JP2021152030A - 筋萎縮性側索硬化症を処置するためのrAAVベースの組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、35 U.S.C. §119(e)の下で、2014年3月18日に出願された米国仮特許出願USSN61/955,189、名称「筋萎縮性側索硬化症を処置するためのrAAVベースの組成物および方法(RAAV-Based Compositions and Methods for Treating Amyotrophic Lateral Sclerosis)」に基づく優先権を主張する;その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、筋萎縮性側索硬化症などの遺伝性疾患を処置するための、方法および組成物に関する。
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、一般に致命的な進行性の運動ニューロン疾患であり、これは前頭側頭型認知症(FTD)と同時に発症することもある。ALSは、散発性(SALS)および家族性(FALS)両方の形態で生じる。症例の約10%は、常染色体優性形質として遺伝する。ALSに対するFDA承認療法は、生存を約10%延長する化合物である、リルゾールである。
いくつかの側面において、本開示は、細胞におけるC9orf72の発現を阻害する方法を提供し、該方法は、細胞に対し、C9orf72遺伝子によってコードされるpre−mRNAおよびmRNAの両方を標的とする阻害性核酸を送達することを含む。
いくつかの態様において、細胞は、中枢神経系の細胞である。いくつかの態様において、細胞はニューロンである。
いくつかの態様において、阻害性核酸に曝露される前に、細胞は、核内G4C2凝集体(foci)を含む。いくつかの態様において、阻害性核酸の細胞への送達は、核内G4C2凝集体の減少をもたらす。
いくつかの態様において、細胞はin vivoである。いくつかの態様において、細胞はin vitroである。いくつかの態様において、細胞は、FTDまたはALSの1または2以上の症状を有する対象のものである。いくつかの態様において、細胞は、FTDまたはALSを有する疑いのある対象のものである。
いくつかの側面において、本開示は、対象の中枢神経系(CNS)におけるC9orf72の発現を阻害する方法を提供し、該方法は、対象のCNSに対して、C9orf72遺伝子によってコードされるRNAを標的とする阻害性核酸を投与することを含み、ここで前記阻害性核酸は、マイクロRNAである。
いくつかの態様において、阻害性核酸はマイクロRNAである。
いくつかの態様において、阻害性核酸を対象に投与するステップは、対象に対して、対象の細胞において阻害性核酸を発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を投与することを含む。
いくつかの側面において、本開示は、FTDまたはALSを有するか、または有することが疑われる対象を処置する方法を提供し、該方法は、対象の細胞においてC9orf72遺伝子によりコードされるpre−mRNAおよびmRNAの両方を標的とする阻害性核酸を発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の有効量を投与すること、を含む。
いくつかの態様において、阻害性核酸は、C9orf72のエクソン3内の少なくとも5個の連続したヌクレオチドに相補的な相補性領域を含む。いくつかの態様において、少なくとも5個の連続したヌクレオチドは、C9orf72のヌクレオチド220〜241内にある。
いくつかの態様において、阻害性核酸は、C9orf72タンパク質のアイソフォームAをコードするmRNAおよびアイソフォームBをコードするmRNAを標的とする。いくつかの態様において、阻害性核酸は、C9orf72バリアントV1(NM_145005.6;配列番号18)、V2(NM_018325.3;配列番号19)、およびV3(NM_001256054.1;配列番号20)を標的とする。いくつかの態様において、阻害性核酸は、C9orf72バリアントV1(NM_145005.6;配列番号18)およびV3(NM_001256054.1;配列番号20)を標的とするが、V2(NM_018325.3;配列番号19)は標的としない。いくつかの態様において、阻害性核酸は、C9orf72バリアントV1(NM_145005.6;配列番号18)を標的とするが、V2(NM_018325.3;配列番号19)およびV3(NM_001256054.1;配列番号20)は標的としない。
いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号1〜8のいずれかに示された配列の、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、rAAVは、髄腔内、脳内、脳室内または静脈内に投与される。
いくつかの側面において、本開示は、細胞におけるSOD1の発現を阻害する方法を提供し、該方法は、細胞に対して、SOD1 mRNAを標的とするmiRNAを送達することを含み、ここで該miRNAは、
配列番号15:AGCATTAAAGGACTGACTGAA(SOD−miR−103);
配列番号16:GACTGAAGGCCTGCATGGATT(SOD−miR−117);または
配列番号17:CTGCATGGATTCCATGTTCAT(SOD−miR−127)、
に示された配列の、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個の連続したヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、miRNAは、
配列番号15:AGCATTAAAGGACTGACTGAA(SOD−miR−103);
配列番号16:GACTGAAGGCCTGCATGGATT(SOD−miR−117);または
配列番号17:CTGCATGGATTCCATGTTCAT(SOD−miR−127)、
に示された配列の、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個の連続したヌクレオチドを含む。
いくつかの側面において、本開示は、配列番号1〜8のいずれかに示された配列を含む、合成マイクロRNAを提供する。
いくつかの側面において、本開示は、配列番号15:AGCATTAAAGGACTGACTGAA(SOD−miR−103);配列番号16:GACTGAAGGCCTGCATGGATT(SOD−miR−117);または配列番号17:CTGCATGGATTCCATGTTCAT(SOD−miR−127)に示された配列を含む、合成マイクロRNAを提供する。いくつかの態様において、合成マイクロRNAは、miR−155の隣接領域をさらに含む。
いくつかの側面において、本開示は、配列番号1〜8または配列番号15〜17のいずれかに記載のマイクロRNAをコードし、AAV血清型の逆方向末端反復(ITR)を含む、組換え核酸を提供する。いくつかの態様において、AAV血清型は、AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRh10、AAV11およびそのバリアントからなる群から選択される。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の組換え核酸を含む、組成物を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の組換え核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)を提供する。いくつかの態様において、組換えAAVは、AV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11およびそのバリアントからなる群から選択される1または2以上のAAV血清型の、1または2以上のキャプシドタンパク質をさらに含む。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の組換えAAVを含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の組成物を収容する容器を含む、キットを提供する。
本開示の側面は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)に関連する遺伝子の発現を調節するための、組成物および方法に関する。本開示の側面は、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターを用いてALSを処置するための、改良された遺伝子治療用組成物および関連する方法に関する。特に、ALSに関連するC9orf72およびSOD1などの遺伝子をサイレンシングする阻害性核酸を発現するように操作された核酸を保有する、rAAVが提供される。いくつかの態様において、本開示は、組換えAAV(例えば、rAAV.Rh10)を利用して、マイクロRNAをCNSに送達し、これによってSOD1またはC9orf72などのALS遺伝子をサイレンシングする。
