ES2856403T3 - Composiciones a base de rAAV y procedimientos para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica - Google Patents

Composiciones a base de rAAV y procedimientos para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica Download PDF

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Abstract

Un virus adenoasociado recombinante (rAAV) para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que padece o se sospecha que padece ELA, comprendiendo el procedimiento: administrar al sujeto una cantidad eficaz del virus adenoasociado recombinante (rAAV), en el que el rAAV alberga un ácido nucleico que está manipulado genéticamente para expresar, en una célula del sujeto, un miARN que comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 17 (CTGCATGGATTCCATGTTCAT (SOD-miR-127)) y que se dirige al ARN codificado por un gen SOD1.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones a base de rAAV y procedimientos para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica Solicitudes relacionadas
La presente solicitud reclama el beneficio según la norma 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud provisional de Estados Unidos USSN 61/955.189, presentada el 18 de marzo de 2014 y titulada "RAAV-Based Compositions and Methods for Treating Amyotrophic Lateral Sclerosis".
Campo de la invención
La invención se refiere a procedimientos y composiciones para el tratamiento de enfermedades genéticas, tales como la esclerosis lateral amiotrófica.
Antecedentes
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es un trastorno progresivo de las motoneuronas, generalmente mortal, que a veces se desarrolla al mismo tiempo que la demencia frontotemporal (DFT). La ELA se encuentra tanto en forma esporádica (ELAE) como familiar (ELAF). Aproximadamente el 10% de los casos se transmiten como rasgos autosómicos dominantes. Un tratamiento aprobado por la FDA para la ELA es el riluzol, un compuesto que prolonga la supervivencia aproximadamente un 10%.
Sumario de la divulgación
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas y se refiere a virus adenoasociados recombinantes (rAAV) para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que padece o se sospecha que padece ELA, a microARN sintéticos, a ácidos nucleicos recombinantes que codifican dichos microARN sintéticos, a AAV recombinantes que albergan un ácido nucleico recombinante de la invención, a composiciones que comprenden dichos rAAV recombinantes y a kits que comprenden dichas composiciones. Las formas de realización de la invención se describen en los párrafos numerados siguientes:
(1). Un virus adenoasociado recombinante (rAAV) para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que padece o se sospecha que padece ELA, comprendiendo el procedimiento:
administrar al sujeto una cantidad eficaz del virus adenoasociado recombinante (rAAV), en el que el rAAV alberga un ácido nucleico que está manipulado genéticamente para expresar, en una célula del sujeto, un miARN que comprende 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de la secuencia expuesta en SEQ iD NO: 17 (CTGCATGGATTCCATGTTCAT (SOD-miR-127)) y que se dirige al ARN codificado por un gen SOD1. 2. El rAAV para su uso según el párrafo 1, en el que el rAAV se dirige a tejido del SNC.
3. El rAAV para su uso según el párrafo 1 o 2, en el que el rAAV comprende una proteína capsídica AAV.Rh10 o AAV9.
4. Un microARN sintético que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 17: CTGCATGGATTCCATGTTCAT (SOD-miR-127) y regiones flanqueantes de miR-155.
5. Un ácido nucleico recombinante que codifica el microARN sintético del párrafo 4 y que comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) de un serotipo de AAV.
6. El ácido nucleico recombinante del párrafo 5, en el que el serotipo de AAV se selecciona del grupo que consiste en: AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVRh10, AAV11 y variantes de los mismos.
7. El ácido nucleico recombinante del párrafo 6, que comprende además un promotor unido operativamente con una región o regiones que codifican el microARN, siendo opcionalmente el promotor un promotor específico de tejido; o un promotor de polimerasa II, tal como un promotor de p-actina; o un promotor de polimerasa III, tal como un promotor U6.
8. Una composición que comprende el ácido nucleico recombinante de uno cualquiera de los párrafos 5 a 7.
9. Un virus adenoasociado recombinante (AAV) que alberga un ácido nucleico recombinante de uno cualquiera de los párrafos 5 a 7.
10. El AAV recombinante del párrafo 9, que comprende además una o más proteínas capsídicas de uno o más serotipos de AAV seleccionados del grupo que consiste en: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV.Rh10, AAV11 y variantes de los mismos.
12. Una composición que comprende el AAV recombinante del párrafo 9 o 10.
13. La composición del párrafo 11, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Un kit que comprende un recipiente que contiene la composición del párrafo 11 o 12.
Algunos aspectos de la divulgación se refieren a composiciones y procedimientos para modular la expresión de genes asociados con la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). En particular, se proporcionan ácidos nucleicos inhibidores que son útiles para el silenciamiento de genes, tales como C9orf72 y SOD1, que están asociados con la ELA. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación se proporcionan ácidos nucleicos inhibidores que se dirigen a todas las variantes de C9orf72. En otros aspectos de la divulgación, se proporcionan ácidos nucleicos inhibidores que se dirigen a un subconjunto de variantes de C9orf72. Algunas opciones de la divulgación se refieren al reconocimiento de que, aunque determinados ácidos nucleicos inhibidores, tales como miARN, generalmente funcionan en el citoplasma, pueden cargarse en la proteína argonauta (por ejemplo, AGO2, el componente catalítico del complejo de silenciamiento inducido por ARN o RISC) en el citoplasma e importarse de nuevo al núcleo, donde pueden silenciar el pre-ARNm. Así, en algunas opciones, se proporcionan ácidos nucleicos inhibidores (por ejemplo, miARN) que son capaces de dirigirse tanto al ARN del núcleo como al ARN del citoplasma para prevenir o inhibir la función del ARN, incluida la traducción de proteínas.
Algunos aspectos de la divulgación se refieren a procedimientos de tratamiento que utilizan la administración intratecal de AAV manipulado genéticamente para expresar ácidos nucleicos inhibidores que silencian genes, tales como C9orf72 y SOD1, que están asociados con ELA. En algunas opciones, se proporcionan procedimientos para administrar ácidos nucleicos que utilizan AAV neurotrópicos, tales como AAV9 y AAV.Rh10, para dirigirse a tejido del SNC. El uso de AAV que albergan ácidos nucleicos que están manipulados genéticamente para expresar ácidos nucleicos inhibidores es ventajoso en parte porque supera las deficiencias asociadas con tener que volver a administrar ácidos nucleicos inhibidores no expresados, tales como, por ejemplo, dúplex de ARNip y oligonucleótidos antisentido, dado que los episomas de los rAAV expresarán continuamente los ácidos nucleicos inhibidores (por ejemplo, miARN). Además, en algunas opciones, los procedimientos proporcionados en el presente documento son ventajosos porque permiten el uso de dosis relativamente bajas de AAV para silenciar genes en el SNC y minimizan la exposición de los tejidos periféricos a los AAV.
En otros aspectos de la divulgación, se proporcionan ratones transgénicos que contienen una expansión G4C2 de C9orf72. En algunas opciones, el modelo facilita la evaluación de ácidos nucleicos inhibidores para el silenciamiento del gen C9orf72 tanto in vitro como in vivo en el SNC de un mamífero. En otros aspectos, se divulga el uso de péptidos traducidos por RAN como marcadores, por ejemplo, para determinar la actividad de C9orf72.
En algunas opciones, el modelo de ratón transgénico facilita la evaluación de la persistencia en el SNC de AAV neurotróficos, tales como AAV que albergan una cápside Rh10. En algunas opciones, el modelo de ratón transgénico facilita la evaluación de la inmunogenicidad incipiente tras la administración, por ejemplo, por vía intratecal.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para inhibir la expresión de C9orf72 en una célula, comprendiendo el procedimiento administrar a la célula un ácido nucleico inhibidor que se dirige tanto al pre-ARNm como al ARNm codificado por un gen C9orf72.
En algunas opciones, la célula expresa C9orf72 que tiene expansiones G4C2 de hasta 50, hasta 90, hasta 160 o hasta 200 repeticiones. En algunas opciones, el nivel de un ARNm que codifica la isoforma B de C9orf72 en la célula es mayor que el nivel de un ARNm que codifica la isoforma A de la proteína C9orf72 en la célula.
En algunas opciones, la célula es una célula del sistema nervioso central. En algunas opciones, la célula es una neurona.
En algunas opciones, antes de exponerse al ácido nucleico inhibidor, la célula contiene focos G4C2 intranucleares. En algunas opciones, la administración del ácido nucleico inhibidor a la célula da como resultado una reducción de focos G4C2 intranucleares.
En algunas opciones, antes de exponerse al ácido nucleico inhibidor, la célula contiene proteínas C9 RAN. En algunas opciones, la administración del ácido nucleico inhibidor a la célula da como resultado una reducción en los niveles de proteína C9 RAN.
En algunas opciones, la célula se encuentra in vivo. En algunas opciones, la célula se encuentra in vitro. En algunas opciones, la célula es de un sujeto que tiene uno o más síntomas de DFT o ELA. En algunas opciones, la célula es de un sujeto sospechoso de padecer DFT o ELA.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para inhibir la expresión de C9orf72 en el sistema nervioso central (SNC) de un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar al SNC del sujeto un ácido nucleico inhibidor que se dirige a un ARN codificado por el gen C9orf72, siendo el ácido nucleico inhibidor un microARN.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para inhibir la expresión de C9orf72 en el sistema nervioso central (SNC) de un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar al SNC del sujeto un ácido nucleico inhibidor que se dirige tanto al pre-ARNm como al ARNm codificado por un gen C9orf72.
En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor es un microARN.
En algunas opciones, la etapa de administrar el ácido nucleico inhibidor al sujeto comprende administrar al sujeto un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que alberga un ácido nucleico que está manipulado genéticamente para expresar el ácido nucleico inhibidor en una célula del sujeto.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto que padece o se sospecha que padece DFT o ELA, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad eficaz de un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que alberga un ácido nucleico que está manipulado genéticamente para expresar, en una célula del sujeto, un ácido nucleico inhibidor que se dirige tanto al pre-ARNm como al ARNm codificado por un gen C9orf72.
En algunas opciones, el rAAV se dirige a tejido del SNC. En algunas opciones, el rAAV comprende una proteína capsídica AAV.Rh10 o AAV9.
En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor comprende una región de complementariedad que es complementaria a al menos 5 nucleótidos consecutivos ubicados dentro del exón 3 de C9orf72. En algunas opciones, los, al menos 5, nucleótidos consecutivos se encuentran dentro de los nucleótidos 220 a 241 de C9orf72.
En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor se dirige al ARNm que codifica la isoforma A y al ARNm que codifica la isoforma B de la proteína C9orf72. En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor se dirige a las variantes de C9orf72 V1 (NM_145005.6; SEQ ID NO: 18), V2 (NM_018325.3; SEQ ID NO: 19) y V3 (NM_001256054.1; SEQ ID NO: 20). En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor se dirige a las variantes de C9orf72 V1 (NM_145005.6; SEQ ID NO: 18) y V3 (NM_001256054.1; SEQ ID NO: 20), pero no a V2 (NM_018325.3; SEQ ID NO: 19). En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor se dirige a la variante V1 de C9orf72 (NM_145005.6; SEQ ID NO: 18), pero no a V2 (n M_018325.3; SEQ ID NO: 19) y V3 (NM_001256054.1; SEQ ID NO: 20).
En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor reduce los niveles de ARNm de C9orf72 en una célula al menos un 50%. En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor reduce los niveles de pre-ARNm de C9orf72 en una célula al menos un 50%.
En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de una secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 8. En algunas opciones, el rAAV se administra por vía intratecal, intracerebral, intraventricular o intravenosa.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para inhibir la expresión de SOD1 en una célula, comprendiendo el procedimiento administrar a la célula un miRNA que se dirige al ARNm de SOD1, en el que el miRNA comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de una secuencia que se expone en:
SEQ ID NO: 15: AGCATTAAAGGACTGACTGAA (SOD-miR-103),
SEQ ID NO: 16: GACTGAAGGCCTGCATGGATT (SOD-miR-117) o
SEQ ID NO: 17: CTGCATGGATTCCATGTTCAT (SOD-miR-127).
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto que padece o se sospecha que padece ELA, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad eficaz de un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que alberga un ácido nucleico que está manipulado genéticamente para expresar, en una célula del sujeto, un miARN que se dirige al ARN codificado por un gen SOD1.
En algunas opciones, el miARN comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de una secuencia expuesta en:
SEQ ID NO: 15: AGCATTAAAGGACTGACTGAA (SOD-miR-103),
SEQ ID NO: 16: GACTGAAGGCCTGCATGGATT (SOD-miR-117) o
SEQ ID NO: 17: CTGCATGGATTCCATGTTCAT (SOD-miR-127).
En algunas opciones, el rAAV se dirige a tejido del SNC. En algunas opciones, el rAAV comprende una proteína capsídica AAV.Rh10 o AAV9.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un microARN sintético que comprende una secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 8.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un microARN sintético que comprende una secuencia expuesta en SEQ ID N2: 15: AGCATTAAAGGACTGACTGAA (SOD-miR-103), SEQ ID NO: 16: GACTGAAGGCCTGCATGGATT (SOD-miR-117) o SEQ ID NO: 17: CTGCATGGATTCCATGTTCAT (SOD-miR-127). En algunas opciones, el microARN sintético comprende además regiones flanqueantes de miR-155.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona ácido nucleico recombinante que codifica el microARN expuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 8 o las SEQ ID NO: 15 a 17 y que comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) de un serotipo de AAV. En algunas opciones, el serotipo de AAV se selecciona del grupo que consiste en: AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, Aa V9, AAVRh10, AAV11 y variantes de los mismos.
