JP2020019772A

JP2020019772A - 筋萎縮性側索硬化症を処置するためのｒＡＡＶベースの組成物および方法

Info

Publication number: JP2020019772A
Application number: JP2019159514A
Authority: JP
Inventors: ミュラー，クリスチャン; Mueller Christian; ブラウン，ロバート，エイチ．，ジュニア; H Brown Robert Jr
Original assignee: University of Massachusetts UMass
Current assignee: University of Massachusetts UMass
Priority date: 2014-03-18
Filing date: 2019-09-02
Publication date: 2020-02-06
Anticipated expiration: 2035-03-18
Also published as: EP3750907A3; EP3119797B1; WO2015143078A1; US20170114340A1; US10711274B2; US10954518B2; JP2017510298A; US10280418B2; CA2942515A1; JP7051118B2; EP3119797A1; AU2020260765B2; JP6756700B2; JP2024032730A; AU2015231294A1; AU2015231294B2; US20190316126A1; US20190276826A1; US20200032256A1; JP2021152030A

Abstract

【課題】筋萎縮性側索硬化症などの遺伝性疾患を処置するための、方法および組成物の提供。【解決手段】Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子によりコードされるｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方を標的とする阻害性核酸、ＳＯＤ１ｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡ、およびｒＡＡＶベースの送達組成物、に関する方法およびキット。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、35 U.S.C. §119(e)の下で、２０１４年３月１８日に出願された米国仮特許出願USSN61/955,189、名称「筋萎縮性側索硬化症を処置するためのｒＡＡＶベースの組成物および方法（RAAV-Based Compositions and Methods for Treating Amyotrophic Lateral Sclerosis）」に基づく優先権を主張する；その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明は、筋萎縮性側索硬化症などの遺伝性疾患を処置するための、方法および組成物に関する。

発明の背景
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、一般に致命的な進行性の運動ニューロン疾患であり、これは前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）と同時に発症することもある。ＡＬＳは、散発性（ＳＡＬＳ）および家族性（ＦＡＬＳ）両方の形態で生じる。症例の約１０％は、常染色体優性形質として遺伝する。ＡＬＳに対するＦＤＡ承認療法は、生存を約１０％延長する化合物である、リルゾールである。

本開示の側面は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する遺伝子の発現を調節するための、組成物および方法に関する。特に、ＡＬＳに関連するＣ９ｏｒｆ７２およびＳＯＤ１などの遺伝子のサイレンシングに有用な、阻害性核酸が提供される。例えば、本開示のいくつかの側面において、Ｃ９ｏｒｆ７２の全てのバリアントを標的とする、阻害性核酸が提供される。本開示の他の側面において、Ｃ９ｏｒｆ７２のバリアントのサブセットを標的とする、阻害性核酸が提供される。本開示のいくつかの態様は、ｍｉＲＮＡなどの特定の阻害性核酸は一般に細胞質において機能するにも関わらず、それらを細胞質のアルゴノートタンパク質（例えば、ＡＧＯ２、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体の触媒成分、またはＲＩＳＣ）に負荷して、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのサイレンシングが可能な核に移入して戻すことができる、との認識に関する。したがって、いくつかの態様において、核内のＲＮＡおよび細胞質内のＲＮＡの両方を標的とすることができて、タンパク質翻訳を含むＲＮＡの機能を妨害または阻害する、阻害性核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）が提供される。

本開示の側面は、ＡＬＳに関連するＣ９ｏｒｆ７２およびＳＯＤ１などの遺伝子をサイレンシングする阻害性核酸を発現するよう操作されたＡＡＶの、髄腔内送達を利用する、処置方法に関する。いくつかの態様において、ＡＡＶ９およびＡＡＶ．Ｒｈ１０などの神経向性のＡＡＶを利用して、ＣＮＳ組織を標的とする核酸を送達するための方法が、提供される。阻害性核酸を発現するよう操作された核酸を保有するＡＡＶの使用は有利であるが、その理由の一部は、前記ＡＡＶが、ｒＡＡＶエピソームが阻害性核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）を継続して発現するため、非発現の阻害性核酸、例えばｓｉＲＮＡ二重鎖およびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの再投与に関連する欠点を克服するからである。さらに、いくつかの態様において、本明細書で提供される方法は、ＣＮＳにおいて遺伝子をサイレンシングするために比較的低用量のＡＡＶの使用が可能であり、末梢組織のＡＡＶへの曝露を最小限に抑えるので有利である。

本開示の他の側面において、Ｃ９ｏｒｆ７２のＧ_４Ｃ_２伸長を含むトランスジェニックマウスが提供される。いくつかの態様において、モデルは、in vitroならびに哺乳類のＣＮＳにおけるin vivoでの、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子サイレンシングのための阻害性核酸の評価を容易にする。他の側面において、ＲＡＮ翻訳ペプチドの使用が、例えばＣ９ｏｒｆ７２活性のマーカーとして、開示される。いくつかの態様において、トランスジェニックマウスモデルは、Ｒｈ１０キャプシドを保有するＡＡＶなどの神経栄養性ＡＡＶの、ＣＮＳにおける持続性の評価を容易にする。いくつかの態様において、トランスジェニックマウスモデルは、例えば髄腔内送達を介した投与後の、初期免疫原性の評価を容易にする。
いくつかの側面において、本開示は、細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２の発現を阻害する方法を提供し、該方法は、細胞に対し、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子によってコードされるｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方を標的とする阻害性核酸を送達することを含む。

いくつかの態様において、細胞は、最大５０、最大９０、最大１６０、または最大２００の反復までのＧ_４Ｃ_２伸長を有する、Ｃ９ｏｒｆ７２１を発現する。いくつかの態様において、細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２のアイソフォームＢをコードするｍＲＮＡのレベルは、細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２タンパク質のアイソフォームＡをコードするｍＲＮＡのレベルよりも高い。
いくつかの態様において、細胞は、中枢神経系の細胞である。いくつかの態様において、細胞はニューロンである。
いくつかの態様において、阻害性核酸に曝露される前に、細胞は、核内Ｇ_４Ｃ_２凝集体（foci）を含む。いくつかの態様において、阻害性核酸の細胞への送達は、核内Ｇ_４Ｃ_２凝集体の減少をもたらす。

いくつかの態様において、阻害性核酸に曝露される前に、細胞は、Ｃ９ＲＡＮタンパク質を含む。いくつかの態様において、阻害性核酸の細胞への送達は、Ｃ９ＲＡＮタンパク質レベルの低下をもたらす。
いくつかの態様において、細胞はin vivoである。いくつかの態様において、細胞はin vitroである。いくつかの態様において、細胞は、ＦＴＤまたはＡＬＳの１または２以上の症状を有する対象のものである。いくつかの態様において、細胞は、ＦＴＤまたはＡＬＳを有する疑いのある対象のものである。
いくつかの側面において、本開示は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＣ９ｏｒｆ７２の発現を阻害する方法を提供し、該方法は、対象のＣＮＳに対して、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子によってコードされるＲＮＡを標的とする阻害性核酸を投与することを含み、ここで前記阻害性核酸は、マイクロＲＮＡである。

いくつかの側面において、本開示は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＣ９ｏｒｆ７２の発現を阻害する方法を提供し、該方法は、対象のＣＮＳに対して、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子によってコードされるｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方を標的とする阻害性核酸を投与することを含む。
いくつかの態様において、阻害性核酸はマイクロＲＮＡである。
いくつかの態様において、阻害性核酸を対象に投与するステップは、対象に対して、対象の細胞において阻害性核酸を発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含む。
いくつかの側面において、本開示は、ＦＴＤまたはＡＬＳを有するか、または有することが疑われる対象を処置する方法を提供し、該方法は、対象の細胞においてＣ９ｏｒｆ７２遺伝子によりコードされるｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方を標的とする阻害性核酸を発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の有効量を投与すること、を含む。

いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ＣＮＳ組織を標的とする。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ．Ｒｈ１０またはＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。
いくつかの態様において、阻害性核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２のエクソン３内の少なくとも５個の連続したヌクレオチドに相補的な相補性領域を含む。いくつかの態様において、少なくとも５個の連続したヌクレオチドは、Ｃ９ｏｒｆ７２のヌクレオチド２２０〜２４１内にある。
いくつかの態様において、阻害性核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質のアイソフォームＡをコードするｍＲＮＡおよびアイソフォームＢをコードするｍＲＮＡを標的とする。いくつかの態様において、阻害性核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２バリアントＶ１（NM_145005.6；配列番号１８）、Ｖ２（NM_018325.3；配列番号１９）、およびＶ３（NM_001256054.1；配列番号２０）を標的とする。いくつかの態様において、阻害性核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２バリアントＶ１（NM_145005.6；配列番号１８）およびＶ３（NM_001256054.1；配列番号２０）を標的とするが、Ｖ２（NM_018325.3；配列番号１９）は標的としない。いくつかの態様において、阻害性核酸は、Ｃ９ｏｒｆ７２バリアントＶ１（NM_145005.6；配列番号１８）を標的とするが、Ｖ２（NM_018325.3；配列番号１９）およびＶ３（NM_001256054.1；配列番号２０）は標的としない。

いくつかの態様において、阻害性核酸は、細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２のｍＲＮＡのレベルを、少なくとも５０％低下させる。いくつかの態様において、阻害性核酸は、細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２のｐｒｅ−ｍＲＮＡのレベルを、少なくとも５０％低下させる。
いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号１〜８のいずれかに示された配列の、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、髄腔内、脳内、脳室内または静脈内に投与される。
いくつかの側面において、本開示は、細胞におけるＳＯＤ１の発現を阻害する方法を提供し、該方法は、細胞に対して、ＳＯＤ１ｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡを送達することを含み、ここで該ｍｉＲＮＡは、
配列番号１５：ＡＧＣＡＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１０３）；
配列番号１６：ＧＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１１７）；または
配列番号１７：ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１２７）、
に示された配列の、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の連続したヌクレオチドを含む。

いくつかの側面において、本開示は、ＡＬＳを有するか、または有することが疑われる対象を処置する方法を提供し、該方法は、対象に対して、対象の細胞においてＳＯＤ１遺伝子によりコードされるＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡを発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の有効量を投与することを含む。
いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、
配列番号１５：ＡＧＣＡＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１０３）；
配列番号１６：ＧＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１１７）；または
配列番号１７：ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１２７）、
に示された配列の、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の連続したヌクレオチドを含む。

いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ＣＮＳ組織を標的とする。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ．Ｒｈ１０またはＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。
いくつかの側面において、本開示は、配列番号１〜８のいずれかに示された配列を含む、合成マイクロＲＮＡを提供する。
いくつかの側面において、本開示は、配列番号１５：ＡＧＣＡＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１０３）；配列番号１６：ＧＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１１７）；または配列番号１７：ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１２７）に示された配列を含む、合成マイクロＲＮＡを提供する。いくつかの態様において、合成マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１５５の隣接領域をさらに含む。
いくつかの側面において、本開示は、配列番号１〜８または配列番号１５〜１７のいずれかに記載のマイクロＲＮＡをコードし、ＡＡＶ血清型の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、組換え核酸を提供する。いくつかの態様において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲｈ１０、ＡＡＶ１１およびそのバリアントからなる群から選択される。

いくつかの態様において、組換え核酸は、マイクロＲＮＡをコードする領域（単数または複数）に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの態様において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、βアクチンプロモーターなどの、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーターなどの、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の組換え核酸を含む、組成物を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の組換え核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。いくつかの態様において、組換えＡＡＶは、ＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．Ｒｈ１０、ＡＡＶ１１およびそのバリアントからなる群から選択される１または２以上のＡＡＶ血清型の、１または２以上のキャプシドタンパク質をさらに含む。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の組換えＡＡＶを含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の組成物を収容する容器を含む、キットを提供する。

図１は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子およびプライマーの図である。上のパネル（Ａ）は、遺伝子のゲノム構成を示し；下のパネルは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡバリアント１〜３である。ボックスはエクソンを表し、線はイントロンである。ヘキサヌクレオチド反復伸長（赤ひし形）は、バリアント１および３に転写される。ＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ終止コドンは示されている通りである。水平方向の線は、各バリアントのオープンリーディングフレームを表す（バリアント２と３は、同一のタンパク質を産生することに注意）。上のパネル（Ａ）は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡアイソフォームを識別するために使用するTaqManプライマーの位置を示す；下のパネル（Ｂ）は、３つのスプライスされたｍＲＮＡを示す；図の注釈は上記の通りであり、３つの異なるスプライスされたｍＲＮＡアイソフォームを検出するプライマー対の位置も示す。図２は、Ｃ９ｏｒｆ７２バリアントの検出に関するｑＲＴ−ＰＣＲのデータを示す。個々のバリアント（Ｖ_１およびＶ_３）、またはすべてのバリアント（Ｖ_ａｌｌ）ｍＲＮＡを検出するように設計されたTaqManプローブアッセイを、種々の細胞株ならびにヒトの脳組織で試験した。結果は、３つの生物学的複製からの平均＋ＳＤである。

図３は、ヒトＣ９ｏｒｆ７２のｍｉＲＮＡ媒介性ノックダウンに関連するin vitroデータの図である。人工Ｃ９ｍｉＲ−２２０によるＣ９ｏｒｆ７２のノックダウン後の、Ｃ９ｏｒｆ７２ｍＲＮＡの相対的レベル。このｍｉＲＮＡは、エクソン３に位置し、すべてのバリアントを標的とする。これらは、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞でのｍｉｒ２２０（ＣＢＡプロモーターＧＦＰ）の一過性トランスフェクションの、３つの生物学的複製からの結果である。対照は、ＳＯＤ１に対するｍｉＲである。図４は、Ｃ９ｏｒｆ７２のｍＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍＲＮＡのノックダウンに関連するin vitroデータの図である。Ｃ９−ｍｉＲ２２０は、Ｃ９ｏｒｆ７２のＯＲＦの塩基２２０〜２４１を標的とするように設計された人工ｍｉＲＮＡである。このｍｉＲＮＡはエクソン３で結合し、したがって、すべてのｍＲＮＡバリアントを標的とする。このｍｉＲＮＡを、Ｕ６またはニワトリβアクチンプロモーターのいずれかを用いてプラスミドへクローニングし、Ｈｅｋ−２９３細胞にトランスフェクトした。ＲＮＡは、トランスフェクションの７２時間後に抽出し、ＲＴの前にＤＮＡｓｅで処理した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、スプライスされた（例えば、Ｖ_ａｌｌｍＲＮＡ）またはスプライスされていない（例えば、Ｖ_ａｌｌｐｒｅ−ｍＲＮＡ）バリアントのいずれかを検出するカスタムTaqManプローブを用いて実施した。結果は、３つの生物学的複製からの平均±ＳＤである。