出現してALSの原因となる、頻繁なSOD1突然変異には、A4V、H46RおよびG93Aが含まれる。典型的には、これらのALSの原因となるSOD1突然変異は、支配的な様式で作用し、SOD1遺伝子の単一の変異型コピーが疾患を引き起こすのに十分であり得る。変異型酵素は典型的には酵素活性を保持するので、これらの突然変異は、毒性の機能獲得につながると考えられている。したがって、変異型SOD1は、ミトコンドリア機能障害、酸化ストレス、カルシウム調節不全、異常に処理されたタンパク質の凝集、小胞体(ER)ストレス、軸索輸送の中断、神経伝達物質の誤制御、プログラムされた細胞死および炎症を含む、広範囲の細胞欠陥を引き起こす可能性がある。本開示の側面は、rAAV(例えば、rAAV.Rh10)を使用して、阻害性核酸(例えば、マイクロRNA)を細胞に導入し、変異型SOD1の発現をサイレンシングすることに関する。
いくつかの態様において、本開示は、SOD1およびC9orf72などのALSの原因となる遺伝子の発現を阻害する、阻害性核酸を提供する。いくつかの態様において、阻害性核酸は、RNA、pre−mRNA、mRNAなどの標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズして、その機能または発現を阻害する核酸である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、一本鎖または二本鎖である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、マイクロRNA(miRNA)である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、miR−155の隣接領域を有する標的配列を含む、マイクロRNAである。
いくつかの態様において、本明細書に提供される配列中の任意の1または2以上のチミジン(T)ヌクレオチドまたはウリジン(U)ヌクレオチドは、アデノシンヌクレオチドとの塩基対形成(例えば、ワトソン−クリック塩基対を介して)に適した任意の他のヌクレオチドで置換されていてもよい。例えば、TはUで置き換えられていてもよく、およびUはTで置き換えられてもよい。いくつかの態様において、中枢神経系の細胞における遺伝子の発現を阻害する、阻害性核酸が提供される。いくつかの態様において、細胞は、ニューロン、星状細胞、またはオリゴデンドロサイトである。
いくつかの態様において、細胞は、変異型SOD1酵素を発現する。いくつかの態様において、SOD1変異は、A4V、H46RおよびG93Aから選択される。いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号15:AGCATTAAAGGACTGACTGAA(SOD−miR−103);配列番号16:GACTGAAGGCCTGCATGGATT(SOD−miR−117);または配列番号17:CTGCATGGATTCCATGTTCAT(SOD−miR−127)に示された配列を含むか、またはこれからなる。
C9orf72またはSOD1などの、FTDおよび/またはALSと関連する遺伝子の発現を阻害するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、細胞おけるC9orf72の発現を阻害する方法が提供され、該方法は、細胞に対して、C9orf72遺伝子によってコードされるpre−mRNAおよびmRNAの両方を標的とする阻害性核酸を送達することを含む。いくつかの態様において、細胞におけるC9orf72の発現を阻害する方法が提供され、該方法は、対象のCNSに、C9orf72遺伝子によりコードされるRNAを標的とする阻害性核酸を投与することを含み、ここで阻害性核酸は、マイクロRNAである。
いくつかの態様において、対象の中枢神経系(CNS)における、C9orf72の発現を阻害する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、対象のCNSに、C9orf72遺伝子によってコードされるpre−mRNAおよびmRNAの両方を標的とする阻害性核酸を投与することを含む。いくつかの態様において、対象は、FTDまたはALSを有するか、または有することが疑われる。いくつかの態様において、方法は、対象に対して、対象の細胞においてC9orf72遺伝子によってコードされるpre−mRNAおよびmRNAの両方を標的とする阻害性核酸を発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の有効量を投与することを含む。いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号1〜8のいずれかに示された配列を含む。
配列番号15:AGCATTAAAGGACTGACTGAA(SOD−miR−103);
配列番号16:GACTGAAGGCCTGCATGGATT(SOD−miR−117);または
配列番号17:CTGCATGGATTCCATGTTCAT(SOD−miR−127)、
に示された配列、またはこれらのいずれかの相補配列の、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、SOD1 mRNAは、GenBank:EF151142.1に記載されている。
いくつかの態様において、ALSを有するかまたは有する疑いのある対象を処置するための方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、対象に対して、SOD1遺伝子によりコードされるRNAを標的とするmiRNAを対象の細胞において発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の有効量を投与することを含む。
いくつかの側面において、本発明は、単離されたAAVを提供する。AAVに関して本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、その天然の環境から(例えば、宿主細胞、組織、または対象から)単離された、または人工的に生成されたAAVを指す。単離されたAAVは、組換え方法を用いて生成することができる。かかるAAVを、本明細書において「組換えAAV」と呼ぶ。組換えAAV(rAAV)は、rAAVの導入遺伝子が1または2以上の所定の組織に特異的に送達されるように、組織特異的な標的化能力を有することができる。AAVキャプシドは、これらの組織特異的標的化能力を決定する重要な要素である。したがって、標的化される組織に対する適切なキャプシドを有する、rAAVを選択することができる。いくつかの態様において、rAAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11およびそのバリアントのいずれかに対応するアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む。組換えAAVは、典型的には、本発明の組換え核酸を保有する。
宿主細胞中で培養されてrAAVベクターをAAVキャプシドにパッケージングする成分は、宿主細胞に対して、トランスで(in trans)供給されてもよい。代替的に、1または2以上の必要な成分(例えば、組換えAAVベクター、rep配列、cap配列および/またはヘルパー機能)は、1または2以上の必要な成分を当業者に既知の方法を使用して含むように操作された、安定な宿主細胞により提供されてもよい。最も適切には、かかる安定な宿主細胞は、必要な成分(単数または複数)を、誘導性プロモーターの制御下で含有するであろう。しかし、必要な成分(単数または複数)は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。適切な誘導性および構成的プロモーターの例は、本明細書中に提供される。さらに別の代替例では、選択された安定な宿主細胞は、選択された成分(単数または複数)を構成的プロモーターの制御化で、および他の選択された成分(単数または複数)を1または2以上の誘導性プロモーターの制御下で含んでもよい。例えば、安定な宿主細胞が生成されて、これは293の細胞に由来し(構成的プロモーターの制御下でE1ヘルパー機能を含有する)、しかしこれは、誘導性プロモーターの制御下でrepおよび/またはcapタンパク質を含有する。さらに他の安定な宿主細胞も、当業者によって生成され得る。
