ES2257051T3 - Administracion potenciada por conveccion de vectores aav que codifican aadc. - Google Patents

Abstract

El uso de las composiciones primera y segunda para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la Enfermedad de Parkinson, en el que la composición primera comprende viriones de virus adeno asociado recombinante (rAAV) que comprenden un transgen que codifica una descarboxilasa de aminoácido aromático (AADC) y un excipiente aceptable farmacéuticamente, para administrar en la cavidad craneana y en el que la composición segunda comprende L-dopa y un excipiente aceptable farmacéuticamente para uso oral, en el que se administra solo un transgen.

Description

Administración potenciada por convección de vectores AAV que codifican AADC.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la administración eficaz de vectores virales al SNC. Más particularmente, la presente invención se refiere a terapia génica para el tratamiento de afecciones del sistema nervioso central (SNC), particularmente aquellas afecciones que involucran el neurotransmisor dopamina.

Antecedentes de la invención

Las afecciones del SNC son temas de gran importancia en la salud pública. Sólo la enfermedad de Parkinson (PD) afecta a más de un millón de personas en los Estados Unidos. Clínicamente, la PD se caracteriza por una disminución en los movimientos espontáneos, dificultad en el andar, inestabilidad postural, rigidez y temblor. La enfermedad de Parkinson es causada por la degeneración de las neuronas pigmentadas en la sustancia nigra del cerebro, lo que da como resultado una disponibilidad disminuida de dopamina. El metabolismo alterado de la dopamina también está implicado en pacientes esquizofrénicos los que muestran incrementos de dopamina en ciertas áreas del
cerebro.

Actualmente, muchas afecciones del SNC tal como el PD se tratan por medio de administración sistémica de un agente terapéutico. La administración sistémica, sin embargo, a menudo es ineficiente debido a la incapacidad del fármaco de atravesar la barrera hematoencefálica y debido a que muchos fármacos provocan efectos secundarios periféricos. Por esto, muchos compuestos potencialmente útiles, tales como proteínas, no pueden administrarse sistémicamente. Si estos compuestos atraviesan exitosamente la barrera hematoencefálica, pueden también inducir efectos secundarios en el sistema nervioso central. El tratamiento de la PD actualmente incluye la administración oral del precursor de dopamina, L-dopa a menudo en combinación con un compuesto tal como carbidopa, un inhibidor periférico de la enzima descarboxilasa de aminoácido aromático (AADC) que descarboxila dopa a dopamina. En la mayoría de los pacientes, sin embargo la producción de AADC en las regiones afectadas del cerebro es reducida y la PD progresa y, consecuentemente, se necesitan mayores y mayores dosis de L-dopa, dejando a los pacientes con beneficios terapéuticos disminuidos y efectos secundarios incrementados.

En vista de las limitaciones de las actuales terapias sistémicas, la administración genética es un procedimiento prometedor para el tratamiento de afecciones del SNC tal como PD. Se han descrito un número de sistemas basados en virus para los objetivos de transferencia genética, tales como sistemas retrovirales que son actualmente los sistemas más ampliamente usados con vectores virales para este objetivo. Para descripciones de diversos sistemas retrovirales, ver por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 5.219.740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa y col. (1991) Virology 180:849-852; Burns y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; y Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

Los sistemas con virus adeno asociados (AAV) están emergiendo como los candidatos principales para usar en terapia génica. El AAV es un parvovirus de ADN dependiente de auxiliar (ayudante) que deriva del género Dependovirus. El AAV necesita la infección con un virus ayudante no relacionado, ya sea adenovirus, un herpesvirus o vaccinia, con el fin de que se produzca una infección productiva. El virus ayudante aporta funciones accesorias que son necesarias para muchas etapas en la replicación de AAV. Para una revisión de AAV, ver por ejemplo, Berns and Bohenzky (1987) Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32:243-307.

El AAV infecta una gran variedad de tejidos y no provocó los efectos citotóxicos y las reacciones inmunes adversas en modelos animales que se vieron con otros vectores virales. (Ver, por ejemplo, Muzyczka, (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Flotte y col., (1993) PNAS USA 90:10613-10617; Kass-eiser y col. (1992) Gene Therapy 1:395-402; Yang y col. PNAS USA 91:4407-4411; Conrad y col. (1996) Gene Therapy 3:658-668; Yange y col. (1996) Gene Therapy 3:137-144; Brynes y col. (1996) J. Neurosci. 16:3045-3055). Dado que puede transducir tejido que no se divide, el AAV puede adaptarse bien para administrar genes al sistema nervioso central (SNC). La Patente de EEUU Número 5.677.158 describe procedimientos para hacer vectores AAV. Los vectores AAV que contienen genes terapéuticos bajo el control del promotor de citomegalovirus (CMV) mostraron transducir cerebro de mamíferos y tener efectos funcionales en modelos de enfermedad.

Los vectores AAV que llevan transgenes se describieron, por ejemplo, en Kaplitt y col. (1994) Nature Genetics 8:148-153; el Documento WO 95/28493 publicado el 26 de Octubre de 1995; el Documento WO 95/34670 publicado el 21 de Diciembre de 1995; During y col., (1998) Gene Therapy 5:820-827; Mandel y col. (1998) J. Neurosci. 18:4271-4284; Szczypka y col. (1999) Neuron 22:167-178. Sin embargo, se ha constatado que la administración de vectores AAV al SNC es dificultosa. El AAV fue usado para transferir el gen de timidina quinasa (tk) a gliomas experimentales en ratones, y se ha demostrado la capacidad del AAV-tk de brindar a estos tumores cerebrales la sensibilidad a los efectos citocidas del ganciclovir. Okada y col. (1996) Gene Therapy 3:959-964; Mizuno y col. (1998) Jpn. J. Cancer Res. 89:76-80. La infusión de un vector AAV-CMV conteniendo el gen de tirosina hidroxilasa humana (TH), una encima involucrada en la conversión del aminoácido tirosina a dopa, dentro del cerebro de rata adulta dio como resultado la transducción tanto de neuronas como de glia (Kaplitt y col. (1995) VIRAL VECTORS, GENE THERAPY AND NEUROSCIENCE APPLICATIONS, Kaplitt and Loewy eds., 12:193-210, Academic Press, San Diego; Bankiewicz y col. (1997) Exper. Neurol. 144:147-156). La administración del mismo vector en el striatum de monos dio como resultado una marcada expresión de TH durante hasta 2,5 meses (During y col., supra). Además, se probó AAV-CMV-TH en un modelo de Enfermedad de Parkinson en roedores donde causó una mejora significativa en el comportamiento rotacional de ratas con afecciones provocadas por 6-hidroxidopamina (Fan y col. (1998) Human Gene Therapy 9:2527-2537; Mandel y col. (1997) PNAS USA 94:14083-14088).

Sin embargo, mientras tales reportes demuestran el potencial de AAV para dirigirse al SNC, también demuestran que la inyección directa de vectores AAV dentro del SNC da como resultado un número limitado de células transfectadas y que las células transfectadas están agrupadas en un área angosta cerca de la extensión de la inyección. (Ver, por ejemplo, During y col., supra; Fan y col., supra). Como las inyecciones múltiples en el SNC provocan complicaciones indeseadas, existe aún una necesidad de encontrar procedimientos para administrar vectores AAV en áreas mayores del cerebro usando la menor cantidad de sitios de inyección. Además, la relación entre la dosis de vector inyectada y su distribución resultante en el tejido cerebral no ha sido reportada anteriormente.

Además, la terapia génica para PD se ha centrado en la administración de al menos 2 genes que codifican enzimas involucradas en la síntesis de dopamina, a saber TH y AADC. Estos procedimientos están sujetos a todos los problemas de administración discutidos anteriormente y, además necesitan que ambos genes se expresen en las cantidades apropiadas. Por esto, el tratamiento de PD usando AAV-AADC en combinación con L-dopa tampoco ha sido demostrado.

Resumen de la invención

En un aspecto, la presente invención provee el uso de viriones AAV recombinantes (rAAV) que llevan un transgen para administración al sistema nervioso central (SNC) de un sujeto, por ejemplo un ser humano, usando administración potenciada por convección (CED). La CED puede llevarse a cabo, por ejemplo usando una bomba osmótica o una bomba de infusión. El transgen codifica una descarboxilasa de aminoácido aromático (AADC) o un fragmento activo de la misma. Resulta de preferencia administrar los viriones rAAV dentro del striatum del SNC.

En otro aspecto, la invención describe la administración de viriones AAV recombinantes a un sujeto con una afección del SNC. Los viriones rAAV codifican un polipéptido terapéutico adecuado y se administran en el SNC de un sujeto usando CED. La afección del SNC es la enfermedad de Parkinson (PD), los viriones rAAV se administran dentro del striatum del SNC y la secuencia de ácido nucleico codifica AADC.

Se administra al SNC una preparación de viriones de virus adeno asociado recombinante (rAAV) con una secuencia de ácido nucleico terapéutica que es expresable por células transducidas, usando administración potenciada por convección (CED). La enfermedad neurodegenerativa es PD y el polipéptido terapéutico es un AADC. El medicamento para tratar la enfermedad neurodegenerativa también incluye al menos un compuesto terapéutico adicional al sujeto, es decir, L-dopa para uso oral y opcionalmente carbidopa.

En otro aún aspecto, se describen procedimientos para determinar niveles de actividad de dopamina en el SNC del sujeto. Se administra un trazador marcado al sujeto. El trazador es de preferencia un compuesto que se une a una célula que utiliza dopamina y el marcador es de preferencia un radioisótopo, por ejemplo, 6-[^{18}F]-fluoro-L-m-tirosina (^{18}F-FMT). La detección del marcador es indicativa de actividad de dopamina por medio de la unión del trazador. De preferencia, se obtienen imágenes del SNC del sujeto, por ejemplo usando exploración con tomografía por emisión de positrones (PET).

También se provee el uso del primer y segundo compuesto terapéutico en la fabricación del primer y segundo medicamentos para tratar la Enfermedad de Parkinson, en el que el primer medicamento comprende viriones AAV recombinantes (rAAV) que comprenden un transgen que codifica AADC, dicho primer medicamento, para ser administrado a un sujeto por administración potenciada por convección (CED), y en el que dicho segundo medicamento comprende L-dopa para ser administrada a un sujeto sistémicamente, es decir por vía oral.

Los expertos en la técnica encontrarán con facilidad éstas y otras formas de realización en vista de la descripción expuesta en este documento.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1, gráficos a a d, representan la respuesta a la dosis (expresión del transgen AAV-tk) en rata tras la administración intracraneal por medio de bomba de infusión. Se representan: el volumen de tejido (Figura 1a); área media (Figura 1b); longitud (Figura 1c) y número de células (Figura 1d) que expresan el transgen.

La Figura 2 es una reproducción en medio tono que muestra la marcación del tejido cerebral de rata tras la inyección de vectores AAV.

La Figura 3, gráficos a a d, representan la administración intracraneal de AAV-tk por medio de una bomba de infusión (BI) o bomba osmótica (BO). Se representan: el volumen de tejido (Figura 3a); área media (Figura 3b); longitud (Figura 3c) y número de células (Figura 3d) que expresan el transgen. Las figuras 4a, 4b, 4c y 4d son reproducciones en medio tono que muestran tejido del SNC al que se le administró por infusión vector conteniendo el transgen tk. Las Figuras 4a y b muestran la expresión de tk en neuronas. Las Figuras 4c y d muestran la expresión en neuronas y glia cerca del sitio de la infusión con bomba osmótica.

La Figura 5 es una reproducción en medio tono que muestra análisis de transferencia Southern de tejidos de un sujeto al que se le infundió vector AAV-tk.

La Figura 6 representa la inmunotinción para AADC de cerebros de monos con lesiones por MPTP. El lado izquierdo (control) muestra una tinción restringida, mientras que el lado derecho (tratados con AAV-AADC) muestra una amplia inmunotinción de AADC.

La Figura 7 es una exploración FMT PET que representa la actividad de dopamina en cerebros de monos con lesiones unilaterales por MPTP. El lado izquierdo (línea basal) muestra actividad restringida del lado lesionado, mientras que el lado derecho (8 semanas tras la administración de AAV-AADC) muestra niveles normales de actividad de dopamina.

La Figura 8, gráficos A a C representan un análisis bioquímico de niveles de L-dopa en monos con lesiones por MPTP. El gráfico A muestra que L-dopa se convierte en dopamina por acción de la enzima AADC. En regiones corticales, sin tener en cuenta el tratamiento con MPTP, se observa una pobre o ninguna conversión de L-dopa a dopamina. El striatum es rico en AADC, por lo tanto, la mayor parte de la L-dopa se convirtió en dopamina en esta región. En el striatum ipsilateral tras la administración de MPTP, la conversión de L-dopa a dopamina está afectada y es similar a la actividad cortical en monos tratados con AAV-Lac-Z. Ambos animales tratados con AAV-AADC mostraron niveles prácticamente normales de conversión de L-dopa a dopamina. El gráfico B representa el análisis de HVA. HVA es un metabolito del catabolismo de la dopamina. Como las regiones corticales no son capaces de convertir L-dopa en dopamina, los niveles de HVA son bajos. Como se muestra en el gráfico A, el striatum convierte L-dopa en dopamina, por lo tanto, la dopamina es catabolizada y se forma HVA en esta región. Como no se ha restablecido la actividad de AADC en los monos tratados con AAV-Lac-Z, los niveles de HVA en el striatum ipsilateral con MPTP son bajos. Los niveles de HVA son significativamente elevados en monos tratados con AAV-AADC en el striatum ipsilateral con MPTP. El gráfico C muestra los niveles de L-dopa medidos en las muestras de tejidos tras la administración de L-dopa. Debido a la diferentes absorción de L-dopa, los niveles tisulares difieren entre los monos. Son similares, sin embargo, dentro de cada sujeto. Los niveles tisulares de L-dopa se redujeron dramáticamente en el striatum ipsilateral con MPTP de monos tratados con AAV-AADC, desde que se restableció la enzima AADC. La actividad de AADC en esta región es muy fuerte, ya que los niveles tisulares de L-dopa son menores que en el striatum contralateral.

La Figura 9 es un gráfico que representa la actividad de la enzima AADC in vitro. Se incubaron muestras de tejidos con L-dopa como se describe en materiales y procedimientos. La actividad de la enzima AADC se determinó midiendo la tasa de conversión de L-dopa en dopamina. Las regiones corticales contienen niveles bajos de AADC. La actividad de AADC en el striatum contralateral es alta, sin embargo, es variable ya que existe alguna lesión dopaminérgica en ese lado del cerebro. La actividad de AADC en el striatum ipsilateral con MPTP está significativamente reducida en monos tratados con AAV-Lac-Z mientras que está completamente restablecida en monos con AAV-DDC.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, procedimientos convencionales de virología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de los usados en la técnica. Tales técnicas se explican en profundidad en la bibliografía. Ver, por ej. Sambrook, y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, y col. eds. current edition); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, eds., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II (P. Tijessen, ed.); Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.)

Como se usan en esta memoria y en las reivindicaciones, las formas en singular "un", "una" y "el ", "la"incluyen las referencias en plural a menos que el contenido lo exprese claramente de otra manera.

Definiciones

Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos, los que se definen como se indica a continuación.

"Transferencia genética" o "administración genética" se refiere a procedimientos o sistemas para insertar de manera fiable ADN extraño dentro de células huésped. Tales procedimientos pueden dar como resultado la expresión transitoria de ADN transferido no integrado, replicación extracromosómica y expresión de replicones transferidos (por ej. episomas), o integración del material genético transferido en el ADN genómico de las células huésped. La transferencia genética provee un enfoque único al tratamiento de enfermedades hereditarias y adquiridas. Se han desarrollado una cantidad de sistemas para realizar transferencia genética en células de mamíferos. Ver, por ej. la Patente de EEUU Nº 5.399.346.

Por "vector" se entiende cualquier elemento genético, tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, virus, virión, etc. que es capaz de replicar cuando está asociado con los elementos de control adecuados y que puede transferir secuencias genéticas entre células. Por ello, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como también vectores virales.

Por "virus recombinante" se entiende un virus que ha sido genéticamente alterado, por ej. mediante adición o inserción de una construcción de ácido nucleico heterólogo dentro de la partícula.

Por "virión AAV" se entiende una partícula de virus completa, tal como una partícula de virus AAV de tipo salvaje (wt) (que comprende un genoma de ácido nucleico lineal, de sola hebra de AAV asociado con un revestimiento de proteína de cápside de AAV). Con respecto a esto, las moléculas de ácido nucleico de AAV de hebra simple de sentido complementario, por ej. hebras "con sentido" o "sin sentido", pueden empaquetarse dentro de cualquier virión AAV y ambas hebras son igualmente infecciosas.