En algunas opciones, el ácido nucleico recombinante comprende además un promotor unido operativamente a una o varias regiones que codifican el microARN. En algunas opciones, el promotor es un promotor específico de tejido. En algunas opciones, el promotor es un promotor de polimerasa II, tal como un promotor de p-actina. En algunas opciones, el promotor es un promotor de polimerasa III, tal como un promotor U6.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición que comprende un ácido nucleico recombinante tal como se describe en la divulgación.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un virus adenoasociado recombinante (AAV) que alberga un ácido nucleico recombinante tal como se describe en la divulgación. En algunas opciones, el AAV recombinante comprende además una o más proteínas capsídicas de uno o más serotipos de AAV seleccionados del grupo que consiste en: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV.Rh10, AAV11 y variantes de los mismos.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición que comprende un AAV recombinante tal como se describe en la divulgación. En algunas opciones, la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un kit que comprende un recipiente que aloja una composición tal como se describe en la divulgación.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 proporciona un diagrama del gen C9orf72 y cebadores. El panel superior (A) representa la organización genómica del gen; los paneles inferiores son variantes 1-3 de pre-ARNm. Los cuadros representan exones y las líneas son intrones. La expansión de repeticiones de hexanucleótidos (rombo rojo) se transcribe en las variantes 1 y 3. El codón de inicio ATG y el codón de detención TAA son tal como se muestran. Una línea horizontal representa el marco de lectura abierto para cada variante (téngase en cuenta que las variantes 2 y 3 producen la misma proteína). El panel superior (A) muestra las ubicaciones de los cebadores TaqMan utilizados para distinguir las isoformas de pre-ARNm; El panel inferior (B) muestra los tres ARNm empalmados; en la figura se muestran anotaciones como anteriormente con las posiciones de los pares de cebadores que detectan las tres isoformas de ARNm empalmadas diferentes.
La figura 2 muestra datos de qRT-PCR relacionados con la detección de variantes de C9orf72. Se llevaron a cabo ensayos de sonda TaqMan diseñados para detectar ARNm de cada variante individual (V1, y V3) o todas las variantes (Vtodas) en diversas líneas celulares, así como en tejido cerebral humano. Los resultados son medias SD de 3 réplicas biológicas.
La figura 3 muestra datos in vitro relacionados con la desactivación de C9orf72 humano mediada por miARN. Niveles relativos de ARNm de C9orf72 después de la desactivación de C9orf72 con C9miR-220 artificial. Este miARN se ubica en el exón 3 y se dirige a todas las variantes. Estos son resultados de 3 réplicas biológicas de transfecciones transitorias de mir220 (promotor CBA-GFP) en células HEK293T. El control es un miR contra SOD1.
La figura 4 muestra datos in vitro relacionados con la desactivación de ARNm y pre-ARNm de C9orf72. El C9-miR220 es un miARN artificial diseñado para dirigirse a las bases 220-241 del ORF de C9orf72. Este miARN se une en el exón 3, dirigiéndose así a todas las variantes de ARNm. El miARN se clonó en un plásmido utilizando o bien un promotor U6 o bien un promotor de beta-actina de pollo y se transfectó en células Hek-293. El ARN se extrajo 72 horas después de la transfección y se trató con ADNasa antes de la RT. La RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando sondas TaqMan personalizadas que detectan variantes empalmadas (por ejemplo, ARNm de Vtodas) o sin empalmar (por ejemplo, pre-ARNm de Vtodas). Los resultados son medias ± SD de 3 réplicas biológicas.
La figura 5 muestra un análisis Southern de ADN (panel izquierdo). Carriles: (A) ADN de linfoblastos de ELA RB8088. C9orf72 expandido, ~8 kb (900 repeticiones); (B) ADN de la corteza cerebral de ELA RB9783. C9orf72 expandido, ~9 kb (1000 repeticiones); (C) ADN de la corteza cerebral de ELA RB2952. C9orf72, tipo silvestre, sin banda de expansión; (D) ADN de bazo de ratón no transgénico; (E): ADN de bazo de ratón CH523-111K12_523. BAC de expansión de C9orf72, ~4,5 kb (350 repeticiones). Para cada espécimen, se digirieron 25 ug de ADN mediante Xbal y se separaron en gel de agar al 0,8% durante 2,5 horas a 80 V. La hibridación se realizó a 55 °C con una oligosonda de ARN (G4C2H-DIG y se visualizó con CDP-Star. Derecha: Hibridación del hipocampo de ratones WT y C9orf72 con sonda G4C2-CyA para hebra sentido de ARN.
La figura 6 proporciona datos que indican una transducción robusta de EGFP y una desactivación mediada por miARN en la médula espinal después de inyección I.T. con rAAV.Rh10. A un tití macho de 4 años se le inyectó I.T. o bien rAAV.Rh10.CBEGFP o bien rAAV.Rh10.U6ant-SOD1 miR a una dosis de 5 x 10 e12 CG/kg. Se realizó la necropsia del animal 2 semanas después y los tejidos del SNC se aislaron y se fijaron. Se tiñeron secciones de cuarenta micrómetros de médula espinal con anticuerpo contra EGFP y se visualizaron mediante DAB. Todas las secciones se contratiñeron con hematoxilina. Se muestran imágenes de bajo aumento (objetivo 4X) de (A) médula espinal lumbar, (B) médula espinal torácica, (C) médula espinal cervical. (D) Las motoneuronas se capturaron con láser a partir de la médula espinal lumbar de control (rAAV.Rh10.GFP) y se trataron (rAAV.Rh10.GFP-miR-SOD1) titíes y se analizaron los niveles de microARN miR-SOD1 y ARNm de SOD1 por RT-qPCR.
La figura 7A-7B ilustran el diseño del vector rAAV para el silenciamiento de C9orf72 mediado por miARN. La figura 7A muestra que las secuencias de miARN dirigidas se clonan en un tallo-bucle, que está flanqueado por secuencias primiARN de miR-155. La figura 7B muestra que la secuencia que se dirige a los C9-miR se clona después en plásmidos AAV provirales con promotores de polimerasa II (B-actina de pollo) o polimerasa III (U6) para ensayos in vitro y empaquetamiento de rAAV.
La figura 8 ilustra datos de qRT-PCR relacionados con diferentes variantes de C9orf72 en ratones.
La figura 9 ilustra que los ratones transgénicos C9orf72 mutantes desarrollan inclusiones poli(GP) en la corteza frontal.
Las figuras 10A-10B muestran que anticuerpos dirigidos contra péptidos traducidos por RAN detectan inclusiones en tejido cerebral C9DFT/ELA. La figura 10A muestra que la especificidad de los anticuerpos se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia Western utilizando lisados de células transfectadas para expresar (GA)5, (GR)5, (GP)5, (PA)5 o (PR)5 marcadas con GFP. La figura 10B muestra que se detectan inclusiones inmunorreactivas anti-GA, anti-GR y anti-GP en todo el encéfalo de C9DFT/ELA, incluido el cerebelo, tal como se muestra en este caso.
La figura 11A-11C muestran el diseño del vector rAAV para el silenciamiento de SOD1 mediado por miARN. Las regiones flanqueantes de miR-155 se clonaron cadena arriba de la región poliA de BGH de un casete de expresión de AAV proviral compuesto por el potenciador CMV, promotor híbrido de beta actina de pollo con un intrón de SV40 corto. La figura 11A muestra que la secuencia que dirige el ARNm de hSOD1 se clonó en el esqueleto de miR-155. La figura 11B muestra que dos copias en tándem de este miARN se clonaron en o bien un vector que expresa GFP o bien un vector que solo expresa los miARN, tal como se desearía en el entorno clínico. La figura 11C muestra un alineamiento de las secuencias del gen SOD1 humano, de mono Rhesus y de tití que muestra que el miR-SOD1-127 maduro dirige una secuencia que está conservada al 100% entre los primates.
La figura 12 muestra datos relacionados con la desactivación in vivo de SOD1 humano mediada por rAAV en ratones transgénicos. A los ratones transgénicos que expresan la mutación G93A de SOD1 humana se les inyectaron vectores rAAV9 que expresan los miR anti-SOD1. A) A los ratones recién nacidos se les administraron 1,0 x 1012 partículas de o bien un vector de control de GFP o bien uno que expresa el SOD1 miR-127 a través de la vena facial. Los ratones se sacrificaron 4 semanas después de la administración y se analizó el músculo para determinar la expresión total de hSOD1 mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. B) A los ratones adultos se les administraron 5 x 1010 partículas vectoriales directamente en el cuerpo estriado. Los ratones se sacrificaron 3 semanas después de la inyección y se analizó el tejido cerebral para determinar la expresión de hSOD1 mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real.
La figura 13 muestra los datos con respecto a los constructos del vector AAV.Rh10 (arriba) y los resultados que indican la reducción de la expresión de SOD1 en el hígado de tití (abajo).
La figura 14 describe los ensayos realizados para evaluar el silenciamiento de SOD1 en titíes.
La figura 15 es una descripción general de los ensayos realizados en titíes.
La figura 16 muestra que en 3 titíes machos que recibieron inyección intratecal (IT) y se les sometió a microdisección por captura láser (LCM) (animales 6 , 8 , 9 en la figura 15) la expresión de SOD1 se redujo en MN por AAV.Rh10 CB-2xmiR-SOD1 (gris claro) y U6-miR-SOD1 (gris oscuro). El promotor U6 impulsó niveles más altos de miR anti-SOD1 y silenció de forma más eficaz SOD1.
La figura 17A-17B muestran datos relacionados con 3 titíes machos (animales 6 , 8 , 9 en la figura 15). La figura 17A muestra que la expresión de SOD1 se redujo en MN y no-MN por AAV.Rh10 CB-2x-miR-SOD1 (gris claro) y U6-miR-SOD1 (gris oscuro) IT. El constructo U6 produjo una mayor desactivación. La figura 17B muestra la expresión relativa de GFP en MN y no MN mediante rAAV.Rh10 CB-2x-mir-SOD1 y U6-miR-SOD1 IT. El constructo U6 produjo la mayor expresión de GFP.
La figura 18 muestra que en los mismos 3 titíes machos descritos en las figuras 17A-17B, la inyección IT de AAV.Rh10 CB-2x-miR-SOD1 (gris claro) y U6-miR-SOD1 (gris oscuro) también produjo el silenciamiento de SOD1 en el tallo cerebral inferior. En estos estudios, la qPCR se realizó en homogeneizados de tejido completo (no en neuronas capturadas con láser).
La figura 19 muestra datos relacionados con una evaluación de la expresión de SOD1 en motoneuronas (MN) utilizando hibridación de ARN (RNAScope) en médulas de dos titíes machos (N° 2 y 3 en la figura 15). En el N° 2, la inyección IT con CB-GFP (sin miR) logró algún grado de expresión de GFP en MN (ChAT pos) que mostró una expresión prominente de SOD1 (izquierda). En el N° 3, la inyección Ti con U6-SOD1 miR-CB-GFP produjo la expresión de GFP en MN y una reducción en la expresión de SOD1 en las mismas neuronas (derecha).
La figura 20 muestra datos relacionados con el tratamiento de ratones G93A SOD1 con el vector CB-miR-SOD1. A los ratones se les inyectó por vía intravenosa 2 X 1012 cg del vector (CB-GFP o CB-miR-SOD1 -GFP) el día 56-68 de edad y posteriormente se supervisaron de forma ciega hasta que la parálisis avanzada requirió eutanasia. Los resultados muestran que la mediana de supervivencia fue de 108 días para el grupo CB-GFP y de 130 días para el grupo CB-miR-SOD1-GFP (ensayo de rango logarítmico, p = 0,018), lo que indica un aumento significativo en la supervivencia de ratones tratados con CB-miR-SOD1.
Descripción detallada
Algunos aspectos de la divulgación se refieren a composiciones y procedimientos para modular la expresión de genes asociados con la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Algunos aspectos de la divulgación se refieren a composiciones mejoradas de tratamiento génico y procedimientos relacionados para tratar la ELA utilizando vectores virales adenoasociados recombinantes (rAAV). En particular, se proporcionan rAAV que albergan ácidos nucleicos manipulados genéticamente para expresar ácidos nucleicos inhibidores que silencian genes, tales como C9orf72 y SOD1, que están asociados con ELA. En algunas opciones, la divulgación utiliza un AAV recombinante (por ejemplo, rAAV.Rh10) para administrar un microARN al SNC y así silenciar un gen de ELA, tal como SOD1 o C9orf72.
La ELA se presenta tanto en forma familiar (ELAF) como esporádica (ELAE). Un número significativo de casos de ELAF se asocia con expansiones de una expansión de hexanucleótido G4C2 no codificante en el gen C9orf72. Estas expansiones también se detectan en el 10-20% de demencia frontotemporal (DFT) familiar, el 10% de DFT esporádica y en ~5% de ELAE. Estas estadísticas definen la expansión G4C2 de C9orf72 como causa común de ELA. En individuos normales, la expansión G4C2 varía en tamaño desde 2 o 3 hasta más de 25 repeticiones; por el contrario, los pacientes con DFT/ELA tienen cientos o incluso miles de estas repeticiones. La transcripción del gen C9orf72 normal produce tres variantes de ARNm V1 (por ejemplo, Genbank: NM_M5005.6; SEQ ID NO: 18), V2 (por ejemplo, Genbank: NM_018325.3; SEQ ID NO: 19) y V3 (por ejemplo, Genbank: NM_001256054.1; SEQ ID NO: 20). El transcrito V1 contiene los exones 1a-6b y codifica una proteína de 222 aminoácidos. Los exones V2 y V3 contienen respectivamente los exones 2-12 y los exones 1b-12 y codifican la misma proteína 481 aa (figura 1).
