JP2019533990A

JP2019533990A - 酸性αグルコシダーゼ変異体及びその使用

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Publication number: JP2019533990A
Application number: JP2019513378A
Authority: JP
Inventors: ミンゴッツィ，フェデリコ; ロンジッティ，ジュゼッペ
Original assignee: ジェネトン; アンスティチュナショナルドゥラサンテエドゥラルシェルシュメディカル; ユニヴェルシテ・デヴリ・ヴァル・デソンヌ
Priority date: 2016-09-12
Filing date: 2017-09-12
Publication date: 2019-11-28
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Abstract

本発明は、酸性αグルコシダーゼ変異体及びその使用に関する。

Description

糖原病（ＧＳＤ）ＩＩ型及び酸性マルターゼ欠損症としても知られるポンペ病は、リソソーム酵素の酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠損症によって引き起こされる常染色体劣性代謝性筋疾患である。ＧＡＡは、リソソーム内でグリコーゲンをグルコースに加水分解するエキソ−１，４及び１，６−α−グルコシダーゼである。ＧＡＡの欠損によりリソソーム内にグリコーゲンが蓄積され、呼吸筋、心筋及び骨格筋への進行的な傷害が引き起こされる。該疾患は、通常は１〜２歳までに致命的となる急速に進行する乳児型の経過から、小児及び成人におけるかなりの罹患率及び早期死亡率を引き起こすことにより緩徐に進行する異質な経過まで多岐にわたる。Hirschhorn RR, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 3: 3389-3420 (2001, McGraw-Hill); Van der Ploeg and Reuser, Lancet 372: 1342-1351 (2008)。

ポンペ病を処置するためのヒトにおける現在の治療法は、別名酵素補充療法（ＥＲＴ）と呼ばれる組換えヒトＧＡＡの投与を含む。ＥＲＴは、重度の乳児型糖原病ＩＩ型に対して有効性を実証した。しかしながら、酵素療法の利点は、頻繁な注入の必要性及び組換えｈＧＡＡに対する阻害抗体の発生によって制限される（Amalfitano, A., et al. (2001) Genet. In Med. 3:132-138）。さらに、ＥＲＴは全身を効果的に修復しない。これはおそらく、末梢静脈から送達後のタンパク質の不十分な体内分布、いくつかの組織からの取り込みがなされないこと、及び高い免疫原性の組合せのためである。

ＥＲＴの代わりの又は補助としての、糖原病ＩＩ型を処置するための遺伝子療法アプローチの実現可能性が研究されている（Amalfitano, A., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8861-8866, Ding, E., et al. (2002) Mol. Ther. 5:436-446, Fraites, T. J., et al. (2002) Mol. Ther. 5:571-578, Tsujino, S., et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1609-1616）。しかしながら、遺伝子異常を修復するための筋肉に指向された遺伝子導入は、疾患が全身性であることの限界、及び、導入遺伝子の筋肉における発現が他の組織と比べてより免疫原性が高くなる傾向があるという事実に直面しなければならない。

Doerfler et al., 2016は、ヒトコドン最適化ＧＡＡをコードしている２つの構築物（一方は、肝特異的プロモーターの制御下にあり、他方は筋肉特異的プロモーターの制御下にある）の組合せ投与を記載している。肝臓特異的プロモーターにより駆動されるＧＡＡの発現が、Ｇａａ^−/−マウスモデルにおいてＧＡＡに対する免疫寛容を促進するために使用され、一方、筋肉特異的プロモーターにより駆動されるＧＡＡの発現が、療法のために標的化された組織の部分における治療用タンパク質の発現を提供する。しかしながら、この戦略は、複数の構築物の使用を必要とし、これによりＧＡＡが全身に発現されるわけではないという点で、完全に満足のいくものではない。

リソソーム蓄積症の処置を改善するために、過去に、改変されたＧＡＡタンパク質が提案されている。特に、国際公開公報第２００４０６４７５０号の出願及びSun et al. 2006は、分泌経路へのタンパク質の標的化を増強するための方法として、ＧＡＡに作動可能に連結させたシグナルペプチドを含む、キメラＧＡＡポリペプチドを開示している。

しかしながら、患者に利用可能な治療法は完全には満足のいくものでなく、改善されたＧＡＡポリペプチド及びＧＡＡの生成は依然として当技術分野において必要である。特に、ＧＡＡによる長期の処置効力、高いレベルのＧＡＡ生成、生成されたＧＡＡポリペプチドに対する改善された免疫寛容、並びにそれを必要とする細胞及び組織によるＧＡＡの取り込みの改善の必要性が依然としてある。さらに、国際公開公報第２００４０６４７５０号及びSun et al. 2006において、そこに開示されたキメラＧＡＡポリペプチドの組織分布は完全には満足のいくものでない。それ故、関心対象の全ての組織ではなくても大半の組織におけるグリコーゲン蓄積の修復を可能とすることによって、完全に治療するであろうＧＡＡポリペプチドが依然として必要である。

発明の要約
本発明は、野生型ＧＡＡタンパク質と比較して高いレベルで発現及び分泌され、全身におけるグリコーゲンの病的蓄積の改善された修復を惹起し、これによりＧＡＡに対する免疫寛容を誘導する、ＧＡＡ変異体に関する。

１つの態様によると、本発明は、親ＧＡＡポリペプチドのＮ末端からの少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む、切断短縮されたＧＡＡポリペプチドに関し、ここでの親ポリペプチドは、そのシグナルペプチドの欠けた前駆体型のＧＡＡポリペプチドに相当する。特定の実施態様では、該切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、親ＧＡＡポリペプチドと比較してそのＮ末端において少なくとも２、特に少なくとも２、特に少なくとも３、特に少なくとも４、特に少なくとも５、特に少なくとも６、特に少なくとも７、特に少なくとも８連続アミノ酸が欠失している。別の実施態様では、該切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、親ＧＡＡポリペプチドと比較してそのＮ末端において最大７５、特に最大７０、特に最大６０、特に最大５５、特に最大５０、特に最大４７、特に最大４６、特に最大４５、特に最大４４、特に最大４３連続アミノ酸を欠失している。さらなる特定の実施態様では、該切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、親ＧＡＡポリペプチドと比較してそのＮ末端において最大４７、特に最大４６、特に最大４５、特に最大４４、特に最大４３連続アミノ酸を欠失している。別の特定の実施態様では、該切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、親ＧＡＡポリペプチドと比較してそのＮ末端において１〜７５、特に１〜４７、特に１〜４６、特に１〜４５、特に１〜４４、特に１〜４３連続アミノ酸を欠失している。別の実施態様では、該切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、親ＧＡＡポリペプチドと比較してそのＮ末端において２〜４３、特に３〜４３、特に４〜４３、特に５〜４３、特に６〜４３、特に７〜４３、特に８〜４３連続アミノ酸を欠失している。より特定した実施態様では、該切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、親ＧＡＡポリペプチドと比較してそのＮ末端において６、７、８、９、１０、２７、２８、２９、３０、３１、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、又は４７連続アミノ酸を欠失し、特に親ＧＡＡポリペプチドと比較してそのＮ末端において７、８、９、２８、２９、３０、４１、４２、４３、又は４４、より特定すると８、２９、４２、又は４３連続アミノ酸が切断短縮されている。さらなる特定の実施態様では、親ポリペプチドは、ヒトＧＡＡ（ｈＧＡＡ）、特に配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するｈＧＡＡである。

特定の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、及び配列番号３５に示される配列を有する。

さらに、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドはさらに、そのＮ末端に融合したシグナルペプチド、特に配列番号３〜７からなる群より選択されたシグナルペプチド、特に配列番号３のシグナルペプチドを含み得る。

別の態様では、本発明は、そのＮ末端を介してシグナルペプチドに場合により融合した、上記のような切断短縮されたＧＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子に関する。いくつかの実施態様では、核酸分子は、インビボにおいて、特にヒト被験者において、切断短縮されたＧＡＡポリペプチドの発現を改善するために及び／又は切断短縮されたＧＡＡポリペプチドに対する免疫寛容を改善するために最適化されたヌクレオチド配列に関する。

さらに別の態様では、本発明は、プロモーター、イントロン、ポリアデニル化シグナル及び／又はエンハンサー（例えばシス調節モジュール、すなわちＣＲＭ）などの１つ以上の調節配列に作動可能に連結させた本発明の核酸分子を含む、核酸構築物に関する。特定の実施態様では、該プロモーターは、好ましくはα−１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、トランスサイレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、及びチロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターからなる群より選択された肝特異的プロモーターである。別の特定の実施態様では、該プロモーターは筋肉特異的プロモーター、例えばＳｐｃ５−１２、ＭＣＫ及びデスミンプロモーターである。別の実施態様では、該プロモーターは、偏在性プロモーター、例えばＣＭＶ、ＣＡＧ及びＰＧＫプロモーターである。該核酸構築物はさらに場合により、イントロン、特にヒトβグロビンｂ２（すなわちＨＢＢ２）イントロン、ＦＩＸイントロン、ニワトリβ−グロビンイントロン、及びＳＶ４０イントロンからなる群より選択されたイントロンを含み得、ここでの該イントロンは、場合により改変されたイントロン、例えば配列番号１７の改変されたＨＢＢ２イントロン、配列番号１９の改変されたＦＩＸイントロン、又は配列番号２１の改変されたニワトリβ−グロビンイントロンである。本発明の核酸構築物の特定の実施態様では、該構築物は、エンハンサー；イントロン；プロモーター、特に肝特異的プロモーター；ＧＡＡタンパク質をコードしている核酸配列；及びポリアデニル化シグナルを好ましくはこの順序で含み、該構築物は、ＡｐｏＥ制御領域；ＨＢＢ２イントロン、特に改変されたＨＢＢ２イントロン；ｈＡＡＴプロモーター；切断短縮されたＧＡＡポリペプチドをコードしている核酸配列；及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを好ましくはこの順序で含む。具体的な実施態様では、該核酸構築物はより特定すると、配列番号２２〜２６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。

別の態様では、本発明は、本明細書に開示されている核酸分子又は核酸構築物を含むベクターに関する。本発明のベクターは、特にウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、又はＡＡＶベクターであり得る。好ましくは、該ベクターは、一本鎖又は二本鎖の自己相補性ＡＡＶベクター、好ましくはＡＡＶに由来するキャプシド、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、変異ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、変異ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、変異ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、変異ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、例えばＡＡＶｃｙ１０、及びＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｄｊ、ＡＡＶ−Ａｎｃ８０、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８、及びブタＡＡＶキャプシド、例えばＡＡＶｐｏ４及びＡＡＶｐｏ６キャプシドを有するＡＡＶベクター、又はキメラキャプシドを有するＡＡＶベクターである。具体的な実施態様では、該ベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８キャプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ７４キャプシド、より特定するとＡＡＶ８キャプシドを有するＡＡＶベクターである。

さらに別の態様では、本発明は、本発明の核酸分子、核酸構築物、又はベクターを用いて形質転換された細胞を提供する。より特定すると該細胞は肝細胞又は筋肉細胞である。

特定の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体に、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチド、核酸分子、核酸構築物、ベクター、又は細胞を含む、医薬組成物を提供する。

本発明はさらに、医薬品としての使用のための、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチド、核酸分子、核酸構築物、ベクター、又は細胞に関する。

本発明はさらに、糖原病を処置するための方法に使用するための、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチド、核酸分子、核酸構築物、ベクター、又は細胞を提供する。特定の実施態様では、糖原病は、糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型、糖原病ＩＩＩ型、糖原病ＩＶ型、糖原病Ｖ型、糖原病ＶＩ型、糖原病ＶＩＩ型、糖原病ＶＩＩＩ型、又は心臓の致死性先天性糖原病である。より特定の実施態様では、糖原病は、糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型、及び糖原病ＩＩＩ型からなる群より選択され、より特定すると糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型からなる群より選択される。さらにより特定の実施態様では、糖原病は糖原病ＩＩ型である。