「宿主細胞」は、目的の物質を保有するか、または保有することが可能な、任意の細胞を指す。多くの場合、宿主細胞は哺乳動物細胞である。宿主細胞は、AAVヘルパー構築物、AAVミニ遺伝子プラスミド、補助機能ベクター、または組換えAAVの生産に関連する他のトランスファーDNAの、レシピエントとして使用することができる。この用語は、トランスフェクトされたオリジナル細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用する「宿主細胞」は、外因性DNA配列でトランスフェクトされた細胞を指すことができる。単一の親細胞の子孫は、天然、偶発的、または意図的変異のために、形態において、またはゲノムもしくは全DNA相補体において、必ずしもオリジナルの親と完全に同一でなくてもよいことが理解される。
本発明のrAAVを生産するために、組換えベクターを所望のAAVキャプシド内にパッケージングするための前述の方法は、限定することを意図しておらず、他の適切な方法も、当業者には明らかであろう。
本発明の組換え核酸は、組換えAAVベクターであってもよい。組換えAAVベクターは、キャプシドタンパク質にパッケージングされて、対象に投与され、および/または選択された標的細胞に送達されることができる。「組換えAAV(rAAV)ベクター」は、典型的には、最小の場合、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに5′および3′AAV逆方向末端反復(ITR)で構成される。導入遺伝子は、本明細書中の他の箇所で開示されるように、対象の内因性mRNAを標的とする核酸を含む1または2以上の阻害性核酸(例えば、miRNA)をコードする、1または2以上の領域を含んでよい。導入遺伝子はまた、タンパク質(例えば、蛍光タンパク質)をコードする外因性mRNAをコードする領域を含んでもよい。
組換えAAVベクターのための上記で同定された主要な要素に加えて、ベクターはまた、導入遺伝子のエレメントに作動可能に連結されている従来の制御エレメントを含み、ここで該連結は、本発明によって産生されたベクターでトランスフェクトされたかまたはウイルスで感染された細胞における、転写、翻訳および/または発現を可能にする様式である。本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子に隣接する発現制御配列、および、目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは距離をおいて作用する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列は、以下を含む:適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列;効率的なRNAプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化(ポリA)シグナル;細胞質mRNAを安定化する配列;翻訳効率を増強する配列(例えば、コザックコンセンサス配列);タンパク質安定性を増強する配列;および、必要な場合は、コードされた産物の分泌を高める配列。天然の、構成的、誘導性および/または組織特異的プロモーターを含む、多数の発現制御配列が、当技術分野で知られており、利用可能である。
宿主細胞での遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種、組織または細胞型の間で変化し得るが、一般的に、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する5′非転写および5′非翻訳配列、例えばTATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列、エンハンサーエレメント、などを含む。特に、かかる5′非転写調節配列は、作動可能に接合された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むであろう。調節配列はまた、所望により、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を含んでもよい。本発明のベクターは、任意に5′リーダーまたはシグナル配列を含んでもよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。
いくつかの態様において、1または2以上のmiRNAのための1または2以上の結合部位をrAAVベクターの導入遺伝子に組み込んで、導入遺伝子を保有する対象の1または2以上の組織、例えば、非肝臓組織、非肺組織において、導入遺伝子の発現を阻害する。当業者は、結合部位が、組織特異的な様式で導入遺伝子の発現を制御するために、選択されてもよいことを理解するであろう。mRNA中のmiRNA標的部位は、5′UTR、3′UTRまたはコード領域にあってもよい。典型的には、標的部位は、mRNAの3′UTRにある。さらに、導入遺伝子は、複数のmiRNAが、同一または複数の部位を認識することにより、mRNAを調節するように設計されてもよい。複数のmiRNA結合部位の存在は、複数のRISCの共同作用をもたらし、発現の高効率的な阻害を提供する。標的部位の配列は、合計で5〜100、10〜60、またはそれ以上のヌクレオチドを含んでよい。標的部位の配列は、標的遺伝子の結合部位の配列の少なくとも5個のヌクレオチドを含むことができる。
rAAVsを十分な量で投与して、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の副作用なしに遺伝子移入および発現の十分なレベルを提供する。従来のおよび薬学的に許容し得る投与経路としては、限定されないが、選択された組織(例えば、肝臓組織、肺組織)への直接送達、および皮下、膵臓内(intraopancreatically)、鼻腔内、非経口、静脈内、筋肉内、髄腔内、脳内、経口、腹腔内への投与、吸入により、または別の経路によるものが挙げられる。所望により、投与経路は組み合わせてもよい。
特定のrAAVの対象への送達は、例えば、対象の血流への投与によってもよい。血流への投与は、静脈、動脈、または任意の他の血管の導管への注入によるものであってよい。さらに、特定の場合では、rAAVを、脳組織、髄膜、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、オリゴデンドロサイト、脳脊髄液(CSF)、間質腔などに送達することが望ましい場合がある。いくつかの態様において、組換えAAVは、直接的に脊髄または脳(例えば、前頭前野)へと、心室領域への注入により送達してもよく、さらに、線条体(例えば、尾状核または線条体の被殻)、および神経筋接合部、または小脳小葉に、針、カテーテルまたは関連するデバイスで、当技術分野で知られている定位注射などの神経外科技術を用いて送達してもよい(例えば、Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999;Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000;Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993;およびAlisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000を参照)。
rAAVベースの治療用構築物の望ましい投与はまた、ex vivo投与も含むことができることを、当業者は理解することができる。いくつかの態様において、ex vivo投与は以下を含む:(1)対象からの目的の細胞または組織(単数または複数)の単離、(2)細胞または組織(単数または複数)を十分な量のrAAVに接触させて、過度の有害な影響なしに、遺伝子移入および発現の十分なレベルを提供すること、および(3)細胞または組織を、対象に移入して返すこと。いくつかの態様において、細胞または組織は、トランスフェクションの前および/または後に数日間、ex vivoで培養してもよい。
いくつかの態様において、単離された細胞は、幹細胞、多能性幹細胞、神経前駆細胞、脂肪吸引物由来幹細胞、肝臓の細胞(例えば、肝細胞)、造血幹細胞、間葉系幹細胞、間質細胞、造血細胞、血液細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、または他の適切な細胞を含む。いくつかの態様において、トランスフェクトされる細胞は、対象から単離された細胞から調製された、誘導多能性幹細胞である。
rAAVは、対象に対して、当技術分野で知られている任意の適切な方法に従って組成物中で送達されてよい。生理学的に適合性の担体中(例えば、組成物中)に懸濁することができるrAAVを、対象、例えば、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、七面鳥、または非ヒト霊長類(例えば、マーモセット、マカク)に投与してもよい。本発明の組成物は、rAAVを単独で、または1もしくは2以上の他のウイルス(例えば、1または2以上の異なる導入遺伝子をコードする、有する、第2のrAAV)と組合せて、含むことができる。
