KR20230042513A - 폴리펩티드 - Google Patents

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아미트 나쓰와니
제니 민토쉬
로무알드 코르바우
아자데흐 키아
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Abstract

본 발명은 변형된 β-글루코세레브로시다제(GCase: Glucocerebrosidase) 폴리펩티드 및 변형된 글루코세레브로시다제(GBA) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는 바이러스 입자, 및 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 바이러스 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 및/또는 조성물의 사용 방법, 및 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료 방법에서 사용하기 위한, 또는 치료 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물에 관한 것이다.

Description

폴리펩티드
본 발명은 변형된 β-글루코세레브로시다제(GCase: Glucocerebrosidase) 폴리펩티드 및 변형된 글루코세레브로시다제(GBA) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는 바이러스 입자, 및 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 바이러스 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 및/또는 조성물의 사용 방법, 및 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료 방법에서 사용하기 위한, 또는 치료 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물에 관한 것이다.
고셔병(GD: Gaucher disease)은 대식세포-단핵구 시스템의 세포에서 글루코세레브로시드의 침착을 특징으로 하는 상염색체 열성 지질 저장 질환이다. GD는 효소 β-글루코세레브로시다제(GCase: Glucocerebrosidase)의 활성 및/또는 생산을 손상시키는 하우스키핑 GBA 유전자의 돌연변이로 인해 발생한다. GCase는 세포막에 풍부한 당지질 대사의 중간체인 화학적 글루코세레브로시드의 베타-글루코시드 연결을 가수분해하는 글루코실세라미다제 활성(EC 3.2.1.45)을 가진 효소이다. 돌연변이는 활성이 감소된 잘못 폴딩된 GCase의 생산을 초래하고 GD로 나타나는 많은 필수 장기에 침투하는 대식세포에 글루코세레브로시드의 축적을 유발할 수 있다.
확인된 특정 돌연변이를 특징으로 하는 GD에는 세 가지 주요 유형이 있으며, 각 유형은 상이한 임상 증상을 나타낼 수 있다. 1형 GD는 중추신경계에 거의 또는 전혀 관여하지 않지만 주로 비장 및 간 비대, 낮은 혈구 수, 출혈 문제 및 뼈 질환과 같은 내장 증상이 특징이다. 지난 20년 동안, 효소 대체 요법이 1형 GD 치료의 표준으로 부상하였다. 높은 비용(약 $200,000 또는 약 ￡150,000/환자/년) 외에도, GD의 효소 대체 요법 치료는 일반적으로 평생 격주로 한 번 이상 주사해야 한다. 이로 인해 높은 수준의 치료 부담을 보이는 GD 환자의 비율이 높아진다.
따라서, GD의 치료를 위한 개선되고 효과적인 요법, 즉 영향을 받는 표적 장기에 대해 기능하는 GCase의 이용가능성을 증가시키는 요법을 제공할 필요가 있으며, 이는 GCase의 빈번하고 평생 정맥 주사의 필요성을 피할 것이다.
본 발명은 하나 이상의 아미노산 치환 돌연변이를 포함하는 변형된 β-글루코세레브로시다제(GCase: Glucocerebrosidase) 폴리펩티드에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 β-글루코세레브로시다제(GCase) 폴리펩티드가 제공되며, 상기 적어도 하나의 돌연변이는:
(i) 보다 높은 유효 활성을 제공하고/하거나;
(ii) 증가된 안정성을 제공하고/하거나;
(iii) 생리학적 pH에서 구조적인 안정화를 제공하고/하거나;
(iv) 보다 긴 반감기를 제공하고/하거나;
(v) 증가된 열안정성을 제공한다..
본 발명의 제2 양태에서, SEQ ID NO: 1의 351, 380, 272, 262, 313, 404, 407, 482, 484, 490, 494, 503, 및 534로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 상응하는 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 β-글루코세레브로시다제(GCase) 폴리펩티드가 제공된다.
본 발명의 제3 양태에서, 변형된 글루코세레브로시다제(GBA) 뉴클레오티드 서열를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명의 제4 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는 바이러스 입자가 제공된다.
본 발명의 제5 양태에서, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 바이러스 입자 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 제6 양태에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물이 제공된다.
본 발명의 제7 양태에서, 유효량의 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 제8 양태에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 제9 양태에서, 질환 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물이 제공되며, 상기 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 비해 pH 7.4에서 증가된 안정성을 갖는다.
본 발명의 제10 양태에서, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여에 의한 질환의 치료 방법이 제공되며, 상기 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 비해 pH 7.4에서 증가된 안정성을 갖는다.
본 발명의 제11 양태에서, 질환의 치료에서 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도가 제공되며, 상기 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 비해 pH 7.4에서 증가된 안정성을 갖는다.
본 발명의 제12 양태에서, 질환의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물이 제공되며, 상기 질환 치료는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 포함하거나 코딩하는 동등한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여에 필요한 용량에 비해 더 낮은 용량의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제13 양태에서, 본 발명의 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여에 의한 질환의 치료 방법이 제공되며, 상기 질환 치료는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 포함하거나 코딩하는 동등한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여에 필요한 용량에 비해 더 낮은 용량의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제14 양태에서, 질환의 치료에서 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도가 제공되며, 상기 질환 치료는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 포함하거나 코딩하는 동등한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여에 필요한 용량에 비해 더 낮은 용량의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제15 양태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 제공되며, 상기 변형된 GCase 폴리펩티드는:
(i) 더 높은 유효 활성을 갖고/갖거나;
(ii) 증가된 안정성을 갖고/갖거나;
(iii) 생리학적 pH에서 구조적인 안정화를 갖고/갖거나;
(iv) 더 긴 반감기를 갖고/갖거나;
(v) 증가된 열안정성을 제공한다.
본 발명의 제16 양태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 제공되며, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 인간 백혈구 항원(HLA: human leukocyte antigen)-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수를 감소시킨다.
본 발명의 제17 양태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 제공되며, 상기 변형된 GCase 폴리펩티드는 감소된 수의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제를 갖는다.
본 발명의 제18 양태에서, GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 다음을 위한 약제의 제조에서 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도가 제공된다:
(i) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(ii) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(iii) 활성화된 대식세포의 수준 감소.
본 발명의 제19 양태에서, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물을 대상체에 투여함으로써 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 하기의 방법이 제공된다:
(i) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(ii) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(iii) 활성화된 대식세포의 수준 감소.
본 발명의 제20 양태에서, GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 하기 방법에서 사용하기 위한, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물이 제공되며:
(iv) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(v) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(vi) 활성화된 대식세포의 수준 감소;
선택적으로, 상기
(i) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(ii) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(iii) 활성화된 대식세포의 수준 감소;
는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태의 치료를 야기한다.
GCase는 정상적으로 기능하고 산성 pH에서 안정한 리소좀 단백질이다. 일반적으로 생리학적 pH(예를 들어, pH 7.4)에서는 반감기가 몇 분에 불과하여 불안정하다. 예를 들어, VPRIV(벨라글루세라제 알파, 천연-발생 인간 GCase 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 GCase인 상업적으로 이용가능한 ERT인 베라글루세라제 알파)의 활성이 pH 7.4에서 인큐베이션 후 극적으로 감소함을 보여주는 실시예 2 및 도 1을 참조한다. SEQ ID NO: 3은 벨라글루세라제 알파의 서열을 포함한다. 기존 효소 대체 치료(ERT: Existing enzyme replacement treatment)는 GD 환자를 위한 표준 치료법이다. ERT에서 GCase 효소는 일반적으로 정맥 내로 제공되는데, 이는 이러한 치료가 또한 이동해야 하는 거리와 혈액 내 불안정성으로 인해 GCase 효소를 표적 장기로 효과적으로 전달하는데 문제가 있음을 의미한다. 본 발명자들은 안정성이 증가된 변형된 GCase 폴리펩티드를 개발하였다. 본 발명자들은 GCase 폴리펩티드의 안정성을 증가시킬 수 있는 GCase 폴리펩티드 내의 아미노산 치환을 확인하였다.
이론에 의해 구속되지 않고, 이러한 아미노산 돌연변이는 생리학적 pH(예를 들어, pH 7.4)에서 안정성을 향상시키는 역할을 할 수 있으며, 이에 따라 GCase가 안정한 시간을 연장하여, 더 높은 유효 활성을 제공할 수 있다고 여겨진다. 본 발명에 따른 변형된 GCase 폴리펩티드는 다양한 pH 하에서 야생형 GCase 폴리펩티드보다 더 높은 잔류 활성을 가질 수 있다(예를 들어 실시예 3 및 4 참조). 본 발명에 따른 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드보다 다양한 pH에서 더 긴 반감기를 가질 수 있다(예를 들어 실시예 5 참조). 본 발명에 따른 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드보다 더 높은 GCase 유효 활성을 나타낼 수 있다(예를 들어 실시예 8 및 9 참조). 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 개선된 열안정성을 가질 수 있다(예를 들어 실시예 12 참조). 본 발명에 따른 변형된 GCase 폴리펩티드는 효소 대체 요법을 위한 단백질로서 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 간에서의 발현(예를 들어, 유전자 요법의 형태)에 의해 제공될 수 있고 단백질이 표적 장기에 도달하기 위해 혈액을 통해 수송되도록 할 수 있다. 본 발명에 따른 변형된 GCase 폴리펩티드의 제공(예를 들어 유전자 요법의 형태)은 야생형 GCase 폴리펩티드의 제공보다 관련 조직에서 더 높은 흡수를 초래할 수 있다(예를 들어 실시예 10 참조). 본 발명자들은 또한 본 발명에 따른 변형된 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드에 비해 감소된 잠재적 면역원성 위험을 가질 수 있음을 발견하였다. 본 발명에 따른 변형된 GCase 폴리펩티드는 HLA-I에 대한 더 낮은 예측 수의 "강력한" 결합제 및 HLA-II에 대한 더 낮은 예측된 수의 강력한 결합제를 가질 수 있다(예를 들어 실시예 7 참조).
GCase가 안정한 시간을 연장하여 더 높은 유효 활성을 제공함으로써, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 안정성이 더 낮은 GCase(예를 들어 야생형 GCase)의 용량과 동일하거나 유사한 용량으로 투여할 때 더 큰 치료 효과를 달성할 수 있다. 또한, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드가 안정성이 더 낮은 GCase보다 더 낮은 용량으로 투여될 때 더 낮은 용량의 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 안정성이 더 낮은 GCase(예를 들어 야생형 GCase)와 동일한 치료 효과를 달성할 수 있다. 따라서, 치료와 관련된 비용이 절감되고 안전성 프로필이 개선될 수 있다.
도 1은 PBS(pH 7.4)에서 VPRIV의 효소 활성을 도시한다. 잔류 효소 활성(잔류 GCase 활성)을 PBS와 함께 인큐베이션 0, 15, 30, 60 및 120분에서 측정하였다. 각 시점에서 잔류 효소 활성을 초기 활성의 백분율로서 계산하였다.
도 2a 및 b는 37℃에서 7일에 걸쳐 측정한 다양한 조건, 즉 AB 완충액(pH 5.6)(도 2a) 및 PBS 완충액(pH 7.4)(도 2b)에서 인큐베이션한 다양한 GCase 변이체(#21, #68, #69, #85 및 #21+85, 표 1 참조), 야생형 GCase 및 VPRIV(벨라글루세라제 알파, 천연-발생 인간 GCase와 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 GCase; VPRIV는 상업적으로 이용가능한 ERT임)의 잔류 효소 활성의 비교를 제공한다. 잔류 효소 활성(잔류 GCase 활성)을 0분, 10분, 30분, 60분, 120분, 3일, 4일, 5일, 6일, 및 7일의 인큐베이션 후 측정하였다. 각 시점의 잔류 효소 활성을 초기 활성의 백분율로서 계산하였다.
도 3a 및 3b는 37℃에서 7일에 걸쳐 측정한 다양한 조건, 즉 인간 혈장(도 3a) 및 인간 혈청(도 3b)에서 인큐베이션한 다양한 GCase 변이체(#21, #85, 및 #21+85, 표 1 참조), 야생형 GCase 및 VPRIV(벨라글루세라제 알파, 천연-발생 인간 GCase와 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 GCase; VPRIV는 상업적으로 이용가능한 ERT임)의 잔류 효소 활성의 비교를 제공한다. 잔류 효소 활성(잔류 GCase 활성)을 0분, 10분, 30분, 60분, 120분, 3일, 4일, 5일, 6일, 및 7일의 인큐베이션 후 측정하였다. 각 시점의 잔류 효소 활성을 초기 활성의 백분율로서 계산하였다.
도 4a 내지 4c는 다양한 생리학적 매트릭스, 즉 AB 완충액(pH 5.6), PBS 완충액(pH 7.4), 마우스 혈청, 마우스 혈장 및 인간 혈청에서의 정제된 GCase 변이체 #85(도 4b) 및 벨라글루세라제 알파(VPRIV, 천연-발생 인간 GCase와 동등한 아미노산 서열을 갖는 재조합 GCase)(도 4a)의 반감기의 비교를 제공한다. 생리학적 매트릭스에서와 함께 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24, 48, 120, 및 144시간의 인큐베이션 후 잔류 효소 활성(잔류 GCase 활성)을 측정하였다(모든 시점이 도시되지 않음). 각각의 시점에서의 잔류 효소 활성을 초기 활성의 백분율로서 계산하였다. 정제된 GCase 변이체 #85 및 야생형 GCase(벨라글루세라제 알파)의 분 단위의 반감기를 결정하였다(도 4c). "리소좀 pH"에 대해 계산한 시간은 AB 완충액(pH 5.6)을 사용한 결과에 해당하고 "생리학적 pH"에 대해 계산한 시간은 PBS 완충액(pH 7.4)을 사용한 결과에 해당한다.
도 5a 내지 5c는 GCase 변이체 #85의 효소 효율(즉 기질을 처리하는 GCase의 능력)과, 야생형 GCase 및 효소 대체 요법(ERT)인 이미글루세라제 및 벨라글루세라제 알파에 대해 다른 사람이 보고한 효소 효율의 비교를 제공한다. 효소 효율을 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드우론산(4-MUG)의 처리에 의해 계산하였다. 도 5a 및 5b에서, 각각 1 nM 및 3.35 nM의 GCase 변이체 #85를 2.5 x 106, 5 x 106, 7.5 x 106 또는 1 x 107 nM의 4-MUG와 인큐베이션 하였다. 각각의 4-MUG 농도에 대한 4-MU 형성 속도를 4-MUG 농도에 대해 플롯팅하였고 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 모델로 피팅하였다. 속도를 초 당 nM 단위로 측정하였다. 도 5c는 야생형 GCase 및 효소 대체 요법(ERT)인 이미글루세라제 및 벨라글루세라제 알파에 대해 다른 사람들이 보고한 Km(mM) 값 외에 GCase 변이체 #85의 Kcat(s-1) 및 Km(mM)을 제공한다.
도 6은 GCase 변이체 #85에 대한 잠재적인 면역원성 위험 프로파일의 인 실리코(in silico) 평가의 결과를 제공한다. GCase 변이체 #85 및 야생형 GCase(GCaseWT)의 단편을 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II에 결합하는 이들의 예상 능력에 대해 평가하였다. MHC: 주 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex); HLA: 인간 백혈구 항원(huamn leukocyte antigen).
도 7은 Huh-7 세포(인간 간 세포주)의 AAV2/'37' 형질도입 시 다수의 GCase 변이체 및 야생형 GCase에 대한 유효 GCase 활성을 도시한다. 각각의 GCase 변이체 #21, GCase 변이체 # 85, 및 GCase 변이체 #21+85의 유효 GCase 활성을 시험하였다. 유효 GCase 활성을 4-MU 표준 곡선에 기초하여 nmol/시간/ml 단위로 제시하였다. 형질도입에 사용된 MOI는 5x103, 1x104 및 5x104vg/세포였으며, MOI: 감염 다중도(multiplicity of infection)였다. 비처리 대조군을 포함시켰다. 결과를 벡터 게놈 카피 수(실시예 1의 "벡터 게놈 카피 수"라는 표제의 섹션에 따라 측정함)에 의해 정규화하였다. 형질도입 효율을 설명하기 위해 MOI군 전체에 걸쳐 정규화하였다. 도면에서 "GCase 활성"이 언급된 경우 "유효 GCase 활성"을 의미한다.
도 8a 내지 8c는 GCase 변이체인 GCase 변이체 #21, GCase 변이체 #85 및 GCase 변이체 #21+85 또는 야생형 GCase 중 하나를 코딩하는 서열을 발현하는 AAV2/8 바이러스 입자를 야생형(C57BL/6) 수컷 마우스에 주입한 후 혈장(도 8a), 비장(도 8b), 및 골수 (도 8c)에서의 유효 GCase 활성 수준을 나타낸다. 대조군(나이브) 마우스를 비처리한 상태로 두었다. AAV2/8 바이러스 입자를 6x1010 vg/kg의 용량으로 마우스에 주입하였다. 처리 후 4주 차에 동물을 도태시켰다. 유효 GCase 활성 수준을 VPRIV 표준 곡선에 따라 mU/ml 혈장 또는 mU/mg 단백질(비장 및 골수)로 표시하였다. 결과를 벡터 게놈 카피 수(실시예 1의 "벡터 게놈 카피 수"라는 표제의 섹션에 따라 결정됨)에 의해 정규화하였다. 도면에서 "GCase 활성"이 언급된 경우 "유효 GCase 활성"을 의미한다.
도 9는 면역조직화학적 염색에 의해 결정된 바와 같은 GCase 변이체 #85 또는 야생형 GCase를 코딩하는 서열을 발현하는 AAV2/8 바이러스 입자를 야생형(C57BL/6) 수컷 마우스에 주입한 후 간, 비장, 폐 및 골수에서의 GCase의 수준을 나타낸다. 처리 후 4주 차에 동물을 도태시켰다.
도 10 a 내지 10e는 GCase 변이체 #85를 코딩하는 서열을 발현하는 AAV2/8 바이러스 입자를 야생형(C57BL/6) 수컷 마우스 에 주입한 후 혈장(도 10a), 비장(도 10b), 골수(도 10c), 폐(도 10d) 및 백혈구 세포(WBC: white blood cell)(도 10e)에서의 GCase 유효 활성 수준을 도시한다. 대조군(나이브) 마우스를 비처리한 상태로 두었다. AAV2/8 바이러스 입자를 다음의 용량으로 마우스에 주입하였다: 2x109, 2x1010 , 2x1011, 6x1011 및 2x1012 vg/kg. 도 10a의 경우, 처리 후 14, 28 및 42일 차에 혈장을 수득하였다. 도 10b 내지 10e의 경우, 처리 후 6주 차에 동물을 도태시켰다. 혈장의 유효 GCase 활성 수준을 mU/ml 혈장 단위로 나타냈고, 조직 및 WBC의 유효 GCase 활성 수준을 mU/mg 단백질 단위로 나타냈고, 이들 모두는 VPRIV 표준 곡선을 사용하여 결정하였다. 결과를 벡터 게놈 카피 수(실시예 1의 "벡터 게놈 카피 수"라는 표제의 섹션에 따라 결정됨)에 의해 정규화하였다. 도면에서 "GCase 활성"이 언급된 경우 "유효 GCase 활성"을 의미한다.
도 11 - 서열 목록
도 12는 pH 5.75(도 12a) 및 pH 7(도 12b)의 용액에서 1.5, 3 및 6 μM 농도에서 GCase 변이체 #85와 벨라글루세라제 알파(VPRIV) 사이의 열안정성의 비교를 도시한다.
도 13은 Gba-결핍 마우스에서 GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV의 단일 주사(2x1012 vg/kg의 용량, "AAV"), 또는 벨라글루세라제 알파 과정(VPRIV는 격주로 60 U/kg으로 전달됨, "ERT") 후 간(도 13a), 백혈구 세포(도 13b), 골수(도 13c), 비장(도 13d) 및 폐(도 13e) 조직에서의 GCase 활성 수준의 비교를 도시한다. AAV 주입 후 12주, 및 ERT 전달 2시간 이내에 측정을 수행하였다. GCase 활성의 평균 수준은 결핍되지 않은(야생형) 마우스에서 발견되는 GCase 활성의 평균 수준에 대해 상대적으로 표시되며, 그 결과는 백분율로 계산하였다(y-축, "WT에 상대적인 %"). 점선은 비교를 위해 야생형 마우스의 평균 GCase 활성 수준을 나타낸다. "비처리" = 대조군. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다.
도 14는 Gba-결핍 마우스에서 표시된 용량의 AAV의 단일 주입, 또는 벨라글루세라제 알파(VPRIV, 격주로 60 U/kg로 전달된 "ERT")의 과정 후 혈장에서의 헥소실스핑고신의 수준의 비교를 도시한다. AAV 주입 후 12주, 및 ERT 전달 2시간 이내에 측정을 수행하였다. 비-결핍 마우스("야생형")에서의 헥소실스핑고신 수준을 비교를 위해 표시하였다. 0 = 비처리 대조군. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. **** = 비처리 대조군 "0"과 상대적인 통계학적으로-유의한 차이(p<0.0001). 수행한 분석 = 1원(one-way) ANOVA.
도 15는 Gba-결핍 마우스에서 표시된 용량(2x1011 및 2x1012 vg/kg)의 AAV의 단일 주입, 또는 벨라글루세라제 알파(VPRIV, 격주로 60 U/kg로 전달된 "ERT")의 과정 후 간(도 15a), 비장(도 15b), 골수(도 15c) 및 폐(도 15d)에서의 헥소실스핑고신의 수준의 비교를 도시한다. AAV 주입 후 12주, 및 ERT 전달 2시간 이내에 측정을 수행하였다. 비-결핍 마우스("야생형")에서의 헥소실스핑고신 수준을 비교를 위해 표시하였다. 0 = 비처리 대조군. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. * 비처리 대조군 "0"과 상대적인 차이(p<0.1). **** = 비처리 대조군 "0"과 상대적인 통계학적으로-유의한 차이(p<0.0001). 수행한 분석 = 1원 ANOVA.
도 16은 Gba-결핍 마우스에서 표시된 용량 AAV의 단일 주입, 또는 벨라글루세라제 알파(VPRIV, 격주로 60 U/kg로 전달된 "ERT")의 과정 후 CD68 밀도 수준(도 16a) 또는 폐에서의 저장 세포 수(도 16b)의 비교를 나타낸다. AAV 주입 후 12주, 및 ERT 전달 2시간 이내에 측정을 수행하였다. 비교를 위해 비-결핍 마우스("야생형")에서의 CD68 밀도 수준 및 저장 세포의 수를 나타내었다. 0 = 비처리 대조군. 표시된 p-값은 비처리 대조군 "0"에 상대적이다. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다.
도 17은 AAV 투여 후 (도 17a) 57일 또는 (도 17b) 170일까지 관찰된 레서스 마카크(rhesus macaques)에 GCase 변이체 #85를 코딩화하는 AAV의 투여(2x1012 vg/kg의 단일 주입) 후 혈장 GCase 활성 수준의 빠르고 지속적인 증가를 보여준다. AAV는 우수한 안전성 프로필을 보여주고 효과적인 것으로 밝혀졌다. (도 17b)에서, 동물 17-020은 조직 흡수 연구를 위해 83일차에 희생되었다.
도 18은 Gba-결핍 마우스에서 GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV의 단일 주사("AAV-#85", 2 x 1011 vg/kg 및 2x1012 vg/kg 용량) 후, 벨라글루세라제 알파(격주로 60 U/kg으로 전달된 VPRIV, "ERT")의 과정 후, 또는 야생형 GCase를 코딩하는 AAV의 단일 주입("AAV-WT", 2x1012 vg/kg의 용량) 후 간, 백혈구 세포, 골수, 비장 및 폐 조직에서의 GCase 활성 수준의 비교를 나타낸다. AAV 주입 후 12주, 및 ERT 전달 2시간 이내에 측정을 수행하였다. GCase 활성의 평균 수준은 결핍되지 않은(야생형) 마우스에서 발견되는 GCase 활성의 평균 수준에 대해 상대적으로 표시되며, 그 결과는 백분율로 계산하였다(y축, "WT에 상대적인 %"). 점선은 비교를 위해 야생형 마우스의 평균 GCase 활성 수준을 나타낸다. "비처리" = 대조군. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. n= 처리 군 당 9 내지 16마리. * P≤0.05, ** P≤0.01, ***P≤0.001, **** P≤0.0001, 1원 ANOVA. 표시된 p- 값은 비처리 대조군 "0"에 대해 상대적이다. x-축의 경우: 1 비처리 대조군; 2 = 2 x 1011 vg/kg의 "AAV-#85"; 3 = 2 x 1012 vg/kg의 "AAV-#85"; 4 = "ERT"; 5 = 2 x 1012 vg/kg의 "AAV-WT".
도 19는 Gba-결핍 마우스에서 GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV의 단일 주사("AAV-#85", 2 x 1011 vg/kg 및 2x1012 vg/kg 용량) 후, 벨라글루세라제 알파(격주로 60 U/kg으로 전달된 VPRIV, "ERT")의 과정 후, 또는 야생형 GCase를 코딩하는 AAV의 단일 주입("AAV-WT", 2x1012 vg/kg의 용량) 후 혈장(도 19a), 간(도 19b), 비장(도 19c), 골수(도 19d) 및 폐(도 19e)에서의 헥소실스핑고신 수준의 비교를 나타낸다. AAV 주입 후 12주, 및 ERT 전달 2시간 이내에 측정을 수행하였다. 비교를 위해 비-결핍 마우스("야생형")에서의 헥소실스핑고신 수준을 나타냈다. 0 = 비처리 대조군. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. n= 군 당 9 내지 16마리. * P≤0.05; **** P≤0.0001, 1원 ANOVA. 표시된 p-값은 비처리 대조군 "0"에 대해 상대적이다.
도 20은 Gba-결핍 마우스에서의 GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV("AAV-#85") 야생형 GCase를 코딩하는 AAV("AAV-WT")의 상이한 용량(2 x 1010 vg/kg, 2 x 1011 vg/kg 또는 2x1012 vg/kg)을 주입한 후 혈장에서의 GCase 활성 수준의 비교를 도시한다. AAV 주입 후 12주에 측정을 수행하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. n= 군 당 9 내지 16마리. *** P≤0.001, **** P≤0.0001, 스튜던트 T-검정.
서열 목록 설명
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
일반 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
일반적으로, 용어 "포함하는(comprising)"은 비제한적으로(but not limited to) 포함되는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 어구 "2개의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드"는 변형된 GCase 폴리펩티드가 적어도 2개의 돌연변이를 포함하지만, 추가의 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 유사하게, 어구 "변형된 글루코세레브로시다제(GBA) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드"는 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭하지만, 이러한 폴리뉴클레오티드는 추가의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 단어 "포함하는(comprising)"은 어구 "~로 필수적으로 이루어지는(consisting essentially of)"으로 대체될 수 있다. 용어 "~로 필수적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 특정한 추가 구성요소, 즉 주제의 본질적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 구성요소가 존재할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 단어 "포함하는(comprising)"은 어구 "~로 이루어지는(consisting of)"으로 대체될 수 있다. 용어 "~로 이루어지는(consisting of)"은 제한적인 것으로 의도된다. 예를 들어, 어구 "2개의 돌연변이로 이루어진 변형된 GCase 폴리펩티드"는 변형된 GCase 폴리펩티드가 적어도 2개의 돌연변이만을 갖고 추가의 돌연변이가 없음을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 유사하게, 어구 "변형된 글루코세레브로시다제(GBA) 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드"는 폴리뉴클레오티드가 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열을 갖고 추가 뉴클레오티드가 없음을 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 단어 "갖다(have)"는 단어 "포함하다(comprise)" 또는 어구 "~로 이루어지는(consist of)"으로 대체될 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 단어 "갖다(has)"는 단어 "포함하다(comprises)" 또는 어구 "~로 이루어지는(consists of)"으로 대체될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 값의 범위를 정의하기 위해 2개의 종점을 언급할 때 "내지(between)"는 "내지 및 포함(between and including)"을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, "5 내지 10"으로 정의된 범위는 5 초과 10 미만인 모든 값과 불연속 값 5 및 10 자체를 포함한다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 사슬을 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "돌연변이", "치환 돌연변이" 및 "아미노산 치환"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 아미노산 서열에서 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 GCase 폴리펩티드의 위치 272의 아미노산이 SEQ ID NO: 1에서의 위치 272의 아미노산과 상이하다는 것을 제외하고 SEQ ID NO: 1의 서열을 갖는 GCase 폴리펩티드에 상응할 수 있다. 대안적으로, SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 위치 272의 아미노산을 비롯하여 몇몇 아미노산이 SEQ ID NO:1에서의 상응하는 아미노산과 상이하다는 것을 제외하고, SEQ ID NO: 1의 서열을 갖는 GCase 폴리펩티드에 상응할 수 있다(예를 들어 위치 272를 포함하는 GCase 폴리펩티드의 연속 부분은 SEQ ID NO: 1에서의 상응하는 아미노산과 상이한 아미노산을 함유할 수 있음). 어구 "SEQ ID NO: Z의 위치 X에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 아미노산 Y로의 치환이다" 및 "적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: Z의 위치 X에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다"에서, 치환된 잔기는 SEQ ID NO: Z의 위치 X에 상응하는 위치의 아미노산이다. 아미노산 Y는 SEQ ID NO: Z의 위치 X에 상응하는 위치에서 아미노산 서열의 원래 또는 천연 아미노산을 대체하는 상이한 아미노산이다. 어구 아미노산 X"의 치환" 또는 "치환된(될) 아미노산 X"에서, 아미노산 X는 아미노산 서열 내에 존재하고 치환될 원래 또는 천연 아미노산이다. 예를 들어, 글루탐산의 치환은 원래 또는 천연 글루탐산 아미노산이 또 다른 아미노산에 의해 대체되는 것을 의미한다. 어구 아미노산 Y"로의 치환" 또는 아미노산 Y"로의 돌연변이"에서, 아미노산 Y는 아미노산 서열에서 원래 또는 천연 아미노산을 대체하는 상이한 아미노산이다. 예를 들어, 글루타민으로의 치환은 원래 또는 천연(비-글루타민) 아미노산의 글루타민으로의 치환을 지칭한다. 치환 돌연변이를 정의하는 데 사용되는 표준 속기 명명법은 치환될 아미노산 서열 내의 위치에 있는 원래 또는 천연 아미노산과 원래 또는 천연 아미노산을 대체하는 아미노산을 나열한다. 예를 들어, 치환 돌연변이 E272Q를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 위치 272에 상응하는 위치의 글루탐산 잔기의 글루타민 잔기로의 치환을 포함하는(즉, 위치 272에 상응하는 위치에 글루타민 잔기를 포함함) 변형된 GCase 아미노산 서열을 지칭한다.
명시된 SEQ ID NO의 명시된 위치"에 상응하는" 아미노산은 언급된 특정한 SEQ ID NO의 명시된 위치에서의 아미노산일 수 있다. 예를 들어, "SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는" 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 위치 272의 아미노산일 수 있다. 대안적으로, 명시된 SEQ ID NO의 명시된 위치"에 상응하는" 아미노산은 명시된 SEQ ID NO의 명시된 위치에 상응하는 대안적인 아미노산 서열 유래의 아미노산일 수 있다. 예를 들어, "SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는" 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 대안적인 아미노산 서열 유래의 아미노산일 수 있다. 명시된 SEQ ID NO의 명시된 위치"에 해당하는" 대안적인 아미노산 서열 내의 아미노산을 결정하는 것은 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들어, 당업자는 본 명세서에 기술된 Needleman 및 Wunsch의 정렬 알고리즘과 같은 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 명시된 SEQ ID NO를 갖는 대안적인 아미노산 서열의 서열 정렬을 수행하고, 대안적인 아미노산 서열의 어떤 영역이 명시된 SEQ ID NO의 명시된 위치에 정렬하는지를 결정하기만 하면 된다. 예를 들어, 당업자는 대안적인 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 1과 정렬할 수 있고 어떤 아미노산이 정렬되는지, 따라서 예를 들어 SEQ ID NO. 1의 위치 272에 상응하는지를 결정할 수 있다.
용어 "보존적(conservative) 치환"은 아미노산이 크기, 전하 또는 소수성과 같은 유사한 생화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 치환 돌연변이를 지칭한다. 아미노산은 측쇄의 구조에 기초하여 군으로 분류될 수 있다: 지방족(글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신); 히드록실/황-함유(세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌); 환형(프롤린); 방향족(페닐알라닌, 티로신, 트립토판); 염기성(히스티딘, 리신, 아르기닌); 산성(아스파르트산, 글루탐산); 및 산 아민(아스파라긴, 글루타민). 따라서 "보존적 치환"은 아미노산이 동일한 군의 또 다른 아미노산으로 치환되는 치환 돌연변이를 지칭한다. 반대로, 용어 "바-보존적 치환"은 아미노산이 생화학적 성질이 상이한 다른 아미노산으로 치환된 치환, 즉 아미노산이 다른 군의 아미노산으로 치환된 치환 돌연변이를 지칭한다. 예를 들어, 아스파르트산을 글루탐산으로 치환하는 것은 "보존적 치환"으로 간주될 수 있는 반면, 글루탐산을 글루타민으로 치환하는 것은 "비-보존적" 치환으로 간주될 수 있다.
용어 "야생형" 및 "천연"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 천연 발생인 무엇인가를 기술하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "야생형 GCase 아미노산 서열"은 천연 발생인 GCase 아미노산 서열이다.
용어 "생리학적 pH"는 인체에서 일반적으로 우세한 pH를 지칭하며, 일반적으로 pH 7.35 내지 7.45 사이이다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "생리학적 pH"는 특히 혈액에서 발견되는 pH를 지칭하며, 이는 약 pH 7.4, 전형적으로 pH 7.35 내지 7.45이다. 따라서, 적어도 하나의 돌연변이가 생리학적 pH에서 구조적인 안정화를 제공하는 경우, 이는 혈액에서 발견될 수 있는 pH, 예를 들어 pH 7.4에서 구조적인 안정화를 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 추가 예로서, 폴리펩티드의 안정성이 생리학적 pH에서 측정되는 경우, 안정성은 혈액에서 발견될 수 있는 pH 수준, 예를 들어 pH 7.4 수준에서 측정된다. 바람직하게는, 생리학적 pH는 pH 7.4이다.
용어 "리소좀 pH"는 리소좀의 pH 수준을 지칭한다. 다른 말로 하면, 리소좀 pH는 리소좀에서 발견될 수 있는 pH 수준, 예를 들어 pH 5.6이다. 예를 들어, 폴리펩티드의 안정성이 리소좀 pH에서 측정되는 경우, 안정성은 리소좀에서 발견될 수 있는 pH 수준, 예를 들어 pH 5.6 수준에서 측정된다. 리소좀 pH는 pH 5.4 내지 pH 5.8일 수 있다. 리소좀 pH는 pH 5.5 내지 5.7일 수 있다. 리소좀 pH는 pH 5.55 내지 5.65일 수 있다. 바람직하게는, 리소좀 pH는 pH 5.6이다.
용어 "AAV 바이러스 입자" 및 "AAV 벡터"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 길이 기술과 관련하여 사용되는 용어 "약(around)"은 서열이 정의된 수의 뉴클레오티드 또는 아미노산, 플러스 또는 마이너스 10%, 보다 특히 플러스 또는 마이너스 5%, 보다 특히 플러스 또는 마이너스 1%, 또는 보다 특히 플러스 또는 마이너스의 단일 정수를 포함하거나 이로 이루어질 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 길이가 "약" 1494개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 대한 지칭은 길이가 1345 내지 1643개 뉴클레오티드, 보다 특히 1420 내지 1568개 뉴클레오티드, 보다 특히 1480 내지 1508개 뉴클레오티드, 보다 특히 1493 내지 1495개 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다.
시간 길이(예를 들어 16시간)와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 시간 길이가 명시된 길이의 시간 플러스 또는 마이너스 10%, 보다 특히 플러스 또는 마이너스 5%, 또는 보다 특히 플러스 또는 마이너스 1%를 포함하는 것을 나타낸다.
본 발명의 목적 상, 2개의 서열(예를 들어, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열)의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 제2 서열과 최적의 정렬을 위해 제1 서열에 갭이 도입될 수 있음). 그런 다음 각 위치의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기에 의해 점유되는 경우, 뉴클레오티드 또는 아미노산은 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/참조 서열에서 위치의 총 수 x 100).
전형적으로 서열 비교는 참조 서열의 길이에 걸쳐 수행된다. 예를 들어, 사용자가 주어진("시험") 서열이 SEQ ID NO: 1과 95% 동일한지 여부를 결정하고자 한다면, SEQ ID NO: 1이 참조 서열이 될 것이다. 서열이 SEQ ID NO: 1(참조 서열의 예)과 적어도 95% 동일한지 여부를 평가하기 위해, 당업자는 SEQ ID NO: 1의 길이에 대해 정렬을 수행하고, 시험 서열의 몇 개의 위치가 SEQ ID NO: 1의 위치와 동일한지 식별해야 한다. 위치의 적어도 95%가 동일한 경우, 시험 서열은 SEQ ID NO: 1과 적어도 95% 동일하다. 시험 서열이 SEQ ID NO: 1보다 짧을 경우, 갭 또는 누락된 위치는 동일하지 않은 위치로 간주되어야 한다.
당업자는 2개의 서열들 사이의 상동성 또는 동일성을 결정하기 위해 이용가능한 상이한 컴퓨터 프로그램을 알고 있다. 예를 들어, 수학적 알고리즘을 사용하여 두 서열들 간의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정이 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열들 사이의 퍼센트 동일성은, Blosum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, Accelrys GCG 소프트웨어 패키지(http://www.accelrys.com/products/gcg/에서 이용가능함)의 GAP 프로그램에 통합되는 Needleman 및 Wunsch(1970) 알고리즘을 사용하여 결정된다.
단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명시적으로 달리 지시하지 않는 한 복수의 지칭을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "아미노산"에 대한 지칭은 그러한 아미노산의 2개 이상의 인스턴스 또는 버전을 포함한다.
본 발명의 목적 상, 용어 "단편(fragment)"은 서열의 인접(contiguous) 부분을 지칭한다. 예를 들어, 50개 아미노산의 SEQ ID NO: 1의 단편은 SEQ ID NO: 1의 50개의 인접 아미노산을 지칭한다.
상기 또는 하기와 관계없이 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
변형된 GCase 폴리펩티드
본 발명은 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드(GCase 변이체로도 지칭됨)를 제공한다. 용어 "변형된"은 야생형 GCase 폴리펩티드와 비교하여 적어도 하나의 차이를 갖는다는 것을 의미하며, 예를 들어, 돌연변이가 도입되었다. 산성 pH에서 생리학적 pH로 이동할 때, 이전에 양전하를 띤 잔기는 중성이 될 수 있고, 중성 잔기는 음전하를 띠게 되어, 폴리펩티드를 불안정하게 만들 수 있는 인력 또는 반발력 형성이 제거될 수 있다고 여겨진다. 이론에 의해 구속되지 않고, 이러한 아미노산 돌연변이는 생리학적 pH(따라서 혈액 내)에서 안정성을 향상시켜 GCase가 안정되어 활성화되는 시간을 연장하는 역할을 할 수 있다고 여겨진다. 예를 들어, 산성 pH에서는 양성자 공여체이지만 생리학적 pH에서는 양성자 공여체가 아닌 아미노산(예를 들어, 글루탐산)을 산성 pH에서는 양성자 공여체이면서 생리학적 pH에서는 양성자 공여체이기도 한 아미노산(예를 들어, 글루타민)으로 대체하는 것은 GCase 폴리펩티드를 안정화시키는 역할을 할 수 있다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 20개 이하, 10개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하 돌연변이를 포함한다(또는 이로 이루어짐). 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 10개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하 돌연변이를 포함한다(또는 이로 이루어짐). 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하 돌연변이를 포함한다(또는 이로 이루어짐). 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 3개 이하 돌연변이를 포함한다(또는 이로 이루어짐). 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 2개 이하 돌연변이를 포함한다(또는 이로 이루어짐). 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 하나의 돌연변이를 포함한다(또는 이로 이루어짐). 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 2개의 돌연변이를 포함한다(또는 이로 이루어짐).
본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 기능적이다. 기능적인 GCase 폴리펩티드는 글루코세레브로시드의 가수분해를 수행하는 것이다. GCase 폴리펩티드가 기능적인지 여부를 결정하는 것은 당업자의 능력 내에 있다. 당업자는 단지 GCase 폴리펩티드가 활성인지 여부를 시험할 필요가 있다. 예를 들어, 당업자는 본 명세서에서 논의된 바와 같이 GCase 폴리펩티드의 특이적인 활성을 결정할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드의 특이적인 활성의 적어도 20%(선택적으로 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%)를 갖는 경우(동일한 방법을 사용하여 결정됨), 기능적이다.
