CN113795575A

CN113795575A - 多核苷酸

Info

Publication number: CN113795575A
Application number: CN202080017551.2A
Authority: CN
Inventors: A·纳斯瓦尼; J·麦金托什; R·柯巴; A·基亚; C·米兰达
Original assignee: Free Exercise Therapy Co ltd
Current assignee: Free Exercise Therapy Co ltd
Priority date: 2019-02-04
Filing date: 2020-02-04
Publication date: 2021-12-14
Also published as: KR20210148101A; EP3850089B1; MX2021009305A; EP4299116A2; WO2020161483A1; FI3850089T3; CA3128875A1; US20220154159A1; SG11202108502UA; DK3850089T3; PL3850089T3; EP3850089A1; JP2022520179A; AU2020217894A1; IL285350A; HUE065347T2; EP4299116A3; BR112021015312A2; HRP20240184T1; ES2968922T3

Abstract

本发明涉及包含编码GCase蛋白或其片段的GBA核苷酸序列的多核苷酸，并且其中编码序列的一部分不是野生型。本发明还涉及包含含有本发明多核苷酸的重组基因组的病毒颗粒、包含多核苷酸或病毒颗粒的组合物，以及多核苷酸、病毒颗粒或组合物的方法和用途。

Description

多核苷酸

发明领域

本发明涉及包含编码β-葡糖脑苷脂酶(GCase)的GBA核苷酸序列的多核苷酸、包含该多核苷酸的病毒颗粒和利用该多核苷酸的治疗。

发明背景

戈谢病(GD)是一种常染色体隐性脂质贮积病，其特征是葡糖脑苷脂在巨噬细胞-单核细胞系统的细胞中沉积。GD是由持家GBA基因中的突变引起的，其会损害酶β-葡糖脑苷脂酶(GCase)的活性和/或产生。

GD有3种主要类型，其特征在于已鉴定的特定突变，并且每种类型都可以表现出不同的临床症状。1型GD很少或不涉及中枢神经系统，但主要特征是内脏表现，例如脾脏和肝脏肿大、血细胞计数低、出血问题和骨骼疾病。在过去的20年中，酶替代疗法已成为1型GD的标准治疗方法。除了高昂的费用(约200,000美元或约150,000英镑/患者/年)之外，GD中的酶替代疗法治疗通常需要终身每隔一周注射一次或多次。这导致高比例的GD患者表现出高水平的治疗负担。

因此，需要提供一种用于治疗GD的有效治疗载体，即允许高水平GCase表达的载体。

本申请涉及用于治疗GD的基因治疗方法，包括施用包含编码GCase的GBA多核苷酸的病毒颗粒。与包含编码野生型GCase的多核苷酸的多核苷酸相比，本文所述的多核苷酸和病毒颗粒能够提供更高的GCase表达。这种基因治疗方法可避免需要频繁和终生静脉注射GCase。

发明概述

本申请证明对编码GCase的GBA核苷酸序列的特定修饰能够帮助提高体外和/或体内表达的GCase多肽的表达水平和活性。例如，本申请证明使用密码子优化的GBA核苷酸序列能够提高编码的GCase蛋白的表达和/或活性。可进一步修饰此类修饰的(即不是野生型)和/或密码子优化的GBA核苷酸序列，以提供编码的GCase蛋白的表达和/或活性的进一步的改进。进一步的修饰可包括在GBA核苷酸序列中提供进一步的修饰，例如去除CpG基序，和/或使用包含特定启动子和/或增强子序列的特定基因调控元件。据信，对GBA核苷酸序列的这种改进能够提高这种核苷酸在治疗GD中的功效。

这些修饰提供了(例如在肝脏中)高表达并且编码GCase多肽或其片段的GBA核苷酸序列。如实施例中所证明的，本发明的多核苷酸以比野生型GBA更高的水平表达GCase活性。

因此，在本发明的第一方面，提供了包含GBA核苷酸序列的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码β-葡糖脑苷脂酶(GCase)蛋白或其片段，并且其中GBA核苷酸序列的至少一部分不是野生型。

在本发明的第二方面，提供了包含GBA核苷酸序列的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码GCase蛋白或其片段并且包含与SEQ ID NO:1-8的至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、小于1611个、1000至1494个、1000至1611个、1300至1494个、1300至1611个或约1494个核苷酸的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的序列。

在本发明的第三方面，提供了包含重组基因组的病毒颗粒，所述重组基因组包含本发明的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供了包含本发明的多核苷酸或病毒颗粒和药学上可接受的赋形剂的组合物。

在本发明的第五方面，提供了一种治疗方法，包括向患者施用有效量的本发明的多核苷酸或病毒颗粒。

在本发明的第六方面，提供了本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物在制备用于治疗方法的药物中的用途。

在本发明的第七方面，提供了本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物在制备用于在受试者中实现稳定的GCase活性的药物中的用途。

在本发明的第八方面，提供了本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物在制备用于在受试者中提供比来自GCase酶替代疗法的生物利用度更高的GCase生物利用度的药物中的用途，其中在施用后2周的时间段内测量生物利用度。

在本发明的第九方面，提供了通过向受试者施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物而在受试者中实现稳定的GCase活性的方法。

在本发明的第十方面，提供了通过向受试者施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物而在受试者中提供比来自GCase酶替代疗法的生物利用度更高的GCase生物利用度的方法，其中在施用后2周的时间段内测量生物利用度。

在本发明的第十一方面，提供了本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于在受试者中表达GBA核苷酸序列并实现稳定的GCase活性的方法。

在本发明的第十二方面，提供了本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于表达GBA核苷酸序列并在受试者中提供与来自GCase酶替代疗法的生物利用度相比更高的GCase生物利用度的方法，其中在施用后2周的时间段内测量生物利用度。

在本发明的第十三方面，提供了本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物在制备用于降低患有与GCase缺乏症相关的疾病或病症的受试者中己糖神经酰胺和/或己糖鞘氨醇水平的药物中的用途。

在本发明的第十四方面，提供了通过向受试者施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物降低患有与GCase缺乏症相关的疾病或病症的受试者中己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平的方法。

在本发明的第十五方面，提供了本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于降低患有与GCase缺乏症相关的疾病或病症的受试者中己糖神经酰胺和/或己糖鞘氨醇水平的方法，任选地其中降低己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平导致治疗与GCase缺乏症相关的疾病或病症。

附图说明

图1——来自构建体FLF-PL01、FLF-PL28和FLF-PL64的GBA盒的示意图。LSP-S和LSP-L：肝脏特异性启动子；GBAwt：野生型人GBA核苷酸序列；GBAco：密码子优化的人GBA核苷酸序列(除了编码信号肽的链段，其末端由虚线表示)。

图2——注射AAV2/8-FLF-PL28后，人GCase剂量依赖性肝脏表达和分泌到鼠血流中。(A)注射AAV2/8-PL28后12周对GCase染色的小鼠肝脏的代表性图像。DAB(3,3'-二氨基联苯胺)用于观察GCase，苏木精用作复染剂。(B)用增加剂量的AAV2/8-PL28处理的小鼠血清中通过活性测定测量的GCase水平。n＝每个处理组5只C57BL/6小鼠。误差棒显示平均值±SD。

图3——在转染到Huh-7细胞后，观察到每个测试的GBA密码子优化构建体(FLF-PL16至FLF-PL36；‘16’至‘36’)的相对GCase水平。在3到5个实验中独立测试每个构建体。此处显示的数据代表相对于野生型GBA构建体FLF-PL01(‘01’)的GCase活性。误差棒代表平均值±SD。

图4——在注射载体AAV2/8-FLF-PL-01、21、28、30、36和37后测量小鼠血流中存在的GCase活性(构建体描述参见实施例5)。(A)注射测试的GBA构建体后8周在小鼠血清中发现的GCase活性水平。(B)在注射构建体FLF-PL01和FLF-PL28后4、8、12和36周时在小鼠血清中观察到的GCase活性水平。误差棒代表平均值±SD，n＝每个实验组5-8只动物。*p≤0.05；**p≤0.001(单因素方差分析)。

图5——在野生型小鼠中注射AAV2/8-FLF-PL28后脾脏和骨髓组织中GCase的摄取水平。显示了注射后4周的幼稚或AAV2/8-PL28处理小鼠GBA染色的脾脏和骨髓组织的代表性图像。DAB(3,3'-二氨基联苯胺)用于观察GBA，苏木精用作复染剂。

图6——在向野生型小鼠注射AAV2/8-FLF-PL28后，在脾脏中观察到人GCase与经典鼠巨噬细胞标志物F4/80的共定位水平。GBA和F4/80抗体染色的脾组织的代表性免疫荧光图像。DAPI(蓝色)用于显示细胞核。

图7——注射AAV2/8-FLF-PL28和FLF-PL64后4周在小鼠血流中发现的GCase活性水平。测定以2×10¹²vg/kg剂量注射后4周收集的小鼠血清的GCase活性。误差棒代表平均值±SD。N＝每个处理组5只C57BL/6小鼠。

图8——在处理后5周的小鼠中观察到AAV2/8-FLF-PL28和FLF-PL64注射后在脾脏、骨髓和肺中观察到的摄取水平。

图9——序列表。

图10——用AAV-FLF-PL64转导后人源细胞系的GCase分泌水平。用载体AAV-FLF-PL64以1×10⁵vg/细胞的MOI转导细胞。(A)用4MU-Glc作为底物荧光测定活性GBA的水平。(B)使用对多聚腺苷酸序列特异的引物通过qPCR获得每个细胞系的转导水平。减去每个细胞系的空白值以获得活性GCase水平的值。误差棒代表重复孔的平均值±SD。

图11：(A)酶替代疗法(

(60U/kg))在野生型小鼠中的药代动力学和半衰期计算。一相衰减模型方程：Y0是X(时间)为零时的Y值。Plateau是无限时间的Y值。K是速率常数。Tau是时间常数。半衰期以X轴的时间单位表示。Span是Y0和Plateau之间的差值。(B)单次注射酶替代疗法(VPRIV(60U/kg)，实心黑色)和FLF-PL64基因疗法后，在野生型小鼠中施用后GCase活性的血清药代动力学曲线的比较。

图12：施用VPRIV或FLF-PL64后小鼠肝脏、脾脏和骨骼中的GCase免疫染色。DAB(3,3'-二氨基联苯胺)用于观察GCase，苏木精用作复染剂。FLF-PL64样品是在注射后五周获得的，而VPRIV处理的样品是在标记的时间收集的。每个图像代表n＝每个处理组5只C57BL/6只小鼠。所有图片的放大倍数相同。

图13：在施用维拉苷酶alfa

(标记为ERT)或AAV-GBA(AAV-FLF-PL64)后，在gba^9v/null小鼠肝脏(a)、白细胞(b)、脾脏(c)和骨髓(d)中观察到GCase活性增加。在对应于组织摄取峰值的最后一次注射后1-2小时收集ERT样品。AAV-GBA(AAV-FLF-PL64)样品在注射后12周收集并对应于稳态摄取水平。GCase活性表示为在野生型健康小鼠(20周龄)中测量的活性的百分比。所有小鼠均在明显症状学前(pre-overt symptomatology)8周龄时进行处理。ERT剂量为60U/kg，每两周注射施用一次；AAV-FLF-PL64以2×10¹²vg/kg的剂量注射。n＝10。****P≤0.0001

图14：AAV-GBA(AAV-FLF-PL64)基因疗法可减少gba^9v/null小鼠肝脏中活化的巨噬细胞和炎症。上图：H&E染色的肝脏切片，显示每组的代表性图像。贮积细胞由圆圈标识。左下图：图表显示了在AAV-FLF-PL64和ERT处理组中计数的贮积细胞与媒介物对照组之间的比较。右下图：显示在用抗CD68抗体染色后与媒介物对照组相比，在AAV-FLF-PL64和ERT处理组中计数的CD68阳性细胞的图。AAV-GBA(AAV-FLF-PL64)以2×10¹²vg/kg的剂量注射；感染后12周收集的样品，ERT剂量为60U/kg，每两周注射施用一次。在最后一次注射后1-2小时收集ERT样品。平均值±SEM，(n＝10)，**P≤0.005，****P≤0.0005

图15：AAV-GBA(AAV-FLF-PL64)基因疗法在gba^9v/null小鼠中显示出比维拉苷酶alfa(

标记为ERT)更好的底物清除率。AAV-FLF-PL64和ERT处理组肝脏、脾脏和骨髓中己糖神经酰胺和己糖神经鞘氨醇水平的LC/MS分析。将水平针对在媒介物对照组中测量的水平进行标准化。AAV-GBA(AAV-FLF-PL64)以2×10¹²vg/kg的剂量注射；感染后12周收集的样品；ERT剂量为60U/kg，每两周注射施用一次。在最后一次注射后1-2小时收集ERT样品。平均值±SEM，(n＝10)，**P≤0.005，****P≤0.0005

详述

一般定义

除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。

一般而言，术语“包含”旨在表示包括但不限于。例如，短语“包含GBA核苷酸序列的多核苷酸”应解释为表示该多核苷酸具有GBA核苷酸序列，但该多核苷酸可含有额外的核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，词语“包含”被短语“由……组成”代替。术语“由……组成”旨在进行限制。例如，短语“由GBA核苷酸序列组成的多核苷酸”应理解为表示该多核苷酸具有GBA核苷酸序列并且不含额外的核苷酸。

如本文所用，当提及两个端点以定义值的范围时，“至”应理解为“至和包括”。因此，定义为“5至10”的范围包括所有大于5且小于10的值，以及离散值5和10本身。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，旨在指任何长度的氨基酸多聚链。

出于本发明的目的，为了确定两个序列(例如两个多核苷酸或两个多肽序列)的同一性百分比，将序列比对以用于最佳比较目的(例如，可以在第一序列中引入缺口用于与第二序列最佳比对)。然后比较每个位置的核苷酸或氨基酸残基。当第一序列中的一个位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸或氨基酸残基占据时，则该位置的核苷酸或氨基酸是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数量的函数(即，同一性百分比＝相同位置的数量/参考序列中的位置总数×100)。

通常在参考序列的长度上进行序列比较。例如，如果用户希望确定给定(“测试”)序列是否与SEQ ID NO:1 95％相同，则SEQ ID NO:1将是参考序列。例如，为了评估序列是否与SEQ ID NO:1(参考序列的一个实例)至少80％相同，本领域技术人员将在SEQ ID NO:1的长度上进行比对，并鉴定测试序列中有多少位置与SEQ ID NO:1的位置相同。如果至少80％的位置相同，则测试序列与SEQ ID NO:1至少80％相同。如果序列短于SEQ ID NO:1，缺口或缺失位置应被认为是不同的位置。

本领域技术人员知道可用于确定两个序列之间的同源性或同一性的不同计算机程序。例如，序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。在一个实施方案中，两个氨基酸或核酸序列之间的同一性百分比是使用Needleman和Wunsch(1970)算法确定的，该算法已并入Accelrys GCG软件包的GAP程序中(在http://www.accelrys.com/products/gcg/可用)，使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

出于本发明的目的，术语“片段”是指序列的连续部分。例如，SEQ ID NO:1的50个核苷酸的片段是指SEQ ID NO:1的50个连续核苷酸。

多核苷酸

在一方面，本发明提供包含GBA核苷酸序列的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码β-葡糖脑苷脂酶(GCase)蛋白或其片段，并且其中至少一部分GBA核苷酸序列不是野生型。

多核苷酸可以进一步包含以下特征中的一个或多个。GBA核苷酸序列或不是野生型的GBA核苷酸序列部分可以是密码子优化的。多核苷酸可以(另外)包含未经密码子优化的部分。多核苷酸可包含内含子或内含子的片段。

术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物的多聚形式。例如，多核苷酸可包含DNA(脱氧核糖核苷酸)或RNA(核糖核苷酸)。多核苷酸可由DNA组成。多核苷酸可以是mRNA。由于多核苷酸可包含RNA或DNA，所有对T(胸腺嘧啶)核苷酸的提及可替换为U(尿嘧啶)。

编码GCase的GBA核苷酸序列

在一方面，本文提供的多核苷酸包含GBA核苷酸序列。GBA核苷酸序列通常编码β-葡糖脑苷脂酶(GCase)蛋白或其片段。

术语“编码序列”是指包含开放阅读框的核苷酸序列，该开放阅读框包含编码所编码多肽的密码子。例如，编码GCase蛋白或其片段的核苷酸序列包含编码GCase蛋白或其片段的氨基酸序列的密码子。在SEQ ID NO:9中提供了编码野生型GCase蛋白的GBA核苷酸序列的一个实例。

GBA核苷酸序列可能被非编码核苷酸(例如内含子)中断，但只有编码多肽的核苷酸才应被视为GBA核苷酸序列的一部分。例如，编码GCase蛋白的GBA核苷酸序列将包含任何密码子，该密码子编码从该编码序列表达的GCase蛋白的组成部分的氨基酸，无论这些密码子在序列上是连续的还是被一个或多个非编码核苷酸分隔开。换言之，包含被非编码核苷酸链段中断的编码核苷酸链段的GBA多核苷酸将被认为包含由直接并列的非连续编码链段组成的“GBA核苷酸序列”(即减去非编码链段)。然而，在本文中，终止密码子将被认为是全长编码序列的一部分。

如本文所述的编码GCase的GBA核苷酸序列和/或GCase编码序列还可包括信号肽的密码子。众所周知，一些蛋白质，特别是那些输出到不同组织的蛋白质，是带有信号肽表达的。信号肽可以位于蛋白质序列的N端(在这种情况下位于编码序列的5'端)，并且许多信号肽在细胞加工后被切割。因此，在本文中，成熟的蛋白质或多肽(例如成熟的GCase蛋白质或多肽)将被认为是在信号肽已经被加工和去除/切割(并且因此不再形成多肽序列的一部分)之后产生的蛋白质或多肽。

下表描述了编码每个氨基酸的密码子：

相应的RNA密码子将包含代替上表中T的U。

本发明的一个方面提供了一种包含GBA核苷酸序列的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码GCase蛋白或其片段并且包含与SEQ ID NO:1-8中任一个的至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、小于1611个、1000至1494个、1000至1611个、1300至1494个、1300至1611个或约1494个核苷酸的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的序列。任选地，全部GBA核苷酸序列或部分GBA核苷酸序列是密码子优化的。在一个实施方案中，GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1-8的至少1300个核苷酸的片段具有至少98％相同的序列。在一个实施方案中，GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1-8的至少1300个核苷酸的片段至少99％相同的序列。

在一个实例中，GBA核苷酸序列可包含与SEQ ID NO:1至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的序列。在一个实施方案中，GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1的至少1300个核苷酸的片段至少98％相同的序列。在一个实施方案中，GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1的至少1300个核苷酸的片段至少99％相同的序列。GBA核苷酸序列可以包含与SEQ ID NO:5至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的序列。GBA核苷酸序列可包含与SEQ ID NO:1至少98％相同的序列。GBA核苷酸序列可包含与SEQ ID NO:1至少99％相同的序列。GBA核苷酸序列可以包含与SEQID NO:5至少98％相同的序列。GBA核苷酸序列可以包含与SEQ ID NO:5至少99％相同的序列。在一个实施方案中，GBA核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:1。在另一个实施方案中，GBA核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:5。

GBA核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:1的序列或编码具有GCase活性的GCase蛋白的SEQ ID NO:1的变体。在这些实例中，除了所述变体包含核苷酸置换使得GCase蛋白相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个或最多10个氨基酸置换以外，SEQ ID NO:1的变体与SEQ ID NO:1相同。在这些实例中，SEQ ID NO:1的变体可以相对于SEQ ID NO:1的序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个、最多10个、最多20个或最多30个核苷酸置换。SEQ ID NO:1的变体相对于SEQ ID NO:1的序列可以具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个或最多6个核苷酸置换。在一个实例中，SEQ IDNO:1的变体相对于SEQ ID NO:1的序列具有最多4个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ IDNO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多3个的氨基酸置换的GCase蛋白。在一个实例中，SEQ ID NO:1的变体相对于SEQ ID NO:1的序列具有最多3个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多2个氨基酸置换的GCase蛋白。在一个实例中，SEQ ID NO:1的变体相对于SEQ ID NO:1的序列具有1个核苷酸置换和/或编码一种相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多1个氨基酸置换的GCase蛋白。

GBA核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:5的序列或编码具有GCase活性的GCase蛋白的SEQ ID NO:5的变体。在这些实例中，除了所述变体包含核苷酸置换使得GCase蛋白相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个或最多10个氨基酸置换以外，SEQ ID NO:5的变体与SEQ ID NO:5相同。在这些实例中，SEQ ID NO:5的变体可以相对于SEQ ID NO:5的序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个、最多10个、最多20个或最多30个核苷酸置换。SEQ ID NO:5的变体相对于SEQ ID NO:5的序列可以具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个或最多6个核苷酸置换。在一个实例中，SEQ IDNO:5的变体相对于SEQ ID NO:5的序列具有最多4个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ IDNO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多3个氨基酸置换的GCase蛋白。在一个实例中，SEQID NO:5的变体相对于SEQ ID NO:5的序列具有最多3个核苷酸置换和/或编码相对于SEQID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多2个氨基酸置换的GCase蛋白。在一个实例中，SEQ ID NO:5的变体相对于SEQ ID NO:5的序列具有1个核苷酸置换和/或编码相对于SEQID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多1个氨基酸置换的GCase蛋白。