Algunos aspectos de la divulgación se refieren al reconocimiento de que V1 y V3 albergan la expansión G4C2. El análisis de cerebros con ELA y DFT humanos con esta expansión ha demostrado la acumulación intranuclear de los transcritos de ARN, lo que genera focos intranucleares de ARN en la corteza frontal y la médula espinal. Esto respalda la afirmación de que la expansión en transcritos V1 y V3 es un agente adverso primario que causa citotoxicidad en las motoneuronas. Aunque las funciones de las proteínas codificadas por C9orf72 no están bien caracterizadas, los enfoques bioinformáticos indican que la proteína C9orf72 comparte características estructurales con (DENN) y factores de intercambio de GDP/GTP (GEF)4 y, por lo tanto, puede regular el tráfico celular en la membrana entre otras funciones potenciales. La citotoxicidad de las expansiones G4C2 puede estar asociada con uno o más mecanismos de ganancia de función, tales como, por ejemplo: 1) secuestro excesivo por los focos de ARN de factores de transcripción (tales como ceguera muscular en distrofia miotónica); 2) traducción no ATG (RAN) asociada a repetición de la repetición expandida, que conduce a la expresión de dipéptidos (Gly-Ala; Gly-Pro; Gly-Arg); los péptidos producidos de esta manera forman inclusiones neuronales en todo el SNC; (3) e inducción de haploinsuficiencia debido a la disminución de la expresión del transcrito de C9orf72. Algunos aspectos de la divulgación se refieren al uso de rAAV (por ejemplo, rAAV.Rh10 administrado por vía intratecal) para introducir un ácido nucleico inhibidor (por ejemplo, un microARN) para silenciar la expresión de los transcritos de C9orf72 que albergan la expansión G4C2 causante de la alteración. En algunas opciones, la divulgación proporciona procedimientos y composiciones que logran silenciar los transcritos clave de pre-ARNm y ARNm maduro de C9orf72 in vitro.
Las mutaciones en el gen que codifica la superóxido dismutasa (SOD1), ubicado en el cromosoma 21, se han relacionado con la esclerosis lateral amiotrófica familiar. La superóxido dismutasa (SOD1) es una enzima codificada por el gen SOD1. La SOD1 se une a los iones de cobre y zinc y es una de las tres superóxido dismutasas responsables de destruir los radicales superóxido libres en el cuerpo. La isoenzima codificada es una proteína del espacio intermembrana citoplasmático y mitocondrial soluble, que actúa como un homodímero para convertir radicales superóxido de origen natural, pero perjudiciales, en oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno.
Las mutaciones frecuentes de SOD1 que tienen lugar y causan ELA incluyen A4V, H46R y G93A. Típicamente, estas mutaciones de SOD1 que causan ELA actúan de forma dominante, de tal modo que una única copia mutante del gen SOD1 puede ser suficiente para causar la enfermedad. Se cree que estas mutaciones dan lugar a una ganancia de función tóxica, ya que las enzimas mutantes generalmente conservan la actividad enzimática. En consecuencia, el SOD1 mutante puede causar un amplio abanico de defectos celulares que incluyen disfunciones mitocondriales, estrés oxidativo, mala regulación del calcio, agregación de proteínas procesadas de forma aberrante, estrés del retículo endoplasmático (ER), interrupción del transporte axonal, mala regulación de neurotransmisores, muerte celular programada e inflamación. Algunos aspectos de la divulgación se refieren al uso de rAAV (por ejemplo, rAAV.Rh10) para introducir un ácido nucleico inhibidor (por ejemplo, un microARN) en las células para silenciar la expresión de la SOD1 mutante.
Ácidos nucleicos inhibidores
En algunas opciones, la divulgación proporciona ácidos nucleicos inhibidores que inhiben la expresión de genes que causan ELA, tales como SOD1 y C9orf72. En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor es un ácido nucleico que se hibrida con al menos una parte del ácido nucleico diana, tal como un ARN, pre-ARNm, ARNm, e inhibe su función o su expresión. En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor es monocatenario o bicatenario. En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor es un microARN (miARN). En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor es un microARN que comprende una secuencia de direccionamiento que tiene regiones flanqueantes de miR-155.
En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor tiene de 5 a 30 bases de longitud (por ejemplo, 10-30, 15-25, 19-22). El ácido nucleico inhibidor también puede tener una longitud de 10-50 o 5-50 bases. Por ejemplo, el ácido nucleico inhibidor puede ser uno de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 bases de longitud. En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor comprende o consiste en una secuencia de bases al menos el 80% o el 90% complementarias a, por ejemplo, al menos 5, 10, 15, 20, 25 o 30 bases, o hasta 30 o 40 bases, del ácido nucleico diana, o comprende una secuencia de bases con hasta 3 desajustes (por ejemplo, hasta 1, o hasta 2 desajustes) a lo largo de 10, 15, 20, 25 o 30 bases del ácido nucleico diana.
En algunas opciones, uno o más nucleótidos de timidina (T) o nucleótidos de uridina (U) en una secuencia proporcionada en el presente documento pueden reemplazarse por cualquier otro nucleótido adecuado para el apareamiento de bases (por ejemplo, por medio de un par de bases de Watson-Crick) con un nucleótido de adenosina. Por ejemplo, T puede reemplazarse por U y U puede reemplazarse por T. En algunas opciones, se proporcionan ácidos nucleicos inhibidores que inhiben la expresión de genes en una célula del sistema nervioso central. En algunas opciones, la célula es una neurona, un astrocito o un oligodendrocito.
En algunas opciones, la célula expresa C9orf72 que tiene expansiones G4C2 de hasta 50, hasta 90, hasta 160, hasta 200, hasta 300, hasta 400, hasta 500 repeticiones, hasta 600 repeticiones o más. En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor comprende una secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 8. En algunas opciones, el nivel de un ARNm que codifica la isoforma B de C9orf72 en la célula es mayor que el nivel de un ARNm que codifica la isoforma A de la proteína C9orf72 en la célula. En algunas opciones, la célula contiene niveles detectables de focos G4C2 intranucleares. En algunas opciones, la célula contiene niveles detectables de proteínas C9 RAN.
En alguna forma de realización, la célula expresa una enzima SOD1 mutante. En algunas opciones, la mutación de SOD1 se selecciona de entre: A4V, H46R y G93A. En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor comprende o consiste en una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 15: AGCATTAAAGGACTGACTGAA (SOD-miR-103), SEQ ID NO: 16: GACTGAAGGCCTGCATGGATT (SOD-miR-117) o SEQ ID NO: 17: CTGCATGGATTCCATGTTCAT (SOD-miR-127).
Procedimientos de uso
En el presente documento se proporcionan procedimientos para inhibir la expresión de genes que están asociados con DFT y/o ELA, tales como C9orf72 o SOD1. En algunas opciones, se proporcionan procedimientos para inhibir la expresión de C9orf72 en una célula que implican administrar a la célula un ácido nucleico inhibidor que se dirige tanto al pre-ARNm como al ARNm codificado por un gen C9orf72. En algunas opciones, se proporcionan procedimientos para inhibir la expresión de C9orf72 en una célula que implican administrar al SNC del sujeto un ácido nucleico inhibidor que se dirige a un ARN codificado por el gen C9orf72, siendo el ácido nucleico inhibidor un microARN.
En algunas opciones, se proporcionan procedimientos para inhibir la expresión de C9orf72 en el sistema nervioso central (SNC) de un sujeto. En algunas opciones, los procedimientos implican administrar al SNC del sujeto un ácido nucleico inhibidor que se dirige tanto al pre-ARNm como al ARNm codificado por un gen C9orf72. En algunas opciones, el sujeto padece o se sospecha que padece DFT o ELA. En algunas opciones, los procedimientos implican administrar al sujeto una cantidad eficaz de un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que alberga un ácido nucleico que está manipulado genéticamente para expresar, en una célula del sujeto, un ácido nucleico inhibidor que se dirige tanto a ARNm como a ARNm codificado por un gen C9orf72. En algunas opciones, el ácido nucleico inhibidor comprende una secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 8.
En algunas opciones, se proporcionan procedimientos para inhibir la expresión de SOD1 en una célula. En algunas opciones, los procedimientos implican administrar a la célula un miARN que se dirige al ARNm de SOD1, en el que el miARN comprende 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de una secuencia expuesta en:
SEQ ID NO: 15: AGCATTAAAGGACTGACTGAA (SOD-miR-103),
SEQ ID NO: 16: GACTGAAGGCCTGCATGGATT (SOD-miR-117) o
SEQ ID NO: 17: CTGCATGGATTCCATGTTCAT (SOD-miR-127), o de una secuencia complementaria de cualquiera de las mismas. En algunas opciones, el ARNm de SOD1 está expuesto en GenBank: EF151142.1.
En algunas opciones, se proporcionan procedimientos para tratar a un sujeto que padece o se sospecha que padece ELA. En algunas opciones, los procedimientos implican administrar al sujeto una cantidad eficaz de un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que alberga un ácido nucleico que está manipulado genéticamente para expresar, en una célula del sujeto, un miARN que se dirige al ARN codificado por un gen SOD1.
De acuerdo con lo anterior, determinados procedimientos proporcionados en el presente documento implican administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que alberga cualquiera de los ácidos nucleicos recombinantes divulgados en el presente documento. En general, la "cantidad eficaz" de un rAAV se refiere a una cantidad suficiente para provocar la respuesta biológica deseada. En algunas opciones, la cantidad eficaz se refiere a la cantidad de rAAV eficaz para transducir una célula o tejido ex vivo. En otras opciones, la cantidad eficaz se refiere a la cantidad eficaz para la administración directa de rAAV a un sujeto. Como apreciarán los expertos en esta técnica, la cantidad eficaz del AAV recombinante de la divulgación varía dependiendo de factores tales como la variable de valoración biológico deseado, la farmacocinética de los productos de expresión, la afección que se está tratando, el modo de administración y el sujeto. Normalmente, el rAAV se administra con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunos casos, después de la administración del rAAV, se evalúa al menos un parámetro de resultado clínico o biomarcador (por ejemplo, focos de ARN de G4C2 intranucleares, expresión de proteína RAN, etc.) asociado con el DFT o ELA en el sujeto. Normalmente, el parámetro o biomarcador de resultado clínico evaluado después de la administración del rAAV se compara con el parámetro o biomarcador de resultado clínico determinado en un punto temporal anterior a la administración del rAAV para determinar la eficacia del rAAV. A menudo, una mejora en el parámetro o biomarcador de resultado clínico después de la administración del rAAV indica la eficacia del rAAV. Puede utilizarse cualquier parámetro o biomarcador de resultado clínico apropiado. Normalmente, el parámetro de resultado clínico o biomarcador es indicativo de uno o más síntomas de DFT o ELA. Por ejemplo, el parámetro de resultado clínico o biomarcador puede seleccionarse del grupo que consiste en: focos de ARN de G4C2 intranucleares, expresión de proteína RAN, expresión de SOD1, expresión de C9orf72, pérdida de memoria y presencia o ausencia de trastornos del movimiento tales como inestabilidad, rigidez, lentitud, espasmos, debilidad muscular o dificultad para tragar, dificultades del habla y del lenguaje, espasmos (fasciculaciones) y calambres en los músculos, incluidos los de las manos y los pies.
AAV recombinantes
En algunos aspectos, la divulgación proporciona AAV aislados. Tal como se utiliza en el presente documento con respecto a los AAV, el término "aislado" se refiere a un AAV que se ha aislado de su entorno natural (por ejemplo, de una célula, un tejido o un sujeto huésped) o se ha producido artificialmente. Los AAV aislados se pueden producir utilizando procedimientos recombinantes. Dichos AAV se denominan en el presente documento "AAV recombinantes". Los AAV recombinantes (rAAV) pueden tener capacidades de direccionamiento específicas de tejido, de tal forma que un transgén del rAAV se suministra específicamente a uno o más tejidos predeterminados. La cápside de AAV es un elemento importante para determinar estas capacidades de direccionamiento específicas de tejido. Por lo tanto, se puede seleccionar un rAAV que tenga una cápside apropiada para el tejido al que se dirige. En algunas opciones, el rAAV comprende una proteína capsídica que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a cualquiera de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, a Av 5, AAV6 , AAV7, AAV8 , AAV9, AAV.Rh10, AAV11 y variantes de los mismos. Los AAV recombinantes normalmente albergan un ácido nucleico recombinante de la divulgación.
Los procedimientos para obtener AAV recombinantes que tienen una proteína capsídica deseada son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos N° 2003/0138772). Las proteínas capsídicas de AAV que se pueden utilizar en los rAAV de la divulgación incluyen, por ejemplo, las descritas por G. Gao, et al., J. Virol, 78 (12): 6381-6388 (junio de 2004); G. Gao, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 100 (10): 6081-6086 (13 de mayo de 2003); documentos US 2003-0138772, US 2007/0036760, US 2009/0197338 y WO 2010/138263. Generalmente los procedimientos implican el cultivo de una célula huésped que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína capsídica de AAV o un fragmento del mismo; un gen rep funcional; un vector AAV recombinante compuesto por repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un transgén; y suficientes funciones auxiliares como para permitir el empaquetamiento del vector AAV recombinante en las proteínas capsídicas de AAV.
Los AAV adecuados que se pueden utilizar en los procedimientos proporcionados en el presente documento se describen en la publicación de patente de Estados Unidos N° 2013/0195801, titulada "CNS TARGETING AAV VECTORS AND METHODS OF USE Th EREOF" y publicada el 1 de agosto de 2013; y la publicación de patente de Estados Unidos N° 2012/0137379, titulada "NOVEL AAV'S AND USES THEREOF" y publicada el 31 de mayo de 2012.
