DE69929600T2 - Konvektion-erhöhte verabreichung aadc-kodierende aav vektoren - Google Patents

Konvektion-erhöhte verabreichung aadc-kodierende aav vektoren Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die effiziente Zufuhr viraler Vektoren zum ZNS. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Gentherapie für die Behandlung von Störungen des Zentralnervensystems (ZNS), insbesondere denjenigen Störungen, die den Neurotransmitter Dopamin involvieren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • ZNS-Störungen sind wichtige Punkte der öffentlichen Gesundheit. Allein die Parkinsonsche Erkrankung (PD) betrifft bereits über 1 Million Menschen in den Vereinigten Staaten. Klinisch ist PD durch eine Abnahme der spontanen Bewegungen, Schwierigkeiten beim Gehen, Instabilität der Haltung, Rigidität und Tremor gekennzeichnet. Die Parkinsonsche Erkrankung wird durch eine Degeneration der pigmentierten Neuronen in der Substantia nigra des Gehirns ausgelöst, was zu einer verminderten Dopaminverfügbarkeit führt. Ein veränderter Dopaminstoffwechsel wurde auch bei schizophrenen Patienten impliziert, die erhöhte Dopaminniveaus in bestimmten Bereichen des Gehirns zeigen.
  • Gegenwärtig werden viele ZNS-Störungen wie PD durch systemische Verabreichung eines Therapeutikums behandelt. Die systemische Verabreichung ist jedoch häufig ineffizient, da das Arzneimittel nicht durch die Blut-Hirn-Schranke passieren kann und da viele Arzneimittel zu peripheren Nebenwirkungen führen. So können viele potenziell nützliche Verbindungen wie Proteine nicht systemisch verabreicht werden. Wenn diese Verbindungen beim Penetrieren der Blut-Hirn-Schranke erfolgreich sind, können sie auch zusätzlich zentral nervöse Nebenwirkungen induzieren. Die Behandlung von PD involviert gegenwärtig die orale Verabreichung des Dopaminvorläufers L-Dopa, häufig in Kombination mit einer Verbindung wie Carbidopa, einem peripheren Inhibitor des Enzyms aromatische Aminosäuredecarboxylase (AADC), die Dopa zu Dopamin decarboxyliert. Bei einer Vielzahl von Patienten ist die Produktion von AADC in den betroffenen Gehirnregionen reduziert, wenn PD fortschreitet und dementsprechend werden größere und größere Dosierungen an L-Dopa notwendig, was für den Patienten reduzierte therapeutische Nutzen und erhöhte Nebenwirkungen bedeutet.
  • Im Hinblick auf die Begrenzungen der gegenwärtigen systemischen Therapien ist die Genzufuhr ein vielversprechendes Verfahren für die Behandlung von ZNS-Störungen wie PD. Eine Anzahl von auf Virus basierenden Systemen für Gentransferzwecke wurden beschrieben, wie z.B. retrovirale Systeme, die gegenwärtig die am häufigsten verwendeten viralen Vektorsysteme für diesen Zweck sind. Für Beschreibungen verschiedener retroviraler Systeme siehe z.B. US-Patent 5,219,740; Miller und Rosman (1989) BioTechniques 7:980–990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5–14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849–852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033–8037 und Boris-Lawrie und Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102–109.
  • Adeno-assoziierte Virus (AAV) -Systeme erweisen sich als die führenden Kandidaten zur Verwendung in der Gentherapie. AAV ist ein helferabhängiger DNA-Parvovirus, der zur Gattung Dependovirus gehört. AAV benötigt eine Infektion mit einem nicht verwandten Helfervirus, entweder einem Adenovirus, einem Herpesvirus oder Vaccinia, um zu einer produktiven Infektion zu führen. Das Helfervirus stellt akzessorische Funktionen bereit, die für die meisten Schritte der AAV-Replikation notwendig sind. Für einen Überblick über AAV siehe z.B. Berns und Bohenzky (1987) Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32: 243–307.
  • AAV infiziert einen breiten Bereich von Geweben und hat nicht die cytotoxischen Wirkungen oder nachteilige Immunreaktionen in Tiermodellen hervorgerufen, die bei anderen viralen Vektoren beobachtet werden (siehe z.B. Muzyczka, (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97–129; Flotte et al. (1993) PNAS USA 90:10613–10617; Kasseiser et al. (1992) Gene Therapy 1:395–402; Yange et al. PNAS USA 91:4407–4411; Conrad et al. (1996) Gene Therapy 3:658–668; Yang et al. (1996) Gene Therapy 3:137–144; Brynes et al. (1996) J.Neurosci. 16:3045–3055). Da AAV sich nicht teilende Gewebe transduzieren kann, kann es gut an die Zufuhr von Genen zum Zentralnervensystem (ZNS) angepasst werden. Das US-Patent 5,677,158 beschrieb Verfahren zur Herstellung von AAV-Vektoren. AAV-Vektoren, die therapeutische Gene unter der Kontrolle des Zytomegalievirus (CMV) -Promotors enthielten, zeigten erwiesenermaßen eine Transduktion des Säugergehirns und funktionale Wirkungen in Modellen der Erkrankung.
  • AAV-Vektoren, die Transgene tragen, wurden z.B. in Kaplitt et al. (1994) Nature Genetics 8:148–153; WO 95/28493, veröffentlicht am 26. Oktober 1995; WO 95/34670, veröffentlicht am 21. Dezember 1995; During et al., (1998) Gene Therapy 5:820–827; Mandel et al. (1998) J. Neurosci. 18:4271–4284; Szczypka et al. (1999) Neuron 22:167–178) beschrieben. Die Zufuhr von AAV-Vektoren zum ZNS hat sich jedoch als schwierig erwiesen. AAV wurde verwendet, um das Thymidin (tk) -Kinasegen zu experimentellen Gliomas in Mäusen zu transferieren und die Fähigkeit von AAV-tk, diese Gehirntumoren gegenüber cytoziden Wirkungen von Ganciclovir empfindlich zu machen, wurde demonstriert. Okada et al. (1996) Gene Therapy 3:959–964; Mizuno et al. (1998) Jpn. J. Cancer Res. 89:76–80. Die Infusion eines AAV-CMV-Vektors, enthaltend das menschliche Tyrosinhydroxylase (TH) -Gen, ein Enzym, das an der Umwandlung der Aminosäure Tyrosin in Dopa beteiligt ist, in das Gehirn erwachsener Ratten führte zu einer Transduktion von sowohl Neuronen als auch Gliazellen (Kaplitt et al. (1995) VIRAL VECTORS, GENE THERAPY AND NEUROSCIENCE APPLICATIONS, Kaplitt und Loewy Hrsg., 12:193–210, Academic Press, San Diego; Bankiewicz et al. (1997) Exper. Neurol. 144:147–156). Die Zufuhr desselben Vektors zu dem Striatum von Affen führte zu einer robusten Expression von TH für bis zu 2,5 Monate (During et al., supra). Weiterhin wurde AAV-CMV-TH in einem Nagermodell der Parkinsonschen Erkrankung getestet, wo es zu einer signifikanten Verbesserung des Rotationsverhaltens von 6-Hydroxydopamin-läsionierten Ratten führte (Fan et al. (1998) Human Gene Therapy 9:2527–2537; Mandel et al. (1997) PNAS USA 94: 14083–14088).
  • Während Berichte wie diese zwar demonstrieren, dass AAV ein Potenzial zum Abzielen auf das ZNS hat, demonstrieren sie auch, dass die direkte Injektion von AAV-Vektoren in das ZNS zu einer begrenzten Zahl transfizierter Zellen führt und dass die transfizierten Zellen als Cluster in einem engen Bereich nahe den Injektionsleitungen angeordnet sind (siehe z.B. During et al, supra; Fan et al., supra). Da multiple Injektionen in das ZNS zu unerwünschten Komplikationen führen, verbleibt ein Bedarf an Verfahren für eine Zufuhr von AAV-Vektoren zu größeren Gehirnbereichen unter Verwendung der geringsten Anzahl von Injektionsstellen. Zusätzlich wurde auch noch nicht über eine Beziehung zwischen der Dosis von injiziertem Vektor und seiner resultierenden Verteilung im Gehirngewebe berichtet.
  • Weiterhin hat sich die Gentherapie von PD auf die Zufuhr von mindestens zwei Genen fokussiert, kodierend Enzyme, die an der Dopaminsynthese beteiligt sind, nämlich TH und AADC. Diese Verfahren unterliegen alle den oben diskutierten Zufuhrproblemen und benötigen zusätzlich die Expression beider Gene in geeigneten Mengen. So wurde eine Behandlung von PD unter Verwendung von AAV-AADC in Kombination mit L-Dopa noch nicht demonstriert.
  • Zusammenfassuag der Erfindung
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von rekombinanten AAV (rAAV) -Virions bereit, die ein Transgen tragen zur Zufuhr zu dem zentralen Nervensystem (ZNS) eines Subjekts, z.B, eines Menschen, wobei konvektionsverstärkte Zufuhr (CED) verwendet wird. Die CED kann z.B. unter Verwendung entweder einer osmotischen oder einer Infusionspumpe durchgeführt werden. Das Transgen kodiert eine aromatische Aminosäuredecarboxylase (AADC) oder ein aktives Fragment davon. Es wird bevorzugt, die rAAV-Virions in das Striatum des ZNS zu verabreichen.
  • Gemäß einem anderen Aspekt offenbart die Erfindung die Zufuhr rekombinanter AAV-Virions zu einem Subjekt mit einer ZNS-Störung. Die rAAV-Virions kodieren ein geeignetes therapeutisches Polypeptid und werden in das ZNS des Subjekts unter Verwendung von CED verabreicht. Die ZNS-Störung ist die Parkinsonsche Erkrankung (PD), die rAAV-Virions werden in das Striatum des ZNS verabreicht und die Nukleinsäuresequenz kodiert AADC.
  • Eine Präparation rekombinanter Adeno-assoziierter Virus (rAAV) -Virions, die eine therapeutische Nukleinsäuresequenz tragen, die in transduzierten Zellen exprimierbar ist, ist für die Verabreichung an das ZNS unter Verwendung der konvektionsverstärkten Zufuhr (CED) gedacht. Die neurodegenerative Erkrankung ist PD und das therapeutische Polypeptid ein AADC. Das Medikament für die Behandlung der neurodegenerativen Erkrankung beinhaltet auch mindestens eine zusätzliche therapeutische Verbindung für das Subjekt, d.h. L-Dopa für die orale Verwendung und optional Carbidopa.
  • In noch einem weiteren Aspekt werden Verfahren für die Bestimmung von Niveaus der Dopaminaktivität im ZNS des Subjekts offenbart. Ein markierter Tracer wird dem Subjekt verabreicht. Der Tracer ist vorzugsweise eine Verbindung, die an eine Zelle bindet, die Dopamin verwendet und die Markierung ist vorzugsweise ein Radioisotop, z.B. 6-[18F]-Fluor-L-m-tyrosin (18F-FMT). Der Nachweis der Markierung ist für die Dopaminaktivität durch die Bindung des Tracers Indikativ. Vorzugsweise wird das ZNS des Subjekts abgebildet, z.B. unter Verwendung eines Positronen-Emissionstomographie (PET) -Scannings.
  • Die Verwendung erster und zweiter therapeutischer Verbindungen bei der Herstellung erster und zweiter Medikamente für die Behandlung der Parkinsonschen Erkrankung, worin das erste Medikament rekombinante AAV (rAAV) -Virions umfasst, umfassend ein Transgen, kodierend AADC, wobei das erste Medikament dem Subjekt durch konvektionsverstärkte Zufuhr (CED) verabreicht werden soll und wobei das zweite Medikament L-Dopa umfasst, das dem Subjekt systemisch, d.h. oral verabreicht werden soll, wird ebenfalls bereitgestellt.
  • Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann auf dem Gebiet unter Betrachtung der hier zur Verfügung gestellten Offenbarung sofort ins Auge fallen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1, Grafiken a bis d zeigen Dosisreaktionen (Expression des AAV-tk-Transgens) bei der Ratte, folgend auf eine intrakraniale Infusionspumpenzufuhr. Das Gewebevolumen (1a); der mittlere Bereich (1b); die Länge (1c) und die Zahl der Zellen (1d), die das Transgen exprimieren, sind angegeben.
  • 2 ist eine Halbtonreproduktion, die die Markierung von Rattengehirngewebe nach Injektion von AAV-Vektoren darstellt.
  • 3, Darstellungen a bis d zeigen die intrakraniale Zufuhr von AAV-tk entweder über eine Infusionspumpe (IP) oder eine osmotische Pumpe (OP). Das Gewebevolumen (3a); der mittlere Bereich (3b); die Länge (3c) und die Zahl der Zellen (3d), die das Transgen exprimieren, sind dargestellt. Die 4a, 4b, 4c und 4d sind Halbtonreproduktionen, die das ZNS-Gewebe, infundiert mit einem Vektor, der das tk-Transgen trägt, darstellen. Die 4a und b zeigen die Expression von tk in Neuronen. Die 4c und d zeigen die Expression in Neuronen und Gliazellen nahe der Stelle der osmotischen Pumpeninfusion.
  • 5 ist eine Halbtonreproduktion, die eine Southern Blot-Analyse von Geweben von einem Subjekt darstellt, dem der AAV-tk-Vektor infundiert wurde.
  • 6 zeigt eine Immunfärbung für AADC von Gehirnen von MPTP-läsionierten Affen. Die linke Seite (Kontrolle) zeigt eine begrenzte Färbung, während die rechte Seite (AAV-AADC-behandelt) eine breite RADC-Immunfärbung zeigt.
  • 7 ist ein FMT PET-Scan, der die Dopaminaktivität im Gehirn von unilateral MPTP-läsionierten Affen darstellt. Die linke Seite (Basislinie) zeigt eine limitierte Aktivität auf der läsionierten Seite, während die rechte Seite (8 Wochen nach der AAV-AADC-Verabreichung) normale Niveaus einer Dopaminaktivität zeigt.
  • 8 Darstellungen A bis C zeigen eine biochemische Analyse der L-Dopaniveaus bei MPTP-läsionierten Affen. Darstellung A zeigt, dass L-Dopa in Dopamin durch das AADC-Enzym umgewandelt wird. In den kortikalen Regionen gibt es unabhängig von der MPTP-Behandlung schlechte oder keine Umwandlung von L-Dopa zu Dopamin. Das Striatum ist AADC-reich, daher wurde das meiste des L-Dopa in diesem Bereich in Dopamin umgewandelt. Im Striatum, ipsilateral zu der MPTP-Verabreichung, ist die L-Dopa-Umwandlung zu Dopamin beeinträchtigt und ähnlich zu der kortikalen Aktivität bei AAV-LacZ-behandelten Affen. Beide AAV-AADC-behandelten Tiere zeigen fast normale Raten einer L-Dopa-zu-Dopamin-Umwandlung. B zeigt die HVA-Analyse. HVA ist ein Metabolit des Dopamin-Katabolismus. Da die kortikalen Regionen nicht dazu in der Lage sind, L-Dopa zu Dopamin umzuwandeln, sind die HVA-Niveaus niedrig. Wie in A dargestellt, wird im Striatum L-Dopa zu Dopamin umgewandelt, daher wird Dopamin zu HVA in diesem Bereich katabolisiert. Da die AADC-Aktivität in den AAV-LacZ-behandelten Affen nicht wieder hergestellt wurde, sind die HVA-Niveaus im MTPT-ipsilateralen Striatum niedrig. Die HVA-Niveaus sind bei AAV-AADC-behandelten Affen im MPTP-ipsilateralen Striatum signifikant erhöht. C zeigt L-Dopa-Niveaus, die in Gewebeausstanzungen gemessen wurden, folgend auf eine L-Dopa-Verabreichung. Aufgrund der unterschiedlichen L-Dopa-Absorption differieren die Gewebeniveaus unter den Affen. Sie sind jedoch innerhalb jedes Subjekts ähnlich. Die Gewebeniveaus von L-Dopa waren dramatisch im MPTP-ipsilateralen Striatum von AAV-AADC-behandelten Affen reduziert, da das AADC-Enzym wiederhergestellt worden war. Die Aktivität von AADC in diesem Bereich ist sehr stark, da die Gewebeniveaus von L-Dopa niedriger sind als im kontralateralen Striatum.
  • 9 ist eine Grafik, die die Aktivität des AADC-Enzyms in vitro darstellt. Gewebeausstanzungen wurden mit L-Dopa, wie in Material und Methoden beschrieben, inkubiert. Die AADC-Enzymaktivität wurde durch Messung der Raten von L-Dopa zu Dopaminumwandlung bestimmt. Kortikale Bereiche enthalten niedrige Niveaus an AADC. Die AADC-Aktivität im kontralateralen Striatum ist hoch, ist jedoch variabel, da es etwa dopaminerge Läsion auf dieser Seite des Gehirns gibt. Die AADC-Aktivität im MPTP-ipsilateralen Striatum ist bei AAV-Lac-Z-behandelten Affen signifikant reduziert, während sie bei den AAV-AADC-Affen vollständig wiederhergestellt ist.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • In der Praxis der vorliegenden Erfindung werden, falls nicht anders angegeben, konventionelle Verfahren der Virologie, Mikrobiologie, Molekularbiologie und der rekombinanten DNA-Verfahren innerhalb des Fachgebiets verwendet. Solche Techniken werden in der Literatur vollständig erklärt. Siehe z.B. Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (gegenwärtige Ausgabe); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. Hrsg., gegenwärtige Ausgabe); DNA Cloning: A Practical Approach, Band I & II (D. Glover, Hrsg.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Hrsg., gegenwärtige Ausgabe); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Hrsg., gegenwärtige Ausgabe); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Hrsg., gegenwärtige Ausgabe); CRC Handbook of Parvoviruses, Band I & II (P. Tijessen, Hrsg.); Fundamental Virology, 2. Ausgabe, Band I & 11 (B. N. Fields und D. M. Knipe, Hrsg.).
  • Wie in dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet, beinhalten die Singularformen "ein", "eine", "einer" und "der, die, das" Pluralreferenzen, wenn nicht der Inhalt deutlich anderes aussagt.
  • Definitionen
  • Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Bezeichnungen verwendet und sollen wie unten angegeben, definiert werden.
  • "Gentransfer" oder "Genzufuhr" bezieht sich auf Verfahren oder Systeme für eine verlässliche Insertion von Fremd-DNA in Wirtszellen. Solche Verfahren können zu einer transienten Expression nicht-integrierter transferierter DNA, extrachromosomaler Replikation und Expression transferierter Replikons (z.B. Episomen) oder Integration von transferiertem genetischem Material in die genomische DNA der Wirtszellen führen. Der Gentransfer stellt einen einzigartigen Ansatz für die Behandlung von erworbenen und ererbten Erkrankungen bereit. Eine Anzahl von Systemen wurde für den Gentransfer in Säugerzellen entwickelt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,399,346.
  • Unter "Vektor" wird jedes genetische Element verstanden, wie z.B. ein Plasmid, ein Phage, ein Transposon, ein Cosmid, ein Chromosom, ein Virus, ein Virion usw., das zu einer Replikation in der Lage ist, wenn es mit den geeigneten Kontrollelementen assoziiert ist und das Gensequenzen zwischen Zellen transferieren kann. So beinhaltet die Bezeichnung Klonierungs- und Expressionsvehikel, wie auch virale Vektoren.
  • Unter "rekombinantem Virus" wird ein Virus verstanden, das genetisch verändert wurde, z.B. durch Addition oder Insertion heterologer Nukleinsäurekonstrukte in den Partikel.
  • Unter "AAV-Virion" wird ein vollständiges Viruspartikel verstanden, wie z.B. ein Wildtyp (wt) -AAV-Viruspartikel (umfassend ein lineares, einzelsträngiges AAV-Nukleinsäuregenom, assoziiert mit einer AAV-Capsidproteinhülle). In diesem Hinblick können einzelsträngige AAV-Nukleinsäuremoleküle von jedem komplementären Sinn, z.B. "Sinn"- oder "Antisinn"-Stränge in irgendein AAV-Virion verpackt werden und beide Stränge sind gleich infektiös.
  • Ein "rekombinantes AAV-Virion" oder "rAAV-Virion" wird hier als infektiöses, replikationsdefektes Virus definiert, bestehend aus einer AAV-Proteinhülle, die eine heterologe Nukleotidsequenz von Interesse verkapselt, flankiert auf beiden Seiten durch AAV ITRs. Ein rAAV-Virion wird in einer geeigneten Wirtszelle erzeugt, in die ein AAV-Vektor, AAV-Helferfunktionen und akzessorische Funktionen eingeführt wurden. Auf diese Weise wird die Wirtszelle befähigt, AAV-Polypeptide zu kodieren, die für eine Verpackung des AAV-Vektors (enthaltend eine rekombinante Nukleotidsequenz von Interesse) in infektiöse rekombinante Virionpartikel für die darauffolgende Genzufuhr nötig sind.
  • Die Bezeichnung "Transfektion" wird verwendet, um sich auf die Aufnahme von Fremd-DNA durch eine Zelle zu beziehen und eine Zelle wurde "transfiziert", wenn exogene DNA über die Zellmembran eingeführt wurde. Eine Anzahl von Transfektionstechniken sind allgemein auf dem Gebiet bekannt. Siehe z.B. Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier und Chu et al. (1981) Gene 13:197. Solche Techniken können verwendet werden, um ein oder mehr exogene DNA-Bestandteile einzuführen, wie z.B. einen Nukleotidintegrationsvektor und andere Nukleinsäuremoleküle, und zwar in die geeigneten Wirtszellen.
  • Die Bezeichnung "Wirtszelle" bezeichnet z.B. Mikroorganismen, Hefezellen, Insektenzellen und Säugerzellen, die als Empfänger eines AAV-Helferkonstrukts, eines AAV-Vektorplasmids, eines akzessorischen Funktionsvektors oder einer anderen Transfer-DNA verwendet werden können oder verwendet wurden. Die Bezeichnung beinhaltet die Nachkommenschaft der ursprünglichen Zelle, die transfiziert wurde. So betrifft eine "Wirtszelle", wie hier verwendet, allgemein eine Zelle, die mit einer exogenen DNA-Sequenz transfiziert wurde. Es wird verstanden, dass die Nachkommenschaft einer einzelnen Elternzelle nicht notwendigerweise vollständig im Hinblick auf Morphologie oder genomische oder Gesamt-DNA-Komplement zu der ursprünglichen Elternzelle identisch sein muss, aufgrund natürlicher, zufälliger oder beabsichtigter Mutationen.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Zelllinie" auf eine Population von Zellen, die zu einem kontinuierlichen oder verlängerten Wachstum und einer Teilung in vitro in der Lage sind. Häufig sind Zelllinien Klonpopulationen, abstammend von einer einzelnen Vorläuferzelle. Es ist weiter auf dem Gebiet bekannt, dass spontane oder induzierte Veränderungen im Karyotyp während der Lagerung oder dem Transfer solcher Klonpopulationen auftreten können. Daher müssen Zellen, abstammend von der in Bezug genommenen Zelllinie nicht mit den Vorläuferzellen oder Kulturen präzise identisch sein und die in Bezug genommene Zelllinie beinhaltet solche Varianten.
