JP3943048B2 - 組織の細胞ｄｎａからの組込みウイルスの直接レスキュー及び増幅の方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
パルボウイルス科のメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７〜６ｋｂ(Ｍｒ．１．５−２．０ｘ１０６)の一本鎖線状ＤＮＡゲノムを有する小型のエンベロープの無い正二十面体ウイルスである。ＡＡＶは、精製されたアデノウイルスストックにおける汚染物(contaminant)として発見されたのでディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に特定される。ＡＡＶの生活環は、ＡＡＶゲノムが感染後に宿主染色体に部位特異的に組込まれる潜伏期及びアデノウイルスもしくは単純ヘルペスウイルスのいずれかの重複感染後に、組込みゲノムを続いてレスキューし、複製し、そして感染性ウイルスにパッケージングする増殖もしくは生産期を含む。単純なゲノム構造、非病原性、非分裂細胞を包含する、感染性についての広い宿主範囲、及び潜在的な部位特異的染色体組込みの特性は、ＡＡＶを遺伝子導入の魅力的な手段にする。最近の研究は、ＡＡＶベクターが安定な遺伝子発現を得るための好ましい媒体であり得ることを示唆する。
【０００２】
【従来の技術】
現在まで、ＡＡＶの６種の異なる血清型（ＡＡＶ１−６）が、ヒトもしくは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され、十分に特性化され、そして遺伝子導入用途のベクターとされている。これらの全ては、霊長類及び非ヒト霊長類起源の汚染されたアデノウイルス調製物もしくは組織検体のいずれかから感染性ウイルスとして単離されている。これらの中で、ＡＡＶ１及びＡＡＶ４は非ヒト霊長類から単離され；ＡＡＶ２、３及び５はヒトから得られ、そしてＡＡＶ６はヒトアデノウイルス調製物の汚染物であった。
【０００３】
核に侵入し、宿主に組込みそしてヘルパーウイルス共感染なしに潜伏感染を確立するＡＡＶの能力を利用して、最近、我々は、非ヒト霊長類起源の異なる組織から調製した細胞ＤＮＡからの新規なＡＡＶの配列の単離のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法を考案した。この方法を用いて、我々は少なくとも１６分子タイプ及び８分子サブタイプの新規なＡＡＶを単離し、遺伝子導入用途におけるそれらの効率を評価するためにそれらの二つに関して組換えウイルスを作製した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
細胞源からＡＡＶビリオンを同定及び単離する信頼できる方法の必要性が依然として当該技術分野にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、細胞ＤＮＡを細胞にトランスフェクションし、ウイルスをレスキューし、そしてアデノウイルスヘルパー機能の存在下で連続継代によってウイルスを増幅することにより組織の細胞ＤＮＡから新規なＡＡＶウイルスを単離する独特な方法を提供する。この方法は、組織、特に非ヒト霊長類（ＮＨＰ）及びヒト組織から新規なＡＡＶ及び他のヘルパー依存性組込みウイルスを単離する非常に有用なそして実用的な手段である。
【０００６】
本発明のこれら及び他の特徴は、以下の本発明の詳細な記述から容易に明らかである。本明細書及び請求項の全体にわたって使用する場合、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語及びとりわけ「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなっている」を包含するその変形には、他の成分、要素、整数、工程などが含まれる。「からなる」もしくは「からなっている」という用語は、他の成分、要素、整数、工程などを除く。
【０００７】
【発明の実施の形態】
一つの態様として、本発明は、ヒトもしくは非ヒト組織からの細胞ＤＮＡからの組込みウイルスもしくは非ウイルス配列の直接レスキューの方法を提供する。
【０００８】
該方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のようなヘルパーに依存する組込みウイルスのレスキューにおける使用に特によく適している。例えば、最近単離された新規なＡＡＶ血清型を用いて、本発明の方法は非常にうまく機能することが示された。ＡＡＶ８配列及びｒｅｐ／ｃａｐタンパク質発現は、トランスフェクション及び連続継代後に２９３細胞において劇的に増幅された。しかしながら、本明細書における実施例は、新規なＡＡＶ血清型のレスキュー及び増幅を示すが、本発明の方法は、既知及び未知のＡＡＶ血清型の両方、並びに宿主細胞のゲノムに組込む他のウイルス及び非ウイルス配列に容易に適用できる。そのような他のウイルス配列には、とりわけ、レトロウイルス［例えば、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩＩ］、及びレンチウイルス亜科［例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス及びスプマウイルス亜科］が包含される。本発明の方法の他の適当な使用は、当業者に容易に明らかである。
【０００９】
本明細書において用いる場合、サンプルは核酸を含有する任意の起源、例えば、組織、組織培養物、細胞、細胞培養物、充実性腫瘍、及び限定なしに尿及び血液を包含する生物学的流体である。これらの核酸配列は、プラスミドからのＤＮＡもしくはＲＮＡ、細菌、酵母、ウイルス、及び植物もしくは動物のような高等生物を包含する任意の起源からの天然のＤＮＡもしくはＲＮＡであることができる。一つの望ましい態様として、細胞は非ヒト霊長類もしくはヒト起源からである。しかしながら、様々な哺乳動物及び非哺乳動物種からの細胞もまた利用することができる。サンプルの起源及び本発明の方法の適用のために核酸を得る方法は、本発明の制約ではない。場合により、本発明の方法は、ＤＮＡの起源に対して直接、もしくはある起源から得られる（例えば抽出される）核酸に対して行うことができる。
【００１０】
細胞ＤＮＡは、様々な通常の技術のいずれかを用いて細胞源から抽出する。ＤＮＡもしくはＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により記述されているもののような、当業者に既知である様々な技術によりサンプルから抽出する。
【００１１】
サンプルからのＤＮＡは、標的組込み外来ＤＮＡ（例えばＡＡＶ）を切断せずに宿主生物に固有のゲノムＤＮＡを優先的に切断するように選択された制限酵素の存在下でインキュベーションする。
【００１２】
典型的に、標的組込み外来ＤＮＡ（例えばＡＡＶ）の量は、サンプルにおける宿主ＤＮＡの量と比較してわずかである。従って、この消化工程は、ＡＡＶを損なわずに保ちながら、細胞サンプルにおける宿主ＤＮＡの複数フラグメントへの消化をもたらす。望ましくは、宿主ＤＮＡ及び使用する任意のヘルパーウイルスにおける複数の認識部位を含有するが、標的ＡＡＶゲノム（もしくは他の標的組込みＤＮＡ）における最低限の数の認識部位のみを含有する制限酵素を選択する。最も望ましくは、選択する制限酵素は、標的組込みＤＮＡにおけるいかなる認識部位も含有しない。本願において、そのような制限酵素はレアカッター（ｒａｒｅ ｃｕｔｔｅｒ）と称する。そのようなレアカッターの例には、例えば、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｓｒＩ、ＢｃｇＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａｂＩ、ＢｓｔＸＩ、ＤｒｄＩ、ＥｃｏＮＩ、ＦｓｅＩ、ＭａＭＩ、ＭｓｌＩ、ＭｗｏＩ、ＰｓｈａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｗａＩ、ＸｃｍＩ及びＸｍｎＩなどを包含する、７、８もしくはそれ以上の塩基の認識部位を有するものが包含される。適当なレアカッターは、文献においてそして様々なオンラインデータベース、例えばＲＥＢＡＳＥＴＭデータベースにおいて当業者が容易に利用できる情報を用いて同定することができる。例えば、標的組込みＤＮＡがＡＡＶ血清型８である場合の本発明の方法における使用に適当なレアカッターには、例えばＰｍｅＩが包含される。本発明の方法のための他の適当なカッターは、様々なコンピュータープログラム及び／もしくはオンラインデータベースを用いて容易に決定することができる。適当な制限酵素は、とりわけ、例えば、Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｏｂｉｏｇｅｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｈｅ、ＢＢ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａを包含する様々な商業供給元から入手できる。
【００１３】
いったん適切なサンプル及び消化酵素を選択すると、通常の消化技術を利用する。典型的には、制限酵素と混合したＤＮＡのサンプルを約１２〜約４８時間インキュベーションする。この後、通常のフェノール／クロロホルム抽出工程を行う。例えば、フェノール／クロロホルム抽出を利用し、続いてエタノールで沈殿させ、そして沈殿物を方法工程の残部における使用のために（例えばＴＥもしくは別の適当なバッファーに）溶解することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，５．２８−５．３２，Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｅ．３−Ｅ．４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）を参照。他の適当な方法は、利用する制限酵素の製造業者もしくは販売者により提供されることができるか、もしくはそうでなければ当業者に既知である。
【００１４】
サンプルにおける細胞ＤＮＡを消化した後、消化したＤＮＡを通常の技術を用いて適当な細胞にトランスフェクションする。好適には、消化したＤＮＡを、細胞においてトランスフェクションされる細胞ＤＮＡの濃度を最大にするようにトランスフェクションする。例えば、これは５０〜８０％の密度の細胞で５ｘ１０５細胞当たり約０．２μｇ〜約２μｇのＤＮＡの量であることができる。しかしながら、これらの量は、とりわけ、細胞プレートのサイズ及び細胞タイプを考慮に入れて、必要もしくは所望に応じて調整することができる。
【００１５】
宿主細胞自体は、原核（例えば細菌）細胞、並びに昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を包含する真核細胞を包含する任意の生物学的生物の中から選択することができる。宿主細胞は、ＤＮＡの感染もしくはトランスフェクション及びトランスフェクションしたＤＮＡの発現が可能である。特に望ましい宿主細胞は、限定なしに、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（これは機能性アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、並びにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ及びハムスターを包含する哺乳動物から得られる一次（ｐｒｉｍａｒｙ）繊維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞のような細胞を包含する任意の哺乳動物種の中から選択する。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明の制約ではなく；また哺乳動物細胞のタイプ、すなわち、繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などもそうではない。
【００１６】
好適には、ＡＡＶの単離及び増幅のために、細胞はＡＡＶの複製に必要なヘルパー機能を含有するかもしくは提供される。これらのヘルパー機能には、少なくとも、アデノウイルスからのＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、及びＶＡＩ ＲＮＡ機能が包含される。例えば、１９９９年９月２３日に公開されたＷＯ ９９／４７６９１；ＲＭ Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５：７９３−８０１（１９９４）；１９９９年４月１日に公開されたＷＯ ９９／１５６８５を参照。さらに、場合により、ヘルパーＡＡＶ機能を供給することができ、そしてこれはサンプルにおけるＡＡＶの低コピー数が推測される場合に望ましい。
【００１７】
アデノウイルスにより提供されるヘルパー機能は、野生型アデノウイルスにより供給することができ、そしてヒトもしくは非ヒト起源、好ましくは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）起源であることができる。Ａｄ５型［Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ７３２６０］を包含する多数のヒトアデノウイルス型のＤＮＡ配列がＧｅｎｂａｎｋから入手できる。アデノウイル配列は、血清型２、３、４、７、１２及び４０のような、そしてさらに任意の現在同定されているヒト型［例えば、Ｈｏｒｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，２ｄ ｅｄ．，ｐｐ．１６７９−１７２１（１９９０）を参照］を包含する任意の既知のアデノウイルス血清型から得ることができる。同様に、非ヒト霊長類（例えば、チンバンジー、アカゲザル、マカク及び他のサル種）もしくは他の非ヒト哺乳動物に感染することが既知であるアデノウイルスもまた本発明のベクター構築物において用いることができる。例えば、適当なアデノウイルスはＡＴＣＣから入手でき、そしてとりわけ、限定なしに、米国特許第６，０８３，７１６号に記述されている、チンパンジーアデノウイルスＰａｎ５［ＶＲ−５９１］、Ｐａｎ６［ＶＲ−５９２］、Ｐａｎ７［ＶＲ−５９３］並びにＣ１及びＣ６８（Ｐａｎ９）；限定なしにＳＶ１［ＶＲ−１９５］；ＳＶ２５［ＳＶ−２０１］；ＳＶ３５；ＳＶ１５；ＳＶ−３４；ＳＶ−３６；ＳＶ−３７を包含するサルアデノウイウルス、並びにヒヒアデノウイルス［ＶＲ−２７５］が包含される。野生型アデノウイルスに加えて、必要なヘルパー機能を保有する組換えウイルスもしくは非ウイルスベクター（例えば、感染性及び非感染性プラスミド、エピソームなど）を利用することができる。そのような組換えウイルスは当該技術分野において既知であり、そして公開された技術に従って製造することができる。例えば、ハイブリッドＡｄ／ＡＡＶウイルスを記述する、米国特許第５，８７１，９８２号及び米国特許６，２５１，６７７を参照。アデノウイルス型の選択は、以下の本発明を限定すると予測されない。様々なアデノウイルス株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手でき、もしくは様々な商業及び公共の供給元から要求に応じて入手できる。さらに、多数のそのような株の配列は、例えばＰｕｂＭｅｄ及びＧｅｎＢａｎｋを包含する様々なデータベースから入手できる。以下の実施例では、便宜上、アデノウイルス５型（Ａｄ５）、Ｐａｎ６及びＰａｎ９を使用する。しかしながら、他のアデノウイルス株から得られる匹敵する領域を容易に選択しそしてこれらの血清型の代わりに（もしくは組み合わせて）本発明において使用できることを当業者は理解する。
【００１８】
一つの態様として、細胞は、ＡＡＶを増幅する継代中の汚染ウイルスの相同的組換えを防ぐためにアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ及び／もしくはＥ４ ＯＲＦ６のみを含有する。別の態様として、細胞はアデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子機能を安定に発現し、そして他の必要なアデノウイルスヘルパー機能をトランスに提供される。適当な細胞の例は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ］，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９から入手できる細胞系からである２９３細胞である。他の適当な細胞系は、ＡＴＣＣ、商業供給元から入手でき、もしくは文献に記述されている。
【００１９】
ＡＡＶヘルパー機能が供給される場合、例えば、サンプルにおけるＡＡＶの低コピー数が推測される場合、宿主細胞は、場合により安定に含有することができ、もしくはそうでなければＡＡＶヘルパー機能を提供されることができる。一つの態様として、ＡＡＶヘルパー機能は、ｃａｐなしに存在するｒｅｐ機能である。この態様として、ｒｅｐ機能は、単一のＡＡＶ血清型により供給することができる。あるいはまた、２種、３種もしくはそれ以上の異なるＡＡＶ血清型からのｒｅｐ機能を選択することができる。好適には、ｒｅｐ機能は、任意の所望のＡＡＶ血清型の中から選択することができる。
【００２０】
適当なＡＡＶ血清型には、文献に記述されている、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５もしくはＡＡＶ６、２００２年１１月１２日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３３６３０号の主題であるＡＡＶ８；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３３６３１号の主題であるＡＡＶ９；及び同時係属中の米国特許出願第１０／２９１，５８３号に同定されているＡＡＶ７、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２などのようなＡＡＶ血清型が包含され、これらは引用することにより本明細書に組み込まれる。さらに、ＡＡＶ７及びＡＡＶ８の配列は記述されている［Ｇ−Ｐ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，９９（１８）：１１８５４−１１８５９（２００２年９月３日）；ＧｅｎＢａｎｋデータベース受託番号ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ７）及び受託番号ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ８）］。様々なＡＡＶ血清型をこれらの同時係属中の出願に記述されている方法に従って単離することができ、もしくはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ Ｖｉｒｇｉｎｉａを包含する様々な供給元から入手することができる。これらのＡＡＶ血清型の配列は公開されており、そして多くはＰｕｂＭｅｄ及びＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースから入手できる。
