DE60315009T2

DE60315009T2 - ZUSAMMENSETZUNGEN ZUR VERABREICHUNG VON ENZYMEN INVOLVIERT IM AMINOSÄUREMETABOLISMUS DURCH VERWENDUNG REKOMBINANTER ADENOASSOZIIERTER VIRUS-VIROEN (rAAV-VIRONEN), UND METHODE UND VERWENDUNG ZUR BEHANDLUNG VON AMINOSÄUREMETABOLISCHEN STÖRUNGEN UNTER VERWENDUNG SOLCHER rAAV-VIRONEN

Info

Publication number: DE60315009T2
Application number: DE60315009T
Authority: DE
Inventors: Keiya Kawachi-gun OZAWA; Hiroaki Kawachi-gun Mizukami; Akihiro Kawachi-gun Kume
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-04-16
Filing date: 2003-04-16
Publication date: 2008-04-03
Also published as: EP1497436A1; EP1847614A1; DE60315009T8; ATE367446T1; JP2005522517A; ES2290447T3; WO2003087383A1; DE60315009D1; CA2479996A1; US20030198620A1; US20050147592A1; EP1497436B1; AU2003222451A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verabreichung von Genen an Patienten mit Stoffwechselkrankheiten. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verabreichung von Genen unter Verwendung von rekombinanten adenoassoziierten Virus (rAAV)-Virionen zur Behandlung von Aminosäurestoffwechselkrankheiten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Lebende Organismen befinden sich nicht im Zustand eines chemischen und physikalischen Gleichgewichts. Stattdessen benötigen sie eine kontinuierliche Zufuhr an Freier Energie, um die Ordnung gegenüber einer Umwelt, die auf Unordnung ausgerichtet ist, aufrechtzuerhalten. Der Stoffwechsel ist ein allumfassender Prozess, durch den lebende Systeme die Freie Energie, die sie benötigen um diese Ordnung aufrechtzuerhalten, aufnehmen und verwenden (z.B. um die lebensnotwendigen Funktionen auszuüben). Sie erreichen dies, indem sie die exergonischen Reaktionen der Nährstoffoxidation an die endergonischen Prozesse koppeln, die notwendig sind, um den lebenden Zustand (z.B. die Ausführung von mechanischer Arbeit, der aktive Transport von Molekülen gegen Konzentrationsgradienten und die Biosynthese von komplexen Makromolekülen) aufrechtzuerhalten.
Tiere erhalten diese Freie Energie durch das Oxidieren von organischen Verbindungen (Kohlenhydrate, Lipide und Proteine), die von anderen Organismen erhalten werden. Die freigesetzte Freie Energie aus Oxidationsreaktionen ist meistens durch die intermediäre Synthese von Adenosintriphosphat und anderen energiereichen Phosphatverbindungen an endergonische Reaktionen gekoppelt. Zusätzlich zu der Tatsache, dass sie vollständig oxidiert werden, werden Nährstoffe in einfache Zwischenprodukte zerlegt, die als Vorläufer in der Synthese von anderen biologischen Molekülen verwendet werden.
Wenn eine Verbindung im einem Stoffwechselweg fehlerhaft ist, ist das Ergebnis oft eine Krankheit – ein sogenannter „angeborener Stoffwechselfehler" (ein Ausdruck der zum ersten mal von Sir Archibald Garrod in 1908 verwendet wurde. Die Komplexität des Stoffwechsels selbst widerspiegelnd, umfassen Stoffwechselkrankheiten eine große und komplexe Klasse von Störungen, die zahlreiche biochemische, physiologische und medizinische Auswirkungen haben. Von im Wesentlichen gutartig bis tödlich, offenbaren sich diese Krankheiten beispielsweise als fast unmerkliche neurologische Veränderungen bis hin zu schwerwiegenden anatomischen Abnormitäten. Es gibt über dreihundert angeborene Stoffwechselstörungen, wovon viele mit geringer Häufigkeit auftreten (von einigen gibt es nur zehn Fälle weltweit) und andere wie Diabetes mellitus in der gesamten Bevölkerung sehr häufig vorkommen.
Stoffwechselkrankheiten resultieren im Allgemeinen aus genetischen Mutationen, die ein oder mehrere nichtfunktionierende Proteine zur Folge haben. Diese Mutationen werden hauptsächlich vererbt (der Grund wieso Garrod die Stoffwechselkrankheiten als angeboren bezeichnete), aber sie können auch somatisch auftreten; in einigen Fällen sind die Mutationen polygen (z.B. Herzfehler, Diabetes mellitus), wobei mehrere Gene betroffen sind und in anderen Fällen sind die Mutationen monogen (z.B. Phenylketonurien, Mucopolysaccharidosen, Glykogenspeicherkrankheiten), wobei nur ein Gen betroffen ist. Insgesamt sind monogene Störungen relativ häufig, wobei sie ungefähr einmal unter 100 Neugeborenen auftreten. Obwohl genetische Defekte Gene, die keine Protein codieren, mit einschließen können (z.B. Defekte in RNA-Transfer-Genen), sind diese viel seltener.
Fast jede Stoffwechselkrankheit kann klinisch zwei großen Kategorien zugeordnet werden: die Krankheiten, die nur ein funktionelles System einbeziehen oder nur ein Organ oder anatomisches System betreffen oder die Krankheiten bei denen der biochemische Defekt einen Stoffwechselpfad betrifft, den eine große Anzahl Zellen oder Organe gemeinsam haben oder der nur auf ein Organ beschränkt ist, aber humorale oder systemische Folgen hat. In der ersten Kategorie sind Störungen, die pysiologische Systeme wie das Endokrin- und das Immunsystem einbeziehen und Störungen, die auf ein Organ oder anatomisches System beschränkt sind, wie der Darm, die Nierenkanälchen oder das Bindegewebe. Die auftretenden Symptome sind einheitlich und die korrekte Diagnose ist, selbst wenn die grundlegende biochemische Schädigung systemische Konsequenzen hat, relativ einfach zu stellen.
Krankheiten in der zweiten Kategorie können weiter in drei Gruppen unterteilt werden. In einer Gruppe sind die Krankheiten, die die Synthese oder den Abbaustoffwechsel von komplexen Molekülen stören. Die Symptome sind permanent, progressiv und stehen nicht im Zusammenhang mit der Nahrungsaufnahme (Lysosomale Speicherkrankheiten und α₁-Antitrypsin-Defizienten sind beispielhafte Beispiele). Krankheiten die den Proteintransport betreffen, fallen auch in diese Kategorie.
Eine andere Gruppe besteht aus angeborenen Störungen des intermediären Stoffwechsels, mit Symptomen deren Ursache wenigsten teilweise in einer Defizienz in der Energieproduktion oder -verwendung liegt und die aus einem Defekt in Leber, Myokard, Muskel oder Hirn resultieren. Dieser Gruppe zugeordnet sind Glykogenese, Glukoneogenesedeffekte, angeborene Laktatazidose (Pyruvatcarboxylase- und Pyruvatdehydrogenasedefizienz), Fettsäureoxidationsdefekte und Störungen in der mitochondrialen Atmungskette. Häufige Symptome dieser Gruppe umfassen Hypoglykämie, Hyperlaktazidämie, schwere generalisierte Hypotonie, Myopathie, Kardiomyopathie, Herzversagen und plötzlicher Kindstod (SIDS, sudden infant death syndrome).
In der letzten Gruppe sind angeborene Störungen des intermediären Stoffwechsels, die aufgrund einer Akkumulation von toxischen Verbindungen in der Nähe des Stoffwechselblocks zu einer akuten oder progressiven Vergiftung führen. Hierin sind die meisten organischen Azidurien (methylmalonische, propionische, isovalerische, etc.), angeborenen Harnstoffzyklusdefekte, Zuckerintoleranzen (Galaktosämie, erbliche Fruktoseintoleranz, etc) und die Aminoazidopathien (Phenylketonurien, Ahornsirupkrankheit, Homocysteinurie, Hypertyrosinämie, etc.)
Aminoazidopathien sind Funktionsstörungen des Aminosäurenstoffwechsels. Aminosäuren sind die essentiellen monomeren Untereinheiten die Proteine bilden, aber sie werden auch zu anderen Molekülen verstoffwechselt, die dann eine große Anzahl von Funktionen wahrnehmen. So wird beispielsweise Phenylalanin in einem mehrstufigen Prozess zu Fumarat verstoffwechselt, einer Verbindung des Zitronensäurezyklus und ein Bestandteil des Glukosebiosynthesepfads; im gleichen Stoffwechselpfad wird Phenylalanin auch in Acetoacetat umgewandelt, einem Bestandteil des Fettsäurebiosynthesepfads. In einem weiteren Satz von mehrstufigen Reaktionen kann Phenylalanin alternativ über Tyrosin zu Dopamin, Norepinephrin und Epinephrin, die biogenen Amine mit zahlreichen Haupt- und Nebenfunktionen sind, verstoffwechselt werden. Störungen im Phenylalaninstoffwechsel können somit zu einer Vielzahl von Krankheiten führen. Ähnlich können Störungen im Stoffwechsel anderer Aminosäuren zu einer großen Anzahl von Störungen führen.
Aufgrund der genetischen Ätiologie von Stoffwechselstörungen, ist eine aktuelle Therapie oft auf eine Standardbehandlung der Symptome beschränkt (z.B. pharmakologisch oder chirurgisch); der dem zugrunde liegende genetische Defekt wird nicht korrigiert. Es gibt einige Beispiele, wo eine Standardbehandlung relativ gut funktioniert, z.B. eine Insulintherapie bei Diabetes mellitus, aber ohne eine Korrektur der eigentlichen genetischen Schädigungen, die für die Pathogenese dieser Krankheit verantwortlich sind, bleibt Diabetes mellitus die dritthäufigste Todesursache bei Amerikanern. Für mit Phenylketonurie geborene Kinder (eine Krankheit die aus einer Phenylalanin-Stoffwechselstörung resultiert), wird eine sehr strenge Diät verschrieben; ihre Wirksamkeit wird jedoch oft durch Complianceprobleme des Patienten gefährdet. Für andere Stoffwechselstörungen ist keine Behandlung verfügbar und abhängig von der Krankheit, kann dies zu schwerer Morbidität oder Mortalität führen.
Aktuelle Behandlungsdefizite haben Bemühungen angeregt, Gentherapieverfahren zur Verabreichung von Ersatzgenen zu entwickeln, die in der Lage sind, das fehlende oder fehlerhaft funktionierende Stoffwechseiprotein, das die Ursache für die Krankheit ist, zu exprimieren. Ein Gentherapieansatz hat mehrere Vorteile bezüglich der Behandlung von Stoffwechselkrankheiten, die bei Standardtherapieansätzen nicht vorhanden sind: Verabreichung eines therapeutischen Gens (somit potentiell die eigentliche Störungsursache heilend) und spezifisches Targeting von Organen oder Geweben, die im Mittelpunkt der Krankheit stehen, sind nur einige erwähnenswerte Beispiele.