  • Die Bezeichnung "heterolog", wenn sie Nukleinsäuresequenzen wie kodierende Sequenzen und Kontrollsequenzen betrifft, bezeichnet Sequenzen, die normalerweise nicht miteinander verbunden sind und/oder normalerweise nicht mit einer bestimmten Zelle assoziiert sind. So ist eine "heterologe" Region eines Nukleinsäurekonstrukts oder eines Vektors ein Segment einer Nukleinsäure innerhalb oder angebunden an ein anderes Nukleinsäuremolekül, das in der Natur nicht in Assoziation mit dem anderen Molekül angetroffen wird. Zum Beispiel könnte ein heterologer Bereich eines Nukleinsäurekonstrukts eine kodierende Sequenz beinhalten, flankiert von Sequenzen, die in der Natur nicht in Assoziation mit der kodierenden Sequenz angetroffen werden. Ein anderes Beispiel einer heterologen kodierenden Sequenz ist ein Konstrukt, wobei die kodierende Sequenz selbst nicht in der Natur angetroffen wird (z.B. synthetische Sequenzen mit Kodons, die sich vom nativen Gen unterscheiden). Ähnlich würde eine Zelle, transformiert mit einem Konstrukt, das normalerweise nicht in der Zelle vorliegt, als heterolog für die Zwecke dieser Erfindung angesehen werden. Allelvariationen oder natürlich auftretende Mutationsereignisse führen nicht zu einer heterologen DNA, wie hier verwendet.
  • Eine "kodierende Sequenz" oder eine Sequenz, die ein bestimmtes Protein "kodiert" ist eine Nukleinsäuresequenz, die in ein Polypeptid in vitro oder in vivo transkribiert (im Fall der DNA) oder translatiert (im Fall der mRNA) wird, wenn sie sich unter Kontrolle der geeigneten regulatorischen Sequenzen befindet. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Startkodon am 5'-(Amino)ende und ein Translations-Stopkodon am 3'-(Carboxy)ende bestimmt. Kodierende Sequenzen können eine cDNA von einer prokaryontischen oder eukaryontischen mRNA, genomische DNA-Sequenzen von prokaryontischer oder eukaryontischer DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen sein, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. Eine Transkriptions-Terminationssequenz wird in der Regel 3' zur Kodierungssequenz lokalisiert sein.
  • Eine "Nukleinsäuresequenz" bezieht sich auf eine DNA- oder RNA-Sequenz. Die Bezeichnung umfasst Sequenzen, die alle bekannten Basenanaloge von DNA und RNA beinhalten, wie z.B. 4-Acetylcytosin, 8-Hydroxy-N6-methyladenosin, Aziridinylcytosin, Pseudoisocytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methyladenin, 1-Methylpseudouracil, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Methyladenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarbonylmethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure-methylester, Uracil-5-oxyessigsäure, Oxybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, N-Uracil-5-oxyessigsäure-methylester, Uracil-5-oxyessigsäure, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin und 2,6-Diaminopurin, ist jedoch nicht hierauf begrenzt.
  • Die Bezeichnung DNA-"Kontrollsequenzen" bezieht sich kollektiv auf Promotorsequenzen, Polyadenylierungssignale, Transkriptions-Terminationssequenzen, stromaufwärts gelegene regulatorische Domänen, Replikationsursprünge, innere Ribosomeneingangsstellen ("IRES"), Enhancer und ähnliche, die kollektiv die Replikation, Transkription und Translation einer kodierenden Sequenz in einer Empfängerzelle ermöglichen. Nicht alle diese Kontrollsequenzen müssen immer vorliegen, solange die gewählte kodierende Sequenz zu einer Replikation, Transkription und Translation in einer geeigneten Wirtszelle in der Lage ist.
  • Die Bezeichnung "Promotorregion" wird hier in ihrem üblichen Sinn verwendet, um sich auf eine Nukleotidregion zu beziehen, umfassend eine DNA-regulatorische Sequenz, wobei die regulatorische Sequenz von einem Gen abgeleitet ist, das zu einer Bindung der RNA-Polymerase und einer Initiation der Transkription einer stromabwärts (3'-Richtung) gelegenen kodierenden Sequenz in der Lage ist.
  • "Operabel gebunden" bezieht sich auf eine Anordnung von Elementen, worin die so beschriebenen Komponenten so konfiguriert sind, dass sie ihre übliche Funktion ausüben. So sind Kontrollsequenzen, die operabel an eine kodierende Sequenz gebunden sind, dazu in der Lage, die Expression der kodierenden Sequenz zu bewirken. Die Kontrollsequenzen müssen zu der kodierenden Sequenz nicht benachbart liegen, solange sie ihre Expression bewirken können. So können z.B. intervenierende, nicht-translatierte, jedoch transkribierte Sequenzen zwischen einer Promotorsequenz und der kodierenden Sequenz vorliegen und die Promotorsequenz kann immer noch als "operabel gebunden" an die kodierende Sequenz angesehen werden.
  • Unter "isoliert" unter Bezugnahme auf eine Nukleotidsequenz wird verstanden, dass das angegebene Molekül in substanzieller Abwesenheit anderer biologischer Makromoleküle derselben Art vorliegt. So bezieht sich ein "isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein bestimmtes Polypeptid kodiert" auf ein Nukleinsäuremolekül, das im wesentlichen von anderen Nukleinsäuremolekülen frei ist, die das betroffene Polypeptid nicht kodieren; das Molekül kann jedoch einige zusätzliche Basen oder Bestandteile beinhalten, die die grundlegenden Eigenschaften der Zusammensetzung nicht nachteilig beeinflussen.
  • Zum Zweck der Beschreibung der relativen Position der Nukleotidsequenzen in einem bestimmten Nukleinsäuremolekül durch die vorliegende Anmeldung, wenn z.B. eine bestimmte Nukleotidsequenz als "stromaufwärts", "stromabwärts" oder "3"' oder "5"' relativ zu einer anderen Sequenz beschrieben wird, sollte verstanden werden, dass dies die Position der Sequenzen im "Sinn" oder "kodierenden" Strang des DNA-Moleküls ist, auf das Bezug genommen wird, wie konventionell auf dem Gebiet.
  • Ein "Gen" bezieht sich auf ein Polynukleotid, das mindestens einen offenen Leserahmen enthält, der dazu in der Lage ist, ein bestimmtes Polypeptid oder Protein nach Transkription oder Translation zu kodieren. Alle hier beschriebenen Polynukleotidsequenzen können verwendet werden, um größere Fragmente oder Gesamtlängen kodierende Sequenzen der Gene, mit denen sie assoziiert sind, zu identifizieren. Verfahren zur Isolation größerer Fragmentsequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
  • Zwei Nukleinsäurefragmente werden als "selektiv hybridisierend", wie hier beschrieben, betrachtet. Der Grad der Sequenzidentität zwischen zwei Nukleinsäuremolekülen beeinflusst die Effizienz und Stärke der Hybridisierungsereignisse zwischen solchen Molekülen. Eine teilweise identische Nukleinsäuresequenz wird zumindest teilweise eine vollständig identische Sequenz an einer Hybridisierung an ein Zielmolekül hindern. Eine Inhibition der Hybridisierung der vollständig identischen Sequenz kann unter Verwendung von Hybridisierungsassays, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind (z.B. Southern Blot, Northern Blot, Lösungshybridisierung oder ähnliches, siehe Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.) bewertet werden. Solche Assays können unter Verwendung verschiedener Grade der Selektivität durchgeführt werden, z.B. unter Verwendung von Bedingungen, die von niedriger bis hoher Stringens variieren. Wenn Bedingungen einer niedrigen Stringens verwendet werden, kann die Abwesenheit einer nicht-spezifischen Bindung unter Verwendung einer sekundären Sonde bewertet werden, der selbst ein teilweiser Grad einer Sequenzidentität fehlt (z.B. eine Sonde, die weniger als ungefähr 30 % Sequenzidentität mit dem Zielmolekül aufweist), so dass in Abwesenheit von nichtspezifischen Bindungsereignissen die sekundäre Sonde nicht mit dem Ziel hybridisieren wird.
  • Wenn ein auf Hybridisierung basierendes Nachweissystem verwendet wird, wird eine Nukleinsäuresonde gewählt, die zu einer Ziel-Nukleinsäuresequenz komplementär ist und dann können durch Selektion geeigneter Bedingungen die Sonde und die Zielsequenz "selektiv hybridisieren" oder aneinander binden, um ein Hybridmolekül zu bilden. Ein Nukleinsäuremolekül, das dazu in der Lage ist, an eine Zielsequenz unter "moderat-stringenten" Bedingungen selektiv zu hybridisieren, hybridisiert typischerweise unter Bedingungen, die einen Nachweis einer Ziel-Nukleinsäuresequenz von mindestens ungefähr 10 bis 14 Nukleotiden in der Länge mit mindestens ungefähr 70 % Sequenzidentität mit der Sequenz der gewählten Nukleinsäuresonde aufweisen. Stringente Hybridisierungsbedingungen ermöglichen typischerweise einen Nachweis von Ziel-Nukleinsäuresequenzen mit mindestens ungefähr 10 bis 14 Nukleotiden in der Länge mit einer Sequenzidentität von mehr als ungefähr 90 bis 95 % mit der Sequenz der gewählten Nukleinsäuresonde. Hybridisierungsbedingungen, die für eine Sonden-/Ziel-Hybridisierung geeignet sind, wobei Sonde und Ziel einen spezifischen Grad an Sequenzidentität aufweisen, können, wie auf dem Gebiet bekannt, bestimmt werden (siehe z.B. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Herausgeber B.D. Hames und S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).
  • Im Hinblick auf die Stringensbedingungen für die Hybridisierung ist es auf dem Gebiet wohlbekannt, dass etliche äquivalente Bedingungen verwendet werden können, um eine bestimmte Stringens zu etablieren, z.B. indem die folgenden Faktoren variiert werden: Länge und Art der Sonde und der Zielsequenzen, Basenzusammensetzung der verschiedenen Sequenzen, Konzentrationen von Salzen und anderen Hybridisierungslösungskomponenten, Gegenwart oder Abwesenheit von Blockierungsmitteln in den Hybridisierungslösungen (z.B. Formamid, Dextransulfat und Polyethylenglykol), Hybridisierungsreaktionstemperatur und Zeitparameter wie auch verschiedene Waschbedingungen. Die Selektion eines bestimmten Satzes von Hybridisierungsbedingungen wird gemäß Standardverfahren auf dem Gebiet gewählt (siehe z.B. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).
  • Die Bezeichnung "aromatische Aminosäure-Decarboxylase" oder "AADC" bezieht sich auf ein Polypeptid, das Dopa zu Dopamin decarboxyliert. So beinhaltet die Bezeichnung ein Gesamtlängen-AADC-Polypeptid, aktive Fragmente oder funktionale Homologe davon.
  • Ein "funktionales Homolog" oder ein "funktionales Äquivalent" eines gegebenen Polypeptids beinhaltet Moleküle, abgeleitet von den nativen Polypeptidsequenzen wie auch rekombinant erzeugte oder chemisch synthetisierte Polypeptide, die auf ähnliche Weise wie das Referenzmolekül wirken, um ein gewünschtes Ergebnis zu erreichen. So umfasst ein funktionales Homolog von AADC Derivate und Analoge dieser Polypeptide – einschließlich allen einzeln oder multiplen Aminosäureadditionen, Substitutionen und/oder Deletionen, die intern oder an den Amino- oder Carboxyenden davon auftreten – solange die Integrität der Aktivität bleibt.
  • Techniken zur Bestimmung der Nukleinsäure- und Aminosäure-"Sequenzidentität" oder "Homologie" sind ebenfalls auf dem Gebiet bekannt. Typischerweise beinhalten solche Techniken die Bestimmung der Nukleotidsequenz der mRNA für ein Gen und/oder die Bestimmung der dadurch kodierten Aminosäuresequenz und Vergleich dieser Sequenzen mit einer zweiten Nukleotid- oder Aminosäuresequenz. Im allgemeinen bezieht sich "Identität" auf eine exakte Nukleotid-zu-Nukleotid- oder Aminosäure-zu-Aminosäure-Korrespondenz von zwei Polynukleotid- bzw. Polypeptid-Sequenzen. Zwei oder mehr Sequenzen (Polynukleotid oder Aminosäure) können durch Bestimmung ihrer "Prozentidentität" verglichen werden. Die prozentuale Identität von zwei Sequenzen, ob Nuklein- oder Aminosäuresequenzen, ist die Zahl der exakten Paarungen zwischen zwei ausgerichteten Sequenzen, dividiert durch die Länge der kürzeren Sequenzen und multipliziert mit 100. Eine ungefähre Ausrichtung für Nukleinsäuresequenzen wird durch den lokalen Homologiealgorithmus von Smith und Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482–489 (1981) bereitgestellt. Dieser Algorithmus kann auf Aminosäuresequenzen unter Verwendung einer Bewertungsmatrix angewandt werden, entwickelt von Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff Hrsg., 5. Nachtrag 3:353–358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA und normalisiert von Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745–6763 (1986). Eine beispielhafte Implementation dieses Algorithmus zur Bestimmung der prozentualen Identität einer Sequenz wird von der Genetics Computer Group (Madison, WI) in der "BestFit"-Anwendung bereitgestellt. Die Defaultparameter für dieses Verfahren werden in dem Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995) (erhältlich von Genetics Computer Group, Madison, WI) beschrieben. Ein bevorzugtes Verfahren, um eine prozentuale Identität im Kontext der vorliegenden Erfindung zu etablieren, ist die Verwendung der MPSRCH-Packung von Programmen, Copyright Universität von Edinburgh, entwickelt von John F. Collins und Shane S. Sturrok und vertrieben von IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Aus dieser Reihe von Packungen kann der Smith-Waterman-Algorithmus verwendet werden, worin Default-Parameter für die Bewertungstabelle verwendet werden (z.B. offene Lückenstrafe (gap open penalty) von 12, Lückenverlängerungsstrafe (gap extension penalty) von eins und eine Lücke (gap) von sechs). Aus den erzeugten Daten reflektiert der "Match"-Wert die "Sequenzidentität". Andere geeignete Programme zur Berechnung der prozentualen Identität oder Ähnlichkeit zwischen Sequenzen sind auf dem Gebiet allgemein bekannt, z.B. ist ein weiteres Ausrichtungsprogramm das BLAST, verwendet mit Defaultparametern. Zum Beispiel können BLASTN und BLASTP unter Verwendung der folgenden Defaultparameter verwendet werden: genetischer Code = Standard; Filter = keiner; Strang = beide; Cutoff = 60; Erwartung = 10; Matrix = BLOSUM62; Beschreibungen = 50 Sequenzen; sortieren nach = HIGH SCORE; Datenbanken = nicht-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS Translationen + Swiss Protein + Spupdate + PIR. Details dieser Programme können unter der folgenden Internetadresse angetroffen werden:
    http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
  • Alternativ kann die Homologie durch Hybridisierung von Polynukleotiden unter Bedingungen bestimmt werden, unter denen stabile Duplexe zwischen homologen Regionen gebildet werden, gefolgt von einem Verdau mit einzelsträngiger spezifischer Nuklease (Nukleasen) und Größenbestimmung der verdauten Fragmente. Zwei DNA- oder zwei Polypeptidsequenzen sind "substantiell homolog" miteinander, wenn die Sequenzen mindestens ungefähr 80 bis 85 %, vorzugsweise mindestens ungefähr 90 % und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 95 bis 98 % Sequenzidentität über eine definierte Länge der Moleküle zeigen, wie bestimmt unter Verwendung der obigen Verfahren. Wie hier verwendet, betrifft substantiell homolog auch Sequenzen, die eine vollständige Identität zu der angegebenen DNA- oder Polypeptidsequenz zeigen. DNA-Sequenzen, die substantiell homolog sind, können in einem Southern-Hybridisierungexperiment z.B. unter stringenten Bedingungen identifiziert werden, wie für das bestimmte System definiert. Die Definition geeigneter Hybridisierungsbedingungen liegt im Wissen auf dem Gebiet. Siehe z.B. Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
  • Eine "konvektionsverstärkte Zufuhr" betrifft jede nicht manuelle Zufuhr von Mitteln. Im Kontext der vorliegenden Erfindung können Beispiele für eine konvektionsverstärkte Zufuhr (CED) von AAV durch Infusionspumpen oder osmotische Pumpen bewirkt werden.
  • Die Bezeichnung "Zentralnervensystem" oder "ZNS" beinhaltet alle Zellen und Gewebe des Gehirns und des Rückgrats von Vertebraten. So beinhaltet die Bezeichnung neuronale Zellen, Gliazellen, Astrozyten, Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), Interstitiumräume, Knochen, Knorpel und ähnliche, ist jedoch nicht hierauf begrenzt. Die "Kranialhöhle" bezieht sich auf den Bereich unterhalb des Schädels (Kranium). Bereiche des ZNS wurden mit verschiedenen Verhalten und/oder Funktionen assoziiert. Zum Beispiel wurden die Basalganglien des Gehirns mit motorischen Funktionen assoziiert, insbesondere der gewollten Bewegung.
  • Die Basalganglien bestehen aus sechs gepaarten Nuklei: dem Nucleus caudatus, dem Putanum, dem Globus pallidus (oder pallidum), dem Nucleus accumbens, dem Nucleus subthalamus und der Substantia nigra. Der Nucleus caudatus und das Putamen, obwohl durch die Capsula interna getrennt, teilen sich cytoarchiotektonische, chemische und physiologische Eigenschaften und werden häufig als Corpus striatum oder einfach "Striatum" bezeichnet. Die Substantia nigra, die bei Parkinson-Patienten degeneriert, stellt einen wesentlichen dopaminergen Input in die Basalganglien bereit.
  • Die Bezeichnungen "Subjekt", "Individuum" oder "Patient" werden austauschbar verwendet und betreffen einen Vertebraten, vorzugsweise einen Säuger. Säuger beinhalten Murine, Affen, Menschen, Bauernhoftiere, Sporttiere und Haustiere, sind jedoch nicht hierauf begrenzt.
  • Eine "effektive Menge" ist eine ausreichende Menge, um günstige oder gewünschte Ergebnisse zu bewirken. Eine effektive Menge kann in ein oder mehr Verabreichungen, Anwendungen oder Dosierungen verabreicht werden.
  • Die Bezeichnung "markierter Tracer" bezieht sich auf jedes Molekül, das verwendet werden kann, um eine definierte Aktivität in vivo zu verfolgen oder nachzuweisen, z.B. ist ein bevorzugter Tracer ein solcher, der an Zellen bindet, die Dopamin verwerten. Vorzugsweise ist der markierte Tracer ein solcher, der in einem vollständigen Tier beobachtet werden kann, z.B. durch Positronen-Emissionstomographie (PET) -Scanning oder andere ZNS-Abbildungsverfahren. Geeignete Marker beinhalten Radioisotope, Fluorochrome, chemilumineszierende Verbindungen, Farbstoffe und Proteine, einschließlich Enzymen, sind jedoch nicht hierauf begrenzt.
  • Allgemeiner Überblick über die Erfindung
  • Zentral für die vorliegende Erfindung ist die Entwicklung von Verfahren, die eine effiziente Zufuhr von viralen Vektoren, wie AAV, in das ZNS von Tieren ermöglichen. Früher hatten Forscher nur minimale Erfolge bei der Zufuhr viraler Vektoren zu breiteren Bereichen des Gehirns. Die Verwendung konvektionsverstärkter Zufuhrvorrichtungen (z.B. osmotischer oder Infusionspumpen) hat es ermöglicht, dass virale Vektoren zu vielen Zellen über große Bereiche des Gehirns zugeführt werden. Außerdem exprimieren die zugeführten Vektoren effizient Transgene in ZNS-Zellen (z.B. Neuronen oder Gliazellen).
  • Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren für eine virale Vektorzufuhr kann eine neue Gentherapiebehandlung für ZNS-Störungen (z.B. die Parkinsonsche Erkrankung) entwickelt werden. In einer Ausführungsform wird die Parkinsonsche Erkrankung (PD) durch Kombination von systemischem L-Dopa und/oder mit Carbidopatherapie mit einer ZNS-Verabreichung (z.B. über CED) von AAV-Vektoren kombiniert, die ein Transgen, kodierend AADC tragen, wobei es sich um ein Enzym handelt, das am Dopamin-Stoffwechsel beteiligt ist.
  • Vorteile der Erfindung beinhalten (i) eine effiziente und breit verteilte Zufuhr von viralen Vektoren (wie z.B. AAV) zum ZNS; (ii) die Expression von Nukleinsäuren (z.B.
  • Transgenen), die von den viralen Vektoren getragen werden; (iii) eine Identifizierung einer therapeutischen Behandlungsvorschrift für die Parkinson-Erkrankung, die die Zufuhr von einem Transgen in Kombination mit einer Verabreichung eines Prodrugs involviert und (iv) die Fähigkeit, die ZNS-Gentherapie unter Verwendung eines PET-Scans nicht invasiv zu überwachen.
  • Konstruktion viraler Vektoren
  • Genzufuhrvehikel, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können unter Verwendung von auf dem Gebiet der molekularen Biologie wohlbekannten Verfahren konstruiert werden (siehe z.B. Ausubel oder Maniatis, supra). Typischerweise werden virale Vektoren, die Transgene tragen, aus Polynukleotiden zusammengesetzt, die das Transgen (die Transgene) kodieren, außerdem geeigneten regulatorischen Elementen und Elementen, die für die Produktion viralen Proteine notwendig sind, die die Zelltransduktion vermitteln. Zum Beispiel werden in einer bevorzugten Ausführungsform Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren verwendet.
  • Allgemeine Verfahren
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Erhalt der Nukleotidkomponenten des viralen Vektors ist die PCR. Allgemeine PCR-Verfahren werden in MacPherson et al., PCR: A PRACTICAL APPROACH, (IRL Press at Oxford University Press, (1991)) gelehrt. PCR-Bedingungen für jede Anwendungsreaktion können empirisch bestimmt werden. Eine Anzahl von Parametern beeinflussen den Erfolg einer Reaktion. Unter diesen Parametern befinden sich die Anhaftungstemperatur und Zeit, die Verlängerungszeit, die Mg2+- und ATP-Konzentration, der pH und die relative Konzentration von Primern, Matrizen und Deoxyribonukleotiden. Beispielhafte Primer werden unten in den Beispielen beschrieben. Nach der Amplifikation können die resultierenden Fragmente durch Agarosegelelektrophorese, gefolgt von Sichtbarmachung mit Ethidiumbromidfärbung und Ultraviolettbestrahlung nachgewiesen werden.
