JP2003310252A - 組織の細胞ｄｎａからの組込みウイルスの直接レスキュー及び増幅の方法 - Google Patents
組織の細胞ｄｎａからの組込みウイルスの直接レスキュー及び増幅の方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＮＨＰ組織の細胞ＤＮＡからＡＡＶウイルス
を単離する方法の提供、および、この方法を実施するた
めに有用なキットの提供。 【解決手段】 非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の細胞ＤＮＡを
２９３細胞にトランスフェクションし、ウイルスをレス
キューし、そしてアデノウイルスヘルパー機能の存在下
で連続継代によってそれを増幅する。
を単離する方法の提供、および、この方法を実施するた
めに有用なキットの提供。 【解決手段】 非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の細胞ＤＮＡを
２９３細胞にトランスフェクションし、ウイルスをレス
キューし、そしてアデノウイルスヘルパー機能の存在下
で連続継代によってそれを増幅する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】パルボウイルス科のメンバー
であるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７〜６ｋ
ｂ(Ｍｒ．１．５−２．０ｘ１０６)の一本鎖線状ＤＮＡ
ゲノムを有する小型のエンベロープの無い正二十面体ウ
イルスである。ＡＡＶは、精製されたアデノウイルスス
トックにおける汚染物(contaminant)として発見された
のでディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）
属に特定される。ＡＡＶの生活環は、ＡＡＶゲノムが感
染後に宿主染色体に部位特異的に組込まれる潜伏期及び
アデノウイルスもしくは単純ヘルペスウイルスのいずれ
かの重複感染後に、組込みゲノムを続いてレスキュー
し、複製し、そして感染性ウイルスにパッケージングす
る増殖もしくは生産期を含む。単純なゲノム構造、非病
原性、非分裂細胞を包含する、感染性についての広い宿
主範囲、及び潜在的な部位特異的染色体組込みの特性
は、ＡＡＶを遺伝子導入の魅力的な手段にする。最近の
研究は、ＡＡＶベクターが安定な遺伝子発現を得るため
の好ましい媒体であり得ることを示唆する。
であるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７〜６ｋ
ｂ(Ｍｒ．１．５−２．０ｘ１０６)の一本鎖線状ＤＮＡ
ゲノムを有する小型のエンベロープの無い正二十面体ウ
イルスである。ＡＡＶは、精製されたアデノウイルスス
トックにおける汚染物(contaminant)として発見された
のでディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）
属に特定される。ＡＡＶの生活環は、ＡＡＶゲノムが感
染後に宿主染色体に部位特異的に組込まれる潜伏期及び
アデノウイルスもしくは単純ヘルペスウイルスのいずれ
かの重複感染後に、組込みゲノムを続いてレスキュー
し、複製し、そして感染性ウイルスにパッケージングす
る増殖もしくは生産期を含む。単純なゲノム構造、非病
原性、非分裂細胞を包含する、感染性についての広い宿
主範囲、及び潜在的な部位特異的染色体組込みの特性
は、ＡＡＶを遺伝子導入の魅力的な手段にする。最近の
研究は、ＡＡＶベクターが安定な遺伝子発現を得るため
の好ましい媒体であり得ることを示唆する。
【０００２】
【従来の技術】現在まで、ＡＡＶの６種の異なる血清型
（ＡＡＶ１−６）が、ヒトもしくは非ヒト霊長類（ＮＨ
Ｐ）から単離され、十分に特性化され、そして遺伝子導
入用途のベクターとされている。これらの全ては、霊長
類及び非ヒト霊長類起源の汚染されたアデノウイルス調
製物もしくは組織検体のいずれかから感染性ウイルスと
して単離されている。これらの中で、ＡＡＶ１及びＡＡ
Ｖ４は非ヒト霊長類から単離され；ＡＡＶ２、３及び５
はヒトから得られ、そしてＡＡＶ６はヒトアデノウイル
ス調製物の汚染物であった。
（ＡＡＶ１−６）が、ヒトもしくは非ヒト霊長類（ＮＨ
Ｐ）から単離され、十分に特性化され、そして遺伝子導
入用途のベクターとされている。これらの全ては、霊長
類及び非ヒト霊長類起源の汚染されたアデノウイルス調
製物もしくは組織検体のいずれかから感染性ウイルスと
して単離されている。これらの中で、ＡＡＶ１及びＡＡ
Ｖ４は非ヒト霊長類から単離され；ＡＡＶ２、３及び５
はヒトから得られ、そしてＡＡＶ６はヒトアデノウイル
ス調製物の汚染物であった。
【０００３】核に侵入し、宿主に組込みそしてヘルパー
ウイルス共感染なしに潜伏感染を確立するＡＡＶの能力
を利用して、最近、我々は、非ヒト霊長類起源の異なる
組織から調製した細胞ＤＮＡからの新規なＡＡＶの配列
の単離のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づ
く方法を考案した。この方法を用いて、我々は少なくと
も１６分子タイプ及び８分子サブタイプの新規なＡＡＶ
を単離し、遺伝子導入用途におけるそれらの効率を評価
するためにそれらの二つに関して組換えウイルスを作製
した。
ウイルス共感染なしに潜伏感染を確立するＡＡＶの能力
を利用して、最近、我々は、非ヒト霊長類起源の異なる
組織から調製した細胞ＤＮＡからの新規なＡＡＶの配列
の単離のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づ
く方法を考案した。この方法を用いて、我々は少なくと
も１６分子タイプ及び８分子サブタイプの新規なＡＡＶ
を単離し、遺伝子導入用途におけるそれらの効率を評価
するためにそれらの二つに関して組換えウイルスを作製
した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】細胞源からＡＡＶビリ
オンを同定及び単離する信頼できる方法の必要性が依然
として当該技術分野にある。
オンを同定及び単離する信頼できる方法の必要性が依然
として当該技術分野にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、細胞ＤＮＡを
細胞にトランスフェクションし、ウイルスをレスキュー
し、そしてアデノウイルスヘルパー機能の存在下で連続
継代によってウイルスを増幅することにより組織の細胞
ＤＮＡから新規なＡＡＶウイルスを単離する独特な方法
を提供する。この方法は、組織、特に非ヒト霊長類（Ｎ
ＨＰ）及びヒト組織から新規なＡＡＶ及び他のヘルパー
依存性組込みウイルスを単離する非常に有用なそして実
用的な手段である。
細胞にトランスフェクションし、ウイルスをレスキュー
し、そしてアデノウイルスヘルパー機能の存在下で連続
継代によってウイルスを増幅することにより組織の細胞
ＤＮＡから新規なＡＡＶウイルスを単離する独特な方法
を提供する。この方法は、組織、特に非ヒト霊長類（Ｎ
ＨＰ）及びヒト組織から新規なＡＡＶ及び他のヘルパー
依存性組込みウイルスを単離する非常に有用なそして実
用的な手段である。
【０００６】本発明のこれら及び他の特徴は、以下の本
発明の詳細な記述から容易に明らかである。本明細書及
び請求項の全体にわたって使用する場合、「含んでなる
（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語及びとりわけ「含ん
でなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなってい
る」を包含するその変形には、他の成分、要素、整数、
工程などが含まれる。「からなる」もしくは「からなっ
ている」という用語は、他の成分、要素、整数、工程な
どを除く。
発明の詳細な記述から容易に明らかである。本明細書及
び請求項の全体にわたって使用する場合、「含んでなる
（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語及びとりわけ「含ん
でなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなってい
る」を包含するその変形には、他の成分、要素、整数、
工程などが含まれる。「からなる」もしくは「からなっ
ている」という用語は、他の成分、要素、整数、工程な
どを除く。
【０００７】
【発明の実施の形態】一つの態様として、本発明は、ヒ
トもしくは非ヒト組織からの細胞ＤＮＡからの組込みウ
イルスもしくは非ウイルス配列の直接レスキューの方法
を提供する。
トもしくは非ヒト組織からの細胞ＤＮＡからの組込みウ
イルスもしくは非ウイルス配列の直接レスキューの方法
を提供する。
【０００８】該方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
のようなヘルパーに依存する組込みウイルスのレスキュ
ーにおける使用に特によく適している。例えば、最近単
離された新規なＡＡＶ血清型を用いて、本発明の方法は
非常にうまく機能することが示された。ＡＡＶ８配列及
びｒｅｐ／ｃａｐタンパク質発現は、トランスフェクシ
ョン及び連続継代後に２９３細胞において劇的に増幅さ
れた。しかしながら、本明細書における実施例は、新規
なＡＡＶ血清型のレスキュー及び増幅を示すが、本発明
の方法は、既知及び未知のＡＡＶ血清型の両方、並びに
宿主細胞のゲノムに組込む他のウイルス及び非ウイルス
配列に容易に適用できる。そのような他のウイルス配列
には、とりわけ、レトロウイルス［例えば、ネコ白血病
ウイルス（ＦｅＬＶ）、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩ
Ｉ］、及びレンチウイルス亜科［例えば、ヒト免疫不全
ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩ
Ｖ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧
血ウイルス及びスプマウイルス亜科］が包含される。本
発明の方法の他の適当な使用は、当業者に容易に明らか
である。
のようなヘルパーに依存する組込みウイルスのレスキュ
ーにおける使用に特によく適している。例えば、最近単
離された新規なＡＡＶ血清型を用いて、本発明の方法は
非常にうまく機能することが示された。ＡＡＶ８配列及
びｒｅｐ／ｃａｐタンパク質発現は、トランスフェクシ
ョン及び連続継代後に２９３細胞において劇的に増幅さ
れた。しかしながら、本明細書における実施例は、新規
なＡＡＶ血清型のレスキュー及び増幅を示すが、本発明
の方法は、既知及び未知のＡＡＶ血清型の両方、並びに
宿主細胞のゲノムに組込む他のウイルス及び非ウイルス
配列に容易に適用できる。そのような他のウイルス配列
には、とりわけ、レトロウイルス［例えば、ネコ白血病
ウイルス（ＦｅＬＶ）、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩ
Ｉ］、及びレンチウイルス亜科［例えば、ヒト免疫不全
ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩ
Ｖ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧
血ウイルス及びスプマウイルス亜科］が包含される。本
発明の方法の他の適当な使用は、当業者に容易に明らか
である。
【０００９】本明細書において用いる場合、サンプルは
核酸を含有する任意の起源、例えば、組織、組織培養
物、細胞、細胞培養物、充実性腫瘍、及び限定なしに尿
及び血液を包含する生物学的流体である。これらの核酸
配列は、プラスミドからのＤＮＡもしくはＲＮＡ、細
菌、酵母、ウイルス、及び植物もしくは動物のような高
等生物を包含する任意の起源からの天然のＤＮＡもしく
はＲＮＡであることができる。一つの望ましい態様とし
て、細胞は非ヒト霊長類もしくはヒト起源からである。
しかしながら、様々な哺乳動物及び非哺乳動物種からの
細胞もまた利用することができる。サンプルの起源及び
本発明の方法の適用のために核酸を得る方法は、本発明
の制約ではない。場合により、本発明の方法は、ＤＮＡ
の起源に対して直接、もしくはある起源から得られる
（例えば抽出される）核酸に対して行うことができる。
核酸を含有する任意の起源、例えば、組織、組織培養
物、細胞、細胞培養物、充実性腫瘍、及び限定なしに尿
及び血液を包含する生物学的流体である。これらの核酸
配列は、プラスミドからのＤＮＡもしくはＲＮＡ、細
菌、酵母、ウイルス、及び植物もしくは動物のような高
等生物を包含する任意の起源からの天然のＤＮＡもしく
はＲＮＡであることができる。一つの望ましい態様とし
て、細胞は非ヒト霊長類もしくはヒト起源からである。
しかしながら、様々な哺乳動物及び非哺乳動物種からの
細胞もまた利用することができる。サンプルの起源及び
本発明の方法の適用のために核酸を得る方法は、本発明
の制約ではない。場合により、本発明の方法は、ＤＮＡ
の起源に対して直接、もしくはある起源から得られる
（例えば抽出される）核酸に対して行うことができる。
【００１０】細胞ＤＮＡは、様々な通常の技術のいずれ
かを用いて細胞源から抽出する。ＤＮＡもしくはＲＮＡ
は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により記述されているものの
ような、当業者に既知である様々な技術によりサンプル
から抽出する。
かを用いて細胞源から抽出する。ＤＮＡもしくはＲＮＡ
は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により記述されているものの
ような、当業者に既知である様々な技術によりサンプル
から抽出する。
【００１１】サンプルからのＤＮＡは、標的組込み外来
ＤＮＡ（例えばＡＡＶ）を切断せずに宿主生物に固有の
ゲノムＤＮＡを優先的に切断するように選択された制限
酵素の存在下でインキュベーションする。
ＤＮＡ（例えばＡＡＶ）を切断せずに宿主生物に固有の
ゲノムＤＮＡを優先的に切断するように選択された制限
酵素の存在下でインキュベーションする。
【００１２】典型的に、標的組込み外来ＤＮＡ（例えば
ＡＡＶ）の量は、サンプルにおける宿主ＤＮＡの量と比
較してわずかである。従って、この消化工程は、ＡＡＶ
を損なわずに保ちながら、細胞サンプルにおける宿主Ｄ
ＮＡの複数フラグメントへの消化をもたらす。望ましく
は、宿主ＤＮＡ及び使用する任意のヘルパーウイルスに
おける複数の認識部位を含有するが、標的ＡＡＶゲノム
（もしくは他の標的組込みＤＮＡ）における最低限の数
の認識部位のみを含有する制限酵素を選択する。最も望
ましくは、選択する制限酵素は、標的組込みＤＮＡにお
けるいかなる認識部位も含有しない。本願において、そ
のような制限酵素はレアカッター（ｒａｒｅ ｃｕｔｔ
ｅｒ）と称する。そのようなレアカッターの例には、例
えば、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｓｒＩ、Ｂｃ
ｇＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａｂＩ、ＢｓｔＸＩ、ＤｒｄＩ、
ＥｃｏＮＩ、ＦｓｅＩ、ＭａＭＩ、ＭｓｌＩ、Ｍｗｏ
Ｉ、ＰｓｈａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｗａＩ、ＸｃｍＩ及びＸ
ｍｎＩなどを包含する、７、８もしくはそれ以上の塩基
の認識部位を有するものが包含される。適当なレアカッ
ターは、文献においてそして様々なオンラインデータベ
ース、例えばＲＥＢＡＳＥＴＭデータベースにおいて当
業者が容易に利用できる情報を用いて同定することがで
きる。例えば、標的組込みＤＮＡがＡＡＶ血清型８であ
る場合の本発明の方法における使用に適当なレアカッタ
ーには、例えばＰｍｅＩが包含される。本発明の方法の
ための他の適当なカッターは、様々なコンピュータープ
ログラム及び／もしくはオンラインデータベースを用い
て容易に決定することができる。適当な制限酵素は、と
りわけ、例えば、Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｏ
ｂｉｏｇｅｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒ
ｏｃｈｅ、ＢＢ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａを包含す
る様々な商業供給元から入手できる。
ＡＡＶ）の量は、サンプルにおける宿主ＤＮＡの量と比
較してわずかである。従って、この消化工程は、ＡＡＶ
を損なわずに保ちながら、細胞サンプルにおける宿主Ｄ
ＮＡの複数フラグメントへの消化をもたらす。望ましく
は、宿主ＤＮＡ及び使用する任意のヘルパーウイルスに
おける複数の認識部位を含有するが、標的ＡＡＶゲノム
（もしくは他の標的組込みＤＮＡ）における最低限の数
の認識部位のみを含有する制限酵素を選択する。最も望
ましくは、選択する制限酵素は、標的組込みＤＮＡにお
けるいかなる認識部位も含有しない。本願において、そ
のような制限酵素はレアカッター（ｒａｒｅ ｃｕｔｔ
ｅｒ）と称する。そのようなレアカッターの例には、例
えば、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｓｒＩ、Ｂｃ
ｇＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａｂＩ、ＢｓｔＸＩ、ＤｒｄＩ、
ＥｃｏＮＩ、ＦｓｅＩ、ＭａＭＩ、ＭｓｌＩ、Ｍｗｏ
Ｉ、ＰｓｈａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｗａＩ、ＸｃｍＩ及びＸ
ｍｎＩなどを包含する、７、８もしくはそれ以上の塩基
の認識部位を有するものが包含される。適当なレアカッ
ターは、文献においてそして様々なオンラインデータベ
ース、例えばＲＥＢＡＳＥＴＭデータベースにおいて当
業者が容易に利用できる情報を用いて同定することがで
きる。例えば、標的組込みＤＮＡがＡＡＶ血清型８であ
る場合の本発明の方法における使用に適当なレアカッタ
ーには、例えばＰｍｅＩが包含される。本発明の方法の
ための他の適当なカッターは、様々なコンピュータープ
ログラム及び／もしくはオンラインデータベースを用い
て容易に決定することができる。適当な制限酵素は、と
りわけ、例えば、Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｏ
ｂｉｏｇｅｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒ
ｏｃｈｅ、ＢＢ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａを包含す
る様々な商業供給元から入手できる。
【００１３】いったん適切なサンプル及び消化酵素を選
択すると、通常の消化技術を利用する。典型的には、制