Un "virión AAV recombinante" o "virión rAAV" se define en este documento como un virus con replicación defectuosa, infeccioso, compuesto por una proteína de envoltura de AAV, encapsidando una secuencia de nucleótidos heterólogos de interés, la que está flanqueada en ambos lados por AAV ITRs. Un virión rAAV se produce en una célula huésped adecuada que ha tenido un vector de AAV, funciones de ayuda al AAV y funciones accesorias introducidas en la misma. De esta manera, la célula huésped se convierte en una célula capaz de codificar polipéptidos de AAV que son necesarios para encapsidar el vector de AAV (conteniendo una secuencia de nucleótidos recombinante de interés) dentro de partículas de viriones recombinantes infecciosas para la posterior administración genética.

El término "transfección" se usa para referirse a la adquisición de ADN extraño por una célula, y una célula fue "transfectada" cuando se le ha introducido un ADN exógeno dentro de su membrana celular. Se conocen en general una cantidad de procedimientos de transfección en la técnica. Ver, por ej. Graham y col. (1973) Virology, 52:456, Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis y col. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu y col. (1981) Gene 13:197. Tales técnicas pueden usarse para introducir uno o más restos de ADN exógeno, tales como un vector de integración de nucleótidos y otras moléculas de ácido nucleico, dentro de células huésped adecuadas.

"Célula huésped" significa, por ejemplo, microorganismos, células de levaduras, células de insectos y células de mamíferos que pueden, o han sido usadas como receptores de una construcción de ayuda al AAV, un plásmido vector de AAV, un vector de funciones accesorias u otro ADN transferido. El término incluye la progenie de la célula original que fue transfectada. Por ello, una "célula huésped" como se usa en este documento generalmente se refiere a una célula que fue transfectada con una secuencia de ADN exógeno. Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente idéntica en morfología o en genómica o en complemento de ADN total a la original, debido a mutación natural, accidental o deliberada.

Como se usa en este documento, "línea celular" se refiere a una población de células capaces de crecer y dividirse de manera continua o prolongada in vitro. A menudo, las líneas celulares son poblaciones clónicas derivadas de una única célula progenitora. Además, en la técnica se sabe que pueden producirse cambios espontáneos o inducidos en el cariotipo durante el almacenamiento o transferencia de dichas poblaciones clónicas. Por lo tanto, las células derivadas de las líneas celulares referidas pueden no ser precisamente idénticas a las células ancestrales o cultivos y la línea celular referida incluye tales variantes.

El término "heterólogo" en referencia a secuencias de ácidos nucleicos tales como secuencias codificadoras o secuencias de control, significa secuencias que no se encuentran normalmente juntas, y/o no están normalmente asociadas con una célula en particular. Por lo tanto, una región "heteróloga" de una construcción de ácido nucleico o un vector es un segmento de ácido nucleico dentro de o unido a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentra asociado con la otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heteróloga de una construcción de ácido nucleico podría incluir una secuencia codificadora flanqueada por secuencias que no se encuentran asociadas con la secuencia codificadora en la naturaleza. Otro ejemplo de una secuencia codificadora heteróloga es una construcción en la que la secuencia codificadora misma no se encuentra en la naturaleza (por ej. secuencias sintéticas con codones diferentes de los del gen nativo). De manera similar, una célula transformada con una construcción que no está normalmente presente en la célula podría considerarse heteróloga para los objetivos de esta invención. La variación alélica o los acontecimientos mutacionales que ocurren naturalmente no dan origen a ADN heterólogo, como se usa en este documento.

Una "secuencia codificadora" o una secuencia que "codifica" una proteína en particular, es una secuencia de ácido nucleico que es transcrita (en el caso de ADN) y traducida (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias regulatorias adecuadas. Los límites de la secuencia codificadora se determinan mediante un codón de inicio en el extremo 5' (amino) terminal y un codón de finalización de lectura en el extremo 3' (carboxi) terminal. Una secuencia codificadora puede incluir, pero no está limitada a ADNc de ARNm procariota o eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN procariota o eucariota, e incluso secuencias de ADN sintéticas. Usualmente se encontrará una secuencia de finalización de la transcripción en 3' hacia la secuencia codificadora.

Una secuencia de "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ADN o de ARN. El término engloba secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases de ADN y ARN conocidos tales como, pero no limitados a 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetil aminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonil metiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, metiléster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metil éster del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

El término "secuencias control" de ADN se refiere en conjunto a secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios de regulación secuencia arriba, orígenes de replicación, sitios de entrada de ribosomas internos ("IRES"), potenciadores y similares, que en conjunto proveen para la replicación, transcripción y traducción de una secuencia codificadora en una célula receptora. No todas estas secuencias de control necesitan estar presentes siempre, siempre y cuando la secuencia codificadora seleccionada sea capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en una célula huésped adecuada.

El término "región promotora" se usa en este documento para referirse a una región de nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, en la que la secuencia reguladora deriva de un gen que es capaz de unir polimerasa de ARN e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora, secuencia abajo en dirección 3'.

"Enlazados operativamente" se refiere a una disposición de elementos en la que los componentes descritos están configurados de manera tal que llevan a cabo su función habitual. Por ello, las secuencias de control enlazadas operativamente a una secuencia codificadora son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificadora. Las secuencias de control no necesitan estar contiguas a la secuencia codificadora, siempre y cuando funcionen para dirigir la expresión de la misma. Por ello, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias transcritas no traducidas intervinientes entre la secuencia promotora y la secuencia codificadora y la secuencia promotora puede aún ser considerada "enlazada operativamente" a la secuencia codificadora.

Por "aislado" al referirse a una secuencia de nucleótidos, se entiende que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. Así, una "molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido particular" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido de interés; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o restos adicionales que no afectan perjudicialmente las características básicas de la composi-
ción.

Con el objeto de describir la posición relativa de secuencias de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico particular a lo largo de la presente solicitud, como cuando se describe a una secuencia de nucleótido particular situada "secuencia arriba", "secuencia abajo", "3'" o "5'" en relación a otra secuencia, se entiende que esa es la posición de las secuencias en la hebra "con sentido" o "codificadora" de una molécula de ADN a la que se refiere, como es habitual en la técnica.

Un "gen" se refiere a un polinucleótido que contiene al menos un marco de lectura abierto capaz de codificar un polipéptido o proteína particular tras ser transcrito o traducido. Cualquiera de las secuencias de polinucleótidos descritas en este documento puede usarse para identificar fragmentos mayores o secuencias codificadoras completas de los genes con las que están asociadas. Los expertos en la técnica conocen procedimientos para aislar secuencias de fragmentos mayores.

Como se describe en este documento, se considera que dos fragmentos de ácido nucleico "hibridan selectivamente". El grado de identidad de las secuencias entre dos moléculas de ácido nucleico afecta la eficacia y la fuerza de la hibridación entre tales moléculas. Una secuencia de ácido nucleico parcialmente idéntica inhibirá al menos parcialmente la hibridación de una secuencia completamente idéntica a una molécula blanco. La inhibición de hibridación de una secuencia completamente idéntica puede valorarse usando ensayos de hibridación bien conocidos en la técnica (por ej., transferencia Southern, transferencia Northern, hibridación de solución o similares, ver Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Tales ensayos pueden llevarse a cabo usando diferentes grados de selectividad, por ejemplo, usando condiciones que varían de baja a alta rigurosidad. Si se usan condiciones de baja rigurosidad, se puede valorar la ausencia de unión no específica usando una sonda secundaria que carece incluso de un grado parcial de identidad de secuencia (por ejemplo, una sonda que tiene menos de aproximadamente 30% se identidad de secuencia con la molécula blanco), tal que, en ausencia de uniones no específicas, la sonda secundaria no hibridará con la molécula blanco.

Cuando se usa un sistema de detección basado en hibridación, se elige una sonda de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana y posteriormente, seleccionando las condiciones adecuadas, la sonda y la secuencia blanco "hibridan selectivamente", o se unen una a la otra para formar una molécula híbrida. Una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridar selectivamente con una secuencia blanco bajo condiciones de "rigurosidad moderada" típicamente hibrida bajo condiciones que permiten la detección de una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 10-14 nucleótidos de largo y con al menos aproximadamente un 70% de identidad con la secuencia de la sonda de ácido nucleico seleccionada. Las condiciones de hibridación rigurosa típicamente permiten la detección de secuencias de ácido nucleico diana de al menos aproximadamente 10-14 nucleótidos de largo y con una identidad de secuencia mayor que aproximadamente 90-95% con la secuencia de la sonda de ácido nucleico seleccionada. Las condiciones de hibridación útiles para la hibridación de sonda/blanco en las que la sonda y el blanco tienen un grado de identidad de secuencia específico pueden determinarse con los conocimientos de la técnica (ver, por ejemplo, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).

Con respecto a las condiciones de rigurosidad para hibridación, es bien sabido en la técnica que pueden emplearse numerosas condiciones equivalentes para establecer una rigurosidad en particular variando, por ejemplo los siguientes factores: la longitud y naturaleza de la secuencia sonda y secuencia blanco, la composición base de las secuencias, las concentraciones de sales y otros componentes de la solución de hibridación, la presencia o ausencia de agentes bloqueantes en las soluciones de hibridación (por ej. formamida, sulfato de dextrán y polietilenglicol), la temperatura de hibridación y los parámetros de tiempo, así como variando las condiciones de lavado. La selección de una serie de condiciones particulares de hibridación se realiza siguiendo procedimientos estándar en la técnica (ver por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).

El término "descarboxilasa de aminoácido aromático" o "AADC" se refiere a un polipéptido que descarboxila dopa para dar dopamina. Por lo tanto, el término incluye un polipéptido de AADC completo, fragmentos activos u homólogos funcionales del mismo.

Un "homólogo funcional" o un "equivalente funcional" de un polipéptido dado incluye moléculas derivadas de una secuencia polipeptídica nativa, así como también polipéptidos sintetizados químicamente o recombinantes que funcionan de manera similar a la molécula de referencia para obtener un resultado deseado. Por lo tanto, un homólogo funcional de AADC incluye derivados y análogos de aquellos polipéptidos (incluyendo cualquier adición, sustitución y/o deleción de aminoácidos únicos o múltiples que tienen lugar internamente o en los extremos amino o carboxiterminal del mismo) siempre que se mantenga intacta su actividad.

También se conocen en la técnica procedimientos para determinar la "identidad de secuencia" u "homología" de ácidos nucleicos y aminoácidos. Típicamente, tales técnicas incluyen determinar las secuencias de nucleótidos del ARNm para un gen y/o determinar la secuencia de aminoácidos codificados por el mismo, y comparar estas secuencias con una segunda secuencia de nucleótidos o aminoácidos. En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido de dos secuencias de polinucleótidos o secuencias polipeptídicas, respectivamente. Se pueden comparar dos o más secuencias (polinucleótidos o aminoácidos) determinando su "identidad porcentual". La identidad porcentual de dos secuencias ya sean ácidos nucleicos o secuencias de aminoácidos, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido por la longitud de las secuencias más cortas y multiplicado por 100. Se provee un alineamiento aproximado para secuencias de ácidos nucleicos por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Este algoritmo puede aplicarse a secuencias de aminoácidos usando la matriz de valoración desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed. 5 supl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, y normalizada por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Se provee un ejemplo de aplicación de este algoritmo para determinar la identidad porcentual de una secuencia por el Genetics Computer Group (Madison, WI) en la aplicación "BestFit". Los parámetros predeterminados para este procedimiento se describen en Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995) (disponible en Genetics Computer Group (Madison, WI)). Un procedimiento para establecer la identidad porcentual de preferencia en el contexto de la presente invención es usar el paquete de programas MPSRCH registrado por la Universidad de Edinburgh, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). De este juego de paquetes puede usarse el algoritmo Smith-Waterman cuando se usan parámetros predeterminados para la tabla de valoración (por ejemplo, penalización abierta del hueco (gap) de 12, penalización por extensión de hueco de uno y un hueco de seis). El valor "Match" refleja la "identidad de secuencias" a partir de los datos generados. Otros programas adecuados para calcular la identidad porcentual o similitud entre secuencias son generalmente bien conocidos en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, usado con parámetros predeterminados. Por ejemplo, pueden usarse BLASTN y BLASTP con los siguientes parámetros predeterminados: genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas pueden encontrarse en internet en:

http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternativamente, la homología puede determinarse por medio de hibridación de polinucleótidos bajo condiciones en las que se forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguido de digestión con nucleasa(s) específicas de hebra única y determinación de tamaño de los fragmentos digeridos. Dos ADN, o dos secuencias polipeptídicas son "sustancialmente homólogas" una con la otra cuando las secuencias exhiben al menos aproximadamente 80%-85%, de preferencia al menos aproximadamente 90% y de mayor preferencia al menos aproximadamente 95%-98% de identidad de secuencia sobre una longitud definida de las moléculas, como se determina usando el procedimiento expuesto anteriormente. Como se usa en este documento, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran identidad completa con el ADN o la secuencia de polipéptidos especificados. Secuencias de ADN sustancialmente homólogas pueden identificarse en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones de rigurosidad, definidas para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación adecuadas se encuentra dentro del conocimiento de la técnica. Ver, por ej., Sambrook y col., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

"Administración potenciada por convección" se refiere a cualquier administración de agentes no manual. En el contexto de la presente invención, pueden obtenerse administraciones potenciadas por convección (CED) de AAV mediante bombas de infusión o con bombas osmóticas.

El término "sistema nervioso central" o "SNC" incluye todas las células y tejidos del cerebro y médula espinal de un vertebrado. Por ello, el término incluye, pero no está limitado a células neuronales, células gliales, astrocitos, líquido cefalorraquídeo (LCR), espacios intersticiales, hueso, cartílago y similares. La "cavidad craneana" se refiere al área debajo del cráneo. Varias regiones del SNC han sido asociadas con diversos comportamientos y/o funciones. Por ejemplo, el ganglio basal del cerebro se ha asociado con funciones motoras, particularmente con el movimiento voluntario. El ganglio basal está compuesto por seis núcleos apareados: el núcleo caudado, el putamen, el globus pallidus, el núcleo accumbens, el núcleo subtalámico y la sustancia nigra. El núcleo caudado y el putamen, aunque separados por la cápsula interna, comparten propiedades citoarquitectónicas, químicas y fisiológicas y a menudo se los conoce como el corpus striatum, o simplemente "el striatum". La sustancia nigra, que se degenera en los pacientes con Parkinson, provee actividad dopaminérgica importante al ganglio basal.

Los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" se usan de manera indistinta en este documento y se refieren a un vertebrado, de preferencia un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no están limitados a roedores, simios, seres humanos, animales de granja, animales deportivos y mascotas.

Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para producir el resultado beneficioso o deseado. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones.

El término "trazador marcado" se refiere a cualquier molécula que puede usarse para seguir o detectar una actividad definida in vivo, por ejemplo, un trazador de preferencia es uno que se une a células que están usando dopamina. De preferencia, el trazador marcado es uno que puede verse en todo el animal, por ejemplo, explorando con tomografía de emisión de positrones (PET) u otras técnicas de imágenes del SNC. Los marcadores adecuados incluyen, pero no están limitados a radioisótopos, fluorocromos, compuestos quimioluminiscentes, tinturas y proteínas, incluyendo enzimas.

Perspectiva general de la invención

El objetivo principal de la presente invención es el desarrollo de procedimientos que permiten la administración eficaz de vectores virales, tales como AAV, en el SNC de animales. Anteriormente, los investigadores tuvieron solo mínimos éxitos administrando vectores virales a extensas áreas del cerebro. Usando dispositivos de administración potenciados por convección (por ejemplo, bombas osmóticas o de infusión), los vectores virales pueden administrarse a muchas células sobre grandes áreas del cerebro. Por otra parte, los vectores administrados expresan eficazmente los transgenes en las células del SNC (por ej., neuronas o células gliales).

Usando los procedimientos de administración de vectores virales descritos en este documento, pueden crearse nuevos tratamientos de terapia génica para afecciones del SNC (por ej., Enfermedad de Parkinson). En una forma de realización, la enfermedad de Parkinson (PD) se trata combinando terapia sistémica con L-dopa y/o carbidopa con la administración al SNC (por ej., vía CED) de vectores AAV que llevan un transgen que codifica AADC, una enzima involucrada en el metabolismo de la dopamina.

La ventajas de la invención incluyen, pero no están limitadas a (i) administración eficaz y extensa de vectores virales (tales como AAV) al SNC; (ii) expresión de ácidos nucleicos (por ej., transgenes) llevados por los vectores virales; (iii) identificación de un régimen terapéutico para la Enfermedad de Parkinson que incluye la administración de un transgen en combinación con la administración de un profármaco; y (iv) la capacidad de controlar de manera no invasiva la terapia génica del SNC usando exploración PET.

