KR20210148101A - 폴리뉴클레오티드 - Google Patents

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KR20210148101A
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아미트 나쓰와니
제니 매킨토시
로무알드 코르바우
아자데 기아
카를로스 미란다
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프리라인 테라퓨틱스 리미티드
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Abstract

본 발명은 GCase 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서 상기 코딩 서열의 일부는 야생형이 아니다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는 바이러스 입자, 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 입자를 포함하는 조성물, 및 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

폴리뉴클레오티드
본 발명은 β-글루코세레브로시다제(GCase: Glucocerebrosidase)를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자 및 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하는 치료에 관한 것이다.
고셔병(GD: Gaucher disease)은 대식세포-단핵구 시스템의 세포에 글루코세레브로시드의 침착을 특징으로 하는 상염색체 열성 지질 축적 질환이다. GD는 효소 β-글루코세레브로시다제(GCase)의 활성 및/또는 생산을 손상시키는 하우스키핑 GBA 유전자의 돌연변이로 인해 발생한다.
확인된 특정 돌연변이를 특징으로 하는 3가지 주요 유형의 GD가 존재하며, 각각의 유형은 상이한 임상 증상을 나타낼 수 있다. 유형 1 GD는 중추 신경계와 거의 또는 전혀 관련이 없지만 비장 및 간 비대와 같은 내장 증상, 낮은 혈구 세포 수, 출혈 문제 및 골 질환을 주로 특징으로 한다. 지난 20년 동안, 효소 대체 요법이 유형 1 GD의 치료 표준으로 부상하였다. 고비용(약 $200,000 또는 약 ￡150,000/환자/년) 외에도, GD의 효소 대체 요법 치료는 일반적으로 평생 동안 격주로 1회 이상의 주사를 필요로 한다. 이는 높은 수준의 치료 부담을 나타내는 높은 비율의 GD 환자로 이어진다.
따라서, GD의 치료를 위한 효과적인 치료 벡터, 특히 높은 수준의 GCase 발현을 허용하는 치료 벡터를 제공할 필요가 있다.
본 출원은 GCase를 코딩하는 GBA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자를 투여하는 단계를 수반하는, GD 치료를 위한 유전자 치료 접근법에 관한 것이다. 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 및 바이러스 입자는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 야생형 GCase를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 더 높은 GCase 발현을 제공할 수 있다. 이러한 유전자 치료 접근법은 GCase의 빈번한 평생 정맥 내 주사의 필요성을 회피한다.
본 출원은 GCase를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열에 대한 특이적 변형이 시험관 내 및/또는 생체 내에서 발현된 GCase 폴리펩티드의 발현 수준 및 활성을 개선하는데 도움이 될 수 있음을 입증한다. 예컨대, 본 출원은 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열의 사용이 코딩된 GCase 단백질의 발현 및/또는 활성을 개선할 수 있음을 입증한다. 이러한 변형된(즉, 비 야생형) 및/또는 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열은 추가로 변형되어 코딩된 GCase 단백질의 발현 및/또는 활성의 추가 개선을 제공할 수 있다. 추가 변형은 GBA 뉴클레오티드 서열에서의 추가 변형 예컨대 CpG 모티프의 제거, 및/또는 특이적 프로모터 및/또는 인핸서 서열을 포함하는 특정 유전자 조절 요소의 사용을 제공하는 것을 포함할 수 있다. GBA 뉴클레오티드 서열에 대한 이러한 개선이 GD의 치료에서 이러한 뉴클레오티드의 효능을 개선할 수 있는 것으로 여겨진다.
이러한 변형은 예컨대 간에서 고도로 발현되고, GCase 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 야생형 GBA보다 높은 수준으로 GCase 활성을 발현한다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에서, GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 β-글루코세레브로시다제(GCase) 단백질 또는 이의 단편을 코딩하고 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부는 야생형이 아니다.
본 발명의 제2 양태에서, GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 GCase 단백질 또는 이의 단편을 코딩하고 SEQ ID NO: 1 내지 8의 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1611개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1000개 내지 1611개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1611개 사이, 또는 약 1494개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
본 발명의 제3 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는 바이러스 입자가 제공된다.
본 발명의 제4 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 입자 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 제5 양태에서, 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 입자를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 제6 양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 제7 양태에서, 대상체에서 안정한 GCase 활성을 달성하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 제8 양태에서, GCase 효소 대체 요법으로부터의 생체이용률(bioavailability)과 비교하여 대상체에서 더 큰 GCase 생체이용률을 제공하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도가 제공되며, 상기 생체이용률은 투여로부터 2주 기간에 걸쳐 측정된다.
본 발명의 제9 양태에서, 대상체에 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하여 대상체에서 안정한 GCase 활성을 달성하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제10 양태에서, 대상체에 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하여 GCase 효소 대체 요법으로부터의 생체이용률과 비교하여 대상체에서 더 큰 GCase 생체이용률을 제공하는 방법이 제공되며, 상기 생체이용률은 투여로부터 2주 기간에 걸쳐 측정된다.
본 발명의 제11 양태에서, GBA 뉴클레오티드 서열의 발현 및 대상체에서 안정한 GCase 활성의 달성 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 제공된다.
본 발명의 제12 양태에서, GBA 뉴클레오티드 서열의 발현 및 GCase 효소 대체 요법으로부터의 생체이용률과 비교하여 대상체에서 더 큰 GCase 생체이용률을 제공하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 제공되며, 상기 생체이용률은 투여로부터 2주 기간에 걸쳐 측정된다.
본 발명의 제13 양태에서, GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신의 수준을 감소시키기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 제14 양태에서, 대상체에 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하여 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신의 수준을 감소시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 제15 양태에서, GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신의 수준을 감소시키는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 제공되며, 선택적으로 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준 감소는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태의 치료로 이어진다.
도 1 - 구조물 FLF-PL01, FLF-PL28, 및 FLF-PL64로부터의 GBA 카세트의 개략도. LSP-S 및 LSP-L: 간 특이적 프로모터; GBAwt: 야생형 인간 GBA 뉴클레오티드 서열; GBAco: 코돈-최적화된 인간 GBA 뉴클레오티드 서열(신호 펩티드를 코딩하는 스트레치 제외, 이의 말단은 점선으로 표시됨).
도 2 - AAV2/8-FLF-PL28 주입 후 쥐(murine) 혈류로의 인간 GCase의 용량-의존적 간 발현 및 분비. (a) AAV2/8-PL28 주입 후 12주차에 GCase에 대해 염색된 마우스 간의 대표적인 이미지. DAB(3,3'-디아미노벤지딘)를 사용하여 GCase를 시각화하고 헤마톡실린을 대조염색으로 사용하였다. (b) 증가된 용량의 AAV2/8-PL28로 처리한 마우스의 혈청에서 활성 검정에 의해 측정된 GCase의 수준. n = 5, 각 처리군에서 C57BL/6 마우스. 오차 막대는 평균 ± SD를 나타낸다.
도 3 - Huh-7 세포에서 형질감염 시 시험된 GBA 코돈-최적화된 구조물(FLF-PL16 내지 FLF-PL36; '16' 내지 '36')에 대해 관찰된 상대적인 GCase 수준. 각 구조물을 3 내지 5회 실험으로 독립적으로 시험하였다. 본원에 제시된 데이터는 야생형 GBA 구조물 FLF-PL01('01')에 상대적인 GCase 활성을 나타낸다. 오차 막대는 평균 ± SD를 나타낸다.
도 4 - 벡터 AAV2/8- FLF-PL- 01, 21, 28, 30, 36 및 37의 주입 시 마우스 혈류에 존재하는 GCase 활성의 측정(구조물 기술에 대해 실시예 5 참조). (a) 시험된 GBA 구조물의 주입 후 8주차에 마우스 혈청에서 확인된 GCase 활성 수준. (b) 구조물 FLF-PL01 및 FLF-PL28의 주입 후 4주, 8주, 12주, 및 36주차에서 마우스 혈청에서 관찰된 GCase 활성 수준. 오차 막대는 평균 ± SD를 나타낸다, n = 실험군 당 5 내지 8마리, * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.001(일원 ANOVA).
도 5 - 야생형 마우스에서 AAV2/8-FLF-PL28 주입 후 비장 및 골수 조직에서 GCase의 흡수 수준. GBA에 대해 염색된 비장 및 골수 조직의 대표적인 이미지는 주사 후 4주차에 나이브(naive) 또는 AAV2/8-PL28 처리에 대해 도시된다. DAB(3,3'-디아미노벤지딘)를 사용하여 GBA를 시각화하고 헤마톡실린을 대조염색으로 사용하였다.
도 6 - AAV2/8-FLF-PL28을 야생형 마우스에 주입 시 비장에서 관찰된 표준 쥐 대식세포 마커 F4/80과 인간 GCase의 동시-국소화 수준. GBA 및 F4/80 항체에 대해 염색된 비장 조직의 대표적인 면역형광 이미지. DAPI(청색)를 핵을 시각화하는데 사용하였다.
도 7 - AAV2/8- FLF-PL28 및 FLF-PL64의 주입 후 4주차에 마우스 혈류에서 확인된 GCase 활성 수준. GCase 활성을 2 × 1012 vg/kg의 용량으로 주사한 후 4주차에 수집된 마우스 혈청에 대해 결정하였다. 오차 막대는 평균 ± SD를 나타낸다. N = 5, 각 처리군에서 C57BL/6 마우스.
도 8 - 처리 후 5주차의 마우스에서 발견된 AAV2/8-FLF-PL28 및 FLF-PL64 주사 후 비장, 골수 및 폐에서 관찰된 흡수 수준.
도 9a-9h - 서열 목록.
도 10 - AAV-FLF-PL64로 형질도입 후 인간-유래 세포주에 의한 GCase 분비 수준. 벡터 AAV-FLF-PL64를 사용하여 1 × 105 vg/세포의 MOI로 세포를 형질도입하였다. (a) 활성 GBA 수준을 4MU-Glc를 기질로 사용하여 형광측정법으로 결정하였다. (b) 폴리A 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 qPCR로 각 세포주의 형질도입 수준을 획득하였다. 활성 GCase 수준에 대한 값을 얻기 위해 각 세포주에 대해 공백 값을 뺐다. 오차 막대는 중복 웰의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 11: (a) 야생형 마우스에서 효소 대체 요법(VPRIV® (60 U/kg)) 약동학 및 반감기 계산, 단상 감쇠 모델 방정식: Y0은 X(시간)이 0인 경우 Y-값이다. Plateau는 무한대의 Y-값이다. K는 속도 상수이다. Tau는 시간 상수이다. 반감기는 X-축의 시간 단위이다. Span은 Y0과 Plateau 사이의 차이이다. (b) 야생형 마우스에 투여한 후 효소 대체 요법(VPRIV(60 U/kg), 단일 흑색) 단일 주사 후 GCAse 활성의 혈청 약동학적 프로파일과 FLF-PL64를 사용한 유전자 치료간의 비교.
도 12: VPRIV 또는 FLF-PL64의 투여 후 쥐 간, 비장 및 뼈에서 GCase 면역염색. DAB(3,3'-디아미노벤지딘)을 사용하여 GCase를 시각화하고 헤마톡실린을 대조염색으로 사용하였다. FLF-PL64 샘플을 주사 후 5주차에 수득한 반면, VPRIV 처리한 샘플을 표지된 시간에 수집하였다. 각 이미지는 각 처리군에 대해 n = 5, C57BL/6 마우스를 나타낸다. 모든 사진은 동일한 배율이다.
도 13: 벨라글루세라제 알파(VPRIV®)(ERT로 표지됨) 또는 AAV-GBA(AAV-FLF-PL64)의 투여 시 gba9v/null 마우스 간(a), 백혈구 세포(b), 비장(c), 및 골수(d)에서 관찰된 GCase 활성의 증가. ERT 샘플은 조직 흡수의 피크에 해당하는 마지막 주사 후 1 내지 2시간에 수집하였다. AAV-GBA(AAV-FLF-PL64) 샘플은 주입 후 12주차에 수집하였으며 정상 상태의 흡수 수준에 해당한다. GCase 활성은 야생형 건강한 마우스(20주령)에서 측정된 활성의 백분율로 표시된다. 모든 마우스는 8주령 전현성 증상학(pre-overt symptomatology)에서 처리하였다. 60 U/kg 용량의 ERT 및 2주 마다 주사로 투여함; 2 × 1012 vg/kg의 용량으로 주입된 AAV-FLF-PL64. n = 10. **** P ≤ 0.0001
도 14: AAV-GBA(AAV-FLF-PL64) 유전자 치료는 gba9v/null 마우스의 간에서 활성화된 대식세포 및 염증을 감소시킨다. 상부 패널: 각 군의 대표적인 이미지를 나타내는 H&E 염색된 간 절편. 저장 세포는 원으로 식별된다. 하단 좌측 패널: 비히클 대조군과 비교하여 AAV-FLF-PL64 및 ERT 처리군에서 계수된 저장 세포간의 비교를 나타내는 그래프. 하단 우측 패널: 항-CD68 항체로 염색한 후 비히클 대조군과 비교하여 AAV-FLF-PL64 및 ERT 처리군에서 계수된 CD68양성 세포를 나타내는 그래프. 2 × 1012 vg/kg의 용량으로 주입된 AAV-GBA(AAV-FLF-PL64); 12주 p.i로 수집된 샘플. 60 U/kg 용량의 ERT 및 2주 마다 주사로 투여됨. ERT 샘플을 마지막 주사 후 1 내지 2시간에 수집하였다. 평균 ± SEM, (n = 10),**P ≤ 0.005 ,**** P ≤ 0.0005
도 15: AAV-GBA(AAV-FLF-PL64) 유전자 치료는 gba9v/null 마우스에서 벨라글루세라제 알파(VPRIV®, ERT로 표지됨)보다 더 나은 기질 제거를 나타낸다. AAV-FLF-PL64 및 ERT 처리군에서 간, 비장, 및 골수에서의 헥소실세라마이드 및 헥소실스핑고신 수준의 LC/MS 분석. 수준은 비히클 대조군에서 측정된 수준으로 표준화하였다. 2 × 1012 vg/kg의 용량으로 주입된 AAV-GBA(AAV-FLF-PL64); 12주 p.i.에서 수집된 샘플; 60 U/kg의 용량의 ERT 및 2주 마다 주사로 투여됨. ERT 샘플을 마지막 주사 후 1 내지 2시간에 수집하였다. 평균 ± SEM, (n = 10),** P ≤0.005, **** P ≤ 0.0005
일반 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
일반적으로, 용어 "포함하는(comprising)"은 포함하지만 이에 제한되지 않는 것을 의미하도록 의도된다. 예컨대, 어구 "GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드"는 상기 폴리뉴클레오티드가 GBA 뉴클레오티드 서열을 갖지만, 상기 폴리뉴클레오티드가 추가의 뉴클레오티드를 함유할 수 있음을 의미하도록 해석되어야 한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 단어 "포함하는(comprising)"은 어구 "~로 이루어진(consisting of)"으로 대체된다. 용어 "~로 이루어진(consisting of)"은 제한되는 것으로 의도된다. 예컨대, 어구 "GBA 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드"는 상기 폴리뉴클레오티드가 GBA 뉴클레오티드 서열을 갖고 추가 뉴클레오티드를 갖지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해해야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이 값의 범위를 정의하기 위해 2개의 종점을 언급할 때 "사이(between)"는 "사이 및 포함하는(between and including)"을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, "5 내지 10 사이"로 정의된 범위는 5 초과 10 미만의 모든 값과 이산 값 5 및 10 자체를 포함한다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 사슬을 지칭하는 것으로 의도된다.
본 발명의 목적을 위해, 2개의 서열(예컨대, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열)의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 상기 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예컨대, 제2 서열과 최적의 정렬을 위해 제1 서열에 갭이 도입될 수 있다). 그런 다음 각 위치의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기에 의해 점유되는 경우, 이어서 상기 뉴클레오티드 또는 아미노산은 그 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, 동일성% = 동일한 위치의 수 / 참조 서열의 총 위치 수 × 100).
일반적으로, 서열 비교는 참조 서열의 길이에 대해 수행된다. 예컨대, 사용자가 주어진("시험") 서열이 SEQ ID NO: 1과 95% 동일한지 여부를 결정하기를 원하는 경우, SEQ ID NO: 1이 참조 서열이 된다. 예컨대, 서열이 SEQ ID NO: 1(참조 서열의 예)과 적어도 80% 동일한지 여부를 평가하기 위해, 당업자는 SEQ ID NO: 1의 길이에 걸쳐 정렬을 수행하고, 시험 서열에서 몇 개의 위치가 SEQ ID NO: 1의 위치와 동일한지 확인한다. 위치의 적어도 80%가 동일한 경우, 시험 서열은 SEQ ID NO: 1과 적어도 80% 동일하다. 서열이 SEQ ID NO: 1보다 짧을 경우, 갭 또는 누락된 위치는 동일하지 않은 위치로 간주되어야 한다.
당업자는 2개의 서열 사이의 상동성 또는 동일성을 결정하기 위해 이용 가능한 상이한 컴퓨터 프로그램을 알고 있다. 예컨대, 수학적 알고리즘을 사용하여 서열 비교 및 두 서열 간의 동일성 퍼센트 결정을 수행할 수 있다. 일 실시형태에서, 2개의 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 Blosum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 사용하여 Accelrys GCG 소프트웨어 패키지(http://www.accelrys.com/products/gcg/에서 입수할 수 있음)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman and Wunsch(1970) 알고리즘을 사용하여 결정되며, 갭 가중치는 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4이고 길이 가중치는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "단편"은 서열의 연속(contiguous) 부분을 지칭한다. 예컨대, 50개의 뉴클레오티드 중 SEQ ID NO: 1의 단편은 SEQ ID NO: 1의 50개의 연속 뉴클레오티드를 지칭한다.
폴리뉴클레오티드
일 양태에서, 본 발명은 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 β-글루코세레브로시다제(GCase) 단백질 또는 이의 단편을 코딩하고 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부는 야생형이 아니다.
폴리뉴클레오티드는 다음의 특징 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. GBA 뉴클레오티드 서열, 또는 야생형이 아닌 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 코돈-최적화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 코돈-최적화되지 않은 부분을 (추가적으로) 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 인트론 또는 인트론의 단편을 포함할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이의 뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체의 중합체 형태를 지칭한다. 예컨대, 폴리뉴클레오티드는 DNA(디옥시리보뉴클레오티드) 또는 RNA(리보뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA로 이루어질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 mRNA로 이루어질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있기 때문에, T(티민) 뉴클레오티드에 대한 모든 언급은 U(우라실)로 대체될 수 있다.
GCase를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열
일 양태에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함한다. GBA 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 β-글루코세레브로시다제(GCase) 단백질 또는 이의 단편을 코딩한다.
용어 "~를 코딩하는 서열"은 코딩된 폴리펩티드를 코딩하는 코돈을 포함하는 개방 판독 프레임을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예컨대, GCase 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 GCase 단백질 또는 이의 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 코돈을 포함한다. 야생형 GCase 단백질을 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열의 예가 SEQ ID NO: 9로 제공된다.
GBA 뉴클레오티드 서열은 비-코딩 뉴클레오티드(예컨대 인트론)에 의해 중단될 수 있지만, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드만이 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되어야 한다. 예컨대, GCase 단백질을 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 해당 코돈이 서열에서 연속적이거나 하나 이상의 비-코딩 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있는지 여부에 관계 없이 해당 코딩 서열로부터 발현되는 GCase 단백질의 일부를 형성하는 아미노산을 코딩하는 임의의 코돈을 포함할 것이다. 즉, 비-코딩 뉴클레오티드의 스트레치에 의해 중단된 코딩 뉴클레오티드의 스트레치를 함유하는 GBA 폴리뉴클레오티드는 바로 병치된(즉, 비-코딩 스트레치에서 뺀) 비-연속 코딩 스트레치로 이루어진 "GBA 뉴클레오티드 서열"을 포함하는 것으로 간주될 것이다. 그러나, 본원에서, 정지 코돈은 전장 코딩 서열의 일부로 간주될 것이다.
본원에 기술된 GCase 및/또는 GCase 코딩 서열을 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 또한 신호 펩티드에 대한 코돈을 포함할 수 있다. 일부 단백질, 특히 다른 조직으로 내보내는 단백질은 신호 펩티드와 함께 발현된다는 것이 잘 알려져 있다. 신호 펩티드는 단백질 서열의 N-말단(그리고 이러한 경우 코딩 서열의 5' 말단에)에 있을 수 있으며 다수의 신호펩티드는 세포 처리 후에 절단된다. 따라서, 본원에서, 성숙 단백질 또는 폴리펩티드(예컨대 성숙 GCase 단백질 또는 폴리펩티드)는 신호 펩티드가 처리 및 제거/절단된 후(그리고 따라서 더 이상 폴리펩티드 서열의 일부를 형성하지 않음) 생성된 단백질 또는 폴리펩티드로 간주될 것이다.
다음의 표는 각 아미노산을 코딩하는 코돈을 기술한다.
Figure pct00001
해당 RNA 코돈은 상기 표에서 T 대신 U를 포함할 것이다.