Gene können dem Patienten über verschiedene Wege verabreicht werden. Es gibt Transfektionsverfahren, einschließend chemische Verfahren wie Calciumphosphatpräzipitation und liposomenvermittelte Transfektion und physikalische Verfahren wie Elektroporation. Aktuelle Viren-vermittelte Gene-Delivery-Vektoren schießen solche, die auf einem Retrovirus, Adenovirus, Herpesvirus, Pockenvirus und adenoassoziiertem Virus (AAV) basieren, mit ein.
Adenoassoziierte Viren-vermittelte Gentherapie

Yang Shen et al. [Human Gene Therapy 11: 1509-1519 (2000)] offenbart rekombinante adenoassoziierte virale Vektoren, die Tyrosinhydroxylase zur Verwendung in der Gentherapie der Parkinson-Krankheit exprimieren.
A.C. Nathwani et al. [Gene Therapy 7: 183-195 (2000)] und Feng Ru et al. [Blond 98, No 11, Teil 2, Seite 404b (2001), zitiert in der Biosis Datenbank, Zugangsnummer PREV200200257471] offenbart rekombinante adenoassoziierte virale Vektoren, die eine mutierte Dihyd rofolatred uktase codieren, die eine Methotrexatresistenz verleiht, zur Verwendung als selektierbarer Marker zum Testen der Transfektionseffizienz von blutbildenden Zellen.
Y. Nagasake et al. [Pediatric Research 45: 465-473 (1999)] offenbart die Verwendung eines replikationsdefizienten Adenovirus, der die humane Phenylalaninhydroxylase-cDNA unter der Kontrolle eines CAG-Promotors zur Verwendung in der Gentherapie, enthält. Die ungünstige, in Mäusen beobachtete Immunantwort wurde durch die gleichzeitige Verabreichung eines Immunsuppressivums unterdrückt.
M. Mitchell et al. [Gene Therapy 7: 1986-1992 (2000)] offenbart rekombinante adenoassoziierte virale Vektoren zum Testen von Gentransfer in Mausföten, die das β Galaktosidasegen unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthalten.
R.C. Eisensmith et al. [MRDD Research Reviews 5: 136-143 (1999)] diskutieren verschiedene Systeme der virusvermittelten Gentherapie zur Behandlung von Phenyleketonurie. Die Autoren stellen eine Hypothese über die Verwendung eines adenoassoziierten Virus zur Behandlung von Phenylketonurie auf und schlussfolgern, dass die mit adenoassoziierten viralen Vektoren beobachteten niedrigen Tranduktionseffizienzen in einer ineffizienten Behandlung der Krankheit resultieren würden.

Der adenoassoziierte Virus, ein Parvovirus, der zum Genus Dependovirus mit sechs bekannten Serotypen (bezeichnet als AAV-1 bis AAV-6) gehört, hat mehrere attraktive Merkmale, die in anderen Viren nicht vorhanden sind. So kann AAV beispielsweise eine große Auswahl von Wirtszellen, einschließend nichtteilende Zellen, infizieren. Darüber hinaus kann AAV Zellen verschiedener Spezies infizieren. Von Bedeutung ist, dass AAV mit keinerlei menschlicher oder tierischer Krankheit assoziiert wurde und nach Integration die physiologischen Eigenschaften der Wirtszelle nicht zu verändern scheint. Schließlich ist AAV unter einer Vielzahl von physikalischen und chemischen Bedingungen stabil, was auch für die Ansprüche an Herstellung, Aufbewahrung und Transport zutrifft.
Das AAV-Genom, eine lineares, ein lineares, einzelsträngiges DNA-Molkül, das ungefähr 4700 Nukleotide (das AAV-2 Genom besteht aus 4681 Nukleotiden) enthält, umfasst im Allgemeinen ein internes sich nicht wiederholendes Segment, das an jedem Ende von invertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITRs, inverted terminal repeats) flankiert ist. Die ITRs sind ungefähr 145 Nukleotide lang (AAV-1 hat 143 Nukleotide lange ITRs) und haben mehrere Funktionen, einschließend Fungieren als Replikationsstartpunkt und Packungssignal für das virale Genom.
Der interne sich nicht wiederholende Teil des Genoms schließt zwei lange offene Leserahmen (ORFs, open reading frames) mit ein, die als die AAV-Replikation (rep)- und AAV-Kapsid (cap)-Regionen bekannt sind. Diese ORFs codieren Replikations- bzw. Kapsidgenprodukte: Replikations- und Kapsidgenprodukte (z.B. Proteine) ermöglichen die Replikation, das Zusammenfügen und das Packen eines vollständigen AAV-Virions. Insbesondere wird aus der AAV rep-Region eine Familie von wenigsten vier viralen Proteinen exprimiert: Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40, die alle nach ihren scheinbaren Molmassen benannt sind. Die AAV-cap-Region codiert wenigstens drei Proteine: VP1, VP2 und VP3.
AAV ist ein helferabhängiger Virus, was eine Coinfektion mit einem Helfervirus erfordert (z.B. Adenovirus, Herpesvirus oder Vaccinia Virus), um funktionell vollständige AAV-Virionen zu bilden. In der Abwesenheit einer Coinfektion mit einem Helfervirus, etabliert AAV einen latenten Zustand, in dem das virale Genom in ein Wirtszellenchromosom insertiert oder in einer episomalen Form existiert, aber keine infektiöse Virionen produziert werden. Eine folgende Infektion durch Helferviren „rettet" das integrierte Genom, und ermöglicht ihm repliziert und in virale Kapside gepackt zu werden, wodurch das infektiöse Virion rekostituiert wird. Während AAV Zellen verschiedene Spezies infizieren kann, muss Helfervirus von der gleichen Art sein wie die Wirtszellen. Somit repliziert beispielsweise humaner AAV in Hundezellen, die mit einem Hundeadenovirus coinfiziert wurden.
Um rekombinante AAV (rAAV)-Virionen herzustellen, die das betreffende Gen enthalten, wird eine geeignete Wirtszelllinie mit einem AAV-Vektor transfiziert, der das Gen enthält, aber dem rep und cap fehlen. Die Wirtszelle wird dann mit Wildtyp (wt)-AAV und einem geeigneten Helfervirus infiziert, um rAAV-Virionen zu bilden. Alternativ können wt-AAV-Gene (bekannt als Helferfunktionsgene, helperfunktion genes,), umfassend rep und cap) und Helfervirusfunktionsgene (helper virus function genes) (bekannt als Zusatzfunktionsgene, accessory function genes) in einem oder mehreren Plasmiden zur Verfügung gestellt werden, wodurch kein Bedarf mehr an einem wt-AAv-Virus und einem Helfervirus für die Herstellung von rAAV-Virionen besteht. Die Helfer- und Zusatzfunktionsprodukte werden in der Wirtszelle exprimiert, wo sie in trans auf den rAAV-Vektor einwirken, der das therapeutische Gen enthält. Des betreffende Gen wird dann repliziert und verpackt, als wäre es ein wt-AAV-Genom, wodurch ein rekombinantes AAV-Virion gebildet wird. Wenn Patientenzellen mit dem resultierenden rAAV-Virion transduziert werden, dringt das Gen ein und wird in den Patientenzellen exprimiert. Da den Patientenzellen sowohl die rep- und cap-Gene als auch die Zusatzfunktionsgene fehlen, kann sich das rAAV-Virion nicht weiter replizieren und sein Genom verpacken. Darüber hinaus können in Patientenzellen wt-AAV-Virionen nicht ohne eine Quelle für rep- und cap-Gene gebildet werden.
Es wäre eine Bereicherung für Stand der Technik, Strategien zur Behandlung von Stoffwechselstörungen zu entwickeln, die die eigentlichen Defekte korrigieren, statt nur die Symptome zu behandeln. Solche Verfahren sind hier offenbart.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung, werden Verfahren und Vektoren für die Verwendung und Verabreichung von Genen an einen Säuger mit einer Aminosäurenstoffwechselstörung, die zu einem überhöhten Gehalt einer Aminosäure im Blutkreislauf oder zu überschüssigen Aminosäuren oder Aminosäurestoffwechselprodukten im Urin des Säugers führt, bereitgestellt. Die Aminsäurestoffwechselstörung wird insbesondere durch Störungen im Stoffwechsel von aromatischen Aminsäuren hervorgerufen, was zu einem überhöhten Aminosäuregehalt im Blut oder zu einem überhöhten Gehalt von aromatischen Aminosäuren und/oder ihrer Stoffwechselprodukte im Urin des Säugers führt. Die aromatische Aminosäurestoffwechselstörung ist insbesondere Hyperphenylalaninämie, bevorzugt Phenylketonurie.
In einer anderen Ausführungsform, resultiert die Aminosäurestoffwechselstörung in einem abweichenden Gehalt biogener Amine. In einer Ausführungsform ist das biogene Amin Dopamin, in einer weiteren Ausführungsform ist das biogene Amin Serotonin und in einer weiteren Ausführungsform ist das biogene Amin Histamin. In einer weiteren Ausführungsform ist das biogene Amin Norepinephrin und in einer anderen Ausführungsform ist das biogene Amin Epinephrin.
Das über rAAV verabreichte Gen wird in einem Säuger mit einer Aminosäurestoffwechselstörung exprimiert und sobald exprimiert, kann das Protein eine therapeutische Wirkung entfalten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Säuger ein Mensch.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung rAAV-Virionen, die ein Phenylalaninhydroxylase codierendes Gen enthalten, zu verabreichen, wobei dieses sobald es in Leberzellen exprimiert wird, bei einem Säuger mit Hyperphenylalaninämie den Gehalt von Phenylalanin im Blut senkt. In einer bevorzugten Ausführungsform codiert das Gen humane Phenylalaninhydroxylase.
In einer Ausführungsform, werden rAAV-Virionen durch eine retroduktale Verabreichung, vorzugsweise über eine endoskopisch retrograde Cholangiopankreatikographie, in die Leber des Menschen eingeschleust.
In einer weiteren Ausführungsform, werden die rAAV-Virionen in den Blutkreislauf des Säugers verabreicht. Unter einem Aspekt werden die rAAV-Virionen über eine periphere Vene verabreicht (z.B. über eine direkte intravenöse Injektion). In einer weiteren Ausführungsform, werden die rAAV-Virionen über eine Injektion in die Pfortader in die Leber verabreicht. In einer weiteren Ausführungsform werden die rAAV-Virionen über eine Injektion in die Leberarterie in die Leber verabreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die rAAV-Virionen über einen Katheter der in eine periphere Arterie, bevorzugt eine Oberschenkelarterie, eingeführt ist, in die Leberarterie verabreicht.