Construcción de vectores virales

Los vehículos para administrar genes útiles en la práctica de la presente invención pueden construirse usando procedimientos bien conocidos en la técnica de biología molecular (ver, por ejemplo, Ausubel o Maniatis, supra). Típicamente, los vectores virales que llevan transgenes son ensamblados a partir de polinucleótidos que codifican el transgen(es), los elementos reguladores adecuados y los elementos necesarios para la producción de proteínas virales que intervienen en la transducción celular. Por ejemplo, en una forma de realización de preferencia, se usan vectores virales adeno asociados (AAV).

Procedimientos Generales

Un procedimiento de preferencia para obtener los componentes nucleotídeos del vector viral es PCR. Los procedimientos generales para PCR se muestran en MacPherson y col., PCR: A PRACTICAL APPROACH, (IRL Press at Oxford University Press, (1991)). Las condiciones de PCR para cada reacción pueden determinarse empíricamente. El éxito de la reacción está influenciado por una cantidad de parámetros. Entre estos parámetros se encuentran la temperatura y tiempo de apareamiento, tiempo de la extensión, concentración de Mg^{2+} y ATP, pH y la concentración relativa de cebadores, moldes y desoxirribonucleótidos. A continuación, en Ejemplos se describen ejemplos de cebadores. Tras la amplificación, los fragmentos resultantes pueden detectarse por medio de electroforesis en gel de agarosa seguida de visualización con tinción de bromuro de etidio e iluminación ultravioleta.

Otro procedimiento para obtener polinucleótidos es mediante digestión enzimática. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos pueden generarse por medio de digestión de vectores apropiados con enzimas de restricción de reconocimiento adecuadas. Los fragmentos resultantes pueden posteriormente unirse de manera apropiada.

Los polinucleótidos se insertan dentro de los genomas de los vectores usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden ponerse en contacto el inserto y el ADN del vector bajo condiciones adecuadas, con una enzima de restricción para crear extremos complementarios o inespecíficos en cada molécula que puede aparearse entre sí y unirse con una ligasa. Alternativamente, pueden unirse conectores de ácido nucleico sintéticos al extremo terminal de un polinucleótido. Estos conectores sintéticos pueden contener secuencias de ácidos nucleicos que corresponden a un sitio de restricción particular en el ADN del vector. Se conocen también en la técnica otros medios útiles.

Vectores retrovirales y adenovirales

Se han usado una cantidad de sistemas basados en virus para la administración de genes. Por ejemplo, se conocen sistemas retrovirales que generalmente usan líneas de encapsidado que tienen un provirus defectuoso integrado (el "ayudante") que expresa todos los genes del virus pero no puede encapsidar su propio genoma debido a una deleción de la señal de encapsidado, conocida como secuencia psi. Por ello, la línea celular produce corazas virales vacías. Las líneas productoras pueden derivar de líneas de encapsidado que, junto con el ayudante, contienen un vector viral que incluye secuencias necesarias en cis para la replicación y el encapsidado del virus, conocidas como repeticiones terminales largas (LTRs). El gen de interés puede insertarse en un vector y encapsidarse en las cápsulas virales sintetizadas por el ayudante retroviral. El virus recombinante puede ser posteriormente aislado y administrado a un sujeto. (Ver, por ej., la Patente de EEUU nº 5.219.740). Los vectores retrovirales representativos incluyen pero no están limitados a vectores tales como LHL, N2, LNSAL, LSHL y LHL2 descritos en por ej., la Patente de EEUU Nº 5.219.740, así como derivados de esos vectores, tal como el vector N2 modificado descrito en este documento. Los vectores retrovirales pueden construirse usando técnicas bien conocidas en la técnica. Ver, por ej. la Patente de EEUU Nº 5.219.740; Mann y col. (1983) Cell 33:153-159.

Los sistemas basados en adenovirus han sido desarrollados para administración de genes y son adecuadas para administrar genes de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento. Los adenovirus humanos son virus de ADN de doble hebra que entran en las células por endocitosis mediada por receptores. Estos virus son particularmente adecuados para transferir genes por que son fáciles de cultivar y manipular y exhiben una amplia variedad de huéspedes in vivo e in vitro. Por ejemplo, los adenovirus pueden infectar células humanas de origen hematopoyético, linfoide y mieloide. Además, los adenovirus infectan células blanco tanto en fase quiescente como en replicación. A diferencia de los retrovirus que se integran en el genoma del huésped, los adenovirus persisten extracromosómicamente y por ello se ve minimizado el riesgo asociado con mutagénesis por inserción. El virus se produce fácilmente en títulos altos y es estable de modo que se puede purificar y almacenar. Aún en la forma replicativa, los adenovirus causan solo un bajo nivel de morbilidad y no están asociados con neoplasias humanas. De acuerdo con esto, se han desarrollado vectores adenovirus que aprovechan estas ventajas. Para consultar una descripción de vectores adenovirus y sus usos ver, por ej., Haj-Ahmad and Graham (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett y col. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder y col. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth y col. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr y col. (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K.L. (1988) BioTechniques 6:616-629; Rich y col. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476.

Vectores de expresión AAV

En una forma de realización de preferencia, los vectores virales son vectores AAV. Por "vector AAV" se entiende un vector derivado de un serotipo viral adeno asociado, incluyendo pero no limitado a AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5. AAVX7, etc. Los vectores AAV pueden tener uno o más de los genes de AAV de tipo salvaje con deleciones totales o parciales, de preferencia los genes rep y/o cap, pero mantienen las secuencias ITR funcionales de flanqueo. Las secuencias ITR funcionales son necesarias para rescate, replicación y encapsidación del virión AAV. Por ello, en este documento se define un vector AAV que incluye al menos aquellas secuencias necesarias en cis para replicación y encapsidación (por ej., ITRs funcionales) del virus. No es necesario que las secuencias ITRs sean las secuencias de nucleótidos de tipo salvaje y pueden estar alteradas, por ej., mediante inserción, deleción o sustitución de nucleótidos, siempre que las secuencias provean para el rescate, replicación y encapsidación.

Los vectores de expresión AAV se construyen usando técnicas conocidas para proveer al menos como componentes unidos operativamente en la dirección de la transcripción, elementos de control que incluyen una región de inicio de la transcripción, el ADN de interés y una región de terminación de la transcripción. Los elementos de control se seleccionan para ser funcionales en células de mamíferos. La construcción resultante que contiene los componentes unidos operativamente está ligada (5' y 3') a secuencias AAV ITR funcionales.

Por "repeticiones terminales invertidas de virus adeno asociados" o "AAV ITRs" se entiende las regiones reconocidas por la técnica que se encuentran en cada extremo del genoma AAV que funcionan en cis como orígenes de replicación de ADN y como señales de encapsidación para el virus. AAV ITRs, junto con la región codificadora AAV rep, proveen para la excisión y rescate eficaz y la integración de una secuencia de nucleótidos interpuesta entre dos ITRs de flanqueo dentro del genoma de una célula de mamífero.

Se conocen las secuencias de nucleótidos de regiones AAV ITR. Ver, por ej., Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" en Fundamental Virology, 2nd Edition, (B.N. Fields and D.M.Knipe, eds.) para la secuencia de AAV-2. Como se usa en este documento, un "AAV ITR" no necesariamente representa la secuencia de nucleótidos del tipo salvaje, puede estar alterada, por ej., por inserción, deleción o sustitución de nucleótidos. Adicionalmente, la AAV ITR puede derivar de cualquiera de los varios serotipos de AAV, incluyendo pero no limitando a, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5. AAVX7, etc. Además, los ITRs 5' y 3' que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector AAV no necesariamente tienen que ser idénticos o derivados del mismo serotipo o aislado AAV, siempre que funcionen como se pretende, es decir, permitiendo la excisión y rescate de la secuencia de interés del genoma de la célula huésped o vector, y permitiendo la integración de la secuencia heteróloga dentro del genoma de la célula receptora cuando los productos del gen AAV Rep están presentes en la célula.

Adicionalmente, las AAV ITRs pueden derivar de cualquiera de los varios serotipos de AAV, incluyendo pero no limitando a, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5. AAVX7, etc. Además, los ITRs 5' y 3' que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector de expresión AAV no necesariamente tienen que ser idénticos o derivados del mismo serotipo o aislado AAV, siempre que funcionen como se pretende, es decir, permitiendo la excisión y rescate de la secuencia de interés del genoma de la célula huésped o vector, y permitiendo la integración de la molécula de ADN dentro del genoma de la célula receptora cuando los productos del gen AAV Rep están presentes en la célula.

Las moléculas de ADN adecuadas para usar en vectores AAV tendrán un tamaño menor que aproximadamente 5 kilobases (kb) e incluirán, por ejemplo, un gen que codifica una proteína defectuosa o faltante en el sujeto receptor o un gen que codifica una proteína que tiene un efecto biológico o terapéutico deseado (por ej., una función antibacteriana, antiviral o antitumoral). Las moléculas de ADN de preferencia incluyen aquellas involucradas en el metabolismo de la dopamina, por ejemplo, AADC o TH. Los vectores AAV-AADC y AAV-TH se describieron, por ejemplo, en Bankiewicz y col. (1997) Exper't Neurol. 144:147-156; Fan y col. (1998) Human Gene Therapy 9:2527-2535 and International Publication WO 95/28493, publicado el 26 de Octubre de 1995.

La secuencia de nucleótidos seleccionada, tal como AADC u otro gen de interés, se une operativamente a elementos de control que dirigen la transcripción o expresión del mismo en el sujeto in vivo. Tales elementos de control pueden comprender secuencias de control normalmente asociadas con el gen seleccionado. Alternativamente, pueden usarse secuencias de control heterólogas. Las secuencias de control heterólogas útiles generalmente incluyen aquellas derivadas de secuencias que codifican genes virales o de mamíferos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan al promotor temprano de SV40, promotor LTR de virus de tumor mamario de ratón, al promotor tardío mayor de adenovirus (Ad MLP); un promotor de virus herpes simplex (HSV), un promotor de citomegalovirus (CMV) tal como la región promotora inmediata temprana de CMV (CMVIE), un promotor de virus de sarcoma rous (RSV), promotores sintéticos, promotores híbridos y similares. Además, las secuencias derivadas de genes no virales, tales como el gen de metalotioneina murino, encontrarán utilidad en este documento. Tales secuencias promotoras están disponibles comercialmente en, por ej., Stratagene (San Diego, CA).

Para los objetivos de la presente invención, serán de uso particular tanto los promotores heterólogos como otros elementos de control, tales como promotores inducibles y específicos del SNC, potenciadores y similares. Los ejemplos de promotores heterólogos incluyen al promotor CMB. Los ejemplos de promotores específicos del SNC incluyen aquellos aislados de los genes de proteína básica de mielina (MBP), de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y de enolasa específica neuronal (NSE). Los ejemplos de promotores inducibles incluyen elementos de ADN que reaccionan con ecdisona, tetraciclina, hipoxia y aufin.

El vector de expresión AAV que se encuentra en la molécula de ADN de interés unido por AAV ITRs, puede construirse insertando directamente la(s) secuencia(s) seleccionada(s) en el genoma de AAV que tuvo el marco de lectura abierto de AAV principal ("ORFs") excindido para ello. Pueden también delecionarse otras porciones del genoma de AAV, siempre que se mantenga una porción suficiente de ITRs para permitir la replicación y encapsidación. Tales construcciones pueden diseñarse usando técnicas bien conocidas en la técnica. Ver, por ej., las Patentes de EEUU No 5.173.414 y 5.139.941; Publicaciones Internacionales Nº WO 92/01070 (publicada el 23 de Enero de 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de Marzo de 1993); Lebkowski y col. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent y col. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. And Immunol. 158:97-129; Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; y Zhou y col. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.

Alternativamente, las AAV ITRs pueden excindirse del genoma viral o del vector AAV que contiene las mismas construcciones del ácido nucleico seleccionado fusionadas 5' y 3' que están presentes en otro vector usando técnicas de unión, tales como aquellas descritas en Sambrook y col., supra. Por ejemplo, las uniones pueden lograrse en Tris-Cl 20 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, 33 \mug/ml BSA, NaCl 10mM-50mM y ya sea ATP 40 \muM, 0,01-0,02 (Weiss) unidades de ligasa de ADN T4 a 0ºC (para unión complementaria "sticky end") ó ATP 1mM, 0,3-0,6 (Weiss) unidades de ligasa de ADN T4 a 14ºC (para unión inespecífica "blunt end"). Las uniones intermoleculares "sticky end" usualmente se llevan a cabo en concentraciones de ADN total de 30-100 \mug/ml (concentración total final 5-100 nM). Los vectores AAV que contienen ITRs se describieron en, por ej., la Patente de EEUU Nº 5.139.941. En particular, varios vectores AAV que se describen en esa patente están disponibles en la American Type Culture Collection ("ATCC") con Números de Acceso 53222, 53223, 53224, 53225 y 53226.

Adicionalmente, pueden producirse sintéticamente genes quiméricos para incluir secuencias AAV ITR en 5' y 3' de una o más secuencias del ácido nucleico seleccionado. Pueden usarse de preferencia codones para expresión de secuencias de genes quiméricos en células de SNC de mamíferos. La secuencia quimérica completa está ensamblada a partir de oligonucléotidos superpuestos preparados por procedimientos estándar. Ver por ej., Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair y col. Science (1984) 223:1299; Jay y col. J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.

Con el fin de producir viriones rAAV, se introduce un vector de expresión AAV dentro de una célula huésped adecuada usando técnicas conocidas, tal como la transfección. Se conocen en la técnica de una cantidad de técnicas de transfección. Ver, por ej., Graham y col. (1973) Virology, 52:456, Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis y col. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier y Chu y col. (1981) Gene 13:197. Los procedimientos de transfección particularmente adecuados incluyen coprecipitación con fosfato de calcio (Graham y col. (1973) Virol 52:456-467), microinyección directa en células cultivadas (Capecchi, M. R. (1980) Cell 22:479-488, electroporación (Shigekawa y col. (1988) BioTechniques 6:742-751), transferencia genética mediada por liposomas (Mannino y cl. (1988) BioTechniques 6:682-690), transducción mediada por lípidos (Felgner y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417) y administración de ácido nucleico usando microproyectiles de alta velocidad (Klein y col. (1987) Nature 327:70-73). Para los objetivos de la invención, las células huésped adecuadas para producir viriones rAAV incluyen microorganismos, células de levadura, célula de insectos y células de mamíferos que pueden, o han sido usadas, como receptoras de una molécula de ADN heterólogo. El término incluye la progenie de la célula original que fue transfectada. Por ello, una "célula huésped" como se usa en este documento generalmente se refiere a una célula que fue transfectada con una secuencia de ADN exógeno. Resultan de preferencia en la práctica de esta invención las células de líneas celulares humanas estables 293, (fácilmente disponibles en, por ej. la American Type Culture Collection bajo el Número de Acceso ATCC CRL1573). Particularmente, la línea celular humana 293 es una línea celular embrionaria de riñón humano que fue transformada con fragmentos de ADN de adenovirus tipo-5 (Graham y col. (1977) J. Gen. Virol. 36:59), y expresa los genes adenovirales E1a y E1b (Aiello y col. (1979) Virology 94:460). La línea celular 293 es fácilmente transfectada y provee una plataforma particularmente conveniente para producir viriones rAAV.

Funciones de ayuda al AAV

Las células huésped que contienen los vectores de expresión AAV descritos anteriormente deben resultar capaces de proveer funciones de ayuda al AAV con el fin de replicar y encapsidar las secuencias de nucleótidos flanqueadas por las AAV ITRs para producir viriones rAAV. Las funciones de ayuda al AAV son generalmente secuencias codificadoras derivadas de AAV que pueden expresarse para proveer productos genéticos de AAV que, a su vez, funcionen en trans para una replicación de AAV productiva. Las funciones de ayuda al AAV se usan en este documento para complementar funciones necesarias de AAV que faltan en los vectores de expresión AAV. Por ello, las funciones de ayuda al AAV incluyen una, o ambas de las AAV ORFs principales, a saber las regiones rep y cap, u homólogos funcionales de las mismas.

Los productos de expresión Rep mostraron tener muchas funciones, incluyendo, entre otras: reconocimiento, unión y corte del origen AAV de la replicación de ADN; actividad ADN helicasa; y modulación de transcripción de promotores AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión Cap aportan funciones de encapsidación necesarias. Las funciones de ayuda al AAV se usan en este documento para complementar funciones de AAV en trans que faltan en los vectores AAV.