限酵素と混合したＤＮＡのサンプルを約１２〜約４８時
間インキュベーションする。この後、通常のフェノール
／クロロホルム抽出工程を行う。例えば、フェノール／
クロロホルム抽出を利用し、続いてエタノールで沈殿さ
せ、そして沈殿物を方法工程の残部における使用のため
に（例えばＴＥもしくは別の適当なバッファーに）溶解
することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，５．２８−５．
３２，Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｅ．３−Ｅ．４（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９
８９）を参照。他の適当な方法は、利用する制限酵素の
製造業者もしくは販売者により提供されることができる
か、もしくはそうでなければ当業者に既知である。
択すると、通常の消化技術を利用する。典型的には、制
限酵素と混合したＤＮＡのサンプルを約１２〜約４８時
間インキュベーションする。この後、通常のフェノール
／クロロホルム抽出工程を行う。例えば、フェノール／
クロロホルム抽出を利用し、続いてエタノールで沈殿さ
せ、そして沈殿物を方法工程の残部における使用のため
に（例えばＴＥもしくは別の適当なバッファーに）溶解
することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，５．２８−５．
３２，Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｅ．３−Ｅ．４（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９
８９）を参照。他の適当な方法は、利用する制限酵素の
製造業者もしくは販売者により提供されることができる
か、もしくはそうでなければ当業者に既知である。
【００１４】サンプルにおける細胞ＤＮＡを消化した
後、消化したＤＮＡを通常の技術を用いて適当な細胞に
トランスフェクションする。好適には、消化したＤＮＡ
を、細胞においてトランスフェクションされる細胞ＤＮ
Ａの濃度を最大にするようにトランスフェクションす
る。例えば、これは５０〜８０％の密度の細胞で５ｘ１
０ ５細胞当たり約０．２μｇ〜約２μｇのＤＮＡの量で
あることができる。しかしながら、これらの量は、とり
わけ、細胞プレートのサイズ及び細胞タイプを考慮に入
れて、必要もしくは所望に応じて調整することができ
る。
後、消化したＤＮＡを通常の技術を用いて適当な細胞に
トランスフェクションする。好適には、消化したＤＮＡ
を、細胞においてトランスフェクションされる細胞ＤＮ
Ａの濃度を最大にするようにトランスフェクションす
る。例えば、これは５０〜８０％の密度の細胞で５ｘ１
０ ５細胞当たり約０．２μｇ〜約２μｇのＤＮＡの量で
あることができる。しかしながら、これらの量は、とり
わけ、細胞プレートのサイズ及び細胞タイプを考慮に入
れて、必要もしくは所望に応じて調整することができ
る。
【００１５】宿主細胞自体は、原核（例えば細菌）細
胞、並びに昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を包含
する真核細胞を包含する任意の生物学的生物の中から選
択することができる。宿主細胞は、ＤＮＡの感染もしく
はトランスフェクション及びトランスフェクションした
ＤＮＡの発現が可能である。特に望ましい宿主細胞は、
限定なしに、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／
２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ
１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、Ｈ
ｅＬａ、２９３細胞（これは機能性アデノウイルスＥ１
を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１
０８０、ＨｅｐＧ２、並びにヒト、サル、マウス、ラッ
ト、ウサギ及びハムスターを包含する哺乳動物から得ら
れる一次（ｐｒｉｍａｒｙ）繊維芽細胞、肝細胞及び筋
芽細胞のような細胞を包含する任意の哺乳動物種の中か
ら選択する。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明
の制約ではなく；また哺乳動物細胞のタイプ、すなわ
ち、繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などもそうではな
い。
胞、並びに昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を包含
する真核細胞を包含する任意の生物学的生物の中から選
択することができる。宿主細胞は、ＤＮＡの感染もしく
はトランスフェクション及びトランスフェクションした
ＤＮＡの発現が可能である。特に望ましい宿主細胞は、
限定なしに、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／
２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ
１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、Ｈ
ｅＬａ、２９３細胞（これは機能性アデノウイルスＥ１
を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１
０８０、ＨｅｐＧ２、並びにヒト、サル、マウス、ラッ
ト、ウサギ及びハムスターを包含する哺乳動物から得ら
れる一次（ｐｒｉｍａｒｙ）繊維芽細胞、肝細胞及び筋
芽細胞のような細胞を包含する任意の哺乳動物種の中か
ら選択する。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明
の制約ではなく；また哺乳動物細胞のタイプ、すなわ
ち、繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などもそうではな
い。
【００１６】好適には、ＡＡＶの単離及び増幅のため
に、細胞はＡＡＶの複製に必要なヘルパー機能を含有す
るかもしくは提供される。これらのヘルパー機能には、
少なくとも、アデノウイルスからのＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ
２ａ、Ｅ４、及びＶＡＩ ＲＮＡ機能が包含される。例
えば、１９９９年９月２３日に公開されたＷＯ ９９／
４７６９１；ＲＭ Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒ．，５：７９３−８０１（１９９４）；１９９９年
４月１日に公開されたＷＯ ９９／１５６８５を参照。
さらに、場合により、ヘルパーＡＡＶ機能を供給するこ
とができ、そしてこれはサンプルにおけるＡＡＶの低コ
ピー数が推測される場合に望ましい。
に、細胞はＡＡＶの複製に必要なヘルパー機能を含有す
るかもしくは提供される。これらのヘルパー機能には、
少なくとも、アデノウイルスからのＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ
２ａ、Ｅ４、及びＶＡＩ ＲＮＡ機能が包含される。例
えば、１９９９年９月２３日に公開されたＷＯ ９９／
４７６９１；ＲＭ Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒ．，５：７９３−８０１（１９９４）；１９９９年
４月１日に公開されたＷＯ ９９／１５６８５を参照。
さらに、場合により、ヘルパーＡＡＶ機能を供給するこ
とができ、そしてこれはサンプルにおけるＡＡＶの低コ
ピー数が推測される場合に望ましい。
【００１７】アデノウイルスにより提供されるヘルパー
機能は、野生型アデノウイルスにより供給することがで
き、そしてヒトもしくは非ヒト起源、好ましくは非ヒト
霊長類（ＮＨＰ）起源であることができる。Ａｄ５型
［Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ７３２６０］を包含する多
数のヒトアデノウイルス型のＤＮＡ配列がＧｅｎｂａｎ
ｋから入手できる。アデノウイル配列は、血清型２、
３、４、７、１２及び４０のような、そしてさらに任意
の現在同定されているヒト型［例えば、Ｈｏｒｗｉｔ
ｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ
Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，２ｄ
ｅｄ．，ｐｐ．１６７９−１７２１（１９９０）を参
照］を包含する任意の既知のアデノウイルス血清型から
得ることができる。同様に、非ヒト霊長類（例えば、チ
ンバンジー、アカゲザル、マカク及び他のサル種）もし
くは他の非ヒト哺乳動物に感染することが既知であるア
デノウイルスもまた本発明のベクター構築物において用
いることができる。例えば、適当なアデノウイルスはＡ
ＴＣＣから入手でき、そしてとりわけ、限定なしに、米
国特許第６，０８３，７１６号に記述されている、チン
パンジーアデノウイルスＰａｎ５［ＶＲ−５９１］、Ｐ
ａｎ６［ＶＲ−５９２］、Ｐａｎ７［ＶＲ−５９３］並
びにＣ１及びＣ６８（Ｐａｎ９）；限定なしにＳＶ１
［ＶＲ−１９５］；ＳＶ２５［ＳＶ−２０１］；ＳＶ３
５；ＳＶ１５；ＳＶ−３４；ＳＶ−３６；ＳＶ−３７を
包含するサルアデノウイウルス、並びにヒヒアデノウイ
ルス［ＶＲ−２７５］が包含される。野生型アデノウイ
ルスに加えて、必要なヘルパー機能を保有する組換えウ
イルスもしくは非ウイルスベクター（例えば、感染性及
び非感染性プラスミド、エピソームなど）を利用するこ
とができる。そのような組換えウイルスは当該技術分野
において既知であり、そして公開された技術に従って製
造することができる。例えば、ハイブリッドＡｄ／ＡＡ
Ｖウイルスを記述する、米国特許第５，８７１，９８２
号及び米国特許６，２５１，６７７を参照。アデノウイ
ルス型の選択は、以下の本発明を限定すると予測されな
い。様々なアデノウイルス株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａ
ｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手でき、もしく
は様々な商業及び公共の供給元から要求に応じて入手で
きる。さらに、多数のそのような株の配列は、例えばＰ
ｕｂＭｅｄ及びＧｅｎＢａｎｋを包含する様々なデータ
ベースから入手できる。以下の実施例では、便宜上、ア
デノウイルス５型（Ａｄ５）、Ｐａｎ６及びＰａｎ９を
使用する。しかしながら、他のアデノウイルス株から得
られる匹敵する領域を容易に選択しそしてこれらの血清
型の代わりに（もしくは組み合わせて）本発明において
使用できることを当業者は理解する。
機能は、野生型アデノウイルスにより供給することがで
き、そしてヒトもしくは非ヒト起源、好ましくは非ヒト
霊長類（ＮＨＰ）起源であることができる。Ａｄ５型
［Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ７３２６０］を包含する多
数のヒトアデノウイルス型のＤＮＡ配列がＧｅｎｂａｎ
ｋから入手できる。アデノウイル配列は、血清型２、
３、４、７、１２及び４０のような、そしてさらに任意
の現在同定されているヒト型［例えば、Ｈｏｒｗｉｔ
ｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ
Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，２ｄ
ｅｄ．，ｐｐ．１６７９−１７２１（１９９０）を参
照］を包含する任意の既知のアデノウイルス血清型から
得ることができる。同様に、非ヒト霊長類（例えば、チ
ンバンジー、アカゲザル、マカク及び他のサル種）もし
くは他の非ヒト哺乳動物に感染することが既知であるア
デノウイルスもまた本発明のベクター構築物において用
いることができる。例えば、適当なアデノウイルスはＡ
ＴＣＣから入手でき、そしてとりわけ、限定なしに、米
国特許第６，０８３，７１６号に記述されている、チン
パンジーアデノウイルスＰａｎ５［ＶＲ−５９１］、Ｐ
ａｎ６［ＶＲ−５９２］、Ｐａｎ７［ＶＲ−５９３］並
びにＣ１及びＣ６８（Ｐａｎ９）；限定なしにＳＶ１
［ＶＲ−１９５］；ＳＶ２５［ＳＶ−２０１］；ＳＶ３
５；ＳＶ１５；ＳＶ−３４；ＳＶ−３６；ＳＶ−３７を
包含するサルアデノウイウルス、並びにヒヒアデノウイ
ルス［ＶＲ−２７５］が包含される。野生型アデノウイ
ルスに加えて、必要なヘルパー機能を保有する組換えウ
イルスもしくは非ウイルスベクター（例えば、感染性及
び非感染性プラスミド、エピソームなど）を利用するこ
とができる。そのような組換えウイルスは当該技術分野
において既知であり、そして公開された技術に従って製
造することができる。例えば、ハイブリッドＡｄ／ＡＡ
Ｖウイルスを記述する、米国特許第５，８７１，９８２
号及び米国特許６，２５１，６７７を参照。アデノウイ
ルス型の選択は、以下の本発明を限定すると予測されな
い。様々なアデノウイルス株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａ
ｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手でき、もしく
は様々な商業及び公共の供給元から要求に応じて入手で
きる。さらに、多数のそのような株の配列は、例えばＰ
ｕｂＭｅｄ及びＧｅｎＢａｎｋを包含する様々なデータ
ベースから入手できる。以下の実施例では、便宜上、ア
デノウイルス５型（Ａｄ５）、Ｐａｎ６及びＰａｎ９を
使用する。しかしながら、他のアデノウイルス株から得
られる匹敵する領域を容易に選択しそしてこれらの血清
型の代わりに（もしくは組み合わせて）本発明において
使用できることを当業者は理解する。
【００１８】一つの態様として、細胞は、ＡＡＶを増幅
する継代中の汚染ウイルスの相同的組換えを防ぐために
アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ及び／もしくはＥ４ ＯＲ
Ｆ６のみを含有する。別の態様として、細胞はアデノウ
イルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子機能を安定に発現し、そ
して他の必要なアデノウイルスヘルパー機能をトランス
に提供される。適当な細胞の例は、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［Ａ
ＴＣＣ］，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０
１１０−２２０９から入手できる細胞系からである２９
３細胞である。他の適当な細胞系は、ＡＴＣＣ、商業供
給元から入手でき、もしくは文献に記述されている。
する継代中の汚染ウイルスの相同的組換えを防ぐために
アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ及び／もしくはＥ４ ＯＲ
Ｆ６のみを含有する。別の態様として、細胞はアデノウ
イルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子機能を安定に発現し、そ
して他の必要なアデノウイルスヘルパー機能をトランス
に提供される。適当な細胞の例は、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［Ａ
ＴＣＣ］，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０
１１０−２２０９から入手できる細胞系からである２９
３細胞である。他の適当な細胞系は、ＡＴＣＣ、商業供
給元から入手でき、もしくは文献に記述されている。
【００１９】ＡＡＶヘルパー機能が供給される場合、例
えば、サンプルにおけるＡＡＶの低コピー数が推測され
る場合、宿主細胞は、場合により安定に含有することが
でき、もしくはそうでなければＡＡＶヘルパー機能を提
供されることができる。一つの態様として、ＡＡＶヘル
パー機能は、ｃａｐなしに存在するｒｅｐ機能である。
この態様として、ｒｅｐ機能は、単一のＡＡＶ血清型に
より供給することができる。あるいはまた、２種、３種
もしくはそれ以上の異なるＡＡＶ血清型からのｒｅｐ機
能を選択することができる。好適には、ｒｅｐ機能は、
任意の所望のＡＡＶ血清型の中から選択することができ
る。
えば、サンプルにおけるＡＡＶの低コピー数が推測され
る場合、宿主細胞は、場合により安定に含有することが
でき、もしくはそうでなければＡＡＶヘルパー機能を提
供されることができる。一つの態様として、ＡＡＶヘル
パー機能は、ｃａｐなしに存在するｒｅｐ機能である。
この態様として、ｒｅｐ機能は、単一のＡＡＶ血清型に
より供給することができる。あるいはまた、２種、３種
もしくはそれ以上の異なるＡＡＶ血清型からのｒｅｐ機
能を選択することができる。好適には、ｒｅｐ機能は、
任意の所望のＡＡＶ血清型の中から選択することができ
る。
【００２０】適当なＡＡＶ血清型には、文献に記述され
ている、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、Ａ
ＡＶ５もしくはＡＡＶ６、２００２年１１月１２日に出
願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３３６３０
号の主題であるＡＡＶ８；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ
０２／３３６３１号の主題であるＡＡＶ９；及び同時係
属中の米国特許出願第１０／２９１，５８３号に同定さ
れているＡＡＶ７、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１
２などのようなＡＡＶ血清型が包含され、これらは引用
することにより本明細書に組み込まれる。さらに、ＡＡ
Ｖ７及びＡＡＶ８の配列は記述されている［Ｇ−Ｐ．Ｇ
ａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃ
ｉ ＵＳＡ，９９（１８）：１１８５４−１１８５９
（２００２年９月３日）；ＧｅｎＢａｎｋデータベース
受託番号ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ７）及び受託番号Ａ
Ｆ５１３８５２（ＡＡＶ８）］。様々なＡＡＶ血清型を
これらの同時係属中の出願に記述されている方法に従っ
て単離することができ、もしくはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴ
ＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ Ｖｉｒｇｉｎｉａを包含す