GCase蛋白或其片段

多核苷酸包含编码GCase蛋白或其片段的GBA核苷酸序列。

β-葡糖脑苷脂酶(GCase)是一种具有葡糖神经酰胺酶活性(EC 3.2.1.45)的酶，可水解化学葡糖脑苷脂的β-葡糖苷键，葡糖脑苷脂是糖脂代谢的中间体，在细胞膜中含量丰富。GBA基因(编码GCase)的突变可导致巨噬细胞中葡糖脑苷脂的积累，这些巨噬细胞会浸润许多重要器官，其表现为戈谢病(GD)。典型的野生型GCase多肽由SEQ ID NO:9编码。

GCase(例如由SEQ ID NO:9编码的SEQ ID NO:25的GCase)最初表达为前体“未成熟”形式，包含信号肽(SEQ ID NO:25的氨基酸残基1至39和SEQ ID NO:9的密码子1至39)，以及成熟的GCase多肽区域。加工后，GCase的“成熟”形式缺少信号肽。术语“成熟GCase”或“成熟GCase多肽”是指不含信号肽的GCase多肽，例如由SEQ ID NO:1-4编码的GCase。典型的GCase信号肽可由SEQ ID NO:17的核苷酸序列编码并具有SEQ ID NO:18的多肽序列。

GCase或其片段可以是变体GCase或其片段，即不具有与SEQ ID NO:25相同的序列的GCase。在一个实施方案中，GCase或其片段由本发明的多肽和/或与SEQ ID NO:25至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同；或与SEQ ID NO:25的至少300个、至少350个、至少400个、小于或等于536个、小于或等于497个、300至536个、或300至497个氨基酸长的片段至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的GBA核苷酸序列编码。在一个实施方案中，GCase蛋白或其片段与SEQ ID NO:25至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同；或与SEQ ID NO:25的长度约497个氨基酸的片段至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。GCase蛋白或其片段可以具有SEQ ID NO:25的序列。优选地，GCase蛋白或其片段不含SEQ ID NO:18的信号肽。优选地，GCase蛋白或其片段是功能性的。功能性GCase蛋白质或片段是进行葡糖脑苷脂水解的蛋白质或片段。

GBA核苷酸序列可以编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个或最多5个氨基酸置换的GCase蛋白。在这样的实例中，GBA核苷酸序列可以编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多3个氨基酸置换的GCase蛋白。GBA核苷酸序列可以编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多2个氨基酸置换的GCase蛋白。GBA核苷酸序列可以编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多1个氨基酸置换的变体GCase蛋白。

确定由GBA核苷酸序列编码的GCase蛋白或片段是否有功能在本领域技术人员的能力范围内。本领域技术人员只需要表达GCase核苷酸序列并测试所表达的蛋白是否有活性即可。例如，本领域技术人员可以制备包含与可操作的启动子连接的GBA核苷酸序列的本发明病毒颗粒，并在适合表达GCase蛋白或其片段的条件下用病毒颗粒转导细胞。可以使用荧光测定法，例如实施例1中描述的“血清GBA活性测定法”来分析表达的GCase蛋白或其片段的活性(量)。

例如，合适的荧光测定法如下。β-葡糖脑苷脂酶(酸性β-葡糖苷酶；GCase)活性可以用4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷(4MU-Glc)作为底物进行荧光测定。简而言之，血清样品(0.5μL，1:50稀释)可以在50mM柠檬酸钠、25mM牛磺胆酸盐、pH约5.75、6mM 4MU-Glc中在37℃下测定30分钟。然后可以使用分别为365nm和445nm的激发和发射波长来评估相对荧光水平(RFU)。GCase表示为基于4-甲基伞形酮(4-MU)标准曲线的纳摩尔/h/mL血清。

GBA核苷酸序列的一部分不是野生型

GBA核苷酸序列的一部分(例如编码GCase蛋白或其片段的编码序列)可不是野生型。编码野生型GCase的GBA核苷酸序列由SEQ ID NO:9表示，并且包含与SEQ ID NO:9的序列不同的部分的GBA核苷酸序列包含不是野生型的部分。

在一个实施方案中，GBA核苷酸序列的不是野生型的部分是密码子优化的。密码子优化能够改善核苷酸序列(例如GBA核苷酸序列)在特定组织和/或特定生物体中的表达。例如，如果对核苷酸序列针对在人肝脏中的表达进行密码子优化，则修改核苷酸序列以增加可能在人肝脏中偏好的密码子数量(从某种意义上说，此类密码子对应于比特异于相同氨基酸的其他tRNA种类丰度更高的tRNA种类)。本领域技术人员会理解，对序列进行密码子优化可能不需要改变每个密码子，尤其是因为“偏好密码子”可能已经存在于某些位置。

这种密码子优化可能受其他因素的影响。例如，可以看出CpG的存在对表达有不利影响，因此用户可能决定不在这样做会将CpG引入序列的位置使用偏好密码子；这仍将被视为密码子优化。在一个实施方案中，以C核苷酸结尾的偏好密码子将不包括在密码子优化的编码序列部分中，其中该序列中的下一个密码子以G开头。例如，密码子CTC编码亮氨酸。在CTC是偏好密码子的方案中，它不应该用于编码序列中下一个密码子以G开头情况下的亮氨酸，例如密码子GTT(或者，可以选择下一个密码子——在可能的情况下——以避免G在第一个位置)。

确定在核苷酸序列的一部分中使用的每个密码子的频率很简单。本领域技术人员仅需要将该部分的序列输入到容易获得的算法之一(其查看密码子使用)并查看结果。或者，用户可以简单地数它们。

在一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含这样的GBA核苷酸序列，其中67％的编码组氨酸的密码子是CAC并且33％的编码组氨酸的密码子是CAT。

任选地，密码子优化的GBA核苷酸序列部分针对在人肝脏中的表达进行密码子优化。任选地，GBA核苷酸序列针对在人肝脏中的表达进行密码子优化。任选地，密码子优化的GBA核苷酸序列部分是连续部分。

密码子优化的部分可以对应于编码部分GCase蛋白或整个GCase蛋白的序列。例如，编码序列可以是全长的(例如SEQ ID NO:9)，包括不属于成熟GCase蛋白的一部分的信号肽，并且整个编码序列可以是密码子优化的。因此，本文提及“GBA序列的一部分是密码子优化的”应理解为意指“GBA序列的至少一部分是密码子优化的”。任选地，密码子优化的GBA核苷酸序列的部分长度为至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1600个、小于1500个、1000至1600个、1000至1500个、1300至1500个或约1494个核苷酸。任选地，密码子优化的GBA核苷酸序列部分编码(对应于)成熟的GCase蛋白。例如，GBA核苷酸序列可以编码前体GCase蛋白(即包括信号肽)，并且如果密码子优化的GBA核苷酸序列的部分对应于成熟GCase蛋白，则信号肽不是密码子优化的。

因此，在一些实施方案中，GBA核苷酸序列的一部分可能不是密码子优化的，例如编码序列的一部分未针对在肝脏中的表达进行密码子优化。在一些实施方案中，未经密码子优化的部分是至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、小于200个、小于170个、小于140个或约117个核苷酸。在一些实施方案中，GBA核苷酸序列中未经密码子优化的部分是编码信号肽的部分。

如上所述，提供包含部分或全部密码子优化的GBA核苷酸序列的多核苷酸序列可以确保所编码的多肽(即GCase多肽)以高水平表达。本领域技术人员将理解，从多核苷酸序列(例如本发明的GBA核苷酸序列)或从本发明的病毒颗粒表达GCase通常需要存在启动子序列或区域在多核苷酸序列的上游和/或可操作地连接至多核苷酸序列。因此，在一个实施方案中，本发明提供包含GBA核苷酸序列的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码这样的GCase多肽，当GBA核苷酸序列与启动子序列可操作连接时，GCase多肽在人肝细胞中高水平表达。在一些实施方案中，启动子序列可以是转录调控元件的一部分。在一些实施方案中，启动子序列可以是肝脏特异性启动子序列。在一个实施方案中，启动子序列是具有SEQ ID NO:12的启动子。在另一个实施方案中，启动子序列是具有SEQ ID NO:15的启动子。

本领域技术人员还将理解，在本发明的多核苷酸或载体与参考(比较)多核苷酸或载体例如包含SEQ ID NO:9的GBA核苷酸序列的参考多核苷酸或病毒颗粒之间进行比较，除了GBA核苷酸序列不同之外，参考多核苷酸或载体可以与本发明的多核苷酸或载体相同。换言之，被比较的不同GBA核苷酸序列可以与相同的启动子序列可操作地连接。在一些实施方案中，被测试的不同GBA核苷酸序列可以与不同的(指定的)启动子序列可操作地连接。

因此，在一个实施方案中，与参考野生型GBA序列相比，由GBA核苷酸序列编码的GCase多肽在人肝细胞中以更高的水平表达。参考野生型GBA核苷酸序列可以是SEQ ID NO:9。在一个实施方案中，与由包含SEQ ID NO:9的GBA核苷酸序列和SEQ ID NO:13的启动子元件(其中SEQ ID NO:9的GBA核苷酸序列和SEQ ID NO:13的启动子元件优选可操作地连接)的核苷酸序列编码的多肽相比，由GBA核苷酸序列编码的多肽在人肝细胞中以更高的水平表达。在一个实施方案中，与由包含SEQ ID NO:9的GBA核苷酸序列和SEQ ID NO:10的转录调控元件(其中SEQ ID NO:9的GBA核苷酸序列和SEQ ID NO:10的启动子元件优选可操作地连接)的核苷酸序列编码的多肽相比，由GBA核苷酸序列编码的多肽在人肝细胞中以更高的水平表达。在此类实施方案中，由GBA核苷酸序列编码的GCase可以在人肝细胞中表达至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍或至少1.5倍。在一个实施方案中，与由包含SEQID NO:9的GBA核苷酸序列并可操作地连接至SEQ ID NO:13的启动子的其他方面相同的参考多核苷酸编码的多肽相比，由GBA核苷酸序列编码的GCase多肽在人肝细胞中以更高的水平表达或非统计学显著不同的水平表达，其中两种多核苷酸以相同方式和相同量递送至细胞。

在一个实施方案中，当将包含GBA核苷酸序列的多核苷酸序列施用于受试者或非人哺乳动物如小鼠时，GCase以较高水平存在于受试者或非人动物的血清中(对于例如，在施用后4或8或12周)，所述较高水平是与由其他方面相同的核苷酸序列编码的GCase相比，该核苷酸序列包含与SEQ ID NO:12、13或15的启动子元件可操作地连接的SEQ ID NO:9的GBA核苷酸序列，其中以相同方式和相同量施用包含GBA核苷酸的多核苷酸。

本领域技术人员可以通过用包含GBA核苷酸序列的病毒颗粒转导一些细胞，以及用包含参考序列的颗粒转导一些细胞，确定与参考序列(例如，野生型GBA核苷酸序列，例如SEQ ID NO:9)相比，从给定GBA核苷酸序列(例如密码子优化的GBA核苷酸序列)是否以更高的水平表达GCase。细胞可以在适合表达由GBA核苷酸序列编码的GCase蛋白或其片段的条件下培养，并且可以比较所表达的GCase蛋白的水平。可以使用如标题为“GCase蛋白或其片段”部分中所述的荧光测定法或使用GCase特异性抗体的ELISA来评估表达的GCase蛋白的水平。合适的细胞包括培养的人肝细胞，例如Huh-7细胞。

如上所述，CpG(即CG二核苷酸)的存在可能会降低表达效率。这是因为CpG可能是甲基化的，它们的甲基化可能导致基因沉默从而降低表达。此外，高CpG含量可能会触发TLR反应，增加抗AAV免疫反应的风险。为此，优选的是，与参考野生型GBA核苷酸序列(例如SEQID NO:9)的相应部分相比，密码子优化的编码序列部分包含数量减少的CpG。在一个实施方案中，密码子优化的GBA核苷酸序列部分(其可以是所有GBA核苷酸序列)包含小于40、小于20、小于10或小于5个CpG。在一个实施方案中，密码子优化的GBA核苷酸序列部分(其可以是所有GBA核苷酸序列)包含小于5、小于4、小于3或小于2个CpG/100nt。在一些实施方案中，密码子优化的编码序列部分不含CpG，即不包含(0个)CG二核苷酸。

在一个实施方案中，GBA核苷酸序列的密码子优化的部分与SEQ ID NO:1-4的至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、1000至1494个、1300至1494个或约1494个核苷酸的片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。在一个实施方案中，密码子优化的编码序列部分与SEQ ID NO:1-4至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。在一个实施方案中，GBA核苷酸序列的密码子优化的部分与SEQ ID NO:1的至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、1000至1494个、1300至1494个或约1494个核苷酸的片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。在一个实施方案中，GBA核苷酸序列的密码子优化的部分与SEQ IDNO:1的至少1300个核苷酸的片段至少99.5％、至少99.8％或100％相同。在一个实施方案中，密码子优化的编码序列部分与SEQ ID NO:1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。

本发明提供了包含编码GCase蛋白或其片段的GBA核苷酸序列的多核苷酸，并且GBA序列包含与SEQ ID NO:1至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的序列。任选地，与SEQ ID NO:1至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.8％相同的序列是密码子优化的。

未经密码子优化的编码序列部分

在一个实施方案中，GBA核苷酸序列包含未经密码子优化的部分。未经密码子优化的部分可以是连续部分。

因此，正如本领域所理解的那样，未经密码子优化的部分没有被修饰以包括与野生型序列相比更多数量的偏好密码子。连续的未经密码子优化的多核苷酸序列是野生型序列。

任选地，未经密码子优化的部分是至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、小于200个、小于170个、小于140个或约117个核苷酸。在一些实施方案中，GBA核苷酸序列中未经密码子优化的部分是编码(对应于)全部信号肽或信号肽的一部分。任选地，未经密码子优化的部分编码GCase信号肽的全部或一部分。在一些实施方案中，GBA核苷酸序列中未经密码子优化的部分是具有SEQ ID NO:17的序列的部分。

多核苷酸可进一步包含转录调控元件

多核苷酸可包含转录调控元件。

在一个实施方案中，转录调控元件与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。在一个实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO:10至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的转录调控元件。任选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO:10至少98％相同的转录调控元件。任选地，多核苷酸包含SEQ ID NO:10的转录调控元件。任选地，多核苷酸包含由SEQ IDNO:10组成的转录调控元件。

在另一个实施方案中，转录调控元件与SEQ ID NO:14至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。在一个实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO:14至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的转录调控元件。任选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO:14至少98％相同的转录调控元件。任选地，多核苷酸包含SEQ ID NO:14的转录调控元件。任选地，多核苷酸包含由SEQ IDNO:14组成的转录调控元件。

可以使用任何合适的转录调控元件，例如HLP2、HLP1、LP1、HCR-hAAT、ApoE-hAAT和LSP，它们都是肝脏特异性转录调控元件。这些转录调控元件在以下参考文献中有更详细的描述：HLP1:McIntosh J.et al.,Blood 2013Apr 25,121(17):3335-44；LP1:Nathwani etal.,Blood.2006April 1,107(7):2653–2661；HCR-hAAT:Miao et al.,Mol Ther.2000；1:522-532；ApoE-hAAT:Okuyama et al.,Human Gene Therapy,7,637-645(1996)；和LSP:Wang et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1999March 30,96(7):3906–3910。

转录调控元件可以包含启动子和/或增强子，例如来自HLP2、HLP1、LP1、HCR-hAAT、ApoE-hAAT和LSP的启动子元件和/或增强子元件。这些转录调控元件中的每一个都包含启动子、增强子和任选的其他核苷酸。

在一个实施方案中，转录调控元件包含增强子，该增强子是人载脂蛋白E(ApoE)肝基因座控制区(HCR；Miao et al(2000),Molecular Therapy 1(6):522)或其片段。在一个实施方案中，转录调控元件包含HCR增强子的片段，该片段是长度为至少80个、至少90个、至少100个、小于192个、80至192个、90至192个、100至250个或117至192个核苷酸的片段。任选地，HCR增强子的片段长度为100至250个核苷酸。在另一个实施方案中，HCR增强子的片段是长度为至少150个、至少190个、至少230个、小于400个、150至400个、190至370个、230至340个、250至340个或约321个核苷酸的片段。任选地，HCR增强子的片段长度为250至340个核苷酸。

在SEQ ID NO:11和16中描述了合适的HCR增强子元件片段。任选地，转录调控元件包含长度为至少80个、至少90个、至少100个、小于192个、80至192个、90至192个、100至250个或117至192个核苷酸的增强子，并且增强子包含与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％，至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的多核苷酸序列。任选地，转录调控元件包含长度为117至192个核苷酸的增强子，并且增强子包含与SEQ ID NO.11至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的多核苷酸序列。任选地，转录调控元件包含与SEQ ID NO:11的至少90个、至少100个或至少110个核苷酸的片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的增强子。任选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的增强子。任选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO:11至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的增强子。任选地，多核苷酸包含SEQ ID NO:11的增强子。任选地，转录调控元件包含长度等于或小于321个核苷酸、等于或小于192个核苷酸或等于或小于117个核苷酸的HCR增强子片段并包含SEQ ID NO:11。

在另一个实施方案中，转录调控元件包含长度为至少150个、至少190个、至少230个、小于400个、150至400个、190至370个、230至340个、250至340个或约318个核苷酸的增强子，并且增强子包含与SEQ ID NO:16至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的多核苷酸序列。任选地，转录调控元件包含长度为250至340个核苷酸的增强子，并且增强子包含与SEQ ID NO:16至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的多核苷酸序列。任选地，转录调控元件包含与SEQ ID NO:16的至少250个核苷酸的片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的增强子。任选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO:16至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的增强子。任选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO:16至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的增强子。任选地，多核苷酸包含SEQ ID NO:16的增强子。

在一个实施方案中，转录调控元件包含启动子，该启动子是人α-1抗胰蛋白酶启动子(A1AT；Miao et al(2000),Molecular Therapy 1(6):522)或其片段。任选地，A1AT启动子的片段长度为至少100个、至少120个、至少150个、至少180个、小于255个、100至255个、150至225个、150至300个或180至255个核苷酸。任选地，A1AT启动子的片段长度为150至300个核苷酸。在另一个实施方案中，A1AT启动子片段的长度为至少200个、至少250个、至少300个、小于500个、200至500个、250至500个或350至450个核苷酸。任选地，A1AT启动子的片段长度为350至450个核苷酸。

在SEQ ID NO:12和15中描述了合适的A1AT启动子片段。任选地，转录调控元件包含长度为至少100个、至少120个、至少150个、至少180个、小于255个、100至255个、150至300个或180至255个核苷酸的启动子，并且启动子包含与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的多核苷酸序列。任选地，转录调控元件包含长度为180至255个核苷酸的启动子，并且启动子包含与SEQ ID NO:12至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的多核苷酸序列。任选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO:12的至少100个、至少120个或至少150个核苷酸的片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的启动子。任选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的启动子。任选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO:12至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的启动子。任选地，多核苷酸包含SEQ ID NO:12的启动子。任选地，转录调控元件包含长度等于或小于418个核苷酸、等于或小于255个核苷酸或等于或小于185个核苷酸的A1AT启动子并包含SEQ ID NO:12。

在另一个实施方案中，转录调控元件包含长度为至少200个、至少250个、至少300个、小于500个、200至500个、250至500个、350至450个或约418个核苷酸的启动子，并且启动子包含与SEQ ID NO:15至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的多核苷酸序列。任选地，转录调控元件包含长度为350至450个核苷酸的启动子，并且启动子包含与SEQ ID NO:15至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的多核苷酸序列。任选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO:15的至少350个核苷酸的片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的启动子。任选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO:15至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的启动子。任选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO:15至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的启动子。任选地，多核苷酸包含SEQ ID NO:15的启动子。

如果意欲让多核苷酸在肝脏中表达，则启动子可以是肝脏特异性启动子。任选地，启动子是人肝脏特异性启动子。“肝脏特异性启动子”是在肝细胞中提供比一般其他细胞以更高水平表达的启动子。例如，本领域技术人员可以通过将多核苷酸在肝细胞(例如Huh-7细胞)中的表达与多核苷酸在来自其他组织的细胞中的表达进行比较来确定启动子是否是肝脏特异性启动子。如果与来自其他组织的细胞相比，肝细胞中的表达水平更高，则该启动子是肝脏特异性启动子。任选地，如果转录调控元件或启动子与来自至少一种其他器官或组织的细胞相比促进肝细胞中更高水平的蛋白质表达并且转录调控元件或启动子促进来自至少一种其他器官或组织的细胞中的蛋白质表达的水平是转录调控元件或启动子促进肝细胞中蛋白质表达的水平的小于40％、小于30％、小于25％、小于15％、小于10％或小于5％，则该转录调控元件或启动子是肝脏特异性的。任选地，来自至少一种其他器官或组织的细胞是肾细胞、胰腺细胞、乳腺细胞、神经母细胞瘤细胞、肺细胞和早期B细胞中的至少一种。任选地，来自至少一种其他器官或组织的细胞是肾细胞、胰腺细胞、乳腺细胞、神经母细胞瘤细胞、肺细胞和早期B细胞。任选地，来自至少一种其他器官或组织的细胞是HEK293T细胞、PANC1细胞、BxPC-3细胞、MCF7细胞、1643细胞、MRC-9细胞和697细胞中的至少一种。任选地，来自至少一种其他器官或组织的细胞是HEK293T细胞、PANC1细胞、BxPC-3细胞、MCF7细胞、1643细胞、MRC-9细胞和697细胞。