図５は、ＤＮＡのサザン分析の図である（左パネル）。レーン：（Ａ）ＡＬＳリンパ芽球ＤＮＡ RB8088。Ｃ９ｏｒｆ７２伸長、〜８ｋｂ（９００反復）；（Ｂ）ＡＬＳ皮質ＤＮＡ RB9783。Ｃ９ｏｒｆ７２伸長、〜９ｋｂ（１０００反復）；（Ｃ）ＡＬＳ皮質ＤＮＡ RB2952。Ｃ９ｏｒｆ７２、野生型、伸長バンドなし；（Ｄ）マウス脾臓ＤＮＡ非トランスジェニック；（Ｅ）マウス脾臓ＤＮＡ CH523-111K12_523。Ｃ９ｏｒｆ７２伸長ＢＡＣ、〜４．５ｋｂ（３５０反復）。各試験片について、２５ｕＧのＤＮＡをＸｂａｌで消化し、０．８％寒天ゲル上、８０Ｖで２．５時間分離した。ハイブリダイゼーションは、５５℃でＲＮＡオリゴプローブ（Ｇ_４Ｃ_２）４−ＤＩＧにより、CDP-Starで可視化した。右：ＷＴおよびＣ９ｏｒｆ７２マウスの海馬の、ＲＮＡのセンス鎖についてのＧ_４Ｃ_２−ＣｙＡプローブによるハイブリダイゼーション。

図６は、ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０のＩ．Ｔ．注射後の、脊髄における堅牢なＥＧＦＰ形質導入およびｍｉＲＮＡ媒介性ノックダウンを示すデータの図である。４歳の雄マーモセットに、ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０．ＣＢＥＧＦＰまたはｒＡＡＶ．Ｒｈ１０．Ｕ６ａｎｔ−ＳＯＤ１ｍｉＲのいずれかを、５×１０ｅ１２のＧＣ／ｋｇの用量で、Ｉ．Ｔ．注射した。動物を２週間後に剖検し、ＣＮＳ組織を単離し、固定した。脊髄の４０ミクロンの切片を、ＥＧＦＰに対する抗体で染色し、ＤＡＢで可視化した。すべての切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。図に示すのは、（Ａ）腰髄、（Ｂ）胸髄、（Ｃ）頸髄の低倍率画像（４倍対物レンズ）である。（Ｄ）運動ニューロンは、対照（ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０．ＧＦＰ）および処置された（ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０．ＧＦＰ−ｍｉＲ−ＳＯＤ１）マーモセットの腰髄からレーザーキャプチャーし、ｍｉＲ−ＳＯＤ１マイクロＲＮＡおよびＳＯＤ１ｍＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲのレベルについてアッセイした。図７Ａ〜７Ｂは、Ｃ９ｏｒｆ７２のｍｉＲＮＡ媒介性サイレンシングのためのｒＡＡＶベクターの設計を示す図である。図７Ａは、標的とするｍｉＲＮＡ配列が、ｍｉＲ−１５５のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列が隣接するステムループ中にクローニングされることを示す。図７Ｂは、Ｃ９−ｍｉＲを標的とする配列が次に、in vitro試験およびｒＡＡＶのパッケージングのために、ポリメラーゼＩＩ（ニワトリＢアクチン）またはポリメラーゼＩＩＩ（Ｕ６）プロモーターのいずれかで、プロウイルスＡＡＶプラスミド中にクローニングされることを示す。

図８は、マウスにおける異なるＣ９ｏｒｆ７２バリアントに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲのデータを示す図である。図９は、Ｃ９ｏｒｆ７２変異型トランスジェニックマウスが、前頭皮質にポリ（ＧＰ）封入体を生じることを示す図である。図１０Ａ〜１０Ｂは、ＲＡＮ翻訳ペプチドに対する抗体が、Ｃ９ＦＴＤ／ＡＬＳの脳組織における封入体を検出することを示す図である。図１０Ａは、抗体の特異性が、ＧＦＰタグ付きの（ＧＡ）５、（ＧＲ）５、（ＧＰ）５、（ＰＡ）５または（ＰＲ）５を発現するようにトランスフェクトされた細胞からの溶解物を用いたウエスタンブロット分析によって確認されたことを示す。図１０Ｂは、ここに示されているように抗ＧＡ、抗ＧＲおよび抗ＧＰ免疫反応性封入体が、Ｃ９ＦＴＤ／ＡＬＳの小脳を含む脳全体で検出されることを示す。図１１Ａ〜１１Ｃは、ＳＯＤ１のｍｉＲＮＡ媒介性サイレンシングのためのｒＡＡＶベクターの設計を示す図である。ｍｉＲ−１５５の隣接領域を、ＣＭＶエンハンサー、短いＳＶ４０イントロンを有するニワトリβアクチンハイブリッドプロモーターからなるプロウイルスＡＡＶ発現カセットの、ＢＧＨポリＡ領域の上流に、クローンニングした。図１１Ａは、ｈＳＯＤ１のｍＲＮＡを標的とする配列を、ｍｉＲ−１５５の骨格にクローニングしたことを示す。図１１Ｂは、このｍｉＲＮＡの２つのタンデムコピーを、臨床設定において所望されるように、ＧＦＰを発現するベクターまたはｍｉＲＮＡのみを発現するベクターのいずれかにクローンニングしたことを示す。図１１Ｃは、ヒト、アカゲザルおよびマーモセットのＳＯＤ１遺伝子配列のアラインメントを示す図であり、成熟したｍｉＲ−ＳＯＤ１−１２７が、霊長類間で１００％保存されている配列を標的とすることを示す。

図１２は、トランスジェニックマウスにおけるヒトＳＯＤ１の、in vivoでのｒＡＡＶ媒介性ノックダウンに関連するデータを示す図である。ヒトＳＯＤ１Ｇ９３Ａ突然変異を発現するトランスジェニックマウスに、抗ＳＯＤ１ｍｉＲを発現するｒＡＡＶ９ベクターを注射した。Ａ）新生仔マウスに、ＧＦＰ対照ベクターまたはＳＯＤ１ｍｉＲ−１２７を発現するベクターのいずれかを、１．０×１０^１２の粒子で顔面の静脈を介して投与した。マウスは送達の４週間後に屠殺し、筋肉を、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる全ｈＳＯＤ１発現について分析した。Ｂ）成体マウスには、５×１０^１０のベクター粒子を、線条体に直接注射した。マウスは注射の３週間後に屠殺し、脳組織を、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりｈＳＯＤ１発現について分析した。図１３は、ＡＡＶ．Ｒｈ１０ベクター構築物に関するデータを示し（上）、結果は、マーモセットの肝臓における、ＳＯＤ１発現の減少を示す（下）。図１４は、マーモセットにおけるＳＯＤ１のサイレンシングを評価するために実施したアッセイの、概略の図である。図１５は、マーモセットで行われたアッセイの概要の図である。

図１６は、髄腔内（ＩＴ）注射し、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）を行った３匹の雄マーモセットにおいて（図１５の動物６、８、９）、ＳＯＤ１発現がＭＮにおいて、ＡＡＶ．Ｒｈ１０ＣＢ−２ｘ−ｍｉＲ−ＳＯＤ１（ライトグレー）およびＵ６−ｍｉＲ−ＳＯＤ１（濃いグレー）により低減したことを示す図である。Ｕ６プロモーターは、抗ＳＯＤ１のｍｉＲの高いレベルを駆動し、より効果的にＳＯＤ１をサイレンシングした。図１７Ａ〜１７Ｂは、３匹の雄マーモセット（図１５の動物６、８、９）に関連するデータを示す図である。図１７Ａは、ＳＯＤ１発現がＭＮおよび非ＭＮにおいて、ＩＴＡＡＶ．Ｒｈ１０ＣＢ−２ｘ−ｍｉＲ−ＳＯＤ１（ライトグレー）およびＵ６−ｍｉＲ−ＳＯＤ１（濃いグレー）により低減したことを示す。Ｕ６構築物は、より大きなノックダウン生成した。図１７Ｂは、ＩＴｒＡＡＶ．Ｒｈ１０ＣＢ−２ｘ−ｍｉｒ−ＳＯＤ１およびＵ６−ｍｉＲ−ＳＯＤ１による、ＭＮおよび非ＭＮにおける相対的ＧＦＰ発現を示す。Ｕ６構築物は、最も高いＧＦＰ発現を生成した。図１８は、図１７Ａ〜１７Ｂに記載されたものと同じ３匹の雄マーモセットにおいて、ＡＡＶ．Ｒｈ１０ＣＢ−２ｘ−ｍｉＲ−ＳＯＤ１（ライトグレー）およびＵ６−ｍｉＲ−ＳＯＤ１（濃いグレー）のＩＴ注射が、より低い脳幹でＳＯＤ１のサイレンシングを生成したことを示す図である。これらの試験において、ｑＰＣＲは、全組織ホモジネート（非レーザーキャプチャーニューロン）で行った。

図１９は、２匹の雄マーモセット（図１５の＃２および３）のコードにおけるＲＮＡハイブリダイゼーション（RNAScope）を使用した、運動ニューロン（ＭＮ）のＳＯＤ１発現の評価に関連するデータを示す図である。＃２では、ＣＢ−ＧＦＰ（ｍｉＲなし）のＩＴ注射は、著名なＳＯＤ１発現を示したＭＮ（ＣｈＡＴｐｏｓ）において、いくらかのＧＦＰ発現を達成した（左）。＃３では、Ｕ６−ＳＯＤ１のｍｉＲ−ＣＢ−ＧＦＰのＩＴ注射は、ＭＮにおいてＧＦＰ発現を生成し、同じニューロンにおいてＳＯＤ１発現の減少をもたらした（右）。図２０は、Ｇ９３ＡＳＯＤ１マウスの、ＣＢ−ｍｉＲ−ＳＯＤ１ベクターによる処置に関連するデータを示す図である。マウスは、２×１０^１２ｇｃのベクター（ＣＢ−ＧＦＰまたはＣＢ−ｍｉＲ−ＳＯＤ１−ＧＦＰ）を、５６〜６８日齢において静脈内注射し、その後、進行する麻痺により安楽死が必要になるまで、盲検的に監視した。結果は、生存期間の中央値が、ＣＢ−ＧＦＰ群について１０８日、およびＣＢ−ｍｉＲ−ＳＯＤ１−ＧＦＰ群について１３０日であり（ログランク検定、ｐ＝０．０１８）、ＣＢ−ｍｉＲ−ＳＯＤ１処置マウスの生存率の有意な増加を示した。

詳細な説明
本開示の側面は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する遺伝子の発現を調節するための、組成物および方法に関する。本開示の側面は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを用いてＡＬＳを処置するための、改良された遺伝子治療用組成物および関連する方法に関する。特に、ＡＬＳに関連するＣ９ｏｒｆ７２およびＳＯＤ１などの遺伝子をサイレンシングする阻害性核酸を発現するように操作された核酸を保有する、ｒＡＡＶが提供される。いくつかの態様において、本開示は、組換えＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０）を利用して、マイクロＲＮＡをＣＮＳに送達し、これによってＳＯＤ１またはＣ９ｏｒｆ７２などのＡＬＳ遺伝子をサイレンシングする。

ＡＬＳは、家族性（ＦＡＬＳ）および散発性（ＳＡＬＳ）両方の形態で生じる。かなりの数のＦＡＬＳ症例は、遺伝子Ｃ９ｏｒｆ７２における非コードヘキサヌクレオチドのＧ_４Ｃ_２伸長に関連する。これらの伸長はまた、家族性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の１０〜２０％、散発性ＦＴＤの１０％、およびＳＡＬＳの〜５％においても検出されている。これらの統計は、Ｃ９ｏｒｆ７２Ｇ_４Ｃ_２伸長を、ＡＬＳの一般的な原因として規定する。正常な個体では、Ｇ_４Ｃ_２伸長は、２または３から２５までの反復のサイズ範囲であり；対照的に、ＦＴＤ／ＡＬＳ患者は、これらの反復を数百から数千有する。正常なＣ９ｏｒｆ７２遺伝子からの転写は、３つのｍＲＮＡバリアント、Ｖ１（例えば、Genbank：NM_145005.6；配列番号：１８）、Ｖ２（例えば、Genbank：NM_018325.3；配列番号：１９）、およびＶ３（例えば、Genbank：NM_001256054.1；配列番号：２０）を生成する。転写物Ｖ１はエクソン１ａ〜６ｂを含み、２２２アミノ酸タンパク質をコードする。エクソンＶ２とＶ３はそれぞれ、エクソン２〜１２およびエクソン１ｂ〜１２を含み、同一の４８１ａａタンパク質をコードする（図１）。

本開示の側面は、Ｖ１およびＶ３がＧ_４Ｃ_２伸長を保有するとの認識に関する。この伸長を有するヒトＡＬＳおよびＦＴＤの脳の分析は、ＲＮＡ転写物の核内蓄積と、前頭皮質および脊髄でのＲＮＡ核内凝集体の生成を示す。これは、転写物Ｖ１とＶ３における伸長が、運動ニューロンで細胞毒性を引き起こす主要な有害物質であることを支持する。Ｃ９ｏｒｆ７２がコードするタンパク質の機能は十分に特徴付けられていないが、バイオインフォマティクスのアプローチは、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質が、構造的な特徴を（ＤＥＮＮ）およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）４と共有し、したがって他の潜在的な機能のうち、膜の細胞輸送を調節し得ることを示す。Ｇ_４Ｃ_２伸長の細胞毒性は、１または２以上の機能獲得のメカニズムに関連付けられる可能性があり、その例としては以下が挙げられる：１）ＲＮＡ凝集体による転写因子の過剰な隔離（sequestering）（例えば筋強直性ジストロフィーにおける筋肉ブラインド（muscleblind））；２）伸長された反復の、反復関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳が、ジペプチドの発現をもたらす（Ｇｌｙ−Ａｌａ；Ｇｌｙ−Ｐｒｏ；Ｇｌｙ−Ａｒｇ）；この様式で産生されるペプチドは、ＣＮＳ全体で神経細胞封入体を形成する；（３）および、Ｃ９ｏｒｆ７２転写物の発現の減少による、ハプロ不全の誘導。本開示の側面は、ｒＡＡＶ（例えば、髄腔内送達ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０）を使用して、阻害性核酸（例えば、マイクロＲＮＡ）を導入し、問題となるＧ_４Ｃ_２伸長を保有するＣ９ｏｒｆ７２の転写物の発現をサイレンシングすることに関する。いくつかの態様において、本開示は、in vitroでＣ９ｏｒｆ７２のキーとなるｐｒｅ−ｍＲＮＡおよび成熟ｍＲＮＡ転写物のサイレンシングを達成する、方法および組成物を提供する。