El término "construcción de ayuda al AAV" se refiere generalmente a una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias de nucleótidos que proveen funciones de AAV eliminadas en un vector AAV que se usará para producir un vector transductor para administrar una secuencia de nucleótidos de interés. Las construcciones de ayuda al AAV son usadas comúnmente para proveer la expresión transitoria de genes AAV rep y/o cap para complementar funciones AAV faltantes que son necesarias para la replicación lítica de AAV; sin embargo, las construcciones de ayuda carecen de AAV ITRs y no pueden por si mismas replicarse ni encapsidarse. Las construcciones de ayuda al AAV pueden estar en forma de un plásmido, fago, transposón, cósmido, virus o virión. Se han descrito una cantidad de construcciones de ayuda al AAV, tales como los plásmidos comúnmente usados pAAV/Ad y pIM29+45 que codifican los productos de expresión Rep y Cap. Ver, por ej., Samulski y col. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; y McCarty y col. (1991) J. Virol. 65:2936-2945. Se han descrito una cantidad de otros vectores que codifican los productos de expresión Rep y/o Cap. Ver, por ej., la Patente de EEUU 5.139.941.

Por "región codificadora de AAV rep" se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de replicación Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40. Estos productos de expresión Rep mostraron tener muchas funciones, incluyendo reconocimiento, unión y corte del origen AAV de la replicación de ADN; actividad ADN helicasa; y modulación de transcripción de promotores AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión Rep son necesarios en conjunto para la replicación del genoma de AAV. Para una descripción de la región codificadora de AAV rep, ver, por ej., Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; y Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801. Los homólogos adecuados de la región codificadora de AAV rep incluyen el gen rep del herpesvirus 6 humano (HHV-6) que también se sabe que media en la replicación del ADN de AAV-2 (Thompson y col. (1994) Virology 204:304-311).

Por "región codificadora de AAV cap" se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de cápside VP1, VP2 y VP3, u homólogos funcionales de las mismas. Estos productos de expresión Cap aportan las funciones de encapsidado necesarias en conjunto para encapsidar el genoma viral. Para una descripción de la región codificadora AAV cap, ver, por ej., Muzyczka and Kotin, R. M. (supra).

Las funciones de ayuda al AAV se introducen en la célula huésped por medio de transfección con una construcción de ayuda al AAV previa a, o junto con la transfección del vector de expresión AAV. Las construcciones de ayuda al AAV son de este modo usadas para proveer al menos la expresión transitoria de los genes de AAV rep y/o cap para complementar las funciones de AAV faltantes necesarias para una infección de AAV productiva. Las construcciones de ayuda al AAV carecen de AAV ITRs y no pueden por sí mismas replicarse ni encapsidarse. Estas construcciones pueden estar en forma de un plásmido, fago, transposón, cósmido, virus o virión. Se han descrito una cantidad de construcciones de ayuda al AAV, tales como los plásmidos comúnmente usados pAAV/Ad y pIM29+45 que codifican los productos de expresión Rep y Cap. Ver, por ej., Samulski y col. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; y McCarty y col. (1991) J. Virol. 65:2936-2945. Se han descrito una cantidad de otros vectores que codifican los productos de expresión Rep y/o Cap. Ver, por ej., la Patente de EEUU 5.139.941.

Tanto los vectores de expresión de AAV como las construcciones de ayuda al AAV pueden construirse conteniendo uno o más marcadores seleccionables opcionales. Los marcadores adecuados incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos o sensibilidad a antibióticos, imparten color o cambian las características antigénicas de aquellas células que han sido transfectadas con una construcción de ácido nucleico conteniendo el marcador seleccionable cuando las células se cultivan en un medio selectivo apropiado. Varios genes marcadores seleccionables útiles en la práctica de la invención incluyen el gen de resistencia a la higromicina B (que codifica fosfotransferasa de aminoglucósido (APH)) que permite la selección en células de mamífero al conferir resistencia a G418 (disponible en Sigma, St. Louis, Mo.). Los expertos en la técnica conocen otros marcadores adecuados.

Funciones accesorias de AAV

La célula huésped (o célula de encapsidación) debe ser capaz de proveer funciones no derivadas de AAV, o "funciones accesorias", con el fin de producir viriones rAAV. Las funciones accesorias son funciones virales y/o celulares no derivadas de AAV de las cuales AAV depende para su replicación. Por ello,  las funciones accesorias incluyen al menos, aquellas proteínas y ARNs no pertenecientes a AAV que son necesarias en la replicación de AAV, incluyendo aquellas involucradas en la activación de la transcripción del gen de AAV, en el corte y empalme de ARNm de AAV específico de fase, replicación de ADN de AAV, síntesis de productos de expresión Cap y ensamble de la cápside de la AAV. Las funciones accesorias basadas en virus pueden derivar de cualquier virus ayudante conocido.

Particularmente, las funciones accesorias pueden introducirse en las células huésped y posteriormente expresarse usando procedimientos conocidos en la técnica. Comúnmente, las funciones accesorias se proveen por medio de infección de las células huésped con un virus ayudante no relacionado. Se conoce una cantidad de virus ayudantes adecuados, incluyendo adenovirus; herpesvirus tales como los virus herpes simplex tipo 1 y tipo 2; y virus de vaccinia. Las funciones accesorias no virales también tienen utilidad en este documento, tales como aquellas provistas por sincronización celular usando cualquiera de los agentes conocidos. Ver, por ej. Buller y col. (1981) J. Virol. 40:241-247; McPherson y col. (1985) Virology 147:217-222; Schlehofer y col. (1986) Virology 152:110-117.

Alternativamente, pueden proveerse funciones accesorias usando un vector de función accesoria. Los vectores de funciones accesorias incluyen secuencias de nucleótidos que proveen una o más funciones accesorias. Un vector de función accesoria es capaz de ser introducido en una célula huésped adecuada con el fin de sustentar la producción eficiente de viriones AAV en la célula huésped. Los vectores de función accesoria pueden estar en forma de un plásmido, fago, transposón o cósmido. Los vectores accesorios pueden también estar en forma de uno o más fragmentos lineales de ADN o ARN que, cuando están asociados con los elementos de control y enzimas adecuados, pueden ser transcritos o expresados en una célula huésped para proveer funciones accesorias. Ver, por ej., la Publicación Internacional Nº WO 97/17548, publicada el 15 de Mayo de 1997.

Las secuencias de ácidos nucleicos que proveen funciones accesorias pueden obtenerse de fuentes naturales, tales como del genoma de una partícula de adenovirus, o construidas usando procedimientos recombinantes o sintéticos conocidos en la técnica. En relación a esto, las funciones accesorias derivadas de adenovirus han sido muy estudiadas, y se han identificado y parcialmente caracterizado una cantidad de genes de adenovirus involucrados en funciones accesorias. Ver, por ej., Carter, B.J. (1990) "Adeno-Associated Virus Ayudante Functions", in CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I (P. Tijssen, ed.), y Muzyczka, N. (1992) Curr. Topics. Microbiol. And Immun. 158:97-129. Se cree que, específicamente, las regiones tempranas de genes de adenovirus E1a, E2a, E4, VAI RNA y posiblemente, E1b participan en el proceso accesorio. Janik y col. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925-1929. Se describieron también las funciones accesorias derivadas de herpesvirus. Ver, por ej., Young y col. (1979) Prog. Med. Virol. 25:113. Se han descrito también las funciones accesorias derivadas del virus vaccinia. Ver, por ej., Carter, B.J. (1990), supra., Schlehofer y col. (1986) Virology 152:110-117.

Como consecuencia de la infección de una célula huésped con un virus ayudante, o la transfección de una célula huésped con un vector de función accesoria, las funciones accesorias se expresan lo que transactiva la construcción de ayuda al AAV para producir proteínas Rep y/o Cap de AAV. Los productos de expresión Rep excinden el ADN recombinante (incluyendo el ADN de interés) del vector de expresión de AAV. Las proteínas Rep también sirven para duplicar el genoma de AAV. Las proteínas Cap expresadas se ensamblan formando cápsides y el genoma de AAV recombinante se encapsida en dichas cápsides. De ello resulta la replicación productiva de AAV, y el ADN se encapsida para formar viriones rAAV.

Tras la replicación de AAV recombinante, los viriones rAAV pueden purificarse de las células huésped usando una variedad de procedimientos convencionales de purificación, tal como gradientes de CsCl. Además, si se usa infección para expresar las funciones accesorias, los virus ayudantes residuales pueden inactivarse, usando procedimientos conocidos, Por ejemplo, los adenovirus pueden ser inactivados calentando a temperaturas de aproximadamente 60ºC durante, por ej. 20 minutos o más. Este tratamiento inactiva eficazmente sólo al virus ayudante ya que AAV es extremadamente estable mientras que el adenovirus ayudante es lábil frente al calor.

Los viriones rAAV resultantes están así listos para usar en la administración de ADN al SNC (por ej. cavidad craneana) del sujeto.

Administración de vectores virales

Los procedimientos de administración de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vías intraarterial, intramuscular, intravenosa, intranasal y oral. Generalmente, los viriones rAAV pueden introducirse en células del SNC usando técnicas de transducción in vivo e in vitro. Si se transducen in vitro, la célula receptora deseada será extraída del sujeto, transducida con viriones rAAV y reintroducida en el sujeto. Alternativamente, pueden usarse células singeneicas o xenogeneicas cuando esas células no generan una respuesta inmune inapropiada en el sujeto.

Se han descrito procedimientos adecuados para la administración e introducción de células transducidas en un sujeto. Por ejemplo, las células pueden transducirse in vitro combinando viriones de AAV recombinantes con células del SNC, en un medio adecuado, y seleccionando aquellas células que contienen el ADN de interés usando técnicas convencionales tales como transferencia Southern y/o PCR, o usando marcadores seleccionables. Las células transducidas pueden posteriormente incluirse en formulaciones dentro de composiciones farmacéuticas, las que se describen con mayor detalle a continuación, y esa composición puede introducirse en un sujeto mediante diversas técnicas, tales como injertos, inyecciones intramusculares, intravenosas, subcutáneas e intraperitoneales.

Para la administración in vivo, los viriones rAAv se incluirán en formulaciones de composiciones farmacéuticas y generalmente se administrarán por vía parenteral, por ej. por medio de inyección intramuscular directamente en músculo esquelético o cardíaco o por inyección dentro del SNC.

Sin embargo, ya que los procedimientos convencionales tales como inyección no han demostrado proveer una administración de los vectores virales en extensión en el cerebro del sujeto, resulta fundamental en la presente invención el descubrimiento de la administración eficiente de los vectores virales en el SNC mediante sistemas de administración potenciados por convección (CED). Los autores de la presente invención son los primeros en describir y demostrar que CED pueden administrar vectores virales eficazmente, por ej. AAV, sobre regiones extensas del cerebro de un animal (por ej. striatum). Como se ejemplifica y describe en detalle a continuación, estos procedimientos son adecuados para una variedad de vectores virales, por ejemplo vectores AAV que llevan genes testigo (por ej. timidina quinasa (tk) o genes terapéuticos (por ej. AADC y tk).

Cualquier dispositivo para administración potenciada por convección puede ser apropiado para administrar vectores virales. En una forma de realización de preferencia, el dispositivo es una bomba osmótica o una bomba de infusión. Ambas bombas se encuentran disponibles comercialmente de varios proveedores (por ejemplo Alzet Corporation, Hamilton Corporation, Alza, Inc. Palo Alto, California). Típicamente, un vector viral se administra por medio de dispositivos CED como se describe a continuación. Se inserta un catéter, cánula u otro dispositivo de inyección en el tejido del SNC del sujeto elegido. De acuerdo con lo expuesto en este documento, un experto en la técnica puede fácilmente determinar qué área general del SNC es un blanco apropiado. Por ejemplo, cuando se administra AAV-AADC para tratar PD, el striatum es un área blanco adecuada del cerebro. Se dispone de mapas estereotácticos y dispositivos de posicionamiento, por ejemplo en ASI Instruments, Warren, MI. El posicionamiento puede también llevarse a cabo usando mapas anatómicos obtenidos por imágenes con TC y/o RMI del cerebro del sujeto para ayudar a guiar el dispositivo de inyección hacia el blanco objetivo. Además, dado que los procedimientos descritos en este documento pueden practicarse de manera tal que los vectores virales ocupen áreas extensas del cerebro, se necesitan menos cánulas de infusión. Dado que las complicaciones quirúrgicas están relacionadas con el número de penetraciones, los procedimientos descritos en este documento sirven también para reducir efectos secundarios que se observan con las técnicas de administración convencionales.

Las composiciones farmacéuticas comprenderán material genético suficiente para producir una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de interés, por ej. una cantidad suficiente para reducir o mejorar los síntomas la enfermedad en cuestión o una cantidad suficiente para brindar el beneficio deseado. Las composiciones farmacéuticas contendrán un excipiente aceptable farmacéuticamente. Tales excipientes incluyen cualquier agente farmacéutico que no induce por si mismo la producción de anticuerpos dañinos en el individuo que recibe la composición y que puede administrarse sin una toxicidad no deseada. Los excipientes aceptables farmacéuticamente incluyen, pero no están limitados a sorbitol, Tween80 y líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Pueden incluirse también sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Adicionalmente, pueden estar presentes en tales vehículos sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH y similares. Se encuentra disponible una completa discusión a cerca de excipientes farmacéuticamente aceptables en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N. J. 1991).

Como resulta evidente para aquellos expertos en la técnica en vista de lo tratado en esta memoria, se puede determinar empíricamente una cantidad eficaz a agregar de vector viral. La administración puede efectuarse en una dosis, de manera continua o intermitente a través del curso del tratamiento. Los procedimientos para determinar los medios y dosificaciones más eficaces de administración son bien conocidos por los expertos en la técnica y variarán con el vector viral, la composición de la terapia, las células blanco y el sujeto a tratar. Pueden realizarse administraciones únicas y múltiples siguiendo el patrón y el nivel de dosis seleccionado por el médico tratante.

Se debería entender que más de un transgen podría expresarse por el vector viral administrado. Alternativamente, pueden también administrarse al SNC vectores separados, cada uno expresando uno o más transgenes diferentes. Además, se prevé que los vectores virales administrados por los procedimientos de la presente invención sean combinados con otras composiciones y terapias adecuadas. Por ejemplo, como se describe en detalle en los Ejemplos a continuación, la enfermedad de Parkinson puede tratarse administrando conjuntamente un vector AAV que expresa AADC en el SNC (por ej. dentro del núcleo caudado o putamen del striatum) y agentes adicionales, tales como precursores de dopamina (por ej. L-dopa) inhibidores de la síntesis de dopamina (por ej. carbidopa), inhibidores de catabolismo de dopamina (por ej., inhibidores MaOB), los agonistas o antagonistas de dopamina pueden administrarse previamente, simultáneamente o a continuación del vector que codifica AADC. Por ejemplo, L-dopa y, opcionalmente carbidopa pueden administrarse sistémicamente. De esta manera se restituye la dopamina que es naturalmente reducida en los pacientes con PD, aparentemente por la expresión de AADC que es capaz de convertir L-dopa en dopamina. En casos en que el transgen (por ej. AADC) está bajo el control de un promotor inducible, pueden administrarse ciertos compuestos administrados sistémicamente tales como muristerona, ponasteron, tetraciclina o aufin con el objeto de regular la expresión del transgen.

Tratamiento de afecciones de SNC

Los vectores virales que expresan transgenes terapéuticos pueden usarse para tratar diversas afecciones del SNC al proveer proteínas o polipéptidos terapéuticos. En una forma de realización de preferencia, los vectores virales se administran al SNC por medio de los procedimientos CED descritos en este documento ya que estos procedimientos proveen la primera forma eficaz de distribuir extensamente vectores virales en el SNC.

Enfermedad de Parkinson

En la presente invención, se usan vectores virales que proveen la enzima AADC para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Como se describió anteriormente la enfermedad de Parkinson es el resultado de una pérdida selectiva de neuronas nigrostriatales dopaminérgicas, lo que genera una pérdida de entrada desde la sustancia nigra hacia el striatum. Se han creado modelos animales de PD, por ejemplo, tratando ratas o primates con 6-hidroxidopamina (6-OHDA) para destruir células dopaminérgicas o lesionando primates con la neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,4-tetrahidropiridina (MPTP), que produce una enfermedad similar al Parkinson.