在一个实施方案中，本发明的多核苷酸可以提供在肝脏中特异性表达的GCase。在此类实例中，与至少一种其他组织类型或器官相比，多核苷酸可在肝细胞中促进显著更多的GCase表达。在一个实例中，提供在肝脏中特异性表达的GCase的本发明的多核苷酸包含肝脏特异性启动子。

任选地，与来自至少一种其他器官或组织的细胞相比，本发明的多核苷酸可以提供在肝细胞中以更高水平表达的GCase，并且使得当在同一测定中测量时，GCase在该一种其他器官或组织中以肝细胞中GCase表达水平的小于40％、小于30％、小于25％、小于15％、小于10％或小于5％的水平表达。

任选地，来自至少一种其他器官或组织的细胞是肾细胞、胰腺细胞、乳腺细胞、神经母细胞瘤细胞、肺细胞和早期B细胞中的至少一种。任选地，来自至少一种其他器官或组织的细胞是肾细胞、胰腺细胞、乳腺细胞、神经母细胞瘤细胞、肺细胞和早期B细胞。任选地，来自至少一种其他器官或组织的细胞是HEK293T细胞、PANC1细胞、BxPC-3细胞、MCF7细胞、1643细胞、MRC-9细胞和697细胞中的至少一种。任选地，来自至少一种其他器官或组织的细胞是HEK293T细胞、PANC1细胞、BxPC-3细胞、MCF7细胞、1643细胞、MRC-9细胞和697细胞。

包含多核苷酸的病毒颗粒

本发明进一步提供了包含重组基因组的病毒颗粒，所述重组基因组包含本发明的多核苷酸。出于本发明的目的，术语“病毒颗粒”是指病毒粒子的全部或部分。例如，病毒颗粒包含重组基因组并且可以进一步包含衣壳。病毒颗粒可以是基因治疗载体。在本文中，术语“病毒颗粒”和“载体”可互换使用。就本申请而言，“基因治疗”载体是可用于基因治疗的病毒颗粒，即包含在宿主细胞施用后表达转基因(例如GBA核苷酸序列)所需的所有功能元件的病毒颗粒。

合适的病毒颗粒包括细小病毒、逆转录病毒、慢病毒或单纯疱疹病毒。细小病毒可以是腺相关病毒(AAV)。病毒颗粒优选为重组腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体。更优选地，病毒颗粒是AAV病毒颗粒。除非上下文另有明示，否则术语AAV和rAAV在本文中可互换使用。

所有已知AAV血清型的基因组结构都非常相似。AAV的基因组是一种线性单链DNA分子，长度小于约5,000个核苷酸。反向末端重复序列(ITR)侧接非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列。VP蛋白(VP1、VP2和VP3)形成衣壳。末端约145nt(ITR)是自互补的，并被组织起来，从而形成一个能量稳定的形成T形发夹的分子内双链体。这些发夹结构作为病毒DNA复制的起点起作用，用作细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中野生型(wt)AAV感染后，Rep基因(即编码Rep78和Rep52蛋白)分别从P5启动子和P19启动子表达，并且这两种Rep蛋白都在病毒基因组的复制中起作用。Rep ORF中的剪接事件导致四种Rep蛋白(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已经表明哺乳动物细胞中未经剪接的mRNA编码的Rep78和Rep52蛋白足以产生AAV载体。同样，在昆虫细胞中，Rep78和Rep52蛋白足以产生AAV载体。

本发明的重组病毒基因组可以包含ITR。本发明的AAV载体可能仅用一个ITR起作用。因此，病毒基因组包含至少一个ITR，但更典型地包含两个ITR(通常在病毒基因组的任一端都有一个，即一个在5'末端，一个在3'末端)。本发明的多核苷酸和一个或多个ITR之间可能存在间插序列。可以将多核苷酸掺入位于两个常规ITR之间或位于带有两个D区的工程改造的ITR任一侧上的病毒颗粒中。

可用于本发明产生AAV载体的AAV序列可以源自任何AAV血清型的基因组。通常，AAV血清型在氨基酸和核酸水平具有显著同源性的基因组序列，提供一组相同的遗传功能，产生物理和功能基本上等效的病毒粒子，并通过几乎相同的机制复制和组装。有关各种AAV血清型的基因组序列和基因组相似性的概述，请参见例如GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；Chiorini et al,1997；Srivastava et al,1983；Chiorini et al,1999；Rutledge et al,1998；和Wu et al,2000。AAV血清型1、2、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11或12可用于本发明。当用于生产基因治疗载体时，来自AAV血清型的序列可能会发生突变或工程改造。

任选地，AAV载体包含源自AAV1、AAV2、AAV4和/或AAV6的ITR序列。优选地，ITR序列是AAV2 ITR序列。在本文中，术语AAVx/y是指包含基因组成分的病毒颗粒，例如至少来自AAVx的ITR(其中x是AAV血清型编号)并具有来自AAVy的衣壳(其中y是相同或不同血清型的编号)。例如，AAV2/8载体可以包含来自AAV2毒株的病毒基因组的一部分(包括ITR)和来自AAV8毒株的衣壳。

在一个实施方案中，病毒颗粒是包含衣壳的AAV病毒颗粒。AAV衣壳通常由三种蛋白质VP1、VP2和VP3形成。VP1的氨基酸序列包含VP2的序列。VP1中不构成VP2的一部分的部分被称为VP1unique或VP1U。VP2的氨基酸序列包含VP3的序列。VP2中不构成VP3一部分的部分称为VP2unique或VP2U。任选地，病毒颗粒包含嗜肝衣壳或嗜CNS衣壳。病毒颗粒(衣壳)对于特定组织是否具有嗜性可以例如通过施用表达标志物基因如萤光素酶的此类颗粒并在多个时间点进行体内成像来评估(例如如Zincarelli et al(2008),Molecular Therapy,16:1073-1080中所述)。分别在肝脏或CNS组织中驱动强标志物表达的颗粒，特别是如果与其他组织中的较少表达相反，将被认为是嗜肝的或嗜CNS的。

在一些实施方案中，嗜肝衣壳可以是AAV3来源或AAV3B来源的衣壳。任选地，嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:19、20或24的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段至少98％、至少99％或至少99.5％相同的序列。任选地，嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:19至少99％相同的序列。任选地，嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:20至少99％相同的序列。任选地，嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:24至少99％相同的序列。任选地，CNS嗜性衣壳包含与SEQ ID NO:21的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段至少98％、至少99％、至少99.5％相同的序列。任选地，嗜CNS衣壳包含与SEQ ID NO:21至少99％相同的序列。本发明的病毒颗粒可以是“杂合”颗粒，其中t病毒ITR和病毒衣壳来自不同的细小病毒，例如不同的AAV血清型。优选地，病毒ITR和衣壳来自不同的AAV血清型，在这种情况下，此类病毒颗粒被称为转衣壳化或假型化。同样，细小病毒可具有“嵌合”衣壳(例如，包含来自不同细小病毒，优选不同AAV血清型的序列)或“靶向”衣壳(例如，定向嗜性)。

在一些实施方案中，重组AAV基因组包含完整的ITR，包含功能性末端分解位点(TRS)。这种AAV基因组可能包含一个或两个可分解的ITR，即ITR包含一个功能性TRS，在该功能性TRS上可以发生位点特异性切口以产生一个游离的3'羟基，它能够作为DNA聚合酶解开和复制ITR的底物。优选地，重组基因组是单链的(即，它以单链形式包装到病毒颗粒中)。任选地，重组基因组不以自我互补构型包装，即基因组不含具有在病毒颗粒中退火的大量自我互补部分的单个共价连接的多核苷酸链。或者，重组基因组可以“单体双链体”形式包装。“单体双链体”描述于WO 2011/122950中。基因组可以包装成在病毒颗粒中退火的两个基本上互补但非共价连接的多核苷酸。

病毒颗粒还可包含多聚腺苷酸序列。多聚腺苷酸序列可以位于编码功能性GCase蛋白的核苷酸序列的下游。多聚腺苷酸序列可以是牛生长激素多聚腺苷酸序列(bGHpA——SEQ ID NO:23)。多聚腺苷酸序列的长度可以为250至270个核苷酸。

病毒颗粒还可包含内含子序列，例如病毒内含子序列，任选地SV40内含子序列(SEQ ID NO:22)。

在一个实施方案中，病毒颗粒包含多核苷酸序列，多核苷酸序列包含启动子元件、内含子序列(例如SV40内含子序列)、GBA核苷酸序列和多聚腺苷酸序列(例如bGHpA序列)。在这样的实施方案中，内含子序列(例如SV40内含子序列)可以位于启动子元件和GBA核苷酸序列之间。在这样的实施方案中，多聚腺苷酸序列(例如bGHpA序列)可以位于GBA核苷酸序列的下游。

本发明的病毒颗粒任选地在宿主细胞中高表达GCase。例如，与以相当的量转导入相当的Huh-7细胞群的包含SEQ ID NO:9的GBA核苷酸序列的其他方面相同病毒颗粒相比，本发明的病毒颗粒在Huh-7细胞中转导后以更高水平表达GCase蛋白或其片段。任选地，在转导入Huh-7细胞群后，本发明的病毒颗粒以比包含SEQ ID NO:9的GBA核苷酸序列和SEQID NO:10的转录调控元件或SEQ ID NO:12的启动子的病毒颗粒更高的水平表达GCase蛋白。任选地，与以相当的量转导入相当的Huh-7细胞群的包含SEQ ID NO:9的GBA核苷酸序列和SEQ ID NO:10的转录调控元件或SEQ ID NO:12的启动子序列的相当的病毒颗粒相比，本发明的病毒颗粒在转导入Huh-7细胞群后以更高水平表达GCase蛋白或其片段。任选地，在转导入Huh-7细胞群后，病毒颗粒以与以相当的量转导到相当的Huh-7细胞群的包含SEQ IDNO:9的GBA核苷酸序列和SEQ ID NO:13的启动子元件的病毒颗粒相当的水平(即非统计学显著不同的水平)表达GCase蛋白。在此类实施方案中，术语“相当的病毒颗粒”是指除了相当的病毒颗粒包含不同的GBA核苷酸序列和不同的转录调控元件之外，与本发明的AAV病毒颗粒相同的病毒颗粒。任选地，相当的病毒颗粒包含与本发明的AAV病毒颗粒相同的转录调控元件。任选地，使用显色测定法例如上面讨论的荧光测定法来评估活性。

在一个实施方案中，提供了一种包含多核苷酸序列的病毒颗粒，该多核苷酸序列包含：

a)与SEQ ID NO:5具有至少98％序列同一性的GBA核苷酸序列，其可操作地连接至：

b)与SEQ ID NO:14具有至少98％序列同一性的转录调控序列；

其中病毒颗粒还包含与SEQ ID NO:20具有至少98％同一性的衣壳。

b)与SEQ ID NO:10具有至少98％序列同一性的转录调控序列；

组合物、方法及用途

在本发明的另一方面，提供了包含本发明的多核苷酸或载体/病毒颗粒和药学上可接受的赋形剂的组合物。

药学上可接受的赋形剂可以包括承载体、稀释剂和/或其他药用剂、药物剂或佐剂等。任选地，药学上可接受的赋形剂包括盐水溶液。任选地，药学上可接受的赋形剂包括人血清白蛋白。

本发明进一步提供了一种在受试者中表达GBA核苷酸序列并实现稳定的GCase活性和/或在受试者中提供与来自GCase酶替代疗法的生物利用度相比更高的GCase生物利用度的方法，其中在施用后2周的时间段内测量生物利用度，其中所述方法包括向受试者施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物。

本发明进一步提供了用于治疗方法的本发明的多核苷酸、载体/病毒颗粒或组合物。任选地，治疗方法包括向患者施用有效量的本发明的多核苷酸或载体/病毒颗粒。

本发明进一步提供了一种治疗方法，包括向患者施用有效量的本发明的多核苷酸或载体/病毒颗粒。

本发明进一步提供本发明的多核苷酸、载体/病毒颗粒或组合物在制备用于治疗方法的药物中的用途。任选地，治疗方法包括向患者施用有效量的本发明的多核苷酸或载体/病毒颗粒。任选地，治疗方法是基因治疗。“基因疗法”涉及施用本发明的载体/病毒颗粒，该载体/病毒颗粒能够在其施用的宿主中表达转基因(例如GBA核苷酸序列)。

任选地，治疗方法是治疗与GCase缺乏症相关的疾病的方法。如上所讨论的，GCase缺乏症可能导致巨噬细胞中葡糖脑苷脂的积累，这些巨噬细胞会浸润许多重要器官，从而导致多种疾病，包括突触核病(synucleopathy)(如WO08/144591中所讨论的)或帕金森病。任选地，治疗方法是治疗帕金森病或突触核病的方法。

任选地，治疗方法是治疗溶酶体贮积症如戈谢病(GD)、例如I型、II型或III型GD的方法。优选地，溶酶体贮积症的特征在于瘀伤、疲劳、贫血、低血小板计数和肝脾肿大。任选地，治疗方法是治疗GD、例如I型GD的方法。在一些实施方案中，患者是患有GD、例如I型GD的患者。任选地，患者具有针对重组GCase的抗体或抑制剂(例如伊米苷酶、维拉苷酶alfa或taliglucerase alfa)，患者之前曾用其作为酶替代疗法的一部分进行治疗。任选地，静脉内施用多核苷酸和/或载体/病毒颗粒。任选地，多核苷酸和/或载体/病毒颗粒仅用于向患者施用一次(即单次剂量)。

当GD以上述方法“得到治疗”时，这意味着I型GD的一种或多种症状得到改善。这并不意味着I型GD的症状已完全治愈，因此它们不再存在于患者身上，但是在某些方法中，情况可能如此。因此，在所有情况下，术语“治疗”可以替换为术语“改善”。治疗方法可能导致I型GD的一种或多种症状比治疗前更轻。任选地，相对于施用前的情况，治疗方法导致患者血液中循环GCase的量/浓度增加，和/或在给定体积的血液和/或巨噬细胞内可检测到的GCase活性的总体水平增加。在一个实施方案中，相对于施用前的情况，治疗方法导致以下一项或多项：血红蛋白浓度增加；血小板计数增加；脾脏大小减小；肝脏大小减小。

此外，本发明的方法可以“预防”疾病，例如戈谢病。戈谢病通常与各种组织中葡糖脑苷脂酶的积累有关，如果本发明的方法在年轻受试者(例如青少年、青年、儿童或婴儿)上进行，则应该有可能防止戈谢病的发生。因此，在所有情况下，术语“治疗”可以替换为术语“预防”。

“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需治疗结果的量，例如提高受试者中功能性GCase的水平(从而导致功能性GCase处于足以改善GD(例如I型GD)症状的水平)。

任选地，以每公斤患者体重小于1×10¹¹个、小于1×10¹²个、小于5×10¹²个、小于2×10¹²个、小于1.5×10¹²个、小于3×10¹²个、小于1×10¹³个、小于2×10¹³个或小于3×10¹³个载体基因组的剂量施用载体/病毒颗粒。任选地，选择施用的载体/病毒颗粒的剂量使得受试者以未患GD的健康受试者水平的10％-90％、20％-80％、30％-70％、25％-50％、20％-150％、30％-140％、40％-130％、50％-120％、60％-110％或70％-100％的水平表达GCase。

任选地，施用多核苷酸、病毒颗粒或组合物的患者可具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9μmol/h/ml的GCase活性水平。任选地，使用对GCase特异的荧光底物测量GCase活性。任选地，GCase活性用4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷(4MU-Glc)作为底物进行荧光测定。任选地，测量受试者的血清、血浆、巨噬细胞、脾脏、肝脏和/或骨髓中的GCase活性。

在一个实施方案中，可以如下用4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃葡糖苷(4MU-Glc)作为底物荧光测定GCase活性：(1)收集血清样品或收获组织(肝脏、脾脏、骨髓)并速冻和裂解；(2)将组织裂解液或血清/血浆样品在50mM柠檬酸钠、25mM牛磺胆酸盐、pH＝5.75、6mM 4MU-Glc中混合，37℃混合30分钟；(3)加入一体积(100μl)终止液(0.5M甘氨酸，0.3M NaOH，pH10.0)终止反应；(4)使用Spectramax I3X(Molecular devices)并使用分别为365nm和445nm的激发和发射波长评估相对荧光水平(RFU)，然后基于4-甲基伞形酮(4-MU,Sigma-Aldrich)标准曲线将荧光水平转换为纳摩尔/h/mL。

任选地，当在施用后的相同时间点在相同测定中测量时，与在施用有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中测量的活性相比，施用多核苷酸、病毒颗粒或组合物的患者在施用后至少5周、至少10周、至少15周、至少20周、至少25周、至少30周或至少35周可具有更高的GCase活性水平。任选地，当在施用后的相同时间点在相同测定中测量时，与在施用有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中测量的活性相比，施用多核苷酸、病毒颗粒或组合物的患者的GCase活性水平在施用后至少5周、至少10周、至少15周、至少20周、至少25周、至少30周或至少35周可为10倍、20倍、50倍、100倍或1000倍。

任选地，选择施用的载体/病毒颗粒的剂量，使得与来自GCase酶替代疗法的生物利用度相比，受试者具有更高的GCase生物利用度。生物利用度可以通过本领域的任何已知方法测量(例如估计或计算)。可以测量受试者的血清、巨噬细胞、脾脏、肝脏和/或骨髓中GCase的生物利用度。在一个实例中，可以使用根据实施例8的曲线下面积(“AUC”)方法来估计生物利用度。在一个实例中，可以通过估计受试者的血清、血浆、巨噬细胞、脾脏、肝脏和/或骨髓中可用的总GCase活性来估计生物利用度。任选地，它是在定义的时间段内计算的，是指该时间段内GCase的总活性或浓度。任选地，使用对GCase特异的荧光底物测量GCase活性。任选地，GCase活性用4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷(4MU-Glc)作为底物进行荧光测定。任选地，测量受试者的血清、血浆、巨噬细胞、脾脏、肝脏和/或骨髓中的GCase活性。任选地，测量受试者的白细胞中的GCase活性。任选地，生物利用度是在施用后2周的时间段内测量的。任选地，生物利用度是在施用后5周的时间段内测量的。任选地，测量血清中的生物利用度。在一个实例中，当在施用后的相同时间点在相同测定中测量时，与在施用有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中测量的生物利用度相比，在施用后至少5周、至少10周、至少15周、至少20周、至少25周、至少30周或至少35周的时间段内在受试者中实现更高的GCase生物利用度。

任选地，施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物的患者(例如，患有与GCase缺乏症相关的疾病或病症的患者)在施用后可具有降低的己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平，优选当己糖神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平在施用后6周、8周、10周或12周测量时。与施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物时的(起始)己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平相比，己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平可降低2倍或更多、3倍或更多、4倍或更多、5倍或更多、6倍或更多、2至3倍、2至4倍、2至5倍、2至6倍或3至5倍。例如，在施用本发明的多核苷酸病毒颗粒或组合物后(例如施用后6周、8周、10周或12周)，与施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物时的(起始)己糖神经酰胺和/或己糖鞘氨醇水平相比，患者的己糖神经酰胺和/或己糖鞘氨醇水平可以是50％或更低、40％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低。任选地，当与健康受试者或没有与GCase缺乏症相关的疾病或病症的受试者相比时，患者的己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平可能增加。例如，测量患者/受试者的脾脏、肝脏和/或骨髓中的己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平。可以测量患者/受试者的血清和/或白细胞(例如巨噬细胞)中的己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平。测量己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平的方法是本领域已知的，并且优选使用质谱法(LC/MS分析)、例如通过实施例9中描述的方法测量己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平。任选地，己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平(例如在患者/受试者的血清、白细胞(例如巨噬细胞)、脾脏、肝脏和/或骨髓中)的降低大于从GCase酶替代疗法实现的降低，优选当在治疗开始后至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平时。例如可以将本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物在施用后至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或至少12周(例如在12周时)后的水平与从首次施用GCase酶替代疗法分别至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或在至少12周(例如在12周时)的水平进行比较。作为一个具体实例，可以在施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物后至少12周(例如在12周时)测量己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平，并将其与首次施用GCase酶替代疗法至少12周(例如在12周时)后测量的水平进行比较。优选地，在施用后的同一时间点在同一测定中测量己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇的水平。任选地，可以每两周施用GCase酶替代疗法。任选地，在施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物后受试者(或患者)中己糖神经酰胺水平的降低使得(例如血清、白细胞(例如巨噬细胞)、肝脏和/或脾脏中的)己糖神经酰胺水平不超过在健康受试者或未患有与GCase缺乏症相关的疾病或病症的受试者中测得的己糖神经酰胺水平的200％、150％或125％。在一个实例中，己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平的降低可分别代表葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平的降低。例如，己糖神经酰胺的减少可以代表葡糖神经酰胺的减少。作为进一步的实例，己糖基鞘氨醇水平的降低可以代表葡糖神经鞘氨醇水平的降低。