る様々な供給元から入手することができる。これらのＡ
ＡＶ血清型の配列は公開されており、そして多くはＰｕ
ｂＭｅｄ及びＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースから
入手できる。
ている、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、Ａ
ＡＶ５もしくはＡＡＶ６、２００２年１１月１２日に出
願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３３６３０
号の主題であるＡＡＶ８；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ
０２／３３６３１号の主題であるＡＡＶ９；及び同時係
属中の米国特許出願第１０／２９１，５８３号に同定さ
れているＡＡＶ７、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１
２などのようなＡＡＶ血清型が包含され、これらは引用
することにより本明細書に組み込まれる。さらに、ＡＡ
Ｖ７及びＡＡＶ８の配列は記述されている［Ｇ−Ｐ．Ｇ
ａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃ
ｉ ＵＳＡ，９９（１８）：１１８５４−１１８５９
（２００２年９月３日）；ＧｅｎＢａｎｋデータベース
受託番号ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ７）及び受託番号Ａ
Ｆ５１３８５２（ＡＡＶ８）］。様々なＡＡＶ血清型を
これらの同時係属中の出願に記述されている方法に従っ
て単離することができ、もしくはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴ
ＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ Ｖｉｒｇｉｎｉａを包含す
る様々な供給元から入手することができる。これらのＡ
ＡＶ血清型の配列は公開されており、そして多くはＰｕ
ｂＭｅｄ及びＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースから
入手できる。
【００２１】別の態様として、ｒｅｐ及びｃａｐの両方
をＡＡＶヘルパー機能として利用する。この態様とし
て、ｒｅｐ機能及びｃａｐ機能を同じＡＡＶ血清型によ
りもしくは異なるＡＡＶ血清型から供給することができ
る。所望に応じて、ｒｅｐ機能及び／もしくはｃａｐ機
能を２種、３種もしくはそれ以上の異なるＡＡＶ血清型
により供給することができ、ここで、ｒｅｐのＡＡＶの
起源は、ｃａｐのＡＡＶ血清型の起源と同じもしくは異
なる。好適には、ｒｅｐ及びｃａｐ機能を任意の所望の
ＡＡＶ血清型の中から選択することができる。
をＡＡＶヘルパー機能として利用する。この態様とし
て、ｒｅｐ機能及びｃａｐ機能を同じＡＡＶ血清型によ
りもしくは異なるＡＡＶ血清型から供給することができ
る。所望に応じて、ｒｅｐ機能及び／もしくはｃａｐ機
能を２種、３種もしくはそれ以上の異なるＡＡＶ血清型
により供給することができ、ここで、ｒｅｐのＡＡＶの
起源は、ｃａｐのＡＡＶ血清型の起源と同じもしくは異
なる。好適には、ｒｅｐ及びｃａｐ機能を任意の所望の
ＡＡＶ血清型の中から選択することができる。
【００２２】本発明において有用な一つの宿主細胞は、
ｒｅｐ及びｃａｐをコードする配列で安定に形質転換さ
れそしてアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ及びＥ４ＯＲＦ６
ＤＮＡでトランスフェクションされる宿主細胞であ
る。Ｂ−５０（ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９４６３）のよう
な安定なｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ発現細胞系もしく
は米国特許第５，６５８，７８５号に記述されているも
のもまた同様に用いることができる。別の望ましい宿主
細胞は、Ｅ４ＯＲＦ６を発現するために十分な最低限の
アデノウイルスＤＮＡを含有する。さらに別の細胞系を
他のＡＡＶ ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ配列を用いて
構築することができる。そのような技術には、周知であ
りそして上記に引用するＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ
ｌ．に記述されているｃＤＮＡ及びゲノムクローニン
グ、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた、アデノウイ
ルス及びＡＡＶゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配
列の使用、合成法、並びに所望のヌクレオチド配列を提
供する任意の他の適当な方法が包含される。
ｒｅｐ及びｃａｐをコードする配列で安定に形質転換さ
れそしてアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ及びＥ４ＯＲＦ６
ＤＮＡでトランスフェクションされる宿主細胞であ
る。Ｂ−５０（ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９４６３）のよう
な安定なｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ発現細胞系もしく
は米国特許第５，６５８，７８５号に記述されているも
のもまた同様に用いることができる。別の望ましい宿主
細胞は、Ｅ４ＯＲＦ６を発現するために十分な最低限の
アデノウイルスＤＮＡを含有する。さらに別の細胞系を
他のＡＡＶ ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ配列を用いて
構築することができる。そのような技術には、周知であ
りそして上記に引用するＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ
ｌ．に記述されているｃＤＮＡ及びゲノムクローニン
グ、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた、アデノウイ
ルス及びＡＡＶゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配
列の使用、合成法、並びに所望のヌクレオチド配列を提
供する任意の他の適当な方法が包含される。
【００２３】場合により、所望のＡＡＶヘルパー機能、
例えばｒｅｐ及び／もしくはｃａｐは、所望のヘルパー
機能をコードする配列を保有する一つもしくはそれ以上
のベクターにより宿主細胞に提供される。例えば、米国
特許６，２０３，９７５［場合により組換えアデノウイ
ルスに結合したｒｅｐ／ｃａｐタンパク質を保有するプ
ラスミド］及び米国特許第６，２５８，５９５号［ｒｅ
ｐ及び／もしくはｃａｐ機能を保有する多数のプラスミ
ドを記述する］を参照。ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、それ
らの発現制御配列と一緒に、単一のベクター上で供給す
ることができ、もしくは各配列をそれ自体のベクター上
で供給することができる。好ましくは、ｒｅｐ及びｃａ
ｐ配列は、同じベクター上で供給される。あるいはま
た、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、宿主細胞に導入されるべ
き他のＤＮＡ配列、例えばヘルパーアデノウイルス機能
を含有するベクター上で供給することができる。好まし
くは、ｒｅｐもしくはｃａｐタンパク質を発現するプロ
モーターは、当業者に既知であるかもしくは上記に説明
するような構成性、誘導性もしくは天然のプロモーター
のいずれかであることができる。一つの態様として、Ａ
ＡＶ Ｐ５プロモーター配列をｒｅｐタンパク質の発現
に用いる。任意のＡＡＶ起源から得ることができるが、
パルボウイルスＰ５プロモーターは、好ましくは、ｒｅ
ｐ及びｃａｐ遺伝子配列を提供する血清型と同じ血清型
である。あるいはまた、プロモーターは、ｒｅｐ及びｃ
ａｐ配列を提供するものと別のＡＡＶ型からのＰ５プロ
モーターであることができる。他のヒトもしくは他の動
物に感染することが既知であるＡＡＶもまたＰ５プロモ
ーターを提供することができる。これらの配列のいずれ
かを提供するＡＡＶの選択は、本発明を限定しない。別
の態様として、ｒｅｐのプロモーターは誘導性プロモー
ターである。上記に説明するように、誘導性プロモータ
ーには、限定なしに、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌ
ｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーター；デキサメ
タゾン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴ
Ｖ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系；
エクジソン昆虫プロモーター；テトラサイクリン抑制
系；テトラサイクリン誘導系；ＲＵ４８６-誘導系；及
びラパマイシン誘導系が包含される。ｒｅｐ発現の一つ
の好ましいプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ
７プロモーターにより調節されるｒｅｐ遺伝子、及びｃ
ａｐ遺伝子を含んでなるベクターは、Ｔ７ポリメラーゼ
を構成的もしくは誘導的のいずれかで発現する細胞にト
ランスフェクションもしくは形質転換される。１９９８
年３月１２日に公開されたＷＯ ９８／１００８８を参
照。
例えばｒｅｐ及び／もしくはｃａｐは、所望のヘルパー
機能をコードする配列を保有する一つもしくはそれ以上
のベクターにより宿主細胞に提供される。例えば、米国
特許６，２０３，９７５［場合により組換えアデノウイ
ルスに結合したｒｅｐ／ｃａｐタンパク質を保有するプ
ラスミド］及び米国特許第６，２５８，５９５号［ｒｅ
ｐ及び／もしくはｃａｐ機能を保有する多数のプラスミ
ドを記述する］を参照。ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、それ
らの発現制御配列と一緒に、単一のベクター上で供給す
ることができ、もしくは各配列をそれ自体のベクター上
で供給することができる。好ましくは、ｒｅｐ及びｃａ
ｐ配列は、同じベクター上で供給される。あるいはま
た、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、宿主細胞に導入されるべ
き他のＤＮＡ配列、例えばヘルパーアデノウイルス機能
を含有するベクター上で供給することができる。好まし
くは、ｒｅｐもしくはｃａｐタンパク質を発現するプロ
モーターは、当業者に既知であるかもしくは上記に説明
するような構成性、誘導性もしくは天然のプロモーター
のいずれかであることができる。一つの態様として、Ａ
ＡＶ Ｐ５プロモーター配列をｒｅｐタンパク質の発現
に用いる。任意のＡＡＶ起源から得ることができるが、
パルボウイルスＰ５プロモーターは、好ましくは、ｒｅ
ｐ及びｃａｐ遺伝子配列を提供する血清型と同じ血清型
である。あるいはまた、プロモーターは、ｒｅｐ及びｃ
ａｐ配列を提供するものと別のＡＡＶ型からのＰ５プロ
モーターであることができる。他のヒトもしくは他の動
物に感染することが既知であるＡＡＶもまたＰ５プロモ
ーターを提供することができる。これらの配列のいずれ
かを提供するＡＡＶの選択は、本発明を限定しない。別
の態様として、ｒｅｐのプロモーターは誘導性プロモー
ターである。上記に説明するように、誘導性プロモータ
ーには、限定なしに、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌ
ｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーター；デキサメ
タゾン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴ
Ｖ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系；
エクジソン昆虫プロモーター；テトラサイクリン抑制
系；テトラサイクリン誘導系；ＲＵ４８６-誘導系；及
びラパマイシン誘導系が包含される。ｒｅｐ発現の一つ
の好ましいプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ
７プロモーターにより調節されるｒｅｐ遺伝子、及びｃ
ａｐ遺伝子を含んでなるベクターは、Ｔ７ポリメラーゼ
を構成的もしくは誘導的のいずれかで発現する細胞にト
ランスフェクションもしくは形質転換される。１９９８
年３月１２日に公開されたＷＯ ９８／１００８８を参
照。
【００２４】ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質を提
供する代表的な分子は、プラスミド、例えば、ｐＭＴ−
Ｒｅｐ／Ｃａｐ、ｐＰ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐ及びｐＭＭＴ
Ｖ−Ｒｅｐ／Ｃａｐである。これらのプラスミドは、ネ
オマイシン選択マーカー遺伝子を含有し、そしてそれら
の天然のＰ５プロモーター（ｐＰ５−Ｒｅｐ／Ｃａ
ｐ）、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネインプロモーター
（ｐＭＴＲｅｐ／Ｃａｐ）、もしくはデキサメタゾン
（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロ
モーター（ｐＭＭＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐ）のいずれかに
より導かれるＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現する。
これらのタンパク質は様々な手段により細胞に提供する
ことができるが、本発明の代表的な方法には様々なプラ
スミドの使用が包含される。プラスミドｐＭＴ−Ｒｅｐ
／Ｃａｐの構築のためには、ＯＲＦ６配列をｐＭＴＥ４
ＯＲＦ６プラスミド［Ｇ．Ｐ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８９３４−８９４３（１９９
６）］からＢａｍＨＩ消化により取り除き、そしてｐＳ
ｕｂ２０１プラスミド［ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８
（１９８９）］を鋳型として用いてＰＣＲ増幅により製
造した４．１ｋｂのｒｅｐ／ｃａｐフラグメントで置換
した。プラスミドｐＭＭＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐは、ｐＭ
ＭＴＶＥ４ＯＲＦ６プラスミド［Ｇａｏ ｅｔ ａ
ｌ．，上記に引用］をベクターバックボーンとして用い
たことを除いて、ｐＭＴ−Ｒｅｐ／Ｃａｐと同じように
構築した。Ｐ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐの構築のためには、Ｍ
Ｔプロモーター及びＯＲＦ６配列をｐＭＴＥ４ＯＲＦ６
プラスミド［Ｇ．Ｐ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．，７０：８９３４−８９４３（１９９６）］から
ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化により取り除き、そしてｐ
Ｓｕｂ２０１プラスミド［ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ｅ
ｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２
８（１９８９）］からＸｂａＩ消化により単離した４．
３ｋｂのＰ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐフラグメントで置換し
た。プラスミド構築は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ
ｌ，上記に引用に記述されているもののような通常の遺
伝子工学方法を含んだ。上記に引用する参考文献の全て
は、引用することにより本明細書に組み込まれる。
供する代表的な分子は、プラスミド、例えば、ｐＭＴ−
Ｒｅｐ／Ｃａｐ、ｐＰ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐ及びｐＭＭＴ
Ｖ−Ｒｅｐ／Ｃａｐである。これらのプラスミドは、ネ
オマイシン選択マーカー遺伝子を含有し、そしてそれら
の天然のＰ５プロモーター（ｐＰ５−Ｒｅｐ／Ｃａ
ｐ）、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネインプロモーター
（ｐＭＴＲｅｐ／Ｃａｐ）、もしくはデキサメタゾン
（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロ
モーター（ｐＭＭＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐ）のいずれかに
より導かれるＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現する。
これらのタンパク質は様々な手段により細胞に提供する
ことができるが、本発明の代表的な方法には様々なプラ
スミドの使用が包含される。プラスミドｐＭＴ−Ｒｅｐ
／Ｃａｐの構築のためには、ＯＲＦ６配列をｐＭＴＥ４
ＯＲＦ６プラスミド［Ｇ．Ｐ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８９３４−８９４３（１９９
６）］からＢａｍＨＩ消化により取り除き、そしてｐＳ
ｕｂ２０１プラスミド［ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８
（１９８９）］を鋳型として用いてＰＣＲ増幅により製
造した４．１ｋｂのｒｅｐ／ｃａｐフラグメントで置換
した。プラスミドｐＭＭＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐは、ｐＭ
ＭＴＶＥ４ＯＲＦ６プラスミド［Ｇａｏ ｅｔ ａ
ｌ．，上記に引用］をベクターバックボーンとして用い
たことを除いて、ｐＭＴ−Ｒｅｐ／Ｃａｐと同じように
構築した。Ｐ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐの構築のためには、Ｍ
Ｔプロモーター及びＯＲＦ６配列をｐＭＴＥ４ＯＲＦ６