  • Ein anderes Verfahren zum Erhalt von Polynukleotiden ist der enzymatische Verdau. Nukleotidsequenzen können beispielsweise durch Verdau geeigneter Vektoren mit geeigneten Restriktionserkennungsenzymen erzeugt werden. Die resultierenden Fragmente können dann in geeigneter Weise miteinander ligiert werden.
  • Polynukleotide werden in Vektorgenome unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind, inseriert. Zum Beispiel kann eine Insert- und Vektor-DNA unter geeigneten Bedingungen mit einem Restriktionsenzym kontaktiert werden, um komplementäre oder glatte Enden auf jedem Molekül zu erzeugen, die eine Paarung bilden können und mit einer Ligase verbunden werden. Alternativ können synthetische Nukleinsäurelinker an die Enden eines Polynukleotids ligiert werden. Diese synthetischen Linker können Nukleinsäuresequenzen enthalten, die zu einer bestimmten Restriktionsstelle in der Vektor-DNA korrespondieren. Andere Mittel sind auf dem Gebiet bekannt und stehen zur Verfügung.
  • Retrovirale und adenovirale Vektoren
  • Eine Anzahl von auf Viren basierenden Systemen wurden für die Genzufuhr verwendet. Zum Beispiel sind retrovirale Systeme bekannt und verwenden allgemein Verpackungslinien, die einen integrierten defekten Provirus (den "Helfer") aufweisen, der alle Gene des Virus exprimiert, jedoch sein eigenes Genom aufgrund einer Deletion des Verpackungssignals, bekannt als psi-Sequenz, nicht verpacken kann. So erzeugt die Zelllinie leere virale Hüllen. Erzeugerlinien können von den Verpackungslinien abgeleitet werden, die zusätzlich zu dem Helfer einen viralen Vektor enthalten, der Sequenzen beinhaltet, die in cis für die Replikation und Verpackung des Virus benötigt werden, bekannt als lange terminale Repeats (LTRs). Das Gen von Interesse kann in den Vektor inseriert und in den viralen Hüllen verpackt werden, die durch den retroviralen Helfer synthetisiert werden. Das rekombinante Virus kann dann isoliert und einem Subjekt zugeführt werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,219,740.). Repräsentative retrovirale Vektoren beinhalten Vektoren wie LHL-, N2-, LNSAL-, LSHL- und LHL2-Vektoren, beschrieben z.B. im US-Patent Nr. 5,219,740, wie auch Derivate dieser Vektoren, wie der hier beschriebene modifizierte N2-Vektor, sind jedoch nicht darauf begrenzt. Retrovirale Vektoren können unter Verwendung von Techniken konstruiert werden, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,219,740; Mann et al. (1983) Cell 33:153–159.
  • Auf Adenoviren basierende Systeme wurden für die Genzufuhr entwickelt und sind für eine Zufuhr gemäß den hier beschriebenen Verfahren geeignet. Menschliche Adenoviren sind doppelsträngige DNA-Viren, die durch eine rezeptorvermittelte Endozytose in die Zellen eintreten. Diese Viren sind insbesondere für eine Genzufuhr gut geeignet, da sie leicht zu züchten und zu manipulieren sind und da sie ein breites Wirtsspektrum in vitro und in vivo aufweisen. Zum Beispiel können Adenoviren menschliche Zellen vom hematopoetischen, lymphoiden und myeloiden Ursprung infizieren. Weiterhin infizieren Adenoviren ruhende wie auch sich replizierende Zielzellen. Anders als Retroviren, die sich ins Wirtsgenom integrieren, persistieren Adenoviren extrachromosomal und minimieren so die Risiken, die mit einer Insertionsmutagenese assoziiert sind. Das Virus wird einfach mit hohem Titer erzeugt und ist stabil, so dass es gereinigt und gelagert werden kann. Selbst in der replikationskompetenten Form führen Adenoviren nur zu einer Morbidität auf niedrigem Niveau und sind nicht mit menschlichen malignen Vorkommnissen assoziiert. Dementsprechend wurden Adenovirusvektoren entwickelt, die sich dieser Vorteile bedienen. Für eine Beschreibung von Adenovirusvektoren und ihre Verwendungen siehe z.B. Haj-Ahmad und Graham (1986) J. Virol. 57:267–274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911–5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717–729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933–940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51–58; Berner, K.L. (1988) BioTechniques 6:616–629; Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461–476.
  • AAV-Expressionsvektoren
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die viralen Vektoren AAV-Vektoren. Unter einem "AAV-Vektor" wird ein Vektor verstanden, abgeleitet von einem Adeno-assoziierten Virus-Serotyp, einschließlich und ohne Begrenzung AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7 usw. AAV-Vektoren können ein oder mehr AAV-Wildtyp-Gene aufweisen, die vollständig oder teilweise deletiert sind, vorzugsweise die rep- und/oder cap-Gene, erhalten sich jedoch funktionale flankierende ITR-Sequenzen. Funktionale ITR-Sequenzen sind für die Rettung, Replikation und Verpackung des AAV-Virions notwendig. So ist ein AAV-Vektor hier definiert, dass er mindestens diejenigen Sequenzen beinhaltet, die in cis für die Replikation und Verpackung (z.B. funktionale ITRs) des Virus benötigt werden. Die ITRs müssen nicht Wildtyp-Nukleotidsequenzen sein und können verändert sein, z.B. durch Insertion, Deletion oder Substitution von Nukleotiden, solange die Sequenzen die funktionale Rettung, Replikation und Verpackung bereitstellen.
  • AAV-Expressionsvektoren werden unter Verwendung bekannter Techniken konstruiert, um mindestens operational gebundene Komponenten in Richtung der Transkription, Kontrollelemente, einschließlich einer Transkriptionsinitiationsregion, die DNA von Interesse und eine Transkriptions-Terminationsregion bereitzustellen. Die Kontrollelemente werden so gewählt, dass sie in einer Säugerzelle funktional sind. Das resultierende Konstrukt, das die operativ gebundenen Komponenten enthält, ist (5' und 3') mit funktionalen AAV-ITR-Sequenzen gebunden.
  • Unter "Adeno-assoziierten Virus inversen terminalen Repeats" oder "AAV ITRs" werden die auf dem Gebiet bekannten Regionen verstanden, die an jedem Ende des AAV-Genoms angetroffen werden, die zusammen in cis als Ursprung der DNA-Replikation und als Verpackungssignale für das Virus wirken. AAV ITRs, zusammen mit dem AAV rep-kodierenden Bereich stellen eine effiziente Exzision und Rettung aus und Integration einer Nukleotidsequenz, zwischengelagert zwischen zwei flankierenden ITRs in das Säugerzellgenom bereit.
  • Die Nukleotidsequenzen von AAV ITR-Regionen sind bekannt. Siehe z.B. Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793–801; Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2. Ausgabe, (B. N. Fields and D. M. Knipe, Hrsg.) für die AAV-2-Sequenz. Wie hier verwendet, muss ein "AAV ITR" nicht die angegebene Wildtyp-Nukleotidsequenz aufweisen sondern kann verändert sein, z.B. durch Insertion, Deletion oder Substitution von Nukleotiden. Zusätzlich kann das AAV ITR von irgendeinem etlicher AAV-Serotypen abstammen, einschließlich ohne Begrenzung AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7 usw. Weiterhin müssen 5'- und 3'-ITRs, die eine gewählte Nukleotidsequenz in einem AAV-Vektor flankieren, nicht notwendigerweise identisch sein oder von demselben AAV-Serotyp oder Isolat abstammen, solange sie wie beabsichtigt funktionieren, d.h. ein Ausschneiden und eine Rettung der Sequenz von Interesse aus einem Wirtszellgenom oder Vektor ermöglichen und eine Integration der heterologen Sequenz in das Empfängerzellgenom ermöglichen, wenn AAV Rep Genprodukte in der Zelle vorliegen.
  • Zusätzlich können AAV ITRs von irgendwelchen etlicher AAV-Serotypen abstammen, einschließlich ohne Begrenzung AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV 5, AAVX7 usw. Weiterhin müssen 5'- und 3'-ITRs, die eine gewählte Nukleotidsequenz in einem AAV-Expressionsvektor flankieren, nicht notwendigerweise zu demselben AAV-Serotyp oder Isolat identisch sein oder von diesem abstammen, solange sie wie beabsichtigt funktionieren, d.h. eine Exzision und Rettung der Sequenz von Interesse aus einem Wirtszellgenom oder Vektor ermöglichen und die Integration des DNA-Moleküls in das Empfängerzellgenom ermöglichen, wenn die AAV Rep Genprodukte in der Zelle vorliegen.
  • Geeignete DNA-Moleküle zur Verwendung in AAV-Vektoren werden eine Größe von weniger als ungefähr 5 Kilobasen (kb) aufweisen und werden z.B. ein Gen beinhalten, das ein Protein kodiert, das bei einem Empfängersubjekt defekt ist oder fehlt oder ein Gen, das ein Protein kodiert, das eine gewünschte biologische oder therapeutische Wirkung (z.B. antibakterielle, antivirale oder Antitumorfunktion) aufweist. Bevorzugte DNA-Moleküle beinhalten diejenigen, die am Dopamin-Stoffwechsel beteiligt sind, z.B. AADC oder TH. AAV-AADC- und AAV-TH-Vektoren wurden z.B. in Bankiewicz et al. (1997) Exper't Neurol. 144:147–156; Fan et al. (1998) Human Gene Therapy 9:2527–2535 und der internationalen Veröffentlichung WO 95/28493, veröffentlicht am 26. Oktober 1995, beschrieben.
  • Die gewählte Nukleotidsequenz, wie z.B. AADC oder ein anderes Gen von Interesse, ist operabel an Kontrollelemente gebunden, die die Transkription oder Expression in dem Subjekt in vivo steuern. Solche Kontrollelemente können Kontrollsequenzen umfassen, die normalerweise mit dem gewählten Gen assoziiert sind. Alternativ können heterologe Kontrollsequenzen verwendet werden. Geeignete heterologe Kontrollsequenzen beinhalten allgemein diejenigen, die von Sequenzen abgeleitet sind, die Säuger- oder virale Gene kodieren. Beispiele beinhalten den SV40 frühen Promotor, den Maus-Brusttumorvirus-LTR-Promotor; den Adenovirus-Haupt-späten Promotor (Ad MLP); einen Herpes simplex-Virus (HSV) -Promotor, einen Zytomegalievirus (CMV) -Promotor, wie z.B. die CMV immediate early Promotorregion(CMVIE), einen Rous-Sarcom-Virus (RSV) -Promotor, synthetische Promotoren, Hybridpromotoren und ähnliche, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. Zusätzlich werden auch Sequenzen, abstammend von nicht-viralen Genen, wie dem murinen Metallothioneingen, hier Verwendung finden. Solche Promotorsequenzen sind kommerziell z.B. von Stratagene (San Diego, CA) erhältlich.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden sowohl heterologe Promotoren als auch andere Kontrollelemente, wie z.B. ZNS-spezifische und induzierbare Promotoren, Enhancer und ähnliches von besonderer Verwendung sein. Beispiele für heterologe Promotoren beinhalten den CMB-Promotor. Beispiele für ZNS-spezifische Promotoren beinhalten diejenigen, die aus Genen des myelinbasischen Proteins (MBP), gliafibrillären Säureproteins (GFAP) und Neuron spezifischer Enolase (NSE) isoliert wurden. Beispiele für induzierbare Promotoren beinhalten DNA-reaktive Elemente für Ecdyson, Tetracyclin, Hypoxie und Aufin.
  • Der AAV-Expressionsvektor, der das DNA-Molekül von Interesse beherbergt, gebunden durch AAV ITRs, kann durch direkte Insertion der gewählten Sequenz (Sequenzen) in ein AAV-Genom konstruiert werden, aus dem die Haupt-AAV offenen Leserahmen (ORFs) ausgeschnitten wurden. Andere Bereiche des AAV-Genoms können ebenfalls deletiert werden, solange ein ausreichender Teil der ITRs verbleibt, um eine Replikation und Verpackung zu ermöglichen. Solche Konstrukte können z.B. unter Verwendung von auf dem Gebiet gut bekannten Techniken entworfen werden, siehe z.B. US-Patent Nrn. 5,173,414 und 5,139,941; internationale Veröffentlichungen Nrn. WO 92/01070 (veröffentlicht am 23. Januar 1992) und WO 93/03769 (veröffentlicht am 4. März 1993); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988–3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533–539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97–129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793–801; Shelling und Smith (1994) Gene Therapy 1:165–169; und Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867–1875.
  • Alternativ können AAV ITRs aus dem viralen Genom oder aus einem AAV-Vektor, enthaltend dasselbe ausgeschnitten und 5' und 3' von einem gewählten Nukleinsäurekonstrukt fusioniert werden, das in einem anderen Vektor vorliegt, wobei Standard-Ligationsverfahren verwendet werden, wie z.B. die in Sambrook et al., supra, beschriebenen. Ligationen können z.B. in 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 μg/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl und entweder 40 μM ATP, 0,01–0,02 (Weiss) Einheiten T4-DNA-Ligase bei 0°C (für eine Ligation mit "klebrigen Enden") oder 1 mM ATP, 0,3–0,6 (Weiss) Einheiten T4-DNA-Ligase bei 14°C (für eine Ligation mit "glatten Enden") bewirkt werden. Intermolekulare "klebrige Enden" -Ligationen werden üblicherweise mit 30 bis 100 μg/ml Gesamt-DNA-Konzentrationen (5 bis 100 nM Gesamt-Endkonzentration) durchgeführt. AAV-Vektoren, die ITRs enthalten, wurden z.B. im US-Patent Nr. 5,139,941 beschrieben. Insbesondere werden dort etliche AAV-Vektoren beschrieben, die von der American Type Culture Collection (ATCC) unter den Hinterlegungsnummern 53222, 53223, 53224, 53225 und 53226 erhältlich sind.
  • Zusätzlich können chimäre Gene synthetisch erzeugt werden, um AAV ITR-Sequenzen zu beinhalten, die 5' und 3' von ein oder mehr gewählten Nukleinsäuresequenzen angeordnet sind. Bevorzugte Kodons für die Expression der chimären Gensequenz in Säuger-ZNS-Zellen können verwendet werden. Die vollständige chimäre Sequenz wird aus überlappenden Oligonukleotiden zusammengesetzt, die durch Standardverfahren hergestellt wurden. Siehe z.B. Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al. Science (1984) 223:1299; Jay et al. J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.
  • Um rAAV-Virions zu erzeugen, wird ein AAV-Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle unter Verwendung bekannter Verfahren, wie z.B. durch Transfektion, eingeführt. Eine Anzahl von Transfektionstechniken sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Siehe z.B. Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier und Chu et al. (1981) Gene 13:197. Besonders geeignete Transfektionsverfahren beinhalten die Calciumphosphat-Co-Präzipitation (Graham et al. (1973) Virol. 52:456–467), die direkte Mikroinjektion in kultivierte Zellen (Capecchi, M.R. (1980) Cell 22:479–488), die Elektroporation (Shigekawa et al. (1988) BioTechniques 6:742–751), den Liposomen-vermittelten Gentransfer (Mannino et al. (1988) BioTechniques 6:682–690), die Lipid-vermittelte Transduktion (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413–7417) und die Nukleinsäurezufuhr unter Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilen (Klein et al. (1987) Nature 327:70–73).
  • Für die Zwecke der Erfindung beinhalten geeignete Wirtszellen zur Erzeugung von rAAV-Virions Mikroorganismen, Hefezellen, Insektenzellen und Säugerzellen, die als Rezipienten eines heterologen DNA-Moleküls verwendet werden können oder wurden. Die Bezeichnung beinhaltet die Nachkommenschaft der ursprünglichen Zelle, die transfiziert wurde. So betrifft eine "Wirtszelle", wie hier verwendet, allgemein eine Zelle, die mit einer exogenen DNA-Sequenz transfiziert wurde. Zellen von der stabilen menschlichen Zelllinie 293 (einfach erhältlich durch z.B. die American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 1573) werden bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Insbesondere ist die menschliche Zelllinie 293 eine menschliche embryonale Nieren-Zelllinie, die mit Adenovirus Typ-5-DNA-Fragmenten transformiert wurde (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59) und die adenoviralen E1a- und E1b-Gene exprimiert (Aiello et al. (1979) Virology 94:460). Die 293-Zelllinie wird einfach transfiziert und stellt eine besonders geeignete Plattform bereit, worin rAAV-Virions erzeugt werden können.
  • AAV-Helferfunktionen
  • Wirtszellen, enthaltend die oben beschriebenen AAV-Expressionsvektoren, müssen dazu gebracht werden, dass sie AAV-Helferfunktionen bereitstellen, um die Nukleotidsequenzen, flankiert von AAV ITRs zur Erzeugung von rAAV-Virions zu replizieren und zu verhüllen. AAV-Helferfunktionen sind allgemein von AAV abgeleitete kodierende Sequenzen, die exprimiert werden können, um AAV-Genprodukte bereitzustellen, die wiederum in trans für eine produktive AAV-Replikation wirken. AAV-Helferfunktionen werden hier verwendet, um notwendige AAV-Funktionen zu komplementieren, die in den AAV-Expressionsvektoren fehlen. So beinhalten AAV-Helferfunktionen eine oder beide Haupt-AAV ORFs, nämlich die rep und cap kodierenden Regionen oder funktionale Homologe davon.
  • Es wurde gezeigt, dass die Rep-Expressionsprodukte viele Funktionen besitzen, einschließlich unter anderem: Erkennung, Bindung und Nickbildung des AAV-Ursprungs der DNA-Replikation; DNA-Helicaseaktivität und Modulation der Transkription von AAV (oder anderen heterologen) Promotoren. Die Cap-Expressionsprodukte stellen die notwendigen Verpackungsfunktionen bereit. Die AAV-Helferfunktionen werden hier verwendet, um AAV-Funktionen in trans zu komplementieren, die bei den AAV-Vektoren fehlen.
  • Die Bezeichnung "AAV-Helferkonstrukt" bezieht sich allgemein auf ein Nukleinsäuremolekül, das Nukleotidsequenzen beinhaltet, die AAV-Funktionen bereitstellen, die von einem AAV-Vektor deletiert wurden, der verwendet wird, um einen transduzierenden Vektor für eine Zufuhr einer Nukleotidsequenz von Interesse zu erzeugen. AAV-Helferkonstrukte werden üblicherweise verwendet, um eine transiente Expression von AAV-rep- und/oder cap-Genen zum Komplementieren fehlender AAV-Funktionen bereitzustellen, die für eine lytische AAV-Replikation notwendig sind; den Helferkonstrukten fehlen jedoch AAV ITRs und sie können sich weder selbst replizieren noch verpacken. AAV-Helferkonstrukte können in Form eines Plasmids, Phagen, Transposons, Cosmids, Virus oder Virions vorliegen. Eine Anzahl von AAV-Helferkonstrukten wurde beschrieben, wie z.B. die üblicherweise verwendeten Plasmide pAAV/Ad und pIM29+45, die beide Rep- und Cap-Expressionsprodukte kodieren. Siehe z.B. Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822–3828; und McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936–2945. Eine Anzahl anderer Vektoren wurde beschrieben, die Rep- und/oder Cap-Expressionsprodukte kodieren. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,139,941.
  • Unter "AAV rep kodierender Region" wird die auf dem Gebiet bekannte Region des AAV-Genoms verstanden, die die Replikationsproteine Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40 kodiert. Es wurde gezeigt, dass diese Rep-Expressionsprodukte viele Funktionen besitzen, einschließlich einer Erkennung, Bindung und Nickbildung des AAV-Ursprungs der DNA-Replikation, DNA-Helicase-Aktivität und Modulation der Transkription von AAV- (oder anderen heterologen) Promotoren. Die Rep-Expressionsprodukte werden kollektiv für eine Replikation des AAV-Genoms benötigt. Für eine Beschreibung der AAV rep Kodierungsregion siehe z.B. Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97–129; und Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793–801. Geeignete Homologe der AAV rep-Kodierungsregion beinhalten das menschliche Herpesvirus 6 (HHV-6) rep Gen, von dem auch bekannt ist, dass es die AAV-2-DNA-Replikation vermittelt (Thomson et al. (1994) Virology 204:304–311).
  • Unter "AAV cap kodierender Region" wird die auf dem Gebiet bekannte Region des AAV-Genoms verstanden, die die Capsidproteine VP1, VP2 und VP3 oder funktionale Homologe davon kodiert. Diese Cap-Expressionsprodukte stellen Verpackungsfunktionen bereit, die kollektiv für eine Verpackung des viralen Genoms benötigt werden. Für eine Beschreibung der AAV cap-Kodierungsregion siehe z.B. Muzyczka, N. und Kotin, R.M. (supra).
  • Die AAV-Helferfunktionen werden in die Wirtszelle durch Transfektion der Wirtszelle mit einem AAV-Helferkonstrukt entweder vor oder gleichzeitig mit der Transfektion des AAV-Expressionsvektors eingeführt. AAV-Helferkonstrukte werden so verwendet, um mindestens eine transiente Expression der AAV rep- und/oder cap-Gene zum Komplementieren fehlender AAV-Funktionen bereitzustellen, die für eine produktive AAV-Infektion notwendig sind. AAV-Helferkonstrukten fehlen die AAV ITRs und sie können sich weder selbst replizieren noch verpacken. Diese Konstrukte können in Form eines Plasmids, Phagen, Transposons, Cosmids, Virus oder Virion vorliegen. Eine Anzahl von AAV-Helferkonstrukten wurde beschrieben, wie die üblicherweise verwendeten Plasmide pAAV/Ad und pIM29+45, die beide Rep- und Cap-Expressionsprodukte kodieren, siehe z.B. Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822–3828; und McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936–2945. Eine Anzahl anderer Vektoren wurde beschrieben, die Rep- und/oder Cap-Expressionsprodukte kodieren. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,139,941.
  • Sowohl AAV-Expressionsvektoren als auch AAV-Helferkonstrukte können konstruiert werden, um ein oder mehr optional selektierbare Marker zu enthalten. Geeignete Marker beinhalten Gene, die eine Antibiotikaresistenz oder Empfindlichkeit verleihen oder eine Farbe verleihen oder die antigenen Eigenschaften dieser Zellen verändern, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt transfiziert wurden, enthaltend den selektierbaren Marker, wenn die Zellen in einem geeigneten selektiven Medium gezüchtet werden. Etliche selektierbare Markergene, die für die Praxis der Erfindung geeignet sind, beinhalten das Hygromycin B-Resistenzgen (das die Aminoglycosid-Phosphotransferase (APH) kodiert), das eine Selektion in Säugerzellen durch Verleihung einer Resistenz gegenüber G418 ermöglicht (erhältlich von Sigma, St. Louis, Mo.). Andere geeignete Marker sind dem Fachmann bekannt.