在一个实例中，己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平的降低分别是葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平的降低。换言之，施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物的患者(例如，患有与GCase缺陷相关的疾病或病症的患者)在施用后可能具有降低的葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平，优选在施用后6周、8周、10周或12周测量葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平。与施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物时的(起始)葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平相比，葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平可降低2倍或更多、3倍或更多、4倍或更多、5倍或更多、6倍或更多、2至3倍、2至4倍、2至5倍、2至6倍或3至5倍。例如，与施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物时的(起始)葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平相比，在施用本发明的多核苷酸病毒颗粒或组合物后(例如施用后6周、8周、10周或12周)，患者的葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平可以是50％或更低、40％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低。任选地，当与健康受试者或不患有与GCase缺乏症相关的疾病或病症的受试者相比时，患者的葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平可能增加。例如，测量患者/受试者的脾脏、肝脏和/或骨髓中的葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平。可以测量患者/受试者的血清和/或白细胞(例如巨噬细胞)中的葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平。测量葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平的方法是本领域已知的，并且葡糖神经酰胺和/或葡糖基鞘氨醇的水平优选使用质谱法(LC/MS分析)测量，例如通过实施例9中描述的方法。任选地，葡萄糖神经酰胺和/或葡萄糖神经鞘氨醇水平(例如在患者/受试者的血清、白细胞(例如巨噬细胞)、脾脏、肝脏和/或骨髓中)的降低大于GCase酶替代疗法所实现的降低，优选当在治疗开始后至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平时。例如可以将本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物施用后至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或至少12周(例如在12周时)后的水平与从首次施用GCase酶替代疗法分别至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或在至少12周(例如在12周时)的水平。作为一个具体实例，可以在施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物后至少12周后(例如在12周时)测量葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平，并与首次施用GCase酶替代疗法后至少12周(例如在12周时)测得的水平进行比较。优选地，在施用后的同一时间点在同一测定中测量葡萄糖神经酰胺和/或葡萄糖神经鞘氨醇水平。任选地，可以每两周施用GCase酶替代疗法。任选地，在施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物后受试者(或患者)中葡糖神经酰胺水平的降低使得葡糖神经酰胺水平(例如在血清、白细胞(例如巨噬细胞)、肝脏和/或脾脏)不超过在健康受试者或未患有与GCase缺乏症相关的疾病或病症的受试者中测得的葡糖神经酰胺水平的200％、150％或125％。

任选地，施用本发明的多核苷酸、病毒颗粒或组合物的患者(例如，患有与GCase缺乏症相关的疾病或病症的患者)在施用后可以显示肝脏中贮积细胞和/或活化的巨噬细胞数量减少，优选在施用后至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或至少12周(例如在12周时)后对细胞进行计数时。肝脏中贮积细胞和/或活化巨噬细胞数量的减少可能表明炎症减少并因此具有治疗益处。活化巨噬细胞的数量可以通过测量CD68^阳性细胞的数量来指示或估计。可以通过本领域已知的方法，例如实施例9中描述的方法来鉴定贮积细胞和CD68^阳性细胞。

“GCase酶替代疗法”可以指包括向受试者施用GCase多肽的任何疗法。GCase多肽可以是野生型，例如具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的GCase多肽。GCase多肽可以以任何合适的剂量施用，任选地以40至100U/kg BW、50至80U/kg BW、60至70U/kg BW或约60U/kgBW的剂量施用。GCase多肽可以通过任何合适的途径施用，任选地通过静脉注射或皮下注射施用。

至少X％(例如至少20％)的GCase活性水平是指从例如脾脏或骨髓的样品测得的正常GCase水平范围的至少X％(例如20％)的GCase活性水平。本领域技术人员将容易理解参考正常GCase活性水平的百分比的含义，其在常规临床实践中通过例如与来自健康受试者的对照样品进行比较。

术语“稳定的GCase活性”或“稳定的GCase活性水平”是指在至少5周的连续时间段内维持在或高于某一水平的GCase活性水平。换言之，活性可能会在所述活性水平之上波动，但只要它保持在所述最低阈值之上，就仍被认为是稳定的。在一些实施方案中，GCase活性水平在至少10周、至少15周、至少20周、至少30周、至少40周或至少50周的连续时间段内维持在或高于某一水平。例如，如果活性水平在至少5周的连续时间段内保持至少20％，则患者具有至少20％的稳定的GCase活性水平。在这样的实例中，GCase活性水平在至少5周后可继续为至少20％，并因此在至少10周、至少15周、至少20周、至少30周或至少40周或至少50周的累积连续时间段内保持在至少20％。如果GCase活性水平在至少5周的连续时间段内保持在或高于某一水平，则患者具有稳定的GCase活性水平。任选地，相对于健康受试者的GCase活性，施用多核苷酸、病毒颗粒或组合物的患者可具有至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少50％的稳定的GCase活性水平。任选地，施用多核苷酸、病毒颗粒或组合物的患者可具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9μmol/h/ml的稳定的GCase活性水平。任选地，使用对GCase特异的荧光底物测量GCase活性。任选地，GCase活性用4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷(4MU-Glc)作为底物进行荧光测定。任选地，测量受试者的血清、巨噬细胞、脾脏、肝脏和/或骨髓中的GCase活性。

任选地，在施用多核苷酸、病毒颗粒或组合物后至少5周、至少10周、至少15周、至少20周、至少30周、至少40周或至少50周后，GCase活性水平是稳定的。例如，如果患者在施用多核苷酸、病毒颗粒或组合物至少5周后具有至少20％的稳定的GCase活性水平，则存在这样的至少20％的GCase活性水平，其中在施用后最初至少5周后至少5周、至少10周、至少15周、至少20周、至少30周或至少40周或至少50周的连续时间段内维持在至少20％。

任选地，在施用多核苷酸、病毒颗粒或组合物后至少5周、至少10周、至少20周、至少30周、至少40周或至少50周后，GCase活性水平在或高于某一水平(例如20％、25％、30％、35％或40％；和/或至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9μmol/h/ml)。例如，在施用多核苷酸、病毒颗粒或组合物后约4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周、26周、27周、28周、29周、30周、31周、32周、33周、34周、35周、36周、37周、38周、39周、40周、41周、42周、43周、44周、45周、46周、47周、48周、49周、50周、51周或52周的时间点，GCase活性水平在或高于某个水平(例如20％、25％、30％、35％或40％；和/或至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9μmol/h/ml)。

现在将参考以下实施例描述本发明，这些实施例仅是说明性的，不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

序列表

本发明的方面

进一步在以下方面描述本发明。

1.包含GBA核苷酸序列的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码β-葡糖脑苷脂酶(GCase)蛋白或其片段，并且其中至少一部分GBA核苷酸序列不是野生型。

2.方面1的多核苷酸，其中不是野生型的GBA核苷酸序列的部分是密码子优化的。

3.方面1或2的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码GCase蛋白或其片段并且包含与SEQ ID NO:1-8中任一项的核苷酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的序列。

4.方面1至3中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的序列或编码具有GCase活性的GCase蛋白的SEQ ID NO:1的变体。

5.方面4的多核苷酸，其中除了SEQ ID NO:1的变体包含核苷酸置换使得GCase蛋白相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个或最多10个氨基酸置换以外，SEQ ID NO:1的变体与SEQ ID NO:1相同。

6.方面4或5的多核苷酸，其中SEQ ID NO:1的变体相对于SEQ ID NO:1的序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个、最多10个、最多20个或最多30个核苷酸置换。

7.方面4至6中任一项的多核苷酸，其中SEQ ID NO:1的变体相对于SEQ ID NO:1的序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个或最多6个核苷酸置换。

8.方面4至7中任一项的多核苷酸，其中SEQ ID NO:1的变体相对于SEQ ID NO:1的序列具有最多4个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多3个的氨基酸置换的GCase蛋白。

9.方面4至8中任一项的多核苷酸，其中SEQ ID NO:1的变体相对于SEQ ID NO:1的序列具有最多3个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多2个氨基酸置换的GCase蛋白。

10.方面4至9中任一项的多核苷酸，其中SEQ ID NO:1的变体相对于SEQ ID NO:1的序列具有1个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多1个氨基酸置换的GCase蛋白。

11.方面1至3中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:5的序列或编码具有GCase活性的GCase蛋白的SEQ ID NO:5的变体。

12.方面11的多核苷酸，其中除了SEQ ID NO:5的变体包含核苷酸置换使得GCase蛋白相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个或最多10个氨基酸置换之外，SEQ ID NO:5的变体与SEQ ID NO:5相同。

13.方面11或12的多核苷酸，其中SEQ ID NO:5的变体相对于SEQ ID NO:5的序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个、最多10个、最多20个或最多30个核苷酸置换。

14.方面11至13中任一项的多核苷酸，其中SEQ ID NO:5的变体相对于SEQ ID NO:5的序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个或最多6个核苷酸置换。

15.方面11至14中任一项的多核苷酸，其中SEQ ID NO:5的变体相对于SEQ ID NO:5的序列具有最多4个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多3个氨基酸置换的GCase蛋白。

16.方面11至15中任一项的多核苷酸，其中SEQ ID NO:5的变体相对于SEQ ID NO:5的序列具有最多3个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多2个氨基酸置换的GCase蛋白。

17.方面11至16中任一项的多核苷酸，其中SEQ ID NO:5的变体相对于SEQ ID NO:5的序列具有1个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多1个氨基酸置换的GCase蛋白。

18.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个或最多5个氨基酸置换的GCase蛋白。

19.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多3个氨基酸置换的GCase蛋白。

20.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多2个氨基酸置换的GCase蛋白。

21.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有最多1个氨基酸置换的GCase蛋白。

22.包含GBA核苷酸序列的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码GCase蛋白或其片段并且包含与SEQ ID NO:1-8中任一个的至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、小于1611个、1000至1494个、1000至1611个、1300至1494个、1300至1611个、约1494个或约1611个核苷酸的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的序列。

23.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1-8中任一个的至少1300个核苷酸的片段至少98％相同的序列。

24.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1-8中任一个的至少1300个核苷酸的片段至少99％相同的序列。

25.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1-8中任一个的核苷酸序列至少98％相同的序列。

26.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1-8中任一个的核苷酸序列至少99％相同的序列。

27.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1的至少1300个核苷酸的片段至少98％相同的序列。

28.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1的至少1300个核苷酸的片段至少99％相同的序列。

29.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1至少98％相同的序列。

30.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1至少99％相同的序列。

31.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:5至少98％相同的序列。

32.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:5至少99％相同的序列。

33.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列中的至少一部分是密码子优化的。

34.方面33的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列的密码子优化的部分是针对在人肝细胞中表达进行密码子优化的。

35.方面33的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列是针对在人肝细胞中表达进行密码子优化的。

36.方面2至35中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列的密码子优化的部分是连续部分。

37.方面2至36中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列的密码子优化的部分的长度为至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、1000至1494个、1300至1494个或约1494个核苷酸。

38.方面2至37中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列的密码子优化的部分对应于成熟GCase蛋白。

39.方面2至38中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列的密码子优化的部分不编码全部信号肽或信号肽的一部分。

40.方面2至39中任一项的多核苷酸，其中与野生型GBA核苷酸序列的相应部分相比，GBA核苷酸序列或GBA核苷酸序列的密码子优化的部分包含的CpG数量减少。

41.方面40的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列或GBA核苷酸序列的密码子优化的部分包含小于40个、小于20个、小于18个、小于10个或小于5个CpG。

42.方面41的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列或GBA核苷酸序列的密码子优化的部分每100个核苷酸包含小于5个、小于4个、小于3个或小于2个CpG。

43.方面41或42的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列或GBA核苷酸序列的密码子优化的部分不含CpG。

44.方面40至43中任一项的多核苷酸，其中野生型GBA核苷酸序列是SEQ ID NO:9。

45.方面2至44中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列的密码子优化的部分与SEQ ID NO:1-4中任一个的至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、1000至1494个、1300至1494个或约1494个核苷酸的片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。

46.方面45的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列的密码子优化的部分与SEQ ID NO:1-4中任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。

47.方面2至46的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列的密码子优化的部分与SEQ IDNO:1的至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、1000至1494个、1300至1494个或约1494个核苷酸的片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。

48.方面47的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列的密码子优化的部分与SEQ ID NO:1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。

49.方面2至48的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列的密码子优化的部分与SEQ IDNO:1的至少1300个核苷酸的片段至少99.5％、至少99.8％或100％相同。

50.方面49的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列的密码子优化的部分与SEQ ID NO:1至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。

51.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含未经密码子优化的部分。

52.方面51的多核苷酸，其中未经密码子优化的部分编码全部GCase信号肽或GCase信号肽的一部分。

53.方面51或52的多核苷酸，其中未经密码子优化的部分为至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、小于200个、小于170个、小于140个或约117个核苷酸。

54.方面51至53中任一项的多核苷酸，其中未经密码子优化的部分包含1个或多个CpG。

55.前述方面中任一项的多核苷酸，其中多核苷酸还包含转录调控元件。

56.方面55的多核苷酸，其中转录调控元件包含肝脏特异性启动子。

57.方面55或56的多核苷酸，其中转录调控元件包含A1AT启动子或A1AT启动子的片段。

58.方面57的多核苷酸，其中A1AT启动子的片段长度为至少100个、至少120个、至少150个、至少180个、小于255个、100至255个、150至225个、150至300个或180至255个核苷酸。

59.方面58的多核苷酸，其中A1AT启动子的片段长度为180至255个核苷酸。

60.前述方面中任一项的多核苷酸，其中多核苷酸包含与SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:15至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的启动子。

61.方面60的多核苷酸，其中多核苷酸包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:15至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的启动子。

62.方面61的多核苷酸，其中多核苷酸包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:15的启动子。

63.方面55至62中任一项的多核苷酸，其中转录调控元件包含长度等于或小于418个核苷酸、等于或小于255个核苷酸、或等于或小于185个核苷酸的A1AT启动子的片段并且包含SEQ ID NO:12。

64.方面55至63中任一项的多核苷酸，其中转录调控元件包含增强子。

65.方面64的多核苷酸，其中增强子是HCR增强子或HCR增强子的片段。

66.方面65的多核苷酸，其中HCR增强子的片段是长度为至少80个、至少90个、至少100个、小于192个、80至192个、90至192个、100至250个或117至192个核苷酸的片段。

67.方面66的多核苷酸，其中HCR增强子的片段长度为117至192个核苷酸。

68.前述方面中任一项的多核苷酸，其中多核苷酸包含与SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:16至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的增强子。

69.方面68的多核苷酸，其中多核苷酸包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:16至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的增强子。

70.方面69的多核苷酸，其中多核苷酸包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:16的增强子。

71.方面55至70中任一项的多核苷酸，其中转录调控元件包含长度等于或小于321个核苷酸、等于或小于192个核苷酸或等于或小于117个核苷酸的HCR增强子的片段并包含SEQ ID NO:11。

72.方面55至71中任一项的多核苷酸，其中转录调控元件与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。

73.方面72的多核苷酸，其中转录调控元件具有SEQ ID NO:10的序列。

74.前述方面中任一项的多核苷酸，其中：

(i)GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1或5至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的序列；并且

(ii)多核苷酸包含与SEQ ID NO:12至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的启动子和/或与SEQ ID NO:11至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的增强子。

75.前述方面中任一项的多核苷酸，其中：

(ii)多核苷酸包含与SEQ ID NO:10至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的转录调控元件。

76.方面57的多核苷酸，其中A1AT启动子或A1AT启动子的片段长度为至少200个、至少250个、至少300个、小于500个、200至500个、250至500个、350至450个或约418个核苷酸。

77.方面76的多核苷酸，其中A1AT启动子或A1AT启动子的片段长度为350至450个核苷酸。

78.方面65的多核苷酸，其中HCR增强子或HCR增强子的片段是长度为至少150个、至少190个、至少230个、小于400个、150至400个、190至370个、230至340个、250至340个或约321个核苷酸的片段。

79.方面78的多核苷酸，其中HCR增强子或HCR增强子的片段长度为250至340个核苷酸。

80.方面55至79的多核苷酸，其中转录调控元件与SEQ ID NO:14至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。

81.方面80的多核苷酸，其中转录调控元件具有SEQ ID NO:14的序列。

82.方面1至56或76至79的多核苷酸，其中：

(ii)多核苷酸包含与SEQ ID NO:14至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的转录调控元件。

83.方面1至56或76至79的多核苷酸，其中：

(ii)多核苷酸包含与SEQ ID NO:15至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的启动子和/或与SEQ ID NO:16至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的增强子。

84.前述方面中任一项的多核苷酸，其中与由在其他方面相同的参考多核苷酸中野生型GBA核苷酸序列编码的GCase相比，由GBA核苷酸序列编码的GCase在人肝细胞中的表达水平更高。

85.前述方面中任一项的多核苷酸，其中与由参考多核苷酸中野生型GBA核苷酸序列编码的GCase相比，由GBA核苷酸序列编码的GCase在人肝细胞中的表达水平为至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍或至少1.5倍。

86.方面84或85的多核苷酸，其中参考多核苷酸包含SEQ ID NO:9的野生型GBA核苷酸序列。

87.方面86的多核苷酸，其中参考多核苷酸包含SEQ ID NO:13的启动子。

88.前述方面中任一项的多核苷酸，其中与由包含SEQ ID NO:9的GBA核苷酸序列并可操作地连接至SEQ ID NO:13的启动子的其他方面相同的参考多核苷酸编码的GCase相比，由GBA核苷酸序列编码的GCase在人肝细胞中以更高的水平表达或非统计学显著不同的水平表达。

89.前述方面中任一项的多核苷酸，其中多核苷酸包含DNA或RNA。

90.包含重组基因组的病毒颗粒，重组基因组包含前述方面中任一项的多核苷酸。

91.方面90的病毒颗粒，其为AAV病毒颗粒、腺病毒病毒颗粒或慢病毒病毒颗粒。

92.方面91的病毒颗粒，其为AAV病毒颗粒。

93.方面90至92中任一项的病毒颗粒，其中病毒颗粒包含嗜肝衣壳或嗜CNS衣壳。

94.方面93的病毒颗粒，其中嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:19或20的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段至少98％、至少99％或至少99.5％相同的序列。

95.方面94的病毒颗粒，其中嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:19至少99％相同的序列。

96.方面94的病毒颗粒，其中嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:20至少99％相同的序列。

97.方面93的病毒颗粒，其中嗜CNS衣壳包含与SEQ ID NO:21的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段至少98％、至少99％或至少99.5％相同的序列。

98.方面97的病毒颗粒，其中嗜CNS衣壳包含与SEQ ID NO:21至少99％相同的序列。

99.方面90至98中任一项的病毒颗粒，其中重组基因组还包含：

a)AAV2 ITR；

b)多聚腺苷酸序列；和/或

c)内含子。

100.方面99的病毒颗粒，其中重组基因组是单链的。

101.方面90至100中任一项的病毒颗粒，其中在转导到Huh-7细胞中后，病毒颗粒表达GCase或其片段，使得被转导的细胞中的GCase活性大于用其他方面相同的包含SEQ IDNO:9的GBA核苷酸序列的病毒颗粒转导的细胞中的GCase或其片段的活性。

102.方面90至101中任一项的病毒颗粒，其中在转导到Huh-7细胞中后，病毒颗粒表达GCase或其片段，使得被转导的细胞中的GCase活性是用其他方面相同的包含SEQ IDNO:9的GBA核苷酸序列的病毒颗粒转导的细胞中的GCase或其片段的活性的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或至少20倍。

103.方面101或102的病毒颗粒，其中使用对GCase特异的荧光底物测量活性。

104.组合物，其包含前述方面中任一项的多核苷酸或病毒颗粒和药学上可接受的赋形剂。

105.前述方面中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于治疗方法。

106.用于方面105的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中治疗方法包括向患者施用有效量的方面1至104中任一项的多核苷酸、组合物或病毒颗粒。

107.治疗方法，其包括向患者施用有效量的方面1至104中任一项的多核苷酸、组合物或病毒颗粒。

108.方面1至104中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物在制备用于治疗方法的药物中的用途。