プラスミド［Ｇ．Ｐ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．，７０：８９３４−８９４３（１９９６）］から
ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化により取り除き、そしてｐ
Ｓｕｂ２０１プラスミド［ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ｅ
ｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２
８（１９８９）］からＸｂａＩ消化により単離した４．
３ｋｂのＰ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐフラグメントで置換し
た。プラスミド構築は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ
ｌ，上記に引用に記述されているもののような通常の遺
伝子工学方法を含んだ。上記に引用する参考文献の全て
は、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００２５】ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐタンパク質を
提供する様々な他のプラスミド構築物は当該技術分野に
おいて既知であり、そして本発明の宿主細胞において用
いることができる。例えば、ｒｅｐ及び／もしくはｃａ
ｐ構築物は、上記の構築物において言及するプロモータ
ーとｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ遺伝子間のスペーサー
を省くことができる。ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子の３’にＰ
５プロモーターを配置する米国特許第５，６２２，８５
６号に記述されているもののような、当該技術分野の他
の構築物もまたこれに関連して用いることができる。
提供する様々な他のプラスミド構築物は当該技術分野に
おいて既知であり、そして本発明の宿主細胞において用
いることができる。例えば、ｒｅｐ及び／もしくはｃａ
ｐ構築物は、上記の構築物において言及するプロモータ
ーとｒｅｐ及び／もしくはｃａｐ遺伝子間のスペーサー
を省くことができる。ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子の３’にＰ
５プロモーターを配置する米国特許第５，６２２，８５
６号に記述されているもののような、当該技術分野の他
の構築物もまたこれに関連して用いることができる。
【００２６】ｒｅｐ及び／もしくはｃａｐタンパク質を
提供する分子は、これらの成分を宿主細胞に導入する任
意の形態であることができる。一つの態様として、この
分子はプラスミドの形態であり、これはマーカー遺伝子
のもののような他の非ウイルス配列を含有することがで
きる。好適には、この分子はＡＡＶ ＩＴＲを含有せ
ず、そして一般にＡＡＶパッケージング配列を含有しな
い。従って、様々なベクターが、宿主細胞にＡＡＶヘル
パー機能を送達することが既知である。しかしながら、
ＡＡＶヘルパー機能の送達のための適切なベクターの選
択は、本発明の制約ではない。
提供する分子は、これらの成分を宿主細胞に導入する任
意の形態であることができる。一つの態様として、この
分子はプラスミドの形態であり、これはマーカー遺伝子
のもののような他の非ウイルス配列を含有することがで
きる。好適には、この分子はＡＡＶ ＩＴＲを含有せ
ず、そして一般にＡＡＶパッケージング配列を含有しな
い。従って、様々なベクターが、宿主細胞にＡＡＶヘル
パー機能を送達することが既知である。しかしながら、
ＡＡＶヘルパー機能の送達のための適切なベクターの選
択は、本発明の制約ではない。
【００２７】本発明によれば、細胞において安定に(sta
bly)含有されない任意の所望のヘルパー機能（例えば、
アデノウイルス、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、もし
くは他のヘルパー機能）は、適当なベクターにより細胞
に提供される。本明細書において用いる場合、ベクター
は、宿主細胞に送達することができる任意の遺伝子要
素、例えば、その上に保有する配列を導入する裸のＤＮ
Ａ、プラスミド（感染性もしくは非感染性）、ファー
ジ、エピソーム、トランスポゾン、コスミド、ウイルス
などである。選択したベクターは、トランスフェクショ
ン、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮ
Ａ被覆ペレット、感染及びプロトプラスト融合を包含す
る任意の適当な方法により細胞に送達することができ
る。トランスフェクションは、便宜のためにのみ本明細
書の全体にわたって言及するが、細胞に遺伝子要素を導
入する方法に対する限定ではない。
bly)含有されない任意の所望のヘルパー機能（例えば、
アデノウイルス、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、もし
くは他のヘルパー機能）は、適当なベクターにより細胞
に提供される。本明細書において用いる場合、ベクター
は、宿主細胞に送達することができる任意の遺伝子要
素、例えば、その上に保有する配列を導入する裸のＤＮ
Ａ、プラスミド（感染性もしくは非感染性）、ファー
ジ、エピソーム、トランスポゾン、コスミド、ウイルス
などである。選択したベクターは、トランスフェクショ
ン、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮ
Ａ被覆ペレット、感染及びプロトプラスト融合を包含す
る任意の適当な方法により細胞に送達することができ
る。トランスフェクションは、便宜のためにのみ本明細
書の全体にわたって言及するが、細胞に遺伝子要素を導
入する方法に対する限定ではない。
【００２８】従って、全ての必要なヘルパー機能が宿主
細胞において安定に含有されない場合、本明細書におい
て記述するように、ヘルパー機能を共トランスフェクシ
ョン、感染もしくは重複感染により供給する。好適に
は、細胞に１〜５ｘ１０５細胞当たり約０．２μｇ〜約
２μｇのＤＮＡ、そしてより好ましくは５ｘ１０５細胞
当たり約１μｇ〜約１．８μｇのＤＮＡの量でヘルパー
を共トランスフェクション／感染させる。本発明は、細
胞のこの濃度に限定されず、それはウェルプレート、細
胞タイプ、もしくは当業者に既知である他の因子により
変えることができる（例えば、１０３以下の細胞〜１０
１２以上の細胞）。制限酵素で消化したＤＮＡ及びヘル
パーベクターは、好適には、１：１〜１：１０の消化し
たＤＮＡ：ヘルパーの比率で細胞に提供する。あるいは
また、ヘルパーベクターより多量の消化したＤＮＡを細
胞に提供することができる。
細胞において安定に含有されない場合、本明細書におい
て記述するように、ヘルパー機能を共トランスフェクシ
ョン、感染もしくは重複感染により供給する。好適に
は、細胞に１〜５ｘ１０５細胞当たり約０．２μｇ〜約
２μｇのＤＮＡ、そしてより好ましくは５ｘ１０５細胞
当たり約１μｇ〜約１．８μｇのＤＮＡの量でヘルパー
を共トランスフェクション／感染させる。本発明は、細
胞のこの濃度に限定されず、それはウェルプレート、細
胞タイプ、もしくは当業者に既知である他の因子により
変えることができる（例えば、１０３以下の細胞〜１０
１２以上の細胞）。制限酵素で消化したＤＮＡ及びヘル
パーベクターは、好適には、１：１〜１：１０の消化し
たＤＮＡ：ヘルパーの比率で細胞に提供する。あるいは
また、ヘルパーベクターより多量の消化したＤＮＡを細
胞に提供することができる。
【００２９】従って、本発明の方法によれば、消化した
ＤＮＡを標的配列のレスキュー及び増幅のために宿主細
胞にトランスフェクションする。一例として、本発明の
方法は、霊長類（ヒトもしくは非ヒト）組織からＡＡＶ
をレスキューするために利用する。
ＤＮＡを標的配列のレスキュー及び増幅のために宿主細
胞にトランスフェクションする。一例として、本発明の
方法は、霊長類（ヒトもしくは非ヒト）組織からＡＡＶ
をレスキューするために利用する。
【００３０】一つの態様として、消化したＤＮＡを宿主
細胞に一晩トランスフェクションし；細胞を一晩インキ
ュベーションし、そして次にヘルパーアデノウイルスを
重複感染させ；完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）後に採取
し、そして場合によりさらに継代する。本明細書におい
て用いる場合、重複感染は、宿主細胞により提供されな
い任意の必要なヘルパー機能を提供するヘルパーウイル
スの送達をさす。例えば、ヘルパー機能をアデノウイル
スにより提供する場合、ＡＡＶパッケージング及び複製
は、少なくとも、Ｅ１機能（すなわち、Ｅ１ａ及びＥ１
ｂ）、Ｅ２ａ、Ｅ４（もしくはＯＲＦ６フラグメントの
ようなその機能性フラグメント）及びＶＡＩ ＲＮＡを
必要とする。宿主細胞がＥ１機能を提供しない場合、ヘ
ルパーベクター、例えばヘルパーアデノウイルスがこれ
らの機能を供給する。好ましくは、Ｅ１機能は、宿主細
胞において安定に含有される。
細胞に一晩トランスフェクションし；細胞を一晩インキ
ュベーションし、そして次にヘルパーアデノウイルスを
重複感染させ；完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）後に採取
し、そして場合によりさらに継代する。本明細書におい
て用いる場合、重複感染は、宿主細胞により提供されな
い任意の必要なヘルパー機能を提供するヘルパーウイル
スの送達をさす。例えば、ヘルパー機能をアデノウイル
スにより提供する場合、ＡＡＶパッケージング及び複製
は、少なくとも、Ｅ１機能（すなわち、Ｅ１ａ及びＥ１
ｂ）、Ｅ２ａ、Ｅ４（もしくはＯＲＦ６フラグメントの
ようなその機能性フラグメント）及びＶＡＩ ＲＮＡを
必要とする。宿主細胞がＥ１機能を提供しない場合、ヘ
ルパーベクター、例えばヘルパーアデノウイルスがこれ
らの機能を供給する。好ましくは、Ｅ１機能は、宿主細
胞において安定に含有される。
【００３１】従って、選択した宿主細胞のトランスフェ
クション後に、選択した宿主細胞がヘルパー機能の発現
及びＡＡＶの複製をできるように細胞をその後培養す
る。典型的には、細胞を通常の条件下で約１８〜約３０
時間、便宜上約２４時間培養し、この時点でそれらにア
デノウイルスヘルパーウイルスを重複感染させる。
クション後に、選択した宿主細胞がヘルパー機能の発現
及びＡＡＶの複製をできるように細胞をその後培養す
る。典型的には、細胞を通常の条件下で約１８〜約３０
時間、便宜上約２４時間培養し、この時点でそれらにア
デノウイルスヘルパーウイルスを重複感染させる。
【００３２】重複感染には、野生型アデノウイルス遺伝
子機能を提供するウイルスベクターを利用することがで
き、もしくはＥ１アデノウイルス機能を提供する組換え
アデノウイルスゲノムを提供する。あるいはまた、細胞
系がＥ１遺伝子機能を提供する場合、Ｅ１を除く全ての
アデノウイルス遺伝子機能を含有するウイルスベクター
を利用することができる。しかしながら、好適には、宿
主細胞に少なくともＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ及びＶＡＩ
ＲＮＡ機能を提供する。アデノウイルスヘルパー機能
は、細胞における他のヘルパー機能を提供するものと同
じアデノウイルス血清型から、もしくはトランス相補性
（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）血清型から
であることができる。例えば、ヒトＡｄ５ Ｅ１ａ及び
Ｅ１ｂを発現する細胞系並びにヒトもしくはサルアデノ
ウイルスヘルパー機能（例えばチンパンジーＣ６８）を
保有するヘルパーウイルスを利用することができる。あ
るいはまた、ヒトＡｄ５ Ｅ１ａ及びＥ１ｂを発現する
細胞系、アデノウイルスヘルパー機能を保有する第一の
ヘルパーベクター、並びに重複感染工程用のアデノウイ
ルスを利用することができる。多数の他の組み合わせが
可能であり、そして当業者に容易に明らかである。好適
には、ヘルパーウイルスは、２〜５の範囲の感染多重度
（ＭＯＩ）で提供される。しかしながら、他の適当なＭ
ＯＩを当業者は容易に決定することができる。
子機能を提供するウイルスベクターを利用することがで
き、もしくはＥ１アデノウイルス機能を提供する組換え
アデノウイルスゲノムを提供する。あるいはまた、細胞
系がＥ１遺伝子機能を提供する場合、Ｅ１を除く全ての
アデノウイルス遺伝子機能を含有するウイルスベクター
を利用することができる。しかしながら、好適には、宿
主細胞に少なくともＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ及びＶＡＩ
ＲＮＡ機能を提供する。アデノウイルスヘルパー機能
は、細胞における他のヘルパー機能を提供するものと同
じアデノウイルス血清型から、もしくはトランス相補性
（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）血清型から
であることができる。例えば、ヒトＡｄ５ Ｅ１ａ及び
Ｅ１ｂを発現する細胞系並びにヒトもしくはサルアデノ
ウイルスヘルパー機能（例えばチンパンジーＣ６８）を
保有するヘルパーウイルスを利用することができる。あ
るいはまた、ヒトＡｄ５ Ｅ１ａ及びＥ１ｂを発現する
細胞系、アデノウイルスヘルパー機能を保有する第一の
ヘルパーベクター、並びに重複感染工程用のアデノウイ
ルスを利用することができる。多数の他の組み合わせが
可能であり、そして当業者に容易に明らかである。好適
には、ヘルパーウイルスは、２〜５の範囲の感染多重度
（ＭＯＩ）で提供される。しかしながら、他の適当なＭ
ＯＩを当業者は容易に決定することができる。
【００３３】任意の所望のヘルパーＡＡＶ機能は、消化
したＤＮＡのトランスフェクションの時点もしくは重複
感染の時点のいずれかで供給することができる。典型的
には、完全なＣＰＥが認められた後に細胞を採取し、こ
れは通常、重複感染後約７２〜約９６時間である。細胞
は、通常の技術を用いて採取する。典型的には、培養物
を１回もしくは好ましくは数回の凍結融解に供し、そし
て得られる粗ライセートを次の継代もしくは標的ＤＮＡ
の検出用に集める。
したＤＮＡのトランスフェクションの時点もしくは重複
感染の時点のいずれかで供給することができる。典型的
には、完全なＣＰＥが認められた後に細胞を採取し、こ
れは通常、重複感染後約７２〜約９６時間である。細胞
は、通常の技術を用いて採取する。典型的には、培養物
を１回もしくは好ましくは数回の凍結融解に供し、そし
て得られる粗ライセートを次の継代もしくは標的ＤＮＡ
の検出用に集める。
【００３４】場合により、第一の継代からの全細胞ＤＮ
Ａ及びタンパク質を含有するペレットを、培養及び収集
工程を繰り返すことによりさらなる継代に供する。場合
により、適当なベクターは、１回もしくはそれ以上の追
加の継代工程中に追加のＡＡＶヘルパー機能を提供する
ことができる。これらの工程は、必要応じて、例えば全
部で２〜５０継代にわたって繰り返すことができる。し
かしながら、継代工程は、所望に応じて、さらに少な
い、例えば全部で２〜３０継代、２〜２０継代、２〜１
０継代、２〜５継代、もしくはそれ以上であることがで
きる。
Ａ及びタンパク質を含有するペレットを、培養及び収集
工程を繰り返すことによりさらなる継代に供する。場合
により、適当なベクターは、１回もしくはそれ以上の追
加の継代工程中に追加のＡＡＶヘルパー機能を提供する
ことができる。これらの工程は、必要応じて、例えば全
部で２〜５０継代にわたって繰り返すことができる。し
かしながら、継代工程は、所望に応じて、さらに少な
い、例えば全部で２〜３０継代、２〜２０継代、２〜１
０継代、２〜５継代、もしくはそれ以上であることがで
きる。
【００３５】第二の態様として、消化したＤＮＡは、最
低限のアデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４（もしくはその機能
性フラグメント）及びＶＡＩ ＲＮＡ機能のみを提供す
るアデノウイルスヘルパープラスミドと共にアデノウイ
ルスＥ１機能を発現する宿主細胞に共トランスフェクシ
ョンし；採取し；そして第一の継代でウイルスを重複感
染させる。あるいはまた、宿主細胞はＥ１機能を提供せ
ず、そしてこれらの機能は、他のヘルパー機能を提供す
るものと同じもしくは異なることができるヘルパーベク
ター上で供給される。任意の所望のヘルパーＡＡＶ機能
は、消化したＤＮＡのトランスフェクションの時点もし
くは重複感染の時点のいずれかで供給することができ
る。
低限のアデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４（もしくはその機能
性フラグメント）及びＶＡＩ ＲＮＡ機能のみを提供す
るアデノウイルスヘルパープラスミドと共にアデノウイ
ルスＥ１機能を発現する宿主細胞に共トランスフェクシ
ョンし；採取し；そして第一の継代でウイルスを重複感
染させる。あるいはまた、宿主細胞はＥ１機能を提供せ
ず、そしてこれらの機能は、他のヘルパー機能を提供す
るものと同じもしくは異なることができるヘルパーベク
ター上で供給される。任意の所望のヘルパーＡＡＶ機能
は、消化したＤＮＡのトランスフェクションの時点もし
くは重複感染の時点のいずれかで供給することができ
る。
【００３６】この第二の態様では、いかなるＣＰＥも認
められず、そして細胞は、典型的に、通常の技術を用い
てトランスフェクション後約７２〜約９６時間後に採取
する。典型的には、培養物を上記のような凍結融解に供
し、そして粗ライセートを継代用に集める。この時点
で、アデノウイルスヘルパー機能を好ましくは感染性プ
ラスミドもしくはウイルスの形態で供給することが必要
である。その後、培養物を上記の第一の態様において記
述するように継代する。さらに、場合により、消化した
ＤＮＡでの最初のトランスフェクションの時点、もしく
は好ましくは、第一の継代（すなわち、重複感染で）を
開始する時点で共トランスフェクションもしくは感染に
より細胞系に任意の所望のＡＡＶ機能を提供することが
できる。場合により、追加のＡＡＶヘルパー機能（例え
ばｒｅｐ）を１回もしくはそれ以上の追加の継代中に供
給することができる。
められず、そして細胞は、典型的に、通常の技術を用い
てトランスフェクション後約７２〜約９６時間後に採取
する。典型的には、培養物を上記のような凍結融解に供
し、そして粗ライセートを継代用に集める。この時点
で、アデノウイルスヘルパー機能を好ましくは感染性プ
ラスミドもしくはウイルスの形態で供給することが必要
である。その後、培養物を上記の第一の態様において記
述するように継代する。さらに、場合により、消化した
ＤＮＡでの最初のトランスフェクションの時点、もしく
は好ましくは、第一の継代（すなわち、重複感染で）を
開始する時点で共トランスフェクションもしくは感染に