  • AAV-akzessorische Funktionen
  • Die Wirtszelle (oder Verpackungszelle) muss auch dazu befähigt werden, nicht-AAV-abstammende Funktionen oder "akzessorische Funktionen" bereitzustellen, um rAAV-Virions zu erzeugen. Akzessorische Funktionen sind nicht AAV-abgeleitete virale und/oder zelluläre Funktionen, von denen AAV für seine Replikation abhängt. So beinhalten akzessorische Funktionen mindestens diejenigen Nicht-AAV-Proteine und RNAs, die für die AAV-Replikation benötigt werden, einschließlich denjenigen, die an der Aktivierung der AAV-Gentranskription, einem stufenspezifischen AAV-mRNA-Splicing, einer AAV-DNA-Replikation, einer Synthese von Cap-Expressionsprodukten und einem AAV-Capsid-Zusammenbau beteiligt sind. Auf Virus basierende akzessorische Funktionen können von allen bekannten Helferviren abgeleitet werden.
  • Insbesondere können akzessorische Funktionen in die Wirtszellen eingeführt und darin exprimiert werden, wobei dem Fachmann auf dem Gebiet bekannte Verfahren verwendet werden. Üblicherweise werden akzessorische Funktionen durch Infektion der Wirtszellen mit einem nicht-verwandten Helfervirus bereitgestellt. Eine Anzahl geeigneter Helferviren sind bekannt, einschließlich Adenoviren; Herpesviren, wie z.B. dem Herpes simplex-Virus Typ 1 und 2; und Vacciniaviren. Nicht-virale akzessorische Funktionen werden hier auch Verwendung finden, wie diejenigen, die durch eine Zellsynchronisierung unter Verwendung irgendeines von verschiedenen bekannten Mitteln bereitgestellt werden. Siehe z.B. Buller et al. (1981) J. Virol. 40:241–247; McPherson et al. (1985) Virology 147:217–222; Schlehofer et al. (1986) Virology 152:110–117.
  • Alternativ können akzessorische Funktionen unter Verwendung eines akzessorischen Funktionsvektors bereitgestellt werden. Akzessorische Funktionsvektoren beinhalten Nukleotidsequenzen, die ein oder mehr akzessorische Funktionen bereitstellen. Ein akzessorischer Funktionsvektor ist dazu in der Lage, in eine geeignete Wirtszelle eingeführt zu werden, um eine effiziente AAV-Virion-Produktion in der Wirtszelle zu unterstützen. Akzessorische Funktionsvektoren können auch in Form eines Plasmids, Phagen, Transposon oder Cosmids vorliegen. Akzessorische Vektoren können auch in Form von ein oder mehr linearisierten DNA- oder RNA-Fragmenten vorliegen, die, wenn sie mit den geeigneten Kontrollelementen und Enzymen assoziiert sind, in einer Wirtszelle zur Bereitstellung akzessorischer Funktionen transkribiert oder exprimiert werden können. Siehe z.B. die internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 97/17548, veröffentlicht am 15. Mai 1997.
  • Nukleinsäuresequenzen, die akzessorische Funktionen bereitstellen, können von natürlichen Quellen erhalten werden, wie z.B. aus dem Genom eines Adenoviruspartikels oder unter Verwendung rekombinanter oder synthetischer Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, konstruiert werden. In diesem Hinblick wurden Adenovirus-abgeleitete akzessorische Funktionen weit verbreitet untersucht und eine Anzahl von Adenovirusgenen, die an akzessorischen Funktionen beteiligt sind, wurde identifiziert und teilweise charakterisiert. Siehe z.B. Carter, B.J. (1990) "Adeno-Associated Virus Helper Functions, "in CRC Handbook of Parvoviruses, Band I (P. Tijssen, Hrsg.) und Muzyczka, N. (1992) Curr. Topics. Microbiol. and Immun. 158:97–129. Spezifisch nimmt man an, dass die frühen adenoviralen Genregionen E1a, E2a, E4, VAI RNA und möglicherweise E1b an dem akzessorischen Prozess teilnehmen. Janik et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925–1929. Von Herpesvirus abstammende akzessorische Funktionen wurden beschrieben. Siehe z.B. Young et al. (1979) Prog. Med. Virol. 25:113. Von Vacciniavirus abstammende akzessorische Funktionen wurden ebenfalls beschrieben. Siehe z.B. Carter, B.J. (1990), supra., Schlehofer et al. (1986) Virology 152:110–117.
  • Als Konsequenz der Infektion der Wirtszelle mit einem Helfervirus oder einer Transfektion der Wirtszelle mit einem akzessorischen Funktionsvektor werden akzessorische Funktionen exprimiert, die das AAV-Helferkonstrukt transaktivieren, um AAV Rep- und/oder Cap-Proteine zu erzeugen. Die Rep-Expressionsprodukte exzisieren die rekombinante DNA (einschließlich der DNA von Interesse) aus dem AAV-Expressionsvektor. Die Rep-Proteine dienen auch zur Duplikation des AAV-Genoms. Die exprimierten Cap-Proteine ordnen sich zu Capsiden an und das rekombinante AAV-Genom wird in die Capside verpackt. So folgt eine produktige AAV-Replikation und die DNA wird in rAAV-Virions verpackt.
  • Folgend auf die rekombinante AAV-Replikation können rAAV-Virions aus der Wirtszelle unter Verwendung einer Vielzahl konventioneller Reinigungsverfahren gereinigt werden, wie z.B. CsCl-Gradienten. Wenn eine Infektion verwendet wird, um die akzessorischen Funktionen zu exprimieren, können weiterhin Resthelferviren inaktiviert werden, wobei bekannte Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel kann Adenovirus durch Erwärmen auf Temperaturen von ungefähr 60°C für z.B. 20 Minuten oder mehr inaktiviert werden. Diese Behandlung inaktiviert effektiv nur das Helfervirus, da AAV extrem hitzestabil ist, während Helfer-Adenovirus hitzelabil ist.
  • Die resultierenden rAAV-Virions sind dann zur Verwendung für die DNA-Zufuhr an das ZNS (z.B. die Kranialhöhle) des Subjekts fertig.
  • Zufuhr viraler Vektoren
  • Verfahren zur Zufuhr viraler Vektoren beinhalten den intraarteriellen, intramuskulären, intravenösen, intranasalen und oralen Weg, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. Allgemein können rAAV-Virions in Zellen des ZNS unter Verwendung von entweder in vivo- oder in vitro-Transduktionstechniken eingeführt werden. Wenn in vitro transduziert wird, wird die gewünschte Empfängerzelle aus dem Subjekt entfernt, mit rAAV-Virions transduziert und wieder in das Subjekt eingeführt. Alternativ können syngene oder xenogene Zellen verwendet werden, wenn diese Zellen keine unerwünschte Immunreaktion im Subjekt auslösen.
  • Geeignete Verfahren für die Zufuhr und Einführung transduzierter Zellen in ein Subjekt wurden beschrieben. Zum Beispiel können die Zellen in vitro durch Kombination rekombinanter AAV-Virions mit ZNS-Zellen, z.B. in geeigneten Medien transduziert werden und ein Screening für diejenigen Zellen durchgeführt werden, die die DNA von Interesse beherbergen, wobei konventionelle Techniken wie Southern Blots und/oder PCR oder selektierbare Marker verwendet werden. Transduzierte Zellen können dann in pharmazeutische Formulierungen, die weiter unten genauer beschrieben werden, formuliert werden und die Zusammensetzung kann in das Subjekt durch verschiedene Techniken wie z.B. Transplantieren, intramuskuläre, intravenöse, subkutane und intraperitoneale Injektion eingeführt werden.
  • Für die in vivo-Zufuhr werden die rAAV-Virions in pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert und werden allgemein parenteral, z.B. durch intramuskuläre Injektion direkt in den Skelett- oder Herzmuskel oder durch Injektion in das ZNS verabreicht.
  • Da es sich jedoch erwiesen hat, dass konventionelle Verfahren wie eine Injektion keine weit verbreitete Zufuhr viraler Vektoren im Gehirn des Subjekts bereitstellen, ist ein Mittelpunkt der vorliegenden Erfindung die Entdeckung, dass virale Vektoren dem ZNS über konvektionsverstärkte Zufuhr (CED) -Systeme effizient zugeführt werden. Die vorliegenden Erfinder sind die ersten, die beschreiben und demonstrieren, dass CED effizient virale Vektoren zuführen kann, z.B. AAV, über große Bereiche des Gehirns des Tieres (z.B. Striatum). Wie im Detail unten beschrieben und durch Beispiele dargestellt, sind diese Verfahren für eine Vielzahl viraler Vektoren, z.B. AAV-Vektoren, die Reportergene tragen (z.B. Thymidinkinase (tk)) oder therapeutische Gene (z.B. AADC und tk) geeignet.
  • Jede konvektionsverstärkte Zufuhrvorrichtung kann für die Zufuhr viraler Vektoren geeignet sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Vorrichtung eine osmotische Pumpe oder eine Infusionspumpe. Sowohl osmotische als auch Infusionspumpen sind von einer Vielzahl von Verkäufern, z.B. Alzet Corporation, Hamilton Corporation, Alza, Inc., Palo Alto, Kalifornien) kommerziell erhältlich. Typischerweise wird ein viraler Vektor über CED-Vorrichtungen wie folgt zugeführt. Ein Katheter, eine Kanüle oder eine andere Injektionsvorrichtung werden in das ZNS-Gewebe des gewählten Subjekts inseriert. Im Hinblick auf die hier offenbarten Lehren kann ein Fachmann einfach bestimmen, welcher allgemeine Bereich des ZNS das geeignete Ziel ist. Wenn z.B. AAV-AADC zur Behandlung von PD zugeführt wird, ist das Striatum ein geeigneter Ziel-Bereich des Gehirns. Stereotaktische Karten und Positionierungsvorrichtungen stehen z.B. von ASI Instruments, Warren, MI zur Verfügung. Die Positionierung kann auch durch Verwendung anatomischer Karten, erhalten von CT- und/oder MRI-Abbildungen des Gehirns des Subjektes durchgeführt werden, um bei dem Führen der Injektionsvorrichtung zu dem gewünschten Ziel zu helfen. Da die hier beschriebenen Verfahren so durchgeführt werden können, dass relativ große Bereiche des Gehirns die viralen Vektoren aufnehmen, werden außerdem weniger Infusionskanülen benötigt. Da chirurgische Komplikationen mit der Anzahl an Penetrationen in Beziehung stehen, dienen die hier beschriebenen Verfahren auch zu einer Reduktion von Nebenwirkungen, die bei konventionellen Zufuhrtechniken angetroffen werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen werden ausreichend genetisches Material umfassen, um eine therapeutisch effektive Menge des Proteins von Interesse zu erzeugen, d.h. eine ausreichende Menge, um Symptome des Erkrankungszustands, der in Frage steht, zu reduzieren oder zu verbessern oder eine ausreichende Menge, um den gewünschten Nutzen bereitzustellen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden auch ein pharmazeutisch akzeptables Exzipiens enthalten. Solche Exzipienzien beinhalten jedes pharmazeutische Mittel, das nicht selbst die Produktion von Antikörpern induziert, die für das Individuum schädlich sind, das die Zusammensetzung erhält und die ohne unerwünschte Toxizität verabreicht werden können. Pharmazeutisch akzeptable Exzipienzien beinhalten Sorbit, Tween 80 und Flüssigkeiten wie Wasser, Salzlösung, Glycerin und Ethanol, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. Pharmazeutisch akzeptable Salze können darin beinhaltet sein, z.B. mineralische Säuresalze, wie Hydrochloride, Hydrobromide, Phosphate, Sulfate und ähnliche und die Salze organischer Säuren wie z.B. Acetate, Propionate, Malonate, Benzoate und ähnliche. Zusätzlich können Hilfssubstanzen wie Befeuchtungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffer und ähnliche in solchen Vehikeln vorliegen. Eine detaillierte Diskussion pharmazeutisch akzeptabler Exzipienzien ist erhältlich von REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mark Pub. Co., N. J. 1991).
  • Wie dem Fachmann auf dem Gebiet im Hinblick auf die Lehren dieser Beschreibung deutlich werden wird, kann eine effektive Menge des viralen Vektors, die zugefügt werden muss, empirisch bestimmt werden. Die Verabreichung kann in einer Dosis, kontinuierlich oder intermittierend über den Verlauf der Behandlung bewirkt werden. Verfahren zur Bestimmung des besonders effektiven Mittels und der Dosierungen der Verabreichung sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt und werden je nach viralem Vektor, Zusammensetzung der Therapie, Zielzellen und dem behandelten Subjekt variieren. Einzelne und multiple Verabreichungen können durchgeführt werden, wobei Dosisniveau und Muster von dem behandelnden Arzt gewählt werden.
  • Es sollte verstanden werden, dass mehr als ein Transgen durch den zugeführten viralen Vektor exprimiert werden könnte. Alternativ können separate Vektoren, die jeweils ein oder mehr unterschiedliche Transgene exprimieren, ebenfalls wie hier beschrieben, dem ZNS zugeführt werden. Weiterhin wird es auch beabsichtigt, dass die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung zugeführten viralen Vektoren mit anderen geeigneten Zusammensetzungen und Therapien kombiniert werden können. Wie im Detail in den Beispielen unten beschrieben, kann z.B. die Parkinson-Erkrankung durch Coverabreichung eines AAV-Vektors, der AADC exprimiert, in das ZNS (z.B. den Nucleus caudatus oder das Putamen des Striatums) mit zusätzlichen Mitteln wie z.B. Dopaminvorläufern (z.B. L-Dopa), Inhibitoren der Dopaminsynthese (z.B. Carbidopa), Inhibitoren des Dopaminkatabolismus (z.B. MaOB-Inhibitoren), Dopaminagonisten oder Antagonisten vor oder folgend auf oder simultan mit dem Vektor, kodierend AADC, verabreicht werden. Zum Beispiel können L-Dopa und optional Carbidopa systemisch verabreicht werden. Auf diese Weise wird Dopamin, das bei PD-Patienten natürlicherweise vermindert ist, wiederhergestellt, anscheinend durch Expression von AADC, das L-Dopa in Dopamin umwandeln kann. Wenn sich das Transgen (z.B. AADC) unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors befindet, können bestimmte systemisch zugeführte Verbindungen wie Muristeron, Ponasteron, Tetracylin oder Aufin verabreicht werden, um die Expression des Transgens zu regulieren.
  • Behandlung von ZNS-Störungen
  • Virale Vektoren, die therapeutische Transgene exprimieren, können verwendet werden, um verschiedene ZNS-Störungen zu behandeln, indem therapeutische Proteine oder Polypeptide bereitgestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die viralen Vektoren dem ZNS über die hier beschriebenen CED-Verfahren zugeführt, da diese Verfahren den ersten effektiven Weg einer breiten Verteilung viraler Vektoren in das ZNS bereitstellen.
  • Parkinson-Erkrankung
  • In der vorliegenden Erfindung werden virale Vektoren, die das Enzym AADC bereitstellen, für die Behandlung der Parkinson-Erkrankung verwendet. Wie oben beschrieben, ergibt sich die Parkinson-Erkrankung aus einem selektiven Verlust der dopaminergen Nigrostriatum-Neuronen, was zu einem Verlust des Inputs von der Substantia nigra zum Striatum führt. Tiermodelle von PD wurden erzeugt, z.B. indem Ratten oder Primaten mit 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) behandelt wurden, um dopaminerge Zellen zu zerstören oder indem Primaten mit dem Neurotoxin 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,4-tetrahydropyridin (MPTP) läsioniert wurden, das eine Parkinson-ähnliche Erkrankung erzeugt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt den ersten Beweis bereit, dass die dopaminerge Aktivität bei Parkinson-Patienten (z.B. MPTP-läsionierten Affen) wiederhergestellt werden kann, indem virale Vektoren verabreicht werden, die das Transgen für AADC tragen, in Kombination mit systemischer (z.B. oraler) Verabreichung von L-Dopa und optional Carbidopa. Frühere Vorschläge für eine Gentherapie für Parkinson haben sich auf die Defizienz der Tyrosinhydroxylase fokussiert, wenn die Krankheit fortschreitet. Diese Vorschläge benötigen daher die Wiederherstellung der Dopaminsynthese im Nigrostriatumweg durch erfolgreiche Expression von mindestens drei Transgenen, um Dopamin in situ herzustellen: das Tyrosinhydroxylase-Gen; das Gen für den Cofaktor Bioptren, GTP-Cyclohydroxylase-1 und das Gen für AADC. Zusätzlich zu den mit der Zufuhr von drei Genen in geeigneten Niveaus assoziierten Problemen würde die Regulation der Dopaminniveaus schwierig zu kontrollieren sein, wenn dieser Ansatz verwendet würde.
  • Die vorliegenden Erfinder haben demonstriert, dass ein Transgen (z.B. AADC) in Kombination mit L-Dopa einen therapeutischen Nutzen bereitstellt. AADC ist das Enzym, das am Endschritt der Dopamin-Biosynthese beteiligt ist, und wandelt L-Dopa zu Dopamin um. So ist es ein deutlicher Vorteil eines AADC-therapeutischen Ansatzes zur Wiederherstellung der dopaminergen Aktivität, dass nur ein Gen zugeführt werden muss und die Regulation der Dopaminniveaus durch Kontrolle peripherer Niveaus an L-Dopa möglich ist. Weiterhin kann durch die Zufuhr von nur dem AADC-Gen L-Dopa als Prodrug verwendet werden, um die Niveaus von Dopamin im Striatum zu regulieren.
  • Da AADC-kodierende Nukleotide, die von AAV-Vektoren zugeführt werden, anscheinend im wesentlichen in den Striatumneuronen exprimiert werden, ist ein weiterer wichtiger therapeutischer Vorteil, dass die Behandlung einen Puffermechanismus für L-Dopa bereitstellt. Viele Nebenwirkungen wie die Dyskinesien, werden einer ineffizienten Pufferung des Gehirns bei Parkinson-Patienten zugeschrieben. Die hier beschriebenen Verfahren vermeiden dieses Problem, indem sie es ermöglichen, dass nicht verstoffwechseltes L-Dopa in den Neuronen gelagert wird. Wie unten beispielhaft dargestellt, ermöglicht die Zufuhr von AADC zu dem MPTP-behandelten Striatum die Umwandlung von L-Dopa in Dopamin und den darauffolgenden Metabolismus zu DOPAC und HVA durch Striatumneuronen. Basierend auf den FMT PET-Daten scheint es, dass die Striatumneuronen ebenfalls Dopamin lagern können, da FMT in dieser Region sichtbar gemacht wurde. Tatsächlich waren die Umwandlungsraten von L-Dopa zu Dopamin folgend auf den AADC- Gentransfer genauso robust und höher als diejenigen, die im normalen Striatum beobachtet wurden (siehe z.B. 7). Weiterhin ist es nicht wahrscheinlich, dass ein fortlaufender Degenerationsprozess die AADC-Expression in Striatumneuronen beeinflussen wird, da diese nicht typischerweise von der idopathischen Parkinson-Erkrankung beeinträchtigt werden, obwohl es sich bei der Parkinson-Erkrankung um eine progressive Störung handelt.
  • Die Degeneration des dopaminergen Systems bei Patienten mit idiopathischer Parkinson-Erkrankung ist nicht einheitlich. Der Nigrostriatumweg degeneriert mit einer sehr viel schnelleren Geschwindigkeit als der mesolimbische Weg, was Patienten mit einem Ungleichgewicht zwischen der Aktivität der beiden Wege zurückläßt. Wenn die Krankheit fortschreitet, werden höhere Niveaus an L-Dopa benötigt, um die Degeneration des Nigrostriatumwegs zu kompensieren, jedoch führt dies auch zuständig steigenden höheren Dopaminniveaus im Nucleus accumbens und anderen Teilen des mesolimbischen Systems. Eine solche Überstimulierung könnte für einige der Nebenwirkungen verantwortlich sein, die mit einer L-Dopa-Behandlung assoziiert sind, wie z.B. Halluzinationen. Auf ähnliche Weise verschont MPTP das mesolimbische dopaminerge System zumindest relativ (siehe 7, im Caudatum und Putamen liegen keine dopaminergen Innervationen vor, eine Teilläsion wird im Nucleus accumbens beobachtet). Wie in 7 dargestellt, kann AAV-AADC dieses Ungleichgewicht fast in den normalen Zustand zurückführen und es ist daher möglich, dass niedrigere Dosierungen an L-Dopa folgend auf die Wiederherstellung der AADC-Enzymniveaus und eine verbesserte L-Dopa zu Dopamin-Umwandlungsrate nötig sein werden. Dies könnte wiederum die Überstimulierung des mesolimbischen System reduzieren, was zu weniger L-Dopa/Carbidopa-bezogenen Nebenwirkungen führen könnte.
  • Wie oben erklärt, können die AAV-AADC-Vektoren durch jedes geeignete Verfahren zugeführt werden, z.B. durch Injektion, Transplantation, Infusion, Transplantation von Zellen, die Vektoren tragen usw. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Vektoren durch die hier beschriebenen CED-Verfahren zugeführt. Wie unten beispielhaft dargestellt, stellt ein solches Zufuhrverfahren eine breite Verteilung und Expression in ZNS-Neuronen bereit und stellt daher eine neue Behandlungsvorschrift für PD bereit.
  • Abbildung
  • Die vorliegende Erfindung offenbart auch Verfahren zur Bestimmung der in vivo-Aktivität eines Enzyms oder anderen Moleküls. Genauer gesagt wird ein Tracer, der spezifisch die Zielaktivität verfolgt, gewählt und markiert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform verfolgt der Tracer die Dopaminaktivität, z.B. handelt es sich um Fluor-L-m-tyrosin (FMT), das an Zellen bindet, die Dopamin verwerten. Geeignete Markierungen für gewählte Tracer beinhalten jede Zusammensetzung, die durch spektroskopische, fotochemische, immunochemische, elektrische, optische oder chemische Mittel nachweisbar ist. Geeignete Markierungen in der vorliegenden Erfindung beinhalten radioaktive Markierungen (z.B. 18F, 3H, 125I, 35S, 32p, usw.), Enzyme, kolorimetrische Markierungen, fluoreszierende Farbstoffe und ähnliches. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Markierung 18F mit FMT verwendet, um die Dopaminaktivität zu quantifizieren.