Das Phenylalaninhydroxylasegen kann in der Leber mittels eines gewebespezifischen Promotors exprimiert werden. Unter einem Aspekt ist der gewebespezifische Promotor ein leberspezifischer Promotor, bevorzugt eine humaner alpha-1-Antitrypsin (hAAT)-Promotor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform, ist der hAAT-Promotor funktionsfähig mit einer Apolioprotein-E hepatischen Kontrollregion verknüpft.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen zur Behandlung von Phenylkentonurie (PKU) bei einem Säuger mit PKU zur Verfügung zu stellen, umfassend das Bereitstellen von AAV-Virionen, die das Phenylalaninhydroxylasegen, enthalten, wobei dieses bevorzugt ein humanes Phenylalaninhydroxylasegen ist. Diese Zusammensetzungen können verwendet werden, um mit der Leber eines Säugers mit PKU in Kontakt gebracht zu werden und um das Phenylalaninhydroxylasegen zu exprimieren, so dass eine therapeutische Wirkung erzielt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform resultiert die Expression von Phenylalaninhydroxylase in einer Senkung des Phenylalaningehalts im Blut, vorzugsweise auf eine Konzentration die niedriger als 1000 μM ist.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine rekombinante Virionenzusammensetzung zur Verabreichung eines Proteins an einen Säuger zur Verfügung zu stellen, wobei die Zusammensetzung umfasst: rekombinante adenoassoziierte Virus (rAAV)-Virionen, wobei die rAAV-Virionen ein heterologes Gen umfassen, das eine Phenylalaninhydroxylase codiert.
Der Säuger ist vorzugsweise ein Mensch und rAAV ist in einer für einen Menschen therapeutisch wirksamen Menge enthalten.
Vorzugsweise liegt rAAV in ausreichenden Mengen vor, um eine Expression eines heterologen Gens zu verursachen, wenn er einem Säuger verabreicht wird und die Expression resultiert in einer therapeutischen Wirkung.
Die therapeutische Wirkung umfasst vorzugsweise eine Senkung des Phenylalaninspiegels des Bluts. Weiterhin wird der Phenylalaninspiegel des Bluts vorzugsweise auf weniger als etwa 1000 Mikromolar gesenkt.
Vorzugsweise ist das heterologe Gen funktionsfähig mit einem heterologen Promotor verknüpft, der in der Lage ist, eine Expression des Gens in den Zielzellen eines Säugers herbeizuführen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt rAAV in einer Menge von wenigstens 5 × 10¹² viralen Genomen/pro Säuger vor.
Es ist ebenfalls eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung eines rekombinanten adenoassoziierten Virus (rAAV)-Virons zur Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung des rAAV-Virions an einen Säuger mit Aminoazidopathie bereitzustellen, wobei das rAAV-Virion ein Nukleinsäuremolekül umfasst, wobei das Nukleinsäuremolekül ein Gen umfasst, das eine Phenylalaninhydroxylase codiert, das funktionsfähig mit einer Kontrollsequenz verknüpft ist, die in der Lage ist, die in vivo Transkription des Gens zu veranlassen.
Die Formulierung kann eine AAV-Vektorsuspension in HBS sein (Hepesgepufferte Salzlösung; 50 mM Hepes + 150 mM NaCl, pH 7,4). Die Vektorkonzentration der Stammlösung kann beispielsweise ungefähr 1 × 10¹³ bis 1 × 10¹⁴ Vektoren/ml sein.
Der Bereich der Vektordosierung kann von 3 × 10¹² bis 1 × 10¹⁴ Vektorgenome/Mund reichen. Wenn sie an einem anderen Säuger angewandt wird, kann eine geeigneter Bereich der Vektordosierung basierend auf dem Bereich für den Mund bestimmt werden. Die therapeutische Wirkung kann auf eine dosisabhängige Weise innerhalb dieses Bereichs beobachtet werden.
Die akute Toxizität des AAV-Vektors wird typischerweise diskutiert in:

i) Long-term correction of canin hemophilia B by gene transfer of blond coagulation factor IX mediated by adeno-associated viral vector. Herzog, R et al., Nature Medicine 5: 56-63, 1999.
ii) Immediate and long-term safety of recombinant adeno-associated vrus injection into the nonhuman Primate muscle. Favre, D et al. Molecular Therapy 4: 559-66, 2001.
iii) Technology evaluation: AAV factor IX gene therapy, Avigen Inc, Fabb, SA and Dickson, JG. Curr Opin Mol Ther 2: 601-6, 2000.

ERLÄUTERUNG VON BESONDEREN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung eines rekombinanten adenoassoziierten Virus (rAAV)-Virions, um ein Gen, das ein an einem Stoffwechselpfad beteiligtes Protein codiert, einem Säuger mit einer Stoffwechselkrankheit zu verabreichen. Sobald es verabreicht ist, wird das Gen transkribiert und translatiert, wobei das Translationsprodukt (z.B. das Protein) eine therapeutische Wirkung für den Säuger der eine Stoffwechselkrankheit hat, bereitstellt. In Kontext der vorliegenden Erfindung schließt der Begriff „Protein" alle Klassen von Polypeptiden, Peptiden, Proteinen und Peptidtransportern, Enzymen, Polypeptiduntereinheiten von Proteinkomplexen, funktionellen Domänen von Proteinen und ähnliches mit ein.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung vermittelt der Begriff „Stoffwechselpfad" das Konzept irgendeiner der zahlreichen biochemischen Reaktionen, die die exergonischen Reaktionen der Nährstoffoxidation an die endergonischen Prozesse, die notwendig sind, den lebenden Zustand aufrecht zu erhalten, koppeln. Der Begriff umfasst sowohl „anabolische" Reaktionen (z.B. chemische Reaktionen die an der Biosynthese von Molekülen beteiligt sind) als auch „katabolische" Reaktionen (z.B. chemische Reaktionen die am Abbau von Molekülen beteiligt sind).
Mit „Stoffwechselkrankheit" ist jede Krankheit oder Störung gemeint, deren eigentliche oder assoziative Ursache auf einen Defekt im Stoffwechsel zurückgeht. Solche Krankheiten können relativ gutartig, stark schwächend oder sogar tödlich sein. Mit „therapeutischer Wirkung" ist eine Verbesserung jedes klinischen Anzeichens oder Symptoms einer Stoffwechselkrankheit gemeint.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung, ist ein „rekombinantes AAV-Virion" oder „rAAV-Virion" ein infektiöser Virus, zusammengesetzt aus einer AAV-Proteinhülle (z.B. einem Kapsid), die einen „rekombinanten AAV (rAAV)-Vektor" umhüllt; der rAAV-Vektor ist hier definiert als ein heterologes Gen und eines oder mehrere AVV invertierte terminale Wiederholungssequenzen (ITRs) umfassend.
„Heterolog" bedeutet ein Nukleinsäuremolekül, das von Nukleotidsequenzen flankiert wird, die in der Natur nicht im Zusammenhang mit dem Nukleinsäuremolekül gefunden werden. Alternativ umfasst „heterolog" das Konzept eines Nukleinsäuremolküls, das selbst in der Natur nicht vorkommt (z.B. künstliche Sequenzen, deren Codons sich von denen eines nativen Gens unterscheiden), mit ein. Eine allelische Variation von natürlich vorkommenden Mutationsereignissen führt nicht zu heterologen Nukleinsäuremolekülen, wie sie hier verwendet werden. Nukleinsäuremoleküle können in Form von Genen, Promotoren, Enhancern oder eines jedwelchen anderen nukleinsäureenthaltenden Moleküls vorliegen, so lange für sie an der hier verwendeten Definition von „heterolog", festgehalten wird.
Rekombinante AAV-Vektoren können unter der Verwendung von rekombinanten Methoden, die Stand der Technik sind, konstruiert werden und schließen ein oder mehrere heterologe Gene, die von funktionellen ITRs flankiert werden, mit ein. Die ITRs des rAAV-Vektors müssen nicht die Wildtypnukleotidsequenz sein und können, solange die Sequenzen die richtige Funktion, z.B. Freisetzung, Replikation und Verpackung des AVV-Genoms, bereitstellen, z.B. durch Insertion, Deletion oder Nukleotidsubstitution verändert werden.
Rekombinante AAV-Virionen können unter Verwendung einer Vielfalt von Methoden, die Stand der Technik sind, hergestellt werden. Der Fachmann kann z.B. wt-AAV und Helferviren verwenden, um die notwendigen replikativen Funktionen zur Herstellung von rAAV-Virionen zur Verfügung zu stellen (siehe, z.B. U.S Patent Nr. 5139914 , auf das hier Bezug genommen wird). Ein Plasmid, das Helferfunktionsgene enthält, in Kombination mit einer Infektion durch einen der bekannten Helferviren, kann alternativ als eine Quelle für replikative Funktionen verwendet werden (siehe z.B. U.S. Patent Nr. 5622856 , auf das hier Bezug genommen wird; U.S. Patent Nr. 5139941 , siehe oben). Ähnlich kann der Fachmann von einem Zusatzfunktionsgene enthaltenden Plasmid, in Kombination mit einer Infektion durch wt-AAV, Gebrauch machen, um die notwendigen replikativen Funktionen zur Verfügung zu stellen. Wie dem Fachmann bekannt ist, sind diese drei Ansätze, wenn in Kombination mit einem rAAV-Vektor verwendet, jeweils ausreichend um rAAV-Virionen herzustellen. Andere Verfahrensweisen, die Stand der Technik sind, können ebenfalls vom Fachmann verwendet werden, um rAAV-Virionen herzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Tripeltransfektionsverfahren (detailliert beschrieben im U.S. Patent Nr. 6001650 , auf das hier vollumfänglich Bezug genommen wird) verwendet, um rAAV-Virionen herzustellen, da dieses Verfahren nicht die Verwendung eines infektiösen Helfervirus erfordert, was es ermöglicht, dass rAAV-Virionen hergestellt werden, ohne dass detektierbarer Helfervirus anwesend ist. Dies wird durch die Verwendung von drei Vektoren zur rAAV-Virionenherstellung erreicht: einem AAV-Helferfunktionsvektor, einem Zusatzfunktionsvektor und einem rAAV-Vektor. Ein Fachmann wird jedoch erkennen, dass die von diesen Vektoren codierten Nukleinsäuresequenzen, auf zwei oder mehr Vektoren in verschiedenen Kombinationen bereitgestellt werden können. Wie hier verwendet, umschließt der Begriff „Vektor" jedes genetische Element, wie z.B. ein Plasmid, Phage, Transposon, Cosmid, Chromosom, künstliches Chromosom, Virus, Virion etc., das in der Lage ist zu replizieren mit ein, wenn es mit den richtigen Kontrollelementen verbunden ist und das Gensequenzen zwischen Zellen transferieren kann. Somit schließt der Begriff Klon- und Expressionsvehikel als auch virale Vektoren mit ein.