【００２１】
別の態様として、ｒｅｐ及びｃａｐの両方をＡＡＶヘルパー機能として利用する。この態様として、ｒｅｐ機能及びｃａｐ機能を同じＡＡＶ血清型によりもしくは異なるＡＡＶ血清型から供給することができる。所望に応じて、ｒｅｐ機能及び／もしくはｃａｐ機能を２種、３種もしくはそれ以上の異なるＡＡＶ血清型により供給することができ、ここで、ｒｅｐのＡＡＶの起源は、ｃａｐのＡＡＶ血清型の起源と同じもしくは異なる。好適には、ｒｅｐ及びｃａｐ機能を任意の所望のＡＡＶ血清型の中から選択することができる。
【００２２】
本発明において有用な一つの宿主細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐをコードする配列で安定に形質転換されそしてアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ及びＥ４ＯＲＦ６ ＤＮＡでトランスフェクションされる宿主細胞である。Ｂ−５０（ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９４６３）のような安定なｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ発現細胞系もしくは米国特許第５，６５８，７８５号に記述されているものもまた同様に用いることができる。別の望ましい宿主細胞は、Ｅ４ＯＲＦ６を発現するために十分な最低限のアデノウイルスＤＮＡを含有する。さらに別の細胞系を他のＡＡＶ ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ配列を用いて構築することができる。そのような技術には、周知でありそして上記に引用するＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．に記述されているｃＤＮＡ及びゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた、アデノウイルス及びＡＡＶゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、合成法、並びに所望のヌクレオチド配列を提供する任意の他の適当な方法が包含される。
【００２３】
場合により、所望のＡＡＶヘルパー機能、例えばｒｅｐ及び／もしくはｃａｐは、所望のヘルパー機能をコードする配列を保有する一つもしくはそれ以上のベクターにより宿主細胞に提供される。例えば、米国特許６，２０３，９７５［場合により組換えアデノウイルスに結合したｒｅｐ／ｃａｐタンパク質を保有するプラスミド］及び米国特許第６，２５８，５９５号［ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ機能を保有する多数のプラスミドを記述する］を参照。ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、それらの発現制御配列と一緒に、単一のベクター上で供給することができ、もしくは各配列をそれ自体のベクター上で供給することができる。好ましくは、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、同じベクター上で供給される。あるいはまた、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、宿主細胞に導入されるべき他のＤＮＡ配列、例えばヘルパーアデノウイルス機能を含有するベクター上で供給することができる。好ましくは、ｒｅｐもしくはｃａｐタンパク質を発現するプロモーターは、当業者に既知であるかもしくは上記に説明するような構成性、誘導性もしくは天然のプロモーターのいずれかであることができる。一つの態様として、ＡＡＶ Ｐ５プロモーター配列をｒｅｐタンパク質の発現に用いる。任意のＡＡＶ起源から得ることができるが、パルボウイルスＰ５プロモーターは、好ましくは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子配列を提供する血清型と同じ血清型である。あるいはまた、プロモーターは、ｒｅｐ及びｃａｐ配列を提供するものと別のＡＡＶ型からのＰ５プロモーターであることができる。他のヒトもしくは他の動物に感染することが既知であるＡＡＶもまたＰ５プロモーターを提供することができる。これらの配列のいずれかを提供するＡＡＶの選択は、本発明を限定しない。別の態様として、ｒｅｐのプロモーターは誘導性プロモーターである。上記に説明するように、誘導性プロモーターには、限定なしに、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーター；デキサメタゾン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系；エクジソン昆虫プロモーター；テトラサイクリン抑制系；テトラサイクリン誘導系；ＲＵ４８６-誘導系；及びラパマイシン誘導系が包含される。ｒｅｐ発現の一つの好ましいプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターにより調節されるｒｅｐ遺伝子、及びｃａｐ遺伝子を含んでなるベクターは、Ｔ７ポリメラーゼを構成的もしくは誘導的のいずれかで発現する細胞にトランスフェクションもしくは形質転換される。１９９８年３月１２日に公開されたＷＯ ９８／１００８８を参照。
【００２４】
ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質を提供する代表的な分子は、プラスミド、例えば、ｐＭＴ−Ｒｅｐ／Ｃａｐ、ｐＰ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐ及びｐＭＭＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐである。これらのプラスミドは、ネオマイシン選択マーカー遺伝子を含有し、そしてそれらの天然のＰ５プロモーター（ｐＰ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐ）、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネインプロモーター（ｐＭＴＲｅｐ／Ｃａｐ）、もしくはデキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター（ｐＭＭＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐ）のいずれかにより導かれるＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現する。これらのタンパク質は様々な手段により細胞に提供することができるが、本発明の代表的な方法には様々なプラスミドの使用が包含される。プラスミドｐＭＴ−Ｒｅｐ／Ｃａｐの構築のためには、ＯＲＦ６配列をｐＭＴＥ４ＯＲＦ６プラスミド［Ｇ．Ｐ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８９３４−８９４３（１９９６）］からＢａｍＨＩ消化により取り除き、そしてｐＳｕｂ２０１プラスミド［ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９）］を鋳型として用いてＰＣＲ増幅により製造した４．１ｋｂのｒｅｐ／ｃａｐフラグメントで置換した。プラスミドｐＭＭＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐは、ｐＭＭＴＶＥ４ＯＲＦ６プラスミド［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，上記に引用］をベクターバックボーンとして用いたことを除いて、ｐＭＴ−Ｒｅｐ／Ｃａｐと同じように構築した。Ｐ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐの構築のためには、ＭＴプロモーター及びＯＲＦ６配列をｐＭＴＥ４ＯＲＦ６プラスミド［Ｇ．Ｐ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８９３４−８９４３（１９９６）］からＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化により取り除き、そしてｐＳｕｂ２０１プラスミド［ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９）］からＸｂａＩ消化により単離した４．３ｋｂのＰ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐフラグメントで置換した。プラスミド構築は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，上記に引用に記述されているもののような通常の遺伝子工学方法を含んだ。上記に引用する参考文献の全ては、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００２５】
ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐタンパク質を提供する様々な他のプラスミド構築物は当該技術分野において既知であり、そして本発明の宿主細胞において用いることができる。例えば、ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ構築物は、上記の構築物において言及するプロモーターとｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ遺伝子間のスペーサーを省くことができる。ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子の３’にＰ５プロモーターを配置する米国特許第５，６２２，８５６号に記述されているもののような、当該技術分野の他の構築物もまたこれに関連して用いることができる。
【００２６】
ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐタンパク質を提供する分子は、これらの成分を宿主細胞に導入する任意の形態であることができる。一つの態様として、この分子はプラスミドの形態であり、これはマーカー遺伝子のもののような他の非ウイルス配列を含有することができる。好適には、この分子はＡＡＶ ＩＴＲを含有せず、そして一般にＡＡＶパッケージング配列を含有しない。従って、様々なベクターが、宿主細胞にＡＡＶヘルパー機能を送達することが既知である。しかしながら、ＡＡＶヘルパー機能の送達のための適切なベクターの選択は、本発明の制約ではない。
【００２７】
本発明によれば、細胞において安定に(stably)含有されない任意の所望のヘルパー機能（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、もしくは他のヘルパー機能）は、適当なベクターにより細胞に提供される。本明細書において用いる場合、ベクターは、宿主細胞に送達することができる任意の遺伝子要素、例えば、その上に保有する配列を導入する裸のＤＮＡ、プラスミド（感染性もしくは非感染性）、ファージ、エピソーム、トランスポゾン、コスミド、ウイルスなどである。選択したベクターは、トランスフェクション、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、感染及びプロトプラスト融合を包含する任意の適当な方法により細胞に送達することができる。トランスフェクションは、便宜のためにのみ本明細書の全体にわたって言及するが、細胞に遺伝子要素を導入する方法に対する限定ではない。
【００２８】
従って、全ての必要なヘルパー機能が宿主細胞において安定に含有されない場合、本明細書において記述するように、ヘルパー機能を共トランスフェクション、感染もしくは重複感染により供給する。好適には、細胞に１〜５ｘ１０５細胞当たり約０．２μｇ〜約２μｇのＤＮＡ、そしてより好ましくは５ｘ１０５細胞当たり約１μｇ〜約１．８μｇのＤＮＡの量でヘルパーを共トランスフェクション／感染させる。本発明は、細胞のこの濃度に限定されず、それはウェルプレート、細胞タイプ、もしくは当業者に既知である他の因子により変えることができる（例えば、１０３以下の細胞〜１０１２以上の細胞）。制限酵素で消化したＤＮＡ及びヘルパーベクターは、好適には、１：１〜１：１０の消化したＤＮＡ：ヘルパーの比率で細胞に提供する。あるいはまた、ヘルパーベクターより多量の消化したＤＮＡを細胞に提供することができる。
【００２９】
従って、本発明の方法によれば、消化したＤＮＡを標的配列のレスキュー及び増幅のために宿主細胞にトランスフェクションする。一例として、本発明の方法は、霊長類（ヒトもしくは非ヒト）組織からＡＡＶをレスキューするために利用する。
【００３０】
一つの態様として、消化したＤＮＡを宿主細胞に一晩トランスフェクションし；細胞を一晩インキュベーションし、そして次にヘルパーアデノウイルスを重複感染させ；完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）後に採取し、そして場合によりさらに継代する。本明細書において用いる場合、重複感染は、宿主細胞により提供されない任意の必要なヘルパー機能を提供するヘルパーウイルスの送達をさす。例えば、ヘルパー機能をアデノウイルスにより提供する場合、ＡＡＶパッケージング及び複製は、少なくとも、Ｅ１機能（すなわち、Ｅ１ａ及びＥ１ｂ）、Ｅ２ａ、Ｅ４（もしくはＯＲＦ６フラグメントのようなその機能性フラグメント）及びＶＡＩ ＲＮＡを必要とする。宿主細胞がＥ１機能を提供しない場合、ヘルパーベクター、例えばヘルパーアデノウイルスがこれらの機能を供給する。好ましくは、Ｅ１機能は、宿主細胞において安定に含有される。
【００３１】
従って、選択した宿主細胞のトランスフェクション後に、選択した宿主細胞がヘルパー機能の発現及びＡＡＶの複製をできるように細胞をその後培養する。典型的には、細胞を通常の条件下で約１８〜約３０時間、便宜上約２４時間培養し、この時点でそれらにアデノウイルスヘルパーウイルスを重複感染させる。
【００３２】
重複感染には、野生型アデノウイルス遺伝子機能を提供するウイルスベクターを利用することができ、もしくはＥ１アデノウイルス機能を提供する組換えアデノウイルスゲノムを提供する。あるいはまた、細胞系がＥ１遺伝子機能を提供する場合、Ｅ１を除く全てのアデノウイルス遺伝子機能を含有するウイルスベクターを利用することができる。しかしながら、好適には、宿主細胞に少なくともＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ及びＶＡＩ ＲＮＡ機能を提供する。アデノウイルスヘルパー機能は、細胞における他のヘルパー機能を提供するものと同じアデノウイルス血清型から、もしくはトランス相補性（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）血清型からであることができる。例えば、ヒトＡｄ５ Ｅ１ａ及びＥ１ｂを発現する細胞系並びにヒトもしくはサルアデノウイルスヘルパー機能（例えばチンパンジーＣ６８）を保有するヘルパーウイルスを利用することができる。あるいはまた、ヒトＡｄ５ Ｅ１ａ及びＥ１ｂを発現する細胞系、アデノウイルスヘルパー機能を保有する第一のヘルパーベクター、並びに重複感染工程用のアデノウイルスを利用することができる。多数の他の組み合わせが可能であり、そして当業者に容易に明らかである。好適には、ヘルパーウイルスは、２〜５の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）で提供される。しかしながら、他の適当なＭＯＩを当業者は容易に決定することができる。
【００３３】
任意の所望のヘルパーＡＡＶ機能は、消化したＤＮＡのトランスフェクションの時点もしくは重複感染の時点のいずれかで供給することができる。典型的には、完全なＣＰＥが認められた後に細胞を採取し、これは通常、重複感染後約７２〜約９６時間である。細胞は、通常の技術を用いて採取する。典型的には、培養物を１回もしくは好ましくは数回の凍結融解に供し、そして得られる粗ライセートを次の継代もしくは標的ＤＮＡの検出用に集める。
【００３４】
場合により、第一の継代からの全細胞ＤＮＡ及びタンパク質を含有するペレットを、培養及び収集工程を繰り返すことによりさらなる継代に供する。場合により、適当なベクターは、１回もしくはそれ以上の追加の継代工程中に追加のＡＡＶヘルパー機能を提供することができる。これらの工程は、必要応じて、例えば全部で２〜５０継代にわたって繰り返すことができる。しかしながら、継代工程は、所望に応じて、さらに少ない、例えば全部で２〜３０継代、２〜２０継代、２〜１０継代、２〜５継代、もしくはそれ以上であることができる。
【００３５】
第二の態様として、消化したＤＮＡは、最低限のアデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４（もしくはその機能性フラグメント）及びＶＡＩ ＲＮＡ機能のみを提供するアデノウイルスヘルパープラスミドと共にアデノウイルスＥ１機能を発現する宿主細胞に共トランスフェクションし；採取し；そして第一の継代でウイルスを重複感染させる。あるいはまた、宿主細胞はＥ１機能を提供せず、そしてこれらの機能は、他のヘルパー機能を提供するものと同じもしくは異なることができるヘルパーベクター上で供給される。任意の所望のヘルパーＡＡＶ機能は、消化したＤＮＡのトランスフェクションの時点もしくは重複感染の時点のいずれかで供給することができる。
【００３６】
この第二の態様では、いかなるＣＰＥも認められず、そして細胞は、典型的に、通常の技術を用いてトランスフェクション後約７２〜約９６時間後に採取する。典型的には、培養物を上記のような凍結融解に供し、そして粗ライセートを継代用に集める。この時点で、アデノウイルスヘルパー機能を好ましくは感染性プラスミドもしくはウイルスの形態で供給することが必要である。その後、培養物を上記の第一の態様において記述するように継代する。さらに、場合により、消化したＤＮＡでの最初のトランスフェクションの時点、もしくは好ましくは、第一の継代（すなわち、重複感染で）を開始する時点で共トランスフェクションもしくは感染により細胞系に任意の所望のＡＡＶ機能を提供することができる。場合により、追加のＡＡＶヘルパー機能（例えばｒｅｐ）を１回もしくはそれ以上の追加の継代中に供給することができる。