２１番染色体上に位置する、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）をコードする遺伝子の変異は、家族性筋萎縮性側索硬化症にリンクされている。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）は、ＳＯＤ１遺伝子によってコードされる酵素である。ＳＯＤ１は銅および亜鉛イオンと結合し、体内の遊離のスーパーオキシドラジカルの破壊に役割を果たす、３つのスーパーオキシドジスムターゼの１つである。コードされたアイソザイムは、可溶性の細胞質およびミトコンドリアの膜間空間タンパク質であり、天然に存在するが有害なスーパーオキシドラジカルを、分子の酸素および過酸化水素に変換するためのホモ二量体として作用する。
出現してＡＬＳの原因となる、頻繁なＳＯＤ１突然変異には、Ａ４Ｖ、Ｈ４６ＲおよびＧ９３Ａが含まれる。典型的には、これらのＡＬＳの原因となるＳＯＤ１突然変異は、支配的な様式で作用し、ＳＯＤ１遺伝子の単一の変異型コピーが疾患を引き起こすのに十分であり得る。変異型酵素は典型的には酵素活性を保持するので、これらの突然変異は、毒性の機能獲得につながると考えられている。したがって、変異型ＳＯＤ１は、ミトコンドリア機能障害、酸化ストレス、カルシウム調節不全、異常に処理されたタンパク質の凝集、小胞体（ＥＲ）ストレス、軸索輸送の中断、神経伝達物質の誤制御、プログラムされた細胞死および炎症を含む、広範囲の細胞欠陥を引き起こす可能性がある。本開示の側面は、ｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０）を使用して、阻害性核酸（例えば、マイクロＲＮＡ）を細胞に導入し、変異型ＳＯＤ１の発現をサイレンシングすることに関する。

阻害性核酸
いくつかの態様において、本開示は、ＳＯＤ１およびＣ９ｏｒｆ７２などのＡＬＳの原因となる遺伝子の発現を阻害する、阻害性核酸を提供する。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズして、その機能または発現を阻害する核酸である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、一本鎖または二本鎖である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ｍｉＲ−１５５の隣接領域を有する標的配列を含む、マイクロＲＮＡである。

いくつかの態様において、阻害性核酸は、５〜３０塩基長である（例えば、１０〜３０、１５〜２５、１９〜２２）。阻害性核酸はまた、１０〜５０、または５〜５０塩基長であってもよい。例えば、阻害性核酸は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基長のいずれかであってよい。いくつかの態様において、阻害性核酸は、標的核酸の、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０塩基、または最大３０もしくは４０塩基に、少なくとも８０％または９０％相補的な塩基の配列を、含むかまたはこれからなり、または、標的核酸の１０、１５、２０、２５または３０塩基にわたって最大３つのミスマッチ（例えば、１つまで、または２つまでのミスマッチ）を有する塩基の配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に提供される配列中の任意の１または２以上のチミジン（Ｔ）ヌクレオチドまたはウリジン（Ｕ）ヌクレオチドは、アデノシンヌクレオチドとの塩基対形成（例えば、ワトソン−クリック塩基対を介して）に適した任意の他のヌクレオチドで置換されていてもよい。例えば、ＴはＵで置き換えられていてもよく、およびＵはＴで置き換えられてもよい。いくつかの態様において、中枢神経系の細胞における遺伝子の発現を阻害する、阻害性核酸が提供される。いくつかの態様において、細胞は、ニューロン、星状細胞、またはオリゴデンドロサイトである。

いくつかの態様において、細胞は、最大５０、最大９０、最大１６０、最大２００、最大３００、最大４００、最大５００、最大６００、またはそれ以上の反復のＧ_４Ｃ_２伸長を有する、Ｃ９ｏｒｆ７２１を発現する。いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号１〜８のいずれかに示された配列を含む。いくつかの態様において、細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２のアイソフォームＢをコードするｍＲＮＡのレベルは、細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２タンパク質のアイソフォームＡをコードするｍＲＮＡのレベルよりも高い。いくつかの態様において、細胞は、核内Ｇ_４Ｃ_２凝集体の検出可能なレベルを含む。いくつかの態様において、細胞は、Ｃ９ＲＡＮタンパク質の検出可能なレベルを含む。
いくつかの態様において、細胞は、変異型ＳＯＤ１酵素を発現する。いくつかの態様において、ＳＯＤ１変異は、Ａ４Ｖ、Ｈ４６ＲおよびＧ９３Ａから選択される。いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号１５：ＡＧＣＡＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１０３）；配列番号１６：ＧＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１１７）；または配列番号１７：ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１２７）に示された配列を含むか、またはこれからなる。

使用の方法
Ｃ９ｏｒｆ７２またはＳＯＤ１などの、ＦＴＤおよび／またはＡＬＳと関連する遺伝子の発現を阻害するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、細胞おけるＣ９ｏｒｆ７２の発現を阻害する方法が提供され、該方法は、細胞に対して、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子によってコードされるｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方を標的とする阻害性核酸を送達することを含む。いくつかの態様において、細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２の発現を阻害する方法が提供され、該方法は、対象のＣＮＳに、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子によりコードされるＲＮＡを標的とする阻害性核酸を投与することを含み、ここで阻害性核酸は、マイクロＲＮＡである。
いくつかの態様において、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）における、Ｃ９ｏｒｆ７２の発現を阻害する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、対象のＣＮＳに、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子によってコードされるｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方を標的とする阻害性核酸を投与することを含む。いくつかの態様において、対象は、ＦＴＤまたはＡＬＳを有するか、または有することが疑われる。いくつかの態様において、方法は、対象に対して、対象の細胞においてＣ９ｏｒｆ７２遺伝子によってコードされるｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方を標的とする阻害性核酸を発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の有効量を投与することを含む。いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号１〜８のいずれかに示された配列を含む。

いくつかの態様において、細胞におけるＳＯＤ１の発現を阻害する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、細胞に対して、ＳＯＤ１ｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡを送達することを含み、ここで該ｍｉＲＮＡは、
配列番号１５：ＡＧＣＡＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１０３）；
配列番号１６：ＧＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１１７）；または
配列番号１７：ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１２７）、
に示された配列、またはこれらのいずれかの相補配列の、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ＳＯＤ１ｍＲＮＡは、GenBank：EF151142.1に記載されている。
いくつかの態様において、ＡＬＳを有するかまたは有する疑いのある対象を処置するための方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、対象に対して、ＳＯＤ１遺伝子によりコードされるＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡを対象の細胞において発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の有効量を投与することを含む。

上記によれば、本明細書で提供される特定の方法は、対象に対して、本明細書に開示された、組換え核酸のいずれかを保有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の有効量を投与することを含む。一般に、ｒＡＡＶの「有効量」は、所望の生物学的応答を誘発するのに十分な量を指す。いくつかの態様において、有効量は、ex vivoで細胞または組織に形質導入するのに有効な、ｒＡＡＶの量を指す。他の態様において、有効量は、ｒＡＡＶの対象への直接投与に有効な量を指す。この技術分野の当業者によって理解されるように、本発明の組換えＡＡＶの有効量は、所望の生物学的エンドポイント、発現産物の薬物動態、処置される状態、投与の様式、および対象などの要因に応じて変化する。典型的には、ｒＡＡＶは、薬学的に許容し得る担体と共に投与される。

いくつかの例において、ｒＡＡＶの投与後、ＦＴＤまたはＡＬＳと関連する少なくとも１つの臨床転帰パラメータまたはバイオマーカー（例えば、核内Ｇ_４Ｃ_２ＲＮＡ凝集体、ＲＡＮ−タンパク質の発現など）が、対象において評価される。典型的には、ｒＡＡＶの投与後に評価される臨床転帰パラメータまたはバイオマーカーを、ｒＡＡＶの投与の前の時点で決定された臨床転帰パラメータまたはバイオマーカーと比較して、ｒＡＡＶの有効性を決定する。多くの場合、ｒＡＡＶの投与後の臨床転帰パラメータまたはバイオマーカーの改善は、ｒＡＡＶの有効性を示す。任意の適切な臨床転帰パラメータまたはバイオマーカーを使用することができる。典型的には、臨床転帰パラメータまたはバイオマーカーは、ＦＴＤまたはＡＬＳの１または２以上の症状を示す。例えば、臨床転帰パラメータまたはバイオマーカーは、核内Ｇ_４Ｃ_２ＲＮＡ凝集体、ＲＡＮ−タンパク質発現、ＳＯＤ１発現、Ｃ９ｏｒｆ７２発現、記憶喪失、ならびに運動障害の有無、例えば不安定性、固縮、遅さ、単収縮、筋力低下や嚥下困難、音声言語の困難、単収縮（線維束性収縮）および手と足のものを含む筋肉のけいれんなど、からなる群から選択されてもよい。

組換えＡＡＶ
いくつかの側面において、本発明は、単離されたＡＡＶを提供する。ＡＡＶに関して本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、その天然の環境から（例えば、宿主細胞、組織、または対象から）単離された、または人工的に生成されたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組換え方法を用いて生成することができる。かかるＡＡＶを、本明細書において「組換えＡＡＶ」と呼ぶ。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ｒＡＡＶの導入遺伝子が１または２以上の所定の組織に特異的に送達されるように、組織特異的な標的化能力を有することができる。ＡＡＶキャプシドは、これらの組織特異的標的化能力を決定する重要な要素である。したがって、標的化される組織に対する適切なキャプシドを有する、ｒＡＡＶを選択することができる。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．Ｒｈ１０、ＡＡＶ１１およびそのバリアントのいずれかに対応するアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む。組換えＡＡＶは、典型的には、本発明の組換え核酸を保有する。

所望のキャプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶを得るための方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許公開番号2003/0138772を参照；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本発明のｒＡＡＶで使用することができるＡＡＶキャプシドタンパク質としては、例えば、G. Gao, et al., J. Virol, 78(12):6381-6388 (June 2004)；G. Gao, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 100(10):6081-6086 (May 13, 2003)；US 2003-0138772、US 2007/0036760、US 2009/0197338、およびWO 2010/138263に開示されているものが挙げられ、ＡＡＶキャプシドタンパク質および関連するヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関するそれらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。典型的には、方法は、ＡＡＶキャプシドタンパク質またはその断片をコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子から成る組換えＡＡＶベクター；および十分なヘルパー機能、を含む宿主細胞を培養して、組換えＡＡＶベクターのＡＡＶキャプシドタンパク質へのパッケージングを可能にすることを含む。

本明細書で提供される方法において使用され得る適切なＡＡＶは、以下に開示されている：米国特許出願公開番号2013/0195801、名称「ＣＮＳ標的化ＡＡＶベクターおよびその使用方法（CNS TARGETING AAV VECTORS AND METHODS OF USE THEREOF）」、２０１３年８月１日公開；および米国特許出願公開番号2012/0137379、名称「新規ＡＡＶおよびその使用（NOVEL AAV'S AND USES THEREOF）」、２０１２年５月３１日公開。これらの文献の内容は、すべての目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
宿主細胞中で培養されてｒＡＡＶベクターをＡＡＶキャプシドにパッケージングする成分は、宿主細胞に対して、トランスで（in trans）供給されてもよい。代替的に、１または２以上の必要な成分（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／またはヘルパー機能）は、１または２以上の必要な成分を当業者に既知の方法を使用して含むように操作された、安定な宿主細胞により提供されてもよい。最も適切には、かかる安定な宿主細胞は、必要な成分（単数または複数）を、誘導性プロモーターの制御下で含有するであろう。しかし、必要な成分（単数または複数）は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。適切な誘導性および構成的プロモーターの例は、本明細書中に提供される。さらに別の代替例では、選択された安定な宿主細胞は、選択された成分（単数または複数）を構成的プロモーターの制御化で、および他の選択された成分（単数または複数）を１または２以上の誘導性プロモーターの制御下で含んでもよい。例えば、安定な宿主細胞が生成されて、これは２９３の細胞に由来し（構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含有する）、しかしこれは、誘導性プロモーターの制御下でｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有する。さらに他の安定な宿主細胞も、当業者によって生成され得る。

本発明のｒＡＡＶを生成するために必要な、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列およびヘルパー機能は、任意の適切な遺伝子エレメント（ベクター）を使用して、パッケージング宿主細胞に送達することができる。選択された遺伝子エレメントは、本明細書に記載のものを含む、任意の適切な方法によって送達することができる。本発明の任意の態様を構築するために使用される方法は、核酸操作の当業者に知られており、遺伝子工学、組換え工学および合成技術を含む。例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Yを参照。同様に、ｒＡＡＶビリオンの生成方法はよく知られており、適切な方法の選択は本発明を限定するものではない。K. Fisher et al, J. Virol., 70:520-532 (1993)および米国特許第5,478,745号を参照。

いくつかの態様において、組換えＡＡＶは、トリプルトランスフェクション法を用いて生成することができる（例えば米国特許第6,001,650号に詳細に記載されるように；トリプルトランスフェクション法に関連するその内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。典型的には組み換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子中にパッケージされる組換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、および補助機能ベクターを用いて、宿主細胞をトランスフェクトすることにより生成される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的なＡＡＶ複製およびキャプシド形成にトランスで機能する、「ＡＡＶヘルパー機能」配列（例えば、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。いくつかの態様において、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、任意の検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（例えば、機能的ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）を生成することなく、効率的なＡＡＶベクターの産生をサポートする。本発明での使用に適切なベクターの非限定的な例としては、米国特許第6,001,650号に記載のｐＨＬＰ１９、および米国特許第6,156,303号に記載のｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが挙げられ、これら両者の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。補助機能ベクターは、非ＡＡＶ由来のウイルスおよび／または細胞機能についてのヌクレオチド配列をコードし、その際に、ＡＡＶは複製に依存する（例えば、「補助機能」）。補助機能としては、ＡＡＶ複製に必要な機能を含み、これには、限定はされないが、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶキャプシドのアセンブリーに関与する部分を含む。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルスなどの任意の既知のヘルパーウイルスに由来することができる。

いくつかの側面において、本発明は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。用語「トランスフェクション」は、外来ＤＮＡの細胞による取り込みを指すために使用され、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合に、細胞は「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術が、当技術分野において一般に知られている。例えば、Graham et al. (1973) Virology, 52:456、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier、およびChu et al. (1981) Gene 13:197を参照。かかる技術を使用して、ヌクレオチド組み込みベクターおよび他の核酸分子などの１または２以上の外因性核酸を、適切な宿主細胞に導入することができる。
「宿主細胞」は、目的の物質を保有するか、または保有することが可能な、任意の細胞を指す。多くの場合、宿主細胞は哺乳動物細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、補助機能ベクター、または組換えＡＡＶの生産に関連する他のトランスファーＤＮＡの、レシピエントとして使用することができる。この用語は、トランスフェクトされたオリジナル細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用する「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指すことができる。単一の親細胞の子孫は、天然、偶発的、または意図的変異のために、形態において、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体において、必ずしもオリジナルの親と完全に同一でなくてもよいことが理解される。