ｈＧＡＡの一部の欠失は、インビトロにおけるその分泌を増加させる。パネルＡ。ヒト肝癌細胞（Ｈｕｈ７）を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現している対照プラスミド、又は野生型ｈＧＡＡ（ｈＧＡＡ）若しくは２つの明確に異なるアルゴリズムに従って最適化されたｈＧＡＡ配列（それぞれｈＧＡＡｃｏ１及びｃｏ２）を発現しているプラスミドを用いてリポフェクタミン（商標）を使用してトランスフェクトした。異なるｈＧＡＡ構築物は、野生型シグナルペプチド又はヒトα−１−アンチトリプシンシグナルペプチド（ｓｐ２）を含有していた。切断短縮されたｈＧＡＡは、シグナルペプチドの後の８アミノ酸の欠失（Δ８）によって得られた。トランスフェクションから４８時間後、培養培地中のｈＧＡＡ活性を、蛍光発生酵素アッセイによって測定し、材料及び方法に示されているような反応生成物の標準曲線に対してＧＡＡ活性を評価した。ヒストグラムプロットは、３回の異なる実験から導かれた分泌されたｈＧＡＡのレベルの平均値±標準誤差を示す。統計分析は対応のあるｔ検定によって実施され、ヒストグラムには得られたｐ値が報告されている（示されているように^＊＝ｐ＜０．０５）。パネルＢ。ヒト肝癌細胞（Ｈｕｈ７）を、ＧＦＰを発現している対照プラスミド、又は野生型シグナルペプチド若しくはキモトリプシノーゲンＢ１シグナルペプチド（ｓｐ７）を有するｈＧＡＡｃｏ１を発現しているプラスミドを用いてリポフェクタミンを使用してトランスフェクトした。ｈＧＡＡタンパク質は、シグナルペプチドの後の８又は４２アミノ酸を除去することによって切断短縮されている（それぞれΔ８及びΔ４２）。トランスフェクションから４８時間後、培養培地中のｈＧＡＡ活性を、上記に示されているように蛍光発生酵素アッセイによって測定した。ヒストグラムプロットは、３回の異なる実験から導かれた分泌されたｈＧＡＡのレベルの平均値±標準誤差を示す。統計分析は分散分析によって実施された（示されているように^＊＝ｐ＜０．０５）。ｈＧＡＡの一部の欠失は、ポンペ病マウスモデルの血流中へのその分泌を増加させる。３か月齢のＧＡＡ^−/−マウス（１群あたりｎ＝４〜５匹のマウス）に、ＰＢＳ、又は肝特異的プロモーターの転写制御下にある配列の最適化されたｈＧＡＡ（ｈＧＡＡｃｏ１）を発現している２×１０^１２vg/kgのＡＡＶ８ベクターを静脈内注射した。ｈＧＡＡの野生型シグナルペプチドは、キモトリプシノーゲンＢ１シグナルペプチド（ｓｐ７）を用いて置換され、ｈＧＡＡ配列は、完全長天然配列として、又はシグナルペプチドの後の８若しくは４２アミノ酸を除去することによって切断短縮された配列（それぞれΔ８及びΔ４２）として使用された。注射から１カ月後、マウスから採血し、血清中のｈＧＡＡ活性を、蛍光発生アッセイを使用して測定した。統計分析は分散分析によって実施された（示されているように^＊＝ｐ＜０．０５）。シグナルペプチドは、ｈＧＡＡの分泌を増強させる。ヒト肝癌細胞（Ｈｕｈ７）を、対照プラスミド（ＧＦＰ）、野生型ｈＧＡＡを発現しているプラスミド（ｓｐ１として記載）、又はシグナルペプチド６〜８（ｓｐ６〜８）に融合させた配列の最適化されたΔ８ｈＧＡＡ（ｈＧＡＡｃｏ）を発現しているプラスミドを用いてリポフェクタミン（商標）によってトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、培養培地中のｈＧＡＡの活性を、蛍光発生酵素アッセイによって測定し、４−メチルウンベリフェロンの標準曲線に対してＧＡＡ活性を評価した。ヒストグラムプロットは、３回の異なる実験から導かれた分泌されたｈＧＡＡのレベルの平均値±標準誤差を示す。統計分析は分散分析によって実施された（^＊＝偽トランスフェクト細胞に対してｐ＜０．０５）。切断短縮されたΔ８ｈＧＡＡは、ポンペ病マウスモデルにおけるグリコーゲン蓄積を効果的に修復する。４か月齢の野生型マウス（ＷＴ）及びＧＡＡ−/−マウス（１群あたりｎ＝４〜５匹のマウス）に、ＰＢＳ、又はヒトα−１−アンチトリプシンプロモーターの転写制御下にありシグナルペプチド１、２、７及び８（ｓｐ１、２、７、８）と融合させた配列の最適化されたΔ８ｈＧＡＡ（ｈＧＡＡｃｏ）を発現している６×１０^１１vg/kgのＡＡＶ８ベクターを静脈内注射した。パネルＡ。ヒストグラムは、ベクターの注射から３カ月後に血中において蛍光発生アッセイによって測定されたｈＧＡＡ活性を示す。統計分析は分散分析によって実施され、ヒストグラムには、ＰＢＳで処置されたＧＡＡ−/−動物に対して得られたｐ値が報告されている（^＊＝ｐ＜０．０５）。パネルＢ〜Ｄ。心臓、横隔膜、及び四頭筋におけるグリコーゲン含量の生化学的修復。４か月齢のＧＡＡ^−/−マウスを上記のように処置した。注射から３カ月後、マウスを屠殺し、グリコーゲン含量を評価した。ヒストグラムは、心臓（パネルＢ）、横隔膜（パネルＣ）及び四頭筋（パネルＤ）において測定されたグリコーゲンの酵素消化後に放出されたグルコースとして表現されるグリコーゲン含量を示す。統計分析は分散分析によって実施された（^＊＝ＰＢＳの注射されたＧＡＡ−/−マウスに対してｐ＜０．０５）。高度に分泌されるｈＧＡＡは、ポンペ病マウスモデルにおける体液性応答を低減させる。４か月齢のＧＡＡ−/−マウスに、ＰＢＳ、又はヒトα−１−アンチトリプシンプロモーターの転写制御下にあり、Δ８ｈＧＡＡをコードし、シグナルペプチド１（ｃｏ）、シグナルペプチド２（ｓｐ２−Δ８−ｃｏ）、シグナルペプチド７（ｓｐ７−Δ８−ｃｏ）又はシグナルペプチド８（ｓｐ８−Δ８−ｃｏ）に融合させた、最適化された配列を含む、２つの異なる用量（５×１０^１１又は２×１０^１２vg/kg）のＡＡＶ８ベクターを静脈内注射した。注射から１カ月後、血清を、ＥＬＩＳＡによって抗ｈＧＡＡ抗体の存在について分析した。定量は、標準物質として精製されたマウスＩｇＧを使用して実施された。統計分析はダネット事後検定と分散分析によって実施された（^＊＝ｐ＜０．０１）。ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｓｐ７−Δ８−ｈＧＡＡｃｏ１の注射により、非ヒト霊長類において血中へのｈＧＡＡの効果的な分泌、及び筋肉への取り込みがなされる。２匹のカニクイザルに０日目に、２×１０^１２vg/kgのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｓｐ７−Δ８−ｈＧＡＡｃｏ１を注射した。パネルＡ。ベクターの投与の１２日前及び３０日後に得られた２匹のサルに由来する血清に対して実施されたｈＧＡＡのウェスタンブロット。左には試料と平行して泳動させた分子量マーカーのバンド位置が示されている。パネルＢ。ベクターの注射から３カ月後、サルを屠殺し、ｈＧＡＡ取り込みの生化学的評価のために組織を収集した。ｈＧＡＡのウェスタンブロットを、二頭筋及び横隔膜から得られた組織抽出物に対して実施した。抗チューブリン抗体を、ローディング対照として使用した。左には、試料と平行して泳動させた分子量マーカーのバンド位置が示されている。ｈＧＡＡを発現しているベクターを注射されたＧＤＥ−/−動物の肝臓におけるグリコーゲン含量の生化学的修復。３か月齢の野生型マウス（ＷＴ）又はＧＤＥ−/−マウスに、ＰＢＳ、又はヒトα−１−アンチトリプシンプロモーターの転写制御下にあり、シグナルペプチド７に融合させたコドンの最適化されたｈＧＡＡを発現しているＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｓｐ７−Δ８−ｈＧＡＡｃｏ１）を１×１０^１１又は１×１０^１２vg/マウスの用量で静脈内注射した。ヒストグラムプロットは、肝臓において測定されたグリコーゲンの酵素消化後に放出されたグルコースとして表現されるグリコーゲン含量を示す。統計分析は分散分析によって実施された（^＊＝ＰＢＳの注射されたＧＤＥ−/−マウスに対してｐ＜０．０５、§＝ＰＢＳの注射されたＷＴ動物に対してｐ＜０．０５）。様々なＧＡＡ変異体をコードしているプラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞の培地中のＧＡＡ活性。天然ＧＡＡｓｐ１シグナルペプチドと組み合わせた天然ＧＡＡ（ｃｏ）をコードしているか、又は異種ｓｐ７シグナルペプチドと組み合わせた天然ＧＡＡを含む工学操作されたＧＡＡ（ｓｐ７−ｃｏ）をコードしている最適化された配列を含む、プラスミドのトランスフェクションから２４時間後（パネルＡ）及び４８時間後（パネルＢ）のＨｕＨ７細胞の培地中のＧＡＡ活性を測定した。ｓｐ７シグナルペプチドの後のＧＡＡコード配列における様々な欠失の効果を評価した（ｓｐ７−Δ８−ｃｏ、ｓｐ７−Δ２９−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４２−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４３−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４７−ｃｏ、ｓｐ７−Δ６２−ｃｏ）。ｅＧＦＰをコードしているプラスミドを陰性対照として使用した。統計分析は、チューキー事後検定と一元配置分散分析によって実施された。棒グラフにおけるハッシュ印（＃）は、ｃｏに対する統計学的有意差を示し；タウ記号（τ）はｓｐ７−Δ８−ｃｏ、ｓｐ７−Δ２９−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４２−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４３−ｃｏに対する統計学的有意差を示す。データは、２回の独立した実験の平均値±標準偏差である。異なる記号が使用される場合を除いて、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。様々なＧＡＡ変異体の細胞内ＧＡＡ活性。天然ＧＡＡｓｐ１シグナルペプチドと組み合わせた天然ＧＡＡ（ｃｏ）をコードしているか、又は異種ｓｐ７シグナルペプチドと組み合わせた天然ＧＡＡを含む工学操作されたＧＡＡ（ｓｐ７−ｃｏ）をコードしている最適化された配列を含む、プラスミドのトランスフェクションから４８時間後のＨｕＨ７細胞の溶解液中のＧＡＡ活性を測定した。シグナルペプチドの後のＧＡＡコード配列における様々な欠失の効果を評価した（ｓｐ７−Δ８−ｃｏ、ｓｐ７−Δ２９−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４２−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４３−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４７−ｃｏ、ｓｐ７−Δ６２−ｃｏ）。ｅＧＦＰをコードしているプラスミドを陰性対照として使用した。統計分析は、チューキー事後検定と一元配置分散分析によって実施された。タウ記号（τ）はｓｐ７−ｃｏ、ｓｐ７−Δ８−ｃｏ、ｓｐ７−Δ２９−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４２−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４３−ｃｏに対する統計学的有意差を示す。データは、２回の独立した実験の平均値±標準偏差である。異なる記号が使用される場合を除いて、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｓｐ６又はｓｐ８シグナルペプチドと組み合わせたΔ８欠失を使用して、細胞培地中において上昇したＧＡＡ活性。天然ＧＡＡｓｐ１シグナルペプチドと組み合わせた天然ＧＡＡ（ｃｏ）をコードしているか、又は異種ｓｐ６若しくはｓｐ８シグナルペプチドと組み合わせた天然ＧＡＡを含む工学操作されたＧＡＡ（ｓｐ６−ｃｏ又はｓｐ８−ｃｏ）をコードしている最適化された配列を含むプラスミドのトランスフェクションから４８時間後のＨｕＨ７細胞の培地（パネルＡ）及び溶解液（パネルＢ）中のＧＡＡ活性を測定した。シグナルペプチドの後のＧＡＡコード配列における８アミノ酸の欠失の効果を評価する（ｓｐ６−Δ８−ｃｏ、又はｓｐ８−Δ８−ｃｏ）。ｅＧＦＰをコードしているプラスミドを陰性対照として使用した。統計分析は、チューキー事後検定と一元配置分散分析によって実施された。棒グラフにおけるアステリスクは、ｃｏに対する統計学的有意差を示す。データは、２回の独立した実験の平均値±標準偏差である。異なる記号が使用される場合を除いて、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

発明の詳細な説明
本発明は、切断短縮されたＧＡＡポリペプチド、このような切断短縮されたＧＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子、該核酸を含む核酸構築物、該核酸構築物を含むベクター、該核酸分子又は構築物又はベクターを含む細胞、及び本発明に記載のポリペプチド、核酸分子、核酸構築物、ベクター、又は細胞を含む医薬組成物に関する。本発明者らは驚くべきことに、本発明に記載のＧＡＡの切断短縮型が、その免疫原性を低減させつつ、ＧＡＡの分泌を大きく改善することを示した。

リソソームの酸性αグルコシダーゼすなわち「ＧＡＡ」（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２０）（１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ）は、オリゴ糖のα−１，４結合及びα−１，６結合の両方を加水分解することによりグルコースを遊離する、エキソ−１，４−α−Ｄ−グルコシダーゼである。ＧＡＡの欠損症により、ポンペ病とも呼ばれる糖原病ＩＩ型（ＧＳＤＩＩ）が起こる（この用語は正式には乳児期発症型の疾患を指す）。それはグリコーゲンの完全分解を触媒し、分岐点では緩徐である。第１７番染色体上の２８ｋｂのヒト酸性αグルコシダーゼ遺伝子は３．６ｋｂのｍＲＮＡをコードし、これは９５１アミノ酸ポリペプチドを生成する（Hoefsloot et al., (1988) EMBO J. 7: 1697; Martiniuk et al., (1990) DNA and Cell Biology 9: 85）。該酵素は、小胞体において同時翻訳的なＮ結合グリコシル化を受ける。それは１１０ｋＤａの前駆体型として合成され、十分なグリコシル化修飾、リン酸化によって、及びタンパク質分解プロセシングによって約９０ｋＤａのエンドソーム内の中間体を通して最終的なリソソーム内の７６及び６７ｋＤａ型へと成熟する（Hoefsloot, (1988) EMBO J. 7: 1697; Hoefsloot et al., (1990) Biochem. J. 272: 485; Wisselaar et al., (1993) J. Biol. Chem. 268: 2223; Hermans et al., (1993) Biochem. J. 289: 681）。

糖原病ＩＩ型患者における酸性αグルコシダーゼ欠損症は、リソソーム内のグリコーゲンの大量の蓄積を引き起こし、細胞機能を破壊する（Hirschhorn, R. and Reuser, A. J. (2001), in The Metabolic and Molecular Basis for Inherited Disease, (eds, Scriver, C. R. et al.) pages 3389-3419 (McGraw-Hill, New York）。最も頻度の高い乳児型では、患者は、進行的な筋肉の変性及び心筋症を示し、２歳になる前に死亡する。若年発症型及び成人発症型においては重度な衰弱が存在する。

さらに、他の糖原病を有する患者は、最適化された形態のＧＡＡの投与から恩恵を受け得る。例えば、ＧＡＡの投与が、糖原病ＩＩＩ型（ＧＳＤＩＩＩ）患者由来の初代筋芽細胞におけるグリコーゲンを減少させることが示されている（Sun et al. (2013) Mol Genet Metab 108(2): 145；国際公開公報第２０１０／００５５６５号）。

特に、本発明の脈絡において、「ＧＡＡの前駆体型」は、その天然シグナルペプチドを含むＧＡＡポリペプチド型である。例えば、配列番号２の配列は、ヒトＧＡＡ（ｈＧＡＡ）の前駆体型である。配列番号２の中のアミノ酸残基１〜２７は、ｈＧＡＡポリペプチドのシグナルペプチドに相当する。ｈＧＡＡのシグナルペプチドのこの配列は、配列番号４でも示される。

本発明の脈絡において、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、親ＧＡＡポリペプチドに由来する。本発明によると、「親ＧＡＡポリペプチド」は、上記に定義されているような機能的な前駆体のＧＡＡ配列であるが、そのシグナルペプチドを欠いている。例えば、典型的な野生型ヒトＧＡＡポリペプチドに言及すると、完全な野生型ＧＡＡポリペプチド（すなわち前駆体型のＧＡＡ）は配列番号２又は配列番号３０に示され、シグナルペプチド（配列番号２又は配列番号３０のアミノ酸１〜２７に相当する）を有し、一方、これらの野生型ヒトＧＡＡポリペプチドの切断短縮ＧＡＡ型の基盤としての役目を果たす親ＧＡＡポリペプチドは、それぞれ配列番号１及び配列番号３３に示され、シグナルペプチドを全く有さない。この例では、配列番号２のアミノ酸２８〜９５２、及び配列番号３０のアミノ酸２８〜９５２に相当する後部は、親ＧＡＡポリペプチドと称される。

本発明によると、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、機能的ＧＡＡポリペプチドであり、すなわち、それは野生型ＧＡＡポリペプチドの機能を有する。上記に定義されているように、野生型ＧＡＡの機能は、オリゴ糖及び多糖、より特定するとグリコーゲンのα−１，４結合及びα−１，６結合の両方を加水分解することによりグルコースを遊離することである。本発明の核酸によってコードされる機能的ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１又は配列番号３３の野生型ＧＡＡポリペプチドと比較して、グリコーゲンに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は少なくとも１００％の加水分解活性を有し得る。本発明の核酸によってコードされるＧＡＡタンパク質の活性は、配列番号１又は配列番号３３の野生型ＧＡＡタンパク質の活性に対して、１００％を超えることさえあり得、例えば１１０％、１２０％、１３０％、１４０％を超え、又はさらには１５０％を超えることさえあり得る。

親ＧＡＡポリペプチドのアミノ酸配列又はそのコード配列は、トリ及び哺乳動物種をはじめとする任意の入手源から得ることができる。本明細書において使用する「トリ」という用語は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、及びキジを含むがこれらに限定されない。本明細書において使用する「哺乳動物」という用語は、ヒト、サル、及び他の非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ類などを含むがこれらに限定されない。本発明の実施態様では、親ＧＡＡポリペプチドは、ヒト、マウス、又はウズラ、特にヒトのＧＡＡポリペプチドである。

さらに、親ＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡポリペプチドと比較してアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換などの１つ以上のアミノ酸の改変を含む、ＧＡＡポリペプチドの機能的変異体であってもよい。例えば、親ポリペプチドは、ヒトＧＡＡポリペプチドの機能的誘導体、例えば、このヒトＧＡＡポリペプチドに対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は少なくとも９９％の配列同一率を有する、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１のポリペプチドなどであり得る。例えば、上記に定義された切断短縮に加えて、ＧＡＡポリペプチドの機能的変異体は、親ＧＡＡポリペプチド、例えば配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示される親ＧＡＡポリペプチドに対して０〜５０個、０〜３０個、０〜２０個、０〜１５個、０〜１０個、又は０〜５個のアミノ酸変化を有し得る。特に、親ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒトＧＡＡポリペプチドからなり得る。

「同一な」という用語及びその派生語は、ポリペプチドに言及する場合、２つの比較されるポリペプチド配列における位置が、同じアミノ酸によって占められている場合（例えば、２つのそれぞれのポリペプチドにおける位置がロイシンによって占められている場合）、該ポリペプチドはその位置において同一である。２つのポリペプチド間の同一率は、２つの配列によって共有される一致している位置の数を、比較される位置の数で割り、これに１００を乗じた関数である。例えば、２つのポリペプチドにおける１０中６個の位置が一致する場合、２つの配列は６０％同一である。一般的に、最大同一率が得られるように２つの配列をアラインさせて比較される。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの、当業者には公知である様々なバイオインフォマティクスツールを使用して、核酸配列をアラインさせることができる。