  • Mittel zum Nachweis von Markierungen sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt. Zum Beispiel können radioaktive Markierungen unter Verwendung von Abbildungstechniken, einem fotografischen Film oder Szintillationszählern nachgewiesen werden. Die Markierung wird in vivo im Gehirn des Subjekts durch Abbildungstechniken nachgewiesen, z.B. eine Positronen-Emissionstomographie (PET). PET-Techniken werden im Detail im Beispiel 3 unten diskutiert.
  • Beispiele
  • Unten werden Beispiele für spezifische Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung angegeben. Die Beispiele werden nur für illustrative Zwecke angeboten und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung auf keine Weise begrenzen.
  • Es wurden alle Bemühungen unternommen, um eine Genauigkeit im Hinblick auf die verwendeten Zahlen sicherzustellen (z.B. Mengen, Temperaturen usw.), jedoch sollte man natürlich Versuchsfehler und Abweichungen zugestehen.
  • Beispiel 1: Konstruktion und Produktion von AAV-TK
  • Der AAV-tk-Vektor wurde konstruiert, indem das Herpes simplex-Virus Thymidinkinase (tk) -Gen unter die Transkriptionskontrolle des Zytomegalievirus (CMV) immediate early Promotors in einem auf pUC basierenden Plasmid (erhältlich von Roche Molecular Biochemicals) platziert wurde. Ein β-Globinintron wurde direkt stromaufwärts vom tk-Gen lokalisiert und menschliches Wachstumshormon poly-A wurde stromabwärts platziert. Die gesamte Kassette wurde von AAV-inversen terminalen Repeats (ITRs) flankiert, die für eine Genexpression, Replikation und Verpackung in virale Partikel benötigt werden.
  • Rekombinante AAV-Virions werden in menschlichen 293-Zellen (einfach erhältlich von z.B. der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL1573) wie folgt erzeugt. Die 293-Zelllinie wurde in komplettem DMEM (Biowhittaker) kultiviert, enthaltend 4,5 g/l Glukose, 10 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS; Hyclone) und 2 mM Glutamin. Subkonfluente 293-Zellen wurden durch Calciumphosphatpräzipitation (siehe z.B. Sambrook, et al.) mit der AAV-tk-Expressionskassette, flankiert durch ITRs und Helferplasmide, abgeleitet von sowohl AAV (pw1909, enthaltend die AAV rep- und cap-Gene) und Adenovirus (pLadenol, enthaltend E2a, E4 und Adenovirus VA1 und VA11 RNA-Gene) cotransfiziert. Nach 6 Stunden wurde das Medium auf DMEM ohne Serum gewechselt und die Inkubation wurde bei 37°C in 5 % CO2 für 72 Stunden fortgesetzt. Pelletisierte Zellen wurden in Tris-Puffer (100 mM Tris/150 mM NaCl, pH 8,0) durch drei Zyklen von Einfrieren/Auftauen lysiert und das Lysat wurde durch Zentrifugation bei 10.000 g für 15 Minuten von Zellabfall geklärt. Um nicht-virale Proteine zu pelletisieren, wurde das geklärte Lysat bei 10.000 g 15 Minuten nach Zugabe von CaCl2 auf eine Endkonzentration von 25 mM zentrifugiert und 1 Stunde bei 0°C inkubiert. Polyethylenglykol 8000 (PEG) wurde dem resultierenden Überstand (Endkonzentration = 8 %) zugefügt; diese Lösung wurde 3 Stunden bei 0°C inkubiert und bei 3000 × g 30 Minuten zentrifugiert. Das Vektor enthaltende Pellet wurde in 50 mM Hepes Na/150 mM NaCl/25 mM EDTA, pH 8,0 löslich gemacht und bei 10.000 × g 15 Minuten zentrifugiert, um unlösliches Material zu pelletisieren und zu entfernen.
  • Eine Cäsiumchlorid-isopykno-Gradientenzentrifugation wurde durchgeführt und AAV-tk wurde aus dem resultierenden Gradienten durch Isolieren der Fraktionen mit einer durchschnittlichen Dichte von 1,38 g/ml wiedergewonnen. Wiederum wurde PEG zum Konzentrieren des Vektors verwendet, der dann in 25 mM Hepes Na/150 mM NaCl, pH 7,4 resuspendiert und wie oben zentrifugiert wurde, um unlösliches Material zu entfernen. Diese Grundlösung wurde mit DNAse behandelt und der Vektortiter wurde durch quantitative dot-blot-Hybridisierung bestimmt.
  • Beispiel 2: In vivo-Zufuhr von AAV-TR: Dosierungen und Verfahren
  • Um die geeignete Dosis von AAV zur Einführung ins Gehirn zu bestimmen, wurde die folgende Studie durchgeführt. Das Striatum wurde verwendet, um die Dosisreaktion auf den AAV- Vektor zu testen und zwar aufgrund seines relativ großen Bereiches an homogenem Gewebe und da es ein Ziel für eine Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen und anderer zentral nervöser Störungen ist.
  • Zusätzlich wurden effiziente Verfahren für die Zufuhr des Vektors zum ZNS bestimmt. Eine einfache stereotaktische Injektion therapeutischer Mittel zeigt erwiesenermaßen ein limitiertes Volumen einer Verteilung im Gehirn (Kroll et al., (1996) Neurosurgery 38:746–754). Daher wurden langsame Infusionspumpen verwendet, um einen Druckgradienten während der intrakranialen Zufuhr aufrechtzuerhalten. Frühere Studien, die mit der Zufuhr kleiner, mittlerer und großer Moleküle zum Gehirn beschäftigt waren, haben gezeigt, dass langsame Infusionspumpen zu einer extensiven und homogenen Gewebeverteilung führen.
  • Um zu untersuchen, welches Verabreichungsverfahren einer intrakranialen Injektion des Vektors am effizientesten ist, wurden Ratten 2,5 × 1010 Partikel von AAV-tk unter Verwendung der Harvard-Infusionspumpe (Harvard Apparatus Inc., Holliston, MA) oder der Alzet-subkutanen osmotischen Pumpen (Alza Scientific Products, Palo Alto, CA) verabreicht. Weibliche Sprague-Dawley-Ratten (250 bis 300 g) von Charles River Laboratories (Wilmington, MA) wurden mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert und für die Chirurgie vorbereitet. Während der Chirurgie wurde eine Sedation mit Isofluoran (Attrane, Omeda PPD Inc., Liberty, NJ) aufrechterhalten und die O2-Flussraten wurden bei 0,3 bis 0,5 L/m gehalten. Der Kopf jeder Ratte wurde in einem stereotaktischen Apparat fixiert (Small Animal Stereotactic Frame; ASI Instruments, Warren, MI), mit Ohrstangen und ein Mittellinieneinschnitt wurde durch die Haut durchgeführt, um das Kranium freizulegen. Ein Bohrloch wurde unter Verwendung eines kleinen Dentalbohrers in den Schädel 1 mm vor dem Scheitel und 2,6 mm lateral zur Mittellinie angelegt. Der Vektor wurde der linken Hemisphäre zugeführt und zwar in einer Tiefe von 5 mm unter Verwendung einer Infusions- oder einer subkutanen osmotischen Pumpe.
  • Für die Dosierungsstudien gab es drei Gruppen von Tieren mit 6 Tieren pro Gruppe. AAV-tk wurde kontinuierlich jeder Ratte mit einer Rate von 8 μl/Stunde für 2,5 Stunden unter Verwendung einer Harvard-Infusionspumpe verabreicht. Die Ladekammer (Teflonleitungen 1/16 Inch OD × 0,03 Inch ID) und die befestigte Infusionskammer (1/16 inch OD × 0,02 inch ID) wurden mit 2,5 × 108, 2,5 × 109 oder 2,5 × 1010 Partikeln AAV-tk in einem Gesamtvolumen von 20 μl künstlichem csf gefüllt (148 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,4 mM CaCl2·2H2O, 0,8 mM MgCl2·6H2O, 1,3 mM Na2HPO4·H2O, 0,2 mM Na2HPO4·H2O). Die Zufuhr geschah durch eine 27 Gauge-Nadel, versehen mit Quarzglas, die 15 Minuten folgend auf die Infusion graduell entfernt wurde.
  • Alternativ wurden subkutane osmotische Pumpen verwendet, um den Vektor einer Gruppe von 6 Tieren zuzuführen. AAV-tk wurde kontinuierlich jeder Ratte mit einer Rate von 8 μl/Stunde für 24 Stunden unter Verwendung von Alzet-osmotischen Pumpen, Modell # 2001D (ALZA Scientific Products, Palo Alto, CA) verabreicht. Das Reservoir der Pumpen und der angehaftete Katheter (Polyethylen 60-Leitung) wurde mit 2,5 × 1010 Partikeln AAV-tk in einem Gesamtvolumen von 200 μl künstlichem csf (Harvard Apparatus, Inc., Hollison, Mass.) gefüllt. Die Zufuhr geschah durch eine 27 Gauge-Kanüle, ausgerüstet mit Quarzglas. Nach einer stereotaktischen Platzierung wurde die Kanüle am Schädel mit einer kleinen rostfreien Stahlschraube und Dentalzement befestigt und die Pumpe wurde subkutan in den mittleren Scapularbereich des Rückens implantiert. Die chirurgische Stelle wurde in anatomischen Schichten mit 9 mm Wundklammern geschlossen. 24 Stunden später wurden die Pumpen durch Klammern und Versiegeln der Katheter entfernt, jedoch ließ man die implantierten Kanülen an ihrer Stelle. Bohrlöcher wurden mit Knochenwachs gefüllt.
  • Alle chirurgischen Verfahren, die Versorgung der Tiere und ihre Käfige sowie die Gewebsernte wurden in der Richmond-Einrichtung der Berkeley Antibody Co. (Berkeley, CA) durchgeführt.
  • Histologie
  • Die Tiere wurden durch eine Pentobarbitol-Überdosis (Dosis) euthanisiert und durch die aufsteigende Aorta mit eiskaltem PBS und 4 % neutralem gepuffertem Paraformaldehyd perfundiert. Die Gehirne wurden aus dem Schädel entfernt, durch Eintauchen in dasselbe Fixativ für 24 Stunden postfixiert, in 30 % Saccharose äquilibriert und bei –70°C in Isopentan eingefroren. Sie wurden dann in einem Cryostat positioniert und 40 μm Sektionen wurden seriell aus dem präfrontalen Cortex bis zum Mittelgehirn gesammelt. Jedes Gehirn ergab ungefähr 150 Sektionen, die eine Anterior-zu-Posterior (AP) -Länge von 6 bis 8 mm umfassten. Für die histologische Routineanalyse wurde jede IP-Sektion mit H & E gefärbt. Gewählte Sektionen, die unterschiedliche Gehirnregionen repräsentierten, wurden mit Kristallviolett gefärbt, um die allgemeine Zelldichte zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
  • Tabelle 1
    Figure 00510001
  • PCR-Analyse
  • Zwei zusätzliche Rattengruppen mit zwei Tieren pro Gruppe wurden mit 2,5 × 1010 Partikeln AAV-tk zum Zweck der Bestimmung der Gewebsverteilung des Vektors behandelt. Eine der Gruppen erhielt den Vektor durch Infusion und die andere durch eine osmotische Pumpe, wie oben beschrieben. Die Tiere wurden drei Wochen später unter Verwendung einer CO2-Inhalation euthanisiert und Proben von 15 Organen und Geweben wurden von jeder Ratte genommen, einschließlich dem rechten Gehirn, dem linken Gehirn, dem Rückgrat, dem rechten Auge, dem linken Auge, dem Herzen, der Lunge, der Leber, der Niere, der Milz, den Ovarien, dem Thymus, der Lymphknoten, dem Knochenmark und dem Beinmuskel. Es wurden sterile Verfahren verwendet und das Gewebe wurde unter Verwendung von Nahtmaterialentfernungswegwerfkits gesammelt, die zwischen den Proben gewechselt wurden. Die Gewebe wurden direkt in flüssigem N2 eingefroren und bei –70°C gehalten, bis sie im Hinblick auf die genomische DNA verarbeitet wurden. Die PCR wurde unter Verwendung des Perkin Elmer GeneAmp PCR Core Kits und zwei 30-mer Oligos, abgeleitet von der tk-Sequenz (5'-AAGTCATCGGCTCGGGTRCGTAGACGATATC-3' (SEQ ID NO: 1) und 5'-ATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGC-3' (SEQ ID NO: 2)) durchgeführt. Die Reaktionen wurden in einem PCR-100 thermal cycler (MJ Reserach, Inc.) durchgeführt und ergaben 158 bp pro Produkt bei Proben, in denen der Vektor vorlag.
  • Immunohistochemie
  • Immuncytochemie wurde verwendet, um die Transgenexpression in jeder Sektion nachzuweisen, die direkt auf eine mit H & E gefärbte folgte. So wurde eine von je 12 Sektionen in PBS gewaschen, mit 3 % H2O2 für 30 Minuten behandelt, um eine endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren, wiederum in dH2O und PBS gespült und in Blockierungslösung (10 % Ziegenserum + 0,01 % Triton-X100 in PBS) inkubiert und zwar für 30 Minuten. Als nächstes wurden Proben in polyklonalem anti-tk-Antikörper (Male) (1:1.000) 1 Stunde inkubiert, dreimal in PBS gewaschen, in biotinyliertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Vektor) (1:300) 1 Stunde inkubiert und wiederum gewaschen. Die Antikörperbindung wurde mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase (1:300) und VIP-Chromogen (Vektor) sichtbar gemacht.
  • Quantitative Analyse
  • Die Transgenexpression wurde für jedes Gehirn unter Verwendung eines Ken-a-vision-Mikroprojektors zum Projizieren von tk-immunogefärbten Sektionen auf ein ARTZII-grafisches Tablett quantifiziert. Das NIH-Image-1,6-Programm wurde verwendet, um die Bilder einzufangen und zu analysieren. Die gesamte geschätzte Zahl positiver Zellen für jedes Gehirn wurde mit einer Vergrößerung von 100X unter Verwendung der folgenden Formel bestimmt: Gesamt-tk-Zelle # = (n1 + n2 + n3 ...) × 12 × k n = positive Zellen/Sektion
    • k:
    Korrekturfaktor, abgeleitet von der Ambercrombie-Gleichung (1946):
    k
    = T/(T + D)
    T
    = Sektionsdicke (40 μm),
    D
    = Zelldurchmesser (60 μm);
    k
    = 0,71.
  • Die Volumina der tk-immunreaktiven Regionen wurden durch Messung von Bereichen einer tk-Expression bestimmt, wobei die eingefangenen Bilder verwendet wurden, projiziert mit 50facher Vergrößerung und unter folgender Berechnung: V = Ax × L
    Figure 00530001
    (worin L = AP-Entfernung (μ) der Färbung = n × 12 × 40 μ und n = # der gefärbten Sektionen).
  • Um zu bestimmen, wie viel Virus zur effizienten Transduktion von Gehirngewebe benötigt wird, wurden Vergleiche der immungefärbten Sektionen zwischen den Ratten durchgeführt, die 2,5 × 108, 2,5 × 109 oder 2,5 × 1010 Partikel AAV-tk durch die Harvard-Infusionspumpe erhielten.
  • Bei allen gemessenen Parametern wurde eine deutliche Dosisreaktion beobachtet. Infundiertes Gewebe von Tieren, die den höchsten Titer erhielten, demonstrierte eine Transgenexpression in einem Mittel von 300 mm3 Gewebe (oder ungefähr 60 % einer cerebralen Hämisphere einer erwachsenen Ratte (Leyden et al. (1998) Behav. Brain Res. 87:59–67) im Vergleich mit Volumina von 10 mm3 für die Gruppe mit der mittleren Dosis und weniger als 1 mm3 für die Gruppe mit der niedrigen Dosis (1a). Die Volumina wurden aus mittleren Bereichen und Längen der Färbung berechnet, die beide ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zeigten (1b, c). Die Expression in einem Volumen eines transduzierten Gewebes war nicht einheitlich, zeigte jedoch einen Färbungsgradienten. Bereiche, die die Injektionsstellen direkt umgaben, waren stark markiert, während weniger positive Zellen nachgewiesen werden konnten, wenn die Entfernung zur Nadelführung zunahm (2). Schlieißlich illustriert 1d, dass die Gesamtzahl von tk-positiven Zellen in der Sektion von der Gruppe mit der hohen Dosis, geschätzt auf ein Mittel von 169.000, ungefähr 10× höher ist als die der Gruppe mit der mittleren Dosis.
  • Infusion gegenüber osmotischer Pumpenzufuhr
  • Ein Vergleich von immungefärbten Gehirnsektionen zeigte Ähnlichkeiten und Unterschiede in den Fähigkeiten der beiden Pumpen, den Vektor zuzufügen. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der tk-Expression zwischen den zwei Gruppen, gemessen durch mittleres Volumen, Bereich, AP-Entfernung und gesamte geschätzte Zahl positiver Zellen (3a–d). Da es um die Nadelführungen von allen Proben bei der Gruppe mit osmotischer Pumpenzufuhr etwas Gewebeverlust gab (Daten nicht dargestellt), könnte der tatsächliche mittlere Wert für die Zahl geschätzter positiver Zellen in dieser Gruppe höher sein. Und während beide Zufuhrverfahren zu einer bemerkenswerten Transgenexpression führten, gab es einen Unterschied in der Art der Zellen, die markiert wurden. Gewebe, infundiert mit einem Vektor, exprimierten tk fast ausschließlich in Neuronen (4a, b) und Gewebe, das den Vektor über eine osmotische Pumpe erhielt, zeigte eine Expression in Neuronen und in reaktiven Gliazellen nahe der Injektionsstelle (4c, d).
  • Gewebeverteilung
  • Um zu bestimmen, ob rekombinante AAVs an Stellen nachgewiesen werden konnten, die von der Stelle der intrakranialen Zufuhr entfernt waren, wurde eine PCR-Analyse an 15 unterschiedlichen Organen und Geweben von jeder von drei Ratten durchgeführt, die eine hohe Dosis des Vektors erhalten hatten. Unabhängig von der Zufuhrmethode (Infusions- oder osmotische Pumpen) konnte ein 458 bp PCR-Produkt von dem tk-Gen im Rückgrat, der Milz und beiden Hämispheren des Gehirns unter Verwendung der Southern Blot-Analyse nachgewiesen werden (6). Bei einer der Ratten wurden Vektorsets ebenfalls im Gewebe der Niere nachgewiesen.
  • Toxizität
  • Um zu bestimmen, ob oder nicht mit irgendeinem der Zufuhrverfahren eine Toxizität assoziiert war, wurde eine Histopathologie an H & E-Sektionen von jeder Gruppe durchgeführt und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Gesamt-Gewebsmorphologie war gut konserviert und es war kein Einfrieren oder andere Artefakte vorhanden. Bei den Infusionszufuhrgruppen war die Gewebsschädigung minimal, wenn überhaupt vorhanden. Es gab keine zelluläre Infiltration, keine Nekrose im Nadeltrakt und nur eine minimale Cortikalnekrose bei einigen der Tiere. Frische Blutungen wurden bei einer der Ratten mit hoher Dosis angetroffen, und eine Hämosiderose, was eine moderate Blutung in der Vergangenheit anzeigt, wurde bei vier der Tiere mit hoher Dosis angetroffen. Alternativ wurden schwere Schäden bei allen Tieren bei der Zufuhrgruppe mit osmotischen Pumpen beobachtet, einschließlich große Nekrosebereiche, die den Nadeltrakt umgaben, zelluläre Infiltrate und eine Hämosiderose.
  • So ist eine Infusion von 2,5 × 1010 Partikeln AAV-tk mit 8 μl/Stunde für 2,5 Stunden ausreichend, um den AAV-Vektor teilweise auf ein Volumen von 300 mm3 Gewebe zu verteilen. Innerhalb dieser Region wurde ein Expressionsgradient mit einer starken Färbung direkt in der Umgebung der Injektionsstelle und weniger positiven Zellen weiter weg beobachtet. Die Verteilung scheint eine Funktion der Dosis (Partikelzahl) und nicht eine Funktion der Zufuhrzeit oder des Probenvolumens zu sein, wenn zwei unterschiedliche Pumpenzufuhrsysteme verglichen werden: Die Verteilung der 2,5 × 1010 Teilen war dieselbe, unabhängig davon, ob sie von einer osmotischen Pumpe (Volumen = 200 μl, Rate = 8 μl/Stunde, Zeit = 24 Stunden) oder einer Infusionspumpe (Volumen = 20 μl, Rate = 8 μl/Stunde, Zeit = 2,5 Stunden) zugeführt wurden. Weiterhin wurden auffallend unterschiedliche Expressionsniveaus zwischen den drei Infusionszufuhrgruppen beobachtet, wobei Probenvolumen, Rate und Zufuhrzeit konstant gehalten wurden und die Partikelzahl die einzige Variable war.
  • Diese mit der konvektionsverstärkten Zufuhr von AAV erhaltenen Ergebnisse sind konsistent mit denjenigen, die bei CED-Studien großer Makromoleküle, wie z.B. supramagnetischer Partikel in Rattengehirne erhalten wurden (Kroll et al. (1996) Neurosurg. 38:746–754, US-Patent Nr. 5,720,720). Kroll et al. verwendeten eine magnetische Resonanzabbildung und histochemische Färbung und demonstrierten, dass die Dosis die wichtigste Variable beim Maximieren der Verteilung der Partikel im Gewebe war. Kroll berichtet, dass unabhängig davon, ob das Infusionsvolumen klein war (2 μl) oder moderat (24 μl) oder ob die Infusionsrate niedrig lag (6 μl/Stunde) oder auch hoch (72 μl/Stunde), das Anheben der Teilchen von 5,3 auf 26,5 μg zu so viel wie einem 5fachen Anstieg des Volumens ihrer Verteilung im Gewebe führte.
  • Im Hinblick auf die Zelltyp-Spezifität wurde bereits früher berichtet, dass AAV Neuronen transduzieren kann und die vorliegende Studie bestätigt diese Feststellung. Die Tatsache, dass die Expression in Neuronen so vorherrschend war legt nahe, dass AAV-Gentherapie-Vektoren, die den CMV-Promotor verwenden, für die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie der Parkinson- und Alzheimer-Erkrankung geeignet sind. In reifen Gliazellen wurde keine Expression beobachtet, außer in kleinen Bereichen von gestörtem Gewebe, wo eine aktive Gliose vorlag. Wir haben jedoch bereits früher demonstriert, dass der AAV-CMV-tk-Vektor gut in Gliomazellen exprimiert wird und wenn er zusammen mit dem Prodrug Ganciclovir verabreicht wird, für die Behandlung experimenteller Gliome bei Nacktmäusen effektiv ist. Da das tk "Selbstmord"-Gen vermutlich toxisch für sich teilende Zellen ist, sollte es nur ein Risiko für die Ziel-Tumorzellen darstellen und nicht für die umgebenden Neuronen. Während der in dieser Studie verwendete CMV-Promotor eine starke Transgenexpression in Neuronen ermöglicht, wird schließlich die Wahl von zelltypspezifischen Promotoren das Abzielen von AAV auf andere ZNS-Komponenten wie Oligodendrozyten und Gliazellen ermöglichen.