適切な担体は、rAAVが指向される適応症の観点から、当業者によって容易に選択することができる。例えば、1つの適切な担体は、種々の緩衝液を用いて配合することができる、生理食塩水を含む(例えば、リン酸緩衝食塩水)。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、ゴマ油、および水が挙げられる。さらにその他のものも、当業者には明らかであろう。
任意に、本発明の組成物は、rAAVおよび担体(単数または複数)に加えて、保存剤または化学的安定剤などの他の従来の医薬成分を含有してもよい。好適な例示的保存剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学的安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。
薬学的に許容し得る賦形剤および担体溶液の配合は、当業者に知られており、種々の処置計画において本明細書に記載の特定の組成物を使用するための、適切な投薬および処置計画の開発も同様である。典型的にこれらの製剤は、少なくとも約0.1%またはそれ以上の活性成分を含んでよく、ただし、活性成分(単数または複数)のパーセンテージは当然ながら変化させることができ、好都合には、全製剤の重量または体積の、約1または2%と、約70%または約80%またはそれ以上の間であってもよい。当然ながら、治療上有用な各組成物中の活性成分の量は、化合物の任意の所与の単位用量で、適切な投与量が得られるような方法で、調製され得る。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命、並びに他の薬理学的検討事項などの要因は、かかる医薬製剤を調製する当業者により考慮され、したがって、多様な投与量および処置計画が望ましい。
滅菌の注射用溶液の調製は、必要量の活性rAAVを、本明細書に列挙した種々の他の成分と共に適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することにより、行われる。一般に分散液は、様々な滅菌活性成分を、基本的な分散媒および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む、滅菌ビヒクルに組み入れることによって、調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これによって、活性成分に加えて、予め濾過滅菌した溶液からの任意のさらなる所望の成分の、粉末が生成される。
本明細書で使用する場合、「担体」は、任意およびすべての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド、などを含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当技術分野で知られている。補助的な活性成分も、組成物に組み込むことができる。語句「薬学的に許容し得る」は、宿主に投与した場合に、アレルギー反応または同様の有害反応を生じない、分子実体および組成物を指す。
かかる製剤は、本明細書に開示された核酸またはrAAV構築物の薬学的に許容し得る製剤の導入のために、好ましい場合がある。リポソームの形成および使用は、一般に当業者に知られている。最近では、改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された(米国特許第5,741,516号)。さらに、リポソームおよびリポソーム様製剤の、潜在的な薬物担体としての様々な方法が記載されている(米国特許第5,567,434号;第5,552,157号;第5,565,213号;第5,738,868号;および第5,795,587号)。
リポソームは、水性媒体中に分散されたリン脂質から形成され、自発的に多重膜同心二重層小胞(多層小胞(MLV)とも呼ばれる)を形成する。MLVは、一般に、25nm〜4μmの直径を有する。MLVの超音波処理は、200〜500オングストロームの範囲の直径を有し、コア中に水溶液を含有する小単層小胞(SUV)の形成をもたらす。
上述の送達方法に加えて、以下の技術も、rAAV組成物を宿主へ送達する代替方法として意図される。ソノフォレシス(例えば、超音波)が使用され、米国特許第5,656,016号において、循環系へと、また循環系を介した、薬物透過の率と有効性を高めるためのデバイスとして記載されている。意図される他の薬物送達の選択肢としては、骨内注入(米国特許第5,779,708号)、マイクロチップデバイス(米国特許第5,797,898号)、眼科用製剤(Bourlais et al., 1998)、経皮マトリックス(米国特許第5,770,219号および第5,783,208号)およびフィードバック制御送達(米国特許第No. 5,697,899号)である。
本明細書に記載の組換え核酸、組成物、rAAVベクター、rAAVなどは、いくつかの態様において、医薬または診断または研究キットに組み込まれて、治療、診断または研究用途におけるそれらの使用を促進することができる。キットは、本発明の構成要素および使用説明書を収容する、1または2以上の容器を含んでよい。具体的には、かかるキットは、本明細書に記載の1または2以上の薬剤を、これらの薬剤の意図する用途および適切な使用を記載する使用説明書と共に、含んでもよい。特定の態様において、キット中の薬剤は、特定の用途および薬剤の投与方法に適した、医薬製剤および投与量であってよい。研究目的のためのキットは、成分を、種々の実験を実行するための適切な濃度または量で含んでいてもよい。
本発明の例示的な態様を、以下の実施例にさらに詳細に説明する。これらの態様は本発明の例示であり、当業者は、本発明が例示的な態様に限定されないことを理解するであろう。
C9orf72を標的とするmiRNAを送達する組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、開発された。
細胞株および正常なヒト脳におけるC9orf72発現の評価:
WTまたは変異型C9orf72のいずれかを発現する、2種類の細胞株を使用した。83のリンパ芽球様細胞株のセットを、C9orf72のG4C2伸長が陽性である78の家族性ALS(FALS)家系の患者から得た。また、以下を有する、継続的HEKおよびSH−SY5Y細胞株を生成した:
・エクソン1aの上流の、2.0kbのC9orf72プロモーター、
・G4C2反復を含む介在イントロンを有する、エクソン1aおよび1b、および
・2.1kbの続くイントロンおよびエクソン2、この開始コドンがルシフェラーゼを駆動する。
4つの下位株が、50、90、160および200の反復のG4C2伸長を有するこれらの細胞株から生産された。線維芽細胞培養物は、C9orf72G4C2伸長の症例からも得た。
図2に示すように、TaqManプライマーは、HEK293およびSH−SY5Y細胞およびヒトの脳からの、3つの主要なpre−mRNA転写物を検出する。V1とV3についての転写レベルは、Vallよりもかなり小さく、示されるように、脳およびこれらの細胞における主要な転写物が、V2であることを示す。
C9orf72遺伝子を標的とするマイクロRNAの、そのRNA転写物をサイレンシングする能力を評価した。C9orf72のエクソン3におけるORFの塩基220〜241を標的とする、C9−miR220と称される人工マイクロRNAを開発した。このmiRNAはエクソン3に結合するため、mRNAバリアントの全てを標的とすることが予想される。図3は、ヒトC9orf72のin vitroでのmiRNA媒介性ノックダウンを示す。これらは、HEK293T細胞における、mir220(CBAプロモータ−GFP)の一過性トランスフェクションの、3つの生物学的複製からの結果である。対照は、SOD1に対するmiRである。
miRNAを、U6またはニワトリβアクチン(CBA)プロモーターのいずれかを使用して、2つの異なるプラスミドにクローニングした。これらのプラスミドを次に、Hek−293細胞にトランスフェクトした。72時間後、定量的RT−PCRを使用し、pre−mRNA転写物を検出するカスタムTaqManプローブまたはスプライスされたmRNAバリアントを検出するプライマーを用いて、転写物をアッセイした。図3および図4に示すように、U6またはCBAプロモーターによって駆動されると、C9−miR220マイクロRNAの両方の形態は、スプライスされたmRNAのレベルを約50%低下させた。pre−mRNA転写物のレベルは、CBA−C9miR220マイクロRNAにより〜65%に低下し(例えば、〜35%の減少)、一方U6−C9miR220は、pre−mRNAのレベルを〜25%に低下させた(例えば、〜75%の減少)(図4参照)。これらの結果は、人工マイクロRNAを用いた、C9orf72遺伝子のpre−mRNAおよびmRNA両方のサイレンシングを実証する。