109.方面108的用途，其中治疗方法包括向患者施用有效量的方面1至104中任一项的多核苷酸或病毒颗粒。

110.方面105至109中任一项的多核苷酸、病毒颗粒、组合物、用途或方法，其中治疗方法是治疗与GCase缺乏症相关的疾病的方法。

111.方面105至109中任一项的多核苷酸、病毒颗粒、组合物、用途或方法，其中治疗方法是治疗帕金森病的方法。

112.方面105至109中任一项的多核苷酸、病毒颗粒、组合物、用途或方法，其中治疗方法是治疗戈谢病的方法。

113.方面112的多核苷酸、病毒颗粒、组合物、用途或方法，其中戈谢病是I型戈谢病。

114.方面112的多核苷酸、病毒颗粒、组合物、用途或方法，其中戈谢病是II型戈谢病。

115.方面112的多核苷酸、病毒颗粒、组合物、用途或方法，其中戈谢病是III型戈谢病。

116.方面112至115中任一项的多核苷酸、病毒颗粒、组合物、用途或方法，其中患者具有针对重组GCase的抗体或抑制剂，患者之前已经用重组GCase作为酶替代疗法的一部分进行治疗。

117.方面1至104中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物在制备用于在受试者中实现稳定的GCase活性的药物中的用途。

118.方面1至104中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物在制备用于在受试者中提供比来自GCase酶替代疗法的生物利用度更高的GCase生物利用度的药物中的用途，其中在施用后2周的时间段内测量生物利用度。

119.通过向受试者施用方面1至104中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物而在受试者中实现稳定的GCase活性的方法。

120.通过向受试者施用方面1至104中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物而在受试者中提供比来自GCase酶替代疗法的生物利用度更高的GCase生物利用度的方法，其中在施用后2周的时间段内测量生物利用度。

121.方面117至120中任一项的方法或用途，其中在受试者中实现稳定的GCase活性或在受试者中提供更高的GCase生物利用度可治疗受试者的疾病。

122.方面1至104中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于在受试者中表达GBA核苷酸序列并实现稳定的GCase活性的方法。

123.方面1至104中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于表达GBA核苷酸序列并在受试者中提供与来自GCase酶替代疗法的生物利用度相比更高的GCase生物利用度的方法，其中在施用后2周的时间段内测量生物利用度。

124.用于方面122或123的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中实现稳定的GCase活性和/或提供更高的GCase生物利用度导致治疗受试者的疾病。

125.方面117至124中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中使用对GCase特异的荧光底物测量GCase活性和/或生物利用度。

126.方面117至125中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者的血清或血浆中的GCase活性。

127.方面117至126中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者的巨噬细胞中的GCase活性。

128.方面117至127中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中受试者的GCase活性稳定在至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9μmol/h/ml的水平。

129.方面117至128中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中受试者的GCase活性稳定在至少3μmol/h/ml的水平。

130.方面117至129中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中受试者的GCase活性稳定在至少5μmol/h/ml的水平。

131.方面117至130中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中受试者的GCase活性稳定在至少9μmol/h/ml的水平。

132.方面117至131中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中方法包括向受试者施用有效剂量的多核苷酸、病毒颗粒或组合物。

133.方面117至132中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中稳定的GCase活性是相对于健康受试者的GCase活性至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的GCase活性。

134.方面117至133中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中稳定的GCase活性是相对于健康受试者的GCase活性10％至100％、20％至90％、30％至70％、40％至70％或50％至70％的GCase活性。

135.方面117至134中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中稳定的GCase活性在施用后至少5周内是稳定的。

136.方面117至135中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中稳定的GCase活性在施用后至少10周内是稳定的。

137.方面117至136中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中稳定的GCase活性在施用后至少15周内是稳定的。

138.方面117至137中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中稳定的GCase活性在施用后至少20周内是稳定的。

139.方面117至138中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中稳定的GCase活性在施用后至少25周内是稳定的。

140.方面117至139中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中稳定的GCase活性在施用后至少30周内是稳定的。

141.方面117至140中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中稳定的GCase活性在施用后至少35周内是稳定的。

142.方面117至141中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中稳定的GCase活性在施用后至少40周内是稳定的。

143.方面117至142中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中当在施用后的相同时间点在相同测定中测量时，当与在施用有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中测量的活性相比时，方法在施用后至少5周、至少10周、至少15周、至少20周、至少25周、至少30周或至少35周在受试者的肝脏、脾脏和/或骨髓中实现更高的GCase活性。

144.方面117至143中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中当在施用后的相同时间点在相同测定中测量时，当与在施用有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中测量的生物利用度相比时，方法在施用后至少5周、至少10周、至少15周、至少20周、至少25周、至少30周或至少35周的时间段内在受试者的肝脏、脾脏和/或骨髓中实现更高的GCase生物利用度。

145.方面118、120或123至144中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中GCase酶替代疗法包括施用具有SEQ ID NO:25的序列的GCase多肽。

146.方面145的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中GCase酶替代疗法包括以40至100、50至80、60至70或约60U/kg BW的剂量施用GCase多肽。

147.方面121或124至146中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中疾病是戈谢病。

148.方面147的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中戈谢病是I型戈谢病。

149.方面147的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中戈谢病是II型戈谢病。

150.方面147的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中戈谢病是III型戈谢病。

151.方面117至150中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中患者具有针对重组GCase的抗体或抑制剂，患者之前已经用重组GCase作为酶替代疗法的一部分进行治疗。

152.方面1至104中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物在制备用于降低患有与GCase缺乏症相关的疾病或病症的受试者中己糖神经酰胺和/或己糖鞘氨醇水平的药物中的用途。

153.通过向受试者施用方面1至104中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物降低患有与GCase缺乏症相关的疾病或病症的受试者的己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平的方法。

154.方面152或153的用途或方法，其中降低受试者的己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平可治疗与GCase缺乏症相关的疾病或病症。

155.方面1至104中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于降低患有与GCase缺乏症相关的疾病或病症的受试者中己糖神经酰胺和/或己糖鞘氨醇水平的方法，任选地其中降低己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平导致治疗与GCase缺乏症相关的疾病或病症。

156.方面152至155中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中与施用方面1至104中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物时的己糖神经酰胺和/或己糖鞘氨醇水平相比，己糖神经酰胺和/或己糖鞘氨醇水平降低了2倍或更多、3倍或更多、4倍或更多、5倍或更多、6倍或更多、2至3倍、2至4倍、2至5倍、2至6倍或3至5倍。

157.方面152至156中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平的降低大于在施用有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中实现的降低，任选地当己糖神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平在施用后至少6周、至少8周、至少10周或至少12周测量时。

158.方面157的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中GCase酶替代疗法包括施用具有SEQ ID NO:25的序列的GCase多肽。

159.方面158的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中GCase酶替代疗法包括以40至100、50至80、60至70或约60U/kg BW的剂量施用GCase多肽。

160.方面152至159中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者的巨噬细胞中的己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平。

161.方面152至160中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者的脾脏中的己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平。

162.方面152至161中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者的肝脏中的己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平。

163.方面152至162中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者的血清中的己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平。

164.方面152至163中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中通过质谱法测量己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平。

165.方面152至164中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中疾病是戈谢病。

166.方面165的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中戈谢病是I型戈谢病。

167.方面165的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中戈谢病是II型戈谢病。

168.方面165的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中戈谢病是III型戈谢病。

169.方面152至168中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中患者具有针对重组GCase的抗体或抑制剂，患者之前已经用重组GCase作为酶替代疗法的一部分进行治疗。

本发明的进一步的方面

还在以下方面描述本发明。

1.包含GBA核苷酸序列的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码β-葡糖脑苷脂酶(GCase)蛋白或其片段，并且其中至少一部分GBA核苷酸序列不是野生型，任选地其中不是野生型的GBA核苷酸序列的部分是密码子优化的，更任选地其中GBA核苷酸序列编码GCase蛋白或其片段并包含与SEQ ID NO:1-8中任一项的核苷酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的序列。

2.包含GBA核苷酸序列的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列编码GCase蛋白或其片段并且包含与SEQ ID NO:1-8中任一个的至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、小于1611个、1000至1494个、1000至1600个、1300至1494个、1300至1611个、约1494个或约1611个核苷酸的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的序列。

3.方面1至2中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列中的至少一部分是密码子优化的。

4.方面3的多核苷酸，其中：

(a)GBA核苷酸序列的密码子优化的至少一部分是针对在人肝细胞中表达进行密码子优化的；

(b)其中GBA核苷酸序列的密码子优化的部分是连续部分；

(c)GBA核苷酸序列的密码子优化的部分的长度为至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、1000至1494个、1300至1494个或约1494个核苷酸；

(d)GBA核苷酸序列的密码子优化的部分对应于成熟GCase蛋白；

(e)GBA核苷酸序列的密码子优化的部分不编码全部信号肽或信号肽的一部分；

(f)与野生型GBA核苷酸序列的相应部分相比，GBA核苷酸序列或GBA核苷酸序列的密码子优化的部分包含的CpG数量减少；任选地其中GBA核苷酸序列或GBA核苷酸序列的密码子优化的部分包含小于40个、小于20个、小于18个、小于10个或小于5个CpG，更任选地其中GBA核苷酸序列或GBA核苷酸序列的密码子优化的部分每100个核苷酸包含小于5个、小于4个、小于3个或小于2个CpG，更任选地其中GBA核苷酸序列或GBA核苷酸序列的密码子优化的部分不含CpG，优选地其中野生型GBA核苷酸序列是SEQ ID NO:9；和/或

(g)GBA核苷酸序列的密码子优化的部分与SEQ ID NO:1-4中任一个的至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、1000至1494个、1300至1494个或约1494个核苷酸的片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。

5.前述方面中任一项的多核苷酸，其中GBA核苷酸序列包含未经密码子优化的部分，任选地其中：

(a)未经密码子优化的部分编码全部GCase信号肽或GCase信号肽的一部分；

(b)未经密码子优化的部分至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、小于200个、小于170个、小于140个或约117个核苷酸；和/或

(c)未经密码子优化的部分包含1个或多个CpG。

6.前述方面中任一项的多核苷酸，其中多核苷酸还包含转录调控元件，任选地其中转录调控元件包含肝脏特异性启动子和/或增强子。

7.方面6的多核苷酸，其中转录调控元件包含A1AT启动子或A1AT启动子的片段，任选地其中

(a)A1AT启动子或A1AT启动子的片段长度为至少100个、至少120个、至少150个、至少180个、小于255个、100至255个、150至225个、150至300个或180至255个核苷酸，更任选地其中A1AT启动子的片段长度为180至255个核苷酸；

(b)A1AT启动子或A1AT启动子的片段长度为至少200个、至少250个、至少300个、小于500个、200至500个、250至500个、350至450个或约418个核苷酸，更任选地其中A1AT启动子的片段长度为350至450个核苷酸；

(c)多核苷酸包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:15至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的启动子。

8.方面6或7的多核苷酸，其中增强子是HCR增强子或HCR增强子的片段，任选地其中：

(a)HCR增强子或HCR增强子的片段是长度为至少80个、至少90个、至少100个、小于192个、80至192个、90至192个、100至250个或117至192个核苷酸的片段，更任选地其中HCR增强子的片段长度为117至192个核苷酸；

(b)HCR增强子或HCR增强子的片段是长度为至少150个、至少190个、至少230个、小于400个、150至400个、190至370个、230至340个、250至340个或约321个核苷酸，更任选地其中HCR增强子的片段长度为250至340个核苷酸

(c)多核苷酸包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:16至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的增强子。

9.方面6的多核苷酸，其中转录调控元件与SEQ ID NO:10或14至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。

10.前述方面中任一项的多核苷酸，其中与由在其他方面相同的参考多核苷酸中野生型GBA核苷酸序列编码的GCase相比，由GBA核苷酸序列编码的GCase在人肝细胞中的表达水平更高，任选地其中与由参考多核苷酸中野生型GBA核苷酸序列编码的GCase相比，由GBA核苷酸序列编码的GCase在人肝细胞中的表达水平为至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍或至少1.5倍，更任选地其中参考多核苷酸包含SEQ ID NO:9的野生型GBA核苷酸序列，任选地其中参考多核苷酸包含SEQ ID NO:13的启动子。

11.包含重组基因组的病毒颗粒，重组基因组包含前述方面中任一项的多核苷酸。

12.方面11的病毒颗粒，其为AAV病毒颗粒、腺病毒病毒颗粒或慢病毒病毒颗粒，任选地其为AAV病毒颗粒。

13.方面11-12中任一项的病毒颗粒，其中病毒颗粒包含嗜肝衣壳或嗜CNS衣壳。

14.方面13的病毒颗粒，其中嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:19、20或24的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段至少98％、至少99％或至少99.5％相同的序列。

15.方面13的病毒颗粒，其中嗜CNS衣壳包含与SEQ ID NO:21的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段至少98％、至少99％或至少99.5％相同的序列。

16.方面11至15中任一项的病毒颗粒，其中重组基因组还包含：

a)AAV2 ITR；

b)多聚腺苷酸序列；和/或

c)内含子；

任选地其中重组基因组是单链的。

17.方面11至16中任一项的病毒颗粒，其中在转导到Huh-7细胞中后，病毒颗粒表达GCase或其片段，使得被转导的细胞中的GCase活性大于用其他方面相同的包含SEQ IDNO:9的GBA核苷酸序列的病毒颗粒转导的细胞中的GCase或其片段的活性，任选地其中在转导到Huh-7细胞中后，病毒颗粒表达GCase或其片段，使得被转导的细胞中的GCase活性是用其他方面相同的包含SEQ ID NO:9的GBA核苷酸序列的病毒颗粒转导的细胞中的GCase或其片段的活性的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或至少20倍，更任选地其中使用对GCase特异的荧光底物测量活性。

18.组合物，其包含前述方面中任一项的多核苷酸或病毒颗粒和药学上可接受的赋形剂。

19.前述方面中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于治疗方法。

20.用于方面19的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中治疗方法包括向患者施用有效量的方面1至17中任一项的多核苷酸、组合物或病毒颗粒。

21.用于方面19至20中任一项的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中治疗方法是治疗与GCase缺乏症相关的疾病的方法。

22.用于方面19至20中任一项的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中治疗方法是治疗帕金森病的方法。

23.用于方面19至20中任一项的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中治疗方法是治疗戈谢病的方法。

24.用于方面23的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中戈谢病是I型、II型或III型戈谢病。

25.用于方面23至24中任一项的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中患者具有针对重组GCase的抗体或抑制剂，患者之前已经用重组GCase作为酶替代疗法的一部分进行治疗。

实施例

实施例1——方法

除非另有说明，否则在以下描述的实施例中遵循以下一般方法。

rAAV的产生

AAV2/8颗粒是通过用编码AAV Rep和Cap、腺病毒辅助功能以及含有GBA构建体的重组基因组的质粒瞬时转染HEK293T细胞产生的。AAV2/8颗粒通过aPOROS CaptureSelect亲和柱进行纯化，并通过qPCR进行滴定，并通过碱性凝胶分析进行表征。

小鼠研究设计

在肝细胞特异性启动子的转录控制下携带GBA转基因的AAV病毒颗粒被施用到6-8周龄的野生型(C57BL/6)雄性小鼠的尾静脉中。如本文针对每项研究那样，AAV剂量范围从6×10¹¹vg/kg至6×10¹²vg/kg。对于每个实验，另外一组动物不接受治疗，作为治疗效果的对照。为了评估转基因表达的动力学和持久性，在注射后的不同时间间隔(4周、8周和12周)测量血清GCase水平。小鼠在AAV处理后随访至12周，处死以进行生化和病理分析。

血清和组织GBA活性测定

β-葡糖脑苷脂酶(酸性β-葡糖苷酶；GCase)活性用4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷(4MU-Glc)作为底物进行荧光测定。从小鼠血液中获得血清样品并将其储存在-80℃。收获组织(肝脏、脾脏、骨髓)并速冻和裂解。β-葡糖脑苷脂酶(酸性β-葡糖苷酶，GCase)活性用4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷(4MU-Glc)作为底物进行荧光测定。在测定当天，将血清稀释(0.5μL，1:50)并在50mM柠檬酸钠、25mM牛磺胆酸盐、pH＝5.75、6mM 4MU-Glc中在37℃下测定30分钟。对于组织样品，直接测定组织蛋白裂解物。通过添加一体积(100μl)终止溶液(0.5M甘氨酸、0.3M NaOH、pH 10.0)来终止反应。使用Spectramax I3X(Moleculardevices)使用分别为365nm和445nm的激发和发射波长评估相对荧光水平(RFU)。然后基于4-甲基伞形酮(4-MU，Sigma-Aldrich)标准曲线将荧光水平转换为纳摩尔/h/mL(血清)或nmol/h/mg总蛋白(组织)。

载体基因组拷贝数

为了确定rAAV注射后每个肝细胞的载体基因组数量，使用QIAGEN DNeasy Bloodand Tissue Kit(QIAGEN)按照制造商的说明从冷冻肝脏样品中分离DNA。DNA分离后，使用与LSP-S和LSP-L启动子共有的区域结合的引物组进行qPCR，从而可以估计AAV拷贝数。

免疫组化

兔抗人GCase(Abcam ab125065；1:100)用于观察小鼠组织中的GCase。大鼠抗F4/80(Abcam ab6640；1:100)用于观察小鼠巨噬细胞。将福尔马林固定的小鼠组织用二甲苯和乙醇洗涤脱蜡，然后根据Ventana CC1产品使用建议进行抗原修复。使用VentanaDiscovery XT仪器并使用Ventana DAB Map检测试剂盒(760-124)进行免疫组织化学染色。切片用苏木精复染。在免疫荧光染色过程中使用了FITC偶联二抗和德克萨斯红偶联二抗。DAPI用于观察细胞核。通过共聚焦荧光显微镜(Zeiss)观察信号。

Huh-7转染和潜能测定

转染前一天，将肝细胞系Huh-7以每孔3×10⁵个细胞的细胞密度铺板于12孔板中。对于转染，FuGENE以每微克质粒4μl的比例使用，并在存在10％血清(胎牛血清，FBS)的情况下加入Huh-7细胞过夜。更换转染培养基，将细胞与补充有胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS，ThermoFisher Scientific)和25mM Hepes缓冲液的培养基一起孵育24小时。Huh-7细胞转导在定义的感染复数(MOI)下在血清存在下进行24小时，然后更换培养基并在新鲜培养基中孵育24小时。如上所述，使用4MU-Glc作为底物，使用20μl培养基测量GCase活性。

统计学分析

使用Prism 7(Graph Pad)软件进行统计学分析。通过单因素方差分析进行柱分析。在附图说明中指出了P值和样本大小。

为了粗略估计生物利用度(AUC)，在GraphPad Prism中使用了一个单阶段衰减模型方程：Y＝(Y0-Plateau)*exp(-K*X)+Plateau。Y0是X(时间)为零时的Y值，其以与Y相同的单位表示。Plateau是无穷大时间的Y值，以与Y相同的单位表示。K是速率常数，表示为X轴时间单位的倒数(即，如果X以分钟为单位，则K以分钟^-1表示)。Tau是时间常数，以与X轴相同的单位表示并且计算为K的倒数。半衰期以X轴的时间单位表示，计算为ln(2)/K。Span是Y0和Plateau之间的差值，以与Y值相同的单位表示。AUC计算采用线性梯形法。AUC表示为U*h/L，其中一个单位定义为在37℃下水解1μmol/h 4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷底物所需的酶量。

实施例2——GBA构建体

为了评估肝脏导向基因治疗方法是否可用于治疗戈谢病(GD)，人全长GBA编码序列(见于GenBank登录号NM_000157.3；SEQ ID NO:9)克隆到肝脏特异性启动子驱动的腺相关病毒(AAV)载体中。在FLF-PL01 AAV构建体(图1A)中，GBA野生型序列(GBAwt，未经密码子优化)由本文称为“LSP-S”(SEQ ID NO:10)的肝脏特异性启动子驱动。为了确定最适合表达的序列，使用多种不同的密码子优化策略设计了序列。在一个示例AAV构建体(FLF-PL28)中，优化了GBA密码子序列，并由相同的肝脏特异性启动子LSP-S驱动(图1B)。FLF-PL64构建体包含与FLF-PL28相同的GBA密码子优化序列，但不同之处在于包含此处称为“LSP-L”(SEQID NO:14)的更长的转录调控元件而不是LSP-S(图1C)。

实施例3——野生型GBA转基因表达分析

为了评估(野生型)GBA构建体FLF-PL01是否会导致β-葡糖脑苷脂酶(GCase)的肝脏表达和随后分泌到血流中，将FLF-PL01假型化为AAV2/8。rAAV颗粒按上述方法制备和滴定，并在用于小鼠之前通过碱性凝胶分析表征。以6×10¹¹vg/kg至6×10¹²vg/kg的剂量单次注射AAV2/8-FLF-PL01处理八周龄的野生型(C57BL/6)小鼠。对照(幼稚)小鼠未经处理。在AAV注射后4、8和12周收集血清样品，用于评估循环活性GCase的水平。如上所述测定GCase活性并进行免疫组织化学染色。切片用苏木精复染。