より細胞系に任意の所望のＡＡＶ機能を提供することが
できる。場合により、追加のＡＡＶヘルパー機能（例え
ばｒｅｐ）を１回もしくはそれ以上の追加の継代中に供
給することができる。
【００３７】さらに第三の態様として、消化したＤＮＡ
は、感染性プラスミドと共に宿主細胞に共トランスフェ
クションする。典型的に、感染性プラスミドは、全長ア
デノウイルスゲノムを含有する。しかしながら、Ｅ１機
能を発現する細胞系にトランスフェクションする場合、
感染性プラスミドは、Ｅ１が欠失しているかもしくは非
機能性にされていることを除いて全長アデノウイルスゲ
ノムを含有することができる。場合により、細胞はま
た、任意の所望のＡＡＶヘルパー機能でトランスフェク
ションされる。通常の技術を用いてＣＰＥが認められた
後に細胞を培養する。典型的には、細胞を上記のように
凍結融解に供し、そして粗ライセートを次の継代もしく
は標的ＤＮＡの検出用に集める。
は、感染性プラスミドと共に宿主細胞に共トランスフェ
クションする。典型的に、感染性プラスミドは、全長ア
デノウイルスゲノムを含有する。しかしながら、Ｅ１機
能を発現する細胞系にトランスフェクションする場合、
感染性プラスミドは、Ｅ１が欠失しているかもしくは非
機能性にされていることを除いて全長アデノウイルスゲ
ノムを含有することができる。場合により、細胞はま
た、任意の所望のＡＡＶヘルパー機能でトランスフェク
ションされる。通常の技術を用いてＣＰＥが認められた
後に細胞を培養する。典型的には、細胞を上記のように
凍結融解に供し、そして粗ライセートを次の継代もしく
は標的ＤＮＡの検出用に集める。
【００３８】上記の３つの別の態様のいずれを利用する
かにかかわらず、第一の継代からの全細胞ＤＮＡ及びタ
ンパク質を含有する粗ライセートを、場合により、トラ
ンスフェクション、培養及び収集工程を繰り返すことに
よりさらなる継代に供する。これらの工程は、必要応じ
て、例えば全部で２〜５０継代にわたって繰り返すこと
ができる。しかしながら、継代工程は、所望に応じて、
さらに少ない、例えば全部で２〜３０、２〜２０、２〜
１０、２〜５、もしくはそれ以上であることができる実
施する最終継代工程からの細胞ペレットの収集後に、標
的組込みＤＮＡ、すなわち、ＡＡＶの存在を検出するた
めにペレット中の細胞ＤＮＡ及びタンパク質をアッセイ
する。この検出工程は、任意の適当な方法を用いて行う
ことができる。一つの態様として、ＴａｑＭａｎ ＰＣ
Ｒ技術を利用する。一般的には、本明細書に引用するＳ
ａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを参照。別の代案として、
ゲノム歩行技術（Ｓｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９
９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
２３：１０８７−１０８８，Ｆｒｉｅｚｎｅｒ−Ｄｅｇ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６１：６９７２−６９８５，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，
ＣＡ）を用いて感染性ＡＡＶを単離することができる。
別の態様として、本発明者等の研究所において開発され
た新規な検出方法を利用することができる。この方法
は、新規なそして／もしくは未知の血清型のＡＡＶ
の検出に特によく適しており、そして引用することに
より本明細書に組み込まれる「アデノ随伴ウイルス（Ａ
ＡＶ）配列を検出及び／もしくは同定する方法並びにそ
れにより同定される新規な配列を単離する方法（“Ａ
Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ／ｏ
ｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ Ｔｈｅｒｅｂ
ｙ”）」という表題の２００１年１１月１２日に出願さ
れた同時係属中の出願、米国特許出願第１０／２９１，
５８３号の主題である。
かにかかわらず、第一の継代からの全細胞ＤＮＡ及びタ
ンパク質を含有する粗ライセートを、場合により、トラ
ンスフェクション、培養及び収集工程を繰り返すことに
よりさらなる継代に供する。これらの工程は、必要応じ
て、例えば全部で２〜５０継代にわたって繰り返すこと
ができる。しかしながら、継代工程は、所望に応じて、
さらに少ない、例えば全部で２〜３０、２〜２０、２〜
１０、２〜５、もしくはそれ以上であることができる実
施する最終継代工程からの細胞ペレットの収集後に、標
的組込みＤＮＡ、すなわち、ＡＡＶの存在を検出するた
めにペレット中の細胞ＤＮＡ及びタンパク質をアッセイ
する。この検出工程は、任意の適当な方法を用いて行う
ことができる。一つの態様として、ＴａｑＭａｎ ＰＣ
Ｒ技術を利用する。一般的には、本明細書に引用するＳ
ａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを参照。別の代案として、
ゲノム歩行技術（Ｓｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９
９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
２３：１０８７−１０８８，Ｆｒｉｅｚｎｅｒ−Ｄｅｇ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６１：６９７２−６９８５，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，
ＣＡ）を用いて感染性ＡＡＶを単離することができる。
別の態様として、本発明者等の研究所において開発され
た新規な検出方法を利用することができる。この方法
は、新規なそして／もしくは未知の血清型のＡＡＶ
の検出に特によく適しており、そして引用することに
より本明細書に組み込まれる「アデノ随伴ウイルス（Ａ
ＡＶ）配列を検出及び／もしくは同定する方法並びにそ
れにより同定される新規な配列を単離する方法（“Ａ
Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ／ｏ
ｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ Ｔｈｅｒｅｂ
ｙ”）」という表題の２００１年１１月１２日に出願さ
れた同時係属中の出願、米国特許出願第１０／２９１，
５８３号の主題である。
【００３９】あるいはまた、継代後に、細胞ペレットを
標準的な方法に従ってＡＡＶビリオンの精製用に採取す
る。そのような標準的な方法の中には、塩化セシウム
（ＣｓＣｌ）勾配精製、カラムクロマトグラフィー、及
び文献において記述されているもの［Ｇａｏ ｅｔ ａ
ｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１１：２０７９
−２０９１（２００２年１０月）］などのような技術が
ある。
標準的な方法に従ってＡＡＶビリオンの精製用に採取す
る。そのような標準的な方法の中には、塩化セシウム
（ＣｓＣｌ）勾配精製、カラムクロマトグラフィー、及
び文献において記述されているもの［Ｇａｏ ｅｔ ａ
ｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１１：２０７９
−２０９１（２００２年１０月）］などのような技術が
ある。
【００４０】例えば、細胞をトランスフェクション培地
と一緒にスクレーパーにより採取し、そしてエタノール
−ドライアイス及び３７℃の水浴における３回の凍結融
解に供することができる。細胞を例えば４℃で１５分間
遠心分離することができる。一般的には、本明細書に引
用するＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを参照。
と一緒にスクレーパーにより採取し、そしてエタノール
−ドライアイス及び３７℃の水浴における３回の凍結融
解に供することができる。細胞を例えば４℃で１５分間
遠心分離することができる。一般的には、本明細書に引
用するＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを参照。
【００４１】従って、本発明の方法は、標的ウイルス配
列、特に組込みウイルス配列の検出、同定及び単離を可
能にする。本発明はさらに、本発明の方法を用いて同定
及び単離される新規なウイルスを提供する。いったんそ
のように単離及び同定されると、当業者に既知である方
法を用いて新規なウイルスを特性化し、そして当業者に
容易に明らかである様々な目的に利用することができ
る。
列、特に組込みウイルス配列の検出、同定及び単離を可
能にする。本発明はさらに、本発明の方法を用いて同定
及び単離される新規なウイルスを提供する。いったんそ
のように単離及び同定されると、当業者に既知である方
法を用いて新規なウイルスを特性化し、そして当業者に
容易に明らかである様々な目的に利用することができ
る。
【００４２】本発明の方法は、新規なＡＡＶ血清型を含
むことができる、ＡＡＶ配列の検出、同定及び単離にお
ける使用に特によく適している。本発明の方法は、様々
な疫学研究、生体内分布の研究、ＡＡＶベクター及び他
の組込みウイルスから得られるベクターによる遺伝子治
療のモニタリングに容易に用いることができる。従っ
て、これらの方法は、臨床医、研究者及び疫学者による
使用のために事前包装したキットにおける使用によく適
している。 ＩＩ．診断キット 別の態様として、本発明は、サンプルにおける既知もし
くは未知の組込み標的、例えばアデノ随伴ウイルス（Ａ
ＡＶ）の存在を検出するための診断キットを提供する。
そのようなキットは、とりわけ、稀な制限酵素、抽出し
たＤＮＡを継代するための細胞、ヘルパーウイルスプラ
スミド及び／もしくはウイルスを含有するバイアルを含
むことができる。
むことができる、ＡＡＶ配列の検出、同定及び単離にお
ける使用に特によく適している。本発明の方法は、様々
な疫学研究、生体内分布の研究、ＡＡＶベクター及び他
の組込みウイルスから得られるベクターによる遺伝子治
療のモニタリングに容易に用いることができる。従っ
て、これらの方法は、臨床医、研究者及び疫学者による
使用のために事前包装したキットにおける使用によく適
している。 ＩＩ．診断キット 別の態様として、本発明は、サンプルにおける既知もし
くは未知の組込み標的、例えばアデノ随伴ウイルス（Ａ
ＡＶ）の存在を検出するための診断キットを提供する。
そのようなキットは、とりわけ、稀な制限酵素、抽出し
たＤＮＡを継代するための細胞、ヘルパーウイルスプラ
スミド及び／もしくはウイルスを含有するバイアルを含
むことができる。
【００４３】本発明はさらに、本発明の方法に従って検
出されるＡＡＶ血清型を同定するため及び／もしくは既
知のＡＡＶから新規なＡＡＶを区別するために有用なキ
ットを提供する。さらに、本発明のキットは、使用説明
書、陰性及び／もしくは陽性コントロール、容器、サン
プルの希釈剤及びバッファー、特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒ
ｅ）比較のための表示図、使い捨て手袋、汚染除去使用
説明書、アプリケーター棒もしくは容器、及びサンプル
準備カップ、並びに培地、洗浄試薬及び濃縮試薬を包含
する任意の所望の試薬を含むことができる。そのような
試薬は、本明細書において記述する試薬の中から、そし
て通常の濃縮試薬の中から容易に選択することができ
る。一つの望ましい態様として、洗浄試薬は、リン酸緩
衝食塩水（ＰＢＳ）のような生理的ｐＨに酸性度を調節
されている等張食塩水溶液であり；溶出試薬は０．４Ｍ
ＮａＣｌを含有するＰＢＳ、並びに濃縮試薬及び装置
である。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）も
しくはＮＨ４ＳＯ４のような試薬、もしくはフィルター
装置のような装置が有用であり得ることを当業者は認識
する。例えば、１００Ｋ膜を有するフィルター装置はｒ
ＡＡＶを濃縮する。
出されるＡＡＶ血清型を同定するため及び／もしくは既
知のＡＡＶから新規なＡＡＶを区別するために有用なキ
ットを提供する。さらに、本発明のキットは、使用説明
書、陰性及び／もしくは陽性コントロール、容器、サン
プルの希釈剤及びバッファー、特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒ
ｅ）比較のための表示図、使い捨て手袋、汚染除去使用
説明書、アプリケーター棒もしくは容器、及びサンプル
準備カップ、並びに培地、洗浄試薬及び濃縮試薬を包含
する任意の所望の試薬を含むことができる。そのような
試薬は、本明細書において記述する試薬の中から、そし
て通常の濃縮試薬の中から容易に選択することができ
る。一つの望ましい態様として、洗浄試薬は、リン酸緩
衝食塩水（ＰＢＳ）のような生理的ｐＨに酸性度を調節
されている等張食塩水溶液であり；溶出試薬は０．４Ｍ
ＮａＣｌを含有するＰＢＳ、並びに濃縮試薬及び装置
である。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）も
しくはＮＨ４ＳＯ４のような試薬、もしくはフィルター
装置のような装置が有用であり得ることを当業者は認識
する。例えば、１００Ｋ膜を有するフィルター装置はｒ
ＡＡＶを濃縮する。
【００４４】本発明により提供されるキットは、本明細
書において記述する方法を行うことそして生体内分布、
疫学、ヒト及びＮＨＰにおける新規なＡＡＶ血清型の伝
達形態の研究に有用である。
書において記述する方法を行うことそして生体内分布、
疫学、ヒト及びＮＨＰにおける新規なＡＡＶ血清型の伝
達形態の研究に有用である。
【００４５】従って、本発明の方法及びキットは、標的
ウイルス配列、特に組込みウイルス配列の検出、同定及
び単離を可能にする。該方法及びキットは、新規なＡＡ
Ｖ血清型を含むことができる、ＡＡＶ配列の検出、同定
及び単離における使用に特によく適している。
ウイルス配列、特に組込みウイルス配列の検出、同定及
び単離を可能にする。該方法及びキットは、新規なＡＡ
Ｖ血清型を含むことができる、ＡＡＶ配列の検出、同定
及び単離における使用に特によく適している。
【００４６】
【実施例】以下の実施例は、本発明のいくつかの特徴及
び態様を例示する。 実施例１：アカゲザル組織におけるＡＡＶ８配列の検出
及び定量 リアルタイムＰＣＲ分析（ＴａｑＭａｎ）用にＡＡＶ８
キャプシド遺伝子の超可変領域４内に位置する一続きの
配列に基づいて一組のプライマー及びプローブを考案し
た。ＴａｑＭａｎ分析は、２つの異なる集団の１１匹の
アカゲザルの各々１０の組織からの１１０のＤＮＡサン
プルにわたって行った。一匹のサル（９８Ｅ０５６）の
心臓及び肝臓組織は、ＡＡＶ８配列が最も豊富であるこ
とが見出された。１μｇのＤＮＡ当たりのＡＡＶ８配列
のゲノムコピーは心臓では８８０００、そして肝臓では
２２０００である。これら２つのＤＮＡサンプルにおけ
るそのような多量のＡＡＶ８配列のために、これらはＡ
ＡＶ８ウイルスのレスキューの優れた候補であると考え
られた。 実施例２：組織ＤＮＡの制限酵素消化 サル組織ＤＮＡからＡＡＶ８をレスキューするために、
適切な細胞へのＤＮＡの送達は第一の工程である。哺乳
動物細胞への高分子量細胞ＤＮＡの直接トランスフェク
ションは、通常、乏しい遺伝子導入効率をもたらす。こ
の障壁を克服するために、サル＃９８Ｅ０５６の５μｇ
の肝臓ＤＮＡをＡＡＶ８ゲノムにおける非カッター（ｎ
ｏｎ−ｃｕｔｔｅｒ）であるＰｍｅＩで一晩処理し、そ
して次にフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール
沈殿させ、そしてＴＥ（１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ ８．０、
０．５Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．０、ｄＨ２Ｏ）に溶解し
た。 実施例３：２９３細胞におけるＡＡＶ８のトランスフェ
クション及びレスキュー この研究では、ヒトアデノウイルス血清型５のＥ１遺伝
子で形質転換したヒト胚腎臓繊維芽細胞細胞系、２９３
細胞をその高いトランスフェクション能力（ｔｒａｎｓ
ｆｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）及び異なる血清型の様々なＡ
ＡＶベクターを生産することにおける成功した利用のた
めにレスキュー用の宿主として選択した。異なる血清型
の組換えＡＡＶの生産のための２９３細胞の三重トラン
スフェクションにおいて一般に用いられた方法であるリ
ン酸カルシウム法は、この実験におけるトランスフェク
ションの方法であった。
び態様を例示する。 実施例１：アカゲザル組織におけるＡＡＶ８配列の検出
及び定量 リアルタイムＰＣＲ分析（ＴａｑＭａｎ）用にＡＡＶ８
キャプシド遺伝子の超可変領域４内に位置する一続きの
配列に基づいて一組のプライマー及びプローブを考案し
た。ＴａｑＭａｎ分析は、２つの異なる集団の１１匹の
アカゲザルの各々１０の組織からの１１０のＤＮＡサン
プルにわたって行った。一匹のサル（９８Ｅ０５６）の
心臓及び肝臓組織は、ＡＡＶ８配列が最も豊富であるこ
とが見出された。１μｇのＤＮＡ当たりのＡＡＶ８配列
のゲノムコピーは心臓では８８０００、そして肝臓では
２２０００である。これら２つのＤＮＡサンプルにおけ
るそのような多量のＡＡＶ８配列のために、これらはＡ
ＡＶ８ウイルスのレスキューの優れた候補であると考え
られた。 実施例２：組織ＤＮＡの制限酵素消化 サル組織ＤＮＡからＡＡＶ８をレスキューするために、
適切な細胞へのＤＮＡの送達は第一の工程である。哺乳
動物細胞への高分子量細胞ＤＮＡの直接トランスフェク
ションは、通常、乏しい遺伝子導入効率をもたらす。こ
の障壁を克服するために、サル＃９８Ｅ０５６の５μｇ
の肝臓ＤＮＡをＡＡＶ８ゲノムにおける非カッター（ｎ
ｏｎ−ｃｕｔｔｅｒ）であるＰｍｅＩで一晩処理し、そ
して次にフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール
沈殿させ、そしてＴＥ（１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ ８．０、
０．５Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．０、ｄＨ２Ｏ）に溶解し
た。 実施例３：２９３細胞におけるＡＡＶ８のトランスフェ
クション及びレスキュー この研究では、ヒトアデノウイルス血清型５のＥ１遺伝
子で形質転換したヒト胚腎臓繊維芽細胞細胞系、２９３
細胞をその高いトランスフェクション能力（ｔｒａｎｓ
ｆｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）及び異なる血清型の様々なＡ
ＡＶベクターを生産することにおける成功した利用のた