親ＧＡＡポリペプチドはまた、Kunita et al., (1997) Biochemica et Biophysica Acta 1362: 269によって記載されているようなＧＡＡＩＩなどのＧＡＡ変異体であり得；ＧＡＡ多型及びＳＮＰは、Hirschhorn, R. and Reuser, A. J. (2001) In The Metabolic and Molecular Basis for Inherited Disease（Scriver, C. R. , Beaudet, A. L., Sly, W. S. & Valle, D. Eds., pp. 3389- 3419. McGraw-Hill, New York,pages 3403-3405参照）によって記載されている。当技術分野において公知である任意の変異ＧＡＡポリペプチドを、親ＧＡＡポリペプチドを定義するための基盤として使用し得る。例示的な変異ＧＡＡポリペプチドとしては、配列番号２（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１４３．２）；配列番号２９（ＧｅｎＢａｎｋＡＡＡ５２５０６．１）；配列番号３０（ＧｅｎＢａｎｋＣＡＡ６８７６３．１）；配列番号３１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＷ８９５８３．１）及び配列番号３２（ＧｅｎＢａｎｋＡＢＩ５３７１８．１）が挙げられる。他の有用な変異体としては、Hoefsloot et al., (1988) EMBO J. 7: 1697；及びVan Hove et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 65に記載されているもの（ヒト）、並びにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００８０６４（マウス）が挙げられる。他の変異ＧＡＡポリペプチドとしては、国際公開公報第２０１２／１４５６４４号、国際公開公報第００／３４４５１号及び米国特許第６，８５８，４２５号に記載されているものが挙げられる。特定の実施態様では、親ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列から得られる。

本発明に記載のＧＡＡの切断短縮型は、親ＧＡＡポリペプチドのＮ末端切断短縮型であり、ここでは少なくとも１つのアミノ酸が、該親ＧＡＡポリペプチドのＮ末端から欠失している。

「切断短縮型」によって、親ＧＡＡポリペプチドのＮ末端部分から１つ又はいくつかの連続アミノ酸が欠失しているＧＡＡポリペプチドを意味する。例えば、ＧＡＡ部分は、親ＧＡＡポリペプチドと比較してそのＮ末端から１〜７５連続アミノ酸、又は７５を超える連続アミノ酸が切断短縮されていてもよい。具体的には、切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、親ＧＡＡタンパク質（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示される親ｈＧＡＡタンパク質の切断短縮型）と比較して、そのＮ末端から

連続アミノ酸が切断短縮されていてもよい。代わりの命名法を使用すると、親ＧＡＡポリペプチドにおける１アミノ酸の切断短縮から生じたＧＡＡポリペプチドは、Δ１ＧＡＡ切断短縮型と称され、Ｎ末端から２連続アミノ酸の切断短縮から生じたＧＡＡポリペプチドは、Δ２ＧＡＡ切断短縮型と称され、親ＧＡＡポリペプチドにおける３連続アミノ酸の切断短縮から生じたＧＡＡポリペプチドは、Δ３ＧＡＡ切断短縮型と称されるなどである。特定の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、

ＧＡＡ切断短縮型（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示される親ｈＧＡＡタンパク質の切断短縮型）である。

別の特定の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、

ＧＡＡ切断短縮型（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示される親ｈＧＡＡタンパク質の切断短縮型）である。

さらなる特定の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、

ＧＡＡ切断短縮型（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示される親ｈＧＡＡタンパク質の切断短縮型）である。

さらなる特定の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ６、Δ７、Δ８、Δ９、又はΔ１０切断短縮型、特にＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ７、Δ８又はΔ９切断短縮型、より特定するとＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ８切断短縮型である。

さらなる特定の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ２７、Δ２８、Δ２９、Δ３０又はΔ３１切断短縮型、特にＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ２８、Δ２９又はΔ３０切断短縮型、より特定するとＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ２９切断短縮型である。

別の特定の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ４０、Δ４１、Δ４２、Δ４３、又はΔ４４切断短縮型、特にＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ４１、Δ４２、又はΔ４３切断短縮型、より特定するとＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ４２切断短縮型である。

さらなる特定の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ（特に、配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ４１、Δ４２、Δ４３、Δ４４、又はΔ４５切断短縮型、特にＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ４２、Δ４３、又はΔ４４切断短縮型、より特定するとＧＡＡ（特に、配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ４３切断短縮型である。

別の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ６、Δ７、Δ８、Δ９、Δ１０、Δ２７、Δ２８、Δ２９、Δ３０、Δ３１、Δ４０、Δ４１、Δ４２、Δ４３、Δ４４、Δ４５、Δ４６、又はΔ４７切断短縮型である。

別の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ７、Δ８、Δ９、Δ２８、Δ２９、Δ３０、Δ４１、Δ４２、Δ４３、又はΔ４４切断短縮型である。

別の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ６、Δ７、Δ８、Δ９、Δ１０、Δ４０、Δ４１、Δ４２、Δ４３、又はΔ４４切断短縮型である。

別の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ８、Δ２９、Δ４２、Δ４３、又はΔ４７切断短縮型である。

別の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ８、Δ２９、Δ４２、又はΔ４３切断短縮型である。

別の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ（特に、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡタンパク質）のΔ８又はΔ４２切断短縮型である。

本発明の特定の実施態様では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、機能的なヒトＧＡＡポリペプチドの切断短縮型である。さらなる特定の実施態様では、親ｈＧＡＡポリペプチドは、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡポリペプチドである。この実施態様の変法では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ｈＧＡＡポリペプチド、より特定すると配列番号１若しくは配列番号３３、さらにより特定すると配列番号１に示されるｈＧＡＡポリペプチド、又は配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示される配列においてアミノ酸置換を含みかつ配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一率を有するその機能的変異体の

ＧＡＡ切断短縮型である。

この実施態様の変法では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ｈＧＡＡポリペプチド、より特定すると配列番号１若しくは配列番号３３、さらにより特定すると配列番号１に示されるｈＧＡＡポリペプチド、又は配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示される配列においてアミノ酸置換を含みかつ配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一率を有するその機能的変異体の

ＧＡＡ切断短縮型である。

この実施態様の別の変法では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ｈＧＡＡポリペプチド、より特定すると配列番号１若しくは配列番号３３、さらにより特定すると配列番号１に示されるｈＧＡＡポリペプチド、又は配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示される配列においてアミノ酸置換を含みかつ配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一率を有するその機能的変異体の

ＧＡＡ切断短縮型である。

この実施態様の別の変法では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ｈＧＡＡポリペプチド、より特定すると配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡポリペプチド、又は配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示される配列においてアミノ酸置換を含みかつ配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一率を有するその機能的変異体のΔ６、Δ７、Δ８、Δ９、又はΔ１０、特にΔ７、Δ８、又はΔ９、より特定するとΔ８切断短縮型である。

この実施態様の別の変法では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ｈＧＡＡポリペプチド、より特定すると配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡポリペプチド、又は配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示される配列においてアミノ酸置換を含みかつ配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一率を有するその機能的変異体のΔ２７、Δ２８、Δ２９、Δ３０、又はΔ３１、特にΔ２８、Δ２９、又はΔ３０、より特定するとΔ２９切断短縮型である。

この実施態様の別の変法では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ｈＧＡＡポリペプチド、より特定すると配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡポリペプチド、又は配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示される配列においてアミノ酸置換を含みかつ配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一率を有するその機能的変異体のΔ４０、Δ４１、Δ４２、Δ４３、又はΔ４４、特にΔ４１、Δ４２、又はΔ４３、より特定するとΔ４２切断短縮型である。

この実施態様の別の変法では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ｈＧＡＡポリペプチド、より特定すると配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡポリペプチド、又は配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示される配列においてアミノ酸置換を含みかつ配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一率を有するその機能的変異体のΔ４１、Δ４２、Δ４３、Δ４４、又はΔ４５、特にΔ４２、Δ４３、又はΔ４４、より特定するとΔ４３切断短縮型である。

この実施態様の別の変法では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ｈＧＡＡポリペプチド、より特定すると配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡポリペプチド、又は配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示される配列においてアミノ酸置換を含みかつ配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一率を有するその機能的変異体の

特に

特にΔ８、Δ２９、Δ４２、又はΔ４３切断短縮型である。

この実施態様の別の変法では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ｈＧＡＡポリペプチド、より特定すると配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡポリペプチド、又は配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示される配列においてアミノ酸置換を含みかつ配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一率を有するその機能的変異体の

特にΔ８又はΔ４２切断短縮型である。

この実施態様の別の変法では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ｈＧＡＡポリペプチド、より特定すると配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡポリペプチド、又は配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示される配列においてアミノ酸置換を含みかつ配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一率を有するその機能的変異体のΔ８、Δ２９、Δ４２、Δ４３、又はΔ４７切断短縮型である。

この実施態様の別の変法では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ｈＧＡＡポリペプチド、より特定すると配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡポリペプチド、又は配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示される配列においてアミノ酸置換を含みかつ配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一率を有するその機能的変異体のΔ８、Δ２９、Δ４２、又はΔ４３切断短縮型である。

この実施態様の別の変法では、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、ｈＧＡＡポリペプチド、より特定すると配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示されるｈＧＡＡポリペプチド、又は配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示される配列においてアミノ酸置換を含みかつ配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一率を有するその機能的変異体のΔ８又はΔ４２切断短縮型である。

具体的な実施態様では、本発明の切断短縮されたｈＧＡＡポリペプチドは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３５若しくは配列番号３６に示される配列からなるアミノ酸配列、又は配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３５若しくは配列番号３６に示される配列と比較して１〜５個、特に１〜４個、特に１〜３個、より特定すると１〜２個、特に１個のアミノ酸置換を含むその機能的変異体を有する。別の具体的な実施態様では、本発明の切断短縮されたｈＧＡＡポリペプチドは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、若しくは配列番号３５に示される配列からなるアミノ酸配列、又は配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、若しくは配列番号３５に示される配列と比較して１〜５個のアミノ酸置換を含むその機能的変異体を有する。具体的な実施態様では、本発明の切断短縮されたｈＧＡＡポリペプチドは、配列番号２７若しくは配列番号２８に示される配列からなるアミノ酸配列、又は配列番号２７若しくは配列番号２８に示される配列と比較して１〜５個、特に１〜４個、特に１〜３個、より特定すると１〜２個、特に１個のアミノ酸置換を含むその機能的変異体を有する。

本発明に記載の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドはさらに、シグナルペプチド、例えばＧＡＡの天然シグナルペプチド、又は別の分泌タンパク質に由来する代替シグナルペプチドを含み得る。このようなシグナルペプチドの非制限的な例としては、配列番号３〜７に示されるものが挙げられる。本発明者らは驚くべきことに、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドを代替シグナルペプチドに融合させることは、その分泌をさらに増強させることを示した。本発明はこれにより、シグナル部分と切断短縮されたＧＡＡポリペプチド部分とを含むキメラＧＡＡポリペプチドを提供し、切断短縮されたＧＡＡポリペプチド部分は、上記に定義されているような切断短縮されたＧＡＡポリペプチドである。特定の実施態様では、シグナルペプチドは、ＧＡＡの天然シグナルペプチド、例えば配列番号４に示されるｈＧＡＡのシグナルペプチドである。別の実施態様では、シグナルペプチドは、ＧＡＡとは異なるタンパク質に由来する外因性（すなわち代替）シグナルペプチドである。特定の実施態様では、代替シグナルペプチドは、配列番号３、５、６、及び７、又は以下に定義されているようなその機能的誘導体からなる群より選択される。

本発明者らは、ＧＡＡタンパク質の残りに融合させた外因性シグナルペプチドは、その天然シグナルペプチドを含む対応するＧＡＡポリペプチドと比較して、結果として得られたキメラＧＡＡポリペプチドの分泌を増加させることを示した。さらに、切断短縮されたＧＡＡポリペプチド部分はまた、親ＧＡＡポリペプチドに融合させた同シグナルペプチドを含むキメラＧＡＡポリペプチドと比較して、キメラＧＡＡポリペプチド（シグナルペプチド及び切断短縮されたＧＡＡポリペプチドの両方を含む）の分泌を増加させる。

本発明において作用可能な特定の外因性シグナルペプチドとしては、キモトリプシノーゲンＢ２由来のアミノ酸１〜２０（配列番号３）、ヒトα−１−アンチトリプシンのシグナルペプチド（配列番号５）、イズロネート−２−スルファターゼ由来のアミノ酸１〜２５（配列番号６）、及びプロテアーゼＣ１阻害剤由来のアミノ酸１〜２３（配列番号７）が挙げられる。配列番号３及び配列番号５から配列番号７のシグナルペプチドは、その天然シグナルペプチドを含むＧＡＡと比較して、インビトロ及びインビボの両方においてキメラＧＡＡタンパク質のより高い分泌を可能とする。特定の実施態様では、シグナルペプチドは、配列番号３〜７に示される配列を有するか、又は、結果として得られる配列が、機能的シグナルペプチド、すなわち、ＧＡＡタンパク質の分泌を可能とするシグナルペプチドに相当する限り、その機能的誘導体、すなわち、配列番号３〜７に示される配列と比較して１〜５個、特に１〜４個、特に１〜３個、より特定すると１〜２個、特に１個のアミノ酸の欠失（群）、挿入（群）、又は置換（群）を含む配列である。

特定の実施態様では、本発明のＧＡＡポリペプチドは、
−ＧＡＡのΔ８切断短縮型、例えば配列番号２７に示されるｈＧＡＡのΔ８切断短縮型と配列番号３の組合せ；
−ＧＡＡのΔ８切断短縮型、例えば配列番号２７に示されるｈＧＡＡのΔ８切断短縮型と配列番号４の組合せ；
−ＧＡＡのΔ８切断短縮型、例えば配列番号２７に示されるｈＧＡＡのΔ８切断短縮型と配列番号５の組合せ；
−ＧＡＡのΔ８切断短縮型、例えば配列番号２７に示されるｈＧＡＡのΔ８切断短縮型と配列番号６の組合せ；
−ＧＡＡのΔ８切断短縮型、例えば配列番号２７に示されるｈＧＡＡのΔ８切断短縮型と配列番号７の組合せ；
−ＧＡＡのΔ２９切断短縮型、例えば配列番号３４に示されるｈＧＡＡのΔ２９切断短縮型と配列番号３の組合せ；
−ＧＡＡのΔ２９切断短縮型、例えば配列番号３４に示されるｈＧＡＡのΔ２９切断短縮型と配列番号４の組合せ；
−ＧＡＡのΔ２９切断短縮型、例えば配列番号３４に示されるｈＧＡＡのΔ２９切断短縮型と配列番号５の組合せ；
−ＧＡＡのΔ２９切断短縮型、例えば配列番号３４に示されるｈＧＡＡのΔ２９切断短縮型と配列番号６の組合せ；
−ＧＡＡのΔ２９切断短縮型、例えば配列番号３４に示されるｈＧＡＡのΔ２９切断短縮型と配列番号７の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４２切断短縮型、例えば配列番号２８に示されるｈＧＡＡのΔ４２切断短縮型と配列番号３の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４２切断短縮型、例えば配列番号２８に示されるｈＧＡＡのΔ４２切断短縮型と配列番号４の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４２切断短縮型、例えば配列番号２８に示されるｈＧＡＡのΔ４２切断短縮型と配列番号５の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４２切断短縮型、例えば配列番号２８に示されるｈＧＡＡのΔ４２切断短縮型と配列番号６の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４２切断短縮型、例えば配列番号２８に示されるｈＧＡＡのΔ４２切断短縮型と配列番号７の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４３切断短縮型、例えば配列番号３５に示されるｈＧＡＡのΔ４３切断短縮型と配列番号３の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４３切断短縮型、例えば配列番号３５に示されるｈＧＡＡのΔ４３切断短縮型と配列番号４の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４３切断短縮型、例えば配列番号３５に示されるｈＧＡＡのΔ４３切断短縮型と配列番号５の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４３切断短縮型、例えば配列番号３５に示されるｈＧＡＡのΔ４３切断短縮型と配列番号６の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４３切断短縮型、例えば配列番号３５に示されるｈＧＡＡのΔ４３切断短縮型と配列番号７の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４７切断短縮型、例えば配列番号３６に示されるｈＧＡＡのΔ４７切断短縮型と配列番号３の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４７切断短縮型、例えば配列番号３６に示されるｈＧＡＡのΔ４７切断短縮型と配列番号４の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４７切断短縮型、例えば配列番号３６に示されるｈＧＡＡのΔ４７切断短縮型と配列番号５の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４７切断短縮型、例えば配列番号３６に示されるｈＧＡＡのΔ４７切断短縮型と配列番号６の組合せ；
−ＧＡＡのΔ４７切断短縮型、例えば配列番号３６に示されるｈＧＡＡのΔ４７切断短縮型と配列番号７の組合せ、から選択されるか、
又は、結果として得られた配列の組合せに対して少なくとも９０％の同一率、特に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一率を有するその機能的誘導体である。これらの実施態様では、上記のように、シグナルペプチド部分は、結果として得られる配列が、機能的シグナルペプチド、すなわち、結果として得られる切断短縮されたキメラＧＡＡタンパク質の分泌を可能とするシグナルペプチドに相当する限り、配列番号３〜７に示される配列と比較して、１〜５個、特に１〜４個、特に１〜３個、より特定すると１〜２個、特に１個のアミノ酸の欠失（群）、挿入（群）、又は置換（群）を含む配列であり得る。