본 발명의 일 양태는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 GCase 단백질 또는 이의 단편을 코딩하고 SEQ ID NO: 1 내지 8 중 임의의 하나의 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1611개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1000개 내지 1611개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1611개 사이, 또는 약 1494개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, GBA 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부는 코돈-최적화된다. 일 실시형태에서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 8의 적어도 1300개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 8의 적어도 1300개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1의 적어도 1300개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1의 적어도 1300개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1과 적어도 98% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1과 적어도 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5와 적어도 98% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5와 적어도 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5를 포함할 수 있다.
상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1의 서열 또는 GCase 활성을 가진 GCase 단백질을 코딩하는 SEQ ID NO: 1의 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 실시예에서, SEQ ID NO: 1의 변이체는 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 GCase 단백질이 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 또는 최대 10개 아미노산 치환을 갖도록 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것을 제외하고 SEQ ID NO: 1과 동일하다. 이러한 실시예에서, 상기 SEQ ID NO: 1의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 최대 10개, 최대 20개, 또는 최대 30개의 뉴클레오티드 치환을 가질 수 있다. 상기 SEQ ID NO: 1의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 또는 최대 6개의 뉴클레오티드 치환을 가질 수 있다. 일 실시예에서, 상기 SEQ ID NO: 1의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열에 비해 최대 4개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 3개 아미노산 치환을 가진 GCase 단백질을 코딩한다. 일 실시예에서, 상기 SEQ ID NO: 1의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열에 비해 최대 3개 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나 SEQ ID NO: 25의 야생형 아미노산 GCase 서열에 비해 최대 2개의 아미노산 치환을 가진 GCase 단백질을 코딩한다. 일 실시예에서, 상기 SEQ ID NO: 1의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열에 비해 1개 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 1개의 아미노산 치환을 가진 GCase 단백질을 코딩한다.
상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5의 서열 또는 GCase 활성을 가진 GCase 단백질을 코딩하는 SEQ ID NO: 5의 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 실시예에서, SEQ ID NO: 5의 변이체는 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 GCase 단백질이 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 또는 최대 10개 아미노산 치환을 갖도록 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것을 제외하고 SEQ ID NO: 5와 동일하다. 이러한 실시예에서, SEQ ID NO: 5의 변이체는 SEQ ID NO: 5의 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 최대 10개, 최대 20개, 또는 최대 30개의 뉴클레오티드 치환을 가질 수 있다. SEQ ID NO: 5의 변이체는 SEQ ID NO: 5의 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 또는 최대 6개의 뉴클레오티드 치환을 가질 수 있다. 일 실시예에서, SEQ ID NO: 5의 변이체는 SEQ ID NO: 5의 서열에 비해 최대 4개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나 SEQ ID NO: 25의 야생형 아미노산 GCase 서열에 비해 최대 3개 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩한다. 일 실시예에서, SEQ ID NO: 5의 변이체는 SEQ ID NO: 5의 서열에 비해 최대 3개 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 2개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩한다. 일 실시예에서, SEQ ID NO: 5의 변이체는 SEQ ID NO: 5의 서열에 비해 1개 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 1개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩한다.
GCase 단백질 또는 이의 단편
상기 폴리뉴클레오티드는 GCase 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
β-글루코세레브로시다제(GCase)는 글루코실세라미다제 활성(EC 3.2.1.45)을 가진 효소로서 이는 세포막에 풍부한 당지질 대사의 중간체인 화학적 글루코세레브로시드의 베타-글루코시드 연결을 가수분해한다. GBA 유전자(GCase를 코딩함)의 돌연변이는 대식세포에 글루코세레브로시드의 축적을 야기하여 많은 중요한 기관에 침투하여 고셔병(GD)을 야기할 수 있다. 전형적인 야생형 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 9에 의해 코딩된다.
GCase(예컨대 SEQ ID NO: 9에 의해 코딩된 SEQ ID NO: 25의 GCase)는 초기에 신호 펩티드(SEQ ID NO: 25의 아미노산 잔기 1 내지 39 및 SEQ ID NO: 9의 코돈 1 내지 39) 및 성숙 GCase 폴리펩티드 영역을 포함하는 전구체 "미성숙" 형태로 발현된다. 처리 후, GCase의 "성숙" 형태는 신호 펩티드가 없다. 용어 "성숙 GCase" 또는 "성숙 GCase 폴리펩티드"는 신호 펩티드를 포함하지 않은 GCase 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 1 내지 4에 의해 코딩된 GCase를 지칭한다. 전형적인 GCase 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 17의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있고 SEQ ID NO: 18의 폴리펩티드 서열을 가질 수 있다.
GCase 또는 이의 단편은 변이체 GCase 또는 이의 단편, 즉, SEQ ID NO: 25와 동일한 서열을 갖지 않는 GCase일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드에 의해 및/또는 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 25와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하거나; 길이가 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 536개 이하, 497개 이하, 300개 내지 536개 사이, 또는 300개 내지 497개 사이의 아미노산인 SEQ ID NO: 25의 단편과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하다. 일 실시형태에서, GCase 단백질 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 25와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하거나; 길이가 약 497개의 아미노산인 SEQ ID NO: 25의 단편과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하다. GCase 단백질 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 25의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 상기 GCase 단백질 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 18의 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 바람직하게는 상기 GCase 단백질 또는 이의 단편은 기능적이다. 기능적인 GCase 단백질 또는 단편은 글루코세레브로시드의 가수분해를 수행하는 것이다.
GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 또는 최대 5개의 아미노산 치환을 가진 GCase 단백질을 코딩할 수 있다. 이러한 실시예에서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 3개 아미노산 치환을 가진 GCase 단백질을 코딩할 수 있다. GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 2개의 아미노산 치환을 가진 GCase 단백질을 코딩할 수 있다. GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 1개의 아미노산 치환을 가진 변이체 GCase 단백질을 코딩할 수 있다.
GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 단백질 또는 단편이 기능적인지 여부를 결정하는 것은 당업자의 능력 내에 있다. 당업자는 단지 GCase 뉴클레오티드 서열을 발현시키고, 발현된 단백질이 활성인지 여부를 시험하기만 하면 된다. 예컨대, 당업자는 작동 가능한 프로모터에 연결된 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 바이러스 입자를 제조하고, GCase 단백질 또는 이의 단편의 발현에 적합한 조건 하에서 바이러스 입자로 세포를 형질도입할 수 있다. 발현된 GCase 단백질 또는 이의 단편의 활성(양)은 실시예 1에 기술된 바와 같이 "혈청 GBA 활성 검정"과 같은 형광측정 분석법을 사용하여 분석될 수 있다.
예컨대, 적합한 형광측정 분석법은 다음과 같다. β-글루코세레브로시다제(산성 β-글루코시다제; GCase) 활성을 기질로서 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4MU-Glc)를 사용하여 형광측정법으로 결정할 수 있다. 간단하게, 혈청 샘플(0.5 μL, 1 : 50 희석)을 50 mM 쇼듐 시트레이트, 25 mM 타우로콜레이트, pH 약 5.75, 6 mM 4MU-Glc에서 37℃에서 30분 동안 분석할 수 있다. 이어서 상대 형광 수준(RFU)을 365 nm 및 445 nm에서 각각 여기 및 방출 파장을 사용하여 평가할 수 있다. GCase는 4-메틸움벨리페론(4-MU) 표준 곡선에 기초하여 혈청의 나노몰/h/mL로 표현된다.
GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 야생형이 아니다
GBA 뉴클레오티드 서열의 일부, 예컨대, GCase 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 코딩 서열은 야생형이 아닐 수 있다. 야생형 GCase-코딩 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 9로 표현되고, SEQ ID NO: 9의 서열과 상이한 부분을 포함하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 야생형이 아닌 부분을 포함한다.
일 실시형태에서, 야생형이 아닌 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 코돈-최적화된다. 코돈-최적화는 특정 조직 및/또는 특정 유기체에서 뉴클레오티드 서열, 예컨대 GBA 뉴클레오티드 서열의 발현을 개선할 수 있다. 예컨대, 뉴클레오티드 서열이 인간 간에서 발현에 대해 코돈-최적화된 경우, 상기 뉴클레오티드 서열은 인간 간에서 선호될 수 있는(이러한 코돈은 동일한 아미노산에 대해 특이적인 다른 tRNA 종 보다 더 풍부한 tRNA 종에 해당한다는 의미에서) 코돈의 수를 증가시키도록 변형된다. 당업자는 특히 "선호하는 코돈"이 일부 위치에 이미 존재할 수 있기 때문에 서열을 코돈-최적화하는 것이 모든 코돈을 변경하는 것을 수반하지 않을 수 있음을 이해할 것이다.
이러한 코돈-최적화는 다른 요인의 영향을 받을 수 있다. 예컨대, CpG의 존재는 발현에 부정적인 영향을 미치므로 사용자는 CpG를 서열에 도입하는 위치에서 선호하는 코돈을 사용하지 않기로 결정할 수 있음을 알 수 있으며; 이는 여전히 코돈-최적화로 간주될 것이다. 일 실시형태에서, C 뉴클레오티드로 끝나는 선호하는 코돈은 코돈-최적화된 코딩 서열의 일부에 포함되지 않을 것이며, 여기서 서열의 다음 코돈은 G로 시작한다. 예컨대, 코돈 CTC는 류신을 코딩한다. CTC가 선호하는 코돈인 체계에서, GTT 코돈과 같이 서열의 다음 코돈이 G로 시작하는 류신을 코딩하는데 사용해서는 안된다(또는 대안적으로, 가능한 경우 다음 코돈은 첫 번째 위치에서 G를 피하기 위해 선택될 수 있음).
뉴클레오티드 서열의 일부에 사용되는 각 코돈의 빈도를 결정하는 것은 간단하다. 당업자는 코돈 사용을 살펴보고 결과를 검토하는 즉시 이용 가능한 알고리즘 중 하나에 해당 부분의 서열을 입력하기만 하면 된다. 대안적으로, 사용자는 단순히 이를 계수할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 히스티딘을 코딩하는 코돈의 67%가 CAC이고 히스티딘을 코딩하는 코돈의 33%가 CAT인 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
선택적으로, 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 인간 간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 선택적으로, GBA 뉴클레오티드 서열은 인간 간에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 선택적으로, 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 연속 부분이다.
코돈-최적화된 부분은 GCase 단백질의 일부 또는 전체를 코딩하는 서열에 해당할 수 있다. 예컨대, 코딩 서열은 성숙 GCase 단백질의 일부가 아닌 신호 펩티드를 포함하여, 전장(예컨대 SEQ ID NO: 9)일 수 있고, 전체 코딩 서열은 코돈-최적화될 수 있다. 따라서, "GBA 서열의 일부는 코돈-최적화됨"에 대한 언급은 "GBA 서열의 적어도 일부가 코돈-최적화됨"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 선택적으로, 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 길이가 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1600개 미만, 1500개 미만, 1000개 내지 1600개 사이, 1000개 내지 1500개 사이, 1300개 내지 1500개 사이, 또는 약 1494개의 뉴클레오티드이다. 선택적으로, 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 성숙 GCase 단백질을 코딩한다(이에 해당한다). 예컨대, GBA 뉴클레오티드 서열은 전구체 GCase 단백질(즉, 신호 펩티드 포함)을 코딩할 수 있고, 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부가 성숙 GCase 단백질에 해당하는 경우, 상기 신호 펩티드는 코돈-최적화되지 않는다.
따라서, 일부 실시형태에서, GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 코돈-최적화되지 않을 수 있으며, 예컨대 코딩 서열의 일부는 간에서의 발현을 위해 코돈-최적화되지 않는다. 일부 실시형태에서, 코돈-최적화되지 않은 부분은 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 110개, 200개 미만, 170개 미만, 140개 미만, 또는 약 117개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, GBA 뉴클레오티드 서열에서 코돈-최적화되지 않은 부분은 신호 펩티드를 코딩하는 부분이다.
상기 논의된 바와 같이, 부분적으로 또는 전체적으로 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 것은 코딩된 폴리펩티드(즉, GCase 폴리펩티드)가 높은 수준으로 발현되는 것을 보장할 수 있다. 본 발명의 GBA 뉴클레오티드 서열과 같이, 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 본 발명의 바이러스 입자로부터의 GCase의 발현은 일반적으로 프로모터 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 상류 및/또는 이와 작동 가능하게 연결된 영역의 존재를 필요로 한다는 것이 당업자에 의해 인지될 것이다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 상기 GBA 뉴클레오티드 서열이 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 경우 인간 간 세포에서 높은 수준으로 발현되는 GCase 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 프로모터 서열은 전사 조절 인자의 일부일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터 서열은 간-특이적 프로모터 서열일 수 있다. 일 실시형태에서, 프로모터 서열은 SEQ ID NO: 12를 갖는 프로모터이다. 다른 실시형태에서, 프로모터 서열은 SEQ ID NO: 15를 갖는 프로모터이다.
또한 당업자는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터와 참조(비교) 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 예컨대 참조 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 입자를 비교하여, GBA 뉴클레오티드 서열이 상이하다는 것을 제외하고 참조 폴리뉴클레오티드 또는 벡터가 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터와 동일할 수 있음을 인지할 것이다. 즉, 비교되는 상이한 GBA 뉴클레오티드 서열은 동일한 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험되는 상이한 GBA 뉴클레오티드 서열은 상이한 (특정한) 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드는 참조 야생형 GBA 서열에 비해 인간 간 세포에서 높은 수준으로 발현된다. 참조 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 9일 수 있다. 실시형태에서, GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 13의 프로모터 요소를 포함하는(상기 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 13의 프로모터 요소는 바람직하게는 작동 가능하게 연결됨) 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드에 비해 인간 간 세포에서 높은 수준으로 발현된다. 일 실시형태에서, GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 10의 전사 조절 인자를 포함하는(상기 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 10의 프로모터 요소는 바람직하게는 작동 가능하게 연결됨) 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드에 비해 인간 간 세포에서 높은 수준으로 발현된다. 이러한 실시형태에서 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase는 인간 간 세포에서 적어도 1.1×, 적어도 1.2×, 적어도 1.3×, 적어도 1.4×, 또는 적어도 1.5× 더 높게 발현될 수 있다. 일 실시형태에서, GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 13의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다른 동일한 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드에 비해 인간 간 세포에서 더 높은 수준으로 또는 비-통계학적으로 크게 상이한 수준으로 발현되며, 상기 2개의 폴리뉴클레오티드는 동일한 방식으로 그리고 동일한 양으로 세포에 전달된다.
일 실시형태에서, GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이 대상체, 또는 마우스와 같은 비-인간 포유류에 투여되는 경우, GCase는 SEQ ID NO: 12, 13 또는 15의 프로모터 요소에 작동 가능하게 연결된 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다른 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase에 비해 대상체 또는 비-인간 동물의 혈청에 높은 수준으로 존재하며(예컨대 투여 후 4 또는 8 또는 12주에), 상기 GBA 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 방식으로 그리고 동일한 양으로 투여된다.
당업자는 GCase가 일부 세포를 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 입자로 형질도입하여, 그리고 일부 세포를 참조 서열을 포함하는 입자로 형질도입하여 참조 서열(예컨대, 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 9)과 비교하여 높은 수준으로 주어진 GBA 뉴클레오티드 서열(예컨대, 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열)로부터 발현되는지 여부를 결정할 수 있다. 상기 세포는 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 단백질 또는 이의 단편을 발현하기에 적합한 조건 하에 배양될 수 있고 발현된 GCase 단백질의 수준이 비교될 수 있다. 발현된 GCcase 단백질의 수준은 "GCase 단백질 또는 이의 단편"이라는 표제의 섹션에 기술된 바와 같이 형광측정 분석법을 사용하여, 또는 GCase-특이적 항체를 사용하여 ELISA로 평가될 수 있다. 적합한 세포는 배양된 인간 간 세포, 예컨대 Huh-7 세포를 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, CpG(즉 CG 디뉴클레오티드)의 존재는 발현 효율을 감소시킬 수 있다. 이는 CpG가 메틸화될 수 있고, 이의 메틸화가 유전자 침묵을 야기하여 발현을 감소시킬 수 있기 때문이다. 또한, 높은 CpG 함량은 TLR 반응을 유발하여 항-AAV 면역 반응의 위험을 증가시킬 수 있다. 이러한 이유로, 코돈-최적화된 코딩 서열의 일부가 참조 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열(예컨대 SEQ ID NO: 9)의 해당하는 부분과 비교하여 감소된 수의 CpG를 포함하는 것이 바람직하다. 일 실시형태에서, 코돈-최적화된(이는 GBA 뉴클레오티드 서열의 전부일 수 있음) GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 40개 미만, 20개 미만, 10개 미만, 또는 5개 미만의 CpG를 포함한다. 일 실시형태에서, 코돈-최적화된(이는 GBA 뉴클레오티드 서열의 전부일 수 있음) GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 100 nt 당 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 또는 2개 미만의 CpG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 코돈-최적화된 코딩 서열의 일부는 CpG가 없다, 즉, CG 디뉴클레오티드를 함유하지 않는다(0개).
일 실시형태에서, 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1 내지 4의 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 또는 약 1494개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하다. 일 실시형태에서, 코돈-최적화된 코딩 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1 내지 4와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하다. 일 실시형태에서, 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1의 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 또는 약 1494개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하다. 일 실시형태에서, 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1의 적어도 1300개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하다. 실시형태에서, 코돈-최적화된 코딩 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하다.
본 발명은 GCase 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고 상기 GBA 서열은 SEQ ID NO: 1과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, SEQ ID NO: 1과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 적어도 99.8% 동일한 서열은 코돈-최적화된다.
코돈-최적화되지 않은 코딩 서열 부분
일 실시형태에서, GBA 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화되지 않은 부분을 포함한다. 코돈-최적화되지 않은 부분은 연속 부분일 수 있다.
당업계에서 이해되는 바와 같이, 코돈-최적화되지 않은 부분은 따라서 야생형 서열에 비해 선호되는 코돈을 더 큰 수로 포함하도록 변형되지 않는다. 연속적인 비-코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 야생형 서열이다.
선택적으로, 코돈-최적화되지 않은 부분은 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 110개, 200개 미만, 170개 미만, 140개 미만, 또는 약 117개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, GBA 뉴클레오티드 서열에서 코돈-최적화되지 않은 부분은 신호 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하는(이에 해당하는) 부분이다. 선택적으로, 코돈-최적화되지 않은 부분은 GCase 신호 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩한다. 일부 실시형태에서, GBA 뉴클레오티드 서열에서 코돈-최적화되지 않은 부분은 SEQ ID NO: 17의 서열을 가진 부분이다.
폴리뉴클레오티드는 전사 조절 인자를 추가로 포함할 수 있다
상기 폴리뉴클레오티드는 전사 조절 인자를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 전사 조절 인자는 SEQ ID NO: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하다. 일 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 10과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 전사 조절 인자를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 10과 적어도 98% 동일한 전사 조절 인자를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 10의 전사 조절 인자를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 10으로 이루어진 전사 조절 인자를 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 전사 조절 인자는 SEQ ID NO: 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하다. 일 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 14와 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 전사 조절 인자를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 14와 적어도 98% 동일한 전사 조절 인자를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 14의 전사 조절 인자를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 14로 이루어진 전사 조절 인자를 포함한다.
임의의 적절한 전사 조절 인자, 예컨대 HLP2, HLP1, LP1, HCR-hAAT, ApoE-hAAT, 및 LSP가 사용될 수 있으며, 이들은 모두 간-특이적 전사 조절 인자가다. 이러한 전사 조절 인자가 다음의 참고문헌에 보다 상세하게 기술되어 있다: HLP1: 문헌[McIntosh J. et al., Blood 2013 Apr 25, 121(17):3335-44]; LP1: 문헌[Nathwani et al., Blood. 2006 April 1, 107(7): 2653-2661]; HCR-hAAT: 문헌[Miao et al., Mol Ther. 2000;1: 522-532]; ApoE-hAAT: 문헌[Okuyama et al., Human Gene Therapy, 7, 637-645 (1996)]; 및 LSP: 문헌[Wang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 March 30, 96(7): 3906-3910].
상기 전사 조절 인자는 프로모터 및/또는 인핸서, 예컨대 HLP2, HLP1, LP1, HCR-hAAT, ApoE-hAAT, 및 LSP의 프로모터 요소 및/또는 인핸서 요소를 포함할 수 있다. 이러한 전사 조절 인자 각각은 프로모터, 인핸서, 및 선택적으로 기타 뉴클레오티드를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 전사 조절 인자는 인간 아포지질단백질 E(ApoE) 간 유전자좌 제어 영역(HCR(hepatic locus control region); 문헌[Miao et al (2000), Molecular Therapy 1(6):522]), 또는 이의 단편인 인핸서를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 전사 조절 인자는 길이가 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 192개 미만, 80개 내지 192개 사이, 90개 내지 192개 사이, 100개 내지 250개 사이, 또는 117개 내지 192개 사이의 뉴클레오티드의 단편인 HCR 인핸서의 단편을 포함한다. 선택적으로, HCR 인핸서의 단편은 길이가 100개 내지 250개 사이의 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에서, 상기 HCR 인핸서의 단편은 길이가 적어도 150개, 적어도 190개, 적어도 230개, 400개 미만, 150개 내지 400개 사이, 190개 내지 370개 사이, 230개 내지 340개 사이, 250개 내지 340개 사이, 또는 약 321개의 뉴클레오티드의 단편이다. 선택적으로, 상기 HCR 인핸서의 단편은 길이가 250개 내지 340개 사이의 뉴클레오티드이다.