【００３７】
さらに第三の態様として、消化したＤＮＡは、感染性プラスミドと共に宿主細胞に共トランスフェクションする。典型的に、感染性プラスミドは、全長アデノウイルスゲノムを含有する。しかしながら、Ｅ１機能を発現する細胞系にトランスフェクションする場合、感染性プラスミドは、Ｅ１が欠失しているかもしくは非機能性にされていることを除いて全長アデノウイルスゲノムを含有することができる。場合により、細胞はまた、任意の所望のＡＡＶヘルパー機能でトランスフェクションされる。通常の技術を用いてＣＰＥが認められた後に細胞を培養する。典型的には、細胞を上記のように凍結融解に供し、そして粗ライセートを次の継代もしくは標的ＤＮＡの検出用に集める。
【００３８】
上記の３つの別の態様のいずれを利用するかにかかわらず、第一の継代からの全細胞ＤＮＡ及びタンパク質を含有する粗ライセートを、場合により、トランスフェクション、培養及び収集工程を繰り返すことによりさらなる継代に供する。これらの工程は、必要応じて、例えば全部で２〜５０継代にわたって繰り返すことができる。しかしながら、継代工程は、所望に応じて、さらに少ない、例えば全部で２〜３０、２〜２０、２〜１０、２〜５、もしくはそれ以上であることができる
実施する最終継代工程からの細胞ペレットの収集後に、標的組込みＤＮＡ、すなわち、ＡＡＶの存在を検出するためにペレット中の細胞ＤＮＡ及びタンパク質をアッセイする。この検出工程は、任意の適当な方法を用いて行うことができる。一つの態様として、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ技術を利用する。一般的には、本明細書に引用するＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを参照。別の代案として、ゲノム歩行技術（Ｓｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：１０８７−１０８８，Ｆｒｉｅｚｎｅｒ−Ｄｅｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６９７２−６９８５，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて感染性ＡＡＶを単離することができる。別の態様として、本発明者等の研究所において開発された新規な検出方法を利用することができる。この方法は、新規なそして／もしくは未知の血清型のＡＡＶ の検出に特によく適しており、そして引用することにより本明細書に組み込まれる「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列を検出及び／もしくは同定する方法並びにそれにより同定される新規な配列を単離する方法（“Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ／ｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ Ｔｈｅｒｅｂｙ”）」という表題の２００１年１１月１２日に出願された同時係属中の出願、米国特許出願第１０／２９１，５８３号の主題である。
【００３９】
あるいはまた、継代後に、細胞ペレットを標準的な方法に従ってＡＡＶビリオンの精製用に採取する。そのような標準的な方法の中には、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配精製、カラムクロマトグラフィー、及び文献において記述されているもの［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１１：２０７９−２０９１（２００２年１０月）］などのような技術がある。
【００４０】
例えば、細胞をトランスフェクション培地と一緒にスクレーパーにより採取し、そしてエタノール−ドライアイス及び３７℃の水浴における３回の凍結融解に供することができる。細胞を例えば４℃で１５分間遠心分離することができる。一般的には、本明細書に引用するＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを参照。
【００４１】
従って、本発明の方法は、標的ウイルス配列、特に組込みウイルス配列の検出、同定及び単離を可能にする。本発明はさらに、本発明の方法を用いて同定及び単離される新規なウイルスを提供する。いったんそのように単離及び同定されると、当業者に既知である方法を用いて新規なウイルスを特性化し、そして当業者に容易に明らかである様々な目的に利用することができる。
【００４２】
本発明の方法は、新規なＡＡＶ血清型を含むことができる、ＡＡＶ配列の検出、同定及び単離における使用に特によく適している。本発明の方法は、様々な疫学研究、生体内分布の研究、ＡＡＶベクター及び他の組込みウイルスから得られるベクターによる遺伝子治療のモニタリングに容易に用いることができる。従って、これらの方法は、臨床医、研究者及び疫学者による使用のために事前包装したキットにおける使用によく適している。
ＩＩ．診断キット
別の態様として、本発明は、サンプルにおける既知もしくは未知の組込み標的、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の存在を検出するための診断キットを提供する。そのようなキットは、とりわけ、稀な制限酵素、抽出したＤＮＡを継代するための細胞、ヘルパーウイルスプラスミド及び／もしくはウイルスを含有するバイアルを含むことができる。
【００４３】
本発明はさらに、本発明の方法に従って検出されるＡＡＶ血清型を同定するため及び／もしくは既知のＡＡＶから新規なＡＡＶを区別するために有用なキットを提供する。さらに、本発明のキットは、使用説明書、陰性及び／もしくは陽性コントロール、容器、サンプルの希釈剤及びバッファー、特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）比較のための表示図、使い捨て手袋、汚染除去使用説明書、アプリケーター棒もしくは容器、及びサンプル準備カップ、並びに培地、洗浄試薬及び濃縮試薬を包含する任意の所望の試薬を含むことができる。そのような試薬は、本明細書において記述する試薬の中から、そして通常の濃縮試薬の中から容易に選択することができる。一つの望ましい態様として、洗浄試薬は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような生理的ｐＨに酸性度を調節されている等張食塩水溶液であり；溶出試薬は０．４Ｍ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ、並びに濃縮試薬及び装置である。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはＮＨ４ＳＯ４のような試薬、もしくはフィルター装置のような装置が有用であり得ることを当業者は認識する。例えば、１００Ｋ膜を有するフィルター装置はｒＡＡＶを濃縮する。
【００４４】
本発明により提供されるキットは、本明細書において記述する方法を行うことそして生体内分布、疫学、ヒト及びＮＨＰにおける新規なＡＡＶ血清型の伝達形態の研究に有用である。
【００４５】
従って、本発明の方法及びキットは、標的ウイルス配列、特に組込みウイルス配列の検出、同定及び単離を可能にする。該方法及びキットは、新規なＡＡＶ血清型を含むことができる、ＡＡＶ配列の検出、同定及び単離における使用に特によく適している。
【００４６】
【実施例】
以下の実施例は、本発明のいくつかの特徴及び態様を例示する。
実施例１：アカゲザル組織におけるＡＡＶ８配列の検出及び定量
リアルタイムＰＣＲ分析（ＴａｑＭａｎ）用にＡＡＶ８キャプシド遺伝子の超可変領域４内に位置する一続きの配列に基づいて一組のプライマー及びプローブを考案した。ＴａｑＭａｎ分析は、２つの異なる集団の１１匹のアカゲザルの各々１０の組織からの１１０のＤＮＡサンプルにわたって行った。一匹のサル（９８Ｅ０５６）の心臓及び肝臓組織は、ＡＡＶ８配列が最も豊富であることが見出された。１μｇのＤＮＡ当たりのＡＡＶ８配列のゲノムコピーは心臓では８８０００、そして肝臓では２２０００である。これら２つのＤＮＡサンプルにおけるそのような多量のＡＡＶ８配列のために、これらはＡＡＶ８ウイルスのレスキューの優れた候補であると考えられた。
実施例２：組織ＤＮＡの制限酵素消化
サル組織ＤＮＡからＡＡＶ８をレスキューするために、適切な細胞へのＤＮＡの送達は第一の工程である。哺乳動物細胞への高分子量細胞ＤＮＡの直接トランスフェクションは、通常、乏しい遺伝子導入効率をもたらす。この障壁を克服するために、サル＃９８Ｅ０５６の５μｇの肝臓ＤＮＡをＡＡＶ８ゲノムにおける非カッター（ｎｏｎ−ｃｕｔｔｅｒ）であるＰｍｅＩで一晩処理し、そして次にフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させ、そしてＴＥ（１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ ８．０、０．５Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．０、ｄＨ２Ｏ）に溶解した。
実施例３：２９３細胞におけるＡＡＶ８のトランスフェクション及びレスキューこの研究では、ヒトアデノウイルス血清型５のＥ１遺伝子で形質転換したヒト胚腎臓繊維芽細胞細胞系、２９３細胞をその高いトランスフェクション能力（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）及び異なる血清型の様々なＡＡＶベクターを生産することにおける成功した利用のためにレスキュー用の宿主として選択した。異なる血清型の組換えＡＡＶの生産のための２９３細胞の三重トランスフェクションにおいて一般に用いられた方法であるリン酸カルシウム法は、この実験におけるトランスフェクションの方法であった。
【００４７】
ＡＡＶゲノムのレスキューのための別の重要な必要条件は、適切なアデノウイルスヘルパー機能の存在である。この実験において、我々は、ヒトアデノウイルス血清型５を２つの結果に基づいて出発するヘルパーとして選択した。第一のものは、２９３細胞の三重トランスフェクションにおけるＡｄ５ヘルパープラスミドの使用が、ＡＡＶ２／８ベクターの高収量生産をもたらすことであり、Ａｄ５が優れたヘルパーであることを示唆した。第二の結果は、高コピー数のＡＡＶ８配列が肝臓及び心臓において検出されたサル９８Ｅ０５６が、殺される前に肝静脈投与によって組換えアデノウイルスベクターで処理されたことであった。これは、アデノウイルスの感染が、このサルのいくつかの組織におけるＡＡＶ８ゲノムのレスキュー及び増幅をもたらしたという考察につながることができた。
【００４８】
２９３細胞をウェル当たり５ｘ１０５細胞の密度で１２ウェルプレートにおいて接種した。トランスフェクション及びレスキュー実験を以下のように実施した。
【００４９】
グループＡ−１：１μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ＋１μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＤＮＡ（キャリヤーＤＮＡ）
グループＡ−２：０．２μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ＋１．８μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＤＮＡ（キャリヤーＤＮＡ）
グループＢ−１：１μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ＋１μｇのｐＡｄΔＦ６ ＤＮＡ（非感染性Ａｄヘルパープラスミド）
グループＢ−２：０．２μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ＋１．８μｇのｐＡｄΔＦ６ ＤＮＡ（非感染性Ａｄヘルパープラスミド）
グループＣ−１：１μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ＋１μｇのｐＡｄＣＭＶＬａｃＺ（感染性Ａｄプラスミド）
グループＣ−２：０．２μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ＋１．８μｇのｐＡｄＣＭＶＬａｃＺ（感染性Ａｄプラスミド））
トランスフェクション後２４時間で、Ａ−１及びＡ−２の細胞にＡｄ５ｗｔウイルスを２のＭＯＩで感染させた。Ａ−１、Ａ−２、Ｂ−１及びＢ−２の細胞をトランスフェクション後９６時間で採取し、そして３サイクルの凍結／融解により溶解させた。Ｃ−１及びＣ−２の細胞は、トランスフェクション後１５日で完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められた後に粗ライセート調製用に採取した。
【００５０】
各グループからの全粗細胞ライセートを次に２９３細胞の１００ｍｍプレート上に継代した。グループＢ−１及びＢ−２には、細胞にＥ１欠失Ａｄ５ｗｔウイルスも５のＭＯＩで重複感染させた。コントロールとして、２９３細胞の１００ｍｍプレートに同じＡｄ５ｗｔウイルスを５のＭＯＩで感染させた。完全なＣＰＥが認められた場合、各感染を採取した。１／１０の各感染を３サイクルの凍結融解用に取っておき、そして次の継代用に２９３細胞の別の１００ｍｍプレート上に継代した。残りの感染は、全細胞ＤＮＡ及びタンパク質の調製用の細胞ペレットを集めるために回転して落とした。該工程を最初の特性化のための継代２及び３の各サンプル用に繰り返した。
実施例４：異なる継代で再感染した２９３細胞の全ＤＮＡ、タンパク質及び粗ライセートの特性化
Ａ．ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ
ＡＡＶ８配列が連続継代中にレスキューされそして増幅されるかどうかを調べるために、各実験グループの異なる継代から抽出した全ＤＮＡをＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子配列のＴａｑＭａｎ分析に供した。結果を以下に要約する（ＧＣ＝ゲノムコピー）。表１を参照。
【００５１】
【表１】
【００５２】
データは以下のことを示唆した：
Ａ−１、Ｂ−１及びＢ−２及びＣ−１グループにおいて、ＡＡＶ８ウイルスはトランスフェクション工程においてレスキューされ、そして連続継代中にさらに増幅された。そのような増幅は、おそらく２９３細胞におけるＡＡＶの限られたパッケージング能力及びアデノウイルスとＡＡＶ間の競合的増殖阻害のために継代中に劇的ではない。
【００５３】
Ａ−２及びＣ−２において０．２μｇのサルＤＮＡを用いた場合、あらゆる継代においていかなる有意なＡＡＶ８配列も検出されなかった。これは、ＡＡＶの最初のゲノムコピーの閾値が、２９３細胞におけるレスキュー及び増幅のアデノウイルス阻害を克服するために必要とされることを意味することができる。しかし、Ｂ−２の場合、ＡＡＶ８及びアデノウイルスレスキューの両方が同時に起こったので、アデノウイルス複製及びパッケージングによるＡＡＶ８レスキュー、複製及びパッケージングの阻害は害が少なく、より低いゲノムコピーでさえＡＡＶ８の成功レスキュー及び増幅につながる。
【００５４】
これは、どのようにしてそしていつアデノウイルスヘルパー機能を提供するかが、この方法によるＡＡＶのレスキュー及び増幅にとって重要であることを示唆する。
【００５５】
Ｂ．ＰＣＲクローニング
ＴａｑＭａｎデータは、ＡＡＶ８プローブ／プライマーと２９３細胞のＤＮＡ配列間のいくらかの交差反応性を示唆した。感染におけるＡＡＶ配列の存在を確かめるために、２つの追加試験を実施した。
【００５６】
１．ユニバーサルプライマー組を用いるＡＡＶシグネチャー領域の通常のＰＣＲ増幅
パッケージングされていないＡＡＶ８ゲノムを消化するためにＡ−１−Ｐ３、Ｃ−１−Ｐ３及びＡｄ−コントロール−Ｐ３の粗ライセートをＤＮアーゼＩで３７℃で１時間処理した。各々０．４μｌの処理したライセートを５０μｌのＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動により調べた。結果は、Ａ−１−Ｐ３及びＣ−１−Ｐ３サンプルにおいて予想される２５０ｂｐのシグネチャーＰＣＲ産物を示し、一方、Ａｄ−コントロール−Ｐ３は、全くバンドを示さなかった。これは、Ａ−１及びＣ−１においてＴａｑＭａｎにより捕捉されるシグナルがＡＡＶ配列であることを裏付けた。
【００５７】
２．特定のＡＡＶ配列を同定するためのＰＣＲクローニング及び塩基配列決定
ＡＡＶ配列のどの分子タイプ（一つもしくは複数）がこの実験においてレスキューされそしてパッケージングされたかを同定するために、全ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子の３’末端にまたがる３．１ｋｂの配列を増幅するように一対のユニベーサルプライマー組を考案した。ＰＣＲ産物をクローン化し、そして同定のために部分的に塩基配列を決定した。
【００５８】
Ｃ．ウェスタンブロット
粗ライセートにおけるＡＡＶウイルスの存在を確かめる別の方法として、異なる継代でのＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質発現を調べた。以前の実験において、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体、クローンＢ１は、ＡＡＶ１、５、７及び８からのキャプシドタンパク質とよく交差反応できることが見出された。ＡＡＶの全てのタイプの詳細な配列比較により、Ｒｅｐ領域における強い類似性が示された。ウェスタンブロット分析には、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体、クローン２５９．５を使用すると決定した。
【００５９】
いくつかの感染の継代３の細胞ペレットから全細胞タンパク質を抽出し、そして定量した。各々５μｇの全タンパク質をウェスタンブロット分析に用いた。結果を以下の表２に要約する。
【００６０】
【表２】
【００６１】
データは、ＡＡＶ８配列のゲノムコピーとＲｅｐ／Ｃａｐ発現間の相関関係を示唆し、細胞に与えたＡＡＶ８配列が転写的そして翻訳的に活性であることを示した。
実施例５：ＡＡＶ８ビリオンの増大
ＴａｑＭａｎ分析、ＰＣＲ／クローニング及びウェスタンブロット分析は、本明細書において記述するようなＡＡＶ配列の存在及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子発現を示した。
【００６２】