C9orf72媒介性ALSのマウスモデルを生成するために、細菌人工染色体(BAC)を、〜580の反復および45の反復のG4C2伸長を有するALSの患者の細胞から単離した。〜580の反復を有するBACは、C9orf72のエクソン1〜6(Hg18 chr0:27,561,112-27,714,301)にまたがり、一方45の反復を有するBACは、完全なコード配列にまたがる。これらのBACからの環状DNAを使用して、トランスジェニックマウスを作製した。49の仔を580反復のBACから得て、このうち3匹は、PCRアッセイによりG4C2伸長について陽性であった。これら3匹のうち1匹は、生殖系列伝達を示し、良好に繁殖する子孫を生産した。導入遺伝子の持続的な伝達を有するこれらのマウスのコロニーを確立した。始祖は〜14月齢までで、明白な運動ニューロン表現型はなかった。しかし、4および6月齢のC9 BACトランスジェニックマウスの脳は、顕著な特徴を示した。第1に、図5(レーンE)に示すように、BAC C9トランスジェニックマウスから単離されたゲノムDNAのサザンブロットは、ほぼ4.5〜6.0kbを走行する、密集した異種のバンドを明らかにする;これは、G4C2伸長を有する個体からの、リンパ芽球(A)および脳(B)のDNAを用いた結果とよく一致する。かかるバンドは、伸長なしの固体(レーンc)または非トランスジェニックマウス(D)の脳由来のDNAでは明らかでない。第2の観察において、4および6月齢両方の580反復のBAC C9トランスジェニックマウスからの海馬の切片の、G4C2−CyAプローブによる(センス鎖RNAを検出するため)プロービングは、残りの脳および脊髄全体にも存在する核内RNA凝集体の豊富さを明らかにした。(図5、右側のパネルを参照)。これらは、「盲検」観察者によって検出された。海馬の対照/WTマウスは、これらの凝集体を示さなかった。これらの結果は、以下を示す:(1)G4C2伸長を有するBAC C9orf72導入遺伝子の、安定した伝達;および(2)マウスが、ヒトC9orf72媒介性ALSで見つかったセンス鎖RNAの核内沈着(deposit)を再現すること。これらの凝集体は、RNAseでの処理後には検出されないことが決定されている。これらのBACトランスジェニックC9マウスは、核RNA凝集体を有するため、C9orf72からの転写物発現のサイレンシングの評価は、運動ニューロン疾患が不在であっても、凝集体の存在についてアッセイすることによって可能である。
miRNAのAAVプラットフォームは、miR−155をベースにする。標的化配列とステムループを、Drosha/DGCR8複合体による効率的な認識および処理のために、miR−155隣接領域のコンテキスト内にクローニングする(図7)。miRNAデザインは、5′末端にアデニンまたはウラシルのいずれかを有する、成熟した21マーのmiRNAのガイド配列を生成する。5′末端でのUまたはAの選択は、Ago2の中間領域が成熟miRNAの5′末端と相互作用し、これら2つの塩基に対して、シトシンおよびグアニンより20倍高い親和性を有するという事実により、駆動される。この設計はまた、RISC複合体へのガイド鎖の熱力学的取り込みを促進する。miRNAは、低い第二級および第三級複雑性標的mRNAの領域を標的とするように、設計される。これはRNAフォールディングアルゴリズムを用いて行われ、標的部位におけるmiRNA:mRNA同族結合の可能性を高めることを目標とする。図7Bに示すように、miRNAは次いで、ポリメラーゼIIまたはポリメラーゼIIIプロモーターのいずれかからの、GFPと関心のmiRNAを発現するITRを有する、プロウイルスプラスミドにクローニングする。選択的にバリアント1および3のいずれかを、またはすべてのバリアントを標的とする、8つのmiRNAを、これらのプラスミドにクローニングした(表1参照)。
さらに、すべてのバリアントを標的とするmiRNAが使用された。miR−C9−220は、mRNAおよびpre−mRNA種両方のin vitroでのノックダウンについて効果的である。特定の場合において、in vitroで40〜50%ノックダウン効率のmiRNAは、ウイルスベクターを用いて達成された形質導入およびゲノムコピーの効率の増加により、翻訳してin vivoで80%を超えるノックダウンを達成する。このmiRNAは、pre−mRNAのノックダウンによって決定されるように、核において機能する。核標的化は、miRNAの3′末端の最後の3塩基を、同族mRNAから脱標的化されるように修飾することによって、改善することができる。miRNAがそのメッセージに100%相補的でなく、3′末端で脱標的化される場合、該miRNAは著しくより安定な複合体をAgo2と形成する。これは、miRNAのAgo2複合体中の滞留時間を増加させ、それによって核移行の可能性を増加させる。表1で示したように、我々は、3′ミスマッチを有するmiRNA(miR−C9−220−3′mm)をクローニングし、これは、この活性を評価するために有用である。
HEK−293T細胞およびSHSY−5Y細胞を、Jet Prime試薬を用いて、製造業者のプロトコルに従って一過性にトランスフェクトした。患者の線維芽細胞のトランスフェクションには、Nucleofactorエレクトロポレーター(Lonza AG)の初代線維芽細胞のためのプロトコルを使用する。細胞をトランスフェクションの48時間後に収集し、RNAの単離を、Trizol試薬を用いて行う。次いで、RNAをDNAseで処理し(Turbo DNA-free kit, Applied Biosystems)、逆転写する(High Capacity RNA-to-cDNA kit, Applied Biosystems)。pre−mRNAの検出ために、転写レベルを、RT−qPCRで定量化する(下の表2,3に記載のFast SYBR Greenマスターミックスおよびプライマーセット、Applied biosystems)。mRNA検出のために、転写物をRT−qPCRで定量化する(下の表に記載のTaqManマスターミックスおよびTaqManアッセイ、Applied Biosystems)。発現データは2ΔΔCtによって分析する。
2つのプライマーセットを、pre−mRNAの検出のために設計した。第1のプライマーセット(Vall)はすべてのバリアントを検出するが、これは、プライマーがエクソン2と隣接するイントロンの間に位置しているためである。pre−mRNAプライマーの第2のセット(V1、V3)は、バリアント1および3を検出する;プライマーは、エクソン1と隣接イントロンとの間に位置する(図1参照)。プライマー配列を以下の表に示す。
スプライスされたmRNAの検出のため、プライマー−プローブセットを使用した。各セットは、DNase消化を行うことなくゲノムDNAから区別するために、エクソンの接合部にまたがる。V1はバリアント1のみを検出する;プライマーおよびプローブセットは、エクソン1aおよび3にまたがる。V2は、エクソン2および3の接合部にまたがる。バリアント3を検出するエクソン3は、エクソン1bとエクソン3の接合部にまたがる。最後に、Vallは、すべてのバリアントを検出する;このプライマープローブセットは、エクソン3と4(図1参照)の間のスプライス接合部にまたがる(図1参照)。TaqManプライマー−プローブ配列は、Life Technologiesを介し、以下の表のように発注した。
組織および患者の線維芽細胞におけるG4C2の検出は、4%PFAを用いて氷上で10〜20分間固定し、PBSで3回洗浄し、70%エタノール中4℃で一晩インキュベートすることにより実施される。40%ホルムアミド+2×SSCを、室温で20分間添加する。ハイブリダイゼーション緩衝液(250μl)は、ヘキサヌクレオチド伸長(G4C2)に特異的なCy3プローブを用いて調製し、37℃で2時間インキュベートし、次いで、40%ホルムアミド+1×SSCで、37℃で30分間洗浄し;続いて1×SSCで2回、RTで15分間洗浄する。次にスライドをマウントし、DAPI含有マウント培地と共にカバーする(図5、右パネル参照)。
RNAは細胞からTrizolを用いて抽出し、逆転写した(High Capacity RNA-to-cDNA kit, Applied Biosystems)。標準的なプロトコルに従い、C9orf72転写物レベルを、RT−qPCRにより、表2および3のFast TaqmanマスターミックスおよびTaqman(Applied Biosystems)を使用して定量した。相対定量を、2−ΔΔCt法を用いて決定した。
G4C2核内凝集体の定量化:
患者の線維芽細胞におけるRNA凝集体の出現頻度を、ランダムな顕微鏡撮影フィールドを60倍で分析することにより、評価する。RNA凝集体の自動計数を、ImageJソフトウェアでFishJアルゴリズムマクロを使用して実施する。