적합한 HCR 인핸서 요소 단편이 SEQ ID NO: 11 및 16에 기술되어 있다. 선택적으로, 상기 전사 조절 인자는 길이가 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 192개 미만, 80개 내지 192개 사이, 90개 내지 192개 사이, 100개 내지 250개 사이, 또는 117개 내지 192개 사이의 뉴클레오티드인 인핸서를 포함하고 상기 인핸서는 SEQ ID NO: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 전사 조절 인자는 길이가 117개 내지 192개 사이의 뉴클레오티드인 인핸서를 포함하고 상기 인핸서는 SEQ ID NO. 11과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 전사 조절 인자는 SEQ ID NO: 11의 적어도 90개, 적어도 100개, 또는 적어도 110개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 11과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 11의 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 상기 전사 조절 인자는 길이가 321개 이하의 뉴클레오티드, 192개 이하의 뉴클레오티드 또는 117개 이하의 뉴클레오티드이고 SEQ ID NO: 11을 포함하는 HCR 인핸서의 단편을 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 전사 조절 인자는 길이가 적어도 150개, 적어도 190개, 적어도 230개, 400개 미만, 150개 내지 400개 사이, 190개 내지 370개 사이, 230개 내지 340개 사이, 250개 내지 340개 사이, 또는 약 318개의 뉴클레오티드인 인핸서를 포함하고 상기 인핸서는 SEQ ID NO: 16과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 전사 조절 인자는 길이가 250개 내지 340개 사이의 뉴클레오티드인 인핸서를 포함하고 상기 인핸서는 SEQ ID NO: 16과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 전사 조절 인자는 SEQ ID NO: 16의 적어도 250개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 16과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 16과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 16의 인핸서를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 전사 조절 인자는 인간 알파-1 항-트립신 프로모터(A1AT; 문헌[Miao et al (2000), Molecular Therapy 1(6):522]), 또는 이의 단편인 프로모터를 포함한다. 선택적으로, A1AT 프로모터의 단편은 길이가 적어도 100개, 적어도 120개, 적어도 150개, 적어도 180개, 255개 미만, 100개 내지 255개 사이, 150개 내지 225개 사이, 150개 내지 300개 사이, 또는 180개 내지 255개 사이의 뉴클레오티드이다. 선택적으로, 상기 A1AT 프로모터의 단편은 길이가 150개 내지 300개 사이의 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에서, A1AT 프로모터의 단편은 길이가 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 500개 미만, 200개 내지 500개 사이, 250개 내지 500개 사이, 또는 350개 내지 450개 사이의 뉴클레오티드이다. 선택적으로, 상기 A1AT 프로모터의 단편은 길이가 350개 내지 450개 사이의 뉴클레오티드이다.
적합한 A1AT 프로모터 단편이 SEQ ID NO: 12 및 15에 기술되어 있다. 선택적으로, 상기 전사 조절 인자는 길이가 적어도 100개, 적어도 120개, 적어도 150개, 적어도 180개, 255개 미만, 100개 내지 255개 사이, 150개 내지 300개 사이, 또는 180개 내지 255개 사이의 뉴클레오티드인 프로모터를 포함하고 상기 프로모터는 SEQ ID NO: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 전사 조절 인자는 길이가 180개 내지 255개 사이의 뉴클레오티드인 프로모터를 포함하고 상기 프로모터는 SEQ ID NO: 12와 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 12의 적어도 100개, 적어도 120개, 또는 적어도 150개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 12와 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 12의 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 상기 전사 조절 인자는 길이가 418개 이하의 뉴클레오티드, 225개 이하의 뉴클레오티드 또는 185개 이하의 뉴클레오티드이고 SEQ ID NO: 12를 포함하는 A1AT 프로모터의 단편을 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 전사 조절 인자는 길이가 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 500개 미만, 200개 내지 500개 사이, 250개 내지 500개 사이, 350개 내지 450개 사이, 또는 약 418개의 뉴클레오티드인 프로모터를 포함하고 상기 프로모터는 SEQ ID NO: 15와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 전사 조절 인자는 길이가 350개 내지 450개 사이의 뉴클레오티드인 프로모터를 포함하고 상기 프로모터는 SEQ ID NO: 15와 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 15의 적어도 350개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 15의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 15와 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 15의 프로모터를 포함한다.
폴리뉴클레오티드가 간에서 발현되도록 의도된 경우, 상기 프로모터는 간-특이적 프로모터일 수 있다. 선택적으로, 상기 프로모터는 인간 간-특이적 프로모터이다.
"간-특이적 프로모터"는 일반적으로 다른 세포와 비교하여 간 세포에서 높은 수준의 발현을 제공하는 프로모터이다. 예컨대, 당업자는 간 세포(예컨대 Huh-7 세포)에서의 폴리뉴클레오티드의 발현을 다른 조직의 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 발현과 비교함으로써 프로모터가 간-특이적 프로모터인지 여부를 결정할 수 있다. 발현 수준이 다른 조직의 세포와 비교하여 간 세포에서 더 높은 경우, 상기 프로모터는 간-특이적 프로모터이다. 선택적으로, 상기 전사 조절 인자 또는 상기 프로모터는 적어도 하나의 다른 기관 또는 조직의 세포와 비교하여 간 세포에서 더 높은 수준으로 단백질 발현을 촉진하고 상기 전사 조절 인자 또는 상기 프로모터가 간 세포에서 단백질 발현을 촉진하는 수준의 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만의 수준에서 적어도 하나의 다른 기관 또는 조직의 세포에서 단백질 발현을 촉진하는 경우 간-특이적이다. 선택적으로, 상기 적어도 하나의 다른 기관 또는 조직의 세포는 신장 세포, 췌장 세포, 유방 세포, 신경모세포종 세포, 폐 세포, 및 초기 B 세포 중 적어도 하나이다. 선택적으로, 상기 적어도 하나의 다른 기관 또는 조직의 세포는 신장 세포, 췌장 세포, 유방 세포, 신경모세포종 세포, 폐 세포, 및 초기 B 세포이다. 선택적으로, 상기 적어도 하나의 다른 기관 또는 조직의 세포는 HEK293T 세포, PANC1 세포, BxPC-3 세포, MCF7 세포, 1643 세포, MRC-9 세포, 및 697 세포 중 적어도 하나이다. 선택적으로, 상기 적어도 하나의 다른 기관 또는 조직의 세포는 HEK293T 세포, PANC1 세포, BxPC-3 세포, MCF7 세포, 1643 세포, MRC-9 세포, 및 697 세포이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 간에서 특이적으로 발현되는 GCase를 제공할 수 있다. 이러한 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 다른 조직 유형 또는 기관에서보다 간 세포에서 실질적으로 더 많은 GCase 발현을 촉진할 수 있다. 일 실시예에서, 간에서 특이적으로 발현되는 GCase를 제공하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 간-특이적 프로모터를 포함한다.
선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 GCase가 적어도 하나의 다른 기관 또는 조직의 세포와 비교하여 간 세포에서 더 높은 수준으로 발현되도록 제공할 수 있으며 이에 따라 동일한 분석법으로 측정한 경우, GCase가 간 세포에서 GCase 발현 수준의 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만의 수준으로 하나의 다른 기관 또는 조직에서 발현된다.
선택적으로, 상기 적어도 하나의 다른 기관 또는 조직의 세포는 신장 세포, 췌장 세포, 유방 세포, 신경모세포종 세포, 폐 세포, 및 초기 B 세포 중 적어도 하나이다. 선택적으로, 상기 적어도 하나의 다른 기관 또는 조직의 세포는 신장 세포, 췌장 세포, 유방 세포, 신경모세포종 세포, 폐 세포, 및 초기 B 세포이다. 선택적으로, 상기 적어도 하나의 다른 기관 또는 조직의 세포는 HEK293T 세포, PANC1 세포, BxPC-3 세포, MCF7 세포, 1643 세포, MRC-9 세포, 및 697 세포 중 적어도 하나이다. 선택적으로, 상기 적어도 하나의 다른 기관 또는 조직의 세포는 HEK293T 세포, PANC1 세포, BxPC-3 세포, MCF7 세포, 1643 세포, MRC-9 세포, 및 697 세포이다.
폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는 바이러스 입자를 제공한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "바이러스 입자"는 비리온의 전부 또는 일부를 지칭한다. 예컨대, 상기 바이러스 입자는 재조합 게놈을 포함하고 캡시드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 바이러스 입자는 유전자 치료 벡터일 수 있다. 본원에서, 용어 "바이러스 입자" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용된다. 본 출원의 목적을 위해, "유전자 치료" 벡터는 유전자 치료에서 사용될 수 있는 바이러스 입자, 즉, 투여 후 숙주 세포에서, GBA 뉴클레오티드 서열과 같은, 전달 유전자(transgene)를 발현하는데 필요한 모든 기능적인 요소를 포함하는 바이러스 입자이다.
적합한 바이러스 입자는 파보바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 헤르페스 단순 바이러스를 포함한다. 파보바이러스는 아데노-관련 바이러스(AAV)일 수 있다. 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 보다 바람직하게는, 상기 바이러스 입자는 AAV 바이러스 입자이다. 용어 AAV 및 rAAV는 문맥이 명백하게 달리 시사하지 않는 한 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
공지된 모든 AAV 혈청형의 게놈 구성은 매우 유사하다. AAV의 게놈은 길이가 약 5,000개 뉴클레오티드 미만인 선형의, 단일-가닥 DNA 분자이다. 역 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat)는 비-구조적 복제(Rep) 단백질 및 구조적(VP) 단백질에 대한 고유한 코딩 뉴클레오티드 서열의 측부에 있다. 상기 VP 단백질(VP1, -2 및 -3)은 캡시드를 형성한다. 말단 약 145 nt(ITR)는 자가-상보적이며 T-형 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정한 분자내 이중체(duplex)를 형성할 수 있도록 구성된다. 이러한 헤어핀 구조는 세포 DNA 중합효소 복합체의 프라이머 역할을 하는바이러스 DNA 복제의 기원으로 기능한다. 포유류 세포에서 야생형(wt) AAV 감염 후 Rep 유전자(즉, Rep78 및 Rep52 단백질로 코딩되는)는 각각 P5 프로모터 및 P19 프로모터로부터 발현되고, Rep 단백질 둘 모두는 바이러스 게놈의 복제에서 기능을 갖는다. Rep ORF의 스플라이싱 사건은 4개의 Rep 단백질(즉 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)을 발현시킨다. 그러나, 포유류 세포에서 Rep78 및 Rep52 단백질을 코딩하는 스플라이싱되지 않은 mRNA는 AAV 벡터 생산에 충분한 것으로 나타났다. 또한, 곤충 세포에서 Rep78 및 Rep52 단백질은 AAV 벡터 생산에 충분하다.
본 발명의 재조합 바이러스 게놈은 ITR을 포함할 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터가 오직 하나의 ITR과 함께 기능하는 것이 가능하다. 따라서, 상기 바이러스 게놈은 적어도 하나의 ITR을 포함하지만, 보다 전형적으로, 2개의 ITR(일반적으로 바이러스 게놈의 양쪽, 즉, 5' 말단에 하나 및 3' 말단에 하나)을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 하나 이상의 ITR 사이에 개재 서열(intervening sequences)이 존재할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 2개의 일반 ITR 사이에 위치하거나 2개의 D 영역으로 조작된 ITR의 양쪽에 위치하는 바이러스 입자 내로 통합될 수 있다.
AAV 벡터 생산을 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 AAV 서열은 임의의 AAV 혈청형의 게놈으로부터 유도될 수 있다. 일반적으로, 상기 AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 상당한 상동성의 게놈 서열을 갖고, 유전 기능의 동일한 세트를 제공하고, 본질적으로 물리적으로 및 기능적으로 동등한 비리온을 생성하고, 실질적으로 동일한 메커니즘에 의해 복제 및 조립된다. 다양한 AAV 혈청형의 게놈 서열 및 게놈의 유사성에 대한 개요를 예컨대 GenBank Accession number U89790; GenBank Accession number J01901; GenBank Accession number AF043303; GenBank Accession number AF085716; 문헌[Chiorini et al, 1997]; 문헌[Srivastava et al, 1983]; 문헌[Chiorini et al, 1999]; 문헌[Rutledge et al, 1998]; 및 문헌[Wu et al, 2000]을 참조한다. AAV 혈청형 1, 2, 3, 3B, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12가 본 발명에서 사용될 수 있다. AAV 혈청형의 서열은 유전자 치료 벡터의 생산에서 사용되는 경우 돌연변이되거나 조작될 수 있다.
선택적으로, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV4 및/또는 AAV6으로부터 유도된 ITR 서열을 포함한다. 바람직하게는 상기 ITR 서열은 AAV2 ITR 서열이다. 본원에서, 용어 AAVx/y는 게놈 성분 예컨대 AAVx(여기서 x는 AAV 혈청형의 수임)로부터의 적어도 ITR을 포함하고 AAVy(여기서 y는 동일하거나 상이한 혈청형의 수임)로부터의 캡시드를 갖는 바이러스 입자를 지칭한다. 예컨대, AAV2/8 벡터는 AAV2 균주로부터의 ITR, 및 AAV8 균주로부터의 캡시드를 비롯하여, 바이러스 게놈의 일부를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 바이러스 입자는 캡시드를 포함하는 AAV 바이러스 입자이다. AAV 캡시드는 일반적으로 3개의 단백질인 VP1, VP2 및 VP3으로부터 형성된다. VP1의 아미노산 서열은 VP2의 서열을 포함한다. VP2의 부분을 형성하지 않는 VP1의 일부는 VP1고유(VP1unique) 또는 VP1U로 지칭된다. VP2의 아미노산 서열은 VP3의 서열을 포함한다. VP3의 부분을 형성하지 않는 VP2의 일부는 VP2고유 또는 VP2U로 지칭된다. 선택적으로, 상기 바이러스 입자는 간-트로픽 또는 CNS-트로픽 캡시드를 포함한다. 바이러스 입자(캡시드)가 특정 조직에 대해 트로픽인지 여부는 예컨대 루시퍼라제와 같은 마커 유전자를 발현하는 입자를 투여하고 생체 내에서 여러 시점에서 영상화하여 평가될 수 있다(예컨대 문헌[Zincarelli et al (2008), Molecular Therapy, 16:1073-1080]에 기술된 바와 같음). 간 또는 CNS 조직에서 각각 강력한 마커 발현을 유도하는 입자는 특히 다른 조직에서 더 적은 발현과 대조적인 경우 간- 또는 CNS-트로픽으로 간주될 것이다.
일부 실시형태에서, 간-트로픽 캡시드는 AAV3- 또는 AAV3B-유도된 캡시드일 수 있다. 선택적으로, 상기 간-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 19, 20, 또는 24의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개 사이, 650개 내지 736개 사이 또는 700개 내지 736개 사이의 아미노산의 단편과 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 간-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 19와 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 간-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 20과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 간-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 24와 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 CNS 트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 21의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개 사이, 650개 내지 736개 사이 또는 700개 내지 736개 사이의 아미노산의 단편과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 CNS-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 21과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 본 발명의 바이러스 입자는 상기 바이러스 ITR 및 바이러스 캡시드가 상이한 파보바이러스 예컨대 상이한 AAV 혈청형 유래인 "하이브리드" 입자일 수 있다. 바람직하게는, 상기 바이러스 ITR 및 캡시드는 상이한 혈청형의 AAV 유래이고, 이러한 경우 이러한 바이러스 입자는 트랜스캡시드화 또는 위형화(pseudotyped)로 공지되어 있다. 마찬가지로, 상기 파보바이러스는 "키메라" 캡시드(예컨대, 상이한 파보바이러스, 바람직하게는 상이한 AAV 혈청형 유래의 서열을 함유함) 또는 "표적화된" 캡시드(예컨대, 유향 방향성)를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 재조합 AAV 게놈은 기능성 말단 분해 부위(TRS: terminal resolution site)를 포함하는, 무손상(intact) ITR을 포함한다. 이러한 AAV 게놈은 하나 또는 2개의 분해가능한 ITR을 함유할 수 있으며, 즉 ITR은 DNA 중합효소가 ITR을 풀고 복제하기 위한 기질로 작용할 수 있는 유리 3' 히드록실기를 생성하기 위해 부위-특이적인 닉킹(nicking)이 발생할 수 있는 기능적 TRS를 함유한다. 바람직하게는, 상기 재조합 게놈은 단일-가닥이다(즉, 단일-가닥 형태로 바이러스 입자 내로 포장된다). 선택적으로, 상기 재조합 게놈은 자가-상보성인 구성으로 포장되지 않는다, 즉, 상기 게놈은 바이러스 입자에서 어닐링되는 실질적인 자가-상보성 부분을 갖는 단일 공유-연결된 폴리뉴클레오티드 가닥을 포함하지 않는다. 대안적으로, 상기 재조합 게놈은 "단량체 이중체" 형태로 포장될 수 있다. "단량체 이중체"가 국제공개 WO 2011/122950호에 기술된다. 상기 게놈은 바이러스 입자에서 어닐링되는 2개의 실질적으로 상보적이지만 비-공유적으로 연결된 폴리뉴클레오티드로서 포장될 수 있다.
상기 바이러스 입자는 폴리 A 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 폴리 A 서열은 기능적인 GCase 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치할 수 있다. 폴리 A 서열은 소 성장 호르몬 폴리 A 서열(bGHpA - SEQ ID NO: 23)일 수 있다. 상기 폴리 A 서열은 길이가 250개 내지 270개 사이의 뉴클레오티드일 수 있다.
상기 바이러스 입자는 인트론 서열, 예컨대 바이러스 인트론 서열, 선택적으로 SV40 인트론 서열(SEQ ID NO: 22)을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 바이러스 입자는 프로모터 요소, 인트론 서열, 예컨대 SV40 인트론 서열, GBA 뉴클레오티드 서열, 및 폴리 A 서열, 예컨대 bGHpA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 상기 인트론 서열, 예컨대 SV40 인트론 서열은 상기 프로모터 요소와 상기 GBA 뉴클레오티드 서열 사이에 위치할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 상기 폴리 A 서열, 예컨대 상기 bGHpA 서열은 GBA 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치할 수 있다.
본 발명의 바이러스 입자는 선택적으로 숙주 세포에서 GCase를 고도로 발현한다. 예컨대, Huh-7 세포에서 형질도입 시, 본 발명의 바이러스 입자는 Huh-7 세포와 유사한(comparable) 집단 내로 유사한(comparable) 양으로 형질도입된 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다른 동일한 바이러스 입자와 비교하여 높은 수준으로 GCase 단백질 또는 이의 단편을 발현한다. 선택적으로, Huh-7 세포 집단 내로의 형질도입 후, 본 발명의 바이러스 입자는 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 10의 전사 조절 인자 또는 SEQ ID NO: 12의 프로모터를 포함하는 바이러스 입자보다 더 높은 수준으로 GCase 단백질을 발현한다. 선택적으로, Huh-7 세포의 집단 내로 형질도입 후, 본 발명의 바이러스 입자는 Huh-7 세포의 유사한 집단 내로 유사한 양으로 형질도입된 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 10의 전사 조절 인자 또는 SEQ ID NO: 12의 프로모터 서열을 포함하는 유사한 바이러스 입자보다 더 높은 수준으로 GCase 단백질을 발현한다. 선택적으로, Huh-7 세포의 집단 내로의 형질도입 후, 상기 바이러스 입자는 Huh-7 세포의 유사한 집단 내로 유사한 양으로 형질도입된 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 13의 프로모터 요소를 포함하는 바이러스 입자와 유사한 수준(즉, 비-통계학적으로 현저하게 상이한 수준)으로 GCase 단백질을 발현한다. 이러한 실시형태에서, 용어 "유사한(comparable) 바이러스 입자"는 상기 유사한 바이러스 입자가 상이한 GBA 뉴클레오티드 서열 및 상이한 전사 조절 인자를 포함한다는 것을 제외하고, 본 발명의 AAV 바이러스 입자와 동일한 바이러스 입자를 지칭한다. 선택적으로, 유사한 바이러스 입자는 본 발명의 AAV 바이러스 입자와 동일한 전사 조절 인자를 포함한다. 선택적으로, 상기 활성은 상기 논의된 형광측정 분석과 같이 발색 분석(chromogenic assay)을 사용하여 평가된다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 입자가 제공되며, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은
a) SEQ ID NO: 5와 적어도 98% 서열 동일성을 가진 GBA 뉴클레오티드 서열, 다음과 작동 가능하게 연결됨:
b) SEQ ID NO: 14와 적어도 98% 서열 동일성을 가진 전사 조절 서열을 포함하고;
상기 바이러스 입자는 SEQ ID NO: 20과 적어도 98% 동일성을 가진 캡시드를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 입자가 제공되며, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은
a) SEQ ID NO: 5와 적어도 98% 서열 동일성을 가진 GBA 뉴클레오티드 서열, 다음과 작동 가능하게 연결됨:
b) SEQ ID NO: 10과 적어도 98% 서열 동일성을 가진 전사 조절 서열을 포함하고;
상기 바이러스 입자는 SEQ ID NO: 20과 적어도 98% 동일성을 가진 캡시드를 추가로 포함한다.