ＴａｑＭａｎ技術を用いて、サル＃９８Ｅ０５６における２つの組織はＡＡＶ８配列が最も豊富であることが決定されている。それらは心臓及び肝臓である（それぞれ、ＤＮＡのμｇ当たり８８，０００及び２２，０００ＧＣのＡＡＶ８）。組織ＤＮＡにおけるＡＡＶ８配列がレスキュー可能でありそしてビリオンにパッケージング可能であるかどうかを調べるために、このサルの肝臓ＤＮＡをＡＡＶ８ゲノムにおける非カッターＰｍｅＩで制限し、そして感染性もしくは非感染性アデノウイルスヘルパープラスミドと２９３細胞にトランスフェクションし、もしくは続いて２４時間後にアデノウイルスを感染させた。各トランスフェクションもしくはトランスフェクション／感染からの粗ライセートをトランスフェクション後７２時間で採取し、そして連続継代に供した。
【００６３】
より特に、サル肝臓から調製した細胞ＤＮＡをＰｍｅＩエンドヌクレアーゼで制限し、そして通常のリン酸カルシウム方法論を用いて感染性及び非感染性アデノウイルスプラスミドもしくはコントロールプラスミドと２９３細胞に共トランスフェクションした（アカゲザル肝臓ＤＮＡ）。コントロールプラスミドを擬似トランスフェクションに使用した（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）。非感染性アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ、Ｅ４及びＶＡＲＮＡヘルパー機能を提供した。感染性Ｅ１欠失組換えアデノウイルスプラスミドを２９３細胞において感染させるために使用した（ｐＡｄΔＦ６）。Ａ−１及びＡ−２グループでは、ヘルパーアデノウイルスをトランスフェクション後２４時間で加え、そして細胞ライセートを継代用に４８時間後に採取した（ｐＡｄＣＭＶＬａｃＺ）。Ｃ−１、Ｃ−２及びコントロールグループでは、細胞ライセートをトランスフェクション後７２時間で調製し、そしてヘルパーウイルスを第一の継代において２９３細胞に加えた（Ａｄ５ ｗｔウイルス）。表３を参照。
【００６４】
【表３】
【００６５】
粗ライセートにおけるＡＡＶウイルスの存在を確かめる方法として、異なる継代でのＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質発現を調べた。以前の実験において、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体、クローンＢ１は、ＡＡＶ１、５、７及び８からのキャプシドタンパク質とよく交差反応できることが見出された（データは示さない）。ＡＡＶの全てのタイプの詳細な配列比較もまた、Ｒｅｐ領域における強い類似性を示した。
【００６６】
ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（クローン２５９．５）をウェスタンブロット分析における使用のために選択した。実験Ｂ−１及びＢ−２の継代１の細胞ペレットから全細胞タンパク質を抽出し、そして定量した。各々２μｇの全タンパク質をｒｅｐ及びｃａｐのウェスタンブロット分析に用いた。Ｂ−１及びＢ−２グループの継代１から抽出した細胞ＤＮＡにおけるＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子配列の存在もまた、ＡＡＶ８ ｃａｐ特異的プライマー及びプローブを用いてＴａｑＭａｎにより定量した。
【００６７】
レスキューされるＡＡＶゲノムが実際にＡＡＶ８であることを決定するために、Ｃ−１及び擬似トランスフェクションの継代３のＤＮアーゼＩ処理した粗ライセートからの３．１ｋｂ ｃａｐ領域のＰＣＲ増幅及びクローニングを実施した。予想されるように、擬似トランスフェクションしたサンプルではいかなるＰＣＲバンドも検出されなかったが、Ｃ−１クローンの配列分析は、アデノウイルスヘルパーの存在下で２９３細胞においてレスキューされそしてパッケージングされたゲノムがＡＡＶ８であることを裏付けた（データは示さない）。
【００６８】
次の工程は、この分子存在のＡＡＶビリオンを単離することである。実施例６においてさらに記述するように、Ａ−１、Ｂ−１、Ｃ−１及びＡｄ−コントロールの粗ライセートを２９３細胞の１、５及び５０の１５０ｍｍプレート上に連続して継代した。細胞ペレットを標準的な方法に従ってＡＡＶビリオンのＣｓＣｌ勾配精製用に感染後４２時間で採取した。
実施例６：ＡＡＶ８ビリオンの透過型電子顕微鏡検査及び感染性クローンの作製いったんＡＡＶビリオンが単離されると、ＡＡＶビリオンの形態を示すために陰性染色サンプルの透過型電子顕微鏡検査を行う。さらに、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（５）：３９９４−４００３（１９９９年５月）に記述されている方法に従って、ビリオンにパッケージングされたＡＡＶゲノムの感染性分子クローンをさらなる特性化のために作製する。
【００６９】
ＡＡＶ８の物理的（ｐｈｙｓｉｃａｌ）ビリオンを調べるために、グループＣ−１の連続継代の粗ライセートを擬似トランスフェクショングループのものと一緒に５０プレート感染に増やし、そしてＡＡＶビリオンの精製のためのＣｓＣｌ勾配遠心分離に供した。ＡＡＶ８のゲノムコピー濃度は、ＴａｑＭａｎ分析により決定した。陰性染色サンプルの透過型電子顕微鏡検査を行った。結果（示さない）としてＣ−１サンプルは典型的なＡＡＶビリオンを示したが、擬似トランスフェクションはいかなる可視のＡＡＶ構造も有さなかった。
実施例７：脾臓組織において同定される新規なＡＡＶのレスキュー
本明細書において記述する方法（実施例３を参照）を用いて、アカゲザルの脾臓組織において同定される新規なサルＡＡＶをレスキューするために実験を行った。細胞ＤＮＡをＰｍｅＩで処理し、そして２９３細胞においてサルアデノウイルスＰａｎ６のＥ１欠失分子クローン、サルアデノウイルスＰａｎ９のＥ１欠失分子クローン及びヒトＡｄ５のＥ１欠失分子クローンで等量（各々１μｇ）で共トランスフェクションした。ＡＡＶ力価は、これらの実施例において記述するようにトランスフェクション後継代１でＴａｑＭａｎ分析により決定した。
【００７０】
【表４】
【００７１】
このデータは、サルアデノウイルス血清型がサルＡＡＶ血清型のレスキューにおいていっそう効率がよい可能性があることを示唆する。
【００７２】
本明細書に引用する全ての公開は、引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明は特定の好ましい態様に関連して記述されているが、本発明の精神からそれずに改変を行うことができると理解される。そのような改変は、請求項の範囲内に入るものとする。
【００７３】
本発明の特徴及び態様を示せば、以下のとおりである。
１． （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるＤＮＡを消化し；
（ｂ）消化したＤＮＡを細胞にトランスフェクションし；
（ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノウイルス機能が細胞において発現される条件下で培養し；
（ｄ）ヘルパー機能を発現する細胞において（ｃ）の培養工程から得られるライセートを継代し；そして
（ｅ）場合により継代工程からのライセートをさらなる継代に供する：
組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューの方法。
２． 消化工程をＰｍｅＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＢｃｇＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａｂＩ、ＢｓｔＸＩ、ＤｒｄＩ、ＥｃｏＮＩ、ＦｓｅＩ及びＭａＭＩよりなる群から選択される制限酵素を用いて行う上記１に記載の方法。
３． 消化工程が、サンプルからのＤＮＡをＰｍｅＩとインキュベーションすること、フェノール／クロロホルム抽出を行うこと、エタノールで沈殿すること及び沈殿物を溶解することの工程をさらに含んでなる上記１もしくは２に記載の方法。
４． インキュベーションする工程を約１２〜４８時間行う上記３に記載の方法。
５． 哺乳動物細胞源が非ヒト霊長類もしくはヒトからの組織である上記１〜４のいずれかに記載の方法。
６． 工程（ｂ）の細胞をＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子産物の発現を導く調節制御要素の制御下のアデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子で安定に形質転換する上記１〜５のいずれかに記載の方法。
７． 工程（ｂ）の細胞が２９３細胞である上記１〜６のいずれかに記載の方法。
８． 工程（ｂ）の細胞がＡＡＶヘルパー機能を発現する上記１〜５のいずれかに記載の方法。
９． 工程（ｂ）の細胞がＡＡＶ ｒｅｐタンパク質を発現する上記１〜８のいずれかに記載の方法。
１０． 工程（ｂ）の細胞をアデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４（もしくはその機能性フラグメント）及びＶＡＩ ＲＮＡからなるアデノウイルス配列を含有するベクターと共トランスフェクションする上記１〜５のいずれかに記載の方法。
１１． 工程（ｂ）の細胞をアデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４（もしくはその機能性フラグメント）及びＶＡＩ ＲＮＡからなるアデノウイルス配列を含有するベクターと共トランスフェクションする上記１〜５のいずれかに記載の方法。
１２． アデノウイルスヘルパー機能をプラスミド上で提供する上記１〜５のいずれかに記載の方法。
１３． ヘルパー機能を一つもしくはそれ以上のアデノウイルス血清型により提供する上記１〜１２のいずれかに記載の方法。
１４． アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ機能をヒトアデノウイルスにより提供する上記１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５． 他の必要なアデノウイルスヘルパー機能をチンパンジーアデノウイルス血清型により提供する上記１４に記載の方法。
１６． 工程（ｂ）の細胞を０．２μｇ〜２μｇでトランスフェクションする上記１２〜１４のいずれかに記載の方法。
１７． 非感染性ヘルパーアデノウイルスプラスミドでトランスフェクションすること及び継代中に野生型アデノウイルスを細胞に重複感染させることの工程をさらに含んでなる上記１に記載の方法。
１８． 非感染性ヘルパーアデノウイルスプラスミドでトランスフェクションすること及び継代中にＥ１欠失アデノウイルスを細胞に重複感染させることの工程をさらに含んでなる上記１〜５のいずれかに記載の方法。
１９． 継代工程を２９３細胞において行う上記１〜１８のいずれかに記載の方法。
２０． 継代工程を繰り返す上記１〜１８のいずれかに記載の方法。
２１． （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるＤＮＡを消化し；
（ｂ）消化したＤＮＡを細胞にトランスフェクションし；
（ｃ）トランスフェクションした細胞をインキュベーションし；
（ｄ）トランスフェクションした細胞に、細胞がＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノウイルス機能を含有するようにアデノウイルスヘルパー機能を重複感染させ；
（ｅ）重複感染細胞をＡＡＶの複製に必要なヘルパー機能が発現される条件下で培養し；
（ｆ）重複感染培養物から粗ライセートを採取し；そして
（ｇ）粗ライセートを継代する：
組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキュー及び検出の方法。
２２． 採取する工程が、粗ライセートを得るために重複感染細胞培養物を凍結融解に供することをさらに含んでなる上記２１に記載の方法。
２３． 粗ライセートを２回もしくはそれ以上の継代に供する上記２１に記載の方法。
２４． （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるＤＮＡを消化し；
（ｂ）消化したＤＮＡ並びに宿主細胞により供給されないＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機能からなるアデノウイルス配列を含んでなる非感染性アデノウイルスヘルパープラスミドを共トランスフェクションし；
（ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機能のみが細胞において発現される条件下で培養し；
（ｄ）粗ライセートを得るために細胞培養物を処理し；
（ｅ）細胞に粗ライセートをトランスフェクションしそして細胞がＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノウイルス機能を含有するようにアデノウイルスヘルパー機能を細胞に重複感染させることにより粗ライセートを第一の継代に供し；そして
（ｆ）場合によりもう２回もしくはそれ以上継代する：
組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューの方法。
２５． ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるＤＮＡを消化し；
（ｂ）消化したＤＮＡ並びに宿主細胞により供給されないＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機能を含んでなる感染性アデノウイルスヘルパープラスミドを共トランスフェクションし；
（ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機能が細胞において発現される条件下で培養し；
（ｄ）粗ライセートを得るために細胞培養物を処理し；そして
（ｅ）粗ライセートを細胞にトランスフェクションすることにより場合により粗ライセートを２回もしくはそれ以上の継代に供する：
組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューの方法。
２６． ＡＡＶの存在に関して上記１、２２、２４もしくは２５の方法のいずれかから得られる粗ライセートをアッセイすることの工程を含んでなる、組織における細胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検出する方法。
２７． （ａ）細胞ペレットを提供するために上記１、２２、２４もしくは２５の方法のいずれかから得られる粗ライセートを遠心分離すること；及び
（ｂ）細胞ペレットからＡＡＶを精製すること：
の工程を含んでなる、組織における細胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法。
２８． 上記１、２２、２４もしくは２５のいずれかの方法による組織の細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューに有用なキット。
２９． 上記２６の方法により組織からの細胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検出するのに有用なキット。
３０． 上記２７の方法により組織からの細胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製するのに有用なキット。
【発明の属する技術分野】
パルボウイルス科のメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７〜６ｋｂ(Ｍｒ．１．５−２．０ｘ１０６)の一本鎖線状ＤＮＡゲノムを有する小型のエンベロープの無い正二十面体ウイルスである。ＡＡＶは、精製されたアデノウイルスストックにおける汚染物(contaminant)として発見されたのでディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に特定される。ＡＡＶの生活環は、ＡＡＶゲノムが感染後に宿主染色体に部位特異的に組込まれる潜伏期及びアデノウイルスもしくは単純ヘルペスウイルスのいずれかの重複感染後に、組込みゲノムを続いてレスキューし、複製し、そして感染性ウイルスにパッケージングする増殖もしくは生産期を含む。単純なゲノム構造、非病原性、非分裂細胞を包含する、感染性についての広い宿主範囲、及び潜在的な部位特異的染色体組込みの特性は、ＡＡＶを遺伝子導入の魅力的な手段にする。最近の研究は、ＡＡＶベクターが安定な遺伝子発現を得るための好ましい媒体であり得ることを示唆する。
【０００２】
【従来の技術】
現在まで、ＡＡＶの６種の異なる血清型（ＡＡＶ１−６）が、ヒトもしくは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され、十分に特性化され、そして遺伝子導入用途のベクターとされている。これらの全ては、霊長類及び非ヒト霊長類起源の汚染されたアデノウイルス調製物もしくは組織検体のいずれかから感染性ウイルスとして単離されている。これらの中で、ＡＡＶ１及びＡＡＶ４は非ヒト霊長類から単離され；ＡＡＶ２、３及び５はヒトから得られ、そしてＡＡＶ６はヒトアデノウイルス調製物の汚染物であった。
【０００３】
核に侵入し、宿主に組込みそしてヘルパーウイルス共感染なしに潜伏感染を確立するＡＡＶの能力を利用して、最近、我々は、非ヒト霊長類起源の異なる組織から調製した細胞ＤＮＡからの新規なＡＡＶの配列の単離のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法を考案した。この方法を用いて、我々は少なくとも１６分子タイプ及び８分子サブタイプの新規なＡＡＶを単離し、遺伝子導入用途におけるそれらの効率を評価するためにそれらの二つに関して組換えウイルスを作製した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
細胞源からＡＡＶビリオンを同定及び単離する信頼できる方法の必要性が依然として当該技術分野にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、細胞ＤＮＡを細胞にトランスフェクションし、ウイルスをレスキューし、そしてアデノウイルスヘルパー機能の存在下で連続継代によってウイルスを増幅することにより組織の細胞ＤＮＡから新規なＡＡＶウイルスを単離する独特な方法を提供する。この方法は、組織、特に非ヒト霊長類（ＮＨＰ）及びヒト組織から新規なＡＡＶ及び他のヘルパー依存性組込みウイルスを単離する非常に有用なそして実用的な手段である。
【０００６】
本発明のこれら及び他の特徴は、以下の本発明の詳細な記述から容易に明らかである。本明細書及び請求項の全体にわたって使用する場合、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語及びとりわけ「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなっている」を包含するその変形には、他の成分、要素、整数、工程などが含まれる。「からなる」もしくは「からなっている」という用語は、他の成分、要素、整数、工程などを除く。