Los componentes que se cultivarán en la célula huésped para empaquetar un vector rAAV en una cápside de AAV se pueden proporcionar a la célula huésped en trans. Alternativamente, uno o más de los componentes requeridos (por ejemplo, vector AAV recombinante, secuencias rep, secuencias cap y/o funciones auxiliares) pueden proporcionarse por una célula huésped estable que se ha manipulado genéticamente para contener uno o más de los componentes requeridos utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. De forma más adecuada, dicha célula huésped estable contendrá el o los componente(s) requeridos bajo el control de un promotor inducible. Sin embargo, el o los componente(s) necesarios pueden encontrarse bajo el control de un promotor constitutivo. En el presente documento se proporcionan ejemplos de promotores constitutivos e inducibles adecuados. En otra alternativa más, una célula huésped estable seleccionada puede contener componente(s) seleccionado(s) bajo el control de un promotor constitutivo y otro(s) componente(s) seleccionado(s) bajo el control de uno o más promotores inducibles. Por ejemplo, se puede generar una célula huésped estable que se deriva de células 293 (que contienen funciones auxiliares E1 bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contienen las proteínas rep y/o cap bajo el control de promotores inducibles. Un experto en la técnica puede generar otras células huésped estables adicionales.
El vector AAV recombinante, las secuencias rep, las secuencias cap y las funciones auxiliares necesarias para producir el rAAV de la divulgación se pueden administrar a la célula huésped de empaquetamiento utilizando cualquier elemento genético apropiado (vector). El elemento genético seleccionado puede administrarse mediante cualquier procedimiento adecuado, incluidos los descritos en el presente documento. Los procedimientos utilizados para construir cualquier opción de la presente divulgación son conocidos por los expertos en la manipulación de ácidos nucleicos e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. De forma similar, los procedimientos para generar viriones rAAV son bien conocidos y la selección de un procedimiento adecuado no representa una limitación de la presente divulgación. Véanse, por ejemplo, K. Fisher et al., J. Virol., 70: 520-532 (1993) y la patente de Estados Unidos N25.478.745.
En algunas opciones, pueden producirse AAV recombinantes utilizando el procedimiento de triple transfección (por ejemplo, tal como se describe en detalle en la patente de Estados Unidos N° 6.001.650). Normalmente, los AAV recombinantes se producen transfectando una célula huésped con un vector AAV recombinante (que comprende un transgén) para empaquetarlo en partículas de AAV, un vector de función auxiliar de AAV y un vector de función accesoria. Un vector de función auxiliar de AAV codifica las secuencias de la función auxiliar de a Av (por ejemplo, rep y cap), que funcionan en trans para la replicación productiva y la encapsidación de AAV. En algunas opciones, el vector de función auxiliar de AAV promueve la producción eficaz del vector AAV sin generar viriones de AAV de tipo silvestre detectables (por ejemplo, viriones de AAV que contienen genes rep y cap funcionales). Los ejemplos no limitantes de vectores adecuados para su uso con la presente divulgación incluyen pHLP19, descrito en la patente de Estados Unidos N° 6.001.650 y el vector pRep6cap6, descrito en la patente de Estados Unidos N° 6.156.303. El vector de función accesoria codifica secuencias de nucleótidos para funciones víricas y/o celulares no derivadas de AAV de las que AAV depende para la replicación (por ejemplo, "funciones accesorias"). Las funciones accesorias incluyen aquellas funciones requeridas para la replicación de AAV, incluidas, sin limitación, los restos implicados en la activación de la transcripción del gen de AAV, empalme de ARNm de AAV específico de etapa, replicación de ADN de AAV, síntesis de productos de expresión de cap y ensamblaje de la cápside de AAV. Las funciones accesorias de base vírica pueden derivarse de cualquiera de los virus auxiliares conocidos, tales como adenovirus, herpesvirus (distintos del virus del herpes simple tipo 1) y virus variolovacunal.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona células huésped transfectadas. El término "transfección" se utiliza para referirse a la captación de ADN extraño por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando se ha introducido ADN exógeno dentro de la membrana celular. Varias técnicas de transfección son conocidas en general en la técnica. Véase, por ejemplo, Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier y Chu et al. (1981) Gene 13:197. Dichas técnicas pueden utilizarse para introducir uno o más ácidos nucleicos exógenos, tales como un vector de integración de nucleótidos y otras moléculas de ácido nucleico, en células huésped adecuadas.
Una "célula huésped" se refiere a cualquier célula que alberga, o es capaz de albergar, una sustancia de interés. A menudo, una célula huésped es una célula de mamífero. Se puede utilizar una célula huésped como receptora de un constructo auxiliar de AAV, un plásmido de minigén de AAV, un vector de función accesoria u otro ADN de transferencia asociado con la producción de AAV recombinantes. El término incluye la progenie de la célula original que se ha transfectado. Por lo tanto, una "célula huésped", tal como se utiliza en el presente documento, puede referirse a una célula que se ha transfectado con una secuencia de ADN exógena. Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN genómico o total a la parental original, debido a una mutación natural, accidental o deliberada.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona células aisladas. Tal como se utiliza en el presente documento con respecto a una célula, el término "aislada" se refiere a una célula que se ha aislado de su entorno natural (por ejemplo, de un tejido o un sujeto). Tal como se utiliza en el presente documento, el término "línea celular" se refiere a una población de células capaces de crecimiento y división continuos o prolongados in vitro. A menudo, las líneas celulares son poblaciones clónicas derivadas de una única célula progenitora. Se sabe además en la técnica que pueden producirse cambios espontáneos o inducidos en el cariotipo durante el almacenamiento o la transferencia de dichas poblaciones clónicas. Por lo tanto, las células derivadas de la línea celular a la que se hace referencia pueden no ser exactamente idénticas a las células o los cultivos de sus ancestros, y la línea celular a la que se hace referencia incluye estas variantes. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "célula recombinante" se refiere a una célula en la que se ha introducido un segmento de ADN exógeno, tal como un segmento de ADN que conduce a la transcripción de un polipéptido biológicamente activo o la producción de un ácido nucleico biológicamente activo, tal como un ARN.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vector" incluye cualquier elemento genético, tal como un plásmido, un fago, un transposón, un cósmido, un cromosoma, un cromosoma artificial, un virus, un virión, etc., que es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control adecuados y que puede transferir secuencias génicas entre células. Por lo tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales. En algunas opciones, se contempla que los vectores útiles sean aquellos vectores en los que el segmento de ácido nucleico que se va a transcribir está posicionado bajo el control transcripcional de un promotor. Un "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o la maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de un gen. Las frases "posicionado operativamente", "bajo control" o "bajo control transcripcional" significan que el promotor se encuentra en la ubicación y la orientación correctas con respecto al ácido nucleico para controlar la iniciación por la ARN polimerasa y la expresión del gen. El término "vector o constructo de expresión" significa cualquier tipo de constructo genético que contenga un ácido nucleico en el que puede transcribirse una parte o la totalidad de la secuencia que codifica el ácido nucleico. En algunas opciones, la expresión incluye la transcripción del ácido nucleico, por ejemplo, para generar un producto polipeptídico biológicamente activo o ARN inhibidor (por ejemplo, ARNhc, miRNA) de un gen transcrito.
Los procedimientos anteriores para empaquetar vectores recombinantes en cápsides de AAV deseadas para producir los rAAV de la divulgación no pretenden ser limitantes y serán evidentes otros procedimientos adecuados para el experto en la técnica.
Vectores AAV recombinantes
Los ácidos nucleicos recombinantes de la divulgación pueden ser vectores AAV recombinantes. El vector AAV recombinante puede empaquetarse en una proteína capsídica y administrarse a un sujeto y/o administrarse a una célula diana seleccionada. Los "vectores AAV recombinantes (rAAV)" están compuestos típicamente por, como mínimo, un transgén y sus secuencias reguladoras, y repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV 5' y 3'. El transgén puede comprender, tal como se divulga en otra parte del presente documento, una o más regiones que codifican uno o más ácidos nucleicos inhibidores (por ejemplo, miARN) que comprenden un ácido nucleico que se dirige a un ARNm endógeno de un sujeto. El transgén también puede comprender una región que codifica un ARNm exógeno que codifica una proteína (por ejemplo, una proteína fluorescente).
Las secuencias de AAV del vector comprenden típicamente las secuencias de repetición terminal invertida 5' y 3' que actúan en cis (véase, por ejemplo, B. J. Carter, en "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, páginas 155­ 168 (1990)). Las secuencias de ITR tienen una longitud de aproximadamente 145 pb. En algunas opciones, se utilizan sustancialmente las secuencias completas que codifican las ITR en la molécula, aunque se permite cierto grado de modificación secundaria de estas secuencias. La capacidad de modificar estas secuencias de ITR se encuentra dentro del conocimiento de la técnica. (Véanse, por ejemplo, textos tales como Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1989); y K. Fisher et al., J Virol., 70: 520 532 (1996)). Un ejemplo de una molécula de este tipo empleada en la presente divulgación es un plásmido "que actúa en cis" que contiene el transgén, en el que la secuencia del transgén seleccionada y los elementos reguladores asociados están flanqueados por las secuencias ITR de AAV 5' y 3'. Las secuencias de ITR de AAV pueden obtenerse de cualquier AAV conocido, incluidos los tipos de AAV de mamíferos identificados actualmente.
Así, los ácidos nucleicos recombinantes pueden comprender repeticiones terminales invertidas (ITR) de serotipos de AAV seleccionados del grupo que consiste en: AAV1, AAV2 , AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, a Av 9, AAV.Rh10, AAV11 y variantes de los mismos. Los ácidos nucleicos recombinantes también pueden incluir un promotor unido operativamente con uno o más primeros ARN inhibidores, el ARNm exógeno y/o uno o más segundos ARN inhibidores. El promotor puede ser un promotor específico de tejido, un promotor constitutivo o un promotor inducible.
Además de los elementos principales identificados anteriormente para el vector AAV recombinante, el vector también incluye elementos de control convencionales que están operativamente unidos a elementos del transgén de una forma que permite su transcripción, su traducción y/o su expresión en una célula transfectada con el vector o infectada con el virus producido por la divulgación. Tal como se utilizan en el presente documento, las secuencias "unidas operativamente" incluyen tanto secuencias de control de la expresión que son contiguas al gen de interés como secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias apropiadas de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de empalme y de poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que mejoran la eficacia de la traducción (por ejemplo, secuencia de consenso de Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. Se conocen en la técnica y se pueden utilizar varias secuencias de control de la expresión, incluidos promotores que sean nativos, constitutivos, inducibles y/o específicos de tejido.
Tal como se utiliza en el presente documento, se dice que una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia codificante) y secuencias reguladoras están unidas operativamente cuando están unidas covalentemente de tal forma que se disponga la expresión o la transcripción de la secuencia de ácido nucleico bajo la influencia o el control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias de ácido nucleico se traduzcan en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están unidas operativamente si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras 5' da como resultado la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación por desplazamiento de marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias codificantes, o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente para traducirlo en una proteína. Por lo tanto, una región promotora estaría unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico si la región promotora fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ADN de forma que el transcrito resultante pudiera traducirse en la proteína o polipéptido deseado. De forma similar, dos o más regiones codificantes están unidas operativamente cuando están unidas de tal forma que su transcripción a partir de un promotor común da como resultado la expresión de dos o más proteínas que se han traducido en marco. En algunas opciones, las secuencias codificantes unidas operativamente producen una proteína de fusión. En algunas opciones, las secuencias codificantes unidas operativamente producen un ARN funcional (por ejemplo, miARN).
Para los ácidos nucleicos que codifican proteínas, generalmente se inserta una secuencia de poliadenilación después de las secuencias transgénicas y antes de la secuencia ITR 3' del AAV. Un constructo de rAAV útil en la presente divulgación también puede contener un intrón, convenientemente ubicado entre la secuencia promotora/potenciadora y el transgén. Una posible secuencia de intrón se deriva de SV-40 y se denomina secuencia de intrón de SV-40 T. Un intrón cualquiera puede ser del gen de p-actina. Otro elemento vectorial que puede utilizarse es un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES).
La naturaleza exacta de las secuencias reguladoras necesarias para la expresión génica en las células huésped puede variar entre especies, tejidos o tipos de células, pero en general incluirá, según sea necesario, secuencias 5' no transcritas y 5' no traducidas implicadas en el inicio de la transcripción y la traducción respectivamente, tales como una caja TATA, una secuencia de encapsulación terminal, una secuencia CAAT, elementos potenciadores y similares. Especialmente, dichas secuencias reguladoras no transcritas 5' incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen unido operativamente. Las secuencias reguladoras también pueden incluir secuencias potenciadoras o secuencias activadoras cadena arriba, según se desee. Los vectores de la divulgación pueden incluir opcionalmente secuencias líder o señal 5'. La elección y el diseño de un vector apropiado se encuentran dentro de la capacidad y el criterio de un experto en la técnica.
Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV) retroviral (opcionalmente con el potenciador del RSV), el promotor del citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador del CMV), el promotor SV40 y el promotor de dihidrofolato reductasa. Los promotores inducibles permiten la regulación de la expresión génica y pueden regularse por medio de compuestos suministrados de forma exógena, factores ambientales tales como la temperatura o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo, una fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o solo en células replicantes. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles están disponibles en una diversidad de fuentes comerciales, incluidas, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito muchos otros sistemas y un experto en la técnica puede seleccionarlos fácilmente. Los ejemplos de promotores inducibles regulados por promotores suministrados de forma exógena incluyen el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc, el promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema promotor de polimerasa T7, el promotor de insectos ecdisona, el sistema reprimible por tetraciclina, el sistema inducible por tetraciclina, el sistema inducible por RU486 y el sistema inducible por rapamicina. Otros tipos más de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son aquellos que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, la temperatura, una fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o solo en células replicantes. En otra opción, se utilizará el promotor nativo, o un fragmento del mismo, para el transgén. En una opción adicional, también pueden utilizarse otros elementos de control de la expresión nativos, tales como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias consenso de Kozak para imitar la expresión nativa.
En algunas opciones, las secuencias reguladoras imparten capacidades de expresión génica específicas de tejido. En algunos casos, las secuencias reguladoras específicas de tejido se unen a factores de transcripción específicos de tejido que inducen la transcripción de una forma específica de tejido. Dichas secuencias reguladoras específicas de tejido (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) son bien conocidas en la técnica. En algunas opciones, el promotor es un promotor de p-actina de pollo.