조성물, 방법 및 용도
본 발명의 추가 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터/바이러스 입자 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
상기 약학적으로 허용되는 부형제는 담체, 희석제 및/또는 다른 의약 제제, 약학 제제 또는 보조제 등을 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 약학적으로 허용되는 부형제는 염수 용액을 포함한다. 선택적으로, 상기 약학적으로 허용되는 부형제는 인간 혈청 알부민을 포함한다.
본 발명은 GBA 뉴클레오티드 서열을 발현하고 대상체에서 안정한 GCase 활성을 달성하는 방법 및/또는 GCase 효소 대체 요법으로부터의 생체이용률에 비해 대상체에서 더 큰 GCase 생체이용률을 제공하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 생체이용률은 투여로부터 2주 기간에 걸쳐 측정되고, 상기 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자 또는 조성물을 추가로 제공한다. 선택적으로 상기 치료 방법은 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터/바이러스 입자를 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터/바이러스 입자를 환자에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 치료 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자 또는 조성물의 용도를 추가로 제공한다. 선택적으로 상기 치료 방법은 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터/바이러스 입자를 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 선택적으로 상기 치료 방법은 유전자 치료이다. "유전자 치료"는 투여될 숙주에서 전달 유전자(예컨대 GBA 뉴클레오티드 서열)를 발현할 수 있는 본 발명의 벡터/바이러스 입자를 투여하는 단계를 수반한다.
선택적으로, 상기 치료 방법은 GCase 결핍과 관련된 질환의 치료 방법이다. 상기 논의된 바와 같이, GCase 결핍은 대식세포에서 글루코세레브로시드의 축적으로 이어질 수 있으며, 이는 다수의 중요한 기관에 침투하여 시누클레오병증(synucleopathy)(국제공개 WO 08/144591호에 기술된 바와 같음) 또는 파킨슨병을 비롯하여 다양한 질환을 야기할 수 있다. 선택적으로, 상기 치료 방법은 파킨슨병 또는 시누클레오병증의 치료 방법이다.
선택적으로, 상기 치료 방법은 리소좀 저장 장애 예컨대 고셔병(GD), 예컨대 GD 유형 I, 유형 II 또는 유형 III의 치료 방법이다. 바람직하게는, 상기 리소좀 저장 장애는 멍, 피로, 빈혈, 낮은 혈소판 수 및 간 및 비장의 비대를 특징으로 한다. 선택적으로, 상기 치료 방법은 GD, 예컨대 GD 유형 I의 치료 방법이다. 일부 실시형태에서, 상기 환자는 GD, 예컨대 GD 유형 I을 앓고 있는 환자이다. 선택적으로 상기 환자는 재조합 GCase(예컨대 이미글루세라제, 벨라글루세라제 알파 또는 탈리글루세라제 알파)에 대한 항체 또는 억제제를 가지며 상기 환자는 이전에 효소 대체 요법의 일부로서 치료를 받았다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터/바이러스 입자는 정맥 내로 투여된다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터/바이러스 입자는 환자에 오직 1회만(단회 투여) 투여된다.
GD가 상기 방법에서 "치료가 되는" 경우, 이는 GD 유형 I의 하나 이상의 증상이 개선되었음을 의미한다. 이는 GD 유형 I의 증상이 완전히 치유되어 더 이상 환자에게 나타나지 않는다는 것을 의미하지는 않지만, 일부 방법에서, 이는 상기 경우일 수 있다. 따라서, 모든 경우에 용어 "치료"는 용어 "개선"으로 대체될 수 있다. 치료 방법으로 인해 GD 유형 I의 증상 중 하나 이상이 치료 전보다 덜 심각할 수 있다. 선택적으로, 투여 전 상황과 비교하여, 치료 방법은 환자의 혈액에서 순환 GCase의 양/농도, 및/또는 주어진 혈액량 내에서 및/또는 환자의 대식세포에서 검출가능한 GCase 활성의 전체 수준을 증가시킨다. 일 실시형태에서, 투여 전 상황과 비교하여, 상기 치료 방법은 다음 중 하나 이상을 야기한다: 헤모글로빈 농도 증가; 혈소판 수 증가; 비장 크기 감소; 간 크기 감소.
또한, 본 발명의 방법은 고셔병과 같은 질환을 "예방"할 수 있다. 고셔병은 일반적으로 다양한 조직에서 글루코세레브로시다제의 축적과 관련되어 있으며, 본 발명의 방법이 어린 대상체(예컨대 10대, 젊은 성인, 어린이 또는 아기)에서 수행되는 경우 고셔병이 확립되는 것을 예방할 수 있어야 한다. 따라서, 모든 경우에 용어 "치료"는 용어 "예방"으로 대체될 수 있다.
"치료 유효량"은 대상체에서 기능적 GCase의 수준을 높이는 것과 같이(GD, 예컨대 GD 유형 I의 증상을 개선하기에 충분한 수준에서 기능적 GCase 생산을 유도하기 위해), 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 용량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
선택적으로, 상기 벡터/바이러스 입자는 1 × 1011 미만, 1 × 1012 미만, 5 × 1012 미만, 2 × 1012 미만, 1.5 × 1012 미만, 3 × 1012 미만, 1 × 1013 미만, 2 × 1013 미만, 또는 3 × 1013 미만의 환자의 체중 kg 당 벡터 게놈의 용량으로 투여된다. 선택적으로, 투여되는 벡터/바이러스 입자의 용량은 대상체가 GD를 앓지 않고 있는 건강한 대상체의 수준의 10% 내지 90%, 20% 내지 80%, 30% 내지 70%, 25% 내지 50%, 20% 내지 150%, 30% 내지 140%, 40% 내지 130%, 50% 내지 120%, 60% 내지 110% 또는 70% 내지 100%의 수준으로 GCase를 발현하도록 선택된다.
선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 투여된 환자는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 또는 적어도 9 μmol/h/ml의 GCase 활성 수준을 가질 수 있다. 선택적으로, 상기 GCase 활성은 GCase에 특이적인 형광측정 기질을 사용하여 측정된다. 선택적으로, 상기 GCase 활성은 기질로서 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4MU-Glc)로 형광측정법으로 측정된다. 선택적으로, 상기 GCase 활성은 대상체의 혈청, 혈장, 대식세포, 비장, 간 및/또는 골수에서 측정된다.
일 실시형태에서, GCase 활성은 다음과 같이 기질로서 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4MU-Glc)로 형광측정법으로 결정될 수 있다: (1) 혈청 샘플을 수집하거나 조직(간, 비장, 골수)을 수확하고 급속 동결 및 용해한다; (2) 조직 용해물 또는 혈청/혈장 샘플을 50 mM 쇼듐 시트레이트, 25 mM 타우로콜레이트, pH = 5.75, 6 mM 4MU-Glc에서 37℃에서 30분 동안 혼합한다; (3) 1 부피(100 μl)의 정지 용액(0.5 M 글리신, 0.3 M NaOH, pH 10.0)을 첨가하여 반응을 정지시킨다; (4) 상대 형광 수준(RFU)을 각각 365 nm 및 445 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 Spectramax I3X(Molecular devices)로 평가한 다음 형광 수준을 4-메틸움벨리페론(4-MU, Sigma-Aldrich) 표준 곡선에 기초하여 나노몰/h/mL로 변환한다.
선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 투여된 환자는 투여 후 동일한 시점에서 동일한 분석으로 측정할 때, 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 측정된 활성과 비교할 때 투여 후 적어도 5주, 적어도 10주, 적어도 15주, 적어도 20주, 적어도 25주, 적어도 30주, 또는 적어도 35주에서 더 큰 GCase 활성 수준을 가질 수 있다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 투여된 환자는 투여 후 동일한 시점에서 동일한 분석으로 측정할 때, 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 측정된 활성과 비교할 때 투여 후 적어도 5주, 적어도 10주, 적어도 15주, 적어도 20주, 적어도 25주, 적어도 30주, 또는 적어도 35주에서 10배, 20배, 50배, 100배 또는 1000배 더 큰 GCase 활성 수준을 가질 수 있다.
선택적으로, 투여되는 벡터/바이러스 입자의 용량은 GCase 효소 대체 요법의 생체이용률과 비교할 때 대상체에 대해 GCase 생체이용률이 더 크도록 선택된다. 생체이용률은 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 측정(예컨대 추정되거나 계산됨)될 수 있다. GCase 생체이용률은 대상체의 혈청, 대식세포, 비장, 간 및/또는 골수에서 측정될 수 있다. 일 실시예에서, 생체이용률은 실시예 8에 따라 곡선 하 면적("AUC: area under the curve") 방법을 사용하여 추정될 수 있다. 일 실시예에서, 생체이용률은 대상체의 혈청, 혈장, 대식세포, 비장, 간 및/또는 골수에서 이용 가능한 총 GCase 활성을 추정함으로써 추정될 수 있다. 선택적으로, 이는 정의된 기간 동안 계산되며, 해당 기간 동안 GCase의 총 활성 또는 농도를 지칭한다. 선택적으로, 상기 GCase 활성은 GCase에 특이적인 형광측정 기질을 사용하여 측정된다. 선택적으로, 상기 GCase 활성은 기질로서 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4MU-Glc)로 형광측정법으로 측정된다. 선택적으로, 상기 GCase 활성은 대상체의 혈청, 혈장, 대식세포, 비장, 간 및/또는 골수에서 측정된다. 선택적으로 상기 GCase 활성은 대상체의 백혈구 세포에서 측정된다. 선택적으로, 상기 생체이용률은 투여로부터 2주 기간에 걸쳐 측정된다. 선택적으로, 상기 생체이용률은 투여로부터 5주 기간에 걸쳐 측정된다. 선택적으로, 상기 생체이용률은 혈청에서 측정된다. 일 실시예에서, 투여 후 동일한 시점에서 동일한 분석으로 측정할 때, 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 측정된 생체이용률과 비교할 때 투여 후 적어도 5주, 적어도 10주, 적어도 15주, 적어도 20주, 적어도 25주, 적어도 30주, 또는 적어도 35주의 기간에 걸쳐 대상체에서 더 큰 GCase 생체이용률이 달성된다.
선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 투여된 환자(예컨대, GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 환자)는 바람직하게는 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준을 투여 후 6주, 8주, 10주 또는 12주에 측정할 때, 투여 후 감소된 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준을 가질 수 있다. 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 시 (출발) 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준과 비교할 때 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 2배 내지 3배, 2배 내지 4배, 2배 내지 5배, 2배 내지 6배, 또는 3배 내지 5배 감소될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 바이러스 입자 또는 조성물 투여 후(예컨대, 투여 후 6주, 8주, 10주 또는 12주), 환자에서 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 시 (출발) 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준과 비교할 때 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하일 수 있다. 선택적으로, 상기 환자는 건강한 대상체 또는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 갖지 않는 대상체와 비교할 때 증가된 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준을 가질 수 있다. 예컨대, 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 환자/대상체의 비장, 간 및/또는 골수에서 측정된다. 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 환자/대상체의 혈청 및/또는 백혈구 세포(예컨대 대식세포)에서 측정될 수 있다. 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준 측정 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신의 수준은 예컨대 실시예 9에 기술된 방법에 의해, 바람직하게는 질량 분석법(LC/MS 분석)을 사용하여 측정된다. 선택적으로, (예컨대, 환자/대상체의 혈청, 백혈구 세포(예컨대 대식세포), 비장, 간 및/또는 골수에서) 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준 감소는 바람직하게는 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준이 치료 시작 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주에 측정될 때, GCase 효소 대체 요법으로부터 달성된 감소보다 더 크다. 예컨대 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여로부터 적어도 6주(예컨대 6주에), 적어도 8주(예컨대 8주에), 적어도 10주(예컨대 10주에) 또는 적어도 12주(예컨대 12주에) 후의 수준은 GCase 효소 대체 요법으로부터의 제1 투여로부터 각각 적어도 6주(예컨대 6주에), 적어도 8주(예컨대 8주에), 적어도 10주(예컨대 10주에) 또는 적어도 12주(예컨대 12주에) 후의 수준과 비교될 수 있다. 특정 실시예로서, 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후 적어도 12주(예컨대 12주에) 후 측정될 수 있고 GCase 효소 대체 요법의 제1 투여 후 적어도 12주(예컨대 12주에)에 측정된 수준과 비교될 수 있다. 바람직하게는, 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신의 수준은 투여 후 동일한 시점에 동일한 분석법으로 측정된다. 선택적으로, 상기 GCase 효소 대체 요법은 2주 마다 투여될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후 대상체(또는 환자)에서 헥소실세라마이드 수준은 상기 헥소실세라마이드 수준(예컨대 혈청, 백혈구 세포(예컨대 대식세포), 간 및/또는 비장에서)이 건강한 대상체 또는 GCase와 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있지 않은 대상체에서 측정된 헥소실세라마이드 수준의 200%, 150%, 또는 125% 이하가 되도록 감소된다. 일 실시예에서, 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준의 감소는 각각 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준의 감소를 나타낼 수 있다. 예컨대, 헥소실세라마이드의 감소는 글루코실세라마이드의 감소를 나타낼 수 있다. 추가 실시예로서, 헥소실스핑고신 수준의 감소는 글루코실스핑고신 수준의 감소를 나타낼 수 있다.
일 실시예에서, 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준의 감소는 각각 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신의 감소이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 투여된 환자(예컨대, GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 환자)는 바람직하게는 상기 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준을 투여 후 6주, 8주, 10주 또는 12주에 측정할 때, 투여 후 감소된 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준을 가질 수 있다. 상기 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 시 (출발) 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준과 비교할 때 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 2배 내지 3배, 2배 내지 4배, 2배 내지 5배, 2배 내지 6배, 또는 3배 내지 5배 감소될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후(예컨대 투여 후 6주, 8주, 10주 또는 12주), 환자에서 상기 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 시 (출발) 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준과 비교할 때 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하일 수 있다. 선택적으로, 상기 환자는 건강한 대상체 또는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 갖지 않는 대상체와 비교할 때 증가된 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준을 가질 수 있다. 예컨대, 상기 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 환자/대상체의 비장, 간 및/또는 골수에서 측정된다. 상기 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 상기 환자/대상체의 혈청 및/또는 백혈구 세포(예컨대 대식세포)에서 측정될 수 있다. 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준의 측정 방법이 당업계에 공지되어 있고, 상기 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신의 수준은 예컨대 실시예 9에 기술된 방법에 의해 바람직하게는 질량 분석법(LC/MS 분석)을 사용하여 측정된다. 선택적으로, 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준(예컨대 상기 환자/대상체의 혈청, 백혈구 세포(예컨대 대식세포), 비장, 간 및/또는 골수에서)의 감소는 바람직하게는 상기 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준이 치료 시작 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후 측정될 때 GCase 효소 대체 요법으로부터 달성된 감소보다 더 크다. 예컨대 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여로부터 적어도 6주(예컨대 6주에), 적어도 8주(예컨대 8주에), 적어도 10주(예컨대 10주에) 또는 적어도 12주(예컨대 12주에) 후 수준은 GCase 효소 대체 요법의 제1 투여로부터, 각각 적어도 6주(예컨대 6주에), 적어도 8주(예컨대 8주에), 적어도 10주(예컨대 10주에) 또는 적어도 12주(예컨대 12주에) 후 수준과 비교될 수 있다. 특정 실시예로서, 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후 적어도 12주(예컨대 12주에) 후 측정될 수 있고 GCase 효소 대체 요법의 제1 투여 후 적어도 12주(예컨대 12주에)에 측정된 수준과 비교될 수 있다. 바람직하게는, 글루코실세라마이드 및/또는 글루코실스핑고신의 수준은 투여 후 동일한 시점에서 동일한 분석법으로 측정된다. 선택적으로, 상기 GCase 효소 대체 요법은 2주 마다 투여될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후 대상체(또는 환자)에서 글루코실세라마이드 수준은 상기 글루코실세라마이드 수준(예컨대 혈청, 백혈구 세포(예컨대 대식세포), 간 및/또는 비장에서)이 건강한 대상체 또는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있지 않은 대상체에서 측정된 글루코실세라마이드 수준의 200%, 150%, 또는 125% 이하가 되도록 감소된다.
선택적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 투여된 환자(예컨대, GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 환자)는 바람직하게는 상기 세포가 투여 후 적어도 6주(예컨대 6주에), 적어도 8주(예컨대 8주에), 적어도 10주(예컨대 10주에) 또는 적어도 12주(예컨대 12주에) 후 계수될 때, 투여 후 간에서 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포 수의 감소를 나타낼 수 있다. 간에서 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포의 수 감소는 염증 감소 및 이에 따른 치료 이익의 표시일 수 있다. 활성화된 대식세포의 수는 CD68양성 세포의 수를 측정하여 표시 또는 추정될 수 있다. 저장 세포 및 CD68양성 세포의 식별은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 실시예 9에 기술된 방법으로 수행될 수 있다.
"GCase 효소 대체 요법"은 GCase 폴리펩티드를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 임의의 요법을 지칭할 수 있다. 상기 GCase 폴리펩티드는 야생형, 예컨대 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 가진 GCase 폴리펩티드일 수 있다. 상기 GCase 폴리펩티드는 임의의 적합한 투여량으로, 선택적으로 40 내지 100 사이, 50 내지 80 사이, 60 내지 70 사이, 또는 약 60 U/kg BW의 투여량으로 투여될 수 있다. 상기 GCase 폴리펩티드는 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 선택적으로 정맥 주사 또는 피하 주사를 통해 투여될 수 있다.
적어도 X%(예컨대 적어도 20%)의 GCase 활성 수준은 정상 GCase 수준의 적어도 X%(예컨대 적어도 20%)가 예컨대 비장 또는 골수의 샘플로부터 측정된 바와 같은 범위인 GCase 활성 수준을 지칭한다. 당업자는 예컨대 건강한 대상체의 대조군 샘플과 비교하여 일상적인 임상 실습에서 측정된 정상 GCase 활성 수준의 %에 대한 참조가 의미하는 바를 쉽게 이해할 것이다.
용어 "안정한 GCase 활성" 또는 "안정한 GCase 활성 수준"은 적어도 5주의 연속 기간 동안 특정 수준 이상을 유지하는 GCase 활성 수준을 지칭한다. 즉, 상기 활성은 상기 활성 수준 초과로 변동할 수 있지만 언급된 최소 임계값 초과로 유지되는 한 여전히 안정적이라고 일컬어 질 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 GCase 활성 수준은 적어도 10주, 적어도 15주, 적어도 20주, 적어도 30주, 적어도 40주, 또는 적어도 50주의 연속 기간 동안 특정 수준 이상을 유지한다. 예컨대, 환자는 상기 활성 수준이 적어도 5주의 연속 기간 동안 적어도 20%를 유지하는 경우 적어도 20%의 안정한 GCase 활성 수준을 갖는다. 이러한 실시예에서, 상기 GCase 활성 수준은 적어도 5주 후에 계속하여 적어도 20%일 수 있고 따라서 적어도 10주, 적어도 15주, 적어도 20주, 적어도 30주 또는 적어도 40주, 또는 적어도 50주의 누적 연속 기간 동안 적어도 20%를 유지한다. 상기 GCase 활성 수준이 적어도 5주의 연속 기간 동안 특정 수준 이상을 유지하는 경우 환자는 안정한 GCase 활성 수준을 갖는다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 투여된 환자는 건강한 대상체의 GCase 활성에 비해 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40% 또는 적어도 50%의 안정한 GCase 활성 수준을 가질 수 있다. 선택적으로, 상기 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 투여된 환자는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8 또는 적어도 9 μmol/h/ml의 안정한 GCase 활성 수준을 가질 수 있다. 선택적으로, 상기 GCase 활성은 GCase에 특이적인 형광측정 기질을 사용하여 측정된다. 선택적으로, 상기 GCase 활성은 기질로서 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4MU-Glc)로 형광측정법으로 측정된다. 선택적으로, 상기 GCase 활성은 대상체의 혈청, 대식세포, 비장, 간 및/또는 골수에서 측정된다.
선택적으로, 상기 GCase 활성 수준은 상기 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여로부터 적어도 5주, 적어도 10주, 적어도 15주, 적어도 20주, 적어도 30주, 적어도 40주, 또는 적어도 50주 후 안정하다. 예컨대, 환자가 상기 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 상기 환자에 투여될 때로부터 적어도 5주 후 적어도 20%의 안정한 GCase 활성 수준을 갖는 경우, GCase 활성 수준은 적어도 20%이며 이는 투여 후 초기 적어도 5주 후 적어도 5주, 적어도 10주, 적어도 15주, 적어도 20주, 적어도 30주 또는 적어도 40주, 또는 적어도 50주의 연속 기간 동안 적어도 20%가 유지된다.
선택적으로, 상기 GCase 활성 수준은 상기 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후 적어도 5주, 적어도 10주, 적어도 20주, 적어도 30주, 적어도 40주 또는 적어도 50주의 시점에 특정 수준(예컨대 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40%; 및/또는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8 또는 적어도 9 μmol/h/ml) 이상이다. 예컨대, 상기 GCase 활성 수준은 상기 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52주의 시점에서 특정 수준(예컨대 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40%; 및/또는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8 또는 적어도 9 μmol/h/ml) 이상이다.
본 발명은 이제 단지 예시적이며 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 다음의 실시예를 참조하여 기술될 것이다.
서열 목록
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본 발명의 양태
본 발명은 다음의 양태에 추가로 기술된다.
1. GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 β-글루코세레브로시다제(GCase) 단백질 또는 이의 단편을 코딩하고 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부는 야생형이 아닌, 폴리뉴클레오티드.
2. 양태 1에 있어서, 야생형이 아닌 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 코돈-최적화된, 폴리뉴클레오티드.
3. 양태 1 또는 2에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 GCase 단백질 또는 이의 단편을 코딩하고, SEQ ID NO: 1 내지 8 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
4. 양태 1 내지 3 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1의 서열 또는 GCase 활성을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는 SEQ ID NO: 1의 변이체를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
5. 양태 4에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 1의 변이체는 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 GCase 단백질이 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 또는 최대 10개 아미노산 치환을 갖도록 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것을 제외하고 SEQ ID NO: 1과 동일한, 폴리뉴클레오티드.
6. 양태 4 또는 5에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 1의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 최대 10개, 최대 20개, 또는 최대 30개의 뉴클레오티드 치환을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
7. 양태 4 내지 6 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 1의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 또는 최대 6개의 뉴클레오티드 치환을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
8. 양태 4 내지 7 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 1의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열에 비해 최대 4개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나, SEQ ID NO: 25의 야생형 아미노산 GCase 서열에 비해 최대 3개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
9. 양태 4 내지 8 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 1의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열에 비해 최대 3개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나, SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 2개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
10. 양태 4 내지 9 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 1의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열에 비해 1개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나, SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 1개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
11. 양태 1 내지 3 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5의 서열 또는 GCase 활성을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는 SEQ ID NO: 5의 변이체를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
12. 양태 11에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 5의 변이체는 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 GCase 단백질이 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 갖도록 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것을 제외하고 각각 SEQ ID NO: 5와 동일한, 폴리뉴클레오티드.
13. 양태 11 또는 12에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 5의 변이체는 SEQ ID NO: 5의 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 최대 10개, 최대 20개, 또는 최대 30개의 뉴클레오티드 치환을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
14. 양태 11 내지 13 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 5의 변이체는 SEQ ID NO: 5의 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 또는 최대 6개의 뉴클레오티드 치환을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
15. 양태 11 내지 14 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 5의 변이체는 SEQ ID NO: 5의 서열에 비해 최대 4개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나, SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 3개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
16. 양태 11 내지 15 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 5의 변이체는 SEQ ID NO: 5의 서열에 비해 최대 3개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나, SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 2개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
17. 양태 11 내지 16 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 변이체는 SEQ ID NO: 5의 서열에 비해 1개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나, SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 1개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
18. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 또는 최대 5개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
19. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 3개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
20. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 2개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
21. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 1개의 아미노산 치환을 갖는 변이체 GCase 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
22. GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 GCase 단백질 또는 이의 단편을 코딩하고, SEQ ID NO: 1 내지 8 중 임의의 하나의 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1611개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1000개 내지 1611개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1611개 사이, 약 1494개, 또는 약 1611개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
23. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 8 중 임의의 하나의 적어도 1300개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
24. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 8 중 임의의 하나의 적어도 1300개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
25. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 8 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
26. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 8 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
27. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1의 적어도 1300개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
28. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1의 적어도 1300개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
29. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
30. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
31. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
32. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5와 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
33. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 적어도 일부가 코돈-최적화된, 폴리뉴클레오티드.
34. 양태 33에 있어서, 상기 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 인간 간 세포에서 발현하기 위해 코돈-최적화된, 폴리뉴클레오티드.
35. 양태 33에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 인간 간 세포에서 발현하기 위해 코돈-최적화된, 폴리뉴클레오티드.
36. 양태 2 내지 35 중 어느 한 양태에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 연속 부분인, 폴리뉴클레오티드.
37. 양태 2 내지 36 중 어느 한 양태에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 길이가 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 또는 약 1494개의 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
38. 양태 2 내지 37 중 어느 한 양태에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 성숙 GCase 단백질에 해당하는, 폴리뉴클레오티드.
39. 양태 2 내지 38 중 어느 한 양태에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 신호 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하지 않는, 폴리뉴클레오티드.
40. 양태 2 내지 39 중 어느 한 양태에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열 또는 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부에 해당하는 것과 비교하여 감소된 수의 CpG를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
41. 양태 40에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열 또는 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 40개 미만, 20개 미만, 18개 미만, 10개 미만, 또는 5개 미만의 CpG를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
42. 양태 41에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열 또는 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 100개의 뉴클레오티드 당 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 또는 2개 미만의 CpG를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
43. 양태 41 또는 양태 42에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열 또는 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 CpG가 없는, 폴리뉴클레오티드.
44. 양태 40 내지 43 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 9인, 폴리뉴클레오티드.
45. 양태 2 내지 44 중 어느 한 양태에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1 내지 4 중 임의의 하나의 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 또는 약 1494개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
46. 양태 45에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1 내지 4 중 임의의 하나와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
47. 양태 2 내지 46 중 어느 한 양태에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1의 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 또는 약 1494개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
48. 양태 47에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
49. 양태 2 내지 48 중 어느 한 양태에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1과 적어도 1300개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
50. 양태 49에 있어서, 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
51. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화되지 않은 부분을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
52. 양태 51에 있어서, 상기 코돈-최적화되지 않은 부분은 GCase 신호 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
53. 양태 51 또는 52에 있어서, 상기 코돈-최적화되지 않은 부분은 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 110개, 200개 미만, 170개 미만, 140개 미만, 또는 약 117개의 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
54. 양태 51 내지 53 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 코돈-최적화되지 않은 부분은 1개 이상의 CpG를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
55. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 전사 조절 인자를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
56. 양태 55에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 간-특이적 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
57. 양태 55 또는 56에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 A1AT 프로모터 또는 A1AT 프로모터의 단편을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
58. 양태 57에 있어서, 상기 A1AT 프로모터의 단편이 길이는 적어도 100개, 적어도 120개, 적어도 150개, 적어도 180개, 255개 미만, 100개 내지 255개 사이, 150개 내지 225개 사이, 150개 내지 300개 사이, 또는 180개 내지 255개 사이의 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
59. 양태 58에 있어서, 상기 A1AT 프로모터의 단편이 길이는 180개 내지 255개 사이의 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
60. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 15에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
61. 양태 60에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 15에 대해 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
62. 양태 61에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 15의 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
63. 양태 55 내지 62 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 길이가 418개 이하의 뉴클레오티드, 225개 이하의 뉴클레오티드, 또는 185개 이하의 뉴클레오티드이고 SEQ ID NO: 12를 포함하는 A1AT 프로모터의 단편을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
64. 양태 55 내지 63 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 인핸서를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
65. 양태 64에 있어서, 상기 인핸서는 HCR 인핸서 또는 HCR 인핸서의 단편인, 폴리뉴클레오티드.
66. 양태 65에 있어서, 상기 HCR 인핸서의 단편이 길이는 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 192개 미만, 80개 내지 192개 사이, 90개 내지 192개 사이, 100개 내지 250개 사이, 또는 117개 내지 192개 사이의 뉴클레오티드의 단편인, 폴리뉴클레오티드.
67. 양태 66에 있어서, 상기 HCR 인핸서의 단편이 길이는 117개 내지 192개 사이의 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
68. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
69. 양태 68에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
70. 양태 69에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 16의 인핸서를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
71. 양태 55 내지 70 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 길이가 321개 이하의 뉴클레오티드, 192개 이하의 뉴클레오티드 또는 117개 이하의 뉴클레오티드이고, SEQ ID NO: 11을 포함하는 HCR 인핸서의 단편를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
72. 양태 55 내지 71 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 SEQ ID NO: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
73. 양태 72에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 SEQ ID NO: 10의 서열을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
74. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서,
(i) 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 5와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고;
(ii) 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 12와 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터 및/또는 SEQ ID NO: 11과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8% 또는 100% 동일한 인핸서 요소를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
75. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서,
(i) 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 5와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고;
(ii) 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 10과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 전사 조절 인자를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
76. 양태 57에 있어서, 상기 A1AT 프로모터 또는 A1AT 프로모터의 단편은 길이가 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 500개 미만, 200개 내지 500개 사이, 250개 내지 500개 사이, 350개 내지 450개 사이, 또는 약 418개의 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
77. 양태 76에 있어서, 상기 A1AT 프로모터 또는 A1AT 프로모터의 단편은 길이가 350개 내지 450개 사이의 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
78. 양태 65에 있어서, 상기 HCR 인핸서 또는 HCR 인핸서의 단편은 길이가 적어도 150개, 적어도 190개, 적어도 230개, 400개 미만, 150개 내지 400개 사이, 190개 내지 370개 사이, 230개 내지 340개 사이, 250개 내지 340개 사이, 또는 약 321개의 뉴클레오티드의 단편인, 폴리뉴클레오티드.
79. 양태 78에 있어서, 상기 HCR 인핸서 또는 HCR 인핸서의 단편은 길이가 250개 내지 340개 사이의 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
80. 양태 55 내지 79 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 SEQ ID NO: 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
81. 양태 80에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 SEQ ID NO: 14의 서열을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
82. 양태 1 내지 56 또는 76 내지 79 중 어느 한 양태에 있어서,
(i) 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 5와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고;
(iii) 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 14와 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 전사 조절 인자를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
83. 양태 1 내지 56 또는 76 내지 79 중 어느 한 양태에 있어서,
(i) 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 5와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고;
(ii) 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO. 15와 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터 및/또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8% 또는 100% 동일한 인핸서 요소를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
84. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase는 다른 동일한 참조 폴리뉴클레오티드에서 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase에 비해 높은 수준으로 인간 간 세포에서 발현되는, 폴리뉴클레오티드.
85. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase는 참조 폴리뉴클레오티드에서 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase에 비해 인간 간 세포에서 적어도 1.1×, 적어도 1.2×, 적어도 1.3×, 적어도 1.4×, 또는 적어도 1.5× 더 높게 발현되는, 폴리뉴클레오티드.
86. 양태 84 또는 85에 있어서, 상기 참조 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 9의 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
87. 양태 86에 있어서, 상기 참조 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 13의 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
88. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 상기 GCase는 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 13의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 다른 동일한 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 GCase에 비해 더 높거나 비-통계학적으로 현저하게 상이한 수준으로 인간 간 세포에서 발현되는, 폴리뉴클레오티드.
89. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
90. 전술한 양태 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는, 바이러스 입자.
91. 양태 90에 있어서, AAV, 아데노바이러스, 또는 렌티바이러스 바이러스 입자인, 바이러스 입자
92. 양태 91에 있어서, AAV 바이러스 입자인, 바이러스 입자.
93. 양태 90 내지 92 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 바이러스 입자는 간-트로픽 또는 CNS-트로픽 캡시드를 포함하는, 바이러스 입자.
94. 양태 93에 있어서, 상기 간-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 19 또는 20의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개 사이, 650개 내지 736개 사이, 또는 700개 내지 736개 사이의 아미노산의 단편에 대해 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
95. 양태 94에 있어서, 상기 간-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 19와 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
96. 양태 94에 있어서, 상기 간-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 20과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
97. 양태 93에 있어서, 상기 CNS-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 21과 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개 사이, 650개 내지 736개 사이 또는 700개 내지 736개 사이의 아미노산의 단편에 대해 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
98. 양태 97에 있어서, 상기 CNS-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 21과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
99. 양태 90 내지 98 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 재조합 게놈은
a) AAV2 ITR;
b) 폴리 A 서열; 및/또는
c) 인트론을 추가로 포함하는, 바이러스 입자.
100. 양태 99에 있어서, 상기 재조합 게놈은 단일-가닥인, 바이러스 입자.
101. 양태 90 내지 100 중 어느 한 양태에 있어서, Huh-7 세포 내로 형질도입 시, 상기 바이러스 입자는 형질도입된 세포에서의 GCase 활성이 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다른 동일한 바이러스 입자로 형질도입된 세포에서의 GCase 또는 이의 단편의 활성보다 더 크도록 GCase 또는 이의 단편을 발현하는, 바이러스 입자.
102. 양태 90 내지 101 중 어느 한 양태에 있어서, Huh-7 세포 내로 형질도입 시, 상기 바이러스 입자는 형질도입된 세포에서의 GCase 활성이 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다른 동일한 바이러스 입자로 형질도입된 세포에서의 GCase 또는 이의 단편의 활성보다 적어도 2×, 적어도 3×, 적어도 4×, 적어도 5×, 적어도 10×, 또는 적어도 20× 더 크도록 GCase 또는 이의 단편을 발현하는, 바이러스 입자.
103. 양태 101 또는 102에 있어서, 상기 활성은 GCase에 대해 특이적인 형광측정(fluorometric) 기질을 사용하여 측정되는, 바이러스 입자.
104. 전술한 양태 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 입자 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 조성물.
105. 치료 방법에 사용하기 위한 전술한 양태 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
106. 양태 105에 있어서, 상기 치료 방법은 유효량의 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드, 조성물 또는 바이러스 입자를 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
107. 유효량의 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드, 조성물 또는 바이러스 입자를 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
108. 치료에서 사용하기 위한 약제의 제조에서 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도.
109. 양태 108에 있어서, 상기 치료 방법은 유효량의 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 입자를 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 용도.
110. 양태 105 내지 109 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 치료 방법은 GCase 결핍과 관련된 질환의 치료 방법인, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 조성물, 용도, 또는 방법.
111. 양태 105 내지 109 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 치료 방법은 파킨슨 병의 치료 방법인, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 조성물, 용도, 또는 방법.
112. 양태 105 내지 109 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 치료 방법은 고셔병 치료 방법인, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 조성물, 용도, 또는 방법.
113. 양태 112에 있어서, 상기 고셔병은 고셔병 유형 I인, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 조성물, 용도, 또는 방법.
114. 양태 112에 있어서, 상기 고셔병은 고셔병 유형 II인, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 조성물, 용도, 또는 방법.
115. 양태 112에 있어서, 상기 고셔병은 고셔병 유형 III인, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 조성물, 용도, 또는 방법.
116. 양태 112 내지 115 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 환자는 상기 환자가 이전에 효소 대체 요법의 일부로서 치료받은 재조합 GCase에 대해 항체 또는 억제제를 가지고 있는, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 조성물, 용도, 또는 방법.
117. 대상체에서 안정한 GCase 활성을 달성하기 위한 약제의 제조에서 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도.
118. GCase 효소 대체 요법 생체이용률에 비해 대상체에서 더 큰 GCase 생체이용률을 제공하는 방법을 제공하기 위한 약제의 제조에서 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도로서, 상기 생체이용률은 투여로부터 2주 기간에 걸쳐 측정되는, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도.
119. 대상체에 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하여 대상체에서 안정한 GCase 활성을 달성하는, 방법,
120. 대상체에 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하여 GCase 효소 대체 요법으로부터의 생체이용률에 비해 대상체에서 더 큰 GCase 생체이용률을 제공하는 방법으로서, 상기 생체이용률은 투여로부터 2주 기간에 걸쳐 측정되는, 방법.
121. 양태 117 내지 120 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 대상체에서 안정한 GCase 활성을 달성하는 단계 또는 대상체에서 더 큰 GCase 생체이용률을 제공하는 단계는 대상체에서 질환을 치료하는, 방법 또는 용도.
122. 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열을 발현하고 대상체에서 안정한 GCase 활성을 달성하는 방법에 사용하기 위한, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
123. 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열을 발현하고 GCase 효소 대체 요법으로부터의 생체이용률에 비해 대상체에서 더 큰 GCase 생체이용률을 제공하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 생체이용률은 투여로부터 2주 기간에 걸쳐 측정되는, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
124. 양태 122 또는 123에 있어서, 안정한 GCase 활성을 달성하는 단계 및/또는 더 큰 GCase 생체이용률을 제공하는 단계는 대상체의 질환 치료를 야기하는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
125. 양태 117 내지 124 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GCase 활성 및/또는 생체이용률은 GCase에 특이적인 형광측정 기질을 사용하여 측정되는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
126. 양태 117 내지 125 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GCase 활성은 대상체의 혈청 또는 혈장에서 측정되는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
127. 양태 117 내지 126 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GCase 활성이 대상체의 대식세포에서 측정되는 것인 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
128. 양태 117 내지 127 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GCase 활성은 대상체에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 또는 적어도 9 μmol/h/ml의 수준에서 안정한, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
129. 양태 117 내지 128 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GCase 활성은 대상체에서 적어도 3 μmol/h/ml의 수준에서 안정한, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
130. 양태 117 내지 129 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GCase 활성은 대상체에서 적어도 5 μmol/h/ml의 수준에서 안정한, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
131. 양태 117 내지 130 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GCase 활성은 대상체에서 적어도 9 μmol/h/ml의 수준에서 안정한, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
132. 양태 117 내지 131 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 방법은 대상체에 유효 용량의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
133. 양태 117 내지 132 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 안정한 GCase 활성은 건강한 대상체의 GCase 활성에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%의 GCase 활성인, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
134. 양태 117 내지 133 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 안정한 GCase 활성은 건강한 대상체의 GCase 활성에 비해 10% 내지 100% 사이, 20% 내지 90% 사이, 30% 내지 70% 사이, 40% 내지 70% 사이, 또는 50% 내지 70% 사이의 GCase 활성인, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
135. 양태 117 내지 134 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 5주 동안 안정한, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
136. 양태 117 내지 135 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 10주 동안 안정한, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
137. 양태 117 내지 136 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 15주 동안 안정한, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
138. 양태 117 내지 137 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 20주 동안 안정한, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
139. 양태 117 내지 138 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 25주 동안 안정한, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
140. 양태 117 내지 139 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 30주 동안 안정한, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
141. 양태 117 내지 140 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 35주 동안 안정한, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
142. 양태 117 내지 141 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 안정한 GCase 활성은 투여 후 적어도 40주 동안 안정한, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
143. 양태 117 내지 142 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 방법은 유효량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 측정된 활성과 비교할 때, 투여 후 동일한 시점에서 동일한 분석법으로 측정할 때, 대상체의 간, 비장, 및/또는 골수에서 투여 후 적어도 5주, 적어도 10주, 적어도 15주, 적어도 20주, 적어도 25주, 적어도 30주, 또는 적어도 35주에 더 큰 GCase 활성을 달성하는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
144. 양태 117 내지 143 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 방법은 유효량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 측정된 생체이용률과 비교할 때, 투여 후 동일한 시점에서 동일한 분석법으로 측정할 때, 투여 후 적어도 5주, 적어도 10주, 적어도 15주, 적어도 20주, 적어도 25주, 적어도 30주, 또는 적어도 35주의 기간에 걸쳐 대상체의 간 비장 및/또는 골수에서 더 큰 GCase 생체이용률을 달성하는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
145. 양태 118, 120 또는 123 내지 144 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GCase 효소 대체 요법은 SEQ ID NO: 25의 서열을 갖는 GCase 폴리펩티드의 투여를 포함하는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
146. 양태 145에 있어서, 상기 GCase 효소 대체 요법은 40 내지 100 사이, 50 내지 80 사이, 60 내지 70 사이, 또는 약 60 U/kg BW의 용량으로 GCase 폴리펩티드의 투여를 포함하는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
147. 양태 121 또는 124 내지 146 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 질환은 고셔병인, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
148. 양태 147에 있어서, 상기 고셔병은 고셔병 유형 I인, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
149. 양태 147에 있어서, 상기 고셔병은 고셔병 유형 II인, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
150. 양태 147에 있어서, 상기 고셔병은 고셔병 유형 III인, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
151. 양태 117 내지 150 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 환자는 상기 환자가 효소 대체 요법의 일부로서 이전에 치료받은 재조합 GCase에 대해 항체 또는 억제제를 가지고 있는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
152. GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준을 감소시키기 위한 약제의 제조에서 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태의 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도.
153. 대상체에 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하여 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준을 감소시키는, 방법.
154. 양태 152 또는 153에 있어서, 대상체에서 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준 감소는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 치료하는, 용도 또는 방법.
155. 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태에 있어서, GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준 감소는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 치료하는, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
156. 양태 152 내지 155 중 어느 한 양태에 있어서, 양태 1 내지 104 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 시점에서 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준과 비교할 때 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 2 내지 3배, 2 내지 4배, 2 내지 5배, 2 내지 6배, 또는 3 내지 5배 감소하는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
157. 양태 152 내지 156 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준 감소는 대상체에 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법을 투여하여 달성된 감소보다 더 크고, 선택적으로 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주에 측정될 때인, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
158. 양태 157에 있어서, 상기 GCase 효소 대체 요법은 SEQ ID NO: 25의 서열을 갖는 GCase 폴리펩티드의 투여를 포함하는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
159. 양태 158에 있어서, 상기 GCase 효소 대체 요법은 40 내지 100 사이, 50 내지 80 사이, 60 내지 70 사이, 또는 약 60 U/kg BW의 용량으로 GCase 폴리펩티드의 투여를 포함하는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
160. 양태 152 내지 159 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 대상체의 대식세포에서 측정되는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
161. 양태 152 내지 160 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 대상체의 비장에서 측정되는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
162. 양태 152 내지 161 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 대상체의 간에서 측정되는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
163. 양태 152 내지 162 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 대상체의 혈청에서 측정되는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
164. 양태 152 내지 163 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 질량 분석법(mass spectrometry)으로 측정되는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
165. 양태 152 내지 164 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 질환은 고셔병인, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
166. 양태 165에 있어서, 상기 고셔병은 고셔병 유형 I인, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
167. 양태 165에 있어서, 상기 고셔병은 고셔병 유형 II인, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
168. 양태 165에 있어서, 상기 고셔병은 고셔병 유형 III인, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
169. 양태 152 내지 168 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 환자는 상기 환자가 이전에 효소 대체 요법의 일부로서 치료받은 재조합 GCase에 대해 항체 또는 억제제를 가지고 있는, 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 용도 또는 방법.