細胞から分泌される新規に合成されたＧＡＡの相対的比率は、当技術分野において公知であり実施例に記載されている方法によって慣用的に決定され得る。分泌されたタンパク質は、細胞培養培地、血清、ミルクなどの中の、タンパク質それ自体を直接測定することによって（例えばウェスタンブロットによって）又はタンパク質活性アッセイ（例えば酵素アッセイ）によって検出され得る。

当業者はさらに、例えば、制限酵素部位の付加などの核酸構築物の操作の結果として、これらの追加のアミノ酸によりシグナルペプチド又はＧＡＡポリペプチドが非機能的とならない限り、切断短縮されたＧＡＡポリペプチド又はキメラＧＡＡポリペプチドは追加のアミノ酸を含有することができることを理解するだろう。追加のアミノ酸は切断されても、又は、保持することで非機能的なポリペプチドとならない限り、成熟ポリペプチドによって保持されていてもよい。

別の態様では、本発明は、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチド又は本発明のキメラＧＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子に関する。

切断短縮されたＧＡＡをコードしている本発明の核酸分子の配列は、インビボにおけるＧＡＡポリペプチドの発現のために最適化されている。配列の最適化は、コドン最適化、ＧＣ含量の増加、ＣｐＧアイランドの数の低減、代替オープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）の数の低減、並びにスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位の数の低減をはじめとする、核酸配列における多くの変化を含み得る。遺伝子コードの縮重のために、異なる核酸分子が同じタンパク質をコードし得る。また、様々な生物の遺伝子コードは、他のアミノ酸よりも同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンの１つを使用することに偏ることが多いことも周知である。コドンの最適化を通して、所与の細胞状況に存在するコドンバイアスを利用した変化をヌクレオチド配列に導入し、これにより、結果として得られたコドンの最適化されたヌクレオチド配列は、このような所与の細胞状況において、コドンの最適化されていない配列と比較して比較的高いレベルで発現される可能性がより高くなる。本発明の好ましい実施態様では、切断短縮されたＧＡＡをコードしているこのような配列の最適化されたヌクレオチド配列は、例えばヒトに特異的なコドン使用頻度バイアスを利用することによってコドンが最適化されることにより、同じ切断短縮されたＧＡＡタンパク質をコードしているコドンの最適化されていないヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞におけるその発現が改善されている。

特定の実施態様では、最適化されたＧＡＡコード配列は、配列番号８の野生型ｈＧＡＡコード配列のヌクレオチド８２〜２８５９と比較して、コドンが最適化されている、並びに／あるいは、増加したＧＣ含量を有する、並びに／あるいは代替オープンリーディングフレームの数が減少している、並びに／あるいはスプライスドナー部位及び／又はスプライスアクセプター部位の数が減少している。例えば、本発明の核酸配列では、野生型ＧＡＡ配列の配列と比較して、ＧＡＡ配列内のＧＣ含量が少なくとも２、３、４、５、又は１０％増加している。特定の実施態様では、本発明の核酸配列では、野生型ＧＡＡヌクレオチド配列の配列と比較して、ＧＡＡ配列内のＧＣ含量は２、３、４、又はより特定すると５％若しくは１０％（特に５％）増加している。特定の実施態様では、機能的ＧＡＡポリペプチドをコードしている本発明の核酸配列は、配列番号８に示される配列のヌクレオチド８２〜２８５９に対して「実質的に同一」である、すなわち、約７０％同一、より好ましくは約８０％同一、さらにより好ましくは約９０％同一、さらにより好ましくは約９５％同一、さらにより好ましくは約９７％、９８％、又はさらには９９％同一である。上記のように、ＧＣ含量及び／又はＡＲＦの数に加えて、配列の最適化はまた、配列内のＣｐＧアイランドの数の低減並びに／あるいはスプライスドナー部位及びアクセプター部位の数の低減も含み得る。勿論、当業者には周知であるように、配列の最適化は、これら全てのパラメーター間のバランスであり、このことは、上記の少なくとも１つのパラメーターが改善されていれば、他のパラメーターの１つ以上が改善されていなくても、最適化された配列により、インビボにおける導入遺伝子の改善、例えば改善された発現及び／又は導入遺伝子に対する免疫応答の低減などがもたらされる限り、配列は最適化されたと考えられ得ることを意味する。

さらに、ヒト細胞のコドン使用頻度に対する、機能的ＧＡＡをコードしているヌクレオチド配列の適応性は、コドン適応指標（codon adaptation index）（ＣＡＩ）として表現され得る。コドン適応指標は本明細書において、高度に発現されているヒト遺伝子のコドン使用頻度に対する、遺伝子のコドン使用頻度の相対的適応性の尺度として定義される。各コドンの相対的適応性（ｗ）は、同じアミノ酸に対する最も豊富なコドンの使用頻度に対する、各コドンの使用頻度の比である。ＣＡＩは、これらの相対的な適応値の幾何学的平均値として定義される。非同義コドン及び終止コドン（遺伝子コードに依存）は除外される。ＣＡＩ値の範囲は０〜１であり、より高い数値は、最も豊富なコドンの比率がより高いことを示す（Sharp and Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295参照； Kim et al, Gene. 1997, 199:293-301; zur Megede et al, Journal of Virology, 2000, 74: 2628-2635も参照）。好ましくは、ＧＡＡをコードしている核酸分子は、少なくとも０．７５（特に０．７７）、０．８、０．８５、０．９０、０．９２、又は０．９４のＣＡＩを有する。

「核酸配列」（又は核酸分子）という用語は、本発明に記載のＧＡＡタンパク質をコードしている、一本鎖又は二本鎖の形態のＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子、特にＤＮＡを指す。

本発明者らは、上記の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドが、それをコードしている核酸分子から発現された場合、インビトロ及びインビボの両方において、野生型ＧＡＡｃＤＮＡと比較して驚くべき程に高いレベルの機能的ＧＡＡタンパク質の発現を引き起こすことを発見した。さらに、本発明者らによってこれもまた示されているように、本発明の核酸分子を発現している肝細胞及び筋肉細胞から生成された切断短縮されたＧＡＡタンパク質は、免疫応答を全く誘発しない。このことは、この核酸分子を使用することにより高いレベルのＧＡＡタンパク質を生成し得、免疫抑制剤による処置に頼ることを回避する、低用量の免疫抑制剤による処置を可能とする、及びそれを必要とする被験者への本発明の核酸分子の反復投与を可能とするなどの治療利点を提供することを意味する。それ故、本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチド及び本発明の核酸分子は、ＧＡＡの発現及び／又は活性が欠損している状況、あるいは高い発現レベルのＧＡＡが糖原病などの疾患を寛解することができる状況において、特に関心が持たれる。特に、糖原病は、糖原病Ｉ型（フォン・ギールケ病）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、糖原病ＩＩＩ型（コーリ病）、糖原病ＩＶ型、糖原病Ｖ型、糖原病ＶＩ型、糖原病ＶＩＩ型、糖原病ＶＩＩＩ型、又は心臓の致死性先天性糖原病であり得る。より特定すると、糖原病は、糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型からなる群より選択され、さらにより特定すると糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型からなる群より選択される。さらにより特定した実施態様では、糖原病は糖原病ＩＩ型である。特に、本発明の核酸分子は、ＧＡＡ欠損容態、又はグリコーゲンの蓄積を伴う他の容態、例えば糖原病Ｉ型（フォン・ギールケ病）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、糖原病ＩＩＩ型（コーリ病）、糖原病ＩＶ型、糖原病Ｖ型、糖原病ＶＩ型、糖原病ＶＩＩ型、糖原病ＶＩＩＩ型、及び心臓の致死性先天性糖原病、より特定すると糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型又は糖原病ＩＩＩ型、さらにより特定すると糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型を処置するための遺伝子療法において有用であり得る。さらにより特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、糖原病ＩＩ型を処置するための遺伝子療法において有用であり得る。

本発明の別の実施態様では、切断短縮されたＧＡＡポリペプチド部分をコードしている本発明の核酸分子の一部は、シグナルペプチドを欠いた野生型ｈＧＡＡポリペプチド配列である、配列番号１又は配列番号３３、特に配列番号１をコードしているヌクレオチド配列の対応する部分に対して少なくとも７５％（例えば７７．７％）、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８２％（例えば８３．１％）の同一率を有する。

本発明の核酸分子の切断短縮されたＧＡＡ部分は、配列の最適化された配列である、配列番号１０又は１１のヌクレオチド配列に対して好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、特に少なくとも９５％、例えば少なくとも９８、９９、又は１００％の同一率を有する。

「同一な」という用語及びその派生語は、２つの核酸分子間の配列同一性を指す。２つの比較される両方の配列における位置が、同じ塩基によって占められている場合、例えば、２つのそれぞれのＤＮＡ分子における位置がアデニンによって占められている場合、該分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一率は、２つの配列によって共有される一致している位置の数を、比較される位置の数で割り、これに１００を乗じた関数である。例えば、２つの配列における１０中６個の位置が一致する場合、２つの配列は６０％同一である。一般的に、最大同一率が得られるように２つの配列をアラインさせて比較される。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの、当業者には公知である様々なバイオインフォマティクスツールを使用して、核酸配列をアラインさせることができる。

さらに、本発明の核酸分子は、機能的ＧＡＡタンパク質をコードし、すなわち、それは発現されると野生型ＧＡＡタンパク質の機能を有する、ヒトＧＡＡタンパク質をコードしている。上記に定義されているように、野生型ＧＡＡの機能は、オリゴ糖及び多糖、より特定するとグリコーゲンのα−１，４結合及びα−１，６結合の両方を加水分解することによりグルコースを遊離することである。本発明の核酸によってコードされる機能的ＧＡＡタンパク質は、配列番号１、２、３０、又は３３の野生型ＧＡＡタンパク質と比較して、グリコーゲンに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は少なくとも１００％の加水分解活性を有し得る。本発明の核酸によってコードされるＧＡＡタンパク質の活性は、配列番号１、２、３０、又は３３の野生型ＧＡＡタンパク質の活性に対して、１００％を超えることさえあり得、例えば１１０％、１２０％、１３０％、１４０％を超え、又はさらには１５０％を超えることさえあり得る。

当業者は、本発明に記載の核酸が機能的ＧＡＡタンパク質を発現するかどうかを容易に決定することができる。適切な方法は、当業者には明らかであろう。例えば、１つの適切なインビトロでの方法は、プラスミド又はウイルスベクターなどのベクターに核酸を挿入する工程、２９３Ｔ細胞又はＨｅＬａ細胞などの宿主細胞又はＨｕｈ７などの他の細胞をベクターを用いてトランスフェクト又は形質導入する工程、及びＧＡＡ活性についてアッセイする工程を含む。あるいは、適切なインビボでの方法は、核酸を含有しているベクターをポンペ病又は別の糖原病のマウスモデルに形質導入する工程、並びにマウスの血漿中の機能的ＧＡＡ及び組織中のＧＡＡの存在についてアッセイする工程を含む。適切な方法は、以下の実験部においてより詳細に記載されている。

特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている配列番号１２若しくは配列番号１３に示される配列；配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている配列番号４８若しくは配列番号４９に示される配列；配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている配列番号５０若しくは配列番号５１に示される配列；又は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている配列番号５２若しくは配列番号５３に示される配列を含む。さらなる実施態様では、本発明の核酸分子は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている配列番号１２若しくは配列番号１３に示される配列；配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている配列番号４８若しくは配列番号４９に示される配列；又は、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている配列番号５０若しくは配列番号５１に示される配列を含む。特定の実施態様では、本発明の核酸分子は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている配列番号１２又は配列番号１３に示される配列を含む。

本発明はまた、本発明の核酸分子を含む核酸構築物にも関する。核酸構築物は、１つ以上の発現制御配列、及び／又は導入遺伝子の発現を改善する他の配列、及び／又はコードされているタンパク質の分泌を増強する配列、及び／又はコードされているタンパク質の取り込みを増強する配列に作動可能に連結させた、本発明の核酸配列を含む、発現カセットに対応し得る。本明細書において使用する「作動可能に連結された」という用語は、機能的な関係でのポリヌクレオチド配列の連結を指す。核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合に「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーター、又は別の転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合にコード配列に作動可能に連結されている。このような発現制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー（例えばシス調節モジュール（ＣＲＭ））、イントロン、ポリＡシグナルなどは当技術分野において公知である。

特に、発現カセットは、プロモーターを含み得る。該プロモーターは、遍在的又は組織特異的プロモーター、特にＧＡＡの発現が望ましい細胞又は組織、例えばＧＡＡ欠損患者においてＧＡＡの発現が望ましい細胞又は組織において発現を促進することのできるプロモーターであり得る。特定の実施態様では、該プロモーターは、肝特異的プロモーター、例えばα−１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）（配列番号１４）、トランスサイレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、ＬＳＰプロモーター（甲状腺ホルモン結合性グロブリンプロモーター配列、２コピーのα１−ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー配列、及びリーダー配列を含む、34.Ill, C. R., et al. (1997). Optimization of the human factor VIII complementary DNA expression plasmid for gene therapy of hemophilia A. Blood Coag. Fibrinol. 8: S23-S30）などである。他の有用な肝特異的プロモーターも当技術分野において公知であり、例えば、コールドスプリングハーバーラボラトリーの編纂した肝特異的遺伝子プロモーターデータベース（http://rulai.cshl.edu/LSPD/）に列挙されているものなどである。本発明の脈絡における好ましいプロモーターは、ｈＡＡＴプロモーターである。別の実施態様では、該プロモーターは、関心対象のある組織又は細胞（例えば筋肉細胞）及び肝細胞における発現を指令するプロモーターである。例えば、ある程度までは、デスミン、Ｓｐｃ５−１２、及びＭＣＫプロモーターなどの筋肉細胞に特異的なプロモーターは、肝細胞への幾分の発現の漏出を呈し得、これは、本発明の核酸から発現されるＧＡＡポリペプチドに対する被験者の免疫寛容を誘導するのに有益であり得る。

他の組織特異的なプロモーター又は組織特異的ではないプロモーターも本発明の実施に有用であり得る。例えば、発現カセットは、肝特異的プロモーターとは異なるプロモーターである組織特異的プロモーターを含み得る。例えば、該プロモーターは、筋肉特異的プロモーター、例えばデスミンプロモーター（及びデスミンプロモーター変異体、例えば天然又は人工のエンハンサーを含むデスミンプロモーター）、ＳＰｃ５−１２又はＭＣＫプロモーターであり得る。別の実施態様では、該プロモーターは、他の細胞系統に特異的なプロモーター、例えば赤血球系統の細胞に由来するＧＡＡポリペプチドの発現のためのエリスロポエチンプロモーターである。

別の実施態様では、該プロモーターは偏在性プロモーターである。代表的な偏在性プロモーターとしては、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーター（ＣＭＶ）、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターなどが挙げられる。

さらに、該プロモーターはまた、内因性プロモーター、例えばアルブミンプロモーター又はＧＡＡプロモーターであり得る。

特定の実施態様では、該プロモーターは、エンハンサー配列、例えばシス調節モジュール（ＣＲＭ）又は人工エンハンサー配列に結合している。例えば、該プロモーターは、エンハンサー配列、例えばヒトＡｐｏＥ制御領域（又はヒトアポリポタンパク質Ｅ／Ｃ−Ｉ遺伝子座、肝制御領域ＨＣＲ−１−Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ３２５１０、配列番号１５に示される）に結合していてもよい。特定の実施態様では、ＡｐｏＥ配列などのエンハンサー配列は、肝特異的プロモーター、例えば上記に列挙されているプロモーター、特に例えばｈＡＡＴプロモーターに結合している。本発明の実施に有用な他のＣＲＭとしては、Rincon et al., Mol Ther. 2015 Jan;23(1):43-52, Chuah et al., Mol Ther. 2014 Sep;22(9):1605-13又はNair et al., Blood. 2014 May 15;123(20):3195-9に記載のものが挙げられる。