種々のプラスミドを用いたトランスフェクション後の、mRNAおよびpre−mRNAの両方についてのC9orf72転写物の相対的発現を、2−ΔΔCt式を用いて分析する。対照(GFP−スクランブル−miR)を実験(GFP−C9−miR)と比較する、少なくとも3つの生物学的複製についての値を、統計的有意性のための2つの試料のt検定を用いて分析した。患者の線維芽細胞を含む実験における二次エンドポイントは、G4C2核内凝集体の平均の存在であった。凝集体データを、対照と実験のトランスフェクションを比較する少なくとも3つの生物学的複製についてのFishJデジタル画像解析から得て、これを再度、2つの試料のスチューデントt検定を用いて比較した。
抗C9miRを発現する髄腔内送達されたrAAV.Rh10は、野生型マウスおよびBAC由来C9orf72mutantトランスジェニックマウスの両方においてC9orf72 RNA転写物の中枢神経系レベルを減少させる。rAAV.Rh10−C9miRの、C9orf72および関連するG4C2転写物のレベルを抑制する有効性を、トランスジェニックマウスにおいて評価する。
プライマーV1、V2、V3、およびVallを用いて、C9orf72転写物を評価する。図8に示すように、V1、V2、およびV3プライマーを使用するアッセイは、トランスジェニックマウスの転写物を検出し、一方Vallプライマーは、マウスおよびヒトのC9orf72の両方を検出する。
rAAV.Rh10−C9miRの、C9orf72のpre−mRNAおよびスプライスされたmRNA転写物のレベルを低下させることに対する有効性を、野生型および当社のC9orf72mutantトランスジェニックマウスの両方を使用して評価する。rAAV.Rh10−C9miRが、トランスジェニックマウスにおけるRNAi凝集体の数を減少させる程度を、評価する。rAAV.Rh10−C9miRが、c9−RANタンパク質[ポリ(G)、ポリ(GA)、ポリ(GR)]のレベルを低下させる程度もまた、評価する。
C9orf72mutantトランスジェニックマウスのrAAV.Rh10−C9miRを用いて、C9−miRが以下における低減を達成する程度を評価する:(1)pre−mRNAおよびmRNAレベル;(2)RNA凝集体の数、および(3)c9−RANタンパク質[ポリ(G)、ポリ(GA)、ポリ(GR)]の産生。G4C2核内凝集体の蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を、図5に示すように、処置ありおよびなしのマウスの脳および脊髄組織で実施する。
表4および5に概要を示すように、rAAVsを、新生仔および成体マウスの両方に注射する;前者には、静脈内送達を使用する;後者では、送達は髄腔内である。新生仔注射は、小容量のベクターで広範囲のCNS伝達を可能にする。髄腔内投与は、CNSへの形質導入に必要なウイルスの量を減少させ、rAAVへの全身曝露を最小限にする。
新生仔の注射のために、低体温を使用して、静脈内投与の前に動物を麻酔する。動物を、湿った氷のベッドの上に1〜3分間置き、次にP1について顔面静脈、およびp28について尾静脈に注射し、その同腹仔と共にベッドに戻した。新生仔注射手順は、約5分を要する。
成体マウスを、導入チャンバーにおいてイソフルラン2.5%で麻酔する。眠った後、動物をノーズコーンに移して、連続的にイソフルランを投与する。マウスに、C9orf72に対するmiRをコードするベクターまたはスクランブル対照miRを、用量:5×1010ベクターゲノム/動物にて、5μlの容量で投与する。この用量は、2×1012vg/kg(25grのマウスを考慮)に相当する。髄腔内(IT)投与は、50μlのガラスLuer-hub Hamiltonシリンジに接続された30ゲージ、0.5インチの滅菌使い捨て針を使用して実施する。注射部位は、L5とL6の間である。術後の痛みは、IT注射時および、24〜48時間後に動物が不快感であるように見える場合、ケトプロフェン(5mg/kg、皮下)で管理する。
ポリ(GP)抗体に対して免疫陽性である細胞質封入体は、図9に示すように、C9orf72mutantトランスジェニックマウスの前頭皮質に存在する。C9orf72mutantトランスジェニックマウスが、他のRAN翻訳ペプチドを発現するかどうかを決定するため、およびRAN翻訳増加の程度が年齢と共に増加するかどうかを評価するために、ポリ(GA)、ポリ(GR)およびポリ(GP)ペプチドの発現を、複数の時点で、ウサギポリクローナル抗体を使用して検査する。これらの抗体は、その免疫原を特異的に検出し、かつC9orf72反復伸長のセンスまたはアンチセンス転写物からRAN翻訳された他のペプチドと交差反応性を示さないものであり(図10A)、c9FTD/ALS患者のCNS全体で、ニューロン封入体を検出する(図10B)。
2、4、8、および12月齢の時点で、脳および脊髄を、野生型およびトランスジェニックマウスから回収する。それぞれの脳を、矢状正中線を横切って二等分する:片半分は10%ホルマリンで固定し、一方他の半分は、6領域(皮質、皮質下、海馬、中脳、脳幹および小脳)に切断して、凍結する。各脊髄は、4つの横断切片に切断する;切片1および3は固定し、切片2および4は凍結する。
RAN翻訳ペプチドの発現レベルおよび、年齢依存的なペプチドの溶解度の変化を評価するために、凍結した脳および脊髄組織を連続抽出に供して、可溶性および不溶性タンパク質の画分を収集する。これらの画分を、ウエスタンブロットおよび定量的電気化学発光免疫測定法により、ポリ(GA)、ポリ(GR)またはポリ(GP)抗体を用いて試験する。
C9orf72転写物の、rAAV.Rh10−C9mirによるサイレンシングが、ポリ(GP)ペプチドおよびC9orf72mutantトランスジェニックマウスで発現される他のRAN翻訳産物の発現を減少させる程度を評価するために、マウスの脳および脊髄を、形質導入後の様々な時点で採取する。RAN翻訳されたペプチドのIHC、ウエスタンブロットおよび免疫測定分析を、多数の封入体に対し、ならびに可溶性および/または不溶性のRAN翻訳ペプチドのレベルに対して実施する。
RAN翻訳タンパク質凝集体の定量化:
RAN翻訳タンパク質のIHC染色スライドの解析を、Aperio陽性の画素数計測画像解析プログラムを用いて実行する。スライド全体をAperioソフトウェアを使用してスキャンし、デジタル化する。解析は脳全体および脊髄切片について実施するが、ただし沈着した(precipitated)色素原などの染色のアーティファクトが指摘されない場合にのみ行う。これらの領域は、領域の輪郭を描くためのペンツールを使用して、解析から除外される。解析手順は、スペクトルソフトウェアを使用するバッチ処理のために提出されたすべての画像に対して実施する。このプロセスは、すべてのIHC染色スライドを、1つの標準陽性画素数計測アルゴリズムに供する。茶色の色素原の定量化のために使用されるデフォルトの設定は、3つの強度範囲(220〜175、175〜100、および100〜0)にある。染色されたが、陽性の色指定に分類されない画素は、陰性染色の画素と考えられる。これらの画素も同様に計測され、陽性画素の、陽性画素と陰性画素の総数に対する割合を決定する。陽性(%)データは、陽性画素数(培地および強陽性)/陽性画素と陰性画素の総数、として報告される。
RNA凝集体の頻度を、小脳と脊髄の灰白質にわたる横断サンプリングによって評価する。顕微鏡視野を盲検オペレータによりランダムに選択し、油浸60倍のレンズで撮影する。次いで画像中のRNA凝集体の自動計数を、ImageJソフトウェアのFishJアルゴリズムマクロを使用して実施する。
種々の構築物によるAAV送達後の、C9orf72 mRNAおよびpre−mRNA転写物の遺伝子発現の相対的変化の定量化を、2−ΔΔCt式を用いて分析する。統計的有意差決定のために、対照群(GFP−スクランブル−miR)または(PBS対照)の平均値を、実験群(AAVRh−C9−miR)からの平均と、統計的有意差のため2標本t検定を用いて比較する。トランスジェニックマウスの組織切片からのRNA核内凝集体およびRAN翻訳タンパク質についてのデジタル画像解析を、それぞれFishJおよびAperioソフトウェアによって定量化する。値は各動物について得られ、統計分析用の群に応じて平均化する(スチューデントt検定)。各群からの小脳および脊髄についてのデータを、個別に分析する。
髄腔内送達後の非ヒト霊長類(NHP)の中枢神経系における、rAAV.Rh10−C9miRの評価およびC9orf72転写物のサイレンシングの程度の評価。