  • Die vorliegende Studie zeigt auch, dass dem Gehirn zugeführter AAV im wesentlichen im ZNS enthalten ist. Andere Forscher haben einen retrograden Transport von Viren zwischen den beiden Hämispheren des Gehirns dargestellt sowie die Fähigkeit von Viren, das Rückgrat über zirkulierende Cerebralspinalflüssigkeit zu erreichen. Das Auftreten des Vektors in der Milz ist seltsam und legt eine Anzahl von Mechanismen nahe. Einer ist der, dass das Virus den Blutstrom während des Infusionsprozesses betritt und durch die Milz zirkuliert wird, wo er "eingefangen" wird. Wenn dies der Fall wäre sollte man jedoch annehmen, dass andere Gewebe, von denen gezeigt wurde, dass sie durch AAV induzierbar sind, ebenfalls das Virus aufnehmen. Ein anderer möglicher Mechanismus könnte einer sein, der durch die dendritischen Zellen ausgeübt wird. Diese Zellen, die im wesentlichen in der Haut angetroffen werden, nehmen Fremdmaterial auf, betreten die Zirkulation und konzentrieren sich in der Milz, wo Fremdstoffe für längere Zeitspannen existieren können und auf eine weitere Verarbeitung oder Zerstörung warten. In jedem Fall haben wir festgestellt, dass unabhängig von der Zufuhrroute, einschließlich intramuskulär, intravenös und jetzt intracerebral der Vektor immer in der Milz nachgewiesen wird.
  • Zusammengefasst wurde gezeigt, dass eine langsame intrakraniale Infusion hoher Dosen des AAV-Vektors einen signifikanten Bereich des Gehirns in einem Nagermodell transduziert. AAV kann zum Abzielen auf eine Myriade von zentral nervösen Störungen einschließlich Tumoren, Verletzungen, die sich aus einem Schlaganfall ergeben und neurodegenerativer Erkrankungen verwendet werden.
  • Beispiel 3: Gentherapie der Parkinson-Erkrankung
  • Konvektionsverstärkte Zufuhr von AAV-Vektoren, die das Transgen tragen, das AADC kodiert, stellen erwiesenermaßen die dopaminergen Systeme bei einer MPTP-induzierter Parkinson-Erkrankung bei Affen wie folgt wieder her.
  • Tiere
  • Rhesusaffen (n = 4,3 bis 5 kg) wurden als Kandidaten für eine Implantation gewählt, basierend auf der Evolution ihrer Parkinson-Symptome. Die Tiere wurden durch Infusion von 2,5 bis 3,5 mg MPTP-HLC durch die rechte innere Karotidarterie (hier als ipsilaterale Seite bezeichnet), gefolgt von 4 i.v.-Dosierungen 0,3 mg/kg MPTP-HCL (hier bezeichnet als kontralaterale Seite) läsioniert, bis ein stabiles, überläsioniertes Hemi-Parkinson-Syndrom erreicht wurde (Eberling, (1998) Brain Res. 805:259–262). Das Primaten-MPTP-Modell wird als Gold-Standardmodell für eine Bewertung vor menschlichen Versuchen angesehen (Langston (1985) Trends Pharmcol. Sci. 6:375–378). MPTP wird in dem ZNS durch die Monoaminoxidase B zu MPP+ umgewandelt. MPP+ ist ein potentes Neurotoxin, das zu einer Degeneration der Nigra-dopaminergen Neuronen führt und zu einem Verlust des Nigro-Striatum-Dopaminweges, wie es bei der Parkinson-Erkrankung beobachtet wird. MPTP-läsionierte Tiere wurden klinisch einmal pro Woche unter Verwendung einer klinischen Bewertungsskala bewertet und durch Überwachung der Aktivität für 5 Monate vor der Chirurgie.
  • Folgend auf die MPTP-Verabreichung entwickelten die Tiere klinische Zeichen einer Parkinson-Erkrankung, manifestiert durch eine allgemeine Langsamkeit, Bradykinesie, Steifheit, Balancestörungen und angespannte Haltung. Der linke Arm wurde weniger häufig verwendet als der rechte und zwar bei allen Affen und alle zeigten Zeichen von Tremor. Unter Verwendung einer klinischen Bewertungsskala hatten alle Affen während der 5-monatigen Post-MPTP-Periode moderate bis schwere stabile Parkinson-Bewertungen (23 ± 1,7, 23 ± 1,2, 24 ± 1,7,19 ± 3).
  • Vektor-Produktion
  • 1. pAAV-AADC:
  • Eine 1,5 kb BamHI/PvuII menschliche AADC cDNA (Fan et al. (1998) Human Gene Therapy 9:2527–2535) wurde in die AAV-Expressionskassette pV4.1c an den BamHI/HindII-Stellen kloniert. Die Expressionskassette enthält einen CMV-Promoter, ein chimäres Intron, bestehend aus einem CMV-Splice-Donor und einer menschlichen β-Globin-Splice-Akzeptorstelle, eine menschliche Wachstumshormon-Polyadenylierungssequenz und flankierende AAV ITRs (inverse terminale Repeats) (Herzog, R. W., et al. (1999) Nature Medicine 5:56–63.).
  • 2. pAAV-LacZ:
  • Der Vektor pAAV-LacZ wurde wie folgt konstruiert. Der AAV kodierende Bereich von pSub201 (Samulski et al. (1987) J. Virol 61:3096–3101) zwischen den XbaI-Stellen wurde durch EcoRI-Linker ersetzt, was zu dem Plasmid pAS203 führte. Das EcoRI- bis HindIII-Fragment von pCMVβ (CLONETECH) wurde mit glatten Enden versehen und in die Klenow-behandelte EcoRI-Stelle von pAS203 zum Erhalt von pAAV-lacZ kloniert.
  • 3. pRLp19:
  • Das Plasmid H19 kodiert ein modifiziertes AAV-2-Genom, das so entworfen wurde, dass es eine verstärkte AAV-Vektor-Produktion aufwies, während die Erzeugung von replikationskompetentem Pseudo-Wildtyp-Virus unterdrückt wurde. Das Plasmid enthält einen P5-Promotor, verlagert an eine Position 3' vom cap-Gen und der Promotor wird durch eine 5'-nicht-translatierte Region ersetzt, die im wesentlichen aus einer FLP-Rekombinase-Erkennungssequenz besteht. pH19 wurde so konstruiert, dass alle Regionen einer Homologie zwischen den 3'- und 5'-Enden des AAV-Genoms eliminiert wurden. Zusätzlich wurde die sieben Basenpaar-TATA-Box des pH19-P5-Promotors durch Mutation dieser Sequenz zu GGGGGGG zerstört.
  • pH19 wurde in einem Prozess mit etlichen Schritten konstruiert, wobei AAV-2-Sequenzen verwendet wurden, die vom AAV-2-Provirus, pSM620 abstammten. pSM620 wurde mit SmaI und PvuII verdaut und das 4543 bp, rep- und cap-Gen, kodierend das SmaI-Fragment, wurde in die SmaI-Stelle von pUC 119 kloniert, um das 7705 bp Plasmid, pUCrepcap, zu produzieren. Die verbleibenden ITR-Sequenzen, die die rep- und cap-Gene flankierten, wurden dann durch eine Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide deletiert:
    145A; 5'-GCT CGG TAC CCG GGC GGA GGG GTG GAG TCG-3' (SEQ ID NO: 3)
    145B; 5'-TAA TCA TTA ACT ACA GCC CGG GGA TCC TCT-3' (SEQ ID NO: 4).
  • Das resultierende Plasmid, pUCRepCapMutated (pUCRCM) (7559 bp) enthält das gesamte AAV-2-Genom ohne irgendeine ITR-Sequenz (4389 bp). SrfI-Stellen, teilweise durch mutagene Oligonukleotide eingeführt, flankieren die rep- und cap-Gene bei diesem Konstrukt. Die AAV-Sequenzen korrespondieren zu den AAV-2-Positionen 146 bis 4534.
  • Eine Eco47III-Stelle wurde am 3'-Ende des P5-Promotors eingeführt, um die Exzision der P5-Promotorsequenzen zu erleichtern. Um dies zu tun, wurde pUCRCM mit dem Primer P547 (5'-GGT TTG AAC GAG CGC TCG CCA TGC-3') (SEQ ID NO: 5) mutagenisiert. Das resultierende 7559 bp-Plasmid wurde als pUCRCM47III bezeichnet.
  • Der Polylinker von pBSIIsk+ wurde durch Exzision des Originals durch BSSHII und durch Ersatz mit Oligonukleotiden Blunt 1 und 2 verändert. Das resultierende Plasmid, Bluntscript, hat eine Länge von 2830 bp und der neue Polylinker kodiert die Restriktionsstellen EcoRV, HpaI, SrfI, PmeI und Eco47III. Die Blunt 1 und 2-Sequenzen waren wie folgt:
    Blunt 1; 5'-CGC GCC GAT ATC GTT AAC GCC CGG GCG TTT AAA CAG CGC TGG-3' (SEQ ID NO: 6)
    Blunt 2; 5'-CGC GCC AGC GCT GTT TAA ACG CCC GGG CGT TAA CGA TAT CGG-3' (SEQ ID NO: 7).
  • pH1 wurde durch Ligation des 4398 bp, rep- und cap-Gens, kodierend das SmaI-Fragment von pUCRCM in die SmaI-Stellt von pBluntscript konstruiert, so dass sich die HpaI-Stelle proximal zum rep-Gen befand. pH1 hat eine Länge von 7228 bp.
  • pH2 ist identisch zu pH1, außer dass der P5-Promotor von pH1 durch den 5'-nicht-translatierten Bereich von pGN1909 ersetzt ist. Um dies zu tun, wurde das 329 bp AscI (blunt)-SfiI-Fragment, kodierend den 5'-nicht-translatierten Bereich von pW1909lacZ in das 6831 bp SmaI (Teil)-SfiI-Fragment von pH1 ligiert, wodurch pH2 erzeugt wurde. pH2 hat eine Länge von 7156 bp.
  • Ein P5-Promotor wurde dem 3'-Ende von pH2 durch Insertion des 172 bp, SmaI-Eco43III-Fragments, kodierend den p5-Promotor von pUCRCM47III in die Eco47III-Stelle in pH2 zugefügt. Dieses Fragment war so orientiert, dass die Transkriptionsrichtung aller drei AAV-Promotoren dieselbe war. Dieses Konstrukt hat eine Länge von 7327 bp.
  • Die TATA-Box von 3'P5 (AAV-2 Positionen 255–261, Sequenz TATTTAA) wurde eliminiert, indem die Sequenz zu GGGGGGG unter Verwendung des mutagenen Oligonukleotids 5DIVE2 (5'-TGT GGT CAC GCT GGG GGG GGG GGC CCG AGT GAG CAC G-3') (SEQ ID NO: 8) geändert wurde. Das resultierende Konstrukt, pH 19, hat eine Länge von 7328 bp.
  • 4. Pladeno5:
  • Pladeno 5 ist ein Plasmid, das einen vollständigen Satz von Adenovirus-Helferfunktionen für die AAV-Vektorproduktion bereitstellt, wenn es in 293 Zellen transfiziert wird. Essenziell besteht es aus den E2A-, E4- und VA RNA-Regionen von Adenovirus-2 und einem Plasmid-Grundgerüst. Das Plasmid wurde wie folgt konstruiert:
    pBSIIs/k+ wurde modifiziert, um die 637 bp-Region, kodierend den Polylinker und die α-Komplementierungskassette durch eine einzelne EcoRV-Stelle zu ersetzen, wobei eine Oligonukleotid gerichtete Mutagenese und das folgende Oligonukleotid verwendet wurden:
    5'-CCG CTA CAG GGC GCG ATA TCA GCT CAC TCA A-3' (SEQ ID NO: 9). Ein Polylinker, kodierend die Restriktionsstellen BamHI, KpnI, Srf1, XbaI, C1apI, Bstl107I, Sa1I, PmeI und NdeI wurde dann in die EcoRV-Stelle kloniert (5'-GGA TCC GGT ACC GCC CGG GCT CTA GAA TCG ATG TAT ACG TCG ACG TTT AAA CCA TAT G-3') (SEQ ID NO: 10).
  • Adenovirus-2-DNA wurde verdaut und Restriktionsfragmente, kodierend die E2A-Region (ein 5.335 bp, KpnI-SrfI-Fragment, korrespondierend zu Positionen 22.233 bis 27.568 des Adenovirus-2-Genoms) und die VA RNAs (ein 731 bp, EcoRV-SacII-Fragment, korrespondierend zu Positionen 10.426 bis 11.157 des Adenovirus-2-Genoms) wurden isoliert. Das E2A- Fragment wurde zwischen den Sa1I- und KpnI-Stellen des Polylinkers installiert. Eine E4-Region wurde zunächst in pBSIIs/k+ durch Ligation eines 13.864 bp, BamHI-AvrII-Fragments, korrespondierend zu den Adenovirus-2-Positionen 21.606 bis 35.470 (kodierend das 5'-Ende des Gens) und eines 462 bp, AvrII und SrfI verdauten PCR-Fragments, korrespondierend zu den Adenovirus-2-Positionen 35.371 bis 35.833 (kodierend das 3'-Ende des Gens) zwischen den BamHI- und SmaI-Stellen von pBSIIs/k+ zusammengebaut. Die zur Erzeugung des PCR-Fragments verwendeten Oligonukleotide waren so entworfen, dass sie eine SrfI-Stelle an der Verbindung einführen, an der der E4-Promotor und das Adenovirusterminale Repeat sich kreuzen und haben die folgenden Sequenzen: 5'-AGA GGC CCG GGC GTT TTA GGG CGG AGT AAC TTG C-3' (SEQ ID NO: 11) und 5'-ACA TAC CCG CAG GCG TAG AGA C-3' (SEQ ID NO: 12). Die intakte E4-Region wurde durch Spaltung mit SrfI und SpeI ausgeschnitten und das 3.189 bp-Fragment, korrespondierend zu den Adenovirus-2-Positionen 32.644 bis 35.833 wurde in das E2A-Intermediat zwischen den SrfI- und XbaI-Stellen kloniert. Schließlich wurde das VA-RNA-Fragment in die Bst1107-Stelle inseriert, nach einer T4-Polymerasevermittelten Modifikation zu glatten Enden der SacII-Stelle. Die Gene in pladeno 5 sind so angeordnet, dass die 5'-Enden der E2A- und E4-Promotoren aufeinander stoßen, was dazu führt, dass sich die Regionen in entgegengesetzten Richtungen voneinander transkribieren. Die VA RNA-Gene, die an den drei Primeenden des E4-Gens lokalisiert sind, transkribieren sich zu dem E4-Gen hin. Das Plasmid hat eine Länge von 11.619 bp.
  • AAV-Vektor-Produktion
  • Die HEK 293-Zelllinie (Graham, F.L., Smiley, J., Russel, W.C. und Naiva, R. (1977) Characteristics of a human cell line transformed by DNA of human Adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 36:59–72) wurde in komplettem DMEM (BioWhittaker), enthaltend 4,5 g/Liter Glukose, 10 % wärmeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS) und 2 mM Glutamin bei 37°C in 5 % CO2 an Luft kultiviert. Vierzig T225-Kolben wurden mit jeweils 2,5 × 106 Zellen ausgesät und drei Tage vor einer Transfektion zu 70 bis 80 % Konfluenz (ungefähr 1,5 × 107 Zellen pro Kolben) gezüchtet.
  • Die Transfektions- und Reinigungsverfahren, wie beschrieben von Matsushita et al (Matsushita, T., Eiliger, S., Elliger, C., Podsakoff, G., Villarreal, L., Kurtzman, G.J.,Iwaki, Y. und Colosi, P. (1998) "Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus," Gene Therapy 5: 938–945) wurden für die AAV-Vektor-Produktion mit kleinen Modifikationen verwendet. Das Vektor-Produktionsverfahren involvierte eine Co-Transfektion von HEK 293-Zellen mit 20 μg von jedem der folgenden drei Plasmide pro Kolben: das AAV-AADC-Plasmid, das AAV-Helferplasmid (pHLP 19, enthaltend die AAV rep- und cap-Gene) und das Adenovirus-Helferplasmid (pladeno-5, früher bekannt als pVAE2AE4-2 (4) und bestehend aus den E2A-, E4- und VA RNA-Genen, abgeleitet von gereinigtem Adenovirus-2), wobei das Calciumphosphatverfahren verwendet wurde (Wigler, M. et al. (1980) Transformation of mammalian cells with an amplifiable dominant-acting gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567–3570) und zwar für eine Zeitspanne von 6 Stunden. Nach der Transfektion wurden die Medien ersetzt und die Zellen 3 Tage später geerntet. Die Zellpellets wurden dann drei Zyklen einer Einfrier-Auftau-Lyse unterzogen (alternierend zwischen trockenem Eis-Ethanol und 37°C-Bädern mit intermittierendem Vortexen). Der Zellabfall wurde durch Zentrifugation (10.000 g für 15 Minuten) entfernt. Der Überstand wurde ein zweites Mal zentrifugiert, um jede verbliebene Trübheit zu entfernen und darauffolgend mit Benzonase® (200 U/ml) bei 37°C für 1 Stunde behandelt, um kontaminierende zelluläre DNA zu reduzieren. Folgend auf die Inkubation wurde der Überstand in CaCl2 auf 25 mM eingestellt und für 1 Stunde auf Eis platziert. Das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugation (10.000 g für 15 Minuten) entfernt und verworfen. Der Überstand wurde dann auf 10 % in PEG (8000) eingestellt und 3 Stunden auf Eis platziert. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation (3000 g für 30 Minuten) gesammelt und in 4 ml 50 mM NaHEPES, 0,15 M NaCl, 25 mM EDTA (pH 8,0) pro 20 T225-Kolben resuspendiert. Festes CsCl wurde zugefügt, um eine Dichte von 1,4 g/ml zu erzeugen und die Probe wurde bei 150.000 g 24 Stunden in einem Beckman TI70-Rotor zentrifugiert. AAV enthaltende Fraktionen wurden gesammelt, auf eine Dichte von 1,4 g/ml CsCl eingestellt und bei 350.000 g 16 Stunden in einem Beckman NVT65-Rotor zentrifugiert. Die Fraktionen, die AAV enthielten, wurden dann konzentriert und gegen Exzipientenpuffer (5 % Sorbitol in PBS) diafiltriert. Der Titer des gereinigten AAV-ARDC-Vektors wurde unter Verwendung einer quantitativen Dot-Blot-Analyse bestimmt und Vektor-Grundlösungen wurden bei –80°C gelagert.
  • Virale Infusion
  • In dem Chirurgieraum wurde ein steriles Feld erzeugt, um das Infusionssystem herzustellen. Infusionskanülen wurden mit Salzlösung gespült, um die Integrität zwischen Nadel und Leitungsgrenzfläche zu bewerten. Sterile Infusionskanülen und Beladungsleitungen wurden unter Verwendung der geeigneten Verbindungsstücke mit großer Vorsicht verbunden, um eine Sammlung von Luftbläschen im System zu vermeiden. Nicht-sterile Öl-Infusionsleitungen wurden wie vorher beschrieben hergestellt und 1 ml gasdichte Hamilton-Spritzen, gefüllt mit Öl, wurden an der Harvard-Infusionspumpe befestigt. Sechs Infusionskanülen wurden auf Mikrodialysehalter (3 Kanülen pro Halter) befestigt und auf einem stereotaktischen Turm angebracht. Folgend auf die Verbindung der Öl- und Beladungsleitungen wurden die Nadelkanülen mit AAV sensibilisiert und das Infusionssystem auf einen Chirurgietisch übertragen. Anfängliche Infusionsraten wurden auf 0,1 pl/min eingestellt und die Leitungen visuell überprüft, um einen glatten Fluss der Flüssigkeit durch das System sicherzustellen und die Kanülen manuell zu ihren Zielstellen abgesenkt. Eine abschließende visuelle Inspektion wurde durchgeführt, um zu überprüfen, ob Luftblasen im Infusionssystem vorhanden waren.
  • Das Kanülensystem bestand aus drei Komponenten: (i) einer sterilen Infusionskanüle; (ii) einer sterilen Beladungsleitung, die AAV-AADC oder AAV-LacZ (Kontrolle) beherbergte und (iii) einer nicht-sterilen Infusionsleitung, die Olivenöl enthielt. Die Präparation jeder Leitung wird hier kurz beschrieben. Die Infusionskanüle bestand aus 27 G Nadeln (äußerer Durchmesser 0,03 inch; innerer Durchmesser 0,06 inch; Terumo Corp., Elkton, MD), verbunden mit Quarzglas (äußerer Durchmesser 0,016 Inch, innerer Durchmesser 0,008 inch; Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) und wurde in eine Teflon-Leitung platziert (0,03 inch ID, Upchurch Scientific, Seattle, WA), so dass die distale Spitze des Quarzglases ungefähr 15 mm aus der Rohrleitung hervorstand. Die Nadel wurde in die Leitung unter Verwendung von Superglue befestigt und das System wurde vor der Verwendung im Hinblick auf Lecks überprüft. Am proximalen Ende der Leitung befand sich ein Tefzel-Verbindungsstück und ein Ferrul, um die benachbarte Beladungsleitung anzubinden.
  • Beladungs- und Infusionsleitungen bestanden aus 50 cm Sektionen einer Teflonrohrleitung (Außendurchmesser 0,062 inch, Innendurchmesser 0,03 inch), verbunden mit Tefzel 1/16 Inch Ferrul, Verbindungsstücken und Außen-Luer-Lock-Adaptern (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) an den distalen Enden. Die sterilen Beladungslinien konnten bis zu 1.000 ml Volumen aufnehmen und wurden mit Salzlösung vor der Verwendung sensiblisiert.