En algunas opciones, se incorporan uno o más sitios de unión para uno o más de los miARN en un transgén de un vector rAAV para inhibir la expresión del transgén en uno o más tejidos de un sujeto que alberga los transgenes, por ejemplo tejidos no hepáticos, tejidos no pulmonares. El experto en la técnica apreciará que se pueden seleccionar sitios de unión para controlar la expresión de un transgén de una forma específica de tejido. Los sitios diana de miARN en el ARNm pueden estar en la UTR 5', la UTR 3' o en la región codificante. Generalmente el sitio diana se encuentra en la UTR 3' del ARNm. Además, el transgén puede diseñarse de forma que múltiples miARN regulen el ARNm mediante el reconocimiento del mismo o de múltiples sitios. La presencia de múltiples sitios de unión de miARN puede dar como resultado la acción cooperativa de múltiples RISC y proporcionar una inhibición de la expresión altamente eficaz. La secuencia del sitio diana puede comprender un total de 5-100, 10-60 o más nucleótidos. La secuencia del sitio diana puede comprender al menos 5 nucleótidos de la secuencia de un sitio de unión del gen diana.
En algunas opciones, la capacidad de clonación del vector de ARN recombinante puede ser limitada y una secuencia codificante deseada puede implicar la sustitución completa del genoma de 4,8 kilobases del virus. Por lo tanto, los genes grandes pueden no ser adecuados para su uso en un vector AAV recombinante estándar en algunos casos. El experto en la técnica apreciará que existen opciones disponibles en la técnica para superar una capacidad de codificación limitada. Por ejemplo, las ITR de AAV de dos genomas pueden hibridarse para formar concatámeros de la cabeza a la cola, casi duplicando la capacidad del vector. La inserción de sitios de empalme permite la eliminación de las ITR del transcrito. Otras opciones para superar una capacidad de clonación limitada serán evidentes para el experto en la técnica.
Administración de AAV recombinante
Los rAAV se administran en cantidades suficientes para transfectar las células de un tejido deseado y para proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión génica sin efectos adversos graves. Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, el suministro directo al tejido seleccionado (por ejemplo, tejido hepático, tejido pulmonar) y administración subcutánea, intrapancreática, intranasal, parenteral, intravenosa, intramuscular, intratecal, intracerebral, oral, intraperitoneal, por inhalación o por otra vía. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea.
La administración de determinados rAAV a un sujeto puede realizarse, por ejemplo, mediante administración en el torrente sanguíneo del sujeto. La administración en el torrente sanguíneo puede ser mediante inyección en una vena, una arteria o cualquier otro conducto vascular. Además, en determinados casos, puede ser deseable administrar los rAAV al tejido cerebral, meninges, células neuronales, células gliales, astrocitos, oligodendrocitos, líquido cefalorraquídeo (LCR), espacios intersticiales y similares. En algunas opciones, los AAV recombinantes pueden administrarse directamente a la médula espinal o al cerebro (por ejemplo, corteza prefrontal) por inyección en la región ventricular, así como en el cuerpo estriado (por ejemplo, el núcleo caudado o el putamen del cuerpo estriado) y la unión neuromuscular, o lóbulo cerebeloso, con una aguja, catéter o dispositivo relacionado, utilizando técnicas neuroquirúrgicas conocidas en la técnica, tales como por inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Stein et al., J Virol 73: 3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97: 3428­ 3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3: 219-223, 1993; y Alisky y Davidson, Hum. Gene Ther. 11: 2315-2329, 2000).
En determinadas circunstancias, será deseable administrar los constructos terapéuticos basadas en rAAV en composiciones farmacéuticas adecuadamente formuladas divulgadas en el presente documento, o bien por vía intratecal, intracerebral, intravenosa, subcutánea, intraopancreática, intranasal, parenteral, intravenosa, intramuscular, oral, intraperitoneal o bien por inhalación.
Un experto en la técnica puede apreciar que la administración deseable de constructos terapéuticos basados en rAAV también puede incluir la administración ex vivo. En algunas opciones, la administración ex vivo comprende (1) aislamiento de células o tejido(s) de interés de un sujeto, (2) poner en contacto las células o tejido(s) con rAAV en cantidades suficientes para transfectar las células o tejido(s) para proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión génica sin efectos adversos graves, y (3) transferir células o tejido de nuevo al sujeto. En algunas opciones, se pueden cultivar células o tejidos ex vivo durante varios días antes y/o después de la transfección.
Se pueden aislar células o tejidos de un sujeto mediante cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, se pueden aislar células o tejidos mediante cirugía, biopsia (por ejemplo, biopsia de tejido cutáneo, tejido pulmonar, tejido hepático, tejido adiposo) o recogida de fluidos biológicos tales como sangre. En algunas opciones, las células se aíslan de la médula ósea. En algunas opciones, las células se aíslan del tejido adiposo. En algunas opciones, las células se aíslan de un lipoaspirado. Los procedimientos apropiados para aislar células del tejido adiposo para transfección ex vivo son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kuroda, M., et al., (2011), Journal of Diabetes Investigation, 2: 333-340; Kouki Morizono et al. Human Gene Therapy. Enero de 2003, 14 (1): 59-66; y Patricia A. Zuk, Viral Transduction of Adipose-Derived Stem Cells, Methods in Molecular Biology, 1, Volumen 702, Adipose-Derived Stem Cells, Parte 4, páginas 345-357.
En algunas opciones, las células aisladas comprenden células madre, células madre pluripotentes, células neuroprogenitoras, células madre derivadas de lipoaspirado, células hepáticas (por ejemplo, hepatocitos), células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimales, células estromales, células hematopoyéticas, células sanguíneas, fibroblastos, células endoteliales, células epiteliales u otras células adecuadas. En algunas opciones, las células que se van a transfectar son células madre pluripotentes inducidas preparadas a partir de células aisladas del sujeto.
En una opción, las células o tejido(s) se transducen a una multiplicidad de infección (MOI) de al menos 10 unidades infecciosas (u.i.) de un rAAV por célula (por ejemplo, 10, 100, 1,000, 5,000, 10,000, 100,000 o más u.i.) o en un número de copias víricas funcionalmente equivalente. En una opción, las células o tejido(s) se transducen a una MOI de 10 a 10.000 u.i. Las vías para la transferencia de células o tejido(s) transfectados a un sujeto incluyen, pero sin limitación, vía subcutánea, intraopancreática, intranasal, parenteral, intravenosa, intravascular, intramuscular, intratecal, intracerebral, intraperitoneal o por inhalación. En algunas opciones, las células transfectadas se administran mediante inyección en la vena porta hepática. En algunas opciones, las células transfectadas se administran por vía intravascular. Los procedimientos para la administración ex vivo de rAAV son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Naldini, L. Nature Reviews Genetics (2011) 12, 301-315, Li, H. et al. Molecular Therapy (2010) 18, 1553-1558 y Loiler et al. Gene Therapy (2003) 10, 1551-1558).
Composiciones de AAVrecombinantes
Los rAAV pueden administrarse a un sujeto en composiciones de acuerdo con cualquier procedimiento apropiado conocido en la técnica. El rAAV, que puede estar suspendido en un vehículo fisiológicamente compatible (por ejemplo, en una composición), se puede administrar a un sujeto, por ejemplo, un ser humano, un ratón, una rata, un gato, un perro, una oveja, un conejo, un caballo, una vaca, una cabra, un cerdo, un cobaya, un hámster, un pollo, un pavo o un primate no humano (por ejemplo, un tití, un macaco). Las composiciones de la divulgación pueden comprender un rAAV solo o en combinación con uno o más virus diferentes (por ejemplo, una segunda codificación de rAAV que tiene uno o más transgenes diferentes).
En algunas opciones, para evaluar el silenciamiento génico en primates relativamente grandes, se realizan experimentos en monos verdes africanos u otros primates relativamente grandes. En algunas opciones, los vectores rAAV que expresan miARN (por ejemplo, miR-SOD1) se inyectan en el LCR de dichos primates tanto por vía caudal utilizando una inyección IT como por vía rostral utilizando inyecciones en la cisterna magna.
Los vehículos adecuados puede seleccionarlos fácilmente un experto en la técnica considerando la indicación a la que se dirige el rAAV. Por ejemplo, un vehículo adecuado incluye solución salina, que se puede formular con una diversidad de soluciones tampón (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Otros ejemplos de vehículos incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato cálcico, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo y agua. Otros más serán evidentes para el experto en la técnica.
Opcionalmente, las composiciones de la divulgación pueden contener, además del rAAV y del o de los vehículo(s), otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tales como conservantes o estabilizantes químicos. Los ejemplos adecuados de conservantes incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, parabenos, etilvainillina, glicerina, fenol y paraclorofenol. Los estabilizantes químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.
La dosis de viriones rAAV requerida para lograr un efecto deseado o "efecto terapéutico", por ejemplo, las unidades de dosificación en genomas vectoriales/por kilogramo de peso corporal (gv/kg) variarán en función de varios factores que incluyen, pero sin limitación: la vía de administración de rAAV, el nivel de expresión del gen o ARN requerido para lograr un efecto terapéutico, la enfermedad o trastorno específico que se está tratando y la estabilidad del gen o producto de ARN. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente un intervalo de dosificación de virión de rAAV para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno particular basándose en los factores antes mencionados, así como en otros factores que son bien conocidos en la técnica. Una cantidad eficaz de rAAV se encuentra generalmente en el intervalo de aproximadamente 10 gl a aproximadamente 100 ml de solución que contiene aproximadamente de 109 a 1016 copias genómicas por sujeto. Pueden utilizarse otros volúmenes de solución. El volumen utilizado dependerá generalmente, entre otras cosas, del tamaño del sujeto, la dosis del rAAV y la vía de administración. Por ejemplo, para la administración intravenosa se puede utilizar un volumen en el intervalo de 10 gl a 100 gl, 100 gl a 1 ml, 1 ml a 10 ml o superior. En algunos casos, una dosis entre aproximadamente 1010 y 1012 copias genómicas de rAAV por sujeto es apropiada. En algunas opciones, el rAAV se administra a una dosis de 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, o 1015 copias genómicas por sujeto. En algunas opciones, el rAAV se administra a una dosis de 1010, 1011, 1012, 1013 o 1014 copias genómicas por kg.
En algunas opciones, las composiciones de rAAV se formulan para reducir la agregación de partículas de AAV en la composición, particularmente cuando hay presencia de altas concentraciones de rAAV (por ejemplo, ~1013 CG/ml o más). Los procedimientos para reducir la agregación de rAAV son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la adición de tensioactivos, el ajuste del pH, el ajuste de la concentración de sal, etc. (Véase, por ejemplo, Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178).
Los expertos en la técnica conocen bien la formulación de excipientes y soluciones de vehículos farmacéuticamente aceptables, así como el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para el uso de las composiciones particulares descritas en el presente documento en una diversidad de regímenes de tratamiento. Generalmente estas formulaciones pueden contener al menos aproximadamente el 0,1% del ingrediente activo o más, aunque el porcentaje del o de los ingrediente(s) activo(s) puede, por supuesto, variarse, y puede encontrarse convenientemente entre aproximadamente el 1 o el 2% y aproximadamente el 70% u 80% o más del peso o el volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de ingrediente activo en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse de tal forma que se obtenga una dosificación adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Un experto en la técnica de preparar dichas formulaciones farmacéuticas tendrá en cuenta factores tales como la solubilidad, la biodisponibilidad, la semivida biológica, la vía de administración, la vida útil del producto, así como otras consideraciones farmacológicas y, como tales, pueden ser deseables una diversidad de dosis y regímenes de tratamiento.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. También se pueden preparar dispersiones en glicerina, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos. En muchos casos, la forma es estéril y fluida en la medida en que se puede inyectar fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención contra la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr mediante el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.
Para la administración de una solución acuosa inyectable, por ejemplo, la solución puede tamponarse de forma adecuada, si es necesario, y el diluyente líquido, en primer lugar, puede volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán medios acuosos estériles que puedan emplearse. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente, deberá producirse alguna variación en la dosis dependiendo de las condiciones del huésped. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el huésped individual.
Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación del rAAV activo en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados en el presente documento, según se requiera, seguida de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo que consiste en el ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución filtrada previamente esterilizada del mismo.
Las composiciones de rAAV divulgadas en el presente documento también se pueden formular en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, de potasio, de amonio, de calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una forma compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas de dosificación, tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.
Tal como se utiliza en el presente documento, "vehículo" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, revestimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, tampones, soluciones de vehículos, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. También se pueden incorporar a las composiciones ingredientes activos complementarios. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción adversa alérgica o similar cuando se administran a un huésped.
Se pueden utilizar vehículos de administración tales como liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas y similares para la introducción de las composiciones de la presente divulgación en células huésped adecuadas. En particular, los transgenes liberados por el vector rAAV pueden formularse para su administración encapsulados en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera o una nanopartícula o similares.
Se puede preferir dichas formulaciones para la introducción de formulaciones farmacéuticamente aceptables de los ácidos nucleicos o los constructos de rAAV descritos en el presente documento. Los expertos en la técnica conocen generalmente la formación y el uso de liposomas. Recientemente, se han desarrollado liposomas con mejor estabilidad del suero y tiempos medios de circulación (patente de Estados Unidos N° 5.741.516). Además, se han descrito varios procedimientos de liposomas y preparaciones similares a liposomas como posibles vehículos de fármacos (patente de Estados Unidos N° 5.567.434, 5.552.157, 5.565.213, 5.738.868 y 5.795.587).