用AAV2/8-FLF-PL01注射野生型小鼠导致经处理动物的肝脏中人GCase的表达增加(图2A)。随着载体剂量的增加，可以观察到肝脏GCase表达水平的增加，在载体剂量6×10¹¹vg/kg组观察到约12倍的增加，在2×10¹²vg/kg剂量组观察到43倍的增加和在6×10¹²vg/kg剂量组观察到57倍的增加(图2B)。该数据表明，AAV2/8-FLF-PL01将GCase的表达驱动到导致GCase显著释放到血液中并可能进入受GD影响组织中的巨噬细胞的水平。

实施例4——密码子优化构建体的体外GCase表达分析

使用各种肝脏表达序列的密码子使用表，以生成在对应于成熟GCase蛋白(但不是信号肽编码区)的整个链段中密码子优化的GBA序列。除了一个这样的密码子优化的GBA序列(‘FLF-PL36’)之外，所得序列随后被进一步手动修改以去除CpG、隐蔽剪接位点、提前终止密码子和不需要的氨基酸置换。创建了21个密码子优化的GBA序列并在转染人肝细胞系Huh-7后测试了GCase的表达水平。Huh-7细胞以每孔3×10⁵个细胞的细胞密度铺板到12孔板上，并如上所述进行转染。使用4MU-Glc作为底物，使用20微升培养基测量GCase活性。当在Huh-7细胞中进行转染时，该分析的结果允许鉴定GBA密码子优化(FLF-PL21、FLF-PL28、FLF-PL30和FLF-PL36)，其证实GCase表达增加(相对于野生型GBA序列，FLF-PL01)(图3)。

实施例5——密码子优化构建体的体内GCase表达分析

实施例4中鉴定的四个构建体(FLF-PL21、FLF-PL28、FLF-PL30和FLF-PL36)被假型化为AAV2/8并以2×10¹²vg/kg的剂量注射到野生型小鼠中。该实验中还包括未经密码子优化的构建体FLF-PL01，以及包含与FLF-PL01相同的野生型GBA序列的由强合成启动子CAG驱动的构建体(FLF-PL37)。对照(幼稚)小鼠未经处理。在注射后最多36周的多个时间点处死动物，并收集血清和组织样品。

图4A显示了在注射由LSP-S启动子驱动的未经密码子优化的GBA序列(FLF-PL01)、也由LSP-S启动子驱动的密码子优化的GBA构建体(FLF-PL21、FLF-PL28、FLF-PL30和FLF-PL36)、由CAG启动子驱动GBA未经密码子优化的序列(FLF-PL37)的小鼠中注射后8周的GCase活性结果。与FLF-PL01相比，所有四个GBA密码子优化构建体在注射到小鼠体内时都显示出血流中存在的GCase活性水平增加(图4A)。与由相同LSP-S启动子驱动的未经密码子优化的构建体(FLF-PL01)相比，FLF-PL28构建体表现出最大的GCase释放到血流的增加(约6倍)。在整个36周的研究期间，观察到由FLF-PL28驱动的GCase水平相对于FLF-PL01升高(图4B)。

特别值得注意的是，在注射了含有肝脏特异性启动子的FLF-PL28的小鼠中观察到的GCase水平与其中由泛在且强CAG启动子表达野生型GBA序列的FLF-PL37构建体驱动的GCase水平一样高(图4A)。

在结束阶段，收集脾脏、骨髓并在福尔马林中固定，然后石蜡包埋。在石蜡切片上进行的GBA免疫染色分析表明，与循环GCase水平一致，与未经密码子优化的构建体FLF-PL01相比，用FLF-PL28GBA密码子优化构建体处理的小鼠中GCase的组织摄取增加(图5)。

为了评估FLF-PL28在肝脏定向GBA表达后脾脏中巨噬细胞摄取的水平，使用小鼠泛巨噬细胞标志物F4/80和GBA抗体进行免疫荧光分析。大多数F4/80阳性细胞表现出人特异性GBA的表达，这表明脾脏中大部分GCase摄取发生在巨噬细胞中(图6)。

实施例6——分析启动子对体内GCase活性的影响

为了测试启动子工程改造是否可以进一步增加GBA密码子优化序列的表达，将来自FLF-PL28的GBA构建体置于肝脏特异性启动子(本文称为“LSP-L”；SEQ ID NO:14)下以生成构建体FLF-PL64(实施例2，图1C)。

使用该新构建体制备AAV2/8载体并以2×10¹²vg/kg的剂量注射到野生型小鼠中。对照(幼稚)小鼠未经处理。5周后，处死动物，收集血清和组织。

血清中的GCase活性分析表明，与用AAV2/8-FLF-PL28处理的小鼠相比，AAV2/8-FLF-PL64导致小鼠血流中GCase的表达增加(约2.5倍，P＝0.0001，单因素方差分析)(图7)。

与构建体FLF-PL28一样，FLF-PL64允许GCase稳健摄取到GD靶组织，如脾脏、骨髓和肺脏(图8)。

实施例7——具有GBA构建体的AAV载体的肝脏表达选择性

为了分析LSP-L启动子对肝细胞系的选择性，选择了来自各种组织的八个人源细胞系。下表总结了每个细胞系及其来源的详细信息。

表1.在本实施例中评估的人源细胞系

细胞系	来源	生长	来源物种
				HUH-7	肝细胞癌(肝脏)	贴壁	人
HEK293T	肾脏	贴壁	人
				PANC-1	胰腺(上皮样癌)	贴壁	人
BxPC-3	胰腺(腺癌)	贴壁	人
				MCF7	乳腺(上皮；腺癌)	贴壁	人
1643	成神经细胞瘤	贴壁	人
				MRC-9	正常肺成纤维细胞(胚胎)	贴壁	人
697	B细胞白血病(早期B细胞)	悬浮	人

如上表1所述的八个人源细胞系在补充有10％FBS的DMEM、IMDM或RPMI培养基中生长。对于每个细胞系，用AAV-FLF-PL64(具有嗜肝衣壳的AAV＝SEQ ID NO:20)以1×10⁵vg/细胞的感染复数(MOI)转导2×10⁴个细胞/孔。所有实验一式两份进行。对悬浮细胞进行计数并在无血清培养基(300μl/孔)中转导至48孔板中。对于贴壁细胞系，吸出培养基，然后用PBS(1X)洗涤并在37℃、5％CO₂下用5ml TripLE处理5分钟以解离细胞。加入5ml完全培养基终止反应。使用Countess^TMII自动细胞计数器(ThermoFisher)对解离的细胞进行计数并离心(250×g，5分钟)，然后以2×10⁵个细胞/ml的密度重新悬浮在完全培养基中。将这些细胞铺板到96孔板(2×10⁴个细胞/孔)中以在转导前贴壁5小时。在X-VIVO培养基(50μl/孔)中制备转导混合物并添加到细胞中。三小时后，加入100μl/孔的完全培养基。转导后一天，将每个细胞系的培养基更换为完全培养基(+25mM HEPES用于分泌分析)。

用4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷(4MU-Glc)作为底物荧光测定GCase活性。

从每个细胞系的培养上清液中测量GCase活性，以确定用AAV-FLF-PL64转导后分泌的GCase水平(图10)。当LSP-L启动子驱动GBA转基因时，仅在HUH-7细胞系中检测到GCase分泌。在HUH-7细胞中观察到的活性GCase水平约为5.0nmol/h/ml[5.1±0.1nmol/h/ml]。对于所分析的任何其他细胞系，均未观察到可检测水平的活性GCase。

实施例8——与ERT疗法的比较

本实施例的目的是将FLF-PL64与

(60U/kg BW)在小鼠在进行单次注射施用时进行比较。

包含与天然酶GCase(即SEQ ID NO:25)相同的氨基酸序列和相似的糖基化模式，因此提供了合适的比较。接受酶替代疗法(ERT)的患者通常会用隔周静脉输注ERT(输注持续时间为1-2小时，

的临床剂量为60U/kg)进行治疗。

获得用于制备输注溶液的

粉末(400单位，Shire)并保持在冷藏和避光下直至重新溶解。按照制造商的建议，将一个小瓶(400U)用4.3ml无菌水重新溶解，以达到100U/ml的溶液。重新溶解后，VPRIV溶液立即速冻为一次性使用的等分试样，并储存在(-80℃)以备后用。

将

(60U/kg BW)或FLF-PL64(配制成AAV2/8颗粒，2×10¹²vg/kg)单次静脉注射施用于野生型小鼠。血清和组织中活性GCase的水平在注射后最多1周以及3周和5周的不同时间点测定。用4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷(4MU-Glc)荧光测定活性GCase的水平。

如图11(A)所示，VPRIV被迅速从鼠血中清除。VPRIV在注射后两分钟达到12.7μmol/h/ml的Cmax；估计半衰期约为5.6分钟。注射后约20分钟，在血清中只能检测到残留水平的活性GCase。在剩余的研究期间，这些水平仍然接近于未经处理的对照组。VPRIV与FLF-PL64的比较是通过分析具有稳定表达GCase的小鼠进行的(图11B)。用FLF-PL64处理还导致鼠血中活性GCase水平增加(Cmax 9.4μmol/h/ml)(图11B)。然而，尽管活性GCase的水平不如

注射后观察到的高，但这些水平在研究持续期间保持恒定。下表2显示了在注射ERT或FLF-PL64后，小鼠在2周间隔期间的预测生物利用度。

表2.单次注射ERT(60U/kg BW)或AAV-FLF-PL64(2×10¹²vg/kg)后，C57BL/6小鼠在2周间隔期间的预测生物利用度(AUC)。

图12显示了施用

或AAV2/8-FLF-PL64后鼠肝脏、脾脏和骨髓中的GCase免疫染色。显示了每个动物组的代表性图像。DAB(3,3'-二氨基联苯胺)用于观察GCase，苏木精用作复染剂。FLF-PL64处理的样品是在注射后五周获得的，而

处理的样品是如标记收集的。这些图像的半定量分析如下表3所示：

表3：在施用ERT

或FLF-PL64后，在鼠肝脏、脾脏和骨髓中观察到的GCase免疫反应性的相对水平。“-”表示GCase阴性染色；“+”代表GCase阳性染色。

分组	肝脏	脾脏	骨髓
				初始	-	-	-
ERT–20min	+	++	++
				ERT–60min	+	+++	++
ERT–240min	+	-/+	-
				ERT–1440min	-/+	-	-
FLF-PL64	+++	+++	++/+++

实施例9——治疗潜力的体内研究

1.方法

小鼠方法

携带Gba1突变D409V/D409V(9V/9V)的9V/null小鼠被用作本研究中的戈谢病模型。9V/null小鼠的寿命几乎正常，但内脏异常(炎症和贮积细胞)和底物积累(Xu et al.AmJ Pathol.2003Nov；163(5):2093-101；Xu et al.PLoS One.2010May 20；5(5):e10750)。通过将携带Gba1突变D409V/D409V(9V/9V)和Gba1 null/WT的小鼠杂交产生9V/null小鼠。每窝产生约两个9V/null。9V/null和WT小鼠的品系背景是C57BL/6、129SvEvBrd和FVB。来自多窝的9V/null小鼠在滚动的基础上随机分配到每个处理组。雄性和雌性小鼠都被纳入每个组，试图平衡各组中的性别。所有小鼠都饲养在无病原体条件下，每天监测并每周称重。所有AAV处理的小鼠都表现出正常的生长和体重增加。

在研究结束时，用戊巴比妥(100mg/kg)对小鼠实施安乐死。小鼠经心灌注生理盐水。然后解剖肝脏、脾脏和肺脏。

AAV/VPRIV制备和施用

AAV8-FLF-PL64的等分试样储存在-80℃。注射前，将等分试样在冰上解冻并用X-VIVO10(Lonza，pH 7.4，4℃)稀释，并通过低速短暂涡旋轻轻混合。注射前将稀释的AAV保持在冰上，并在2小时内使用。

重新悬浮并等分(25、50、100μl)并储存在-80℃。注射前，将等分试样在冰上解冻并用酸化的X-VIVO10(Lonza，pH5.5，4℃)稀释至指定剂量，并通过低速短暂涡旋轻轻混合。注射前将稀释的酶保持在冰上，并在2小时内使用。

将AAV(2×10¹²vg/kg)和媒介物(X-vivo)以5μL/g体重(BW)的指定剂量给予8周龄的9V/null小鼠一次。用媒介物施用于WT小鼠。AAV和媒介物通过尾静脉同时短暂地在异氟醚下施用于小鼠。

通过尾静脉推注注射施用于9V/null小鼠，在生物气泡室中以60U/kg和2.5μL/g BW用异氟醚和氧气的混合物麻醉，从8周龄开始，每两周，注射7次。

组织收集

在12周、16周和20周龄时，从尾静脉收集血液(约100μL)，放入含有0.5M EDTA(5μL)的管中。将新鲜收集的血样保持在冰上并在2小时内分离到血浆中以测定GCase活性。

处理组的每次血浆收集和活性测定均在预定的酶注射后2小时内进行。处理单独的一部分血液(约400μL)以分离白细胞(WBC)以进行GCase活性测定。收集的WBC储存在-80℃。

在实验终点(20周龄)收集组织(肝脏、肺脏、脾脏、骨髓)。

组的组织收集是在最后一次预定的酶注射后2小时内进行的。肝脏、肺脏和脾脏样品分为4份，其中3份冷冻在单独的管中，并在GCase活性测定、蛋白质和底物分析之前储存在-80℃。剩下的1份固定在10％福尔马林中用于组织学分析。从小鼠双腿的股骨和胫骨收集骨髓细胞并冷冻在两个管中，储存在-80℃冰箱中用于GCase活性和底物测定。

GCase活性测定

使用Precellys Evolution组织匀浆器在1％牛磺胆酸钠和1％Triton X-100(Tc/Tx)中匀浆组织，在4℃下进行两个循环(每次20秒，间隔30秒)。将细胞(骨髓(BM)和白细胞(WBC))在1％Tc/Tx中4℃用超声处理匀浆。将组织和细胞裂解物(2μL)用测定混合物中的反应缓冲液(0.025M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，pH 5.6)稀释(5倍)。将稀释的裂解物(10μL)(每个样品一式三份)加载到反应板上。用4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷(4MU-葡萄糖，4mM)(Biosynth AG,Switzerland)在存在和不存在2mM Conduritol B环氧化物(Millipore.CA)在37℃孵育1小时荧光测定GCase活性。使用BCA蛋白质测定试剂(Pierce,Rockford,IL)测定蛋白质浓度。

血浆在0.025M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，pH 5.6中稀释。如上用4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷(4MU-葡萄糖，4mM)(Biosynth AG,Switzerland)荧光测定GCase活性。

底物分析

将冷冻组织称重并在3.6mL甲醇/氯仿/H2O(2:1:0.6v/v/v)中匀浆。对裂解物的等分试样(500μL)进行LC/MS分析。定量的己糖神经酰胺和己糖鞘氨醇通过组织重量进行标准化。

血浆在水中稀释(40μL血浆+60μL水)并进行LC/MS分析。

底物水平通过血浆体积进行标准化。

骨髓细胞悬浮在200μL水中，超声和涡旋以制备细胞裂解物。对160μL裂解液进行LC/MS分析。确定剩余的裂解物的蛋白质浓度。

底物水平通过mg蛋白质进行标准化。

进行LC/MS分析以分析己糖神经酰胺和己糖神经鞘氨醇的浓度。由于半乳糖神经酰胺和半乳糖神经鞘氨醇水平在该小鼠模型中非常低，因此测量的己糖神经酰胺和己糖神经鞘氨醇浓度分别代表葡糖神经酰胺和葡糖神经鞘氨醇的水平。

组织学分析

从生理盐水灌注的小鼠中解剖肝脏、肺脏、脾脏和骨髓，并在福尔马林(10％)中固定并石蜡包埋。固定的组织被切成4μm切片并安装在载玻片上。

贮积细胞计数

组织切片通过Autostainner(Leica Autostainner XL)用苏木精和伊红(H&E)染色。染色的组织用Aperio AT2(Leica,40倍)扫描。使用Aperio ImageScope(V12.4.0.0543)处理组织图像。从每只小鼠的肝脏和肺脏中选择10张20倍大小的照片(500μm×800μm的图像)进行分析。从每个图像中计数贮积细胞。计算数据图的10张图像的细胞计数平均值。“贮积细胞”的定义基于细胞(巨噬细胞)的大小，例如肝脏中的贮积细胞大小>10μm，肺脏中的贮积细胞大小>15μm。

CD68染色和定量

组织切片在Discover Ultra自动化IHC/ISH载玻片染色机中用兔抗小鼠CD68抗体(1:25.Abcam Ab53444)染色。组织用苏木精对细胞核进行复染。用Aperio AT2(Leica,40倍)扫描染色的组织，并通过Aperio ImageScope(V12.4.0.0543)获取图像。20倍大小(500μm×800μm)的肝脏和肺脏图像用于定量分析。使用Image J(Fiji,v5.1)分析来自每只小鼠的5张肝脏或肺脏图像的IHC信号。计算数据图的每只小鼠的平均CD68信号。

统计学分析

通过Student's t检验或单因素方差分析数据。通过PRISM 8软件(PRISM 8.0.1版)生成图形和统计学分析。

2.结果

GCase活性

通过测量细胞和组织中的GCase活性研究了AAV-FLF-PL64处理恢复9V/null小鼠的活性GCase水平。如上在实验终点(即AAV-FLF-PL64注射后12周或最终

施用时)收集白细胞(WBC)、骨髓和组织样品，此时小鼠为20周龄。

显示可以提高所有测试细胞和组织的活性(图13)。如上所述，

处理组的组织是在最后一次注射后2小时内收集的，并且这与之前的数据一致，表明这是在

在组织中处于其C-max的时间段内。

AAV-FLF-PL64也显示在仅单次施用后即可显著增加所有组织中的GCase活性(图13)。与媒介物-9V/null相比，肝脏GCase活性增加了4.7倍，脾脏GCase活性增加了2.5倍。在白细胞中，AAV-FLF-PL64处理组的GCase活性显著增加了7-9倍。具体而言，白细胞中的GCase活性水平达到了WT活性水平的约82％。

组织的组织学

通过将泡沫巨噬细胞计数为贮积细胞并定量活化巨噬细胞上的CD68染色信号确定9V/null小鼠的内脏病理。对H&E染色的肝脏切片中贮积细胞进行计数。定量抗CD68抗体染色的肝脏和肺脏切片的CD68信号(棕色)强度。

从每只小鼠的每个组织10张图像中计数肝脏中大小≥10μm的贮积细胞。在肝脏中，在AAV-FLF-PL64处理组以及

组中检测不到贮积细胞的数量(图14)。

在AAV-FLF-PL64处理组中，肝脏中的CD68信号也显著降低。AAV-FLF-PL64处理将CD68信号降低到媒介物-9V/null水平的约25％。相比之下，VPRIV组的CD68信号约为媒介物-9V/null水平的37％(图14)。

底物积累

已知9V/null小鼠会在肝脏、肺脏和脾脏中产生糖脂底物积累(Xu et al.PLoSOne.2010May 20；5(5):e10750)。例如，该研究表明对照媒介物-9V/null组中的己糖神经酰胺在肝脏中比WT水平高7.97倍，在脾脏中则为3.57倍(数据未显示)。

与媒介物-9V/null相比，AAV-FLF-PL64处理组显示出肝脏和脾脏中己糖神经酰胺和己糖鞘氨醇的显著降低(图15)。具体而言，AAV-FLF-PL64处理组的己糖神经酰胺水平降低到肝脏中野生型水平的1.20倍和脾脏中为野生型水平的1.03倍(数据未显示)。在分析骨髓时观察到类似的降低至接近WT水平(数据未显示)。

另一方面，

处理仅显示肝脏中己糖神经酰胺的显著降低，而其他测试组织的己糖神经酰胺水平则没有显著变化。

似乎对任何测试组织中的己糖基鞘氨醇水平没有任何显著影响。

当然应当理解，虽然本发明已经通过示例的方式进行了描述，但是这些实施例绝不意味着限制，并且可以在所附权利要求书的范围内进行修改。本发明的每个实施方案的优选特征与其他实施方案中的每一个相同。在本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，都通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物都被具体地和单独地指示为通过引用并入本文一样。