La presente invención provee la primera evidencia de que la actividad dopaminérgica puede ser restituida en pacientes con Parkinson (por ej., monos lesionados con MPTP), por medio de la administración de vectores virales que llevan el transgen para AADC en combinación con la administración sistémica (por ej. oral) de L-dopa y, opcionalmente, carbidopa. Las sugerencias previas para la terapia génica del Parkinson estuvieron enfocadas hacia la deficiencia de tirosina hidroxilasa con el progreso de la enfermedad. Estas sugerencias, por lo tanto, exigen el restablecimiento de la síntesis de dopamina en la vía nigrostriatal por medio de la expresión exitosa de al menos tres transgenes con el fin de generar dopamina in situ: el gen de tirosina hidroxilasa; el gen para el cofactor bioptreno, GTP-ciclohidroxilasa-1; y el gen para AADC. Además de los problemas asociados con la administración de tres genes en niveles adecuados, la regulación de los niveles de dopamina resultaría difícil de controlar usando este enfoque.

Los autores de la presente invención demostraron que un transgen (por ej., AADC) en combinación con L-dopa provee beneficios terapéuticos. AADC es la enzima involucrada en la etapa final de la biosíntesis de dopamina, convirtiendo L-dopa en dopamina. Por ello, representa una clara ventaja en el enfoque terapéutico con AADC para restituir la actividad dopaminérgica que sólo debe administrarse un gen y la regulación de los niveles de dopamina es posible controlando los niveles periféricos de L-dopa. Además, administrando sólo el gen AADC, la L-dopa puede usarse como un profármaco para regular los niveles de dopamina en el striatum.

Dado que los nucleótidos que codifican AADC administrados por medio de vectores AAV parecen expresarse fundamentalmente en las neuronas del striatum, otra ventaja terapéutica importante es la provisión en el tratamiento de un mecanismo tamponador para L-dopa. Se atribuyen muchos efectos secundarios tales como disquinesias al tamponado ineficaz del cerebro Parkinsoniano. Los procedimientos descritos en este documento evitan este problema permitiendo el almacenamiento de L-dopa no metabolizada en las neuronas como se ejemplifica a continuación la administración de AADC al striatum tratado con MPTP permite la conversión de L-dopa en dopamina y el siguiente metabolismo a DOPAC y HVA por las neuronas del striatum. En base a los datos obtenidos con FMT PET, parece que las neuronas del striatum pueden también almacenar dopamina, ya que se visualizó FMT en esta región. De hecho, las tasas de conversion de L-dopa en dopamina tras la transferencia del gen AADC fueron tan altas e importantes como las observadas en el striatum normal (ver, por ej., Figura 7). Además a pesar de que la enfermedad de Parkinson es una afección progresiva, no parece que un proceso degenerativo en curso afectará la expresión de AADC en las neuronas del striatum ya que éstas no son típicamente afectadas por la enfermedad de Parkinson idiopática.

La degeneración del sistema dopaminérgico en pacientes con enfermedad de Parkinson idiopática no es uniforme. La vía nigrostriatal se degenera más rápidamente que la vía mesolímbica, dejando a los pacientes con un desequilibrio entre la actividad de las dos vías. A medida que progresa la enfermedad, se necesitan niveles más altos de L-dopa para compensar la degeneración de la vía nigrostriatal, pero esto también da como resultado mayores niveles de dopamina en aumento en los núcleos accumbens y otras partes del sistema mesolímbico. Tal sobre estimulación puede ser responsable de algunos de los efectos secundarios asociados con el tratamiento con L-dopa tales como alucinaciones. De manera similar, el MPTP deja al sistema dopaminérgico mesolímbico relativamente libre (ver en Figura 7 que no hay presencia de inervación dopaminérgica en el caudado y en el putamen, se ve una lesión parcial en el núcleo accumbens). Como se muestra en la Figura 7, AAV-AADC puede restituir el desequilibrio casi hasta la normalidad, por lo tanto, es posible que se necesiten dosis menores de L-dopa tras la restitución de los niveles de enzima AADC y el aumento de las tasas de conversión de L-dopa en dopamina. Esto puede reducir la sobre estimulación del sistema mesolímbico, dando como resultado menos efectos secundarios relacionados con L-dopa/carbidopa.

Como se explicó anteriormente, los vectores AAV-AADC pueden administrarse por cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, inyección, injerto, infusión, transplante de células con el vector, etc.. En una forma de realización de preferencia, los vectores se administran por medio de los procedimientos CED descritos en este documento. Como se ejemplifica a continuación, tales procedimientos de administración proveen una distribución y expresión extensa en las neuronas del SNC y por lo tanto proveen un régimen de tratamiento nuevo para PD.

Generación de imágenes

La presente invención también describe procedimientos para determinar in vivo la actividad de una enzima o de otra molécula. Más específicamente, se selecciona y marca un trazador que localiza específicamente la actividad blanco. En una forma de realización de preferencia, el trazador localiza la actividad de la dopamina, por ejemplo la fluoro-L-m-tirosina (FMT) que se une a células que usan dopamina. Los marcadores adecuados para el trazador seleccionado incluyen cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles en la presente invención incluyen marcadores radiactivos (por ej. ^{18}F, ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{32}P, etc.) enzimas, marcadores colorimétricos, colorantes fluorescentes y similares. En una forma de realización de preferencia, el marcador ^{18}F se usa con FMT para cuantificar la actividad de dopamina.

Los expertos en la técnica conocen medios para detección de marcadores. Por ejemplo, los marcadores radiactivos pueden detectarse usando técnicas de generación de imágenes, películas fotográficas o contadores de centelleo. El marcador se detecta in vivo en el cerebro del sujeto por medio de técnicas de generación de imágenes, por ejemplo tomografía por emisión de positrones (PET). Las técnicas PET se exponen en detalle en el Ejemplo 3 a continuación.

Ejemplos

A continuación se exponen ejemplos de formas de realización específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen ilustrativamente y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en ningún caso.

Se realizaron esfuerzos para asegurar la precisión en relación a los números usados (por ej. cantidades, temperaturas, etc.), pero deberían tenerse en cuenta, por supuesto, algunos errores y desviaciones experimentales.

Ejemplo 1 Construcción y producción de AAV-TK

El vector AAV-tk se construyó poniendo el gen de timidina quinasa (tk) del virus herpes simplex bajo el control transcripcional del promotor inmediato temprano del citomegalovirus (CMV) en un plásmido basado en pUC (disponible en Roche Molecular Biochemicals). Se colocó un intrón de \beta-globina directamente secuencia arriba del gen tk y se colocó poli-A de hormona de crecimiento humana secuencia abajo. El módulo entero se flanqueó por repeticiones terminales invertidas de AAV (ITRs), las que son necesarias para la expresión genética, replicación y encapsidación de las partículas virales.

Los viriones AAV recombinantes se produjeron en células 293 humanas (fácilmente disponibles en por ej., la American Type Culture Collection bajo el Número de Acceso ATCC CRL1573) como se describe a continuación. Se cultivó la línea celular 293 en DMEM completo (Biowhittaker) conteniendo 4,5 g/l de glucosa, 10% de suero de ternera fetal inactivado por calor (FCS; Hyclone), y glutamina 2 mM. Se cotransfectaron células 293 subconfluentes con precipitación con fosfato de calcio (ver, por ej. Sambrook, y col.) con el módulo de expresión AAV-tk flanqueado por ITRs y plásmidos ayudantes derivados de AAV (pw1909, conteniendo los genes AAV rep y cap) y adenovirus (pLadenol, conteniendo genes ARN E2a, E4 y VA_{I}, VA_{II} adenovirales). Tras 6 horas, se cambió el medio por DMEM sin suero y se continuó la incubación a 37ºC en CO_{2} 5% durante 72 horas. Se lisaron los sedimentos celulares en tampón Tris (Tris 100 mM/NaCl 150 mM, pH 8-0) en tres ciclos de congelamiento/descongelamiento y se clarificaron los lisados de restos celulares por centrifugación a 10.000 g durante 15 minutos. Para formar sedimientos con las proteínas no virales, se centrifugó el lisado clarificado a 10.000 durante 15 minutos tras agregar CaCl_{2} hasta una concentración final 25 mM y se incubó durante 1 hora a 0ºC. Se agregó polietilenglicol 8000 (PEG) al sobrenadante resultante (concentración final igual 8%); se incubó esta solución durante 3 horas a 0ºC y se centrifugó a 3.000 g durante 30 minutos. El sedimento conteniendo el vector se solubilizó en Hepes Na 50 mM/NaCl 150 mM/EDTA 25 mM, pH 8,0 y se centrifugó a 10.000 g durante 15 minutos para formar un sedimento y eliminar el material insoluble.

Se llevó a cabo la centrifugación en gradiente isopícnico de cloruro de cesio y se recuperó AAVtk del gradiente resultante aislando las fracciones con densidad promedio 1,38 g/ml. Se usó otra vez PEG para concentrar el vector, que posteriormente se resuspendió en Hepes Na 25 mM/NaCl 150 mM, pH 7,4 y se centrifugó como se describió para eliminar el material insoluble. Se trató la solución madre con ADNasa y se determinó el título del vector por medio de hibridación mancha-transferencia cuantitativa.

Ejemplo 2 Administración in Vivo de AAV-tk: dosificaciones y procedimientos

Para determinar la dosis apropiada de AAV a introducir en el cerebro se llevó a cabo el siguiente estudio. Se usó el striatum para probar la respuesta a las dosis del vector AAV debido a su área relativamente extensa de tejido homogéneo y porque es un blanco para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y otras afecciones del sistema nervioso central.

Además, se determinaron procedimientos eficaces para administrar el vector en el SNC. La inyección estereotáctica simple de agentes terapéuticos ha demostrado un volumen limitado de distribución en el cerebro (Kroll y col. (1996) Neurosurgery 38:746-754). Por lo tanto, se usaron bombas de infusión lenta para mantener un gradiente de presión durante la administración intracraneal. Los estudios previos en los que se administraron moléculas pequeñas, medianas y grandes al cerebro demostraron que las bombas de infusión lenta dan como resultado una distribución tisular extensa y homogénea.

Para investigar qué procedimiento de administración por inyección intracraneana del vector es más eficaz, se administraron 2,5 x 10^{10} partículas de AAV-tk a ratas usando la bomba de infusión Harvard (Harvard Apparatus Inc., Holliston, MA) o bombas osmóticas subcutáneas Alzet (Alza Scientific Products, Palo Alto, CA). Se anestesiaron ratas hembra Sprague-Dawley (250-300 g) de Charles River Laboratories (Wilmington MA) con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilazina (10 mg/kg de peso corporal) y se prepararon para cirugía. Durante la cirugía, se mantuvo la sedación con isofluorano (Attrane, Omeda PPD Inc., Liberty NJ) y las velocidades de flujo de O_{2} se mantuvieron en 0,3-0,5 l/min. Se fijó la cabeza de cada rata en un aparato estereotáctico (Small Animal Stereotactic Frame; ASI Instruments, Warren, MI) con soportes para las orejas y se le realizó una incisión en la piel en la línea media para exponer el cráneo. Se realizó una perforación con un trépano en el cráneo en una posición 1 mm anterior al bregma y 2,6 mm lateral a la línea media usando un taladro dental pequeño. Se administró el vector al hemisferio izquierdo en una profundidad de 5 mm usando una bomba de infusión o bombas osmóticas subcutáneas.

Para estudiar la dosificación, se dividieron los animales en 3 grupos de 6 animales en cada uno. Se administró de manera continua AAV-tk a cada rata a una velocidad de 8 \mul/h durante 2,5 horas usando una bomba de infusión Harvard. La cámara de carga (tubuladura de Teflon 1/16" (2,54/40,64 cm) DE x 0,03" (0,0762 cm) DI) y la cámara de infusión adjunta (1/16" (2,54/40,64 cm) DE x 0,02" (0,0508 cm) DI) se llenaron con 2,5 x 10^{8}, 2,5 x 10^{9} ó 2,5 x 10^{10} partículas de AAV-tk en un volumen total de 20 \mul de LCR artificial (NaCl 148 mM, KCl 3 mM, CaCl_{2} \cdot 2 H_{2}O 1,4 mM, MgCl_{2} \cdot 6 H_{2}O 0-8 mM, Na_{2}HPO_{4} \cdot H_{2}O 1,3 mM, Na_{2}HPO_{4} \cdot H_{2}O 0,2 mM). La administración se realizó a través de una aguja de calibre 27 ajustada con sílice de fusión, la que fue extraída gradualmente 15 minutos tras la infusión.

Alternativamente, se usaron bombas osmóticas subcutáneas para administrar el vector a un grupo de 6 animales. Se administro AAV-tk de manera continua a cada rata a una velocidad de 8 \mul/h durante 24 horas usando bombas osmóticas Alzet, modelo #2001D (ALZA Scientific Products, Palo Alto, CA). Se llenó el reservorio de la bomba y el catéter adjunto (tubuladura de polietileno 60) con 2,5 x 10^{10} partículas de AAV-tk en un volumen total de 200 \mul de LCR artificial (Harvard Apparatus Inc., Holliston, Mass). La administración se realizó a través de una cánula de calibre 27 ajustada con sílice de fusión. Luego de la ubicación estereotáctica, se aseguró la cánula al cráneo con tornillos pequeños de acero inoxidable y cemento dental y se implantó la bomba de manera subcutánea en el área media escapular del lomo. El campo quirúrgico se cerró en capas anatómicas con clips de sutura de 9 mm. Veinticuatro horas más tarde se retiraron las bombas ajustando y sellando los catéteres pero se dejaron las cánulas implantadas en el lugar. Las perforaciones craneanas se sellaron con cera ósea.

Todos los procedimientos quirúrgicos, cuidado y cría de los animales y recolección de tejidos fueron llevados a cabo en las instalaciones Richmond del Berkeley Antibody Co. (Berkekey, CA).

Histología

Se sacrificó a los animales con sobredosis de pentobarbital y se les infiltró a través de la aorta ascendente PBS enfriado con hielo y paraformaldehido tamponado neutro 4%. Se extrajeron los cerebros de los cráneos, se fijaron por inmersión en el mismo fijador durante 24 h, se equilibraron en sacarosa al 30% y se congelaron en isopentano a -70ºC. Posteriormente se colocaron en un criostato y se recolectaron secciones en serie de 40 micrones de la corteza prefrontal a la mitad del cerebro. De cada cerebro se realizaron aproximadamente 150 secciones las que abarcaron una longitud anterior-posterior (AP) de 6-8 mm. Para el análisis histológico de rutina se realizó la tinción H & E a cada sección IP. Las secciones seleccionadas representando las diferentes secciones del cerebro se tiñeron con violeta cristal para determinar la densidad celular general. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

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TABLA 1

	Sangrado de Infilt.	Fresco	Hemosiderina	Marca de	Aguja
	Celular			Necrosis
Bomba de Infusión	-	-	-	-	Líneas
(2 x 10^{8})					finas
Bomba de Infusión	-	-	+	-	Líneas
(2 x 10^{9})					finas
Bomba de Infusión	-	++(1/6)	++(4/6)	-	Líneas
(2 x 10^{10})					finas
Bomba osmótica	+++(5/6)	+++	++	+++	agujeros
(2 x 10^{10})

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Análisis PCR

Se trataron 2 grupos adicionales de ratas, con dos animales por grupo, con 2,5 x 10^{10} partículas de AAV-tk para determinar la distribución tisular del vector. Uno de los grupos recibió el vector por infusión y el otro por bomba osmótica, como se describió anteriormente. Los animales se sacrificaron 3 semanas después usando inhalación de CO_{2} y se recolectaron muestras de 15 órganos y tejidos de cada rata incluyendo cerebro derecho, cerebro izquierdo, médula espinal, ojo derecho, ojo izquierdo, corazón, pulmón, hígado, riñón, bazo, ovario, timo, ganglios linfáticos, médula ósea y músculo de la pata. Se usaron técnicas estériles y los tejidos se recolectaron usando kits de extracción de suturas descartables que se cambiaron entre cada muestra. Los tejidos se congelaron inmediatamente en N_{2} líquido y se conservaron a -70ºC hasta el procesamiento para ADN genómico. La PCR se llevó a cabo usando Perkin Elmer's GeneAmp PCR Core Kit y dos oligonucléotidos de 30 bases de la secuencia de tk

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
(5'-AAGTCATCGGCTCGGGTACGTAGACGATATC-3'
(SEC ID Nº 1)  \hskip0.3cm  y\cr 
5'  -  ATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGC  -  3'
(SEC ID Nº
2)).\cr}

Las reacciones se llevaron a cabo en un ciclador térmico PTC-100 (MJ Research, Inc.) y dieron como resultado 158 pb por producto en muestras donde estaba presente el vector.

Inmunohistoquímica

Se usó inmunohistoquímica para detectar la expresión del transgen en cada sección siguiente a una teñida con H & E. Por ello, una de cada 12 secciones se lavó en PBS, se trató con H_{2}O_{2} al 3% durante 30 min para bloquear la actividad peroxidasa endógena, se aclaró nuevamente en H_{2}O destilada y PBS y se incubó en solución bloqueante (suero de cabra al 10% + Triton-X100 al 0,01% en PBS) durante 30 min. Posteriormente, se incubaron las muestras en anticuerpo anti-tk policlonal (Yale) (1:1000) durante una hora, se lavaron tres veces en PBS, se incubaron en IgG anti conejo de cabra biotinilada (Vector) (1:300) durante una hora y se lavaron nuevamente. La unión de los anticuerpos se visualizó con Estreptavidina y peroxidasa del rábano picante (1:300) y cromógeno VIP (Vector).