【０００７】
【発明の実施の形態】
一つの態様として、本発明は、ヒトもしくは非ヒト組織からの細胞ＤＮＡからの組込みウイルスもしくは非ウイルス配列の直接レスキューの方法を提供する。
【０００８】
該方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のようなヘルパーに依存する組込みウイルスのレスキューにおける使用に特によく適している。例えば、最近単離された新規なＡＡＶ血清型を用いて、本発明の方法は非常にうまく機能することが示された。ＡＡＶ８配列及びｒｅｐ／ｃａｐタンパク質発現は、トランスフェクション及び連続継代後に２９３細胞において劇的に増幅された。しかしながら、本明細書における実施例は、新規なＡＡＶ血清型のレスキュー及び増幅を示すが、本発明の方法は、既知及び未知のＡＡＶ血清型の両方、並びに宿主細胞のゲノムに組込む他のウイルス及び非ウイルス配列に容易に適用できる。そのような他のウイルス配列には、とりわけ、レトロウイルス［例えば、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩＩ］、及びレンチウイルス亜科［例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス及びスプマウイルス亜科］が包含される。本発明の方法の他の適当な使用は、当業者に容易に明らかである。
【０００９】
本明細書において用いる場合、サンプルは核酸を含有する任意の起源、例えば、組織、組織培養物、細胞、細胞培養物、充実性腫瘍、及び限定なしに尿及び血液を包含する生物学的流体である。これらの核酸配列は、プラスミドからのＤＮＡもしくはＲＮＡ、細菌、酵母、ウイルス、及び植物もしくは動物のような高等生物を包含する任意の起源からの天然のＤＮＡもしくはＲＮＡであることができる。一つの望ましい態様として、細胞は非ヒト霊長類もしくはヒト起源からである。しかしながら、様々な哺乳動物及び非哺乳動物種からの細胞もまた利用することができる。サンプルの起源及び本発明の方法の適用のために核酸を得る方法は、本発明の制約ではない。場合により、本発明の方法は、ＤＮＡの起源に対して直接、もしくはある起源から得られる（例えば抽出される）核酸に対して行うことができる。
【００１０】
細胞ＤＮＡは、様々な通常の技術のいずれかを用いて細胞源から抽出する。ＤＮＡもしくはＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により記述されているもののような、当業者に既知である様々な技術によりサンプルから抽出する。
【００１１】
サンプルからのＤＮＡは、標的組込み外来ＤＮＡ（例えばＡＡＶ）を切断せずに宿主生物に固有のゲノムＤＮＡを優先的に切断するように選択された制限酵素の存在下でインキュベーションする。
【００１２】
典型的に、標的組込み外来ＤＮＡ（例えばＡＡＶ）の量は、サンプルにおける宿主ＤＮＡの量と比較してわずかである。従って、この消化工程は、ＡＡＶを損なわずに保ちながら、細胞サンプルにおける宿主ＤＮＡの複数フラグメントへの消化をもたらす。望ましくは、宿主ＤＮＡ及び使用する任意のヘルパーウイルスにおける複数の認識部位を含有するが、標的ＡＡＶゲノム（もしくは他の標的組込みＤＮＡ）における最低限の数の認識部位のみを含有する制限酵素を選択する。最も望ましくは、選択する制限酵素は、標的組込みＤＮＡにおけるいかなる認識部位も含有しない。本願において、そのような制限酵素はレアカッター（ｒａｒｅ ｃｕｔｔｅｒ）と称する。そのようなレアカッターの例には、例えば、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｓｒＩ、ＢｃｇＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａｂＩ、ＢｓｔＸＩ、ＤｒｄＩ、ＥｃｏＮＩ、ＦｓｅＩ、ＭａＭＩ、ＭｓｌＩ、ＭｗｏＩ、ＰｓｈａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｗａＩ、ＸｃｍＩ及びＸｍｎＩなどを包含する、７、８もしくはそれ以上の塩基の認識部位を有するものが包含される。適当なレアカッターは、文献においてそして様々なオンラインデータベース、例えばＲＥＢＡＳＥＴＭデータベースにおいて当業者が容易に利用できる情報を用いて同定することができる。例えば、標的組込みＤＮＡがＡＡＶ血清型８である場合の本発明の方法における使用に適当なレアカッターには、例えばＰｍｅＩが包含される。本発明の方法のための他の適当なカッターは、様々なコンピュータープログラム及び／もしくはオンラインデータベースを用いて容易に決定することができる。適当な制限酵素は、とりわけ、例えば、Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｏｂｉｏｇｅｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｈｅ、ＢＢ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａを包含する様々な商業供給元から入手できる。
【００１３】
いったん適切なサンプル及び消化酵素を選択すると、通常の消化技術を利用する。典型的には、制限酵素と混合したＤＮＡのサンプルを約１２〜約４８時間インキュベーションする。この後、通常のフェノール／クロロホルム抽出工程を行う。例えば、フェノール／クロロホルム抽出を利用し、続いてエタノールで沈殿させ、そして沈殿物を方法工程の残部における使用のために（例えばＴＥもしくは別の適当なバッファーに）溶解することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，５．２８−５．３２，Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｅ．３−Ｅ．４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）を参照。他の適当な方法は、利用する制限酵素の製造業者もしくは販売者により提供されることができるか、もしくはそうでなければ当業者に既知である。
【００１４】
サンプルにおける細胞ＤＮＡを消化した後、消化したＤＮＡを通常の技術を用いて適当な細胞にトランスフェクションする。好適には、消化したＤＮＡを、細胞においてトランスフェクションされる細胞ＤＮＡの濃度を最大にするようにトランスフェクションする。例えば、これは５０〜８０％の密度の細胞で５ｘ１０５細胞当たり約０．２μｇ〜約２μｇのＤＮＡの量であることができる。しかしながら、これらの量は、とりわけ、細胞プレートのサイズ及び細胞タイプを考慮に入れて、必要もしくは所望に応じて調整することができる。
【００１５】
宿主細胞自体は、原核（例えば細菌）細胞、並びに昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を包含する真核細胞を包含する任意の生物学的生物の中から選択することができる。宿主細胞は、ＤＮＡの感染もしくはトランスフェクション及びトランスフェクションしたＤＮＡの発現が可能である。特に望ましい宿主細胞は、限定なしに、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（これは機能性アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、並びにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ及びハムスターを包含する哺乳動物から得られる一次（ｐｒｉｍａｒｙ）繊維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞のような細胞を包含する任意の哺乳動物種の中から選択する。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明の制約ではなく；また哺乳動物細胞のタイプ、すなわち、繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などもそうではない。
【００１６】
好適には、ＡＡＶの単離及び増幅のために、細胞はＡＡＶの複製に必要なヘルパー機能を含有するかもしくは提供される。これらのヘルパー機能には、少なくとも、アデノウイルスからのＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、及びＶＡＩ ＲＮＡ機能が包含される。例えば、１９９９年９月２３日に公開されたＷＯ ９９／４７６９１；ＲＭ Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５：７９３−８０１（１９９４）；１９９９年４月１日に公開されたＷＯ ９９／１５６８５を参照。さらに、場合により、ヘルパーＡＡＶ機能を供給することができ、そしてこれはサンプルにおけるＡＡＶの低コピー数が推測される場合に望ましい。
【００１７】
アデノウイルスにより提供されるヘルパー機能は、野生型アデノウイルスにより供給することができ、そしてヒトもしくは非ヒト起源、好ましくは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）起源であることができる。Ａｄ５型［Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ７３２６０］を包含する多数のヒトアデノウイルス型のＤＮＡ配列がＧｅｎｂａｎｋから入手できる。アデノウイル配列は、血清型２、３、４、７、１２及び４０のような、そしてさらに任意の現在同定されているヒト型［例えば、Ｈｏｒｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，２ｄ ｅｄ．，ｐｐ．１６７９−１７２１（１９９０）を参照］を包含する任意の既知のアデノウイルス血清型から得ることができる。同様に、非ヒト霊長類（例えば、チンバンジー、アカゲザル、マカク及び他のサル種）もしくは他の非ヒト哺乳動物に感染することが既知であるアデノウイルスもまた本発明のベクター構築物において用いることができる。例えば、適当なアデノウイルスはＡＴＣＣから入手でき、そしてとりわけ、限定なしに、米国特許第６，０８３，７１６号に記述されている、チンパンジーアデノウイルスＰａｎ５［ＶＲ−５９１］、Ｐａｎ６［ＶＲ−５９２］、Ｐａｎ７［ＶＲ−５９３］並びにＣ１及びＣ６８（Ｐａｎ９）；限定なしにＳＶ１［ＶＲ−１９５］；ＳＶ２５［ＳＶ−２０１］；ＳＶ３５；ＳＶ１５；ＳＶ−３４；ＳＶ−３６；ＳＶ−３７を包含するサルアデノウイウルス、並びにヒヒアデノウイルス［ＶＲ−２７５］が包含される。野生型アデノウイルスに加えて、必要なヘルパー機能を保有する組換えウイルスもしくは非ウイルスベクター（例えば、感染性及び非感染性プラスミド、エピソームなど）を利用することができる。そのような組換えウイルスは当該技術分野において既知であり、そして公開された技術に従って製造することができる。例えば、ハイブリッドＡｄ／ＡＡＶウイルスを記述する、米国特許第５，８７１，９８２号及び米国特許６，２５１，６７７を参照。アデノウイルス型の選択は、以下の本発明を限定すると予測されない。様々なアデノウイルス株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手でき、もしくは様々な商業及び公共の供給元から要求に応じて入手できる。さらに、多数のそのような株の配列は、例えばＰｕｂＭｅｄ及びＧｅｎＢａｎｋを包含する様々なデータベースから入手できる。以下の実施例では、便宜上、アデノウイルス５型（Ａｄ５）、Ｐａｎ６及びＰａｎ９を使用する。しかしながら、他のアデノウイルス株から得られる匹敵する領域を容易に選択しそしてこれらの血清型の代わりに（もしくは組み合わせて）本発明において使用できることを当業者は理解する。
【００１８】
一つの態様として、細胞は、ＡＡＶを増幅する継代中の汚染ウイルスの相同的組換えを防ぐためにアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ及び／もしくはＥ４ ＯＲＦ６のみを含有する。別の態様として、細胞はアデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子機能を安定に発現し、そして他の必要なアデノウイルスヘルパー機能をトランスに提供される。適当な細胞の例は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ］，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９から入手できる細胞系からである２９３細胞である。他の適当な細胞系は、ＡＴＣＣ、商業供給元から入手でき、もしくは文献に記述されている。
【００１９】
ＡＡＶヘルパー機能が供給される場合、例えば、サンプルにおけるＡＡＶの低コピー数が推測される場合、宿主細胞は、場合により安定に含有することができ、もしくはそうでなければＡＡＶヘルパー機能を提供されることができる。一つの態様として、ＡＡＶヘルパー機能は、ｃａｐなしに存在するｒｅｐ機能である。この態様として、ｒｅｐ機能は、単一のＡＡＶ血清型により供給することができる。あるいはまた、２種、３種もしくはそれ以上の異なるＡＡＶ血清型からのｒｅｐ機能を選択することができる。好適には、ｒｅｐ機能は、任意の所望のＡＡＶ血清型の中から選択することができる。
【００２０】
適当なＡＡＶ血清型には、文献に記述されている、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５もしくはＡＡＶ６、２００２年１１月１２日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３３６３０号の主題であるＡＡＶ８；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３３６３１号の主題であるＡＡＶ９；及び同時係属中の米国特許出願第１０／２９１，５８３号に同定されているＡＡＶ７、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２などのようなＡＡＶ血清型が包含され、これらは引用することにより本明細書に組み込まれる。さらに、ＡＡＶ７及びＡＡＶ８の配列は記述されている［Ｇ−Ｐ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，９９（１８）：１１８５４−１１８５９（２００２年９月３日）；ＧｅｎＢａｎｋデータベース受託番号ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ７）及び受託番号ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ８）］。様々なＡＡＶ血清型をこれらの同時係属中の出願に記述されている方法に従って単離することができ、もしくはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ Ｖｉｒｇｉｎｉａを包含する様々な供給元から入手することができる。これらのＡＡＶ血清型の配列は公開されており、そして多くはＰｕｂＭｅｄ及びＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースから入手できる。
【００２１】
別の態様として、ｒｅｐ及びｃａｐの両方をＡＡＶヘルパー機能として利用する。この態様として、ｒｅｐ機能及びｃａｐ機能を同じＡＡＶ血清型によりもしくは異なるＡＡＶ血清型から供給することができる。所望に応じて、ｒｅｐ機能及び／もしくはｃａｐ機能を２種、３種もしくはそれ以上の異なるＡＡＶ血清型により供給することができ、ここで、ｒｅｐのＡＡＶの起源は、ｃａｐのＡＡＶ血清型の起源と同じもしくは異なる。好適には、ｒｅｐ及びｃａｐ機能を任意の所望のＡＡＶ血清型の中から選択することができる。
【００２２】
本発明において有用な一つの宿主細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐをコードする配列で安定に形質転換されそしてアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ及びＥ４ＯＲＦ６ ＤＮＡでトランスフェクションされる宿主細胞である。Ｂ−５０（ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９４６３）のような安定なｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ発現細胞系もしくは米国特許第５，６５８，７８５号に記述されているものもまた同様に用いることができる。別の望ましい宿主細胞は、Ｅ４ＯＲＦ６を発現するために十分な最低限のアデノウイルスＤＮＡを含有する。さらに別の細胞系を他のＡＡＶ ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ配列を用いて構築することができる。そのような技術には、周知でありそして上記に引用するＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．に記述されているｃＤＮＡ及びゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた、アデノウイルス及びＡＡＶゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、合成法、並びに所望のヌクレオチド配列を提供する任意の他の適当な方法が包含される。
【００２３】