Los liposomas se han utilizado con éxito con varios tipos de células que normalmente son resistentes a la transfección mediante otros procedimientos. Además, los liposomas están exentos de las limitaciones de la longitud del ADN que son típicas de los sistemas de administración basados en virus. Los liposomas se han utilizado eficazmente para introducir genes, fármacos, agentes radioterapéuticos, virus, factores de transcripción y efectores alostéricos en una diversidad de líneas celulares en cultivo y animales. Además, se han completado varios ensayos clínicos exitosos que examinan la eficacia de la administración de fármacos mediada por liposomas.
Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilaminares (también denominadas vesículas multilaminares (MLV)). Las MLV generalmente tienen diámetros de 25 nm a 4 gm. La sonicación de las MLV da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilaminares (SUV), con diámetros en el intervalo de 200 a 500 ANG, que contienen una solución acuosa en el núcleo.
Como alternativa, pueden utilizarse formulaciones de nanocápsulas del rAAV. Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar sustancias de forma estable y reproducible. Para evitar los efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de un tamaño aproximado de 0,1 gm) deben diseñarse utilizando polímeros capaces de degradarse in vivo. Se contempla el uso de nanopartículas de poli(cianoacrilato de alquilo) biodegradables que cumplen estos requisitos.
Además de los procedimientos de administración descritos anteriormente, también se contemplan las técnicas siguientes como procedimientos alternativos para administrar las composiciones de rAAV a un huésped. Se ha utilizado sonoforesis (por ejemplo, ultrasonido), y se describe en la patente de Estados Unidos N° 5.656.016, como un dispositivo para mejorar la velocidad y la eficacia de la penetración del fármaco en y a través del sistema circulatorio. Otras alternativas de administración de fármacos contempladas son la inyección intraósea (patente de Estados Unidos N° 5.779.708), dispositivos de microchip (patente de Estados Unidos N° 5.797.898), formulaciones oftálmicas (Bourlais et al., 1998), matrices transdérmicas (patentes de Estados Unidos N° 5.770.219 y 5.783.208) y administración controlada por retroalimentación (patente de Estados Unidos N° 5.697.899).
Kits y composiciones relacionadas
Los ácidos nucleicos recombinantes, composiciones, vectores rAAV, rAAV, etc. descritos en el presente documento pueden, en algunas opciones, envasarse conjuntamente en kits farmacéuticos o de diagnóstico o de investigación para facilitar su uso en aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico o de investigación. Un kit puede incluir uno o más recipientes que contienen los componentes de la divulgación y las instrucciones de uso. Específicamente, dichos kits pueden incluir uno o más agentes descritos en el presente documento, junto con instrucciones que describen la aplicación prevista y el uso adecuado de estos agentes. En determinadas opciones, los agentes de un kit pueden encontrarse en una formulación farmacéutica y una dosis adecuada para una aplicación particular y para un procedimiento de administración de los agentes. Los kits para fines de investigación pueden contener los componentes en concentraciones o cantidades adecuadas para realizar varios experimentos.
El kit puede estar diseñado para facilitar el uso de los procedimientos descritos en el presente documento por los investigadores y puede adoptar muchas formas. Cada una de las composiciones del kit, en su caso, se puede proporcionar en forma líquida (por ejemplo, en solución), o en forma sólida, (por ejemplo, un polvo seco). En determinados casos, algunas de las composiciones pueden constituirse o procesarse de otra forma (por ejemplo, para dar una forma activa), por ejemplo, mediante la adición de un disolvente adecuado u otra especie (por ejemplo, agua o un medio de cultivo celular), que puede, o no, proporcionarse con el kit. Tal como se utiliza en el presente documento, "instrucciones" pueden definir un componente que proporciona instrucciones y/o ayuda, y generalmente implican instrucciones escritas en, o asociadas con, el envase de la divulgación. Las instrucciones también pueden incluir cualesquiera instrucciones orales o electrónicas proporcionadas de cualquier modo de forma que el usuario reconozca claramente que las instrucciones están asociadas con el kit, por ejemplo, audiovisuales (por ejemplo, cinta de video, DVD, etc.), por Internet y/o comunicaciones basadas en la web, etc. Las instrucciones escritas pueden estar en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, instrucciones que también pueden reflejar la aprobación de la agencia a su fabricación, su uso o su venta para administración animal.
El kit puede contener uno cualquiera o más de los componentes descritos en el presente documento en uno o más recipientes. Como ejemplo, en una opción, el kit puede incluir instrucciones para mezclar uno o más componentes del kit y/o aislar y mezclar una muestra y aplicarla a un sujeto. El kit puede incluir un recipiente que aloja los agentes descritos en el presente documento. Los agentes pueden encontrarse en forma de líquido, gel o sólido (polvo). Los agentes pueden prepararse de forma estéril, envasarse en jeringas y enviarse refrigerados. Como alternativa, puede alojarse en un vial u otro recipiente para su almacenamiento. Un segundo recipiente puede tener otros agentes preparados de forma estéril. Como alternativa, el kit puede incluir los agentes activos premezclados y transportados en una jeringa, un vial, un tubo u otro recipiente. El kit puede tener uno o más o todos los componentes necesarios para administrar los agentes a un sujeto, tales como una jeringa, dispositivos de aplicación tópica o un tubo y una bolsa con aguja para administración intravenosa.
Las opciones ejemplares de la divulgación se describen con más detalle mediante los ejemplos siguientes. Estas opciones constituyen ejemplos de la divulgación, que un experto en la técnica reconocerá que no se limita a las opciones ejemplares.
Ejemplos
Ejemplo 1: Evaluación y direccionamiento de la expresión de C9orf72
Se han desarrollado vectores virales adenoasociados recombinantes que suministran miARN dirigidos a C9orf72.
Evaluación de la expresión de C9orf72 en líneas celulares y cerebro humano normal:
Se utilizaron dos tipos de líneas celulares que expresan C9orf72 WT o mutante. Se obtuvo un conjunto de 83 líneas de células linfoblastoides de pacientes en 78 genealogías de ELA familiar (ELAF) que son positivas a expansión G4C2 de C9orf72. Además, se generaron líneas celulares HEK y SH-SY5Y continuas que tienen:
- 2,0 kb del promotor C9orf72 cadena arriba del exón 1a,
- exones 1a y 1b en los que el intrón intermedio contiene la repetición G4C2 y
- 2,1 kb del siguiente intrón y exón 2, cuyo codón de inicio dirige la luciferasa.
Se produjeron cuatro sublíneas a partir de estas líneas celulares que tienen expansiones G4C2 de 50, 90, 160 y 200 repeticiones. También se obtuvieron cultivos de fibroblastos de casos de expansión G4C2 de C9orf72.
Para sondear los principales transcritos de C9orf72 se produjeron una serie de sondas y cebadores que detectan o bien el pre-ARNm o bien el ARNm empalmado. Tal como se muestra en la figura 1 (parte superior), se desarrollaron sondas TaqMan para las diferentes isoformas de pre-ARNm. Una sonda, Vtodas detecta todos los transcritos de pre-ARNm, mientras que otras dos (V1 o V3) detectan las isoformas V1 o V3 del pre-ARNm. Tal como se muestra en la figura 1 (parte inferior), se generaron pares de cebadores que detectan tres isoformas de ARNm empalmado distintas. V1 detecta la isoforma B, mientras que los pares de cebadores V2 y V3 detectar dos variantes de isoformas A.
Tal como se muestra en la figura 2, los cebadores TaqMan detectan los tres principales transcritos de pre-ARNm de las células HEK293 y SH-SY5Y y del cerebro humano. Los niveles de transcritos de V1 y V3 son considerablemente más pequeños que Vtodas, lo que indica que, tal como se muestra, el transcrito predominante en el cerebro y en estas células es V2.
Silenciamiento mediado por microARN de la expresión de pre-ARNm y ARNm empalmado en células:
Se evaluó la capacidad de un microARN dirigido al gen C9orf72 para silenciar sus transcritos de ARN. Se desarrolló un microARN artificial, designado C9-miR220 que se dirige a las bases 220-241 del ORF presente en el exón 3 de C9orf72. Debido a que este miARN se une al exón 3, se espera que se dirija a todas las variantes de ARNm. La figura 3 muestra la desactivación in vitro mediada por miARN de C9orf72 humano. Estos son resultados de 3 réplicas biológicas de transfecciones transitorias mir220 (promotor CBA-GFP) en células HEK293T. El control es un miR contra SOD1.
El miARN se clonó en dos plásmidos diferentes, utilizando un promotor U6 o de beta-actina de pollo (CBA). A continuación, estos plásmidos se transfectaron en células Hek-293. Después de 72 horas, los transcritos se analizaron mediante RT-PCR cuantitativa con las sondas TaqMan personalizadas que detectan el transcrito de pre-ARNm o con los cebadores que detectan las variantes de ARNm empalmado. Tal como se muestra en las figuras 3 y 4, de forma dirigida por el promotor U6 o por el promotor CBA, ambas formas del microARN C9-miR220 redujeron los niveles de ARNm empalmado en aproximadamente el 50%. El nivel del transcrito de pre-ARNm se redujo a ~65% (por ejemplo, ~35% de reducción) mediante el microARN CBA-C9miR220, mientras que el U6-C9miR220 disminuyó los niveles del pre-ARNm a ~25% (por ejemplo, ~75% de reducción). (Véase la figura 4). Estos resultados demuestran el silenciamiento tanto del pre-ARNm como del ARNm del gen C9orf72 utilizando un microARN artificial.
Generación de modelo de ratón con expansión G4C2 transgénica de BAC
Para generar un modelo de ratón de ELA mediada por C9orf72, se aisló un cromosoma artificial bacteriano (BAC) de células de pacientes que padecían ELA con expansiones G4C2 con ~580 repeticiones y 45 repeticiones. El BAC que tiene ~580 repeticiones abarcan los exones 1-6 de C9orf72 (Hg18 chr0: 27,561,112-27,714,301), mientras que el BAC que tiene 45 repeticiones abarca la secuencia codificante completa. Se utilizó ADN circularizado de estos BAC para generar ratones transgénicos. Se obtuvieron 49 crías del BAC de 580 repeticiones, de las que 3 fueron positivas a la expansión G4C2 por ensayo PCR. Una de estas tres mostró transmisión de línea germinal y produjo una progenie que se reprodujo bien; se estableció una colonia de estos ratones con transmisión mantenida del transgén. El fundador original llegó hasta ~14 meses de edad sin un fenotipo de motoneurona obvio. Sin embargo, los cerebros de ratones transgénicos C9 BAC a los 4 y 6 meses de edad ya presentaban características excepcionales. En primer lugar, tal como se muestra en la figura 5 (carril E), una inmunotransferencia Southern de ADN genómico aislado de ratón transgénico BAC C9 revela una banda heterogénea densa que discurre de aproximadamente 4,5 a ~6,0 kb; es comparable con los resultados obtenidos con el uso de ADN linfoblastoide (A) y cerebral (B) de un individuo con una expansión G4C2. Ninguna banda de este tipo es evidente en el ADN del cerebro de un individuo sin expansión (carril c) o de un ratón no transgénico (D). Una segunda observación fue que el sondeo de secciones del hipocampo de ratones transgénicos BAC C9 de 580 repeticiones de 4 y 6 meses de edad con una sonda G4C2-CyA (para detectar el ARN de hebra sentido) reveló una abundancia de focos de ARN intranucleares también presentes en todo el resto del cerebro y la médula espinal. (Véase la figura 5, panel derecho).
Estos se detectaron por medio de un observador "ciego". El ratón de control de hipocampo/WT no mostró estos focos. Estos resultados indican: (1) transmisión estable de un trangén BAC C9orf72 con una expansión G4C2; y (2) que los ratones recapitulan los depósitos intranucleares de ARN de hebra sentido que se encuentran en ELA mediada por C9orf72 humana. Se ha determinado que estos focos no se detectan después de un tratamiento con ARNasa. Debido a que estos ratones C9 transgénicos BAC tienen focos de ARN nucleares, el silenciamiento de la expresión del transcrito de C9orf72 incluso en ausencia de la enfermedad de la motoneurona se puede evaluar analizando la presencia de focos.
Diseño de microARN:
La plataforma de AAV de miARN se basa en miR-155. Se clona un tallo-bucle con una secuencia de direccionamiento en el contexto de las regiones flanqueantes de miR-155 para reconocimiento y procesamiento eficaces por el complejo Drosha/DGCR8 (figura 7). El diseño de miARN produce una secuencia guía de miARN 21-mérica madura que tiene una adenina o un uracilo en el extremo 5'. La elección de U o A en el extremo 5' está dirigida por el hecho de que el dominio Mid de Ago2 interactúa con el extremo 5' del miARN maduro y tiene una afinidad 20 veces mayor por estas dos bases que por la citosina y la guanina. Este diseño también favorece la incorporación termodinámica de la hebra guía en el complejo RISC. Los miRNA están diseñados para dirigirse a zonas de ARNm diana de baja complejidad secundaria y terciaria. Esto se realiza con algoritmos de plegamiento de ARN con el objetivo de aumentar la probabilidad de unión afín de miARN:ARNm en el sitio diana. Tal como se muestra en la figura 7B, los miARN se clonan después en un plásmido pro­ viral con ITR que expresa GFP y el miARN de interés de un promotor de polimerasa II o de polimerasa III. Se clonaron 8 miARN en estos plásmidos que se dirigen a las variantes 1 y 3 de forma selectiva o a todas las variantes (véase la tabla 1).
Tabla 1: miARN clonados para dirigirse a C9orf72
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Tal como se muestra en la tabla 1, se han identificado y clonado miARN potenciales para la región que abarca la repetición de hexanucleótidos. Las isoformas V1 y V3 de pre-ARNm fueron la diana porque estas abarcan la repetición G4C2 de hexanucleótidos; como en la tabla 1, se espera que mir-C9-21 y -48 se dirijan a V1 y V3.