Der AAV-Helferfunktionsvektor codiert die „AAV-Helferfunktion"-Sequenzen (z.B. rep und cap), die in trans für eine produktive AAV-Replikation und -Enkapsidation funktionieren. Vorzugsweise unterstützt der AAV-Helferfunktionsvektor eine effiziente AAV-Vektorpoduktion, ohne detektierbare AAV-Virionen (z.B. AAV-Virionen, die funktionelle rep- und cap-Gene enthalten). Ein Beispiel eines solchen Vektors, pHLP19 ist im U.S. Patent No. 6001650 , siehe oben und in Beispiel 1, siehe unten, beschrieben. Die rep- und cap-Gene des AAV-Helferfunktionsvektor können von jedem der bekannten AAV-Serotypen abgeleitet werden. Der AAV-Helferfunktionsvektor kann beispielsweise ein rep-Gen, dass von AAV-2 abgeleitet ist und ein cap-Gen, das von AAV-6 abgeleitet ist, enthalten; ein Fachmann wird erkennen, dass andere rep- und cap-Genkombinationen möglich sind, wobei das kennzeichnende Merkmal die Fähigkeit ist, die rAAV-Virionherstellung zu unterstützen.
Der Zusatzfunktionsvektor codiert Nukleotidsequenzen für nicht von AAV abgeleitete virale und/oder zelluläre Funktionen, wovon AAV für eine Replikation abhängig ist. Die Zusatzfunktionen schließen die Funktionen, die für eine AAV-Replikation notwendig sind, mit ein, einschließend ohne Einschränkung die Teile die in der Aktivierung von AAV-Gentranskription, stadiumspezifischem AAV-mRNA-Splicing, AAV-DNA-Replikation, Synthese von cap-Expressionsprodukten und AAV-Kapsidzusammenbau beteiligt sind. Virenbasierte Zusatzfunktionen können von jedem der bekannten Helferviren wie Adenovirus, Herpesvirus (verschieden zu Herpes-Simplex-Virus Typ-1) und Vaccinia-Virus abgeleitet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform, wird das Zusatzfunktionsplasmid pLadeno5 verwendet (Details betreffend pLadeno5 sind im U.S. Patent Nr. 6004797 beschrieben, auf das hier vollinhaltlich Bezug genommen wird). Dieses Plasmid stellt einen vollständigen Satz von Adenovirus-Zusatzfunktionen für eine AAV-Vektorproduktion zur Verfügung, hat aber nicht die Komponenten, die notwendig sind, um replikationskompetente Adenoviren zu bilden.
Der rAAV-Vektor kann ein Vektor sein, der von einem beliebigen AAV-Serotyp abgeleitet ist, einschließend ohne Einschränkung, AAV-1, AAV-2, AAV-3A, AAV-3B, AAV-4, AAV-5, AAV-6 etc. AAV-Vektoren können ein oder mehr der wt-AAV-Gene vollständig oder in Teilen deletiert haben, z.B. die rep- und/oder cap-Gene, aber sie behalten wenigstens eine funktionelle flankierende ITR-Sequenz, da sie für die Freisetzung, die Replikation und Verpackung des AAV-Virions notwendig ist. Somit ist ein AAV-Vektor hier so definiert, dass er wenigstens eine dieser Sequenzen enthält, die in cis für eine virale Replikation und Verpackung (z.B. funktionelle ITRs) notwendig sind. Die ITRs müssen nicht die Wildtypsequenzen sein und können z.B. durch Insertion, Deletion oder Nukleotidsubstitution verändert werden, solange die Sequenzen funktionelle Freisetzung, Replikation und Verpacken bereitstellen. AAV-Vektoren können unter Verwendung von rekombinanten Methoden, die Stand der Technik sind, so konstruiert werden, dass sie eines oder mehrere heterologe Gene, die von funktionalen AAV-ITRs flankiert sind, enthalten.
Das heterologe Gen ist funktionsfähig mit einem heterologen Promotor (konstitutiv, zellspezifisch oder induzierbar) verknüpft, so dass das Gen in der Lage ist, unter geeigneten oder gewünschten Bedingungen in den Zielzellen des Patienten exprimiert zu werden. Mit „funktionsfähig verknüpft" ist eine Anordnung von Elementen gemeint, wobei derartig beschriebenen Bestandteil so konfiguriert sind, dass sie ihre übliche Funktion ausüben können. Somit sind Kontrollsequenzen, die funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz verknüpft sind, in der Lage, die Transkription der codierenden Sequenz zu bewirken. Die Kontrollsequenzen müssen nicht an die codierende Sequenz grenzen, solange sie funktionieren, um die Transkription zu steuern. Somit können beispielsweise dazwischenliegende untranslatierte aber bereits transkribierte Sequenzen zwischen einer Promotorsequenz und der codierenden Sequenz anwesend sein und die Promotorsequenz kann immer noch als funktionsfähig mit der codierenden Sequenz verknüpft betrachtet werden.
Zahlreiche Beispiele von konstitutiven, zellspezifischen und induzierbaren Promotoren entsprechen dem Stand der Technik und ein Fachmann kann leicht einen Promotor für eine spezifische, angestrebte Verwendung auswählen, z.B. die Wahl des leberspezifischen humanen alpha-1 Antitrypsinpromotors für eine leberzellspezifische Expression, die Wahl des konstitutiven CMV-Promotors für hohe Niveaus kontinuierlicher oder fast-kontinuierlicher Expression oder die Wahl des induzierbaren Ecdysonpromotors für eine induzierte Expression. Eine induzierte Expression ermöglicht es dem Fachmann die synthetisierte Proteinmenge zu kontrollieren. Auf diese Weise ist es möglich, die Konzentration des therapeutischen Produkts zu variieren. Andere Beispiele von bekannten induzierbaren Promotoren schließen mit ein: Steroidpromotoren (z.B. Östrogen- und Androgenpromotoren) und Metallothioneinpromotoren.
Eine Genexpression kann mit einem „Enhancer-Element" gesteigert werden. „Enhancer-Element" meint eine DNA-Sequenz (z.B. ein cis-wirkendes Element), die, wenn sie an einen Transkriptionsfaktor gebunden ist, die Expression eine Gens relativ zur Expression über einen Promotor allein, steigert. Zahlreiche Enhacer-Elemente entsprechen dem Stand der Technik und der Fachmann kann leicht ein Enhancer-Element für eine bestimmten Zweck auswählen. Ein Beispiel eines Enhancer-Elements, das nützlich zur Steigerung der Genexpression in der Leber ist, ist die Apolipoprotein E hepatische Kontrollregion (beschrieben in Schachter et al. (1993) J Lipid Res 34: 1699-1707).
Erfindungsgemäß werden rAAV-Virionen verwendet, um Gene einzuschleusen, die Proteine, die am Aminosäurestoffwechsel beteiligt sind, codieren. „Aminosäurestoffwechsel" meint sowohl den enzymatischen Umbau oder Abbau von Aminosäuren zu Stoffwechselprodukten, die keine Aminosäuren mehr sind, für eine weitere biochemische Verwendung (wie beispielsweise dem Einbau der Abbauprodukte in Glukose, Fettsäuren und ähnliches oder die Umwandlung der Abbauprodukte in biogene Amin- oder Purin- und Pyrimidin-Stickstoffbasen) als auch als den direkten Einbau in Proteine, Polypeptide, Enzyme und ähnliches.
Die Erfindung umfasst rAAV-Virionen, umfassend Gene, die Enzyme codieren, die am Stoffwechsel von aromatischen Aminosäuren beteiligt sind. Von den zwanzig natürlich vorkommenden, in der Proteinsynthese verwendeten Aminosäuren sind nur drei aromatisch: Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan.
Im ersten (und geschwindigkeitsbestimmenden) Schritt des Abbaus von aromatischen Aminosäuren werden Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan hydroxyliert und bilden Tyrosin, Dihydroxyphenylalanin (L-Dopa) bzw. 5-Hydroxytryptophan. Spezifische aromatische Aminsäurehydrolasen vermitteln die Hydroxylierungsreaktion: z.B. Phenylalaninhydroxylase hydroxyliert Phenylalanin, Tyrosinhydroxylase hydroxyliert Tyrosin und Tryptophanhydroxylase hydroxyliert Tryptophan. Tyrosin ist insofern einmalig, als dass es sowohl eine natürlich vorkommende Aminosäure ist, als auch das erste Stoffwechselprodukt im Phenylalaninabbaustoffwechsel. Eine nachfolgende Verarbeitung im Stoffwechsel führt zur Bildung von Zwischenprodukten, die zur Herstellung von Energie (über den Zitronensäurezyklus und oxidative Phosphorylierung) und in der Fettsäure- und Kohlenhydratbiosynthese verwendet werden.
Abhängig von den speziellen Bedürfnissen des Organismus, können aromatische Aminosäuren über eine unterschiedliche Reihe von Pfaden verstoffwechselt werden, um mit den biogenen Aminen eine einmalige Verbindungsklasse zu bilden. Aromatische Aminosäuredecarboxylase, die eine Spezifität für L-Dopa und 5-Hydroxytryptophan hat, vermittelt die Decarboxylierung von diesen beiden Verbindungen, um Dopamin bzw. Serotonin zu bilden. Serotonin hat eine Vielzahl von peripheren und zentralen Wirkungen, einschließend als Agonist für die Kontraktion der glatten Muskelzellen und als Neurotranmitter im zentralen Nervensystem. Ungleichgewichte des Serotoningehalts sind an verschiedenen psychiatrischen Störungen, einschließlich Depression und Angstzuständen beteiligt. Dopamin, ein Chatecholaminneurotransmitter ist für die einwandfreie Kontrolle der Körperbewegung entscheidend. Seine Abwesenheit im Gehirn führt zur Parkinson-Krankheit, aufgrund der Degradation von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra.
Dopamin kann über eine von Dopamin-β-Hydroxylase vermittelte Hydroxylierungsreaktion weiter verstoffwechselt werden, um Norepinephrin zu bilden. Norepinephrin, ein Catecholamin, dient dem sympathischen Nervensystem als Hauptneurotransmitter. In einer einstufigen Methylierungsreaktion, die durch Phenylethanolamin-N-Methyltransferase vermittelt wird, wird Norepinephrin zu Epinephrin verstoffwechselt. Epinephrin wird im Nebennierenmark gebildet, welches es als Antwort auf niedrigen Blutzucker, Bewegung und Stress in die Blutbahn sekretiert, was zum Absinken des Glykogenspiegels in der Leber, dem Freisetzen von Fettsäure aus Fettgewebe und einer Steigerung der Herzleistung führt.