いくつかの側面において、本発明は、単離された細胞を提供する。細胞に関して本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、その天然の環境から（例えば、組織または対象から）単離された細胞を指す。本明細書で使用する用語「細胞株」は、in vitroで連続的または長期の増殖および分裂が可能な、細胞の集団を指す。細胞株はしばしば、単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。さらに、自発的なまたは誘導された変化が、かかるクローン集団の貯蔵または移送中に核型において生じ得ることは、当技術分野で知られている。したがって、参照された細胞株由来の細胞は、祖先細胞または培養物と正確に同一でなくてもよく、参照された細胞株は、かかるバリアントを含む。本明細書で使用する場合、用語「組換え細胞」は、生物学的に活性なポリペプチドの転写、またはＲＮＡ等の生物学的に活性な核酸の産生をもたらすような、ＤＮＡのセグメントなどの外因性ＤＮＡセグメントが導入された細胞を指す。

本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝子エレメントであって、適切な制御エレメントに関連付けられた場合に複製可能であり、細胞間で遺伝子配列を転送することができるものを含む。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。いくつかの態様において、有用なベクターは、転写される核酸セグメントが、プロモーターの転写制御下に配置されているベクターであることが意図される。「プロモーター」は、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列であって、遺伝子の特定の転写を開始するのに必要なものを指す。「作動的に配置された」、「制御下」または「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸に関して正しい位置および配向にあり、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子発現を制御することを意味する。用語「発現ベクターまたは構築物」は、核酸コード配列の一部または全てが転写されることが可能である核酸を含む、任意の種類の遺伝子構築物を意味する。いくつかの態様において、発現は、例えば、転写された遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物または阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を生成するための、核酸の転写を含む。
本発明のｒＡＡＶを生産するために、組換えベクターを所望のＡＡＶキャプシド内にパッケージングするための前述の方法は、限定することを意図しておらず、他の適切な方法も、当業者には明らかであろう。

組換えＡＡＶベクター
本発明の組換え核酸は、組換えＡＡＶベクターであってもよい。組換えＡＡＶベクターは、キャプシドタンパク質にパッケージングされて、対象に投与され、および／または選択された標的細胞に送達されることができる。「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、典型的には、最小の場合、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに５′および３′ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）で構成される。導入遺伝子は、本明細書中の他の箇所で開示されるように、対象の内因性ｍＲＮＡを標的とする核酸を含む１または２以上の阻害性核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）をコードする、１または２以上の領域を含んでよい。導入遺伝子はまた、タンパク質（例えば、蛍光タンパク質）をコードする外因性ｍＲＮＡをコードする領域を含んでもよい。

ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、ｃｉｓ作用性５′および３′逆方向末端反復配列を含む（例えば、B. J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)を参照）。ＩＴＲ配列は、長さが約１４５ｂｐである。いくつかの態様において、ＩＴＲをコードする実質的に全配列が、分子内で使用されるが、ただしこれらの配列のある程度の軽微な修飾は許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当業者の範囲内である（例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；およびK. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)などのテキストを参照）。本発明で用いられるかかる分子の例は、導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドであり、ここで、選択された導入遺伝子配列および関連する調節エレメントは、５′および３′のＡＡＶＩＴＲ配列に隣接する。ＡＡＶＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物のＡＡＶのタイプを含む、任意の既知のＡＡＶから得ることができる。

したがって組換え核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．Ｒｈ１０、ＡＡＶ１１およびそれらのバリアントからなる群から選択されるＡＡＶ血清型の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を、含むことができる。組換え核酸はまた、１または２以上の第１の阻害性ＲＮＡと作動可能に連結されたプロモーター、外因性ｍＲＮＡ、および／または１または２以上の第２の阻害性ＲＮＡを含んでもよい。プロモーターは、組織特異的プロモーター、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってよい。
組換えＡＡＶベクターのための上記で同定された主要な要素に加えて、ベクターはまた、導入遺伝子のエレメントに作動可能に連結されている従来の制御エレメントを含み、ここで該連結は、本発明によって産生されたベクターでトランスフェクトされたかまたはウイルスで感染された細胞における、転写、翻訳および／または発現を可能にする様式である。本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子に隣接する発現制御配列、および、目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは距離をおいて作用する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列は、以下を含む：適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；および、必要な場合は、コードされた産物の分泌を高める配列。天然の、構成的、誘導性および／または組織特異的プロモーターを含む、多数の発現制御配列が、当技術分野で知られており、利用可能である。

本明細書で使用する場合、核酸配列（例えば、コード配列）および調節配列は、これらが、核酸配列の発現または転写を調節配列の影響または制御下に置くような様式で、共有的に連結されている場合に、作動可能に連結されているとされる。核酸配列の機能的タンパク質への翻訳が所望される場合、２つのＤＮＡ配列が作動可能に連結されているとされるのは、以下の場合である：５′調節配列のプロモーターの誘導が、コード配列の転写をもたらす場合、および、２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさない、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力を妨害しない、または（３）タンパク質に翻訳されるべき対応するＲＮＡ転写物の能力を妨害しない場合。したがって、プロモーター領域が核酸配列に作動可能に連結されているのは、プロモーター領域が、得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるような様式で、ＤＮＡ配列の転写に影響を及ぼすことができる場合である。同様に、２または３以上のコード領域が作動可能に連結されているのは、一般的なプロモーターからのそれらの転写が、フレーム内で翻訳された２または３以上のタンパク質の発現をもたらすように、連結されている場合である。いくつかの態様において、作動可能に連結されたコード配列は、融合タンパク質を生じる。いくつかの態様において、作動可能に連結されたコード配列は、機能的ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を生じる。

タンパク質をコードする核酸に対して、ポリアデニル化配列は、一般に、導入遺伝子配列の後でかつ３′のＡＡＶＩＴＲ配列の前に挿入される。本発明において有用なｒＡＡＶ構築物もまた、イントロンを、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に位置して含んでいてもよい。１つの可能なイントロン配列は、ＳＶ−４０から誘導され、これはＳＶ−４０Ｔイントロン配列と呼ばれる。任意のイントロンは、βアクチン遺伝子からのものであってもよい。使用することができる別のベクターエレメントは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）である。
宿主細胞での遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種、組織または細胞型の間で変化し得るが、一般的に、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５′非転写および５′非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、エンハンサーエレメント、などを含む。特に、かかる５′非転写調節配列は、作動可能に接合された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むであろう。調節配列はまた、所望により、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を含んでもよい。本発明のベクターは、任意に５′リーダーまたはシグナル配列を含んでもよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。

構成的プロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを伴う）、ＳＶ４０プロモーター、およびジヒドロ葉酸還元酵素プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、これは以下によって：外因的に供給された化合物、温度などの環境因子、または急性期などの特定の生理学的状態の存在、細胞の特定の分化状態によって、または複製細胞のみにおいて、調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導系は、様々な商業的供給源から入手可能であり、これには、限定はされないが、Invitrogen、ClontechおよびAriadが含まれる。他の多くの系が記載されており、当業者によって容易に選択することができる。外因的に供給されたプロモーターにより調節される誘導可能なプロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（metallothionine）（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制系、テトラサイクリン誘導系、ＲＵ４８６誘導系およびラパマイシン誘導系が挙げられる。この文脈において有用であり得る誘導性プロモーターのさらに他の種類は、特定の生理学的状態により、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、または複製細胞のみにおいて、調節されるものである。別の態様において、導入遺伝子のための天然のプロモーターまたはその断片が使用される。さらなる態様において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位もしくはコザックコンセンサス配列などの、他の天然の発現制御エレメントもまた、天然の発現を模倣するために使用することができる。

いくつかの態様において、調節配列は、組織特異的遺伝子発現の能力を付与する。いくつかの場合において、組織特異的調節配列は、組織特異的な様式で転写を誘導する、組織特異的な転写因子に結合する。かかる組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は、当技術分野において知られている。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリβアクチンプロモーターである。
いくつかの態様において、１または２以上のｍｉＲＮＡのための１または２以上の結合部位をｒＡＡＶベクターの導入遺伝子に組み込んで、導入遺伝子を保有する対象の１または２以上の組織、例えば、非肝臓組織、非肺組織において、導入遺伝子の発現を阻害する。当業者は、結合部位が、組織特異的な様式で導入遺伝子の発現を制御するために、選択されてもよいことを理解するであろう。ｍＲＮＡ中のｍｉＲＮＡ標的部位は、５′ＵＴＲ、３′ＵＴＲまたはコード領域にあってもよい。典型的には、標的部位は、ｍＲＮＡの３′ＵＴＲにある。さらに、導入遺伝子は、複数のｍｉＲＮＡが、同一または複数の部位を認識することにより、ｍＲＮＡを調節するように設計されてもよい。複数のｍｉＲＮＡ結合部位の存在は、複数のＲＩＳＣの共同作用をもたらし、発現の高効率的な阻害を提供する。標的部位の配列は、合計で５〜１００、１０〜６０、またはそれ以上のヌクレオチドを含んでよい。標的部位の配列は、標的遺伝子の結合部位の配列の少なくとも５個のヌクレオチドを含むことができる。

いくつかの態様において、組換えＲＮＡベクターのクローニング能力は限定されていてもよく、所望のコード配列は、ウイルスの４．８キロベースのゲノムの完全な置換を含むことができる。大きな遺伝子はしたがって、いくつかの場合には、標準的な組換えＡＡＶベクターでの使用に適していない場合もある。当業者は、限定されたコーディング能力を克服するための選択肢が、当技術分野で利用可能であることを理解するであろう。例えば、２つのゲノムのＡＡＶＩＴＲをアニールしてヘッドツゥテイルコンカテマーを形成し、ベクターの能力をほぼ倍増することができる。スプライス部位の挿入は、転写産物からのＩＴＲの除去を可能にする。限定されたクローニング能力を克服するための他の選択肢は、当業者には明らかであろう。

組換えＡＡＶの投与
ｒＡＡＶｓを十分な量で投与して、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の副作用なしに遺伝子移入および発現の十分なレベルを提供する。従来のおよび薬学的に許容し得る投与経路としては、限定されないが、選択された組織（例えば、肝臓組織、肺組織）への直接送達、および皮下、膵臓内（intraopancreatically）、鼻腔内、非経口、静脈内、筋肉内、髄腔内、脳内、経口、腹腔内への投与、吸入により、または別の経路によるものが挙げられる。所望により、投与経路は組み合わせてもよい。
特定のｒＡＡＶの対象への送達は、例えば、対象の血流への投与によってもよい。血流への投与は、静脈、動脈、または任意の他の血管の導管への注入によるものであってよい。さらに、特定の場合では、ｒＡＡＶを、脳組織、髄膜、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、オリゴデンドロサイト、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質腔などに送達することが望ましい場合がある。いくつかの態様において、組換えＡＡＶは、直接的に脊髄または脳（例えば、前頭前野）へと、心室領域への注入により送達してもよく、さらに、線条体（例えば、尾状核または線条体の被殻）、および神経筋接合部、または小脳小葉に、針、カテーテルまたは関連するデバイスで、当技術分野で知られている定位注射などの神経外科技術を用いて送達してもよい（例えば、Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999；Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000；Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993；およびAlisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000を参照）。

特定の状況では、ｒＡＡＶベースの治療用構築物を、本明細書に開示の適切に製剤化された医薬組成物中で、髄腔内、脳内、静脈内、皮下、膵臓内、鼻腔内、非経口、静脈内、筋肉内、経口、腹腔内に、または吸入により、送達することが望ましいであろう。
ｒＡＡＶベースの治療用構築物の望ましい投与はまた、ex vivo投与も含むことができることを、当業者は理解することができる。いくつかの態様において、ex vivo投与は以下を含む：（１）対象からの目的の細胞または組織（単数または複数）の単離、（２）細胞または組織（単数または複数）を十分な量のｒＡＡＶに接触させて、過度の有害な影響なしに、遺伝子移入および発現の十分なレベルを提供すること、および（３）細胞または組織を、対象に移入して返すこと。いくつかの態様において、細胞または組織は、トランスフェクションの前および／または後に数日間、ex vivoで培養してもよい。

細胞または組織は、対象から、任意の適切な方法によって単離することができる。例えば、細胞または組織は、外科手術、生検（例えば、皮膚組織、肺組織、肝臓組織、脂肪組織の生検）、または血液などの生体液の収集により、単離してよい。いくつかの態様において、細胞は、骨髄から単離される。いくつかの態様において、細胞は、脂肪組織から単離される。いくつかの態様において、細胞は、脂肪吸引物から単離される。ex vivoでのトランスフェクションのために、脂肪組織から細胞を単離するための適切な方法は、当技術分野で知られている。例えば、Kuroda, M., et al., (2011), Journal of Diabetes Investigation, 2: 333-340；Kouki Morizono, et al. Human Gene Therapy. January 2003, 14(1): 59-66；およびPatricia A. Zuk, Viral Transduction of Adipose-Derived Stem Cells, Methods in Molecular Biology, 1, Volume 702, Adipose-Derived Stem Cells, Part 4, Pages 345-357を参照。
いくつかの態様において、単離された細胞は、幹細胞、多能性幹細胞、神経前駆細胞、脂肪吸引物由来幹細胞、肝臓の細胞（例えば、肝細胞）、造血幹細胞、間葉系幹細胞、間質細胞、造血細胞、血液細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、または他の適切な細胞を含む。いくつかの態様において、トランスフェクトされる細胞は、対象から単離された細胞から調製された、誘導多能性幹細胞である。

ある態様において、細胞または組織（単数または複数）は、細胞あたりのｒＡＡＶの少なくとも１０感染単位（ｉ．ｕ．）（例えば、１０、１００、１，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００またはそれ以上のｉ．ｕ．）の感染多重度（ＭＯＩ）で、または機能的に同等なウイルスのコピー数で、形質導入される。一態様において、細胞または組織（単数または複数）は、１０〜１０，０００ｉ．ｕ．のＭＯＩで、形質導入される。トランスフェクトされた細胞または組織（単数または複数）の対象への移入の経路としては、限定されないが、以下が挙げられる：皮下、膵臓内、鼻腔内、非経口、静脈内、血管内、筋肉内、髄腔内、脳内、腹腔内、または吸入による。いくつかの態様において、トランスフェクトされた細胞は、肝門静脈注射によって投与される。いくつかの態様において、トランスフェクトされた細胞は、血管内に投与される。ｒＡＡＶのex vivo投与の方法は、当技術分野においてよく知られている（例えば、Naldini, L. Nature Reviews Genetics (2011) 12, 301-315, Li、H. et al. Molecular Therapy (2010) 18, 1553-1558、およびLoiler et al. Gene Therapy (2003) 10, 1551-1558を参照）。