  • Die Tiere wurden ursprünglich mit Ketamin sediert (Ketaset; 10 mg/kg, i. m.), intubiert und für die Chirurgie vorbereitet. Eine venöse Leitung wurde unter Verwendung eines 22 Gauge-Katheters etabliert, positioniert in der Schädelvene oder der Vena saphena, um isotonische Flüssigkeiten mit 5 bis 10 ml/kg/h zuzuführen. Isofluran (Aerrane, Omeda PPD Inc., Liberty, NJ) wurde mit 1 bis 3 % zugeführt, bis das Tier eine stabile Anästhesieebene aufrechterhielt. Der Kopf wurde in einen MRI-kompatiblen stereotaktischen Rahmen gemäß vorher festgesetzten Werten, erhalten während eines Basislinien-MRI-Scans, platziert. Das Tier wurde mit subkutanen Elektrokardiogrammelektroden und einer Rektalsonde versehen und der Körper mit zirkulierenden Wasserdecken bedeckt, um eine Kerntemperatur von 36 bis 38°C zu erhalten. Elektrokardiogramm und Herzrate (unter Verwendung des Silogic ECG-60, Stewartstown, PA) und Körpertemperatur wurden während des Verfahrens kontinuierlich überwacht. Der Kopf wurde mit Betadin und 70 % Ethanol vorbereitet, ein steriles Feld wurde erzeugt und eine Mittellinieninzision wurde durch die Haut, die Muskeln und die Faszien unter Verwendung einer Elektrokauterisierung durchgeführt (Surgistat Electrosurgery, Valleylab Inc., Boulder, CO).
  • Eine vorsichtige Retraktion der Faszien und Muskeln ermöglichte ein Offenlegen des Kraniums über kortikale Eingangsstellen. Eine unilaterale Kraniotomie wurde unter Verwendung eines Dremel-Dentalbohrers durchgeführt, um einen 3 cm × 2 cm Bereich der Dura mater überhalb der Zielstellen freizulegen. Multiple Nadelkanülen, befestigt an einer Haltevorrichtung, wurden stereotaktisch in die Ziel-Striatum-Stellen geführt. Chirurgische Parameter für die unilaterale Infusion von AAV in die Hämisphere, ipsilateral zu der ICA MPTP-Infusion sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
  • Tabelle 2: Chirurgische Parameter für die AAV-Infusion
    Figure 00680001
  • Ungefähr 15 Minuten folgend auf die Infusion wurde die Kanülen-Anordnung mit einer Rate von 1 mm/min angehoben, bis sie sich außerhalb des Kortex befand. Der Kortex wurde mit Salzlösung gespült, die Knochenränder mit Knochenzangen getrimmt und die Wundstelle in anatomischen Schichten geschlossen. Analgetika (Numorphan, 1M) und Antibiotika (Flocillin, 1M) wurden als Teil des chirurgischen Protokolls verabreicht. Die Tiere wurden im Hinblick auf eine vollständige Erholung aus der Anästhesie überwacht, in ihren Heimatkäfigen platziert und klinisch beobachtet (2×/Tag) und zwar für ungefähr fünf Tage folgend auf die Chirurgie. Die gesamte Neurochirurgiezeit betrug 4,5 Stunden pro Tier.
  • Folgend auf eine Intrastriatum-AAV-Verabreichung wurden die Tiere im Hinblick auf irgenwelche Zeichen eines abnormalen Verhaltens hin bewertet. Die Tiere wurden beobachtet und von Veterinärtechnikern zweimal am Tag unter Verwendung von klinischen Beobachtungsformularen bewertet. Alle Affen erholten sich innerhalb von 2 Stunden von der Chirgie und waren in der Lage, sich selbst zu erhalten, einschließlich Fressen und Pflege. Es gab keine Zeichen nachteiliger Wirkungen während der gesamten 8-wöchigen postchirurgischen Periode.
  • Magnetische Resonanzabbildung
  • Die Visualisierung der Zielstelle ist für die präzise Platzierung der Zellen innerhalb des Nucleus caudatum oder Putamen wichtig. Stereotaktische Verfahren, kombiniert mit MRI, wurden verwendet, um die Kanüle in den gewünschten Zielstrukturen akkurat zu platzieren. Alle Tiere wurden vor der Chirurgie gescannt, um akkurate stereotaktische Koordinaten der Zielimplantatstellen für jedes individuelle Tier zu erzeugen. Dieselben Fiduzial-Marker, die für das PET-Scanning verwendet werden, wurden auf dem Rahmen für die Co-Registrierung von MRI- und PET-Bilder platziert. Kurz gefasst wurden die Tiere während des Scanningverfahrens unter Verwendung einer Mischung aus Ketamin (Ketaset, 7 mg/kg, i.m.) und Xylazin (Rompun, 3 mg/kg, i.m.) sediert. Die Tiere wurden in einem MRI-kompatiblen stereotaktischen Rahmen platziert, Ohrstangen- und Augenstangen-Messungen wurden aufgezeichnet und eine IV-Leitung etabliert. Sechs koronale Bilder (1 mm) und 15 Sagittalbilder (3 mm) wurden unter Verwendung einer GE Signa 1,5 Tesla-Maschine aufgenommen. Magnetische Resonanzbilder waren T1-gewichtet und wurden in drei Ebenen unter Verwendung einer Spoiled-Grass-Sequenz mit einer Wiederholungszeit (TR) = 700 ms, einer Echozeit (TE) = 20 ms und einem Kipp- (Flip-) Winkel von 30 erhalten. Das Feld der Ansicht betrug 15 cm mit einer 192 Matrix und 2 NEX (Zahl der Mittel pro Signalinformation). Die Grundlinien-Scanzeit betrug ungefähr 20 Minuten. Rostro-kaudale und medio-laterale Verteilungen einer Zielstruktur (z.B. Nucleus caudatus) wurden unter Verwendung der koronalen MR-Bilder bestimmt. Chirurgische Koordinaten wurden aus vergrößerten koronalen Bildern (1,5×) des Nucleus caudatum und Putamen bestimmt.
  • Positronen-Emissions-Tomographie (PET)
  • Alle 4 Tiere erhielten 2 PET-Scans, einen Grundlinienscan, folgend auf die Etablierung der MPTP-Läsion und einen zweiten Scan 7 bis 8 Wochen nach der Infusion entweder mit AAV-AADC oder AAV-LacZ. Vor der PET durchlief jedes Tier eine magnetische Resonanz (MR) -Abbildung unter Verwendung eines 1,5 T-Magneten und eines stereotaktischen Rahmens, der eine Coregistrierung zwischen PET- und MR-Datensätzen durch Verwendung von externen Fiduzial-Markern ermöglichte. Die PET-Studien wurden am dem PET-600-System durchgeführt, einem Einzelschnitt-Tomograph mit einer Auflösung von 2,6 mm inplane und einer einstellbaren axialen Auflösung, die für die gegenwärtige Studie von 6 mm auf 3 mm erhöht wurde, durch Verminderung der Abschirmlücke. Die Charakteristiken dieses Tomographen wurden bereits früher beschrieben (Budinger et al. (1991) Nucl. Med. Biol. 23(6):659–667; Valk, (1990) Radiology 176(3):783–790). Die Affen wurden intubiert und mit Isofluran anästhesiert, in einen sterotaktischen Rahmen platziert und in dem PET-Scanner positioniert, um einen coronalen Gehirnschnitt abzubilden, der durch das Striatum führte. Die Affen wurden auf dieselbe Weise für jede Studie unter Verwendung der Anterior-Posterior-Bewertungen auf den stereotaktischen Rahmen und einem Laserlicht, verbunden mit dem Tomographen, positioniert. Nach Positionierung in dem Scanner wurde ein 5-Minuten-Transmissionsscan erhalten, um die Photonenattenuierung zu korrigieren und die Positionierung des Tiers zu überprüfen. Die Affen wurden dann mit 10 bis 15 mCi des AADC-Tracers, 6-[18F]-Fluor-L-m-tyrosin (FMT) injiziert und die Abbildung begann. Die Abbildung dauerte 60 Minuten an, zu welchem Zeitpunkt der Affe so repositioniert wurde, dass ein zweiter Schnitt 6 mm kaudal zum ersten abgebildet wurde.
  • Die PET- und MR-Datensätze wurden coregistriert und interessierende Regionen (ROs) wurden für das Striatum in der kontralateralen Hämisphere (der Seite gegenüber der ICA MPTP- Infusion) an den PET-Daten, gesammelt nach 50 bis 60 min (Schnitt 1) und 65 bis 75 min (Schnitt 2) unter Referenz auf das MR gezeichnet. Spiegelbilder der ROs wurden in der ipsilateralen Hämisphere (Seite der MPTP-Infusion) erzeugt und Radioaktivitätszählungen (cm2/sek) wurden für jedes ROI bestimmt. Striatumzahlen wurden über die zwei Schnitte für jede Studie gemittelt. FMT-Aufnahme-Asymmetrieverhältnisse wurden für jedes Tier zu jedem Zeitpunkt berechnet durch Subtraktion der Zahlen für das ipsilaterale (läsionierte) Striatum von den Zahlen für das kontralaterale (nicht-läsionierte) Striatum und Division durch die durchschnittlichen Zahlen für die ipsilateralen und kontralateralen Striata. Um zwischen der Tiervariabilität in Asymetrieverhältnissen zu reduzieren, wurde eine Veränderungsbewertung kalkuliert und zwar durch Subtraktion des Asymmetrieverhältnisses von der zweiten PET-Studie von dem Asymmetrieverhältnis für die Basislinienstudie für jedes Tier. Ungepaarte t-Tests wurden verwendet, um die Veränderung in den PET-Asymmetrieverhältnissen für die AAV-AADC- und AAV-LacZ-Affen zu vergleichen.
  • Wie erwartet, zeigten alle 4 Affen eine größere FMT-Aufnahme im kontralateralen als im ipsilateralen Striatum bei der Grundlinie, die eine vernachlässigbare Aufnahme zeigte. Zu der Zeit der zweiten PET-Studie zeigten die AAV-AADC-behandelten Affen eine erhöhte FMT-Aufnahme im ipsilateralen Striatum, während die AAV-LacZ-behandelten Tiere keine Veränderung von der Basislinie zeigten (7). Die Veränderung der FMT-Aufnahmeasymmetrie von der Basislinie zu der zweiten PET-Studie war signifikant (p < 0,01) größer für die AAV-AADC-Affen, die eine geringe Asymmetrie zum Zeitpunkt der zweiten Studie zeigten, als für die AAV-LacZ-Affen, die eine höhere kontralaterale FMT-Aufnahme zu beiden Zeitpunkten zeigten (8).
  • Nekropsie
  • Die Tiere wurden mit Natriumpentobarbital (25 mg/kg i. v.) tief anästhesiert und 8 bis 9 Wochen folgend auf die AAV-Verabreichung und eine Woche folgend auf postchirurgische PET-Scans geopfert. Am Tag der Opferung wurden Blutproben genommen und die Tiere mit einer L-Dopa/Carbidopa-Präparation (Sinemet 250/25) behandelt. Zum Zeitpunkt der Nekropsie wurden Plasma und zervikales CSF gesammelt. Die Gehirne wurden 30 bis 45 Minuten folgend auf die Sinemet-Verabreichung entfernt, in der Gehirnmatrix platziert und koronal in 3 bis 6 mm Schnitte sektioniert. Ein 3 mm dicker Striatum-Gehirnschnitt von jedem Affen wurde direkt bei –70°C Isopentan eingefroren und gefroren für die biochemische Analyse gelagert. Die verbliebenen 6 mm dicken Schnitte wurden in Formalin 72 Stunden postfixiert, 12 Stunden in PBS gewaschen und in einem aufsteigenden Saccharosegradienten (10–20–30 %) eingestellt und eingefroren.
  • Histologische Analyse
  • Die Formalin-fixierten Gehirnschnitte wurden in 30 μm dicke Koronalsektionen in einem Cryostat geschnitten. Gefrorene Sektionen wurden in einer Reihe gesammelt, beginnend auf dem Niveau der Rostralspitze des Nucleus caudatus bis hin kaudal auf das Niveau der Substantia nigra. Jede Sektion wurde gespeichert und in Anti-Einfrierlösung bei 70°C gehalten. Serielle Sektionen wurden für Tyrosinhydroxylase (TH), Dopa-Decarboxylase (DDC) oder β-Galactosidase (β-gal) -Immunreaktivität (IR) gefärbt. Jede 12. Sektion wurde in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in 3 % H2O2 20 Minuten inkubiert, um die endogene Peroxidasaktivität zu blockieren. Nach dem Waschen in PBS wurden die Sektionen für 30 Minuten in Blockierungslösung inkubiert (10 % normales Pferdeserum für TH oder 10 % normales Ziegenserum für DDC und β-gal und 0,1 % Triton-X100 in PBS), gefolgt von einer Inkubation in primärer Antikörperlösung-TH (Maus-monoklonal, Chemicon, 1:1000), DDC (Kaninchen-polyklonal, Chemicon, 1:2000) oder β-gal (Kaninchen-polyklonal, Cortex Blochem, 1:5000) für 24 Stunden. Die Sektionen wurden dann 1 Stunde in biotinyliertem Anti-Maus-IgG-sekundärem Antikörper für TH oder Anti-Kaninchen-IgG-sekundärem Antikörper für DDC und β-gal (Vektor Labs, 1:300) inkubiert. Die Antikörperbindung wurde mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase (Vektor Labs, 1:300) und DAB-Chromogen mit Nickel (Vektor Labs) sichtbar gemacht. Die Sektionen wurden dann mit einer Abdeckung versehen und unter einem Lichtmikroskop überprüft.
  • Folgend auf ein Gewebeausstanzen wurden die frisch eingefrorenen Blocks alle 20 μm sektioniert. Die Sektionen wurden mit H & E und für DDC-IR gefärbt.
  • Quantitative Schätzungen der Gesamtzahl der AAV-infizierten Zellen innerhalb des Nucleus caudatum, Putamen und Globus pallidus wurden unter Verwendung einer optischen Dissektormethode bestimmt. Das optische Dissektorsystem bestand aus einem computerunterstützten Bildanalysesystem, einschließlich einem Leitz Otholux 11-Mikroskop, hart gekoppelt mit einer Prior H128-Computer-kontrollierten x-y-z-motorisierten Stufe, einem hoch empfindlichen Sony 3CCD-Video-Kamera-System (Song, Japan) und einem Macintosh G-3-Computer. Alle Analysen wurden unter Verwendung der NeuroZoom-Software (La Jolla, CA) durchgeführt. Vor jeder Messreihe wurde das Instrument kalibriert. Die Region positiver Neuronen im Nucleus caudatum, Putamen und Globus pallidus wurde bei niedriger Vergrößerung (2,5fach Objektiv) umrissen. Aufgrund der diffusen Gegenwart von AAV-infizierten Zellen im Striatum wurde 1 % des umrissenen Bereiches mit einem systematischen statistischen Design der Dissektorzählrahmen (1 505 1IM2) unter Verwendung eines 63fach Plan-Neofluar-Immersionsobjektiv mit einer 0,95 numerischen Öffnung gemessen. Basierend auf Pilot-Experimenten wurden als Probe mindestens vier Sektionen in gleicher Beabstandung genommen. Unter Verwendung des Dissektorprinzips wurden als Proben bis zu 200 AADC-positive Neuronen durch optisches Scanning unter Verwendung eines einheitlichen, systematischen und statistischen Designverfahrens für alle Messungen genommen. Die durchschnittliche Dicke der Sektionen wurde bei 23 μm gemessen. Sobald die Spitze der Sektion im Fokus war, wurde die z-Ebene auf 1 bis 2 gm erniedrigt. Die Zählungen wurden dann durchgeführt, während durch drei 5 lim dicke Dissektoren fokussiert wurde. Man sollte dabei vorsichtig sein um sicherzustellen, dass die Bodenverbotsebene nie in der Analyse enthalten war. Die Volumina der Strukturen wurden gemäß Standardverfahren berechnet. Die Gesamtzahl der positiven Zellen in den überprüften Strukturen wurde unter Verwendung der Formel N = Nv × Vs berechnet, wobei Nv die numerische Dichte und Vs das Volumen der Struktur ist.
  • Die TH-IR-Färbung ergab eine robuste Reduktion der Nigrostriatumfasern und Zellkörper in der Substantia nigra auf der ipsilateralen Seite aller Affen. Die kontralaterale Seite zeigte variable Reduktionen von TH und AADC-IR im Striatum und der Substantia nigra.
  • DDC-IR ergab nur bei den Affen, die mit AAV-LacZ behandelt wurden, Parallelen zu TH-IR. Die AAV-AADC-behandelten Affen zeigten eine robuste AADC-Färbung auf der ipsilateralen Seite, die die auf der kontralateralen Seite angetroffene Färbung überstieg. Eine hohe Dichte an AADC-IR-Zellen wurde durch 80 % des Striatums und 100 % des Globus pallidus bei einem der AAV-AADC-behandelten Tiere beobachtet. Die stereologische Analyse ergab 18.384 Zellen pro mm3 im Putamen, 15.126 Zellen pro mm3 im Nucleus caudatum und 9.511 Zellen pro mm3 im Globus pallidus. Die Gesamtzahl der AAV-infizierten Zellen wurde auf mindestens 16 × 106 Zellen geschätzt. Bei dem anderen AAV-AADC-behandelten Affen wurden AADC-IR-Zellen in über 60 % des ipsilateralen Striatums angetroffen, mit 7.515 Zellen pro mm3 im Nucleus caudatum und 15.352 Zellen pro mm3 im Putamen und 3.850 Zellen pro mm3 im Globus pallidus. Es wurden keine AADC-Zellen im kontralateralen Striatum angetroffen. Die AAV/LacZ-behandelten Affen zeigten AADC-IR weder im ipsilateralen noch im kontralateralen Striatum.
  • Mit AAV infizierte Zellen schienen eine neuronale Morphologie aufzuweisen. Der durchschnittliche Durchmesser der infizierten Zellen betrug 9 ± 2,3 μm im Putamen und 14,6 ± 9 μm. Viele LacZ- und AADC-Zellen hatten eine typische halb-fortsatzartige Neuronenmorphologie. AAV-infizierte Zellen waren im Hinblick auf den neuronalen Marker, Neu-N, positiv. Bei den AAV-AADC-behandelten Affen war eine von 4–6 Neu-N-positiven Zellen AADC-positiv im Nucleus caudatus und dem Putamen und eine von 3–4 Neu-N-positiven Zellen war AADC-positiv im Globus pallidus. Keine der AAV-infizierten Zellen in den Lac-Z- oder AADC-behandelten Affen war GFAP-positiv.
  • Bereiche, benachbart zu den Kanülentrakts waren mit Nissi- und H & E-Färbung gefärbt. Es wurden keine Zeichen einer Zytotoxizität beobachtet. Es wurde keiner perivaskuläre Leukozytenansammlung beobachtet, unabhängig von der Entfernung von der Kanüle. Es gab keine Zeichen einer neuronalen Zellreduktion nahe der Infusionsstelle im Vergleich mit der kontralateralen Seite unter Verwendung von Neu-N-Immunfärbung. Eine GFAP-Immunfärbung konnte keine abnormale Gliareaktion innerhalb des AAV-behandelten Striatums nachweisen.
  • Biochemische Analyse
  • Gehirnregionen wurden aus den frisch eingefrorenen Blocks unter Verwendung einer Mikrostanzvorrichtung entfernt, um Gewebeniveaus an L-Dopa- und Dopamin-Metaboliten und die Aktivität von AADC und die Gegenwart des AAV-Vektors zu bewerten. Die Gehirnregionen beinhalteten Striatum und Cortex.
  • Eingefrorene Mikroausstanzungen wurden gesammelt und unter Verwendung einer Ultraschallverarbeitung in 300 pl 0,1 M Perchlorsäure (Fisher Scientific), enthaltend 1 % Ethanol und 0,02 % EDTA (Fisher Scientific) homogenisiert. 50 pl des Homogenats wurde für die Proteinanalyse (BCA Protein Assay Kit Pierce #23225) entfernt und der Rest in einer Mikrozentrifuge 1,5 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. 30 bis 50 pl Homogenat wurden für die Katecholaminanalyse durch HPLC unter Verwendung einer Ultrasphere C-18-Ionenpaars, 5 p, 4,6 × 250 mm Säule (Beckman 235329) verwendet; ein Waters 717p1us Autosampler bei 4°C, Waters 510-Pumpe bei 0,9 mv/min und ein amperometrischer elektrochemischer Detektor (Decade), festgesetzt auf Eox. 0,82 V wurden weiterhin verwendet. Säule und Detektorzelle waren auf 31°C eingestellt. Die mobile Phase enthielt 2 L HPLC Grad Wasser, 2,2 g 1-Heptansulfonsäure, Natriumsalz (Fisher Scientific), 0,17 g EDTA, 12 ml Triethylamin (Fisher Scientific), pH mit 8 ml 85%iger Phosphorsäure (Fisher Scientific) auf 2,5 eingestellt und 60 ml Acetonitril (J. T. Baker). Die Detektorausgabe wurde aufgezeichnet und mit dem Waters Millennium 32 Chromatographiemanager analysiert.
  • AADC-Analyse
  • Die AADC-Aktivität wurde durch eine Anpassung des Verfahrens von Nagatsu et al. (1979) Anal. Biochem. 100:160–165 bestimmt. Kurz gefasst wurde Gewebe (10 mg/ml) in einem 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 0,04 mM Pyrixylphosphat (ein AADC-Cofaktor) und 0,2 mM Pargylin homogenisiert. Die Proben wurden 5 Minuten bei 37°C präinkubiert und die Reaktion durch Zugabe von L-Dopa (Endkonzentration: 100 μM) initiiert. Die Inkubationen wurden 20 Minuten lang durchgeführt und die Reaktion durch Zugabe von 0,02 ml konzentrierter Perchlorsäure beendet. Nach der Zentrifugation wurde die Überstand-Dopaminkonzentration unter Verwendung von HPLC mit elektrochemischem Nachweis bestimmt (siehe z.B. Boomsa et al. (1988) Clin. Chem. Acta 178:59–69). Die Proteinkonzentration im Gewebepellet wurde unter Verwendung des BCA Protein Assay Kits (Pierce #23225) bestimmt. Die Ergebnisse sind als nM/Stunde/mg Protein ausgedrückt. Gefrorene Gewebeausstanzungen wurden gemäß Standardprotokollen verarbeitet.
  • Kortikalbereiche aller Affen zeigten variable Niveaus an L-Dopa, waren jedoch innerhalb jedes Affen konsistent. Wie erwartet, gab es keine Decarboxylierung von L-Dopa zu Dopamin im Kortex, jedoch wurde im Striatum auf der Seite kontralateral zur MPTP-Verabreichung L-Dopa zu Dopamin umgewandelt und weiter zu HVA verstoffwechselt. Im MPTP-behandelten Striatum der AAV-LacZ-Affen wurde L-Dopa nicht in Dopamin umgewandelt, noch wurde es zu HVA verstoffwechselt. Gewebeniveaus von L-Dopa blieben bei den AAV-LacZ-behandelten Affen auch auf demselben Niveau wie im Kortex. In dem MPTP-behandelten Striatum von AAV-AADC-behandelten Affen wurde L-Dopa zu Dopamin und HVA umgewandelt und die Gewebeniveaus an L-Dopa in dieser Region waren reduziert.