Además, se utilizaron miARN que se dirigen a todas las variantes. El miR-C9-220 es eficaz para la desactivación in vitro de las especies de ARNm y pre-ARNm. En determinados casos, un miARN con una eficacia de desactivación del 40-50% in vitro se traduce en desactivación de más del 80% in vivo debido a la mayor eficacia de transducción y las copias genómicas logradas con un vector viral. Este miARN funciona en el núcleo tal como se determina mediante la desactivación del pre-ARNm. El direccionamiento nuclear se puede mejorar modificando las últimas 3 bases del extremo 3' del miARN para que se desvíen del ARNm afín. Cuando los miARN no son el 100% complementarios a su mensaje y se desvían en el extremo 3', forman complejos significativamente más estables con Ago2. Esto aumentaría el tiempo de residencia del miARN en el complejo Ago2 y, por lo tanto, aumentaría la posibilidad de translocación nuclear. Tal como se muestra en la tabla 1, hemos clonado un miARN que tiene un desajuste en el extremo 3' (miR-C9-220-3'mm) que es útil para evaluar esta actividad.
Desactivación in vitro de C9orf72:
Se transfectaron transitoriamente células HEK-293T y células SHSY-5Y con reactivo Jet Prime de acuerdo con el protocolo del fabricante. La transfección de fibroblastos de pacientes utiliza el protocolo para fibroblastos primarios en el electroporador Nucleofactor (Lonza AG). Las células se recogen 48 horas después de la transfección y el aislamiento del ARN se realiza utilizando reactivo Trizol. A continuación, el ARN se trata con ADNasa (kit Turbo DNA-free, Applied Biosystems) y se transcribe de forma inversa (kit de ARN a ADNc de alta capacidad, Applied Biosystems). Para la detección de pre-ARNm se cuantifican los niveles de transcritos mediante RT-qPCR (mezcla maestra Fast SYBR Green y conjuntos de cebadores mencionados en las tablas 2 y 3 siguientes, Applied biosystems). Para la detección de ARNm se cuantifican los transcritos mediante RT-qPCR (ensayos TaqMan mastermix y TaqMan en la tabla siguiente, Applied Biosystems). Los datos de expresión se analizan por 2ññCt.
Diseño de cebador para la detección de pre-ARNm de C9orf72:
Se diseñaron dos conjuntos de cebadores para la detección de pre-ARNm. El primer conjunto de cebadores (Vtodas) detecta todas las variantes, porque los cebadores se encuentran entre el exón 2 y el intrón adyacente. El segundo conjunto de cebadores pre-ARNm (V1, V3) detecta las variantes 1 y 3; los cebadores están ubicados entre el exón 1 y el intrón adyacente (véase la figura 1). Las secuencias de cebadores se muestran en la tabla siguiente:
Tabla 2: Ensayos de RT-qPCR de pre-ARNm de C9orf72
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Diseño de cebador-sonda para la detección de ARNm de C9orf72:
Para la detección de ARNm empalmado, se utilizaron conjuntos de cebador-sonda. Cada conjunto abarca uniones de exones para discriminar del ADN genómico sin tener que realizar una digestión con ADNasa. V1 detecta solo la variante 1; el conjunto de cebador y sonda abarca los exones 1a y 3. V2 abarca la unión entre el exón 2 y el exón 3. V3, que detecta la variante 3, abarca la unión del exón 1b y el exón 3. Finalmente, Vtodas detecta todas las variantes; este conjunto de cebador-sonda abarca la unión de empalme entre los exones 3 y 4 (véase la figura 1). Las secuencias de sonda-cebador TaqMan se ordenaron a través de Life Technologies tal como se muestra en la tabla siguiente
Tabla 3: Ensayos de RT-qPCR de ARNm de C9orf72
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Hibridación fluorescente in situ (FISH) de focos nucleares G4C2 :
La detección de G4C2 en tejido y fibroblastos del paciente se logra mediante la fijación con PFA al 4% durante 10-20 min en hielo, se lava 3X con PBS y se incuba en etanol al 70% durante la noche a 4 °C. Se añaden formamida al 40% 2X SSC durante 20 min a temperatura ambiente. El tampón de hibridación (250 ul) se prepara con una sonda Cy3 específica para la expansión de hexanucleótidos (G4C2), se incuba durante 2 horas a 37 °C y después se lava con formamida al 40% 1 x SSC durante 30 min a 37 °C; seguido de 2 lavados con 1x SSC, a TA durante 15 min. A continuación, se montan los portaobjetos y se cubren mediante deslizamiento con un medio de montaje que contiene DAPI (véase la figura 5, panel derecho).
PCR cuantitativa en tiempo real de C9orf72:
Se extrajo ARN de la célula utilizando Trizol y se sometió a transcripción inversa (kit de ARN a ADNc de alta capacidad, Applied Biosystems). Siguiendo protocolos estándar, los niveles de transcritos de C9orf72 se cuantificaron mediante RT-qPCR utilizando la mezcla maestra Fast Taqman y los ensayos de Taqman de las tablas 2 y 3 (Applied Biosystems). La cuantificación relativa se determinó utilizando el procedimiento 2-ññCt.
Cuantificación de focos nucleares G4C2 :
La frecuencia de aparición de focos de ARN en fibroblastos de pacientes se evalúa analizando campos aleatorios fotografiados microscópicamente a 60x. El recuento automático de focos de ARN se lleva a cabo utilizando la macro del algoritmo FishJ del programa informático ImageJ.
Análisis estadístico:
La expresión relativa de los transcritos de C9orf72 tanto para el ARNm como para el pre-ARNm después de la transfección con los diversos plásmidos se analiza utilizando la ecuación 2-ññCt. Los valores de al menos tres réplicas biológicas que comparan controles (GFP-Scramble-miR) con experimentales (GFP-C9-miR) se analizaron con una prueba t de dos muestras para determinar la significancia estadística. Una variable de valoración secundaria en los experimentos con fibroblastos de pacientes fue la presencia promedio de focos nucleares G4C2. Los datos de los focos se obtuvieron del análisis de imágenes digitales de FishJ para al menos 3 réplicas biológicas que comparan controles frente a transfecciones experimentales, y de nuevo se compararon utilizando una prueba t de Student de dos muestras.
Ejemplo 2: Eficacia in vivo de virus adenoasociado recombinante tipo Rh10 (rAAV.Rh10-C9miR) administrado por vía intratecal en el silenciamiento de la expresión de pre-ARNm y ARNm maduro del gen C9orf72 en ratones
El rAAV.Rh10 que expresa anti-C9 miR administrado por vía intratecal reduce los niveles del sistema nervioso central de transcritos de ARN de C9orf72 en ratones de tipo silvestre y ratones transgénicos C9orf72mutante derivados de BAC. La eficacia de rAAV.Rh10-C9miR en la supresión de los niveles de C9orf72 y los transcritos de G4C2 asociados se evalúan en ratones transgénicos.
Se utilizan los cebadores V1, V2. V3 y Vtodas para evaluar transcritos de C9orf72. Tal como se muestra en la figura 8, los ensayos mediante cebadores V1, V2 y V3 detectan transcritos del ratón transgénico, mientras que los cebadores Vtodas detectan C9orf72 tanto de ratón como humano.
La eficacia de rAAV.Rh10-C9miR en la reducción de los niveles de los transcritos de pre-ARNm y ARNm empalmado de C9orf72 se evalúa utilizando tanto ratones de tipo silvestre como nuestros ratones transgénicos C9orf72mutante. Se evalúa hasta qué grado rAAV.Rh10-C9miR reduce el número de focos de ARNi en los ratones transgénicos. También se evalúa el grado en que rAAV.Rh10-C9miR reduce los niveles de proteínas c9-RAN [poli(G), poli(GA), poli(GR)].
Se administran rAAV.Rh10-C9miR en ratones de tipo silvestre y ratones transgénicos C9orf72mutante para evaluar la desactivación del pre-ARNm y el ARNm empalmado de C9orf72 endógeno. Los ratones transgénicos C9orf72mutante muestran la presencia de focos de ARN tal como se indica en la figura 9; el tejido del SNC de ratones transgénicos C9orf72mutante inmunotiñe positivamente péptidos traducidos por RAN. Por lo tanto, los cambios en la aparición de focos y péptidos traducidos por RAN se utilizan para evaluar la eficacia de la administración de rAAV.Rh10-C9miR. La reducción de los niveles de dipéptidos, por ejemplo, sirve como medida de la eficacia del silenciamiento.
Los rAAV.Rh10-C9miR utilizados en ratones transgénicos C9orf72mutante para evaluar el grado en que los C9-miR logran reducciones en (1) los niveles de pre-ARNm y ARNm, (2) el número de focos de ARN y (3) la producción de proteínas c9 RAN [poli(G), poli(GA), poli(GR)]. La hibridación fluorescente in situ (FISH) de focos nucleares G4C2 se realiza en el tejido del cerebro y la médula espinal de ratones tratados y no tratados, tal como se muestra en la figura 5.
Tal como se indica en las tablas 4 y 5, los rAAV se inyectan a ratones tanto recién nacidos como adultos; para los primeros se utiliza la administración intravenosa; para los segundos, la administración es intratecal. Las inyecciones en recién nacidos permiten una transducción generalizada del SNC con un pequeño volumen de vector. La administración intratecal reduce la cantidad de virus necesaria para transducir el SNC y minimiza la exposición sistémica al rAAV.
Tabla 4: Estudios en ratones de tipo silvestre con AAVRh10-C9-miR
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Tabla 5: Estudios de ratones transgénicos con AAVRh10-C9-miR
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Inyección periférica en recién nacidos:
Para las inyecciones en recién nacidos, se utiliza hipotermia para anestesiar a los animales antes de la administración intravenosa. Los animales se disponen en una cama de hielo húmedo durante 1-3 minutos, después se inyectan en la vena facial para P1 y la vena caudal para P28 y se vuelven a disponer en su lecho con sus compañeros de camada. El procedimiento de inyección al recién nacido dura aproximadamente 5 minutos.
Inyección intratecal lumbar:
Los ratones adultos se anestesian con isoflurano en una cámara de inducción al 2,5%. Una vez dormidos, los animales se transfieren a un cono nasal donde se les administra isoflurano en continuo. A los ratones se les inyecta un vector que codifica un miR contra C9orf72 o un miR de control revuelto a una dosis de 5 x 1010 genomas vectoriales/animal en un volumen de 5 pl. Esta dosis es equivalente a 2 x 1012 gv/kg (considerando un ratón de 25 g). La administración intratecal (IT) se realiza utilizando una aguja desechable estéril de 0,5 pulgadas de calibre 30 conectada a una jeringa Hamilton de vidrio Luer-hub de 50 pl. El lugar de la inyección se encuentra entre L5 y L6. El dolor posprocedimiento se gestiona con ketoprofeno (5 mg/kg, s.c.) en el momento de la inyección IT, y de 24 a 48 horas después si el animal parece sentirse incómodo.
Detección de péptidos traducidos por RAN:
Hay presencia de inclusiones citoplasmáticas inmunopositivas para un anticuerpo poli(GP) en la corteza frontal de ratones transgénicos C9orf72mutante tal como se muestra en la figura 9. Para determinar si los ratones transgénicos C9orf72mutante expresan otros péptidos traducidos por RAN, y para evaluar si el grado de traducción de RAN aumenta con la edad, la expresión de los péptidos poli(GA), poli(GR) y poli(GP) se examina en múltiples puntos temporales utilizando anticuerpos policlonales de conejo. Estos anticuerpos, que detectan específicamente su inmunógeno y no muestran reactividad cruzada con otros péptidos traducidos por RAN a partir de transcritos sentido o antisentido de la expansión de repeticiones C9orf72 (figura 10A) detectan inclusiones neuronales en todo el SNC de pacientes con c9DFT/ELA (figura 10B).
A los 2, 4, 8 y 12 meses de edad, se recogen el cerebro y la médula espinal de ratones transgénicos y de tipo silvestre. Cada cerebro se hemisecciona a través de la línea media sagital: la mitad se fija en formalina al 10%, mientras que la otra mitad se disecciona en 6 regiones (corteza, subcorteza, hipocampo, mesencéfalo, tronco encefálico y cerebelo) y se congela. Cada médula espinal se corta en 4 secciones transversales; las secciones 1 y 3 se fijan y las secciones 2 y 4 se congelan.
Para los estudios inmunohistoquímicos, la médula espinal fija y los hemisferios cerebrales se embeben en parafina y se seccionan (sagitalmente para el cerebro y transversalmente para la médula espinal). Las secciones se inmunotiñen con anticuerpos poli(GA), poli(GR) y poli(GP) utilizando DAKO Autostainer (DAKO Auto Machine Corporation) con DAKO Envision HRP System. Además, para evaluar hasta qué grado las inclusiones de péptidos traducidos por RAN se encuentran solo en neuronas, como es el caso del cerebro humano con c9DFT/ELA, se lleva a cabo una tinción de inmunofluorescencia doble utilizando anticuerpos para péptidos traducidos por RAN y marcadores neuronales o astrocíticos.
Para evaluar los niveles de expresión de péptidos traducidos por RAN y los cambios de solubilidad de péptidos de una forma dependiente de la edad, los tejidos congelados del cerebro y la médula espinal se someten a extracciones secuenciales para recolectar fracciones de proteínas solubles e insolubles. Estas fracciones se examinan mediante inmunotransferencia Western e inmunoensayo electroquimioluminiscente cuantitativo utilizando anticuerpos poli(GA), poli(GR) o poli(GP).
Efecto de miARN anti-C9orf72 sobre la expresión de péptidos traducidos por RAN en ratones transgénicos C9orf72mutante:
Para evaluar en qué grado el silenciamiento de los transcritos de C9orf72 por rAAV.Rh10-C9mir reduce la expresión de péptidos poli(GP) y otros productos traducidos por RAN expresados en ratones transgénicos C9orf72mutante, se recolectan cerebro y médula espinal de ratones en varios puntos temporales después de la transducción. Se llevan a cabo análisis de IHC, inmunotranferencia Western e inmunoensayo de péptidos traducidos por RAN para determinar el número de inclusiones, así como los niveles de péptidos traducidos por RAN solubles y/o insolubles.