Stark erhöhte Tyrosin-, Tryptophan- oder Phenylalaninspiegel im Blut (bezeichnet als Tyrosinämie Typ I und Typ II, Hypertryptophanämie und Hyperphenylalaninämie) können von vielen verschiedenen defekten Enzymen, die wenigstens zum Teil für den Abbau von aromatischen Aminosäuren verantwortlich sind, herrühren. Abhängig von den sich daraus ergebenden Konzentrationen dieser aromatischen Aminosäuren im Blut, können die Folgen ziemlich schwer sein, einschließlich mentaler und physischer Retardierung und Tod. Ererbte Mutationen in den Genen, die Phenylalaninhydroxylase (GenBank Zugangsnummer U49897), Tyrosinhydroxylase (GenBank Zugangsnummer NM_000360) und Tryptophanhydroxylase (GenBank Zugangsnummer NM_004179) als auch andere aromatische Aminosäurestoffwechselproteine (diskutiert weiter unten) codieren, führen zu einem erhöhten Gehalt von aromatischen Aminosäuren im Blut.
Zusätzlich zu den aromatischen Aminosäurenhydroxylasen werden Enzyme, die an der Synthese von Tetrahydropterin (BH4) – ein notwendiger Kofaktor für alle drei aromatischen Aminsäurehydroxylasen – beteiligt sind, ebenfalls für einen effizienten Abbaustoffwechsel von aromatischen Aminosäuren benötigt. Unter den wichtigeren BH4-synthetisierenden Enzymen sind Dihydrofolatreduktase (GenBank Zugangsnummer XM_017857), Dihydropteridinreduktase (GenBank Zugangsnummer A6053170), 6-Pyruvol-Tetrahydropteridinsynthase (GenBank Zugangsnummer NM_000317) und Guanosin-Triphosphat-Cyclohydrolase I (GenBank Zugangsnummer NM_000161). Falls Fehler in der BH4-Synthese auftreten, die durch Mutationen in Genen, die eines dieser Enzyme codieren, auftreten können, dann kann der Abbau von Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin gegenteilig betroffen sein, was zu einem erhöhten Gehalt dieser Aminosäuren im Blut führt.
Genetische Mutationen in den Phenylalaninhydroxylase- und BH₄-synthetisierenden Enzymen führt zu Hyperphenylalaninämie. Die schwerste Form dieses Zustandes, Phenylketonurie (PKU) in eine relativ häufige angeborene Krankheit (1:10000 Geburten in der kaukasischen und asiatischen Bevölkerung), die als ein autosomal-rezessives Merkmal weitergegeben wird. Ein abnormal hoher Phenylalaningehalt wird zur Bildung von Phyenylpyruvatsäure und seinen Stoffwechselderivaten, Phenylessigsäure, Phenylmilchsäure und Orthohydroxyphenylessigsäure umgelenkt. Die Ausscheidung dieser Säuren in den Urin ist stark erhöht. Zusätzlich gibt es eine Interferenz mit dem normalen Tyrosin- und Tryptophanstoffwechsel und unübliche Zwischenprodukte dieser beiden Aminosäuren treten ebenfalls im Urin auf.
Eine mentale Retardierung, normalerweise schwergradig, ist eine der klinischen Manifestationen dieser Krankheit, wenn sie unbehandelt bleibt. Petit und grand mal Krampfanfälle treten häufig auf und eine hohe Inzidenz von abnormalen Elektroenzephalogrammen ist auch bei Abwesenheit von Krämpfen üblich. Die neurologischen Manifestationen in unbehandelten Patienten schließen muskuläre Hypertonizie, übertriebene Sehnenreflexe, Zittern und Hyperkinese mit ein. In ungefähr 15-20 % der unbehandelten Fälle wurde eine einem infantilen Ekzem ähnelnde Dermatitis beobachtet. Viele Fälle zeigen aufgrund einer unzureichenden Produktion von Melanin Störungen des Pigmenstoffwechsels.
Es gibt ein Zahl von bekannten klinischen Fällen von mentaler und physischer Retardierung, die bei Nachkommen von PKU-Müttern, die keine spezielle Ernährungshilfe für PKU zur Zeit der Empfängnis und während ihrer Schwangerschaft erhalten hatten, auftraten. Diese Nachkommen hatten selbst keine PKU; stattdessen schädigten die hohen mütterlichen Phenylalaninspiegel diese Kinder in utero. Der Phenylalaningehalt im Plasma von PKU-Müttern muss während der Schwangerschaft kontrolliert werden. Eine Behandlung mit einer phenylalaninreduzierten Diät während der Schwangerschaft, insbesondere wenn sie vor der Empfängnis begonnen wird, scheint dem Fötus einigen Schutz vor Geburtschäden zu bieten.
Um Phenylalanin zu vermeiden, besteht die aktuelle Behandlung von PKU aus einer sehr strengen, sorgfältig kontrollierten Diät. Eine Behandlung muss während der ersten Lebenstage begonnen werden, um einer mentalen Retardierung vorzubeugen. Eine frühe und konsequente Behandlung begünstigt eine normale Entwicklung und verhindert, dass das ZNS in Mitleidenschaft gezogen wird. Eine Behandlung, die in einem Alter von 2 bis 3 Jahren begonnen wird, kann nur bezüglich der Kontrolle von extremer Hyperaktivität und schwerer Krampfanfälle erfolgreich sein. Was den idealen Zeitraum der Behandlung betrifft, so steht dieser noch nicht endgültig fest. Obwohl es früher als sicher angesehen wurde, mit der Behandlung aufzuhören, sobald die Myelinbildung im Gehirn gewissermaßen abgeschlossen ist, haben Berichte über ein Absinken des Intelligenzquotienten und der Entwicklung von Lern- und Verhaltensschwierigkeiten zu einer nochmaligen Prüfung dieser Empfehlung geführt. Aktuelle Daten deuten darauf hin, dass die Diätbeschränkung lebenslang aufrechterhalten werden sollte. Solch ein strenge Diät, insbesondere wenn sie lebenslang ist, ist mit einigen Schwierigkeiten, einschließend die Patientencompliance, verbunden. Zusätzlich ist der normale Proteinumsatz im Abbaustoffwechsel im Köper eine Quelle von endogenem Phenylalanin, die nicht mit einer Diät kontrolliert werden kann.
Um Störungen des aromatischen Aminosäurestoffwechsels zu behandeln, betrachtet die vorliegende Erfindung die Verwendung von rAAV-Virionen, um Gene, die Enyzme des aromatischen Aminosäurestoffwechels codieren, an Menschen mit aromatischen Aminosäurestoffwechselkrankheiten zu verabreichen. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung rAAV-Virionen, umfassend Gene, die am Phenylalaninstoffwechsel beteiligte Enyzme codieren, die unter Verwendung von Verfahren der vorliegenden Erfindung in die Zellen eines Säugers mit Hyperphenylalaninämie verabreicht werden können. Solche Gene umschließen, sind aber nicht darauf beschränkt, Phenylalaninhyroxylase, Dihydrofolatreduktase, Dihydropteridinreduktase, 6-Pyruvoyl-Tetrahydropteridinsynthase und Guanosin-Triphosphat-Cyclohydrolase I.
Durch die Verabreichung von Genen, die Enyzme des Phenylalaninstoffwechsels codieren, kann eine therapeutischen Wirkung in einem Säuger mit Hyperphenylalaninämie erzielt werden. Die Erfindung umfasst die Verabreichung von Enyzmen des Phenylalaninstoffwechsels zur Behandlung von PKU. Insbesondere codiert das zu verabreichende Enyzym Phenylalaninhydroxylase. Im Kontext von PKU, wird eine therapeutische Wirkung durch eine Senkung des Plasmaphenylalaninspiegels auf eine Konzentration unter 1000 μM (entspricht 20 Milligram pro Deziliter (mg/dL) und für klinisch mildere Formen von Hyperphenylalaninämie (z.B. irgendeine andere Hyperphenylalaninämie als PKU) auf eine Konzentration vorzugsweise unter 120 μM, erzielt.
Eine nachteilige Wirkung von Hyperphenylalaninämie und PKU ist eine Hypopigmentierung. Ein erhöhter Phenylalaningehalt im Blut inhibiert Tyrosinase, ein Melanozyten-spezifisches Enzym, dass Tyrosin in Melanin umwandelt. Unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, reduziert eine Senkung der Phenylalaninspiegel auf eine Konzentration unter 100 μM, vorzugsweise unter 120 μM, sehr wahrscheinlich die Hypopigmentierung in Patienten mit Hyperphenylalaninämie. Auf diese Art und Weise kann der Arzt einen Patienten mit einer Hyperphenylalaninämie-bezogenen Hypopigmentierung behandeln.
Ein erhöhter Phenylalaninspiegel im Plasma aufgrund einer PAH-Defizienz führen zu einem Rückgang der Tyrosinbildung. Wie oben beschrieben, wird Tyrosin durch die Hydroxylierung von Phenylalanin, dem ersten Schritt im Phenylalaninstoffwechsel, gebildet. Tyrosin ist eine essentielle Aminosäure für die Bildung einer Vielzahl von Hormonen einschließend Dopamin (wie oben beschrieben), als auch der Thyroidhormone Triiodthyronin (T3) und Tetraiodthyronin (T4). Diese beiden Thyroidhormone regulieren Stoffwechselvorgänge. Unter der Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung kann der Arzt Stoffwechselstörungen, die aufgrund einer T3 und T4-Insufizienz auftreten, durch die Verabreichung von rAA-Virionen, die Phenylalanin-verstoffwechselnde Enzyme enthalten, behandeln, was zu einer erhöhten Tyrosinproduktion führt. Solche thyroidbezogenen Stoffwechselstörungen schließen Hypothyreose und Kretinismus mit ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein Phenylalaningehalt im Plasma können unter Verwendung von bekannten Verfahren bestimmt werden, einschließend, aber nicht darauf beschränkt, Gaschromatographie-Massenspektrometrie, enzymgekoppelter Immunadsorptionstest, Radioimmunoassay oder enzymatischer mikrofluorometrischer Assay.
Es ist bevorzugt, rAAV-Virionen in spezielle Organe oder Gewebe im Körper, wo die Stoffwechselkrankheit primär auftritt, zu verabreichen. Der Fachmann kann bekannte Verabreichungswege, einschließend eine intravenöse, intrareterielle und direkte Injektion verwenden, um die Transduktion der Zielzellen durch rAAV-Virionen sicherzustellen. Obwohl es im Kontext von Stoffwechselkrankheiten viele Organe und Zellen gibt, die attraktive Ziele für eine rAAV-Virionen-vermittelte Genverabreichung darstellen würden, ist der Fachmann in der Lage, auszuwählen, welche Organe und Zellen transduziert werden sollen, wobei die Auswahl von verschiedenen Faktoren abhängig ist, einschließend, aber nicht darauf beschränkt, die zu behandelnde Krankheit und die Stelle im Körper, wo das therapeutische Stoffwechselprotein normalerweise exprimiert wird.
Zur Verabreichung von Phenylalanin-verstoffwechselnden Enzymen ist es bevorzugt, aber nicht notwendig, dass rAAV-Virionen diese Enyzme, die in die Leber eine Säugers mit Hyperphenylalaninämie verabreicht werden, umfassen. Weniger bevorzugt, aber innerhalb des erfindungsgemäßen Rahmens, ist die Verabreichung von rAAV-Virionen, umfassend die Phenylalanin-verstoffwechselnden Enzyme, in das Muskelgewebe eines Säugers über eine direkte Injektion.