  • Die AADC-Aktivität in den Kortikalbereichen und dem MPTP-ehandelten Striatum von AAV-LacZ-behandelten Affen war niedrig. L-Dopa wurde im kontralateralen Striatum in Dopamin umgewandelt, was hohe Niveaus einer AADC-Aktivität nahelegt. Die Gewebeausstanzungen des MPTP-behandelten Striatums von AAV-AADC-infizierten Affen enthielten extrem hohe Dopaminniveaus mit nur Spuren von verbliebenem L-Dopa.
  • Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die Kombination aus infundiertem AAV-AADC-Vektor und systemischem L-Dopa eine vielversprechende Therapie für die Behandlung von PD ist.
  • So stellt die Erfindung ein neues und effizientes Behandlungsverfahren für ZNS-Störungen, wie der Parkinson-Erkrankung bereit. Zusätzlich offenbart die Erfindung auch Verfahren zur Bestimmung einer Dopamin-Aktivität in vivo.
  • SEQUENZPROTOROLL
    Figure 00780001
  • Figure 00790001
  • Figure 00800001
  • Figure 00810001

Claims (5)

  1. Verwendung von ersten und zweiten Zusammensetzungen zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung der Parkinson-Erkrankung, wobei die erste Zusammensetzung rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAV)-Virions umfasst, umfassend ein Transgen, codierend eine aromatische Aminosäuredecarboxylase (AADC) und ein pharmazeutisch akzeptables Exzipiens zur Verabreichung an die Kranialhöhle, und wobei die zweite Zusammensetzung L-Dopa umfasst und ein pharmazeutisch akzeptables Exzipiens zur oralen Verwendung, wobei nur ein Transgen verabreicht wird.
  2. Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei die Verabreichung eine konvektionsverstärkte Verabreichung (CED) ist.
  3. Verwendung von ersten und zweiten therapeutischen Verbindungen zur Herstellung von ersten und zweiten Medikamenten für die Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung der Parkinson-Erkrankung, wobei die erste Verbindung rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAV)-Virions umfasst, umfassend ein Transgen, codierend eine aromatische Aminosäuredecarboxylase (AADC) zur Verabreichung an die Kranialhöhle, und wobei die zweite Verbindung L-Dopa zur oralen Verwendung umfasst, wobei nur ein Transgen verabreicht werden soll.
  4. Verwendung gemäss Anspruch 3, wobei die Verabreichung an die Kranialhöhle über konvektionsverstärkte Zufuhr unter Verwendung einer osmotischen oder Infusionspumpe geschieht.
  5. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Verabreichung an das Striatum geschieht.
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Families Citing this family (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030215422A1 (en) 1996-09-11 2003-11-20 John A. Chiorini Aav4 vector and uses thereof
DE69929600T2 (de) 1998-05-27 2006-09-07 Avigen Inc., Alameda Konvektion-erhöhte verabreichung aadc-kodierende aav vektoren
WO1999061601A2 (en) * 1998-05-28 1999-12-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Aav5 vector and uses thereof
US6855314B1 (en) * 2000-03-22 2005-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells
US7672712B2 (en) * 2000-03-30 2010-03-02 The Regents Of The University Of Michigan Internal marker device for identification of biological substances
US7098374B2 (en) 2001-02-09 2006-08-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Human disease modeling using somatic gene transfer
US7588757B2 (en) * 2001-03-14 2009-09-15 Genzyme Corporation Methods of treating Parkinson's disease using recombinant adeno-associated virus virions
US7182944B2 (en) * 2001-04-25 2007-02-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods of increasing distribution of nucleic acids
US20050191638A1 (en) * 2002-02-20 2005-09-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA)
US20030050273A1 (en) * 2001-08-29 2003-03-13 Keiya Ozawa Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases
CA2464887A1 (en) * 2001-10-30 2003-05-08 Biogen, Inc. Methods and compositions for treating parkinson's disease
US7419817B2 (en) * 2002-05-17 2008-09-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography
US7090836B2 (en) 2002-06-21 2006-08-15 Institut Pasteur Vector for expressing α-L-iduronidase and method of treating MPS I by stereotactic injection into the brain of a mammal
US20050143330A1 (en) * 2002-09-30 2005-06-30 Ron Mandel Method for the treatment of Parkinson's Disease
US7605249B2 (en) 2002-11-26 2009-10-20 Medtronic, Inc. Treatment of neurodegenerative disease through intracranial delivery of siRNA
US7618948B2 (en) 2002-11-26 2009-11-17 Medtronic, Inc. Devices, systems and methods for improving and/or cognitive function through brain delivery of siRNA
US7829694B2 (en) 2002-11-26 2010-11-09 Medtronic, Inc. Treatment of neurodegenerative disease through intracranial delivery of siRNA
US7994149B2 (en) 2003-02-03 2011-08-09 Medtronic, Inc. Method for treatment of Huntington's disease through intracranial delivery of sirna
US7732591B2 (en) * 2003-11-25 2010-06-08 Medtronic, Inc. Compositions, devices and methods for treatment of huntington's disease through intracranial delivery of sirna
BRPI0407487A (pt) * 2003-02-14 2006-02-14 Biogen Idec Inc cassete e um vetor de expressão para a expressão transitória ou estável de moléculas exógenas
US8946151B2 (en) * 2003-02-24 2015-02-03 Northern Bristol N.H.S. Trust Frenchay Hospital Method of treating Parkinson's disease in humans by convection-enhanced infusion of glial cell-line derived neurotrophic factor to the putamen
US7963956B2 (en) 2003-04-22 2011-06-21 Antisense Pharma Gmbh Portable equipment for administration of fluids into tissues and tumors by convection enhanced delivery technique
US8927269B2 (en) 2003-05-19 2015-01-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Avian adenoassociated virus and uses thereof
US7186699B2 (en) 2003-06-03 2007-03-06 Cell Genesys, Inc. Method for treating cancer by vector-mediated delivery of one or more anti-angiogenic or pro-apoptotic genes
ATE423134T1 (de) 2003-06-10 2009-03-15 Nsgene As Verbesserte sezernierung von neublastin
US7261882B2 (en) 2003-06-23 2007-08-28 Reagents Of The University Of Colorado Methods for treating neuropathic pain by administering IL-10 polypeptides
DE602004025959D1 (de) 2003-10-20 2010-04-22 Nsgene As Viraler Vektor zur Verwendung in der in-vivo-Gentherapie von Morbus Parkinson
WO2005056807A2 (en) 2003-12-04 2005-06-23 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Bovine adeno-associated viral (baav) vector and uses thereof
US20050208090A1 (en) * 2004-03-18 2005-09-22 Medtronic, Inc. Methods and systems for treatment of neurological diseases of the central nervous system
EP2289911A3 (de) 2004-03-30 2011-03-30 NsGene A/S Therapeutische Verwendung des Wachstumsfaktors nsg33
JP2008503590A (ja) * 2004-06-21 2008-02-07 メドトロニック・インコーポレーテッド 組成物を細胞にデリバリーするための医学用システム及び方法
US20090136552A1 (en) * 2004-07-30 2009-05-28 Mette Gronborg Growth factors nsg28, nsg30, and nsg32
US20080188431A1 (en) * 2004-09-08 2008-08-07 Chiorini John A Transcytosis of Adeno-Associated Viruses
PL2572661T3 (pl) 2004-10-05 2020-06-01 Genzyme Corporation Stopniowana kaniula
US20060253068A1 (en) * 2005-04-20 2006-11-09 Van Bilsen Paul Use of biocompatible in-situ matrices for delivery of therapeutic cells to the heart
WO2006119432A2 (en) * 2005-04-29 2006-11-09 The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes
EP1885854B1 (de) * 2005-05-06 2012-10-17 Medtronic, Inc. Verfahren und sequenzen zur unterdrückung der expression des huntington-gens in primaten
US7902352B2 (en) * 2005-05-06 2011-03-08 Medtronic, Inc. Isolated nucleic acid duplex for reducing huntington gene expression
ES2696824T3 (es) 2005-05-31 2019-01-18 Univ Colorado Regents Métodos para suministrar genes
US20080280843A1 (en) * 2006-05-24 2008-11-13 Van Bilsen Paul Methods and kits for linking polymorphic sequences to expanded repeat mutations
US9133517B2 (en) 2005-06-28 2015-09-15 Medtronics, Inc. Methods and sequences to preferentially suppress expression of mutated huntingtin
US9089667B2 (en) * 2005-08-23 2015-07-28 The Regents Of The University Of California Reflux resistant cannula and system for chronic delivery of therapeutic agents using convection-enhanced delivery
US20070132284A1 (en) * 2005-12-06 2007-06-14 Albert Ekladyous Headliner mounted center high mount stop lamp (chmsl)
DE602005023550D1 (de) 2005-12-14 2010-10-21 Licentia Ltd Verwendungen eines neurotrophischen Faktors
EP2514824A3 (de) 2006-03-03 2013-01-23 Amorfix Life Sciences Ltd. Verfahren und Zusammensetzungen zum Behandeln und Erkennen von missgefaltetem SOD 1-herbeigeführte Erkrankungen
US7922999B2 (en) 2006-04-25 2011-04-12 The Regents Of The University Of California Administration of growth factors for the treatment of CNS disorders
US20070259031A1 (en) * 2006-04-26 2007-11-08 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for convection enhanced delivery of high molecular weight neurotherapeutics
US9273356B2 (en) 2006-05-24 2016-03-01 Medtronic, Inc. Methods and kits for linking polymorphic sequences to expanded repeat mutations
EP2038279A2 (de) * 2006-06-06 2009-03-25 Avigen, Inc. Substituierte pyrazolo[1,5-alpha]pyridinverbindungen und verfahren zu ihrer anwendung
US20080039415A1 (en) * 2006-08-11 2008-02-14 Gregory Robert Stewart Retrograde transport of sirna and therapeutic uses to treat neurologic disorders
WO2008033285A2 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 The Trustees Of Culumbia University In The City Of New York Delivery of double-stranded rna into the central nervous system
US9375440B2 (en) * 2006-11-03 2016-06-28 Medtronic, Inc. Compositions and methods for making therapies delivered by viral vectors reversible for safety and allele-specificity
US8324367B2 (en) 2006-11-03 2012-12-04 Medtronic, Inc. Compositions and methods for making therapies delivered by viral vectors reversible for safety and allele-specificity
US7988668B2 (en) * 2006-11-21 2011-08-02 Medtronic, Inc. Microsyringe for pre-packaged delivery of pharmaceuticals
US7819842B2 (en) * 2006-11-21 2010-10-26 Medtronic, Inc. Chronically implantable guide tube for repeated intermittent delivery of materials or fluids to targeted tissue sites
US20080171906A1 (en) * 2007-01-16 2008-07-17 Everaerts Frank J L Tissue performance via hydrolysis and cross-linking
WO2008094571A1 (en) 2007-01-30 2008-08-07 Avigen, Inc. Methods for treating acute and subchronic pain
EP1970001B1 (de) * 2007-03-16 2014-07-23 Brainlab AG Katheter mit Drucksensorik
WO2008134646A2 (en) 2007-04-26 2008-11-06 University Of Iowa Research Foundation Rna interference suppression of neurodegenerative diseases and methods of use thereof
ES2557482T3 (es) * 2007-05-17 2016-01-26 Medgenesis Therapeutix Inc. Catéter de entrega mejorada por convección con un miembro de rigidización eliminable
EP2530152B1 (de) * 2007-05-31 2017-12-27 University of Iowa Research Foundation Reduktion der Off-Target-RNA-Interferenztoxizität
WO2009018275A1 (en) * 2007-07-30 2009-02-05 University Of Rochester Adenosine and its mimetics, modulators, transport inhibitors, and receptor agonists as a therapeutic tool to replace or improve the efficacy of deep brain stimulation
EP2187898B8 (de) * 2007-09-12 2016-09-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Verwendung viraler vektoren, die das cyp46a1 gen tragen, für die behandlung der alzheimer krankheit
FI20070808A0 (fi) 2007-10-25 2007-10-25 Mart Saarma GDNF:n silmukointivariantit ja niiden käytöt
FI20080326A0 (fi) 2008-04-30 2008-04-30 Licentia Oy Neurotroofinen tekijä MANF ja sen käytöt
WO2009137630A1 (en) * 2008-05-07 2009-11-12 Wintherix Llc Methods for identifying compounds that modulate wnt signaling in cancer cells
US20120021039A1 (en) 2009-01-23 2012-01-26 Nsgene A/S Expression of neuropeptides in mammalian cells
CA2751266A1 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Krystof Bankiewicz Methods for distributing high levels of therapeutic agent throughout the cortex to treat neurological disorders
EP3421603B1 (de) 2009-05-02 2021-10-06 Genzyme Corporation Gentherapie für neurodegenerative erkrankungen
WO2010138263A2 (en) 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
JP5847717B2 (ja) * 2009-08-25 2016-01-27 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 脳に治療剤を送達するためのカニューレ配置の最適化
CA2779437A1 (en) 2009-11-09 2011-05-12 Genepod Therapeutics Ab Novel viral vector construct for neuron specific continuous dopa synthesis in vivo
EP2558154B1 (de) 2010-04-16 2020-06-17 ClearPoint Neuro, Inc. Chirurgisches mrt-system mit mrt-kompatiblen chirurgischen kanülen zur übertragung einer substanz in den oder aus dem körper eines patienten
CN103269708A (zh) 2010-10-01 2013-08-28 Ns基因公司 镍纹蛋白用于治疗异常性疼痛、痛觉过敏、自发性疼痛和幻痛的用途
WO2012094511A2 (en) 2011-01-05 2012-07-12 Rhode Island Hospital Compositions and methods for the treatment of orthopedic disease or injury
US9181544B2 (en) 2011-02-12 2015-11-10 University Of Iowa Research Foundation Therapeutic compounds
US20120220648A1 (en) * 2011-02-24 2012-08-30 National Taiwan University Hospital Method of Treating Aromatic L-Amino Acid Decarboxylase (AADC) Deficiency Using Adeno-Associated Virus (AAV)-AADC Vector
WO2012144446A1 (ja) * 2011-04-18 2012-10-26 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター 薬剤送達粒子及びその製造方法
US20130035660A1 (en) 2011-08-01 2013-02-07 Alcyone Lifesciences, Inc. Multidirectional microfluidic drug delivery devices with conformable balloons
US9474786B2 (en) 2011-09-05 2016-10-25 Nsgene A/S Treatment of allodynia
WO2013155152A1 (en) 2012-04-10 2013-10-17 The Regents Of The University Of California Bis-polymer lipid-peptide conjugates and nanoparticles thereof
CA2882072A1 (en) * 2012-08-17 2014-02-20 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Parenteral formulations of rasagiline
AU2013361601B2 (en) 2012-12-18 2018-04-19 Alcyone Therapeutics, Inc. Systems and methods for reducing or preventing backflow in a delivery system
WO2014172372A1 (en) 2013-04-15 2014-10-23 Northwestern University Treatment for dopaminergic disorders
SG11201509419QA (en) 2013-05-15 2015-12-30 Univ Minnesota Adeno-associated virus mediated gene transfer to the central nervous system
WO2014191630A2 (en) 2013-05-28 2014-12-04 Helsingin Yliopisto Non-human animal model encoding a non-functional manf gene
EP3010574B1 (de) 2013-06-17 2019-12-18 Alcyone Lifesciences, Inc. Vorrichtungen zum schutz von katheterspitzen und stereotaktische befestigungen für mikrokatheter
JP6498670B2 (ja) 2013-07-31 2019-04-10 アルキオーネ・ライフサイエンシズ・インコーポレイテッドＡｌｃｙｏｎｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ． 薬剤送達、治療、およびモニタリングのためのシステムおよび方法
US9891296B2 (en) 2013-09-13 2018-02-13 MRI Interventions, Inc. Intrabody fluid transfer devices, systems and methods
EP3046586B1 (de) 2013-09-19 2021-07-07 The Regents of The University of California Behandlungsverfahren mit bis-polymer-lipidpeptid-konjugaten und nanopartikeln daraus
EP3137497B1 (de) 2014-05-02 2021-04-07 Genzyme Corporation Aav-vektoren zur retinalen und cns-gentherapie
CA2949437C (en) 2014-05-20 2023-08-15 University Of Iowa Research Foundation Huntington's disease therapeutic compounds
US10758484B2 (en) 2014-08-25 2020-09-01 Nippon Kayaku Co., Ltd. CED of SN-38-loaded micelles against brain tumor
CN107073051B (zh) * 2014-10-21 2021-08-24 马萨诸塞大学 重组aav变体及其用途
JP6401871B2 (ja) 2014-11-05 2018-10-10 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． パーキンソン病の治療のためのａａｄｃポリヌクレオチド
US11242374B2 (en) 2015-01-22 2022-02-08 Brown University Minimally-invasive and activity-dependent control of excitable cells
US10806396B2 (en) 2015-01-26 2020-10-20 Alcyone Lifesciences, Inc. Drug delivery methods with tracer
CN116019934A (zh) * 2015-02-10 2023-04-28 建新公司 病毒颗粒至纹状体和皮质的增强递送
CN106190949B (zh) * 2015-05-08 2020-04-10 上海微创心通医疗科技有限公司 一种干态动物源性胶原纤维组织材料及其制备方法和生物假体
CA2992511A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Myodopa Limited Systemic synthesis and regulation of l-dopa
AU2016325613B2 (en) 2015-09-23 2020-06-25 Sangamo Therapeutics, Inc. Htt repressors and uses thereof
US10531882B2 (en) 2016-01-04 2020-01-14 Alcyone Lifesciences, Inc. Methods and devices for treating stroke
WO2017142698A1 (en) 2016-02-17 2017-08-24 MRI Interventions, Inc. Intrabody surgical fluid transfer assemblies with adjustable exposed cannula to needle tip length, related systems and methods
SG10201912761UA (en) 2016-04-15 2020-02-27 The Trustees Of The Univ Of Pennsyvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii
US20190300864A1 (en) 2016-05-20 2019-10-03 Braingene Ab Destabilising domains for conditionally stabilising a protein
EP3831281A1 (de) 2016-08-30 2021-06-09 The Regents of The University of California Verfahren für biomedizinisches targeting und freisetzung sowie vorrichtungen und systeme zur ausführung davon
AU2017341849B2 (en) 2016-10-13 2024-03-21 University Of Massachusetts AAV capsid designs
IL266862B2 (en) 2016-12-01 2024-01-01 Sangamo Therapeutics Inc Tau modulators and methods and preparations for their administration
WO2018191450A2 (en) 2017-04-14 2018-10-18 National Taiwan University Hospital Gene therapy for aadc deficiency
WO2018212271A1 (ja) 2017-05-18 2018-11-22 国立大学法人京都大学 脊髄小脳変性症３６型の予防又は治療用組成物
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
US11497576B2 (en) 2017-07-17 2022-11-15 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
EP3684938A1 (de) 2017-09-22 2020-07-29 The Trustees of the University of Pennsylvania Gentherapie zur behandlung von mukopolysaccharidose typ ii
US11447775B2 (en) 2018-01-12 2022-09-20 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
US11253237B2 (en) 2018-05-09 2022-02-22 Clearpoint Neuro, Inc. MRI compatible intrabody fluid transfer systems and related devices and methods
EP3781074A1 (de) 2018-05-09 2021-02-24 ClearPoint Neuro, Inc. Mrt-kompatible intrakorporale flüssigkeitsübertragungssysteme und zugehörige vorrichtungen und verfahren
CA3099306A1 (en) * 2018-05-15 2019-11-21 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of parkinson's disease
US11684750B2 (en) 2019-10-08 2023-06-27 Clearpoint Neuro, Inc. Extension tube assembly and related medical fluid transfer systems and methods
KR20240006581A (ko) 2021-05-06 2024-01-15 호바 세라퓨틱스 에이피에스 화학요법-유도된 신경병성 통증의 예방 및 치료
WO2023104960A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Hoba Therapeutics Aps Treatment of nociceptive pain

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4916151A (en) * 1985-12-05 1990-04-10 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Method of treating parkinson's syndrome
JP2514913B2 (ja) * 1987-10-19 1996-07-10 忠三 岸本 ヒトｂｃｄｆを含有する神経系障害治療剤
DE3841955A1 (de) * 1987-12-31 1989-07-13 Asta Pharma Ag Synergistische kombination von decarboxylasehemmern und l-dopa-pellets
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5766948A (en) * 1993-01-06 1998-06-16 The Regents Of The University Of California Method for production of neuroblasts
WO1995005864A1 (en) * 1993-08-27 1995-03-02 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Convection-enhanced drug delivery
CA2187626C (en) 1994-04-13 2009-11-03 Michael G. Kaplitt Aav-mediated delivery of dna to cells of the nervous system
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US6103226A (en) 1994-08-12 2000-08-15 Arch Development Corporation Genetically engineered cells that produce produce L. Dopa
US5599706A (en) * 1994-09-23 1997-02-04 Stinchcomb; Dan T. Ribozymes targeted to apo(a) mRNA
US5667158A (en) 1995-05-23 1997-09-16 Glaxo Wellcome Inc. Automated blend reclaim system for pharmaceutical tablet compression machine
US5677158A (en) 1995-06-07 1997-10-14 Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US6004797A (en) 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
AU3591597A (en) * 1996-06-28 1998-01-21 Regents Of The University Of California, The Transformation and genetherapy of cells of the inner ear
JPH1113A (ja) 1997-06-12 1999-01-06 Mitsubishi Agricult Mach Co Ltd 乗用農機
DE69929600T2 (de) * 1998-05-27 2006-09-07 Avigen Inc., Alameda Konvektion-erhöhte verabreichung aadc-kodierende aav vektoren

Also Published As

Publication number Publication date
DE69941100D1 (de) 2009-08-20
JP2002516295A (ja) 2002-06-04
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ES2257051T3 (es) 2006-07-16
CA2329259C (en) 2003-08-05
US7534613B2 (en) 2009-05-19
ES2324540T3 (es) 2009-08-10
WO1999061066A2 (en) 1999-12-02
EP1080202A2 (de) 2001-03-07
DE69940899D1 (de) 2009-06-25
ES2326893T3 (es) 2009-10-21
ATE435917T1 (de) 2009-07-15
US8309355B2 (en) 2012-11-13
EP1080202B1 (de) 2006-01-25
DE69929600D1 (de) 2006-04-13
CA2329259A1 (en) 1999-12-02

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Miyake et al. Gene delivery into the central nervous system (CNS) using AAV vectors

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