Tabla 6: Resumen de variables de valoración y medidas del resultado para estudios con animales
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Análisis de imágenes digitales:
Cuantificación de los focos proteicos traducidas por RAN:
El análisis de los portaobjetos teñidos con IHC para las proteínas traducidas por RAN se realiza utilizando el programa de análisis de imágenes de recuento de píxeles positivos Aperio. Los portaobjetos completos se escanean y se digitalizan con el programa informático Aperio. Los análisis se llevan a cabo en todas las secciones del cerebro y la médula espinal a menos que se observen artefactos de tinción, tales como cromógeno precipitado. Estas áreas se excluyen del análisis utilizando la herramienta Pluma para delinear la región. El procedimiento de análisis se realiza en todas las imágenes que se envían para procesamiento por lotes utilizando el programa informático Spectrum. Este proceso somete todos los portaobjetos teñidos con IHC al algoritmo de recuento de píxeles positivo estándar. La configuración predeterminada utilizada para la cuantificación del cromógeno marrón se encuentra en los tres intervalos de intensidad (220-175, 175-100 y 100-0). Los píxeles que están teñidos, pero que no entran en la especificación de color positivo, se consideran píxeles teñidos negativos. Estos píxeles también se cuentan, de modo que se determina la fracción de píxeles positivos y negativos totales con respecto a positivos. Los datos de positividad (%) se notifican como el número de píxeles positivos (positivos medios y fuertes)/número total de píxeles positivos y negativos.
Cuantificación de focos nucleares G4C2 :
La frecuencia de los focos de ARN se evalúa mediante muestreo de transectos a través del cerebelo y la materia gris de la médula espinal. Los campos microscópicos se eligen aleatoriamente por un operador ciego y se fotografían con una lente de inmersión en aceite de 60x. A continuación, se lleva a cabo el recuento automático de focos de ARN en las imágenes utilizando la macro del algoritmo FishJ del programa informático ImageJ.
Consideraciones estadísticas:
La cuantificación de los cambios relativos en la expresión génica de los transcritos de ARNm y pre-ARNm de C9orf72 después de la administración de AAV con los diversos constructos se analiza utilizando la ecuación 2-ññCt. Para determinar diferencias estadísticamente significativas, se comparan los valores promedio para los grupos de control (GFP-ScramblemiR) o (controles PBS) con los promedios del grupo experimental (AAVRh-C9-miR) utilizando una prueba t de dos muestras para determinar la significancia estadística. El análisis de imágenes digitales para focos nucleares de ARN y proteínas traducidas por RAN de secciones de tejido de ratón transgénico se cuantifican mediante los programas informáticos FishJ y Aperio, respectivamente. Los valores se obtienen para cada animal y se promedian según los grupos para el análisis estadístico (prueba t de Student). Los datos del cerebelo y la médula espinal de cada grupo se analizan individualmente.
Ejemplo 3: Direccionamiento de miARN de C9orf72 en primates
Evaluación de rAAV.Rh10-C9miR y el grado de silenciamiento de los transcritos de C9orf72 en el sistema nervioso central de primates no humanos (NHP) después de administración intratecal
Se evalúa el grado en que el rAAV.Rh10-C9miR administrado por vía intratecal se propaga por la médula espinal, el cerebro y el cerebelo en primates no humanos (NHP). Se preparan tres vectores rAAV.Rh10 para la administración de constructos de expresión que codifican anti-C9-miARN. Los vectores se administran mediante inyección intratecal. Se evalúan tanto la propagación como el tropismo de AAVRh10, así como la eficacia de silenciamiento de C9-miR de dos promotores diferentes durante un periodo de 3 semanas. A una de las cohortes se le inyectan vectores que expresan el miARN procedente de un promotor de la polimerasa II (un promotor híbrido de beta actina de pollo) que conduce GFP. A otra cohorte se le administra un vector bicistrónico en el que el miARN se expresa a partir de un promotor de la polimerasa III U6 que está dispuesto cadena arriba del promotor híbrido de beta-actina de pollo que dirige la expresión de GFP (figura 7B). Una tercera cohorte recibe un control de solo GFP (véase la tabla 7 siguiente). Se realiza una RT-qPCR en ARN obtenidos de motoneuronas que se capturan con láser mediante microdisección. La dosis de vector utilizada se basa en la administración IT de rAAV en estudios de NHP que muestran una transducción robusta de la médula espinal y cortical.
Tabla 7: Estudio de silenciamiento de C9orf72 a corto plazo en NHP que compara los promotores Pol II y Pol III
Figure imgf000023_0001
Se utilizan vectores rAAV.Rh10-C9-miR que no codifican GFP para examinar la seguridad a largo plazo de la administración vírica de rAAV.Rh10 en titíes (por ejemplo, 4 controles y 4 tratados). Las variables de valoración en vida incluyen exámenes físicos detallados, observaciones clínicas detalladas, peso corporal, parámetros hematológicos y químicos estándar en sangre, evaluación de anticuerpos séricos contra AAVRh10, respuestas de células T a péptidos de AAV y grado de eliminación del vector en fluidos corporales y heces. Las variables de valoración post mortem incluyen observaciones de necropsia macroscópica, pesos de órganos e histopatología, y contenido de ADN del vector rAAV.Rh10-C9-miR en sangre y tejido (tabla 9). Además, se evalúa el grado de silenciamiento de miR de C9orf72 utilizando procedimientos descritos en el presente documento.
Tabla 8. Variables de valoración de biodistribución de NHP/estudio de toxicología
Figure imgf000023_0002
Microdisección de captura láser:
Se recogen 12 secciones congeladas de médula espinal lumbar de mm en portaobjetos de membrana PEN (Zeiss, Múnich, Alemania) y se tiñen con violeta de cresilo al 1% (Sigma, St. Louis, MO) en metanol. Las secciones se secan al aire y se almacenan a -80 °C. Después de descongelar, las motoneuronas se recolectan dentro de los 30 minutos posteriores a la tinción utilizando el microdisector de captura láser PALM Robo3 Zeiss usando los ajustes siguientes: Energía de corte: 48, energía LPC: 20, enfoque de corte: 80/81, enfoque LPC: 1, velocidad de posición: 100, velocidad de corte: 50. Se recolectan aproximadamente 500 MN por animal. Las células no neuronales del asta ventral se recolectan de las mismas secciones después de recolectar las motoneuronas. A continuación, se aísla el ARN utilizando el kit RNaqueous Micro Kit (Ambion, Grand Island, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Elispot de interferón gamma en respuesta a cápside de rAAV.Rh10 :
Para caracterizar la respuesta inmunitaria a rAAV.Rh10 después de la administración IT, se evalúa la proliferación de linfocitos con respecto a péptidos de la cápside rAAV.Rh10 agrupados utilizando el ensayo ELISPOT. La sangre obtenida en los distintos puntos temporales se procesa utilizando un protocolo Ficoll-Paque™ Plus estándar para obtener células mononucleares de sangre periférica. Se añaden PBMC a una concentración de 2 x 105 células por pocillo a una placa recubierta con anticuerpo de captura de IFN-gamma. La estimulación específica de antígeno con rAAV.Rh10 se realiza durante 18-24 horas, después de las cuales las células se lavan a fondo. Este proceso viene seguido por la adición del anticuerpo de detección y posteriormente Avidina-HRP, que se desarrolla con el sustrato apropiado para una lectura colorimétrica.
Ensayos de anticuerpos neutralizantes de AAV:
La presencia de anticuerpos neutralizantes de AAV se evalúa utilizando técnicas apropiadas en un laboratorio central de vectores.
Ejemplo 4: Evaluación y direccionamiento de la expresión de SOD1:
Administración del vector rAA V a ratones transgénicos
Se desarrolló un vector viral adenoasociado recombinante que suministra miARN contra SOD1 (véanse las figuras 11A-C) a células in vitro o in vivo. La administración del vector rAAV a ratones transgénicos que expresan la forma mutante de SOD1 dio como resultado una desactivación del 80-90% del ARNm diana en tejidos transducidos (figura 12). Por ejemplo, se determinó que (miR) anti-SOD1 silencia la expresión de SOD1 en hígado de ratón, tal como se muestra en la figura 13.
Para estos experimentos, se utilizan vectores rAAV con tres tipos de constructos: (a) beta actina de pollo (CB) que dirige GFP seguido de miR anti-SOD1 en tándem (mir127); (b) el promotor U6 que dirige miR-SOD1 seguido de CB-GFP; y como control CB-GFP solo. La figura 13 (panel superior) muestra esquemas de estos constructos.
Se determinó que el rAAV9 administrado por vía intratecal que porta un microARN para atenuar la expresión de SOD1 prolonga la supervivencia en ratones ELA transgénicos SOD1G93A. Los 2,4 x 1010 genomas víricos/5 ul inyectados en el espacio intratecal lumbar de un ratón de 60 días lograron una administración generalizada del microARN a múltiples tipos de células a lo largo de la médula espinal. (Esta dosis es ~1/16 de la dosis utilizada en nuestra administración IV). En animales que fueron altamente transducidos, se observó una reducción de la expresión de SOD1 de aproximadamente el 50% evaluada por inmunotransferencia Western. También se observó una prolongación de la supervivencia en aproximadamente 14 días en general y hasta más de 160 días en ratones con el nivel más alto de silenciamiento de SOD1 (en comparación con 123 días en ratones ELA tratados con rAAV9-microARN revuelto). Estos resultados indican que C9-miR220 puede administrarse a lo largo de la longitud de la médula espinal en roedores y primates no humanos utilizando rAAV.Rh10.
La figura 20 indica que el tratamiento de ratones G93A SOD1 con CB-miR-SOD1 aumenta significativamente la supervivencia en comparación con los animales de control. Se inyectaron a ratones G93A SOD1 2 x 1012 copias genómicas (gc) del vector CB-GFP o CB-miR-SOD1-GFP el día 56-68 de edad y se supervisaron a ciegas hasta que la parálisis avanzada requirió eutanasia. La mediana de supervivencia fue de 108 días para los animales de control (CB-GFP, n = 19) y de 130 días para CB-miR-SOD1-GFP (n = 28). La prueba de rango logarítmico da como resultado un valor de p de 0,018, lo que sugiere que el aumento de la supervivencia es estadísticamente significativo. Estos datos indican además que la administración sistémica de mir-SOD1 mediante inyección intravenosa da como resultado un aumento significativo en la supervivencia de ratones G93A SOD1.
Ejemplo 5: Direccionamiento de miARN de SOD1 en primates:
Administración intratecal de AAV recombinante (rAAV) que expresa miARN de SOD1 al cerebro y la médula espinal
Se utilizó la administración de microARN mediada por virus adenoasociado (AAV) para silenciar SOD1 en tejidos de mamíferos, incluida la médula espinal.
Tal como se muestra en la figura 6, la administración intratecal de rAAV.Rh10.EGFP a un tití adulto dio como resultado una captación notable en la materia gris de los cuernos anteriores (A) lumbosacros y (B) cervicales, con una marcación prominente de las motoneuronas (identificadas por su tamaño y ubicación). Se obtuvieron motoneuronas capturadas con láser de este tití (tratado con rAAV.Rh10.EGFP) y de otro tratado con rAAV.Rh10.U6-miR-SOD1, que expresa un miR que silencia SOD1. Como en la figura 6 (parte inferior), el animal de control mostró niveles altos de transcrito de SOD1 y un miR-SOD1 mínimo (esencialmente 0 con respecto al valor inicial). Por el contrario, en el animal tratado, el transcrito de SOD1 era casi indetectable, mientras que había un alto nivel de microARN miR-SOD1.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un virus adenoasociado recombinante (rAAV) para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que padece o se sospecha que padece ELA, comprendiendo el procedimiento:
administrar al sujeto una cantidad eficaz del virus adenoasociado recombinante (rAAV), en el que el rAAV alberga un ácido nucleico que está manipulado genéticamente para expresar, en una célula del sujeto, un miARN que comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de la secuencia expuesta en SeQ ID NO: 17 (CTGCATGGATTCCATGTTCAT (SOD-miR-127)) y que se dirige al ARN codificado por un gen SOD1.
2. El rAAV para su uso según la reivindicación 1, en el que el rAAV se dirige a tejido del SNC.
3. El rAAV para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el rAAV comprende una proteína capsídica AAV.Rh10 o AAV9.
4. Un microARN sintético que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 17: CTGCATGGATTCCATGTTCAT (SOD-miR-127) y regiones flanqueantes de miR-155.
5. Un ácido nucleico recombinante que codifica el microARN sintético de la reivindicación 4 y que comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) de un serotipo de AAV.
6. Un ácido nucleico recombinante según la reivindicación 5, en el que el serotipo de AAV se selecciona del grupo que consiste en: AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVRh10, AAV11 y variantes de los mismos.
7. Un ácido nucleico recombinante según la reivindicación 6, que comprende además un promotor unido operativamente a una región o regiones que codifican el microARN, en el que opcionalmente el promotor es un promotor específico de tejido; o un promotor de la polimerasa II, tal como un promotor de p-actina; o un promotor de la polimerasa III, tal como un promotor U6.
8. Una composición que comprende el ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
9. Un virus adenoasociado (AAV) recombinante que alberga un ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
10. El AAV recombinante de la reivindicación 9, que comprende además una o más proteínas capsídicas de uno o más serotipos de AAV seleccionados del grupo que consiste en: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV.Rh10, AAV11 y variantes de los mismos.
11. Una composición que comprende el AAV recombinante de la reivindicación 9 o 10.
12. La composición de la reivindicación 11, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Un kit que comprende un recipiente que contiene la composición de la reivindicación 11 o 12.
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