髄腔内投与されたrAAV.Rh10−C9miRが、非ヒト霊長類(NHP)の脊髄、大脳および小脳全体に広がる程度を評価する。3種のrAAV.Rh10ベクターを、抗C9 miRNAをコードする発現構築物の送達用に調製する。ベクターは、髄腔内注射を介して送達される。AAVRh10の広がりおよび向性(tropism)ならびに、2つの異なるプロモーターからのC9−miRの、サイレンシング有効性を、3週間にわたって評価する。コホートの1つには、GFPを駆動するポリメラーゼIIプロモーター(ハイブリッドニワトリβアクチンプロモーター)からのmiRNAを発現するベクターを注入する。別のコホートには、GFP発現を駆動するハイブリッドニワトリβアクチンプロモーターの上流に配置されたU6ポリメラーゼIIIプロモーターからmiRNAが発現される、バイシストロニックベクターを投与する(図7B)。第3のコホートは、GFPのみを受領する対照である(下記の表7を参照)。RT−qPCRを、マイクロダイセクションによりレーザーキャプチャーされた運動ニューロンから得られたRNAに対して実施する。使用されるベクターの用量は、強固な皮質および脊髄伝達を示す、NHP研究におけるIT rAAV送達に基づく。
12mmの腰部脊髄凍結切片を、PEN膜スライド(Zeiss, Munich, Germany)上に収集し、メタノール中の1%クレシルバイオレット(Sigma, St. Louis, MO)で染色する。切片を空気乾燥し、−80℃で保存する。解凍後、運動ニューロンを、染色から30分以内に、レーザーキャプチャーマイクロダイセクターPALM Robo3(Zeiss)を使用し、次の設定を用いて収集した:カットエネルギー:48、LPCエネルギー:20、カットフォーカス:80/81、LPCフォーカス:1、ポジション速度:100、カット速度:50。約500のMNを、動物ごとに収集する。前角(腹角)の非神経細胞を、運動ニューロンを採取した後に同じ切片から収集する。RNAは、その後、RNaqueous Micro Kit(Ambion, Grand Island, NY)を使用し、製造者の指示に従って単離する。
IT送達後のrAAV.Rh10に対する免疫応答を特徴づけるために、プールされたrAAV.Rh10キャプシドペプチドに対するリンパ球増殖を、ELISPOTアッセイを用いて評価する。種々の時点で採取した血液を、標準のFicoll-Paque(商標)Plusプロトコルを使用して処理し、末梢血単核細胞を得る。PBMCをウェルあたり2×105細胞の濃度で、IFN−γ捕捉抗体でコーティングしたプレートに添加する。rAAV.Rh10による抗原特異的刺激を18〜24時間実施し、その後細胞を完全に洗浄する。この後、検出抗体と、続いて比色読み取りに適した基質で開発されたアビジンHRPを添加する。
AAV中和抗体アッセイ:
AAV中和抗体の存在を、適切な技術を使用しベクターコア研究室において評価する。
rAAVベクターのトランスジェニックマウスへの送達
SOD1に対するmiRNA(図11A〜Cを参照)をin vivoまたはin vitroで細胞に送達する、組換えアデノ随伴ウイルスベクターを開発した。rAAVベクターの、SOD1の突然変異型を発現するトランスジェニックマウスへの送達は、形質導入された組織中の標的mRNAの80〜90%のノックダウンをもたらした(図12)。例えば、抗SOD1(miR)が、マウス肝臓におけるSOD1の発現をサイレンシングすることが、図13に示すように決定された。
これらの実験のために、rAAVベクターを、3種類の構築物と共に用いる:(a)ニワトリβアクチン(CB)駆動GFPと、続いてタンデム抗SOD1 miR(mir127);(b)U6プロモーター駆動miR−SOD1と、続いてCB−GFP;および、対照としてCB−GFPのみ。図13(上パネル)は、これらの構築物の概略図を示す。
図20は、G93A SOD1マウスのCB−miR−SOD1による処置が、対照動物と比較して、生存率を顕著に増加させることを示す。G93A SOD1マウスに、CB−GFPまたはCB−miR−SOD1−GFPの2×1012ゲノムコピー(gc)を、56〜68の日齢で注射し、進行した麻痺のために安楽死が必要となるまで、盲検的にモニタリングした。生存期間の中央値は、対照動物について108日であり(CB−GFP、n=19)、CB−miR−SOD1−GFPについて130日であった(n=28)。ログランク検定結果は0.018のp値をもたらし、生存率の増加が統計的に有意であることを示唆する。これらのデータはさらに、静脈内注射によるmiR−SOD1の全身送達が、G93A SOD1マウスの生存率の有意な増加をもたらすことを示す。
SOD1 miRNAを発現する組換えAAV(rAAV)の脳および脊髄への髄腔内送達。
マイクロRNAのアデノ随伴ウイルス(AAV)媒介性送達を用いて、脊髄を含む哺乳動物の組織において、SOD1をサイレンシングした。
図6に示すように、成体マーモセットへのrAAV.Rh10.EGFPの髄腔内投与は、運動ニューロン(そのサイズと位置によって識別される)の顕著な標識付けと共に、(A)腰仙部および(B)子宮頸前方の角の両方の、灰白質の著しい取り込みをもたらした。レーザーキャプチャー腰仙運動ニューロンは、このマーモセット(rAAV.Rh10.EGFPで処置)から、および、miRをサイレンシングするSOD1を発現する、rAAV.Rh10.U6−miR−SOD1で処置した別のマーモセットから得た。図6(下)に示すように、対照動物は、SOD1転写物の高いレベルおよび最小の(実質的に0ベースライン)miR−SOD1を示した。これとは対照的に、処置された動物において、転写物はほとんど検出されず、一方で高レベルのmiR−SOD1マイクロRNAが存在した。
図16に示すように、レーザーキャプチャーの後、対照CB−GFPで形質導入したMNは、qPCRでの測定により高レベルのSOD1を示し、miR−SOD1は示さなかった。U6−miR−SOD1およびCB−miR−SOD1で形質導入したMNは、SOD1発現のサイレンシングを示した。U6構築物は、より多くのmiRを産生した;その動物において、SOD1発現はより少なかった。図17A〜Bは、結果を脊髄の3つの領域に拡張したものである(腰髄、胸部(thora)、およびレーザーキャプチャーMNと、MN切除後のコード(cord)の残りの組織(非MN)の両方で、サイレンシング検査する)。組織の両方のセットにおいて、SOD1サイレンシングの証拠が存在する。図18は、組織ホモジネートでqPCRを用いて評価された、脳幹におけるサイレンシングを示す。
本発明の少なくとも1つの態様のいくつかの側面をこのように説明したが、当業者には容易に、様々な変更、修飾、および改良が想起されるであろうことを理解されたい。かかる変更、修飾、および改良は、本開示の一部であることが意図され、また本発明の精神および範囲内にあることが意図される。したがって、前述の説明および図面は単なる例示であり、本発明は、以下の特許請求の範囲により詳細に記載される。
請求項において、請求項の要素を修飾するための「第1」、「第2」、「第3」等の序数用語の使用は、それ自体いかなる優先度、序列、または1つの請求項要素の別のものに対する順位、または方法の行為が実施される順序を意味せず、1つの名称を有する請求項要素を、同一名称を有する別の要素(ただし序数用語のみ異なる)から区別するための、単なる標識として使用される。
本明細書に引用される全ての参考文献、刊行物、抄録、およびデータベースエントリの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (50)
- 細胞におけるC9orf72の発現を阻害する方法であって、
該細胞に対し、C9orf72遺伝子によってコードされるpre−mRNAおよびmRNAの両方を標的とする阻害性核酸を送達すること、
を含む、前記方法。 - 細胞が、最大50、最大90、最大160、または最大200の反復のG4C2伸長を有するC9orf721を発現する、請求項1に記載の方法。
- 細胞におけるC9orf72のアイソフォームBをコードするmRNAのレベルが、細胞におけるC9orf72タンパク質のアイソフォームAをコードするmRNAのレベルよりも高い、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、中枢神経系の細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がニューロンである、請求項4に記載の方法。
- 阻害性核酸に曝露される前に、細胞が、核内G4C2凝集体を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 阻害性核酸の細胞への送達が、核内G4C2凝集体の減少をもたらす、請求項6に記載の方法。
- 阻害性核酸に曝露される前に、細胞が、C9 RANタンパク質を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 阻害性核酸の細胞への送達が、C9 RANタンパク質レベルの低下をもたらす、請求項8に記載の方法。