別の特定の実施態様では、核酸構築物は、イントロン、特にプロモーターとＧＡＡコード配列の間に配置されたイントロンを含む。イントロンは、ｍＲＮＡの安定性及びタンパク質の生成を増加させるために導入され得る。さらなる実施態様では、核酸構築物は、ヒトβグロビンｂ２（すなわちＨＢＢ２）イントロン、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）イントロン、ＳＶ４０イントロン、又はニワトリβ−グロビンイントロンを含む。別のさらなる実施態様では、本発明の核酸構築物は、該イントロンに見られる代替オープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）の数を減少させるために又はさらには完全に除去するために設計された改変されたイントロン（特に改変されたＨＢＢ２又はＦＩＸイントロン）を含有している。好ましくは、その長さが５０ｂｐにわたり、読み枠内に開始コドンと終止コドンを有するＡＲＦが除去される。ＡＲＦは、イントロンの配列を改変することによって除去されてもよい。例えば、ヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失を用いて、好ましくはヌクレオチドの置換によって改変が行なわれ得る。一例として、関心対象のイントロン配列に存在するＡＴＧ又はＧＴＧ開始コドンにおける１つ以上のヌクレオチド、特に１つのヌクレオチドを置換することにより、非開始コドンがもたらされ得る。例えば、ＡＴＧ又はＧＴＧを、関心対象のイントロンの配列内の、開始コドンではない、ＣＴＧによって置換し得る。

核酸構築物に使用される古典的なＨＢＢ２イントロンを配列番号１６に示す。例えば、このＨＢＢ２イントロンは、該イントロン内の開始コドン（ＡＴＧコドン及びＧＴＧコドン）を排除することによって改変され得る。特定の実施態様では、構築物に含まれる改変されたＨＢＢ２イントロンは、配列番号１７に示される配列を有する。核酸構築物に使用される古典的なＦＩＸイントロンは、ヒトＦＩＸの第一イントロンから得られ、配列番号１８に示されている。ＦＩＸイントロンは、該イントロン内の開始コドン（ＡＴＧコドン及びＧＴＧコドン）を排除することによって改変され得る。特定の実施態様では、本発明の構築物に含まれる改変されたＦＩＸイントロンは、配列番号１９に示される配列を有する。核酸構築物に使用される古典的なニワトリ−βグロビンイントロンは、配列番号２０に示される。ニワトリ−βグロビンイントロンは、該イントロン内の開始コドン（ＡＴＧコドン及びＧＴＧコドン）を排除することによって改変され得る。特定の実施態様では、本発明の構築物に含まれる改変されたニワトリ−βグロビンイントロンは、配列番号２１に示される配列を有する。

本発明者らは以前に、国際公開公報第２０１５／１６２３０２号において、このような改変されたイントロン、特に改変されたＨＢＢ２イントロン又はＦＩＸイントロンが有益な特性を有し、導入遺伝子の発現を有意に改善させることができることを示した。

特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、５’から３’の方向に、場合によりエンハンサーが前に存在するプロモーター、本発明のコード配列（すなわち、最適化された本発明の切断短縮されたＧＡＡコード配列、本発明のキメラＧＡＡコード配列、又は本発明のキメラかつ配列の最適化されたＧＡＡコード配列）、及びポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、又は別の天然に存在するか若しくは人工のポリアデニル化シグナル）を含む、発現カセットである。特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、５’から３’の方向に、場合によりエンハンサー（例えばＡｐｏＥ制御領域）が前に存在するプロモーター、イントロン（特に上記に定義されているようなイントロン）、本発明のコード配列、及びポリアデニル化シグナルを含む、発現カセットである。さらなる特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、５’から３’の方向に、ＡｐｏＥ制御領域などのエンハンサー、プロモーター、イントロン（特に上記に定義されているようなイントロン）、本発明のコード配列、及びポリアデニル化シグナルを含む、発現カセットである。本発明のさらなる特定の実施態様では、発現カセットは、５’から３’の方向に、ＡｐｏＥ制御領域、ｈＡＡＴ肝特異的プロモーター、ＨＢＢ２イントロン（特に上記に定義されているような改変されたＨＢＢ２イントロン）、本発明のコード配列、及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含み、例えば、
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ８切断短縮型をコードしかつ配列番号５のシグナルペプチドをコードしている最適化されていないヌクレオチド配列を含む、配列番号２２；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ８切断短縮型をコードし（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号５のシグナルペプチドをコードしている最適化された配列を含む、配列番号２３；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ８切断短縮型をコードし（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号５のシグナルペプチドをコードしている別の最適化された配列を含む、配列番号２４；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ８切断短縮型（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）及び配列番号３のシグナルペプチドをコードしている最適化された配列を含む、配列番号２５；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４２切断短縮型（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）及び配列番号３のシグナルペプチドをコードしている最適化された配列を含む、配列番号２６；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ２９切断短縮型（配列番号９の最適化されていない配列に由来するヌクレオチド配列）及び配列番号３のシグナルペプチドをコードしている最適化されていない配列を含む、配列番号３７；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ２９切断短縮型（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）及び配列番号３のシグナルペプチドをコードしている最適化された配列を含む、配列番号３８；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ２９切断短縮型（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）及び配列番号３のシグナルペプチドをコードしている別の最適化された配列を含む、配列番号３９；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４２切断短縮型（配列番号９の最適化されていない配列に由来するヌクレオチド配列）及び配列番号３のシグナルペプチドをコードしている最適化されていない配列を含む、配列番号４０；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４２切断短縮型（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）及び配列番号３のシグナルペプチドをコードしている別の最適化された配列を含む、配列番号４１；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４３切断短縮型（配列番号９の最適化されていない配列に由来するヌクレオチド配列）及び配列番号３のシグナルペプチドをコードしている最適化されていない配列を含む、配列番号４２；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４３切断短縮型（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）及び配列番号３のシグナルペプチドをコードしている最適化された配列を含む、配列番号４３；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４３切断短縮型（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）及び配列番号３のシグナルペプチドをコードしている別の最適化された配列を含む、配列番号４４；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４７切断短縮型（配列番号９の最適化されていない配列に由来するヌクレオチド配列）及び配列番号３のシグナルペプチドをコードしている最適化されていない配列を含む、配列番号４５；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４７切断短縮型（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）及び配列番号３のシグナルペプチドをコードしている最適化された配列を含む、配列番号４６；並びに
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４７切断短縮型（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）及び配列番号３のシグナルペプチドをコードしている別の最適化された配列を含む、配列番号４７
に示される構築物である。

本発明の他の発現カセットは、以下の核酸配列を含み得る：
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ８切断短縮型をコードしかつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されていないヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ２９切断短縮型をコードしかつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されていないヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４２切断短縮型をコードしかつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されていないヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４３切断短縮型をコードしかつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されていないヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４７切断短縮型をコードしかつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されていないヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ８切断短縮型をコードし（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ８切断短縮型をコードし（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ２９切断短縮型をコードし（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ２９切断短縮型をコードし（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４２切断短縮型をコードし（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４２切断短縮型をコードし（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４３切断短縮型をコードし（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４３切断短縮型をコードし（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４７切断短縮型をコードし（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４７切断短縮型をコードし（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列。

これらの特定の構築物の代替的な実施態様では、配列番号１をコードしている配列は、配列番号３３をコードしている配列によって置換されている。

特定の実施態様では、発現カセットは、ＡｐｏＥ制御領域、ｈＡＡＴ肝特異的プロモーター、コドン最適化ＨＢＢ２イントロン、本発明のコード配列、及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。

本発明の核酸構築物の設計の際に、当業者は、該構築物を細胞又は器官に送達するために使用されるベクターのサイズ限界を配慮することに気を付けるだろう。特に、当業者は、ＡＡＶベクターの主な限界はその積載能であり、これはＡＡＶ血清型によって異なり得るが、ほぼ親ウイルスゲノムのサイズが限界であると考えられている。例えば、５ｋｂが、ＡＡＶ８キャプシドにパッケージングされると通常考えられている最大のサイズである。（Wu Z. et al., Mol Ther., 2010, 18(1): 80-86; Lai Y. et al., Mol Ther., 2010, 18(1): 75-79; Wang Y. et al., Hum Gene Ther Methods, 2012, 23(4): 225-33）。したがって、当業者は、本発明の実施の際に、ＡＡＶ５’−及び３’−ＩＴＲをコードしている配列を含む、結果として得られる核酸配列が、装備されるＡＡＶベクターの積載能の好ましくは１１０％を超えないように、特に好ましくは５．５ｋｂを超えないように、本発明の核酸構築物の成分を選択するように気を付けるだろう。

本発明はまた、本明細書に開示されているような核酸分子又は構築物を含むベクターにも関する。特に、本発明のベクターは、タンパク質の発現に、好ましくは遺伝子療法に使用するのに適したベクターである。１つの実施態様では、該ベクターはプラスミドベクターである。別の実施態様では、該ベクターは、本発明の核酸分子、特に本発明のＧＡＡポリペプチドをコードしているメッセンジャーＲＮＡを含有している、ナノ粒子である。別の実施態様では、該ベクターは、活動亢進スリーピングビューティ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポゾン系（Mates et al. 2009）などの、標的細胞のゲノム内への本発明の核酸分子又は構築物の組み込みを可能とする、トランスポゾンに基づいた系である。別の実施態様では、該ベクターは、肝組織又は肝細胞、筋肉細胞、ＣＮＳ細胞（例えば脳細胞）、又は造血幹細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば赤血球）などの関心対象の任意の細胞を標的化する、遺伝子療法に適したウイルスベクターである。この場合、本発明の核酸構築物は、当技術分野において周知であるような、効果的なウイルスベクターを生成するのに適した配列も含有している。特定の実施態様では、該ウイルスベクターは、組込み用ウイルスから得られる。特に、該ウイルスベクターは、レトロウイルス又はレンチウイルスから誘導され得る。さらなる特定の実施態様では、該ウイルスベクターはＡＡＶベクター、例えば肝組織又は肝細胞を形質導入するのに適したＡＡＶベクター、より特定するとＡＡＶ−１、−２及びＡＡＶ−２変異体（例えば、Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods［印刷物に先駆けてオンラインで出版された論文］に開示された、Ｙ４４＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖの変化を有する工学操作されたキャプシドを含む、四重変異のキャプシドの最適化されたＡＡＶ−２）、ＡＡＶ−３及びＡＡＶ−３変異体（例えば、Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. Vol. 24(6), p. 1042に開示された、２つのアミノ酸変化、Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖを有する工学操作されたＡＡＶ３キャプシドを含むＡＡＶ３−ＳＴ変異体）、ＡＡＶ−３Ｂ及びＡＡＶ−３Ｂ変異体、ＡＡＶ−４、−５、−６、及びＡＡＶ−６変異体（例えば、Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, p.16026に開示された、三重変異ＡＡＶ６キャプシドＹ７３１Ｆ／Ｙ７０５Ｆ／Ｔ４９２Ｖ型を含むＡＡＶ６変異体）、ＡＡＶ−７、−８、−９、−１０、例えばＡＡＶ−ｃｙ１０及び−ｒｈ１０、−ｒｈ７４、−ｄｊ、Ａｎｃ８０、ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８、ブタＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶｐｏ４及びＡＡＶｐｏ６などのベクター又はレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター及びα−レトロウイルスである。当技術分野において公知であるように、使用するのに考えられる具体的なウイルスベクターに応じて、追加の適切な配列が、機能的なウイルスベクターを得るために本発明の核酸構築物に挿入されるだろう。適切な配列としては、ＡＡＶベクター用のＡＡＶＩＴＲ、又はレンチウイルスベクター用のＬＴＲが挙げられる。したがって、本発明はまた、それぞれの側においてＩＴＲ又はＬＴＲによってフランキングされた、上記のような発現カセットにも関する。

ウイルスベクターの利点は、この開示の以下の部分において考察されている。ウイルスベクターが、本発明の核酸分子又は構築物を送達するのに好ましく、例えば、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、又は非病原性パルボウイルス、より好ましくはＡＡＶベクターがある。ヒトパルボウイルスアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、感染した細胞のゲノムに組み込むことにより潜伏感染を確立することのできる、天然では複製欠損であるディペンドウイルスである。最後の特性は、哺乳動物ウイルスの中では独特なようである。なぜなら、組込みが、第１９番染色体（１９ｑ１３．３−ｑｔｅｒ）上に位置するＡＡＶＳ１と呼ばれるヒトゲノム内の特定の部位で起こるからである。

それ故、ＡＡＶベクターは、ヒト遺伝子療法のためのベクター候補としてかなりの関心を集めた。ウイルスの好ましい特性には、あらゆるヒト疾患を伴わないこと、分裂中の細胞及び分裂していない細胞の両方に感染することができること、及び様々な組織に由来する多種多様な細胞株に感染することができることがある。

ヒト又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され十分に特徴付けられたＡＡＶの血清型の中で、ヒト血清型２は、遺伝子導入用ベクターとして開発された最初のＡＡＶである。他の現在使用されているＡＡＶ血清型としては、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２変異体（例えば、Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods［印刷物に先駆けてオンラインで出版された論文］に開示された、Ｙ４４＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖの変化を有する工学操作されたキャプシドを含む、四重変異のキャプシドの最適化されたＡＡＶ−２）、ＡＡＶ−３及びＡＡＶ−３変異体（例えば、Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. Vol. 24(6), p. 1042に開示された、２つのアミノ酸変化、Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖを有する工学操作されたＡＡＶ３キャプシドを含むＡＡＶ３−ＳＴ変異体）、ＡＡＶ−３Ｂ及びＡＡＶ−３Ｂ変異体、ＡＡＶ−４、−５、−６、及びＡＡＶ−６変異体（例えば、Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, p.16026に開示された、三重変異ＡＡＶ６キャプシドＹ７３１Ｆ／Ｙ７０５Ｆ／Ｔ４９２Ｖ型を含むＡＡＶ６変異体）、ＡＡＶ−７、−８、−９、−１０、例えばＡＡＶ−ｃｙ１０及び−ｒｈ１０、−ｒｈ７４、−ｄｊ、Ａｎｃ８０、ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８、ブタＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶｐｏ４及びＡＡＶｐｏ６、並びにチロシン、リジン、及びセリンキャプシド突然変異体のＡＡＶ血清型などが挙げられる。さらに、他の非天然の工学操作された変異体及びキメラＡＡＶも有用であり得る。

ＡＡＶウイルスを慣用的な分子生物学技術を使用して工学操作し得、これにより、核酸配列を細胞特異的に送達するために、免疫原性を最小限とするために、安定性及び粒子の寿命を調整するために、効果的な分解のために、核への正確な送達のために、これらの粒子を最適化することが可能となる。

ベクターへの構築のための望ましいＡＡＶ断片は、キャップタンパク質（ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３を含む）及び超可変領域、ｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０を含む）及びこれらのタンパク質をコードしている配列を含む。これらの断片は、様々なベクター系及び宿主細胞において容易に利用され得る。

Ｒｅｐタンパク質を欠失しているＡＡＶ系組換えベクターは、低い効率で宿主のゲノムに組み込み、標的細胞内で数年間におよび持続し得る安定な環状エピソームとして主に存在する。ＡＡＶ天然血清型を使用する代わりに、天然に存在しないキャプシドタンパク質を有するＡＡＶを含むがこれに限定されない、人工的なＡＡＶ血清型を本発明の脈絡において使用し得る。このような人工的なキャプシドは、選択された異なるＡＡＶ血清型から、同じＡＡＶ血清型の非連続的部分から、ＡＡＶではないウイルス入手源から、又はウイルスではない入手源から得ることのできる異種配列と組み合わせた、選択されたＡＡＶ配列（例えばｖｐ１キャプシドタンパク質の断片）を使用して、任意の適切な技術によって作製され得る。人工的なＡＡＶ血清型は、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド、又は「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであり得るがこれらに限定されない。

