JP2023552841A - ライソゾーム酸性リパーゼバリアント及びその使用 - Google Patents

ライソゾーム酸性リパーゼバリアント及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ライソゾーム酸性リパーゼ(LAL)のバリアント及びその使用に関する。

Description

本発明は、ライソゾーム酸性リパーゼ(lysosomal acid lipase)(LAL)の核酸及びタンパク質バリアント並びにその使用に関する。前記バリアントは、異種シグナルペプチドに関連する。
ライソゾーム酸性リパーゼ(LAL)は、低密度リポタンパク質(LDL)受容体を介してライソゾーム(lysosome)に内部移行されるコレステロールエステル(CE)及びトリグリセリド(TG)を加水分解する。LAL酵素は、酵素的に活性であるために翻訳後修飾(N-グリコシル化)を必要とし、その後、ライソゾームを通過し、細胞の外に分泌される。
LALは、脂質ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす。従って、LAL酵素をコードするLIPA遺伝子(OMIM ID: 613497、GenBank Accession no. NG_008194)における変異は、深刻な代謝疾患を引き起こす。LAL欠損(LAL-D)は、欠失した又は欠損したLAL酵素をもたらす常染色体劣性ライソゾーム蓄積症である。LAL-Dの表現型の範囲は、深刻な乳児発症型形態(ウォルマン病、WDとして知られる)から晩期発症型形態(コレステロールエステル蓄積症、CESDとして参照される)までに及ぶ。～1/300,000の出生に影響を及ぼす最も深刻な形態である、ウォルマン病(≦5% LAL活性)は、栄養障害、肝腫大、肝疾患及び皮質不全により特徴付けられる。治療無しで、ウォルマン病は、生後1年以内に死に至る。晩期発症型のLAL欠損である、コレステリルエステル蓄積症は、生涯の様々な段階において、異なる深刻度で確認されることができる。晩期発症型CESDの病的状態は、アテローム性動脈硬化(冠動脈疾患、脳卒中)、肝疾患(例えば、変化した肝機能、脂肪肝、線維症、硬変及び関連する食道静脈瘤、並びに/又は肝不全)、二次的な脾機能亢進の合併症(すなわち、貧血及び/又は血小板減少)及び/又は吸収障害から生じる。
ドナーに由来する造血性幹細胞移植(HSCT)及び肝臓移植は、少数の症例において使用されたが、HSCTの少ない報告された生存者で、結果は非常に乏しいままであった(Krivitら、Bone Marrow Transplantation. 1992 ;10 Suppl 1:97-101. ; Gramatgesら、Bone Marrow Transplant. 2009;44(7):449-450 ; Yanirら、Mol Genet Metab. 2013;109(2):224-226)。死亡の多くは、LAL欠損の進行又はHSCT関連合併症のいずれか、例えば感染、移植片対宿主病及び/若しくは移植不全から生じた。加えて、移植治療は、ドナーの利用可能性により著しく制限される。
2015年12月に、リコンビナントLAL(セベリパーゼアルファ)による酵素補充療法は、LAL欠損の管理のための食品医薬品局により承認された(Jonesら、Orphanet J Rare Dis. 2017; 12:25)。この治療は、影響を受ける細胞により取り込まれる、欠失LAL酵素の静脈内注射にあり、蓄積された毒性の基質を除去する(クロス-コレクション(cross-correction))。酵素補充療法は、ただ一つの利用可能な対症療法である。しかしながら、酵素補充療法の利点は、頻繁な注入の必要性により制限される。なぜならば、患者の生涯を通してリコンビナントヒトLAL酵素の毎週の注射を要するからである。その長期間の有効性は、未だに評価されているが、最初の証拠は、有効性が、おそらくアンチドラッグ免疫応答により、いくつかの患者において経時的に減少することを示す。
患者の生活の質を改善する、LAL欠損の長期間の治療を提供する目的で、本発明者は、遺伝子療法に基づくもう一つの治療のアプローチを提供した。例えば、本発明者は、患者の造血性幹細胞(HSC)へLIPA遺伝子の機能的なコピーを導入することを目的とするex vivo遺伝子療法を提供した(Pavaniら; Nat Commun. 2020;11(1):3778)。自己HSCは、ex vivo遺伝子操作及び再投与に対して容易にアクセスされることができ、従って免疫学的な問題を回避する。修正されたHSCは、血流に投与され、骨髄に到達し及び増殖し、血液において新しく修正された細胞を産生することを意図される。LAL酵素は、その後、LAL欠損細胞により回収されるために血流中に分泌され、最終的に代謝機能を回復させる。
しかしながら、LAL酵素は、主に細胞内にあり、ごく一部分のみが血液に分泌されクロス-コレクションに利用可能である。従って、治療的なLAL酵素の高い発現及び分泌レベルにより、LAL欠損の長期間の治療を提供する必要性が存在する。特には、LALの酵素活性又はクロス-コレクト(cross-correct)LAL欠損細胞に対するその能力に影響を与えることなく、LALの発現及び分泌を改善させる必要性がある。
本発明の第一の態様は、シグナルペプチド部分及び機能的なLAL部分を含む、機能的なキメラLALタンパク質をコードする核酸分子であって、シグナルペプチド部分は、配列番号3から5から成る群において選択されるアミノ酸配列を有し、又はシグナルペプチド部分は、配列番号3から5の配列と比較して、1から5個まで、特には1から4個まで、特には1から3個まで、特には1から2個まで、特には1個のアミノ酸の欠失、挿入若しくは置換を含むアミノ酸配列を有する機能的なシグナルペプチド部分である、核酸分子に関する。好ましい実施形態において、シグナルペプチド部分は、配列番号5のアミノ酸配列を有し、又は配列番号5の配列と比較して、1から5個まで、特には1から4個まで、特には1から3個まで、特には1から2個まで、特には1個のアミノ酸の欠失、挿入又は置換を含むアミノ酸配列を有する機能的なシグナルペプチド部分である。
特定の実施形態において、機能的なLAL部分は、機能的なヒトLAL部分、好ましくはその天然のシグナルペプチドを欠く機能的なヒトLAL部分である。特定の実施形態において、機能的なLAL部分は、配列番号9を含み若しくはそれから成り、又は配列番号9に示される配列に対して、少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はそれから成る。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
- 配列番号11から13及び配列番号18から20から成る群において選択される配列をコードするシグナルペプチド部分;並びに
- 配列番号14から17から成る群において選択される配列をコードするLAL部分
の組み合わせから生じるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、核酸分子は、in vivoでの機能的なキメラLALタンパク質の発現を向上させるために最適化されたヌクレオチド配列、特には配列番号21から23、好ましくは配列番号22又は配列番号23から成る群において選択されるヌクレオチド配列である。
本発明は、本発明の核酸分子を含む核酸コンストラクトであって、特には、プロモーター、例えば遍在性プロモーター、肝臓特異的プロモーター又は赤血球特異的プロモーターと操作可能に接続される前記核酸分子を含む発現カセットである、核酸コンストラクトであって、任意選択で、更にイントロン及び/又は転写後制御配列を含む、核酸コンストラクトにもまた関する。
本発明は、本明細書において記載される核酸分子又は核酸コンストラクトを含むベクターであって、好ましくはウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター又はAAVベクター、例えば一本鎖若しくは二本鎖の自己相補的なAAVベクター、好ましくはAAV由来キャプシド、例えばAAV6、AAV8、AAV9、AAV2若しくはAAV-DJ由来キャプシドを有するAAVベクターである、ベクターにもまた関する。
本発明のもう一つの態様は、本明細書において記載される核酸分子、核酸コンストラクト又はベクターを含む細胞であって、特には造血性幹細胞(HSC)である、細胞に関する。特定の実施形態において、細胞は、少なくとも一つのグロビン遺伝子座において核酸分子を含む遺伝的に改変された造血性幹細胞であり、核酸分子は、グロビン遺伝子の内在性プロモーターの制御下に位置する。
本発明は、シグナルペプチド部分及び機能的なLAL部分を含む、機能的なキメラLALタンパク質であって、シグナルペプチド部分が、配列番号3から5から成る群において選択されるアミノ酸配列を有し、又はシグナルペプチド部分が、配列番号3から5の配列と比較して、1から5個、特には1から4個、特には1から3個、特には1から2個、特には1個のアミノ酸の欠失、挿入又は置換を含むアミノ酸配列を有する機能的なシグナルペプチド部分である、機能的なキメラLALタンパク質にもまた関する。特定の実施形態において、機能的なLAL部分は、機能的なヒトLAL部分、好ましくはその天然のシグナルペプチドを欠く機能的なヒトLAL部分、より好ましくは配列番号9を含み若しくはそれから成り、又は配列番号9に示される配列に対して、少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む若しくはそれから成る、機能的なLAL部分である。
特定の実施形態において、機能的なキメラLALタンパク質は、以下:
- 配列番号3から5から成る群において選択されるシグナルペプチド部分配列;及び
- 配列番号9のLAL部分配列
の組み合わせから生じるアミノ酸配列を含む。
本発明は、薬学的に許容される担体において、本明細書において記載される核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、細胞又はキメラポリペプチドを含む、医薬組成物にもまた関する。
本発明は、医薬としての使用のための、本明細書において記載される核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、細胞又はキメラポリペプチドにもまた関する。
本発明は、LAL欠損を治療するための、例えばウォルマン病(WD)又はコレステリルエステル蓄積症(CESD)を治療するための方法における使用のための、本明細書において記載される核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、細胞又はキメラポリペプチドにもまた関する。
レンチウイルスの形質導入後6日目のK562細胞におけるLAL発現及び活性。(A)細胞内LALのウエスタンブロット(UT:処理されていない細胞)。(B)分泌されたLALの定量化。(C)上清におけるLAL活性の定量化。バーは、平均値±SDを示す。 レンチウイルスの形質導入後14日目のCD34+細胞におけるLAL発現及び活性。上清(A)及び細胞可溶化物(B)におけるLALのウエスタンブロット。(C)LAL発現及び分泌(A及びB)の定量化。未処理細胞に対する比。(D)上清におけるLAL活性の定量化。未処理細胞に対する比。バーは、平均値±SDを示す。 患者の細胞のクロス-コレクション。異なるキメラLAL酵素をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたK562細胞と共培養されたウォルマン病患者の線維芽細胞のナイルレッド染色の平均強度(MFI)。それぞれのドットは、細胞を示す(UT n=88; Sp 1 n=133; Sp 7 n=125; Sp8 n=130; 健常 n=104)。バーは、平均値±SDを示す(***、p<0.001 NS:有意でない、p>0.9999 ANOVA)。UT: 形質導入されていないK562との共培養; 健常: 健常な線維芽細胞。 コドン最適化LIPA cDNAの発現及び活性。異なる最適化LIPA cDNA配列をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたK562におけるLAL発現、分泌(A、B)及び活性(C)(11日目)。
核酸分子
本発明は、キメラLALポリペプチドをコードする核酸分子に関する。このキメラLALポリペプチドは、異種シグナルペプチド部分と融合した機能的なLAL部分を含む。本発明者は、驚くべきことに、LAL配列の、異種シグナルペプチド、例えば以下に記載されるものに対する融合は、LAL欠損細胞をクロス-コレクトするその酵素活性及びその能力を保存しながら、LALの分泌及び発現を大きく向上させることを示した。
「コレステリルエステルヒドロラーゼ」(EC 3.1.1.13)とも呼ばれる、ライソゾーム酸性リパーゼ(又は「LAL」)は、低密度リポタンパク質(LDL)粒子受容体媒介エンドサイトーシスを介してライソゾームに内部移行する、コレステリルエステル及びトリグリセリドを加水分解する、重要なライソゾームの酵素である。特には、LALは、取り込まれた低密度リポタンパク質のトリアシルグリセリル及びコレステリルエステルコア脂質の脱アシル化を触媒して、遊離の脂肪酸及びコレステロールを産生する。
LALは、10番染色体に位置する9つのコードエクソンを含む「LIPA」(NCBIアクセッション番号 U08464.1)として知られる遺伝子によりコードされる。この遺伝子における変異は、肝臓、脾臓、腸、血管壁及び他の重要な器官を含む、影響を受けた個体の主要組織における、コレステリルエステル及びトリグリセリドの大量の蓄積により特徴付けられる、LAL欠損として知られる状態をもたらす可能性がある。結果として、LAL欠損は、典型的には著しい病的状態及び死亡率と関連し、乳児期から成人期を通して個体に影響を与える可能性がある。
非常に低レベルのLAL酵素は、典型的には、時にはウォルマン病(Wolman Disease)(Wolman's disease又はWolman's syndromeとしてもまた知られる)と呼ばれる、LAL欠損の早期の発症を引き起こす。早発性のLAL欠損は、典型的には、生後1年で乳児に影響を与える。例えば、腸の細胞における脂肪物質の蓄積は、身体が栄養を吸収することを妨げる。従って、ウォルマン病は、吸収障害、成長阻害及び著しい体重減少により特徴付けられる、急速な進行性の及び典型的には致死的な状態である。これらの乳児は、典型的には、発育不全により及び肝不全による他の合併症により、生後1年の間に死亡する。
晩発性のLAL欠損は、時にはコレステリルエステル蓄積症(CESD)と呼ばれ、小児及び成人に影響を与えることができる。典型的には、CESD患者は、肝腫大(enlarged liver、hepatomegaly)、硬変、慢性肝不全、深刻な早発性アテローム性動脈硬化、動脈硬化又は血清低密度リポタンパク質(LDL)レベルの上昇を経験する。小児は、副腎に石灰沈着を有し、黄疸を発症する可能性もまたある。
ヒトLIPAのアレル変異は特徴付けられ、WD及びCESDと関連するミスセンス並びにナンセンス及び欠失変異が、同定された(例えば、Lugowskaら、Lysosomal Storage Diseases (2012) Vol. 10: 1-8を参照)。