바람직하게는, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 변형된 인간 GCase 폴리펩티드이다.
본원에서 GCase 폴리펩티드의 "활성"(또는 "GCase 활성" 또는 "효소 활성"으로도 지칭됨)에 대한 언급은 GCase 폴리펩티드의 활성을 결정하기 위한 기능적인 분석법에서 관찰된 활성을 지칭한다. GCase 폴리펩티드의 활성은 본원에 기술된 것들과 같은 발색 분석법 또는 형광측정 분석법을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 적합한 형광측정 분석법은 다음과 같다. GCase 폴리펩티드는 GCase의 형광 기질인 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4-MUG)와 함께 인큐베이션된다. GCase에 의한 4-MUG의 가수분해는 형광 생성물인 4-메틸움벨리페론(4-MU)을 방출한다. 생성된 형광 생성물의 수준은 각각 365 nm 및 445 nm의 방출 및 여기 파장을 사용하여 측정될 수 있다. 선택적으로 형광 수준은 4-MU(예를 들어, Sigma-Aldrich) 표준 곡선을 기반으로 나노몰/시간/mL로 변환된다. 선택적으로, 형광 수준은 VPRIV 표준 곡선을 기준으로 mU/ml(예를 들어, 혈장) 또는 mU/mg(예를 들어, 단백질)로 변환된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 30분 동안 4-MUG와 함께 인큐베이션된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 37℃에서 4-MUG와 함께 인큐베이션된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 pH 5.75에서 30분 동안 37℃에서 4-MUG와 함께 인큐베이션된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어 Conduritol B 에폭시드의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 1시간 동안 4-MUG와 함께 인큐베이션된다. 예를 들어, 샘플 일부분은 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어, Conduritol B의의 존재 하에 인큐베이션되고, 샘플 일부분은 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어, Conduritol B의의 부재 하에 인큐베이션되고, 결과가 비교되어 GCase의 활성 수준이 수득된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 또는 pH 5.75에서 인큐베이션된다. GCase 폴리펩티드의 활성은 실시예 1의 "GCase 활성 결정"이라는 표제의 섹션에 기술된 프로토콜 또는 실시예 13의 "방법"이라는 표제의 섹션에 "GCase 활성 분석"으로 시작되는 문단에 기술된 프로토콜에 따라 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, GCase 폴리펩티드는 활성 측정 전에 정제된다. 단백질은 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 컬럼 크로마토그래피(예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피), HPLC 또는 전하 또는 소수성에 기반한 분리를 사용하여 정제될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 세파로스 컬럼(친화성 크로마토그래피 수지)을 사용하여 정제될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 실시예 1에 기술된 바와 같은 세파로스 컬럼(친화성 크로마토그래피 수지)을 사용하여 정제될 수 있다. GCase 폴리펩티드 활성은 정제된 GCase 폴리펩티드 상에서 수행된 형광측정 분석법(예를 들어 본원에 기술된 것들)에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 "유효 활성"("유효 GCase 활성"으로도 지칭됨)에 대한 언급은 생물학적 시스템에서 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열의 발현 후 GCase 폴리펩티드의 관찰된 활성을 지칭한다. "유효 활성"은 GCase 폴리펩티드의 효소 효율 및 GCase 폴리펩티드의 안정성의 함수이다. "유효 활성"은 "총 결과 활성"으로도 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유효 활성의 증가는 변형된 GCase 폴리펩티드의 안정성 증가의 결과이다. 일부 실시형태에서, 유효 활성의 증가는 변형된 GCase 폴리펩티드의 효소 효율 증가의 결과이다. 일부 실시형태에서, 유효 활성의 증가는 변형된 GCase 폴리펩티드의 효소 효율 및 안정성의 증가의 결과이다. 일부 실시형태에서, GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 프로모터에 작동가능하게 연결된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 입자를 생성하고, AAV 입자로 세포(예를 들어, 인간 세포, 선택적으로 Huh-7 세포)를 형질도입하고, 세포 및/또는 배양 배지로부터 GCase 폴리펩티드를 수확하고, 선택적으로, 형광측정 분석법을 사용하여 GCase 폴리펩티드의 활성을 측정함으로써 결정된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 입자는 약 16시간 동안 Huh-7 세포와 함께 인큐베이션되어 형질도입되게 하며, GCase 폴리펩티드는 배양 배지로부터 수확된다. 선택적으로, AAV 입자는 SEQ ID NO: 37의 캡시드를 포함한다. 선택적으로, 형질도입은 5x103, 1x104　또는 5x104　vg/세포의 감염 다중도에서 발생한다. 수확된 GCase 폴리펩티드의 활성은 본원에 기술된 바와 같은 형광측정 분석법 프로토콜에 따라 측정될 수 있다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드는 37℃에서 30분 동안 4-MUG와 함께 인큐베이션될 수 있다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 pH 5.75에서 30분 동안 37℃에서 4-MUG와 함께 인큐베이션된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어, Conduritol B 에폭시드의 존재 및 부재 하에서 37℃에서 1시간 동안 4-MUG와 함께 인큐베이션된다. 예를 들어, 샘플의 일부는 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어 Conduritol B 에폭시드의 존재 하에서 인큐베이션되고, 샘플의 일부는 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어 Conduritol B 에폭시드의 부재 하에서 인큐베이션되며, 결과가 비교되어 GCase의 활성 수준이 수득된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 또는 pH 5.75에서 인큐베이션된다. 생성된 형광 생성물의 수준은 각각 365 nm 및 445 nm의 방출 및 여기 파장을 사용하여 측정될 수 있다. 형광 수준은 4-메틸움벨리페론(4-MU, 예를 들어, Sigma-Aldrich) 표준 곡선을 기반으로 나노몰/시간/mL로 변환될 수 있다. 선택적으로, 수확된 GCase 폴리펩티드의 활성은 실시예 1의 "GCase 활성 결정"이라는 표제의 섹션에 기술된 형광측정 분석법 프로토콜 또는 실시예 13의 "방법"이라는 표제의 섹션에 "GCase 활성 분석"으로 시작되는 문단에 기술된 형광측정 분석법 프로토콜에 따라 측정된다. 선택적으로, 활성은 벡터 게놈 카피 수에 의해 정규화된다. 형질도입 후 세포에 존재하는 벡터 게놈 수가 결정될 수 있으며(예를 들어 qPCR에 의해) 측정된 GCase 폴리펩티드의 활성을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 형질도입 후 세포에 존재하는 벡터 게놈 수는 qPCR에 의해 결정된다. 선택적으로, 형질도입 후 세포에 존재하는 벡터 게놈 수는 프로모터에 결합하는(예를 들어, LSP-L 프로모터에 결합하는 것 외) 프라이머 세트를 사용하여 qPCR에 의해 결정된다. 선택적으로, 벡터 게놈 카피 수는 실시예 1의 "벡터 게놈 카피 수"라는 표제의 섹션의 첫 번째 문단에 따라 결정된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 실시예 8의 방법론을 사용하여 결정된다.
일부 실시형태에서, GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 프로모터에 작동가능하게 연결된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 입자를 생성하고, AAV 입자를 마우스에 주입하고, 마우스의 혈장, 백혈구 세포 및/또는 조직(예를 들어 간, 비장, 골수 및/또는 폐)의 활성 수준을 선택적으로 형광측정 분석법을 사용하여 측정함으로써 결정된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 입자는 단일 미정맥 주입을 통해 예를 들어 2x109 vg/kg 내지 2x1012　vg/kg의 용량으로 마우스에 주입될 수 있다. 선택적으로, 용량은 2x109 vg/kg, 2x1010 vg/kg, 2x1011 vg/kg, 6x1011 vg/kg, 및 2x1012　vg/kg으로부터 선택된다. 선택적으로, 용량은 6x1010 vg/kg이다. 선택적으로, AAV 입자는 AAV8 캡시드를 포함한다. 혈장 샘플은 처리 후 14일차에(역-안와 출혈(retro-orbital bleeding)에 의해) 또는 처리 후 28일차에(역-안와 출혈에 의해) 수득될 수 있다. 동물은 처리 후 4주 또는 6주차에 도태될 수 있고 혈장, 백혈구 세포, 및/또는 기타 조직(예를 들어 간, 비장, 골수, 및/또는 폐)가 수집된다. 선택적으로, 동물은 처리 후 4주차에 도태된다. 수확된 혈장, 백혈구 세포, 및/또는 기타 조직에서의 GCase 폴리펩티드의 활성은 본원에 기술된 바와 같은 형광측정 분석법 프로토콜에 따라 측정될 수 있다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드는 37℃에서 30분 동안 4-MUG와 함께 인큐베이션될 수 있다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 pH 5.75에서 30분 동안 4-MUG와 함께 인큐베이션된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어 Conduritol B 에폭시드의 존재 및 부재 하에서 37℃에서 1시간 동안 4-MUG와 함께 인큐베이션된다. 예를 들어, 샘플의 일부는 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어 Conduritol B 에폭시드의 존재 하에서 인큐베이션되고, 샘플의 일부는 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어 Conduritol B 에폭시드의 부재 하에서 인큐베이션되고, 결과가 비교되어 GCase 활성 수준이 수득된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 또는 pH 5.75에서 인큐베이션된다. 생성된 형광 생성물의 수준은 각각 365 nm 및 445 nm의 방출 및 여기 파장을 사용하여 측정될 수 있다. 혈장, 조직 및 WBC에서의 GCase 폴리펩티드의 활성은 VPRIV 표준 곡선을 사용하여, mU/ml 혈장(혈장의 경우) 또는 mU/mg 단백질(조직 및 WBC의 경우) 단위로 제시될 수 있다. 선택적으로, GCase 활성은 4-MU 표준 곡선을 사용하여, 혈장 또는 조직에 대해, 각각 nmole/h/ml 또는 nmole/h/mg로서 계산될 수 있다. 선택적으로, 수확된 혈장, 백혈구 세포, 및/또는 기타 조직에서의 GCase 폴리펩티드의 활성은 실시예 1의 "GCase 활성 결정"이라는 표제의 섹션에 기술된 형광측정 분석법 프로토콜 또는 실시예 13의 "방법"이라는 표제의 섹션에서 "GCase 활성 분석"으로 시작하는 문단에 기술된 형광측정 분석법 프로토콜에 따라 측정될 수 있다. 선택적으로, 활성은 벡터 게놈 카피 수에 의해 정규화된다. AAV 입자 주입 후 간에 존재하는 벡터 게놈 수가 결정될 수 있고(예를 들어 qPCR에 의해) 측정된 GCase 폴리펩티드의 활성을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, AAV 입자 주입 후 간에 존재하는 벡터 게놈 수가 qPCR에 의해 결정된다. 선택적으로, AAV 입자 주입 후 간에 존재하는 벡터 게놈 수는 프로모터에 결합하는(예를 들어, LSP-L 프로모터에 결합하는 것 외) 프라이머 세트를 사용하여 qPCR에 의해 결정된다. 선택적으로, 벡터 게놈 카피 수는 실시예 1의 "벡터 게놈 카피 수"라는 표제의 섹션의 두 번째 문단에 따라 결정된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 실시예 9의 방법론을 사용하여 결정된다.
본 발명은 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드를 제공한다. 적어도 하나의 돌연변이는:
(i) 보다 높은 유효 활성을 제공할 수 있고/있거나;
(ii) 증가된 안정성을 제공할 수 있고/있거나;
(iii) 생리학적 pH에서 구조적인 안정화를 제공할 수 있고/있거나;
(iv) 보다 긴 반감기를 제공할 수 있고/있거나;
(v) 증가된 열안정성을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 보다 높은 유효 활성을 제공한다.
보다 높은 유효 활성을 제공하는 예시적인 돌연변이가 본원에 개시되어 있다. "적어도 하나의 돌연변이가 더 높은 유효 활성을 제공한다"는 것을 명시함으로써, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않지만 그 외에는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일한 참조 GCase 폴리펩티드보다 더 높은 유효 활성을 갖는다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이가 보다 높은 유효 활성을 제공하고 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 돌연변이 W351C 및 A380C)를 포함한다는 것을 제외하고 그 외에는 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 경우, 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드보다 더 높은 유효 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 제외하고 SEQ ID NO: 1과 동일한 "시험" 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드와 비교하여 더 높은 유효 활성을 갖고, 선택적으로 상기 "시험" 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 1은 동일한 세포주에서 발현에 의해 생산되는 경우, 적어도 하나의 돌연변이는 "보다 높은 유효 활성을 제공"한다.
적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드보다 더 높은 유효 활성을 가질 필요는 없을 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 폴리펩티드의 유효 활성을 감소시키는 하나 이상의 추가 변형(예를 들어 결실된 부분)을 포함할 수 있음이 고려된다. 그러한 경우에, 본원에 개시된 적어도 하나의 돌연변이는 변형된 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 유효 활성을 갖지 않을 수 있지만 그럼에도 불구하고 그 외에는 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일하지만 적어도 하나의 돌연변이가 결여되어 있는 참조 GCase 폴리펩티드보다 더 높은 유효 활성을 갖도록 변형된 GCase 폴리펩티드에 더 높은 유효 활성을 제공하는 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성을 야생형 GCase 폴리펩티드의 유효 활성의 수준으로 회복시키는 증가된 유효 활성을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 더 높은 유효 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 더 높은 유효 활성을 갖는다. 예를 들어, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교된다. 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성을 증가시키는 예시적인 돌연변이가 본원에 개시되어 있다.
"참조 GCase 폴리펩티드"는 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않는 GCase 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않지만 그 외에는 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일하다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 5 중 임의의 하나의 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 임의의 야생형 GCase 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 임의의 하나의 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드일 수 있다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드가 아니고 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않는다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 184에 상응하는 위치에 류신으로의 돌연변이, 선택적으로 H184L을 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 184에 상응하는 위치에 류신으로의 돌연변이, 선택적으로 H184L를 포함하며, 참조 GCase 폴리펩티드는 또한 SEQ ID NO: 1의 위치 360에 상응하는 위치에 아스파라긴으로의 돌연변이, 선택적으로 K360N을 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 H184L 및 K360N을 포함한다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 41 또는 44의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 43 또는 46의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 42 또는 45의 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드 예를 들어 VPRIV일 수 있다. 선택적으로, VPRIV는 멸균수 또는 뉴클레아제가 없는 물에 재구성된다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 이미글루세라제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에 히스티딘으로의 돌연변이, 선택적으로 R534H를 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에 히스티딘으로의 돌연변이를 제외하고 SEQ ID NO: 1 또는 2의 서열을 포함하거나 SEQ ID NO: 1 또는 2의 서열이다.
변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드(본원에 기술된 바와 같은 것, 예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)에 비해 더 높은 유효 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해, 변형된 GCase 폴리펩티드 및 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 동일한 방법과 비교된 결과를 사용하여 결정된다. 이러한 방법은 유효 활성을 결정하기 위해 본 명세서에 기술된 임의의 방법일 수 있다.
본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드(예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)의 유효 활성보다 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배 더 높은 유효 활성을 가질 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드(예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)의 유효 활성보다 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 또는 적어도 50배 더 높은 유효 활성을 가질 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드(예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)의 유효 활성보다 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 또는 적어도 50배 더 높은 유효 활성을 가질 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드(예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)의 유효 활성보다 1.2배 내지 3배, 1.2배 내지 5배, 3배 내지 6배, 5배 내지 10배, 1.5배 내지 8배, 2배 내지 10배, 3배 내지 15배, 6배 내지 15배, 10배 내지 15배, 15배 내지 20배, 10배 내지 30배, 20배 내지 30배, 25배 내지 30배, 25배 내지 40배, 또는 30배 내지 50배 더 높은 유효 활성을 가질 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드(예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)의 유효 활성보다 2배 내지 100배, 10배 내지 100배, 10배 내지 80배, 25배 내지 100배, 또는 25배 내지 80배 더 높은 유효 활성을 가질 수 있다. 활성의 배수 변화를 언급할 때, "내지(between)"라는 용어에는 지정된 값이 포함된다. 따라서, 예를 들어 "1.5배 내지 8배"는 1.5배와 8배의 값을 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 증가된 안정성(보다 높은 안정성으로도 지칭됨)을 제공한다. 증가된 안정성을 제공하는 예시적인 돌연변이가 본원에 개시되어 있다. "적어도 하나의 돌연변이가 증가된 안정성을 제공한다"라고 명시함으로써, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않지만 그 외에는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일한 참조 GCase 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 갖는다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이가 증가된 안정성을 제공하고 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 돌연변이 W351C 및 A380C)를 포함하는 것을 제외하고 그 외에는 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 경우, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이가 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드에 비해 더 높은 안정성을 갖는 것을 제외하고 SEQ ID NO: 1과 동일한 "시험" 폴리펩티드이며, 선택적으로 상기 "시험" 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 1은 동일한 세포주에서 발현에 의해 생산되는 경우, 적어도 하나의 돌연변이는 "증가된 안정성을 제공"한다. 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 가질 필요는 없을 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 폴리펩티드의 안정성을 감소시키는 하나 이상의 추가 변형(예를 들어 결실 부분)을 포함할 수 있음이 고려된다. 그러한 경우에, 본원에 개시된 적어도 하나의 돌연변이는 변형된 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 안정성을 갖지 않을 수 있지만 그럼에도 불구하고 그 외에는 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일하지만 적어도 하나의 돌연변이가 결여되어 있는 참조 GCase 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 갖도록, 변형된 GCase 폴리펩티드에 대해 더 높은 안정성을 제공하는 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 변형된 GCase 폴리펩티드의 안정성을 야생형 GCase 폴리펩티드의 안정성의 수준으로 회복시키는 증가된 안정성을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 증가된 안정성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이에 의해 제공되는 증가된 안정성 또는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드의 증가된 안정성은 pH 7.4에서의 증가된 안정성이다. 일부 실시형태에서, 증가된 안정성은 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이에 의해 제공되는 증가된 안정성 또는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드의 증가된 안정성은 pH 5.6에서의 증가된 안정성이다. 일부 실시형태에서, 증가된 안정성은 pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정된다. 일부 실시형태에서, 증가된 안정성은 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성이다. 예를 들어, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드일 수 있다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖는다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖고 증가된 안정성은 pH 7.4에서의 증가된 안정성이다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase의 안정성은 참조 GCase 폴리펩티드의 안정성과 비교된다. 변형된 GCase 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 예시적인 돌연변이가 본원에 개시되어 있다. 예를 들어, 이황화 결합의 형성을 가능케 하는 돌연변이.
참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖는 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 시간 경과에 따라 더 높은 비율의 GCase 활성을 유지한다. 일부 실시형태에서, GCase 폴리펩티드의 안정성은 GCase 폴리펩티드의 잔류 효소 활성을 측정함으로써 결정된다. 본원에서 "잔류 효소 활성"(또는 "잔류 GCase 활성" 또는 "잔류 활성"으로도 지칭됨)이라는 언급은 특정 기간이 경과한 후에 유지되는 GCase 폴리펩티드의 활성을 지칭한다. GCase의 잔류 효소 활성은 하나 이상의 특정 시간이 경과한 후 샘플에서 측정될 수 있다. 선택적으로, 샘플은 숙주 세포(예를 들어 Expi293F 세포)를 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염시키고, 배양 배지로부터 GCase 폴리펩티드를 수확함으로써 수득된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 형질감염 후 4일 차에 배양 배지로부터 수확된다. 선택적으로 샘플은 실시예 1의 "Expi293F 세포의 확장", "Expi293F 세포의 형질감염 전 일", "Expi293F 세포의 형질감염" 및 "형질감염된 Expi293F 세포의 수확"이라는 표제의 섹션에 기술된 방법에 따라 수득된다. GCase 폴리펩티드를 함유하는 샘플은 매트릭스(예를 들어 pH 5.6의 AB 완충액, pH 7.4의 PBS, 혈청 또는 혈장)로 옮겨져 인큐베이션될 수 있다. 특정 pH에서 잔류 활성(또는 안정성)을 결정하기 위해 매트릭스의 pH가 선택될 수 있다. 인큐베이션 온도는 특정 온도에서 잔류 활성(또는 안정성)을 결정하기 위해 선택될 수 있다. GCase 폴리펩티드를 함유하는 인큐베이션된 샘플의 분취량은 일련의 시점, 예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 시점에서 취해질 수 있고, 또한 초기 시점에서 샘플의 분취량을 취하고 각 분취량에서 GCase 활성이 결정될 수 있다. 초기 시점(즉, 0분 또는 0시간)은 샘플이 인큐베이션을 위해 매트릭스로 옮겨지는 시간이다. 주어진 시점에서의 GCase 활성을 초기 시점에서의 GCase 활성과 비교하면 주어진 시점에서 잔류 GCase 활성을 결정할 수 있다. GCase 폴리펩티드를 함유하는 샘플의 분취량은 0분, 30분, 60분, 120분, 3일, 4일, 5일, 6일, 및/또는 7일에 취해질 수 있다. 선택적으로, 샘플은 pH 7.4의 PBS에서 120분 동안 인큐베이션된다. 선택적으로, 샘플은 pH 7.4의 PBS에서 72시간 동안 인큐베이션된다. 선택적으로, 샘플은 pH 7.4의 PBS에서 7일 동안 인큐베이션된다. 선택적으로, 샘플은 pH 5.6의 AB 완충액에서 72시간 동안 인큐베이션된다. 선택적으로, 잔류 효소 활성은 실시예 1의 "안정성 평가"라는 표제의 섹션에 따라 샘플에서 측정된다. 분취량에서의 GCase 폴리펩티드의 활성은 본원에 기술된 형광측정 분석법 프로토콜에 따라 측정될 수 있다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드는 37℃에서 30분 동안 4-MUG와 함께 인큐베이션될 수 있다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 pH 5.75에서 30분 동안 37℃에서 4-MUG와 함께 인큐베이션될 수 있다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어 Conduritol B 에폭시드의 존재 및 부재 하에 37℃에서 1시간 동안 4-MUG와 함께 인큐베이션된다. 예를 들어, 샘플의 일부는 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어 Conduritol B 에폭시드의 존재 하에 인큐베이션되고, 샘플의 일부는 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어 Conduritol B 에폭시드의 부재 하에 인큐베이션되고, 결과가 비교되어 GCase의 활성 수준이 수득된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 또는 pH 5.75에서 인큐베이션된다. 생성된 형광 생성물의 수준은 각각 365 nm 및 445 nm의 방출 및 여기 파장을 사용하여 측정될 수 있다. 선택적으로, 분취량에서의 GCase 폴리펩티드의 활성은 실시예 1의 "GCase 활성 결정"이라는 표제의 섹션에 기술된 형광측정 분석법 프로토콜 또는 실시예 13의 "방법"이라는 표제의 섹션에 "GCase 활성 분석"으로 시작되는 문단에 기술된 형광측정 분석법 프로토콜에 따라 측정될 수 있다. 주어진 시점에서의 GCase 활성은 샘플의 초기 GCase 활성과 비교될 수 있으며(즉, 또한 초기 시점에서 GCase 활성 결정에 의해), 잔류 GCase 활성은 초기 GCase 활성의 퍼센트로서 계산될 수 있다. 따라서, 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖는 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드보다 더 높은 잔류 활성(즉, 초기 GCase 폴리펩티드 활성의 퍼센트로서)을 가질 수 있다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 VPRIV와 같은 야생형 GCase 폴리펩티드일 수 있다. 선택적으로, VPRIV는 뉴클레아제가 없거나 멸균수에서 재구성된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드의 잔류 효소 활성은 실시예 3의 방법론을 사용하여 결정된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드의 잔류 효소 활성은 실시예 4의 방법론을 사용하여 결정된다.
선택적으로, 특정 활성이 각 시점에서 결정될 수 있다. "특정 활성"은 샘플 내 GCase 폴리펩티드의 양 또는 농도를 고려하여 활성이 '정상화'되는 GCase 폴리펩티드 단위 당 활성을 지칭한다. 이는 예를 들어 표준 ELISA 분석을 사용하여 샘플에서 GCase 폴리펩티드의 농도를 측정하고, 활성을 GCase 농도로 나눔으로써 수행될 수 있다. "특정 활성"을 측정하기 위해 형광측정 분석법이 사용될 수 있다. 형광측정 분석법은 본원에 기술된 형광측정 분석 중 임의의 하나일 수 있다.
ELISA 분석의 예에서, GCase 폴리펩티드에 결합하는 항체는 플레이트에 결합될 수 있다. 미지의 농도의 GCase 폴리펩티드를 포함하는 샘플은 플레이트 위로 통과할 수 있다. GCase 폴리펩티드에 결합하는 두 번째 검출 항체가 플레이트에 적용되고 초과분이 씻겨내질 수 있다. 남아 있는(즉, 씻겨 나가지 않은) 검출 항체는 GCase 폴리펩티드에 결합될 것이다. 검출 항체는 양고추냉이 과산화효소와 같은 효소에 연결될 수 있다. 플레이트 상의 GCase 폴리펩티드에 결합하는 검출 항체의 수준은 검출 항체의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 검출 항체가 양고추냉이 과산화효소에 연결되면, 양고추냉이 과산화효소는 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)와 같은 기질로부터 청색 반응 생성물의 생성을 촉매할 수 있고, 청색 생성물의 수준은 450 nm에서의 흡광도에 의해 검출될 수 있다. 청색 생성물의 수준은 세척 단계 후에 남아있는 검출 항체의 양에 비례하며, 이는 샘플의 GCase 폴리펩티드의 양에 비례한다. 대안적으로, 예를 들어 정제된 단백질을 사용하는 경우, GCase 폴리펩티드의 양 또는 농도는 분광광도계로 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, GCase 폴리펩티드의 안정성은 GCase 폴리펩티드의 반감기를 측정함으로써 결정된다. 반감기는 본원에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.
변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드(본원에 기술된 바와 같은 것, 예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)에 비해 더 증가된 안정성을 갖는지 여부를 결정하기 위해, 변형된 GCase 폴리펩티드 및 참조 GCase 폴리펩티드의 안정성은 동일한 방법과 비교된 결과를 사용하여 결정된다. 이러한 방법은 안정성을 결정하기 위해 본 명세서에 기술된 임의의 방법일 수 있다.
변형된 GCase 폴리펩티드의 안정성 또는 잔류 활성은 적어도 5분, 적어도 10분, 적어도 15분, 적어도 20분, 적어도 25분, 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 8시간, 적어도 9시간, 적어도 10시간, 적어도 11시간, 적어도 12시간, 적어도 18시간, 적어도 24시간, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 또는 적어도 7일의 인큐베이션 후 결정될 수 있다. 선택적으로, 샘플 중의 변형된 GCase 폴리펩티드의 증가된 안정성 또는 증가된 잔류 활성은 적어도 5분, 적어도 10분, 적어도 15분, 적어도 20분, 적어도 25분, 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 8시간, 적어도 9시간, 적어도 10시간, 적어도 11시간, 적어도 12시간, 적어도 18시간, 적어도 24시간, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 또는 적어도 7일의 인큐베이션 후에 관찰될 수 있다.
변형된 GCase 폴리펩티드의 잔류 활성은 초기 GCase 활성의 백분율로서 표현될 수 있다. 여기에서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 특정 시점에서 적어도 X%(예를 들어, X는 30일 수 있음)의 활성을 "유지"한다고 명시되어 있는 경우, 이는 변형된 GCase 폴리펩티드가 적어도 X%의 잔류 활성(예를 들어, 적어도 30%의 잔류 활성)을 갖는다는 의미로 해석되어야 한다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같이 측정되는 경우(예를 들어, 활성이 시간 경과에 따라 측정되고 주어진 시점에서의 활성이 샘플의 초기 GCase 활성과 비교되는 경우) 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 활성을 유지할 수 있다. 활성은 pH 5.6에서 인큐베이션 후 측정될 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 90%, 또는 적어도 95% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 60% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 80% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 85% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 40% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 60% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 80% 활성을 유지할 수 있다. 활성은 pH 7.4에서 인큐베이션 후 측정될 수 있다. 활성은 37℃에서 인큐베이션 후 측정될 수 있다. 활성은 pH 7.4 및 37℃에서 인큐베이션 후 측정될 수 있다. 인큐베이션은 PBS 중에서일 수 있다. 인큐베이션은 혈청 또는 혈장 중에서일 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 적어도 10분, 적어도 30분, 적어도 60분, 적어도 120분, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 또는 적어도 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드는 동일한 조건(예를 들어, 변형된 GCase 폴리펩티드 및 참조(예를 들어 야생형) GCase의 활성 각각이 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정됨) 하에 측정되는 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드(예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)의 활성에 비해 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2배, 적어도 2.1배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 2.6배, 적어도 2.7배, 적어도 2.8배, 적어도 2.9배, 또는 적어도 3배 더 높은 활성을 유지한다. "동일한 조건"이라는 언급은 실험적 공차의 관점에서 허용가능한 임의의 변형이 포함됨을 나타낸다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 동일한 조건 하에서 측정되는 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 또는 적어도 90배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 2.8배, 또는 적어도 3배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 1.1배 내지 10배, 2배 내지 8배, 또는 2배 내지 5배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 72시간 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 또는 적어도 90배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 72시간 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 1.1배 내지 150배, 2배 내지 120배, 또는 2배 내지 100배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 72시간 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 72시간 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 또는 적어도 90배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 1.1배 내지 150배, 2배 내지 120배, 또는 2배 내지 100배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 15% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 20% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 40% 활성을 유지할 수 있다. 인큐베이션은 혈청 또는 혈장 중에서일 수 있다. 인큐베이션은 PBS 중에서일 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 60% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 80% 활성을 유지할 수 있다. 활성은 인간 혈장 중에서 인큐베이션 후 측정될 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈장 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 4배, 또는 적어도 5배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈장 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 1.1배 내지 10배, 2배 내지 8배, 또는 4배 내지 8배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈장 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈장 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 또는 적어도 50배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈장 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 10배 내지 100배, 20배 내지 100배, 또는 20배 내지 80배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈장 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈장 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 또는 적어도 50배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈장 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 10배 내지 100배, 20배 내지 100배, 또는 20배 내지 80배 더 높은 활성을 유지할 수 있다.
변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈장 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 20% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈장 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 30% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈장 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 40% 활성을 유지할 수 있다. 활성은 인간 혈청에서 인큐베이션 후 측정될 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈청 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 또는 적어도 2배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈청 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 1.1배 내지 10배, 1.1배 내지 8배, 또는 1.1배 내지 5배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈청 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈청 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배 더 높은, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 또는 적어도 40배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈청 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 1.1배 내지 100배, 2배 내지 80배, 또는 5배 내지 80배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈청 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 20%, 적어도 30%, 또는 적어도 40% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈청 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 또는 적어도 40배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈청 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 10배 내지 100배, 20배 내지 100배, 또는 20배 내지 80배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈청 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 20% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈청 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 30% 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈청 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 40% 활성을 유지할 수 있다.
변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4(선택적으로 PBS에서) 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.5배, 적어도 1.7배 또는 적어도 1.8배 더 높은 활성을 유지할 수 있으며, 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 184에 상응하는 위치에서 히스티딘의 류신으로의 치환을 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4이다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4(선택적으로 PBS에서) 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.1배, 또는 적어도 1.2배 더 높은 활성을 유지할 수 있으며, 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 EQ ID NO: 1의 위치 184에 상응하는 위치에 히스티딘의 류신으로의 치환 및 SEQ ID NO: 1의 위치 360에 상응하는 위치에 리신의 아스파라긴으로의 치환을 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5이다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4(선택적으로 PBS에서) 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 3의 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.5, 또는 적어도 1.7배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4(선택적으로 PBS에서) 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 또는 적어도 90배 더 높은 활성을 유지할 수 있으며, 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 184에 상응하는 위치에 히스티딘의 류신으로의 치환을 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4이다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4(선택적으로 PBS에서) 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 또는 적어도 90배 더 높은 활성을 유지할 수 있으며, 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 184에 상응하는 위치에 히스티딘의 류신으로의 치환 및 SEQ ID NO: 1의 위치 360에 상응하는 위치에 리신의 아스파라긴으로의 치환을 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5이다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4(선택적으로 PBS에서) 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 3의 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 또는 적어도 90배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4(선택적으로 PBS에서) 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 높은 활성을 유지할 수 있으며, 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 184에 상응하는 위치에 히스티딘의 류신으로의 치환을 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4이다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4(선택적으로 PBS에서) 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 높은 활성을 유지할 수 있으며, 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 184에 상응하는 위치에 히스티딘의 류신으로의 치환 및 SEQ ID NO: 1의 위치 360에 상응하는 위치에 리신의 아스파라긴으로의 치환을 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5이다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4(선택적으로 PBS에서) 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 3의 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈장 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 3의 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 3배, 적어도 4배, 또는 적어도 5배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 인간 혈청 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 3의 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 또는 적어도 2배 더 높은 활성을 유지할 수 있다.
변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 및 37℃에서 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 또는 적어도 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지할 수 있다. 선택적으로 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 PBS에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 또는 적어도 60% 활성을 유지한다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 PBS에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 50% 활성을 유지한다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 30배, 또는 적어도 50배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 예를 들어, 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 30배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 PBS에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 30배, 또는 적어도 50배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 예를 들어, 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 PBS에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 30배 더 높은 활성을 유지할 수 있다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 80% 활성을 유지한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 생리학적 pH(예를 들어 pH 7.4)에서 구조적인 안정화를 제공한다. 구조적인 안정화를 제공하는 예시적인 돌연변이가 본원에 개시되어 있다. "적어도 하나의 돌연변이가 생리학적 pH에서 구조적인 안정화를 제공한다"라고 명시함으로써, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않지만 그 외에는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일한 참조 GCase 폴리펩티드보다 생리학적 pH에서 보다 구조적으로 안정하다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이가 생리학적 pH에서 구조적인 안정화를 제공하고 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 돌연변이 W351C 및 A380C)를 포함하는 것을 제외하고 그 외에는 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 경우, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드보다 생리학적 pH에서 보다 구조적으로 안정하다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 제외하고 SEQ ID NO: 1과 동일한 "시험" 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드에 비해 생리학적 pH에서 보다 구조적으로 안정하고, 선택적으로 상기 "시험" 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 1이 동일한 세포주에서 발현에 의해 생산되는 경우, 적어도 하나의 돌연변이는 "생리학적 pH에서 구조적인 안정화를 제공"한다. 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드보다 생리학적 pH에서 보다 반드시 구조적으로 안정하지 않을 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 폴리펩티드의 생리학적 pH에서 구조적인 안정성을 감소시키는 하나 이상의 추가의 변형(예를 들어 결실된 부분)을 포함할 수 있음이 고려된다. 이러한 경우, 본원에 개시된 적어도 하나의 돌연변이는 변형된 GCase 폴리펩티드가 생리학적 pH에서 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 구조적인 안정성을 갖지 않을 수 있지만 그럼에도 불구하고 그 외에는 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일하지만 적어도 하나의 돌연변이가 결여되어 있는 참조 GCase 폴리펩티드보다 생리학적 pH에서 더 높은 구조적인 안정성을 갖도록, 변형된 GCase 폴리펩티드에 대해 생리학적 pH에서 더 높은 구조적 안정성을 제공하는 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 생리학적 pH에서 변형된 GCase 폴리펩티드의 구조적인 안정성을 야생형 GCase 폴리펩티드의 구조적인 안정성의 수준으로 회복시키는 생리학적 pH에서 구조적인 안정화를 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 생리학적 pH(예를 들어 pH 7.4)에서 보다 구조적으로 안정하다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 pH 7.4에서 구조적인 안정화를 제공한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4에서 보다 구조적으로 안정하다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 생리학적 pH(예를 들어 pH 7.4)에서 보다 구조적으로 안정하다. 예를 들어, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드일 수 있다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 생리학적 pH에서 보다 구조적으로 안정하다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 pH 7.4에서 보다 구조적으로 안정하다. 일부 실시형태에서, 생리학적 pH에서 변형된 GCase의 구조적인 안정성은 생리학적 pH에서 참조 GCase 폴리펩티드의 구조적인 안정성과 비교된다. 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드의 생리학적 pH에서의 구조적인 안정화를 제공하는 예시적인 돌연변이가 본원에 개시되어 있다. 예를 들어, 이황화 결합의 형성을 가능케 하는 돌연변이다.
pH 7.4에서 GCase 폴리펩티드의 구조적인 안정성은 GCase 폴리펩티드의 안정성 또는 반감기를 결정하기 위해 본원에 기술된 방법 중 임의의 하나를 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 방법에서, GCase 폴리펩티드를 함유하는 샘플의 임의의 인큐베이션은 생리학적 pH(예를 들어 pH 7.4)에서 일 수 있다.
변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드(본원에 기술된 바와 같은 것, 예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)에 비해 생리학적 pH에서 보다 구조적으로 안정한지 여부를 결정하기 위해, 변형된 GCase 폴리펩티드 및 참조 GCase 폴리펩티드의 생리학적 pH에서의 구조적인 안정성은 동일한 방법과 비교된 결과를 사용하여 결정된다. 이러한 방법은 안정성 또는 반감기를 결정하기 위해 본 명세서에 기술된 임의의 방법일 수 있다.
폴리펩티드의 안정성 또는 구조적인 안정성은 전형적으로 아미노산 측쇄들 간의 상호작용에 의해 및/또는 아미노산 측쇄(들)와 단백질 백본 사이의 상호작용에 의해 매개된다. 상호작용은 비-공유 상호작용일 수 있다. 대안적으로, 공유 결합(예를 들어 이황화 결합)이 형성될 수 있다. GCase 폴리펩티드는 따라서 아미노산 측쇄들 간 및/또는 아미노산 측쇄(들)와 GCase 폴리펩티드의 단백질 백본 사이의 상호작용을 안정화하는 아미노산 치환(들)(치환 돌연변이)에 의해 안정화될 수 있다(예를 들어 참조 GCase 폴리펩티드에 비해). 예를 들어, 변형된 GCase 폴리펩티드에서 SEQ ID NO: 1의 위치 351 및 380에 상응하는 위치에서 시스테인들 사이에 형성된 이황화 결합은 증가된 안정성 또는 구조적인 안정화를 제공할 수 있다. 이황화 결합이 SEQ ID NO: 1의 위치 351 및 380에 상응하는 위치에서 시스테인들 사이에 형성된 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성 또는 구조적인 안정성을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 보다 긴 반감기를 제공한다. 보다 긴 반감기를 제공하는 예시적인 돌연변이가 본원에 개시되어 있다. "적어도 하나의 돌연변이가 보다 긴 반감기를 제공한다"라고 명시함으로써, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않지만 그 외에는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일한 참조 GCase 폴리펩티드보다 더 긴 반감기를 갖는다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이가 보다 긴 반감기를 제공하고 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 돌연변이 W351C 및 A380C)를 포함하는 것을 제외하고 그 외에는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 경우, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드보다 더 긴 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 제외하고 SEQ ID NO: 1와 동일한 "시험" 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드에 비해 보다 긴 반감기를 갖고, 선택적으로 상기 "시험" 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 1과 동일한 세포주에서 발현에 의해 생산되는 경우 적어도 하나의 돌연변이는 "보다 긴 반감기를 제공"한다. 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드보다 반드시 더 긴 반감기를 가질 필요는 없을 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 폴리펩티드의 반감기를 감소시키는 하나 이상의 추가 변형(예를 들어 결실된 부분)을 포함할 수 있음이 고려된다. 이러한 경우, 본원에 개시된 적어도 하나의 돌연변이는 변형된 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 반감기를 갖지 않을 수 있지만 그럼에도 불구하고 그 외에는 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일하지만 적어도 하나의 돌연변이가 결여되어 있는 참조 GCase 폴리펩티드보다 더 긴 반감기를 갖도록 변형된 GCase 폴리펩티드에 대해 더 긴 반감기를 제공하는 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 변형된 GCase 폴리펩티드의 반감기를 야생형 GCase 폴리펩티드의 전형적인 반감기로 회복시키는 보다 긴 반감기를 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 보다 긴 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 보다 긴 반감기를 갖는다. 예를 들어, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드의 반감기는 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기와 비교된다. 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 예시적인 돌연변이가 본원에 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드의 안정성 또는 구조적인 안정성은 반감기를 결정함으로써 결정될 수 있다.
