las fibras musculares de los músculos cuádriceps, gatrocnemio e intercostal, se realizó como se informó (Lesbordes et al., Hum. Mol. Genet. (2003) 12:1233-1239). Los terminales nerviosos pre-sinápticos se marcaron mediante incubación durante la noche a 4°C con un anticuerpo policlonal de conejo contra la isoforma de neurofilamento de 150 kD (NF-M, Millipore, Billerica, MA, dilución 1:200), seguido de un anticuerpo secundario anti-conejo biotinilado (Jackson ImmunoResearch, dilución 1:200). Los receptores de acetilcolina en las placas terminales de los músculos se marcaron con a-bungarotoxina conjugada con Alexa 555 (Molecular Probes, Eugene, OR) a 1:5000 durante 3 horas a RT. Las fibras musculares teñidas se montaron en diapositivas, se cubrieron con Vectashield y se observaron bajo epifluorescencia. Para la cuantificación de NMJ, se seleccionó, en forma aleatoria, un mínimo de 100 NMJ de cada músculo por animal y se evaluó con el microscopio. Las imágenes confocales se capturaron utilizando un microscopio Zeiss LSM 510-META.
Pruebas de comportamiento. En el reflejo de reposicionamiento, cada ratón se colocó en una posición supina y se midió el tiempo que le llevó al ratón volverse a poner en cuatro patas. El procedimiento se repitió tres veces para cada animal, y el promedio de las tres puntuaciones se designó como la puntuación de reposicionamiento. Si el ratón no respondía en 60 segundos, la prueba concluía. En la geotaxis negativa, cada ratón se colocó en una plataforma a 45° mirando hacia abajo. La prueba se consideraba exitosa si el ratón giraba 180° a la posición “cabeza arriba”. Cada ratón tuvo tres oportunidades para completar la tarea en 180 segundos o menos. En la fuerza de agarre, las extremidades superiores e inferiores se colocaron juntas en una rejilla de alambre y se arrastraron suavemente en forma horizontal a lo largo de la malla. La resistencia se registró en gramos a través de un transductor de fuerza. En la prueba de la extremidad inferior, cada ratón fue suspendido por su cola durante 5 segundos y la separación resultante se calificó en función de un sistema arbitrario. Una separación sana de ambas extremidades inferiores similar a la observada en ratones de tipo salvaje recibió una puntuación de 4. Un ángulo de apertura agudo o "separación débil" de ambas extremidades posteriores tuvo un puntaje de 3. A una sola pierna se le asignó una puntuación de 2. Un ratón que no exhibió separación recibió una puntuación de 1. Finalmente, hubo una puntuación de 0 cuando el cachorro empujó sus extremidades inferiores juntas, y cruzó efectivamente unas sobe otras.
Estadísticas. Las pruebas de conducta, el número de neuronas motoras, las áreas de miofibra transversales, y NMJ se analizaron con comparaciones post hoc múltiples de Bonferroni y ANOVA unidireccional y con pruebas t de student bilaterales no apareadas. La curva de supervivencia de Kaplan-Meier se analizó con la prueba de rango logarítmico equivalente a la prueba de Mantel-Haeszel. Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism v4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Los valores con p < 0,05 se consideraron significativos.
Ejemplo 1
Aumento significativo en la supervivencia con tratamiento que utiliza la administración de SMN1 mediada por AAV
Los ratones con AME en el día pos-natal 0 (P0) recibieron, por vía intracerebroventricular, AAV-hSMN1 en los ventrículos laterales cerebrales y mediante inyección directa a la médula espinal en la médula espinal lumbar superior una dosis total de copias genómicas 5,0 e10 por ratón. Los ratones con AME tratados y no tratados se separaron aleatoriamente en un grupo de supervivencia en el que todos los ratones se dejaron tranquilos y se sacrificaron de manera no cruel o en un grupo de la misma edad en la que los ratones se sacrificaron a los 16 días para las comparaciones de la misma edad con ratones con AME no tratados al final de la etapa.