めにレスキュー用の宿主として選択した。異なる血清型
の組換えＡＡＶの生産のための２９３細胞の三重トラン
スフェクションにおいて一般に用いられた方法であるリ
ン酸カルシウム法は、この実験におけるトランスフェク
ションの方法であった。
【００４７】ＡＡＶゲノムのレスキューのための別の重
要な必要条件は、適切なアデノウイルスヘルパー機能の
存在である。この実験において、我々は、ヒトアデノウ
イルス血清型５を２つの結果に基づいて出発するヘルパ
ーとして選択した。第一のものは、２９３細胞の三重ト
ランスフェクションにおけるＡｄ５ヘルパープラスミド
の使用が、ＡＡＶ２／８ベクターの高収量生産をもたら
すことであり、Ａｄ５が優れたヘルパーであることを示
唆した。第二の結果は、高コピー数のＡＡＶ８配列が肝
臓及び心臓において検出されたサル９８Ｅ０５６が、殺
される前に肝静脈投与によって組換えアデノウイルスベ
クターで処理されたことであった。これは、アデノウイ
ルスの感染が、このサルのいくつかの組織におけるＡＡ
Ｖ８ゲノムのレスキュー及び増幅をもたらしたという考
察につながることができた。
要な必要条件は、適切なアデノウイルスヘルパー機能の
存在である。この実験において、我々は、ヒトアデノウ
イルス血清型５を２つの結果に基づいて出発するヘルパ
ーとして選択した。第一のものは、２９３細胞の三重ト
ランスフェクションにおけるＡｄ５ヘルパープラスミド
の使用が、ＡＡＶ２／８ベクターの高収量生産をもたら
すことであり、Ａｄ５が優れたヘルパーであることを示
唆した。第二の結果は、高コピー数のＡＡＶ８配列が肝
臓及び心臓において検出されたサル９８Ｅ０５６が、殺
される前に肝静脈投与によって組換えアデノウイルスベ
クターで処理されたことであった。これは、アデノウイ
ルスの感染が、このサルのいくつかの組織におけるＡＡ
Ｖ８ゲノムのレスキュー及び増幅をもたらしたという考
察につながることができた。
【００４８】２９３細胞をウェル当たり５ｘ１０５細胞
の密度で１２ウェルプレートにおいて接種した。トラン
スフェクション及びレスキュー実験を以下のように実施
した。
の密度で１２ウェルプレートにおいて接種した。トラン
スフェクション及びレスキュー実験を以下のように実施
した。
【００４９】グループＡ−１：１μｇのＰｍｅＩ処理し
た肝臓ＤＮＡ＋１μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＤＮ
Ａ（キャリヤーＤＮＡ） グループＡ−２：０．２μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓Ｄ
ＮＡ＋１．８μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＤＮＡ
（キャリヤーＤＮＡ） グループＢ−１：１μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ
＋１μｇのｐＡｄΔＦ６ ＤＮＡ（非感染性Ａｄヘルパ
ープラスミド） グループＢ−２：０．２μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓Ｄ
ＮＡ＋１．８μｇのｐＡｄΔＦ６ ＤＮＡ（非感染性Ａ
ｄヘルパープラスミド） グループＣ−１：１μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ
＋１μｇのｐＡｄＣＭＶＬａｃＺ（感染性Ａｄプラスミ
ド） グループＣ−２：０．２μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓Ｄ
ＮＡ＋１．８μｇのｐＡｄＣＭＶＬａｃＺ（感染性Ａｄ
プラスミド）） トランスフェクション後２４時間で、Ａ−１及びＡ−２
の細胞にＡｄ５ｗｔウイルスを２のＭＯＩで感染させ
た。Ａ−１、Ａ−２、Ｂ−１及びＢ−２の細胞をトラン
スフェクション後９６時間で採取し、そして３サイクル
の凍結／融解により溶解させた。Ｃ−１及びＣ−２の細
胞は、トランスフェクション後１５日で完全な細胞変性
効果（ＣＰＥ）が認められた後に粗ライセート調製用に
採取した。
た肝臓ＤＮＡ＋１μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＤＮ
Ａ（キャリヤーＤＮＡ） グループＡ−２：０．２μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓Ｄ
ＮＡ＋１．８μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＤＮＡ
（キャリヤーＤＮＡ） グループＢ−１：１μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ
＋１μｇのｐＡｄΔＦ６ ＤＮＡ（非感染性Ａｄヘルパ
ープラスミド） グループＢ−２：０．２μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓Ｄ
ＮＡ＋１．８μｇのｐＡｄΔＦ６ ＤＮＡ（非感染性Ａ
ｄヘルパープラスミド） グループＣ−１：１μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓ＤＮＡ
＋１μｇのｐＡｄＣＭＶＬａｃＺ（感染性Ａｄプラスミ
ド） グループＣ−２：０．２μｇのＰｍｅＩ処理した肝臓Ｄ
ＮＡ＋１．８μｇのｐＡｄＣＭＶＬａｃＺ（感染性Ａｄ
プラスミド）） トランスフェクション後２４時間で、Ａ−１及びＡ−２
の細胞にＡｄ５ｗｔウイルスを２のＭＯＩで感染させ
た。Ａ−１、Ａ−２、Ｂ−１及びＢ−２の細胞をトラン
スフェクション後９６時間で採取し、そして３サイクル
の凍結／融解により溶解させた。Ｃ−１及びＣ−２の細
胞は、トランスフェクション後１５日で完全な細胞変性
効果（ＣＰＥ）が認められた後に粗ライセート調製用に
採取した。
【００５０】各グループからの全粗細胞ライセートを次
に２９３細胞の１００ｍｍプレート上に継代した。グル
ープＢ−１及びＢ−２には、細胞にＥ１欠失Ａｄ５ｗｔ
ウイルスも５のＭＯＩで重複感染させた。コントロール
として、２９３細胞の１００ｍｍプレートに同じＡｄ５
ｗｔウイルスを５のＭＯＩで感染させた。完全なＣＰＥ
が認められた場合、各感染を採取した。１／１０の各感
染を３サイクルの凍結融解用に取っておき、そして次の
継代用に２９３細胞の別の１００ｍｍプレート上に継代
した。残りの感染は、全細胞ＤＮＡ及びタンパク質の調
製用の細胞ペレットを集めるために回転して落とした。
該工程を最初の特性化のための継代２及び３の各サンプ
ル用に繰り返した。実施例４：異なる継代で再感染した
２９３細胞の全ＤＮＡ、タンパク質及び粗ライセートの
特性化Ａ．ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ＡＡＶ８配列が連続継代中にレスキューされそして増幅
されるかどうかを調べるために、各実験グループの異な
る継代から抽出した全ＤＮＡをＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子
配列のＴａｑＭａｎ分析に供した。結果を以下に要約す
る（ＧＣ＝ゲノムコピー）。表１を参照。
に２９３細胞の１００ｍｍプレート上に継代した。グル
ープＢ−１及びＢ−２には、細胞にＥ１欠失Ａｄ５ｗｔ
ウイルスも５のＭＯＩで重複感染させた。コントロール
として、２９３細胞の１００ｍｍプレートに同じＡｄ５
ｗｔウイルスを５のＭＯＩで感染させた。完全なＣＰＥ
が認められた場合、各感染を採取した。１／１０の各感
染を３サイクルの凍結融解用に取っておき、そして次の
継代用に２９３細胞の別の１００ｍｍプレート上に継代
した。残りの感染は、全細胞ＤＮＡ及びタンパク質の調
製用の細胞ペレットを集めるために回転して落とした。
該工程を最初の特性化のための継代２及び３の各サンプ
ル用に繰り返した。実施例４：異なる継代で再感染した
２９３細胞の全ＤＮＡ、タンパク質及び粗ライセートの
特性化Ａ．ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ＡＡＶ８配列が連続継代中にレスキューされそして増幅
されるかどうかを調べるために、各実験グループの異な
る継代から抽出した全ＤＮＡをＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子
配列のＴａｑＭａｎ分析に供した。結果を以下に要約す
る（ＧＣ＝ゲノムコピー）。表１を参照。
【００５１】
【表１】
【００５２】データは以下のことを示唆した：Ａ−１、
Ｂ−１及びＢ−２及びＣ−１グループにおいて、ＡＡＶ
８ウイルスはトランスフェクション工程においてレスキ
ューされ、そして連続継代中にさらに増幅された。その
ような増幅は、おそらく２９３細胞におけるＡＡＶの限
られたパッケージング能力及びアデノウイルスとＡＡＶ
間の競合的増殖阻害のために継代中に劇的ではない。
Ｂ−１及びＢ−２及びＣ−１グループにおいて、ＡＡＶ
８ウイルスはトランスフェクション工程においてレスキ
ューされ、そして連続継代中にさらに増幅された。その
ような増幅は、おそらく２９３細胞におけるＡＡＶの限
られたパッケージング能力及びアデノウイルスとＡＡＶ
間の競合的増殖阻害のために継代中に劇的ではない。
【００５３】Ａ−２及びＣ−２において０．２μｇのサ
ルＤＮＡを用いた場合、あらゆる継代においていかなる
有意なＡＡＶ８配列も検出されなかった。これは、ＡＡ
Ｖの最初のゲノムコピーの閾値が、２９３細胞における
レスキュー及び増幅のアデノウイルス阻害を克服するた
めに必要とされることを意味することができる。しか
し、Ｂ−２の場合、ＡＡＶ８及びアデノウイルスレスキ
ューの両方が同時に起こったので、アデノウイルス複製
及びパッケージングによるＡＡＶ８レスキュー、複製及
びパッケージングの阻害は害が少なく、より低いゲノム
コピーでさえＡＡＶ８の成功レスキュー及び増幅につな
がる。
ルＤＮＡを用いた場合、あらゆる継代においていかなる
有意なＡＡＶ８配列も検出されなかった。これは、ＡＡ
Ｖの最初のゲノムコピーの閾値が、２９３細胞における
レスキュー及び増幅のアデノウイルス阻害を克服するた
めに必要とされることを意味することができる。しか
し、Ｂ−２の場合、ＡＡＶ８及びアデノウイルスレスキ
ューの両方が同時に起こったので、アデノウイルス複製
及びパッケージングによるＡＡＶ８レスキュー、複製及
びパッケージングの阻害は害が少なく、より低いゲノム
コピーでさえＡＡＶ８の成功レスキュー及び増幅につな
がる。
【００５４】これは、どのようにしてそしていつアデノ
ウイルスヘルパー機能を提供するかが、この方法による
ＡＡＶのレスキュー及び増幅にとって重要であることを
示唆する。
ウイルスヘルパー機能を提供するかが、この方法による
ＡＡＶのレスキュー及び増幅にとって重要であることを
示唆する。
【００５５】Ｂ．ＰＣＲクローニング
ＴａｑＭａｎデータは、ＡＡＶ８プローブ／プライマー
と２９３細胞のＤＮＡ配列間のいくらかの交差反応性を
示唆した。感染におけるＡＡＶ配列の存在を確かめるた
めに、２つの追加試験を実施した。
と２９３細胞のＤＮＡ配列間のいくらかの交差反応性を
示唆した。感染におけるＡＡＶ配列の存在を確かめるた
めに、２つの追加試験を実施した。
【００５６】１．ユニバーサルプライマー組を用いるＡ
ＡＶシグネチャー領域の通常のＰＣＲ増幅 パッケージングされていないＡＡＶ８ゲノムを消化する
ためにＡ−１−Ｐ３、Ｃ−１−Ｐ３及びＡｄ−コントロ
ール−Ｐ３の粗ライセートをＤＮアーゼＩで３７℃で１
時間処理した。各々０．４μｌの処理したライセートを
５０μｌのＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲ産物を２％アガ
ロースゲル電気泳動により調べた。結果は、Ａ−１−Ｐ
３及びＣ−１−Ｐ３サンプルにおいて予想される２５０
ｂｐのシグネチャーＰＣＲ産物を示し、一方、Ａｄ−コ
ントロール−Ｐ３は、全くバンドを示さなかった。これ
は、Ａ−１及びＣ−１においてＴａｑＭａｎにより捕捉
されるシグナルがＡＡＶ配列であることを裏付けた。
ＡＶシグネチャー領域の通常のＰＣＲ増幅 パッケージングされていないＡＡＶ８ゲノムを消化する
ためにＡ−１−Ｐ３、Ｃ−１−Ｐ３及びＡｄ−コントロ
ール−Ｐ３の粗ライセートをＤＮアーゼＩで３７℃で１
時間処理した。各々０．４μｌの処理したライセートを
５０μｌのＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲ産物を２％アガ
ロースゲル電気泳動により調べた。結果は、Ａ−１−Ｐ
３及びＣ−１−Ｐ３サンプルにおいて予想される２５０
ｂｐのシグネチャーＰＣＲ産物を示し、一方、Ａｄ−コ
ントロール−Ｐ３は、全くバンドを示さなかった。これ
は、Ａ−１及びＣ−１においてＴａｑＭａｎにより捕捉
されるシグナルがＡＡＶ配列であることを裏付けた。
【００５７】２．特定のＡＡＶ配列を同定するためのＰ
ＣＲクローニング及び塩基配列決定 ＡＡＶ配列のどの分子タイプ（一つもしくは複数）がこ
の実験においてレスキューされそしてパッケージングさ
れたかを同定するために、全ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺
伝子の３’末端にまたがる３．１ｋｂの配列を増幅する
ように一対のユニベーサルプライマー組を考案した。Ｐ
ＣＲ産物をクローン化し、そして同定のために部分的に
塩基配列を決定した。
ＣＲクローニング及び塩基配列決定 ＡＡＶ配列のどの分子タイプ（一つもしくは複数）がこ
の実験においてレスキューされそしてパッケージングさ
れたかを同定するために、全ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺
伝子の３’末端にまたがる３．１ｋｂの配列を増幅する
ように一対のユニベーサルプライマー組を考案した。Ｐ
ＣＲ産物をクローン化し、そして同定のために部分的に
塩基配列を決定した。
【００５８】Ｃ．ウェスタンブロット
粗ライセートにおけるＡＡＶウイルスの存在を確かめる
別の方法として、異なる継代でのＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣ
ａｐタンパク質発現を調べた。以前の実験において、Ａ
ＡＶ２キャプシドタンパク質に対するマウスモノクロー
ナル抗体、クローンＢ１は、ＡＡＶ１、５、７及び８か
らのキャプシドタンパク質とよく交差反応できることが
見出された。ＡＡＶの全てのタイプの詳細な配列比較に
より、Ｒｅｐ領域における強い類似性が示された。ウェ
スタンブロット分析には、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質
に対するマウスモノクローナル抗体、クローン２５９．
５を使用すると決定した。
別の方法として、異なる継代でのＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣ
ａｐタンパク質発現を調べた。以前の実験において、Ａ
ＡＶ２キャプシドタンパク質に対するマウスモノクロー
ナル抗体、クローンＢ１は、ＡＡＶ１、５、７及び８か
らのキャプシドタンパク質とよく交差反応できることが
見出された。ＡＡＶの全てのタイプの詳細な配列比較に
より、Ｒｅｐ領域における強い類似性が示された。ウェ
スタンブロット分析には、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質
に対するマウスモノクローナル抗体、クローン２５９．
５を使用すると決定した。
【００５９】いくつかの感染の継代３の細胞ペレットか
ら全細胞タンパク質を抽出し、そして定量した。各々５
μｇの全タンパク質をウェスタンブロット分析に用い
た。結果を以下の表２に要約する。
ら全細胞タンパク質を抽出し、そして定量した。各々５
μｇの全タンパク質をウェスタンブロット分析に用い
た。結果を以下の表２に要約する。
【００６０】
【表２】
【００６１】データは、ＡＡＶ８配列のゲノムコピーと
Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現間の相関関係を示唆し、細胞に与え
たＡＡＶ８配列が転写的そして翻訳的に活性であること
を示した。 実施例５：ＡＡＶ８ビリオンの増大 ＴａｑＭａｎ分析、ＰＣＲ／クローニング及びウェスタ
ンブロット分析は、本明細書において記述するようなＡ
ＡＶ配列の存在及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子発現を示し
た。
Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現間の相関関係を示唆し、細胞に与え
たＡＡＶ８配列が転写的そして翻訳的に活性であること
を示した。 実施例５：ＡＡＶ８ビリオンの増大 ＴａｑＭａｎ分析、ＰＣＲ／クローニング及びウェスタ
ンブロット分析は、本明細書において記述するようなＡ
ＡＶ配列の存在及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子発現を示し
た。
【００６２】ＴａｑＭａｎ技術を用いて、サル＃９８Ｅ
０５６における２つの組織はＡＡＶ８配列が最も豊富で
あることが決定されている。それらは心臓及び肝臓であ
る（それぞれ、ＤＮＡのμｇ当たり８８，０００及び２
２，０００ＧＣのＡＡＶ８）。組織ＤＮＡにおけるＡＡ
Ｖ８配列がレスキュー可能でありそしてビリオンにパッ
ケージング可能であるかどうかを調べるために、このサ
ルの肝臓ＤＮＡをＡＡＶ８ゲノムにおける非カッターＰ
ｍｅＩで制限し、そして感染性もしくは非感染性アデノ
ウイルスヘルパープラスミドと２９３細胞にトランスフ
ェクションし、もしくは続いて２４時間後にアデノウイ
ルスを感染させた。各トランスフェクションもしくはト
ランスフェクション／感染からの粗ライセートをトラン
スフェクション後７２時間で採取し、そして連続継代に
供した。
０５６における２つの組織はＡＡＶ８配列が最も豊富で
あることが決定されている。それらは心臓及び肝臓であ
る（それぞれ、ＤＮＡのμｇ当たり８８，０００及び２
２，０００ＧＣのＡＡＶ８）。組織ＤＮＡにおけるＡＡ
Ｖ８配列がレスキュー可能でありそしてビリオンにパッ
ケージング可能であるかどうかを調べるために、このサ
ルの肝臓ＤＮＡをＡＡＶ８ゲノムにおける非カッターＰ
ｍｅＩで制限し、そして感染性もしくは非感染性アデノ
ウイルスヘルパープラスミドと２９３細胞にトランスフ
ェクションし、もしくは続いて２４時間後にアデノウイ
ルスを感染させた。各トランスフェクションもしくはト
ランスフェクション／感染からの粗ライセートをトラン
スフェクション後７２時間で採取し、そして連続継代に
供した。
【００６３】より特に、サル肝臓から調製した細胞ＤＮ
ＡをＰｍｅＩエンドヌクレアーゼで制限し、そして通常
のリン酸カルシウム方法論を用いて感染性及び非感染性
アデノウイルスプラスミドもしくはコントロールプラス
ミドと２９３細胞に共トランスフェクションした（アカ
ゲザル肝臓ＤＮＡ）。コントロールプラスミドを擬似ト