선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 긴 반감기를 가질 수 있다. 즉, 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 긴 보다 긴 반감기를 가질 수 있다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기보다 1.2배 내지 30배, 또는 1.2배 내지 25배 더 긴 반감기를 가질 수 있다. 즉, 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기보다 1.2배 내지 30배, 또는 1.2배 내지 25배 더 긴 보다 긴 반감기를 가질 수 있다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기보다 1.2배 내지 20배, 1.2배 내지 15배, 또는 2배 내지 15배 더 긴 반감기를 가질 수 있다. 즉, 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기보다 1.2배 내지 20배, 1.2배 내지 15배, 또는 2배 내지 15배 더 긴 보다 긴 반감기를 가질 수 있다. 보다 긴 반감기는 생리학적 pH, 예를 들어 pH 7.4에서 보다 긴 반감기일 수 있다. 선택적으로, 반감기는 pH 5.6 또는 pH 7.4에서 측정될 수 있다. 보다 긴 반감기는 pH 7.4에서 보다 긴 반감기일 수 있다. 예를 들어, 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 1.8배 더 긴 pH 7.4에서의 반감기를 가질 수 있다. 보다 긴 반감기는 리소좀 pH에서 보다 긴 반감기일 수 있다. 보다 긴 반감기는 pH 5.6에서의 보다 긴 반감기일 수 있다. 예를 들어, 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 20배 더 긴 pH 5.6에서의 반감기를 가질 수 있다. 선택적으로, 반감기는 적합한 매트릭스, 예를 들어, 혈청(예를 들어 인간 또는 마우스) 또는 혈장(예를 들어 인간 또는 마우스)에서 측정될 수 있다. 보다 긴 반감기는 혈청 또는 혈장에서 보다 긴 반감기일 수 있다. 바람직하게는, 반감기가 혈청(예를 들어 인간)에서 측정되는 경우 반감기는 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 5배 더 길다. 반감기는 형광측정 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 반감기는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 반감기는 일련의 특정 시간이 경과한 후 샘플에서 잔류 효소 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 선택적으로, 샘플은 숙주 세포(예를 들어 Expi293F 세포)를 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염시키고, 및 배양 배지로부터 GCase 폴리펩티드를 수확함으로써 수득된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 형질감염 후 4일 차에 배양 배지로부터 수확된다. 선택적으로 샘플은 실시예 1의 "Expi293F 세포의 확장", "Expi293F 세포의 형질감염 전 일", "Expi293F 세포의 형질감염" 및 "형질감염된 Expi293F 세포의 수확"이라는 표제의 섹션에 기술된 방법에 따라 수득된다. GCase 폴리펩티드를 함유하는 샘플은 매트릭스(예를 들어 pH 5.6의 AB 완충액, pH 7.4의 PBS, 혈청 또는 혈장)로 옮겨져 인큐베이션될 수 있다. 매트릭스의 pH는 특정 pH에서의 반감기를 결정하기 위해 선택될 수 있다. 인큐베이션 온도는 특정 온도에서의 반감기를 결정하기 위해 선택될 수 있다. 인큐베이션은 37℃에서일 수 있다. GCase 폴리펩티드를 함유하는 인큐베이션된 샘플의 분취량은 적합한 시점(예를 들어 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24, 48, 120, 및 144시간)에서 제거될 수 있다. 초기 시점(즉, 0분 또는 0시간)은 샘플이 인큐베이션을 위해 매트릭스로 옮겨지는 시간이다. 주어진 시점에서의 GCase 활성을 초기 시점에서의 GCase 활성과 비교하는 것은 잔류 GCase 활성이 주어진 시점에서 결정될 수 있게 한다. 선택적으로, 잔류 효소 활성은 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24, 48, 120, 및 144시간의 시점에서 실시예 1의 "안정성 평가"라는 표제의 섹션에 따라 샘플에서 측정된다. 분취량 중의 GCase 폴리펩티드의 활성은 본원에 기술된 형광측정 분석법 프로토콜에 따라 측정될 수 있다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드는 37℃에서 30분 동안 4-MUG와 함께 인큐베이션될 수 있다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어 Conduritol B 에폭시드의 존재 및 부재 하에 37℃에서 1시간 동안 4-MUG와 함께 인큐베이션된다. 예를 들어, 샘플의 일부는 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어 Conduritol B 에폭시드의 존재 하에 인큐베이션되고, 샘플의 일부는 비가역적 GCase 억제제, 예를 들어 Conduritol B 에폭시드의 부재 하에 인큐베이션되고, 결과가 비교되어 GCase의 활성 수준이 수득된다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 pH 5.6 또는 pH 5.75에서 인큐베이션된다. 생성된 형광 생성물의 수준은 각각 365 nm 및 445 nm의 방출 및 여기 파장을 사용하여 측정될 수 있다. 선택적으로, 분취량에서의 GCase 폴리펩티드의 활성은 실시예 1의 "GCase 활성 결정"이라는 표제의 섹션에 기술된 형광측정 분석법 프로토콜 또는 실시예 13의 "방법"이라는 표제의 섹션에 "GCase 활성 분석"으로 시작되는 문단에 기술된 형광측정 분석법 프로토콜에 따라 측정될 수 있다. 값은 실시예 5에 약술된 것과 같은 1상 붕괴 모델(one-phase decay model)에 적용될 수 있다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 반감기를 결정하기 전에 정제될 수 있다. GCase 폴리펩티드는 예를 들어 실시예 1의 "GCase 단백질 정제"라는 표제의 섹션에 따라 본원에 기술된 바와 같이 정제될 수 있다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드의 반감기는 실시예 5의 방법론을 사용하여 결정된다.
변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드(본원에 기술된 바와 같은 것, 예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)에 비해 더 긴 반감기를 갖는지 여부를 결정하기 위해, 변형된 GCase 폴리펩티드 및 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기는 동일한 방법과 비교된 결과를 사용하여 결정된다. 이러한 방법은 반감기를 결정하기 위해 본 명세서에 기술된 임의의 방법일 수 있다.
변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성, 안정성, 잔류 활성 또는 반감기는 pH 5, pH 5.1, pH 5.2, pH 5.3, pH 5.4, pH 5.5, pH 5.6, pH 5.7, pH 5.8, pH 5.9, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9 또는 pH 8, 또는 pH 5 내지 pH 6, pH 5.3 내지 pH 5.7, pH 5.6 내지 pH 5.8, pH 6.8 내지 pH 7.8, pH 7 내지 pH 7.6, pH 7.2 내지 pH 7.5, 또는 pH 7.3 내지 pH 7.8에서 결정될 수 있다. 선택적으로, pH는 리소좀 pH(예를 들어 pH 5.6) 또는 생리학적 pH(예를 들어 pH 7.4)이다. 선택적으로, pH는 pH 7.35 내지 pH 7.45이다. 바람직하게는, pH는 생리학적 pH, 예를 들어 pH 7.4이다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드의 보다 높은 유효 활성, 증가된 안정성, 보다 높은 잔류 활성 또는 보다 긴 반감기는 각각 pH 5, pH 5.1, pH 5.2, pH 5.3, pH 5.4, pH 5.5, pH 5.6, pH 5.7, pH 5.8, pH 5.9, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9 또는 pH 8, 또는 pH 5 내지 pH 6, pH 5.3 내지 pH 5.7, pH 5.6 내지 pH 5.8, pH 6.8 내지 pH 7.8, pH 7 내지 pH 7.6, pH 7.2 내지 pH 7.5, 또는 pH 7.3 내지 pH 7.8에서의 보다 높은 유효 활성, 증가된 안정성, 보다 높은 잔류 활성 또는 보다 긴 반감기를 지칭한다. 선택적으로, pH는 리소좀 pH(예를 들어 pH 5.6) 또는 생리학적 pH(예를 들어 pH 7.4)이다. 선택적으로, pH는 pH 7.35 내지 pH 7.45이다. 바람직하게는, pH는 생리학적 pH, 예를 들어 pH 7.4이다.
변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성, 안정성, 잔류 활성 또는 반감기는 18℃(섭씨), 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 또는 37℃에서 결정될 수 있다. 바람직하게는, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성, 안정성, 잔류 활성 또는 반감기는 37℃에서 결정된다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드의 보다 높은 유효 활성, 증가된 안정성, 증가된 잔류 활성 또는 보다 긴 반감기는 각각 18℃(섭씨), 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 또는 37℃에서의 보다 높은 유효 활성, 증가된 안정성, 증가된 잔류 활성 또는 보다 긴 반감기를 지칭한다. 바람직하게는, 보다 높은 유효 활성, 증가된 안정성, 증가된 잔류 활성 또는 보다 긴 반감기는 각각 37℃에서의 보다 높은 유효 활성, 증가된 안정성, 증가된 잔류 활성 또는 보다 긴 반감기이다.
변형된 GCase 폴리펩티드는 액체에서(즉, 용액에서일 때) 증가된 안정성을 가질 수 있다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 액체에서 더 긴 반감기를 갖는다. 선택적으로, 액체는 GCase 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포가 배양되는 조건화된 배지와 같은 조건화된 배지이다. 선택적으로, 액체는 생물학적 샘플이다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 혈장에서 더 높은 안정성을 가질 수 있다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 혈장에서 더 긴 반감기를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이 증가된 열안정성을 제공한다. 증가된 열안정성을 제공하는 예시적인 돌연변이가 본원에 개시되어 있다. "적어도 하나의 돌연변이가 증가된 열안정성을 제공한다."라고 명시함으로써, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않지만 그 외에는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일한 참조 GCase 폴리펩티드와 비교하여 증가된 열안정성을 갖는다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이가 증가된 열안정성을 제공하고 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 돌연변이 W351C 및 A380C)를 포함한다는 것을 제외하고 그 외에는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 경우, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 열안정성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 제외하고 SEQ ID NO: 1과 동일한 "시험" 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드와 비교하여 증가된 열안정성을 갖고, 선택적으로 "시험" 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 1이 동일한 세포주에서 발현에 의해 생산되는 경우, 적어도 하나의 돌연변이는 "증가된 열안정성을 제공"한다. 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드와 비교하여 반드시 증가된 열안정성을 가질 필요는 없을 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 폴리펩티드의 열안정성을 감소시키는 하나 이상의 추가 변형(예를 들어 결실된 부분)을 포함할 수 있음이 고려된다. 이러한 경우, 본원에 개시된 적어도 하나의 돌연변이는 변형된 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 열안정성을 갖지 않을 수 있지만 그럼에도 불구하고 그 외에는 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일하지만 적어도 하나의 돌연변이가 결여되어 있는 참조 GCase 폴리펩티드보다 더 높은 열안정성을 갖도록 변형된 GCase 폴리펩티드에 대해 증가된 열안정성을 제공하는 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 변형된 GCase 폴리펩티드의 열안정성을 야생형 GCase 폴리펩티드의 전형적인 열안정성으로 회복시키는 증가된 열안정성을 제공할 수 있다.
열안정성은 용융 온도(중간 변성 온도 또는 폴리펩티드 절반이 변성되는 온도로도 알려짐)를 결정함으로써 측정될 수 있다. 용융 온도가 더 높은 폴리펩티드는 용융 온도가 더 낮은 폴리펩티드보다 열적으로 더 안정하며, 따라서 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 제외하고 SEQ ID NO: 1과 동일한 "시험" 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드와 비교하여 더 높은 용융 온도를 갖고, 선택적으로 "시험" 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 1이 동일한 세포주에서 발현에 의해 생산되는 경우, 적어도 하나의 돌연변이는 "증가된 열안정성을 제공"한다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.75에서 적어도 55, 적어도 56, 또는 적어도 57℃의 용융 온도를 갖는다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 5.75에서 적어도 53, 또는 적어도 54℃의 용융 온도를 갖는다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7에서 적어도 52, 적어도 53, 또는 적어도 53.5℃의 용융 온도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 열안정성을 갖는다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드의 열안정성은 참조 GCase 폴리펩티드의 열안정성과 비교된다. 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드의 열안정성을 증가시키는 예시적인 돌연변이가 본원에 개시되어 있다.
선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드의 용융 온도는 pH 5.75에서 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5 또는 적어도 5.4℃ 더 높다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드 용융 온도는 pH 7에서 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 적어도 1, 적어도 2, 또는 적어도 2.5℃ 더 높다.
선택적으로, 용융 온도는 1.5 μM, 3 μM, 또는 6 μM의 변형된 GCase 폴리펩티드 농도에서 계산된 용융 온도이다. 선택적으로, 용융 온도는 1.5 μM 또는 3 μM의 변형된 GCase 폴리펩티드 농도에서 계산된 용융 온도이다. 선택적으로, 용융 온도는 3 μM의 변형된 GCase 폴리펩티드 농도에서 계산된 용융 온도이다.
열 안정성은 열 이동 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 열 이동 분석을 사용하여 폴리펩티드(예를 들어 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 본원에 기술된 참조 GCas 폴리펩티드)의 열안정성을 측정하는 것은 본질적으로 증가하는 온도에서 폴리펩티드를 인큐베이션하고 온도가 증가함에 따라 폴리펩티드의 접힘 풀림(unfolding)을 모니터링하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드(예를 들어 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 참조 GCase 폴리펩티드)는 일정 기간(예를 들어 2분) 동안 25℃에서 유지될 수 있으며, 그런 다음 시간이 지남에 따라 온도가 점진적으로 증가한다. 선택적으로, 온도는 분 당 1℃씩 증가한다. 선택적으로, 온도는 모든 변형된 GCase 폴리펩티드가 변성되는 온도, 예를 들어 95℃의 온도까지 분 당 1℃씩 증가한다. 선택적으로, 열 이동 분석은 분 당 1℃씩 증가하는 온도에서 변형된 GCase 폴리펩티드를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 열 이동 분석은 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 참조 GCase 폴리펩티드가 분 당 1℃씩 증가하는 온도에서 인큐베이션됨에 따라 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 참조 GCase 폴리펩티드의 접힘 풀림을 측정하는 단계를 포함한다, 즉, 용융 온도는 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 참조 GCase 폴리펩티드가 분 당 1℃씩 증가하는 온도에서 인큐베이션됨에 따라 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 참조 GCase 폴리펩티드의 접힘 풀림을 측정함으로써 계산된다.
폴리펩티드의 접힘 풀림은 단백질 구조의 변화에 민감한 형광 염료를 사용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들어, SYPROTM Orange Protein gel Stain과 같은 염료는 소수성 단백질 영역에 결합하고 단백질 접힘이 풀릴 때 형광을 방출한다. 폴리펩티드의 접힘 풀림을 모니터링하기 위해 형광 염료가 사용되는 경우, 형광 염료를 열 이동 분석 동안 폴리펩티드가 인큐베이션되는 배지에 첨가하고, 형광이 모니터링된다.
용융 곡선이 생성되어, Y축에 형광 수준(상대 형광 단위(relative fluorescence unit) 또는 RFU)이 플롯팅되고 X축에 온도가 플롯팅될 수 있다. 용융 온도는 용융 곡선의 음의 1차 미분의 최소 미분에 해당한다. 선택적으로, 용융 온도는 "열안정성 시험"이라는 표제 하에 실시예 1에 기재된 분석법을 사용하여 측정될 수 있다.
선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드 및/또는 참조 GCase 폴리펩티드는 열 이동 분석과 같은 열안정성 분석법 수행 전에 pH 5.75 완충액(예를 들어 소듐 시트레이트 완충액)에서 저장된다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드 예를 들어 VPRIV일 수 있다. 선택적으로, VPRIV는 열 이동 분석과 같은 열안정성 분석법 수행 전에 뉴클레아제가 없는 물에 재구성된다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 인간 백혈구 항원(HLA)-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수를 감소시킨다. HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수를 감소시키는 예시적인 돌연변이가 본원에 개시되어 있다. HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 감소에 대한 언급, 예를 들어 적어도 하나의 돌연변이가 "HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수를 감소시킨다" 또는 변형된 GCase 폴리펩티드는 "감소된 수의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제를 갖는다"라는 언급은 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수가 감소될 것으로 예측되는 것을 의미하도록 해석되어야 한다. HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수는 본원에 기술된 바와 같이 예측될 수 있다. "적어도 하나의 돌연변이가 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수를 감소시킨다"라고 명시함으로써, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않지만 그 외에는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일한 참조 GCase 폴리펩티드보다 감소된 수의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제를 갖는다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이가 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수를 감소시키고 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 돌연변이 W351C 및 A380C)를 포함한다는 것을 제외하고 그 외에는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 경우, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드에 비해 감소된 수의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제를 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 제외하고 SEQ ID NO: 1과 동일한 "시험" 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드와 비교하여 감소된 수의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제를 갖고, 선택적으로 상기 "시험" 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 1이 동일한 세포주에서 발현에 의해 생산되는 경우, 적어도 하나의 돌연변이는 "HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수를 감소"시킨다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 감소된 수의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제를 갖는다. 선택적으로, HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제는 강력한 결합제이다. 선택적으로, HLA-I 결합제는 강력한 결합제이다. 선택적으로, HLA-II 결합제는 강력한 결합제이다. "HLA-I 결합제"는 HLA-I에 결합할 수 있는 폴리펩티드 유래의 단편이다. HLA-II 결합제"는 HLA-II에 결합할 수 있는 폴리펩티드 유래의 단편이다. 폴리펩티드 유래의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제(특히 "강력한" 결합제)의 수가 적으면 폴리펩티드가 면역 반응을 유도할 위험이 잠재적으로 더 낮다. HLA-I 및 HLA-II 결합제(특히 "강력한" 결합제)의 수는 하기 추가로 논의되는 바와 같이 예측될 수 있다. 하기 추가로 논의되는 바와 같이, "강력한" 결합제는 0 내지 ≤ 50nM의 IC50 컷-오프 범위를 갖는 것으로 정의될 수 있다. 일부 실시형태에서, HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수는 IC50 결합 친화도를 사용하여 예측된다. 바람직하게는, 감소된 수의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제는 강력한 결합제이다. 감소된 수의 HLA-I 결합제는 강력한 결합제일 수 있다. 감소된 수의 HLA-II 결합제는 강력한 결합제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 수의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제(예를 들어 강력한 결합제)는 각각 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드에 대한 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제(예를 들어 강력한 결합제)의 수에 대해 상대적이다. 예를 들어, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드일 수 있다. 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드일 수 있다. 적어도 하나의 돌연변이는 HLA-I 결합제(예를 들어 강력한 결합제)의 수를 감소시킬 수 있다. 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 대한 HLA-I 결합제(예를 들어 강력한 결합제)의 수에 비해 감소된 수의 HLA-I 결합제(예를 들어 강력한 결합제)를 가질 수 있다. 적어도 하나의 돌연변이는 HLA-II 결합제(예를 들어 강력한 결합제)의 수를 감소시킬 수 있다. 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 대한 HLA-II 결합제(예를 들어 강력한 결합제)의 수에 비해 감소된 수의 HLA-II 결합제(예를 들어 강력한 결합제)를 가질 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드에서 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수를 감소시키는 예시적인 돌연변이가 본원에 개시되어 있다.
GCase 폴리펩티드의 면역학적 위험 프로필은 알려진 인 실리코(in silico) 분석 또는 예측을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, Immune Epitope Database 및 Analysis Resource 데이터베이스를 사용하여 계산을 위해 데이터가 입력될 수 있다. 사용된 예측 방법은 NetMHCpan EL 4.0(HLA-I용) 및 NetMHCIIpan 3.2(HLA-II용)일 수 있다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드의 면역원성 위험 프로파일은 실시예 7의 방법론에 따라 평가될 수 있다. 예를 들어, 변형된 GCase 폴리펩티드에서 관련 아미노산 치환의 업스트림 50개 아미노산과 다운스트림 50개 아미노산에 걸쳐 있는 영역(예를 들어 W351C 업스트림의 50개 아미노산에서 A380C의 다운스트림 50개 아미노산에 이르는 영역)에서 길이가 9개 및 15개 아미노산인 펩티드 단편(각각 HLA-I 및 HLA-II 수용체 분자에 대한 결합 친화도를 계산하기 위해)은 Immune Epitope Database 및 Analysis Resource 데이터베이스를 사용하여 계산을 위한 입력값으로 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 예측 방법은 NetMHCpan EL 4.0(HLA-I용) 및 NetMHCIIpan 3.2(HLA-II용)를 포함할 수 있다. IC50 값은 펩티드 결합 친화도의 척도로서 사용될 수 있다. IC50 값은 결합제를 "강력한" 결합제 또는 "중간" 결합제로 분류하는데 사용될 수 있다. IC50 값이 낮을 수록, 더 나은 결합이 예측된다. "강력한" 결합제의 경우, 0내지 ≤50nM의 IC50 컷-오프 범위가 사용될 수 있으며, "중간" 결합제의 경우 >50내지 ≤500nM의 IC50 컷-오프가 사용될 수 있다.
변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드(본원에 기술된 바와 같은 것, 예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)에 비해 감소된 수의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제를 갖는지 여부를 결정하기 위해, 변형된 GCase 폴리펩티드 및 참조 GCase 폴리펩티드의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수는 동일한 방법과 비교된 결과를 사용하여 예측된다. 이러한 방법은 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수를 예측하기 위해 본 명세서에 기술된 임의의 방법일 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 감소된 면역원성을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 감소된 면역원성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드의 면역원성 수준은 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드에 대한 수준과 비교된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드의 면역원성에 비해 감소된 면역원성을 갖는다. 변형된 GCase 폴리펩티드의 면역원성을 감소시킬 수 있는 예시적인 돌연변이가 본원에 개시되어 있다.
"적어도 하나의 돌연변이는 감소된 면역원성을 제공한다"라고 명시함으로써, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않지만 그 외에는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일한 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 감소된 면역원성을 갖는다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이가 면역원성을 감소시키고 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 돌연변이 W351C 및 A380C)를 포함하는 것을 제외하고 그 외에는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 경우, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드보다 감소된 면역원성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 제외하고 SEQ ID NO: 1과 동일한 "시험" 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드와 비교하여 감소된 면역원성을 갖고, 선택적으로 상기 "시험" 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 1이 동일한 세포주에서 발현에 의해 생산되는 경우, 적어도 하나의 돌연변이는 "감소된 면역원성을 제공"한다.
일부 실시형태에서, GCase 폴리펩티드의 면역원성은 본원에 기술된 바와 같은 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수를 예측함으로써 평가된다.
일부 실시형태에서, GCase 폴리펩티드의 면역원성은 GCase 폴리펩티드에 대해 생성된 면역 반응을 측정함으로써 평가된다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드는 시험 동물, 예를 들어 마우스에 투여될 수 있고, 시험 동물에서의 면역 반응이 측정되어 참조 GCase 폴리펩티드가 투여된 비교가능한 시험 동물에서의 면역 반응과 비교될 수 있다. 면역 반응은 사이토카인 또는 급성기 단백질과 같은 혈액 내 염증 마커를 검사하여 측정될 수 있다. 측정될 수 있는 사이토카인의 예는 TNF-α, IL-1β 및/또는 INF-γ이다. 측정될 수 있는 급성기 단백질의 예는 C-반응성 단백질, 만난-결합 렉틴(mannan-binding lectin) 및/또는 보체 인자이다. 염증 마커의 감소는 낮은 면역원성을 나타내기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, GCase 폴리펩티드의 면역원성은 전체 단백질(예를 들어, 야생형 GCase 폴리펩티드 또는 본 발명의 변형된 GCas 폴리펩티드)와 함께 인큐베이션 시 인간 말초 혈액 단핵구 세포 세포(PMBC: peripheral blood mononuclear cell) 중의 T-세포의 활성화 수준을 검사하는 T-세포 증식 분석법을 사용하여 평가된다. 예를 들어, ProMap®　나이브 CFSE T 세포 증식 분석법이 사용될 수 있다(https://www.proimmune.com/promap-t-cell-proliferation-assays/).
변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드(본원에 기술된 바와 같은 것, 예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)에 비해 감소된 면역원성을 갖는지 여부를 결정하기 위해, 변형된 GCase 폴리펩티드 및 참조 GCase 폴리펩티드의 면역원성은 동일한 방법과 비교된 결과를 사용하여 평가된다. 이러한 방법은 면역원성을 평가하기 위해(예를 들어, HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수를 예측하기 위해) 본 명세서에 기술된 임의의 방법일 수 있다.
이상 반응 수준의 관찰 없음(NOAEL: no observation of adverse event level)이 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드에 대해 계산될 수 있다. NOAEL이 높다면, 이는 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드가 낮은 면역원성을 갖는다는 것을 시사한다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드는 마우스와 같은 시험 동물에게 투여량을 증가시키면서 투여될 수 있고 마우스는 부작용이 있는지 여부를 확인하기 위해 모니터링된다. 이상 반응과 관련된 최저 용량이 NOAEL이다. 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 바이러스 입자의 일부로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 마우스는 1x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 5x1010 등의 용량과 같이 증가하는 용량으로 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스 입자를 투여받을 수 있다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, GBA 뉴클레오티드 서열이 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는 바이러스 입자로 투여되고 NOAEL이 적어도 1x1012 vg/kg, 적어도 5x1012vg/kg, 적어도 1x1013 vg/kg, 또는 적어도 2x1013 vg/kg이다.
본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드의 효소 효율은 야생형 GCase 폴리펩티드의 효소 효율과 동일할 수 있다. 제1 GCase 폴리펩티드(예를 들어, 변형된 GCase 폴리펩티드)의 효소 효율(즉, 기질을 처리하는 능력)을 제2 GCase 폴리펩티드(예를 들어, 야생형 GCase 폴리펩티드)의 효소 효율과 "동일"하다고 기술하는 것은 제1 GCase 폴리펩티드의 효소 효율이 제2 GCase 폴리펩티드의 효소 효율 +/- 10%, 보다 특히 +/- 5%, 또는 보다 특히 +/- 1%와 동일할 수 있음을 나타낸다. 본 발명의 목적을 위해, "효소 효율"은 GCase 폴리펩티드가 기질, 예를 들어 메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드우론산(4-MUG) 또는 이의 천연 기질 글루코세레브로시드를 처리할 수 있는 능력을 지칭한다. 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드의 효소 효율은 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 효소 효율일 수 있지만, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성 또는 잔류 활성은 야생형 GCase 폴리펩티드보다 높을 수 있다. 이러한 관찰은 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드가 더 안정하고 따라서 더 오랫동안 활성인 결과일 수 있다. 따라서, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드와 동일한 기질 처리 능력을 가질 수 있지만, 더 오래 동안 활성을 유지하여 더 높은 유효 활성 및/또는 더 높은 잔류 활성을 야기할 수 있다.
GCase 폴리펩티드의 효소 효율은 Km 및/또는 Kcat 값을 결정하여 측정될 수 있다. Km 및/또는 Kcat 값은 당업계의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. 효소 효율은 실시예 6에 기술된 방법과 같이 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시두론산(4-MUG)을 처리하여 측정될 수 있다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드는 실시예 1에 기술된 바와 같이 정제될 수 있다. 정제된 단백질(예를 들어 1 또는 3.5 nM)은 AB 완충액 중의 4-MUG의 양을 증가시키며(예를 들어 2.5 x 106, 5 x 106, 7.5 x 106 또는 1 x 107 nM) 인큐베이션될 수 있다. 선택적으로, 정제된 단백질은 pH 5.75의 조성물에서 4-MUG와 함께 인큐베이션된다. 4-메틸움벨리페론(4-MU) 형성은 생성된 형광(여기 파장: 365nm, 방출 파장: 445nm)을 측정함으로써 예를 들어 15분에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 각 4-MUG 농도에서 4-MU 형성 속도는 4-MUG 농도에 대해 플롯팅될 수 있고 미카엘리스-멘텐 모델로 피팅될 수 있다. Kcat 값은 32 s-1 내지 40 s-1, 32.8 s-1 내지 39.2 s-1, 33 s-1 내지 39 s-1, 또는 35 s-1 내지 37 s-1일 수 있다. Kcat 값은 약 36.0 s-1일 수 있다. 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드에 대한 Km 값은 1.4 mM 내지 2.5 mM, 1.6 mM 내지 2.2 mM, 또는 1.8 mM 내지 2.2 mM일 수 있다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드의 Km 값은 약 2.0 mM일 수 있다.
본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 생리학적 pH에서 보다 높은 유효 활성 및/또는 증가된 안정성 및/또는 구조적인 안정화 및/또는 보다 긴 반감기를 가질 수 있다. 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 감소된 수의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제를 가질 수 있다. 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 감소된 면역원성을 가질 수 있다. 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 증가된 열안정성을 가질 수 있다. 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드보다 숙주 세포에서 더 높은 수준으로 발현될 수 있다.
본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이(즉 하나 이상의 치환 돌연변이)는 SEQ ID NO: 1의 351, 380, 272, 262, 313, 404, 407, 482, 484, 490, 494, 503 및 534로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 상응하는 위치에 있다. 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 상기 열거된 위치에 상응하는 위치에서의 돌연변이)는 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 특성(예를 들어 보다 높은 유효 활성, 증가된 안정성, 생리학적 pH에서 구조적인 안정화, 보다 긴 반감기, 보다 높은 잔류 활성, 감소된 수의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제, 감소된 면역원성 또는 증가된 열안정성)을 제공할 수 있다. 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 상기 열거된 위치에 상응하는 위치에서의 돌연변이)를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 논의된 바와 같은 하나 이상의 특성(예를 들어 보다 높은 유효 활성, 증가된 안정성, 생리학적 pH에서 구조적인 안정화, 보다 긴 반감기, 보다 높은 잔류 활성, 감소된 수의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제, 감소된 면역원성, 증가된 열안정성, 등)을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 pH 7.4에서 양성자 공여자로서 작용하는 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이는 글루타민으로 치환된다. 예를 들어, 돌연변이는 E272Q일 수 있다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 262에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 아스파라긴 또는 티로신으로의 치환일 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 아스파라긴으로의 치환이다. 예를 들어, 돌연변이는 H262N일 수 있다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 262에 상응하는 위치에서의 티로신으로의 돌연변이, 예를 들어 H262Y를 포함한다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 313에 상응하는 위에서의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이는 아스파라긴으로의 치환이다. 예를 들어, 돌연변이는 H313N일 수 있다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 404에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이는 리신으로의 치환이다. 예를 들어, 돌연변이는 H404K일 수 있다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 490에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이는 리신으로의 치환이다. 예를 들어, 돌연변이는 H490K일 수 있다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이는 아스파라긴으로의 치환이다. 예를 들어, 돌연변이는 R534N일 수 있다.
선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드의 적어도 하나의 돌연변이는 2개의 돌연변이를 포함하며, 상기 2개의 돌연변이 각각은 이황화 결합의 형성을 가능케 하는 시스테인으로의 치환이다. 이황화 결합의 형성은 예를 들어 생리학적 pH에서 변형된 GCase의 구조를 안정화할 수 있다. 이황화 결합의 형성은 질량 분광분석법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어 이황화 결합의 형성은 이황화 결합을 함유하는 것으로 의심되는 폴리펩티드의 단편화 패턴을 분석하고, 선택적으로 예를 들어 문헌[Gorman et al. 2002, 질량 분석법 Reviews 21, 183-216]에 기술된 제한된 단백질분해를 수행함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로, 이황화 결합의 형성은 선택적으로 N-말단 서열분석과 함께, 환원 및 비환원 조건 모두에서 폴리펩티드에 대한 제한된 단백질분해를 수행하고 생성된 단백질 단편을 SDS-PAGE로 분석함으로써 결정될 수 있다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 2개의 돌연변이를 포함함)는 (i) SEQ ID NO: 1의 위치 482에 상응하는 위치에서의 돌연변이, 및 (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 503에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 선택적으로, (i) SEQ ID NO: 1의 위치 482에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환이고, (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 503에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환이다. 선택적으로, (i) SEQ ID NO: 1의 위치 482에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 아스파르트산에서 시스테인으로의 돌연변이이고, (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 503에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 세린의 시스테인으로의 돌연변이이다. 예를 들어, 돌연변이는 D482C/S503C일 수 있다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 2개의 돌연변이를 포함함)는 (i) SEQ ID NO: 1의 위치 494에 상응하는 위치에서의 돌연변이, 및 (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 선택적으로, (i) SEQ ID NO: 1의 위치 494에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환이고, (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환이다. 선택적으로, (i) SEQ ID NO: 1의 위치 494에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 세린의 시스테인으로의 돌연변이이고, (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 아르기닌의 시스테인으로의 돌연변이이다. 예를 들어, 돌연변이는 S494C/R534C일 수 있다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 2개의 돌연변이를 포함함)는 (i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 돌연변이, 및 (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 선택적으로, (i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환이고, (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환이다. 선택적으로, (i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 트립토판의 시스테인으로의 돌연변이이고, (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 알라닌의 시스테인으로의 돌연변이이다. 예를 들어, 돌연변이는 W351C/A380C일 수 있다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 2개의 돌연변이를 포함함)는 (i) SEQ ID NO: 1의 위치 407에 상응하는 위치에서의 돌연변이, 및 (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 484에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 선택적으로, (i) SEQ ID NO: 1의 위치 407에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환이고, (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 484에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환이다. 선택적으로, (i) SEQ ID NO: 1의 위치 407에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 이소류신의 시스테인으로의 돌연변이이고; (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 484에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 아스파르트산의 시스테인으로의 돌연변이이다. 예를 들어, 돌연변이는 I407C/D484C일 수 있다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어 3개의 돌연변이를 포함함)는 (i) SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서의 돌연변이, (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 돌연변이, 및 (iii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 선택적으로, (i) SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 글루타민으로의 치환이고, (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환이고, (iii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환이다. 선택적으로, (i) SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 글루탐산의 글루타민으로의 돌연변이이고, (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 트립토판의 시스테인으로의 돌연변이이고, (iii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 알라닌의 시스테인으로의 돌연변이이다. 예를 들어, 돌연변이는 E272Q/W351C/A380C일 수 있다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서의 글루타민으로의 치환을 포함하고, 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드(예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)와 비교하여 증가된 안정성을 가지며, pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 85%의 활성을 유지한다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 (i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서 시스테인으로의 치환(예를 들어, 트립토판의 시스테인으로의 돌연변이); 및 (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 시스테인으로의 치환(예를 들어 알라닌의 시스테인으로의 돌연변이)를 포함하고, 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드(예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)와 비교하여 증가된 안정성을 가지며, pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 85%의 활성을 유지한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서 글루타민으로의 치환을 포함하며, 이러한 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드와 비교하여 증가된 안정성을 가지며, pH 7.4 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 60%의 활성을 유지하고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서 글루타민으로의 치환을 포함하고, 상기 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖고, pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 50% 또는 적어도 55% 활성을 유지하며, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 (i) SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서 글루타민으로의 치환(예를 들어 E272Q); 및 (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서 시스테인으로의 치환(예를 들어 트립토판의 시스테인으로의 돌연변이); 및 (iii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 시스테인으로의 치환(예를 들어 알라닌의 시스테인으로의 돌연변이)를 포함한다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드(예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)와 비교하여 증가된 안정성을 가지며, pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 85% 활성을 유지한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 하기를 포함하고:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 트립토판의 시스테인으로의 돌연변이; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 돌연변이;
변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드와 비교하여 증가된 안정성을 갖고, pH 7.4의 PBS 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 60% 활성을 유지하며, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 하기를 포함하고:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 트립토판의 시스테인으로의 돌연변이; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 돌연변이;
변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드와 비교하여 증가된 안정성을 갖고, pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 50%, 또는 적어도 55% 활성을 유지하며, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 하기를 포함하고:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서의 글루타민으로의 치환, 선택적으로 E272Q;
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 트립토판의 시스테인으로의 돌연변이; 및
(iii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 돌연변이;
변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드와 비교하여 증가된 안정성을 갖고, pH 7.4의 PBS 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 60% 활성을 유지하며, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 하기를 포함하고:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서의 글루타민으로의 치환, 선택적으로 E272Q;
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 트립토판의 시스테인으로의 돌연변이; 및
(iii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 돌연변이;
변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드와 비교하여 증가된 안정성을 갖고, pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 50%, 또는 적어도 55% 활성을 유지하며, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 (i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 시스테인으로의 치환(예를 들어 트립토판의 시스테인으로의 돌연변이); 및 (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 시스테인으로의 치환(예를 들어 알라닌의 시스테인으로의 돌연변이)을 포함하고, 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드(예를 들어 야생형 GCase 폴리펩티드)와 비교하여 증가된 안정성을 갖고, pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 15%, 또는 적어도 20% 활성을 유지한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서의 글루타민으로의 치환을 포함하고, 상기 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드와 비교하여 증가된 안정성을 갖고, pH 7.4의 PBS 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 15%, 또는 적어도 20% 활성을 유지하고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 하기를 포함하고:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서의 글루타민으로의 치환, 선택적으로 E272Q; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 트립토판의 시스테인으로의 돌연변이; 및
(iii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 알라닌의 시스테인으로의 돌연변이;
변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드와 비교하여 증가된 안정성을 갖고, pH 7.4의 PBS 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 60%, 또는 적어도 80% 활성을 유지하고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다.
선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드와 비교하여 보다 높은 유효 활성 및/또는 증가된 안정성을 갖는다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않고 그 외에는 변형된 GCase 폴리펩티드와 동일하다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 5 중 임의의 하나로부터 선택된다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1에서 각각 위치 184, 272, 351, 360 및 380에 상응하는 위치인 H184L, E272L, W351C, K360N 및 A380T로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하지 않는다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 H184L 돌연변이(SEQ ID NO: 1에서 위치 184에 상응하는 위치에서임)를 포함하지 않는다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 K360N 돌연변이(SEQ ID NO: 1에서 위치 360에 상응하는 위치에서임)를 포함하지 않는다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 H184L 돌연변이 및 K360N 돌연변이(SEQ ID NO: 1에서 각각 위치 184 및 360에 상응하는 위치에서임)를 포함하지 않는다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4 또는 5의 아미노산 서열을 포함하지 않거나 갖지 않는다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 A380T 돌연변이(SEQ ID NO: 1에서 위치 360에 상응하는 위치에서임)를 포함하지 않는다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 R534H 돌연변이(SEQ ID NO: 1에서 위치 534에 상응하는 위치에서임)를 포함하지 않는다.
선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1에서 각각 위치 184, 355, 356, 및 360에 상응하는 위치에서인 H184L, H184F, F355A, L356F, K360N, 및 K360A으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하지 않는다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1에서 각각 위치 184, 355, 356, 및 360에 상응하는 위치에서인 H184F, F355A, L356F, 및 K360A으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하지 않는다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 F355A 돌연변이 및 L356F 돌연변이(SEQ ID NO: 1에서 각각 위치 355 및 356에 상응하는 위치에서임)를 포함하지 않는다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 F355A 돌연변이, L356F 돌연변이 및 K360N 돌연변이(SEQ ID NO: 1에서 각각 위치 355, 356 및 360에 상응하는 위치에서임)를 포함하지 않는다.
선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 41 내지 46 중 임의의 하나로 기술된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO 41 내지 46 중 임의의 하나에 기술된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 42 또는 45로 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
전형적으로, GCase 폴리펩티드는 신호 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 1 내지 39) 및 성숙한 GCase 폴리펩티드 영역을 포함하는, 전구체인 "미성숙한" 형태(예를 들어 SEQ ID NO: 1의 GCase 폴리펩티드)로서 초기에 발현된다. 처리 후, GCase 폴리펩티드의 "성숙한" 형태는 신호 펩티드가 결여되어 있다. 용어 "성숙한 GCase" 또는 "성숙한 GCase 폴리펩티드"는 신호 펩티드를 포함하지 않는 GCase 폴리펩티드, 예를 들어 SEQ ID NO: 2의 GCase 폴리펩티드를 지칭한다.
야생형 인간 GCase 폴리펩티드의 서열은 SEQ ID NO: 1(미성숙) 및 SEQ ID NO: 2(성숙)로 기재되어 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1의 단편과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.8% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2의 단편과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 또는 적어도 99.7% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로 단편은 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 또는 적어도 450개 아미노산, 또는 300개 내지 497개, 400개 내지 497개, 또는 450개 내지 497개 아미노산이다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 400개, 300개 내지 497개, 400개 내지 497개, 또는 450개 내지 497개 아미노산의 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 단편과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 400개 내지 536개 아미노산의 단편과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2의 400개 내지 497개 아미노산의 단편과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.8% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 또는 적어도 99.7% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 변형된 GCase 폴리펩티드가 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환 돌연변이)를 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 즉, 변형된 GCase 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이 단독에 의해 SEQ ID NO: 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열과 상이한 GCase 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 위치 351 및 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에 시스테인으로의 치환, 및 선택적으로 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 20개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개의 치환 돌연변이에 의해 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열과 상이한 GCase 아미노산 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개의 치환 돌연변이에 의해 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열과 상이한 GCase 아미노산 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 3개 이하의 치환 돌연변이에 의해 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열과 상이한 GCase 아미노산 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 2개 이하의 치환 돌연변이에 의해 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열과 상이한 GCase 아미노산 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 8개, 적어도 10개, 적어도 15개 또는 적어도 20개의 치환 돌연변이에 의해 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열과 상이한 GCase 아미노산 서열을 포함한다. 선택적으로, GCase 폴리펩티드는 1개 내지 20개, 1개 내지 15개, 1개 내지 10개, 1개 내지 5개, 1개 내지 3개, 2개 내지 6개, 3개 내지 8개, 5개 내지 10개, 8개 내지 13개, 10개 내지 15개, 13개 내지 18개, 또는 15개 내지 20개 치환 돌연변이에 의해 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열과 상이한 GCase 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 치환 돌연변이는 비-보존적 치환이다.