組み換えＡＡＶ組成物
ｒＡＡＶは、対象に対して、当技術分野で知られている任意の適切な方法に従って組成物中で送達されてよい。生理学的に適合性の担体中（例えば、組成物中）に懸濁することができるｒＡＡＶを、対象、例えば、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、七面鳥、または非ヒト霊長類（例えば、マーモセット、マカク）に投与してもよい。本発明の組成物は、ｒＡＡＶを単独で、または１もしくは２以上の他のウイルス（例えば、１または２以上の異なる導入遺伝子をコードする、有する、第２のｒＡＡＶ）と組合せて、含むことができる。

いくつかの態様において、比較的大型の霊長類における遺伝子サイレンシングを評価するために、アフリカミドリザルまたはその他の比較的大型霊長類において、実験が実施される。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−ＳＯＤ１）を発現するｒＡＡＶベクターを、かかる霊長類のＣＳＦに、ＩＴ注射で尾側、および大槽内注射で吻側の両方に注射する。
適切な担体は、ｒＡＡＶが指向される適応症の観点から、当業者によって容易に選択することができる。例えば、１つの適切な担体は、種々の緩衝液を用いて配合することができる、生理食塩水を含む（例えば、リン酸緩衝食塩水）。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、ゴマ油、および水が挙げられる。さらにその他のものも、当業者には明らかであろう。
任意に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（単数または複数）に加えて、保存剤または化学的安定剤などの他の従来の医薬成分を含有してもよい。好適な例示的保存剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学的安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。

所望の効果または「治療効果」を達成するために必要なｒＡＡＶビリオンの用量、例えば、ベクターゲノム／体重ｋｇにおける単位用量、（ｖｇ／ｋｇ）は、以下を含むがこれには限定されないいくつかの要因に基づいて変化する：ｒＡＡＶの投与経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子またはＲＮＡの発現のレベル、処置する特定の疾患または障害、および遺伝子またはＲＮＡ産物の安定性。当業者は、特定の疾患または障害を有する対象を処置するためのｒＡＡＶビリオンの用量範囲を、前述の要因、および当技術分野でよく知られている他の要因に基づいて、容易に決定することができる。ｒＡＡＶの有効量は、対象当たり、約１０^９〜１０^１６ゲノムコピーを含有する溶液の約１０μｌ〜１０ｍｌの範囲である。溶液の他の容量を使用してもよい。使用される容量は、典型的には、特に、対象のサイズ、ｒＡＡＶの用量、および投与経路に依存するであろう。例えば、静脈内投与に対して、１０μｌ〜１００μｌ、１００μｌ〜１ｍｌ、１ｍｌ〜１０ｍｌ、またはそれ以上の範囲の容量を使用してよい。いくつかのケースにおいて、対象あたり、約１０^１０〜１０^１２のｒＡＡＶゲノムコピーの投与量が適切である。いくつかのケースにおいて、ｒＡＡＶは、対象あたり、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５ゲノムコピーの用量で投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、１ｋｇあたり、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、または１０^１４ゲノムコピーの用量で投与される。

いくつかの態様において、ｒＡＡＶ組成物は、特に高いｒＡＡＶ濃度が存在する場合（例えば、〜１０^１３ＧＣ／ｍｌ以上）、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を低減するように製剤化される。ｒＡＡＶの凝集を低減するための方法は当技術分野で知られており、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整などを含む（例えばWright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178を参照、この内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
薬学的に許容し得る賦形剤および担体溶液の配合は、当業者に知られており、種々の処置計画において本明細書に記載の特定の組成物を使用するための、適切な投薬および処置計画の開発も同様である。典型的にこれらの製剤は、少なくとも約０．１％またはそれ以上の活性成分を含んでよく、ただし、活性成分（単数または複数）のパーセンテージは当然ながら変化させることができ、好都合には、全製剤の重量または体積の、約１または２％と、約７０％または約８０％またはそれ以上の間であってもよい。当然ながら、治療上有用な各組成物中の活性成分の量は、化合物の任意の所与の単位用量で、適切な投与量が得られるような方法で、調製され得る。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命、並びに他の薬理学的検討事項などの要因は、かかる医薬製剤を調製する当業者により考慮され、したがって、多様な投与量および処置計画が望ましい。

注射用途に適した医薬形態としては、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物ならびに油中に調製することができる。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。多くの場合において、形態は滅菌で、容易な注射可能性が存在する程度に流体である。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含む、溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤の、組成物における使用によって、もたらされ得る。

注射用水溶液の投与のために、例えば、必要に応じて溶液を適切に緩衝することができ、液体希釈剤は、十分な生理食塩水またはグルコースで最初に等張性にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用できる滅菌水性媒体は、当業者に知られている。例えば、１投与量を１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解して、１０００ｍｌの皮下液に添加するか、または注入の提案部位に注射することができる（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照）。投与量のいくらかの変化は、宿主の状態に応じて必然的に発生するであろう。投与責任者は、いずれにしても、個々の宿主のための適切な用量を決定するであろう。
滅菌の注射用溶液の調製は、必要量の活性ｒＡＡＶを、本明細書に列挙した種々の他の成分と共に適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することにより、行われる。一般に分散液は、様々な滅菌活性成分を、基本的な分散媒および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む、滅菌ビヒクルに組み入れることによって、調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これによって、活性成分に加えて、予め濾過滅菌した溶液からの任意のさらなる所望の成分の、粉末が生成される。

本明細書に開示されたｒＡＡＶ組成物はまた、中性または塩形態に製剤化することができる。薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、これらは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。製剤化の際に、溶液は、投薬製剤と適合する方法で、治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセルなどの種々の剤形で、容易に投与される。
本明細書で使用する場合、「担体」は、任意およびすべての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド、などを含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当技術分野で知られている。補助的な活性成分も、組成物に組み込むことができる。語句「薬学的に許容し得る」は、宿主に投与した場合に、アレルギー反応または同様の有害反応を生じない、分子実体および組成物を指す。

送達媒体、例えばリポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などは、本発明の組成物の、適切な宿主細胞への導入のために使用することができる。具体的には、ｒＡＡＶベクターが送達する導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化して、送達用に製剤化することができる。
かかる製剤は、本明細書に開示された核酸またはｒＡＡＶ構築物の薬学的に許容し得る製剤の導入のために、好ましい場合がある。リポソームの形成および使用は、一般に当業者に知られている。最近では、改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（米国特許第5,741,516号）。さらに、リポソームおよびリポソーム様製剤の、潜在的な薬物担体としての様々な方法が記載されている（米国特許第5,567,434号；第5,552,157号；第5,565,213号；第5,738,868号；および第5,795,587号）。

リポソームは、他の手順によるトランスフェクションに通常抵抗性である多くの細胞種に、成功して使用されてきた。さらにリポソームは、ウイルスベースの送達系に特有の、ＤＮＡ長の制約がない。リポソームは、遺伝子、薬剤、放射線治療剤、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターを、種々の培養細胞株および動物に導入するために、効果的に使用されてきた。さらに、リポソーム媒介性薬物送達の有効性を検査する、いくつかの成功した臨床試験が完了している。
リポソームは、水性媒体中に分散されたリン脂質から形成され、自発的に多重膜同心二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００〜５００オングストロームの範囲の直径を有し、コア中に水溶液を含有する小単層小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。

代替的に、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤を使用することができる。ナノカプセルは一般に、物質を安定かつ再現可能な方法で捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷による副作用を避けるために、かかる超微粒子（サイズ０．１μｍ前後）は、in vivoで分解することができるポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために意図される。
上述の送達方法に加えて、以下の技術も、ｒＡＡＶ組成物を宿主へ送達する代替方法として意図される。ソノフォレシス（例えば、超音波）が使用され、米国特許第5,656,016号において、循環系へと、また循環系を介した、薬物透過の率と有効性を高めるためのデバイスとして記載されている。意図される他の薬物送達の選択肢としては、骨内注入（米国特許第5,779,708号）、マイクロチップデバイス（米国特許第5,797,898号）、眼科用製剤（Bourlais et al., 1998）、経皮マトリックス（米国特許第5,770,219号および第5,783,208号）およびフィードバック制御送達（米国特許第No. 5,697,899号）である。

キットおよび関連組成物
本明細書に記載の組換え核酸、組成物、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶなどは、いくつかの態様において、医薬または診断または研究キットに組み込まれて、治療、診断または研究用途におけるそれらの使用を促進することができる。キットは、本発明の構成要素および使用説明書を収容する、１または２以上の容器を含んでよい。具体的には、かかるキットは、本明細書に記載の１または２以上の薬剤を、これらの薬剤の意図する用途および適切な使用を記載する使用説明書と共に、含んでもよい。特定の態様において、キット中の薬剤は、特定の用途および薬剤の投与方法に適した、医薬製剤および投与量であってよい。研究目的のためのキットは、成分を、種々の実験を実行するための適切な濃度または量で含んでいてもよい。

キットは、研究者による本明細書に記載の方法の使用を容易にするように設計されてもよく、多くの形態をとることができる。キットの各組成物は、適用可能な場合は、液体形態（例えば、溶液中で）、または固体形態（例えば、乾燥粉末）で提供されてよい。ある場合には、組成物のいくつかは、例えば、キットと共に提供されている場合もされない場合もある、適切な溶媒または他の種（例えば、水または細胞培養培地）を添加することにより、例えば、構成的であるか（constitutable）または他の方法で、（例えば活性型に）加工可能である。本明細書で使用する場合、「使用説明書」は、指示および／またはプロモーションの成分を定義し、典型的には、本発明のパッケージング上の、またはこれに関連した書面による、使用説明書を含むことができる。使用説明書はまた、ユーザーが明確に使用説明書がキットに関連することを認識するような任意の様式で提供される、任意の口頭または電子的な使用説明書を含むことができ、例えば、オーディオビジュアル（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネット、および／またはＷｅｂベースの通信などである。書面による使用説明書は、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態であってもよく、該使用説明書はまた、動物への投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映することができる。

キットは、１または２以上の容器中に、本明細書に記載の任意の１または２以上の成分を含んでよい。一例として、一態様において、キットは、キットの１または２以上の成分を混合し、および／または試料を単離および混合し、対象に対して適用するための使用説明書を含んでよい。キットは、本明細書に記載の薬剤を収容する容器を含んでいてもよい。薬剤は、液体、ゲルまたは固体（粉末）の形態であってもよい。薬剤は、滅菌的に調製し、注射器中に包装し、冷蔵出荷されてよい。代替的に、薬剤は、貯蔵のためにバイアルまたは他の容器内に収容されてよい。第２の容器は、滅菌的に調製された他の薬剤を有してよい。代替的に、キットは、予め混合されて注射器、バイアル、チューブ、または他の容器中で出荷される活性剤を、含んでよい。キットは、対象に薬剤を投与するために必要な、１または２以上またはすべての構成部品、例えば注射器、局所適用デバイス、またはＩＶ針のチューブおよび袋などを、有してよい。
本発明の例示的な態様を、以下の実施例にさらに詳細に説明する。これらの態様は本発明の例示であり、当業者は、本発明が例示的な態様に限定されないことを理解するであろう。

例１：Ｃ９ｏｒｆ７２発現の評価および標的化
Ｃ９ｏｒｆ７２を標的とするｍｉＲＮＡを送達する組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、開発された。
細胞株および正常なヒト脳におけるＣ９ｏｒｆ７２発現の評価：
ＷＴまたは変異型Ｃ９ｏｒｆ７２のいずれかを発現する、２種類の細胞株を使用した。８３のリンパ芽球様細胞株のセットを、Ｃ９ｏｒｆ７２のＧ_４Ｃ_２伸長が陽性である７８の家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）家系の患者から得た。また、以下を有する、継続的ＨＥＫおよびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株を生成した：
・エクソン１ａの上流の、２．０ｋｂのＣ９ｏｒｆ７２プロモーター、
・Ｇ_４Ｃ_２反復を含む介在イントロンを有する、エクソン１ａおよび１ｂ、および
・２．１ｋｂの続くイントロンおよびエクソン２、この開始コドンがルシフェラーゼを駆動する。
４つの下位株が、５０、９０、１６０および２００の反復のＧ_４Ｃ_２伸長を有するこれらの細胞株から生産された。線維芽細胞培養物は、Ｃ９ｏｒｆ７２Ｇ_４Ｃ_２伸長の症例からも得た。

Ｃ９ｏｒｆ７２の原理的（principle）転写産物を探索するために、ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはスプライスされたｍＲＮＡのいずれかを検出する、プローブおよびプライマーの系列を生成した。図１に示すように（上）、異なるｐｒｅ−ｍＲＮＡアイソフォームに対するTaqManプローブを開発した。１つのプローブであるＶ_ａｌｌはすべてのｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写物を検出し、一方他の２つ（Ｖ_１またはＶ_３）は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡアイソフォームＶ_１またはＶ_３を検出する。図１に示すように（下）、３つの異なるスプライスされたｍＲＮＡアイソフォームを検出するプライマー対が、生成された。Ｖ_１は、アイソフォームＢを検出し、一方プライマー対Ｖ_２とＶ_３は、アイソフォームＡの２つのバリアントを検出する。
図２に示すように、TaqManプライマーは、ＨＥＫ２９３およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびヒトの脳からの、３つの主要なｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写物を検出する。Ｖ_１とＶ_３についての転写レベルは、Ｖ_ａｌｌよりもかなり小さく、示されるように、脳およびこれらの細胞における主要な転写物が、Ｖ_２であることを示す。