Análisis cuantitativo

La expresión del transgen se cuantificó para cada cerebro usando un microproyector Ken-a-vision para proyectar las secciones inmunoteñidas-tk en una tabla gráfica ARTZII. Se usó el programa NIH image 1.6 para capturar y analizar imágenes. El número estimado total de células positivas para cada cerebro se determinó con un aumento de 100X usando la siguiente fórmula:

Número total de células tk = (n1 + n2 + n3...) x 12 x k

n = células positivas/sección

k = factor de corrección derivado de la ecuación de Ambercrombie (1946):

k = T/(T+D) T= espesor de la sección (40 \mu); D= diámetro celular (16 \mu); k = 0,71

Los volúmenes de las regiones inmunorreactivas-tk se determinaron midiendo áreas de expresión de tk usando imágenes capturadas proyectadas con un aumento de 50X y calculándolos de la siguiente manera:

V = A_{x} x L

A_{x} = área \ promedio \ (mm^{2}) = \frac{a1 + a2 + a3...)}{n} An

(donde L = distancia AP (\mu) de tinción = n x 12 x 40 \mu y n = número de secciones teñidas)

Para determinar cuantos virus se necesitan para transducir eficazmente el tejido cerebral, se llevaron a cabo comparaciones de secciones inmunoteñidas entre ratas que recibieron 2,5 x 10^{8}, 2,5 x 10^{9} ó 2,5 x 10^{10} partículas de AAV-tk por medio de bomba de infusión Harvard.

Con todos los parámetros medidos, se observó una clara respuesta a la dosis. El tejido infundido de animales que recibieron los títulos más altos demostró una expresión del transgen en un promedio de 300 mm^{3} de tejido (o aproximadamente 60% de un hemisferio cerebral de rata adulta (Leyden y col. (1998) Behav. Brain Res. 87:59-67)) comparado con volúmenes de 10 mm^{3} del grupo que recibió una dosis media y < a 1 mm^{3} para el grupo que recibió dosis bajas (Fig. 1a). Los volúmenes se calcularon a partir de las áreas medias y las longitudes de tinción que mostraron diferencias significativas entre los grupos (Fig. 1b, c). La expresión dentro de un volumen de tejido transducido no fue uniforme, sin embargo exhibió un gradiente de tinción. Las áreas directamente alrededor de los sitios de inyección se marcaron fuertemente mientras que se detectaron menos células positivas a medida que aumentaba la distancia desde el conducto de la aguja (Fig. 2). Finalmente, la Fig. 1d ilustra que la totalidad de las células positivas para tk en la sección del grupo que recibió dosis alta, estimativamente promediaron 169.000, lo que es aproximadamente 10 veces mayor que el del grupo que recibió dosis medias.

Administración con bomba de infusión versus bomba osmótica

Las comparaciones de las secciones de cerebro inmunoteñidas demostraron similitudes y diferencias en la capacidad de las dos bombas para administrar el vector. No se evidenció diferencias significativas en la expresión de tk entre los dos grupos que se midieron como volumen medio, área, distancia AP y número total estimado de células positivas (Fig. 3a, d). Debido a que se perdió algo de tejido alrededor del surco de la aguja en todas las muestras dentro del grupo en el que se usó bomba osmótica (datos no mostrados), el valor medio verdadero del número de células positivas estimadas para este grupo puede ser mayor. Además, aunque ambos procedimientos de administración dieron como resultado una expresión del transgen notable, hubo una diferencia en el tipo de células que resultaron marcadas. Los tejidos infundidos con el vector expresaron tk casi exclusivamente en las neuronas (Fig. 4a, b) y los tejidos que recibieron el vector por medio de la bomba osmótica exhibieron expresión en neuronas y en células gliales reactivas cercanas al sitio de inyección (Fig. 4c, d).

Distribución tisular

Se llevó a cabo análisis PCR en 15 órganos y tejidos diferentes de cada una de tres ratas que recibieron el vector en dosis alta para determinar si el AAV recombinante podía detectarse en posiciones distantes del sitio de administración intracraneana. Independientemente del procedimiento de administración (bombas de infusión u osmóticas), se pudo detectar un producto de PCR de 458 pb del gen de tk en médula espinal, bazo y ambos hemisferios del cerebro usando análisis transferencia Southern (Fig. 6). En una de las ratas, se detectaron los vectores en tejido del riñón.

Toxicidad

Para evaluar si la toxicidad estaba asociada con algunos de los procedimientos de administración, se realizaron estudios histopatológicos en secciones teñidas con H & E de cada grupo y los resultados se resumieron en la tabla 1. La morfología tisular general se conservó bien y no se presentaron artefactos por la congelación ni otros artefactos. En los grupos con administración por infusión, el daño tisular, si se presentó fue mínimo. No hubo infiltración celular, ni necrosis en el surco de la aguja y sólo hubo una mínima necrosis cortical en pocos animales. Se encontró sangrado fresco en una de las ratas del grupo de dosis alta y también se encontró hemosiderosis en cuatro de los animales que recibieron dosis alta, lo que indica sangrado moderado en el pasado. Alternativamente, se observó daño serio en todos los animales del grupo con administración con bomba osmótica incluyendo áreas necróticas extensas alrededor del surco de la aguja, infiltrados celulares y hemosiderosis.

Por ello, es suficiente la infusión de 2,5 x 10^{10} partículas de AAV-tk a 8 \mul/hora durante 2,5 horas para distribuir parcialmente el vector AAV a un volumen de 300 mm^{3} de tejido. Dentro de esta región, se observó un gradiente de expresión con teñido intenso directamente alrededor del sitio de la inyección y menos células positivas alejadas. La distribución parece estar en función de la dosis (número de partículas) y no en función del tiempo de administración o volumen de muestra cuando se comparan dos sistemas de administración con bomba diferentes: la distribución de 2,5 x 10^{10} partículas fue la misma ya sea con la administración por medio de bomba osmótica (volumen = 200 \mul, velocidad de flujo = 8 \mul/h, tiempo = 24 h) o bomba de infusión (volumen = 20 \mul, velocidad de flujo = 8 \mul/h, tiempo = 2,5 h). Además, se observaron niveles de expresión llamativamente diferentes entre los tres grupos de administración por infusión, donde el volumen de muestra, velocidad de flujo y tiempo de administración se mantuvieron constantes y el número de partículas fue la única variable.

Estos resultados obtenidos con administración de AAV potenciada por convección son consistentes con aquellos obtenidos en estudios CED de macromoléculas grandes, tales como partículas supramagnéticas en cerebro de rata. (Kroll y col. (1996) Neurosurg. 38:746-754, Patente de EEUU Nº 5.720.720). Kroll y col. usaron imágenes obtenidas por resonancia magnética y teñido histoquímico y demostraron que la dosis fue la variable más importante para maximizar la distribución de partículas en el tejido. Kroll describe que independientemente de si el volumen de infusión era pequeño (2 \mul) o moderado (24 \mul) o si la velocidad de infusión era baja (6 \mul/h) o alto (72 \mul/h), incrementando las partículas de 5,3 a 26,5 \mug el resultado fue hasta 5 veces superior en el volumen de su distribución en el tejido.

Con respecto a la especificidad del tipo celular, se ha descrito que AAV es capaz de transducir neuronas y el presente estudio confirma estos hallazgos. El hecho de que la expresión fuera tan importante en neuronas sugiere que la terapia génica con vectores AAV usando el promotor de CMV resulta útil para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Parkinson y el Alzheimer. No se observó expresión en células gliales maduras, excepto en pequeñas áreas de tejido afectado donde se presentó gliosis activa. Sin embargo, hemos demostrado previamente que el vector AAV-CMV-tk se expresa bien en células de glioma y, cuando se administran en conjunto con el profármaco ganciclovir, es eficaz en el tratamiento de gliomas experimentales en ratones desnudos. Dado que se cree que el gen "suicida" tk es tóxico para las células en división, sólo representaría un riesgo para las células tumorales marcadas y no para las neuronas circundantes. Finalmente, mientras que el promotor de CMV usado en este estudio permite una fuerte expresión del transgen en neuronas, la elección de promotores específicos de tipo celular permitirá dirigir AAV a otros componentes del SNC tales como oligodendrocitos y células gliales.

El presente estudio también mostró que el AAV administrado al cerebro está contenido en su mayor parte en el sistema nervioso central. Otros demostraron transporte retrógrado de virus entre los dos hemisferios cerebrales y capacidad de los virus para alcanzar la médula espinal circulando por el líquido cefalorraquídeo. La aparición del vector en el bazo resulta curiosa y sugiere un par de mecanismos. Uno es que el virus penetra en el torrente sanguíneo durante el procedimiento de infusión y circula a través del bazo donde queda retenido. Si éste fuera el caso, sería de esperar que otros tejidos que mostraron ser inducibles por AAV tuvieran también el virus. Otro mecanismo posible podría ser uno exhibido por células dendríticas. Estas células encontradas principalmente en la piel, recogen material extraño, entran a la circulación y se concentran en el bazo donde el material extraño puede permanecer durante largo tiempo en espera de su procesamiento o destrucción. En cualquier caso, hemos visto independientemente de la vía de administración, incluyendo la intramuscular, intravenosa y ahora intracerebral, el vector siempre se detecta en el bazo.

En resumen, se ha visto que la infusión lenta intracraneal de altas dosis de vector AAV transduce una porción significativa del cerebro en un modelo roedor. AAV puede ser usado para tratar una miríada de afecciones nerviosas centrales, incluyendo tumores, lesiones como resultado de accidentes cerebrovasculares y enfermedades neurodegenerativas.

Ejemplo 3 Terapia génica de la enfermedad de Parkinson

La administración potenciada por convección de vectores AAV con el transgen que codifica AADC mostró la restauración de sistemas dopaminérgicos en monos con enfermedad de Parkinson inducida con MPTP como se describe a continuación.

Animales

Se eligieron monos Rhesus (n= 4, 3-5 kg) como candidatos para la implantación en base a la evolución de sus síntomas parkinsonianos. Los animales se lesionaron por medio de infusión con 2,5-3,5 mg de MPTP-HCL a través de la arteria carótida interna derecha (referido al lado ipsilateral) seguida de 4 dosis I.V. de 0,3 mg/kg de MPTP-HCL (referido al lado contralateral) hasta que se alcanzó un síndrome hemiparkinsoniano sobrelesionado estable (Eberling, (1998) Brain Res. 805:259-262). El modelo MPTP en primate se considera el modelo por excelencia de evaluación previo a ensayos en seres humanos. (Langston (1985) Trends Pharmcol. Sci. 6:375-378). El MPTP es convertido en el SNC en MPP+ por la monoamino oxidasa B. MPP+ es una potente neurotoxina que provoca degeneración en las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra y pérdida de la vía de la dopamina nigro-striatal, como se puede ver en la enfermedad de Parkinson. Los animales lesionados con MPTP se evaluaron clínicamente una vez por semana usando una escala de valoración clínica y controlando la actividad durante 5 meses antes de la cirugía.

Tras la administración de MPTP, los animales desarrollaron signos clínicos de enfermedad de Parkinson manifestados por lentitud general, bradiquinesia, rigidez, trastornos de equilibrio y postura flexionada. Todos los monos usaron menos frecuentemente el brazo izquierdo que el derecho, y todos mostraron signos de temblor. Usando la escala de valoración clínica, todos los monos tuvieron valores parkinsonianos estables de moderados a severos (23±1,7; 23±1,2; 24±1,7; 19±3) durante los 5 meses posteriores a la administración de MPTP.

Producción de vectores 1. pAAV-AADC

Se clonó un ADNc de AADC humano BamHI/PvuII de 1,5 kb (Fan y col. (1998) Human Gene Therapy 9:2527-2535) en el módulo de expresión de AAV pV4.1c en los sitios BamHI/HindII. El módulo de expresión contiene un promotor de CMV, un intrón quimérico compuesto por un donador de corte y empalme de CMV y un sitio aceptor de corte y empalme de \beta-globina humana, secuencia de poliadenilación de hormona de crecimiento humana y secuencias AAV ITRs flanqueando (repeticiones terminales invertidas) (Herzog, R. W., y col. (1999) Nature Medicine 5:56-63).

2. pAAV-LacZ

El vector pAAV-LacZ se construyó como se describe a continuación. Se reemplazó la región codificadora de AAV de pSub201 (Samulski y col. (1987) J. Virol 61:3096-3101), entre los sitios XbaI, con conectores EcoRI, dando como resultado el plásmido pAS203. Se volvió el fragmento EcoRI a Hindi de pCMVB (CLONOTECH) de extremo romo y se clonó en el sitio EcoRI tratado con Klenow de pAS203 para dar pAAV-Lacz.

3. pHLp19

El plásmido H19 codifica un genoma de AAV-2 modificado diseñado para potenciar la producción del vector AAV mientras suprime la generación del del virus de replicación del tipo seudo salvaje competente. EL plásmido contiene un promotor P5 movido a la posición 3' del gen cap y el promotor es reemplazado por una región no traducida en 5' compuesta principalmente por una secuencia de reconocimiento de recombinasa FLP. El pH19 se construyó para eliminar cualquier región de homología entre los extremos 3' y 5' del genoma de AAV. Además, la caja TATA de siete pares de bases del promotor pH19P5 se destruyó por mutación de esa secuencia a GGGGGGG.

El pH19 se construyó en un procedimiento de varias etapas usando secuencias de AAV-2 derivadas del provirus de AAV-2, pSM620. Se digirió pSM620 con SmaI y PvuII y se clonaron los genes rep y cap de 4543 pb que codifican el fragmento SmaI en el sitio SmaI de pUC119 para dar el plásmido de 7705 pb, pUCrepcap. Las secuencias ITR restantes flanqueando los genes rep y cap se eliminaron por mutagénesis dirigida a oligonucleótidos usando los siguientes oligonucleótidos:

145A; 5'-GCT CGG TAC CCG GGC GGA GGG GTG GAG TCG-3' (SEC ID Nº: 3)

145B; 5'-TAA TCA TTA ACT ACA GCC CGG GGA TCC TCT-3' (SEC ID Nº: 4)

El plásmido resultante, pUCRepCapMutated (pUCRCM) (7559 pb) contiene el genoma entero de AAV-2 sin ninguna secuencia ITR (4389 pb). Los sitios SrfI, en parte introducidos por los oligonucleótidos mutagénicos, flanquean los genes rep y cap en esta construcción. Las secuencias de AAV corresponden a posiciones de AAV-2 146-4.534.

Se introdujo un sitio Eco47III en el extremo 3' del promotor P5 para facilitar la excisión de las secuencias del promotor P5. Para hacer esto, hubo que mutagenizar pUCRCM con cebador P547 (5'-GGT TTG AAC GAG CGC TCG CCA TGC-3') (SEC ID Nº: 5). El plásmido resultante de 7559 pb se llamó pUCRCM47III.

El policonector pBSIIsk+ se cambió por excisión del original con BSSHII y reemplazo con oligonucleótidos de extremos romos (blunt) 1 y 2. El plásmido resultante, bluntscript, tiene 2830 pb de longitud y el nuevo policonector codifica los sitios de restricción EcoRV, HpaI, SrfI, PmeI y Eco47III. Las secuencias blunt 1 y 2 son las siguientes:

blunt 1; 5'-CGC GCC GAT ATC GTT AAC GCC CGG GCG TTT AAA CAG CGC TGG-3'(SEC ID Nº:6)

blunt 2; 5'-CGC GCC AGC GCT GTT TAA ACG CCC GGG CGT TAA CGA TAT CGG-3'(SEC ID Nº:7)

El pH1 se construyó uniendo los genes rep y cap, de 4398 pb que codifican el fragmento SmaI de pUCRCM dentro del sitio SmaI de pBluntscript de manera que el sitio HpaI estuviera cercano al gen rep. El pH1 tiene una longitud de 7228 pb.

El pH2 es idéntico a pH1 excepto en que el promotor P5 de pH1 está reemplazado por la región sin traducir 5' de pGN1909. Para hacer esto, se unió el fragmento AscI(blunt)-SfiI de 329 pb que codifica la región sin traducir 5' de pW1909lacZ dentro del fragmento SmaI(parcial)-SfiI de 6831 pb del pH1 creando pH2. El pH2 tiene una longitud de 7156 pb.