임의의 또는 모든 변형된 GCase 폴리펩티드는, 변형된 GCase 폴리펩티드의 아미노산 서열이 야생형 GCase 아미노산 서열과 비교되는 경우, 본원에 정의된 적어도 하나의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환 돌연변이) 외에 하나 이상의 추가 변형, 예를 들어 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가 변형은 하나 이상의 치환일 수 있다. 하나 이상의 추가 변형은 하나 이상의 보존적 치환일 수 있다. 하나 이상의 추가 변형은 하나 이상의 비-보존적 치환일 수 있다. 적어도 하나의 돌연변이는 하나 이상의 추가 변형 내에 위치할 수 있다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드의 연속 부분(예를 들어 최대 50개, 최대 20개, 또는 최대 10개 아미노산)은 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 대안적인 부분으로 대체되었을 수 있다.
글루코세레브로시다제(GBA) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 변형된 글루코세레브로시다제(GBA) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩한다. 용어 "변형된"은 뉴클레오티드 서열이 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열과 비교하여 적어도 하나의 차이를 갖는다는 것, 예를 들어, 돌연변이가 도입되었음을 의미한다.
용어 "핵산 분자", "폴리뉴클레오티드" 및 "뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체를 포함하여, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 사슬을 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열은 DNA(데옥시리보뉴클레오티드) 또는 RNA(리보뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열은 DNA로 이루어질 수 있다. 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열은 mRNA일 수 있다. 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열이 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있으므로, T(티민) 뉴클레오티드에 대한 모든 언급은 U(우라실)로 대체될 수 있다.
일부 실시형태에서, 용어 "뉴클레오티드 서열"은 용어 "핵산 분자"로 대체될 수 있다.
GBA 뉴클레오티드 서열은 GCase 폴리펩티드를 코딩한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하고 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩한다. 용어 "~을 코딩하는 서열" 또는 "서열이 ~을 코딩한다"는 코딩된 폴리펩티드를 코딩하는 코돈을 포함하는 개방형 판독틀을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 GCase 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 코돈을 포함한다. 야생형 GCase를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열의 예가 SEQ ID NO: 40에 제공되어 있다.
폴리펩티드를 코딩하는 코돈은 또한 "코딩 뉴클레오티드"로서 지칭된다. GBA 뉴클레오티드 서열은 비-코딩 뉴클레오티드(예를 들어 인트론)에 의해 중단될 수 있지만, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드(즉, 코딩 뉴클레오티드)만이 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부로서 간주되어야 한다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은, 이러한 코돈이 서열에서 연속적이거나 하나 이상의 비-코딩 뉴클레오티드에 의해 분리되는지 여부에 관계 없이, GCase 폴리펩티드의 일부를 형성하는 아미노산을 코딩하는 임의의 코돈(즉, 코딩 뉴클레오티드)을 포함할 것이다. 즉, 비-코딩 뉴클레오티드의 스트레치에 의해 중단된 코딩 뉴클레오티드의 스트레치를 함유하는 GBA 폴리뉴클레오티드는 바로 병치된(즉, 비-코딩 뉴클레오티드의 스트레치의 마이너스) 비-연속 코딩 스트레치로 이루어진 "GBA 뉴클레오티드 서열"을 포함하는 것으로 간주될 것이다. 그러나, 본원에서, 종결 코돈의 뉴클레오티드는 코딩 뉴클레오티드로 간주될 것이다.
GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 또한 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 단백질, 특히 다른 조직으로 내보내지는 단백질은 신호 펩티드와 함께 발현된다는 것이 잘 알려져 있다. 신호 펩티드는 단백질 서열의 N-말단(이 경우 코딩 서열의 5' 말단)에 있을 수 있으며 많은 신호 펩티드는 세포 처리 후 절단된다. 따라서, 본원에서, 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어 성숙한 GCase 단백질 또는 폴리펩티드)는 신호 펩티드가 처리 및 제거/절단된 후(따라서 더 이상 폴리펩티드 서열의 일부를 형성하지 않음) 생성된 단백질 또는 폴리펩티드로 간주될 것이다.
다음의 표는 각각의 아미노산을 코딩하는 코돈을 설명한다:
[표 2]
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상응하는 RNA 코돈은 상기 표에서 T 대신에 U를 함유할 것이다.
본 발명은 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩한다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 내지 29 중 임의의 하나의 적어도 750개, 적어도 850개, 적어도 950개, 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 적어도 1400개, 적어도 1494개, 1494개 이하, 1611개 이하, 1000개 내지 1494개, 1000개 내지 1611개, 1300개 내지 1494개, 1300개 내지 1611개, 또는 약 1494개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%. 적어도 99.8%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 내지 29 중 임의의 하나의 적어도 750개, 적어도 850개, 적어도 950개, 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1400개, 또는 적어도 1494개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 내지 29 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%. 적어도 99.8%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 내지 29 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 또는 10의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%. 적어도 99.8%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%. 적어도 99.8%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 26의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%. 적어도 99.8%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 26의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 26의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화된 부분을 포함할 수 있다. 코돈-최적화된 부분은 변형된 GCase 폴리펩티드의 일부 또는 전체를 코딩하는 서열에 상응할 수 있다. 선택적으로, 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열의 부분은 연속 부분이다. 본 발명의 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화될 수 있다. 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 인간 간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 선택적으로, 인간 간 세포는 Huh-7 세포이다. 상기 언급한 바와 같이, 유전 코드는 퇴화되어 있으며, 다수의 아미노산이 1개 초과의 대안적인 코돈에 의해 코딩될 수 있다. 그러나, 상이한 유기체, 조직 또는 세포의 유전 코드는 특정 아미노산을 코딩하기 위한 하나의 특정 코돈을 사용하는 쪽으로 편향될 수 있다. "코돈-최적화된" 뉴클레오티드 서열은 특정 숙주 세포 또는 유기체에서의 발현, 예를 들어 인간 간 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 바람직하게는, 코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 비-코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 비해 변형된 것인 반면 코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 및 비-코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열은 동일하다.
본 발명의 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 야생형 코돈 대신에 하나 이상의 대안적인 코돈을 포함할 수 있으며, 상기 "대안적인" 코돈은 야생형 코돈과 상이한 서열을 갖지만 야생형 코돈과 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(즉, 퇴화된 코돈)이다. 표 2는 각각의 아미노산을 코딩하는 코돈을 설명한다.
코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화되지 않은 상응하는 뉴클레오티드 서열에 비해 적어도 하나의 보다 "바람직한" 코돈을 포함할 수 있다. 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화되지 않은 상응하는 뉴클레오티드 서열에 비해 더 높은 퍼센트의 "바람직한" 코돈을 포함할 수 있다. 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화되지 않은 상응하는 뉴클레오티드 서열에 비해 적어도 하나의 더 적은 "바람직하지 않은" 코돈을 포함할 수 있다. 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화되지 않은 상응하는 뉴클레오티드 서열에 비해 더 낮은 퍼센트의 "바람직하지 않은" 코돈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열이 인간 간에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 경우, 뉴클레오티드 서열은 인간 간에서 바람직할 수 있는 코돈의 수를 증가시키기 위해 변형된다(이러한 코돈은 동일한 아미노산에 특이적인 다른 tRNA 종보다 더 풍부한 tRNA 종에 해당한다는 의미에서). 추가의 예로서, 뉴클레오티드 서열이 인간 간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 경우, 뉴클레오티드 서열은 인간 간 세포에서 바람직할 수 있는 코돈의 수를 증가시키기 위해 변형될 수 있다(이러한 코돈은 동일한 아미노산에 특이적인 다른 tRNA 종보다 더 풍부한 tRNA 종에 해당한다는 의미에서). 당업자는 "바람직한 코돈"이 일부 위치에 이미 존재할 수 있기 때문에 서열을 코돈 최적화하는 것이 모든 코돈을 변화시키는 것을 수반하지 않을 수 있음을 이해할 것이다.
이러한 코돈-최적화는 다른 요인에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, CpG(즉, CG 디뉴클레오티드)의 존재는 발현에 악영향을 미치므로 사용자는 CpG를 서열에 도입하는 위치에서 바람직한 코돈을 사용하지 않기로 결정할 수 있는 것으로 보여지며; 이는 여전히 코돈-최적화로 간주될 것이다. 일 실시형태에서, C 뉴클레오티드로 끝나는 바람직한 코돈은 코돈-최적화된 코딩 서열의 일부에 포함되지 않을 것이며, 여기서 서열의 다음 코돈은 G로 시작한다. 예를 들어, 코돈 CTC는 류신을 코딩한다. CTC가 바람직한 코돈인 계획에서는, 서열의 다음 코돈이 GTT 코돈과 같이 G로 시작하는 류신을 코딩하는데 사용되어서는 안된다(또는 대안적으로, 다음 코돈은-가능한 경우-첫 번째 위치에서 G를 피하도록 선택될 수 있음).
뉴클레오티드 서열을 "코돈-최적화된"으로 기술함으로써, 모든 코돈이 최적화될 필요는 없다. 따라서 코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부분은 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열의 상응하는 부분과 비교할 때 야생형 코돈 대신에 하나 이상의 대안적인 코돈을 포함할 수 있다. 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열이 코돈-최적화된 부분을 포함하는 경우, GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드는 야생형 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열 또는 코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 인간 간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 따라서 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 서열이 인간 간 세포에서 발현될 때 동등한 코돈-최적화되지 않은 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 선택적으로, 인간 간 세포는 Huh-7 세포이다. "동등한" 코돈-최적화되지 않은 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은, GCase 폴리펩티드를 코딩하기 위해 사용된 코돈이 SEQ ID NO: 40에서와 같은 야생형 GCase 서열의 상응하는 코돈에 상응할 것이라는 것을 제외하고는 동일하다(즉, 동일한 GCase 폴리펩티드를 코딩하고 동일한 전사 조절 요소를 포함하는 등). 선택적으로, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드의 적어도 하나의 돌연변이를 코딩하는 서열(예를 들어 코돈)은 코돈-최적화되지 않는다. 선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은, 적어도 하나의 돌연변이를 코딩하는 서열을 제외하고는 코돈-최적화된다. 전형적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열의 코돈-최적화된 부분은 정지 코돈을 포함하지 않는다.
코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드는 코돈-최적화되지 않은 GBA 뉴클레오티드 서열과 비교하여 인간 간 세포에서 높은 수준으로 발현될 수 있다. 본 발명의 코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 코돈-최적화되지 않은 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 비해 인간 간 세포에서 높은 수준으로 발현될 수 있다. 본 발명의 코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는, 서열이 인간 간 세포에서 발현되는 경우 코돈-최적화되지 않은 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 비해 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 예를 들어, 코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조의 코돈-최적화되지 않은 GBA 뉴클레오티드 서열에 비해 인간 간 세포에서 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 또는 적어도 50배 더 높게 발현될 수 있다. "참조의 코돈-최적화되지 않은 GBA 뉴클레오티드 서열"은 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열과 같이, GCase 폴리펩티드를 코딩하는 야생형 코돈을 사용하는 임의의 GBA 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 선택적으로, 참조의 코돈-최적화되지 않은 GBA 뉴클레오티드 서열은 "동등한" GBA 뉴클레오티드 서열이며, 즉, 참조의 코돈-최적화되지 않은 GBA 뉴클레오티드 서열은 비교되는 경우 GBA 뉴클레오티드 서열과 동일한 GCase 폴리펩티드를 코딩한다. 본 발명의 코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드는 코돈-최적화되지 않은 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드와 비교하여 더 높은 수준으로 인간 간 세포에서 발현될 수 있다. 본 발명의 코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는, 서열이 인간 간 세포에서 발현되는 경우 코돈-최적화되지 않은 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드에 비해 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 선택적으로, 인간 간 세포는 Huh-7 세포이다.
일부 실시형태에서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열의 일부는 코돈-최적화되지 않으며, 예를 들어 코딩 서열의 일부는 간에서의 발현을 위해 코돈-최적화되지 않는다. 일부 실시형태에서, 코돈-최적화되지 않은 부분은 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 110개, 200개 이하, 170개 이하, 140개 이하, 또는 약 117개 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에서 코돈-최적화되지 않은 부분은 신호 펩티드를 코딩하는 부분이다. 선택적으로, 코돈-최적화된 GBA 뉴클레오티드 서열의 부분은 성숙한 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열의 부분은 신호 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하지 않는다. 예를 들어, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 미성숙한 GCase 폴리펩티드(즉, 신호펩티드를 포함함)를 코딩할 수 있고, 코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열의 부분은 성숙한 GCase 단백질을 코딩하며 신호 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하지 않는다. 일부 실시형태에서, 코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열의 부분은 신호 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩한다. 예를 들어, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 미성숙한 변형된 GCase 폴리펩티드(즉 신호 펩티드를 포함함)를 코딩할 수 있고, 코돈-최적화된 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열의 부분은 성숙한 변형된 GCase 폴리펩티드 및 신호 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 성숙한 변형된 GCase 폴리펩티드 서열 전체를 코딩하는 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화된다.
선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드가 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 59 또는 60의 서열을 포함한다. 예를 들어, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 351에 해당하는 위치에서 시스테인으로의 치환, 선택적으로 W351C, 및 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 해당하는 위치에서 시스테인으로의 치환, 선택적으로 A380C를 포함할 수 있다. 또 다른 추가 예로서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이, 선택적으로 E272Q를 포함할 수 있다. 또 다른 추가의 예로서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서 시스테인으로의 치환, 선택적으로 W351C, 및 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 시스테인으로의 치환, 선택적으로 A380C를 포함할 수 있으며, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이, 선택적으로 E272Q를 포함할 수 있다.
선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드가 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 40 또는 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함한다. 예를 들어, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서 시스테인으로의 치환, 선택적으로 W351C, 및 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 시스테인으로의 치환, 선택적으로 A380C를 포함할 수 있다. 또 다른 추가 예로서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서의 돌연변이, 선택적으로 E272Q를 포함할 수 있다. 또 다른 추가 예로서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서 시스테인으로의 치환, 선택적으로 W351C, 및 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 시스테인으로의 치환, 선택적으로 A380C를 포함할 수 있으며, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서 돌연변이, 선택적으로 E272Q를 포함할 수 있다.
선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드가 본원에 기술된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 국제특허공개 WO 2019/070893호 또는 국제특허공개 WO 2019/070894호의 SEQ ID NO: 15의 서열을 포함한다. 예를 들어, 변형된 GBA 뉴클레오티드에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함할 수 있다. 추가 예로서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서 및 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 시스테인으로의 치환을 포함할 수 있다. 또 다른 추가 예로서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서 및 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 시스테인으로의 치환을 포함할 수 있으며, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함할 수 있다.
선택적으로, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드가 본원에 기술된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 국제특허공개 WO2020/012149호 또는 국제특허공개 WO 2020/012164호의 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함한다. 예를 들어, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 추가 예로서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치 및 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 시스테인으로의 치환을 포함할 수 있다. 또 다른 추가 예로서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치 및 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 시스테인으로의 치환을 포함할 수 있으며, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 전사 조절 요소를 포함할 수 있다.
임의의 적절한 전사 조절 요소, 예를 들어 모두 간-특이적 전사 조절 요소인HLP2, HLP1, LP1, HCR-hAAT, ApoE-hAAT, 또는 LSP가 사용될 수 있다. 이러한 전사 조절 요소는 하기 참고문헌에 보다 상세하게 기술되어 있다: HLP1: 문헌[McIntosh J. et al., Blood 2013 Apr 25, 121(17):3335-44]; LP1: 문헌[Nathwani et al., Blood. 2006 April 1, 107(7): 2653-2661]; HCR-hAAT: 문헌[Miao et al., Mol Ther. 2000;1: 522-532]; ApoE-hAAT: 문헌[Okuyama et al., Human Gene Therapy, 7, 637-645 (1996)]; 및 LSP: 문헌[Wang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 March 30, 96(7): 3906-3910]. 전사 조절 요소는 간-특이적 프로모터를 포함할 수 있다.
선택적으로, 전사 조절 요소는 일반적으로 다른 세포와 비교하여 간 세포에서 더 높은 수준의 발현을 유도하는 경우 "간-특이적"이다. 예를 들어, 당업자는 전사 조절 요소가 간 세포(예를 들어 Huh 7 세포)에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 다른 조직 유래의 세포(예를 들어 신장 세포, 예를 들어 HEK293T 세포)에서 폴리뉴클레오티드 발현과 비교하여 간-특이적 전사 조절 요소인지 여부를 결정할 수 있다. 발현 수준이 다른 조직 유래의 세포와 비교하여 간 세포에서 더 높은 경우, 전사 조절 요소는 간-특이적 전사 조절 요소이다. 선택적으로, 간-특이적 전사 조절 요소는 비-간 세포에서 감지할 수 있는 수준의 발현을 유도하지 않는다.
전사 조절 요소는 HLP2, HLP1, LP1, HCR-hAAT, ApoE-hAAT, 또는 LSP로부터의 프로모터 요소 및/또는 인핸서 요소와 같은 프로모터 및/또는 인핸서를 포함할 수 있다. 이러한 전사 조절 요소 각각은 프로모터, 인핸서 및 선택적으로 다른 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 전사 조절 요소는 인간 알파-1 항-트립신 프로모터(A1AT; 문헌[Miao et al (2000), Molecular Therapy 1(6):522]), 또는 이의 단편인 프로모터를 포함한다. 일 실시형태에서, A1AT 프로모터의 단편은 길이가 적어도 100개, 적어도 120개, 적어도 150개, 적어도 180개, 255개 이하, 100개 내지 255개, 150개 내지 225개, 150개 내지 300개, 또는 180개 내지 255개 뉴클레오티드이다. 선택적으로, A1AT 프로모터의 단편은 길이가 150개 내지 300개 뉴클레오티드이다. 선택적으로, A1AT 프로모터의 단편은 길이가 180개 내지 255개 뉴클레오티드이다. 일 실시형태에서, A1AT 프로모터의 단편은 길이가 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 500개 이하, 200개 내지 500개, 250개 내지 500개, 또는 350개 내지 450개 뉴클레오티드이다. 선택적으로, A1AT 프로모터의 단편은 길이가 350개 내지 450개 뉴클레오티드이다.
적합한 A1AT 프로모터 단편이 SEQ ID NO: 30 및 31에 기술되어 있다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 길이가 적어도 100개, 적어도 120개, 적어도 150개, 적어도 180개, 255개 이하, 100개 내지 255개, 150개 내지 300개, 또는 180개 내지 255개 뉴클레오티드인 프로모터를 포함하고 프로모터는 SEQ ID NO: 30과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 길이가 180개 내지 255개 뉴클레오티드인 프로모터를 포함하고 프로모터는 SEQ ID NO: 30과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 30의 적어도 100개, 적어도 120개, 또는 적어도 150개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 30과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 30과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 30의 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 길이가 418개 이하 뉴클레오티드, 255개 이하 뉴클레오티드, 또는 185개 이하 뉴클레오티드인 A1AT 프로모터의 단편을 포함하고, SEQ ID NO: 30을 포함한다.
전사 조절 요소는 길이가 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 500개 이하, 200개 내지 500개, 250개 내지 500개, 350개 내지 450개, 또는 약 418개 뉴클레오티드인 프로모터를 포함할 수 있고 프로모터는 SEQ ID NO: 31과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 길이가 350개 내지 450개 뉴클레오티드인 프로모터를 포함하고 프로모터는 SEQ ID NO: 31과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 31의 적어도 350개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 31과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 31과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 31의 프로모터를 포함한다.
선택적으로, 전사 조절 요소는 최소 네프린 프로모터 NPHS1 또는 포도신(podocin) 프로모터 NPHS2를 포함할 수 있다.
전사 조절 요소는 인핸서를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 전사 조절 요소는 인간 아포지단백질 E(ApoE: apolipoprotein E) 간 유전자좌 제어 영역(HCR; 문헌[Miao et al (2000), Molecular Therapy 1(6):522]), 또는 이의 단편인 인핸서를 포함한다. 일 실시형태에서, 전사 조절 요소는 길이가 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 192개 이하, 80개 내지 192개, 90개 내지 192개, 100개 내지 250개, 또는 117개 내지 192개 뉴클레오티드의 단편인 HCR 인핸서의 단편을 포함한다. 선택적으로, HCR 인핸서의 단편은 길이가 100개 내지 250개 뉴클레오티드이다. 선택적으로, HCR 인핸서의 단편은 길이가 117개 내지 192개 뉴클레오티드이다. 일 실시형태에서, HCR 인핸서의 단편은 길이가 적어도 150개, 적어도 190개, 적어도 230개, 400개 이하, 150개 내지 400개, 190개 내지 370개, 230개 내지 340개, 250개 내지 340개, 또는 약 321개 뉴클레오티드의 단편이다. 선택적으로, HCR 인핸서의 단편은 길이가 250개 내지 340개 뉴클레오티드이다.
적합한 HCR 인핸서 요소 단편이 SEQ ID NO: 32 및 33에 정의되어 있다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 길이가 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 192개 이하, 80개 내지 192개, 90개 내지 192개, 100개 내지 250개, 또는 117개 내지 192개 뉴클레오티드인 인핸서를 포함하고 인핸서는 SEQ ID NO: 32와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 길이가 117개 내지 192개 뉴클레오티드인 인핸서를 포함하고 인핸서는 SEQ ID NO. 32와 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 SEQ ID NO: 32의 적어도 90개, 적어도 100개, 또는 적어도 110개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 32와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 32와 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 32의 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 길이가 321개 이하 뉴클레오티드, 192개 이하 뉴클레오티드, 또는 117개 이하 뉴클레오티드인 HCR 인핸서의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 32를 포함한다.
일부 실시형태에서, 전사 조절 요소는 길이가 적어도 150개, 적어도 190개, 적어도 230개, 400개 미만, 150개 내지 400개, 190개 내지 370개, 230개 내지 340개, 250개 내지 340개, 또는 약 321개 뉴클레오티드인 인핸서를 포함하고 인핸서는 SEQ ID NO: 33과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 길이가 250개 내지 340개 뉴클레오티드인 인핸서를 포함하고 인핸서는 SEQ ID NO: 33과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 SEQ ID NO: 33의 적어도 250개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 33과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 33과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 33의 인핸서를 포함한다.
일 실시형태에서, 전사 조절 요소는 SEQ ID NO: 34와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하다. 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 34와 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 전사 조절 요소를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 34와 적어도 98% 동일한 전사 조절 요소를 포함한다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 SEQ ID NO: 34와 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 34와 100% 동일한 전사 조절 요소를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 34의 전사 조절 요소를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 34로 이루어진 전사 조절 요소를 포함한다.
일 실시형태에서, 전사 조절 요소는 SEQ ID NO: 35와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하다. 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 35와 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 전사 조절 요소를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 35와 적어도 98% 동일한 전사 조절 요소를 포함한다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 SEQ ID NO: 35와 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 35와 100% 동일한 전사 조절 요소를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 35의 전사 조절 요소를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 35로 이루어진 전사 조절 요소를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 우드척 간염 전사 후 조절 요소(WPRE: woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element) 또는 이의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 문헌[Zanta-Boussif et al (2009), Gene Therapy, 16:605-619]에 기술된 돌연변이된 WPRE 서열을 포함한다. 선택적으로, 우드척 간염 전사 후 조절 요소는 SEQ ID NO: 61 내지 63 중 임의의 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 61 내지 63 중 임의의 하나와 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 우드척 간염 전사 후 조절 요소를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 61 내지 63 중 임의의 하나와 적어도 98% 동일한 우드척 간염 전사 후 조절 요소를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 61 내지 63 중 임의의 하나의 서열을 갖는 우드척 간염 전사 후 조절 요소를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 61 내지 63 중 임의의 하나의 우드척 간염 전사 후 조절 요소를 포함한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 61 내지 63 중 임의의 하나로 이루어진 우드척 간염 전사 후 조절 요소를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 우드척 간염 전사 후 조절 요소(WPRE)를 포함하지 않는다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 1개 또는 2개의 ITR을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 각각의 ITR의 뉴클레오티드 서열은 길이가 157개 미만, 154개 미만, 또는 약 145개 뉴클레오티드이다. 선택적으로, 각각의 ITR은 야생형 ITR이다. 선택적으로, 각각의 ITR은 AAV2 ITR이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 폴리A 서열을 추가로 포함할 수 있다. 폴리A 서열은 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치될 수 있다. 폴리A 서열은 소 성장 호르몬 폴리A 서열(bGHpA - SEQ ID NO: 58)일 수 있다. 폴리A 서열은 길이가 250개 내지 270개 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인트론 서열, 예를 들어 바이러스 인트론 서열, 선택적으로 SV40 인트론 서열(SEQ ID NO: 57)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 참조 GCase 폴리펩티드보다 숙주 세포에서 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배 또는 적어도 5배 더 높이 발현될 수 있다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 1.1배 내지 5배, 1.2배 내지 5배, 1.5배 내지 5배, 1.8배 내지 5배, 2배 내지 5배, 2.5배 내지 5배, 3배 내지 5배, 3.5배 내지 5배, 4배 내지 5배, 또는 4.5배 내지 5배 더 높이 발현될 수 있다.
GCase 폴리펩티드의 발현 수준(및 따라서 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드보다 숙주 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는지 여부)은 일반적으로 샘플에서 GCase 폴리펩티드의 수준을 측정하여 결정될 수 있다. 숙주 세포에서 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드의 발현 수준은 숙주 세포에서 참조 GCase 폴리펩티드의 발현 수준과 비교될 수 있다. 이는 정량적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드의 발현 수준은 상기 기재된 바와 같은 ELISA 분석법에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, GCase 폴리펩티드의 발현 수준은 예를 들어 SDS-PAGE 전기영동 또는 웨스턴 블롯에 의해 반-정량적으로 결정될 수 있다.
숙주 세포에 의해 분비되는 GCase 폴리펩티드의 수준은 GCase 폴리펩티드의 발현 수준을 결정하는데 사용될 수 있다(즉, 숙주 세포에 의해 세포 내에 유지되는 GCase 폴리펩티드의 수준과 대조적으로). 선택적으로, 본 발명의 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드보다 더 높은 수준으로 숙주 세포에 의해 분비된다. 예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 또는 적어도 5배 더 높은 수준으로 분비될 수 있다. 선택적으로, 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 1.1배 내지 5배, 1.2배 내지 5배, 1.5배 내지 5배, 1.8배 내지 5배, 2배 내지 5배, 2.5배 내지 5배, 3배 내지 5배, 3.5배 내지 5배, 4배 내지 5배, 또는 4.5배 내지 5배 더 높은 수준으로 분비될 수 있다.
숙주 세포에 의해 분비되는 GCase 폴리펩티드의 수준은 예를 들어 세포(예를 들어 숙주 세포)를 GCase 폴리펩티드를 함유하는 액체(예를 들어 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액, 혈청 또는 혈장, 또는 배양 배지 예를 들어 GCase 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포가 배양되는 조건화된 배지)로부터 분리하고 액체에서 GCase 폴리펩티드의 발현 수준을 결정함으로써 결정될 수 있다. 세포는 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 분리될 수 있고/있거나 액체는 세포로부터 경사분리(decant)(예를 들어, 피펫팅에 의해)될 수 있다. GCase 폴리펩티드의 발현 수준은 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 생물학적 샘플에서 결정될 수 있거나, GCase 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포가 배양되는 조건화된 배지와 같은 배양 배지에서 결정될 수 있다.
숙주 세포는 포유류 세포 또는 곤충 세포와 같은 임의의 진핵 세포일 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드(또는 참조 GCase 폴리펩티드)를 발현하는 임의의 진핵 숙주 세포일 수 있다. 선택적으로, 숙주 세포는 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드(또는 참조 GCase 폴리펩티드)를 발현하는 곤충 세포일 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드(또는 참조 GCase 폴리펩티드)를 발현하는 포유류 숙주 세포일 수 있다. 포유류 숙주 세포는 인간(예를 들어 Expi293F 인간 배아 신장 세포), 개, 돼지, 마우스, 햄스터 또는 기니피그 세포를 포함한다. 보다 특히, 숙주 세포는 포유류 간 세포일 수 있고, 보다 특히 인간 간 세포일 수 있다. 선택적으로, 숙주 세포는 Huh7 세포일 수 있다. 선택적으로, 숙주 세포는 유기체 내에서의 숙주 세포일 수 있다. 선택적으로, 발현은 생체 내 발현일 수 있다. 선택적으로, 발현은 생체 내 발현일 수 있고 혈장에서의 발현이 결정될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는 바이러스 입자를 추가로 제공한다. 본 발명의 목적 상, 용어 "바이러스 입자"는 비리온의 전체 또는 일부를 지칭한다. 예를 들어, 바이러스 입자는 재조합 게놈을 포함하고 캡시드를 추가로 포함할 수 있다. 바이러스 입자는 유전자 요법 벡터일 수 있다. 본원에서, 용어 "바이러스 입자" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용된다. 본 출원의 목적 상, "유전자 요법" 벡터는 유전자 요법에서 사용될 수 있는 바이러스 입자, 즉, 투여 후 숙주 세포에서 GBA 뉴클레오티드 서열과 같은 트랜스진을 발현하기 위해 필요한 기능적인 요소를 모두 포함하는 바이러스 입자이다.
적합한 바이러스 입자는 파보바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 헤르페스 단순 바이러스를 포함한다. 파보바이러스는 아데노-관련 바이러스(AAV: adeno-associated virus)일 수 있다. 선택적으로, 바이러스 입자는 AAV, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 바이러스 입자이다. 바이러스 입자는 바람직하게는 재조합 AAV 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 보다 바람직하게는, 바이러스 입자는 AAV 바이러스 입자이다. 용어 AAV 및 rAAV는 문맥이 명백히 달리 시사하지 않는 한, 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
알려진 모든 AAV 혈청형의 게놈 조직은 매우 유사하다. AAV의 게놈은 길이가 약 5,000개 뉴클레오티드 미만인 선형 단일-가닥 DNA 분자이다. 역위 말단 반복(ITR: Inverted terminal repeat)은 비-구조적 복제(Rep) 단백질과 구조적(VP) 단백질에 대한 고유한 코딩 뉴클레오티드 서열 옆에 있다. VP 단백질(VP1, -2 및 -3)은 캡시드를 형성한다. 말단 약 145 nt(ITR)는 자기-상보적이며 T자형 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정한 분자 내 듀플렉스가 형성될 수 있도록 구성된다. 이러한 헤어핀 구조는 세포 DNA 폴리머라제 복합체의 프라이머 역할을 하는 바이러스 DNA 복제의 기점 역할을 한다. 포유류 세포에서 야생형(wt) AAV 감염 후, Rep 유전자(즉, Rep78 및 Rep52 단백질을 코딩함)는 각각 P5 프로모터 및 P19 프로모터로부터 발현되며, 두 Rep 단백질 모두 바이러스 게놈의 복제에서 기능을 갖는다. Rep ORF의 스플라이싱 이벤트는 4개의 Rep 단백질(즉, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)의 발현을 초래한다. 그러나, 포유류 세포에서 Rep78 및 Rep52 단백질을 코딩하는 스플라이싱되지 않은 mRNA가 AAV 벡터 생산에 충분하다는 것이 밝혀졌다. 또한 곤충 세포에서 Rep78 및 Rep52 단백질은 AAV 벡터 생산에 충분하다.
본 발명의 재조합 바이러스 게놈은 ITR을 포함할 수 있다. 재조합 게놈 또는 바이러스 입자는 상기 기재된 바와 같은 ITR과 같이, 1개 또는 2개의 ITR을 포함할 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터는 단지 하나의 ITR과 함께 기능하는 것이 가능하다. 따라서, 바이러스 게놈은 전형적으로 적어도 하나의 ITR을 포함하지만, 보다 전형적으로는, 2개의 ITR(일반적으로 바이러스 게놈의 한쪽 말단, 즉 5' 말단에 하나, 3' 말단에 하나)을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 ITR 중 하나 또는 둘 모두 사이에 개재 서열이 있을 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 2개의 정규 ITR 사이에 위치하거나 2개의 D 영역으로 조작된 ITR들의 양쪽에 위치하는 바이러스 입자에 통합될 수 있다.
AAV 벡터의 생산을 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 AAV 서열은 임의의 AAV 혈청형의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 상당한 상동성의 게놈 서열을 갖고, 동일한 유전 기능 세트를 제공하고, 본질적으로 물리적 및 기능적으로 동등한 비리온을 생성하고, 실질적으로 동일한 메커니즘에 의해 복제 및 조립한다. 다양한 AAV 혈청형의 게놈 서열 및 게놈 유사성에 대한 개요에 대해 예를 들어 GenBank 수탁 번호 U89790; GenBank 수탁 번호 J01901; GenBank 수탁 번호 AF043303; GenBank 수탁 번호 AF085716; 문헌[Chiorini et al, 1997]; 문헌[Srivastava et al, 1983]; 문헌[Chiorini et al, 1999]; 문헌[Rutledge et al, 1998]; 및 문헌[Wu et al, 2000]을 참조한다. AAV 혈청형 1, 2, 3, 3B, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12가 본 발명에서 사용될 수 있다. AAV 혈청형의 서열은 유전자 요법 벡터의 생산에서 사용되는 경우 돌연변이 또는 조작될 수 있다.
선택적으로, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV4 및/또는 AAV6에서 유래된 ITR 서열을 포함한다. 바람직하게는 ITR 서열은 AAV2 ITR 서열이다. 본원에서, 용어 AAVx/y는 AAVx(여기서 x는 AAV 혈청형 번호임)로부터의 적어도 ITR과 같은 게놈 구성요소를 포함하고 AAVy(여기서 y는 동일하거나 상이한 혈청형의 수임)로부터의 캡시드를 갖는 바이러스 입자를 지칭한다. 예를 들어, AAV2/8 벡터는 AAV2 균주로부터의 ITR을 포함하는 바이러스 게놈의 일부 및 AAV8 균주로부터의 캡시드를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 바이러스 입자는 캡시드를 포함하는 AAV 바이러스 입자이다. AAV 캡시드는 일반적으로 VP1, VP2 및 VP3의 세 가지 단백질로부터 형성된다. VP1의 아미노산 서열은 VP2의 서열을 포함한다. VP2의 일부를 형성하지 않는 VP1의 부분은 VP1unique 또는 VP1U라고 지칭된다. VP2의 아미노산 서열은 VP3의 서열을 포함한다. VP3의 일부를 형성하지 않는 VP2의 부분은 VP2unique 또는 VP2U라고 지칭된다. 선택적으로, 바이러스 입자는 간-친화성(tropic) 또는 CNS-친화성 캡시드를 포함한다. 바이러스 입자(캡시드)가 특정 조직에 대해 친화성인지 여부는 예를 들어 루시퍼라제와 같은 마커 유전자를 발현하는 입자를 투여하고 여러 시점에서 생체 내 이미징을 통해 평가될 수 있다(예를 들어 문헌[Zincarelli et al (2008), Molecular Therapy, 16:1073-1080]에 기술된 바와 같이). 간 조직 또는 CNS 조직 각각에서 강력한 마커 발현을 유도하는 입자는 특히 다른 조직에서의 발현이 적은 경우와 대조적으로 간-친화성 또는 CNS-친화성으로 간주된다.
일부 실시형태에서, 간-친화성 캡시드는 AAV3-, AAV3B-, AAV5, 또는 AAV8-유도된 캡시드일 수 있다. 선택적으로, 간-친화성 캡시드는 AAV3-, AAV3B-, 또는 AAV8-유도된 캡시드일 수 있다. 선택적으로, 간-친화성 캡시드는 AAV3-, 또는 AAV3B- 유도된 캡시드일 수 있다. 선택적으로, 간-친화성 캡시드는 SEQ ID NO: 36, 37, 또는 38의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개, 650개 내지 736개 또는 700개 내지 736개 아미노산의 단편과 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 간-친화성 캡시드는 SEQ ID NO: 36과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 간-친화성 캡시드는 SEQ ID NO: 37과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 간-친화성 캡시드는 SEQ ID NO: 38과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 간-친화성 캡시드는 SEQ ID NO: 36, 37, 또는 38의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개, 650개 내지 736개 또는 700개 내지 736개 아미노산의 단편과 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 간-친화성 캡시드는 SEQ ID NO: 36과 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 간-친화성 캡시드는 SEQ ID NO: 37과 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 간-친화성 캡시드는 SEQ ID NO: 38과 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, CNS-친화성 캡시드는 SEQ ID NO: 39의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개, 650개 내지 736개, 또는 700개 내지 736개 아미노산의 단편과 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, CNS-친화성 캡시드는 SEQ ID NO: 39의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개, 650개 내지 736개, 또는 700개 내지 736개 아미노산의 단편과 100% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, CNS-친화성 캡시드는 SEQ ID NO: 39와 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, CNS-친화성 캡시드는 SEQ ID NO: 39와 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CNS-친화성 캡시드는 AAV9 또는 AAVrh.10-유도된 캡시드일 수 있다. 본 발명의 바이러스 입자는 바이러스 ITR 및 바이러스 캡시드가 상이한 AAV 혈청형과 같은 상이한 파보바이러스로부터 유래된 "하이브리드" 입자일 수 있다. 바람직하게는, 바이러스 ITR 및 캡시드는 AAV의 상이한 혈청형으로부터 유래되며, 이 경우 이러한 바이러스 입자는 트랜스캡시드화 또는 위형(pseudotype)으로 알려져 있다. 마찬가지로, 파보바이러스는 "키메라" 캡시드(예를 들어, 상이한 파보바이러스, 바람직하게는 상이한 AAV 혈청형으로부터의 서열 함유) 또는 "표적화된" 캡시드(예를 들어, 지시된 지향성)를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 AAV 게놈은 기능적 말단 분해 부위(TRS: terminal resolution site)를 포함하는 무손상 ITR을 포함한다. 이러한 AAV 게놈은 1개 또는 2개의 분해가능한 ITR, 즉 DNA 폴리머라제가 풀리고 ITR을 복사하기 위한 기질로 작용할 수 있는 유리 3' 히드록실기를 생성하기 위해 부위-특이적 닉킹(nicking)이 발생할 수 있는 기능적 TRS를 포함하는 ITR을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 재조합 게놈은 단일-가닥이다(즉, 단일-가닥 형태로 바이러스 입자에 패키징된다). 선택적으로, 재조합 게놈은 자가-상보적 구성으로 패키징되지 않으며, 즉 게놈은 바이러스 입자에서 어닐링하는 실질적인 자가-상보적 부분을 갖는 단일 공유 결합 폴리뉴클레오티드 가닥을 포함하지 않는다. 대안적으로, 재조합 게놈은 "단량체 듀플렉스" 형태로 패키징될 수 있다. "단량체 듀플렉스"는 국제특허공개 WO 2011/122950호에 기재되어 있다. 게놈은 바이러스 입자에서 어닐링하는 2개의 실질적으로 상보적이지만 비공유적으로 연결된 폴리뉴클레오티드로서 패키징될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 폴리A 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 재조합 게놈 또는 바이러스 입자는 전술한 바와 같은 폴리A 서열과 같은 폴리A 서열을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인트론 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 게놈 또는 바이러스 입자는 전술한 바와 같은 인트론 서열과 같은 인트론 서열을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 바이러스 입자는 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서 포함), 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열, 및 폴리A 서열, 예를 들어 bGHpA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, bGHpA 서열과 같은 폴리A 서열은 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 AAV2 ITR 및 폴리A 서열(예를 들어 bGHpA 서열)을 포함한다.