場合により、所望のＡＡＶヘルパー機能、例えばｒｅｐ及び／もしくはｃａｐは、所望のヘルパー機能をコードする配列を保有する一つもしくはそれ以上のベクターにより宿主細胞に提供される。例えば、米国特許６，２０３，９７５［場合により組換えアデノウイルスに結合したｒｅｐ／ｃａｐタンパク質を保有するプラスミド］及び米国特許第６，２５８，５９５号［ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ機能を保有する多数のプラスミドを記述する］を参照。ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、それらの発現制御配列と一緒に、単一のベクター上で供給することができ、もしくは各配列をそれ自体のベクター上で供給することができる。好ましくは、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、同じベクター上で供給される。あるいはまた、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、宿主細胞に導入されるべき他のＤＮＡ配列、例えばヘルパーアデノウイルス機能を含有するベクター上で供給することができる。好ましくは、ｒｅｐもしくはｃａｐタンパク質を発現するプロモーターは、当業者に既知であるかもしくは上記に説明するような構成性、誘導性もしくは天然のプロモーターのいずれかであることができる。一つの態様として、ＡＡＶ Ｐ５プロモーター配列をｒｅｐタンパク質の発現に用いる。任意のＡＡＶ起源から得ることができるが、パルボウイルスＰ５プロモーターは、好ましくは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子配列を提供する血清型と同じ血清型である。あるいはまた、プロモーターは、ｒｅｐ及びｃａｐ配列を提供するものと別のＡＡＶ型からのＰ５プロモーターであることができる。他のヒトもしくは他の動物に感染することが既知であるＡＡＶもまたＰ５プロモーターを提供することができる。これらの配列のいずれかを提供するＡＡＶの選択は、本発明を限定しない。別の態様として、ｒｅｐのプロモーターは誘導性プロモーターである。上記に説明するように、誘導性プロモーターには、限定なしに、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーター；デキサメタゾン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系；エクジソン昆虫プロモーター；テトラサイクリン抑制系；テトラサイクリン誘導系；ＲＵ４８６-誘導系；及びラパマイシン誘導系が包含される。ｒｅｐ発現の一つの好ましいプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターにより調節されるｒｅｐ遺伝子、及びｃａｐ遺伝子を含んでなるベクターは、Ｔ７ポリメラーゼを構成的もしくは誘導的のいずれかで発現する細胞にトランスフェクションもしくは形質転換される。１９９８年３月１２日に公開されたＷＯ ９８／１００８８を参照。
【００２４】
ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質を提供する代表的な分子は、プラスミド、例えば、ｐＭＴ−Ｒｅｐ／Ｃａｐ、ｐＰ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐ及びｐＭＭＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐである。これらのプラスミドは、ネオマイシン選択マーカー遺伝子を含有し、そしてそれらの天然のＰ５プロモーター（ｐＰ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐ）、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネインプロモーター（ｐＭＴＲｅｐ／Ｃａｐ）、もしくはデキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター（ｐＭＭＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐ）のいずれかにより導かれるＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現する。これらのタンパク質は様々な手段により細胞に提供することができるが、本発明の代表的な方法には様々なプラスミドの使用が包含される。プラスミドｐＭＴ−Ｒｅｐ／Ｃａｐの構築のためには、ＯＲＦ６配列をｐＭＴＥ４ＯＲＦ６プラスミド［Ｇ．Ｐ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８９３４−８９４３（１９９６）］からＢａｍＨＩ消化により取り除き、そしてｐＳｕｂ２０１プラスミド［ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９）］を鋳型として用いてＰＣＲ増幅により製造した４．１ｋｂのｒｅｐ／ｃａｐフラグメントで置換した。プラスミドｐＭＭＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐは、ｐＭＭＴＶＥ４ＯＲＦ６プラスミド［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，上記に引用］をベクターバックボーンとして用いたことを除いて、ｐＭＴ−Ｒｅｐ／Ｃａｐと同じように構築した。Ｐ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐの構築のためには、ＭＴプロモーター及びＯＲＦ６配列をｐＭＴＥ４ＯＲＦ６プラスミド［Ｇ．Ｐ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８９３４−８９４３（１９９６）］からＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化により取り除き、そしてｐＳｕｂ２０１プラスミド［ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９）］からＸｂａＩ消化により単離した４．３ｋｂのＰ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐフラグメントで置換した。プラスミド構築は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，上記に引用に記述されているもののような通常の遺伝子工学方法を含んだ。上記に引用する参考文献の全ては、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００２５】
ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐタンパク質を提供する様々な他のプラスミド構築物は当該技術分野において既知であり、そして本発明の宿主細胞において用いることができる。例えば、ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ構築物は、上記の構築物において言及するプロモーターとｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ遺伝子間のスペーサーを省くことができる。ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子の３’にＰ５プロモーターを配置する米国特許第５，６２２，８５６号に記述されているもののような、当該技術分野の他の構築物もまたこれに関連して用いることができる。
【００２６】
ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐタンパク質を提供する分子は、これらの成分を宿主細胞に導入する任意の形態であることができる。一つの態様として、この分子はプラスミドの形態であり、これはマーカー遺伝子のもののような他の非ウイルス配列を含有することができる。好適には、この分子はＡＡＶ ＩＴＲを含有せず、そして一般にＡＡＶパッケージング配列を含有しない。従って、様々なベクターが、宿主細胞にＡＡＶヘルパー機能を送達することが既知である。しかしながら、ＡＡＶヘルパー機能の送達のための適切なベクターの選択は、本発明の制約ではない。
【００２７】
本発明によれば、細胞において安定に(stably)含有されない任意の所望のヘルパー機能（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、もしくは他のヘルパー機能）は、適当なベクターにより細胞に提供される。本明細書において用いる場合、ベクターは、宿主細胞に送達することができる任意の遺伝子要素、例えば、その上に保有する配列を導入する裸のＤＮＡ、プラスミド（感染性もしくは非感染性）、ファージ、エピソーム、トランスポゾン、コスミド、ウイルスなどである。選択したベクターは、トランスフェクション、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、感染及びプロトプラスト融合を包含する任意の適当な方法により細胞に送達することができる。トランスフェクションは、便宜のためにのみ本明細書の全体にわたって言及するが、細胞に遺伝子要素を導入する方法に対する限定ではない。
【００２８】
従って、全ての必要なヘルパー機能が宿主細胞において安定に含有されない場合、本明細書において記述するように、ヘルパー機能を共トランスフェクション、感染もしくは重複感染により供給する。好適には、細胞に１〜５ｘ１０５細胞当たり約０．２μｇ〜約２μｇのＤＮＡ、そしてより好ましくは５ｘ１０５細胞当たり約１μｇ〜約１．８μｇのＤＮＡの量でヘルパーを共トランスフェクション／感染させる。本発明は、細胞のこの濃度に限定されず、それはウェルプレート、細胞タイプ、もしくは当業者に既知である他の因子により変えることができる（例えば、１０３以下の細胞〜１０１２以上の細胞）。制限酵素で消化したＤＮＡ及びヘルパーベクターは、好適には、１：１〜１：１０の消化したＤＮＡ：ヘルパーの比率で細胞に提供する。あるいはまた、ヘルパーベクターより多量の消化したＤＮＡを細胞に提供することができる。
【００２９】
従って、本発明の方法によれば、消化したＤＮＡを標的配列のレスキュー及び増幅のために宿主細胞にトランスフェクションする。一例として、本発明の方法は、霊長類（ヒトもしくは非ヒト）組織からＡＡＶをレスキューするために利用する。
【００３０】
一つの態様として、消化したＤＮＡを宿主細胞に一晩トランスフェクションし；細胞を一晩インキュベーションし、そして次にヘルパーアデノウイルスを重複感染させ；完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）後に採取し、そして場合によりさらに継代する。本明細書において用いる場合、重複感染は、宿主細胞により提供されない任意の必要なヘルパー機能を提供するヘルパーウイルスの送達をさす。例えば、ヘルパー機能をアデノウイルスにより提供する場合、ＡＡＶパッケージング及び複製は、少なくとも、Ｅ１機能（すなわち、Ｅ１ａ及びＥ１ｂ）、Ｅ２ａ、Ｅ４（もしくはＯＲＦ６フラグメントのようなその機能性フラグメント）及びＶＡＩ ＲＮＡを必要とする。宿主細胞がＥ１機能を提供しない場合、ヘルパーベクター、例えばヘルパーアデノウイルスがこれらの機能を供給する。好ましくは、Ｅ１機能は、宿主細胞において安定に含有される。
【００３１】
従って、選択した宿主細胞のトランスフェクション後に、選択した宿主細胞がヘルパー機能の発現及びＡＡＶの複製をできるように細胞をその後培養する。典型的には、細胞を通常の条件下で約１８〜約３０時間、便宜上約２４時間培養し、この時点でそれらにアデノウイルスヘルパーウイルスを重複感染させる。
【００３２】
重複感染には、野生型アデノウイルス遺伝子機能を提供するウイルスベクターを利用することができ、もしくはＥ１アデノウイルス機能を提供する組換えアデノウイルスゲノムを提供する。あるいはまた、細胞系がＥ１遺伝子機能を提供する場合、Ｅ１を除く全てのアデノウイルス遺伝子機能を含有するウイルスベクターを利用することができる。しかしながら、好適には、宿主細胞に少なくともＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ及びＶＡＩ ＲＮＡ機能を提供する。アデノウイルスヘルパー機能は、細胞における他のヘルパー機能を提供するものと同じアデノウイルス血清型から、もしくはトランス相補性（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）血清型からであることができる。例えば、ヒトＡｄ５ Ｅ１ａ及びＥ１ｂを発現する細胞系並びにヒトもしくはサルアデノウイルスヘルパー機能（例えばチンパンジーＣ６８）を保有するヘルパーウイルスを利用することができる。あるいはまた、ヒトＡｄ５ Ｅ１ａ及びＥ１ｂを発現する細胞系、アデノウイルスヘルパー機能を保有する第一のヘルパーベクター、並びに重複感染工程用のアデノウイルスを利用することができる。多数の他の組み合わせが可能であり、そして当業者に容易に明らかである。好適には、ヘルパーウイルスは、２〜５の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）で提供される。しかしながら、他の適当なＭＯＩを当業者は容易に決定することができる。
【００３３】
任意の所望のヘルパーＡＡＶ機能は、消化したＤＮＡのトランスフェクションの時点もしくは重複感染の時点のいずれかで供給することができる。典型的には、完全なＣＰＥが認められた後に細胞を採取し、これは通常、重複感染後約７２〜約９６時間である。細胞は、通常の技術を用いて採取する。典型的には、培養物を１回もしくは好ましくは数回の凍結融解に供し、そして得られる粗ライセートを次の継代もしくは標的ＤＮＡの検出用に集める。
【００３４】
場合により、第一の継代からの全細胞ＤＮＡ及びタンパク質を含有するペレットを、培養及び収集工程を繰り返すことによりさらなる継代に供する。場合により、適当なベクターは、１回もしくはそれ以上の追加の継代工程中に追加のＡＡＶヘルパー機能を提供することができる。これらの工程は、必要応じて、例えば全部で２〜５０継代にわたって繰り返すことができる。しかしながら、継代工程は、所望に応じて、さらに少ない、例えば全部で２〜３０継代、２〜２０継代、２〜１０継代、２〜５継代、もしくはそれ以上であることができる。
【００３５】
第二の態様として、消化したＤＮＡは、最低限のアデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４（もしくはその機能性フラグメント）及びＶＡＩ ＲＮＡ機能のみを提供するアデノウイルスヘルパープラスミドと共にアデノウイルスＥ１機能を発現する宿主細胞に共トランスフェクションし；採取し；そして第一の継代でウイルスを重複感染させる。あるいはまた、宿主細胞はＥ１機能を提供せず、そしてこれらの機能は、他のヘルパー機能を提供するものと同じもしくは異なることができるヘルパーベクター上で供給される。任意の所望のヘルパーＡＡＶ機能は、消化したＤＮＡのトランスフェクションの時点もしくは重複感染の時点のいずれかで供給することができる。
【００３６】
この第二の態様では、いかなるＣＰＥも認められず、そして細胞は、典型的に、通常の技術を用いてトランスフェクション後約７２〜約９６時間後に採取する。典型的には、培養物を上記のような凍結融解に供し、そして粗ライセートを継代用に集める。この時点で、アデノウイルスヘルパー機能を好ましくは感染性プラスミドもしくはウイルスの形態で供給することが必要である。その後、培養物を上記の第一の態様において記述するように継代する。さらに、場合により、消化したＤＮＡでの最初のトランスフェクションの時点、もしくは好ましくは、第一の継代（すなわち、重複感染で）を開始する時点で共トランスフェクションもしくは感染により細胞系に任意の所望のＡＡＶ機能を提供することができる。場合により、追加のＡＡＶヘルパー機能（例えばｒｅｐ）を１回もしくはそれ以上の追加の継代中に供給することができる。
【００３７】
さらに第三の態様として、消化したＤＮＡは、感染性プラスミドと共に宿主細胞に共トランスフェクションする。典型的に、感染性プラスミドは、全長アデノウイルスゲノムを含有する。しかしながら、Ｅ１機能を発現する細胞系にトランスフェクションする場合、感染性プラスミドは、Ｅ１が欠失しているかもしくは非機能性にされていることを除いて全長アデノウイルスゲノムを含有することができる。場合により、細胞はまた、任意の所望のＡＡＶヘルパー機能でトランスフェクションされる。通常の技術を用いてＣＰＥが認められた後に細胞を培養する。典型的には、細胞を上記のように凍結融解に供し、そして粗ライセートを次の継代もしくは標的ＤＮＡの検出用に集める。
【００３８】
上記の３つの別の態様のいずれを利用するかにかかわらず、第一の継代からの全細胞ＤＮＡ及びタンパク質を含有する粗ライセートを、場合により、トランスフェクション、培養及び収集工程を繰り返すことによりさらなる継代に供する。これらの工程は、必要応じて、例えば全部で２〜５０継代にわたって繰り返すことができる。しかしながら、継代工程は、所望に応じて、さらに少ない、例えば全部で２〜３０、２〜２０、２〜１０、２〜５、もしくはそれ以上であることができる
実施する最終継代工程からの細胞ペレットの収集後に、標的組込みＤＮＡ、すなわち、ＡＡＶの存在を検出するためにペレット中の細胞ＤＮＡ及びタンパク質をアッセイする。この検出工程は、任意の適当な方法を用いて行うことができる。一つの態様として、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ技術を利用する。一般的には、本明細書に引用するＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを参照。別の代案として、ゲノム歩行技術（Ｓｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：１０８７−１０８８，Ｆｒｉｅｚｎｅｒ−Ｄｅｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６９７２−６９８５，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて感染性ＡＡＶを単離することができる。別の態様として、本発明者等の研究所において開発された新規な検出方法を利用することができる。この方法は、新規なそして／もしくは未知の血清型のＡＡＶ の検出に特によく適しており、そして引用することにより本明細書に組み込まれる「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列を検出及び／もしくは同定する方法並びにそれにより同定される新規な配列を単離する方法（“Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ／ｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ Ｔｈｅｒｅｂｙ”）」という表題の２００１年１１月１２日に出願された同時係属中の出願、米国特許出願第１０／２９１，５８３号の主題である。
【００３９】
あるいはまた、継代後に、細胞ペレットを標準的な方法に従ってＡＡＶビリオンの精製用に採取する。そのような標準的な方法の中には、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配精製、カラムクロマトグラフィー、及び文献において記述されているもの［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１１：２０７９−２０９１（２００２年１０月）］などのような技術がある。