본 발명의 추가 양태
본 발명은 또한 다음의 양태에 기술된다.
1. GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 β-글루코세레브로시다제(GCase) 단백질 또는 이의 단편을 코딩하고, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부는 야생형이 아니고, 선택적으로 야생형이 아닌 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 코돈-최적화되었고, 보다 선택적으로 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 GCase 단백질 또는 이의 단편을 코딩하고, SEQ ID NO: 1 내지 8 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
2. GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 GCase 단백질 또는 이의 단편을 코딩하고, SEQ ID NO: 1 내지 8 중 임의의 하나의 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1611개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1000개 내지 1600개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1611개 사이, 약 1494개, 또는 약 1611개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
3. 양태 1 또는 2에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부는 코돈-최적화된, 폴리뉴클레오티드.
4. 양태 3에 있어서,
(a) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부는 인간 간 세포에서 발현하기 위해 코돈-최적화;
(b) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 연속(contiguous) ;
(c) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 길이가 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 또는 약 1494개의 뉴클레오티드;
(d) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 성숙 GCase 단백질;
(e) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 신호 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하지 않음;
(f) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열 또는 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부에 해당하는 것과 비교하여 감소된 수의 CpG를 포함하고; 선택적으로 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열 또는 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 40개 미만, 20개 미만, 18개 미만, 10개 미만, 또는 5개 미만의 CpG를 포함하고, 보다 선택적으로 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열 또는 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 100개의 뉴클레오티드 당 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 또는 2개 미만의 CpG를 포함하고, 보다 선택적으로 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열 또는 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 CpG가 없고, 바람직하게 상기 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 9; 및/또는
(g) 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1 내지 4 중 임의의 하나의 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 또는 약 1494개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
5. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화되지 않은 부분을 포함하고, 선택적으로
(a) 상기 코돈-최적화되지 않은 부분은 GCase 신호 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩;
(b) 상기 코돈-최적화되지 않은 부분은 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 110개, 200개 미만, 170개 미만, 140개 미만, 또는 약 117개의 뉴클레오티드; 및/또는
(c) 상기 코돈-최적화되지 않은 부분은 1개 이상의 CpG를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
6. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 전사 조절 인자를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 전사 조절 인자는 간-특이적 프로모터 및/또는 인핸서를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
7. 양태 6에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 A1AT 프로모터 또는 A1AT 프로모터의 단편을 포함하고, 선택적으로
(a) 상기 A1AT 프로모터 또는 A1AT 프로모터의 단편은 길이가 적어도 100개, 적어도 120개, 적어도 150개, 적어도 180개, 255개 미만, 100개 내지 255개 사이, 150개 내지 225개 사이, 150개 내지 300개 사이, 또는 180개 내지 255개 사이의 뉴클레오티드이고, 보다 선택적으로 상기 A1AT 프로모터의 단편은 길이가 180개 내지 255개 사이의 뉴클레오티드;
(b) 상기 A1AT 프로모터 또는 A1AT 프로모터의 단편은 길이가 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 500개 미만, 200개 내지 500개 사이, 250개 내지 500개 사이, 350개 내지 450개 사이, 또는 약 418개의 뉴클레오티드이고, 보다 선택적으로 상기 A1AT 프로모터의 단편은 길이가 350개 내지 450개 사이의 뉴클레오티드;
(c) 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 15에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 상동성인 프로모터;를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
8. 양태 6 또는 7에 있어서, 상기 인핸서가 HCR 인핸서 또는 HCR 인핸서의 단편이고, 선택적으로
(a) 상기 HCR 인핸서 또는 상기 HCR 인핸서의 단편은 길이가 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 192개 미만, 80개 내지 192개 사이, 90개 내지 192개 사이, 100개 내지 250개 사이, 또는 117개 내지 192개 사이의 뉴클레오티드의 단편이고, 보다 선택적으로 상기 HCR 인핸서의 단편은 길이가 117개 내지 192개 사이의 뉴클레오티드의 단편이고;
(b) 상기 HCR 인핸서 또는 상기 HCR 인핸서의 단편은 길이가 적어도 150개, 적어도 190개, 적어도 230개, 400개 미만, 150개 내지 400개 사이, 190개 내지 370개 사이, 230개 내지 340개 사이, 250개 내지 340개 사이, 또는 약 321개의 뉴클레오티드의 단편이고, 보다 선택적으로 상기 HCR 인핸서의 단편은 길이가 250개 내지 340개 사이의 뉴클레오티드이고;
(c) 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
9. 양태 6에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 SEQ ID NO: 10 또는 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
10. 전술한 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 상기 GCase는 다른 동일한 참조 폴리뉴클레오티드에서 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase에 비해 높은 수준으로 인간 간 세포에서 발현되고, 선택적으로 상기 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 상기 GCase는 다른 동일한 참조 폴리뉴클레오티드에서 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase에 비해 인간 간 세포에서 적어도 1.1×, 적어도 1.2×, 적어도 1.3×, 적어도 1.4×, 또는 적어도 1.5× 더 높게 발현되고, 보다 선택적으로 상기 참조 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 9의 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 선택적으로 상기 참조 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 13의 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
11. 전술한 양태 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는, 바이러스 입자.
12. 양태 11에 있어서, AAV, 아데노바이러스, 또는 렌티바이러스 바이러스 입자이고, 선택적으로 AAV 바이러스 입자인, 바이러스 입자.
13. 양태 11 내지 12 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 바이러스 입자는 간-트로픽 또는 CNS-트로픽 캡시드를 포함하는, 바이러스 입자.
14. 양태 13에 있어서, 상기 간-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 19, 20 또는 24의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개 사이, 650개 내지 736개 사이 또는 700개 내지 736개 사이의 아미노산의 단편에 대해 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%인 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
15. 양태 13에 있어서, 상기 CNS-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 21의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개 사이, 650개 내지 736개 사이 또는 700개 내지 736개 사이의 아미노산의 단편에 대해 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%인 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
16. 양태 11 내지 15 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 재조합 게놈은
a) AAV2 ITR;
b) 폴리 A 서열; 및/또는
c) 인트론을 추가로 포함하고;
선택적으로 상기 재조합 게놈은 단일-가닥인, 바이러스 입자.
17. 양태 11 내지 16 중 어느 한 양태에 있어서, Huh-7 세포 내로 형질도입 시, 상기 바이러스 입자는 형질도입된 세포에서의 GCase 활성이 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다른 동일한 바이러스 입자로 형질도입된 세포에서의 GCase 또는 이의 단편의 활성보다 더 크도록 GCase 또는 이의 단편을 발현하고, 선택적으로 Huh-7 세포 내로 형질도입 시, 상기 바이러스 입자는 형질도입된 세포에서의 GCase 활성이 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다른 동일한 바이러스 입자로 형질도입된 세포에서의 GCase 또는 이의 단편의 활성보다 적어도 2×, 적어도 3×, 적어도 4×, 적어도 5×, 적어도 10×, 또는 적어도 20× 더 크도록 GCase 또는 이의 단편을 발현하고, 보다 선택적으로 상기 활성이 GCase에 대해 특이적인 형광측정(fluorometric) 기질을 사용하여 측정되는, 바이러스 입자.
18. 전술한 양태 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 입자 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 조성물.
19. 치료 방법에 사용하기 위한 전술한 양태 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
20. 양태 19에 있어서, 상기 치료 방법은 유효량의 양태 1 내지 17 중 어느 한 양태의 폴리뉴클레오티드, 조성물 또는 바이러스 입자를 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
21. 양태 19 내지 20 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 치료 방법은 GCase 결핍과 관련된 질환의 치료 방법인, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
22. 양태 19 내지 20 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 치료 방법은 파킨슨 병의 치료 방법인, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
23. 양태 19 내지 20 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 치료 방법은 고셔병 치료 방법인, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
24. 양태 23에 있어서, 상기 고셔병은 고셔병 유형 I, II 또는 III인, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
25. 양태 23 내지 24 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 환자는 상기 환자가 효소 대체 요법의 일부로서 이전에 치료받은 재조합 GCase에 대해 항체 또는 억제제를 가지고 있는, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
실시예
실시예 1 - 방법
달리 명시되지 않는 한, 하기 실시예에서 다음의 일반적인 방법을 따랐다.
rAAV 생산
HEK293T 세포를 AAV Rep 및 Cap을 코딩하는 플라스미드, 및 아데노바이러스 헬퍼 기능뿐만 아니라 GBA 구조물을 함유하는 재조합 게놈으로 일시적으로 형질감염시켜 AAV2/8 입자를 생산하였다. AAV2/8 입자를 aPOROS CaptureSelect 친화도 컬럼으로 정제하고 qPCR로 적정하고 알칼리성 겔 분석으로 특성분석하였다.
마우스 연구 설계
간세포-특이적 프로모터의 전사 제어 하에 GBA 전달유전자를 운반하는 AAV 바이러스 입자를 6 내지 8주령의 야생형(C57BL/6) 수컷 마우스의 미정맥에 투여하였다. AAV 용량은 각 연구에 대해 본원에서와 같이, 6 × 1011 vg/kg 내지 6 × 1012 vg/kg의 범위였다. 각 실험에 대해, 추가 동물 군을 비처리로 두어 치료 효과에 대한 대조군으로 사용하였다. 전달 유전자 발현의 동역학 및 지속성을 평가하기 위해, 주사 후 다양한 시간 간격(4주, 8주, 및 12주)에서 혈청 GCase 수준을 측정하였다. AAV 처리 후 12주까지 마우스를 추적하고 생화학적 및 병리학적 분석을 위해 희생시켰다.
혈청 및 조직 GBA 활성 검정
기질로서 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4MU-Glc)를 사용하여 형광측정법으로 β-글루코세레브로시다제(산성 β-글루코시다제; GCase) 활성을 결정하였다. 마우스 혈액으로부터 혈청 샘플을 수득하고 -80℃에 저장하였다. 조직(간, 비장, 골수)을 수확하고 급속 동결하고 용해하였다. 기질로서 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4MU-Glc)를 사용하여 형광측정법으로 β-글루코세레브로시다제(산성 β-글루코시다제, GCase) 활성을 결정하였다. 분석 당일에, 혈청을 희석하고(0.5 μL, 1 : 50) 50 mM 쇼듐 시트레이트, 25 mM 타우로콜레이트, pH = 5.75, 6 mM 4MU-Glc 중에서 37℃에서 30분 동안 분석하였다. 조직 샘플의 경우, 상기 조직 단백질 용해물을 직접 분석하였다. 1 부피(100 μl)의 정지 용액(0.5 M 글리신, 0.3 M NaOH, pH 10.0)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 각각 365 nm 및 445 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 Spectramax I3X(Molecular devices)로 상대 형광 수준(RFU)을 평가하였다. 이어서 4-메틸움벨리페론(4-MU, Sigma-Aldrich) 표준 곡선을 기준으로 형광 수준을 나노몰/h/mL(혈청) 또는 nmol/h/mg의 총 단백질(조직)로 변환하였다.
벡터 게놈 복제본 수
rAAV 주사 후 간 세포 당 벡터 게놈의 수를 결정하기 위해, QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 동결 간 샘플로부터 DNA를 단리하였다. DNA 단리 후, LSP-S 및 LSP-L 프로모터 둘 모두에 공통인 영역에 결합하는 프라이머 세트를 사용하여 qPCR을 수행하여 AAV 복제본 수를 추정하였다.
면역조직화학
토끼 항-인간 GCase(Abcam ab125065; 1 : 100)를 사용하여 마우스 조직에서 GCase를 시각화하였다. 랫트 항-F4/80(Abcam ab6640; 1 : 100)을 사용하여 마우스 대식세포를 시각화하였다. 포르말린-고정된 마우스 조직을 자일렌 및 에탄올 세척으로 파라핀을 제거한 다음, Ventana CC1 제품 사용 권장사항에 따라 항원 검색하였다. Ventana DAB Map 검출 키트(760-124)를 사용하여, Ventana Discovery XT 기기에서 면역조직화학 염색을 수행하였다. 절편을 헤마톡실린으로 대조염색하였다. FITC- 및 Texas 레드-접합된 2차 항체를 면역형광 염색 동안 사용하였다. DAPI를 사용하여 핵을 시각화하였다. 공초점 형광 현미경(Zeiss)으로 신호를 시각화하였다.
Huh-7 형질감염 및 역가(potency) 분석
형질감염 전날, 간 간세포주 Huh-7을 12 웰 플레이트에 웰 당 3 × 105 세포의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 형질감염을 위해, 10%의 혈청(우 태아 혈청, FBS)의 존재 하에 FuGENE을 플라스미드 μg 당 4 μl의 비율로 사용하여 Huh-7 세포에 밤새 첨가하였다. 형질감염 배지를 교체하고, 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS: Insulin-Transferrin-Selenium, ThermoFisher Scientific) 및 25 mM Hepes 완충액으로 보충된 배지로 세포를 24시간 동안 인큐베이션하였다. 혈청의 존재 하에 24시간 동안 정의된 다중 감염도(MOI: multiplicity of infection)로 Huh-7 세포 형질도입을 수행한 다음, 배지를 교체하고 신선한 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 20 μl의 배지를 사용하여 전술한 바와 같이 기질로서 4MU-Glc를 사용하여 GCase 활성을 측정하였다.
통계 분석
Prism 7(Graph Pad) 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 일원 ANOVA로 컬럼 분석을 수행하였다. P-값 및 샘플 크기가 도면 설명에 나타나 있다.
생체이용률(AUC)을 근사하기 위해, 단상 감괴 모델(one-phase decay model) 방적식: Y = (Y0 - Plateau)*exp(-K*X) + Plateau를 GraphPad Prism에서 사용하였다. Y0은 X(시간)이 0일 때의 Y-값이고 이는 Y와 동일한 단위로 표현된다. Plateau는 무한대 시간의 Y-값이며, Y와 동일한 단위로 표현된다. K는 속도 상수이며, X-축 시간 단위의 역수로 표현된다(즉, X가 분인 경우, K는 분-1로 표현됨). Tau는 시간 상수이며, X-축과 동일한 단위로 표현되고 K의 역수로 계산된다. 반감기는 X-축의 시간 단위에서이고, ln(2)/K로 계산된다. Span은 Y0과 Plateau 사이의 차이이며, Y-값과 동일한 단위로 표현된다. AUC 계산에 선형 사다리꼴 방법을 사용하였다. AUC는 U*h/L 로 표현되고 여기서 1 단위는 37℃에서 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드 기질의 1 μmol/h를 가수분해하는데 필요한 효소의 양으로 정의된다.
실시예 2 - GBA 구조물
간-유도된 유전자 치료 접근법이 고셔병(GD)을 치료하는데 사용될 수 있는지를 평가하기 위해, 인간 전장 GBA 코딩 서열(GenBank accession no. NM_000157.3으로 식별됨; SEQ ID NO: 9)을 간-특이적 프로모터-유도된 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 내로 클로닝하였다. FLF-PL01 AAV 구조물(도 1a)에서 상기 GBA 야생형 서열(GBAwt, 코돈-최적화되지 않음)을 본원에서 'LSP-S'(SEQ ID NO: 10)로 지칭되는 간-특이적 프로모터로 유도하였다. 발현에 대한 서열 최적을 결정하기 위해, 다수의 상이한 코돈 최적화 전략을 사용하여 서열을 설계하였다. 일 실시예 AAV 구조물(FLF-PL28)에서 GBA 코돈 서열을 최적화하고 동일한 간 특이적 프로모터 LSP-S(도 1b)로 유도하였다. FLF-PL64 구조물은 FLF-PL28과 동일한 GBA 코돈-최적화된 서열을 함유하지만 본원에서 LSP-S 대신 'LSP-L'(SEQ ID NO: 14)로 지칭되는 더 긴 전사 조절 인자를 함유한다는 점에서 다르다(도 1c).
실시예 3 - 야생형 GBA 전달 유전자 발현 분석
(야생형) GBA 구조물 FLF-PL01이 간 발현을 야기하여 β-글루코세레브로시다제(GCase)가 혈류로 후속 분비될 수 있는지를 평가하기 위해, FLF-PL01을 AAV2/8로 위형화(pseudotyped) 하였다. 전술한 바와 같이 rAAV 입자를 생성하고 적정하고, 마우스에서 사용하기 전에, 알칼리성 겔 분석으로 특성분석하였다. 8주령 야생형(C57BL/6) 마우스를 6 × 1011 내지 6 × 1012 vg/kg 범위의 용량으로 AAV2/8-FLF-PL01을 단회 주사로 처리하였다. 대조군(나이브) 마우스를 비처리된 채로 두었다. AAV 주입 후 4, 8, 및 12주에 혈청 샘플을 수집하고 순환 활성 GCase의 수준을 평가하기 위해 사용하였다. GCase 활성을 결정하고 전술한 바와 같이 면역조직화학 염색을 수행하였다. 절편을 헤마톡실린으로 대조염색하였다.
AAV2/8-FLF-PL01을 야생형 마우스에 주입한 결과 처리된 동물의 간에서 인간 GCase의 발현이 증가하였다(도 2a). 간에서 GCase의 발현 증가는 벡터 용량 증가와 함께 관찰될 수 있으며, 6 × 1011 vg/kg의 벡터 용량 군에서 약 12배 증가, 2 × 1012 vg/kg의 용량에서 43배 증가, 및 6 × 1012 vg/kg의 용량에서 57배 증가가 관찰되었다(도 2b). 이러한 데이터는 AAV2/8-FLF-PL01이 GCase를 혈류로 크게 방출시키고 GD 영향을 받은 조직에서 대식세포에 대한 접근을 허용하는 수준으로 GCase의 발현을 유도함을 보여준다.
실시예 4 - 코돈-최적화된 구조물로부터 시험관 내 GCase 발현 분석
다양한 간 발현된 서열의 코돈 사용 표를 사용하여 성숙한 GCase 단백질에 해당하는(그러나 신호 펩티드 코딩 영역은 아님) 스트레치 전체에 걸쳐 코돈 최적화된 GBA 서열을 생성하였다. 이러한 코돈-최적화된 GBA 서열('FLF-PL36') 중 하나를 제외하고, 생성된 서열을 이어서 CpG, 잠복 스플라이스 부위, 조기 정지 코돈 및 원치 않는 아미노산 치환을 제거하기 위해 수동으로 추가로 변경하였다. 21개의 코돈-최적화된 GBA 서열을 생성하였고 인간 간 세포주 Huh-7에서 형질감염 시 GCase 발현 수준에 대해 시험하였다. Huh-7 세포를 웰 당 3 × 105의 세포 밀도로 12 웰 플레이트에 플레이팅하고 전술한 바와 같이 형질감염시켰다. 20 마이크로리터의 배지를 사용하고 기질로서 4MU-Glc를 사용하여 GCase 활성을 측정하였다. 이러한 분석 결과로부터 Huh-7 세포에서 형질감염될 때 GCase의 발현 증가(야생형 GBA 서열 FLF-PL01 대비)를 입증하는 GBA 코돈-최적화(FLF-PL21, -PL28, -PL30, 및 -PL36)를 확인할 수 있다(도 3).
실시예 5 - 코돈-최적화된 구조물의 생체 내 GCase 활성 분석
실시예 4에서 확인된 4개의 구조물(FLF-PL21, FLF-PL28, FLF-PL30 및 FLF-PL36)을 AAV2/8로 위형화(pseudotyped) 하고 야생형 마우스에 2 × 1012 vg/kg의 용량으로 주입하였다. 또한, 코돈-최적화되지 않은 구조물 FLF-PL01뿐만 아니라, 강력한 합성 프로모터 CAG에 의해 유도된 FLF-PL01과 동일한 야생형 GBA 서열을 함유하는 구조물(FLF-PL37)도 본 실험에 포함시켰다. 대조군(나이브) 마우스를 비처리된 채로 두었다. 주입 후 최대 36주 시점에, 동물을 희생시키고, 혈청 및 조직 샘플을 수집하였다.
도 4a는 LSP-S 프로모터(FLF-PL01)에 의해 유도된 코돈-최적화되지 않은 GBA 서열, 역시 LSP-S 프로모터에 의해 유도된 코돈-최적화된 GBA 구조물(FLF-PL21, FLF-PL28, FLF-PL30 및 FLF-PL36), 및 CAG 프로모터(FLF-PL37)에 의해 유도된 GBA 코돈-최적화되지 않은 서열을 주입한 마우스에서 확인된 GCase 활성의 주입 후 8주차에서의 결과를 나타낸다. 4개의 GBA 코돈-최적화된 구조물 모두는 마우스에 주사했을 때 FLF-PL01에 비해, 혈류에 존재하는 GCase 활성 수준이 증가하는 것(도 4a)으로 나타났다. FLF-PL28 구조물은 동일한 LSP-S 프로모터(FLF-PL01)에 의해 유도된 코돈-최적화되지 않은 구조물에 비해 혈류로 방출되는 GCase의 가장 큰 증가(약 6배)를 나타냈다. FLF-PL01에 비해 FLF-PL28에 의해 유도된 GCase의 상승된 수준이 36주 연구 기간에 걸쳐 관찰되었다(도 4b).