일 실시형태에서, 바이러스 입자는 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서 포함), 인트론 서열, 예를 들어 SV40 인트론 서열, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열, 및 폴리A 서열, 예를 들어 bGHpA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, SV40 인트론 서열과 같은 인트론 서열은 전사 조절 요소와 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열 사이에 위치할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 폴리A 서열, 예를 들어 bGHpA 서열은 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 AAV2 ITR, 폴리A 서열(예를 들어 bGHpA 서열), 및/또는 인트론(예를 들어 SV40 인트론)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 입자를 숙주 세포(예를 들어 Huh-7 세포)에 형질도입한 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자(otherwise identical viral particle)의 숙주 세포(예를 들어 Huh-7 세포)로의 형질도입 후의 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 동일하거나 더 높다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 41 또는 44의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 41 또는 44의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 또는 10의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 43 또는 46의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 43 또는 46의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 22 또는 26의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 42 또는 45의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 42 또는 45의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 14 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 59 또는 60의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 7배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 또는 적어도 70배 더 높다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 적어도 50배, 적어도 60배, 또는 적어도 70배 더 높다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 최대 50배, 최대 60배, 최대 70배, 최대 80배, 또는 최대 100배 더 높다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 2배 내지 100배, 3배 내지 100배, 5배 내지 100배, 15배 내지 100배, 20배 내지 100배, 30배 내지 100배, 40배 내지 100배, 50배 내지 100배, 또는 70배 내지 100배 더 높다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 2배 내지 80배, 5배 내지 80배, 20배 내지 80배, 또는 50배 내지 80배 더 높다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 2배 내지 70배, 2배 내지 10배, 3배 내지 20배, 5배 내지 10배, 15배 내지 30배, 20배 내지 40배, 30배 내지 50배, 40배 내지 60배, 또는 50배 내지 70배 더 높다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 59 또는 60의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 41 또는 44의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 41 또는 44의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 또는 10의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 43 또는 46의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 43 또는 46의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 22 또는 26의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 42 또는 45의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 42 또는 45의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 14 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 SEQ ID NO: 14 또는 18의 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%이다. 선택적으로, 숙주 세포는 Huh-7 세포이다. 선택적으로, 본 발명의 바이러스 입자 및 그 밖의 동일한 바이러스 입자는 SEQ ID NO: 37의 캡시드를 포함한다.
변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 "동일"하다고 기술하는 것은 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 플러스 또는 마이너스 10%, 보다 특히 플러스 또는 마이너스 5%, 또는 보다 특히 플러스 또는 마이너스 1% 동일할 수 있음을 나타낸다.
참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 "달리 동일한" 바이러스 입자는 GBA 뉴클레오티드 서열이 상이하다는 것을 제외하고 본 발명의 바이러스 입자와 동일한(즉, 바이러스 입자가 동일한 캡시드를 포함하고 재조합 게놈이 동일한 전사 조절 요소를 포함한다는 등) 바이러스 입자이다. 예를 들어, 비교되는 상이한 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 상이한 GBA 뉴클레오티드 서열은 동일한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 입자의 투여 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여, 간, 혈장, 백혈구 세포, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 동일하거나 더 높다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 입자의 투여 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여, 간에서 동일하거나 더 높다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 입자의 투여 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여, 혈장, 백혈구 세포, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 동일하거나 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은, 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여, 골수, 비장 및/또는 혈장에서 동일하거나 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은, 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여, 비장, 폐 및/또는 골수에서 동일하거나 더 높다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 41 또는 44의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 41 또는 44의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 또는 10의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 43 또는 46의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 43 또는 46의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 22 또는 26의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 42 또는 45의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 42 또는 45의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 14 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 59 또는 60의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 7배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 또는 적어도 70배 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 7배, 또는 적어도 10배 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 혈장에서 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 7배, 또는 적어도 10배 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 또는 적어도 40배 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 혈장에서 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 또는 적어도 40배 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 4배 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 비장에서 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 4배 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 골수에서 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 4배 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 2배 내지 5배, 2배 내지 10 배, 3배 내지 7배, 3배 내지 20배, 5배 내지 10배, 15배 내지 30배, 20배 내지 40배, 30배 내지 50배, 40배 내지 60배, 또는 50배 내지 70배 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 2배 내지 20배, 2배 내지 15배, 2배 내지 10배, 2배 내지 7배, 2배 내지 5배, 또는 3배 내지 5배 더 높다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 59 또는 60의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 41 또는 44의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 41 또는 44의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 또는 10의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 43 또는 46의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 43 또는 46의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 22 또는 26의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 42 또는 45의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 42 또는 45의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 14 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 SEQ ID NO: 14 또는 18의 서열에 의해 코딩되는 GCase 폴리펩티드의 유효 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%이다. 선택적으로, 본 발명의 바이러스 입자 및 그 밖의 동일한 바이러스 입자는 AAV8 캡시드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유효 활성은 본 발명의 바이러스 입자의 투여로부터 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후에 측정된다. 바람직하게는, 유효 활성은 12주에 또는 그 후에 측정된다. 예를 들어, 본 발명의 바이러스 입자의 투여로부터 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에), 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여의 각각 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에) 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 수준과 비교될 수 있다. 특정한 예에서, 유효 활성 수준은 본 발명의 바이러스 입자의 투여로부터 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후에 측정될 수 있으며 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여의 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후에 측정된 수준과 비교된다. 바람직하게는, 유효 활성 수준은 투여 후 동일한 시점에 동일한 분석법으로 측정된다.
일부 실시형태에서, GCase 유효 활성은 예를 들어 GCase에 특이적인 형광 기질을 사용하여 본원에 기술된 것과 같은 형광측정 분석법을 사용하여 측정된다. 형광 기질은 본원에 기술된 바와 같을 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성과 비교하여, 혈장, 간, 백혈구 세포, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 동일하거나 더 높다. 일부 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성과 비교하여, 간, 백혈구 세포, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 동일하거나 더 높다. 일 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성과 비교하여 골수 및/또는 폐 조직에서 동일하거나 더 높다.
일 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성과 비교하여 더 높다. 일 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성과 비교하여 적어도 1.1배, 적어도 1.2배 또는 적어도 1.3배 더 높다. 일 실시형태에서, 폐 조직에서의 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성과 비교하여 적어도 1.5배 또는 적어도 2배 더 높다.
일 실시형태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성(예를 들어 대상체에서)은, 바람직하게는 유효 활성이 대상체에서 치료 시작 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후에 측정되는 경우 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성과 비교하여 더 높다. 바람직하게는, 유효 활성은 12주에 또는 그 후에 측정된다.
"GCase 효소 대체 요법"은 GCase 폴리펩티드를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 임의의 요법을 지칭할 수 있다. GCase 폴리펩티드는 야생형, 예를 들어 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 GCase 폴리펩티드 및/또는 벨라글루세라제 알파일 수 있다. GCase 폴리펩티드는 임의의 적합한 용량으로, 선택적으로 40 내지 100, 50 내지 80, 60 내지 70, 또는 약 60 U/kg BW의 용량으로 투여될 수 있다. GCase 폴리펩티드는 임의의 적합한 경로를 통해, 선택적으로 정맥 내 주입 또는 피하 주입을 통해 투여될 수 있다. GCase 효소 대체 요법의 유효 활성은 바람직하게는 GCase 효소 대체 요법의 용량(예를 들어 이전 용량) 투여 후 2시간에 측정된다. 예를 들어, GCase 효소 대체 요법이 대상체에 2주 마다 투여되는 경우, 12주에서의 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성의 측정은 12주 차(즉 7회 차) 용량의 투여 후 2시간에 대상체의 조직 샘플을 수득하는 단계를 수반한다. 선택적으로, GCase 효소 대체 요법의 유효 활성의 측정은 2주 마다 GCase 효소 대체 요법의 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 선택적으로, GCase 효소 대체 요법의 유효 활성의 측정은 적어도 12 또는 12주 동안 GCase 효소 대체 요법의 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 선택적으로, GCase 효소 대체 요법의 유효 활성의 측정은 2주 마다 GCase 효소 대체 요법의 용량을 투여하는 단계를 포함하고 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성은 GCase 효소 대체 요법의 최종 용량의 투여 후 2시간에 측정된다.
일 실시형태에서, 바이러스 입자의 투여 후, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은, 전술된 바와 같은 GCase 효소 대체 요법의 투여 후 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준과 비교하여, 혈장, 간, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 더 낮다. 관련 실시형태에서, 바이러스 입자의 투여 후, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준은 고셔병이 있는 대상체에서(예를 들어, 동일하거나 동등한 장기에서) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준과 비교하여, 혈장, 간, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 더 낮다. 선택적으로, 바이러스 입자의 투여 후, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은 GCase 효소 대체 요법의 투여 후 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만 또는 0% 내지 25%이다. 선택적으로, 바이러스 입자의 투여 후, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은 고셔병이 있는 대상체에서(예를 들어, 동일하거나 동등한 장기에서) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만 또는 0% 내지 25%이다. 일 실시형태에서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은 질량 분석법에 의해, 예를 들어 실시예 13에 기술된 바와 같은 방법에 의해 측정된다. 고셔병이 있는 대상체는 고셔병 모델 유기체, 예를 들어 고셔병 마우스 모델(예를 들어 9V/null 마우스)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 입자의 투여 후, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준과 비교하여, 혈장, 간, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 더 낮다. 선택적으로, 바이러스 입자의 투여 후, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준과 비교하여, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만 또는 0% 내지 25%이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 59 또는 60의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 바이러스 입자의 투여 후, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은 고셔병이 있는 대상체에서(예를 들어, 동일하거나 동등한 장기에서) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만 또는 0% 내지 25%이다. 일 실시형태에서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은 질량 분석법에 의해, 예를 들어 실시예 13에 기술된 바와 같은 방법에 의해 측정된다. 고셔병이 있는 대상체는 고셔병 모델 유기체, 예를 들어 고셔병 마우스 모델(예를 들어 9V/null 마우스)일 수 있다.
일 실시형태에서, 바이러스 입자의 투여 후, 저장 세포의 수 또는 활성화된 대식세포의 수준은, 전술된 바와 같은 GCase 효소 대체 요법의 투여 후 저장 세포의 수 또는 활성화된 대식세포의 수준과 비교하여, 간 또는 폐 조직, (및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기)에서 더 낮다. 선택적으로, 저장 세포의 수는 GCase 효소 대체 요법의 투여 후의 저장 세포의 수의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 15% 미만 또는 0% 내지 25%이다. 선택적으로, 활성화된 대식세포의 수준은 GCase 효소 대체 요법의 투여 후의 활성화된 대식세포의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 15% 미만 또는 0% 내지 25%이다.
일 실시형태에서, 헥소실스핑고신 수준, 헥소실세라미드 수준, 저장 세포 수 및/또는 활성화된 대식세포의 수준은 바이러스 입자의 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후에 측정된다. 바람직하게는, 헥소실스핑고신 수준, 헥소실세라미드 수준, 저장 세포 수 및/또는 활성화된 대식세포의 수준은 12주에 또는 그 후에 측정된다.
일부 실시형태에서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은 바이러스 입자의 투여로부터 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후에 측정된다. 바람직하게는, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은 12주에 또는 그 후에 측정된다. 예를 들어, 본 발명의 바이러스 입자의 투여로부터 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에), 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후, 각각 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에), 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 수준과 비교될 수 있다. 특정한 예에서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은 본 발명의 바이러스 입자의 투여로부터 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후에 측정될 수 있고 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여로부터 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후에 측정된 수준과 비교될 수 있다. 바람직하게는, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은 투여 후 동일한 시점에 동일한 분석법으로 측정된다.
GCase 효소 대체 요법 후 헥소실스핑고신 수준, 헥소실세라미드 수준, 저장 세포 수 및/또는 활성화된 대식세포 수준의 측정 시, 헥소실스핑고신 수준, 헥소실세라미드 수준, 저장 세포 수 및/또는 활성화된 대식세포 수준은 바람직하게는 GCase 효소 대체 요법의 용량(예를 들어 이전 용량)의 투여 후 2시간에 측정된다. 예를 들어, GCase 효소 대체 요법이 대상체에서 2주 마다 투여되는 경우, 12주에서의 헥소실스핑고신 수준, 헥소실세라미드 수준, 저장 세포 수 및/또는 활성화된 대식세포 수준의 측정은 12주차(즉 7회차) 용량의 투여 후 2시간에 대상체의 조직 샘플을 수득하는 단계를 수반한다. 선택적으로, GCase 효소 대체 요법의 투여 후 헥소실스핑고신 수준, 헥소실세라미드 수준, 저장 세포 수 및/또는 활성화된 대식세포 수준의 측정은 2주 마다 GCase 효소 대체 요법의 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 선택적으로, GCase 효소 대체 요법의 투여 후 헥소실스핑고신 수준, 헥소실세라미드 수준, 저장 세포 수 및/또는 활성화된 대식세포 수준의 측정은 적어도 12 또는 12주 동안 GCase 효소 대체 요법의 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 선택적으로, GCase 효소 대체 요법의 투여 후 헥소실스핑고신 수준, 헥소실세라미드 수준, 저장 세포 수 및/또는 활성화된 대식세포 수준의 측정은 2주 마다 GCase 효소 대체 요법의 용량을 투여하는 단계를 포함하고 GCase 효소 대체 요법의 투여 후 헥소실스핑고신 수준, 헥소실세라미드 수준, 저장 세포 수 및/또는 활성화된 대식세포 수준은 GCase 효소 대체 요법의 최종 용량의 투여 후 2시간에 측정된다.
일 실시형태에서, 저장 세포의 수는 현미경으로 측정된다. 일 실시형태에서, 활성화된 대식세포의 수준은 면역조직화학을 사용하여 CD68 밀도를 측정하여 검출된다. 저장 세포 및/또는 CD68양성 세포의 식별은 당업계에 알려진 방법, 예를 들어 면역조직화학 또는 현미경에 의해, 예를 들어 실시예 13에 기술된 방법에 의해 수행될 수 있다.
일례에서, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준의 감소는 각각 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준의 감소를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 헥소실세라미드의 감소는 글루코실세라미드의 감소를 나타낼 수 있다. 추가 예로서, 헥소실스핑고신 수준의 감소는 글루코실스핑고신 수준의 감소를 나타낼 수 있다.
조성물, 방법 및 용도
본 발명의 추가 양태에서, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터/본 발명의 바이러스 입자 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
약학적으로 허용되는 부형제는 담체, 희석제 및/또는 다른 의약제, 약학제 또는 어쥬번트 등을 포함할 수 있다. 선택적으로, 약학적으로 허용되는 부형제는 염수 용액을 포함한다. 선택적으로, 약학적으로 허용되는 부형제는 인간 혈청 알부민을 포함한다.
본 발명은 치료 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자 또는 조성물을 추가로 제공한다. 선택적으로 치료 방법은 유효량의 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자, 또는 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 유효량의 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자, 또는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 치료 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자 또는 조성물의 용도를 추가로 제공한다. 선택적으로 치료 방법은 유효량의 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자, 또는 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
선택적으로, 치료 방법은 유전자 요법이다. "유전자 요법"은 본 발명의 벡터/바이러스 입자가 투여되는 숙주(예를 들어 환자)에서 트랜스진(예를 들어 GBA 뉴클레오티드 서열)을 발현할 수 있는 본 발명의 벡터/바이러스 입자를 투여하는 단계를 수반한다.
선택적으로, 치료 방법은 GCase 효소 대체 요법이다. "GCase 효소 대체 요법"은 폴리펩티드를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 임의의 요법을 지칭할 수 있다. 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드가 투여될 수 있다. 변형된 GCase 폴리펩티드는 임의의 적합한 용량으로, 선택적으로 40 내지 100, 50 내지 80, 60 내지 70, 또는 약 60 U/kg BW의 용량으로 투여될 수 있다. GCase 폴리펩티드는 임의의 적절한 경로를 통해, 선택적으로 정맥 내 주입 또는 피하 주입을 통해 투여될 수 있다.
선택적으로, 치료 방법은 GCase 결핍과 관련된 질환을 치료하는 방법이다. 위에서 논의한 바와 같이, GCase 결핍은 시누클레오병증(synucleopathy)(국제특허공개 WO08/144591호에서 논의된 바와 같음) 또는 파킨슨병을 비롯한 다양한 질병을 유발할 수 있는 많은 필수 장기에 침투하는 대식세포에서 글루코세레브로시드의 축적을 유발할 수 있다. 선택적으로, 치료 방법은 파킨슨병 또는 시누클레오병증을 치료하는 방법이다. 선택적으로 치료 방법은 파킨슨병을 치료하는 방법이다. 선택적으로, 치료 방법은 루이 소체 치매, 말초 신경병증, 다계통 위축 또는 순수 자율신경 부전을 치료하는 방법이다.
선택적으로, 치료 방법은 고셔병(GD), 예를 들어 GD I형, II형 또는 III형과 같은 리소좀 축적 장애를 치료하는 방법이다. 바람직하게는, 리소좀 축적 장애는 타박상, 피로, 빈혈, 낮은 혈소판 수 및 간 및 비장의 비대를 특징으로 한다. 선택적으로, 치료 방법은 GD를 치료하는 방법이다. 선택적으로 치료 방법은 GD I형을 치료하는 방법이다. 선택적으로 치료 방법은 GD II형을 치료하는 방법이다. 선택적으로 치료 방법은 GD III형을 치료하는 방법이다. 일부 실시형태에서, 환자는 GD를 앓고 있는 환자이다. 일부 실시형태에서, 환자는 GD I형을 앓고 있는 환자이다. 일부 실시형태에서, 환자는 GD II형을 앓고 있는 환자이다. 일부 실시형태에서, 환자는 GD III형을 앓고 있는 환자이다. 선택적으로 환자는 이전에 효소 대체 요법의 일부로서 치료받은 적이 있는 재조합 GCase(예를 들어 이미글루세라아제, 벨라글루세라아제 알파 또는 탈리글루세라아제 알파)에 대한 항체 또는 억제제를 가지고 있다.
선택적으로, 치료 방법은 니만-픽병(Niemann-Pick disease), 예를 들어 니만-픽 C형(NPC: Niemann-Pick type C)의 치료 방법이다.
선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자 및/또는 조성물은 정맥 내로 투여된다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자 및/또는 조성물은 환자에게 1회만(즉, 단회 투여) 투여하기 위한 것이다.
선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자 및/또는 조성물은 예를 들어 대상체의 뇌 및/또는 척수로의 직접 주사에 의해 대상체의 CNS에 직접 투여된다. 선택적으로, 직접 주사는 뇌내 주사, 뇌실 내 주사, 수조 내 주사, 실질 내 주사, 척수강 내 주사, 또는 이들의 조합이다. 선택적으로, 전달 강화 전달(CED: convection enhanced delivery)은 대상체의 CNS에 직접 주입하기 위해 사용된다. CED는 뇌를 외과적으로 노출시키고 소구경 카테터를 뇌의 표적 영역에 직접 배치한 다음, 치료제(예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자 및/또는 조성물)를 대상체의 뇌에 직접 투여하는 치료 전략이다. CED는 예를 들어 문헌[Debinski et al. (2009) Expert Rev Neurother. 9(10): 1519-27]에 기술되어 있다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자 및/또는 조성물은 예를 들어 말초 주입에 의해 대상체에 말초적으로 투여된다. 선택적으로, 말초 주입은 피하 주입, 정맥 내 주입, 동맥 내 주입(예를 들어 대상체의 경동맥으로의 주입), 복강 내 주입, 또는 이들의 임의의 조합이다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자 및/또는 조성물은 대상체의 CNS로 말초적이고 및 직접적으로 투여된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상체는 동맥 내 주입(예를 들어, 경동맥으로의 주입)에 의해 및 실질 내 주입(예를 들어, CED에 의한 실질 내 주입)에 의해 조성물이 투여된다. 선택적으로, CNS로의 직접 주사 및 말초 주입은 동시에 발생한다. 선택적으로, 직접 주사는 말초 주입 전에(예를 들어 이전 1분 내지 1주, 또는 그 이상) 발생한다. 선택적으로, 직접 주사는 말초 주입 후에(예를 들어 이후 1분 내지 1주, 또는 그 이상) 발생한다.
선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자 및/또는 조성물은 신동맥(renal artery)으로의 주입에 의해 투여된다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터/바이러스 입자 및/또는 조성물은 예를 들어 요도 카테터를 사용하여 요관을 통해, 역행 투여(retrograde administration)에 의해 투여된다.
질환 또는 장애(예를 들어 GD, 예를 들어 GD I형)가 본 명세서에서 논의된 바와 같이(예를 들어, 본 발명의 방법 또는 용도에서) "치료"될 때, 이는 질환 또는 장애(예를 들어 GD, 예를 들어 GD I형)의 하나 이상의 증상이 완화됨을 의미한다. 이는 질환이나 장애(예를 들어 GD, 예를 들어 GD I형)의 증상이 완전히 치료되어 환자에게 더 이상 존재하지 않는 것을 의미하지는 않지만, 일부 방법에서는 그럴 수 있다. 따라서, 모든 경우에 "치료" 또는 "치료하는"이라는 용어는 각각 "개선" 또는 "개선하는"이라는 용어로 대체될 수 있다. 본 발명의 방법 또는 용도(예를 들어, 치료 또는 치료하는 방법)는 질환 또는 장애(예를 들어 GD, 예를 들어 GD I형)의 증상 중 하나 이상을 치료 전보다 덜 심각하게 만들 수 있다. 선택적으로, 투여 전 상황에 비해, 본 발명의 방법 또는 용도(예를 들어, 치료 또는 치료하는 방법)는 환자의 혈액에서 순환하는 GCase의 양/농도를 증가시키고/시키거나, 주어진 혈액 부피 내에서 검출가능한 GCase 활성의 전체적인 수준을 증가시키고/시기커나 환자의 대식세포를 증가시킨다. 일 실시형태에서, 투여 전 상황에 비해, 본 발명의 방법 또는 용도(예를 들어 치료 또는 치료하는 방법)는 다음 중 하나 이상의 결과를 초래한다: 헤모글로빈 농도의 증가; 혈소판 수 증가; 비장 크기 감소; 간 크기 감소.
또한, 본 발명의 방법 또는 용도는 고셔병과 같은 질환을 "예방"할 수 있다. 고셔병은 일반적으로 다양한 조직에서 글루코세레브로시다제의 축적과 관련이 있으며, 본 발명의 방법 또는 용도가 젊은 대상체(예를 들어 10대, 젊은 성인, 어린이 또는 아기)에게 수행되는 경우 고셔병의 발병을 예방할 수 있어야 한다. 따라서, 모든 경우에 "치료" 또는 "치료하는"이라는 용어는 각각 "예방" 또는 "예방하는"이라는 용어로 대체될 수 있다.
"유효량"은 대상체에서 기능적 GCase의 수준을 높이는 것과 같은, 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 용량 및 기간에서 효과적인 양을 지칭한다(GD, 예를 들어 GD I형과 같은 질환 또는 장애의 증상을 개선하기에 충분한 수준에서 기능적 GCase 생산을 유도하도록).
선택적으로, 벡터/바이러스 입자는 환자의 체증 kg 당 1 x 1011 미만, 2 x 1011 미만, 1 x 1012 미만, 5 x 1012 미만, 2 x 1012 미만, 1.5 x 1012 미만, 3 x 1012 미만, 1 x 1013 미만, 2 x 1013 미만, 또는 3 x 1013 미만 벡터 게놈(vg/kg)의 용량으로 투여된다. 선택적으로, 투여되는 벡터/바이러스 입자의 용량은 대상체가 GD를 앓고 있지 않은 건강한 대상체의 수준의 10% 내지 90%, 20% 내지 80%, 30% 내지 70%, 25% 내지 50%, 20% 내지 150%, 30% 내지 140%, 40% 내지 130%, 50% 내지 120%, 60% 내지 110% 또는 70% 내지 100%의 수준으로 GCase를 발현하도록 선택된다.
본 발명은 질환의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물을 추가로 제공하며, 상기 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드, 예를 들어 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 GCase 폴리펩티드에 비해 pH 7.4에서 증가된 안정성을 가질 수 있다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 의해 유지되는 활성보다 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 또는 적어도 2배 더 높은 활성을 유지한다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 GCase 폴리펩티드에 의해 유지되는 활성보다 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 7배, 적어도 10배, 또는 적어도 15배 더 높은 활성을 유지한다.
본 발명은 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여에 의해 질환을 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase GCase 폴리펩티드는 참조 야생형 GCase 폴리펩티드, 예를 들어 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 비해 pH 7.4에서 증가된 안정성을 갖는다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 의해 유지되는 활성에 비해 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 또는 적어도 2배 더 높은 활성을 유지한다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 GCase 폴리펩티드에 의해 유지되는 활성보다 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 7배, 적어도 10배, 또는 적어도 15배 더 높은 활성을 유지한다.
본 발명은 질환의 치료에서 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도를 추가로 제공하며 상기 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드, 예를 들어 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 비해 pH 7.4에서 증가된 안정성을 갖는다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 의해 유지되는 활성에 비해 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 또는 적어도 2배 더 높은 활성을 유지한다. 선택적으로, 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 GCase 폴리펩티드에 의해 유지되는 활성보다 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 7배, 적어도 10배, 또는 적어도 15배 더 높은 활성을 유지한다.
본 발명은 질환을 치료하는 용도를 위한 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물을 추가로 제공하며, 이는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 포함하거나 코딩하는 동등한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 투여될 용량과 비교하여 보다 낮은 용량의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여에 의한 질환의 치료 방법을 추가로 제공하며 상기 치료는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 포함하거나 코딩하는 동등한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 투여될 용량과 비교하여 보다 낮은 용량의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 질환의 치료에서 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도를 추가로 제공하며, 질환을 치료하는 단계는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 포함하거나 코딩하는 동등한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 투여될 용량과 비교하여 보다 낮은 용량의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
어구 "질환을 치료하는"이라는 것과 관련하여, "질환"은 상기 논의된 질환 또는 장애 중 임의의 하나일 수 있다. 이와 같이, 질환을 치료하는 것은 고셔병(GD), 예를 들어 GD I형, II형 또는 III형과 같은 대상체 또는 환자에서 리소좀 저장 장애를 치료하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 리소좀 저장 장애는 타박상, 피로, 빈혈, 낮은 혈소판 수 및 간 및 비장의 비대를 특징으로 한다. 선택적으로, "질환을 치료하는"은 대상체 또는 환자에서 GD, 예를 들어 GD I형을 치료하는 것을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 환자는 GD, 예를 들어 GD I형을 앓고 있는 대상체 또는 환자이다.
"SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 포함하거나 코딩하는 동등한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물"과 관련하여, "동등한" 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 포함한다(또는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드이다). "동등한" 폴리뉴클레오티드는 "동등한" 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드보다는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 코딩한다 것을 제외하고 비교되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 동일하다. "동등한" 바이러스 입자는 "동등한" 바이러스 입자가 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드보다는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 코딩한다 것을 제외하고 비교되는 본 발명의 바이러스 입자와 동일하다. "동등한" 조성물은 "동등한" 조성물이 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드보다는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 코딩한다 것을 제외하고 비교되는 본 발명의 조성물과 동일하다.
일 양태에서, GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태에 걸린 대상체에서 하기를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도가 제공된다:
(i) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(ii) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(iii) 활성화된 대식세포의 수준 감소.
일 양태에서, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물을 대상체에 투여함으로써 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서의 하기 방법이 제공된다:
(i) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(ii) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(iii) 활성화된 대식세포의 수준 감소. 선택적으로,
(i) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(ii) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(iii) 활성화된 대식세포의 수준 감소;
는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 치료한다.
일 양태에서, GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 하기 방법에서 사용하기 위한, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물은:
(iv) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(v) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(vi) 활성화된 대식세포의 수준 감소이며; 선택적으로 상기
(iv) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(v) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(vi) 활성화된 대식세포의 수준 감소;
는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태의 치료를 유도한다.
선택적으로, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주, 적어도 12주 또는 12주에 측정된다. 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 시점에서 (출발) 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준과 비교할 때 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 2배 내지 3배, 2배 내지 4배, 2배 내지 5배, 2배 내지 6배, 또는 3배 내지 5배만큼 감소될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물의 투여 후(예를 들어 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주, 적어도 12주 또는 12주), 환자에서의 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 시점에서의 (출발) 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준과 비교하여 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하일 수 있다. 선택적으로, 환자는 건강한 대상체 또는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 갖고 있지 않은 대상체와 비교하여 증가된 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준을 가질 수 있다, 즉, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 전에 환자는 건강한 대상체 또는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 갖고 있지 않은 대상체와 비교하여 증가된 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준을 갖는다. 예를 들어, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 환자/대상체의 폐, 비장, 간 및/또는 골수에서 측정된다. 선택적으로, 폐, 비장, 간 및/또는 골수에서의 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준을 측정하는 단계는 마우스 대상체에서 수득된 데이터에 기반하여 폐, 비장, 간 및/또는 골수에서의 헥소실세라민 및/또는 헥소실스핑고신 수준을 추정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드가 마우스의 비장에서 헥소실스핑고신 수준을 감소시킬 수 있는지 시험함으로써 환자의 비장에서 헥소실스핑고신 수준을 감소시키는지 여부를 시험할 수 있다. 헥소실세라마이드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 환자/대상체의 혈청 및/또는 백혈구 세포(예를 들어 대식세포)에서 측정될 수 있다. 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 환자/대상체의 혈장에서 측정될 수 있다. 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준의 측정 방법은 당업계에 알려져 있으며, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 바람직하게는 질량 분석법(LC/MS 분석)을 사용하여, 예를 들어 실시예 13에 기술된 방법에 의해 측정된다.
선택적으로, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준(예를 들어 환자/대상체의 폐, 혈청, 백혈구 세포(예를 들어 대식세포), 비장, 간 및/또는 골수에서; 추가 예는 환자/대상체의 혈장에서임)의 감소는, 바람직하게는 치료 시작 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준이 측정되는 경우 GCase 효소 대체 요법으로부터 달성된 감소보다 더 크다. 예를 들어 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여로부터 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에) 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 수준은 GCase 효소 대체 요법의 제1 투여로부터 각각 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에) 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 수준과 비교될 수 있다. 특정 예로서, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후에 측정될 수 있으며 GCase 효소 대체 요법의 제1 투여 후 적어도 12주(예를 들어 12주에)에 측정된 수준과 비교될 수 있다. 바람직하게는, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 투여 후 동일한 시점에 동일한 분석법으로 측정된다. 선택적으로, GCase 효소 대체 요법은 2주 마다 투여될 수 있다. 선택적으로, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준은, 바람직하게는 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준이 치료 개시 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후 측정되는 경우 GCase 효소 대체 요법을 겪고 있는 대상체에서 달성된 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만, 또는 5% 내지 25%로 감소된다. 선택적으로, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준은, 바람직하게는 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준이 치료 개시 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후 측정되는 경우, 유효량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 달성된 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만, 또는 5% 내지 25%로 감소된다. 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법을 투여한 후 대상체에서 달성된 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준을 측정할 때, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은 바람직하게는 GCase 효소 대체 요법의 용량(예를 들어, 이전 용량)의 투여 후 2시간에 측정된다. 예를 들어, GCase 효소 대체 요법이 대상체에게 2주 마다 투여되는 경우, 예를 들어 12주 차에서의 혈청에서의 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라마이드의 수준을 측정하는 단계는 12주 차(즉, 7회 차) 용량을 투여한 후 2시간에 대상체로부터 혈청 샘플을 수득하는 단계를 수반한다.
선택적으로, 본 발명의 바이러스 입자의 투여 후 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준(예를 들어 환자/대상체의 폐, 혈장, 혈청, 백혈구 세포(예를 들어 대식세포), 비장, 간 및/또는 골수)의 감소는 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자가 투여된 대상체에서 달성된 감소에 비해 더 크다.
선택적으로 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준(예를 들어 환자/대상체의 폐, 혈장, 혈청, 백혈구 세포(예를 들어 대식세포), 비장, 간 및/또는 골수에서)에서의 더 큰 감소를 제공하며, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스 입자 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자의 일부로서 제공되는 경우, 즉 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스 입자 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자의 투여 후, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준(예를 들어 환자/대상체의 폐, 혈장, 혈청, 백혈구 세포(예를 들어 대식세포), 비장, 간 및/또는 골수)의 감소는 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자가 투여된 대상체에서 달성된 감소보다 더 크다.
이러한 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 "달리 동일한" 바이러스 입자는 GBA 뉴클레오티드 서열이 상이하다는 것을 제외하고 하기와 동등한 바이러스 입자이다(즉, 바이러스 입자는 동일한 캡시드를 포함하고 재조합 게놈은 동일한 전사 조절 요소를 포함하는 등)
(i) 본 발명의 바이러스 입자;
(ii) 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스 입자; 또는
(iii) 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자.
예를 들어, 상이한 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 상이한 GBA 뉴클레오티드 서열은 동일한 프로모터 서열과 작동가능하게 연결되어 있다.
바람직하게는, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주, 또는 적어도 12주 후에 측정된다. 예를 들어, (i) 본 발명의 바이러스 입자, (ii) 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스 입자, 또는 (iii) 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자의 투여로부터 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에), 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 수준은 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 각각 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에), 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 수준과 비교될 수 있다. 특정 예로서, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 (i) 본 발명의 바이러스 입자, (ii) 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스 입자, 또는 (iii) 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자의 투여로부터 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후에 측정될 수 있으며 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 적어도 12주(예를 들어 12주에)에 측정되는 수준과 비교될 수 있다. 바람직하게는, 헥소실세라미드 수준 및/또는 헥소실스핑고신은 투여 후 동일한 시점에서 동일한 분석법에서 측정된다. 선택적으로, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준은, 바람직하게는 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준이 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후 측정되는 경우, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자가 투여된 대상체에서 달성된 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만, 또는 5% 내지 25%으로 감소된다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 59 또는 60의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
선택적으로, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 대상체의 혈장에서 측정된다. 선택적으로, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 대상체의 골수에서 측정된다. 선택적으로, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 대상체의 비장에서 측정된다. 선택적으로, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 대상체의 간에서 측정된다. 선택적으로, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 대상체의 폐에서 측정된다. 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준을 측정하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준은 바람직하게는 질량 분석법(LC/MS 분석)을 사용하여, 예를 들어 실시예 13에 기술된 방법에 의해 측정된다.
선택적으로, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후 대상체(또는 환자)에서의 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준은, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준(예를 들어 골수, 폐, 혈청, 백혈구 세포(예를 들어 대식세포), 간 및/또는 비장에서; 추가 예는 환자/대상체의 혈장에서임)이 건강한 대상체 또는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있지 않는 대상체에서 측정되는 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 200%, 150%, 또는 125% 이하로 감소되도록 한다. 일례에서, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준의 감소는 각각 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준의 감소를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 헥소실세라미드의 감소는 글루코실세라미드의 감소를 나타낼 수 있다. 추가 예로서, 헥소실스핑고신 수준의 감소는 글루코실스핑고신 수준의 감소를 나타낼 수 있다.
일례에서, 헥소실세라미드 및/또는 헥소실스핑고신 수준의 감소는 각각 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신의 감소이다. 즉, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 투여된 환자(예를 들어, GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 환자)는, 바람직하게는 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준이 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주, 적어도 12주, 또는 12주에 측정되는 경우, 투여 후 감소된 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준을 가질 수 있다. 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 시점에서 (출발) 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준과 비교하여 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 2배 내지 3배, 2배 내지 4배, 2배 내지 5배, 2배 내지 6배, 3배 내지 5배까지 감소될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후(예를 들어 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주, 적어도 12주 또는 12주), 환자에서의 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 시점에서의 (출발) 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준과 비교할 때 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하일 수 있다. 선택적으로, (본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 전에) 환자는 건강한 대상체 또는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 갖고 있지 않은 대상체와 비교할 때 증가된 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준을 가질 수 있다. 예를 들어, 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 환자/대상체의 폐, 비장, 간 및/또는 골수에서 측정된다. 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 환자/대상체의 혈청 및/또는 백혈구 세포(예를 들어 대식세포)에서 측정될 수 있다. 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 환자/대상체의 혈장에서 측정될 수 있다. 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준을 측정하는 방법이 당업계에 알려져 있으며, 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 바람직하게는 질량 분석법(LC/MS 분석)을 사용하여, 예를 들어 실시예 13에 기술된 방법에 의해 측정된다. 선택적으로, 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준(예를 들어 환자/대상체의 혈청, 백혈구 세포(예를 들어 대식세포), 비장, 간 및/또는 골수에서; 추가 예는 환자/대상체의 혈장에서임)의 감소는, 바람직하게는 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준이 치료 개시 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후 측정되는 경우 GCase 효소 대체 요법으로부터 달성되는 감소보다 더 크다. 예를 들어 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여로부터 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에) 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 수준은 GCase 효소 대체 요법의 제1 투여로부터 각각 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에) 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 수준과 비교될 수 있다. 특정 예로서, 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후에 측정될 수 있으며 GCase 효소 대체 요법의 제1 투여 후 적어도 12주(예를 들어 12주에)에 측정되는 수준과 비교될 수 있다. 바람직하게는, 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 투여 후 동일한 시점에 동일한 분석으로 측정된다. 선택적으로, GCase 효소 대체 요법은 2주 마다 투여될 수 있다. 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법의 투여 후 대상체에서 달성된 글루코실스핑고신 및/또는 글루코실세라미드의 수준을 측정하는 경우, 글루코실스핑고신 및/또는 글루코실세라미드 수준은 바람직하게는 GCase 효소 대체 요법의 용량(예를 들어 이전 용량)의 투여 후 2시간에 측정된다. 예를 들어, GCase 효소 대체 요법이 대상체에 2주 마다 투여되는 경우, 예를 들어, 12주 차에 혈청에서 글루코실스핑고신 및/또는 글루코실세라미드의 수준을 측정하는 것은 12주 차(즉 7회 차) 용량의 투여 후 2시간에 대상체의 혈청 샘플을 수득하는 단계를 수반한다.
선택적으로, 본 발명의 바이러스 입자의 투여 후 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준(예를 들어 환자/대상체의 폐, 혈장, 혈청, 백혈구 세포(예를 들어 대식세포), 비장, 간 및/또는 골수에서)의 감소는 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자가 투여된 대상체에서 달성된 감소보다 더 크다.
선택적으로 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준(예를 들어 환자/대상체의 폐, 혈장, 혈청, 백혈구 세포(예를 들어 대식세포), 비장, 간 및/또는 골수에서)의 더 큰 감소를 제공하며, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스 입자의 일부로서 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자로서 제공되는 경우, 즉, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스 입자 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자의 투여 후, 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준(예를 들어 환자/대상체의 폐, 혈장, 혈청, 백혈구 세포(예를 들어 대식세포), 비장, 간 및/또는 골수에서)의 감소는 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자가 투여된 대상체에서 달성된 감소보다 더 크다.
이러한 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 "달리 동일한" 바이러스 입자는 GBA 뉴클레오티드 서열이 상이하다는 것을 제외하고 하기와 동일한 바이러스 입자이다(즉, 바이러스 입자는 동일한 캡시드를 포함하고 재조합 게놈은 동일한 전사 조절 요소를 포함하는 등)
(i) 본 발명의 바이러스 입자,
(ii) 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스 입자, 또는
(iii) 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자.
예를 들어, 상이한 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 상이한 GBA 뉴클레오티드 서열은 동일한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다.
바람직하게는, 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후에 측정된다. 예를 들어, (i) 본 발명의 바이러스 입자, (ii) 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스 입자, 또는 (iii) 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자의 투여로부터 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에), 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 수준은 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후로부터 각각 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에), 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 수준과 비교될 수 있다. 특정한 예로서, 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은 (i) 본 발명의 바이러스 입자, (ii) 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스 입자, 또는 (iii) 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자의 투여로부터 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후에 측정될 수 있으며 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여로부터 적어도 12주(예를 들어 12주에)에 측정된 수준과 비교될 수 있다. 바람직하게는, 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신의 수준은 투여 후 동일한 시점에 동일한 분석으로 측정될 수 있다. 선택적으로, 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준은, 바람직하게는 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준이 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후에 측정되는 경우, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자가 투여된 대상체에서 달성된 글루코실세라미드 및/또는 글루코실스핑고신 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만, 또는 5% 내지 25%로 감소된다. 일부 실시형태에서, 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드이다. 선택적으로, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 59 또는 60의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
선택적으로, 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후 대상체(또는 환자)에서 글루코실세라미드 수준은 글루코실세라미드 수준(예를 들어 혈청, 백혈구 세포(예를 들어 대식세포), 간 및/또는 비장에서)이 건강한 대상체 또는 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있지 않은 대상체에서 측정된 글루코실세라미드 수준의 200% , 150%, 또는 125% 이하가 되도록 감소된다.
선택적으로 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물이 투여된 환자(예를 들어, GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 환자)는, 바람직하게는 세포가 투여 후 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에) 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후에 계수되는 경우, 투여 후 대상체의 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서 감소된 수의 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포를 나타낼 수 있다. 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서 저장 세포의 수 및/또는 활성화된 대식세포의 감소는 감소된 염증의 표시일 수 있으며 따라서 치료 이익일 수 있다. 활성화된 대식세포의 수는 CD68양성 세포의 수를 측정함으로써 표시 또는 예측될 수 있다. 저장 세포 및/또는 CD68양성 세포의 식별은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 면역조직화학 또는 현미경에 의해, 예를 들어 실시예 13에 기술된 방법에 의해 수행될 수 있다.
선택적으로, 간 및/또는 폐에서의 활성화된 대식세포의 수 및/또는 저장 세포의 수의 측정은 마우스 연구에서 수득된 데이터를 기반으로 간 및/또는 폐에서의 활성화된 대식세포의 수 및/또는 저장 세포의 수를 추정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, GCase 폴리펩티드가 마우스의 간에서 저장 세포의 수를 감소시킬 수 있는지 시험함으로써 환자의 간에서 저장 세포의 수를 감소시키는지 여부를 시험할 수 있다.