Eine Verabreichung von rAAV-Virionen in die Leber kann unter Verwendung einer Vielzahl von bekannten Verfahren, einschließend eine Injektion in die Pfortader, Injektion in die Leberarterie oder eine direkte Injektion in das Lebergewebe erreicht werden. Es ist bevorzugt, dass die Verabreichung in die Leber über minimalinvasive Verfahren durchgeführt wird. Wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, kann der Fachmann beispielsweise die Kathetertechnik verwenden, um rAAV-Virionen über eine periphere Arterie in die Leber zu injizieren. Während dieses Verfahrens wird ein Schnitt im Oberschenkel gemacht, die Oberschenkelarterie wird zugänglich gemacht, ein Katheter wird in die Oberschenkelarterie eingeführt und bis zur Leberarterie weitergeführt, wo die rAAV injiziert werden, was den Virionen ermöglicht, die Leber zu transduzieren. Alternativ, können rAAV-Virionen einem Säuger intravenös injiziert werden, wobei eine solche Injektion in einer Lebertransduktion resultiert.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine retrograde duktale Verabreichung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Eine retrograde duktale Verabreichung ist ein Minimalinvasivverfahren, was sie zu einem besonders attraktiven Verfahren zur Verabreichung von rAAV-Virionen in die Leber macht. Mit „retrograder duktaler Verabreichung" ist die Verabreichung von rAAV-Virionen in eine Richtung, die dem normalen Materialfluss im Duktus entgegensetzt ist, gemeint. Eine Einführung von rAAV-Virionen kann über eine Verabreichung in eine externe Öffnung eines Duktus, der mit der Leber assoziiert ist, wie der gemeinsame Gallenduktus, gemeinsame hepatische Duktus, zystische Duktus, biliäre Duktus oder durch die Duktuswand erfolgen, solange die rAAV-Virionen in einer Art und Weise verabreicht werden, so dass die rAAV-Vironen veranlasst werden, in die entgegengesetzte Richtung zum normalen Materialfluss im Duktus zu wandern. Eine retrograde duktale Verabreichung kann eine einzelne diskontinuierliche Verabreichung (z.B. eine einzelne Injektion) oder eine kontinuierliche Verabreichung (z.B. eine Infusion) umfassen.
Vorzugsweise wird eine endoskopische retrograde Cholangiopankreatikographie (ERCP), eine Form von retrograder duktaler Verabreichung, verwendet, um rAAV-Virionen in die Leber zu verabreichen. Dieses Verfahren verwendet ein Endoskop, das in die Speiseröhre eingeführt ist, wo es durch den Verdauungstrakt zum gemeinsamen Gallenduktus geleitet wird und durch den gemeinsamen Gallenduktus zum hepatischen Duktus geführt wird. Der hepatische Duktus kann anschießend kanüliert werden und Material kann über eine retrograde duktale Verabreichung in die Leber eingeführt werden. Falls gewünscht, können beispielsweise der pankreatische Duktus und der cystische Duktus über einen Ballonverschluss verschlossen werden, um zu verhindern, dass Material in die Bauchspeicheldrüse oder Gallenblase gelangt. Die rAAV-Virionendosis, die für die Verabreichung an eine Zielzelle (vorzugsweise eine oder mehrere Leberzellen) benötigt wird, um eine bestimmte therapeutische Wirkung zu erzielen, z.B. Dosiseinheiten in viralen Genomen(vg)/pro Säuger oder vg/Kilogramm Körpergewicht (vg/kg), variiert basierend auf mehreren Faktoren, einschließend: das Niveau der Genexpression, die notwendig ist, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen, die spezifische zu behandelnde Stoffwechselkrankheit, eine potentielle Immunantwort des Wirts auf das rAAV-Virion, eine Immunantwort des Wirts auf das Genprodukt und die Stabilität des Genprodukts. Im Kontext der Dosis ist der Begriff „virales Genom" synonym mit „Virion", da ein virales Genom den rAAV-Vektor umfasst (enthaltend das Gen, das an den Wirt verabreicht wird und ebenda exprimiert wird), wobei der rAAV-Vektor in dem rAAV-Virion eingekapselt ist. Wie dem Fachmann bekannt ist, ist, wenn auf die Dosis bezogen, virales Genom der bevorzugte Begriff, da die Detektion von viralen Genomen der Endpunkt von quantitativen Dosismessungen ist. Mehrere solche quantitative Messungen sind aus dem Stand der Technik bekannt, einschließend, aber nicht darauf beschränkt, das Dot-Blot-Hybridisierungsverfahren (beschrieben im U.S. Nr. 6335011 , auf das hier Bezug genommen wird) und das quantitative Polymerasekettenreaktionsverfahren (QPCR) (beschrieben in Real Time Quantitative PCR. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J. und Williams P.M. 1996. Genome Research. Cold Spring Harbor Laborstory Press). Ein Fachmann kann leicht einen rAAV-Virion-Dosisbereich bestimmen, um einen Patienten, mit einer bestimmten Stoffwechselkrankheit, basierend auf den vorher erwähnten Faktoren, als auch anderen Faktoren, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, zu behandeln.

Durch die Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, senkte eine über rAAV-Virionen verabreichte Phenylalaninhydroxylase den Phenylalaningehalt im Plasma in einem PKU-Mausmodell um 95 %, wobei eine Mehrheit der behandelten Mäuse ein Phenylalaningehalt im Plasma erreichten, der sechs Wochen nach einer rAAV-Injektion therapeutisch war (siehe Tabelle 1). TABELLE 1 Phenylalaninsgehalt des Plasmas in 57BI/Naiven Mäusen (mg/dL)

Maus Nr./Vektor	Dosis (vg)	Vorinjektion	2 Wochen	4 Wochen	6 Wochen
125/2C¹	5e12	31.89	38.47	30.30	28.92
126/2C	5e12	33.82	34.47	30.56	22.95
129/2C	5e12	36.87	33.93	25.84	17.04
131/2C	5e12	28.89	26.34	29.50	20.62
127/2G²	7.5e12	34.68	31.41	27.55	21.97
128/2G	7.5e12	33.49	31.35	27.19	22.78
130/2G	7.5e12	29.70	25.38	33.04	18.39
132/2G	7.5e12	23.97	26.55	30.92	19.97
134/5C³	1.5e13	31.45	3.48	2.17	2.59
135/5C	1.5e13	42.19	10.37	7.14	3.61
133/5G⁴	2.5e13	26.67	3.81	5.21	3.16
136/5G	2.5e13	59.27	9.76	3.62	3.19
137/5G	2.5e13	56.08	6.61	2.20	3.55
139/5G	2.5e13	46.46	4.71	3.22	2.85

¹ = Rekombinante AAV2-CAG-mPAH-SV40polyA-Virionen
² = Rekombinante AAV2-GSTE-CAG-mPAH-SV40polyA-Virionen
³ = Rekombinante AAV2-CAG-mPAH-SV40polyA
⁴ = Rekombinante AAV2- GSTE-CAG-mPAH-SV40polyA

(Beispiele)
Die folgenden Beispiele werden vorgestellt, um ein vollständigeres Bild der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung zu erzeugen. Sie sollen in keiner Weise als den breiten Anwendungsbereich der Erfindung einschränkend ausgelegt werden, der einzig und allein durch die angehängten Ansprüche beschränkt ist.
BEISPIEL 1
REKOMBINANTE AAV-PHENYLALANINHYDROXYLASE
VIRIONENHERSTELLUNG
Rekombinante Virionen, die das Mausgen für Phenylalaninhydroxylase enthalten, wurden unter Verwendung eines Tripletransfektionsverfahrens, das im U.S. Patent Nr. 60001650 beschrieben ist, siehe oben, durchgeführt.
Vektorkonstruktion
Konstruktion des AAV pHLP19-Helferfunktionsvektors
Der AAV pHLP19-Helferfunktionsvektor wurde unter der Verwendung von molekularbiologischen Standardmethoden konstruiert; seine Konstruktion ist detailliert im U.S. Patent Nr. 6001650 , siehe oben, beschrieben.
Zusammenfassend wurde der AAV pHLP19-Helferfunktionsvektor über ein mehrere Schritte umfassendes Verfahren konstruiert, unter Verwendung von AAV-2-Sequenzen, die von dem AAV-2-Provirus pSM620 abgeleitet waren, GenBank Zugangsnummern K01624 und K01625. Zuerst wurden die ITRs von den rep- und cap-Sequenzen entfernt. Das pSM620-Plasmid wurde mit SmaI und PvuII verdaut und das 4543 bp rep- und cap-codierende SmaI-Fragment wurde, um pUCCrepcap, ein 7705 bp Plasmid zu erhalten, in die SmaI-Schnittstelle von pUC19 cloniert. Die verbliebene, die cap- und rep-Gene flankierende ITR-Sequenz wurde anschließend unter Verwendung der Oligonukleotide 145A (5'-GCTCGGTACCCGGGCGGAGGGGTGGAGTCG-3') (SEQ ID NO:1) und 1456 (5'-TAATCATTAACTACAGCCCGGGGATCCTCT-3') (SEQ ID NO:2) durch eine gezielte Oligonukleotidmutagenese deletiert. Das resultierende Plasmid, pUCRepCapMutated (pUCRCM) (7559 bp), enthält des gesamte AAV-2 Genom (AAV-2 Genom, Zugangsnummer NC-001401) ohne irgendeine ITR-Sequenz (4389 bp). SrfI-Schnittstellen, die teilweise durch die mutagenen Oligonukleotide eingefügt wurden, flankieren in diesem Konstrukt die rep- und cap-Gene. Die AAV-Sequenzen entsprechen den AAV-2 Positionen 146-4534.
Zweitens wurde eine Eco47III-Restriktionsenzymschnittstelle am 3'-Ende von p5 eingeführt. Diese Eco47III-Schnittstelle wurde am 3'-Ende des p5-Promotors eingeführt um die Excision der p5-Promotorsequenzen zu erleichtern. Um dies durchzuführen wurde pUCRCM mit dem P547-Primer (5'-GGTTTGAACGAGCGCTCGCCATGC-3') (SEQ ID NO:3) mutiert. Das resultierende 7559 bp Plasmid wurde pUCRCM47III benannt.
Drittens wurde ein Hilfsplasmid (assembly plasmid), pBluntscript genannt, konstruiert. Der Polylinker von pBSII SK+ wurde durch die Exzision des Originals mit BssHll verändert und mit den Oligonukleotiden blunt 1 und 2 ersetzt. Das resultierende Plasmid, pBluntscript, ist 2839 bp lang und der neue Polylinker codiert die Restriktionsschnittstellen EcoRV, HpaI, SrfI, PmeI, and Eco47III. Die blunt 1-Sequenz ist 5'-CGCGCCGATATCGTTAACGCCCGGGCGTTTAAACAGCGCTGG-3' (SEQ ID NO:4) und die blunt 2-Sequenz ist 5'-CGCGCCAGCGCTGTTTAAACGCCCGGGCGTTAACGATATCGG-3' (SEQ ID NO:5).