ランスフェクションに使用した（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ）。非感染性アデノウイルスヘルパープラスミドは、
Ｅ２ａ、Ｅ４及びＶＡＲＮＡヘルパー機能を提供した。
感染性Ｅ１欠失組換えアデノウイルスプラスミドを２９
３細胞において感染させるために使用した（ｐＡｄΔＦ
６）。Ａ−１及びＡ−２グループでは、ヘルパーアデノ
ウイルスをトランスフェクション後２４時間で加え、そ
して細胞ライセートを継代用に４８時間後に採取した
（ｐＡｄＣＭＶＬａｃＺ）。Ｃ−１、Ｃ−２及びコント
ロールグループでは、細胞ライセートをトランスフェク
ション後７２時間で調製し、そしてヘルパーウイルスを
第一の継代において２９３細胞に加えた（Ａｄ５ ｗｔ
ウイルス）。表３を参照。
ＡをＰｍｅＩエンドヌクレアーゼで制限し、そして通常
のリン酸カルシウム方法論を用いて感染性及び非感染性
アデノウイルスプラスミドもしくはコントロールプラス
ミドと２９３細胞に共トランスフェクションした（アカ
ゲザル肝臓ＤＮＡ）。コントロールプラスミドを擬似ト
ランスフェクションに使用した（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ）。非感染性アデノウイルスヘルパープラスミドは、
Ｅ２ａ、Ｅ４及びＶＡＲＮＡヘルパー機能を提供した。
感染性Ｅ１欠失組換えアデノウイルスプラスミドを２９
３細胞において感染させるために使用した（ｐＡｄΔＦ
６）。Ａ−１及びＡ−２グループでは、ヘルパーアデノ
ウイルスをトランスフェクション後２４時間で加え、そ
して細胞ライセートを継代用に４８時間後に採取した
（ｐＡｄＣＭＶＬａｃＺ）。Ｃ−１、Ｃ−２及びコント
ロールグループでは、細胞ライセートをトランスフェク
ション後７２時間で調製し、そしてヘルパーウイルスを
第一の継代において２９３細胞に加えた（Ａｄ５ ｗｔ
ウイルス）。表３を参照。
【００６４】
【表３】
【００６５】粗ライセートにおけるＡＡＶウイルスの存
在を確かめる方法として、異なる継代でのＡＡＶ Ｒｅ
ｐ及びＣａｐタンパク質発現を調べた。以前の実験にお
いて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質に対するマウスモ
ノクローナル抗体、クローンＢ１は、ＡＡＶ１、５、７
及び８からのキャプシドタンパク質とよく交差反応でき
ることが見出された（データは示さない）。ＡＡＶの全
てのタイプの詳細な配列比較もまた、Ｒｅｐ領域におけ
る強い類似性を示した。
在を確かめる方法として、異なる継代でのＡＡＶ Ｒｅ
ｐ及びＣａｐタンパク質発現を調べた。以前の実験にお
いて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質に対するマウスモ
ノクローナル抗体、クローンＢ１は、ＡＡＶ１、５、７
及び８からのキャプシドタンパク質とよく交差反応でき
ることが見出された（データは示さない）。ＡＡＶの全
てのタイプの詳細な配列比較もまた、Ｒｅｐ領域におけ
る強い類似性を示した。
【００６６】ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質に対するマウ
スモノクローナル抗体（クローン２５９．５）をウェス
タンブロット分析における使用のために選択した。実験
Ｂ−１及びＢ−２の継代１の細胞ペレットから全細胞タ
ンパク質を抽出し、そして定量した。各々２μｇの全タ
ンパク質をｒｅｐ及びｃａｐのウェスタンブロット分析
に用いた。Ｂ−１及びＢ−２グループの継代１から抽出
した細胞ＤＮＡにおけるＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子配列の
存在もまた、ＡＡＶ８ ｃａｐ特異的プライマー及びプ
ローブを用いてＴａｑＭａｎにより定量した。
スモノクローナル抗体（クローン２５９．５）をウェス
タンブロット分析における使用のために選択した。実験
Ｂ−１及びＢ−２の継代１の細胞ペレットから全細胞タ
ンパク質を抽出し、そして定量した。各々２μｇの全タ
ンパク質をｒｅｐ及びｃａｐのウェスタンブロット分析
に用いた。Ｂ−１及びＢ−２グループの継代１から抽出
した細胞ＤＮＡにおけるＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子配列の
存在もまた、ＡＡＶ８ ｃａｐ特異的プライマー及びプ
ローブを用いてＴａｑＭａｎにより定量した。
【００６７】レスキューされるＡＡＶゲノムが実際にＡ
ＡＶ８であることを決定するために、Ｃ−１及び擬似ト
ランスフェクションの継代３のＤＮアーゼＩ処理した粗
ライセートからの３．１ｋｂ ｃａｐ領域のＰＣＲ増幅
及びクローニングを実施した。予想されるように、擬似
トランスフェクションしたサンプルではいかなるＰＣＲ
バンドも検出されなかったが、Ｃ−１クローンの配列分
析は、アデノウイルスヘルパーの存在下で２９３細胞に
おいてレスキューされそしてパッケージングされたゲノ
ムがＡＡＶ８であることを裏付けた（データは示さな
い）。
ＡＶ８であることを決定するために、Ｃ−１及び擬似ト
ランスフェクションの継代３のＤＮアーゼＩ処理した粗
ライセートからの３．１ｋｂ ｃａｐ領域のＰＣＲ増幅
及びクローニングを実施した。予想されるように、擬似
トランスフェクションしたサンプルではいかなるＰＣＲ
バンドも検出されなかったが、Ｃ−１クローンの配列分
析は、アデノウイルスヘルパーの存在下で２９３細胞に
おいてレスキューされそしてパッケージングされたゲノ
ムがＡＡＶ８であることを裏付けた（データは示さな
い）。
【００６８】次の工程は、この分子存在のＡＡＶビリオ
ンを単離することである。実施例６においてさらに記述
するように、Ａ−１、Ｂ−１、Ｃ−１及びＡｄ−コント
ロールの粗ライセートを２９３細胞の１、５及び５０の
１５０ｍｍプレート上に連続して継代した。細胞ペレッ
トを標準的な方法に従ってＡＡＶビリオンのＣｓＣｌ勾
配精製用に感染後４２時間で採取した。実施例６：ＡＡ
Ｖ８ビリオンの透過型電子顕微鏡検査及び感染性クロー
ンの作製いったんＡＡＶビリオンが単離されると、ＡＡ
Ｖビリオンの形態を示すために陰性染色サンプルの透過
型電子顕微鏡検査を行う。さらに、Ｘｉａｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（５）：３９９４−４０
０３（１９９９年５月）に記述されている方法に従っ
て、ビリオンにパッケージングされたＡＡＶゲノムの感
染性分子クローンをさらなる特性化のために作製する。
ンを単離することである。実施例６においてさらに記述
するように、Ａ−１、Ｂ−１、Ｃ−１及びＡｄ−コント
ロールの粗ライセートを２９３細胞の１、５及び５０の
１５０ｍｍプレート上に連続して継代した。細胞ペレッ
トを標準的な方法に従ってＡＡＶビリオンのＣｓＣｌ勾
配精製用に感染後４２時間で採取した。実施例６：ＡＡ
Ｖ８ビリオンの透過型電子顕微鏡検査及び感染性クロー
ンの作製いったんＡＡＶビリオンが単離されると、ＡＡ
Ｖビリオンの形態を示すために陰性染色サンプルの透過
型電子顕微鏡検査を行う。さらに、Ｘｉａｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（５）：３９９４−４０
０３（１９９９年５月）に記述されている方法に従っ
て、ビリオンにパッケージングされたＡＡＶゲノムの感
染性分子クローンをさらなる特性化のために作製する。
【００６９】ＡＡＶ８の物理的（ｐｈｙｓｉｃａｌ）ビ
リオンを調べるために、グループＣ−１の連続継代の粗
ライセートを擬似トランスフェクショングループのもの
と一緒に５０プレート感染に増やし、そしてＡＡＶビリ
オンの精製のためのＣｓＣｌ勾配遠心分離に供した。Ａ
ＡＶ８のゲノムコピー濃度は、ＴａｑＭａｎ分析により
決定した。陰性染色サンプルの透過型電子顕微鏡検査を
行った。結果（示さない）としてＣ−１サンプルは典型
的なＡＡＶビリオンを示したが、擬似トランスフェクシ
ョンはいかなる可視のＡＡＶ構造も有さなかった。実施
例７：脾臓組織において同定される新規なＡＡＶのレス
キュー本明細書において記述する方法（実施例３を参
照）を用いて、アカゲザルの脾臓組織において同定され
る新規なサルＡＡＶをレスキューするために実験を行っ
た。細胞ＤＮＡをＰｍｅＩで処理し、そして２９３細胞
においてサルアデノウイルスＰａｎ６のＥ１欠失分子ク
ローン、サルアデノウイルスＰａｎ９のＥ１欠失分子ク
ローン及びヒトＡｄ５のＥ１欠失分子クローンで等量
（各々１μｇ）で共トランスフェクションした。ＡＡＶ
力価は、これらの実施例において記述するようにトラン
スフェクション後継代１でＴａｑＭａｎ分析により決定
した。
リオンを調べるために、グループＣ−１の連続継代の粗
ライセートを擬似トランスフェクショングループのもの
と一緒に５０プレート感染に増やし、そしてＡＡＶビリ
オンの精製のためのＣｓＣｌ勾配遠心分離に供した。Ａ
ＡＶ８のゲノムコピー濃度は、ＴａｑＭａｎ分析により
決定した。陰性染色サンプルの透過型電子顕微鏡検査を
行った。結果（示さない）としてＣ−１サンプルは典型
的なＡＡＶビリオンを示したが、擬似トランスフェクシ
ョンはいかなる可視のＡＡＶ構造も有さなかった。実施
例７：脾臓組織において同定される新規なＡＡＶのレス
キュー本明細書において記述する方法（実施例３を参
照）を用いて、アカゲザルの脾臓組織において同定され
る新規なサルＡＡＶをレスキューするために実験を行っ
た。細胞ＤＮＡをＰｍｅＩで処理し、そして２９３細胞
においてサルアデノウイルスＰａｎ６のＥ１欠失分子ク
ローン、サルアデノウイルスＰａｎ９のＥ１欠失分子ク
ローン及びヒトＡｄ５のＥ１欠失分子クローンで等量
（各々１μｇ）で共トランスフェクションした。ＡＡＶ
力価は、これらの実施例において記述するようにトラン
スフェクション後継代１でＴａｑＭａｎ分析により決定
した。
【００７０】
【表４】
【００７１】このデータは、サルアデノウイルス血清型
がサルＡＡＶ血清型のレスキューにおいていっそう効率
がよい可能性があることを示唆する。
がサルＡＡＶ血清型のレスキューにおいていっそう効率
がよい可能性があることを示唆する。
【００７２】本明細書に引用する全ての公開は、引用す
ることにより本明細書に組み込まれる。本発明は特定の
好ましい態様に関連して記述されているが、本発明の精
神からそれずに改変を行うことができると理解される。
そのような改変は、請求項の範囲内に入るものとする。
ることにより本明細書に組み込まれる。本発明は特定の
好ましい態様に関連して記述されているが、本発明の精
神からそれずに改変を行うことができると理解される。
そのような改変は、請求項の範囲内に入るものとする。
【００７３】本発明の特徴及び態様を示せば、以下のと
おりである。 １． （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない制
限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプル
におけるＤＮＡを消化し； （ｂ）消化したＤＮＡを細胞にトランスフェクション
し； （ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッ
ケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノ
ウイルス機能が細胞において発現される条件下で培養
し； （ｄ）ヘルパー機能を発現する細胞において（ｃ）の培
養工程から得られるライセートを継代し；そして （ｅ）場合により継代工程からのライセートをさらなる
継代に供する：組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴
ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューの方法。 ２． 消化工程をＰｍｅＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、Ｐｓ
ｒＩ、ＢｃｇＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａｂＩ、ＢｓｔＸＩ、
ＤｒｄＩ、ＥｃｏＮＩ、ＦｓｅＩ及びＭａＭＩよりなる
群から選択される制限酵素を用いて行う上記１に記載の
方法。 ３． 消化工程が、サンプルからのＤＮＡをＰｍｅＩと
インキュベーションすること、フェノール／クロロホル
ム抽出を行うこと、エタノールで沈殿すること及び沈殿
物を溶解することの工程をさらに含んでなる上記１もし
くは２に記載の方法。 ４． インキュベーションする工程を約１２〜４８時間
行う上記３に記載の方法。 ５． 哺乳動物細胞源が非ヒト霊長類もしくはヒトから
の組織である上記１〜４のいずれかに記載の方法。 ６． 工程（ｂ）の細胞をＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子産物
の発現を導く調節制御要素の制御下のアデノウイルスＥ
１ａ及びＥ１ｂ遺伝子で安定に形質転換する上記１〜５
のいずれかに記載の方法。 ７． 工程（ｂ）の細胞が２９３細胞である上記１〜６
のいずれかに記載の方法。 ８． 工程（ｂ）の細胞がＡＡＶヘルパー機能を発現す
る上記１〜５のいずれかに記載の方法。 ９． 工程（ｂ）の細胞がＡＡＶ ｒｅｐタンパク質を
発現する上記１〜８のいずれかに記載の方法。 １０． 工程（ｂ）の細胞をアデノウイルスＥ１ａ、Ｅ
１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４（もしくはその機能性フラグメン
ト）及びＶＡＩ ＲＮＡからなるアデノウイルス配列を
含有するベクターと共トランスフェクションする上記１
〜５のいずれかに記載の方法。 １１． 工程（ｂ）の細胞をアデノウイルスＥ２ａ、Ｅ
４（もしくはその機能性フラグメント）及びＶＡＩ Ｒ
ＮＡからなるアデノウイルス配列を含有するベクターと
共トランスフェクションする上記１〜５のいずれかに記
載の方法。 １２． アデノウイルスヘルパー機能をプラスミド上で
提供する上記１〜５のいずれかに記載の方法。 １３． ヘルパー機能を一つもしくはそれ以上のアデノ
ウイルス血清型により提供する上記１〜１２のいずれか
に記載の方法。 １４． アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ機能をヒトア
デノウイルスにより提供する上記１〜１３のいずれかに
記載の方法。 １５． 他の必要なアデノウイルスヘルパー機能をチン
パンジーアデノウイルス血清型により提供する上記１４
に記載の方法。 １６． 工程（ｂ）の細胞を０．２μｇ〜２μｇでトラ
ンスフェクションする上記１２〜１４のいずれかに記載
の方法。 １７． 非感染性ヘルパーアデノウイルスプラスミドで
トランスフェクションすること及び継代中に野生型アデ
ノウイルスを細胞に重複感染させることの工程をさらに
含んでなる上記１に記載の方法。 １８． 非感染性ヘルパーアデノウイルスプラスミドで
トランスフェクションすること及び継代中にＥ１欠失ア
デノウイルスを細胞に重複感染させることの工程をさら
に含んでなる上記１〜５のいずれかに記載の方法。 １９． 継代工程を２９３細胞において行う上記１〜１
８のいずれかに記載の方法。 ２０． 継代工程を繰り返す上記１〜１８のいずれかに
記載の方法。 ２１． （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない
制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプ
ルにおけるＤＮＡを消化し； （ｂ）消化したＤＮＡを細胞にトランスフェクション
し； （ｃ）トランスフェクションした細胞をインキュベーシ
ョンし； （ｄ）トランスフェクションした細胞に、細胞がＡＡＶ
のパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限の
アデノウイルス機能を含有するようにアデノウイルスヘ
ルパー機能を重複感染させ； （ｅ）重複感染細胞をＡＡＶの複製に必要なヘルパー機
能が発現される条件下で培養し； （ｆ）重複感染培養物から粗ライセートを採取し；そし
て （ｇ）粗ライセートを継代する：組織からの細胞ＤＮＡ
からのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキュー
及び検出の方法。 ２２． 採取する工程が、粗ライセートを得るために重
複感染細胞培養物を凍結融解に供することをさらに含ん
でなる上記２１に記載の方法。 ２３． 粗ライセートを２回もしくはそれ以上の継代に
供する上記２１に記載の方法。 ２４． （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない
制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプ
ルにおけるＤＮＡを消化し； （ｂ）消化したＤＮＡ並びに宿主細胞により供給されな
いＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のア
デノウイルス機能からなるアデノウイルス配列を含んで
なる非感染性アデノウイルスヘルパープラスミドを共ト
ランスフェクションし； （ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッ
ケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機
能のみが細胞において発現される条件下で培養し； （ｄ）粗ライセートを得るために細胞培養物を処理し； （ｅ）細胞に粗ライセートをトランスフェクションしそ
して細胞がＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少
なくとも最低限のアデノウイルス機能を含有するように
アデノウイルスヘルパー機能を細胞に重複感染させるこ
とにより粗ライセートを第一の継代に供し；そして （ｆ）場合によりもう２回もしくはそれ以上継代する：
組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ）の直接レスキューの方法。 ２５． ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない制
限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプル
におけるＤＮＡを消化し； （ｂ）消化したＤＮＡ並びに宿主細胞により供給されな
いＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のア
デノウイルス機能を含んでなる感染性アデノウイルスヘ
ルパープラスミドを共トランスフェクションし； （ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッ
ケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機