En el grupo de supervivencia, los ratones con AME tratados con AAV-hSMN1 mostraron un aumento significativo en la vida útil media hasta 50 días (p < 0,0001), en comparación con 15 días en controles de AME no tratados (Figura 1). Todos los ratones con AME tratados sobrevivieron durante 15 días, el 87,5% de los ratones con AME tratados se mantuvieron con vida durante 19 días en comparación con el 0% de AME no tratados. La curva de Kaplan-Meier mostró una distribución de la supervivencia bimodal con tratamiento, en donde el primer grupo falleció entre los 17 y 27 días y el segundo grupo a los 58-66 días (Figura 1). En el primer grupo, la mayoría de los ratones con AME tratados mostró deambulación, pero lo ratones sufrieron un retraso en el crecimiento y finalmente se los encontró muertos en la jaula. El segundo grupo de ratones con AME tratados a los 58-66 días mostró deambulación y aumento de peso, pero posteriormente desarrollaron necrosis de las extremidades inferiores que resultó en eutanasia del animal. Como tales, los ratones que sobrevivieron hasta los 58-66 días fueron analizados en paralelo con el grupo de la misma edad de 16 días.
Ejemplo 2
Expresión mediada por AAV de SMN en la médula espinal y conteos de neuronas motoras
Los niveles de la proteína hSMN aumentó en la médula espinal tras la administración de AAV-hSMN1 en el SNC. En ratones con AME tratados con AAV a los 16 días, hubo un aumento de aproximadamente 34,0 veces y 3,6 veces en los niveles de la proteína hSMN en el segmento lumbar inyectado en comparación con ratones con AME no tratados y del tipo silvestre, respectivamente (Figura 2A). El aumento en la expresión de la proteína hSMN se extendió a los otros segmentos, que incluyeron un aumento de >2,0 veces por encima de los niveles del tipo silvestre en la médula espinal torácica y cervical a los 16 días (Figuras 2B y 2C). En el segundo grupo, la expresión de la proteína hSMN se sostuvo en ratones con AME tratados con AAV a los 58-66 días. Las regiones lumbar, torácica y cervical lindantes inyectadas fueron aproximadamente 2,5, 2,2 y 1,2 veces más altas que los controles WT de la misma edad, respectivamente.
La inmunotinción de las secciones tisulares mostró proteína hSMN en las astas dorsal y ventral de la médula espinal en ratones con AME tratados a los 16 días y a los 58-66 días (Figura 3). Con la examinación más profunda de las células transducidas, se detectó la expresión de hSMN derivada del vector en un patrón puntiforme en el citosol, y en estructuras tipo gema en el núcleo (Figura 3A). Además, la proteína hSMN se ubicó en neuritas en estructuras tipo gránulo diferentes que podrían estar expandiendo la longitud de las dendritas y los axones (Figuras 3B-3D). El nivel muy bajo de proteína hSMN endógena en ratones con AME estuvo debajo del límite de la inmunodetección en células (Figura 3E).
La co-localización con ChAT y hSMN confirmó que un subconjunto de células transducidas era, de hecho, neuronas motoras (Figuras 3F-3I). A los 16 días, aproximadamente entre un 18 y un 42% de las células positivas en ChAT en los segmentos lumbar, torácico y cervical de la médula espinal se transdujeron mediante AAV-hSMN1 (Figura 3J). Este porcentaje fue mayor a los 58-66 días, en donde entre un 60 y un 70% de las neuronas motoras expresaron hSMN exógeno en los tres segmentos de la médula espinal (Figura 3J). Se produjo un aumento general en el número de neuronas motoras en ratones con AME tratados en comparación con los mutantes sin tratar (Figura 4). Sin embargo, hubieron significativamente menos neuronas motoras en ratones con AME tratados en comparación con ratones del tipo silvestre a los 16 y a los 58-66 días (Figura 4).