典型的には、ヒトLALは、N末端にシグナルペプチドを含む、399アミノ酸残基の前駆タンパク質(配列番号8)として最初に合成される。シグナルペプチドは、翻訳後に切断され、ヒトLALの成熟形態をもたらす。
上記で言及したように、本発明の核酸分子は、キメラLALポリペプチドをコードし、それは、機能的なLAL部分と融合した異種シグナルペプチド部分を含む。
表現「機能的なLAL部分(functional LAL moiety)」は、野生型のLALタンパク質の、特にはヒトLAL(hLAL)の機能性を有する任意のLALポリペプチドを指す。上記で定義されるように、野生型LALの機能性は、コレステリルエステル及びトリグリセリドを加水分解すること、脂肪酸及びコレステロールを遊離することである。本発明の核酸によりコードされる機能的なLAL部分は、野生型ヒトLALポリペプチドと比較して、少なくとも50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、99 %又は少なくとも100 %の加水分解活性を有することができる。本発明の核酸によりコードされるLALタンパク質の活性は、野生型ヒトLALポリペプチドの活性の100%超、例えば110 %、120 %、130 %、140 %超、又は150 %超であることさえできる。
当業者は、本発明による核酸分子が機能的なLAL部分を発現するかどうかを容易に決定することができる。適切な方法は、当業者には明らかである。例えば、一つの適切なin vitroの方法は、核酸をベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターに挿入すること、宿主細胞をトランスフェクトする又は形質導入すること及びLAL活性を解析することを含む。LAL酵素活性は、蛍光発生基質、例えば4-メチルウンベリフェリル-オレエート又は4-メチルウンベリフェリル ホスフェートを使用することにより決定されることができる。適切な方法は、以下の実施例の部分においてより詳細に記載される。
機能的なLAL部分のコード配列は、トリの及び哺乳類の種を含む、任意のソースに由来することができる。本明細書において使用される用語「トリの(avian)」は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ及びキジを含むが、それらに制限されない。本明細書において使用される用語「哺乳類の(mammal)」は、ヒト、サル及び他の非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ等を含むが、それらに制限されない。本発明の特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、ヒト、マウス又はウズラの、特にはヒトのLALポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、「機能的なLAL部分」は、ヒトの機能的なLALポリペプチドである。
本明細書において使用される、用語「機能的なLAL部分」は、成熟及び前駆LAL、並びにLALの機能的な誘導体である、すなわち、LALの生物学的な機能を保持する(すなわち、上記で定義されるように、コレステリルエステル及びトリグリセリドから脂肪酸を切断する)、挿入、欠失及び/又は置換により改変された又は変異したLALタンパク質又はそのフラグメントを包含する。ヒトLALポリペプチドの天然の機能的なバリアントは公知である。例えば、いくつかの実施形態において、配列番号8の残基1～56は、欠失しており、及び/又は配列番号8の残基57から76(DGYILCLNRIPHGRKNHSDK、配列番号24)は、MACLEFVPFDVQMCLEFLPS(配列番号25)で置換される。特には、天然の機能的なバリアントは、配列番号26の配列であることができ、LALタンパク質のアイソフォーム2に相当する(Uniprot identifier: P38571-2)。いくつかの実施形態において、配列番号8の残基16は、ThrからProへの置換を有する(Uniprot identifier: VAR_004247)。いくつかの実施形態において、配列番号8の残基23は、GlyからArgへの置換を有する(Uniprot identifier: VAR_026523)。いくつかの実施形態において、配列番号8の残基29は、ValからLeuへの置換を有する(Uniprot identifier: VAR_026524)。いくつかの実施形態において、配列番号8の残基228は、PheからSerへの置換を有する(Uniprot identifier: VAR_049821)。
さらに、本明細書に記載される核酸分子によりコードされるキメラLALポリペプチドは、機能的な、LALの切断された形態である、LAL部分を含むことができる。
特定の実施形態において、「LALの前駆形態(precursor form of LAL)」は、その天然のシグナルペプチドを含むLALポリペプチドである。例えば、配列番号8の配列(399アミノ酸残基長)がヒトLAL(hLAL)の前駆形態である。
本発明の特定の実施形態において、本発明の核酸分子によりコードされる機能的なLAL部分は、LAL、特にはhLALの成熟形態に相当する。この実施形態によると、機能的なLAL部分は、上記で定義されるLALポリペプチドの、しかしその天然のシグナルペプチドを欠く、前駆形態に相当する。特定の実施形態において、機能的なLAL部分は、その天然のシグナルペプチドを欠く機能的なヒトLAL部分である。ヒトLALのシグナルペプチドは、配列番号8の前駆hLALのN末端における任意の最初の21から27までのアミノ酸残基である。シグナルペプチドの切断後に、hLALの成熟形態は、399アミノ酸残基長のhLALから切断されたシグナルペプチド配列の長さに依存して、372から378アミノ酸残基長であることができる。従って、シグナルペプチド無しのhLALの成熟形態は、378個のアミノ酸残基(すなわち、配列番号8のSer22からGln399まで)、377個のアミノ酸残基(すなわち、配列番号8のGly23からGln399まで)、376個のアミノ酸残基(すなわち、配列番号8のGly24からGln399まで)、375個のアミノ酸残基(すなわち、配列番号8のLys25からGln399まで)、374個のアミノ酸残基(すなわち、配列番号8のLeu26からGln399まで)、373個のアミノ酸残基(すなわち、配列番号8のThr27からGln399まで)、又は372個のアミノ酸残基(すなわち、配列番号8のAla28からGln399まで)を有するhLALを含むことができる。
特定の実施形態において、hLALのシグナルペプチドは、配列番号8の前駆hLALのN末端における最初の23個のアミノ酸残基に相当する。この実施形態によると、hLALのシグナルペプチドは、配列番号1において示される通りである。従って、特定の実施形態において、機能的なLAL部分は、配列番号1に示される、天然のシグナルペプチドを欠く機能的なヒトLAL部分である。
特定の実施形態によると、hLALの成熟形態(シグナルペプチド無し)は、配列番号9において参照される、376個のアミノ酸残基の配列に相当する。
特定の実施形態において、核酸分子は、配列番号9を含む若しくはそれから成る機能的なLAL部分をコードし、又は配列番号9に示される配列に対して、少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む若しくはそれから成る。
特定の実施形態において、機能的なLAL部分は、配列番号9、又は配列番号9に示される配列と比較して、1から50個まで、特には1から340個まで、特には1から30個まで、特には1から10個まで若しくは1から5個までのアミノ酸置換、例えば、1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸置換を含む、その機能的なバリアントを含み若しくはそれから成る。
ポリペプチドを指すときの用語「同一(identical)」及びその類語は、二つの比較されるポリペプチド配列における位置が、同じアミノ酸により占められるとき(例えば、二つのポリペプチドのそれぞれにおける位置がロイシンにより占められる場合)、ポリペプチドはその位置において同一である。二つのポリペプチドの間の同一性の割合は、二つの配列により共有されるマッチする位置の数を、位置の数で割り、×100で比較する、関数である。例えば、二つのポリペプチドにおける位置の10個の内の6個がマッチする場合、二つの配列は60%同一である。一般には、比較は、二つの配列が最大の同一性を与えるように整列される場合に行われる。当業者に公知の様々なバイオインフォマティクスのツール、例えば、BLAST又はFASTAは、核酸配列を整列するために使用されることができる。
本発明の特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列をコードする機能的なLAL部分を含み、配列をコードする機能的なLAL部分は、配列番号10において示される配列のヌクレオチド70～1197に対して、少なくとも70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99%の配列同一性を有し、それは配列番号8の野生型hLAL(hLALの天然のシグナルペプチドをコードする部分である配列番号10のヌクレオチド1～69)をコードする配列である。本発明の特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列をコードする機能的なLAL部分を含み、配列をコードする機能的なLAL部分は、配列番号14の配列に対して、少なくとも70、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。
用語「核酸配列(nucleic acid sequence)」(又は核酸分子)は、一又は二本鎖形態におけるDNA又はRNA分子、特には本発明によるキメラLALタンパク質をコードするDNAを指す。
用語「同一」及びその類語は、二つの核酸分子の間の配列同一性を指す。二つの比較される配列の両方における位置が同じ塩基により占められるとき、例えば二つのDNA分子のそれぞれにおける位置がアデニンにより占められる場合、分子はその位置において同一である。二つの配列の間の同一性の割合は、二つの配列により共有されるマッチする位置の数を、位置の数により割り、×100で比較する、関数である。例えば、二つの配列における位置の10個の内の6個がマッチする場合、二つの配列は60%同一である。一般には、比較は、二つの配列が、最大の同一性を与えるように整列されるときに行われる。当業者に公知の様々なバイオインフォマティクスのツール、例えば、BLAST又はFASTAは、核酸配列を整列するために使用されることができる。
機能的なLAL部分をコードする、本発明の核酸分子の配列は、in vivoでのLALポリペプチドの発現のために最適化されることができる。配列の最適化は、コドンの最適化、GC含量の増加、CpGアイランドの数の減少、代替的なオープンリーディングフレーム(ARF)の数の減少並びにスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位の数の減少を含む、核酸配列における多数の変化を含むことができる。遺伝コードの縮重が原因で、異なる核酸分子は同じタンパク質をコードすることができる。異なる生物の遺伝子コードは、他のものよりも、同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンの一つを使用するようにしばしば偏る。コドンの最適化を通して、所定の細胞の構成において存在するコドンの偏りを利用する変化は、ヌクレオチド配列において導入され、結果として生じるコドン最適化ヌクレオチド配列は、非コドン最適化配列と比べて相対的に高いレベルにおいて、そのような所定の細胞の構成において発現される可能性がより高い。本発明の好ましい実施形態において、機能的なLAL部分をコードするそのような最適化ヌクレオチド配列は、例えばヒト特異的なコドン使用の偏りを利用することにより、コドン最適化され、同じ機能的なLAL部分をコードする非コドン最適化ヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞においてその発現を向上させる。
特定の実施形態において、最適化LALコード配列は、配列番号10の野生型hLALコード配列のヌクレオチド70～1197と比較して、最適化されたコドンであり、並びに/又は増加したGC含量を有し、並びに/又は減少した数の代替的なオープンリーディングフレームを有し、並びに/又は減少した数のスプライスドナー及び/若しくはスプライスアクセプター部位を有する。GC含量及び/又はARFの数に加えて、配列最適化は、配列におけるCpGアイランドの数の減少並びに/又はスプライスドナー及びアクセプター部位の数の減少もまた含むことができる。もちろん、当業者に公知の通り、配列最適化は、これら全てのパラメーターの間のバランスであり、上記パラメーターの少なくとも一つが向上する一方で他のパラメーターの1つ以上が向上しない場合、最適化配列が導入遺伝子の向上、例えばin vivoでの導入遺伝子の改善された発現をもたらす限りは、配列は最適化されたと考えられることができることを意味する。
本発明の核酸分子のLAL部分は、in vivoでの導入遺伝子の発現に対して最適化された配列である、配列番号15から17のヌクレオチド配列に対して、好ましくは配列番号16又は配列番号17のヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも85パーセント、より好ましくは少なくとも90パーセント、及び更により好ましくは少なくとも92パーセントの同一性又は少なくとも94パーセントの同一性、特には少なくとも95パーセントの同一性、例えば少なくとも96、97、98、99若しくは100パーセントの同一性を有する。
本発明の核酸分子は、キメラの機能的なLALタンパク質をコードし、上記の機能的なLAL部分は、異種シグナルペプチドと融合される。「異種シグナルペプチド(heterologous signal peptide)」は、LALタンパク質以外のタンパク質のペプチドを意味する。それゆえに、核酸分子は、従って、LALポリペプチドと操作可能に接続される、LAL以外のタンパク質由来のシグナルペプチドを含む、キメラLALポリペプチドをコードする。
特定の実施形態において、コードされるキメラLALポリペプチドにおいて、LALポリペプチドの内在性の(又は天然の)シグナルペプチドは、異種シグナルペプチド、すなわち他のタンパク質のシグナルペプチドで置き換えられる。コードされるキメラポリペプチドは、従って、機能的なLALタンパク質であって、LALの天然のシグナルペプチドに相当するアミノ酸配列(例えば配列番号8のhLALのN末端における、最初の21から27のアミノ酸残基、特には最初の23のアミノ酸残基)は、異なるタンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列により置換される。上記より、野生型LALポリペプチドと比較すると、野生型LALの内在性シグナルペプチドは、異種シグナルペプチド、すなわちLALと異なるタンパク質由来のシグナルペプチドで置換される。