선택적으로, 대상체의 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포의 감소는, 바람직하게는 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서 저장 세포의 수 및/또는 활성화된 대식세포가 치료 개시 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후에 측정되는 경우, GCase 효소 대체 요법으로부터 달성된 감소보다 더 크다. 예를 들어 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여로부터 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에) 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 수준은 GCase 효소 대체 요법의 제1 투여로부터 각각 적어도 6주(예를 들어 6주에), 적어도 8주(예를 들어 8주에), 적어도 10주(예를 들어 10주에) 또는 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후의 수준과 비교될 수 있다. 특정 예로서, 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포의 수준(예를 들어 수)은 본 발명의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후 적어도 12주(예를 들어 12주에) 후에 측정될 수 있고 GCase 효소 대체 요법의 제1 투여 후 적어도 12주(예를 들어 12주에)에 측정된 수준과 비교될 수 있다. 바람직하게는, 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포의 수준(예를 들어 수)은 투여 후 동일한 시점에 동일한 분석으로 측정된다. 선택적으로, GCase 효소 대체 요법은 2주 마다 투여될 수 있다. 선택적으로, 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서의 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포의 수준(예를 들어 수)은, 바람직하게는 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포의 수준(예를 들어 수)이 치료 개시 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주 또는 적어도 12주 후에 측정되는 경우, GCase 효소 대체 요법을 겪고 있는 대상체에서 달성된 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서의 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포의 수준(예를 들어 수)의 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만, 0% 내지 25%, 또는 5% 내지 25%로 감소된다. 선택적으로, 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서의 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포의 수준(예를 들어 수)은, 바람직하게는 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서의 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포의 수준(예를 들어 수)이 치료 개시 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주, 적어도 12주 또는 12주 후 측정되는 경우, 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 달성된 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서의 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포의 수준(예를 들어 수)의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만, 0% 내지 25%, 또는 5% 내지 25%로 감소된다. 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법의 투여 후 대상체에서 달성된 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서의 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포의 수준(예를 들어 수)을 측정할 때, 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서의 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포의 수준(예를 들어 수)은 바람직하게는 GCase 효소 대체 요법의 용량(예를 들어 이전 용량)의 투여 후 2시간에 측정된다. 예를 들어, GCase 효소 대체 요법이 대상체에 2주 마다 투여되는 경우, 12주에서 간 또는 폐(예를 들어 폐 조직)에서의 저장 세포 및/또는 활성화된 대식세포의 수준(예를 들어 수)의 측정은 12주차(즉 7회차) 용량의 투여 후 2시간에 대상체로부터의 조직 샘플을 수득하는 단계를 수반한다.
"GCase 효소 대체 요법"은 대상체에 GCase 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 임의의 요법을 지칭할 수 있다. GCase 폴리펩티드는 야생형, 예를 들어 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 GCase 폴리펩티드, 예를 들어 벨라글루세라제 알파일 수 있다. GCase 폴리펩티드는 임의의 적합한 용량으로, 선택적으로 40 내지 100, 50 내지 80, 60 내지 70, 또는 약 60 U/kg BW의 용량으로 투여될 수 있다. GCase 폴리펩티드는 임의의 적합한 경로를 통해, 선택적으로 정맥 내 주입 또는 피하 주입을 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 양태
본 발명은 하기 양태에 추가로 기술된다.
1. 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 β-글루코세레브로시다제(GCase) 폴리펩티드로서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는:
(i) 보다 높은 유효 활성을 제공하고/하거나;
(ii) 증가된 안정성을 제공하고/하거나;
(iii) 생리학적 pH에서 구조적인 안정화를 제공하고/하거나;
(iv) 보다 긴 반감기를 제공하고/하거나;
(v) 증가된 열안정성을 제공하는,
변형된 β-글루코세레브로시다제(GCase) 폴리펩티드.
2. SEQ ID NO: 1의 351, 380, 272, 262, 313, 404, 407, 482, 484, 490, 494, 503, 및 534로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 상응하는 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 변형된 β-글루코세레브로시다제(GCase) 폴리펩티드.
3. 양태 1 또는 2에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 보다 높은 유효 활성을 제공하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
4. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 증가된 안정성을 제공하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
5. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 생리학적 pH에서 구조적인 안정화를 제공하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
6. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 보다 긴 반감기를 제공하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
7. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 더 높은 유효 활성을 갖는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
8. 양태 7에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드이고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
9. 양태 7에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
10. 양태 7 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성에 비해 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 또는 적어도 50배 더 높은, 변형된 GCase 폴리펩티드.
11. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 증가된 안정성을 제공하고 증가된 안정성이 pH 7.4에서인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
12. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 증가된 안정성을 제공하고 증가된 안정성이 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후에 측정되는 것인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
13. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 pH 7.4에서 구조적인 안정화를 제공하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
14. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 생리학적 pH에서 보다 구조적으로 안정하고, 선택적으로 상기 pH가 pH 7.4인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
15. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖고, 선택적으로 상기 증가된 안정성이 pH 7.4에서의 증가된 안정성인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
16. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7.4 및 37℃에서 적어도 10분, 적어도 30분, 적어도 60분, 적어도 120분, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 또는 적어도 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
17. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 5.6 및 37℃에서 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 또는 적어도 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
18. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 2.8배, 또는 적어도 3배 더 높은 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
19. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 30배, 또는 적어도 50배 더 높은 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
20. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7.4의 PBS 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 30배, 또는 적어도 50배 더 높은 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
21. 양태 10 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
22. 양태 10 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
23. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7.4의 PBS 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 또는 적어도 60% 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
24. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7.4의 PBS 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 50% 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
25. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서,
- 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지하고/하거나;
- 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
26. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서,
- 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 15%, 또는 적어도 20% 활성을 유지하고, 선택적으로 상기 인큐베이션이 혈청 또는 혈장에서이고/이거나;
- 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 40% 활성을 유지하고, 선택적으로 상기 인큐베이션이 혈청 또는 혈장에서인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
27. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 60% 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
28. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 80% 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
29. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 80% 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
30. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 활성, 유효 활성, 안정성, 및/또는 반감기가 형광측정 분석법을 사용하여 결정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
31. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 증가된 열안정성을 제공하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
32. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 5.75에서 적어도 55, 적어도 56, 또는 적어도 57℃의 용융 온도를 갖는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
33. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7에서 적어도 52, 적어도 53, 또는 적어도 53.5℃의 용융 온도를 갖는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
34. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 열안정성을 갖는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
35. 양태 34에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 용융 온도가 pH 5.75에서 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 5.4℃ 더 높은, 변형된 GCase 폴리펩티드.
36. 양태 34에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 용융 온도가 pH 7에서 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 적어도 1, 적어도 2, 또는 적어도 2.5℃ 더 높은, 변형된 GCase 폴리펩티드.
37. 양태 34 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드이고, 선택적으로 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
38. 양태 32 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 용융 온도가 1.5 μM 또는 3 μM의 변형된 GCase 폴리펩티드 농도에서 계산된 용융 온도인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
39. 양태 32 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 용융 온도가 열 이동 분석법을 사용하여 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
40. 양태 32 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 분 당 1℃ 씩 증가하는 온도에서 인큐베이션됨에 따라 변형된 GCase 폴리펩티드의 접힘 풀림을 측정함으로써 용융 온도가 계산되는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
41. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수를 감소키는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
42. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 감소된 수의 HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제를 갖는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
43. 양태 41 또는 42에 있어서, HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제의 수가 IC50 결합 친화도를 사용하여 예측되는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
44. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 감소된 수의 HLA-I 결합제를 갖는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
45. 양태 41 내지 44 중 어느 하나에 있어서, HLA-I 및/또는 HLA-II 결합제가 강력한 결합제인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
46. 양태 41 내지 45 중 어느 하나에 있어서, HLA-I 결합제가 강력한 결합제인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
47. 양태 41 내지 46 중 어느 하나에 있어서, HLA-II 결합제가 강력한 결합제인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
48. 양태 42 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
49. 양태 42 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
50. 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 더 긴 반감기를 갖는 전술된 양태 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드.
51. 양태 50에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 긴 반감기를 갖는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
52. 양태 50 또는 51에 있어서, 보다 긴 반감기가 pH 7.4에서의 보다 긴 반감기인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
53. 양태 50 또는 51에 있어서, 보다 긴 반감기가 pH 5.6에서의 보다 긴 반감기인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
54. 양태 53에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 20배 더 긴 pH 5.6에서의 반감기를 갖는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
55. 양태 50 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 보다 긴 반감기가 혈청 또는 혈장에서의 보다 긴 반감기인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
56. 양태 50 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 반감기가 형광측정 분석법을 사용하여 결정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
57. 양태 50 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
58. 양태 50 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
59. 양태 50 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
60. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 1.8 내지 2.2 mM, 또는 약 2.0 mM의 Km 값을 갖는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
61. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
62. 양태 61에 있어서, SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치의 돌연변이가 글루타민으로의 치환, 선택적으로 E272Q인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
63. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 SEQ ID NO: 1의 위치 262에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
64. 양태 63에 있어서, SEQ ID NO: 1의 위치 262에 상응하는 위치의 돌연변이가 아스파라긴 또는 티로신으로의 치환인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
65. 양태 64에 있어서, SEQ ID NO: 1의 위치 262에 상응하는 위치의 돌연변이가 아스파라긴으로의 치환, 선택적으로 H262N인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
66. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 SEQ ID NO: 1의 위치 313에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
67. 양태 66에 있어서, SEQ ID NO: 1의 위치 313에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 아스파라긴으로의 치환, 선택적으로 H313N인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
68. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 SEQ ID NO: 1의 위치 404에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
69. 양태 68에 있어서, SEQ ID NO: 1의 위치 404에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 리신으로의 치환, 선택적으로 H404K인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
70. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 SEQ ID NO: 1의 위치 490에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
71. 양태 70에 있어서, SEQ ID NO: 1의 위치 490에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 리신으로의 치환, 선택적으로 H490K인, 변형된 폴리펩티드.
72. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
73. 양태 72에 있어서, SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 아스파라긴으로의 치환, 선택적으로 R534N인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
74. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 2개의 돌연변이를 포함하고, 상기 2개의 돌연변이 각각은 이황화 결합의 형성을 가능케 하는 시스테인으로의 치환인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
75. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 하기를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 482에 상응하는 위치에서의 돌연변이; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 503에 상응하는 위치에서의 돌연변이.
76. 양태 75에 있어서, 하기와 같은, 변형된 GCase 폴리펩티드:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 482에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 시스테인으로의 치환, 선택적으로 아스파르트산에서 시스테인으로의 돌연변이이고;
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 503에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 시스테인으로의 치환, 선택적으로 세린에서 시스테인으로의 돌연변이이다.
77. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 하기를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 494에 상응하는 위치에서의 돌연변이; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에서의 돌연변이.
78. 양태 77에 있어서, 하기와 같은, 변형된 GCase 폴리펩티드:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 494에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 시스테인으로의 치환, 선택적으로 세린에서 시스테인으로의 돌연변이이고;
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 시스테인으로의 치환, 선택적으로 아르기닌에서 시스테인으로의 돌연변이이다.
79. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 하기를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 돌연변이; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 돌연변이.
80. 양태 79에 있어서, 하기와 같은, 변형된 GCase 폴리펩티드:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 시스테인으로의 치환, 선택적으로 트립토판에서 시스테인으로의 돌연변이이고;
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 시스테인으로의 치환, 선택적으로 알라닌에서 시스테인으로의 돌연변이이다.
81. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 하기를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 407에 상응하는 위치에서의 돌연변이; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 484에 상응하는 위치에서의 돌연변이.
82. 양태 81에 있어서, 하기와 같은, 변형된 GCase 폴리펩티드:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 407에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 시스테인으로의 치환, 선택적으로 이소류신에서 시스테인으로의 돌연변이이고;
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 484에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 시스테인으로의 치환, 선택적으로 아스파르트산에서 시스테인으로의 돌연변이이다.
83. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 글루타민으로의 치환을 포함하고, 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 가지며, pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 85% 활성을 유지하고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
84. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 글루타민으로의 치환을 포함하고, 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 가지며, pH 7.4의 PBS 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 60% 활성을 유지하며, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
85. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 글루타민으로의 치환을 포함하고, 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 가지며, pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 50%, 또는 적어도 55% 활성을 유지하며, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
86. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 하기를 포함하고,
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서 트립토판에서 시스테인으로의 돌연변이; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 알라닌에서 시스테인으로의 돌연변이;
상기 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖고, pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 85% 활성을 유지하며, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
87. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 하기를 포함하고,
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서 트립토판에서 시스테인으로의 돌연변이; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 알라닌에서 시스테인으로의 돌연변이;
상기 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖고, pH 7.4 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 60% 활성을 유지하며, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
88. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 하기를 포함하고,
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서 트립토판에서 시스테인으로의 돌연변이; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 알라닌에서 시스테인으로의 돌연변이;
상기 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖고, pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 50%, 또는 적어도 55% 활성을 유지하며, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
89. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 하기를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 글루타민으로의 치환, 선택적으로 E272Q; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에 트립토판에서 시스테인으로의 돌연변이; 및
(iii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에 알라닌에서 시스테인으로의 돌연변이.
90. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 하기를 포함하고:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서 글루타민으로의 치환, 선택적으로 E272Q; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서 트립토판에서 시스테인으로의 돌연변이; 및
(iii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 알라닌에서 시스테인으로의 돌연변이;
상기 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖고, pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 85% 활성을 유지하며, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
91. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 하기를 포함하고:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서 글루타민으로의 치환, 선택적으로 E272Q; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서 트립토판에서 시스테인으로의 돌연변이; 및
(iii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 알라닌에서 시스테인으로의 돌연변이;
상기 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖고, pH 7.4의 PBS 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 60% 활성을 유지하며, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
92. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 하기를 포함하고:
(i) SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에서 글루타민으로의 치환, 선택적으로 E272Q; 및
(ii) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서 트립토판에서 시스테인으로의 돌연변이; 및
(iii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서 알라닌에서 시스테인으로의 돌연변이;
상기 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖고, pH 5.6 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 50%, 또는 적어도 55% 활성을 유지하며, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
93. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드가 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 더 높은 유효 활성 및/또는 증가된 안정성을 갖고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 5 중 임의의 하나로부터 선택되는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
94. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서,
(i) 변형된 GCase 폴리펩티드가 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 400개, 300개 내지 497개, 400개 내지 497개, 또는 450개 내지 497개 아미노산의 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 단편과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(ii) 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(iii) 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 400개 내지 536개 아미노산의 단편과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(iv) 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 2의 400개 내지 497개 아미노산의 단편과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(v) 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(vi) 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 2와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(vii) 변형된 GCase 폴리펩티드가 전술된 양태 중 어느 하나에 정의된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(viii) 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(ix) 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치 및 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에 시스테인으로의 치환을 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(x) 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치 및 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에 시스테인으로의 치환을 포함하고, 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
95. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 SEQ ID NO: 1의 위치 184에 상응하는 위치에 히스티딘의 류신으로의 돌연변이를 포함하지 않는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
96. 전술된 양태 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 SEQ ID NO: 1의 위치 360에 상응하는 위치에 리신의 아스파라긴으로의 돌연변이를 포함하지 않는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
97. 변형된 글루코세레브로시다제(GBA) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열이 전술된 양태 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
98. 양태 97에 있어서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 6 내지 29 중 임의의 하나의 적어도 750개, 적어도 850개, 적어도 950개, 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1400개, 또는 적어도 1494개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
99. 양태 97 또는 98에 있어서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 6 내지 29 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
100. 양태 97 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
101. 양태 97 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
102. 양태 97 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 26의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
103. 양태 97 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열이 코돈-최적화된, 폴리뉴클레오티드.
104. 양태 97 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열이 인간 간 세포에서의 발현을 위한 코돈-최적화된, 폴리뉴클레오티드.
105. 양태 97 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
106. 양태 105에 있어서, 전사 조절 요소가 간-특이적 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
107. 양태 105 또는 106에 있어서, 전사 조절 요소가 A1AT 프로모터 또는 A1AT 프로모터의 단편을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
108. 양태 107에 있어서, A1AT 프로모터의 단편이 길이가 적어도 100개, 적어도 120개, 적어도 150개, 적어도 180개, 255개 이하, 100개 내지 255개, 150개 내지 225개, 150개 내지 300개, 또는 180개 내지 255개 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
109. 양태 108에 있어서, A1AT 프로모터의 단편이 길이가 180개 내지 255개 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
110. 양태 97 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
111. 양태 110에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
112. 양태 110 또는 111에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31의 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
113. 양태 105 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 전사 조절 요소가 길이가 418개 이하의 뉴클레오티드, 255개 이하의 뉴클레오티드, 또는 185개 이하의 뉴클레오티드인 A1AT 프로모터의 단편을 포함하고, SEQ ID NO: 30을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
114. 양태 105 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 전사 조절 요소가 인핸서를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
115. 양태 114에 있어서, 인핸서가 HCR 인핸서 또는 HCR 인핸서의 단편인, 폴리뉴클레오티드.
116. 양태 115에 있어서, HCR 인핸서의 단편이 길이가 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 192개 이하, 80개 내지 192개, 90개 내지 192개, 100개 내지 250개, 또는 117개 내지 192개 뉴클레오티드의 단편인, 폴리뉴클레오티드.
117. 양태 116에 있어서, HCR 인핸서의 단편이 길이가 117개 내지 192개 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드.
118. 양태 97 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 32 또는 SEQ ID NO: 33과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
119. 양태 118에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 32 또는 SEQ ID NO: 33과 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
120. 양태 119에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 32 또는 SEQ ID NO: 33의 인핸서를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
121. 양태 105 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 전사 조절 요소가 길이가 321개 이하인 뉴클레오티드, 192개 이하인 뉴클레오티드, 또는 117개 이하인 뉴클레오티드인 HCR 인핸서의 단편을 포함하고, SEQ ID NO: 32를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
122. 양태 105 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 전사 조절 요소가 SEQ ID NO: 34와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
123. 양태 122에 있어서, 전사 조절 요소가 SEQ ID NO: 34와 100% 동일한 서열을 포함하거나 전사 조절 요소가 SEQ ID NO: 34와 동일한, 폴리뉴클레오티드.
124. 양태 105 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 전사 조절 요소가 SEQ ID NO: 35와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
125. 양태 124에 있어서, 전사 조절 요소가 SEQ ID NO: 35와 100% 동일한 서열을 포함하거나 전사 조절 요소가 SEQ ID NO: 35와 동일한, 폴리뉴클레오티드.
126. 양태 97 내지 125 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는 바이러스 입자.
127. 양태 126에 있어서, AAV, 아데노바이러스, 또는 렌티바이러스 바이러스 입자인, 바이러스 입자.
128. 양태 127에 있어서, 바이러스 입자가 AAV 바이러스 입자인, 바이러스 입자.
129. 양태 126 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 입자가 간-친화성 또는 CNS-친화성 캡시드를 포함하는, 바이러스 입자.
130. 양태 129에 있어서, 간-친화성 캡시드가 SEQ ID NO: 36, 37 또는 38의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개, 650개 내지 736개, 또는 700개 내지 736개 아미노산의 단편과 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
131. 양태 129에 있어서, 간-친화성 캡시드가 SEQ ID NO: 36과 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
132. 양태 129에 있어서, 간-친화성 캡시드가 SEQ ID NO: 37과 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
133. 양태 129에 있어서, 간-친화성 캡시드가 SEQ ID NO: 38과 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
134. 양태 129에 있어서, CNS-친화성 캡시드가 SEQ ID NO: 39의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개, 650개 내지 736개, 또는 700개 내지 736개 아미노산의 단편과 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
135. 양태 129에 있어서, CNS-친화성 캡시드가 SEQ ID NO: 39와 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
136. 양태 126 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 입자가 하기를 추가로 포함하는, 바이러스 입자:
a) AAV2 ITR;
b) 폴리A 서열; 및/또는
c) 인트론.
137. 양태 126 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 재조합 게놈이 단일-가닥인, 바이러스 입자.
138. 양태 126 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포로의 형질도입 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 숙주 세포로의 형질도입 후 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 동일하거나 더 높은, 바이러스 입자.
139. 양태 138에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 더 높은, 바이러스 입자.
140. 양태 139에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 7배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 또는 적어도 70배 더 높은, 바이러스 입자.
141. 양태 138 내지 140 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 바이러스 입자.
142. 양태 141에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드를 포함하는, 바이러스 입자.
143. 양태 142에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 59 또는 60의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
144. 양태 138 내지 140 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 41 또는 44의 폴리펩티드를 포함하는, 바이러스 입자.
145. 양태 144에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 6 또는 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
146. 양태 138 내지 140 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 43 또는 46의 폴리펩티드를 포함하는, 바이러스 입자.
147. 양태 146에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 22 또는 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
148. 양태 138 내지 140 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 42 또는 45의 폴리펩티드를 포함하는, 바이러스 입자.
149. 양태 148에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 14 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
150. 양태 126 내지 149 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 SEQ ID NO: 14 또는 18의 서열에 의해 코딩되는 GCase 폴리펩티드의 유효 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%인, 바이러스 입자.
151. 양태 138 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 Huh-7 세포인, 바이러스 입자.
152. 양태 126 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 입자의 투여 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여, 혈장, 백혈구 세포, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 동일하거나 더 높은, 바이러스 입자.
153. 양태 126 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 입자의 투여 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 간에서 동일하거나 더 높은, 바이러스 입자.
154. 양태 152 또는 153에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 더 높은, 바이러스 입자.
155. 양태 154에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 7배, 또는 적어도 10배 더 높은, 바이러스 입자.
156. 양태 153 내지 155 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 또는 적어도 40배 더 높은, 바이러스 입자.
157. 양태 152 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 바이러스 입자.
158. 양태 157에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드를 포함하는, 바이러스 입자.
159. 양태 158에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 59 또는 60의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
160. 양태 152 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 41 또는 44의 폴리펩티드를 포함하는, 바이러스 입자.
161. 양태 160에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 6 또는 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
162. 양태 152 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 43 또는 46의 폴리펩티드를 포함하는, 바이러스 입자.
163. 양태 162에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 22 또는 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
164. 양태 152 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 42 또는 45의 폴리펩티드를 포함하는, 바이러스 입자.
165. 양태 164에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 14 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
166. 양태 152 내지 165 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 SEQ ID NO: 14 또는 18의 서열에 의해 코딩되는 GCase 폴리펩티드의 유효 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%인, 바이러스 입자.
167. 양태 126 내지 166 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 입자의 투여 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이, GCase 효소 대체 요법의 유효 활성과 비교하여, 간, 백혈구 세포, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 동일하거나 더 높은, 바이러스 입자.
168. 양태 167에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성과 비교하여 골수 및/또는 폐 조직에서 더 높은, 바이러스 입자.
169. 양태 167에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성과 비교하여 더 높은, 바이러스 입자.
170. 양태 167 내지 169 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성과 비교하여 적어도 1.1배, 적어도 1.2배 또는 적어도 1.3배 더 높은, 바이러스 입자.
171. 양태 167 내지 170 중 어느 하나에 있어서, 폐 조직에서의 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성과 비교하여 적어도 1.5배 또는 적어도 2배 더 높은, 바이러스 입자.
172. 양태 167 내지 171 중 어느 하나에 있어서, GCase 효소 대체 요법이 SEQ ID NO: 3의 GCase 폴리펩티드 및/또는 벨라글루세라제 알파(VPRIV)의 투여인, 바이러스 입자.
173. 양태 167 내지 172 중 어느 하나에 있어서, GCase 효소 대체 요법의 유효 활성이 GCase 효소 대체 요법의 용량의 투여 후 2시간에 측정된 유효 활성인, 바이러스 입자.
174. 양태 167 내지 173 중 어느 하나에 있어서, GCase 효소 대체 요법이 40 내지 100, 50 내지 80, 60 내지 70, 또는 약 60 U/kg BW의 용량의 GCase 폴리펩티드의 투여를 포함하는, 바이러스 입자.
175. 양태 167 내지 174 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 활성이 바이러스 입자의 투여 후 적어도 12주, 또는 12주에 측정되는, 바이러스 입자.
176. 양태 126 내지 175 중 어느 하나에 있어서, 유효 활성이 GCase에 특이적인 형광 기질을 사용하여 측정되는, 바이러스 입자.
177. 양태 126 내지 176 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 입자의 투여 후, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준이, GCase 효소 대체 요법의 투여 후 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준과 비교하여, 혈장, 간, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 더 낮은, 바이러스 입자.
178. 양태 126 내지 177 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 입자의 투여 후, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준이 고셔병이 있는 대상체에서 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준과 비교하여, 혈장, 간, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 더 낮은, 바이러스 입자.
179. 양태 177 또는 178에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준이 GCase 효소 대체 요법의 투여 후 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만, 또는 0% 내지 25%인, 바이러스 입자.
180. 양태 177 내지 179 중 어느 하나에 있어서, GCase 효소 대체 요법이 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드 및/또는 벨라글루세라제 알파(VPRIV)의 투여인, 바이러스 입자.
181. 양태 126 내지 180 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 입자의 투여 후, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준이, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준과 비교하여, 혈장, 간, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 더 낮은, 바이러스 입자.
182. 양태 181에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준이, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만, 또는 0% 내지 25%인, 바이러스 입자.
183. 양태 181 또는 182에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 바이러스 입자.
184. 양태 181 내지 183 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드를 포함하는, 바이러스 입자.
185. 양태 181 내지 184 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 59 또는 60의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
186. 양태 177 내지 185 중 어느 하나에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준이 고셔병이 있는 대상체에서의 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만, 또는 0% 내지 25%인, 바이러스 입자.
187. 양태 177 내지 186 중 어느 하나에 있어서, 효소 대체 요법의 투여 후의 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준이 GCase 효소 대체 요법의 용량의 투여 후 2시간에 측정되는 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준인, 바이러스 입자.
188. 양태 177 내지 187 중 어느 하나에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준이 바이러스 입자의 투여 후 적어도 12주에 측정되는, 바이러스 입자.
189. 양태 177 내지 188 중 어느 하나에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준이 질량 분석법에 의해 측정되는, 바이러스 입자.
190. 양태 126 내지 189 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 입자의 투여 후, 저장 세포의 수 또는 활성화된 대식세포의 수준이 GCase 효소 대체 요법의 투여 후 저장 세포의 수 또는 활성화된 대식세포의 수준과 비교하여 간 또는 폐 조직에서 더 낮은, 바이러스 입자.
191. 양태 190에 있어서, 저장 세포의 수가 GCase 효소 대체 요법의 투여 후의 저장 세포 수의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 15% 미만, 또는 0% 내지 25%인, 바이러스 입자.
192. 양태 190 또는 양태 191에 있어서, 활성화된 대식세포의 수준이 GCase 효소 대체 요법의 투여 후 활성화된 대식세포의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 또는 0% 내지 25%인, 바이러스 입자.
193. 양태 190 내지 192 중 어느 하나에 있어서, GCase 효소 대체 요법이 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드 및/또는 벨라글루세라제 알파(VPRIV)의 투여인, 바이러스 입자.
194. 양태 190 내지 193 중 어느 하나에 있어서, GCase 효소 대체 요법의 투여 후 저장 세포의 수 또는 활성화된 대식세포의 수준이 GCase 효소 대체 요법의 용량의 투여 후 2시간에 측정되는 저장 세포의 수 또는 활성화된 대식세포의 수준인, 바이러스 입자.
195. 양태 190 내지 194 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GCase 폴리펩티드의 투여 후 저장 세포의 수 또는 활성화된 대식세포의 수준이 바이러스 입자의 투여 후 적어도 12주에 측정되는, 바이러스 입자.
196. 양태 190 내지 195 중 어느 하나에 있어서, 저장 세포의 수가 현미경에 의해 측정되는, 바이러스 입자.
197. 양태 190 내지 196 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 대식세포의 수준이 면역조직화학을 사용하여 CD68 밀도를 측정하여 검출되는, 바이러스 입자,
198. 전술된 양태 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 바이러스 입자 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 조성물.
199. 치료 방법에서 사용하기 위한 전술된 양태 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물.
200. 양태 199의 사용에 있어서, 치료 방법이 유효량의 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
201. 유효량의 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
202. 치료 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에서 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도.
203. 양태 202에 있어서, 치료 방법이 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 용도.
204. 양태 199 내지 203 중 어느 하나에 있어서, 치료 방법이 GCase 결핍과 관련된 질환의 치료 방법인, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
205. 양태 199 내지 204 중 어느 하나에 있어서, 치료 방법이 파킨슨병의 치료 방법인, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
206. 양태 199 내지 204 중 어느 하나에 있어서, 치료 방법이 고셔병의 치료 방법인, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
207. 양태 206에 있어서, 고셔병이 고셔병 I형인, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
208. 양태 206에 있어서, 고셔병이 고셔병 II형인, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
209. 양태 206에 있어서, 고셔병이 고셔병 III형인, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
210. 양태 200, 201, 또는 203 내지 209 중 어느 하나에 있어서, 이전에 효소 대체 요법의 일부로서 치료받은 적이 있는 환자가 재조합 GCase에 대한 항체 또는 억제제를 가지고 있는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물.
211. 질환의 치료에서 사용하기 위한 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물로서, 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드와 비교하여 pH 7.4에서 증가된 안정성을 갖는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물.
212. 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여에 의한 질환의 치료 방법으로서, 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드와 비교하여 pH 7.4에서 증가된 안정성을 갖는, 치료 방법.
213. 질환의 치료에서 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도로서, 상기 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드와 비교하여 pH 7.4에서 증가된 안정성을 갖는, 용도.
214. 양태 211, 212, 또는 213 중 어느 하나에 있어서,
- 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 의해 유지되는 활성에 비해 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 또는 적어도 2배 더 높은 활성을 유지하고/하거나;
- 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드가 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 의해 유지된 활성에 비해 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 7배, 적어도 10배, 또는 적어도 15배 더 높은 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물.
215. 질환의 치료에서 사용하기 위한 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물로서, 질환의 치료는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 포함하거나 코딩하는 동등한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여에 필요한 용량에 비해 보다 낮은 용량의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물.
216. 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여에 의한 질환의 치료 방법으로서, 질환의 치료는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 포함하거나 코딩하는 동등한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여에 필요한 용량에 비해 보다 낮은 용량의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물.
217. 질환의 치료에서 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도로서, 질환의 치료는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 포함하거나 코딩하는 동등한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여에 필요한 용량에 비해 보다 낮은 용량의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 용도.
218. 양태 211 내지 217 중 어느 하나에 있어서, 질환이 고셔병, 선택적으로 고셔병 I형, 고셔병 II형, 또는 고셔병 III형인, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
219. GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 하기를 위한 약제의 제조에서 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 용도:
(i) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(ii) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(iii) 활성화된 대식세포의 수준 감소.
220. 대상체에 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물을 투여하여 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서의 하기의 방법:
(i) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(ii) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(iii) 활성화된 대식세포의 수준 감소.
221. 양태 219 또는 220에 있어서,
(i) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(ii) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(iii) 활성화된 대식세포의 수준 감소;
가 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 치료하는, 용도 또는 방법.
222. GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 하기의 방법에서 사용하기 위한, 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물로서:
(i) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(ii) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(iii) 활성화된 대식세포의 수준 감소;
선택적으로
(i) 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소;
(ii) 저장 세포의 수 감소; 및/또는
(iii) 활성화된 대식세포의 수준 감소;
가 GCase 결핍과 관련된 질환 또는 병태의 치료를 유도하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물.
223. 양태 219 내지 222중 어느 하나에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준이 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 시점에서 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만, 또는 0% 내지 25%로 감소시키는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
224. 양태 219 내지 223중 어느 하나에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준이 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물의 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주, 적어도 12주, 또는 12주에 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물.
225. 양태 219 내지 224중 어느 하나에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소가 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 달성된 감소보다 더 큰, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
226. 양태 225에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준이 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 달성된 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만, 또는 5% 내지 25%로 감소시키는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
227. 양태 225 또는 양태 226에 있어서, GCase 효소 대체 요법이 SEQ ID NO: 3의 서열을 갖는 GCase 폴리펩티드의 투여를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
228. 양태 225 내지 227 중 어느 하나에 있어서, GCase 효소 대체 요법이 40 내지 100, 50 내지 80, 60 내지 70, 또는 약 60 U/kg BW의 용량의 GCase 폴리펩티드의 투여를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
229. 양태 225 내지 228 중 어느 하나에 있어서, 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법의 투여 후 대상체에서 달성된 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준이 GCase 효소 대체 요법의 용량 투여 후 2시간에 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
230. 양태 219 내지 229 중 어느 하나에 있어서, 하기의 투여 후 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준의 감소가 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자가 투여된 대상체에서 달성된 감소보다 더 큰, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물:
(i) 바이러스 입자;
(ii) 변형된 GCase 폴리펩티드를 포함하는 바이러스 입자; 및/또는
(iii) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자.
231. 양태 230에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준이 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자가 투여된 대상체에서 달성된 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 10% 미만, 또는 5% 내지 25%로 감소되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
232. 양태 230 또는 231에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
233. 양태 230 내지 232 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
234. 양태 230 내지 233 중 어느 하나에 있어서, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 59 또는 60의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
235. 양태 219 내지 234 중 어느 하나에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준이 대상체의 혈장에서 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
236. 양태 219 내지 235 중 어느 하나에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준이 대상체의 골수에서 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
237. 양태 219 내지 236 중 어느 하나에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준이 대상체의 비장에서 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
238. 양태 219 내지 237 중 어느 하나에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준이 대상체의 간에서 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
239. 양태 219 내지 238 중 어느 하나에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준이 대상체의 폐에서 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
240. 양태 219 내지 239 중 어느 하나에 있어서, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드 수준이 질량 분석법에 의해 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
241. 양태 219 내지 240 중 어느 하나에 있어서, 저장 세포의 수가 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 시점에서 저장 세포 수의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 15% 미만, 또는 0% 내지 25%로 감소되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
242. 양태 241에 있어서, 저장 세포의 수가 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주, 적어도 12주, 또는 12주에 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
243. 양태 219 내지 242 중 어느 하나에 있어서, 저장 세포의 수의 감소가 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 달성된 감소보다 더 큰, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
244. 양태 243에 있어서, 저장 세포의 수가 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 달성된 저장 세포의 수의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 15% 미만, 또는 0% 내지 25%로 감소되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
245. 양태 243 또는 244에 있어서, GCase 효소 대체 요법이 SEQ ID NO: 3의 서열을 갖는 GCase 폴리펩티드의 투여를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
246. 양태 243 내지 245 중 어느 하나에 있어서, GCase 효소 대체 요법이 40 내지 100, 50 내지 80, 60 내지 70, 또는 약 60 U/kg BW의 용량의 GCase 폴리펩티드의 투여를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
247. 양태 243 내지 246 중 어느 하나에 있어서, 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 달성된 저장 세포의 수가 GCase 효소 대체 요법의 용량의 투여 후 2시간에 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
248. 양태 219 내지 247 중 어느 하나에 있어서, 저장 세포의 수가 대상체의 간에서 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
249. 양태 219 내지 248 중 어느 하나에 있어서, 저장 세포의 수가 대상체의 폐 조직에서 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
250. 양태 219 내지 249 중 어느 하나에 있어서, 저장 세포의 수가 현미경을 사용하여 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
251. 양태 219 내지 250 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 대식세포의 수준이 양태 1 내지 198 중 어느 하나의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 시점의 활성화된 대식세포의 수준의 60% 미만, 50% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 또는 0% 내지 30%로 감소되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
252. 양태 219 내지 251 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 대식세포의 수준이 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여 후 적어도 6주, 적어도 8주, 적어도 10주, 적어도 12주, 또는 12주에 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
253. 양태 219 내지 252 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 대식세포의 수준이 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 달성된 활성화된 대식세포의 수준의 60% 미만, 50% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 또는 0% 내지 30%로 감소되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
254. 양태 253에 있어서, GCase 효소 대체 요법이 SEQ ID NO: 3의 서열을 갖는 GCase 폴리펩티드의 투여를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
255. 양태 253 또는 254에 있어서, GCase 효소 대체 요법이 40 내지 100, 50 내지 80, 60 내지 70, 또는 약 60 U/kg BW의 용량의 GCase 폴리펩티드의 투여를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
256. 양태 253, 254 또는 255 중 어느 하나에 있어서, 유효 용량의 GCase 효소 대체 요법이 투여된 대상체에서 달성된 활성화된 대식세포의 수준이 GCase 효소 대체 요법의 용량이 투여된 후 2시간에 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
257. 양태 219 내지 256 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 대식세포의 수준이 대상체의 간에서 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
258. 양태 219 내지 257 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 대식세포의 수준이 대상체의 폐 조직에서 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
259. 양태 219 내지 258 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 대식세포의 수준이 면역조직화학을 사용하여 CD68 밀도를 측정하여 측정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
260. 양태 219 내지 259 중 어느 하나에 있어서, 질환이 고셔병인, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
261. 양태 260에 있어서, 고셔병이 고셔병 I형인, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
262. 양태 260에 있어서, 고셔병이 고셔병 II형인, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
263. 양태 260에 있어서, 고셔병이 고셔병 III형인, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
본 발명은 단지 예시를 위한 것이며 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되는 하기 실시예를 참조하여 설명될 것이다.
실시예
실시예 1 - 일반적인 재료 및 방법
실시예에서 사용한 일부 시약 및 재료의 세부사항:
● Expi293F 세포(Thermo Fisher, Cat. no. A14527)
● Expi293 무혈청 배지(Thermo Fisher, Cat. no. A1435101)
● 배출 마개가 있는 Nalgene® 일회용 삼각 플라스크, PETG, 멸균, 일반 바닥(Thermo Scientific, Cat. no. 4115-0125)
● 트립판 블루 염색(Thermo Fisher, Cat No. T10282)
● 50 ml 원심분리 튜브 CentriStar(Corning, Cat. No. 430829)
● 마이크로플레이트 딥-웰 2.0mL 96 웰 폴리프로필렌(Fisher Scientific, Cat No. 10447181)
● PureLink® 공기 다공성 테이프(Invitrogen, Cat No. 10544453)
● 클로닝 벡터 pCDNA5/FRT(Thermo Fisher의 pCDNA5/FRT, Cat. No. V601020; 맞춤 합성 유전자(예를 들어 GCase 변이체 또는 야생형 GCase)를 함유하는 클로닝 벡터(pCDNA5/FRT)는 GenScript에서 생산하였음)에서 GCase 변이체를 코딩하는 맞춤 합성 유전자
● 뉴클레아제가 없는 물(DEPC-처리되지 않음)(Invitrogen, Cat. No. AM9937)
● 96 V-바닥 모양의 웰 플레이트(Corning, REF 3894)
● Opti-MEM I 감소된 혈청 배지(Gibco, Cat. no. 31985062)
● 형질감염 시약: ExpiFectamineTM 293 형질감염 키트(Thermo Fisher, Cat. No. A14524)
● 마우스 혈청(Sigma-Aldrich, Cat. No. M5905-10ML)
● 마우스 혈장, EDTA(Rockland, Cat No. D508-04-0050)
● 인간 혈청(Sera Laboratories International Ltd.)
● 인간 혈장(Sera Laboratories International Ltd.)
● 1x 인산염-완충된 염수(PBS)(Gibco, Cat No 14190-094)
● 마이크로플레이트용 접착 포일, 피어싱가능(VWR, Cat. no. 391-1275)
● EasySeal 플레이트 실러, 투명(Greiner bio-one, Cat No. 676001)
● 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(Sigma-Aldrich, Cat. no M3633-500MG)
● 시트르산(Sigma-Aldrich, Cat. no. 251275-100G)
● 소듐 타우로디옥시콜레이트 수화물(Sigma-Aldrich, Cat. no. T0557-5g)
● 글리신(Glentham life Sciences, Cat. no. GM2385)
● 소듐 시트레이트(Glentham life Sciences, Cat. no GK0137)
● 소듐 히드록시드(Fisher Scientific, Cat. no. BP359-500)
● 벨라글루세라제 알파(VPRIV), (Shire Human Genetic Therapies)
● 10% FBS 및 1% GlutaMAX로 보충된 DMEM 저글루코스(D-10)
● 1% GlutaMAX로 보충된 DMEM 저글루코스(D-0)
● GCase 분석 완충액(AB 완충액): 50 mM 소듐 시트레이트, 25 mM 타우로 콜레이트, pH 5.75
● 용해 완충액: 0.25% 트리톤 X, 및 1X Halt(프로테아제 억제제 칵테일)을 함유하는 AB 완충액
● 10 kDa 컷-오프 멤브레인(10 kD MWCO)이 있는 Amicon 초 원심분리 필터(Millipore), (Sigma Aldrich)
● SYPROTM 오렌지 단백질 겔 염색(ThermoFisher, Cat. no. SS6651)
● 일회용 PD-10 탈염 컬럼(VWR, Cat. no. 17-0851-01)
실시예에서 사용한 일부 장비의 세부사항:
● 회전 진탕기, New BrunswickTM S41i 125 rpm, Expi293F 세포용. 400 rpm이 가능한 플레이트 진탕기(Eppendorf)
● 마이크로플레이트 랙(Eppendorf, Cat. no. M1289-0700)
● 실험실 원심분리기(Beckman Coulter, Avanti J-15R)
● Incubator in55(Memmert, 독일)
● CountessTM II FL 자동화 세포 계수기(ThermoFisher, Cat. No. AMQAF1000)
● The SpectraMax® i3x 다중-모드 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)
방법
달리 명시되지 않는 한, 하기 기술된 실시예에서 다음과 같은 일반적인 방법을 따랐다.