Viertens wurde das pH1-Plasmid über ein Ligieren des 4397 bp rep- und capcodierenden Fragments aus pUCRCM in die Srf1-Schnittstelle von pBluntscript konstruiert, so dass die HpaI-Schnittstelle sich in der Nähe des rep-Gens befand. Das pH1-Plasmid ist 7228 bp lang.
Fünftens wurde das pH2-Plasmid konstruiert. Das pH2-Plasmid ist mit pH1 identisch, mit der Ausnahme, dass der p5-Promotors von pH1 durch die 5'-untranslatierte Region von pGN1909 (ATTCC Zugangsnummer 69871) ersetzt wurde. Die Konstruktion des pGN1909-Plasmids wird detailliert im U.S. Patent Nr. 5622856 , auf das hier vollumfänglich Bezug genommen wird). Um dies zu erreichen, wurde das 329 bp AscI(blunt)-SfiI-Fragment, das die 5'-untranslatierte Region von pW1909IacZ (detailliert im U.S. Pat. Nr. 5622856 beschrieben, siehe oben) codiert, in das 6831 bp SmaI(partiell)-SfiI-Fragment von pH1 ligiert, um pH2 herzustellen. Das pH2-Plasmid ist 7155 bp lang.
Sechstens wurde pH8 konstruiert. Ein p5-Promotor wurde am 3'-Ende von pH2 durch Insertion des 172 bp SmaI-Eco47III-Fragments, das den p5-Promotor von pUCRCM47III codiert, in die Eco47III-Schnittstelle von pH2 hinzugefügt. Dieses Fragment war so orientiert, das die Transkriptionsrichtung aller drei AAV-Promotoren gleich war. Dieses Konstrukt ist 7327 bp lang.
Siebtens wurde der AAV-Helferfunktionsvektor pHLP19 konstruiert. Die TATA-Box des 3' p5 (AAV-2 Positionen 255-261, Sequenz TATTTAA (SEQ ID NO:6)) wurde durch Änderung der Sequenz in GGGGGGG (SEQ ID NO:7) unter Verwendung des mutagenen Oligonukleotids 5DIVE2 (5'-TGTGGTCACGCTGGGGGG GGGGGCCCGAGTGAGCACG-3') (SEQ ID NO:8) eliminiert. Das resultierende Konstrukt pHLP19, ist 7327 bp lang.
Konstruktion des AAV pREpCap5-Helferfuntionsvektors
Der AAV pREpCap5-Helferfuntionsvektor wurde durch Insertion der AAV-5 rep- und cap-Gene (GenBank Zugangsnummer Y18065) in die XbaI-Schnittstelle des pUC-Plasmids (siehe Chiorini et al. (1999) J. Virol 73: 1309-1319) kostruiert.
pLadeno5-Zusatzfunktionsvektor
Der Zusatzfunktionsvektor pLadeno5 wurde wie folgt konstruiert: aus aufgereinigter Adenovirus Serotyp-2 DNA (erhalten von Gibco/BRL) isolierte DNA-Fragmente, die die Ea2, E4 und VA-RNA Regionen codierten, wurden in ein sogenanntes pAmpscript-Plasmid ligiert. Das pAmpscript-Plasmid wurde wie folgt zusammengefügt: eine gezielte Oligonukleotidmutagenese wurde verwendet um eine 623-bp-Region einschließend die Expressionskassette für den Polylinker und die Alpha-Komplementation von pBSII s/k+ (erhalten von Stratagene) zu eliminieren und mit einer EcoRV-Schnittstelle zu ersetzen. Die Sequenz des mutagenen Oligo, das für die gezielte Oligonukleotidmutagenese verwendet wurde, war 5'-CCGCTACAGGGCGCGATATCAGCTCACTCAA-3' (SEQ ID NO:9). Ein Polylinker (enthaltend die folgenden Restrikitionsschnittstellen: BamHI; KpnI; SrfI; XbaI; ClaI; Bst1107I; SalI; PmeI; and NdeI) wurde synthetisiert und in die oben hergestellte EcoRV-Schnittstelle insertiert, so dass die BamHI-Schnittstelle des Linkers nahe am f1-Replikationsstart im modifizierten Plasmid war, um das pAmpscript zur Verfügung zu stellen. Die Sequenz des Polylinkers war 5¹-GGATCCGGTACCGCCCGGGCTCTAGAATCGATGTATACGTCGACGTTTAAAC CATATG-3' (SEQ ID NO:10).
DNA-Fragmente umfassend die Adenovirus Serotyp-2 Ea2- und VA-RNA-Sequenzen wurden direkt in pAmpscript cloniert. Insbesondere wurde einen 5962-bp SrfI-KpnI (partielles) Fragment, enthaltend die E2a-Region zwischen die SrfI und Kpn-Schnittstellen von pAmpscript cloniert. Das 5962-bp-Fragment umfasst die Basenpaare 21606-27568 des Adenovirus Serotyp-2 Genoms. Die vollständige Sequenz des Adenovirus Serotyp-2-Genoms ist unter der GenBank Nr. 9626158 zugänglich.
Die DNA umfassend die Adenovirus Serotyp-2 E4-Sequenzen musste modifiziert werden, bevor sie in den pAmpscript-Polylinker insertiert werden konnte. Insbesondere wurde eine PCR-Mutagenese verwendet, um den E4-proximalen, adenoviralen terminalen Repeat mit einer SrfI-Schnittstelle zu ersetzen. Die Position dieser SrfI-Schnittstelle ist äquivalent mit den Basenpaaren 35836-35844 des Adenovirus Serotyp-2-Genoms. Die Sequenzen der in der Mutagenese verwendeten Oligonukleotide waren: 5'-AGAGGCCCGGGCGTTTTAGGGCGGAGTAACTTGC-3' (SEQ ID NO:11) und 5'-ACATACCCGCAGGCGTAGAGAC-3' (SEQ ID NO:12). Ein 3192 bp E4-Fragment, dass durch Schneiden des oben beschriebenen modifizierten E4-Gens mit SrfI und SpeI hergestellt wurde, wurde zwischen die Srf- und XbaI-Schnittstellen von pAmpscript, das bereits die Ea2- und VA-RNA-Sequenzen enthielt, ligiert, was im dem pLadeno5-Plasmid resultierte. Das 3192-bp-Fragment ist äquivalent mit den Basenpaaren 32644-3536 des Adenovirus Seroytyp-2-Genoms.
Rekombinante AAV-mPAH-SV40polyA-Vektoren
Rekombinanter adenoassoziierter Virus Serotyp 2 umfassend den humanen Cytomegalovirus Immediate Early Promotor/Enhancer (CAG), das Maus-Phenylalaninhydroylasegen (mPAH) und die Simianes Virus Polyadenylierungs (SV40polyA)-Sequenz („rAAV2-CAG-mPAH-SV40polyA") oder der gleiche Vektor mit dem plazentaren Ratten-Glutathion-S-Transferase-Enhancer (GSTE) platziert 5' zum CAG-Promotor („rAAV2-GSTE-CAG-mPAH-SV40polyA") wurden wie folgt konstruiert: die Maus-Phenylalaninhydroylasesequenz wurde durch RT PCR von Maus-Leber-mRNA kloniert. In einer Serie von Vektorplasmiden steuert der humane Cytomegalievirus-Enhancer-Aktinpromotor-Globinintron (CAG)-Promotor die Phenylalanin PAH-Expression (Niwa H. et al. (1991) Gene 108: 193-199). Das SV40 späte Polyadenylierung flankiert das 3'-Ende des Maus-PAH-Gens. Die anderen Vektorserien sind identisch mit der Ausnahme, dass der plazentaren Ratten-Glutathion-S-Transferase-Enhancer (GSTE) 5' von der CAG-Promotorsequenz platziert wurde. Es wurden entweder die CAG-mPAH-SV40polyA- oder die GSTE-CAG-mPAH-SV40polyA-Kassetten zwischen die 5'- und 3'-ITR-Sequenzen von AAV2 oder AAV5 insertiert. Die Sequenz für den linken ITR von AAV-2 ist unter der GenBank Zugangsnummer K01624 und die rechte ITR-Sequenz von AAV-2 ist unter der GenBank-Zugangsnummer K01625 publiziert. Rekombinante AAV-Vektoren, die die AV-5-ITRs enthalten, wurden auf eine identische Art und Weise konstruiert. Das vollständige AAV-5-Genom, einschließend die beiden ITRs, ist publiziert (Chiorini et al., siehe oben).
Tripeltransfektionsverfahren
Rekombinante AAV-mPAH-SV40polyA-Virionen wurden unter Verwendung das AAV-Helferfunktionsvektors pHLP19 (verwendet mit rAAV-Vektoren enthaltend AAV-2 ITRs) oder des AAV-pRepCap5-Helferfunktionsvektors (verwendet mit rAAV-Vektoren enthaltend AAV-5 ITRs) hergestellt, der Zusatzfunktionsvektor pLadeno5 und entweder die rAAV2-CAG-mPAH-SV40polyA-, rAAV2-GSTE-CAG-mPAH-SV40polyA-, rAAV5-CAG-mPAH-SV40polyA-, oder die rAAV5-GSTE-CAG-mPAH-SV40polyA-Vektoren wurden verwendet. Zwei komplette Sätze von rekombinanten Vektoren wurden hergestellt: ein Satz mit AAV-2-ITRs und ein Satz mit AAV-5-ITRs.
Menschliche embryonale Nierenzellen Typ 293 (293-Zellen erhältlich von der American Type Culture Collection, Katalognummer CRL-1573) wurden in CellFactory bei einer Dichte von 3,5 × 10⁸ Zellen pro Flasche in 1000 mL Zellkulturmedium bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium versetzt mit 10 % fötalem Kälberserum kultiviert und bei einer hohen Luftfeuchtigkeit und 37 °C in 5 % CO2 inkubiert. Nach einer Inkubation über Nacht, waren die 293 Zellen ungefähr 80 % konfluent. Die 293 Zellen wurde anschließend mit DNA mit Hilfe des Calciumphosphatpräzipitations-Verfahren transfiziert. In Kürze, 650 μg eines jeden Vektors (pHLP19- oder pRepCap5-, pLadeno5-, und die rAAV-mPAH-SV40polyA Vektoren) wurde mit sterilen Pipetten in eine 250-mL steriles Polystrol-Schnappverschluss-Röhrchen überführt. 100 mL einer 300 mM CaCl₂-Lösung (JRH-Grad) wurde zu jedem Röhrchen hinzugefügt und durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Ein äquivalentes Volumen 2X HBS (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 42 mM HEPES, 1.4 mM Na₂HPO4, 12 mM Dextrose, pH 7.05, JRH-Grad) wurde mit einer 100-mL Pipette hinzugefügt und die Lösung wurde dreimal auf- und abpipettiert. Die DNA-Mixtur wurde sofort zu den 293 Zellen hinzugefügt und gleichmäßig in der Flasche verteilt. Die Zellen wurden anschließend für sechs Stunden bei einer hohen Luftfeuchtigkeit und 37 °C in 5 % CO2 inkubiert. Ein körniger Niederschlag war in den transfizierten Zellkulturen sichtbar. Nach sechs Stunden wurde die DNA-Mixtur von den Zellen entfernt, die anschließend mit frischem Zellkulturmedium versorgt und für weitere 72 Stunden inkubiert wurden.