序列表

<110> 自由行疗法有限公司

<120> 多核苷酸

<130> N414281WO

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

gccaggccct gcatccctaa gagctttggc tacagctctg tggtgtgtgt gtgcaatgcc 60

acctactgtg acagctttga cccccccacc tttcctgccc tgggcacctt cagcagatat 120

gagagcacca ggtctgggag gaggatggag ctgagcatgg ggcccatcca ggctaatcac 180

actggcactg gcctgctgct gaccctgcag cctgagcaga agttccagaa agtaaagggc 240

tttggagggg ccatgactga tgctgctgct ctgaacatcc tggccctgag cccccctgcc 300

cagaatctgc tgctgaagag ctacttctct gaggagggca ttggctataa catcatcagg 360

gtgcccatgg ccagctgtga cttcagcatc aggacctaca cctatgctga cacccctgat 420

gatttccagc tgcacaactt cagcctgcct gaggaggata ccaagctgaa gatcccactg 480

atccacaggg ctctgcagct ggcccagagg cctgtgagcc tgctggccag cccctggacc 540

agccccactt ggctgaagac caatggggct gtgaatggga aggggagcct gaagggacag 600

cctggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660

gctgagcaca agctgcagtt ctgggctgtg actgctgaga atgagccttc tgctgggctg 720

ctgtctggct accccttcca atgcctgggc ttcacccctg agcatcagag ggacttcatt 780

gccagggacc tgggccctac cctggccaac agcactcacc ataatgttag gctgctgatg 840

ctggatgacc agaggctgct gctgccccac tgggctaagg tggtgctgac tgaccctgag 900

gctgctaaat atgtgcatgg cattgctgtg cattggtacc tggactttct ggctcctgcc 960

aaggccaccc tgggggagac ccacaggctg ttccccaaca ccatgctgtt tgcctctgag 1020

gcctgtgtgg gcagcaagtt ctgggagcag tctgtgaggc tgggcagctg ggataggggg 1080

atgcagtaca gccacagcat catcaccaac ctgctgtacc atgtggtggg ctggactgac 1140

tggaacctgg ccctgaaccc tgagggagga cctaactggg tcagaaactt tgtggacagc 1200

cccatcattg tggacatcac caaggacacc ttttacaagc agcccatgtt ctaccacctg 1260

ggccacttca gcaagttcat ccctgagggc agccagagag tggggctggt ggccagccag 1320

aagaatgacc tggatgctgt ggctctgatg catcctgatg gctctgctgt ggtggtggtg 1380

ctgaacagga gctctaagga tgtgcctctg accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440

gagaccatca gccctggcta cagcatccac acctacctgt ggaggaggca gtga 1494

<210> 2

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

gccaggccct gtatccctaa gagctttggc tacagctcag tagtttgtgt ctgtaatgcc 60

acatactgtg actcctttga cccccctacc ttccctgccc tgggaacctt cagcagatat 120

gagtcaacaa gatcaggaag gaggatggag ctgtcaatgg gacccatcca ggctaatcac 180

acaggcacag gcctgctgct gaccctgcag ccagaacaga agttccagaa agtgaaggga 240

tttggaggag ccatgacaga tgctgctgct ctcaacatcc tggccctgtc accccctgcc 300

cagaatctgc tgctgaagtc atacttctct gaagaaggaa ttggatataa catcatcagg 360

gtgcccatgg ccagctgtga cttctccatc aggacctaca cctatgctga cacccctgat 420

gatttccagc tgcacaactt cagcctccca gaggaagata ccaagctcaa gatccctctg 480

atacataggg cactgcagct ggcccagagg cctgtgtcac tcctggccag cccctggaca 540

tcacccactt ggctcaagac caatggagct gtgaatggaa agggatcact caagggacag 600

cctggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660

gctgagcaca agctgcagtt ctgggcagtg acagctgaaa atgagccttc tgctggactg 720

ctgtcaggat accccttcca gtgtctgggc ttcacccctg aacatcagag ggacttcatt 780

gccagggacc tgggacctac ccttgccaac tcaactcacc acaatgtcag gctgctcatg 840

ctggatgacc agaggctgct gctgccccac tgggccaagg tggtgctgac agacccagaa 900

gctgctaaat atgtgcatgg cattgctgtg cattggtacc tggacttcct ggctccagcc 960

aaggccaccc tgggagagac acacaggctg ttccccaaca ccatgctctt tgcctctgag 1020

gcctgtgtgg gctccaagtt ctgggagcag tcagtgaggc tgggctcctg ggatagggga 1080

atgcagtaca gccacagcat catcacaaac ctcctgtacc atgtggtggg ctggactgac 1140

tggaacctgg ccctgaaccc tgaaggagga cccaactggg tcagaaattt tgtggactca 1200

cccatcattg tggacatcac caaggacaca ttctacaagc agcccatgtt ctaccacctg 1260

ggccacttca gcaagttcat ccctgagggc tcccagaggg tgggactggt ggcctcacag 1320

aagaatgacc tggatgcagt ggccctgatg catcctgatg gctctgctgt ggtggttgtg 1380

ctgaatagat cctctaagga tgtgcctctg accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440

gagacaatct cacctggcta ctccatccac acctacctgt ggaggaggca gtga 1494

<210> 3

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

gccaggccct gcatccctaa gagctttggc tacagctctg tggtgtgtgt gtgcaatgcc 60

acatactgtg actcctttga cccccccacc tttcctgccc tgggcacatt ctccagatat 120

gagagcacaa gatctgggag aaggatggag ctgagcatgg ggcccatcca ggctaatcac 180

actggcacag gcctgctgct gaccctgcag cctgaacaga agtttcagaa agtgaaggga 240

tttggagggg ccatgacaga tgctgctgct ctgaatatcc tggccctgtc accccctgcc 300

cagaatctgc tgctgaagag ctacttttca gaagaaggaa ttggatataa tatcatcaga 360

gtgcccatgg ccagctgtga cttttccatc agaacctaca cctatgcaga cacccctgat 420

gattttcagc tgcacaattt tagcctgcct gaggaagata ccaagctgaa gatacccctg 480

attcacaggg ccctgcagct ggcccagagg cctgtttcac tgctggccag cccctggaca 540

tcacccacct ggctgaagac caatggagct gtgaatggga aggggtcact gaagggacag 600

cctggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagtttct ggatgcctat 660

gctgagcaca agctgcagtt ttgggcagtg acagctgaaa atgagccttc agctgggctg 720

ctgtcaggat acccctttca gtgcctgggc tttacccctg aacatcagag ggactttatt 780

gccagggacc tgggccctac cctggccaat agcacccacc ataatgtgag gttgctgatg 840

ctggatgacc agaggctgct gctgccccac tgggcaaagg tggtgctgac agaccctgaa 900

gcagctaaat atgttcatgg cattgctgtg cattggtacc tggactttct ggctcctgcc 960

aaggccaccc tgggggagac acacaggctg tttcccaata ccatgctgtt tgcctctgag 1020

gcctgtgtgg gctccaagtt ttgggagcag tctgtgaggc tgggctcctg ggatagaggg 1080

atgcagtaca gccacagcat catcaccaat ctgctgtacc atgtggtggg ctggactgac 1140

tggaatctgg ccctgaatcc tgaaggagga cctaactggg tcaggaattt tgtggacagc 1200

cccatcattg tggacatcac caaggacacc ttttacaagc agcccatgtt ttaccacctg 1260

ggccacttta gcaagtttat tcctgagggc tcccagagag tggggctggt tgccagccag 1320

aagaatgacc tggatgcagt ggcactgatg catcctgatg gctcagctgt tgtggtggtg 1380

ctgaatagat ccagcaagga tgtgcctctg accatcaagg atcctgctgt gggctttctg 1440

gagacaatct cacctggcta ctccattcac acctacctgt ggagaaggca gtga 1494

<210> 4

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

gccaggcctt gcatcccaaa gtctttcggc tacagctccg tggtgtgcgt gtgcaacgcc 60

acctattgtg actccttcga tccccctacc tttcccgccc tgggcacatt ttctagatac 120

gagtctacac gcagcggccg gagaatggag ctgagcatgg gccctatcca ggccaatcac 180

acaggaacag gcctgctgct gaccctgcag ccagagcaga agttccagaa ggtgaagggc 240

tttggcggag ccatgacaga tgcagccgcc ctgaacatcc tggccctgtc cccacccgcc 300

cagaatctgc tgctgaagtc ctacttctct gaggagggca tcggctataa catcatccgg 360

gtgcccatgg ccagctgcga cttttccatc agaacctaca catatgccga tacccctgac 420

gatttccagc tgcacaattt ttccctgcca gaggaggata caaagctgaa gatccccctg 480

attcaccggg ccctgcagct ggcacagcgg cccgtgagcc tgctggccag cccctggacc 540

tcccctacat ggctgaagac caacggcgcc gtgaatggca agggctctct gaagggacag 600

cctggcgaca tctaccacca gacatgggcc agatatttcg tgaagtttct ggatgcctac 660

gccgagcaca agctgcagtt ctgggccgtg acagcagaga atgagccttc tgccggcctg 720

ctgagcggct atcccttcca gtgcctgggc tttacacctg agcaccagcg ggactttatc 780

gccagagatc tgggcccaac cctggccaac tccacacacc acaatgtgag gctgctgatg 840

ctggacgatc agcgcctgct gctgcctcac tgggccaagg tggtgctgac cgacccagag 900

gccgccaagt acgtgcacgg catcgccgtg cactggtatc tggatttcct ggcacctgca 960

aaggccaccc tgggagagac acaccggctg ttccctaaca ccatgctgtt tgccagcgag 1020

gcctgcgtgg gctccaagtt ttgggagcag tccgtgaggc tgggatcttg ggacagaggc 1080

atgcagtact cccactctat catcaccaat ctgctgtatc acgtggtggg ctggacagac 1140

tggaacctgg ccctgaatcc agagggcggc cccaactggg tgagaaattt cgtggatagc 1200

cccatcatcg tggacatcac caaggataca ttctacaagc agccaatgtt ttatcacctg 1260

ggccacttct ctaagtttat ccctgagggc agccagaggg tgggcctggt ggccagccag 1320

aagaacgacc tggatgccgt ggccctgatg caccctgatg gctccgccgt ggtggtggtg 1380

ctgaatcgct ctagcaagga cgtgcctctg accatcaagg atccagccgt gggatttctg 1440

gagactattt cacctggcta ttcaattcat acctacctgt ggaggaggca gtga 1494

<210> 5

<211> 1611

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 5

atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60

atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120

aggccctgca tccctaagag ctttggctac agctctgtgg tgtgtgtgtg caatgccacc 180

tactgtgaca gctttgaccc ccccaccttt cctgccctgg gcaccttcag cagatatgag 240

agcaccaggt ctgggaggag gatggagctg agcatggggc ccatccaggc taatcacact 300

ggcactggcc tgctgctgac cctgcagcct gagcagaagt tccagaaagt aaagggcttt 360

ggaggggcca tgactgatgc tgctgctctg aacatcctgg ccctgagccc ccctgcccag 420

aatctgctgc tgaagagcta cttctctgag gagggcattg gctataacat catcagggtg 480

cccatggcca gctgtgactt cagcatcagg acctacacct atgctgacac ccctgatgat 540

ttccagctgc acaacttcag cctgcctgag gaggatacca agctgaagat cccactgatc 600

cacagggctc tgcagctggc ccagaggcct gtgagcctgc tggccagccc ctggaccagc 660

cccacttggc tgaagaccaa tggggctgtg aatgggaagg ggagcctgaa gggacagcct 720

ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780

gagcacaagc tgcagttctg ggctgtgact gctgagaatg agccttctgc tgggctgctg 840

tctggctacc ccttccaatg cctgggcttc acccctgagc atcagaggga cttcattgcc 900

agggacctgg gccctaccct ggccaacagc actcaccata atgttaggct gctgatgctg 960

gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gctaaggtgg tgctgactga ccctgaggct 1020

gctaaatatg tgcatggcat tgctgtgcat tggtacctgg actttctggc tcctgccaag 1080

gccaccctgg gggagaccca caggctgttc cccaacacca tgctgtttgc ctctgaggcc 1140

tgtgtgggca gcaagttctg ggagcagtct gtgaggctgg gcagctggga tagggggatg 1200

cagtacagcc acagcatcat caccaacctg ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260

aacctggccc tgaaccctga gggaggacct aactgggtca gaaactttgt ggacagcccc 1320

atcattgtgg acatcaccaa ggacaccttt tacaagcagc ccatgttcta ccacctgggc 1380

cacttcagca agttcatccc tgagggcagc cagagagtgg ggctggtggc cagccagaag 1440

aatgacctgg atgctgtggc tctgatgcat cctgatggct ctgctgtggt ggtggtgctg 1500

aacaggagct ctaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560

accatcagcc ctggctacag catccacacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611

<210> 6

<211> 1611

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60

atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120

aggccctgta tccctaagag ctttggctac agctcagtag tttgtgtctg taatgccaca 180

tactgtgact cctttgaccc ccctaccttc cctgccctgg gaaccttcag cagatatgag 240

tcaacaagat caggaaggag gatggagctg tcaatgggac ccatccaggc taatcacaca 300

ggcacaggcc tgctgctgac cctgcagcca gaacagaagt tccagaaagt gaagggattt 360

ggaggagcca tgacagatgc tgctgctctc aacatcctgg ccctgtcacc ccctgcccag 420

aatctgctgc tgaagtcata cttctctgaa gaaggaattg gatataacat catcagggtg 480

cccatggcca gctgtgactt ctccatcagg acctacacct atgctgacac ccctgatgat 540

ttccagctgc acaacttcag cctcccagag gaagatacca agctcaagat ccctctgata 600

catagggcac tgcagctggc ccagaggcct gtgtcactcc tggccagccc ctggacatca 660

cccacttggc tcaagaccaa tggagctgtg aatggaaagg gatcactcaa gggacagcct 720

ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780

gagcacaagc tgcagttctg ggcagtgaca gctgaaaatg agccttctgc tggactgctg 840

tcaggatacc ccttccagtg tctgggcttc acccctgaac atcagaggga cttcattgcc 900

agggacctgg gacctaccct tgccaactca actcaccaca atgtcaggct gctcatgctg 960

gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gccaaggtgg tgctgacaga cccagaagct 1020

gctaaatatg tgcatggcat tgctgtgcat tggtacctgg acttcctggc tccagccaag 1080

gccaccctgg gagagacaca caggctgttc cccaacacca tgctctttgc ctctgaggcc 1140

tgtgtgggct ccaagttctg ggagcagtca gtgaggctgg gctcctggga taggggaatg 1200

cagtacagcc acagcatcat cacaaacctc ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260

aacctggccc tgaaccctga aggaggaccc aactgggtca gaaattttgt ggactcaccc 1320

atcattgtgg acatcaccaa ggacacattc tacaagcagc ccatgttcta ccacctgggc 1380

cacttcagca agttcatccc tgagggctcc cagagggtgg gactggtggc ctcacagaag 1440

aatgacctgg atgcagtggc cctgatgcat cctgatggct ctgctgtggt ggttgtgctg 1500

aatagatcct ctaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560

acaatctcac ctggctactc catccacacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611

<210> 7

<211> 1611

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 7

atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60

atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120

aggccctgca tccctaagag ctttggctac agctctgtgg tgtgtgtgtg caatgccaca 180

tactgtgact cctttgaccc ccccaccttt cctgccctgg gcacattctc cagatatgag 240

agcacaagat ctgggagaag gatggagctg agcatggggc ccatccaggc taatcacact 300

ggcacaggcc tgctgctgac cctgcagcct gaacagaagt ttcagaaagt gaagggattt 360

ggaggggcca tgacagatgc tgctgctctg aatatcctgg ccctgtcacc ccctgcccag 420

aatctgctgc tgaagagcta cttttcagaa gaaggaattg gatataatat catcagagtg 480

cccatggcca gctgtgactt ttccatcaga acctacacct atgcagacac ccctgatgat 540

tttcagctgc acaattttag cctgcctgag gaagatacca agctgaagat acccctgatt 600

cacagggccc tgcagctggc ccagaggcct gtttcactgc tggccagccc ctggacatca 660

cccacctggc tgaagaccaa tggagctgtg aatgggaagg ggtcactgaa gggacagcct 720

ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agtttctgga tgcctatgct 780

gagcacaagc tgcagttttg ggcagtgaca gctgaaaatg agccttcagc tgggctgctg 840

tcaggatacc cctttcagtg cctgggcttt acccctgaac atcagaggga ctttattgcc 900

agggacctgg gccctaccct ggccaatagc acccaccata atgtgaggtt gctgatgctg 960

gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gcaaaggtgg tgctgacaga ccctgaagca 1020

gctaaatatg ttcatggcat tgctgtgcat tggtacctgg actttctggc tcctgccaag 1080

gccaccctgg gggagacaca caggctgttt cccaatacca tgctgtttgc ctctgaggcc 1140

tgtgtgggct ccaagttttg ggagcagtct gtgaggctgg gctcctggga tagagggatg 1200

cagtacagcc acagcatcat caccaatctg ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260

aatctggccc tgaatcctga aggaggacct aactgggtca ggaattttgt ggacagcccc 1320

atcattgtgg acatcaccaa ggacaccttt tacaagcagc ccatgtttta ccacctgggc 1380

cactttagca agtttattcc tgagggctcc cagagagtgg ggctggttgc cagccagaag 1440

aatgacctgg atgcagtggc actgatgcat cctgatggct cagctgttgt ggtggtgctg 1500

aatagatcca gcaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg ctttctggag 1560

acaatctcac ctggctactc cattcacacc tacctgtgga gaaggcagtg a 1611

<210> 8

<211> 1611

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60

atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120

aggccttgca tcccaaagtc tttcggctac agctccgtgg tgtgcgtgtg caacgccacc 180

tattgtgact ccttcgatcc ccctaccttt cccgccctgg gcacattttc tagatacgag 240

tctacacgca gcggccggag aatggagctg agcatgggcc ctatccaggc caatcacaca 300

ggaacaggcc tgctgctgac cctgcagcca gagcagaagt tccagaaggt gaagggcttt 360

ggcggagcca tgacagatgc agccgccctg aacatcctgg ccctgtcccc acccgcccag 420

aatctgctgc tgaagtccta cttctctgag gagggcatcg gctataacat catccgggtg 480

cccatggcca gctgcgactt ttccatcaga acctacacat atgccgatac ccctgacgat 540

ttccagctgc acaatttttc cctgccagag gaggatacaa agctgaagat ccccctgatt 600

caccgggccc tgcagctggc acagcggccc gtgagcctgc tggccagccc ctggacctcc 660

cctacatggc tgaagaccaa cggcgccgtg aatggcaagg gctctctgaa gggacagcct 720

ggcgacatct accaccagac atgggccaga tatttcgtga agtttctgga tgcctacgcc 780

gagcacaagc tgcagttctg ggccgtgaca gcagagaatg agccttctgc cggcctgctg 840

agcggctatc ccttccagtg cctgggcttt acacctgagc accagcggga ctttatcgcc 900

agagatctgg gcccaaccct ggccaactcc acacaccaca atgtgaggct gctgatgctg 960

gacgatcagc gcctgctgct gcctcactgg gccaaggtgg tgctgaccga cccagaggcc 1020

gccaagtacg tgcacggcat cgccgtgcac tggtatctgg atttcctggc acctgcaaag 1080

gccaccctgg gagagacaca ccggctgttc cctaacacca tgctgtttgc cagcgaggcc 1140

tgcgtgggct ccaagttttg ggagcagtcc gtgaggctgg gatcttggga cagaggcatg 1200

cagtactccc actctatcat caccaatctg ctgtatcacg tggtgggctg gacagactgg 1260

aacctggccc tgaatccaga gggcggcccc aactgggtga gaaatttcgt ggatagcccc 1320

atcatcgtgg acatcaccaa ggatacattc tacaagcagc caatgtttta tcacctgggc 1380

cacttctcta agtttatccc tgagggcagc cagagggtgg gcctggtggc cagccagaag 1440

aacgacctgg atgccgtggc cctgatgcac cctgatggct ccgccgtggt ggtggtgctg 1500

aatcgctcta gcaaggacgt gcctctgacc atcaaggatc cagccgtggg atttctggag 1560

actatttcac ctggctattc aattcatacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611

<210> 9

<211> 1611

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 9

atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60

atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120

cgcccctgca tccctaaaag cttcggctac agctcggtgg tgtgtgtctg caatgccaca 180

tactgtgact cctttgaccc cccgaccttt cctgcccttg gtaccttcag ccgctatgag 240

agtacacgca gtgggcgacg gatggagctg agtatggggc ccatccaggc taatcacacg 300

ggcacaggcc tgctactgac cctgcagcca gaacagaagt tccagaaagt gaagggattt 360

ggaggggcca tgacagatgc tgctgctctc aacatccttg ccctgtcacc ccctgcccaa 420

aatttgctac ttaaatcgta cttctctgaa gaaggaatcg gatataacat catccgggta 480

cccatggcca gctgtgactt ctccatccgc acctacacct atgcagacac ccctgatgat 540

ttccagttgc acaacttcag cctcccagag gaagatacca agctcaagat acccctgatt 600

caccgagccc tgcagttggc ccagcgtccc gtttcactcc ttgccagccc ctggacatca 660

cccacttggc tcaagaccaa tggagcggtg aatgggaagg ggtcactcaa gggacagccc 720

ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780

gagcacaagt tacagttctg ggcagtgaca gctgaaaatg agccttctgc tgggctgttg 840

agtggatacc ccttccagtg cctgggcttc acccctgaac atcagcgaga cttcattgcc 900

cgtgacctag gtcctaccct cgccaacagt actcaccaca atgtccgcct actcatgctg 960

gatgaccaac gcttgctgct gccccactgg gcaaaggtgg tactgacaga cccagaagca 1020

gctaaatatg ttcatggcat tgctgtacat tggtacctgg actttctggc tccagccaaa 1080

gccaccctag gggagacaca ccgcctgttc cccaacacca tgctctttgc ctcagaggcc 1140

tgtgtgggct ccaagttctg ggagcagagt gtgcggctag gctcctggga tcgagggatg 1200

cagtacagcc acagcatcat cacgaacctc ctgtaccatg tggtcggctg gaccgactgg 1260

aaccttgccc tgaaccccga aggaggaccc aattgggtgc gtaactttgt cgacagtccc 1320

atcattgtag acatcaccaa ggacacgttt tacaaacagc ccatgttcta ccaccttggc 1380

cacttcagca agttcattcc tgagggctcc cagagagtgg ggctggttgc cagtcagaag 1440

aacgacctgg acgcagtggc actgatgcat cccgatggct ctgctgttgt ggtcgtgcta 1500

aaccgctcct ctaaggatgt gcctcttacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560

acaatctcac ctggctactc cattcacacc tacctgtggc gtcgccagtg a 1611

<210> 10

<211> 334

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaca cctctctggg cccatgccac ctccaactgg 120

acacaggacg ctgtggtttc tgagccaggg ggcgactcag atcccagcca gtggacttag 180

cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca gcagcctccc 240

ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct gtctcctcag 300

cttcaggcac caccactgac ctgggacagt gaat 334

<210> 11

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 11

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaca cctctctggg cccatgccac ctccaac 117