Expi293F 세포의 확장
Expi293F 세포를 GCase 변이체를 발현하는데 사용하였다. Expi293F 세포를 배출 캡이 있는 플라스틱 플라스크에서 37℃, 125 rpm, 8% CO2 분위기, 80% 습도의 Expi293 배지에서 성장시켰다. 유지 및 확장 단계 동안, 세포가 3 내지 5x106 세포/ml의 밀도에 도달했을 때 ml 당 0.3 x106 생존 세포로 세포를 분할하였다. 통과할 때, 세포를 계수하고, 혈구계산기 및 트립판 블루 배제를 사용하여 생존력을 결정하였다. 세포를 50 ml 원심분리 튜브에 넣고 실온에서 10분 동안 200 xg로 스핀 다운하고 배지를 흡인하여 제거한 후 미리 데운 신선한 Expi293 배지에 세포를 재현탁하였다. 세포를 4일 마다 분할해야 하였다. 분할에 사용한 부피는 125 ml 플라스크에 담긴 30 ml Expi293 배지였다.
Expi293F 세포의 형질감염 전날
형질감염에 사용한 세포는 적어도 95%의 생존율을 나타냈다. 형질감염 전날, 세포를 분할하고 2개의 125 ml 플라스크에 미리 데운 새로운 Expi293 배지에서 2x106 세포/ml로 희석하였다. 세포를 형질감염 당일까지 표준 조건 하에서 인큐베이션하였다.
Expi293F 세포의 형질감염
형질감염 당일, 세포 수를 계수하여 생존율을 측정하였다. 미리 데운 Expi293 배지를 사용하여 각 플라스크에 대해 세포 농도를 2.8 x 106개 세포/ml의 밀도로 조정하였다. 96개의 딥-웰 플레이트에서의 형질감염을 위해, 웰 당 0.5ml의 배지 중의 세포를 첨가하였다. 플레이트를 다공성 테이프로 밀봉하고 진탕기 인큐베이터의 마이크로플레이트 랙에 400 rpm으로 배치하였다.
96 딥-웰 플레이트의 각 웰에서, 80 μl의 뉴클레아제가 없는 물을 동결건조된 플라스미드 DNA(GenScript에서 생산된 맞춤형 합성 유전자(예를 들어 GCase 변이체 또는 야생형 GCase)를 함유하는 4 μg/웰의 pCDNA5/FRT)에 첨가하였다. 별도의 96-웰 플레이트(V자 바닥 모양)의 웰에서, 각각의 재구성된 플라스미드 DNA 14 μl를 21 μl Opti-MEM I 무혈청 배지로 희석한 반면, 1.9 μl의 양이온성 지질-기반 형질감염 시약(ExpiFectamine 293 또는 이와 유사한 것)을 다른 플레이트의 웰에서 35 μl Opti-MEM I로 희석하였다. 희석된 DNA를 희석된 형질감염 시약과 혼합하여 DNA-지질 복합체를 제조하였다. 실온에서 20분간 인큐베이션한 후, 50μl/웰의 DNA-지질 복합체를 Expi293F 세포에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 세포를 진탕(400 rpm)하면서 5 내지 8% CO2 가습된 분위기에서 37℃에서 배양하였다.
다음 날, 형질감염 후 16 내지 20시간에, ExpiFectamine 293 형질감염 키트의 인핸서 1 및 인핸서 2 칵테일을 첨가하였다(27.5 μL/웰). 플레이트를 밀봉하고 400 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 가습된 5 내지 8% CO2 인큐베이터로 되돌렸다.
형질감염된 Expi293 세포의 수확
형질감염 후 4일 차에, 플레이트를 200 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확하고 모든 상등액을 수집하여 새로운 96-딥 웰 플레이트로 옮겼다. 상등액에 존재하는 GCase(예를 들어 야생형 GCase 또는 GCase 변이체)를 분석할 수 있다. 예를 들어, 상등액은 아래에 설명된 대로 "안정성 평가"에 사용될 수 있다.
Huh-7 세포의 형질도입
Huh-7 세포를 10% FBS 및 1% GlutaMAX가 보충된 DMEM 저글루코스(D-10)에서 유지시켰다. CountessTM II FL 자동화 세포 계수기로 세포를 계수하였다. 형질도입을 위해, 세포를 12-웰 플레이트에 2x105개 세포/웰로 시딩하고 형질도입 전에 24시간 동안 부착시켰다. 이어서, 시험관 내에서 형질도입 효능을 증가시키기 위해, 세포를 37℃에서 1시간 동안 Mitomycin C(D-10에서 10 μg/mL)로 처리하고 1% GlutaMAX가 보충된 DMEM 저글루코스(D-0)로 세척하였다. AAV 바이러스 입자를 함유하는 D-10의 형질도입 혼합물을 준비하고 세포에 첨가하고(500 μL/웰) 37℃, 5% CO2에서 밤새(약 16시간 동안) 배양하였다. 필요한 AAV 감염 다중도(MOI): 5x103, 1x104 또는 5x104 vg/세포에서 형질도입이 발생하였다. 각 형질 도입을 3중으로 수행하였다.
GBA 발현 카세트
GCase 변이체 또는 야생형 GCase를 코딩하는 GBA 발현 카세트를 생성하였다( 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 하기 표 1 참조). 사용한 프로모터는 "LSP-L"이며, 이는 간-특이적 전사 조절 요소(SEQ ID NO: 35)이다.
AAV　생산
GBA 발현 카세트를 생체 내 실험을 위해 AAV2/8, 또는 시험관 내 실험을 위해 AAV2/'37'(SEQ ID NO: 37의 캡시드 및 AAV2의 ITR을 사용함)로 슈도타이핑하였다. AAV 바이러스 입자(AAV 벡터)를 AAV Rep 및 Cap 기능; 아데노바이러스 헬퍼 기능; 및 AAV2 ITR이 측면에 있는 GBA 발현 카세트를 함유하는 재조합 게놈을 코딩하는 플라스미드로 HEK293T 세포의 삼중 플라스미드 일시적 형질감염에 의해 생산하였다. AAV 벡터를 AVB Sepharose(AAV2/'37'용) 또는 POROSTM CaptureSelectTM(AAV2/8용) 친화성 크로마토그래피 수지로 정제하였다. 정제된 스톡을 qPCR로 적정하고 알칼리성 아가로스 겔 전기영동으로 특성분석하였다.
안정성 평가
96 딥-웰 플레이트에서, 정제된 단백질(예를 들어 GCase 변이체), Shire Human Genetic Therapies에서 구입한 정제된 VPRIV(상업용 ERT) 또는 상등액(예를 들어 GCase 변이체 또는 야생형 GCase를 함유하는 위의 "형질감염된 Expi293F 세포의 수확"이라는 표제의 방법에서 얻은 상등액)을 미리 데운 AB 완충액, PBS, 혈청 또는 혈장과 혼합하였다. 시점 0에서의 초기 활성이 신호의 동적 창(1x109 RFU 미만)의 상위 범위에 있도록 샘플을 희석하여(즉, 신호의 포화 방지, 또는 배경에 너무 가까운 신호) 서로 다른 샘플에서 활성의 변화를 일관되게 측정되게 하였다. 밀봉된 플레이트를 진탕하지 않고 37℃에서 인큐베이션하였다. 0분, 30분, 60분, 120분, 3일, 4일, 5일, 6일, 및 7일과 같은 다양한 시간 후에 GCase 활성 분석을 위해 20 μL의 분취량을 취하였다. 잔류 활성을 초기 활성의 백분율로서 각 시점에 대해 계산하였다. 잔류 활성(잔류 효소 활성)을 사용하여 안정성을 평가하였다.
GCase 활성 결정
활성 GCase의 수준을 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4-MUG)를 기질로 사용하여 형광 측정법으로 결정하였다. 간략하게, 분취량(20 μL)(예를 들어 위의 "안정성 평가" 동안 취한 20 μL 분취량; 위의 "Huh-7 세포의 형질도입"이라는 표제의 섹션에 명시된 바와 같이 세포 형질도입 및 밤새 인큐베이션 후 웰에서 취한 배양 배지 20μL; 또는 20μL의 희석된 혈장 또는 아래 "혈장 및 조직 수집"이라는 표제의 섹션에 설명된 용해된 WBC)을 100 μl의 50mM 소듐 시트레이트, 25mM 타우로콜레이트, pH 5.75(분석 완충액), 6 mM 4-MUG에서 37℃에서 30분 동안 분석하였다. 수집된 조직의 GCase 활성(아래 "혈장 및 조직 수집"이라는 표제의 섹션에 설명됨)을 조직을 용해하고 조직 단백질 용해물을 50 mM 소듐 시트레이트, 25mM 타우로콜레이트, pH 5.75, 6mM 4MUG에서 37℃에서 30분 동안 분석하여 측정하였다. 위의 모든 경우에, pH 10의 0.3 M 소듐 히드록시드, 0.5 M 글리신 용액을 정지 용액으로 사용하였다. SpectraMax® i3 플레이트 판독기를 사용하여 각각 365 nm 및 445 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 샘플 및 원시 데이터 출력의 형광 측정을 수행하였다. 시험관 내 및 생체 내 연구를 위해, 형광 수준을 4-메틸움벨리페론(4-MU, Sigma-Aldrich) 표준 곡선을 기준으로 나노몰/시간/mL로 변환하였다. 혈장, 조직 및 WBC의 형광 수준을 모두 VPRIV 표준 곡선을 사용하여 mU/ml 혈장(혈장의 경우) 또는 mU/mg 단백질(조직 및 WBC의 경우)로 측정하였다.
동물 및 처리 절차(야생형 마우스)
야생형(C57BL/6) 수컷 마우스(6 내지 8주령, n=5)를 본 연구에 사용하였다. AAV 벡터를 단일 미정맥 주사를 통해 2x109 vg/kg 내지 2x1012 vg/kg 범위의 용량으로 투여하였다. 처리 효과에 대한 대조군(처리 경험이 없음)으로 사용하기 위해 추가적인 동물군을 처리하지 않은 채로 두었다. 연구에 따라 처리 후 4주 또는 6주에 동물을 도태시켰다. 종말점에서, 뮤린 혈액과 조직을 분자 및 조직학적 분석을 위해 수집하였다.
동물 및 처리 절차(9V/null 마우스)
Gba1 돌연변이 D409V/D409V(9V/9V)가 있는 9V/null 마우스를 사용하였다. 9V/null 마우스는 내장 이상(염증 및 저장 세포) 및 기질 축적으로 거의 정상적인 수명을 갖는다(문헌[Xu et al. Am J Pathol. 2003 Nov;163(5):2093-101]; 문헌[Xu et al. PLoS One. 2010 May 20;5(5):e10750]). 9V/null 마우스를 Gba1 돌연변이 D409V/D409V(9V/9V) 및 Gba1 null/WT를 보유하는 마우스를 교배하여 생성하였다. 각 한배새끼 당 약 2마리의 9V/null이 생성된다. 9V/null 및 WT 마우스의 계통 배경은 C57BL/6, 129SvEvBrd 및 FVB이다. 다수의 한배새끼로부터의 9V/null 마우스를 롤링 기준으로 각 처리군에 무작위로 할당하였다. 군 내 성별 균형을 맞추기 위해 각 군에 수컷 및 암컷 마우스를 모두 등록하였다. 모든 마우스는 병원균이 없는 상태에서 수용하였고 매일 모니터링하였으며 매주 체중을 측정하였다. 모든 AAV 처리 마우스는 정상적인 성장 및 체중 증가를 보였다.
AAV의 분취량을 -80℃에서 보관하였다. 주입하기 전에, 분취량을 얼음 위에서 해동하고 X-VIVO 10(Lonza, pH7.4, 4℃)으로 희석하고, 저속으로 잠시 와동시켜 부드럽게 혼합하였다. 희석된 AAV를 주입 전에 얼음에 보관하고 2시간 이내에 사용하였다.
VPRIV®를 재현탁하고 분취(25, 50, 100 μl)하고 -80℃에서 보관하였다. 주입하기 전에, 분취량을 얼음 위에서 해동하고 산성화된 X-VIVO 10(Lonza, pH5.5, 4℃)으로 지시된 용량으로 희석하고, 저속으로 잠시 와동시켜 부드럽게 혼합하였다. 희석된 효소는 주사 전 얼음에 보관하여 2시간 이내에 사용하였다.
AAV 및 비히클(X-비보)을 8주령의 9V/null 마우스에 5 μL/g 체중(BW)의 표시된 용량으로 1회 제공하였다. WT 마우스의 8주령에 비히클을 투여하였다. AAV 및 비히클 투여는 잠시 동안 이소플루란 하에 마우스에게 미정맥을 통해 이루어졌다. VPRIV®를 바이오-버블 룸에서 이소플루란과 산소의 혼합물로 마취된 9V/null 마우스에 60 U/kg 및 2.5 μL/g BW로 8주령부터 시작하여 격주로 7회 주사 미정맥 볼루스 주입에 의해 투여하였다.
동물 및 처리 절차(비-인간 영장류)
레서스 마카크(3 마리 수컷 및 3마리 암컷을 처리함)를 2x1012 vg/kg로 GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV2/'37'로 투여하였다. 적어도 6개월(수컷 2마리와 암컷 2마리) 또는 최대 60개월(수컷 1마리와 암컷 1마리)의 투여 후 관찰 기간 동안 동물을 추적하였다.
AAV를 실온에서 해동하고 냉동고에서 꺼낸 후 3시간 이내에 투여하였다. Keeling Center for Comparative Medicine and Research(KCCMR) Rhesus Monkey Breeding and Research Resource(RMBRR) 콜로니(MDAndersen, 미국 텍사스주 소재)에서 입수한 수컷 3마리와 암컷 3마리의 레서스 마카크에 AAV를 주입(IV, 30분)하였다. AAV 중화 항체에 대해 동물을 사전 스크리닝한 결과 음성으로 판명되었다. 분석을 위해 혈액 샘플을 첫 달 동안 매주 채취한 다음 매월 간격으로 기준선 샘플과 비교하였다.
측정은 사망률, 국소 내성 결과, 임상 관찰, 체중, 음식 소비, 혈액학 및 혈액 화학을 포함한다. 연구는 또한 GCase 및 면역원성(항-GBA)에 대한 만성 초생리학적 혈장 노출의 효과를 확립하기 위해 종료 시 조직의 완전한 조직병리학적 평가를 포함한다.
혈장 내 GCase 활성을 첫 달 동안 매주, 두 번째 달에는 2주 마다, 그 후 처음 6개월 동안은 매월 모니터링하였다. 종료 시 대표적인 조직 샘플을 채취하여 GCase 흡수 및 생체분포를 평가하였다.
GCase 활성을 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4MUG)를 사용하여 형광측정 분석법에서 결정하였다. 50 mM 소듐 시트레이트(pH 5.75) 중의 1% 소듐 타우로콜레이트(Sigma, Cat.#: T0557-56)로 구성된 GCase 분석 완충액(AB 완충액)을 혈장에서 GCase 활성을 결정하기 전에 신선하게 제조하였다. 혈장 샘플을 분석 전에 AB 완충액 중에서 1:25로 희석하였다. 25 uL의 혈장을 25 μL 6mM 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드(4-MUG, Sigma Aldrich, Cat.#: M3633 500MG)와 함께 혼합하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, pH 10의 50 μL의 정지 용액(0.3 M 소듐 히드록시드, Fisher Scientific Cat# BP359-500; 0.5 M 글리신, Glentham Life Science Cat# GM2385)을 반응 당 첨가하였다. 효소 활성을 형광 측정법으로 평가하였다(SpectraMax® i3 플레이트 판독기[Molecular Devices]; λex= 365 nm 및 λem= 445 nm). GCase-특이적 활성을 7-포인트 4-메틸움벨리페론(4-MU) 표준 곡선을 기준으로 nmol/h/ml로 표현하였다.
혈장 및 조직 수집
야생형 마우스의 경우, 응고를 피하기 위해 K2-EDTA가 있는 상태에서 10분 동안 얼음에 보관된 전체 혈액에서 분리하여 뮤린 혈장을 수득하였다. 혈장을 냉장 원심분리기에서 5분 동안 5 xg로 원심분리하여 분리하였다. 분리 후, 혈장을 분취하고, 혈장을 50 mM　소듐 시트레이트, 25 mM　타우로콜레이트, pH　5.75 완충액(AB 완충액, 희석 1:25, 즉 AB 완충액 24부에 대해 1 부의 혈장)으로 희석하여 GCase 활성을 보존하였다. 조직(간, 비장, 골수, 폐)을 수확하고 10% 완충 포르말린(조직학) 또는 급속 냉동(GCase 활성)에 보존하였다.
백혈구(WBC)를 200 μl의 K2-EDTA 처리 튜브를 사용하여 전체 혈액에서 수득하였다. 얼음에서 10분간 인큐베이션한 후, 1800 μl의 물을 첨가하여 적혈구를 균질화하였다. 30초 동안 혼합한 후, 추가 세포 용해를 방지하기 위해 10X PBS를 첨가하였다. WBC를 5분 동안 1000 xg에서 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 상등액을 버리고, 세포를 0.25% Triton X 및 1X Halt(Lysis 완충액)를 함유하는 200 μl의 AB 완충액에 재현탁하고 드라이아이스에서 동결하고 -80℃에서 보관하였다.
벡터 게놈 카피 수
시험관 내 형질도입 후 Huh-7 세포에서 벡터 게놈의 수를 결정하기 위해, 세포를 먼저 PBS-1X로 세척하고 40 μl TrypLE(Thermo Fisher)로 5분 동안 처리하였다. 펠릿화 시, PBS(110 μl)를 세포에 첨가하고, 동결시키고 -80℃에서 보관하였다. DNA를 용해하고 방출하기 위한 3번의 동결/해동 주기 후, 3중 웰을 풀링하고 원심분리(5분 동안 14000xg)한 후 분취량(15 μl)을 취하고 ddH2O로 1:33으로 희석하였다. LSP-L 프로모터에 결합하는 프라이머 세트와 같은 프로모터에 결합하는 프라이머 세트를 사용하는 qPCR을 사용하여 AAV 카피 수 추정을 수행하였다.
AAV 바이러스 입자 주입 후 간 세포 당 벡터 게놈 수를 결정하기 위해, 제조업체의 프로토콜에 따라 QIAGEN DNeasy 혈액 및 조직 키트(QIAGEN)를 사용하여 냉동 간 샘플에서 DNA를 분리하였다. DNA 단리 후, LSP-L 프로모터에 결합하는 프라이머 세트와 같은 프로모터에 결합하는 프라이머 세트를 사용하는 qPCR을 사용하여 AAV 카피 수 추정을 수행하였다.
면역조직화학
수집 후, 조직을 후속 파라핀 포매(FFPE: subsequent paraffin embedding)를 위해 완충 포르말린에 보존하였다. FFPE 뮤린 조직을 자일렌 및 에탄올 세척으로 탈파라핀화하였다. 항원 복원(retrieval) 처리를 Ventana CC1 권장 사항에 따라 수행하였다. 면역조직화학적 염색은 Ventana DAB Map Detection Kit(760-124)를 사용하여 Ventana Discovery XT 장비로 수행하였다. 뮤린 조직에서 GCase를 시각화하기 위해 토끼 항-인간 산성 β-글루코세레브로시다제(Abcam, Ab125065, 1:100 내지 400)를 사용하였다. GCase 염색을 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)으로 가시화하였다. 섹션을 헤마톡실린으로 대비 염색하였다. 자동 광학 현미경(Leica)을 사용하여 이미지를 캡처하였다.
GCase 단백질 정제
형질감염된 Expi293F 세포의 배지를 5000 rpm에서 원심분리하여 정화하였다. 프로테이나제 억제제(Roche 완전 정제)를 제조업체의 권장 농도로 정화 배지에 첨가하였다. 그런 다음 정화된 배지를 n-부탄올(1:4 v/v, 부탄올: 배지)과 혼합하고 회전-진탕기에서 4℃에서 >1시간 동안 탈지 처리하였다. 그런 다음 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고 정화된 배지에서 지질층을 분리하기 위해 적어도 30분 동안 두었다. GCase 변이체를 AKTA 순수 시스템을 사용하여 Octyl-Sepharose® CL-4B 컬럼으로 정제하였다. 정화되고 지질이 제거된 배지를 유속 < 1ml/분으로 로딩하고 pH 5.75의 25 mM 시트르 인산염 완충액에서 각각 25%, 50% 및 75% 에틸렌 글리콜의 두 컬럼 부피로 세척하였다. GCase 단백질을 100% 에틸렌 글리콜로 용출하고 PD-10 컬럼을 사용하여 완충액을 25 mM 시트르 인산염 완충액(pH 5.75)으로 교환하고 Amicon 초원심분리 필터(10kD MWCO 막)를 사용하여 원하는 농도로 농축하였다.
열안정성 시험
GCase의 열안정성을 QuantStudio® 3 및 5 실시간 PCR 시스템 및 SYPROTM 오렌지 단백질 겔 염색(소수성 단백질 영역에 결합하여 형광 방출을 증가시키는 환경에 민감한 형광 염료)을 기반으로 하는 열 이동 분석을 사용하여 조사하였다.
알려진 농도의 용액에 있는 GCase를 5x SYPROTM 오렌지 단백질 겔 염색과 혼합하여 온도가 증가함에 따라 단백질 분자가 접힘이 풀릴 때 형광 신호가 가능하게 한다. 'ROX'가 리포터로서 선택된 QuantStudio® 3 및 5 실시간-PCR 시스템에서 용융 곡선을 생성하였다. 25℃에서 2분간 유지한 후, 온도를 95℃까지 분 당 1℃ 씩 증가시켰다. 용융 온도는 용융 곡선의 음의 도함수의 최소값에 해당한다(온도에 대한 RFU의 형광 플롯).
실시예 2 - pH 7.4에서 VPRIV 활성
pH 7.4(생리학적 pH) 하에서 VPRIV의 안정성을 확인하기 위해, VPRIV를 실시예 1의 "안정성 평가"라는 표제의 섹션에 따라 120분에 걸쳐 PBS(pH 7.4)에서 인큐베이션 하였다. 효소 활성(GCase 활성)을 실시예 1의 "GCase 활성 결정"이라는 표제의 섹션에 설명된 대로 측정하였다.
VPRIV의 잔류 효소 활성(잔류 GCase 활성)을 각 시점(0, 15, 30, 60 및 120분)에서 계산하였다. 각 시점에 대한 잔류 효소 활성을 초기 활성(시점 0)의 백분율로 계산하였다.
결과는 pH 7.4의 PBS에서 120분 동안 인큐베이션한 후에 남아 있는 VPRIV의 잔류 효소 활성이 거의 없다는 것을 보여준다(도 1).
실시예 3 - GCase 변이체의 안정성
[표 1]
Figure pct00005
89개의 GCase 변이체를 생성하였다. 부위-지정 돌연변이 유발과 같은 표준 절차를 사용하여 GCase 변이체를 생성할 수 있다. GCase 변이체를 코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열을 유전자-합성하고 GenScript에 의해 시판되는 발현 벡터 pcDNA5/FRT(Thermo Fisher)에 클로닝하였다.
89개의 GCase 변이체를 잔류 효소 활성에 대해 시험하였다. 요컨대, 실시예 1의 "Expi293F 세포의 확장", "Expi293F 세포의 형질감염 전날", "Expi293F 세포의 형질감염" 및 "형질감염된 Expi293F 세포의 수확"이라는 표제의 섹션에 기술된 방법에 따라 GCase 변이체를 발현시켰다. 효소 활성(GCase 활성)을 실시예 1의 "안정성 평가" 및 "GCase 활성 측정"이라는 표제의 섹션에 기재된 방법에 따라 측정하였다.
"안정성 평가"와 관련하여, 89개의 GCase 변이체 및 야생형 GCase를 pH 7.4의 PBS 완충액, 37℃에서 2시간 인큐베이션 후 잔류 효소 활성(잔류 GCase 활성)에 대해 시험하였다. 잔류 효소 활성을 초기 활성과 관련하여 2시간 후 유지되는 활성의 퍼센트로서 계산하였다.
표 1에 제시된 12개의 GCase 변이체(19, 21, 34, 47, 57, 63, 68, 69, 74, 79, 85 및 89)는 야생형에 비해 더 높은 잔류 활성(적어도 10% 더 높음)을 가졌다(데이터는 제시되지 않음). 또한, GCase 변이체 H262Y(데이터는 제시되지 않음)는 변이체 19와 유사한 잔류 활성을 가졌다.
12개의 GCase 변이 중에서, 특히 2개의 변이체인 #21 및 #85가 가장 높은 잔류 활성을 보였으므로 추가 특성분석을 위해 선택하였다. 변이체 #21 및 #85의 모든 돌연변이가 있는 GCase 변이체도 또한 시험하였다(변이체 #21+85).
실시예 4 - 향상된 단백질 안정성을 갖는 GCase 변이체에 의해 달성되는 생리학적 pH에서 GCase 활성의 구조
다양한 GCase 변이체, 야생형 GCase 및 VPRIV를 다양한 조건에서 잔류 효소 활성에 대해 시험하였다.
요컨대, GCase 변이체와 야생형 GCase를 실시예 1의 "Expi293F 세포의 확장", "Expi293F 세포의 형질감염 전날", "Expi293F 세포의 형질감염" 및 "형질감염된 Expi293F 세포의 수확"이라는 표제의 섹션에 기술된 방법에 따라 GCase 변이체 및 야생형 GCase를 발현시켰다. 효소 활성(GCase 활성)을 실시예 1의 "안정성 평가" 및 "GCase 활성 측정"이라는 표제의 섹션에 기재된 방법에 따라 측정하였다. GCase 변이체, 야생형 GCase 및 VPRIV의 잔류 효소 활성(잔류 GCase 활성)을 다양한 시점(하기 기재되어 있음)에서 계산하였다. 잔류 효소 활성을 초기 활성의 퍼센트로서 각각의 시점에 대해 계산하였다.
한 실험에서, GCase 변이체 #21 및 #85(실시예 2에서 잔류 활성이 가장 높은 2개의 GCase 변이체), 변이체 #21+85, 야생형 GCase, 2개의 참조(변이체 #68 및 #69) 및 다양한 pH 조건에서 VPRIV의 활성을 비교하였다. "안정성 평가"와 관련하여, GCase 변이체, 야생형 GCase, 참조 GCase 또는 VPRIV를 AB 완충액(pH 5.6) 또는 PBS 완충액(pH 7.4)에서 최대 7일 동안 인큐베이션하였다. 잔류 효소 활성(잔류 GCase 활성)을 인큐베이션 0분, 10분, 30분, 60분, 120분, 3일, 4일, 5일, 6일 및 7일 후에 측정하였다. 변형 #21, #85 및 #21+85는 두 pH 조건에서 7일 동안 야생형 GCase, 참조 GCase 및 VPRIV보다 높은 효소 활성을 유지하는 것으로 나타났다(도 2a 및 b).
추가 실험에서, 변이체 #21, #85 및 #21+85 및 VRPIV의 활성도 인간 혈청 또는 인간 혈장에서 최대 7일 동안 인큐베이션한 후 비교하였다. "안정성 평가"와 관련하여, 인간 혈청 또는 인간 혈장에서 0분, 10분, 30분, 60분, 120분, 3일, 4일, 5일, 6일 및 7일의 인큐베이션 후에 잔류 효소 활성(잔류 GCase 활성)을 측정하였다. 변이체 #21 및 #85는 인간 혈청 및 인간 혈장 모두에서 2시간 동안 VPRIV보다 더 높은 효소 활성을 유지하는 것으로 밝혀졌으며, 변이체 #21+85는 인간 혈청과 인간 혈장 모두에서 7일 과정에 걸쳐 시험한 다른 모든 GCase 변이체 및 VPRIV보다 더 높은 효소 활성을 유지하는 것으로 밝혀졌다(도 3a 및 b).
실시예 5 - VPRIV와 비교하여 다양한 생리학적 매트릭스에서 GCase 변이체 #85의 증가된 반감기
정제된 VPRIV(벨라글루세라제 알파) 및 정제된 GCase 변이체 #85 변이체의 반감기를 결정하였다.
요컨대, GCase 변이체를 실시예 1의 "Expi293F 세포의 확장", "Expi293F 세포의 형질감염 전날", "Expi293F 세포의 형질감염" 및 "형질감염된 Expi293F 세포의 수확"이라는 표제의 섹션에 기술된 방법에 따라 GCase 변이체를 발현시켰다. 정제된 VPRIV(벨라글루세라제 알파)를 Shire Human Genetic Therapies에서 구매하였다. GCase 변이체 #85를 실시예 1의 "GCase 단백질 정제"라는 표제의 섹션에 기술된 바와 같이 정제하였다. 효소 활성(GCase 활성)을 실시예 1의 "안정성 평가" 및 "GCase 활성 측정"이라는 표제의 섹션에 기재된 방법에 따라 측정하였다.
"안정성 평가"와 관련하여, 정제된 단백질(변이체 #85 및 VPRIV)을 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24, 48, 120, 및 144시간(모든 시점이 도시되지 않음) 동안 37℃에서 AB 완충액(pH 5.6), PBS 완충액(pH 7.4), 마우스 혈청, 마우스 혈장 또는 인간 혈청과 함께 인큐베이션하였다. VPRIV 및 GCase 변이체 #85의 잔류 효소 활성(잔류 GCase 활성)을 각각의 시점에서 계산하였다. 각 시점에서의 잔류 효소 활성을 초기 활성의 퍼센트로서 계산하였다.
반감기를 GraphPad Prism을 사용한 1상 붕괴 모델을 기반으로 계산하였다. GCase 변이체 #85는 시험한 각 매트릭스에 대해 VPRIV에 비해 더 높은 잔류 효소 활성을 나타냈다(도 4a, b 및 c). 반감기는 리소좀 pH, 생리학적 pH, 마우스 혈청 및 인간 혈청에서 VPRIV보다 GCase 변형 #85에서 더 길었다(도 4c).
실시예 6 - GCase 변이체 #85는 4-메틸움벨리페릴-β- D-글루코피라노시드우론산(4-MUG)을 처리할 때 야생형 GCase 및 ERT에 대해 보고된 것과 유사한 효소 효율(즉, 기질을 처리하는 GCase 변이체의 능력)을 나타낸다
4-메틸움벨리페릴-β- D -글루코피라노시드우론산(4-MUG)을 처리할 때 GCase 변이체 #85의 효소 효율을 결정하였다. GCase 변이체 #85 단백질을 실시예 1의 "GCase 단백질 정제"라는 표제의 섹션에 기술된 바와 같이 정제하였다. 1 또는 3.5nM의 정제된 단백질(GCase 변이체 #85)을 증가하는 양(2.5 x 106, 5 x 106, 7.5 x 106 또는 1 x 107 nM)의 AB 완충액 중의 4-MUG(GCase의 형광 기질)와 함께 인큐베이션하였다. 생성된 형광(여기 파장: 365nm, 방출 파장: 445nm)을 측정하여 15분에 걸쳐 4-MU 형성을 모니터링하였다. 각 4-MUG 농도에서 4-메틸움벨리페론(4-MU) 형성 속도를 4-MUG 농도에 대해 플롯팅하고 미카엘리스-멘텐 모델에 피팅하였다(도 5a 및 b).
도 5c는 야생형 GCase 및 효소 대체 요법(ERT) 이미글루세라아제 및 벨라글루세라아제 알파에 대해 다른 사람들이 보고한 Km(mM) 값 외에 GCase 변이체 #85의 Km 및 Kcat을 보여준다.
GCase 변이체 #85는 고셔병 치료에 사용된 야생형 GCase 및 ERT에 대해 다른 사람들이 보고한 바와 같이 약 2.0mM의 유사한 Km을 갖는다.
실시예 7 - GCase 변이체 #85의 인 실리코 면역원성 평가는 야생형 GCase보다 낮은 면역원성 위험 프로필을 시사한다
야생형 GCase 및 GCase 변이체 #85의 잠재적 면역원성 위험 프로파일을 평가하고 인 실리코 계산 및 분석을 사용하여 비교하였다. 평가는 MHC 수용체 분자에 대한 특정 길이의 펩티드의 예측된 결합 친화도의 계산을 기반으로 하였다. 펩티드-MHC 결합은 면역 반응의 첫 번째 중요한 필수 단계이다. GCase 변이체에서 아미노산 치환의 50개 아미노산 업스트림 및 50개 아미노산 다운스트림에 걸쳐 있는 영역(즉, W351C의 50개 아미노산 업스트림에서 A380C의 50개의 아미노산에 걸쳐있는 영역)에서 9개(9-량체) 및 15개(15-량체) 아미노산 길이의 펩티드 단편(각각 HLA-I 및 HLA-II 수용체 분자에 대한 결합 친화도 계산용)을 면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 리소스 데이터베이스(https://www.iedb.org/)를 사용하여 계산을 위한 입력값으로서 사용하였다. 사용된 예측 방법은 NetMHCpan EL 4.0(HLA-I용) 및 NetMHCIIpan 3.2(HLA-II용)였다. 계산된 IC50 값(나노몰 단위, nM으로 표시됨)은 펩티드 결합 친화도의 척도로 사용되었고 IC50 컷-오프 값은 펩티드를 "강력한" 또는 "중간" 결합제로 분류하는데 사용되었다. IC50 값이 낮을 수록, 더 우수한 결합이 예상된다. "강력한" 결합제의 경우 사용된 IC50 컷-오프 범위는 0 내지 ≤50nM이고 "중간" 결합제의 경우 >50 내지 ≤500nM이다. 인 실리코 분석 및 비교 결과에 따르면, GCase 변이체 #85는 MHC 클래스 I(HLA-I) "강력한" 결합체의 수가 적고 MHC 클래스 II(HLA-II) "강력한" 결합제의 수가 적은 것으로 나타남에 따라 야생형 GCase에 비해 전체적으로 더 낮은 잠재적인 면역원성 위험 프로파일을 갖는다(도 6).
실시예 8 - GCase 변이체는 Huh-7 세포의 AAV2/'37' 형질도입 시 야생형 GCase에 비해 증가된 GCase 유효 활성을 나타낸다
이전 실시예로부터의 GCase 변이체, 즉 GCase 변이체 #21, GCase 변이체 #85, GCase 변이체 #21+85 및 야생형 GCase에 대해 시험관 내 연구를 수행하였다. AAV2/'37' 바이러스 입자는 실시예 1의 "AAV 생성"이라는 표제의 섹션에 따라 생성하였다. AAV2/'37' 바이러스 입자는 GCase 변이체 또는 야생형 GCase 중 하나를 코딩하는 서열을 발현하였다. 실시예 1에서 "Huh-7 세포의 형질도입"이라는 표제의 섹션에 따라 AAV2/'37' 바이러스 입자로 Huh-7 세포를 형질도입하였다. 형질도입에 사용된 MOI는 5x103, 1x104 및 5x104vg/세포였으며, 비처리 대조군을 포함하였다. GCase 유효 활성을 "GCase 활성 결정"이라는 표제의 섹션에 따라 측정하였다. GCase 유효 활성을 4-MU 표준 곡선에 기초하여 nmol/시간/ml로 측정하였다. 결과를 벡터 게놈 카피 수(실시예 1의 "벡터 게놈 카피 수"라는 표제의 섹션에 따라 결정됨)에 의해 정규화하였다. 형질도입 효율을 설명하기 위해 MOI 군 전체에서 정규화하였다.
모든 GCase 변이체(#21, #85 및 #21+85)는 야생형 GCase와 비교할 때 증가된 유효 GCase 활성을 나타냈다. 특히, GCase 변이체 #85(이황화 결합 함유)는 최고 수준의 GCase 활성을 나타냈다(도 7).
실시예 9 - 야생형 마우스에 주사했을 때, GCase 변이체는 고셔병에 의해 영향을 받는 주요 조직에서 순환하는 GCase 및 흡수의 증가된 수준을 나타낸다
이전 실시예로부터의 GCase 변이체, 즉 GCase 변이체 #21, GCase 변이체 #85, GCase 변이체 #21+85 및 야생형 GCase에 대해 생체 내 연구를 수행하였다. 고셔병에 의해 영향을 받은 주요 조직(도 8b 및 8c)에서 순환하는 GCase 수준(도 8a) 및 GCase 수준을 GCase 변이체(#21, #85 또는 #21+85) 또는 야생형 GCase 중 하나를 코딩하는 서열을 발현하는 AAV2/8 바이러스 입자의 야생형 (C57BL/6) 수컷 마우스 내로 주입 한 후 측정하였다. AAV2/8 바이러스 입자를 실시예 1의 "AAV 생산"이라는 표제에 따라 생산하였다. AAV2/8 바이러스 입자는 GCase 변이체 또는 야생형 GCase 중 하나를 코딩하는 서열을 발현한다. 마우스 및 마우스를 처리한 방법은 실시예 1의 "동물 및 처리 절차"라는 표제의 섹션에 설명되어 있다. AAV2/8 바이러스 입자를 6x1010 vg/kg의 용량으로 마우스에 주입하였다. 동물을 처리 4주 후 도태시켰다. 혈장 및 조직은 실시예 1의 "혈장 및 조직 수집"이라는 표제의 섹션에 설명된 대로 수집하였다. GCase 유효 활성은 "GCase 활성 측정"이라는 섹션에 설명된 대로 측정하였다. 유효 GCase 활성 수준을 VPRIV 표준 곡선에 따라 mU/ml 혈장 또는 mU/mg 단백질(비장 및 골수)로 측정하였다. 결과를 벡터 게놈 카피 수(실시예 1의 "벡터 게놈 카피 수"라는 표제의 섹션에 따라 결정됨)에 의해 정규화하였다.
GCase 변이체(#21, #85 및 #21+85)는 야생형 GCase와 비교할 때 증가된 유효 GCase 활성 수준을 나타냈다. 특히, GCase 변이체 #85는 순환 GCase에 대해 최고 유효 GCase 활성 수준을 보였을 뿐만 아니라 비장 및 골수와 같은 주요 장기에 대한 최대 수준의 흡수를 나타냈다. 추가 특성화를 위해 변형 #85를 선택하였다.
실시예 10 - GCase 변이체 #85로 처리 시 비장, 폐 및 뼈 조직에서 더 많은 GCase 흡수가 달성된다
간, 비장, 폐 및 골수에서의 GCase 수준을 실시예 9에 기술된 바와 같이 AAV2/8 바이러스 입자의 야생형(C57BL/6) 수컷 마우스 내로 주입한 후 조사하였다. 실시예 9에 기술된 바와 같이, 조직을 마우스로부터 수집하였다. 실시예 9의 마우스의 간, 폐, 비장 및 골수를 수집하고 실시예 1의 "혈장 및 조직 수집"이라는 표제의 섹션에 기술된 바와 같이 보존하였다. 면역조직화학적 염색을 파라핀 섹션 상에서 수행하고 시각화를 실시예 1의 "면역조직화학"이라는 표제의 섹션에 기술된 바와 같이 수행하였다. 도 9는 실시예 9의 활성 데이터와 일치하게, 폐, 비장 및 골수와 같은 고셔병에 영향을 받은 장기에서, GCase의 조직 흡수가 야생형 GCase에 비해 GCase 변이체 #85를 코딩하는 서열을 발현하는 AAV2/8 바이러스 입자가 주입된 마우스에서 증가됨을 보여준다.