Nach 72 Stunden wurden die Zellen lysiert und dann mit Nuklease behandelt, um die verbliebene Zell- und Plasmid-DNA zu zerkleinern. Nach einer Präzipitation wurden die Virionen über eine zweistufige isopyknischen Zentrifugation aufgereinigt; Fraktionen, die rAAV-Virionen enthielten, wurden vereinigt, dialysiert und konzentriert. Die aufkonzentrierten Virionen wurden formuliert, sterilfiltriert (0,22 μM) und aseptisch in Glasampullen abgefüllt. Die viralen Genome wurde über eine Dot-Blot-Analyse quantifiziert.
BEISPIEL 2
PHENYLKETONURIE-MAUSMODEL
Ein Phenylketonurie-Mausmodell, bezeichnet als PAHenu2, wurde in einem BTBR-Mausstamm über eine Keimbahnmutagenese mit Ethylnitrosoharnstoff (ENU) gemäß des Verfahrens beschrieben in Shredovski (Shedrovsky et al. (1993) Genetics 134: 1205-1210), etabliert. In PAHenu2-Mäusen, resultiert eine T zu C Transition im Exon 7 der PAH-Gene in einer F263S-Mutation und einer verminderten PAH-Aktivität in der Leber. Die betroffenen homozygoten Mäuse zeigen den klassischen humanen PKU-Phänotyp, wie einen deutlich erhöhten Phenylalaninspiegel des Bluts (Phe > 1000 μM oder 20 mg/dl), Hypopigmentierung und Defekte in der Neoroentwicklung.
BEISPIEL 3
REKOMBINANTE VERABREICHUNG VON AAV-VIRIONEN UND QUANTIFIZIERUNG DES PHENYLALANINGEHALTS IM PLASMA
Rekombinante AAV-Virionen wurden in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung resuspendiert. Männlichen PAHenu2-Mäusen wurden verschiedene Virionendosen in einer 300-μL Lösung (wie in Tabelle 1 gezeigt) über die obere Darmvene unter Isoflulananästhesie gemäß den Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, verabreicht. Der Phenylalaningehalt des Bluts wurden über einen enzymatischen mikrofluorometrischen Assay unter Verwendung von Enzaplate PKU-R (Bayer Medial, Tokyo, Japan) gemessen. Den Mäuse wurden durch Kürzen des Schwanzes Blut entnommen und das Blut wurde auf ein Massenscreening-geeigetes Filterpapier (#545, von Advantec Toyo, Tokyo, Japan) aufgetragen. Ein Scheibe mit 3 mm Durchmesser aus dem Blutfleck ausgestanzt und in eine 96-Lochplatte platziert. Phenylalanin wurde von der Scheibe eluiert und mit Phenylalanindehydrogenase, einem NAD-abhängigen Enzym und Resazurin inkubiert. Die Enyzmreaktion produziert NADH, das wiederum Resazulin mit der Hilfe von Diaphorase in Resolfin umwandelt. Das resultierende Resorufin wurde mit einem Fluoroskan Ascent (Labsystems, Helsinki, Finnland) und einem 544 nm/590 nm Exzitation/Emission-Filtersatz gemessen.
BEISPIEL 4
RETROGRADE DUKTALE VERABREICHUNG IN DIE LEBER VON MAUSEN
Phenylkentonurie-Mäusen (PAHenu2 Mäusen) werden über eine retrograde duktale Verabreichung in den hepatischen Duktus 250 μL-Infusionen von rAAV2-CAGhPAH-SV40polyA-, rAAV2-GSTE-CAG-h PAH-SV40polyA-, rAAV5-CAG-hPAH-SV40polyA- oder rAAV5-GSTE-CAG-hPAH-SV40polyA-Virionen verabreicht. Die Mäsue werden anästhesiert und unter einem Operationsmikroskop wird ein abdominaler Schnitt entlang der Mittellinie ausgeführt, um Zugang zu dem cystischen Duktus zu erhalten. Das vordere Sichelband wird separiert und der mittlere Leberlappen wird verschoben, um die Gallenblase, den cystischen Duktus und den gemeinsamen Gallenduktus freizulegen. Der gemeinsame Gallenduktus wird über der Verbindungsstelle zum pankreatischen Duktus abgeklemmt, um den anterograden Fluss des Vektors in das Duodenum und den retrograden Fluss in den Pankreas zu verhindern. Bevor der gemeinsame Gallenduktus jedoch abgeklemmt wird, wird der gemeinsame Gallenduktus mit Salzlösung gespült. Eine Seidennaht wird lose herum der proximalen Seite der Gallenblase platziert und der cystische Duktus wird kanüliert. Rekombinante AAV-Virionen werden langsam als Infusion in die Kanüle verabreicht. Drei Dosisgruppen mit sechs Mäusen pro Dosisgruppe wurden etabliert, wobei die Niedrigdosisgruppe 1 × 10¹² rAAV2-CAG-hPAH-SV40polyA- oder rAAV2-GSTE-CAG-hPAH-5V4 virale Genome erhält, die mittlere Dosisgruppe 5 × 10¹² virale Genome erhält und die hohe Dosisgruppe 1 × 10¹³ virale Genome erhält. Nach Infusion wird das distale Ende des Polyethylenschlauchs koaguliert, alle Retraktoren und die Klemme vom Processus xiphoideus werden entfernt und der intestinale Duktus wir in seine ursprüngliche Position verschoben. Eine Stunde nach der rAAV-Virionen-Infusion, wird der anterograde Fluss von dem Gallenduktus in das Duodenum durch Entfernen der Klemme von dem gemeinsamen Gallenduktus wiederhergestellt. Das Abdomen wird dann zweischichtig verschlossen. Der Phenylalaningehalt des Plasmas wird gemessen wie in Beispiel 3.
BEISPIEL 5
VERABREICHUNG VON REKOMBINANTEM AAV-mPAH IN DAS MUSKLEGEWEBE OVN MÄUSEN ALLEIN ODER IN KOMBINATION MIT DEM HUMANEN GUANOSIN-TRIPHOSPHAT-CYCLOHYDROLASE I GEN (rAAV-hGCH)
Rekombinante AAV-Virionen werden in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung resuspendiert. Männlichen PAHenu2-Mäusen werden rAAV-Virionen über eine Injektion in den vorderen Schienbeinmuskel gemäß den Verfahren, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, injiziert. Rekombinante rAAV-Virionen werden direkt in den exponierten Schienbeinmuskel injiziert. Die einzelne rAAV-Virioneninjektion besteht aus rAAV-mPAH. Es werden 3 Dosisgruppen mit 6 Mäusen pro Dosisgruppe etabliert, wobei die Niedrigdosisgruppe 1 × 10¹² rAAV2-CAG-hPAH-SV40polyA- oder rAAV2-GSTE-CAG-hPAH-SV4 virale Genome erhält, die mittlere Dosisgruppe 5 × 10¹² virale Genome enthält und die hohe Dosisgruppe 1 × 10¹³ virale Genome erhält. Phenylalaninspiegel des Bluts werden gemäß den in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gemessen.
Zusätzlich werden in einem separaten Experiment die Mäuse mit rAAV-mPAH und rAAV, enthaltend das humane Guanosin-Triphosphat-Cyclohydrolase I Gen (rAAV-hGCH), das hGCH-Gen erhältlich unter der GenBank Zugangsnummer NM_000161, coinjiziert. Es werden 3 Dosisgruppen mit 6 Mäusen pro Dosisgruppe etabliert, wobei die Niedrigdosisgruppe 1 × 10¹² rAAV2-CAG-hPAH-SV40polyA- oder rAAV2-GSTE-CAG-hPAH-SV4 virale Genome erhält, die mittlere Dosisgruppe 5 × 10¹² virale Genome erhält und die hohe Dosisgruppe 1 × 10¹³ virale Genome erhält. Der Phenylalaningehalt des Bluts wird gemäß den in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gemessen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinante Virionenzusammensetzung zur Verabreichung eines Proteins an einen Säuger, wobei die Zusammensetzung umfasst: rekombinante adenoassoziierte Virus (rAAV)-Virionen, die ein heterologes Gen umfassen, das für Phenylalaninhydroxylase codiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Säuger ein Mensch ist und das rAAV in einer für einen Menschen therapeutisch wirksamen Menge enthalten ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das rAAV in Mengen vorliegt, die ausreichen, damit es bei Verabreichung an einen Säuger zu einer Expression des heterologen Gens kommt, und wobei die Expression zu einer therapeutischen Wirkung führt.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die therapeutische Wirkung eine Senkung des Phenylalaninspiegels im Blut umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der Phenylalaninspiegel des Bluts auf weniger als etwa 1000 Mikromolar gesenkt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das heterologe Gen funktionsfähig mit einem heterologen Promotor verknüpft ist, der in Zielzellen eines Säugers zur Expression des Gens in der Lage ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das rAAV in einer Menge von wenigstens 5 × 10¹² Virusgenomen pro Säuger vorliegt.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die sich zur Behandlung von Aminoazidopathie bei einem Säuger eignet, umfassend: Bereitstellen eines rekombinanten adenoassoziierten Virus (rAAV)-Virions, das einen rAAV-Vektor mit einem für Phenylalaninhydroxylase codierenden Nukleinsäuremolekül umfasst, wobei das Nukleinsäuremolekül funktionsfähig mit Kontrollsequenzen verknüpft ist, die die Transkription der Nukleinsäure in einer Wirtszelle bewirken, und Vereinigen des rekombinanten rAAV-Virions mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Säuger ein Mensch ist und das rAAV in einer für einen Menschen therapeutisch wirksamen Menge enthalten ist.
Verwendung einer rekombinanten Virionenzusammensetzung gemäß Anspruch 1-7 zur Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung des rAAV-Virions an einen Säuger mit Aminoazidopathie, wobei das rAAV-Virion ein Nukleinsäuremolekül umfasst und das Nukleinsäuremolekül ein Gen umfasst, das für Phenylalaninhydroxylase codiert und funktionsfähig mit einer Kontrollsequenz verknüpft ist, die zur in vivo-Transkription des Gens in der Lage ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der Säuger ein Mensch ist und das rAAV in einer für einen Menschen therapeutisch wirksamen Menge enthalten ist.