特定の実施形態において、LALタンパク質に融合された異種シグナルペプチドは、LALの天然のシグナルペプチドを含む、対応するLALポリペプチドと比較される場合、結果として生じるキメラLALポリペプチドの分泌を増加させる。細胞から分泌されるLALの相対的な割合は、当業者に公知の及び実施例において記載される方法により、常に決定されることができる。分泌されるタンパク質は、タンパク質それ自体を直接測定することにより(例えば、ウエスタンブロットにより)又は細胞培養培地、血清、ミルク等におけるタンパク質活性アッセイ(例えば、酵素アッセイ)により、検出されることができる。
もう一つの特定の実施形態において、LALタンパク質と融合された異種シグナルペプチドは、特にはその酵素活性又はLAL欠損細胞をクロス-コレクトするその能力を減少させることなく、その天然のシグナルペプチドを含む、対応するLALポリペプチドと比較して、結果として生じるキメラLALポリペプチドの分泌及び発現を増加させる。
本発明において実施可能なシグナルペプチドは、制限なく、イズロン酸-2-スルファターゼ由来のアミノ酸1～25(配列番号3)、キモトリプシノーゲンB2由来のアミノ酸1～18(配列番号4)及びプロテアーゼC1阻害剤由来のアミノ酸1～22(配列番号5)を含む。本発明者は、驚くべきことに、配列番号3から配列番号5のシグナルペプチドが、その天然のシグナルペプチドを含むLAL、又は他の異種シグナルペプチド、例えばhAATのシグナルペプチドを含むキメラLALタンパク質と比較されるとき、キメラLALタンパク質のより高い分泌及び発現を可能にすることを示した。前記シグナルペプチドは、その酵素活性及びLAL欠損細胞をクロス-コレクトするその能力を保存しながら、LALの分泌及び発現を向上させることが示される。従って、本発明の核酸分子は、配列番号3から5から成る群において選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチド(別の方法では、本明細書において「代替的なシグナルペプチド(alternative signal peptide)」として参照される)をコードする配列を含む。
加えて、本発明の核酸分子によりコードされるキメラLALタンパク質のシグナルペプチド部分は、結果として生じる配列が、機能的なシグナルペプチド、すなわちLALの天然のシグナルペプチドで観察される分泌よりも高いLALタンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチドに相当する限りは、配列番号3から5において示される配列と比較して、1から5個、特には1から4個、特には1から3個、より特には1から2個、特には1個のアミノ酸の欠失、挿入又は置換を含むことができる。特定の実施形態において、シグナルペプチド部分の配列は、配列番号3から5から成る群において選択される配列から成る。
当業者は、キメラLALポリペプチドが、例えば、核酸コンストラクトの操作、例えば制限部位の付加の結果として、これらの追加のアミノ酸がシグナルペプチド又はLALポリペプチドを非機能的にしない限りは、追加のアミノ酸を含むことができることを、更に理解する。追加のアミノ酸は、切断されることができ、又は保持が非機能的なポリペプチドをもたらさない限りは、成熟ポリペプチドにより保持されることができる。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号11(配列番号3のシグナルペプチドをコードする)、配列番号12(配列番号4のシグナルペプチドをコードする)又は配列番号13(配列番号5のシグナルペプチドをコードする)の核酸配列を含む。
さらに、本発明の特定の実施形態によると、代替的なシグナルペプチドに相当する核酸配列は、最適化された配列であることができる。
例えば、配列番号18から20は、配列番号5のシグナルペプチドをコードする最適化された配列に相当する。好ましくは、シグナルペプチドをコードする配列は、配列番号19又は配列番号20である。
本発明の核酸分子は、機能的なキメラLALポリペプチドをコードする、すなわち、それは、発現されるときに、野生型LALタンパク質、特にはhLALの機能性を有する、キメラLALポリペプチドをコードする。上記で定義されるように、野生型LALの機能性は、コレステリルエステル及びトリグリセリドを加水分解して、脂肪酸及びコレステロールを遊離することである。本発明の核酸によりコードされるキメラの機能的なLALポリペプチドは、野生型LALポリペプチドと比較すると、特にはヒト野生型LALと比較すると、より特には配列番号10の核酸配列によりコードされるhLAL(すなわち、配列番号8のアミノ酸配列を有するLALポリペプチド)と比較すると、少なくとも50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、99 %、又は少なくとも100 %の加水分解活性を有することができる。本発明の核酸によりコードされるキメラLALタンパク質の活性は、野生型LALポリペプチドの、特にはヒト野生型LALの、より特には配列番号10の核酸配列によりコードされるhLAL(すなわち、配列番号8のアミノ酸配列を有するLALポリペプチド)の活性の、100 %超、例えば、110 %超、120 %超、130 %超、140 %超又は更に150 %超であることさえできる。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、キメラLALタンパク質の発現を向上させるために最適化されたヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、最適化されたシグナルペプチド部分コード配列及び/又は最適化されたLAL部分コード配列を含む。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
- 配列番号11から13から成る群において選択されるシグナルペプチド部分コード配列;及び
- 配列番号14から17から成る群において選択されるLAL部分コード配列
の組み合わせから生じるヌクレオチド配列を含む又はそれから成る。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
- 配列番号13のシグナルペプチド部分コード配列;及び
- 配列番号14から17から成る群において選択されるLAL部分コード配列
の組み合わせから生じるヌクレオチド配列を含む又はそれから成る。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
- 配列番号18から20、好ましくは配列番号19又は配列番号20から成る群において選択される最適化されたシグナルペプチド部分コード配列;及び
- 配列番号14から17から成る群において選択されるLAL部分コード配列
の組み合わせから生じるヌクレオチド配列を含む又はそれから成る。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
- 配列番号11から13、好ましくは配列番号13から成る群において選択されるシグナルペプチド部分コード配列;及び
- 配列番号14のLAL部分コード配列
の組み合わせから生じるヌクレオチド配列を含む又はそれから成る。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
- 配列番号11から13、好ましくは配列番号13から成る群において選択されるシグナルペプチド部分コード配列;及び
- 配列番号15の最適化されたLAL部分コード配列
の組み合わせから生じるヌクレオチド配列を含む又はそれから成る。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
- 配列番号11から13、好ましくは配列番号13から成る群において選択されるシグナルペプチド部分コード配列;及び
- 配列番号16の最適化されたLAL部分コード配列
の組み合わせから生じるヌクレオチド配列を含む又はそれから成る。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
- 配列番号11から13、好ましくは配列番号13から成る群において選択されるシグナルペプチド部分コード配列;及び
- 配列番号17の最適化されたLAL部分コード配列
の組み合わせから生じるヌクレオチド配列を含む又はそれから成る。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
- 配列番号18から20、好ましくは配列番号19又は配列番号20から成る群において選択される最適化されたシグナルペプチド部分コード配列;及び
- 配列番号14のLAL部分コード配列
の組み合わせから生じるヌクレオチド配列を含む又はそれから成る。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
- 配列番号18から20、好ましくは配列番号19又は配列番号20から成る群において選択される最適化されたシグナルペプチド部分コード配列;及び
- 配列番号15の最適化されたLAL部分コード配列
の組み合わせから生じるヌクレオチド配列を含む又はそれから成る。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
- 配列番号18から20、好ましくは配列番号19又は配列番号20から成る群において選択されるシグナルペプチド部分コード配列;及び
- 配列番号16の最適化されたLAL部分コード配列
の組み合わせから生じるヌクレオチド配列を含む又はそれから成る。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
- 配列番号18から20、好ましくは配列番号19又は配列番号20から成る群において選択されるシグナルペプチド部分コード配列;及び
- 配列番号17の最適化されたLAL部分コード配列
の組み合わせから生じるヌクレオチド配列を含む又はそれから成る。
特定の実施形態において、核酸分子は、上記に記載される機能的なLAL部分及び少なくとも一つの上記に記載されるシグナルペプチド部分、例えば二つ、三つ、四つ又は五つの上記に記載されるシグナルペプチド部分を含む機能的なキメラLALタンパク質をコードする。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号21、配列番号22若しくは配列番号23のヌクレオチド配列、又は配列番号21、配列番号22若しくは配列番号23の配列に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは少なくとも99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む又はそれから成る。好ましくは、本発明の核酸分子は、配列番号22若しくは配列番号23のヌクレオチド配列、又は配列番号22若しくは配列番号23の配列に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは少なくとも99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む又はそれから成る。
核酸コンストラクト
本発明は、本発明の核酸分子を含む核酸コンストラクトにもまた関する。
核酸コンストラクトは、1つ以上の発現制御配列及び/又は導入遺伝子の発現を向上させる他の配列及び/又はコードされるタンパク質の分泌を高める配列及び/又はコードされるタンパク質の取り込みを高める配列と操作可能に接続された、本発明の核酸配列を含む、発現カセットに相当することができる。本明細書において使用される、用語「操作可能に接続された(operaly linked)」は、機能的な関係におけるポリヌクレオチド要素の結合を指す。核酸は、もう一つの核酸配列との機能的な関係に置かれる場合に「操作可能に接続」される。例えば、プロモーター、又はもう一つの転写制御配列は、コード配列の転写に影響を与える場合に、コード配列と操作可能に接続される。そのような発現制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー(例えばcis-制御モジュール(CRM))、イントロン、コザック配列、ポリAシグナル等は、当該技術分野において公知である。
特には、発現カセットはプロモーターを含むことができる。プロモーターは、遍在性の又は組織特異的なプロモーター、特には、LALの発現が望ましい細胞又は組織において、例えば、LAL発現がLAL欠損患者において望ましい細胞又は組織において、発現を促進することのできるプロモーターであることができる。特定の実施形態において、プロモーターは、肝臓特異的プロモーター、例えばアルファ-1 アンチトリプシンプロモーター(hAAT)、トランスサイレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン(TBG)プロモーター、LSPプロモーター(甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター配列、2コピーのアルファ1-ミクログロブリン/ビクニンエンハンサー配列、及びリーダー配列- 34.Ill(C. R.ら、(1997). Optimization of the human factor VIII complementary DNA expression plasmid for gene therapy of hemophilia A. Blood Coag. Fibrinol. 8: S23-S30.)等である。他の有用な肝臓特異的プロモーター、例えばコールド・スプリング・ハーバー研究所により編集された肝臓特異的遺伝子プロモーターデータベース(Liver Specific Gene Promoter Database)(http://rulai.cshl.edu/LSPD/)において列挙されるものは、当該技術分野において公知である。本発明の構成において好ましいプロモーターは、hAATプロモーターである。
他の組織特異的な又は非組織特異的なプロモーターは、本発明の実施において有用であることができる。例えば、発現カセットは、組織特異的プロモーターを含むことができ、それは、肝臓特異的プロモーターとは異なるプロモーターである。
もう一つの特定の実施形態において、プロモーターは、赤血球系の細胞由来のLALポリペプチドの発現のための、赤血球特異的プロモーターである。特定の実施形態において、プロモーターは、造血性幹細胞への導入遺伝子の発現に適している。「赤血球特異的プロモーター」として、以下:ヒトベータグロビンプロモーター;ヒト赤血球遺伝子クルッペル様因子1(KLF1)のプロモーター領域;スペクトリンアルファ遺伝子(SPTAl)プロモーター;GATA-1遺伝子プロモーター;BVL-1様VL30プロモーター;アンキリン-1プロモーター;ピルベートキナーゼ赤血球特異的プロモーター;又はグリコホリンA(GPA)遺伝子若しくはグリコホリンB(GPG)遺伝子のプロモーターを、制限するわけではなく引用することができる。前記赤血球プロモーターは、エンハンサー、例えば赤血球系に特異的なエンハンサーに関連することができる。赤血球系に特異的なエンハンサーは、以下:βグロビンHS2、αグロビンHS40、GATA-1、ARE及びALAS2イントロン8エンハンサーを、制限するわけではなく、含む。