能が細胞において発現される条件下で培養し； （ｄ）粗ライセートを得るために細胞培養物を処理し；
そして （ｅ）粗ライセートを細胞にトランスフェクションする
ことにより場合により粗ライセートを２回もしくはそれ
以上の継代に供する：組織からの細胞ＤＮＡからのアデ
ノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューの方法。 ２６． ＡＡＶの存在に関して上記１、２２、２４もし
くは２５の方法のいずれかから得られる粗ライセートを
アッセイすることの工程を含んでなる、組織における細
胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検出する
方法。 ２７． （ａ）細胞ペレットを提供するために上記１、
２２、２４もしくは２５の方法のいずれかから得られる
粗ライセートを遠心分離すること；及び（ｂ）細胞ペレ
ットからＡＡＶを精製すること：の工程を含んでなる、
組織における細胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ）を精製する方法。 ２８． 上記１、２２、２４もしくは２５のいずれかの
方法による組織の細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス
（ＡＡＶ）の直接レスキューに有用なキット。 ２９． 上記２６の方法により組織からの細胞ＤＮＡか
らアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検出するのに有用な
キット。 ３０． 上記２７の方法により組織からの細胞ＤＮＡか
らアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製するのに有用な
キット。
おりである。 １． （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない制
限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプル
におけるＤＮＡを消化し； （ｂ）消化したＤＮＡを細胞にトランスフェクション
し； （ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッ
ケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノ
ウイルス機能が細胞において発現される条件下で培養
し； （ｄ）ヘルパー機能を発現する細胞において（ｃ）の培
養工程から得られるライセートを継代し；そして （ｅ）場合により継代工程からのライセートをさらなる
継代に供する：組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴
ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューの方法。 ２． 消化工程をＰｍｅＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、Ｐｓ
ｒＩ、ＢｃｇＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａｂＩ、ＢｓｔＸＩ、
ＤｒｄＩ、ＥｃｏＮＩ、ＦｓｅＩ及びＭａＭＩよりなる
群から選択される制限酵素を用いて行う上記１に記載の
方法。 ３． 消化工程が、サンプルからのＤＮＡをＰｍｅＩと
インキュベーションすること、フェノール／クロロホル
ム抽出を行うこと、エタノールで沈殿すること及び沈殿
物を溶解することの工程をさらに含んでなる上記１もし
くは２に記載の方法。 ４． インキュベーションする工程を約１２〜４８時間
行う上記３に記載の方法。 ５． 哺乳動物細胞源が非ヒト霊長類もしくはヒトから
の組織である上記１〜４のいずれかに記載の方法。 ６． 工程（ｂ）の細胞をＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子産物
の発現を導く調節制御要素の制御下のアデノウイルスＥ
１ａ及びＥ１ｂ遺伝子で安定に形質転換する上記１〜５
のいずれかに記載の方法。 ７． 工程（ｂ）の細胞が２９３細胞である上記１〜６
のいずれかに記載の方法。 ８． 工程（ｂ）の細胞がＡＡＶヘルパー機能を発現す
る上記１〜５のいずれかに記載の方法。 ９． 工程（ｂ）の細胞がＡＡＶ ｒｅｐタンパク質を
発現する上記１〜８のいずれかに記載の方法。 １０． 工程（ｂ）の細胞をアデノウイルスＥ１ａ、Ｅ
１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４（もしくはその機能性フラグメン
ト）及びＶＡＩ ＲＮＡからなるアデノウイルス配列を
含有するベクターと共トランスフェクションする上記１
〜５のいずれかに記載の方法。 １１． 工程（ｂ）の細胞をアデノウイルスＥ２ａ、Ｅ
４（もしくはその機能性フラグメント）及びＶＡＩ Ｒ
ＮＡからなるアデノウイルス配列を含有するベクターと
共トランスフェクションする上記１〜５のいずれかに記
載の方法。 １２． アデノウイルスヘルパー機能をプラスミド上で
提供する上記１〜５のいずれかに記載の方法。 １３． ヘルパー機能を一つもしくはそれ以上のアデノ
ウイルス血清型により提供する上記１〜１２のいずれか
に記載の方法。 １４． アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ機能をヒトア
デノウイルスにより提供する上記１〜１３のいずれかに
記載の方法。 １５． 他の必要なアデノウイルスヘルパー機能をチン
パンジーアデノウイルス血清型により提供する上記１４
に記載の方法。 １６． 工程（ｂ）の細胞を０．２μｇ〜２μｇでトラ
ンスフェクションする上記１２〜１４のいずれかに記載
の方法。 １７． 非感染性ヘルパーアデノウイルスプラスミドで
トランスフェクションすること及び継代中に野生型アデ
ノウイルスを細胞に重複感染させることの工程をさらに
含んでなる上記１に記載の方法。 １８． 非感染性ヘルパーアデノウイルスプラスミドで
トランスフェクションすること及び継代中にＥ１欠失ア
デノウイルスを細胞に重複感染させることの工程をさら
に含んでなる上記１〜５のいずれかに記載の方法。 １９． 継代工程を２９３細胞において行う上記１〜１
８のいずれかに記載の方法。 ２０． 継代工程を繰り返す上記１〜１８のいずれかに
記載の方法。 ２１． （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない
制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプ
ルにおけるＤＮＡを消化し； （ｂ）消化したＤＮＡを細胞にトランスフェクション
し； （ｃ）トランスフェクションした細胞をインキュベーシ
ョンし； （ｄ）トランスフェクションした細胞に、細胞がＡＡＶ
のパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限の
アデノウイルス機能を含有するようにアデノウイルスヘ
ルパー機能を重複感染させ； （ｅ）重複感染細胞をＡＡＶの複製に必要なヘルパー機
能が発現される条件下で培養し； （ｆ）重複感染培養物から粗ライセートを採取し；そし
て （ｇ）粗ライセートを継代する：組織からの細胞ＤＮＡ
からのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキュー
及び検出の方法。 ２２． 採取する工程が、粗ライセートを得るために重
複感染細胞培養物を凍結融解に供することをさらに含ん
でなる上記２１に記載の方法。 ２３． 粗ライセートを２回もしくはそれ以上の継代に
供する上記２１に記載の方法。 ２４． （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない
制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプ
ルにおけるＤＮＡを消化し； （ｂ）消化したＤＮＡ並びに宿主細胞により供給されな
いＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のア
デノウイルス機能からなるアデノウイルス配列を含んで
なる非感染性アデノウイルスヘルパープラスミドを共ト
ランスフェクションし； （ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッ
ケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機
能のみが細胞において発現される条件下で培養し； （ｄ）粗ライセートを得るために細胞培養物を処理し； （ｅ）細胞に粗ライセートをトランスフェクションしそ
して細胞がＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な少
なくとも最低限のアデノウイルス機能を含有するように
アデノウイルスヘルパー機能を細胞に重複感染させるこ
とにより粗ライセートを第一の継代に供し；そして （ｆ）場合によりもう２回もしくはそれ以上継代する：
組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ）の直接レスキューの方法。 ２５． ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断しない制
限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサンプル
におけるＤＮＡを消化し； （ｂ）消化したＤＮＡ並びに宿主細胞により供給されな
いＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限のア
デノウイルス機能を含んでなる感染性アデノウイルスヘ
ルパープラスミドを共トランスフェクションし； （ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッ
ケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機
能が細胞において発現される条件下で培養し； （ｄ）粗ライセートを得るために細胞培養物を処理し；
そして （ｅ）粗ライセートを細胞にトランスフェクションする
ことにより場合により粗ライセートを２回もしくはそれ
以上の継代に供する：組織からの細胞ＤＮＡからのアデ
ノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューの方法。 ２６． ＡＡＶの存在に関して上記１、２２、２４もし
くは２５の方法のいずれかから得られる粗ライセートを
アッセイすることの工程を含んでなる、組織における細
胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検出する
方法。 ２７． （ａ）細胞ペレットを提供するために上記１、
２２、２４もしくは２５の方法のいずれかから得られる
粗ライセートを遠心分離すること；及び（ｂ）細胞ペレ
ットからＡＡＶを精製すること：の工程を含んでなる、
組織における細胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ）を精製する方法。 ２８． 上記１、２２、２４もしくは２５のいずれかの
方法による組織の細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス
（ＡＡＶ）の直接レスキューに有用なキット。 ２９． 上記２６の方法により組織からの細胞ＤＮＡか
らアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検出するのに有用な
キット。 ３０． 上記２７の方法により組織からの細胞ＤＮＡか
らアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製するのに有用な
キット。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ジエイムズ・エム・ウイルソン
アメリカ合衆国ペンシルベニア州19035グ
ラドウイン・ノースアビニヨンドライブ
1350
(72)発明者 モーリシオ・アール・アルビラ
アメリカ合衆国ペンシルベニア州19104フ
イラデルフイア・アパートメント203・パ
インストリート4417
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA04 CA05 CA09
DA02 EA02 GA18 GA19 HA08
HA09 HA12 HA14
4B063 QA01 QA18 QQ10 QR32 QR41
QR42 QR48 QR55 QR69 QR77
QR82 QS12 QS24 QS25 QS28
QS34 QS36 QX01
4B065 AA95X BA24 CA46
Claims (9)
- 【請求項１】 （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断
しない制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡの
サンプルにおけるＤＮＡを消化し； （ｂ）消化したＤＮＡを細胞にトランスフェクション
し； （ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッ
ケージング及び複製に必要な少なくとも最低限のアデノ
ウイルス機能が細胞において発現される条件下で培養
し； （ｄ）ヘルパー機能を発現する細胞において（ｃ）の培
養工程から得られるライセートを継代し；そして （ｅ）場合により継代工程からのライセートをさらなる
継代に供する：組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴
ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューの方法。 - 【請求項２】 （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断
しない制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡの
サンプルにおけるＤＮＡを消化し； （ｂ）消化したＤＮＡを細胞にトランスフェクション
し； （ｃ）トランスフェクションした細胞をインキュベーシ
ョンし； （ｄ）トランスフェクションした細胞に、細胞がＡＡＶ
のパッケージング及び複製に必要な少なくとも最低限の
アデノウイルス機能を含有するようにアデノウイルスヘ
ルパー機能を重複感染させ； （ｅ）重複感染細胞を、ＡＡＶの複製に必要なヘルパー
機能が発現される条件下で培養し； （ｆ）重複感染培養物からの粗ライセートを採取し；そ
して （ｇ）粗ライセートを継代する：組織からの細胞ＤＮＡ
からのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキュー
及び検出の方法。 - 【請求項３】 （ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断
しない制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡの
サンプルにおけるＤＮＡを消化し； （ｂ）消化したＤＮＡ並びに、宿主細胞により供給され
ないＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限の
アデノウイルス機能からなるアデノウイルス配列を含ん
でなる非感染性アデノウイルスヘルパープラスミドを、
共トランスフェクションし； （ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッ
ケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機
能のみが細胞において発現される条件下で培養し； （ｄ）粗ライセートを得るために細胞培養物を処理し； （ｅ）細胞中に粗ライセートをトランスフェクション
し、そして細胞がＡＡＶのパッケージング及び複製に必
要な少なくとも最低限のアデノウイルス機能を含有する
ようにアデノウイルスヘルパー機能を細胞に重複感染さ
せることにより、粗ライセートを第一の継代に供し；そ
して （ｆ）場合によりもう２回もしくはそれ以上継代する：
組織からの細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ）の直接レスキューの方法。 - 【請求項４】 ａ）天然のＡＡＶゲノムにおいて切断し
ない制限酵素で哺乳動物細胞源からのゲノムＤＮＡのサ
ンプルにおけるＤＮＡを消化し； （ｂ）消化したＤＮＡ、並びに宿主細胞により供給され
ないＡＡＶのパッケージング及び複製に必要な最低限の
アデノウイルス機能を含んでなる感染性アデノウイルス
ヘルパープラスミドを、共トランスフェクションし； （ｃ）トランスフェクションした細胞を、ＡＡＶのパッ
ケージング及び複製に必要な最低限のアデノウイルス機
能が細胞において発現される条件下で培養し； （ｄ）粗ライセートを得るために細胞培養物を処理し；
そして （ｅ）粗ライセートを細胞にトランスフェクションする
ことにより、場合により粗ライセートを２回もしくはそ
れ以上の継代に供する：組織からの細胞ＤＮＡからのア
デノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の直接レスキューの方法。 - 【請求項５】 ＡＡＶの存在に関して請求項１、３もし
くは４の方法のいずれかから得られる粗ライセートをア
ッセイすることの工程を含んでなる、組織における細胞
ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検出する方
法。 - 【請求項６】 （ａ）細胞ペレットを提供するために請
求項１、３もしくは４の方法のいずれかから得られる粗
ライセートを遠心分離すること；及び（ｂ）細胞ペレッ
トからＡＡＶを精製すること：の工程を含んでなる、組
織における細胞ＤＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ）を精製する方法。 - 【請求項７】 請求項１、３もしくは４のいずれかの方
法による組織の細胞ＤＮＡからのアデノ随伴ウイルス
（ＡＡＶ）の直接レスキューに有用なキット。 - 【請求項８】 請求項５の方法により組織からの細胞Ｄ
ＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検出するのに
有用なキット。 - 【請求項９】 請求項６の方法により組織からの細胞Ｄ
ＮＡからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製するのに
有用なキット。
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