細胞におけるｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびスプライスされたｍＲＮＡの発現の、マイクロＲＮＡ媒介性サイレンシング：
Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子を標的とするマイクロＲＮＡの、そのＲＮＡ転写物をサイレンシングする能力を評価した。Ｃ９ｏｒｆ７２のエクソン３におけるＯＲＦの塩基２２０〜２４１を標的とする、Ｃ９−ｍｉＲ２２０と称される人工マイクロＲＮＡを開発した。このｍｉＲＮＡはエクソン３に結合するため、ｍＲＮＡバリアントの全てを標的とすることが予想される。図３は、ヒトＣ９ｏｒｆ７２のin vitroでのｍｉＲＮＡ媒介性ノックダウンを示す。これらは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ｍｉｒ２２０（ＣＢＡプロモータ−ＧＦＰ）の一過性トランスフェクションの、３つの生物学的複製からの結果である。対照は、ＳＯＤ１に対するｍｉＲである。
ｍｉＲＮＡを、Ｕ６またはニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターのいずれかを使用して、２つの異なるプラスミドにクローニングした。これらのプラスミドを次に、Ｈｅｋ−２９３細胞にトランスフェクトした。７２時間後、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用し、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写物を検出するカスタムTaqManプローブまたはスプライスされたｍＲＮＡバリアントを検出するプライマーを用いて、転写物をアッセイした。図３および図４に示すように、Ｕ６またはＣＢＡプロモーターによって駆動されると、Ｃ９−ｍｉＲ２２０マイクロＲＮＡの両方の形態は、スプライスされたｍＲＮＡのレベルを約５０％低下させた。ｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写物のレベルは、ＣＢＡ−Ｃ９ｍｉＲ２２０マイクロＲＮＡにより〜６５％に低下し（例えば、〜３５％の減少）、一方Ｕ６−Ｃ９ｍｉＲ２２０は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのレベルを〜２５％に低下させた（例えば、〜７５％の減少）（図４参照）。これらの結果は、人工マイクロＲＮＡを用いた、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ両方のサイレンシングを実証する。

ＢＡＣトランスジェニックＧ_４Ｃ_２伸長を有するマウスモデルの生成：
Ｃ９ｏｒｆ７２媒介性ＡＬＳのマウスモデルを生成するために、細菌人工染色体（ＢＡＣ）を、〜５８０の反復および４５の反復のＧ_４Ｃ_２伸長を有するＡＬＳの患者の細胞から単離した。〜５８０の反復を有するＢＡＣは、Ｃ９ｏｒｆ７２のエクソン１〜６（Hg18 chr0:27,561,112-27,714,301）にまたがり、一方４５の反復を有するＢＡＣは、完全なコード配列にまたがる。これらのＢＡＣからの環状ＤＮＡを使用して、トランスジェニックマウスを作製した。４９の仔を５８０反復のＢＡＣから得て、このうち３匹は、ＰＣＲアッセイによりＧ_４Ｃ_２伸長について陽性であった。これら３匹のうち１匹は、生殖系列伝達を示し、良好に繁殖する子孫を生産した。導入遺伝子の持続的な伝達を有するこれらのマウスのコロニーを確立した。始祖は〜１４月齢までで、明白な運動ニューロン表現型はなかった。しかし、４および６月齢のＣ９ＢＡＣトランスジェニックマウスの脳は、顕著な特徴を示した。第１に、図５（レーンＥ）に示すように、ＢＡＣＣ９トランスジェニックマウスから単離されたゲノムＤＮＡのサザンブロットは、ほぼ４．５〜６．０ｋｂを走行する、密集した異種のバンドを明らかにする；これは、Ｇ_４Ｃ_２伸長を有する個体からの、リンパ芽球（Ａ）および脳（Ｂ）のＤＮＡを用いた結果とよく一致する。かかるバンドは、伸長なしの固体（レーンｃ）または非トランスジェニックマウス（Ｄ）の脳由来のＤＮＡでは明らかでない。第２の観察において、４および６月齢両方の５８０反復のＢＡＣＣ９トランスジェニックマウスからの海馬の切片の、Ｇ_４Ｃ_２−ＣｙＡプローブによる（センス鎖ＲＮＡを検出するため）プロービングは、残りの脳および脊髄全体にも存在する核内ＲＮＡ凝集体の豊富さを明らかにした。（図５、右側のパネルを参照）。これらは、「盲検」観察者によって検出された。海馬の対照／ＷＴマウスは、これらの凝集体を示さなかった。これらの結果は、以下を示す：（１）Ｇ_４Ｃ_２伸長を有するＢＡＣＣ９ｏｒｆ７２導入遺伝子の、安定した伝達；および（２）マウスが、ヒトＣ９ｏｒｆ７２媒介性ＡＬＳで見つかったセンス鎖ＲＮＡの核内沈着（deposit）を再現すること。これらの凝集体は、ＲＮＡｓｅでの処理後には検出されないことが決定されている。これらのＢＡＣトランスジェニックＣ９マウスは、核ＲＮＡ凝集体を有するため、Ｃ９ｏｒｆ７２からの転写物発現のサイレンシングの評価は、運動ニューロン疾患が不在であっても、凝集体の存在についてアッセイすることによって可能である。

マイクロＲＮＡの設計：
ｍｉＲＮＡのＡＡＶプラットフォームは、ｍｉＲ−１５５をベースにする。標的化配列とステムループを、Drosha／ＤＧＣＲ８複合体による効率的な認識および処理のために、ｍｉＲ−１５５隣接領域のコンテキスト内にクローニングする（図７）。ｍｉＲＮＡデザインは、５′末端にアデニンまたはウラシルのいずれかを有する、成熟した２１マーのｍｉＲＮＡのガイド配列を生成する。５′末端でのＵまたはＡの選択は、Ａｇｏ２の中間領域が成熟ｍｉＲＮＡの５′末端と相互作用し、これら２つの塩基に対して、シトシンおよびグアニンより２０倍高い親和性を有するという事実により、駆動される。この設計はまた、ＲＩＳＣ複合体へのガイド鎖の熱力学的取り込みを促進する。ｍｉＲＮＡは、低い第二級および第三級複雑性標的ｍＲＮＡの領域を標的とするように、設計される。これはＲＮＡフォールディングアルゴリズムを用いて行われ、標的部位におけるｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡ同族結合の可能性を高めることを目標とする。図７Ｂに示すように、ｍｉＲＮＡは次いで、ポリメラーゼＩＩまたはポリメラーゼＩＩＩプロモーターのいずれかからの、ＧＦＰと関心のｍｉＲＮＡを発現するＩＴＲを有する、プロウイルスプラスミドにクローニングする。選択的にバリアント１および３のいずれかを、またはすべてのバリアントを標的とする、８つのｍｉＲＮＡを、これらのプラスミドにクローニングした（表１参照）。

表１に示すように、潜在的なｍｉＲＮＡが同定され、ヘキサヌクレオチド反復にわたる領域についてクローニングされた。ｐｒｅ−ｍＲＮＡアイソフォームＶ_１およびＶ_３が標的とされたが、その理由は、これらがＧ_４Ｃ_２のヘキサヌクレオチド反復を包含しているためである；表１に示すように、ｍｉＲ−Ｃ９−２１および−４８は、Ｖ_１およびＶ_３を標的とすることが予想される。
さらに、すべてのバリアントを標的とするｍｉＲＮＡが使用された。ｍｉＲ−Ｃ９−２２０は、ｍＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍＲＮＡ種両方のin vitroでのノックダウンについて効果的である。特定の場合において、in vitroで４０〜５０％ノックダウン効率のｍｉＲＮＡは、ウイルスベクターを用いて達成された形質導入およびゲノムコピーの効率の増加により、翻訳してin vivoで８０％を超えるノックダウンを達成する。このｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのノックダウンによって決定されるように、核において機能する。核標的化は、ｍｉＲＮＡの３′末端の最後の３塩基を、同族ｍＲＮＡから脱標的化されるように修飾することによって、改善することができる。ｍｉＲＮＡがそのメッセージに１００％相補的でなく、３′末端で脱標的化される場合、該ｍｉＲＮＡは著しくより安定な複合体をＡｇｏ２と形成する。これは、ｍｉＲＮＡのＡｇｏ２複合体中の滞留時間を増加させ、それによって核移行の可能性を増加させる。表１で示したように、我々は、３′ミスマッチを有するｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−Ｃ９−２２０−３′ｍｍ）をクローニングし、これは、この活性を評価するために有用である。

Ｃ９ｏｒｆ７２のin vitroノックダウン：
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞およびＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、Jet Prime試薬を用いて、製造業者のプロトコルに従って一過性にトランスフェクトした。患者の線維芽細胞のトランスフェクションには、Nucleofactorエレクトロポレーター（Lonza AG）の初代線維芽細胞のためのプロトコルを使用する。細胞をトランスフェクションの４８時間後に収集し、ＲＮＡの単離を、Trizol試薬を用いて行う。次いで、ＲＮＡをＤＮＡｓｅで処理し（Turbo DNA-free kit, Applied Biosystems）、逆転写する（High Capacity RNA-to-cDNA kit, Applied Biosystems）。ｐｒｅ−ｍＲＮＡの検出ために、転写レベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲで定量化する（下の表２，３に記載のFast SYBR Greenマスターミックスおよびプライマーセット、Applied biosystems）。ｍＲＮＡ検出のために、転写物をＲＴ−ｑＰＣＲで定量化する（下の表に記載のTaqManマスターミックスおよびTaqManアッセイ、Applied Biosystems）。発現データは２^ΔΔＣｔによって分析する。

Ｃ９ｏｒｆ７２のｐｒｅ−ｍＲＮＡ検出用プライマーの設計：
２つのプライマーセットを、ｐｒｅ−ｍＲＮＡの検出のために設計した。第１のプライマーセット（Ｖ_ａｌｌ）はすべてのバリアントを検出するが、これは、プライマーがエクソン２と隣接するイントロンの間に位置しているためである。ｐｒｅ−ｍＲＮＡプライマーの第２のセット（Ｖ_１、Ｖ_３）は、バリアント１および３を検出する；プライマーは、エクソン１と隣接イントロンとの間に位置する（図１参照）。プライマー配列を以下の表に示す。

Ｃ９ｏｒｆ７２のｍＲＮＡ検出のための、プライマー−プローブ設計：
スプライスされたｍＲＮＡの検出のため、プライマー−プローブセットを使用した。各セットは、ＤＮａｓｅ消化を行うことなくゲノムＤＮＡから区別するために、エクソンの接合部にまたがる。Ｖ_１はバリアント１のみを検出する；プライマーおよびプローブセットは、エクソン１ａおよび３にまたがる。Ｖ_２は、エクソン２および３の接合部にまたがる。バリアント３を検出するエクソン３は、エクソン１ｂとエクソン３の接合部にまたがる。最後に、Ｖ_ａｌｌは、すべてのバリアントを検出する；このプライマープローブセットは、エクソン３と４（図１参照）の間のスプライス接合部にまたがる（図１参照）。TaqManプライマー−プローブ配列は、Life Technologiesを介し、以下の表のように発注した。

Ｇ_４Ｃ_２核内凝集体の蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）：
組織および患者の線維芽細胞におけるＧ_４Ｃ_２の検出は、４％ＰＦＡを用いて氷上で１０〜２０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、７０％エタノール中４℃で一晩インキュベートすることにより実施される。４０％ホルムアミド＋２×ＳＳＣを、室温で２０分間添加する。ハイブリダイゼーション緩衝液（２５０μｌ）は、ヘキサヌクレオチド伸長（Ｇ_４Ｃ_２）に特異的なＣｙ３プローブを用いて調製し、３７℃で２時間インキュベートし、次いで、４０％ホルムアミド＋１×ＳＳＣで、３７℃で３０分間洗浄し；続いて１×ＳＳＣで２回、ＲＴで１５分間洗浄する。次にスライドをマウントし、ＤＡＰＩ含有マウント培地と共にカバーする（図５、右パネル参照）。

Ｃ９ｏｒｆ７２の定量的リアルタイムＰＣＲ：
ＲＮＡは細胞からTrizolを用いて抽出し、逆転写した（High Capacity RNA-to-cDNA kit, Applied Biosystems）。標準的なプロトコルに従い、Ｃ９ｏｒｆ７２転写物レベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲにより、表２および３のFast TaqmanマスターミックスおよびTaqman（Applied Biosystems）を使用して定量した。相対定量を、２^{−ΔΔＣｔ}法を用いて決定した。
Ｇ_４Ｃ_２核内凝集体の定量化：
患者の線維芽細胞におけるＲＮＡ凝集体の出現頻度を、ランダムな顕微鏡撮影フィールドを６０倍で分析することにより、評価する。ＲＮＡ凝集体の自動計数を、ImageJソフトウェアでFishJアルゴリズムマクロを使用して実施する。

統計分析：
種々のプラスミドを用いたトランスフェクション後の、ｍＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍＲＮＡの両方についてのＣ９ｏｒｆ７２転写物の相対的発現を、２^{−ΔΔＣｔ}式を用いて分析する。対照（ＧＦＰ−スクランブル−ｍｉＲ）を実験（ＧＦＰ−Ｃ９−ｍｉＲ）と比較する、少なくとも３つの生物学的複製についての値を、統計的有意性のための２つの試料のｔ検定を用いて分析した。患者の線維芽細胞を含む実験における二次エンドポイントは、Ｇ_４Ｃ_２核内凝集体の平均の存在であった。凝集体データを、対照と実験のトランスフェクションを比較する少なくとも３つの生物学的複製についてのFishJデジタル画像解析から得て、これを再度、２つの試料のスチューデントｔ検定を用いて比較した。

例２：髄腔内送達された組換えアデノ随伴ウイルスＲｈ１０型（ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０−Ｃ９ｍｉＲ）の、マウスＣ９ｏｒｆ７２遺伝子からのｐｒｅ−ｍＲＮＡおよび成熟ｍＲＮＡの発現をサイレンシングすることにおける、in vivo有効性
抗Ｃ９ｍｉＲを発現する髄腔内送達されたｒＡＡＶ．Ｒｈ１０は、野生型マウスおよびＢＡＣ由来Ｃ９ｏｒｆ７２^{ｍｕｔａｎｔ}トランスジェニックマウスの両方においてＣ９ｏｒｆ７２ＲＮＡ転写物の中枢神経系レベルを減少させる。ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０−Ｃ９ｍｉＲの、Ｃ９ｏｒｆ７２および関連するＧ_４Ｃ_２転写物のレベルを抑制する有効性を、トランスジェニックマウスにおいて評価する。
プライマーＶ_１、Ｖ_２、Ｖ_３、およびＶ_ａｌｌを用いて、Ｃ９ｏｒｆ７２転写物を評価する。図８に示すように、Ｖ_１、Ｖ_２、およびＶ_３プライマーを使用するアッセイは、トランスジェニックマウスの転写物を検出し、一方Ｖ_ａｌｌプライマーは、マウスおよびヒトのＣ９ｏｒｆ７２の両方を検出する。
ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０−Ｃ９ｍｉＲの、Ｃ９ｏｒｆ７２のｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびスプライスされたｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させることに対する有効性を、野生型および当社のＣ９ｏｒｆ７２^{ｍｕｔａｎｔ}トランスジェニックマウスの両方を使用して評価する。ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０−Ｃ９ｍｉＲが、トランスジェニックマウスにおけるＲＮＡｉ凝集体の数を減少させる程度を、評価する。ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０−Ｃ９ｍｉＲが、ｃ９−ＲＡＮタンパク質［ポリ（Ｇ）、ポリ（ＧＡ）、ポリ（ＧＲ）］のレベルを低下させる程度もまた、評価する。

ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０−Ｃ９ｍｉＲを、野生型マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２^{ｍｕｔａｎｔ}トランスジェニックマウスに投与して、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２ｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびスプライスされたｍＲＮＡのノックダウンを評価する。図９に示すように、Ｃ９ｏｒｆ７２^{ｍｕｔａｎｔ}トランスジェニックマウスは、ＲＮＡ凝集体の存在を実証し、Ｃ９ｏｒｆ７２^{ｍｕｔａｎｔ}トランスジェニックマウスからのＣＮＳ組織は、ＲＡＮ翻訳ペプチドについて陽性の免疫染色を示す。したがって、凝集体およびＲＡＮ翻訳ペプチドの発生の変化を用いて、ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０−Ｃ９ｍｉＲ投与の有効性を評価する。ジペプチドレベルの低下は、例えば、サイレンシングの有効性の尺度として役立つ。
Ｃ９ｏｒｆ７２^{ｍｕｔａｎｔ}トランスジェニックマウスのｒＡＡＶ．Ｒｈ１０−Ｃ９ｍｉＲを用いて、Ｃ９−ｍｉＲが以下における低減を達成する程度を評価する：（１）ｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡレベル；（２）ＲＮＡ凝集体の数、および（３）ｃ９−ＲＡＮタンパク質［ポリ（Ｇ）、ポリ（ＧＡ）、ポリ（ＧＲ）］の産生。Ｇ_４Ｃ_２核内凝集体の蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、図５に示すように、処置ありおよびなしのマウスの脳および脊髄組織で実施する。
表４および５に概要を示すように、ｒＡＡＶｓを、新生仔および成体マウスの両方に注射する；前者には、静脈内送達を使用する；後者では、送達は髄腔内である。新生仔注射は、小容量のベクターで広範囲のＣＮＳ伝達を可能にする。髄腔内投与は、ＣＮＳへの形質導入に必要なウイルスの量を減少させ、ｒＡＡＶへの全身曝露を最小限にする。

新生仔末梢注射：
新生仔の注射のために、低体温を使用して、静脈内投与の前に動物を麻酔する。動物を、湿った氷のベッドの上に１〜３分間置き、次にＰ１について顔面静脈、およびｐ２８について尾静脈に注射し、その同腹仔と共にベッドに戻した。新生仔注射手順は、約５分を要する。

腰部髄腔内注射：
成体マウスを、導入チャンバーにおいてイソフルラン２．５％で麻酔する。眠った後、動物をノーズコーンに移して、連続的にイソフルランを投与する。マウスに、Ｃ９ｏｒｆ７２に対するｍｉＲをコードするベクターまたはスクランブル対照ｍｉＲを、用量：５×１０^１０ベクターゲノム／動物にて、５μｌの容量で投与する。この用量は、２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ（２５ｇｒのマウスを考慮）に相当する。髄腔内（ＩＴ）投与は、５０μｌのガラスLuer-hub Hamiltonシリンジに接続された３０ゲージ、０．５インチの滅菌使い捨て針を使用して実施する。注射部位は、Ｌ５とＬ６の間である。術後の痛みは、ＩＴ注射時および、２４〜４８時間後に動物が不快感であるように見える場合、ケトプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ、皮下）で管理する。

ＲＡＮ翻訳ペプチドの検出：
ポリ（ＧＰ）抗体に対して免疫陽性である細胞質封入体は、図９に示すように、Ｃ９ｏｒｆ７２^{ｍｕｔａｎｔ}トランスジェニックマウスの前頭皮質に存在する。Ｃ９ｏｒｆ７２^{ｍｕｔａｎｔ}トランスジェニックマウスが、他のＲＡＮ翻訳ペプチドを発現するかどうかを決定するため、およびＲＡＮ翻訳増加の程度が年齢と共に増加するかどうかを評価するために、ポリ（ＧＡ）、ポリ（ＧＲ）およびポリ（ＧＰ）ペプチドの発現を、複数の時点で、ウサギポリクローナル抗体を使用して検査する。これらの抗体は、その免疫原を特異的に検出し、かつＣ９ｏｒｆ７２反復伸長のセンスまたはアンチセンス転写物からＲＡＮ翻訳された他のペプチドと交差反応性を示さないものであり（図１０Ａ）、ｃ９ＦＴＤ／ＡＬＳ患者のＣＮＳ全体で、ニューロン封入体を検出する（図１０Ｂ）。
２、４、８、および１２月齢の時点で、脳および脊髄を、野生型およびトランスジェニックマウスから回収する。それぞれの脳を、矢状正中線を横切って二等分する：片半分は１０％ホルマリンで固定し、一方他の半分は、６領域（皮質、皮質下、海馬、中脳、脳幹および小脳）に切断して、凍結する。各脊髄は、４つの横断切片に切断する；切片１および３は固定し、切片２および４は凍結する。

免疫組織化学的研究のために、固定した脊髄および半脳をパラフィンに包埋し、切片にする（脳については矢状方向、脊髄については横方向）。切片は、ポリ（ＧＡ）、ポリ（ＧＲ）およびポリ（ＧＰ）抗体で、DAKO Envision＋HRP Systemと共にDAKO Autostainer（DAKO Auto Machine Corporation）を使用して、免疫染色する。さらに、ＲＡＮ翻訳ペプチドの封入体が、ヒトｃ９ＦＴＤ／ＡＬＳの脳の場合のようにニューロンのみに見られる程度を評価するために、二重免疫蛍光染色を、ＲＡＮ翻訳ペプチドおよび神経マーカーまたは星状細胞マーカーに対する抗体を使用して実施する。
ＲＡＮ翻訳ペプチドの発現レベルおよび、年齢依存的なペプチドの溶解度の変化を評価するために、凍結した脳および脊髄組織を連続抽出に供して、可溶性および不溶性タンパク質の画分を収集する。これらの画分を、ウエスタンブロットおよび定量的電気化学発光免疫測定法により、ポリ（ＧＡ）、ポリ（ＧＲ）またはポリ（ＧＰ）抗体を用いて試験する。

Ｃ９ｏｒｆ７２^{ｍｕｔａｎｔ}トランスジェニックマウスにおけるＲＡＮ翻訳ペプチドの発現に対する抗Ｃ９ｏｒｆ７２ｍｉＲＮＡの効果：
Ｃ９ｏｒｆ７２転写物の、ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０−Ｃ９ｍｉｒによるサイレンシングが、ポリ（ＧＰ）ペプチドおよびＣ９ｏｒｆ７２^{ｍｕｔａｎｔ}トランスジェニックマウスで発現される他のＲＡＮ翻訳産物の発現を減少させる程度を評価するために、マウスの脳および脊髄を、形質導入後の様々な時点で採取する。ＲＡＮ翻訳されたペプチドのＩＨＣ、ウエスタンブロットおよび免疫測定分析を、多数の封入体に対し、ならびに可溶性および／または不溶性のＲＡＮ翻訳ペプチドのレベルに対して実施する。

デジタル画像解析：
ＲＡＮ翻訳タンパク質凝集体の定量化：
ＲＡＮ翻訳タンパク質のＩＨＣ染色スライドの解析を、Aperio陽性の画素数計測画像解析プログラムを用いて実行する。スライド全体をAperioソフトウェアを使用してスキャンし、デジタル化する。解析は脳全体および脊髄切片について実施するが、ただし沈着した（precipitated）色素原などの染色のアーティファクトが指摘されない場合にのみ行う。これらの領域は、領域の輪郭を描くためのペンツールを使用して、解析から除外される。解析手順は、スペクトルソフトウェアを使用するバッチ処理のために提出されたすべての画像に対して実施する。このプロセスは、すべてのＩＨＣ染色スライドを、１つの標準陽性画素数計測アルゴリズムに供する。茶色の色素原の定量化のために使用されるデフォルトの設定は、３つの強度範囲（２２０〜１７５、１７５〜１００、および１００〜０）にある。染色されたが、陽性の色指定に分類されない画素は、陰性染色の画素と考えられる。これらの画素も同様に計測され、陽性画素の、陽性画素と陰性画素の総数に対する割合を決定する。陽性（％）データは、陽性画素数（培地および強陽性）／陽性画素と陰性画素の総数、として報告される。

Ｇ_４Ｃ_２核内凝集体の定量化：
ＲＮＡ凝集体の頻度を、小脳と脊髄の灰白質にわたる横断サンプリングによって評価する。顕微鏡視野を盲検オペレータによりランダムに選択し、油浸６０倍のレンズで撮影する。次いで画像中のＲＮＡ凝集体の自動計数を、ImageJソフトウェアのFishJアルゴリズムマクロを使用して実施する。

統計的考慮：
種々の構築物によるＡＡＶ送達後の、Ｃ９ｏｒｆ７２ｍＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写物の遺伝子発現の相対的変化の定量化を、２^{−ΔΔＣｔ}式を用いて分析する。統計的有意差決定のために、対照群（ＧＦＰ−スクランブル−ｍｉＲ）または（ＰＢＳ対照）の平均値を、実験群（ＡＡＶＲｈ−Ｃ９−ｍｉＲ）からの平均と、統計的有意差のため２標本ｔ検定を用いて比較する。トランスジェニックマウスの組織切片からのＲＮＡ核内凝集体およびＲＡＮ翻訳タンパク質についてのデジタル画像解析を、それぞれFishJおよびAperioソフトウェアによって定量化する。値は各動物について得られ、統計分析用の群に応じて平均化する（スチューデントｔ検定）。各群からの小脳および脊髄についてのデータを、個別に分析する。

例３：霊長類におけるＣ９ｏｒｆ７２のｍｉＲＮＡ標的化。
髄腔内送達後の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の中枢神経系における、ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０−Ｃ９ｍｉＲの評価およびＣ９ｏｒｆ７２転写物のサイレンシングの程度の評価。
髄腔内投与されたｒＡＡＶ．Ｒｈ１０−Ｃ９ｍｉＲが、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の脊髄、大脳および小脳全体に広がる程度を評価する。３種のｒＡＡＶ．Ｒｈ１０ベクターを、抗Ｃ９ｍｉＲＮＡをコードする発現構築物の送達用に調製する。ベクターは、髄腔内注射を介して送達される。ＡＡＶＲｈ１０の広がりおよび向性（tropism）ならびに、２つの異なるプロモーターからのＣ９−ｍｉＲの、サイレンシング有効性を、３週間にわたって評価する。コホートの1つには、ＧＦＰを駆動するポリメラーゼＩＩプロモーター（ハイブリッドニワトリβアクチンプロモーター）からのｍｉＲＮＡを発現するベクターを注入する。別のコホートには、ＧＦＰ発現を駆動するハイブリッドニワトリβアクチンプロモーターの上流に配置されたＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターからｍｉＲＮＡが発現される、バイシストロニックベクターを投与する（図７Ｂ）。第３のコホートは、ＧＦＰのみを受領する対照である（下記の表７を参照）。ＲＴ−ｑＰＣＲを、マイクロダイセクションによりレーザーキャプチャーされた運動ニューロンから得られたＲＮＡに対して実施する。使用されるベクターの用量は、強固な皮質および脊髄伝達を示す、ＮＨＰ研究におけるＩＴｒＡＡＶ送達に基づく。

ＧＦＰをコードしないｒＡＡＶ．Ｒｈ１０−Ｃ９−ｍｉＲベクターを使用して、マーモセット（例えば、４つの対照群および４つの処置群）におけるｒＡＡＶ．Ｒｈ１０のウイルス送達の長期安全性を調査する。生存中のエンドポイントは、詳細な身体検査、詳細臨床観察、体重、血液の標準的な血液学的および化学的パラメータ、ＡＡＶＲｈ１０に対する血清抗体の評価、ＡＡＶペプチドへのＴ細胞応答、ならびに体液および排泄物におけるベクターの脱落の程度を含む。死後のエンドポイントは、剖検観察、臓器重量および病理組織学的検査、血液および組織のｒＡＡＶ．Ｒｈ１０−Ｃ９−ｍｉＲベクターＤＮＡ量を含む（表９）。また、Ｃ９ｏｒｆ７２のｍｉＲサイレンシングの程度を、本明細書に開示した方法を使用して評価する。

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション：
１２ｍｍの腰部脊髄凍結切片を、ＰＥＮ膜スライド（Zeiss, Munich, Germany）上に収集し、メタノール中の１％クレシルバイオレット（Sigma, St. Louis, MO）で染色する。切片を空気乾燥し、−８０℃で保存する。解凍後、運動ニューロンを、染色から３０分以内に、レーザーキャプチャーマイクロダイセクターPALM Robo3（Zeiss）を使用し、次の設定を用いて収集した：カットエネルギー：４８、ＬＰＣエネルギー：２０、カットフォーカス：８０／８１、ＬＰＣフォーカス：１、ポジション速度：１００、カット速度：５０。約５００のＭＮを、動物ごとに収集する。前角（腹角）の非神経細胞を、運動ニューロンを採取した後に同じ切片から収集する。ＲＮＡは、その後、RNaqueous Micro Kit（Ambion, Grand Island, NY）を使用し、製造者の指示に従って単離する。

ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０キャプシドに応答したインターフェロンガンマElispot：
ＩＴ送達後のｒＡＡＶ．Ｒｈ１０に対する免疫応答を特徴づけるために、プールされたｒＡＡＶ．Ｒｈ１０キャプシドペプチドに対するリンパ球増殖を、ELISPOTアッセイを用いて評価する。種々の時点で採取した血液を、標準のFicoll-Paque（商標）Plusプロトコルを使用して処理し、末梢血単核細胞を得る。ＰＢＭＣをウェルあたり２×１０^５細胞の濃度で、ＩＦＮ−γ捕捉抗体でコーティングしたプレートに添加する。ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０による抗原特異的刺激を１８〜２４時間実施し、その後細胞を完全に洗浄する。この後、検出抗体と、続いて比色読み取りに適した基質で開発されたアビジンＨＲＰを添加する。
ＡＡＶ中和抗体アッセイ：
ＡＡＶ中和抗体の存在を、適切な技術を使用しベクターコア研究室において評価する。

例４：ＳＯＤ１発現の評価および標的化：
ｒＡＡＶベクターのトランスジェニックマウスへの送達
ＳＯＤ１に対するｍｉＲＮＡ（図１１Ａ〜Ｃを参照）をin vivoまたはin vitroで細胞に送達する、組換えアデノ随伴ウイルスベクターを開発した。ｒＡＡＶベクターの、ＳＯＤ１の突然変異型を発現するトランスジェニックマウスへの送達は、形質導入された組織中の標的ｍＲＮＡの８０〜９０％のノックダウンをもたらした（図１２）。例えば、抗ＳＯＤ１（ｍｉＲ）が、マウス肝臓におけるＳＯＤ１の発現をサイレンシングすることが、図１３に示すように決定された。
これらの実験のために、ｒＡＡＶベクターを、３種類の構築物と共に用いる：（ａ）ニワトリβアクチン（ＣＢ）駆動ＧＦＰと、続いてタンデム抗ＳＯＤ１ｍｉＲ（ｍｉｒ１２７）；（ｂ）Ｕ６プロモーター駆動ｍｉＲ−ＳＯＤ１と、続いてＣＢ−ＧＦＰ；および、対照としてＣＢ−ＧＦＰのみ。図１３（上パネル）は、これらの構築物の概略図を示す。