もう一つの実施形態において、プロモーターは、遍在性プロモーターである。代表的な遍在性プロモーターは、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリベータアクチン(CAG)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/プロモーター(CMV)、PGKプロモーター、SV40初期プロモーター等を含む。
加えて、プロモーターは、内在性プロモーター、例えばアルブミンプロモーター又はLALプロモーターであることもまたできる。
特定の実施形態において、プロモーターは、エンハンサー配列、例えばcis-制御モジュール(CRM)又は人工エンハンサー配列に関連する。例えば、プロモーターは、エンハンサー配列、例えばヒトApoE制御領域(又はヒトアポリポタンパク質E/C-I遺伝子座、肝臓制御領域HCR-1－Genbankアクセッション番号No.U32510)に関連することができる。特定の実施形態において、エンハンサー配列、例えばApoE配列は、肝臓特異的プロモーター、例えば上記に記載されるプロモーター、及び特には、例えばhAATプロモーターに関連する。本発明の実施において有用な他のCRMは、Rinconら、Mol Ther. 2015 Jan;23(1):43-52、Chuahら、Mol Ther. 2014 Sep;22(9):1605-13又はNairら、Blood. 2014 May 15;123(20):3195-9において記載されるものを含む。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子を含む核酸コンストラクトは、プロモーターに操作可能に接続される前記核酸分子を含む発現カセットであり、前記核酸コンストラクトは、任意選択で、イントロン及び/又は転写後制御配列を更に含む。
「転写後制御配列(post-transcriptional regulatory sequence)」は、転写後経路を介して発現を制御することのできる任意の配列、例えばmRNAの安定性に作用し、輸送をする任意の配列を意味する。転写後制御配列は、例えばポリアデニル化シグナル、3’及び5’UTR配列又はmiRNA結合部位を含む。
もう一つの特定の実施形態において、核酸コンストラクトは、イントロン、特にはプロモーター及びLALコード配列の間に位置するイントロンを含む。イントロンは、mRNAの安定性及びタンパク質の産生を増加させるために導入されることができる。更なる実施形態において、核酸コンストラクトは、ヒトベータグロビンb2(又はHBB2)イントロン、凝固因子IX(FIX)イントロン、SV40イントロン又はニワトリベータグロビンイントロンを含む。もう一つの更なる実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、前記イントロンにおいて発見される代替的なオープンリーディングフレーム(ARF)の数を減少させる又は完全に取り除きさえするように設計される、改変されたイントロン(特には改変されたHBB2又はFIXイントロン)を含む。好ましくは、長さが50bpを超え、開始コドンの枠に終止コドンを有するARFは、取り除かれる。ARFは、イントロンの配列を改変することにより、取り除かれることができる。例えば、改変(modification)は、ヌクレオチド置換、挿入又は欠失の方法により、好ましくはヌクレオチド置換により、実行されることができる。実例として、対象とするイントロンの配列に存在するATG又はGTG開始コドンにおける、一又は数個のヌクレオチド、特には一個のヌクレオチドは、置換され、非開始コドンをもたらすことができる。例えば、対象とするイントロンの配列内で、ATG又はGTGは、CTGにより置換されることができ、それは開始コドンではない。
特定の実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、5'から3'の配向において、任意選択でエンハンサーにより先行されるプロモーター、LALコード配列(例えば、上記のキメラLALコード配列又はキメラ及び最適化LALコード配列)及びポリアデニル化シグナル(例えば、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、SV40ポリアデニル化シグナル、又はもう一つの天然に生じる若しくは人工的なポリアデニル化シグナル)を含む発現カセットである。特定の実施形態において、発現カセットは、上記のシグナルペプチドコード配列及びLAL部分コード配列の組み合わせから生じるコード配列を含む。
本発明の核酸コンストラクトの設計において、当業者は、前記コンストラクトを細胞又は器官へ送達するために使用される、ベクターのサイズの制限を配慮することに留意する。特には、当業者は、AAVベクターの主な制限が、AAV血清型により異なることのできるそのカーゴ容量であるが、それが、親のウイルスゲノムのサイズ付近に制限されると考えられることを知っている。例えば、5kbは、AAV8キャプシドに収納されると通常考えられる最大サイズである(Wu Z.ら、Mol Ther.、2010、18(1): 80-86; Lai Y.ら、Mol Ther.、2010、18(1): 75-79; Wang Y.ら、Hum Gene Ther Methods、2012、23(4): 225-33)。従って、当業者は、本発明を実施する場合、AAV5'-及び3'-ITRをコードする配列を含む、結果として生じる核酸配列が、好ましくは実施されるAAVベクターのカーゴ容量の110%を超えないように、特には、好ましくは5.5kbを超えないように、本発明の核酸コンストラクトの要素を選択するように留意する。
ベクター
本発明は、本明細書において公開される核酸分子又はコンストラクトを含むベクターにもまた関する。
特には、本発明のベクターは、タンパク質発現に、好ましくは遺伝子療法における使用に適切なベクターである。一つの実施形態において、ベクターは、プラスミドベクターである。もう一つの実施形態において、ベクターは、本発明の核酸分子を含むナノ粒子、特には本発明のキメラLALポリペプチドをコードするメッセンジャーRNAである。もう一つの実施形態において、ベクターは、標的細胞のゲノムにおける本発明の核酸分子又はコンストラクトの統合をすることのできる、トランスポゾンに基づくシステム、例えばhyperactive Sleeping Beauty(SB100X)トランスポゾンシステム(Matesら、2009)である。
もう一つの実施形態において、ベクターは、任意の対象とする細胞を標的とする、遺伝子療法に適切なウイルスベクターである。例えば、ベクターは、全ての細胞系列を標的とすることができ(遍在性ベクター)、又は肝臓組織、マイクログリア若しくは造血性幹細胞、例えば赤血球系の細胞(例えば赤血球)を標的とすることができる。この場合において、本発明の核酸コンストラクトは、当該技術分野で非常に公知である、効率的なウイルスベクターを産生するために適切な配列もまた含む。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、組み込みウイルス(integrating virus)に由来する。特には、ウイルスベクターは、レトロウイルス又はレンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)に由来するレンチウイルスベクターに由来することができる。更なる特定の実施形態において、ウイルスベクターは、AAVベクター、例えば肝臓組織又は細胞に形質導入するために適切なAAVベクター、より特にはAAV-1、-2及びAAV-2バリアント(例えばLingら、2016 Jul 18、Hum Gene Ther Methods. [Epub ahead of print]において公開される、Y44+500+730F+T491V変異を有する操作されたキャプシドを含む、四重変異キャプシド最適化AAV2)、-3及びAAV-3バリアント(例えば、Vercauterenら、2016、Mol. Ther. Vol. 24(6)、p. 1042において公開される、S663V+T492Vの二つのアミノ酸変異を有する操作されたAAV3キャプシドを含む、AAV3-STバリアント)、-3B及びAAV-3Bバリアント、-4、-5、-6及びAAV-6バリアント(例えばRosarioら、2016、Mol Ther Methods Clin Dev. 3、p.16026において公開される、三重変異AAV6キャプシドY731F/Y705F/T492V形態を含む、AAV6バリアント)、-7、-8、-9、-10、例えば-cy10及び-rh10、-rh74、-dj、Anc80、LK03、AAV2i8、ブタAAV血清型、例えばAAVpo4及びAAVpo6等、ベクター又はレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター及びアルファレトロウイルスである。当該技術分野において公知であるように、使用のためであると考えられる特定のウイルスベクターに依存して、追加の適切な配列が、機能的なウイルスベクターを得るために、本発明の核酸コンストラクトに導入される。適切な配列は、AAVベクターのためのAAV ITR、又はレンチウイルスベクターのためのLTRを含む。従って、本発明は、それぞれの側にITR又はLTRが配置される、上記の発現カセットにもまた関する。
ウイルスベクターの利点は、本開示の以下の部分において議論される。ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、又は非病原性パルボウイルス、より好ましくはAAVベクターは、本発明の核酸分子又はコンストラクトを送達するために好ましい。ヒトパルボウイルスアデノ関連ウイルス(AAV)は、感染細胞のゲノムに組み込まれて潜在性の感染を確立することのできる、複製を天然に欠失しているディペンドウイルスである。最後の特性は、哺乳類のウイルスの間で特有であるように思われる。なぜならば、組み込み(integration)は、染色体19(19q13.3-qter)に位置する、AAVS1と呼ばれる、ヒトゲノムにおける特定の部位において生じるためである。従って、AAVベクターは、ヒト遺伝子療法のための潜在的なベクターとして、多くの関心を生じた。ウイルスの好ましい特性の中には、任意のヒトの疾患との関連がないこと、分裂及び非分裂細胞の両方に感染するその能力、並びに、感染することのできる異なる組織に由来する広い範囲の細胞系列がある。
ヒト又は非ヒト霊長類(NHP)から単離され、よく特徴づけられる、AAVの血清型の中で、ヒト血清型2は、遺伝子トランスファーベクターとして開発された最初のAAVである。他の現在使用されるAAV血清型は、AAV-1、AAV-2バリアント(例えばLingら、2016 Jul 18、Hum Gene Ther Methods. [Epub ahead of print]において公開される、Y44+500+730F+T491V変異を有する操作されたキャプシドを含む、四重変異キャプシド最適化AAV-2)、-3及びAAV-3バリアント(例えばVercauterenら、2016、Mol. Ther. Vol. 24(6)、p. 1042において公開される、S663V+T492Vの二つのアミノ酸変異を有する操作されたAAV3キャプシドを含む、AAV3-STバリアント)、-3B及びAAV-3Bバリアント、-4、-5、-6及びAAV-6バリアント(例えばRosarioら、2016、Mol Ther Methods Clin Dev. 3、p.16026において公開される、三重変異AAV6キャプシドY731F/Y705F/T492V形態を含むAAV6バリアント)、-7、-8、-9、-10、例えばcy10及び-rh10、-rh74、-dj、Anc80、LK03、AAV2i8、ブタAAV血清型、例えばAAVpo4及びAAVpo6、並びにAAV血清型のチロシン、リジン及びセリンキャプシド変異体等を含む。加えて、他の非天然の操作されたバリアント及びキメラAAVもまた有用であることができる。AAVウイルスは、従来の分子生物学の技術を使用して操作されることができ、核酸配列の細胞特異的な送達のために、免疫原性を最小化するために、安定性及び粒子の寿命を調整するために、効率的な分解のために、核への正確な送達のために、これらの粒子を最適化することを可能にする。ベクターへのアセンブリーのための望ましいAAVフラグメントは、vp1、vp2、vp3及び超可変領域を含む、capタンパク質、rep 78、rep 68、rep 52及びrep 40を含む、repタンパク質、並びにこれらのタンパク質をコードする配列を含む。これらのフラグメントは、多様なベクターシステム及び宿主細胞において容易に利用されることができる。Repタンパク質を欠いているAAVに基づくリコンビナントベクターは、宿主ゲノムに低い有効性で組み込まれ、標的細胞において何年もの間持続することのできる安定な環状のエピソームとして主に存在する。
AAVの天然の血清型を使用する代わりに、制限するわけではなく、非天然に生じるキャプシドタンパク質を有するAAVを含む、人工的なAAV血清型は、本発明の文脈において使用されることができる。そのような人工的なキャプシドは、異なって選択されたAAV血清型、同じAAV血清型の非近接部分、非AAVウイルス源由来のもの又は非ウイルス源由来のものから得ることができる異種配列と組み合わせて、選択されるAAV配列(例えば、vp1キャプシドタンパク質のフラグメント)を使用して、任意の適切な技術により、産生されることができる。人工的なAAV血清型は、以下に制限するわけではなく、キメラAAVキャプシド、リコンビナントAAVキャプシド又は「ヒト化(humanized)」AAVキャプシドであることができる。