Se realizó la inmunotinción de hSMN de secciones tisulares cervicales de ratones heterocigotas no tratados inyectados por vía intracerebroventricular (ICV) solamente, y lumbar solamente. Las inyecciones ICV por sí solas no contribuyeron con los patrones de transducción de AAV apreciables en el cerebro pero, igualmente, generaron una focalización sustancial de la médula espinal cervical que las inyecciones lumbares solamente no pudieron alcanzar. En particular, las inyecciones ICV solamente resultaron en la expresión de la médula espinal cervical de hSMN. Esto contrastó con la inyección intraparenquimal del segmento lumbar que mostró muy poca transducción de la médula espinal cervical, presumiblemente, debido a la proximidad distal desde el sitio de inyección. En esta ocasión, se observó la señal inmunopositiva de SMN que poseía una apariencia tipo gema en el núcleo de los ratones heterocigotas no tratados y del tipo silvestre. Sin embargo, el patrón de inmunotinción no se observó en el núcleo de ratones con AME no tratados.
Por lo tanto, la combinación de inyecciones ICV y lumbar en ratones P0 brindó una transducción amplia, generalizada de la médula espinal. Las inyecciones ICV de AAV8-hSMN estuvieron dirigidas a la médula espinal cervical para la transducción.
Ejemplo 3
Efectos del tratamiento de AAV en tamaño de miofibra. NMJ y comportamiento
Se eligieron músculos cuádriceps (próximo), gastrocnemio (distal) e intercostal (respiratorio) para análisis dado que muestran degeneración marcada. En ratones con AME no tratados a los 16 días, las miofibras eran pequeñas y la mayoría de las células individuales contenía un área transversal de <100 um2 (Figura 5A). Menos del 10% de las miofibras de los ratones con AME no tratados contenía un área transversal de más de 200 um2. Por el contrario, la distribución de los tamaños de miofibra en ratones con AME tratados con AAV-hSMN1 fue similar al tipo silvestre, y muchas células poseían un área transversal de más de 200 y de más de 400^m2 a los 16 y 58-66 días, respectivamente (Figuras 5A y 5B). El promedio general a los 16 días mostró que las miofibras de ratones con AME tratados eran dos veces más grandes que la de ratones con AME no tratados (Figura 5C). Además, el área transversal de miofibras promedio en ratones con AME tratados a los 58-66 días fue un 67%, de un 76%, de un 82% respecto de los ratones tipo silvestre en los músculos cuádriceps, gastrocnemio e intercostal, respectivamente (Figura 5C).
El análisis de la unión neuromuscular (NMJ) de ratones con AME no tratados a los 16 días mostró acumulación anormal de proteína neurofilamento en las terminales pre-sinápticas (Figura 6A). Cerca de un 75-90% de las terminales pre-sinápticas de los músculos cuádriceps, gastrocnemio e intercostal mostraron esta patología distintiva en ratones con AME no tratados (Figura 6F). Por el contrario, la mayoría de las terminales pre-sinápticas de ratones con AME tratados con AAV-hSMN1 no contenía esta estructura colapsada (Figuras 6B, 6D). Solo entre el 10-25% y el 5% de las terminales pre-sinápticas de ratones con AME tratados mostraron esta patología distintiva a los 16 y 58-66 días, respectivamente (Figura 6F). Sin embargo, el tratamiento resultó en más ramificación en las terminales pre-sinápticas en comparación con el tipo silvestre (Figuras 6B-6E). En las NMJ post-sinápticas de ratones con AME tratados y ratones del tipo silvestre, una tinción de a-bungarotoxina produjo una estructura “tipo pretzel” que fue indicio de una red funcional de los receptores de acetilcolina (Figuras 6B-6E)
Se sometieron a pruebas de comportamiento periódicas a ratones tratados y no tratados que han sido validadas para este modelo de animal (Butchbach et al., Neurobiol. Dis. (2007) 27:207-219; El-Khodar et al., Exp. Neurol. (2008) 212:29-43). Los ratones con AME tratados tuvieron buenas puntuaciones corporales y habilidades ambulatorias, mientras que los ratones con AME no tratados se emanciparon y paralizaron (Figura 7A). Los ratones con AME tratados fueron significativamente más pesados que los controles con AME no tratados, aunque nunca alcanzaron el tamaño tipo silvestre (Figura 7B). Los ratones con AME tratados mostraron una mejora significativa en el reflejo (Figura 7C). También se produjo una mejora significativa en los ratones con AME tratados para completar la prueba de geotaxis negativa, la cual mide la conducta locomotriz espacial (Figura 7D). Además, los ratones con AME tratados mostraron mejoras significativas en la fuerza de agarre y en la capacidad de extender sus extremidades inferiores (Figuras 7E, 7F).