Se agregó un promotor P5 a la terminación 3' del pH2 por inserción del fragmento SmaI-Eco43III, de 172 pb que codifica el promotor P5 de pUCRCM47III dentro del sitio Eco47III en pH2. Este fragmento se orientó de manera que la dirección de transcripción de los tres promotores de AAV fuera la misma. Esta construcción tiene una longitud de 7327 pb.

La caja TATA de 3'P5 (posiciones 255-261 de AAV-2, secuencia TATTTAA) se eliminó cambiando la secuencia por GGGGGGG usando oligonucleótidos mutagénicos 5DIVE2 (5'-TGT GGT CAC GCT GGG GGG GGG GGC CCG AGT GAG CAC G-3') (SEC ID Nº:8). La construcción resultante, pH19, tiene una longitud de 7328 pb.

4. pladeno5

El pladeno5 es un plásmido que provee una serie completa de funciones de ayuda al adenovirus para la producción del vector AAV cuando se transfecta en células 293. Está compuesto fundamentalmente por las regiones de ARN E2A, E4 y VA del adenovirus-2 y un esqueleto de plásmido. El plásmido se construyó de la siguiente manera.

Se modificó pBSIIs/k+ para reemplazar la región de 637 pb que codifica el policonector y el módulo de complementación alfa con un sitio EcoRV único usando mutagénesis dirigida de oligonucleótidos y el siguiente oligonucleótido: 5'-CCG CTA CAG GGC GCG ATA TCA GCT CAC TCA A-3' (SEC ID Nº: 9). Posteriormente se clonó un policonector que codifica los sitios de restricción BamHI, KpnI, SrfI, XbaI, ClaI, Bst1107I, SalI, PmeI y NdeI dentro del sitio EcoRV (5'-GGA TCC GGT ACC GCC CGG GCT CTA GAA TCG ATG TAT ACG TCG ACG TTT AAA CCA TAT G-3') (SEC ID Nº: 10).

Se sometió el ADN de adenovirus-2 a digestión y se aislaron fragmentos de restricción que codifican la región E2A (un fragmento KpnI-SrfI de 5335 pb, correspondiente a las posiciones 22.233-27.568 del genoma del adenovirus-2) y el fragmento VA ARNs (un fragmento de EcoRV-SacII de 731 pb, correspondiente a las posiciones 10.426-11.157 del genoma del adenovirus-2). El fragmento E2A se instaló entre los sitios SalI y KpnI del policonector. Se ensambló primeramente una región E4 en pBSIIs/k+ uniendo un fragmento BamHI de 13.864 pb correspondiente a las posiciones 21.606-35.470 del genoma del adenovirus-2 (que codifica el extremo 5' del gen) y un fragmento de PCR digerido, AvrII y SrfI de 462 pb correspondiente a las posiciones 35.371-35.833 del adenovirus-2 (que codifica el extremo 3' del gen) entre los sitios BamHI y SmaI de pBSIIs/k+. Los oligonucleótidos usados para producir los fragmentos por PCR se diseñaron para introducir un sitio SrfI en la unión donde se intersectan el promotor E4 y la repetición terminal del adenovirus y tiene las secuencias 5'-AGA GGC CCG GGC GTT TTA GGG CGG AGT AAC TTG C-3' (SEQ ID NO: 11) y 5'-ACA TAC CCG CAG GCG TAG AGA C-3' (SEC ID Nº: 12). Se realizó la excisión del promotor E4 intacto por medio de clivaje con SrfI y SpeI y el fragmento de 3.189 pb correspondiente a las posiciones 32.644-35.833 del adenovirus-2 se clonó en el intermediario E2A entre los sitios SrfI y XbaI. Finalmente, se insertó el fragmento VA ARN en el sitio Bst1107 tras la modificación de extremo romo del sitio SacII mediada por T4 polimerasa. Los genes en pladeno 5 están dispuestos de manera tal que los extremos 5' de los promotores E2A y E4 estén contiguos, provocando que las regiones se transcriban hacia fuera, en direcciones opuestas. Los genes VA ARN, ubicados en los tres extremos cebadores del gen E4, transcriben hacia el gen E4. El plásmido tiene una longitud de 11.619 pb.

Producción del vector AAV

Se cultivó la línea celular HEK293 (Graham, F. L., Smiley, J., Russel, W. C., y Naiva, R. (1977) Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 36:59-72.) en DMEM completo (BioWhittaker) conteniendo 4,5 g/l de glucosa, suero bovino de ternera inactivado por calor al 10% (FCS) y glutamina 2mM a 37°C en aire con 5% CO_{2}. Se sembraron cuarenta matraces T225 con 2,5\times10^{6} células cada uno y se cultivaron durante tres días antes de la transfección hasta una confluencia del 70-80% (aproximadamente 1,5\times10^{7} células por matraz).

Los procedimientos de transfección y purificación descritos por Matsushita y col. (Matsushita, T., Elliger, S., Elliger, C., Podsakoff, G., Villarreal, L., Kurtzman, G. J., Iwaki, Y., y Colosi, P. (1998) "Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without ayudante virus," Gene Therapy 5:938-945) se emplearon para la producción del vector AAV con pequeñas modificaciones. El procedimiento de producción de vectores incluyó la cotransfección de células HEK 293 con 20 \mug de cada uno de los siguientes tres plásmidos por matraz: el plásmido AAV-AADC, el plásmido ayudante de AAV (pHLP19, conteniendo los genes rep y cap de AAV), y el plásmido de ayuda al adenovirus (pladeno-5, anteriormente conocido como pVAE2AE4-2 (4) y compuesto por los genes E2A, E4, y VA ARN derivados de adenovirus-2 purificado), usando el procedimiento de fosfato de calcio (Wigler, M. y col. (1980) Transformation of mammalian cells with an amplifiable dominant-acting gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570) durante un periodo de 6 horas. Tras la transfección, se reemplazó el medio y se recolectaron las células 3 días después. Los sedimentos celulares fueron posteriormente sometidos a 3 ciclos por lisis por congelación y descongelación (alternando entre etanol hielo seco seco y baños a 37ºC agitando con vórtex intermitentemente). Se eliminaron los sedimentos celulares por centrifugación (10.000 g durante 15 minutos). Se centrifugó por segunda vez el sobrenadante para eliminar cualquier turbidez remanente y seguidamente se trató con Benzonase® (200 \mu/ml) a 37°C durante 1 hora con el fin de reducir el DNA celular contaminante. Tras la incubación, se llevó el sobrenadante a 25 mM en CaCl_{2} y se colocó en hielo durante una hora. Se eliminó el precipitado resultante por centrifugación (10.000 g durante 15 minutos) y se desechó. Este sobrenadante posteriormente se llevó al 10% en PEG(8000) y se lo colocó en hielo durante 3 horas. Se recolectó el precipitado por centrifugación (3.000 g durante 30 minutos) y se resuspendió en 4 ml de NaHEPES 50 mM, NaCl 0,15M, EDTA 25 mM (pH 8,0) por cada uno de 20 matraces T225. Se agregó CsCl sólido para producir una densidad de 1,4 g/ml y se centrifugó la muestra a 150.000 g durante 24 h en un rotor Beckman TI70. Se combinaron las fracciones conteniendo AAV, se ajustó la densidad a 1,4 g/ml CsCl y se centrifugaron a 350.000 g durante 16 h en un rotor Beckman NVT65. Las fracciones conteniendo AAV se concentraron y se sometieron a diafiltración contra tampón excipiente (sorbitol 5% en PBS). Se determinó el título del vector AAV-AADC purificado usando análisis de transferencia por mancha cuantitativo y se almacenaron patrones de vectores a -80°C.

Infusión Viral

Se creó un campo estéril en la sala de cirugía para preparar el sistema de infusión. Se purgaron con solución salina las cánulas de infusión para evaluar la integridad entre la aguja y la interfase de la tubuladura. Se conectaron las cánulas de infusión estériles y las líneas de carga usando ajustes apropiados con extremo cuidado para evitar la incorporación de burbujas de aire en el sistema. Se prepararon las líneas de infusión de aceite no estériles como se describió previamente y se ajustaron jeringas herméticas para gas Hamilton de 1 ml llenas con aceite a una bomba de infusión Harvard. Se colocaron seis cánulas de infusión en los soportes de microdiálisis (3 cánulas por soporte) y se montaron en una torre estereotáctica. Tras la unión de las líneas de carga y de aceite, se cebaron las cánulas de las agujas con AAV y se transfirió el sistema de infusión a la mesa de cirugía. Las velocidades de infusión iniciales se establecieron en 0,1 pl/min, se inspeccionaron visualmente las líneas para asegurar un flujo suave de fluido a través del sistema y se llevó manualmente la cánula al sitio blanco. Se controló con una última inspección visual la posible presencia de burbujas en el sistema de infusión.

El sistema de cánula estaba constituido por tres componentes: (i) una cánula de infusión estéril; (ii) una línea de carga estéril llevando AAV-AADC o AAV-LacZ (control); (iii) una línea de infusión no estéril conteniendo aceite de oliva. La preparación de cada línea se describe aquí brevemente. La cánula de infusión estaba constituida por agujas 27 G (diámetro externo de 0,076 cm; diámetro interno de 0,152 cm; Terumo Corp. Elkton, MD) ajustadas con silicona (diámetro externo de 0,041 cm; diámetro interno de 0,020 cm; Polymicro Technologies, Phoenix, AZ), las que se colocaron en tubuladuras de Teflon (DI = 0,076 cm, Upchurch Scientific, Seattle, WA) de manera tal que la punta distal de silicona sobresaliera aproximadamente 15 mm por fuera de la tubuladura. Se aseguraron las agujas dentro de las tubuladuras usando superglue y se controló el sistema en busca de posibles fugas previo a su utilización. En el extremo proximal de la tubuladura se colocaron un conector Tefzel y una férula para conectar la línea de carga adyacente.

Las líneas de carga y de infusión estaban constituidas por secciones de tubuladura de Teflon de 50 cm (diámetro externo de 0,157 cm; diámetro interno de 0,076 cm) unidas con férulas Tefzel 2,54/40,64 cm, uniones y adaptadores macho Luer-lock (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) en los extremos distales. Las líneas de carga estériles fueron llevadas a un volumen de 1000 ml y purgadas con solución salina antes de su uso.

Se sedaron inicialmente los animales con Ketamina (Ketaset; 10 mg/kg intramuscular), intubaron y prepararon para cirugía. Se estableció una vía venosa usando un catéter calibre 22 ubicado en la vena cefálica o safena para administrar fluidos isotónicos a 5-10 ml/kg/h. Se administró Isoflurane (Aerrane, Omeda PPD Inc., Liberty, N.J.) al 1-3% hasta que el animal mantuvo una anestesia estable. Se posicionó la cabeza en un marco estereotáctico compatible con MRI de acuerdo con los valores preestablecidos obtenidos durante la exploración MRI de base. Se conectaron al animal electrodos subcutáneos para electrocardiograma, se colocó una sonda rectal y se cubrió el cuerpo con sábanas con circulación de agua para mantener una temperatura central de 36-38ºC. Se controlaron el electrocardiograma y el ritmo cardíaco (usando Silogic ECG-60, Stewartstown, PA.) y la temperatura corporal durante el procedimiento. Se preparó la cabeza con Betadine y etanol al 70%, se creó un campo estéril y se realizó una incisión en la línea media a través de la piel, músculo y fascia usando electrocauterización (Surgistat Electrosurgery, Valleylab Inc., Boulder, CO).

La retracción suave de la fascia y del músculo permitió exponer el cráneo sobre los sitios de entrada corticales. Se llevó a cabo una craneotomía unilateral usando un torno dental Dremel para exponer un área de 3 cm x 2 cm de duramadre por encima de los sitios blanco. Se guiaron estereotácticamente múltiples cánulas unidas a un soporte hacia los sitios blanco striatales. Los parámetros quirúrgicos para infusión unilateral de AAV dentro del hemisferio ipsilateral para la infusión para ICA MPTP se resumen en la Tabla 2.

TABLA 2 Parámetros quirúrgicos para infusión de AAV

Sitios Blanco	Striatum (2 caudado, 4 putamen)
Hemisferio	Lado derecho (ipsilateral para infusión de ICA MPTP)
Volumen de Infusión	30 \mul/sitio
Velocidad de Infusión	0,1 \mul/min (60 min)
	0,2 \mul/min (60 min)
	0,4 \mul/min (30 min)
Virus	AAV-AADC; 2,1 x 10^{12} partículas/ml;
	Lote Nº 176,12; 200 \mul/vial
Artículo Control	AAV-LacZ; 9,2 x 10^{11} partículas/ml;
	Lote Nº 176,126; 200 \mul/vial

Aproximadamente quince minutos tras la infusión, se levantó la cánula a una velocidad de 1 mm/min, hasta quedar fuera del córtex. Se enjuagó el córtex con solución salina, se recortaron los márgenes óseos con ronguers y se cerró la herida en capas anatómicas. Se administraron analgésicos (Numorfan 1M) y antibióticos (Flocillin, 1M) como parte del protocolo quirúrgico. Se controló a los animales hasta recuperación total de la anestesia, se los colocó en sus jaulas y observó clínicamente (2/día) durante aproximadamente cinco días tras la cirugía. El tiempo total de la neurocirugía fue de 4,5 horas por animal.

Tras la administración intrastriatal de AAV, se evaluó a los animales controlando posibles signos de comportamiento anormal. Los técnicos veterinarios observaron y puntuaron los animales dos veces al día usando formularios de observación clínica. Todos los monos se recuperaron de la cirugía dentro de las 2 horas y fueron capaces de mantenerse e incluso alimentarse por sí mismos. No se observaron signos o efectos adversos durante las 8 semanas posteriores al periodo quirúrgico.

Generación de imágenes con resonancia magnética

La visualización del sitio blanco es crucial para el posicionamiento preciso de células dentro del núcleo caudado o del putamen. Se usaron procedimientos estereotácticos combinados con MRI para ubicar la cánula con precisión dentro de las estructuras blanco deseadas. Se escanearon todos los animales antes de la cirugía para generar coordenadas estereotácticas precisas de los sitios de implante blanco para cada animal individual. Se colocaron los mismos marcadores fieles usados para el escaneo PET en el marco para registrar conjuntamente las imágenes de PET y de MRI. Brevemente, durante el procedimiento de escaneo, se sedaron los animales usando una mezcla de Ketamina (Ketaset, 7 mg/kg, intramuscular) y xilacina (Rompun, 3 mg/kg, intramuscular). Se pusieron los animales en un marco estereotáctico compatible con MRI, se registraron las medidas de soportes de oreja y soportes de ojo y se estableció una línea IV. Se tomaron seis imágenes coronales (1 mm) y 15 imágenes sagitales (3 mm) usando una máquina GE Signa 1.5 Tesla.

Las imágenes de resonancia magnética fueron ponderadas en T1 y obtenidas en tres planos usando secuencia "spoil grass" con un tiempo de repetición (TR) = 700 ms, tiempo de eco (TE) = 20 ms y un ángulo de 30'). El campo de visión de 15 cm con una matriz 192 y NEX 2 (número de promedios por señal). El tiempo de escaneo de base fue de aproximadamente 20 minutos. Se determinó la distribución rostro-caudal y medio-lateral de una estructura blanco (por ej. el núcleo caudado) usando las imágenes coronales obtenidas por resonancia magnética. Las coordenadas quirúrgicas se determinaron a partir de las imágenes coronales ampliadas (1,5x) del núcleo caudado y del putamen.

Tomografía por emisión de positrones (PET)

Se realizaron 2 escaneos PET a todos los animales (4), un escaneo tras el establecimiento de la lesión con MPTP y un segundo escaneo 7-8 semanas tras la infusión con AAV-AADC o AAV-LacZ. Antes de PET, se obtuvieron imágenes de cada animal con resonancia magnética (RM) usando un imán 1,5 T y un marco estereotáctico que permitió registrar conjuntamente las series de datos de PET y RM a través de marcadores fieles externos. Los estudios PET se llevaron a cabo con un sistema PET-600, un tomógrafo de corte único con una resolución de 2,6 mm en plano y una resolución axial ajustable que se aumentó desde 6 mm hasta 3 mm para este estudio disminuyendo la abertura protectora (shielding gap). Las características de este tomógrafo se describieron anteriormente (Budinger y col. (1991) Nucl. Med. Biol. 23(6):659-667; Valk, (1990) Radiology 176(3):783-790). Se intubaron los monos y se anestesiaron con isoflurano, se colocaron en el marco estereotáctico y posicionaron en el escáner PET para obtener una imagen coronal de un corte del cerebro pasando a través del striatum. Los monos se posicionaron de la misma manera para cada estudio usando las escalas anterior-posterior en el marco estereotáctico y una luz láser conectada al tomógrafo. Tras ser posicionados en el escáner, se obtuvo una exploración de transmisión de 5 minutos para corregir la atenuación fotónica y para evaluar la posición del animal. Se administró a los monos 10-15 mCi del marcador de AADC, 6-[^{18}F]fluoro-L-m-tirosina (FMT) por inyección y se comenzó la generación de imágenes, la que continuó durante 60 minutos, posteriormente se reposicionó el mono para obtener la imagen de un segundo corte 6 mm caudal al primero.