従って、本発明は、本発明の核酸分子又はコンストラクトを含むAAVベクターに関する。本発明の文脈において、AAVベクターは、対象とする標的細胞、特には肝細胞又は赤血球系の細胞に形質導入することができる、AAVキャプシドを含む。特定の実施形態によると、AAVベクターは、AAV-1、-2、AAV-2バリアント(例えばLingら、2016 Jul 18、Hum Gene Ther Methods. [Epub ahead of print]において公開される、Y44+500+730F+T491V変異を有する操作されたキャプシドを含む、四重変異キャプシド最適化AAV-2)、-3及びAAV-3バリアント(例えばVercauterenら、2016、Mol. Ther. Vol. 24(6)、p. 1042において公開される、S663V+T492Vの二つのアミノ酸変異を有する操作されたAAV3キャプシドを含む、AAV3-STバリアント)、-3B及びAAV-3Bバリアント、-4、-5、-6及びAAV-6バリアント(例えばRosarioら、2016、Mol Ther Methods Clin Dev. 3、p.16026において公開される、三重変異AAV6キャプシドY731F/Y705F/T492V形態を含むAAV6バリアント)、-7、-8、-9、-10、例えばcy10及び-rh10、-rh74、-dj、Anc80、LK03、AAV2i8、ブタAAV、例えばAAVpo4及びAAVpo6、並びにAAV血清型のチロシン、リジン及びセリンキャプシド変異体等、血清型のベクターである。特定の実施形態において、AAVベクターは、AAV8、AAV9、AAVrh74又はAAV2i8血清型(すなわち、AAVベクターは、AAV8、AAV9、AAVrh74又はAAV2i8血清型のキャプシドを有する)のベクターである。更なる特定の実施形態において、AAVベクターは、シュードタイプ化ベクターであり、すなわち、そのゲノム及びキャプシドは、異なる血清型のAAVに由来する。例えば、シュードタイプ化ベクターは、そのゲノムが上述のAAV血清型の一つに由来し、そのキャプシドがもう一つの血清型に由来するベクターであることができる。例えば、シュードタイプ化ベクターのゲノムは、AAV8、AAV9、AAVrh74又はAAV2i8血清型に由来するキャプシドを有することができ、そのゲノムは異なる血清型に由来することができる。
もう一つの特定の実施形態において、ベクターは、肝臓細胞への導入遺伝子の送達における使用のためのものであり、AAVベクターは、とりわけ、AAV5、AAV6、AAV-DJ、AAV8、AAV9、AAV-LK03、AAV-Anc80及びAAV3Bから成る群において選択されることができる。
もう一つの実施形態において、キャプシドは、改変されたキャプシドである。本発明の文脈において、「改変されたキャプシド(modified capsid)」は、キメラキャプシド、又は一以上の野生型AAV VPキャプシドタンパク質に由来する、一以上のバリアントVPキャプシドタンパク質を含む、キャプシドであることができる。特定の実施形態において、AAVベクターは、キメラベクターであり、すなわち、そのキャプシドは、少なくとも二つの異なるAAV血清型に由来するVPキャプシドタンパク質を含み、又は少なくとも二つのAAV血清型に由来するVPタンパク質領域又はドメインと組み合わせる少なくとも一つのキメラVPタンパク質を含む。肝臓細胞を形質導入するために有用なそのようなキメラAAVベクターの例は、Shenら、Molecular Therapy、2007及びTenneyら、Virology、2014において記載される。例えば、キメラAAVベクターは、AAV8キャプシド配列と、AAV8血清型とは異なるAAV血清型の配列、例えば、特に上述される任意の配列との組み合わせに由来することができる。もう一つの実施形態において、AAVベクターのキャプシドは、高い肝臓指向性を示す、一以上のバリアントVPキャプシドタンパク質、例えば、国際公開第2015/013313号において記載されるもの、特にはRHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4及びRHM15-6キャプシドバリアントを含む。
もう一つの実施形態において、改変されたキャプシドは、エラープローンPCR及び/又はペプチド挿入(例えば、Bartelら、2011において記載される)により挿入されるキャプシド改変にもまた由来することができる。加えて、キャプシドバリアントは、単一のアミノ酸の変異、例えばチロシン変異を含むことができる(例えば、Zhongら、2008において記載される)。
加えて、AAVベクターのゲノムは、一本鎖又は自己相補的な二本鎖ゲノムのいずれかであることができる(McCartyら、Gene Therapy、2003)。自己相補的な二本鎖AAVベクターは、AAV末端リピートの一つから末端分解部位(terminal resolution site)(trs)を削除することにより産生される。複製ゲノムが野生型AAVゲノムの半分の長さである、これらの改変されたベクターは、DNAダイマーを収納する傾向を有する。好ましい実施形態において、本発明の実施において実行されるAAVベクターは、一本鎖ゲノムを有し、更に好ましくはAAV2、AAV6、AAV-DJ、AAV8又はAAV9キャプシドを含む。好ましくは、AAVベクターは、AAV6キャプシド又はAAV6に由来するキャプシドを含む。
特定の実施形態において、本発明は、一本鎖又は二本鎖の自己相補的なゲノム(例えば、一本鎖ゲノム)において、本発明の核酸分子を含む、AAVベクター又はレンチウイルスベクターに関する。更に特定の実施形態において、前記核酸分子は、プロモーター、特には、上述の遍在性で肝臓特異的な又は赤血球特異的プロモーターに操作可能に接続される。更なる特定の実施形態において、本発明のウイルスベクターのゲノムに含まれる核酸コンストラクトは、上記のイントロン、例えばプロモーター及びLALコード配列をコードする核酸配列の間に位置するイントロンを更に含む。
in vivoで投与される発現ベクターの使用に対する代替物として、細胞は、本発明の核酸分子により、ex vivo又はin vitroで感染することができる。これらの細胞は、その後、それを必要とする個体に投与され、遺伝子送達システムの役割を果たす(例えば国際公開第19/138082号を参照)。例えば、活性内在性プロモーターの制御下にある導入遺伝子標的組み込みによる、本明細書において記載されるex vivo又はin vitro産生造血性幹細胞の使用は、セミランダム組み込みベクターの使用に関連する挿入変異誘発性及び癌遺伝子トランス活性化のリスク並びに遺伝子トランス活性化のリスクを有利に最小化する。なぜならば、外因性プロモーター/エンハンサーの要素は、導入遺伝子の発現に必要とされず、ゲノムに挿入されないからである。この方法は、それを必要とする個体に対して非常に有利である。なぜならば、本明細書において考慮される疾患のための現在の治療のほとんどは、治療的なタンパク質の頻繁な注射にあり、それは、負担が多く、高価であり、長期間治療的ではなく、高い割合の治療される患者において抗タンパク質中和抗体の発達をもたらすからである。
特定の実施形態において、ベクターは、細胞、特には赤血球系の細胞、例えば造血性幹細胞のゲノムに、本発明の核酸分子を組み込むのに適切なベクターである。本明細書において使用される、ベクターは、核酸ベクター(例えば、プラスミド又はリコンビナントウイルスゲノム)又はウイルスベクター(例えば、リコンビナントゲノムを含む、rAAV粒子)を指すことができる。
赤血球系の細胞、例えば造血性幹細胞のゲノムに本発明の核酸分子を組み込むために適切なベクターは、レトロウイルスベクター及びAAVベクターを含む。特には、レンチウイルスベクターは、複製欠損であり、例えば、ウイルスの複製に必要とされる一又は数個の遺伝子を含まない。使用されることのできる、代表的なAAVベクターは、AAV2ベクター、改変されたAAV2ベクター、AAV3ベクター、改変されたAAV3ベクター、AAV6ベクター、改変されたAAV6ベクター、AAV8ベクター及びAAV9ベクターを含む。特定の実施形態において、本発明の核酸分子のCRISPR/Cas9媒介性の組み込みは、レンチウイルスベクター又はAAVベクターを使用して実行されることができる。
補助的なベクターは、部位特異的な遺伝子操作システムを、細胞へと提供するために使用されることができ、本発明の核酸分子の細胞ゲノムへの組み込みを可能とする。
キメラLALタンパク質
もう一つの態様において、本発明は、本発明の核酸分子によりコードされるキメラLALポリペプチドを提供する。
本発明のキメラLALポリペプチドは、機能的なキメラLALタンパク質であり、すなわち、それは、野生型LALタンパク質、特にはヒトLAL(hLAL)の機能性を有する。上記で定義される、野生型LALの機能性は、コレステリルエステル及びトリグリセリドを加水分解すること、脂肪酸及びコレステロールを遊離することである。本発明のキメラLALタンパク質は、野生型ヒトLALポリペプチドと比較して、少なくとも50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、99 %又は少なくとも100 %の加水分解活性を有することができる。本発明のキメラLALタンパク質の活性は、野生型ヒトLALポリペプチドの活性の、100 %超、例えば110 %、120 %、130 %、140 %超、又は150 %超であることさえできる。
上記の、本発明のキメラLALポリペプチドは、異種シグナルペプチド部分及び機能的なLAL部分を含む。
「機能的なLAL部分(functional LAL moiety)」は、野生型LALタンパク質、特にはヒトLAL(hLAL)の機能性を有する任意のLALポリペプチドを指す。特定の実施形態によると、「機能的なLAL部分」は、ヒトの機能的なLALポリペプチドである。上記で定義される、用語「機能的なLAL部分」は、成熟した及び前駆体のLAL、並びに挿入、欠失及び/又は置換により改変された若しくは変異したLALタンパク質、又はLALの機能的な誘導体である、すなわちLALの生物学的機能を保持するそのフラグメントを包含する。さらに、キメラLALポリペプチドは、LALの機能的な、切断形態であるLAL部分を含むことができる。
機能的なLAL部分は、「LALの前駆形態(precursor form of LAL)」、すなわちその天然のシグナルペプチドを含むLALポリペプチドであることができる。例えば、機能的なLAL部分は、ヒトLAL(hLAL)の前駆形態である、配列番号8の配列(399アミノ酸残基長)を有することができる。特定の実施形態において、機能的なLAL部分は、配列番号8の配列を含み若しくはから成り、又は配列番号8に示される配列に対して、少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含み若しくはから成る。
好ましい実施形態において、機能的なLAL部分は、LAL、特にはhLALの成熟形態であり、すなわち、上記で定義されるLALポリペプチドの前駆形態に相当するが、その天然のシグナルペプチドは欠く。特定の実施形態において、機能的なLAL部分は、その天然のシグナルペプチドを欠く、機能的なヒトLAL部分である。ヒトLALのシグナルペプチドは、配列番号8の前駆体hLALのN末端における、任意の最初の21から27アミノ酸残基である。シグナルペプチドの切断の後、hLALの成熟形態は、399アミノ酸残基長のhLALから切断されるシグナルペプチド配列の長さに依存して、372から378アミノ酸残基長であることができる。従って、シグナルペプチド無しのhLALの成熟形態は、378アミノ酸残基(すなわち、配列番号8のSer22からGln399)、377アミノ酸残基(すなわち、配列番号8のGly23からGln399)、376アミノ酸残基(すなわち、配列番号8のGly24からGln399)、375アミノ酸残基(すなわち、配列番号8のLys25からGln399)、374アミノ酸残基(すなわち、配列番号8のLeu26からGln399)、373アミノ酸残基(すなわち、配列番号8のThr27からGln399)、又は372アミノ酸残基(すなわち、配列番号8のAla28からGln399)を有するhLALを含むことができる。
特定の実施形態において、hLALのシグナルペプチドは、配列番号8の前駆体hLALのN末端における最初の23アミノ酸残基に相当する。この実施形態によると、hLALのシグナルペプチドは、配列番号1に示される通りである。従って、特定の実施形態において、機能的なLAL部分は、配列番号1に示される天然のシグナルペプチドを欠く、機能的なヒトLAL部分である。
特定の実施形態によると、hLALの成熟形態(シグナルペプチド無し)は、配列番号9において参照される376アミノ酸残基の配列に相当する。
特定の実施形態において、機能的なLAL部分は、配列番号9を含み若しくはから成り、又は配列番号9において示される配列に対して、少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む若しくはから成る。
特定の実施形態において、機能的なLAL部分は、配列番号9、又は配列番号9に示される配列と比較して、1から50個まで、特には1から40個まで、特には1から30個まで、特には1から20個まで、特には1から10個まで若しくは1から5個までのアミノ酸置換、例えば1、2、3、4若しくは5個のアミノ酸置換を含む、その機能的なバリアントを含む又はから成る。
上記で定義される、「異種シグナルペプチド(heterologous signal peptide)」は、LALタンパク質とは異なるタンパク質のペプチドである。従って、本発明のキメラLALポリペプチドは、LALポリペプチドに操作可能に接続される、LAL以外のタンパク質由来のシグナルペプチドを含む。
特定の実施形態において、LALポリペプチドの内在性(又は天然の)シグナルペプチドは、異種シグナルペプチド、すなわちもう一つのタンパク質のシグナルペプチドで置換される。キメラポリペプチドは、従って、LALの天然シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列(例えば配列番号8のhLALのN末端における、最初の21から27アミノ酸残基、特には最初の23アミノ酸残基)が、異なるタンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列により置換される、機能的なLALタンパク質である。上述より、野生型LALポリペプチドと比較して、野生型LALの内在性シグナルペプチドは、異種シグナルペプチド、すなわちLALとは異なるタンパク質に由来するシグナルペプチドで置換される。
特定の実施形態において、LAL部分と融合した異種シグナルペプチドは、特にはその酵素活性、又はLAL欠損細胞をクロス-コレクトするその能力を減少させることなく、その天然のシグナルペプチドを含む、対応するLALポリペプチドと比較して、結果として生じるキメラLALポリペプチドの分泌及び発現を増加させる。
本発明において実施可能なシグナルペプチドは、イズロン酸-2-スルファターゼ由来のアミノ酸1～25(配列番号3)、キモトリプシノゲンB2由来のアミノ酸1～18(配列番号4)及びプロテアーゼC1阻害剤由来のアミノ酸1～22(配列番号5)を含む。本発明者は、驚くべきことに、配列番号3から5のシグナルペプチドが、天然のシグナルペプチドを含むLAL、又は異種シグナルペプチド、例えばhAATのシグナルペプチドを含むキメラLALタンパク質と比較される場合に、キメラLALタンパク質のより高い分泌及び発現を可能にすることを示した。前記シグナルペプチドは、LALの分泌及び発現を向上させながら、その酵素活性及びLAL欠損細胞をクロス-コレクトするその能力を保存することが示される。従って、本発明のキメラLALタンパク質は、配列番号3から5(そうでない場合は、本明細書において「代替的なシグナルペプチド(alternative signal peptide)」として参照される)から成る群において選択されるアミノ酸を有するシグナルペプチドをコードする配列を含む。