ＳＯＤ１発現を減衰するためのマイクロＲＮＡを保有する、髄腔内送達されたｒＡＡＶ９は、ＳＯＤ１^Ｇ９３ＡトランスジェニックＡＬＳマウスの生存を延長することが決定された。６０日齢のマウスの腰部髄腔内空間に注入された２．４×１０^１０ウイルスゲノム／５ｕｌは、マイクロＲＮＡの、複数の細胞型への脊髄に沿った広範囲の送達を達成した。（この用量は、我々のＩＶ送達に使用される用量の〜１／１６である）。高度に形質導入された動物において、ウエスタン免疫ブロッティングにより評価されるように、〜５０％のＳＯＤ１発現の減少が観察された。また、全体で〜１４日の生存の延長、および最高レベルのＳＯＤ１サイレンシングを有するマウスにおいて１６０日を超える生存の延長が、観察された（ｒＡＡＶ９スクランブルされたマイクロＲＮＡで処置されたＡＬＳマウスにおける１２３日と比較して）。これらの結果は、Ｃ９−ｍｉＲ２２０が、げっ歯類および非ヒト霊長類において、ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０を用いて、脊髄の長さに沿って投与可能であることを示す。
図２０は、Ｇ９３ＡＳＯＤ１マウスのＣＢ−ｍｉＲ−ＳＯＤ１による処置が、対照動物と比較して、生存率を顕著に増加させることを示す。Ｇ９３ＡＳＯＤ１マウスに、ＣＢ−ＧＦＰまたはＣＢ−ｍｉＲ−ＳＯＤ１−ＧＦＰの２×１０^１２ゲノムコピー（ｇｃ）を、５６〜６８の日齢で注射し、進行した麻痺のために安楽死が必要となるまで、盲検的にモニタリングした。生存期間の中央値は、対照動物について１０８日であり（ＣＢ−ＧＦＰ、ｎ＝１９）、ＣＢ−ｍｉＲ−ＳＯＤ１−ＧＦＰについて１３０日であった（ｎ＝２８）。ログランク検定結果は０．０１８のｐ値をもたらし、生存率の増加が統計的に有意であることを示唆する。これらのデータはさらに、静脈内注射によるｍｉＲ−ＳＯＤ１の全身送達が、Ｇ９３ＡＳＯＤ１マウスの生存率の有意な増加をもたらすことを示す。

例５：霊長類におけるＳＯＤ１のｍｉＲＮＡ標的化：
ＳＯＤ１ｍｉＲＮＡを発現する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の脳および脊髄への髄腔内送達。
マイクロＲＮＡのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達を用いて、脊髄を含む哺乳動物の組織において、ＳＯＤ１をサイレンシングした。
図６に示すように、成体マーモセットへのｒＡＡＶ．Ｒｈ１０．ＥＧＦＰの髄腔内投与は、運動ニューロン（そのサイズと位置によって識別される）の顕著な標識付けと共に、（Ａ）腰仙部および（Ｂ）子宮頸前方の角の両方の、灰白質の著しい取り込みをもたらした。レーザーキャプチャー腰仙運動ニューロンは、このマーモセット（ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０．ＥＧＦＰで処置）から、および、ｍｉＲをサイレンシングするＳＯＤ１を発現する、ｒＡＡＶ．Ｒｈ１０．Ｕ６−ｍｉＲ−ＳＯＤ１で処置した別のマーモセットから得た。図６（下）に示すように、対照動物は、ＳＯＤ１転写物の高いレベルおよび最小の（実質的に０ベースライン）ｍｉＲ−ＳＯＤ１を示した。これとは対照的に、処置された動物において、転写物はほとんど検出されず、一方で高レベルのｍｉＲ−ＳＯＤ１マイクロＲＮＡが存在した。

これらの構築物を、ＡＡＶの新しい株であるＲｈ１０．ＡＡＶの髄腔内送達を用いた、９匹のマーモセットで行われた研究で使用した。設計の詳細を、図１４に示す。特定の例において、これらのサルにおけるＩＴ注射は、針の挿入と共に、テールフリックおよび硬膜の「ポップ（pop）」をもたらした。他では、針の配置は、観察できるテールフリックをもたらさなかった。両方の場合において、ＡＡＶのＣＳＦへの良好な送達があった。これらの点を、図１５に示す。動物は、３．５〜４週後に屠殺した。図１５中の表が示すように、３匹の動物は固定剤（ＰＦＡ）で、および６匹は生理食塩水で灌流した。後者のうちの３匹は、「良好な」注入を有し、運動ニューロンのレーザーキャプチャーのために、および運動ニューロンにおけるｍｉＲおよびＳＯＤ１レベルのアッセイに使用した。
図１６に示すように、レーザーキャプチャーの後、対照ＣＢ−ＧＦＰで形質導入したＭＮは、ｑＰＣＲでの測定により高レベルのＳＯＤ１を示し、ｍｉＲ−ＳＯＤ１は示さなかった。Ｕ６−ｍｉＲ−ＳＯＤ１およびＣＢ−ｍｉＲ−ＳＯＤ１で形質導入したＭＮは、ＳＯＤ１発現のサイレンシングを示した。Ｕ６構築物は、より多くのｍｉＲを産生した；その動物において、ＳＯＤ１発現はより少なかった。図１７Ａ〜Ｂは、結果を脊髄の３つの領域に拡張したものである（腰髄、胸部（thora）、およびレーザーキャプチャーＭＮと、ＭＮ切除後のコード（cord）の残りの組織（非ＭＮ）の両方で、サイレンシング検査する）。組織の両方のセットにおいて、ＳＯＤ１サイレンシングの証拠が存在する。図１８は、組織ホモジネートでｑＰＣＲを用いて評価された、脳幹におけるサイレンシングを示す。

図１９は、ＲＮＡハイブリダイゼーション（「RNAScope」）を使用して、単一の運動ニューロンにおいて、ｍｉＲ−ＳＯＤ１の（この場合はＵ６構築物からの）発現が、ＳＯＤ１発現の欠如と相関し、一方ＣＢ−ＧＦＰのみを形質導入したＭＮでは、十分なＳＯＤ１発現が存在することを実証する。まとめると、これらのデータは、ｍｉＲ−ＳＯＤ１試薬がＩＴ注射後の脊髄に送達され、ＳＯＤ１の実質的なサイレンシングを達成することを実証する。
本発明の少なくとも１つの態様のいくつかの側面をこのように説明したが、当業者には容易に、様々な変更、修飾、および改良が想起されるであろうことを理解されたい。かかる変更、修飾、および改良は、本開示の一部であることが意図され、また本発明の精神および範囲内にあることが意図される。したがって、前述の説明および図面は単なる例示であり、本発明は、以下の特許請求の範囲により詳細に記載される。

本明細書で使用する場合、数値を参照しての用語「約」または「およそ」は、他の記載があるかまたは文脈からその他が明らかでない限り、一般に、その数値の両方向（これより大またはこれより小）の１％、５％、１０％、１５％、または２０％の範囲内の数値を含むと解釈される（ただしかかる数値が、可能な値の０％未満または１００％を超える場合は除く）。
請求項において、請求項の要素を修飾するための「第１」、「第２」、「第３」等の序数用語の使用は、それ自体いかなる優先度、序列、または１つの請求項要素の別のものに対する順位、または方法の行為が実施される順序を意味せず、１つの名称を有する請求項要素を、同一名称を有する別の要素（ただし序数用語のみ異なる）から区別するための、単なる標識として使用される。
本明細書に引用される全ての参考文献、刊行物、抄録、およびデータベースエントリの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims

細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２の発現を阻害する方法であって、
該細胞に対し、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子によってコードされるｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方を標的とする阻害性核酸を送達すること、
を含む、前記方法。
細胞が、最大５０、最大９０、最大１６０、または最大２００の反復のＧ_４Ｃ_２伸長を有するＣ９ｏｒｆ７２１を発現する、請求項１に記載の方法。
細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２のアイソフォームＢをコードするｍＲＮＡのレベルが、細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２タンパク質のアイソフォームＡをコードするｍＲＮＡのレベルよりも高い、請求項１に記載の方法。
細胞が、中枢神経系の細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
細胞がニューロンである、請求項４に記載の方法。
阻害性核酸に曝露される前に、細胞が、核内Ｇ_４Ｃ_２凝集体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
阻害性核酸の細胞への送達が、核内Ｇ_４Ｃ_２凝集体の減少をもたらす、請求項６に記載の方法。
阻害性核酸に曝露される前に、細胞が、Ｃ９ＲＡＮタンパク質を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
阻害性核酸の細胞への送達が、Ｃ９ＲＡＮタンパク質レベルの低下をもたらす、請求項８に記載の方法。
細胞がin vivoである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
細胞がin vitroである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、ＦＴＤまたはＡＬＳの１または２以上の症状を有する対象のものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
細胞が、ＦＴＤまたはＡＬＳを有する疑いのある対象のものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
対象の中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＣ９ｏｒｆ７２発現を阻害する方法であって、
対象のＣＮＳに対して、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子によってコードされるＲＮＡを標的とする阻害性核酸を投与することを含み、ここで該阻害性核酸がマイクロＲＮＡである、前記方法。
対象の中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＣ９ｏｒｆ７２発現を阻害する方法であって、
対象のＣＮＳに対して、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子によってコードされるｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方を標的とする阻害性核酸を投与すること、
を含む、前記方法。
阻害性核酸がマイクロＲＮＡである、請求項１５に記載の方法。
阻害性核酸を対象に投与するステップが、対象に対して、対象の細胞において阻害性核酸を発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
ＦＴＤまたはＡＬＳを有するか、または有することが疑われる対象を処置する方法であって、
対象の細胞においてＣ９ｏｒｆ７２遺伝子によりコードされるｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方を標的とする阻害性核酸を発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の有効量を投与すること、
を含む、前記方法。
ｒＡＡＶが、ＣＮＳ組織を標的とする、請求項１７または１８に記載の方法。
ｒＡＡＶが、ＡＡＶ．Ｒｈ１０またはＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む、請求項１７、１８または１９に記載の方法。
阻害性核酸が、Ｃ９ｏｒｆ７２のエクソン３内の少なくとも５個の連続したヌクレオチドに相補的な相補性領域を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも５個の連続したヌクレオチドが、Ｃ９ｏｒｆ７２のヌクレオチド２２０〜２４１内にある、請求項２１に記載の方法。
阻害性核酸が、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質のアイソフォームＡをコードするｍＲＮＡおよびアイソフォームＢをコードするｍＲＮＡを標的とする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
阻害性核酸が、Ｃ９ｏｒｆ７２バリアントＶ１（配列番号１８）、Ｖ２（配列番号１９）、およびＶ３（配列番号２０）を標的とする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
阻害性核酸が、Ｃ９ｏｒｆ７２バリアントＶ１（配列番号１８）およびＶ３（配列番号２０）を標的とするが、Ｖ２（配列番号１９）を標的としない、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
阻害性核酸が、Ｃ９ｏｒｆ７２バリアントＶ１（配列番号１８）を標的とするが、Ｖ２（配列番号１９）およびＶ３（配列番号２０）は標的としない、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
阻害性核酸が、細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２のｍＲＮＡのレベルを少なくとも５０％低下させる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
阻害性核酸が、細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２のｐｒｅ−ｍＲＮＡのレベルを少なくとも５０％低下させる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
阻害性核酸が、配列番号１〜８のいずれかに示された配列の、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
ｒＡＡＶが、髄腔内、脳内、脳室内または静脈内に投与される、請求項１３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
細胞におけるＳＯＤ１の発現を阻害する方法であって、
細胞に対して、ＳＯＤ１ｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡを送達することを含み、ここで該ｍｉＲＮＡが、
配列番号１５：ＡＧＣＡＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１０３）；
配列番号１６：ＧＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１１７）；または
配列番号１７：ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１２７）、
に示された配列の、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の連続したヌクレオチドを含む、
前記方法。
ＡＬＳを有するか、または有することが疑われる対象を処置する方法であって、
対象に対して、対象の細胞においてＳＯＤ１遺伝子によりコードされるＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡを発現するように操作された核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の有効量を投与することを含む、
前記方法。
ｍｉＲＮＡが、
配列番号１５：ＡＧＣＡＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１０３）；
配列番号１６：ＧＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１１７）；または
配列番号１７：ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１２７）、
に示された配列の、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の連続したヌクレオチドを含む、請求項３２に記載の方法。
ｒＡＡＶが、ＣＮＳ組織を標的とする、請求項３２または３３に記載の方法。
ｒＡＡＶが、ＡＡＶ．Ｒｈ１０またはＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む、請求項３４に記載の方法。
配列番号１〜８のいずれかに示された配列を含む、合成マイクロＲＮＡ。
配列番号１５：ＡＧＣＡＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１０３）；配列番号１６：ＧＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１１７）；または配列番号１７：ＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴ（ＳＯＤ−ｍｉＲ−１２７）に示された配列を含む、合成マイクロＲＮＡ。
ｍｉＲ−１５５の隣接領域をさらに含む、請求項３６または３７に記載の合成マイクロＲＮＡ。
請求項３６〜３８のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡをコードし、ＡＡＶ血清型の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、組換え核酸。
ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲｈ１０、ＡＡＶ１１およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項３９に記載の組換え核酸。
マイクロＲＮＡをコードする領域（単数または複数）に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項４０に記載の組換え核酸。
プロモーターが、組織特異的プロモーターである、請求項４１に記載の組換え核酸。
プロモーターが、βアクチンプロモーターなどの、ポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項４２に記載の組換え核酸。
プロモーターが、Ｕ６プロモーターなどの、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項４２に記載の組換え核酸。
請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の組換え核酸を含む、組成物。
請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の組換え核酸を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．Ｒｈ１０、ＡＡＶ１１およびそのバリアントからなる群から選択される１または２以上のＡＡＶ血清型の、１または２以上のキャプシドタンパク質をさらに含む、請求項４６に記載の組換えＡＡＶ。
請求項４６または４７の組換えＡＡＶを含む、組成物。
薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項４８に記載の組成物。
請求項４８または４９の組成物を収容する容器を含む、キット。