【００４０】
例えば、細胞をトランスフェクション培地と一緒にスクレーパーにより採取し、そしてエタノール−ドライアイス及び３７℃の水浴における３回の凍結融解に供することができる。細胞を例えば４℃で１５分間遠心分離することができる。一般的には、本明細書に引用するＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを参照。
【００４１】
従って、本発明の方法は、標的ウイルス配列、特に組込みウイルス配列の検出、同定及び単離を可能にする。本発明はさらに、本発明の方法を用いて同定及び単離される新規なウイルスを提供する。いったんそのように単離及び同定されると、当業者に既知である方法を用いて新規なウイルスを特性化し、そして当業者に容易に明らかである様々な目的に利用することができる。
【００４２】
本発明の方法は、新規なＡＡＶ血清型を含むことができる、ＡＡＶ配列の検出、同定及び単離における使用に特によく適している。本発明の方法は、様々な疫学研究、生体内分布の研究、ＡＡＶベクター及び他の組込みウイルスから得られるベクターによる遺伝子治療のモニタリングに容易に用いることができる。従って、これらの方法は、臨床医、研究者及び疫学者による使用のために事前包装したキットにおける使用によく適している。
ＩＩ．診断キット
別の態様として、本発明は、サンプルにおける既知もしくは未知の組込み標的、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の存在を検出するための診断キットを提供する。そのようなキットは、とりわけ、稀な制限酵素、抽出したＤＮＡを継代するための細胞、ヘルパーウイルスプラスミド及び／もしくはウイルスを含有するバイアルを含むことができる。
【００４３】
本発明はさらに、本発明の方法に従って検出されるＡＡＶ血清型を同定するため及び／もしくは既知のＡＡＶから新規なＡＡＶを区別するために有用なキットを提供する。さらに、本発明のキットは、使用説明書、陰性及び／もしくは陽性コントロール、容器、サンプルの希釈剤及びバッファー、特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）比較のための表示図、使い捨て手袋、汚染除去使用説明書、アプリケーター棒もしくは容器、及びサンプル準備カップ、並びに培地、洗浄試薬及び濃縮試薬を包含する任意の所望の試薬を含むことができる。そのような試薬は、本明細書において記述する試薬の中から、そして通常の濃縮試薬の中から容易に選択することができる。一つの望ましい態様として、洗浄試薬は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような生理的ｐＨに酸性度を調節されている等張食塩水溶液であり；溶出試薬は０．４Ｍ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ、並びに濃縮試薬及び装置である。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはＮＨ４ＳＯ４のような試薬、もしくはフィルター装置のような装置が有用であり得ることを当業者は認識する。例えば、１００Ｋ膜を有するフィルター装置はｒＡＡＶを濃縮する。
【００４４】
本発明により提供されるキットは、本明細書において記述する方法を行うことそして生体内分布、疫学、ヒト及びＮＨＰにおける新規なＡＡＶ血清型の伝達形態の研究に有用である。
【００４５】
従って、本発明の方法及びキットは、標的ウイルス配列、特に組込みウイルス配列の検出、同定及び単離を可能にする。該方法及びキットは、新規なＡＡＶ血清型を含むことができる、ＡＡＶ配列の検出、同定及び単離における使用に特によく適している。
【００４６】
【実施例】
以下の実施例は、本発明のいくつかの特徴及び態様を例示する。
実施例１：アカゲザル組織におけるＡＡＶ８配列の検出及び定量
リアルタイムＰＣＲ分析（ＴａｑＭａｎ）用にＡＡＶ８キャプシド遺伝子の超可変領域４内に位置する一続きの配列に基づいて一組のプライマー及びプローブを考案した。ＴａｑＭａｎ分析は、２つの異なる集団の１１匹のアカゲザルの各々１０の組織からの１１０のＤＮＡサンプルにわたって行った。一匹のサル（９８Ｅ０５６）の心臓及び肝臓組織は、ＡＡＶ８配列が最も豊富であることが見出された。１μｇのＤＮＡ当たりのＡＡＶ８配列のゲノムコピーは心臓では８８０００、そして肝臓では２２０００である。これら２つのＤＮＡサンプルにおけるそのような多量のＡＡＶ８配列のために、これらはＡＡＶ８ウイルスのレスキューの優れた候補であると考えられた。
実施例２：組織ＤＮＡの制限酵素消化
サル組織ＤＮＡからＡＡＶ８をレスキューするために、適切な細胞へのＤＮＡの送達は第一の工程である。哺乳動物細胞への高分子量細胞ＤＮＡの直接トランスフェクションは、通常、乏しい遺伝子導入効率をもたらす。この障壁を克服するために、サル＃９８Ｅ０５６の５μｇの肝臓ＤＮＡをＡＡＶ８ゲノムにおける非カッター（ｎｏｎ−ｃｕｔｔｅｒ）であるＰｍｅＩで一晩処理し、そして次にフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させ、そしてＴＥ（１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ ８．０、０．５Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．０、ｄＨ２Ｏ）に溶解した。
実施例３：２９３細胞におけるＡＡＶ８のトランスフェクション及びレスキューこの研究では、ヒトアデノウイルス血清型５のＥ１遺伝子で形質転換したヒト胚腎臓繊維芽細胞細胞系、２９３細胞をその高いトランスフェクション能力（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）及び異なる血清型の様々なＡＡＶベクターを生産することにおける成功した利用のためにレスキュー用の宿主として選択した。異なる血清型の組換えＡＡＶの生産のための２９３細胞の三重トランスフェクションにおいて一般に用いられた方法であるリン酸カルシウム法は、この実験におけるトランスフェクションの方法であった。
【００４７】
ＡＡＶゲノムのレスキューのための別の重要な必要条件は、適切なアデノウイルスヘルパー機能の存在である。この実験において、我々は、ヒトアデノウイルス血清型５を２つの結果に基づいて出発するヘルパーとして選択した。第一のものは、２９３細胞の三重トランスフェクションにおけるＡｄ５ヘルパープラスミドの使用が、ＡＡＶ２／８ベクターの高収量生産をもたらすことであり、Ａｄ５が優れたヘルパーであることを示唆した。第二の結果は、高コピー数のＡＡＶ８配列が肝臓及び心臓において検出されたサル９８Ｅ０５６が、殺される前に肝静脈投与によって組換えアデノウイルスベクターで処理されたことであった。これは、アデノウイルスの感染が、このサルのいくつかの組織におけるＡＡＶ８ゲノムのレスキュー及び増幅をもたらしたという考察につながることができた。
【００４８】
２９３細胞をウェル当たり５ｘ１０５細胞の密度で１２ウェルプレートにおいて接種した。トランスフェクション及びレスキュー実験を以下のように実施した。
【００４９】
グループＡ−１：１μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ＋１μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＤＮＡ（キャリヤーＤＮＡ）
グループＡ−２：０．２μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ＋１．８μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＤＮＡ（キャリヤーＤＮＡ）
グループＢ−１：１μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ＋１μｇのｐＡｄΔＦ６ ＤＮＡ（非感染性Ａｄヘルパープラスミド）
グループＢ−２：０．２μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ＋１．８μｇのｐＡｄΔＦ６ ＤＮＡ（非感染性Ａｄヘルパープラスミド）
グループＣ−１：１μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ＋１μｇのｐＡｄＣＭＶＬａｃＺ（感染性Ａｄプラスミド）
グループＣ−２：０．２μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ＋１．８μｇのｐＡｄＣＭＶＬａｃＺ（感染性Ａｄプラスミド））
トランスフェクション後２４時間で、Ａ−１及びＡ−２の細胞にＡｄ５ｗｔウイルスを２のＭＯＩで感染させた。Ａ−１、Ａ−２、Ｂ−１及びＢ−２の細胞をトランスフェクション後９６時間で採取し、そして３サイクルの凍結／融解により溶解させた。Ｃ−１及びＣ−２の細胞は、トランスフェクション後１５日で完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められた後に粗ライセート調製用に採取した。
【００５０】
各グループからの全粗細胞ライセートを次に２９３細胞の１００ｍｍプレート上に継代した。グループＢ−１及びＢ−２には、細胞にＥ１欠失Ａｄ５ｗｔウイルスも５のＭＯＩで重複感染させた。コントロールとして、２９３細胞の１００ｍｍプレートに同じＡｄ５ｗｔウイルスを５のＭＯＩで感染させた。完全なＣＰＥが認められた場合、各感染を採取した。１／１０の各感染を３サイクルの凍結融解用に取っておき、そして次の継代用に２９３細胞の別の１００ｍｍプレート上に継代した。残りの感染は、全細胞ＤＮＡ及びタンパク質の調製用の細胞ペレットを集めるために回転して落とした。該工程を最初の特性化のための継代２及び３の各サンプル用に繰り返した。
実施例４：異なる継代で再感染した２９３細胞の全ＤＮＡ、タンパク質及び粗ライセートの特性化
Ａ．ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ
ＡＡＶ８配列が連続継代中にレスキューされそして増幅されるかどうかを調べるために、各実験グループの異なる継代から抽出した全ＤＮＡをＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子配列のＴａｑＭａｎ分析に供した。結果を以下に要約する（ＧＣ＝ゲノムコピー）。表１を参照。
【００５１】
【表１】
データは以下のことを示唆した：
Ａ−１、Ｂ−１及びＢ−２及びＣ−１グループにおいて、ＡＡＶ８ウイルスはトランスフェクション工程においてレスキューされ、そして連続継代中にさらに増幅された。そのような増幅は、おそらく２９３細胞におけるＡＡＶの限られたパッケージング能力及びアデノウイルスとＡＡＶ間の競合的増殖阻害のために継代中に劇的ではない。
【００５３】
Ａ−２及びＣ−２において０．２μｇのサルＤＮＡを用いた場合、あらゆる継代においていかなる有意なＡＡＶ８配列も検出されなかった。これは、ＡＡＶの最初のゲノムコピーの閾値が、２９３細胞におけるレスキュー及び増幅のアデノウイルス阻害を克服するために必要とされることを意味することができる。しかし、Ｂ−２の場合、ＡＡＶ８及びアデノウイルスレスキューの両方が同時に起こったので、アデノウイルス複製及びパッケージングによるＡＡＶ８レスキュー、複製及びパッケージングの阻害は害が少なく、より低いゲノムコピーでさえＡＡＶ８の成功レスキュー及び増幅につながる。
【００５４】
これは、どのようにしてそしていつアデノウイルスヘルパー機能を提供するかが、この方法によるＡＡＶのレスキュー及び増幅にとって重要であることを示唆する。
【００５５】
Ｂ．ＰＣＲクローニング
ＴａｑＭａｎデータは、ＡＡＶ８プローブ／プライマーと２９３細胞のＤＮＡ配列間のいくらかの交差反応性を示唆した。感染におけるＡＡＶ配列の存在を確かめるために、２つの追加試験を実施した。
【００５６】
１．ユニバーサルプライマー組を用いるＡＡＶシグネチャー領域の通常のＰＣＲ増幅
パッケージングされていないＡＡＶ８ゲノムを消化するためにＡ−１−Ｐ３、Ｃ−１−Ｐ３及びＡｄ−コントロール−Ｐ３の粗ライセートをＤＮアーゼＩで３７℃で１時間処理した。各々０．４μｌの処理したライセートを５０μｌのＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動により調べた。結果は、Ａ−１−Ｐ３及びＣ−１−Ｐ３サンプルにおいて予想される２５０ｂｐのシグネチャーＰＣＲ産物を示し、一方、Ａｄ−コントロール−Ｐ３は、全くバンドを示さなかった。これは、Ａ−１及びＣ−１においてＴａｑＭａｎにより捕捉されるシグナルがＡＡＶ配列であることを裏付けた。
【００５７】
２．特定のＡＡＶ配列を同定するためのＰＣＲクローニング及び塩基配列決定
ＡＡＶ配列のどの分子タイプ（一つもしくは複数）がこの実験においてレスキューされそしてパッケージングされたかを同定するために、全ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子の３’末端にまたがる３．１ｋｂの配列を増幅するように一対のユニベーサルプライマー組を考案した。ＰＣＲ産物をクローン化し、そして同定のために部分的に塩基配列を決定した。
【００５８】
Ｃ．ウェスタンブロット
粗ライセートにおけるＡＡＶウイルスの存在を確かめる別の方法として、異なる継代でのＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質発現を調べた。以前の実験において、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体、クローンＢ１は、ＡＡＶ１、５、７及び８からのキャプシドタンパク質とよく交差反応できることが見出された。ＡＡＶの全てのタイプの詳細な配列比較により、Ｒｅｐ領域における強い類似性が示された。ウェスタンブロット分析には、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体、クローン２５９．５を使用すると決定した。
【００５９】
いくつかの感染の継代３の細胞ペレットから全細胞タンパク質を抽出し、そして定量した。各々５μｇの全タンパク質をウェスタンブロット分析に用いた。結果を以下の表２に要約する。
【００６０】
【表２】
データは、ＡＡＶ８配列のゲノムコピーとＲｅｐ／Ｃａｐ発現間の相関関係を示唆し、細胞に与えたＡＡＶ８配列が転写的そして翻訳的に活性であることを示した。
実施例５：ＡＡＶ８ビリオンの増大
ＴａｑＭａｎ分析、ＰＣＲ／クローニング及びウェスタンブロット分析は、本明細書において記述するようなＡＡＶ配列の存在及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子発現を示した。
【００６２】
ＴａｑＭａｎ技術を用いて、サル＃９８Ｅ０５６における２つの組織はＡＡＶ８配列が最も豊富であることが決定されている。それらは心臓及び肝臓である（それぞれ、ＤＮＡのμｇ当たり８８，０００及び２２，０００ＧＣのＡＡＶ８）。組織ＤＮＡにおけるＡＡＶ８配列がレスキュー可能でありそしてビリオンにパッケージング可能であるかどうかを調べるために、このサルの肝臓ＤＮＡをＡＡＶ８ゲノムにおける非カッターＰｍｅＩで制限し、そして感染性もしくは非感染性アデノウイルスヘルパープラスミドと２９３細胞にトランスフェクションし、もしくは続いて２４時間後にアデノウイルスを感染させた。各トランスフェクションもしくはトランスフェクション／感染からの粗ライセートをトランスフェクション後７２時間で採取し、そして連続継代に供した。
【００６３】
より特に、サル肝臓から調製した細胞ＤＮＡをＰｍｅＩエンドヌクレアーゼで制限し、そして通常のリン酸カルシウム方法論を用いて感染性及び非感染性アデノウイルスプラスミドもしくはコントロールプラスミドと２９３細胞に共トランスフェクションした（アカゲザル肝臓ＤＮＡ）。コントロールプラスミドを擬似トランスフェクションに使用した（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）。非感染性アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ、Ｅ４及びＶＡＲＮＡヘルパー機能を提供した。感染性Ｅ１欠失組換えアデノウイルスプラスミドを２９３細胞において感染させるために使用した（ｐＡｄΔＦ６）。Ａ−１及びＡ−２グループでは、ヘルパーアデノウイルスをトランスフェクション後２４時間で加え、そして細胞ライセートを継代用に４８時間後に採取した（ｐＡｄＣＭＶＬａｃＺ）。Ｃ−１、Ｃ−２及びコントロールグループでは、細胞ライセートをトランスフェクション後７２時間で調製し、そしてヘルパーウイルスを第一の継代において２９３細胞に加えた（Ａｄ５ ｗｔウイルス）。表３を参照。
【００６４】
【表３】
粗ライセートにおけるＡＡＶウイルスの存在を確かめる方法として、異なる継代でのＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質発現を調べた。以前の実験において、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体、クローンＢ１は、ＡＡＶ１、５、７及び８からのキャプシドタンパク質とよく交差反応できることが見出された（データは示さない）。ＡＡＶの全てのタイプの詳細な配列比較もまた、Ｒｅｐ領域における強い類似性を示した。
【００６６】
ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（クローン２５９．５）をウェスタンブロット分析における使用のために選択した。実験Ｂ−１及びＢ−２の継代１の細胞ペレットから全細胞タンパク質を抽出し、そして定量した。各々２μｇの全タンパク質をｒｅｐ及びｃａｐのウェスタンブロット分析に用いた。Ｂ−１及びＢ−２グループの継代１から抽出した細胞ＤＮＡにおけるＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子配列の存在もまた、ＡＡＶ８ ｃａｐ特異的プライマー及びプローブを用いてＴａｑＭａｎにより定量した。
【００６７】
レスキューされるＡＡＶゲノムが実際にＡＡＶ８であることを決定するために、Ｃ−１及び擬似トランスフェクションの継代３のＤＮアーゼＩ処理した粗ライセートからの３．１ｋｂ ｃａｐ領域のＰＣＲ増幅及びクローニングを実施した。予想されるように、擬似トランスフェクションしたサンプルではいかなるＰＣＲバンドも検出されなかったが、Ｃ−１クローンの配列分析は、アデノウイルスヘルパーの存在下で２９３細胞においてレスキューされそしてパッケージングされたゲノムがＡＡＶ８であることを裏付けた（データは示さない）。