加えて、本発明のキメラLALタンパク質のシグナルペプチド部分は、結果として生じる配列が機能的なシグナルペプチド、すなわちLALタンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチドに相当する限りは、配列番号3から5において示される配列と比較して、1から5個まで、特には1から4個、特には1から3個、より特には1から2個、特には1個のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換を含むことができる。特定の実施形態において、シグナルペプチド部分の配列は、配列番号3から5から成る群において選択される配列から成る。
当業者は、更に、キメラLALポリペプチドが、追加のアミノ酸がシグナルペプチド又はLALポリペプチドを非機能的にしない限りは、例えば核酸コンストラクトの操作、例えば制限部位の追加の結果として、追加のアミノ酸を含むことができることを、更に理解する。追加のアミノ酸は、切断されることができ、又は保持が非機能的なポリペプチドをもたらさない限りは、成熟ポリペプチドにより保持されることができる。
特定の実施形態において、本発明の機能的なキメラLALタンパク質は、以下:
- 配列番号3から5、好ましくは配列番号5から成る群において選択されるシグナルペプチド部分配列;及び
- 配列番号9において示される配列に対して、少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列から成る機能的なLAL部分配列
の組み合わせから生じるアミノ酸配列を含む又はから成る。
特定の実施形態において、本発明の機能的なキメラLALタンパク質は、以下:
- 配列番号3から5、好ましくは配列番号5から成る群において選択されるシグナルペプチド部分配列;及び
- 配列番号9において示される配列から成る機能的なLAL部分配列
の組み合わせから生じるアミノ酸配列を含む又はから成る。
特定の実施形態において、機能的なキメラLALタンパク質は、上記の機能的なLAL部分及び少なくとも一つの上記のシグナルペプチド部分、例えば二つ、三つ、四つ又は五つの上記のシグナルペプチド部分を含む。
特定の実施形態において、本発明の機能的なキメラLALタンパク質は、配列番号30から32、好ましくは配列番号32、又は配列番号30から32、好ましくは配列番号32に示される配列と比較して、1から40個まで、特には1から20個まで、特には1から10個まで又は1から5個までのアミノ酸置換、例えば1、2、3、4又は5個のアミノ酸置換を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含む又はから成る。
特定の実施形態において、本発明の機能的なキメラLALタンパク質は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンから成る部分を含まない。
細胞
本発明は、ex vivo遺伝子療法の場合と同様に、本発明の核酸分子又はコンストラクトにより形質転換される細胞にもまた関する。従って、本発明は、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト又はベクターを含む、単離された細胞、例えば肝臓細胞に関する。本発明の細胞は、任意の適切な投与経路により、例えば前記対象の血流における注射を介して、それを必要とする対象、例えばLAL欠損患者へと送達されることができる。
特定の実施形態において、本発明は、治療される対象の細胞、例えば造血性幹細胞又は肝臓細胞へと本発明の核酸を導入する工程、及び核酸分子が導入された、前記の形質転換された細胞を、対象に投与する工程を含む。有利には、この実施形態は、前記細胞からLALを分泌するために有用である。特定の実施形態において、細胞は、治療される患者由来の細胞である。
好ましい実施形態において、細胞は、造血性幹細胞である。造血性幹細胞(HSC)は、自己複製することのできる多能性幹細胞であり、許容的な状態の下で、造血システムの全ての細胞型を生じさせる、それらの能力により特徴づけられる。造血性幹細胞は、全能性細胞ではなく、すなわち、それらは完全な生命体に発展することはできない。有利には、赤血球細胞は、もっとも豊富な造血の産物であり(一日当たり約2×10個の新しい赤血球)、適切な量の治療的なタンパク質を分泌することができる。
特定の実施形態において、本発明は、赤血球系に分化する場合、本発明の核酸分子によりコードされるLALキメラ治療的タンパク質を産生することのできる、遺伝的に改変された造血性幹細胞に関する。従って、本発明のもう一つの対象は、ゲノム内に、本発明の核酸分子を含む、遺伝的に改変された造血性幹細胞に関する。
特定の実施形態において、遺伝的に改変された造血性幹細胞は、そのゲノム内に含まれる少なくとも一つのグロビン遺伝子の側に位置する遺伝子間領域において、前記グロビン遺伝子の内在性プロモーターの制御下に位置する、本発明の核酸分子を含む。
遺伝的に改変されたHSC及び前記細胞を産生するための方法は、特許出願である国際公開第19/138082号において記載されることができる。
特定の実施形態において、本発明によるHSCは、胚性幹細胞、特にはヒト胚性幹細胞に由来し、従って、胚性造血性幹細胞である。胚性幹細胞(ESC)は、胚の未分化の内部集団細胞に由来し、自己複製することができる、幹細胞である。許容的な状態の下で、これらの多能性幹細胞は、成体における220個超の細胞型の任意の一つに分化することができる。胚性幹細胞は、例えばYoung Chungら(Cell Stem Cell 2、2008 February 7;2(2): 113-7)において示される方法により、得ることができる。
もう一つの実施形態において、本発明による造血性幹細胞は、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell)、より特にはヒトの誘導された多能性幹細胞(human induced pluripotent stem cell)(hiPSC)である。従って、特定の実施形態によると、本明細書において記載される造血性幹細胞は、造血性人工多能性幹細胞である。
特定の実施形態において、造血性幹細胞及び/又は血液細胞の初期集団は、自己のものであることができる。「自己(autologous)」は、同一の患者又は個体に由来すること又は起源を有することを指す。「自己移植(autologous transplant)」は、対象自身の細胞又は器官の回収及び再注入又は移植を指す。自己の細胞の排他的な又は追加の使用は、宿主へと戻る、細胞の投与の数多くの有害作用、特には移植片対宿主反応を除外する又は減少させることができる。この場合において、造血性幹細胞は、前記個体から回収され、ex vivo又はin vitroで遺伝的に改変されて本発明の核酸分子を組み込み、同一の個体に投与される。
特定の実施形態において、造血性幹細胞及び/又は血液細胞の初期集団は、同種のドナー又は多数の同種のドナーに由来することができる。ドナーは、互いに関連しており、又は関連しておらず、及び、移植のセッティングにおいて、レシピエント(又は個体)に関連しており、又は関連していないことができる。
改変される幹細胞は、従って、療法を必要とする個体に対して外因性であることができる。外因性の起源の改変された幹細胞の投与の状況において、前記幹細胞は、同系の、同種の、異種の細胞又はその混合物であることができる。
もう一つの実施形態において、本明細書において記載される幹細胞は、哺乳類の細胞、特にはヒトの細胞である。
本発明のもう一つの対象は、本明細書において記載される遺伝的に改変された造血性幹細胞に起源を有する血液細胞に関する。従って、特定の実施形態において、前記血液細胞は、巨核球、血小板、赤血球、マスト細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、単核球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、小リンパ球、Tリンパ球、Bリンパ球、形質細胞、及び全てのそれらの前駆体から成る群から選択される。
in vitro、ex vivo又はin vivoで細胞へとタンパク質及び核酸分子を導入する方法は、当該技術分野において非常に公知である。細胞において核酸又はタンパク質を導入するための伝統的な方法は、ベクター、例えばレンチウイルスベクター若しくはAAVベクター、又はタンパク質の微量注入、エレクトロポレーション及びソノポレーション(sonoporation)を含む。物理的な、力学的な及び生化学的なアプローチに基づく他の技術、例えばマグネトフェクション、オプトインジェクション、オプトポレーション、光学的なトランスフェクション及びレーザーフェクションが言及されることもまたできる(Stewart MPら、Nature、2016を参照)。
加えて、ゲノム編集技術、例えばジンク・フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、TALEN及びCRISPRもまた、本発明の核酸分子を細胞ゲノムへと組み込むために使用されることができる。
例えば、ガイドペプチド含有エンドヌクレアーゼ、例えば転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)又はジンク・フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、細胞内に導入されることができる。TALEN技術は、特異的なDNA結合ドメインと融合された非特異的なDNA切断ドメイン(ヌクレアーゼ)を含む。特異的なDNA結合ドメインは、ザントモナス(Xanthomonas)細菌により分泌され、宿主プラント(plant)細胞における遺伝子の転写を変化させるタンパク質である、転写アクチベーター様エフェクター(TALE)に由来する高度に保存されたリピートで構成される。ジンク・フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)技術は、ジンク・フィンガーDNA結合ドメインのDNA切断ドメイン(ヌクレアーゼ)への融合により産生される人工的な制限酵素の使用にある。ジンク・フィンガードメインは、望ましいDNA配列を特異的に標的とし、それは関連するヌクレアーゼが複雑なゲノム内の特有の配列を標的とすることを可能にする。
好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、以下:
- 選択された標的部位へと結合する、少なくとも一つの一本鎖ガイドRNA、及び
- タンパク質(Cas)に関連するClustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)、特にはタンパク質9(Cas9)に関連するCRISPR
と組み合わせて、細胞へ導入される。
メカニズム的には、CRISPR/Cas9システムは、二つの要素、一本鎖ガイドRNA(sgRNA)及びCas9エンドヌクレアーゼを含む。sgRNAは、配列特異的な様式において標的DNA部位を相補するために設計された特有の20塩基対(bp)の配列をしばしば含み、これは、その後に、使用されるCas9タンパク質との適合性に不可欠である、上流の短いDNA配列が続かなければならず、それは、「NGG」又は「NAG」の「プロトスペーサー隣接モチーフ(protospacer adjacent motif)」(PAM)と呼ばれる。50,51 sgRNAは、ワトソン-クリック塩基対合により標的配列に結合し、Cas9は、DNAを正確に切断し、DNA-DSB修復機構開始ゲノム修復の前に二本鎖切断を生成する。
医薬組成物
本発明は、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド又は細胞を含む医薬組成物もまた提供する。
そのような組成物は、治療的な有効量の治療薬(本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド又は細胞)及び薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態において、用語「薬学的に許容される(pharmaceutically acceptable)」は、連邦若しくは州政府の規制機関により承認された、又は動物、及びヒトにおける使用のために、U.S.若しくはヨーロッパの薬局方又は他の一般的に認識される薬局方においてリスト化されたことを意味する。用語「担体(carrier)」は、治療薬と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。そのような医薬担体は、無菌の液体、例えば水、及び石油、動物、野菜又は合成起源のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油等を含む、油であることができる。水は、医薬組成物が静脈内に投与される場合に、好ましい担体である。生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた、特には注射可能な溶液のために、液体の担体として使用されることができる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ナトリウムステアレート、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含む。
組成物は、望ましい場合、少量の湿潤若しくは乳化剤、又はpH緩衝剤もまた含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁物、乳濁物、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放製剤等の形態をとることができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、マグネシウムステアレート、サッカリンナトリウム、セルロース、マグネシウムカーボネート等を含むことができる。適切な医薬担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」において記載される。そのような組成物は、対象に対する適切な投与のための形態を提供するために、治療的に有効な量の治療薬を、好ましくは精製された形態において、適切な量の担体と共に含む。特定の実施形態において、本発明の核酸、ベクター又は細胞は、ホスフェート緩衝生理食塩水を含む組成物において処方され、0.25％のヒト血清アルブミンを補充される。もう一つの特定の実施形態において、本発明の核酸、ベクター又は細胞は、乳酸リンゲル及び非イオン性界面活性剤、例えば、最終濃度が組成物全体の0.01～0.0001重量%、例えば0.001重量%の濃度のプルロニックF68を含む組成物において処方される。製剤は、血清アルブミン、特にはヒト血清アルブミン、例えば0.25%のヒト血清アルブミンを更に含むことができる。貯蔵又は投与のいずれかのための他の適切な製剤は、当該技術分野において、特には国際公開第2005/118792号、又はAllayら、2011から公知である。