したがって、本発明は、本発明の核酸分子又は構築物を含むＡＡＶベクターに関する。本発明の脈絡において、ＡＡＶベクターは、関心対象の標的細胞、特に肝癌細胞に形質導入することのできるＡＡＶキャプシドを含む。特定の実施態様によると、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−１、−２、ＡＡＶ−２変異体（例えば、Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods［印刷物に先駆けてオンラインで出版された論文］に開示された、Ｙ４４＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖの変化を有する工学操作されたキャプシドを含む、四重変異のキャプシドの最適化されたＡＡＶ−２）、ＡＡＶ−３及びＡＡＶ−３変異体（例えば、Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. Vol. 24(6), p. 1042に開示された、２つのアミノ酸変化、Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖを有する工学操作されたＡＡＶ３キャプシドを含むＡＡＶ３−ＳＴ変異体）、ＡＡＶ−３Ｂ及びＡＡＶ−３Ｂ変異体、ＡＡＶ−４、−５、−６、及びＡＡＶ−６変異体（例えば、Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, p.16026に開示された、三重変異ＡＡＶ６キャプシドＹ７３１Ｆ／Ｙ７０５Ｆ／Ｔ４９２Ｖ型を含むＡＡＶ６変異体）、ＡＡＶ−７、−８、−９、−１０、例えばＡＡＶ−ｃｙ１０及び−ｒｈ１０、−ｒｈ７４、−ｄｊ、Ａｎｃ８０、ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８、ブタＡＡＶ、例えばＡＡＶｐｏ４及びＡＡＶｐｏ６、並びにチロシン、リジン、及びセリンキャプシド突然変異体のＡＡＶ血清型などのものである。特定の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８血清型のものである（すなわち、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８血清型のキャプシドを有する）。さらなる特定の実施態様では、ＡＡＶベクターは偽型ベクターであり、すなわち、そのゲノム及びキャプシドは、異なる血清型のＡＡＶに由来する。例えば、偽型ＡＡＶベクターは、そのゲノムが上記の１つのＡＡＶ血清型に由来し、そのキャプシドが別の血清型に由来する、ベクターであり得る。例えば、偽型ベクターのゲノムは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８血清型に由来するキャプシドを有し得、そのゲノムは異なる血清型に由来し得る。特定の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ７４血清型、特にＡＡＶ８又はＡＡＶ９血清型、より特定するとＡＡＶ８血清型のキャプシドを有する。

ベクターは、導入遺伝子を筋肉細胞に送達するのに使用するためのものである具体的な実施態様では、ＡＡＶベクターは、とりわけ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶｒｈ７４からなる群より選択され得る。ベクターは、導入遺伝子を肝細胞に送達するのに使用するためのものである別の具体的な実施態様では、ＡＡＶベクターは、とりわけ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ−Ａｎｃ８０及びＡＡＶ３Ｂからなる群より選択され得る。

別の実施態様では、キャプシドは改変されたキャプシドである。本発明の脈絡において、「改変されたキャプシド」は、キメラキャプシド、又は１つ以上の野生型ＡＡＶＶＰキャプシドタンパク質に由来する１つ以上の変異ＶＰキャプシドタンパク質を含むキャプシドであり得る。

特定の実施態様では、ＡＡＶベクターはキメラベクターであり、すなわち、そのキャプシドは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型に由来するＶＰキャプシドタンパク質を含むか、又は、少なくとも２つのＡＡＶ血清型に由来するＶＰタンパク質領域若しくはドメインと組み合わせた少なくとも１つのキメラＶＰタンパク質を含む。肝細胞を形質導入するのに有用なこのようなキメラＡＡＶベクターの例は、Shen et al., Molecular Therapy, 2007及びTenney et al., Virology, 2014に記載されている。例えば、キメラＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８キャプシド配列と、ＡＡＶ８血清型とは異なるＡＡＶ血清型の配列、例えば上記に具体的に記載されているもののいずれかとの組合せから得ることができる。別の実施態様では、ＡＡＶベクターのキャプシドは、国際公開公報第２０１５０１３３１３号に記載のものなどの１つ以上の変異ＶＰキャプシドタンパク質、特に、高い肝指向性を示す、ＲＨＭ４−１、ＲＨＭ１５−１、ＲＨＭ１５−２、ＲＨＭ１５−３／ＲＨＭ１５−５、ＲＨＭ１５−４及びＲＨＭ１５−６キャプシド変異体を含む。

別の実施態様では、改変されたキャプシドはまた、エラープローンＰＣＲ及び／又はペプチド挿入（例えばBartel et al., 2011に記載のような）によって挿入されたキャプシド改変に由来し得る。さらに、キャプシド変異体は、チロシン突然変異体などの単一アミノ酸変化を含み得る（例えば、Zhong et al., 2008に記載のような）。

さらに、ＡＡＶベクターのゲノムは、一本鎖又は自己相補的二本鎖ゲノムのいずれかであり得る（McCarty et al., Gene Therapy, 2003）。自己相補性二本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ末端反復配列の１つから末端解離部位（ｔｒｓ）を欠失させることによって作製される。これらの改変されたベクター（その複製ゲノムは、野生型ＡＡＶゲノムの半分の長さである）は、ＤＮＡ二量体をパッケージングする傾向を有する。好ましい実施態様では、本発明の実施に装備されるＡＡＶベクターは一本鎖ゲノムを有し、さらに好ましくはＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８キャプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ７４キャプシド、例えばＡＡＶ８又はＡＡＶ９キャプシド、より特定するとＡＡＶ８キャプシドを含む。

特に好ましい実施態様では、本発明は、一本鎖又は二本鎖の自己相補性ゲノム（例えば一本鎖ゲノム）に、本発明の核酸構築物を含む、ＡＡＶベクターに関する。１つの実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４又はＡＡＶ２ｉ８キャプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ７４キャプシド、例えばＡＡＶ８又はＡＡＶ９キャプシド、より特定するとＡＡＶ８キャプシドを含む。さらなる特定の実施態様では、該核酸は、プロモーター、特に偏在性プロモーター又は肝特異的プロモーターに作動可能に連結されている。特定の変異体の実施態様によると、該プロモーターは、遍在性プロモーター、例えばサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーター（ＣＭＶ）、ＰＧＫプロモーター、及びＳＶ４０初期プロモーターである。特定の変異体では、該偏在性プロモーターはＣＡＧプロモーターである。別の変異体によると、該プロモーターは肝特異的プロモーター、例えばα−１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、トランスサイレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、及びチロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターである。特定の変異体では、肝特異的プロモーターは、配列番号１４のｈＡＡＴ肝特異的プロモーターである。さらなる特定の実施態様では、本発明のＡＡＶベクターのゲノムに含まれる核酸構築物はさらに、上記のようなイントロン、例えばプロモーターと、ＧＡＡコード配列をコードしている核酸配列（すなわち、本発明の最適化されたＧＡＡコード配列、本発明のキメラＧＡＡコード配列、または本発明のキメラかつ最適化されたＧＡＡコード配列）との間に配置されたイントロンを含む。ＡＡＶベクターゲノム内に導入された核酸構築物内に含まれ得る代表的なイントロンとしては、ヒトβグロビンｂ２（すなわちＨＢＢ２）イントロン、ＦＩＸイントロン、及びニワトリβ−グロビンイントロンが挙げられるがこれらに限定されない。ＡＡＶベクターのゲノム内の該イントロンは、古典的な（すなわち改変されていない）イントロンであっても、又は、該イントロン内の代替オープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）の数を減少させるために若しくはさらには完全に除去するために設計された改変されたイントロンであってもよい。本発明の核酸がＡＡＶベクター内に導入されている、この実施態様の実施に使用され得る、改変されたイントロン及び改変されていないイントロンは、上記に徹底的に記載されている。特定の実施態様では、本発明のＡＡＶベクター、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８キャプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ７４キャプシド、例えばＡＡＶ８又はＡＡＶ９キャプシド、より特定するとＡＡＶ８キャプシドを含むＡＡＶベクターは、そのゲノム内に、改変された（すなわち最適化された）イントロン、例えば配列番号１７の改変されたＨＢＢ２イントロン、配列番号１９の改変されたＦＩＸイントロン、及び配列番号２１の改変されたニワトリβ−グロビンイントロンを含む。さらなる特定の実施態様では、本発明のベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８キャプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ７４キャプシド、例えばＡＡＶ８又はＡＡＶ９キャプシド、より特定するとＡＡＶ８キャプシドを含み、５’から３’の方向に、ＡＡＶ５’−ＩＴＲ（例えばＡＡＶ２５’−ＩＴＲ）；ＡｐｏＥ制御領域；ｈＡＡＴ肝特異的プロモーター；ＨＢＢ２イントロン（特に上記に定義されているような改変されたＨＢＢ２イントロン）；本発明のＧＡＡコード配列；ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル；及びＡＡＶ３’−ＩＴＲ（例えばＡＡＶ２３’−ＩＴＲ）を含有しているゲノム、例えばＡＡＶ５’−ＩＴＲ（例えばＡＡＶ２５’−ＩＴＲ）とＡＡＶ３’−ＩＴＲ（例えばＡＡＶ２３’−ＩＴＲ）によってフランキングされている配列番号２２〜２６及び配列番号３７〜４７に示される核酸構築物を含むゲノムを含む、ＡＡＶベクターである。本発明の実施に有用である他の核酸構築物は、上記のもの、例えば以下を含む：
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ８切断短縮型をコードしかつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されていないヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ２９切断短縮型をコードしかつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されていないヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４２切断短縮型をコードしかつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されていないヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４３切断短縮型をコードしかつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されていないヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４７切断短縮型をコードしかつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されていないヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ８切断短縮型をコードし（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ８切断短縮型をコードし（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ２９切断短縮型をコードし（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ２９切断短縮型をコードし（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４２切断短縮型をコードし（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４又は６のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４２切断短縮型をコードし（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４３切断短縮型をコードし（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４３切断短縮型をコードし（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４７切断短縮型をコードし（配列番号１２の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列；
−配列番号１の親ｈＧＡＡに由来するＧＡＡのΔ４７切断短縮型をコードし（配列番号１３の最適化された配列に由来するヌクレオチド配列）かつ配列番号４、６、又は７のシグナルペプチドをコードしている、最適化されたヌクレオチド配列。

本発明の特定の実施態様では、本発明の核酸構築物は、上記のような肝特異的プロモーターを含み、該ベクターは、上記のような肝組織又は肝細胞を形質導入することのできるウイルスベクターである。本発明者らは、この実施態様のお蔭で、肝癌細胞において分泌可能な形態のＧＡＡを発現させ、かつタンパク質に対する免疫寛容を誘発するための高度に効果的かつ最適化されたベクターを開発する際に、肝臓の免疫寛容誘発特性及び代謝特性が有利には装備されることを示すデータを以下に提示する。

さらに、さらなる特定の実施態様では、本発明は、関心対象の細胞における遺伝子送達及び処置効力を改善するための、２つのベクター、例えば２つのウイルスベクター、特に２つのＡＡＶベクターの組合せを提供する。例えば、２つのベクターは、これらの２つのそれぞれのベクター内に、１つの異なるプロモーターの制御下にある、本発明のＧＡＡタンパク質をコードしている本発明の核酸分子を有し得る。特定の実施態様では、一方のベクターは、肝特異的プロモーターであるプロモーター（例えば上記のようなものの１つ）を含み、他方のベクターは、糖原病の処置のための関心対象の別の組織に特異的であるプロモーター、例えば筋肉特異的プロモーター、例えばデスミンプロモーターを含む。この実施態様の特定の変異体では、このベクターの組合せは、国際公開公報第２０１５１９６１７９号に記載のように作製された、複数の共パッケージングされたＡＡＶベクターに相当する。

本発明はまた、エクスビボにおける遺伝子療法の場合と同様に、本発明の核酸分子又は構築物を用いて形質転換された細胞、例えば肝細胞に関する。本発明の細胞は、それを必要とする被験者、例えばＧＡＡ欠損患者に、任意の適切な投与経路によって、例えば該被験者の肝臓又は血流への注射を介して送達され得る。特定の実施態様では、本発明は、本発明の核酸分子、核酸構築物、又はベクター、特にレンチウイルスベクターを、肝細胞、特に処置される予定の被験者の肝細胞に導入する工程、及び該核酸が導入されている形質転換された該肝細胞を被験者に投与する工程を含む。有利には、この実施態様は、該細胞からＧＡＡを分泌するのに有用である。特定の実施態様では、肝細胞は、処置される予定の患者に由来する肝細胞であるか、又は、患者へのその後の投与のために、さらにインビトロにおいて形質転換されそして肝細胞へと分化させた肝幹細胞である。

本発明はさらに、そのゲノム内に、本発明に記載のＧＡＡタンパク質をコードしている核酸分子又は構築物を含む、トランスジェニック非ヒト動物に関する。特定の実施態様では、動物はマウスである。

以下の実施例において具現化された具体的な送達システムとは別に、様々な送達システムが知られており、これを使用して本発明の核酸分子又は構築物を投与することができ、例えば、本発明のコード配列を発現することのできる組換え細胞をリポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル内に封入、受容体媒介エンドサイトーシス、レトロウイルス若しくは他のベクターの一部としての治療用核酸の構築などがある。

１つの実施態様によると、本発明のＧＡＡポリペプチド、核酸分子、核酸構築物、又は細胞を被験者の肝臓に任意の適切な経路によって導入することが望ましくあり得る。さらに、ミニサークル及びトランスポゾンなどの裸ＤＮＡを、送達又はレンチウイルスベクターのために使用することができる。さらに、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集技術を使用して、本発明のコード配列を送達することもできる。

本発明はまた、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、ＧＡＡポリペプチド、又は細胞を含む、医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の治療薬（本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、ＧＡＡポリペプチド又は細胞）及び薬学的に許容される担体を含む。具体的な実施態様では、「薬学的に許容される」という用語は、動物及びヒトへの使用について、米国政府若しくは州政府の規制当局によって認可されているか、又は米国薬局方若しくは欧州薬局方若しくは他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指し、これと共に治療薬が投与される。このような薬学的担体は、無菌液体、例えば水及び油、例えば石油、動物油、植物油、又は合成起源の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであり得る。医薬組成物が静脈内投与される場合には水が好ましい担体である。食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射液用に使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。

所望であれば、該組成物はまた、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝化剤も含有し得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの剤形をとり得る。経口用製剤は、標準的な担体、例えば製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。適切な薬学的担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、治療有効量の治療薬、好ましくは精製形の治療薬を、適切な量の担体と一緒に含有することにより、被験者への適切な投与のための剤形を提供するだろう。特定の実施態様では、本発明の核酸、ベクター又は細胞は、リン酸緩衝食塩水を含みかつ０．２５％のヒト血清アルブミンの補充された組成物に製剤化される。別の特定の実施態様では、本発明の核酸、ベクター、又は細胞は、乳酸リンゲル液及び非イオン性界面活性剤、例えばプルロニックＦ６８を、全組成物の重量に対して、０．０１〜０．０００１％の最終濃度で、例えば０．００１％の濃度で含む組成物に製剤化される。該製剤はさらに、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、例えば０．２５％のヒト血清アルブミンを含み得る。保存又は投与のいずれかのための他の適切な製剤は当技術分野において、特に国際公開公報第２００５／１１８７９２号又はAllay et al., 2011から公知である。

好ましい実施態様では、前記組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として慣用的な手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌等張緩衝水溶液中の溶液である。必要であれば、該組成物はまた、可溶化剤、及び注射部位における疼痛を和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含み得る。

１つの実施態様では、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、ＧＡＡポリペプチド又は細胞は、小胞で、特にリポソームで送達され得る。さらに別の実施態様では、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、ＧＡＡポリペプチド又は細胞は、放出制御システムで送達され得る。

本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、ＧＡＡポリペプチド又は細胞の投与法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、投与は、静脈内又は筋肉内経路を介する。本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、ＧＡＡポリペプチド又は細胞（ベクター化されていようがいまいが）は、任意の簡便な経路によって、例えば注入又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜裏打ち（例えば口腔粘膜、直腸粘膜、及び腸管粘膜など）を通した吸収によって投与され得、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は全身性であっても、局所的であってもよい。

具体的な実施態様では、本発明の医薬組成物を処置の必要な領域、例えば肝臓に局所的に投与することが望ましくあり得る。これは、例えば、埋込剤を用いることによって成し遂げられ得、該埋込剤は、多孔性、無孔性、又はゲル状材料、例えば膜、例えばシリコンゴム膜、又は繊維である。

糖原病の処置に有効であろう本発明の治療薬（すなわち、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、ＧＡＡポリペプチド又は細胞）の量は、標準的な臨床的技術によって決定され得る。さらに、インビボ及び／又はインビトロアッセイを場合により使用することにより、至適用量範囲を予測するのを補助し得る。製剤中に使用される予定の正確な用量はまた、投与経路及び疾患の深刻度にも依存し、医師の判断及び各患者の環境に従って決断されるべきである。それを必要とする被験者に投与される、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、ＧＡＡポリペプチド又は細胞の用量は、投与経路、処置される具体的な疾患、被験者の年齢、又は治療効果を達成するために必要とされる発現レベルを含むがこれらに限定されない、いくつかの因子に基づいて変更されるだろう。当業者は、この分野におけるその知識に基づいて、これらの因子及びその他の因子に基づいて必要とされる用量範囲を容易に決定することができる。被験者にＡＡＶベクターなどのウイルスベクターを投与する工程を含む処置の場合、ベクターの典型的な用量は、体重１kgあたり少なくとも１×１０^８個のベクターゲノム（vg/kg）、例えば少なくとも１×１０^９vg/kg、少なくとも１×１０^１０vg/kg、少なくとも１×１０^１１vg/kg、少なくとも１×１０^１２vg/kg、少なくとも１×１０^１３vg/kg、又は少なくとも１×１０^１４vg/kgである。