【００６８】
次の工程は、この分子存在のＡＡＶビリオンを単離することである。実施例６においてさらに記述するように、Ａ−１、Ｂ−１、Ｃ−１及びＡｄ−コントロールの粗ライセートを２９３細胞の１、５及び５０の１５０ｍｍプレート上に連続して継代した。細胞ペレットを標準的な方法に従ってＡＡＶビリオンのＣｓＣｌ勾配精製用に感染後４２時間で採取した。
実施例６：ＡＡＶ８ビリオンの透過型電子顕微鏡検査及び感染性クローンの作製いったんＡＡＶビリオンが単離されると、ＡＡＶビリオンの形態を示すために陰性染色サンプルの透過型電子顕微鏡検査を行う。さらに、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（５）：３９９４−４００３（１９９９年５月）に記述されている方法に従って、ビリオンにパッケージングされたＡＡＶゲノムの感染性分子クローンをさらなる特性化のために作製する。
【００６９】
ＡＡＶ８の物理的（ｐｈｙｓｉｃａｌ）ビリオンを調べるために、グループＣ−１の連続継代の粗ライセートを擬似トランスフェクショングループのものと一緒に５０プレート感染に増やし、そしてＡＡＶビリオンの精製のためのＣｓＣｌ勾配遠心分離に供した。ＡＡＶ８のゲノムコピー濃度は、ＴａｑＭａｎ分析により決定した。陰性染色サンプルの透過型電子顕微鏡検査を行った。結果（示さない）としてＣ−１サンプルは典型的なＡＡＶビリオンを示したが、擬似トランスフェクションはいかなる可視のＡＡＶ構造も有さなかった。
実施例７：脾臓組織において同定される新規なＡＡＶのレスキュー
本明細書において記述する方法（実施例３を参照）を用いて、アカゲザルの脾臓組織において同定される新規なサルＡＡＶをレスキューするために実験を行った。細胞ＤＮＡをＰｍｅＩで処理し、そして２９３細胞においてサルアデノウイルスＰａｎ６のＥ１欠失分子クローン、サルアデノウイルスＰａｎ９のＥ１欠失分子クローン及びヒトＡｄ５のＥ１欠失分子クローンで等量（各々１μｇ）で共トランスフェクションした。ＡＡＶ力価は、これらの実施例において記述するようにトランスフェクション後継代１でＴａｑＭａｎ分析により決定した。
【００７０】
【表４】
このデータは、サルアデノウイルス血清型がサルＡＡＶ血清型のレスキューにおいていっそう効率がよい可能性があることを示唆する。
【００７２】
本明細書に引用する全ての公開は、引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明は特定の好ましい態様に関連して記述されているが、本発明の精神からそれずに改変を行うことができると理解される。そのような改変は、請求項の範囲内に入るものとする。
【００７３】
本発明の特徴及び態様を示せば、以下のとおりである。
１． （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるＤＮＡを消化し；
（ｂ）消化したＤＮＡを細胞にトランスフェクションし；
（ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノウイルス機能が細胞において発現される条件下で培養し；
（ｄ）ヘルパー機能を発現する細胞において（ｃ）の培養工程から得られるライセートを継代し；そして
（ｅ）場合により継代工程からのライセートをさらなる継代に供する：
組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューの方法。
２． 消化工程をＰｍｅＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｒＩ、ＢｃｇＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａｂＩ、ＢｓｔＸＩ、ＤｒｄＩ、ＥｃｏＮＩ、ＦｓｅＩ及びＭａＭＩよりなる群から選択される制限酵素を用いて行う上記１に記載の方法。
３． 消化工程が、サンプルからのＤＮＡをＰｍｅＩとインキュベーションすること、フェノール／クロロホルム抽出を行うこと、エタノールで沈殿すること及び沈殿物を溶解することの工程をさらに含んでなる上記１もしくは２に記載の方法。
４． インキュベーションする工程を約１２〜４８時間行う上記３に記載の方法。
５． 哺乳動物細胞源が非ヒト霊長類もしくはヒトからの組織である上記１〜４のいずれかに記載の方法。
６． 工程（ｂ）の細胞をＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子産物の発現を導く調節制御要素の制御下のアデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子で安定に形質転換する上記１〜５のいずれかに記載の方法。
７． 工程（ｂ）の細胞が２９３細胞である上記１〜６のいずれかに記載の方法。
８． 工程（ｂ）の細胞がＡＡＶヘルパー機能を発現する上記１〜５のいずれかに記載の方法。
９． 工程（ｂ）の細胞がＡＡＶ ｒｅｐタンパク質を発現する上記１〜８のいずれかに記載の方法。
１０． 工程（ｂ）の細胞をアデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４（もしくはその機能性フラグメント）及びＶＡＩ ＲＮＡからなるアデノウイルス配列を含有するベクターと共トランスフェクションする上記１〜５のいずれかに記載の方法。
１１． 工程（ｂ）の細胞をアデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４（もしくはその機能性フラグメント）及びＶＡＩ ＲＮＡからなるアデノウイルス配列を含有するベクターと共トランスフェクションする上記１〜５のいずれかに記載の方法。
１２． アデノウイルスヘルパー機能をプラスミド上で提供する上記１〜５のいずれかに記載の方法。
１３． ヘルパー機能を一つもしくはそれ以上のアデノウイルス血清型により提供する上記１〜１２のいずれかに記載の方法。
１４． アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ機能をヒトアデノウイルスにより提供する上記１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５． 他の必要なアデノウイルスヘルパー機能をチンパンジーアデノウイルス血清型により提供する上記１４に記載の方法。
１６． 工程（ｂ）の細胞を０．２μｇ〜２μｇでトランスフェクションする上記１２〜１４のいずれかに記載の方法。
１７． 非感染性ヘルパーアデノウイルスプラスミドでトランスフェクションすること及び継代中に野生型アデノウイルスを細胞に重複感染させることの工程をさらに含んでなる上記１に記載の方法。
１８． 非感染性ヘルパーアデノウイルスプラスミドでトランスフェクションすること及び継代中にＥ１欠失アデノウイルスを細胞に重複感染させることの工程をさらに含んでなる上記１〜５のいずれかに記載の方法。
１９． 継代工程を２９３細胞において行う上記１〜１８のいずれかに記載の方法。
２０． 継代工程を繰り返す上記１〜１８のいずれかに記載の方法。
２１． （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるＤＮＡを消化し；
（ｂ）消化したＤＮＡを細胞にトランスフェクションし；
（ｃ）トランスフェクションした細胞をインキュベーションし；
（ｄ）トランスフェクションした細胞に、細胞がＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノウイルス機能を含有するようにアデノウイルスヘルパー機能を重複感染させ；
（ｅ）重複感染細胞をＡＡＶの複製に必要なヘルパー機能が発現される条件下で培養し；
（ｆ）重複感染培養物から粗ライセートを採取し；そして
（ｇ）粗ライセートを継代する：
組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキュー及び検出の方法。
２２． 採取する工程が、粗ライセートを得るために重複感染細胞培養物を凍結融解に供することをさらに含んでなる上記２１に記載の方法。
２３． 粗ライセートを２回もしくはそれ以上の継代に供する上記２１に記載の方法。
２４． （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるＤＮＡを消化し；
（ｂ）消化したＤＮＡ並びに宿主細胞により供給されないＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機能からなるアデノウイルス配列を含んでなる非感染性アデノウイルスヘルパープラスミドを共トランスフェクションし；
（ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機能のみが細胞において発現される条件下で培養し；
（ｄ）粗ライセートを得るために細胞培養物を処理し；
（ｅ）細胞に粗ライセートをトランスフェクションしそして細胞がＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノウイルス機能を含有するようにアデノウイルスヘルパー機能を細胞に重複感染させることにより粗ライセートを第一の継代に供し；そして
（ｆ）場合によりもう２回もしくはそれ以上継代する：
組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューの方法。
２５． ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるＤＮＡを消化し；
（ｂ）消化したＤＮＡ並びに宿主細胞により供給されないＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機能を含んでなる感染性アデノウイルスヘルパープラスミドを共トランスフェクションし；
（ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機能が細胞において発現される条件下で培養し；
（ｄ）粗ライセートを得るために細胞培養物を処理し；そして
（ｅ）粗ライセートを細胞にトランスフェクションすることにより場合により粗ライセートを２回もしくはそれ以上の継代に供する：
組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューの方法。
２６． ＡＡＶの存在に関して上記１、２２、２４もしくは２５の方法のいずれかから得られる粗ライセートをアッセイすることの工程を含んでなる、組織における細胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検出する方法。
２７． （ａ）細胞ペレットを提供するために上記１、２２、２４もしくは２５の方法のいずれかから得られる粗ライセートを遠心分離すること；及び
（ｂ）細胞ペレットからＡＡＶを精製すること：
の工程を含んでなる、組織における細胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法。
２８． 上記１、２２、２４もしくは２５のいずれかの方法による組織の細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューに有用なキット。
２９． 上記２６の方法により組織からの細胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検出するのに有用なキット。
３０． 上記２７の方法により組織からの細胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製するのに有用なキット。
Claims (12)
- （ａ）天然のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムにおいて切断しないレアカッター制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるＤＮＡを消化し；
（ｂ）消化したＤＮＡを細胞にトランスフェクションし；
（ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノウイルス機能が細胞において発現される条件下で培養し；
（ｄ）ヘルパー機能を発現する細胞において（ｃ）の培養工程から得られるライセートを継代し；そして
（ｅ）ライセートからＡＡＶを検出、同定及び / または単離する
の工程を含んでなる、組織からの細胞ＤＮＡからのＡＡＶの直接レスキューの方法。 - 工程（ｄ）からのライセートを更に２回もしくはそれ以上の継代に供することを含んでなる、請求項１の方法。
- （ａ）天然のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムにおいて切断しないレアカッター制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるＤＮＡを消化し；
（ｂ）消化したＤＮＡを細胞にトランスフェクションし；
（ｃ）トランスフェクションした細胞をインキュベーションし；
（ｄ）トランスフェクションした細胞に、細胞がＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノウイルス機能を含有するようにアデノウイルスヘルパー機能を重複感染させ；
（ｅ）重複感染細胞を、ＡＡＶの複製に必要なヘルパー機能が発現される条件下で培養し；
（ｆ）重複感染培養物からの粗ライセートを採取し；
（ｇ）粗ライセートを継代し；そして
（ｈ）ライセートからＡＡＶを検出、同定及び / または単離する
の工程を含んでなる、組織からの細胞ＤＮＡからのＡＡＶの直接レスキューの方法。 - （ａ）天然のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムにおいて切断しないレアカッター制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるＤＮＡを消化し；
（ｂ）消化したＤＮＡ並びに、宿主細胞により供給されないＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機能からなるアデノウイルス配列を含んでなる非感染性アデノウイルスヘルパープラスミドを、共トランスフェクションし；
（ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機能のみが細胞において発現される条件下で培養し；
（ｄ）粗ライセートを得るために細胞培養物を処理し；
（ｅ）細胞中に粗ライセートをトランスフェクションし、そして細胞がＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノウイルス機能を含有するようにアデノウイルスヘルパー機能を細胞に重複感染させることにより、粗ライセートを第一の継代に供し、；そして
（ｆ）ライセートからＡＡＶを検出、同定及び / または単離する
の工程を含んでなる、組織からの細胞ＤＮＡからのＡＡＶの直接レスキューの方法。 - 粗ライセートを細胞中にトランスフェクトすることにより、粗ライセートを２回もしくはそれ以上の継代に供することを含んでなる、請求項４の方法。
- ａ）天然のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムにおいて切断しないレアカッター制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるＤＮＡを消化し；
（ｂ）消化したＤＮＡ、並びに宿主細胞により供給されないＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機能を含んでなる感染性アデノウイルスヘルパープラスミドを、共トランスフェクションし；
（ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機能が細胞において発現される条件下で培養し；
（ｄ）粗ライセートを得るために細胞培養物を処理し；そして
（ｅ）ライセートからＡＡＶを検出、同定及び / または単離する
の工程を含んでなる、組織からの細胞ＤＮＡからのＡＡＶの直接レスキューの方法。 - 粗ライセートを細胞中にトランスフェクトすることにより、粗ライセートを２回もしくはそれ以上の継代に供することを含んでなる、請求項６の方法。
- アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の存在に関して請求項１、４もしくは６の方法のいずれかから得られる粗ライセートをアッセイすることの工程を含んでなる、組織における細胞ＤＮＡからＡＡＶを検出する方法。
- （ａ）細胞ペレットを提供するために請求項１、４もしくは６の方法のいずれかから得られる粗ライセートを遠心分離すること；及び
（ｂ）細胞ペレットからＡＡＶを精製すること：
の工程を含んでなる、組織における細胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法。 - （ａ）哺乳動物からのゲノムＤＮＡのサンプルのＤＮＡを消化できる、天然のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を切断しない１もしくはそれ以上のレアカッター制限酵素
（ｂ）ＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノウイルス機能を含む、ヘルパー機能を発現する細胞
を含んでなる、請求項１、４もしくは６のいずれかの方法による組織の細胞ＤＮＡからのＡＡＶの直接レスキューのためのキット。 - （ａ）哺乳動物からのゲノムＤＮＡのサンプルのＤＮＡを消化できる、天然のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を切断しない１もしくはそれ以上のレアカッター制限酵素
（ｂ）ＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノウイルス機能を含む、ヘルパー機能を発現する細胞
を含んでなる、請求項８の方法により組織からの細胞ＤＮＡからＡＡＶを検出するためのキット。 - （ａ）哺乳動物からのゲノムＤＮＡのサンプルのＤＮＡを消化できる、天然のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を切断しない１もしくはそれ以上のレアカッター制限酵素
（ｂ）ＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノウイルス機能を含む、ヘルパー機能を発現する細胞
を含んでなる、請求項９の方法により組織からの細胞ＤＮＡからＡＡＶを精製するためのキット。
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