好ましい実施形態において、組成物は、ヒトに対する静脈内投与のために適応される医薬組成物として、日常的な手順に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液における溶液である。必要である場合には、組成物は、可溶化剤及び注射の部位における痛みを軽減するための局所麻酔剤、例えばリグノカインもまた含むことができる。
実施形態において、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド又は細胞は、ベシクル、特にはリポソームで送達されることができる。更にもう一つの実施形態において、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド又は細胞は、制御された放出システムにおいて送達されることができる。
本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド又は細胞の投与方法は、皮内の、筋肉内の、腹腔内の、静脈内の、皮下の、鼻腔内の、硬膜外の及び経口の経路を含むが、これらに制限されない。特定の実施形態において、投与は、静脈内の又は筋肉内の経路を介する。本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド又は細胞は、ベクトル化されていようとされていまいと、任意の都合の良い経路により、例えば注入又は急速投与により、上皮の又は皮膚粘膜の裏層(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管の粘膜等)を通る吸収により投与されることができ、他の生物学的に活性な剤と共に投与されることができる。投与は、全身的又は局所的であることができる。
特定の実施形態において、本発明の医薬組成物を、治療を必要とする部分、例えば肝臓に局所的に投与することが望ましい。これは、例えば移植の手段により、達成されることができ、前記移植は、膜、例えばサイラスティックの膜、又は繊維を含む、多孔性の、非多孔性の又はゼラチン状の物質の移植である。
LAL欠損の治療において効果的である、本発明の治療薬(すなわち、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド又は細胞)の量は、標準的な臨床技術により決定されることができる。加えて、in vivo及び/又はin vitroのアッセイは、任意選択で、最適な用量の範囲の予測を助けるために使用されることができる。製剤において使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度にもまた依存し、医師の判断及びそれぞれの患者の状況により判断されるべきである。必要とする対象に投与される、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド又は細胞の用量は、以下に制限されるわけではなく、投与経路、治療される特定の疾患、対象の年齢又は治療的な効果を得るために必要な発現レベルを含むいくつかの因子に基づいて異なる。当業者は、当該分野の知識に基づいて、これらの因子及び他の因子に基づいて必要とされる用量の範囲を容易に決定することができる。ウイルスベクター、例えばAAVベクターを対象に投与する工程を含む治療の場合において、ベクターの典型的な用量は、体重1キログラム当たり少なくとも1x108ベクターゲノム(vg/kg)、例えば少なくとも1x109 vg/kg、少なくとも1x1010 vg/kg、少なくとも1x1011 vg/kg、少なくとも1x1012 vg/kg、少なくとも1x1013 vg/kg又は少なくとも1x1014 vg/kgである。
本発明の更なる対象は、薬学的に許容される媒体において、本明細書において記載される遺伝的に改変された造血性幹細胞及び/又は本明細書において記載される少なくとも一つの血液細胞を含む、医薬組成物である。特定の実施形態において、本明細書において記載される細胞は、造血性幹細胞又は前駆細胞の分化を増大する治療的な化合物と共に、本明細書において記載される組成物において投与されることができる。これらの治療的な化合物は、造血性幹細胞及び/若しくは内在性である前駆細胞、並びに/又は療法の一部として個体に投与される細胞の、分化及び可動化を誘導する効果を有する。
本明細書において記載される細胞は、任意の適切な経路、例えば静脈内の、心臓内の、髄腔内の、筋肉内の、関節内の又は骨髄内の注射により、及び治療的な恩恵を提供するのに十分な量において、対象に投与される。治療的な効果を達成するために必要とされる細胞の量は、特定の目的のための従来の手順に従って、経験的に決定される。実例として、LAL欠損に罹患する患者に対する細胞の投与は、根底にある状態が根絶される又は回復される場合のみでなく、患者が疾患に関連する症状の重症度又は持続期間の減少を報告する場合にもまた、治療的な恩恵を提供する。治療的な恩恵は、改善が実現されるかどうかに関わらず、根底にある疾患又は障害の進行を停止すること又は遅くすることもまた含む。注入される細胞の数は、因子、例えば性別、年齢、体重、疾患又は障害の型、障害の段階、細胞集団における望ましい細胞の割合(例えば、細胞集団の純度)、及び治療的な恩恵を産生するために必要とされる細胞数を考慮に入れる。一般的には、注入される細胞の数は、1.104から5.106 cells/kg、特には1.105から10.106 cells/kg、好ましくは5.105から約5.106 cells/kg体重であることができる。
治療
本発明は、LAL欠損を治療するための方法における使用のための、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、LALキメラポリペプチド、医薬組成物又は細胞にもまた関する。
本発明は、更に、LAL欠損を治療するための方法であって、治療的な有効量の、本発明の核酸分子、ベクター、LALキメラポリペプチド、医薬組成物又は細胞を、それを必要とする対象に送達する工程を含む方法に関する。
特定の実施形態によると、治療的な有効量の、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、LALキメラポリペプチド、医薬組成物又は細胞の反復投与が、実施されることができる。実施形態によると、反復投与を含む態様において、前記投与は、少なくとも1回以上反復されることができ、周期的なスケジュールに従って、例えば週、月又は年に一回行われると考えることさえできる。周期的なスケジュールは、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10年、又は10年超に一回の投与もまた含むことができる。
本発明によると、治療は、治療的な、軽減の又は予防的な効果を含むことができる。従って、治療的な及び予防的な治療は、LAL欠損の症状の回復、又はLAL欠損を発症するリスクを予防すること、若しくはそうでなければ減少させることを含む。用語「予防的な(prophylactic)」は、特定の状態の重症度又は発症を減少させることとして考えることができる。「予防的な(prophylactic)」は、過去に状態を診断された患者における特定の状態の再発を予防することもまた含む。「治療的な(therapeutic)」は、存在する状態の重症度を減少させることもまたできる。用語「治療(treatment)」は、本明細書において、動物、特には哺乳類、より特にはヒト対象に恩恵をもたらすことのできる任意の処置計画を指すために使用される。
本発明は、本発明の核酸分子又は核酸コンストラクトを、それを必要とする患者の単離された細胞、例えば単離された造血性幹細胞に導入する工程、及び前記細胞をそれを必要とする前記患者に導入する工程を含む、LAL欠損の治療のためのex vivoでの遺伝子治療方法における使用のための、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、LALキメラポリペプチド、医薬組成物又は細胞にもまた関する。この態様の特定の実施形態において、核酸分子又はコンストラクトが、上記で定義されるベクターと共に、細胞へと導入される。特定の実施形態において、ベクターは組み込みウイルスベクターである。更なる特定の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターである。例えば、van Tilら、2010、Blood、115(26)、p.5329において公開されるレンチウイルスベクターは、本発明の方法における実施において使用されることができる。
本発明は、医薬としての使用のための、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド、細胞又は医薬組成物にもまた関する。
本発明は、LAL遺伝子における変異により引き起こされる疾患を治療するための方法における、特にはLAL欠損を治療するための方法における使用のための、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド、細胞又は医薬組成物にもまた関する。
本発明は、更に、早発性の又は遅発性のLAL欠損を治療するための方法における使用のための、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド、細胞又は医薬組成物に関する。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド、細胞又は医薬組成物は、ウォルマン病(WD)を治療するための方法において使用される。
もう一つの特定の実施形態において、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド、細胞又は医薬組成物は、コレステリルエステル蓄積症(CESD)を治療するための方法において使用される。
本発明のキメラLALポリペプチドは、酵素補充療法(ERT)における使用のために、例えばLAL欠損、例えばウォルマン病(WD)又はコレステリルエステル蓄積症(CESD)の酵素補充療法(ERT)における使用のために、それを必要とする患者に投与されることができる。
好ましい実施形態において、上記の遺伝的に改変されたHSCは、LAL欠損、例えばウォルマン病(WD)又はコレステリルエステル蓄積症(CESD)の治療における使用のために、それを必要とする患者に対して投与される。この方針により、治療的な量のLALタンパク質の発現及び分泌が、それを必要とする患者において達成されることができる。
本発明は、更に、LAL欠損、例えばウォルマン病(WD)又はコレステリルエステル蓄積症(CESD)を治療するために有用な医薬の製造における、本発明の核酸分子、核酸コンストラクト、ベクター、キメラLALポリペプチド又は細胞の使用に関する。
本発明は、以下の実験的な実施例及び添付された図面の参照により、更に詳細に記載される。これらの実施例は、説明のみの目的のために提供され、制限することは意図されていない。
材料及び方法
細胞培養
K562細胞(ATCC(登録商標) CCL-243)は、2 mMグルタミンを含むRPMI 1640培地において維持され、10% ウシ胎児血清(FBS、BioWhittaker、Lonza)、10 mM HEPES、1 mM ナトリウムピルベート(LifeTechnologies)並びにペニシリン及びストレプトマイシン(それぞれ100U/ml、LifeTechnologies)を補充された。
起動された(mobilized)末梢血液又は臍帯血に由来するHSPCは、解凍され、予備刺激媒体において48h培養された(StemSpan、ステムレゲニン1 0.75uM、StemCell technologies; rhSCF 300 ng/ml、Flt3-L 300 ng/ml、rhTPO 100 ng/ml及びIL-3 20 ng/mL、CellGenix)。
レンチウイルスの記載/クローニング
βLCRのDNase I HSであるHS2(ゲノムコーディネート[hg38]、chr11:5280255-5281665)及びHS3(ゲノムコーディネート[hg38]、chr11:5284251-5285452)及びLIPA cDNAから成る発現カセットは、pCCL LVバックボーン(Weberら、Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Sep 21; 10: 268-280.)にクローニングされた。それぞれのカセットは、Genscript(Piscataway、NJ)により合成された。
LVは、第三世代パッケージングプラスミドであるpMDLg/p.RRE及びpK.REVを使用して、293Tのトランジェント遺伝子導入により産生され、水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質G(VSV-G)エンベロープでシュードタイプ化された。LVは、HCT116細胞において用量設定(titrate)され、HIV-1 Gag p24量は、製造業者の指示に従って、ELISA (Perkin-Elmer)により測定された。
レンチウイルスのトランスダクション
K562細胞は、ポリブレンの存在下において、MOI 30でレンチウイルスベクターと共に一晩形質導入され、その後、細胞は洗浄され、新鮮培地で処理された。
HSPCは、レトロネクチン(rectronectin)及びプロタミドスルフェート(protamilde sulfate)の存在下で、MOI 75でレンチウイルスベクターと共に一晩形質導入され、その後、細胞は洗浄され、赤血球分化培地(StemSpan、StemCell Technologies; SCF 20 ng/ml、Epo 1 u/mL、IL3 5 ng/ml、デキサメタゾン 2 μM及びベータエストラジオール 1 μM; Sigma)において14日間培養された。
ウェスタンブロット
細胞内タンパク質を検出するために、細胞は、プロテアーゼ阻害剤(Roche)を補充したRIPAバッファー(Sigma Aldrich)に溶解され、凍結/解凍され、4℃、14000、10’で遠心された。全タンパク質は、BCAアッセイ(Thermofisher)を使用して定量化された。5～15 μgのタンパク質又は2.5 ulの上清は、90℃、10’で変性され、4～12% Bis-trisゲル上で還元条件でランされ、iBlot2システム(Invitrogen)を使用してニトロセルロース膜にトランスファーされた。ポンソー染色(Invitrogen)の後、膜は、Odysseyブロッキングバッファー(Odysseyブロッキングバッファー(PBS)、Li-Cor Biosciences)で2時間ブロッキングされ、ヒトLALに対する一次抗体で1時間インキュベートされ、その後、PBS:ブロッキングバッファーにおける特異的な二次抗体が続いた(以下の表1を参照)。βチューブリンが、ローディングコントロールとして使用された。ブロットは、Odysseyイメージャーで169 μmでイメージングされ、ImageStudio Liteソフトウェア(Li-Cor Biosciences)で分析された。画像のバックグラウンドのサブトラクション(平均法、トップ/ボトム)の後、バンド強度は定量化され、チューブリンシグナルで標準化された。
LAL活性