- 細胞がin vivoである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がin vitroである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、FTDまたはALSの1または2以上の症状を有する対象のものである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、FTDまたはALSを有する疑いのある対象のものである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 対象の中枢神経系(CNS)におけるC9orf72発現を阻害する方法であって、
対象のCNSに対して、C9orf72遺伝子によってコードされるRNAを標的とする阻害性核酸を投与することを含み、ここで該阻害性核酸がマイクロRNAである、前記方法。 - 対象の中枢神経系(CNS)におけるC9orf72発現を阻害する方法であって、
対象のCNSに対して、C9orf72遺伝子によってコードされるpre−mRNAおよびmRNAの両方を標的とする阻害性核酸を投与すること、
を含む、前記方法。 - 阻害性核酸がマイクロRNAである、請求項15に記載の方法。
- 阻害性核酸を対象に投与するステップが、対象に対して、対象の細胞において阻害性核酸を発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を投与することを含む、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
- FTDまたはALSを有するか、または有することが疑われる対象を処置する方法であって、
対象の細胞においてC9orf72遺伝子によりコードされるpre−mRNAおよびmRNAの両方を標的とする阻害性核酸を発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の有効量を投与すること、
を含む、前記方法。 - rAAVが、CNS組織を標的とする、請求項17または18に記載の方法。
- rAAVが、AAV.Rh10またはAAV9キャプシドタンパク質を含む、請求項17、18または19に記載の方法。
- 阻害性核酸が、C9orf72のエクソン3内の少なくとも5個の連続したヌクレオチドに相補的な相補性領域を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも5個の連続したヌクレオチドが、C9orf72のヌクレオチド220〜241内にある、請求項21に記載の方法。
- 阻害性核酸が、C9orf72タンパク質のアイソフォームAをコードするmRNAおよびアイソフォームBをコードするmRNAを標的とする、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 阻害性核酸が、C9orf72バリアントV1(配列番号18)、V2(配列番号19)、およびV3(配列番号20)を標的とする、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 阻害性核酸が、C9orf72バリアントV1(配列番号18)およびV3(配列番号20)を標的とするが、V2(配列番号19)を標的としない、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 阻害性核酸が、C9orf72バリアントV1(配列番号18)を標的とするが、V2(配列番号19)およびV3(配列番号20)は標的としない、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 阻害性核酸が、細胞におけるC9orf72のmRNAのレベルを少なくとも50%低下させる、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 阻害性核酸が、細胞におけるC9orf72のpre−mRNAのレベルを少なくとも50%低下させる、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 阻害性核酸が、配列番号1〜8のいずれかに示された配列の、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個の連続したヌクレオチドを含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- rAAVが、髄腔内、脳内、脳室内または静脈内に投与される、請求項13〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞におけるSOD1の発現を阻害する方法であって、
細胞に対して、SOD1 mRNAを標的とするmiRNAを送達することを含み、ここで該miRNAが、
配列番号15:AGCATTAAAGGACTGACTGAA(SOD−miR−103);
配列番号16:GACTGAAGGCCTGCATGGATT(SOD−miR−117);または
配列番号17:CTGCATGGATTCCATGTTCAT(SOD−miR−127)、
に示された配列の、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個の連続したヌクレオチドを含む、
前記方法。 - ALSを有するか、または有することが疑われる対象を処置する方法であって、
対象に対して、対象の細胞においてSOD1遺伝子によりコードされるRNAを標的とするmiRNAを発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の有効量を投与することを含む、
前記方法。 - miRNAが、
配列番号15:AGCATTAAAGGACTGACTGAA(SOD−miR−103);
配列番号16:GACTGAAGGCCTGCATGGATT(SOD−miR−117);または
配列番号17:CTGCATGGATTCCATGTTCAT(SOD−miR−127)、
に示された配列の、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個の連続したヌクレオチドを含む、請求項32に記載の方法。 - rAAVが、CNS組織を標的とする、請求項32または33に記載の方法。
- rAAVが、AAV.Rh10またはAAV9キャプシドタンパク質を含む、請求項34に記載の方法。
- 配列番号1〜8のいずれかに示された配列を含む、合成マイクロRNA。
- 配列番号15:AGCATTAAAGGACTGACTGAA(SOD−miR−103);配列番号16:GACTGAAGGCCTGCATGGATT(SOD−miR−117);または配列番号17:CTGCATGGATTCCATGTTCAT(SOD−miR−127)に示された配列を含む、合成マイクロRNA。
- miR−155の隣接領域をさらに含む、請求項36または37に記載の合成マイクロRNA。
- 請求項36〜38のいずれか一項に記載のマイクロRNAをコードし、AAV血清型の逆方向末端反復(ITR)を含む、組換え核酸。
- AAV血清型が、AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRh10、AAV11およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項39に記載の組換え核酸。
- マイクロRNAをコードする領域(単数または複数)に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項40に記載の組換え核酸。
- プロモーターが、組織特異的プロモーターである、請求項41に記載の組換え核酸。
- プロモーターが、βアクチンプロモーターなどの、ポリメラーゼIIプロモーターである、請求項42に記載の組換え核酸。
- プロモーターが、U6プロモーターなどの、ポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項42に記載の組換え核酸。
- 請求項39〜44のいずれか一項に記載の組換え核酸を含む、組成物。
- 請求項39〜44のいずれか一項に記載の組換え核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)。
- AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11およびそのバリアントからなる群から選択される1または2以上のAAV血清型の、1または2以上のキャプシドタンパク質をさらに含む、請求項46に記載の組換えAAV。
- 請求項46または47の組換えAAVを含む、組成物。
- 薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項48に記載の組成物。
- 請求項48または49の組成物を収容する容器を含む、キット。
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