Ejemplo 4
Efectos de la longevidad mediante el uso de AAV autocomplementario
Sin estar limitados por la teoría, se predice que los vectores de AAV autocomplementarios (scAAV) tienen una cinética de expresión más rápida debido al genoma recombinante bicatenario (revisado en McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656). Este rápido aumento en la expresión puede ser beneficioso en enfermedades o trastornos altamente agresivos donde la ventana temporal de la intervención es pequeña. Por lo tanto, para determinar si la expresión temprana podría mejorar la eficacia, se diseñó y probó un vector de scAAV (scAAV-hSMN1). Mediante el uso del mismo sitio de inyecciones que en el Ejemplo 1, se administró una copia de copias genómicas 1,7 e10 de scAAV-hSMN1 en ratones con AME a P0.
El tratamiento con scAAV-hSMN1 resultó en una mejora notable en la supervivencia media de 157 días (p <0.0001), la cual representó un aumento de 214% y 881% en comparación de ratones con AME no tratados y tratados con AAV-hSMN1, respectivamente (Figura 8). Aproximadamente un 42% de los ratones tratados con scAAV tuvieron un aumento de más de 1000% (aumento en doblez) en la supervivencia media. Además el tratamiento con scAAV2/8-GUSB-hSMN1 resultó en una supervivencia de más de 66 días del 88% de los ratones con AME, a

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un virión de AAV recombinante que comprende un vector del virus adeno-asociado autocomplementario (scAAV) para uso en el tratamiento de la atrofia de la médula espinal (AME), donde el vector de scAAV comprende un polinucleótido que codifica una proteína que modula la función motora, donde la expresión de dicha proteína en el SNC resulta en al menos una corrección parcial de la neuropatología y/o estabilización del avance de AME, donde el vector de scAAV comprende proteínas de la cápside del serotipo AAV9, y donde el virión de AAV:
(i) se ha de administrar a través de la administración en al menos una región de los núcleos cerebelosos profundos del cerebelo;
(ii) se ha de administrar a través de inyección directa en la médula espinal; o
(iii) se ha de administrar a través de inyección intracerebroventricular.
2. Uso de un virión de AAV recombinante en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la atrofia muscular espinal (AME), donde el virión de AAV recombinante comprende un vector del virus adeno-asociado autocomplementario (scAAV) que comprende un polinucleótido que codifica una proteína que modula la función motora, donde la expresión de dicha proteína en el SNC resulta en al menos una corrección parcial de la neuropatología y/o estabilización del progreso de la AME, donde el vector de scAAV comprende proteínas de la cápside del serotipo AAV9, y donde el virión de AAV:
(i) se ha de administrar a través de la administración en al menos una región de los núcleos cerebelosos profundos del cerebelo;
(ii) se ha de administrar a través de inyección directa en la médula espinal; o
(iii) se ha de administrar a través de inyección intracerebroventricular.
3. El virión de AAV recombinante para uso de conformidad con la reivindicación 1 o el uso de conformidad con la reivindicación 2, donde el polinucleótido codifica una proteína de la neurona motora de supervivencia (SMN).
4. El virión de AAV recombinante para uso de conformidad con la reivindicación 3 o el uso de conformidad con la reivindicación 3, donde la proteína SMN es codificada por SMN-1 humana.
5. El virión de AAV recombinante para uso de conformidad con la reivindicación 4 o el uso de conformidad con la reivindicación 4, donde la proteína SMN comprende:
(i) una secuencia de aminoácidos con al menos una identidad de secuencia del 90% respecto de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o
(ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
6. El virión de AAV recombinante para uso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-5 o el uso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, donde el virión de AAV recombinante se administra en al menos un ventrículo cerebral lateral.
7. El virión de AAV recombinante para uso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-5 o el uso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, donde el virión de AAV recombinante se administra tanto mediante inyección intracerebroventricular como inyección directa en la médula espinal.
8. El virión de AAV recombinante para uso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-5 o el uso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, donde el virión de AAV recombinante se administra mediante inyección intratecal.
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