サンプルは、42 μMラリスタット2(Lalistat-2)(Sigma Aldrich)、LALの特異的な競合阻害剤又は水と共に、37℃で10分間インキュベートされた。サンプルは、その後、蛍光定量的な反応が75 ulの基質バッファー(135 mM アセテートバッファー pH 4.0における340 μM 4-MUP、0.9% Triton X-100及び12,9 μM カルジオリピン)で開始される、Optiplate 96Fプレート(PerkinElmer)に移動された。10分後、蛍光が、SPARK TECANリーダー(Tecan、Austria)を使用して記録された(35サイクル、30’’感覚、37°C)。動力学的なパラメーター(平均レート)は、Magellanソフトウェアを使用して計算された。未処理のサンプルと比較したLAL活性は、以下の式:
を使用して定量化された。
患者の線維芽細胞と形質転換されたK562との共培養
形質転換されたK562細胞は、24穴プレートにおいて24時間培養された患者の線維芽細胞(ウォルマン患者; GM 11851A;健康なドナー: GM 08333C、Coriell institute)の上に配置された0.4 μmのインサートに適用された。K562及び患者の線維芽細胞は、opti-MEM培地(Gibco)において3日間共培養され、その後、インサートは、取り除かれ、線維芽細胞は、ナイルレッドで染色された。それぞれの状態について8フィールドが、倒立蛍光顕微鏡(EVOS、10x拡大率)でランダムに得られ、細胞当たりの平均蛍光強度が、カスタムメイドImage Jプラグインで計算された。
キメラLALタンパク質
いくつかのキメラLALタンパク質の発現、分泌及び活性が試験された。LALタンパク質の内在性シグナルペプチド配列は、異なるヒトタンパク質に由来するいくつかの異なるシグナルペプチド配列で置換された(表2)。
図において、「Sp1」、「Sp2」、「Sp6」、「Sp7」、「Sp8」、「Sp9」及び「Sp10」は、表2において参照される対応するシグナルペプチドに融合した、配列番号9の機能的なLAL部分ペプチドを含むキメラLALタンパク質を参照する。
Sp8をシグナルペプチドとして含むキメラLALタンパク質をコードする、いくつかのコドン最適化配列もまた、試験された。図において、「Sp8_Opt1」、「Sp8_Opt2」及び「Sp8_Opt3」は、それぞれ、配列番号27、配列番号28及び配列番号29のコドン最適化配列を指す。配列番号27は、KOZAK配列(CACC)、配列番号21の最適化配列及びHA-tagコード配列を含む。配列番号28は、KOZAK配列(CACC)、配列番号22の最適化配列及びHA-tagコード配列を含む。配列番号29は、KOZAK配列(CACC)、配列番号23の最適化配列及びHA-tagコード配列を含む。
これらの最適化された配列によりコードされたタンパク質の発現、分泌及び活性は、評価され、Sp8を含むキメラLALタンパク質をコードする配列番号33の非最適化配列から発現されるタンパク質の発現、分泌及び活性において標準化された。
結果及び考察
ヒトLAL酵素の分泌を改善するために、我々は、ヒトLALcDNA配列において、内在性シグナルペプチドを、異なって分泌されるヒトタンパク質に由来するシグナルペプチドと交換した。これらのcDNAは、赤血球発現のために、人工的なヒトベータグロビンプロモーター(Miccio A.ら、PNAS 2008)の制御下のレンチウイルスベクターに挿入された。K562ヒト赤白血病細胞系列は、同様の量の異なるレンチウイルスベクターで形質導入され、6日後に、細胞は、定量化(ウエスタンブロット)及び酵素活性(蛍光発生基質を使用して)のためにタンパク質を抽出するために溶解された。
図1において、我々は、異種シグナルペプチドsp6、sp7及びsp8が、タンパク質の発現及びタンパク質の分泌(上清におけるタンパク質)の両方を増加させることを観察することができる。上清における酵素活性もまた、重要なことに、異種シグナルペプチドsp6、sp7及びsp8で増加した。反対には、異種シグナルペプチドsp2、sp9及びsp10は、そのような改善をもたらさない。sp10は、野生型の配列と比較して、酵素活性の減少さえもたらす。
臨床的に適切な細胞においてこの結果を確かめるために、我々は、初代ヒト造血性幹細胞/前駆細胞を、選択されたレンチウイルスベクターで形質転換した。再度、我々は、異種シグナルペプチドsp6、sp7及びsp8を使用する場合に、細胞上清における、タンパク質の発現、分泌及び活性の明確な増加を観察した(図2)。我々は、シグナルペプチドsp6、sp7及びsp8が、分泌されるLALタンパク質の印象的な増加をもたらしたことを確認することができる。加えて、sp6、sp7及びsp8は、sp1シグナルペプチドと比較した場合に、LALのより良い分泌だけでなく、LALのより良い全体的な発現(細胞内LAL＋分泌されたLAL)もまた可能とする。sp6、sp7及びsp8シグナルペプチドで得られたこの二重の効果は、当業者にとって予想外である。
これらのキメラLALタンパク質の全ての機能性を確かめるために、我々は、患者の初代線維芽細胞を、形質導入されたK562細胞から分泌されたキメラ酵素に曝露することによる、クロス-コレクション能力を確かめた。図3は、sp7及びsp8を含むキメラLALタンパク質が、未処理の細胞と比較して、脂質の分解の回復を可能とし、従って、キメラLALタンパク質の機能性が確認されることを示す。
最後に、LAL発現及び分泌を更に増加させるために、我々は、LAL cDNAの3つのコドン最適化バージョンを産生し、我々は、それらの少なくとも二つが、酵素発現の有意な増加をもたらすことを確かめた(図4)。
全体的には、我々は、ヌクレオチド配列及びシグナルペプチドを操作することにより、酵素の機能性に影響を与えることなく、hLALの分泌及び発現を向上させた。
結論
本研究において、LIPA遺伝子は、その分泌を向上させることを目的として、改変された。
特には、LALタンパク質の内在性シグナルペプチド配列は、異なるヒトタンパク質に由来するいくつかの異なる配列で置換され(表2)、K562ヒト赤白血病細胞系列における酵素分泌の効果(図1)及び初代造血性幹/前駆細胞(HSPC、図2)が試験された。本明細書において、シグナルペプチドSP6、SP7及びSP8が、酵素活性に影響を与えることなく、タンパク質の分泌を有意に増加させることが示される。
さらに、結果は、前記キメラ酵素が、更に、クロス-コレクションをすることができたことを示す。実際には、ウォルマン患者に由来する線維芽細胞の、キメラ酵素を発現するK562細胞との共培養は、病理学的な脂質の蓄積の減少をもたらした。
全体的には、これらのデータは、これらのキメラ酵素が、より良く発現され分泌されるだけでなく、それらが、依然として機能的であり、影響を受ける細胞により取り込まれ、それらを機能的にコレクトすることを示す。
最後に、LIPA配列のコドン最適化による酵素発現の増加の可能性が、評価された。3つの新規な導入遺伝子が設計され(Opt_1、Opt_2及びOpt_3)、少なくとも2つがK562における野生型配列よりも良いパフォーマンスをした(図4)。
これらの二つのパラメーターは、血流における機能的な酵素の割合をより大きくすることができ、それは、より優れた治療的な効果をもたらす。前記結果は、LAL欠損に対する効果的な長期間の治療戦略への道をひらく。特には、前記キメラLALペプチドは、遺伝子療法ベクターと組み合わせて使用されることができ、欠損酵素のin vivoでの発現及び置換を可能にする。前記キメラLALペプチドは、改変されたLIPA遺伝子の機能的なコピーを、患者の造血性幹細胞(HSC)に導入することを目的とする、ex vivoでの遺伝子療法のためにもまた使用されることができる。コレクトされたHSCは、血流に投与され、骨髄に到達して増殖し、新しいコレクトされた細胞を血液に産生する。結果として、キメラLAL酵素は、LAL欠損細胞により取り込まれるために、効率的に発現され、血流中に分泌され、代謝機能を回復させる。

Claims (18)

  1. シグナルペプチド部分及び機能的なLAL部分を含む、機能的なキメラLALタンパク質をコードする核酸分子であって、前記シグナルペプチド部分が、配列番号3から5、好ましくは配列番号5から成る群において選択されるアミノ酸配列を有し、又は前記シグナルペプチド部分が、配列番号3から5の配列と比較して、好ましくは配列番号5と比較して、1から5個まで、特には1から4個まで、特には1から3個まで、特には1から2個まで、特には1個のアミノ酸の欠失、挿入若しくは置換を含むアミノ酸配列を有する、機能的なシグナルペプチド部分である、核酸分子。
  2. 前記機能的なLAL部分が、機能的なヒトLAL部分、好ましくはその天然のシグナルペプチドを欠く機能的なヒトLAL部分である、請求項1に記載の核酸分子。
  3. 前記機能的なLAL部分が、配列番号9の配列を含む若しくはからなり、又は配列番号9に示される配列に対して、少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む若しくはから成る、請求項1又は2に記載の核酸分子。
  4. - 配列番号11から13及び配列番号18から20から成る群において選択される配列をコードするシグナルペプチド部分;並びに
    - 配列番号14から17から成る群において選択される配列をコードするLAL部分
    の組み合わせから生じるヌクレオチド配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸分子。
  5. in vivoでの前記機能的なキメラLALタンパク質の発現を向上させるために最適化されたヌクレオチド配列、特には配列番号21から23から成る群において選択されるヌクレオチド配列である、請求項1から4のいずれか一項に記載の核酸分子。
  6. 配列番号22又は配列番号23、好ましくは配列番号22又は配列番号23のヌクレオチド配列である、請求項5に記載の核酸分子。
  7. 請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、核酸コンストラクトであって、前記核酸コンストラクトは、プロモーター、例えば遍在性のプロモーター、肝臓特異的プロモーター又は赤血球特異的プロモーターと操作可能に接続された、前記核酸分子を含む発現カセットであり、前記核酸コンストラクトは、任意選択でイントロン及び/又は転写後制御配列を更に含む、核酸コンストラクト。
  8. ウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はAAVベクター、例えば一本鎖又は二本鎖の自己相補的なAAVベクター、好ましくはAAVに由来するキャプシド、例えばAAV6、AAV8、AAV9、AAV2又はAAV-DJに由来するキャプシドを有するAAVベクターである、請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸分子、又は請求項7に記載の核酸コンストラクトを含む、ベクター。
  9. 請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項7に記載の核酸コンストラクト又は請求項8に記載のベクターを含む、細胞であって、前記細胞が特には造血性幹細胞(HSC)である、細胞。
  10. 少なくとも一つのグロビン遺伝子座に請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、遺伝的に改変された造血性幹細胞である、請求項9に記載の細胞であって、前記核酸分子がグロビン遺伝子の内在性プロモーターの制御下に位置する、細胞。
  11. シグナルペプチド部分及び機能的なLAL部分を含む、機能的なキメラLALタンパク質であって、前記シグナルペプチド部分が、配列番号3から5から成る群において選択されるアミノ酸配列を有し、又は前記シグナルペプチド部分が、配列番号3から5の配列と比較して、1から5個、特には1から4個、特には1から3個、特には1から2個、特には1個のアミノ酸の欠失、挿入若しくは置換を含むアミノ酸配列を有する、機能的なシグナルペプチド部分である、機能的なキメラLALタンパク質。
  12. 前記機能的なLAL部分が、機能的なヒトLAL部分、好ましくはその天然のシグナルペプチドを欠く機能的なヒトLAL部分、より好ましくは配列番号9の配列を含む若しくはから成り、又は配列番号9に示される配列に対して、少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む若しくはから成る、機能的なLAL部分である、請求項11に記載の機能的なキメラLALタンパク質。
  13. - 配列番号3から5から成る群において選択されるシグナルペプチド部分配列;及び
    - 配列番号9のLAL部分配列
    の組み合わせから生じるアミノ酸配列を含む、請求項11又は12に記載の機能的なキメラLALタンパク質。
  14. 薬学的に許容される担体において、請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項7に記載の核酸コンストラクト、請求項8に記載のベクター、請求項9又は10に記載の細胞、又は請求項11から13のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドを含む、医薬組成物。
  15. 医薬としての使用のための、請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項7に記載の核酸コンストラクト、請求項8に記載のベクター、請求項9若しくは10に記載の細胞、請求項11から13のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド又は請求項14に記載の医薬組成物。
  16. LAL欠損を治療するための、例えばウォルマン病(WD)又はコレステリルエステル蓄積症(CESD)の治療のための方法における使用のための、請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項7に記載の核酸コンストラクト、請求項8に記載のベクター、請求項9又は10に記載の細胞、請求項11から13のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド又は請求項14に記載の医薬組成物。
  17. LAL欠損を治療するための、例えばウォルマン病(WD)又はコレステリルエステル蓄積症(CESD)の治療のための方法における使用のための、請求項10に記載の細胞、又は薬学的に許容される担体において、請求項10に記載の細胞を含む医薬組成物であって、前記細胞が好ましくは自己の造血性幹細胞である、細胞又は医薬組成物。
  18. 請求項10において定義される遺伝的に改変された造血性幹細胞のex vivoでの調製のための方法における、請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項7に記載の核酸コンストラクト又は請求項8に記載のベクターの使用。
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