특히, 간-특이적 프로모터-함유 FLF-PL28이 주입된 마우스에서 관찰된 GCase의 수준은 야생형 GBA 서열이 보편적이고(ubiquitous) 강력한 CAG 프로모터로부터 발현되는 FLF-PL37 구조물에 의해 유도된 GCase 수준만큼 높았다(도 4a).
말기에, 비장 및 골수를 수집하여 포르말린에 고정시킨 다음, 파라핀에 포매하였다. 파라핀 절편 상에서 수행된 GBA 면역염색 분석은, 순환 GCase 수준과 일치하여, GCase의 조직 흡수가 코돈-최적화되지 않은 구조물 FLF-PL01에 비해 FLF-PL28 GBA 코돈-최적화된 구조물로 처리된 마우스에서 증가하는 것을 나타낸다(도 5).
FLF-PL28에 의한 간-지시된 GBA 발현 시 비장의 대식세포 흡수 수준을 평가하기 위해, 마우스 범-대식세포 마커 F4/80 및 GBA 항체를 사용하여 면역형광 분석을 수행하였다. F4/80 양성 세포 대부분은 인간-특이적 GBA의 발현을 나타냈으며, 이는 비장에서의 대부분의 GCase 흡수가 대식세포에서 발생함을 시사한다(도 6).
실시예 6 - 생체 내 GCase 활성에 대한 프로모터 영향 분석
프로모터 조작이 GBA 코돈-최적화된 서열로부터의 발현을 추가로 증가시킬 수 있는지 시험하기 위해, FLF-PL28의 GBA 구조물을 간-특이적 프로모터(본원에서 'LSP-L'로 지칭됨; SEQ ID NO: 14) 하에 두어 구조물 FLF-PL64(실시예 2, 도 1c)를 생산하였다.
AAV2/8 벡터를 새로운 구조물로 제조하였고 2 × 1012 vg/kg의 용량으로 야생형 마우스에 주입하였다. 대조군(나이브) 마우스를 비처리 상태로 두었다. 5주 후, 동물을 희생시키고, 혈청 및 조직을 수집하였다.
혈청에서 GCase 활성 분석은 AAV2/8-FLF-PL64가 AAV2/8-FLF-PL28로 처리된 마우스와 비교하여 마우스 혈류에서 GCase의 발현을 증가시킨다(약 2.5배, P = 0.0001, 일원 ANOVA)(도 7).
구조물 FLF-PL28과 마찬가지로, FLF-PL64는 비장, 골수 및 폐와 같은 GD 표적 조직으로 GCase의 강력한 흡수를 허용한다(도 8).
실시예 7 - GBA 구조물을 가진 AAV 벡터로부터의 간 발현 선택성
간 세포주에 대한 LSP-L 프로모터의 선택성을 분석하기 위해, 다양한 조직에서 8개의 인간-유래 세포주를 선택하였다. 각 세포주와 그 기원에 대한 자세한 내용을 아래 표에 요약하였다.
본 실시예에서 평가된 인간-유래 세포주
세포주 기원 성장 기원 종
HUH-7 간세포 암종(간) 부착성 인간
HEK293T 신장 부착성 인간
PANC-1 췌장(상피양 암종) 부착성 인간
BxPC-3 췌장(선암종) 부착성 인간
MCF7 유방(상피; 선암종) 부착성 인간
1643 신경모세포종 부착성 인간
MRC-9 정상 폐 섬유아세포(배아) 부착성 인간
697 B-세포 백혈병(초기 B-세포) 현탁 인간
상기 표 1에 기재된 바와 같은 8개의 인간-유래 세포주를 10% FBS가 보충된 DMEM, IMDM 또는 RPMI 배지에서 성장시켰다. 각 세포주에 대해, 2 × 104 세포/웰을 AAV-FLF-PL64(간 트로픽 캡시드를 갖는 AAV = SEQ ID NO: 20)로 1 × 105 vg/세포의 다중 감염도(MOI)로 형질도입하였다. 모든 실험을 이중으로 수행하였다. 현탁액 중의 세포를 계수하고 무혈청 배지(300 μl/웰)에서 48-웰 플레이트로 형질도입하였다. 부착성 세포주의 경우, 배지를 흡인한 후, PBS(1X)로 세척하고 37℃, 5% CO2에서 5분 동안 TripLE 5ml로 처리하여 세포를 해리시켰다. 5 ml의 완전 배지를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 해리된 세포를 CountessTM II 자동 세포 계수기(Automated Cell Counter)(ThermoFisher)를 사용하여 계수하고 원심분리(5분 동안 250× g)한 다음, 2 × 105 세포/ml의 밀도로 완전 배지에 재현탁하였다. 이들 세포를 96-웰 플레이트(2 × 104 세포/웰)에 플레이팅하여 형질도입 전에 5시간 동안 부착시켰다. 형질도입 혼합물을 X-VIVO 배지(50 μl/웰)에서 제조하고 세포에 첨가하였다. 3시간 후, 완전 배지 100 μl/웰을 첨가하였다. 형질도입 하루 후, 각 세포주의 배지를 완전 배지(분비 분석을 위한 +25 mM HEPES)로 교체하였다.
GCase 활성을 기질로서 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4MU-Glc)를 사용하여 형광측정법으로 결정하였다.
GCase 활성을 AAV-FLF-PL64로 형질도입한 후 분비된 GCase의 수준을 결정하기 위해 각 세포주에 대한 배양 상등액으로부터 측정하였다(도 10). LSP-L 프로모터가 GBA 전달 유전자를 유도할 때, GCase 분비는 HUH-7 세포주에서만 검출되었다. Huh-7 세포에서 관찰된 활성 GCase의 수준은 대략 5.0 nmol/h/ml[5.1 ± 0.1 nmol/h/ml]이었다. 활성 GCase의 검출가능한 수준은 분석된 다른 세포주에 대해 관찰되지 않았다.
실시예 8 - ERT 요법과 비교
본 실시예의 목표는 FLF-PL64와 VPRIV®(60 U/kg BW)를 마우스에 단회 주사로 투여했을 때 비교하는 것이었다. VPRIV®는 천연 효소인 GCase(즉, SEQ ID NO: 25)와 동일한 아미노산 서열과 유사한 글리코실화 패턴을 포함하므로, 적절한 비교를 제공한다. 효소 대체 요법(ERT)을 받는 환자는 일반적으로 격주로 ERT의 IV 주입(1 내지 2시간 주입 지속, VPRIV®의 임상 용량은 60 U/kg임)으로 처리한다.
주사용 용액을 제조하기 위한 VPRIV® 분말(400 Units, Shire)을 수득하고 재구성할 때까지 냉장 보관 하에 유지하였고 빛으로부터 보호하였다. 1 바이알(400U)을 4.3 ml의 멸균수로 재구성하여 제조사의 권장사항과 같이 100 U/ml의 용액을 달성하였다. 재구성 후, VPRIV 용액을 즉시 1회용 분취량으로 급속동결하고 나중에 사용하기 위해 저장하였다(-80℃).
VPRIV®(60 U/kg BW) 또는 FLF-PL64(AAV2/8 입자로서 제형화됨, 2 × 1012 vg/kg)의 단회 IV 주사를 야생형 마우스에 투여하였다. 혈청 및 조직의 활성 GCase 수준을 주사 후 최대 1주 및 또한 3주 및 5주차 동안 다양한 시점에서 결정하였다. 활성 GCase의 수준을 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4MU-Glc)를 사용하여 형광측정법으로 결정하였다.
도 11a에 나타난 바와 같이, VPRIV는 쥐 혈액으로부터 신속하게 제거된다. 주사 후 2분에 VPRIV가 12.7 μmol/h/ml의 Cmax에 도달하였으며; 반감기는 약 5.6분으로 추정되었다. 주사 후 약 20분에, 혈청에서 단지 잔여 수준의 활성 GCase가 검출될 수 있었다. 이러한 수준은 연구 기간의 나머지 기간 동안 비처리된 대조군에 가깝게 유지되었다. GCase의 안정한 발현이 있는 마우스를 분석하여 VPRIV과 FLF-PL64를 비교하였다(도 11b). 또한 FLF-PL64로 처리하면 쥐 혈액에서 활성 GCase의 수준이 증가하였다(Cmax 9.4 μmol/h/ml)(도 11b). 그러나, 활성 GCase의 수준은 VPRIV® 주사 후에 관찰된 것만큼 높지 않았지만, 이러한 수준은 연구 지속기간 동안 일정하게 유지되었다. 아래 표 2는 ERT 또는 FLF-PL64 주사 후 마우스에서 2주 간격 동안 예측된 생체이용률을 나타낸다.
ERT(60 U/kg BW) 또는 AAV-FLF-PL64(2 × 10 12 vg/kg)의 단회 주사 시 C57BL/6 마우스에서 2주 간격 동안 예측된 생체이용률(AUC).
ERT (VPRIV®) FLF-PL64
AUC2week (분 U/ml) 18.6 ± 5.6 3,161.6 ± 348.2
도 12는 VPRIV® 또는 AAV2/8-FLF-PL64의 투여 후 쥐 간, 비장 및 골수에서의 GCase 면역염색을 나타낸다. 각 동물군에 대한 대표적인 이미지가 제시되어 있다. DAB(3,3'-디아미노벤지딘)를 사용하여 GCase를 시각화하고 헤마톡실린을 대조염색으로 사용하였다. FLF-PL64 처리된 샘플은 주사 후 5주차에 수득한 반면 VPRIV® 처리된 샘플은 표지된 대로 수집하였다. 이미지의 반-정량적 분석을 아래 표 3에 나타냈다.
ERT(VPRIV®) 또는 FLF-PL64 투여 후 쥐 간, 비장 및 골수에서 관찰된 GCase 면역반응성의 상대적인 수준. "-"는 GCase에 대한 음성 염색을 지칭하고; "+"는 GCase에 대한 양성 염색을 나타낸다.
군 간 비장 골수
나이브 - - -
ERT - 20분 + ++ ++
ERT - 60분 + +++ ++
ERT - 240분 + -/+ -
ERT - 1440분 -/+ - -
FLF-PL64 +++ +++ ++/+++
실시예 9 - 치료 가능성의 생체 내 연구
1. 방법
마우스 방법
Gba1 돌연변이 D409V/D409V(9V/9V)를 보유하는 9V/null 마우스를 본 연구에서 고셔병 모델로 사용하였다. 9V/null 마우스는 내장 이상(염증 및 저장 세포) 및 기질 축적이 있는 거의 정상적인 수명을 가지고 있다(문헌[Xu et al. Am J Pathol. 2003 Nov;163(5):2093-101]; 문헌[Xu et al. PLoS One. 2010 May 20;5(5):e10750]). 9V/null 마우스는 Gba1 돌연변이 D409V/D409V(9V/9V)와 Gba1 null/WT를 보유하는 마우스를 교배하여 생성하였다. 각 짚(litter)에는 약 2개의 9V/null이 생성된다. 9V/null 및 WT 마우스의 스트레인 배경(strain background)은 C57BL/6, 129SvEvBrd 및 FVB이다. 여러 짚의 9V/null 마우스를 롤링 기준으로 무작위로 각 처리군에 할당하였다. 그룹의 성별 균형을 맞추기 위해 수컷과 암컷 마우스 둘 모두를 각 그룹에 등록하였다. 모든 마우스를 병원균이 없는 조건에서 수용하였고 매일 모니터링하였고 매주 체중을 쟀다. 모든 AAV 처리된 마우스는 정상적인 성장 및 체중 증가를 나타냈다.
연구 종료 시, 마우스는 펜토바르비탈(100 mg/kg)로 안락사하였다. 마우스를 식염수로 경심관류로(transcardially) 관류시켰다. 그런 다음 간, 비장 및 폐를 해부하였다.
AAV/VPRIV 제조 및 투여
AAV8-FLF-PL64의 분취액을 -80℃에서 저장하였다. 주입하기 전에, 분취액을 얼음 위에서 해동하고 X-VIVO 10(Lonza, pH7.4, 4℃)으로 희석하고, 저속으로 잠시 볼텍싱하여 부드럽게 혼합하였다. 희석된 AAV를 주사 전에 얼음에 보관하고 2시간 이내에 사용하였다.
VPRIV®를 재현탁하고 분취(25, 50, 100 μl)하고 -80℃에서 저장하였다. 주입하기 전에, 분취액을 얼음 위에서 해동하고 산성화된 X-VIVO 10(Lonza, pH5.5, 4℃)으로 표시된 용량까지 희석하고, 저속으로 잠시 볼텍싱하여 부드럽게 혼합하였다. 희석된 효소를 주사 전에 얼음에 보관하고 2시간 이내에 사용하였다.
AAV(2 × 1012 vg/kg) 및 비히클(X-vivo)을 8주령의 9V/null 마우스에 5 μL/g 체중(BW)으로 표시된 용량으로 1회 제공하였다. WT 마우스에 비히클을 투여하였다. AAV 및 비히클 투여는 이소플루란 하에 잠시 동안 미정맥을 통해 마우스에 이루어졌다. VPRIV®는 생후 8주령 부터 격주로 60 U/kg 및 2.5 μL/g BW로 바이오버블 룸에서 이소플루란과 산소의 혼합물로 마취된 9V/null 마우스에 미정맥 볼루스 주사로 7회 주사하였다.
조직 수집
12주, 16주 및 20주령에 혈액(약 100 μL)을 0.5 M EDTA(5 μL)가 포함된 튜브에서 미정맥으로부터 수집하였다. 신선하게 수집한 혈액 샘플을 얼음에 보관하고 혈장을 분리하여 2시간 이내에 GCase 활성을 분석하였다. VPRIV® 처리군의 각 혈장 수집 및 활성 분석을 예정된 효소 주입 후 2시간 이내에 수행하였다. 혈액의 별도 부분(약 400 μL)을 처리하여 GCase 활성 검정을 위해 백혈구(WBC)를 단리하였다. 수집된 WBC를 -80℃에서 저장하였다.
조직(간, 폐, 비장, 골수)을 실험 종료점(20주령)에서 수집하였다. VPRIV® 군의 조직 수집을 최종 예정된 효소 주입 후 2시간 이내에 수행하였다. 간, 폐 및 비장 샘플을 4개 부분으로 나누었으며, 3개 부분은 개별 튜브에서 동결하고 GCase 활성 검정, 단백질 및 기질 분석 전에 -80℃에서 저장하였다. 나머지 부분은 조직학 분석을 위해 10% 포르말린으로 고정하였다. 골수 세포는 마우스의 두 다리의 대퇴골 및 경골에서 수집하였고 GCase 활성 및 기질 분석을 위해 -80℃ 냉동고에 저장된 2개의 튜브에서 동결하였다.
GCase 활성 검정
Precellys Evolution 조직 균질화기를 사용하여 4℃에서 2개 사이클(각각 20초, 30초 간격)을 사용하여 1% Na 타우로콜레이트 및 1% Triton X-100(Tc/Tx)에서 조직을 균질화하였다. 세포(골수(BM) 및 백혈구 세포(WBC))를 4℃에서 초음파 처리하여 1% Tc/Tx에서 균질화하였다. 조직 및 세포 용해물(2 μL)을 분석 혼합물(0.025 M 시트레이트-인산염 완충액, pH5.6)의 반응 완충액으로 희석(5×)하였다. 희석된 용해물(10 μL)(샘플 당 3회)을 반응 플레이트에 로딩하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션된 2mM Conduritol B 에폭시드(Millipore. 미국 캘리포니아주 소재)의 존재 및 부재 하에 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4MU-글루코스, 4 mM)(Biosynth AG, 스위스 소재)를 사용하여 형광측정법으로 GCase 활성을 결정하였다. BCA 단백질 분석 시약(Pierce, 미국 일리노이주 락포드 소재)을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
혈장을 0.025 M 시트레이트-인산염 완충액, pH 5.6에 희석하였다. GCase 활성을 상기와 같이 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4MU-글루코스, 4 mM)(Biosynth AG, 스위스 소재)를 사용하여 형광측정법으로 결정하였다.
기질 분석
동결 조직을 칭량하고 3.6 mL의 메탄올/클로로포름/H2O(2 : 1 : 0.6 v/v/v)에서 균질화하였다. 용해물의 분취액(500 μL)을 LC/MS 분석에 적용하였다. 정량된 헥소실세라마이드 및 헥소실스핑고신을 조직 중량에 의해 정규화하였다.
혈장을 물(40 μL 혈장 + 60 μL 물)에 희석하고 LC/MS 분석을 수행하였다. 기질 수준을 플라즈마 부피에 의해 정규화하였다.
골수 세포를 200 μL 물에 현탁시키고 초음파 처리하고 볼텍싱하여 세포 용해물을 제조하였다. 160 μL 용해물을 LC/MS 분석에 적용하였다. 남아있는 용해물의 단백질 농도를 결정하였다. 기질 수준은 mg 단백질로 정규화하였다.
LC/MS 분석을 수행하여 헥소실세라마이드 및 헥소실스핑고신 농도를 분석하였다. 이러한 마우스 모델 모델에서 갈라토실세라마이드 및 갈라토실스핑고신 수준이 매우 낮기 때문에, 측정된 헥소실세라마이드 및 헥소실스핑고신 농도는 각각 글루코실세라마이드 및 글루코실스핑고신의 수준을 나타낸다.
조직학 분석
간, 폐, 비장 및 골수를 염수 관류한 마우스로부터 절개하고 포르말린(10%)으로 고정하고 파라핀에 포매하였다. 고정된 조직을 4μm 절편으로 절단하고 슬라이드에 장착하였다.
저장 세포 수
조직 절편을 Autostainner(Leica Autostainner XL)에 의해 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 염색된 조직을 Aperio AT2(Leica, 40X)로 스캔하였다. 조직 이미지는 Aperio ImageScope(V12.4.0.0543)로 처리하였다. 분석을 위해 마우스 당 간 및 폐에서 20X 배율(500 μm × 800 μm 이미지)의 사진 10장을 선택하였다. 저장 세포를 각 이미지에서 계수하였다. 데이터 그래프에 대해 10개 이미지의 평균 세포 수를 계산하였다. "저장 세포"의 정의는 세포(대식세포)의 크기를 기반으로 하며, 예컨대 간에서의 저장 세포 크기는 > 10 μm이고, 폐에서는 > 15 μm이다.
CD68 염색 및 정량
조직 절편을 Discover Ultra 자동화 IHC/ISH 슬라이드 염색 기계에서 토끼 항-마우스 CD68 항체(1 : 25. Abcam Ab53444)로 염색하였다. 조직을 세포 핵 상에서 헤마톡실린으로 대조 염색하였다. 염색된 조직을 Aperio AT2(Leica, 40X)로 스캔하고 이미지를 Aperio ImageScope(V12.4.0.0543)으로 획득하였다. 20X 배율(500 μm × 800 μm)의 간 및 폐 이미지를 정량 분석에 사용하였다. 마우스 당 5개의 간 또는 폐 이미지의 IHC 신호를 Image J(Fiji, v5.1)를 사용하여 분석하였다. 데이터 그래프에 대해 마우스 당 평균 CD68 신호를 계산하였다.
통계 분석
데이터를 Student t-검정 또는 일원 ANOVA로 분석하였다. 도면 그래프 및 통계 분석을 PRISM 8 소프트웨어(PRISM 버전 8.0.1)로 생성하였다.
2. 결과
GCase 활성
9V/null 마우스에서 활성 GCase 수준을 회복하기 위한 AAV-FLF-PL64 처리를 세포 및 조직에서 GCase 활성을 측정함으로써 연구하였다. 마우스가 20주령일 때 백혈구 세포(WBC), 골수 및 조직 샘플을 위와 같은 실험 종료점에서 수집하였다(즉, AAV-FLF-PL64 주사 후 12주 또는 최종 VPRIV® 투여 시).
VPRIV®는 시험한 모든 세포와 조직에서 활성을 증가시키는 것으로 나타났다(도 13). 위에서 언급한 바와 같이, VPRIV® 처리군의 조직을 마지막 주사 후 2시간 이내에 수집하였으며, 이는 VPRIV®가 조직에서 C-max에 있는 기간 내에 있음을 보여주는 이전 데이터와 일치한다.
AAV-FLF-PL64는 또한 단회 투여 후에 모든 조직에서 GCase 활성을 크게 증가시키는 것으로 나타났다(도 13). 비히클-9V/null과 비교하여, 간 GCase 활성은 4.7배 증가하였고, 비장 GCase 활성은 2.5배 증가하였다. 백혈구 세포에서 GCase 활성은 AAV-FLF-PL64 처리군에서 7 내지 9배까지 크게 증가하는 것으로 나타났다. 특히, 백혈구 세포에서 GCase 활성 수준은 WT 활성 수준의 약 82%에 도달하였다.
조직 조직학
9V/null 마우스의 내장 병리를 저장 세포로서 포말성(foamy) 대식세포를 계수하고 활성화된 대식세포에 대한 CD68 염색 신호를 정량화하여 결정하였다. H&E 염색된 간 절편에서 저장 세포를 계수하였다. CD68 신호(갈색) 강도를 항-CD68 항체로 염색된 간 및 폐 절편에서 정량화하였다.