La serie de datos de PET y RM se registraron conjuntamente y se dibujaron las regiones de interés (ROs) para el striatum en el hemisferio contralateral (el lado opuesto a la infusión de ICA MPTP) en datos obtenidos por PET a 50 y 60 min. (corte 1) y de 65 a 75 min (corte 2) con referencia a RM. Se crearon imágenes especulares de las ROs en el hemisferio ipsilateral (lado de la infusión de MPTP) y se determinaron los conteos radiactivos (cm^{2}/seg) para cada ROI. Se promediaron los conteos striatales para los dos cortes para cada estudio. Se calcularon las proporciones de asimetría por consumo de FMT para cada animal en cada tiempo restando los conteos para el striatum ipsilateral (lesionado) de los conteos para el striatum contralateral (no lesionado) y dividiendo por el promedio de conteos para el striata ipsilateral y contralateral. Con el fin de reducir la variación de la relación de asimetría entre animales, se calculó un valor de cambio restando la relación de asimetría del segundo estudio PET de la relación de asimetría del estudio de base para cada animal. Se usaron pruebas t para muestras no relacionadas para comparar el cambio en la relación de asimetría para los monos con AAV-AADC y AAV-LacZ.

Como se esperaba, los 4 monos mostraron mayor consumo de FMT en el striatum contralateral frente al ipsilateral en el estado basal, que mostró un consumo insignificante. Durante el segundo estudio PET, los monos tratados con AAV-AADC mostraron consumo aumentado en el striatum ipsilateral, mientras que los tratados con AAV-LacZ no mostraron cambios con respecto al estado basal (Fig. 7). El cambio en la asimetría de consumo desde estado basal hasta el segundo estudio PET fue significativamente mayor (p< 0.01) para los monos con AAV-AADC, que mostraron pequeña asimetría durante el segundo estudio, que en los monos con AAV-LacZ, que mostraron un consumo de FMT contralateral mayor en ambos tiempos puntuales. (Fig. 8).

Necropsia

Se anestesió profundamente a los animales con pentobarbital sódico (25 mg/kg, intravenoso) y se sacrificaron 8-9 semanas tras la administración de AAV y una semana tras las exploraciones PET post quirúrgicos. El día del sacrificio se obtuvieron muestras de sangre y se trató a los animales con una preparación de L-dopa/carbidopa (Sinemet 250/25). Se recolectó plasma y LCR cervical en el momento de la necropsia. Se extirparon los cerebros 30-45 minutos tras la administración de Sinemet, se colocaron en la matriz cerebral y se seccionaron de manera coronal en láminas de 3-6 mm de espesor. Se congeló una lámina de 3 mm de espesor del cerebro striatal de cada mono inmediatamente con isopentano a -70ºC y se almacenó congelado para análisis bioquímico. Las láminas restantes de 6 mm de espesor se fijaron en formalina durante 72 horas, se lavaron en PBS durante 12 horas, se ajustaron en gradiente de sacarosa ascendente (10-20-30%) y se congelaron.

Análisis histológico

Las muestras de cerebro fijadas en formalina se cortaron en secciones coronales de 30 \mum de espesor en un crióstato. Se recogieron las secciones congeladas en series empezando a nivel del extremo rostral del núcleo caudado hacia el nivel de la sustancia nigra. Se guardó cada sección y se mantuvo en solución anticongelante a 70ºC. Las secciones seriales se tiñeron para observar inmunorreactividad de tirosina hidroxilasa (TH), dopa descarboxilasa (DDC) o B-galactosidasa (B-gal). Cada 12º sección se lavó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubó en H_{2}O_{2} 3% durante 20 minutos para bloquear la actividad peroxidasa endógena. Tras el lavado en PBS, se incubaron las secciones en solución bloqueante (suero normal de caballo 10% para TH o suero normal de cabra 10% para DDC y B-gal y Triton-X 100, 0,1% en PBS) durante 30 minutos, posteriormente se incubaron en solución de anticuerpo primario -TH (monoclonal de ratón, Chemicon, 1:1000), DDC (policlonal de conejo, Chemicon, 1:2000) o B-gal (policlonal de conejo, Cortex Blochem, 1:5000) durante 24 horas. Posteriormente se incubaron las secciones durante 1 hora con anticuerpo secundario IgG anti ratón biotinilado para TH, o anticuerpo secundario IgG anti conejo para DDC y B-gal (Vector Labs, 1:300). La unión a los anticuerpos se visualizó con peroxidasa del rábano picante estreptavidina (Vector Labs, 1:300) y cromógeno DAB con níquel (Vector Labs). Por último se colocaron cubreobjetos sobre las secciones y se examinaron con microscopio óptico.

Tras obtener las muestras de tejido, se seccionaron los bloques congelados a 20 \mum. Se tiñeron las secciones con H&E y para DDC-IR.

Se determinaron los valores estimados cuantitativos para el número total de células infectadas con AAV dentro del núcleo caudado, putamen y globus pallidus usando un procedimiento disector óptico constituido por un sistema de análisis de imágenes asistido por ordenador, incluyendo un microscopio Leitz Otholux 11 acoplado a una platina controlada por ordenador para x-y-z Prior H128, un sistema de cámara de vídeo de alta sensibilidad Sony 3CCD (Sony, Japan) y un ordenador Macintosh G-3. Todos los análisis se realizaron con un software NeuroZoom (La Jola, CA). El instrumento se calibró previamente a cada serie de mediciones. Se marcó el contorno de la región de neuronas positivas en el caudado, putamen y globus pallidus a bajo aumento (objetivo 2,5x). Debido a la presencia difusa de células infectadas con AAV dentro del striatum, se midió un 1% de la región contorneada con un diseño aleatorio sistemático de marcos de conteo de disector (1 505 1IM2) usando un objetivo de inmersión 63x plan-neofluar con apertura 0,95. Tomando como base experimentos piloto se muestrearon al menos cuatro secciones separadas idénticamente. Usando el principio del disector, se muestrearon hasta 200 neuronas positivas para AADC por barrido óptico usando procedimientos de diseño uniforme aleatorio y sistemático para todas las mediciones. Se midió el espesor promedio de las secciones en 23 micrones. Una vez en foco la parte superior de la sección, se bajó el plano z a 1-2 gm. Posteriormente se realizaron recuentos mientras se enfocaba hacia abajo a través de tres disectores de 5 micras de espesor. Se prestó atención para asegurar que el plano inferior prohibido nunca se incluyera en el análisis. Se calcularon los volúmenes de las estructuras de acuerdo con procedimientos estándar. Se calculó el número total de células positivas en las estructuras examinadas usando la fórmula N = Nv x Vs, donde Nv es la densidad numérica y Vs es el volumen de la estructura.

La tinción TH-IR reveló una fuerte reducción de las fibras nigrostriatales y cuerpos celulares en la sustancia nigra en el lado ipsilateral en todos los monos. El lado contralateral mostró reducciones variables de TH y AADC-IR en el striatum y la sustancia nigra.

Solo en los monos tratados con AAV-LacZ se vio paralelismo entre DDC-IR y TH-IR. Los monos tratados con AAV-AADC mostraron teñido intenso AADC en el lado ipsilateral que excedió el teñido que mostró el lado contralateral. Se vio una alta densidad de células AADC-IR en el 80% del striatum y en el 100% del globus pallidus en uno de los animales tratado con AAV-AADC. El análisis estereológico reveló 18.384 células por mm^{3} en el putamen, 15.126 células por mm^{3} en el caudado y 9.511 células por mm^{3} en el globus pallidus. El número total de células infectadas con AAV se estimó en al menos 16 x 10^{6} células. En el otro mono tratado con AAV-AADC, las células AADC-IR se encontraron en más del 60% del striatum ipsilateral, con 7.515 células por mm^{3} en el caudado, 15.352 células por mm^{3} en el putamen y 3.850 células por mm^{3} en el globus pallidus. No se encontraron células AADC en el striatum contralateral. Los monos tratados con AAV/LacZ no mostraron AADC-IR en el striatum ipsilateral ni en el contralateral.

Las células infectadas con AAV parecían mostrar morfología neuronal. El diámetro promedio de las células infectadas fue de 9 \pm 2,3 \mum en el putamen y 14,6 \pm 9 \mum. Muchas células LacZ y AADC mostraron típica morfología neuronal medio espinosa. Las células infectadas con AAV resultaron positivas para el marcador neuronal, Neu-N. En los monos tratados con AAV-AADC, una de 4-6 células positivas para Neu-N fue positiva para AADC en el caudado y putamen, y una de 3-4 células positivas para Neu-N fue positiva para DAC en el globus pallidus. Ninguna de las células infectadas con AAV en los monos tratados con LacZ o AADC fue positiva para GFAP.

Las áreas adyacentes al conducto de la cánula se tiñeron con Nissi y H&E. No se observaron signos de citotoxicidad. No se observaron manguitos perivasculares, independientemente de la distancia desde la cánula. No hubo signos de reducción de células neuronales cerca del sitio de infusión comparado con el lado contralateral usando inmunotinción Neu-N. La inmunotinción GFAP no detectó reacción glial anormal dentro del striatum tratado con AAV.

Análisis bioquímico

Se extrajeron regiones del cerebro de los bloques frescos congelados usando una microperforadora para evaluar los niveles tisulares de L-dopa y metabolitos de dopamina, la actividad de AADC y la presencia de vector AAV. Las regiones del cerebro incluyeron striatum y córtex.

Se recogieron las muestras congeladas obtenidas con la microperforadora y se homogeneizaron por ultrasonido en 300 pl de ácido perclórico 0,1 M (Fisher Scientific) conteniendo etanol 1% y EDTA 0,02% (Fisher Scientific). Se extrajeron cincuenta pl del homogenado para análisis de proteínas (BCA Protein Assay Kit Pierce #23225), se centrifugó el resto en una microcentrífuga durante 1,5 min. a velocidad máxima. Se usaron de 30 a 50 pl del homogenado para análisis de catecolaminas por HPLC usando una columna de par iónico Ultrasphere C-18, 5 p, 4,6 x 250 mm (Beckman 235329); un procesador automático de muestras Waters 717plus a 4ºC, bomba Waters 510 a 0,9 mv/min y un detector electroquímico amperométrico (Decade) a Eox. 0,82 V. La columna y la célula de detección se pusieron a 31ºC. La fase móvil contenía 2 l de agua de grado HPLC, 2,2 g de ácido 1-heptansulfónico, sal de sodio (Fisher Scientific), 0,17 g EDTA, 12 ml de trietilamina (Fisher Scientific), se ajustó el pH hasta 2,5 con = 8 ml ácido fosfórico 85% (Fisher Scientific) y 60 ml de acetonitrilo (J. T. Baker). Se registró la salida del detector y se analizó con el Waters Millennium 32 Chromatography Manager.

Análisis de AADC

Se determinó la actividad de AADC con una adaptación del procedimiento de Nagatsu y col. (1979) Anal. Biochem. 100:160-165. Brevemente, se homogeneizó tejido (10 mg/ml) en tampón fosfato 50 mM (pH 7.4) conteniendo fosfato de pirixilo 0.04 mM (un cofactor de AADC) y pargiline 0.2 mM. Las muestras se incubaron previamente a 37°C durante 5 minutos y se inició la reacción agregando L-dopa (concentración final: 100\muM). Las incubaciones se llevaron a cabo durante 20 minutos y se detuvo la reacción agregando 0.02 ml de ácido perclórico concentrado. Tras la centrifugación, se determinó la concentración de dopamina en el sobrenadante usando HPLC con detección electroquímica. (ver, por ej., Boomsa y col. (1988) Clin. Chem. Acta 178-59-69). Se determinó la concentración de proteínas en el sedimento tisular usando BCA Protein Assay Kit (Pierce #23225). Los resultados se expresan en nM/h/mg de proteína. Las muestras tisulares congeladas fueron procesadas de acuerdo con los protocolos estándar.

Las regiones corticales de todos los monos mostraron niveles variables de L-dopa, sin embargo, fueron consistentes dentro de cada mono. Como se esperaba, no hubo decarboxilación de L-dopa a dopamina dentro del córtex, sin embargo, en el striatum, en el lado contralateral a la administración de MPTP, hubo conversión de L-dopa a dopamina y además se metabolizó a HVA. En el striatum tratado con MPTP de los monos tratados con AAV-Lac-Z, no hubo conversión de L-dopa a dopamina ni se metabolizó a HVA. Los niveles tisulares de L-dopa también se mantuvieron en el mismo nivel que en el córtex en los monos tratados con AAV-Lac-Z. En el striatum tratado con MPTP de los monos tratados con AAV-AADC, L-dopa se convirtió en dopamina y HVA y los niveles tisulares de L-dopa en esta región disminuyeron.

La actividad de AADC fue muy baja en las regiones corticales y en el striatum tratado con MPTP de monos tratados con AAV-LacZ. L-dopa se convirtió en dopamina en el striatum contralateral, sugiriendo niveles altos de actividad de AADC. Las muestras tisulares de striatum tratado con MPTP de monos infectados con AAV-AADC tuvieron niveles extremadamente altos de dopamina con trazas de L-dopa restante.

Estos resultados demuestran que la combinación de vector AAV-AADC infundido y L-dopa sistémica es una terapia promisoria para el tratamiento de PD.

Por ello, la invención provee un procedimiento para el tratamiento nuevo y eficaz de afecciones del SNC, tal como la Enfermedad de Parkinson. Además, la invención también describe procedimientos para determinar la actividad de la dopamina in vivo.

<110> Avigen, Inc.

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<120> ADMINISTRACIÓN POTENCIADA POR CONVECCIÓN DE VECTORES AAV

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<130> 0800-0014.40

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<140> PCT/US99/11687

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<141> 26-05-1999

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<150> US 60/134.748

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<151> 18-05-1999

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<150> US 60/086.949

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<151> 27-05-1998

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<160> 12

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador AAV-tk

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<400> 1

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aagtcatcgg ctcgggtacg tagacgatat c

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31

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<210> 2

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador AAV-tk

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<400> 2

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atagcagcta caatccagct accattctgc

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30

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<210> 3

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: 145A

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<400> 3

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gctcggtacc cgggcggagg ggtggagtcg

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30

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<210> 4

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: 145B

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<400> 4

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: P547

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<400> 5

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ggtttgaacg agcgctcgcc atgc

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24

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: blunt1

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: blunt2

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<400>7

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cgcgccagcg ctgtttaaac gcccgggcgt taacgatatc gg

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42

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<210> 8

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: 5DIVE2

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<400> 8

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tgtggtcacg ctgggggggg gggcccgagt gagcacg

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37

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<210> 9

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: sitio EcoRV

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<400> 9

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31

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<210> 10

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<211> 57

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: policonector

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<400> 10

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ggatccggta ccgcccgggc tctagaatcg atgtatacgt cgacgtttaa accatat

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57

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<210> 11

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: E4(1)

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<400> 11

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agaggcccgg gcgttttagg gcggagtaac ttgc

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34

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<210> 12

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: E4(2)

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<400> 12

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acatacccgc aggcgtagag ac

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22

Claims (5)

1. El uso de las composiciones primera y segunda para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la Enfermedad de Parkinson, en el que la composición primera comprende viriones de virus adeno asociado recombinante (rAAV) que comprenden un transgen que codifica una descarboxilasa de aminoácido aromático (AADC) y un excipiente aceptable farmacéuticamente, para administrar en la cavidad craneana y en el que la composición segunda comprende L-dopa y un excipiente aceptable farmacéuticamente para uso oral, en el que se administra solo un transgen.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que la administración comprende administración potenciada por convección (CED).

3. El uso de los compuestos terapéuticos primero y segundo en la fabricación de medicamentos primero y segundo para uso en un procedimiento para tratar la Enfermedad de Parkinson, en el que el compuesto primero comprende viriones de virus adeno asociado recombinante (rAAV) que comprenden un transgen que codifica una descarboxilasa de aminoácido aromático (AADC) para administrar en la cavidad craneana y en el que dicho compuesto segundo comprende L-dopa para uso oral, en el que se administra solo un transgen.

4. El uso de la reivindicación 3, en el que la administración en la cavidad craneana se realiza por medio de administración potenciada por convección usando una bomba osmótica o una bomba de infusión.

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 en el que la administración es en el striatum.