<210> 12

<211> 185

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

gggcgactca gatcccagcc agtggactta gcccctgttt gctcctccga taactggggt 60

gaccttggtt aatattcacc agcagcctcc cccgttgccc ctctggatcc actgcttaaa 120

tacggacgag gacagggccc tgtctcctca gcttcaggca ccaccactga cctgggacag 180

tgaat 185

<210> 13

<211> 659

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 13

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 420

cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 480

tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg 540

gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 600

cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcg 659

<210> 14

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 14

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300

ggtttaggta gtgtgagagg ggtacccggg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag 360

gattctgcag tgagagcaga gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc 420

acgccacccc ctccaccttg gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact 480

cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag 540

gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg 600

gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta 660

aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac 720

agtgaatgat ccccctgatc tgcggcc 747

<210> 15

<211> 418

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 15

ggatcttgct accagtggaa cagccactaa ggattctgca gtgagagcag agggccagct 60

aagtggtact ctcccagaga ctgtctgact cacgccaccc cctccacctt ggacacagga 120

cgctgtggtt tctgagccag gtacaatgac tcctttcggt aagtgcagtg gaagctgtac 180

actgcccagg caaagcgtcc gggcagcgta ggcgggcgac tcagatccca gccagtggac 240

ttagcccctg tttgctcctc cgataactgg ggtgaccttg gttaatattc accagcagcc 300

tcccccgttg cccctctgga tccactgctt aaatacggac gaggacaggg ccctgtctcc 360

tcagcttcag gcaccaccac tgacctggga cagtgaatga tccccctgat ctgcggcc 418

<210> 16

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 16

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300

ggtttaggta gtgtgagagg g 321

<210> 17

<211> 117

<212> DNA

<213> 智人

<400> 17

atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60

atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggt 117

<210> 18

<211> 39

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

Met Glu Phe Ser Ser Pro Ser Arg Glu Glu Cys Pro Lys Pro Leu Ser

1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Met Ala Gly Ser Leu Thr Gly Leu Leu Leu Leu Gln

20 25 30

Ala Val Ser Trp Ala Ser Gly

35

<210> 19

<211> 736

<212> PRT

<213> 腺相关病毒3B

<400> 19

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

260 265 270

Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

340 345 350

Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

355 360 365

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser

370 375 380

Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser

385 390 395 400

Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

405 410 415

Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

420 425 430

Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr

435 440 445

Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser

450 455 460

Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro

465 470 475 480

Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln

565 570 575

Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr

580 585 590

Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 20

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成衣壳蛋白

<400> 20

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

260 265 270

Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

340 345 350

Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

355 360 365

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser

370 375 380

Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser

385 390 395 400

Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

405 410 415

Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

420 425 430

Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr

435 440 445

Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser

450 455 460

Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro

465 470 475 480

Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln

565 570 575

Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr

580 585 590

Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 21

<211> 736

<212> PRT

<213> 腺相关病毒9

<400> 21

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser

565 570 575

Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln

580 585 590

Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 22

<211> 66

<212> DNA

<213> 猿猴病毒40

<400> 22

gtaaatataa aatttttaag tgtataatgt gttaaactac tgattctaat tgtttctctc 60

ttttag 66

<210> 23

<211> 208

<212> DNA

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 23

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctgggga 208

<210> 24

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成衣壳蛋白

<400> 24

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

260 265 270

Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

340 345 350

Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

355 360 365

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser

370 375 380

Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser

385 390 395 400

Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

405 410 415

Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

420 425 430

Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr

435 440 445

Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser

450 455 460

Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro

465 470 475 480

Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln

565 570 575

Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr

580 585 590

Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu

725 730 735

<210> 25

<211> 536

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

Met Glu Phe Ser Ser Pro Ser Arg Glu Glu Cys Pro Lys Pro Leu Ser

1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Met Ala Gly Ser Leu Thr Gly Leu Leu Leu Leu Gln

20 25 30

Ala Val Ser Trp Ala Ser Gly Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe

35 40 45

Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser

50 55 60

Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu

65 70 75 80

Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln

85 90 95

Ala Asn His Thr Gly Thr Gly Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln

100 105 110

Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala

115 120 125

Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu

130 135 140

Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val

145 150 155 160

Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp

165 170 175

Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp

180 185 190

Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln

195 200 205

Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu

210 215 220

Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro

225 230 235 240

Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu

245 250 255

Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu

260 265 270

Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu

275 280 285

Gly Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly

290 295 300

Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu

305 310 315 320

Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr

325 330 335

Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr

340 345 350

Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg

355 360 365

Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser

370 375 380

Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met

385 390 395 400

Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly

405 410 415

Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp

420 425 430

Val Arg Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp

435 440 445

Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys

450 455 460

Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys

465 470 475 480

Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val

485 490 495

Val Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys

500 505 510

Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile

515 520 525

His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg Gln

530 535

Claims

1.包含GBA核苷酸序列的多核苷酸，其中所述GBA核苷酸序列编码β-葡糖脑苷脂酶(GCase)蛋白或其片段，并且其中至少一部分GBA核苷酸序列不是野生型，任选地其中不是野生型的GBA核苷酸序列的部分是密码子优化的，更任选地其中所述GBA核苷酸序列编码GCase蛋白或其片段并包含以下的序列：

(i)与SEQ ID NO:1-8中任一项的核苷酸序列100％相同；

(ii)与SEQ ID NO:1-8中任一项的核苷酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同；和/或

(iii)编码具有GCase活性的GCase蛋白的SEQ ID NO:1-8中任一项的变体，其中除了所述变体包含核苷酸置换使得GCase蛋白相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个或最多10个氨基酸置换以外，所述变体分别与SEQ ID NO:1-8相同。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述GBA核苷酸序列包含以下的序列：

(i)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的核苷酸序列100％相同；

(ii)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的核苷酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.8％相同；和/或

(iii)编码具有GCase活性的GCase蛋白的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的变体，其中除了所述变体包含核苷酸置换使得GCase蛋白相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个或最多10个氨基酸置换以外，所述变体分别与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5相同。

3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述变体是SEQ ID NO:1的变体，并且所述SEQ ID NO:1的变体：

(i)除了所述变体包含核苷酸置换使得GCase蛋白相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个或最多10个氨基酸置换以外，与SEQ ID NO:1相同；

(ii)相对于SEQ ID NO:1的序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个、最多10个、最多20个或最多30个核苷酸置换；

(iii)相对于SEQ ID NO:1的序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个或最多6个核苷酸置换；

(iv)相对于SEQ ID NO:1的序列具有最多4个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ ID NO:25的野生型氨基酸GCase序列具有最多3个氨基酸置换的GCase蛋白；

(v)相对于SEQ ID NO:1的序列具有最多3个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ ID NO:25的野生型氨基酸GCase序列具有最多2个氨基酸置换的GCase蛋白；和/或

(vi)相对于SEQ ID NO:1的序列具有1个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ ID NO:25的野生型氨基酸GCase序列具有最多1个氨基酸置换的GCase蛋白。

4.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述变体是SEQ ID NO:5的变体，并且所述SEQ ID NO:5的变体：

(i)除了所述变体包含核苷酸置换使得GCase蛋白相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个或最多10个氨基酸置换以外，与SEQ ID NO:5相同；

(ii)相对于SEQ ID NO:5的序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个、最多10个、最多20个或最多30个核苷酸置换；

(iii)相对于SEQ ID NO:5的序列具有1个、最多2个、最多3个、最多4个、最多5个或最多6个核苷酸置换；

(iv)相对于SEQ ID NO:5的序列具有最多4个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ ID NO:25的野生型氨基酸GCase序列具有最多3个氨基酸置换的GCase蛋白；

(v)相对于SEQ ID NO:5的序列具有最多3个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ ID NO:25的野生型氨基酸GCase序列具有最多2个氨基酸置换的GCase蛋白；和/或

(vi)相对于SEQ ID NO:5的序列具有1个核苷酸置换和/或编码相对于SEQ ID NO:25的野生型氨基酸GCase序列具有最多1个氨基酸置换的GCase蛋白。

5.根据前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述GBA核苷酸序列编码这样的GCase蛋白，所述GCase蛋白具有：

(i)相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列最多3个氨基酸置换；

(ii)相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列最多2个氨基酸置换；和/或

(iii)相对于SEQ ID NO:25的野生型GCase氨基酸序列最多1个氨基酸置换。

6.包含GBA核苷酸序列的多核苷酸，其中所述GBA核苷酸序列编码GCase蛋白或其片段并且包含与SEQ ID NO:1-8中任一个的至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、小于1611个、1000至1494个、1000至1611个、1300至1494个、1300至1611个、约1494个或约1611个核苷酸的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的序列。

7.根据前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述GBA核苷酸序列中的至少一部分是密码子优化的。

8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中：

(a)所述GBA核苷酸序列的密码子优化的至少一部分是针对在人肝细胞中表达进行密码子优化的；

(b)所述GBA核苷酸序列的密码子优化的部分是连续部分；

(c)所述GBA核苷酸序列是针对在人肝细胞中表达进行密码子优化的；

(d)所述GBA核苷酸序列的密码子优化的部分的长度为至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、1000至1494个、1300至1494个或约1494个核苷酸；

(e)所述GBA核苷酸序列的密码子优化的部分对应于成熟GCase蛋白；

(f)所述GBA核苷酸序列的密码子优化的部分不编码全部信号肽或信号肽的一部分；

(g)与野生型GBA核苷酸序列的相应部分相比，所述GBA核苷酸序列或GBA核苷酸序列的密码子优化的部分包含的CpG数量减少；任选地其中所述GBA核苷酸序列或GBA核苷酸序列的密码子优化的部分包含小于40个、小于20个、小于18个、小于10个或小于5个CpG，更任选地其中所述GBA核苷酸序列或GBA核苷酸序列的密码子优化的部分每100个核苷酸包含小于5个、小于4个、小于3个或小于2个CpG，更任选地其中所述GBA核苷酸序列或GBA核苷酸序列的密码子优化的部分不含CpG，优选地其中所述野生型GBA核苷酸序列是SEQ ID NO:9；

(h)所述GBA核苷酸序列的密码子优化的部分与SEQ ID NO:1-4中任一个的至少1000个、至少1200个、至少1300个、小于1494个、1000至1494个、1300至1494个或约1494个核苷酸的片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同；和/或

(i)所述GBA核苷酸序列的密码子优化的部分与SEQ ID NO:1至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。

9.根据前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述GBA核苷酸序列包含未经密码子优化的部分，任选地其中：

(a)所述未经密码子优化的部分编码全部GCase信号肽或GCase信号肽的一部分；

(b)所述未经密码子优化的部分为至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、小于200个、小于170个、小于140个或约117个核苷酸；和/或

(c)所述未经密码子优化的部分包含1个或多个CpG。

10.根据前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含转录调控元件，任选地其中所述转录调控元件包含增强子和/或肝脏特异性启动子。

11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述转录调控元件包含A1AT启动子或A1AT启动子的片段，任选地其中：

(a)所述A1AT启动子或A1AT启动子的片段长度为至少100个、至少120个、至少150个、至少180个、小于255个、100至255个、150至225个、150至300个或180至255个核苷酸，更任选地其中所述A1AT启动子的片段长度为180至255个核苷酸；

(b)所述A1AT启动子或A1AT启动子的片段长度为至少200个、至少250个、至少300个、小于500个、200至500个、250至500个、350至450个或约418个核苷酸，更任选地其中A1AT启动子的片段长度为350至450个核苷酸；和/或

(c)所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的启动子。

12.根据权利要求10或11所述的多核苷酸，其中所述增强子是HCR增强子或HCR增强子的片段，任选地其中：

(a)所述HCR增强子或HCR增强子的片段是长度为至少80个、至少90个、至少100个、小于192个、80至192个、90至192个、100至250个或117至192个核苷酸的片段，更任选地其中所述HCR增强子的片段长度为117至192个核苷酸；

(b)所述HCR增强子或HCR增强子的片段是长度为至少150个、至少190个、至少230个、小于400个、150至400个、190至370个、230至340个、250至340个或约321个核苷酸的片段，更任选地其中所述HCR增强子的片段长度为250至340个核苷酸；

(c)所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的增强子。

13.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述转录调控元件与SEQ ID NO:14或10至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同。

14.根据前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中与由在其他方面相同的参考多核苷酸中野生型GBA核苷酸序列编码的GCase相比，由所述GBA核苷酸序列编码的GCase在人肝细胞中的表达水平更高，任选地其中与由参考多核苷酸中野生型GBA核苷酸序列编码的GCase相比，由所述GBA核苷酸序列编码的GCase在人肝细胞中的表达水平为至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍或至少1.5倍，更任选地其中所述参考多核苷酸包含SEQ IDNO:9的野生型GBA核苷酸序列，任选地其中所述参考多核苷酸包含SEQ ID NO:13的启动子。

15.包含重组基因组的病毒颗粒，所述重组基因组包含前述权利要求中任一项所述的多核苷酸。

16.根据权利要求15所述的病毒颗粒，其为AAV病毒颗粒、腺病毒病毒颗粒或慢病毒病毒颗粒，任选地其为AAV病毒颗粒。

17.根据权利要求15或16所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含嗜肝衣壳或嗜CNS衣壳。

18.根据权利要求17所述的病毒颗粒，其中所述嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:19、20或24的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段至少98％、至少99％、至少99.5％相同的序列，任选地其中所述嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:19或20至少99％相同的序列。

19.根据权利要求17所述的病毒颗粒，其中所述嗜CNS衣壳包含与SEQ ID NO:21的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段至少98％、至少99％、至少99.5％相同的序列，任选地其中所述嗜CNS衣壳包含与SEQ ID NO:21至少99％相同的序列。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的病毒颗粒，其中所述重组基因组还包含：

a)AAV2 ITR；

b)多聚腺苷酸序列；和/或

c)内含子；

任选地其中所述重组基因组是单链的。

21.根据权利要求15至20中任一项所述的病毒颗粒，其中在转导到Huh-7细胞中后，所述病毒颗粒表达GCase或其片段，使得被转导的细胞中的GCase活性大于用其他方面相同的包含SEQ ID NO:9的GBA核苷酸序列的病毒颗粒转导的细胞中的GCase或其片段的活性，任选地其中在转导到Huh-7细胞中后，所述病毒颗粒表达GCase或其片段，使得被转导的细胞中的GCase活性是用其他方面相同的包含SEQ ID NO:9的GBA核苷酸序列的病毒颗粒转导的细胞中的GCase或其片段的活性的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或至少20倍，更任选地其中使用对GCase特异的荧光底物测量所述活性。

22.组合物，其包含根据前述权利要求中任一项的多核苷酸或病毒颗粒和药学上可接受的赋形剂。

23.根据前述权利要求中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于治疗方法。

24.用于根据权利要求23所述的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中所述治疗方法包括向患者施用有效量的根据权利要求1至22中任一项的多核苷酸、组合物或病毒颗粒。

25.用于根据权利要求23至24中任一项所述的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中所述治疗方法是治疗与GCase缺乏症相关的疾病的方法。

26.用于根据权利要求23至24中任一项所述的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中所述治疗方法是治疗帕金森病的方法。

27.用于根据权利要求23至24中任一项所述的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中所述治疗方法是治疗戈谢病的方法，任选地其中：

(i)所述戈谢病是I型、II型或III型戈谢病；和/或

(ii)所述患者具有针对重组GCase的抗体或抑制剂，所述患者之前已经用重组GCase作为酶替代疗法的一部分进行治疗。

28.根据权利要求1至22中任一项所述的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于在受试者中表达所述GBA核苷酸序列并实现稳定的GCase活性的方法。

29.根据权利要求1至22中任一项所述的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于在受试者中表达所述GBA核苷酸序列并提供比来自GCase酶替代疗法的生物利用度更高的GCase生物利用度的方法，其中在施用后2周的时间段内测量所述生物利用度。

30.用于根据权利要求28或29所述的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中实现稳定的GCase活性和/或提供更高的GCase生物利用度导致治疗所述受试者的疾病。

31.用于根据权利要求28至30中任一项所述的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中：

(i)使用对GCase特异的荧光底物测量所述GCase活性和/或生物利用度；

(ii)测量所述受试者的血清或血浆中的GCase活性；

(iii)测量所述受试者的巨噬细胞中的GCase活性；

(iv)所述受试者的GCase活性稳定在至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9μmol/h/ml的水平；

(v)所述受试者的GCase活性稳定在至少3μmol/h/ml的水平；

(vi)所述受试者的GCase活性稳定在至少5μmol/h/ml的水平；

(vii)所述受试者的GCase活性稳定在至少9μmol/h/ml的水平；

(viii)所述方法包括向所述受试者施用有效剂量的所述多核苷酸、病毒颗粒或组合物；

(ix)所述稳定的GCase活性是相对于健康受试者的GCase活性至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的GCase活性；

(x)所述稳定的GCase活性是相对于健康受试者的GCase活性10％至100％、20％至90％、30％至70％、40％至70％或50％至70％的GCase活性；

(xi)所述稳定的GCase活性在施用后至少5周内是稳定的；

(xii)所述稳定的GCase活性在施用后至少10周内是稳定的；

(xiii)所述稳定的GCase活性在施用后至少15周内是稳定的；

(xiv)所述稳定的GCase活性在施用后至少20周内是稳定的；

(xv)所述稳定的GCase活性在施用后至少25周内是稳定的；

(xvi)所述稳定的GCase活性在施用后至少30周内是稳定的；

(xvii)所述稳定的GCase活性在施用后至少35周内是稳定的；

(xviii)所述稳定的GCase活性在施用后至少40周内是稳定的；

(xix)当在施用后的相同时间点在相同测定中测量时，当与在施用有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中测量的活性相比时，所述方法在施用后至少5周、至少10周、至少15周、至少20周、至少25周、至少30周或至少35周在受试者的肝脏、脾脏和/或骨髓中实现更高的GCase活性；和/或

(xx)当在施用后的相同时间点在相同测定中测量时，当与在施用有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中测量的生物利用度相比时，所述方法在施用后至少5周、至少10周、至少15周、至少20周、至少25周、至少30周或至少35周的时间段内在受试者的肝脏、脾脏和/或骨髓中实现更高的GCase生物利用度。

32.用于根据权利要求30至31中任一项所述的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中所述疾病是戈谢病，任选地其中所述戈谢病是I型、II型或III型戈谢病。

33.根据权利要求1至22中任一项所述的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于降低患有与GCase缺乏症相关的疾病或病症的受试者中己糖神经酰胺和/或己糖鞘氨醇水平的方法，任选地其中降低己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平导致治疗所述与GCase缺乏症相关的疾病或病症。

34.用于根据权利要求33所述的用途的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中：

(i)当与施用权利要求1至22中任一项的多核苷酸、病毒颗粒或组合物时的己糖神经酰胺和/或己糖鞘氨醇水平相比时，所述己糖神经酰胺和/或己糖鞘氨醇水平降低了2倍或更多、3倍或更多、4倍或更多、5倍或更多、6倍或更多、2至3倍、2至4倍、2至5倍、2至6倍或3至5倍；

(ii)所述己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平的降低大于在施用有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中实现的降低，任选地当己糖神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平在施用后至少6周、至少8周、至少10周或至少12周测量时；

(iii)测量所述受试者的巨噬细胞中的所述己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平；

(iv)测量所述受试者的脾脏中的所述己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平；

(v)测量所述受试者的肝脏中的所述己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平；

(vi)测量所述受试者的血清中的所述己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平；

(vii)通过质谱法测量所述己糖神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平；和/或

(viii)所述疾病是戈谢病，任选地其中所述戈谢病是I型、II型或III型戈谢病。

35.用于根据权利要求23至34中任一项所述的用途或方法的多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中所述患者具有针对重组GCase的抗体或抑制剂，所述患者之前已经用重组GCase作为酶替代疗法的一部分进行治疗。