간에서 크기가 10μm 이상인 저장 세포를 각 마우스의 조직 당 10개의 이미지에서 계수하였다. 간에서, 저장 세포의 수는 AAV-FLF-PL64 처리군과 VPRIV® 군에서 감지할 수 없었다(도 14).
간에서 CD68 신호는 또한 AAV-FLF-PL64 처리군에서 크게 감소하였다. AAV-FLF-PL64 처리는 CD68 신호를 비히클-9V/null 수준의 약 25%로 감소시켰다. 이에 비해, VPRIV 군의 CD68 신호는 비히클-9V/null 수준의 약 37%였다(도 14).
기질 축적
9V/null 마우스는 간, 폐 및 비장에서 당지질 기질 축적을 발생시키는 것으로 알려져 있다(문헌[Xu et al. PLoS One. 2010 May 20;5(5):e10750]). 예를 들어, 상기 연구는 대조군 비히클-9V/null 군에서 헥소실세라마이드가 간에서 7.97배 및 비장에서 3.57배 만큼 WT 수준보다 높다는 것을 보여주었다(데이터는 표시되지 않음).
AAV-FLF-PL64 처리군은 비히클-9V/null과 비교하여 간 및 비장에서 헥소실세라마이드 및 헥소실스핑고신의 큰 감소를 나타냈다(도 15). 특히, AAV-FLF-PL64 처리군은 헥소실세라마이드 수준이 간에서 야생형 수준의 1.20배 및 비장에서 야생형 수준의 1.03배로 감소하였다(데이터는 표시되지 않음). 골수 분석 시 WT 수준에 가까운 유사한 감소가 나타났다(데이터는 표시되지 않음).
반면에, VPRIV® 처리는 간에서 헥소실세라마이드의 유의한 감소만을 보여주었고, 다른 시험된 조직은 헥소실세라마이드 수준에서 유의한 변화를 나타내지 않았다. VPRIV®는 모든 시험된 조직에서 헥소실핑고신 수치에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
물론, 본 발명이 예로서 설명되었지만, 상기 실시예는 결코 제한을 의미하지 않으며, 이하의 청구범위의 범위 내에서 수정이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 각 실시형태의 바람직한 특징은 필요한 수정을 가하여 다른 실시형태 각각에 대한 것과 같다. 본 명세서에 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 국한되지 않는 모든 간행물은 각각의 개별 간행물이 본원에 인용되어 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 본원에 인용되어 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> FREELINE THERAPEUTICS LIMITED <120> POLYNUCLEOTIDES <130> N414281WO <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1494 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 gccaggccct gcatccctaa gagctttggc tacagctctg tggtgtgtgt gtgcaatgcc 60 acctactgtg acagctttga cccccccacc tttcctgccc tgggcacctt cagcagatat 120 gagagcacca ggtctgggag gaggatggag ctgagcatgg ggcccatcca ggctaatcac 180 actggcactg gcctgctgct gaccctgcag cctgagcaga agttccagaa agtaaagggc 240 tttggagggg ccatgactga tgctgctgct ctgaacatcc tggccctgag cccccctgcc 300 cagaatctgc tgctgaagag ctacttctct gaggagggca ttggctataa catcatcagg 360 gtgcccatgg ccagctgtga cttcagcatc aggacctaca cctatgctga cacccctgat 420 gatttccagc tgcacaactt cagcctgcct gaggaggata ccaagctgaa gatcccactg 480 atccacaggg ctctgcagct ggcccagagg cctgtgagcc tgctggccag cccctggacc 540 agccccactt ggctgaagac caatggggct gtgaatggga aggggagcct gaagggacag 600 cctggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660 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Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr 435 440 445 Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr 580 585 590 Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 21 <211> 736 <212> PRT <213> adeno-associated virus 9 <400> 21 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 22 <211> 66 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 22 gtaaatataa aatttttaag tgtataatgt gttaaactac tgattctaat tgtttctctc 60 ttttag 66 <210> 23 <211> 208 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 23 ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180 gggaagacaa tagcaggcat gctgggga 208 <210> 24 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic capsid protein <400> 24 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr 435 440 445 Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr 580 585 590 Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu 725 730 735 <210> 25 <211> 536 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Glu Phe Ser Ser Pro Ser Arg Glu Glu Cys Pro Lys Pro Leu Ser 1 5 10 15 Arg Val Ser Ile Met Ala Gly Ser Leu Thr Gly Leu Leu Leu Leu Gln 20 25 30 Ala Val Ser Trp Ala Ser Gly Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe 35 40 45 Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser 50 55 60 Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu 65 70 75 80 Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln 85 90 95 Ala Asn His Thr Gly Thr Gly Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln 100 105 110 Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala 115 120 125 Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu 130 135 140 Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val 145 150 155 160 Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp 165 170 175 Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp 180 185 190 Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln 195 200 205 Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu 210 215 220 Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro 225 230 235 240 Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu 245 250 255 Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu 260 265 270 Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu 275 280 285 Gly Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly 290 295 300 Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu 305 310 315 320 Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr 325 330 335 Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr 340 345 350 Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg 355 360 365 Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser 370 375 380 Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met 385 390 395 400 Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly 405 410 415 Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp 420 425 430 Val Arg Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp 435 440 445 Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys 450 455 460 Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys 465 470 475 480 Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val 485 490 495 Val Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys 500 505 510 Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile 515 520 525 His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg Gln 530 535

Claims (35)

  1. GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 β-글루코세레브로시다제(GCase) 단백질 또는 이의 단편을 코딩하고, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부는 야생형이 아니고, 선택적으로 야생형이 아닌 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 코돈-최적화되었고, 보다 선택적으로 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 GCase 단백질 또는 이의 단편을 코딩하고,
    (i) SEQ ID NO: 1 내지 8 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 100% 동일하고;
    (ii) SEQ ID NO: 1 내지 8 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 100% 동일하고/하거나;
    (iii) GCase 활성을 가진 GCase 단백질을 코딩하는 SEQ ID NO: 1 내지 8 중 임의의 하나의 변이체로서, 상기 변이체는 SEQ ID NO: 25의 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 상기 GCase 단백질이 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 갖도록 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것을 제외하고 각각 SEQ ID NO: 1 내지 8과 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은
    (i) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 100% 동일하고;
    (ii) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 적어도 99.8% 동일하고/하거나;
    (iii) GCase 활성을 가진 GCase 단백질을 코딩하는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5의 변이체로서, 상기 변이체는 SEQ ID NO: 25의 상기 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 상기 GCase 단백질이 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 갖도록 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것을 제외하고 각각 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5와 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변이체는 SEQ ID NO: 1의 변이체이고, 상기 SEQ ID NO: 1의 변이체는
    (i) SEQ ID NO: 25의 상기 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 상기 GCase 단백질이 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 또는 최대 10개 아미노산 치환을 갖도록 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것을 제외하고 SEQ ID NO: 1과 동일하고;
    (ii) SEQ ID NO: 1의 상기 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 최대 10개, 최대 20개, 또는 최대 30개의 뉴클레오티드 치환을 갖고;
    (iii) SEQ ID NO: 1의 상기 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 또는 최대 6개의 뉴클레오티드 치환을 갖고;
    (iv) SEQ ID NO: 1의 상기 서열에 비해 최대 4개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나, SEQ ID NO: 25의 상기 야생형 아미노산 GCase 서열에 비해 최대 3개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하고;
    (v) SEQ ID NO: 1의 상기 서열에 비해 최대 3개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나, SEQ ID NO: 25의 상기 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 2개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하고/하거나;
    (vi) SEQ ID NO: 1의 상기 서열에 비해 1개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나 SEQ ID NO: 25의 상기 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 1개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변이체는 SEQ ID NO: 5의 변이체이고, 상기 SEQ ID NO: 5의 변이체는
    (i) SEQ ID NO: 25의 상기 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 상기 GCase 단백질이 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 또는 최대 10개의 아미노산 치환을 갖도록 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것을 제외하고 SEQ ID NO: 5와 동일하고;
    (ii) SEQ ID NO: 5의 상기 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 6개, 최대 7개, 최대 8개, 최대 9개, 최대 10개, 최대 20개, 또는 최대 30개의 뉴클레오티드 치환을 갖고;
    (iii) SEQ ID NO: 5의 상기 서열에 비해 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 또는 최대 6개의 뉴클레오티드 치환을 갖고;
    (iv) SEQ ID NO: 5의 상기 서열에 비해 최대 4개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나, SEQ ID NO: 25의 상기 야생형 아미노산 GCase 서열에 비해 최대 3개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하고;
    (v) SEQ ID NO: 5의 상기 서열에 비해 최대 3개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나, SEQ ID NO: 25의 상기 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 2개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하고/하거나;
    (vi) SEQ ID NO: 5의 상기 서열에 비해 1개의 뉴클레오티드 치환을 갖고/갖거나, SEQ ID NO: 25의 상기 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 1개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
  5. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은
    (i) SEQ ID NO: 25의 상기 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 3개의 아미노산 치환;
    (ii) SEQ ID NO: 25의 상기 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 2개의 아미노산 치환; 및/또는
    (iii) SEQ ID NO: 25의 상기 야생형 GCase 아미노산 서열에 비해 최대 1개의 아미노산 치환을 갖는 GCase 단백질을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
  6. GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 GCase 단백질 또는 이의 단편을 코딩하고, SEQ ID NO: 1 내지 8 중 임의의 하나의 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1611개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1000개 내지 1611개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1611개 사이, 약 1494개, 또는 약 1611개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  7. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부는 코돈-최적화된, 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서,
    (a) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부는 인간 간 세포에서 발현하기 위해 코돈-최적화되었고;
    (b) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 연속(contiguous) 부분이고;
    (c) 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 인간 간 세포에서 발현하기 위해 코돈-최적화되었고;
    (d) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 길이가 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 또는 약 1494개의 뉴클레오티드이고;
    (e) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 성숙 GCase 단백질에 해당하고;
    (f) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 신호 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하지 않고;
    (g) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열 또는 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부에 상응하는 것과 비교하여 감소된 수의 CpG를 포함하고; 선택적으로 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열 또는 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 40개 미만, 20개 미만, 18개 미만, 10개 미만, 또는 5개 미만의 CpG를 포함하고, 보다 선택적으로 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열 또는 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 100개의 뉴클레오티드 당 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 또는 2개 미만의 CpG를 포함하고, 보다 선택적으로 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열 또는 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 CpG가 없고, 바람직하게 상기 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 9이고;
    (h) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1 내지 4 중 임의의 하나의 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 1494개 미만, 1000개 내지 1494개 사이, 1300개 내지 1494개 사이, 또는 약 1494개의 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하고/하거나;
    (i) 코돈-최적화된 상기 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 SEQ ID NO: 1과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
  9. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화되지 않은 부분을 포함하고, 선택적으로
    (a) 상기 코돈-최적화되지 않은 부분은 GCase 신호 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하고;
    (b) 상기 코돈-최적화되지 않은 부분은 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 110개, 200개 미만, 170개 미만, 140개 미만, 또는 약 117개의 뉴클레오티드이고/이거나;
    (c) 상기 코돈-최적화되지 않은 부분은 1개 이상의 CpG를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  10. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 전사 조절 인자를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 전사 조절 인자는 간-특이적 프로모터 및/또는 인핸서를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 A1AT 프로모터 또는 A1AT 프로모터의 단편을 포함하고, 선택적으로
    (a) 상기 A1AT 프로모터 또는 상기 A1AT 프로모터의 단편은 길이가 적어도 100개, 적어도 120개, 적어도 150개, 적어도 180개, 255개 미만, 100개 내지 255개 사이, 150개 내지 225개 사이, 150개 내지 300개 사이, 또는 180개 내지 255개 사이의 뉴클레오티드이고, 보다 선택적으로 상기 A1AT 프로모터의 단편은 길이가 180개 내지 255개 사이의 뉴클레오티드이고;
    (b) 상기 A1AT 프로모터 또는 상기 A1AT 프로모터의 단편은 길이가 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 500개 미만, 200개 내지 500개 사이, 250개 내지 500개 사이, 350개 내지 450개 사이, 또는 약 418개의 뉴클레오티드이고, 보다 선택적으로 상기 A1AT 프로모터의 단편은 길이가 350개 내지 450개 사이의 뉴클레오티드이고/이거나;
    (c) 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 인핸서는 HCR 인핸서 또는 HCR 인핸서의 단편이고, 선택적으로
    (a) 상기 HCR 인핸서 또는 상기 HCR 인핸서의 단편은 길이가 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 192개 미만, 80개 내지 192개 사이, 90개 내지 192개 사이, 100개 내지 250개 사이, 또는 117개 내지 192개 사이의 뉴클레오티드의 단편이고, 보다 선택적으로 상기 HCR 인핸서의 단편은 길이가 117개 내지 192개 사이의 뉴클레오티드이고;
    (b) 상기 HCR 인핸서 또는 상기 HCR 인핸서의 단편은 길이가 적어도 150개, 적어도 190개, 적어도 230개, 400개 미만, 150개 내지 400개 사이, 190개 내지 370개 사이, 230개 내지 340개 사이, 250개 내지 340개 사이, 또는 약 321개의 뉴클레오티드의 단편이고, 보다 선택적으로 상기 HCR 인핸서의 단편은 길이가 250개 내지 340개 사이의 뉴클레오티드이고;
    (c) 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  13. 제10항에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 SEQ ID NO: 14 또는 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
  14. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 상기 GCase는 다른 동일한 참조 폴리뉴클레오티드에서 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase에 비해 높은 수준으로 인간 간 세포에서 발현되고, 선택적으로 상기 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 상기 GCase는 다른 동일한 참조 폴리뉴클레오티드에서 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase에 비해 인간 간 세포에서 적어도 1.1×, 적어도 1.2×, 적어도 1.3×, 적어도 1.4×, 또는 적어도 1.5× 더 높게 발현되고, 보다 선택적으로 상기 참조 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 9의 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 선택적으로 상기 참조 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 13의 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  15. 전술한 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는, 바이러스 입자.
  16. 제15항에 있어서, AAV, 아데노바이러스, 또는 렌티바이러스 바이러스 입자이고, 선택적으로 AAV 바이러스 입자인, 바이러스 입자.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 바이러스 입자는 간-트로픽 또는 CNS-트로픽 캡시드를 포함하는, 바이러스 입자.
  18. 제17항에 있어서, 상기 간-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 19, 20 또는 24의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개 사이, 650개 내지 736개 사이 또는 700개 내지 736개 사이의 아미노산의 단편에 대해 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%인 서열을 포함하고, 선택적으로 상기 간-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 19 또는 20과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
  19. 제17항에 있어서, 상기 CNS-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 21의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개 사이, 650개 내지 736개 사이 또는 700개 내지 736개 사이의 아미노산의 단편에 대해 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%인 서열을 포함하고, 선택적으로 상기 CNS-트로픽 캡시드는 SEQ ID NO: 21과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 게놈은
    a) AAV2 ITR;
    b) 폴리 A 서열; 및/또는
    c) 인트론;을 추가로 포함하고,
    선택적으로 상기 재조합 게놈은 단일-가닥인, 바이러스 입자.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, Huh-7 세포 내로 형질도입 시, 상기 바이러스 입자가 형질도입된 세포에서의 상기 GCase 활성은 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다른 동일한 바이러스 입자로 형질도입된 세포에서의 상기 GCase 또는 이의 단편의 활성보다 더 크도록 GCase 또는 이의 단편을 발현하고, 선택적으로 Huh-7 세포 내로 형질도입 시, 상기 바이러스 입자가 상기 형질도입된 세포에서의 상기 GCase 활성은 SEQ ID NO: 9의 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다른 동일한 바이러스 입자로 형질도입된 세포에서의 GCase 또는 이의 단편의 상기 활성보다 적어도 2×, 적어도 3×, 적어도 4×, 적어도 5×, 적어도 10×, 또는 적어도 20× 더 크도록 GCase 또는 이의 단편을 발현하고, 보다 선택적으로 상기 활성은 GCase에 대해 특이적인 형광측정(fluorometric) 기질을 사용하여 측정되는, 바이러스 입자.
  22. 전술한 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 입자 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 조성물.
  23. 치료 방법에 사용하기 위한 전술한 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 치료 방법은 유효량의 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 조성물 또는 바이러스 입자를 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 치료방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
  25. 제23항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 방법은 GCase 결핍과 관련된 질환의 치료 방법인, 치료방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
  26. 제23항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 방법은 파킨슨 병의 치료 방법인, 치료방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
  27. 제23항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 방법은 고셔병 치료 방법이고, 선택적으로
    (i) 상기 고셔병은 고셔병 유형 I, II 또는 III이고/이거나;
    (ii) 상기 환자는 상기 환자가 이전에 효소 대체 요법의 일부로서 치료받은 재조합 GCase에 대해 항체 또는 억제제를 가지고 있는, 치료방법에 사용하기 위한폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
  28. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열을 발현하고 대상체에서 안정한 GCase 활성을 달성하는 방법에 사용하기 위한, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
  29. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA 뉴클레오티드 서열을 발현하고, GCase 효소 대체 요법에 대한 상기 생체이용률에 비해 대상체에서 더 큰 GCase 생체이용률을 제공하는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 상기 생체이용률은 투여로부터 2주 기간에 걸쳐 측정되는, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
  30. 제28항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 안정한 GCase 활성 달성 및/또는 더 큰 GCase 생체이용률 제공으로 상기 대상체의 질환을 치료하는, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 GCase 활성 및/또는 생체이용률은 GCase에 특이적인 형광측정 기질을 사용하여 측정되고;
    (ii) 상기 GCase 활성은 상기 대상체의 상기 혈청 또는 혈장에서 측정되고;
    (iii) 상기 GCase 활성은 상기 대상체의 상기 대식세포에서 측정되고;
    (iv) 상기 GCase 활성은 상기 대상체에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 또는 적어도 9 μmol/h/ml의 수준에서 안정하고;
    (v) 상기 GCase 활성은 상기 대상체에서 적어도 3 μmol/h/ml의 수준에서 안정하고;
    (vii) 상기 GCase 활성은 상기 대상체에서 적어도 5 μmol/h/ml의 수준에서 안정하고;
    (vii) 상기 GCase 활성은 상기 대상체에서 적어도 9 μmol/h/ml의 수준에서 안정하고;
    (viii) 상기 방법은 상기 대상체에 유효 용량의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고;
    (ix) 상기 안정한 GCase 활성은 건강한 대상체의 상기 GCase 활성에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%의 GCase 활성이고;
    (x) 상기 안정한 GCase 활성은 건강한 대상체의 상기 GCase 활성에 비해 10% 내지 100% 사이, 20% 내지 90% 사이, 30% 내지 70% 사이, 40% 내지 70% 사이, 또는 50% 내지 70% 사이의 GCase 활성이고;
    (xi) 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 5주 동안 안정하고;
    (xii) 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 10주 동안 안정하고;
    (xiii) 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 15주 동안 안정하고;
    (xiv) 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 20주 동안 안정하고;
    (xv) 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 25주 동안 안정하고;
    (xvi) 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 30주 동안 안정하고;
    (xvii) 상기 안정한 GCase 활성은 투여로부터 적어도 35주 동안 안정하고;
    (xviii) 상기 안정한 GCase 활성은 투여 후 적어도 40주 동안 안정하고;
    (xix) 상기 방법은 유효량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 측정된 활성과 비교할 때, 투여 후 동일한 시점에서 동일한 분석법으로 측정할 때, 상기 대상체의 간, 비장, 및/또는 골수에서 투여 후 적어도 5주, 적어도 10주, 적어도 15주, 적어도 20주, 적어도 25주, 적어도 30주, 또는 적어도 35주에 더 큰 GCase 활성을 달성하고/하거나;
    (xx) 상기 방법은 유효량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 측정된 생체이용률과 비교할 때, 투여 후 동일한 시점에서 동일한 분석법으로 측정할 때, 투여 후 적어도 5주, 적어도 10주, 적어도 15주, 적어도 20주, 적어도 25주, 적어도 30주, 또는 적어도 35주의 기간에 걸쳐 대상체의 간 비장 및/또는 골수에서 더 큰 GCase 생체이용률을 달성하는, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
  32. 제30항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 고셔병이고, 선택적으로 상기 고셔병은 고셔병 유형 I, II 또는 III인, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
  33. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 것으로서, 선택적으로 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준 감소는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 치료하는, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
  34. 제33항에 있어서,
    (i) 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 시점에서 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준과 비교할 때 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준이 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 2 내지 3배, 2 내지 4배, 2 내지 5배, 2 내지 6배, 또는 3 내지 5배 감소하고;
    (ii) 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준 감소는 대상체에 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법을 투여하여 달성된 상기 감소보다 더 크고, 선택적으로 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주에 측정될 때이고;
    (iii) 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 상기 대상체의 대식세포에서 측정되고;
    (iv) 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 상기 대상체의 비장에서 측정되고;
    (v) 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 상기 대상체의 간에서 측정되고;
    (vi) 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 상기 대상체의 혈청에서 측정되고;
    (vii) 상기 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 질량 분석법(mass spectrometry)으로 측정되고/되거나;
    (viii) 상기 질환은 고셔병이고, 선택적으로 상기 고셔병은 고셔병 유형 I, II 또는 III인, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
  35. 제23항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 상기 환자가 효소 대체 요법의 일부로서 이전에 치료받은 재조합 GCase에 대해 항체 또는 억제제를 가지고 있는, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물, 또는 방법.
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