本発明はまた、治療有効量の本発明の核酸、ベクター、ＧＡＡポリペプチド、医薬組成物、又は細胞を、それを必要とする被験者に送達する工程を含む、糖原病を処置するための方法にも関する。

本発明はまた、糖原病を処置するための方法にも関し、該方法は、導入遺伝子に対して（すなわち本発明のＧＡＡポリペプチドに対して）全く免疫応答を誘発しないか、又は、導入遺伝子に対して低減された免疫応答を誘発し、治療有効量の本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、医薬組成物、又は細胞を、それを必要とする被験者に送達する工程を含む。本発明はまた、糖原病を処置するための方法にも関し、該方法は、治療有効量の本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、医薬組成物、又は細胞の、それを必要とする被験者への反復投与を含む。この態様では、本発明の核酸分子又は核酸構築物は、肝細胞において機能的であるプロモーターを含み、これにより、それから生成された発現されたＧＡＡポリペプチドに対する免疫寛容が可能となる。同様に、この態様では、この態様において使用される医薬組成物は、肝細胞において機能的であるプロモーターを含む核酸分子又は核酸構築物を含む。肝細胞の送達の場合、該細胞は、処置を必要とする被験者から事前に回収され、その中に本発明の核酸分子又は核酸構築物を導入することによって、それらが本発明のＧＡＡポリペプチドを生成することを可能とするように工学操作された細胞であり得る。反復投与を含む態様における１つの実施態様によると、該投与は、少なくとも１回以上繰り返され得、さらには週１回、月１回、又は年１回などの周期的計画に従って実施されることが考えられ得る。周期的計画はまた、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０年間毎に１回、又は１０年間以上毎に１回の投与も含み得る。別の特定の実施態様では、本発明のウイルスベクターの各投与の投与は、それぞれの連続した投与について異なるウイルスを使用して実施され、これにより、以前に投与されたウイルスベクターに対する起こり得る免疫応答による効力の減少は回避される。例えば、ＡＡＶ８キャプシドを含むウイルスベクターの１回目の投与に続いて、ＡＡＶ９キャプシドを含むベクターの投与が行なわれ得、又はさらにはレトロウイルスベクター若しくはレンチウイルスベクターなどのＡＡＶに関連性のないウイルスの投与が行なわれ得る。

本発明によると、処置は、治癒効果、寛解効果、又は予防効果を含み得る。したがって、治療処置及び予防処置は、特定の糖原病の症状の寛解、又は特定の糖原病を発症するリスクの予防若しくはさもなくば低減を含む。「予防」という用語は、特定の容態の重症度又は発症を低減させることと考えられ得る。「予防」はまた、容態を有すると事前に診断された患者における特定の容態の再発を予防することも含む。「治療」はまた、既存の容態の重症度を低減させ得る。「処置」という用語は本明細書において、動物、特に哺乳動物、より特定するとヒト被験者に恩恵をもたらし得る任意の処方計画を指すために使用される。

本発明はまた、本発明の核酸分子又は核酸構築物を、それを必要とする患者の単離された細胞、例えば単離された造血幹細胞に導入する工程、及び該細胞をそれを必要とする該患者に導入する工程を含む、糖原病の処置のためのエクスビボにおける遺伝子療法に関する。この態様の特定の実施態様では、核酸分子又は構築物は、上記に定義されているようなベクターを用いて細胞に導入される。特定の実施態様では、ベクターは組込み用ウイルスベクターである。さらなる特定の実施態様では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターである。例えば、van Til et al., 2010, Blood, 115(26), p. 5329に開示されているようなレンチウイルスベクターを、本発明の方法における実施に使用し得る。

本発明はまた、医薬品としての使用のための、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、ＧＡＡポリペプチド、又は細胞にも関する。

本発明はまた、ＧＡＡ遺伝子の突然変異によって引き起こされる疾患を処置するための方法において、特にポンペ病を処置するための方法において使用するための、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、ＧＡＡポリペプチド、又は細胞にも関する。本発明はさらに、糖原病Ｉ型（フォン・ギールケ病）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、糖原病ＩＩＩ型（コーリ病）、糖原病ＩＶ型、糖原病Ｖ型、糖原病ＶＩ型、糖原病ＶＩＩ型、糖原病ＶＩＩＩ型、及び心臓の致死性先天性糖原病、より特定すると糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型又は糖原病ＩＩＩ型、さらにより特定すると糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型、最も特定すると糖原病ＩＩ型などの糖原病を処置するための方法に使用するための、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、ＧＡＡポリペプチド、又は細胞に関する。本発明の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、それを必要とする患者に、酵素補充療法（ＥＲＴ）に使用するために、例えば、糖原病、例えば糖原病Ｉ型（フォン・ギールケ病）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、糖原病ＩＩＩ型（コーリ病）、糖原病ＩＶ型、糖原病Ｖ型、糖原病ＶＩ型、糖原病ＶＩＩ型、糖原病ＶＩＩＩ型、及び心臓の致死性先天性糖原病、より特定すると糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型又は糖原病ＩＩＩ型、さらにより特定すると糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型、最も特定すると糖原病ＩＩ型の酵素補充療法にも使用するために投与され得る。

本発明はさらに、糖原病Ｉ型（フォン・ギールケ病）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、糖原病ＩＩＩ型（コーリ病）、糖原病ＩＶ型、糖原病Ｖ型、糖原病ＶＩ型、糖原病ＶＩＩ型、糖原病ＶＩＩＩ型、及び心臓の致死性先天性糖原病、より特定すると糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型又は糖原病ＩＩＩ型、さらにより特定すると糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型、最も特定すると糖原病ＩＩ型などの糖原病の処置に有用な医薬品の製造における、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、ＧＡＡポリペプチド、又は細胞の使用にも関する。

実施例
本発明は、以下の実験実施例及び添付の図面を参照することによりさらに詳述されている。これらの実施例は、説明のためだけに提供され、制限する意図はない。

材料及び方法
ＧＡＡ活性
凍結した組織試料を蒸留水中でホモジナイズした後にＧＡＡ活性を測定した。５０〜１００mgの組織を秤量し、ホモジナイズし、次いで、１００００×ｇで２０分間遠心分離にかけた。反応を、９６ウェルプレートにおいて１０μlの上清及び２０μlの基質（４ＭＵα−Ｄ−グルコシド）を用いて組み立てた。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次いで、１５０μlの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）の添加によって停止した。標準曲線（０〜２５００pmol/μlの４ＭＵ）を使用して、個々の反応混合物から放出された蛍光４ＭＵを、４４９nm（発光）及び３６０nm（励起）でＥｎＳｐｉｒｅアルファプレートリーダー（パーキンエルマー社）を使用して測定した。清澄化した上清のタンパク質濃度をＢＣＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）によって定量した。ＧＡＡ活性を計算するために、放出された４ＭＵ濃度を試料のタンパク質濃度で割り、活性をnmol/時間/mg（タンパク質）として報告した。

マウス試験
Ｇａａ−/−マウスを、エキソン６の標的化破壊によって作製し、Ｃ５７ＢＬ/６Ｊ/１２９Ｘ１/ＳｖＪバックグランドに維持した（Raben N. et al 1998）。０．２mlの容量のベクターを、尾静脈を介して送達した。血清試料を月１回収集して、分泌されたｈＧＡＡのレベルをモニタリングした。ＰＢＳの注射された罹患動物及び野生型同腹仔を対照として使用した。

非ヒト霊長類の試験
雄のカニクイザルを、ステンレス鋼のケージで飼い、１２時間の明暗サイクルに維持した。全てのマカクが、試験開始前に１：５未満の中和抗体力価を示した。２×１０^１２vg/kgの用量のＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｓｐ７−Δ８−ｈＧＡＡｃｏ１を、伏在静脈を介して注入した。血液試料を、大腿静脈を介した注射の１２日前及び３０日後に採取した。全血を、ＥＤＴＡ含有チューブに収集し、遠心分離にかけて血清を分離した。ベクター投与から３カ月後に全てのマカクを安楽死させた。動物をまず、ケタミン／デクスメデトミジンの混合物を用いて麻酔し、次いで、静注ペントバルビタールナトリウムを使用して安楽死させた。組織を直ちに収集し、液体窒素で凍結させた。

ウェスタンブロット分析
凍結させた筋肉から完全ホモジネートを得た。抽出物中のタンパク質の濃度を、製造業者の説明書に従って、ピアス社のＢＣＡタンパク質アッセイ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）によって決定した。ウェスタンブロットを、抗ｈＧＡＡ抗体（アブカム社）を用いて実施した。抗チューブリン抗体（シグマアルドリッチ社）をローディング対照として使用した。

結果
改善された分泌及び低減した免疫原性を有する新規な形態のＧＡＡを設計する目的で、本発明者らは、場合により切断短縮型のＧＡＡを代替シグナルペプチドと組み合わせた、切断短縮型のＧＡＡを作製することを決断した。

配列番号２に示されるヒトＧＡＡは、これらの新規な形態を設計するための基盤の役目を果たした。配列番号１は、ＧＡＡの相当する天然シグナルペプチド（配列番号２のアミノ酸１〜２７）の欠けた、配列番号２の配列に相当する。核酸構築物は、そのＮ末端において切断短縮された配列番号１に由来するＧＡＡポリペプチドをコードするように設計された。本発明者らは、配列番号１の最初の８アミノ酸に相当するコドンを欠失させた（Δ８）野生型ｈＧＡＡコード配列（シグナルペプチドコード配列を含む野生型ｈＧＡＡコード配列である配列番号８のヌクレオチド８２〜２８５９に相当する、配列番号９）に基づいて核酸配列を設計することから始めた。野生型ｈＧＡＡコード配列に加えて、本発明者らは、起こり得る配列特異的効果を排除するために、Δ８切断短縮ｈＧＡＡポリペプチドをコードしている最適化された核酸配列（配列番号１０及び配列番号１１は、それぞれｈＧＡＡｃｏ１及びｈＧＡＡｃｏ２の最適化コード配列に相当する）を設計した。

ｈＧＡＡ配列のアミノ酸１〜２７（ここではｓｐ１として定義されている、ｈＧＡＡの天然シグナルペプチドに相当する；その配列は配列番号４に示される）は、ここではｓｐ２（配列番号５に示される配列）として定義されるヒトα−１−アンチトリプシン配列（ＮＰ＿０００２８６．３）のアミノ酸１〜２４によって置換されている。本発明者らは、ヒト肝癌細胞（Ｈｕｈ−７）に切断短縮されたｈＧＡＡをコードしている構築物をその完全サイズのバージョンと平行してトランスフェクトし、本発明者らは４８時間後に培地中に放出されたｈＧＡＡの量を測定した（図１Ａ）。ｈＧＡＡ配列のΔ８欠失により、野生型配列（ｈＧＡＡ）及びコドンの最適化された（ｈＧＡＡｃｏ２）配列の両方において分泌レベルの有意な５０％の増加がもたらされた。異なるコドンの最適化された配列（ｈＧＡＡｃｏ１）に対して実施された同じ切断短縮によっても、同程度までｈＧＡＡの分泌が改善された。

シグナルペプチドの後の配列の変化が、ｈＧＡＡの分泌を改善させ得ることを確認するために、本発明者らはｈＧＡＡポリペプチドをさらに切断短縮した。本発明者らは、ｈＧＡＡｃｏ１構築物からｈＧＡＡの最初の４２アミノ酸に相当するコドンを排除し（Δ４２）、本発明者らはそれらをキモトリプシノーゲンＢ１に由来するシグナルペプチド（ｓｐ７；配列番号３に示される配列）で置換した。次いで、本発明者らは、ｓｐ７シグナルペプチドと融合させたそのΔ８バージョンを有するこの新規な欠失構築物を用いて得られた分泌効力と、ｓｐ１又はｓｐ７を有する完全サイズのｈＧＡＡｃｏ１を用いて得られた分泌効力を比較した。本発明者らは、Ｈｕｈ−７細胞にそうした構築物をトランスフェクトし、本発明者らは４８時間後に培地中のｈＧＡＡ活性を測定した。予想された通り、本発明者らは、完全サイズのｈＧＡＡｃｏ１のトランスフェクション後のｈＧＡＡ活性を測定することができ（ＧＦＰに対してｐ＝０．０５５）、その分泌は、野生型シグナルペプチドをｓｐ７で置換することによって２倍増加する（ｈＧＡＡｃｏ１に対してｐ＝０．００６）。驚くべきことに、ｓｐ７シグナルペプチドと融合させたΔ８ｈＧＡＡ配列及びΔ４２ｈＧＡＡ配列の両方が、完全サイズの配列と比較して、ｈＧＡＡの２倍の分泌増加を示した（ｓｐ７−ｈＧＡＡｃｏ１に対してそれぞれｐ＝０．０００２及びｐ＝０．０００３、図１Ｂ）。

要するに、これらのデータは、効果的なシグナルペプチドと結合させたｈＧＡＡ配列の切断短縮は、インビトロにおいてタンパク質の分泌を増加させることができることを実証する。さらに、切断短縮により主な新生抗原が発生しないので（これは治療用製品の工学操作における利点である）、切断短縮は、天然配列の突然変異誘発と比較して１つの重要な利点を有する。

次いで、本発明者らは、インビボで、ポンペ病マウスモデルにおいてそうした所見を確認した。本発明者らは、アポリポタンパク質Ｂエンハンサーとヒトα−１−アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）の融合から得られた非常に強力な肝特異的プロモーターの転写制御下にある、ｓｐ７シグナルペプチドと融合させたｈＧＡＡｃｏ１の完全サイズ、Δ８、又はΔ４２を発現しているＡＡＶ８ベクターをＧＡＡ−/−マウス（Raben et al J. Bio. Chem. 1998）に注射した。上記の２×１０^１２vg/kgのベクターの注射から１カ月後、マウスから採血し、血清中のｈＧＡＡ活性を測定した。ｓｐ７と融合させた完全長のｈＧＡＡｃｏ１を発現しているベクターを用いたマウスの処置は、血流中に上昇したレベルのｈＧＡＡを示した（ＰＢＳに対してｐ＝０．１１５）。驚くべきことに、切断短縮されたｈＧＡＡであるΔ８及びΔ４２の両方により、血清中のｈＧＡＡレベルは有意に上昇した（それぞれｐ＝０．０１４及びｐ＝０．０１３）。

これらのデータは、ｈＧＡＡの最初のアミノ酸の欠失により、血流中に分泌されるｈＧＡＡのレベルは有意に改善されることを示す。

さらに、イズロネート−２−スルファターゼに由来するアミノ酸１〜２５（ｓｐ６；配列番号６）に相当する別のシグナルペプチドを、ｈＧＡＡのΔ８切断短縮型に融合させた。本発明者らは、ｓｐ１、ｓｐ２、ｓｐ６、ｓｐ７、又はｓｐ８と融合させた最適化されたｈＧＡＡ（ｈＧＡＡｃｏ１）を発現しているプラスミドと平行して、ＧＦＰ又は野生型ｈＧＡＡ（ｈＧＡＡ；配列番号３０のアミノ酸残基２８〜９５２に相当する親ポリペプチド）を発現しているプラスミドを用いて肝癌細胞（Ｈｕｈ−７）をトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、増殖培地をｈＧＡＡの存在について分析した。注目すべきことには、これらの構築物により、ＧＦＰのトランスフェクトされた細胞によって示される陰性細胞において観察されたものよりも有意に高いレベルのｈＧＡＡの分泌がもたらされた（図３）。

次いで、本発明者らは、Δ８−ｈＧＡＡを用いて上記のように処置されたＧＡＡ−/−マウスの心臓、横隔膜、及び四頭筋におけるグリコーゲン含量を評価した。注目すべきは、本発明者らは、Δ８−ｈＧＡＡｃｏ発現ベクターを用いての処置後に組織中に高いレベルのｈＧＡＡを観察し（データは示されていない）、これは、考察された全ての組織におけるグリコーゲン含量の有意な減少と相関していた（図４Ｂ〜Ｄ）。特に、心臓（図４Ｂ）における、非常に効果的なシグナルペプチドｓｐ７及び８を有するベクターを用いての処置後に測定されたグリコーゲンレベルは、罹患していない動物において観察されたものと区別できなかった（それぞれ、野生型に対してｐ＝０．９８３及び０．９９６）。重要なことには、ｓｐ７ベクター及びｓｐ８ベクターの両方を用いての処置後に観察されたレベルは、ＰＢＳの注射された又はｓｐ１シグナルペプチドと融合させたｈＧＡＡｃｏ発現ベクターを用いて処置されたＧＡＡ−/−動物と比較して有意に減少していた。

本発明者らはまた、本発明者らのベクターを用いての肝臓への形質導入が、導入遺伝子に対する体液性応答を誘発するかどうかを試験した。マウスに、肝特異的プロモーターの転写制御下にある、天然ｓｐ１シグナルペプチドを有するｈＧＡＡｃｏ１（ｃｏ）、又はｓｐ２、ｓｐ７、若しくはｓｐ８と融合させたΔ８−ｈＧＡＡｃｏ１を発現しているＡＡＶ８ベクターを静脈内注射した。結果を図５に提示する。構成性プロモーターの転写制御下にあるΔ８−ｈＧＡＡｃｏ１を発現しているＡＡＶを筋肉内注射されたＧａａ−/−は、非常に高いレベルの全ＩｇＧ（約１５０μg/mL）を示し、一方、一般的に肝臓において同じタンパク質を発現しているベクターは、より低いレベルの体液性応答を示した。興味深いことに、ｓｐ１ｈＧＡＡｃｏ１（ｃｏ）発現ベクターを注射されたマウスは、両方の用量において検出可能なレベルの抗体を示し、一方、工学操作された高度に分泌されるベクターを注射されたマウスは、検出不可能なＩｇＧレベルを示した。これらのデータは、肝臓における導入遺伝子の発現が、末梢性寛容の誘発に必要であることを示し、また、それらは、効果的なシグナルペプチドとの融合によって達成されるｈＧＡＡの高い循環レベルが、タンパク質それ自体に対する体液性応答の低減を誘発するという見通しも提供する。

マウス試験において選択された最善の挙動を示すベクターを、２匹の非ヒト霊長類（ＮＨＰ、カニクイザル属）に注射することにより、本発明者らのベクターの分泌の有効性及び筋肉への取り込みを確認した。本発明者らは、２匹のサルに２×１０^１２vg/kgのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｓｐ７−Δ８−ｈＧＡＡｃｏ１を注射した。注射の１カ月後、本発明者らは、特異的な抗ｈＧＡＡ抗体を使用してウェスタンブロットによって２匹の動物の血清中のｈＧＡＡレベルを測定した。本発明者らは、２匹のサルにおいてｈＧＡＡのサイズと適合したサイズを有する明瞭なバンドを観察した。このバンドは、ベクターの注射から１２日前に得られた血清試料中には存在せず、したがって、本発明者らの検出法の特異性が確認された（図６Ａ）。注射の３カ月後、本発明者らは動物を屠殺し、本発明者らは組織を入手し、肝臓から血流中に分泌されたｈＧＡＡが筋肉によって効果的に取り込まれたかどうかを確認した。本発明者らは、２匹のサルの二頭筋及び横隔膜から得られた完全溶解液に対して、ｈＧＡＡに特異的な抗体を使用してウェスタンブロットを実施した。興味深いことに、本発明者らは、２番の動物に明瞭なバンドを観察することができ、これはまた、血流中においても最も高いｈＧＡＡレベルを示した（図６Ｂ）。また、１番の動物において本発明者らは、分析された両方の筋肉においてｈＧＡＡのものと一致する分子量を有するかすかなバンドを観察することができた。これらのデータは、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｓｐ７−Δ８−ｈＧＡＡｃｏ１ベクターが、非ヒト霊長類の肝臓を効果的に形質導入することを示す。それらはまた、血流中に分泌されたタンパク質が、筋肉に効果的に取り込まれ、この取り込みは、血中において測定されたｈＧＡＡのレベルと相関することを実証する。

本発明者らはまた、ＧＳＤＩＩＩマウスモデルにおけるマウス試験において選択された最善な挙動を示すベクター（ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｓｐ７−Δ８−ｈＧＡＡｃｏ１）の効果を決定した。本発明者らはグリコーゲン枝切り酵素（ＧＤＥ）のノックアウトマウスモデルを開発した。このモデルは、糖原病ＩＩＩ型（ＧＳＤＩＩＩ）に罹患したヒトにおいて観察される疾患の表現型を再現する。特に、ＧＤＥ活性を完全に欠失したＧＤＥ−/−マウスは筋肉強度の障害を有し、様々な組織にグリコーゲンを蓄積している。興味深いことには、それらはまた、肝臓にもグリコーゲンを蓄積し、これはヒトにも見られる。ここで本発明者らは、肝臓におけるｓｐ７−Δ８−ｈＧＡＡの過剰発現がＧＤＥ−/−マウスにおいて観察されたグリコーゲン蓄積を救出するかどうかを試験した。本発明者らは、ＧＤＥ−/−マウスに１×１０^１１又は１×１０^１２vg/マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｓｐ７−Δ８−ｈＧＡＡｃｏ１を注射した。対照として、本発明者らは平行して、野生型（ＷＴ）及びＧＤＥ−/−マウスにＰＢＳを注射した。ベクターの投与から３カ月後、マウスを屠殺し、肝臓におけるグリコーゲンレベルを定量した。結果を図７に報告する。すでに報告されているように（Pagliarani et al及び本発明者らのモデル）、ＧＤＥ−/−マウスは肝臓において有意なグリコーゲン蓄積の増加を示し（ｐ＝１．３×１０^−７）、野生型動物と比較して５倍のグリコーゲンを有する。驚くべきことには、１×１０^１１及び１×１×１０^１２vg/マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｓｐ７−Δ８−ｈＧＡＡｃｏ１ベクターによる処置は、グリコーゲン含量の統計学的に有意な減少を誘発した（それぞれ、ｐ＝４．５×１０^−５及び１．４×１０^−６）。重要なことには、特に最も高い用量で、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｓｐ７−Δ８−ｈＧＡＡｃｏ１ベクターを注射されたマウスの肝臓において測定されたグリコーゲンレベルは、野生型動物において測定されたものと区別できなかった（１×１０^１１の用量コホートではｐ＝０．０５３、１×１０^１２の用量コホートでは０．２４４）。

本発明者らは、様々なＧＡＡバージョン（全てのコドンが最適化されている）（１：天然ｓｐ１ＧＡＡシグナルペプチドを含む天然ＧＡＡ（ｃｏ）、２．異種ｓｐ７シグナルペプチドを含有している工学操作されたＧＡＡ（ｓｐ７−ｃｏ）、及び３．異種ｓｐ７シグナルペプチドを含有し、その後、様々な数のアミノ酸を欠失させた工学操作されたＧＡＡ（ｓｐ７−Δ８−ｃｏ、ｓｐ７−Δ２９−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４２−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４３−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４７−ｃｏ、及びｓｐ７−Δ６２−ｃｏ、ここで配列番号１の８個、２９個、４２個、４７個、及び６２個の最初のＮ末端アミノ酸がそれぞれ欠失している））を用いてトランスフェクトされたＨｕＨ７細胞の培地及び溶解液中のＧＡＡ活性の分析を実施した。分析は、工学操作された欠失していないＧＡＡ（ｓｐ７−ｃｏ）及び天然ＧＡＡ（ｃｏ）の両方と比較して、Δ８、Δ２９、Δ４２及びΔ４３ＧＡＡバージョンを用いてトランスフェクトされた細胞の培地中に有意により高いＧＡＡ活性を示した（図８）。その代わりに有意により低いＧＡＡ活性が、他の工学操作されたＧＡＡバージョン［欠失あり（ｓｐ７−Δ８−ｃｏ、ｓｐ７−Δ２９−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４２−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４３−ｃｏ及び欠失なし（ｓｐ７−ｃｏ））と比較して、Δ４７及びΔ６２ＧＡＡバージョンを用いてトランスフェクトされた細胞の培地中において観察された。興味深いことには、（図９）細胞内ＧＡＡ活性は、生産的な欠失（ｓｐ７−Δ８−ｃｏ、ｓｐ７−Δ２９−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４２−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４３−ｃｏ）と欠失なしのバージョン（ｓｐ７−ｃｏ）との間で差がなく、このことは、それらは全て細胞内で効果的に生成されプロセシングされることを示す。その代わりに細胞内ＧＡＡ活性は、ｓｐ７−Δ４７−ｃｏ及びｓｐ７−Δ６２−ｃｏバージョンにおいて非常に低く、他の全ての工学操作されたバージョン［欠失あり（ｓｐ７−Δ８−ｃｏ、ｓｐ７−Δ２９−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４２−ｃｏ、ｓｐ７−Δ４３−ｃｏ）及び欠失なし（ｓｐ７−ｃｏ）］と比較して有意により低いことを示す。

本発明者らはまた、様々なＧＡＡバージョン（全てのコドンが最適化されている）（１：天然ｓｐ１ＧＡＡシグナルペプチドを含む天然ＧＡＡ（ｃｏ）、２．異種ｓｐ６又はｓｐ８シグナルペプチドを含有している工学操作されたＧＡＡ（ｓｐ６−ｃｏ、ｓｐ８−ｃｏ）、及び３．異種ｓｐ６又はｓｐ８シグナルペプチドを含有し、その後、８アミノ酸を欠失させた、工学操作されたＧＡＡ（ｓｐ６−Δ８−ｃｏ、ｓｐ８−Δ８−ｃｏ））を用いてトランスフェクトされたＨｕＨ７細胞の培地及び溶解液中のＧＡＡ活性の分析を実施した。分析は、ｉ．それらのそれぞれの工学操作された欠失していないＧＡＡバージョン（ｓｐ６−ｃｏ又はｓｐ８−ｃｏ）；及びｉｉ．天然ＧＡＡ（ｃｏ）と比較して、Δ８バージョンを用いてトランスフェクトされた細胞の培地中において有意により高いＧＡＡ活性を示した（図１０）。興味深いことに、細胞内ＧＡＡ活性は、全ての工学操作されたＧＡＡバージョン（欠失あり及び欠失なしの両方）間で差はなく、このことは、それらは細胞内で効果的に生成されプロセシングされることを示す（細胞溶解液のパネル）。その代わりに細胞内ＧＡＡ活性は、工学操作されたバージョンと比較して天然ＧＡＡ（ｃｏ）を使用した場合に有意により高く、このことは、天然ＧＡＡが主に細胞内に保持されていることを示す。

Claims

親ＧＡＡポリペプチドのＮ末端からの少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む切断短縮されたＧＡＡポリペプチドであって、ここでの該親ポリペプチドは、そのシグナルペプチドを欠いたＧＡＡポリペプチドの前駆体型に相当し、ここでの該切断短縮されたＧＡＡポリペプチドは、親ＧＡＡポリペプチドと比較してそのＮ末端において１〜７５連続アミノ酸が欠失し、ここでの該切断短縮されたＧＡＡポリペプチドはさらに、そのＮ末端に融合したシグナルペプチドを含む、切断短縮されたＧＡＡポリペプチド。
切断短縮されたＧＡＡポリペプチドが、親ＧＡＡポリペプチドと比較してそのＮ末端において１〜７５連続アミノ酸を欠失し、特に親ＧＡＡポリペプチドと比較してそのＮ末端において６、７、８、９、１０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、又は４６連続アミノ酸を欠失し、さらにより特定すると親ＧＡＡポリペプチドと比較してそのＮ末端において８、４２、又は４３連続アミノ酸を欠失している、請求項１の切断短縮されたＧＡＡポリペプチド。
親ポリペプチドが、ヒトＧＡＡ（ｈＧＡＡ）、特に配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するｈＧＡＡ、又は配列番号１若しくは配列番号３３、特に配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するｈＧＡＡの機能的変異体であるｈＧＡＡである、請求項１又は２の切断短縮されたＧＡＡポリペプチド。
切断短縮されたＧＡＡポリペプチドが、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、又は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項の切断短縮されたＧＡＡポリペプチド。
融合したシグナルペプチドが、配列番号３〜７からなる群より選択され、特に配列番号３のシグナルペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項の切断短縮されたＧＡＡポリペプチド。
請求項１〜５のいずれか一項の切断短縮されたＧＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子であって、該核酸分子は特に、インビボにおいて切断短縮されたＧＡＡポリペプチドの発現を改善するために及び／又は切断短縮されたＧＡＡポリペプチドに対する免疫寛容を改善するために最適化されたヌクレオチド配列、例えば配列番号１２、配列番号１３、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、又は配列番号５１に示される核酸配列である、核酸分子。
請求項６の核酸分子を含み、プロモーター、特に好ましくはα−１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、トランスサイレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、及びチロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターからなる群より選択された肝特異的プロモーターであるプロモーターに作動可能に連結された該核酸分子を含む、核酸構築物であって、該核酸構築物はさらに場合により、イントロン、特にヒトβグロビンｂ２（すなわちＨＢＢ２）イントロン、ＦＩＸイントロン、ニワトリβ−グロビンイントロン、及びＳＶ４０イントロンからなる群より選択されたイントロンを含み、ここでの該イントロンは、場合により改変されたイントロン、例えば配列番号１７の改変されたＨＢＢ２イントロン、配列番号１９の改変されたＦＩＸイントロン、又は配列番号２１の改変されたニワトリβ−グロビンイントロンである、核酸構築物。
エンハンサー；イントロン；プロモーター、特に肝特異的プロモーター；ＧＡＡタンパク質をコードしている核酸配列；及びポリアデニル化シグナルを好ましくはこの順序で含む、請求項７の核酸構築物（該構築物は、ＡｐｏＥ制御領域；ＨＢＢ２イントロン、特に改変されたＨＢＢ２イントロン；ｈＡＡＴプロモーター；切断短縮されたＧＡＡポリペプチドをコードしている核酸配列；及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを好ましくはこの順序で含み、該核酸構築物はより特定すると配列番号２２〜２６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む）。
ウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである、請求項６〜８のいずれか一項記載の核酸分子又は核酸構築物を含むベクター。
一本鎖又は二本鎖の自己相補性ＡＡＶベクター、好ましくはＡＡＶに由来するキャプシド、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、変異ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、変異ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、変異ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、変異ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、例えばＡＡＶｃｙ１０、及びＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｄｊ、ＡＡＶ−Ａｎｃ８０、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８、及びブタＡＡＶ、例えばＡＡＶｐｏ４及びＡＡＶｐｏ６キャプシドを有するＡＡＶベクター、又はキメラキャプシドを有するＡＡＶベクターである、請求項９記載のベクター。
ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、又はＡＡＶ２ｉ８キャプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ７４キャプシド、より特定するとＡＡＶ８キャプシドを有する、請求項１０記載のベクター。
請求項６の核酸分子、請求項７〜８のいずれか一項の核酸構築物、又は請求項９〜１１のいずれか一項のベクターを用いて形質転換された細胞であって、該細胞が特に肝細胞又は筋肉細胞である、細胞。
薬学的に許容される担体に、請求項１〜５のいずれか一項の切断短縮されたＧＡＡポリペプチド、請求項６の核酸分子、請求項７〜８のいずれか一項の核酸構築物、請求項９〜１１のいずれか一項のベクター、又は請求項１２記載の細胞を含む、医薬組成物。
医薬品としての使用のための、請求項１〜５のいずれか一項の切断短縮されたＧＡＡポリペプチド、請求項６の核酸分子、請求項７〜８のいずれか一項の核酸構築物、請求項９〜１１のいずれか一項のベクター、又は請求項１２記載の細胞。
糖原病、例えば糖原病Ｉ型（フォン・ギールケ病）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、糖原病ＩＩＩ型（コーリ病）、糖原病ＩＶ型、糖原病Ｖ型、糖原病ＶＩ型、糖原病ＶＩＩ型、糖原病ＶＩＩＩ型、及び心臓の致死性先天性糖原病、より特定すると糖原病Ｉ型、糖原病ＩＩ型、又は糖原病ＩＩＩ型、さらにより特定すると糖原病ＩＩ型及び糖原病ＩＩＩ型、最も特定すると糖原病ＩＩ型を処置するための方法に使用するための、請求項１〜５のいずれか一項の切断短縮されたＧＡＡポリペプチド、請求項６の核酸分子、請求項７〜８のいずれか一項の核酸構築物、請求項９〜１１のいずれか一項のベクター、又は請求項１２記載の細胞。