실시예 11 - AAV2/8-GCase 변이체 #85는 혈장 내 순환 GCase의 용량 의존적 증가 및 WBC, 비장, 폐 및 골수 조직에 의한 흡수의 용량 의존적 증가를 나타낸다
순환하는 GCase 수준(도 10a), 고셔병에 영향을 받은 주요 조직(도 10b 내지 d)에서 GCase 수준 및 백혈구 세포에서의 GCase 수준(도 10e)을 실시예 9에 기술된 바와 같이 GCase 변이체 #85를 코딩하는 서열을 발현하는 AAV2/8 바이러스 입자의 야생형 (C57BL/6) 수컷 마우스에 주입한 후 측정하였다. 방법론은, 2x109 vg/kg 내지 2x1012 vg/kg의 AAV2/8 바이러스 입자의 용량 범위를 사용하고 처리 후 14일(역-안와 출혈에 의해), 처리 후 28일(역-안와 출혈에 의해) 및 처리 후 42일(도태 후)에 혈장을 수득하였음을 제외하고, 실시예 9와 동일하다. 조직 및 WBC의 경우, 처리 후 6주에 동물을 도태시켰다. GCase 수준을 실시예 1의 "GCase 활성 결정"이라는 표제의 섹션에 기술된 바와 같이 측정하였다.
도 10a는 42일에 걸쳐 혈장에서 순환하는 활성 GCase의 용량 의존적 증가를 나타낸다. 비장, 골수 및 폐와 같은 주요 고셔병 장기로의 GCase의 용량 의존적 흡수가 또한 관찰하였다(도 10b 내지 d). 또한, 백혈구로의 GCase의 용량 의존적 흡수가 관찰되었다(도 10e). 안정기(plateau)에 도달하지 못하였다.
실시예 12 - GCase 변이체 #85는 pH 5.75 및 pH 7.0에서 농도 범위에 걸쳐 벨라글루세라제 알파보다 더 큰 열 안정성을 나타낸다
GCase 변이체 #85의 열안정성을 조사하고 실시예 1의 "열안정성 시험"이라는 표제의 섹션에 설명된 열 이동 분석을 사용하여 벨라글루세라제 알파(VPRIV)의 열안정성과 비교하였다.
GCase 변이체 #85 단백질을 실시예 1의 "Expi293F 세포의 확장", "Expi293F 세포의 형질감염 전날", "Expi293F 세포의 형질감염" 및 "형질감염된 Expi293F 세포의 수확"이라는 표제의 섹션에 기술된 방법에 따라 발현시켰다. GCase 변이체 #85를 실시예 1의 "GCase 단백질 정제"라는 표제의 섹션에 기술된 바와 같이 후속적으로 정제하였다. GCase 변이체 #85 단백질을 25 mM 소듐 시트레이트 완충액 pH 5.75에 저장하였고, VPRIV를 뉴클레아제가 없는 물에서 재구성하였다. GCase 변이체 #85 및 VPRIV를 pH 5.75 및 pH 7에서 조사하였으며, 일회용 PD-10 탈염 컬럼을 사용하여 확립된 각 용액으로 교환하였다. 1.5, 3 및 6 μM의 GCase 변이체 #85 및 VPRIV를 5x SYPROTM 오렌지 단백질 겔 염색과 혼합하고 용융 곡선을 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하였다.
pH 5.75 및 pH 7에서 단백질 농도가 증가하는 GCase 변이체 #85 및 VPRIV에 대한 각각의 용융 온도(즉, 단백질의 50%가 접힘이 풀리는 온도)는 각각 도 12a 및 도 12b에 나와있다.
실시예 13 - GBA-결핍 마우스에 주사 시, GCase 변이체 #85는 효소 대체 요법(ERT)과 비교하여 그리고 야생형 GCase를 코딩하는 AAV와 비교하여 주요 조직에서 순환 GCase 수준 및 흡수의 증가를 나타낸다
방법
상기 실시예 1에 기술된 바와 같이, 본 연구에서 고셔병 모델로서 Gba1 돌연변이 D409V/D409V(9V/9V)가 있는 9V/null 마우스를 사용하였다. 본 연구의 목적은 고셔병 I형의 특징이 잘 알려진 모델인 9V/null 마우스에서 GCase 변이체 #85 단백질을 코딩하는 AAV 벡터의 치료 가능성을 평가하는 것이었다.
8주령의 수컷 및 암컷 9V/null 마우스에 GCase 변이체 #85(SEQ ID NO: 18로 코딩됨)를 코딩하는 AAV2/8의 0("비처리" 비히클 대조군, X-vivo 10), 2x1010, 2x1011 또는 2x1012 vg/kg의 단일 정맥 내 용량을 투여하엿다. 9V/null 마우스의 추가군을 벨라글루세라제 알파(VPRIV®, 고셔병에 대한 효소 대체 요법[ERT]으로 승인된 GCasea)로 2주 마다 1회 60 U/kg의 임상 용량으로 측면 미정맥 주입으로 처리하였다. 9V/null 마우스의 추가군을 2x1010, 2x1011 또는 2x1012 vg/kg의 용량으로 야생형 GCase(SEQ ID NO: 60으로 코딩됨)를 코딩하는 AAV로 처리하였다. 모든 군의 n 수는 군 당 9 내지 16마리였다. 야생형 GCase를 코딩하는 서열은, 야생형 GCase를 코딩하는 서열이 변이체 #85(GCaseW351C/A380C)에서 돌연변이 상응하는 위치에 상이한 코돈을 함유한다는 것을 제외하고, GCase 변이체 #85를 코딩하는데 사용된 것과 동일한 코돈-최적화된 서열이었다.
AAV 처리된 마우스는 비히클 또는 VPRIV®를 투여받은 마우스와 비슷한 체중 증가를 나타냈다; 마찬가지로, 부검에서 혈액학적 매개변수와 간과 비장의 무게는 모든 군 간에 비슷하였다. 혈액학 혈액 샘플링: 종말점에서 조직 수집 1 내지 3일 전에 미정맥에서 0.5M EDTA(5 μL) 튜브에 신선한 혈액(약 100μL)을 수집하고 Hemavet 950FS(Drew Scientific Inc. . 미국) 상에서 24시간 이내에 혈액학적 매개변수를 판독하였다.
마우스 조직 수집 및 처리: 마우스 혈장 및 선별된 조직을 처리 개시 후 12주에 해당하는 종말점에서 수집하였다. 간략하게, 마우스를 펜토바비탈(100 mg/kg)로 안락사시켰다. 혈액(약 700 μL)을 문맥을 통해 0.5M EDTA(20 μL) 튜브에 수집하였다. GCase 활성 분석을 위해 백혈구(WBC)를 수집하기 위해 혈액의 일부(약 400 μL)를 처리하였다. 나머지 혈액은 혈장으로 가공하고, 분취한 후 후속 단백질 및 기질 분석을 위해 -80℃에 보관하였다. 수집 후 2시간 이내에 GCase 활성 분석을 위해 신선한 혈장의 일부를 처리하였다.
조직 수확 전에, 마우스를 식염수로 경심관류시켰다. 간, 비장, 폐, 뇌 및 척수를 해부하였다. 전체 간 및 비장을 다중 분석을 위해 추가 해부 전에 칭량하였다. 간, 폐, 및 비장을 네 부분으로 나누었다. 세 부분은 활성, 단백질 및 기질 분석 전에 -80℃에 보관된 개별 튜브에서 동결시켰다; 한 부분은 조직학 분석을 위해 10% 포르말린으로 고정시켰다. 척수를 자궁경부에서 해부하고 조직학 분석을 위해 10% 포르말린에 고정시켰다. 또한 양 다리의 대퇴골과 경골에서 골수(BM) 세포를 채취하여 활성 및 기질 분석을 위해 -80℃ 냉동고에 보관된 두 개의 튜브에 냉동 보관하였다.
VPRIV® 치료군의 각 혈장 수집 및 GCase 활성 분석을 예정된 효소 주입 후 2시간 이내에 수행하였다.
백혈구 세포(WBC) 단리: WBC를 적혈구(RBC) 용해에 의해 혈액에서 단리하였다. 0.5M EDTA 튜브에 수집한 혈액(약 400 μL)을 10X 부피의 PBS에 현탁하고 3,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 분리하였다. 그런 다음 세포를 10X 부피의 RBC 용해 완충액(0.01 M Tris-HCL 완충액 중 8.3 gm/L NH4Cl, pH 7.5)에 현탁하고 3,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 펠릿이 옅은 색이 될 때까지 용해 절차를 3회 반복하였다. 최종 WBC를 PBS로 세척하고 원심분리기로 수집하였다. 수집한 WBC를 GCase 활성 분석 전에 -80℃에서 보관하였다.
GCase 활성 분석: WBC, BM 및 조직 샘플을 Precellys® 2 mL 조직 균질화 혼합 비드 키트(Bertin Instruments, 프랑스)를 사용하여 1% 소듐 타우로콜레이트 및 1% Triton X-100(Tc/Tx)에서 균질화하고 Cryolys 열 제어(4℃, Bertin Instruments, 프랑스)가 장착된 Precellys Evolution 조직 균질화기를 통해 4℃에서 2개 사이클(각가 20초, 30초 간격) 동안 작동시켰다. 세포(BM 및 WBC)를 4℃에서 초음파 처리하여 1% Tc/Tx에서 균질화하였다. 조직 및 세포 용해물(2 μL)을 분석 혼합물(0.025 M 시트르산-인산염 완충액, pH 5.6)로 희석하였다(5 X). 샘플 당 3중으로 희석된 용해물(10 μL)을 반응 플레이트에 로딩하였다. 혈장 샘플의 경우, 혈장을 0.025 M 시트르산-인산염 완충액, pH 5.6으로 희석하였다. GCase 활성을 혈장 부피에 의해 정규화하였고 nmole/h/mL로 표시하였다. 비가역적 GCase 억제제인 2 mM Conduritol B 에폭시드(CBE, Millipore. 미국 캘리포니아주)의 존재 및 부재 하에 4-메틸움베르페릴-β-D-글루코피라노시드(4-MU-글루코스, 4 mM)(Biosynth AG, 스위스)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 상대 형광 단위(RFU)에 대해 형광 측정법(Molecular Devise M5 형광 분광계, 여기 및 방출 파장이 각각 365nm 및 445nm)으로 결정하여 4-MU-글루코스를 절단하는 비-산-β-글루코시다제를 추정하였다. 4-MU-글루코스 계수 계수(CF)는 56,000이며 측정 당 3회 반복의 2회 측정에 의해 생성된 4-MU 표준 곡선에서 유도하였다. 순 RFU/CF = nmole. GCase 활성은 각각 혈장 또는 조직에 대해 nmole/h/ml 또는 nmole/h/mg로 계산하였다.
GCase 기질, 글루코실세라미드 및 글루코실스핑고신을 LC/MS로 혈장, 간, 비장, 폐 및 BM 샘플에서 분석하였다.
동결된 간, 비장 및 폐의 무게를 측정하고(약 50 mg) 7 mm 스테인리스 스틸 생성기 프로브(OMNI International)가 장착된 Omni TipTM 균질화 키트를 사용하여 15초 동안 3.6 mL의 메탄올/클로로포름/H2O(2:1:0.6 v/v/v)에서 균질화하였다. 용해물의 분취량(500 μL)을 LC/MS 분석에 사용하였다. 정량화된 글루코실세라미드 및 글루코실스핑고신을 조직 중량으로 정규화하였다.
혈장(약 100 μL)을 LC/MS으로 분석하였다. 글루코실세라미드 및 글루코실스핑고신 수준을 사용한 혈장 부피에 의해 정규화하였다.
BM 세포 200 μL 물에 현탁시키고 초음파 처리한 다음 와동시켜 세포 용해물을 만들었다. 160 μL의 용해물을 LC/MS 분석에 사용하였다. 나머지 용해물을 단백질 추정에 사용하였다. 글루코실세라미드 및 글루코실스핑고신 수준을 단백질 양으로 정규화하였다.
헥소실세라미드 및 헥소실스핑고신의 LC/MS 분석을 South Carolina의 의과 대학의 Lipidomics Shared Resources에서 수행하였다. 헥소실세라미드 및 헥소실스핑고신의 경우 정량화의 최저 한계는 25 pmole/mL이다. 헥소실세라미드는 글루코실세라미드와 갈락토실세라미드로 구성되어 있다. 헥소실스핑고신은 글루코실스핑고신과 갈락토실스피그노신을 포함한다. 갈락토실세라미드 및 갈락토실스피그노신은 혈장, 간, 비장, 폐 및 BM에서 검출할 수 없기 때문에, 정량화된 헥소실세라미드 및 헥소실스핑고신은 각각 글루코실세라미드 및 글루코실스핑고신을 나타낸다.
9V/null 마우스의 내장 병리학을 포말성 대식세포를 저장 세포로서 계수하고 대식세포에서 고셔병의 염증 마커인 CD68 강도 염색 신호를 정량화하여 결정하였다.
저장 세포 계수: Autostainner(Leica Autostainner XL, CCHMC 핵심 시설)에서 조직 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 염색된 조직을 Aperio AT2(Leica, 20X)로 스캔하였다. 조직 이미지는 Aperio eSlide ImageScope(V12.4.0.0543)로 처리하였다. 마우스 간과 폐에서 20X 크기(500 μm X 800 μm 이미지)의 사진 10장을 분석을 위해 무작위로 선택하였다. 저장 세포를 각 이미지에서 수동으로 계수하였다. 분석된 10개의 이미지에서 관찰된 평균 세포 수를 사용하였고 그래프로 나타내었다. "저장 세포"의 정의는 세포(대식세포)의 크기를 기반으로 한다, 예를 들어 간에서 저장 세포의 크기는 >10 μm이고, 폐에서 >15 μm이다. 저장 세포 크기는 Aperio eSlide ImageScope 소프트웨어(V12.4.0.0543)로 처리된 이미지의 눈금 막대에서 결정하였다. 샘플 정체에 대해 실험자는 맹검이었다.
CD68 염색 및 정량화: 조직 절편을 Discover Ultra 자동 IHC/ISH 슬라이드 염색기를 사용하여 토끼 항-마우스 CD68 항체(1:25. Abcam Ab53444)로 염색하였다. 세포 핵을 시각화하기 위해 조직을 헤마톡실린(파란색)으로 역-염색하였다. 염색된 조직을 Aperio AT2(Leica, 20X)로 스캔하고, 이미지를 Aperio eSlide ImageScope(V12.4.0.0543)로 획득하였다. CD68 신호(갈색) 밀도의 정량 분석을 위해 20X 크기(500 μm X 800 μm)의 간 및 폐 이미지를 선택하였다. Image J(Fiji, v5.1)를 사용하여 마우스 당 5개의 간 또는 폐 이미지의 면역조직화학 신호를 분석하였다. 샘플 정체에 대해 실험자는 맹검이었다.
신호 밀도 보정: CD68 염색을 두 가지 개별 실험에서 수행하였다:
1) 비히클-9V/null, WT 비히클 및 VPRIV;
2) 비히클-9V/null 및 AAV-GCase #85.
두 실험 사이의 밀도 변화(변산 계수)를 각 실험의 참조 샘플 세트(비히클-9V/null의 수컷 3마리와 암컷 3마리)로부터 결정하였다. 변환 계수는 두 실험의 샘플에서 CD68 밀도를 동일한 배경 수준으로 보정하기 위해 적용하였다. 마우스 당 분석된 5개의 이미지에서 관찰된 평균 CD68 신호를 데이터 분석에 사용하였다.
결과
AAV 전달 후 GCase 활성의 증가는 마지막 ERT 주사 후 12주 및 2시간 이내에 측정하였으며, 이는 ERT가 조직에서 C-max인 기간 내에 있음을 보여주는 이전 데이터와 일치한다. GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV의 주입은 간, 비장, 폐, 백혈구(WBC) 및 골수에서 야생형(WT) 수준 이상으로 조직 GCase 활성을 증가시켰다(도 13). 또한, 질병 진행과 함께 축적되는 글루코실스핑고신의 현저한 감소가 혈장에서 관찰되었고(도 14), 모든 조직은 GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV의 투여 후 분석되었다(도 15). 유사한 감소가 글루코실세라미드에서도 관찰되었다.
GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV의 주입 후 조직 GCase 활성 수준은 또한 야생형 GCase를 코딩하는 AAV 주입 후 관찰된 수준보다 더 높았다. 도 13과 야생형 GCase를 코딩하는 AAV 주입 후 GCase 활성 수준, 2x1011의 용량의 GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV의 주입 후 GCase 활성 수준의 데이터, 및 비처리군에서 4마리 추가 마우스의 데이터가 포함된 도 18을 참조한다. 또한, GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV의 투여 후 글루코실스핑고신 수준의 감소 정도도 또한 야생형 GCase를 코딩하는 AAV의 투여 후 보다 더 컸다. 도 14와 야생형 GCase를 코딩하는 AAV의 주입 후 글루코실스핑고신 수준, 및 비처리군에서 4마리의 추가 마우스로부터의 데이터를 포함하는 도 19a를 참조한다. 또한, 도 15a 내지 d로부터의 데이터와 야생형 GCase를 코딩하는 AAV의 주입 후 글루코실스핑고신 수준, 및 비처리군에서 4마리의 추가 마우스로부터의 데이터를 포함하는 도 19b 내지 e를 참조한다.
폐 및 골수는 GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV의 단일 주입 시 기질 제거율이 상당히 개선되었음을 보여주었다. 고셔병 바이오마커 lysoGb1인 글루코실스핑고신은 AAV 주입으로 이들 조직과 혈장 모두에서 대략 WT 수준으로 감소하였다. 또한, 조직 염증은 항-CD68 항체 염색 및 간 및 폐의 저장 세포 수에 의해 평가된 바와 같이 AAV-처리된 마우스에서 유의하게 감소하였다. 폐에서 CD68 밀도 수준의 비교를 보여주는 도 16a 및 폐에서 저장 세포의 수에서 비교를 보여주는 도 16b를 참조한다.
GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV 또는 야생형 GCase를 코딩하는 AAV의 투여 12주 후, 9V/null 마우스의 혈장에서 순환 GCase 수준의 용량-의존적 증가가 관찰되었다(도 20). 또한, 야생형 GCase를 코딩하는 AAV가 투여된 마우스와 비교하여 GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV가 투여된 마우스에서 더 높은 수준의 GCase 활성이 관찰되었다(도 20). 야생형 GCase를 코딩하는 AAV를 사용한 투여와 비교하여 GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV의 투여 후 최대 42배 더 높은 수준의 GCase 활성이 관찰되었다.
실시예 14 - AAV-GCase#85 주입 후 비-인간 영장류에 대한 장기 조사 연구는 모든 시점에서 모든 AAV-처리 동물에서 처리 전 수준에 비해 GCase 활성이 증가함을 보여준다
연구 목표는 수컷 및 암컷 원숭이(레서스 마카크)에서 단일 AAV IV(주입) 투여 후 60개월 관찰 기간 동안 전신 장기 독성 가능성 및 생체분포를 평가하는 것이다.
실험은 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행한다. 레서스 마카크(처리한 3마리의 수컷 및 3마리의 암컷)에 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 GCase 변이체 #85를 코딩하는 AAV2/'37'을 투여하였다. 적어도 6개월(수컷 2마리 및 암컷 2마리) 또는 최대 60개월(수컷 1마리 및 암컷 1마리)의 투여 후 관찰 기간 동안 동물을 추적할 것이다.
측정은 사망률, 국소 내성 결과, 임상 관찰, 체중, 음식 소비, 혈액학 및 혈액 화학을 포함한다. 이 연구는 또한 GCase 및 면역원성(항-GBA)에 대한 만성 초생리학적 혈장 노출의 효과를 확립하기 위해 종료 시 조직의 전체 조직병리학적 평가를 포함할 것이다.
GCase 활성 수준을 첫 번째 달에는 매주, 두 번째 달에는 격주로, 그 이후에는 매월 결정하였다. 종료 시 대표적인 조직 샘플을 채취하여 GCase 흡수 및 생체분포를 평가하였다.
연구가 현재 진행 중이다. 임상 상태, 투여 후 관찰, 체중, 음식 소비, 혈액학, 혈액 화학, 말초 백혈구의 면역 표현형에 대한 연구 또는 처리-관련 영향 중 사망은 없었다.
8일, 15일, 22일, 29일, 43일 및 57일로부터의 샘플의 예비 혈장 분석은 모든 시점에서 모든 AAV-처리된 동물에서 전처리 수준(즉, 0일)에 비해 증가된 GCase 활성을 검출하였다(도 17a). GCase 수치는 8일까지 급격히 증가하였다; 22일과 43일 사이에 약간의 변동이 있었고 43일 이후부터는 수준이 안정하였다. 달성된 GCase 수준은 Gba-결핍 마우스에서 달성된 수준과 조직에서 기질 제거율와 관련된 범위 내에서 일치하였다.
도 17b는 AAV 투여 후 8, 15, 22, 29, 43, 57, 85, 113, 141 및 170일에 동일한 AAV-처리된 동물에서 관찰된 GCase 활성 수준을 보여준다. 동물 17-020은 조직 섭취 연구를 위해 83일에 희생되었다.
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<210> 55 <211> 1611 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 55 atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60 atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120 aggccctgca tccctaagag ctttggctac agctctgtgg tgtgtgtgtg caatgccacc 180 tactgtgaca gctttgaccc ccccaccttt cctgccctgg gcaccttcag cagatatgag 240 agcaccaggt ctgggaggag gatggagctg agcatggggc ccatccaggc taatcacact 300 ggcactggcc tgctgctgac cctgcagcct gagcagaagt tccagaaagt aaagggcttt 360 ggaggggcca tgactgatgc tgctgctctg aacatcctgg ccctgagccc ccctgcccag 420 aatctgctgc tgaagagcta cttctctgag gagggcattg gctataacat catcagggtg 480 cccatggcca gctgtgactt cagcatcagg acctacacct atgctgacac ccctgatgat 540 ttccagctgc acaacttcag cctgcctgag gaggatacca agctgaagat cccactgatc 600 cacagggctc tgcagctggc ccagaggcct gtgagcctgc tggccagccc ctggaccagc 660 cccacttggc tgaagaccaa tggggctgtg aatgggaagg ggagcctgaa gggacagcct 720 ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780 gagcacaagc tgcagttctg ggctgtgact gctgagaatg agccttctgc tgggctgctg 840 tctggctacc ccttccaatg cctgggcttc acccctgagc atcagaggga cttcattgcc 900 agggacctgg gccctaccct ggccaacagc actcaccata atgttaggct gctgatgctg 960 gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gctaaggtgg tgctgactga ccctgaggct 1020 gctaaatatg tgcatggcat tgctgtgcat tggtacctgg actttctggc tcctgccaag 1080 gccaccctgg gggagaccca caggctgttc cccaacacca tgctgtttgc ctctgaggcc 1140 tgtgtgggca gcaagttctg ggagcagtct gtgaggctgg gcagctggga tagggggatg 1200 cagtacagcc acagcatcat caccaacctg ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260 aacctggccc tgaaccctga gggaggacct aactgggtca gaaactttgt ggacagcccc 1320 atcattgtgg acatcaccaa ggacaccttt tacaagcagc ccatgttcta ccacctgggc 1380 cacttcagca agttcatccc tgagggcagc cagagagtgg ggctggtggc cagccagaag 1440 aatgacctgg atgctgtggc tctgatgcat cctgatggct gcgctgtggt ggtggtgctg 1500 aacaggagct ctaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560 accatcagcc ctggctacag catccacacc tacctgtggt gcaggcagtg a 1611 <210> 56 <211> 1611 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 56 atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60 atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120 aggccctgca tccctaagag ctttggctac agctctgtgg tgtgtgtgtg caatgccacc 180 tactgtgaca gctttgaccc ccccaccttt cctgccctgg gcaccttcag cagatatgag 240 agcaccaggt ctgggaggag gatggagctg agcatggggc ccatccaggc taatcacact 300 ggcactggcc tgctgctgac cctgcagcct gagcagaagt tccagaaagt aaagggcttt 360 ggaggggcca tgactgatgc tgctgctctg aacatcctgg ccctgagccc ccctgcccag 420 aatctgctgc tgaagagcta cttctctgag gagggcattg gctataacat catcagggtg 480 cccatggcca gctgtgactt cagcatcagg acctacacct atgctgacac ccctgatgat 540 ttccagctgc acaacttcag cctgcctgag gaggatacca agctgaagat cccactgatc 600 cacagggctc tgcagctggc ccagaggcct gtgagcctgc tggccagccc ctggaccagc 660 cccacttggc tgaagaccaa tggggctgtg aatgggaagg ggagcctgaa gggacagcct 720 ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780 gagcacaagc tgcagttctg ggctgtgact gctgagaatg agccttctgc tgggctgctg 840 tctggctacc ccttccaatg cctgggcttc acccctgagc atcagaggga cttcattgcc 900 agggacctgg gccctaccct ggccaacagc actcaccata atgttaggct gctgatgctg 960 gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gctaaggtgg tgctgactga ccctgaggct 1020 gctaaatatg tgcatggcat tgctgtgcat tggtacctgg actttctggc tcctgccaag 1080 gccaccctgg gggagaccca caggctgttc cccaacacca tgctgtttgc ctctgaggcc 1140 tgtgtgggca gcaagttctg ggagcagtct gtgaggctgg gcagctggga tagggggatg 1200 cagtacagcc acagcatctg caccaacctg ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260 aacctggccc tgaaccctga gggaggacct aactgggtca gaaactttgt ggacagcccc 1320 atcattgtgg acatcaccaa ggacaccttt tacaagcagc ccatgttcta ccacctgggc 1380 cacttcagca agttcatccc tgagggcagc cagagagtgg ggctggtggc cagccagaag 1440 aatgacctgt gcgctgtggc tctgatgcat cctgatggct ctgctgtggt ggtggtgctg 1500 aacaggagct ctaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560 accatcagcc ctggctacag catccacacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611 <210> 57 <211> 66 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 57 gtaaatataa aatttttaag tgtataatgt gttaaactac tgattctaat tgtttctctc 60 ttttag 66 <210> 58 <211> 208 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 58 ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180 gggaagacaa tagcaggcat gctgggga 208 <210> 59 <211> 1494 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 59 gccaggccct gcatccctaa gagctttggc tacagctctg tggtgtgtgt gtgcaatgcc 60 acctactgtg acagctttga cccccccacc tttcctgccc tgggcacctt cagcagatat 120 gagagcacca ggtctgggag gaggatggag ctgagcatgg ggcccatcca ggctaatcac 180 actggcactg gcctgctgct gaccctgcag cctgagcaga agttccagaa agtaaagggc 240 tttggagggg ccatgactga tgctgctgct ctgaacatcc tggccctgag cccccctgcc 300 cagaatctgc tgctgaagag ctacttctct gaggagggca ttggctataa catcatcagg 360 gtgcccatgg ccagctgtga cttcagcatc aggacctaca cctatgctga cacccctgat 420 gatttccagc tgcacaactt cagcctgcct gaggaggata ccaagctgaa gatcccactg 480 atccacaggg ctctgcagct ggcccagagg cctgtgagcc tgctggccag cccctggacc 540 agccccactt ggctgaagac caatggggct gtgaatggga aggggagcct gaagggacag 600 cctggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660 gctgagcaca agctgcagtt ctgggctgtg actgctgaga atgagccttc tgctgggctg 720 ctgtctggct accccttcca atgcctgggc ttcacccctg agcatcagag ggacttcatt 780 gccagggacc tgggccctac cctggccaac agcactcacc ataatgttag gctgctgatg 840 ctggatgacc agaggctgct gctgccccac tgggctaagg tggtgctgac tgaccctgag 900 gctgctaaat atgtgcatgg cattgctgtg cattggtacc tggactttct ggctcctgcc 960 aaggccaccc tgggggagac ccacaggctg ttccccaaca ccatgctgtt tgcctctgag 1020 gcctgtgtgg gcagcaagtt ctgggagcag tctgtgaggc tgggcagctg ggataggggg 1080 atgcagtaca gccacagcat catcaccaac ctgctgtacc atgtggtggg ctggactgac 1140 tggaacctgg ccctgaaccc tgagggagga cctaactggg tcagaaactt tgtggacagc 1200 cccatcattg tggacatcac caaggacacc ttttacaagc agcccatgtt ctaccacctg 1260 ggccacttca gcaagttcat ccctgagggc agccagagag tggggctggt ggccagccag 1320 aagaatgacc tggatgctgt ggctctgatg catcctgatg gctctgctgt ggtggtggtg 1380 ctgaacagga gctctaagga tgtgcctctg accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440 gagaccatca gccctggcta cagcatccac acctacctgt ggaggaggca gtga 1494 <210> 60 <211> 1611 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 60 atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60 atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120 aggccctgca tccctaagag ctttggctac agctctgtgg tgtgtgtgtg caatgccacc 180 tactgtgaca gctttgaccc ccccaccttt cctgccctgg gcaccttcag cagatatgag 240 agcaccaggt ctgggaggag gatggagctg agcatggggc ccatccaggc taatcacact 300 ggcactggcc tgctgctgac cctgcagcct gagcagaagt tccagaaagt aaagggcttt 360 ggaggggcca tgactgatgc tgctgctctg aacatcctgg ccctgagccc ccctgcccag 420 aatctgctgc tgaagagcta cttctctgag gagggcattg gctataacat catcagggtg 480 cccatggcca gctgtgactt cagcatcagg acctacacct atgctgacac ccctgatgat 540 ttccagctgc acaacttcag cctgcctgag gaggatacca agctgaagat cccactgatc 600 cacagggctc tgcagctggc ccagaggcct gtgagcctgc tggccagccc ctggaccagc 660 cccacttggc tgaagaccaa tggggctgtg aatgggaagg ggagcctgaa gggacagcct 720 ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780 gagcacaagc tgcagttctg ggctgtgact gctgagaatg agccttctgc tgggctgctg 840 tctggctacc ccttccaatg cctgggcttc acccctgagc atcagaggga cttcattgcc 900 agggacctgg gccctaccct ggccaacagc actcaccata atgttaggct gctgatgctg 960 gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gctaaggtgg tgctgactga ccctgaggct 1020 gctaaatatg tgcatggcat tgctgtgcat tggtacctgg actttctggc tcctgccaag 1080 gccaccctgg gggagaccca caggctgttc cccaacacca tgctgtttgc ctctgaggcc 1140 tgtgtgggca gcaagttctg ggagcagtct gtgaggctgg gcagctggga tagggggatg 1200 cagtacagcc acagcatcat caccaacctg ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260 aacctggccc tgaaccctga gggaggacct aactgggtca gaaactttgt ggacagcccc 1320 atcattgtgg acatcaccaa ggacaccttt tacaagcagc ccatgttcta ccacctgggc 1380 cacttcagca agttcatccc tgagggcagc cagagagtgg ggctggtggc cagccagaag 1440 aatgacctgg atgctgtggc tctgatgcat cctgatggct ctgctgtggt ggtggtgctg 1500 aacaggagct ctaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560 accatcagcc ctggctacag catccacacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611 <210> 61 <211> 588 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis virus <400> 61 atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60 cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120 tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180 ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240 gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300 ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360 tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg 420 cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480 atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540 gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc 588 <210> 62 <211> 245 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis virus <400> 62 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttag ttcttgccac ggcggaactc 180 atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc 240 gtggt 245 <210> 63 <211> 589 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis virus <400> 63 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540 cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589 <210> 64 <211> 1494 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 gcccgcccct gcatccctaa aagcttcggc tacagctcgg tggtgtgtgt ctgcaatgcc 60 acatactgtg actcctttga ccccccgacc tttcctgccc ttggtacctt cagccgctat 120 gagagtacac gcagtgggcg acggatggag ctgagtatgg ggcccatcca ggctaatcac 180 acgggcacag gcctgctact gaccctgcag ccagaacaga agttccagaa agtgaaggga 240 tttggagggg ccatgacaga tgctgctgct ctcaacatcc ttgccctgtc accccctgcc 300 caaaatttgc tacttaaatc gtacttctct gaagaaggaa tcggatataa catcatccgg 360 gtacccatgg ccagctgtga cttctccatc cgcacctaca cctatgcaga cacccctgat 420 gatttccagt tgcacaactt cagcctccca gaggaagata ccaagctcaa gatacccctg 480 attcaccgag ccctgcagtt ggcccagcgt cccgtttcac tccttgccag cccctggaca 540 tcacccactt ggctcaagac caatggagcg gtgaatggga aggggtcact caagggacag 600 cccggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660 gctgagcaca agttacagtt ctgggcagtg acagctgaaa atgagccttc tgctgggctg 720 ttgagtggat accccttcca gtgcctgggc ttcacccctg aacatcagcg agacttcatt 780 gcccgtgacc taggtcctac cctcgccaac agtactcacc acaatgtccg cctactcatg 840 ctggatgacc aacgcttgct gctgccccac tgggcaaagg tggtactgac agacccagaa 900 gcagctaaat atgttcatgg cattgctgta cattggtacc tggactttct ggctccagcc 960 aaagccaccc taggggagac acaccgcctg ttccccaaca ccatgctctt tgcctcagag 1020 gcctgtgtgg gctccaagtt ctgggagcag agtgtgcggc taggctcctg ggatcgaggg 1080 atgcagtaca gccacagcat catcacgaac ctcctgtacc atgtggtcgg ctggaccgac 1140 tggaaccttg ccctgaaccc cgaaggagga cccaattggg tgcgtaactt tgtcgacagt 1200 cccatcattg tagacatcac caaggacacg ttttacaaac agcccatgtt ctaccacctt 1260 ggccacttca gcaagttcat tcctgagggc tcccagagag tggggctggt tgccagtcag 1320 aagaacgacc tggacgcagt ggcactgatg catcccgatg gctctgctgt tgtggtcgtg 1380 ctaaaccgct cctctaagga tgtgcctctt accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440 gagacaatct cacctggcta ctccattcac acctacctgt ggcgtcgcca gtga 1494

Claims (27)

  1. 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 β-글루코세레브로시다제(GCase) 폴리펩티드로서,
    상기 적어도 하나의 돌연변이는 증가된 안정성을 제공하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 351, 380, 272, 262, 313, 404, 407, 482, 484, 490, 494, 503, 및 534로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 상응하는 위치에 있고, 선택적으로 상기 적어도 하나의 돌연변이는
    (i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 돌연변이; 및
    (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
  4. 전술하는 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 돌연변이는:
    (i) 보다 높은 유효 활성을 제공하고/하거나;
    (ii) 증가된 열안정성을 제공하고/하거나;
    (iii) 생리학적 pH에서 구조적인 안정화를 제공하고/하거나;
    (iv) 보다 긴 반감기를 제공하는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
  5. 전술하는 항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 보다 높은 유효 활성을 갖고, 선택적으로:
    (i) 참조 GCase 폴리펩티드가 야생형 GCase 폴리펩티드, 선택적으로 SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드이고/이거나;
    (ii) 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성이 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성에 비해 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5.배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 또는 적어도 50배 더 높은, 변형된 GCase 폴리펩티드.
  6. 전술하는 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 적어도 하나의 돌연변이는 증가된 안정성을 제공하고, 증가된 안정성이 pH 7.4에서이고/이거나;
    (ii) 적어도 하나의 돌연변이는 증가된 안정성을 제공하고, 증가된 안정성이 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후에 측정되는 것이고/이거나;
    (iii) 적어도 하나의 돌연변이는 pH 7.4에서 구조적인 안정화를 제공하고/하거나;
    (iv) 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 생리학적 pH에서 보다 구조적으로 안정하고, 선택적으로 상기 pH는 pH 7.4이고, 추가로 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이거나 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드이고/이거나;
    (v) 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖고, 선택적으로 상기 증가된 안정성은 pH 7.4에서의 증가된 안정성이고, 추가로 선택적으로 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이거나 SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드이고/이거나;
    (vi) 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 적어도 10분, 적어도 30분, 적어도 60분, 적어도 120분, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 또는 적어도 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지하고/하거나;
    (vii) 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 참조 GCase 폴리펩티드의 활성보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 2.8배, 또는 적어도 3배 더 높은 활성을 유지하고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이거나, SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
  7. 전술하는 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 활성을 유지하고/하거나;
    (ii) 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 72시간의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 또는 적어도 60% 활성을 유지하고, 선택적으로 상기 인큐베이션은 PBS에서이고/이거나;
    (iii) 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 15%, 또는 적어도 20% 활성을 유지하고, 선택적으로 상기 인큐베이션은 혈청 또는 혈장에서이고/이거나;
    (iv) 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 40% 활성을 유지하고, 선택적으로 상기 인큐베이션은 혈청 또는 혈장에서이고/이거나;
    (v) 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 60% 활성을 유지하고/하거나;
    (vi) 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 7일의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 80% 활성을 유지하고/하거나;
    (vii) 활성, 유효 활성, 안정성, 및/또는 반감기는 형광측정 분석법을 사용하여 결정되는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
  8. 전술하는 항 중 어느 한 항에 있어서,
    참조 GCase 폴리펩티드에 비해 더 긴 반감기를 갖고, 선택적으로 상기 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 긴 반감기를 갖는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서,
    a. 보다 긴 반감기는 pH 7.4 또는 pH 5.6에서의 보다 긴 반감기이고/이거나;
    b. 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 20배 더 긴 pH 5.6에서의 반감기를 갖고/갖거나;
    c. 보다 긴 반감기는 혈청 또는 혈장에서의 보다 긴 반감기이고/이거나;
    d. 반감기는 형광측정 분석법을 사용하여 결정되고/되거나;
    e. 참조 GCase 폴리펩티드는 (a) 야생형 GCase 폴리펩티드, (b) SEQ ID NO: 3의 폴리펩티드, 또는 (c) SEQ ID NO: 4 또는 5의 폴리펩티드인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
  10. 전술하는 항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하고, 선택적으로 상기 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치의 돌연변이는 글루타민으로의 치환이고, 추가로 선택적으로 E272Q이고/이거나;
    b. 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 262에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하고, 선택적으로 상기 SEQ ID NO: 1의 위치 262에 상응하는 위치의 돌연변이는 아스파라긴 또는 티로신으로의 치환이고/이거나;
    c. 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 262에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하고, 상기 SEQ ID NO: 1의 위치 262에 상응하는 위치의 돌연변이는 아스파라긴으로의 치환, 선택적으로 H262N이고/이거나;
    d. 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 313에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하고, 선택적으로 상기 SEQ ID NO: 1의 위치 313에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 아스파라긴으로의 치환이고, 추가로 선택적으로 H313N이고/이거나;
    e. 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 404에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하고, 선택적으로 상기 SEQ ID NO: 1의 위치 404에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 리신으로의 치환이고, 추가로 선택적으로 H404K이고/이거나;
    f. 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 490에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하고, 선택적으로 상기 SEQ ID NO: 1의 위치 490에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 리신으로의 치환이고, 추가로 선택적으로 H490K이고/이거나;
    g. 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하고, 선택적으로 상기 SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 아스파라긴으로의 치환이고, 추가로 선택적으로 R534N인, 변형된 GCase 폴리펩티드.
  11. 전술하는 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 적어도 하나의 돌연변이는:
    (i) SEQ ID NO: 1의 위치 482에 상응하는 위치에서의 돌연변이; 및
    (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 503에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하고,
    선택적으로
    (i) SEQ ID NO: 1의 위치 482에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환, 선택적으로 아스파르트산에서 시스테인으로의 돌연변이이고;
    (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 503에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환, 선택적으로 세린에서 시스테인으로의 돌연변이이고/이거나;
    (b) 적어도 하나의 돌연변이는:
    (i) SEQ ID NO: 1의 위치 494에 상응하는 위치에서의 돌연변이; 및
    (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하고,
    선택적으로
    (i) SEQ ID NO: 1의 위치 494에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환, 선택적으로 세린에서 시스테인으로의 돌연변이이고;
    (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 534에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환, 선택적으로 아르기닌에서 시스테인으로의 돌연변이이고/이거나;
    (c) 적어도 하나의 돌연변이는:
    (i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 돌연변이; 및
    (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하고,
    선택적으로
    (i) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환, 선택적으로 트립토판에서 시스테인으로의 돌연변이이고;
    (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환, 선택적으로 알라닌에서 시스테인으로의 돌연변이이고/이거나;
    (d) 적어도 하나의 돌연변이는:
    (i) SEQ ID NO: 1의 위치 407에 상응하는 위치에서의 돌연변이; 및
    (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 484에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하고,
    선택적으로
    (i) SEQ ID NO: 1의 위치 407에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환, 선택적으로 이소류신에서 시스테인으로의 돌연변이이고;
    (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 484에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 시스테인으로의 치환, 선택적으로 아스파르트산에서 시스테인으로의 돌연변이이고/이거나;
    (e) 적어도 하나의 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 글루타민으로의 치환을 포함하고, 상기 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖고, pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 85%의 활성을 유지하고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이고/이거나;
    (f) 적어도 하나의 돌연변이는:
    (i) 트립토판에서 시스테인으로의 SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에서의 돌연변이; 및
    (ii) 알라닌에서 시스테인으로의 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하고;
    상기 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖고, pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 85%의 활성을 유지하고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이고/이거나;
    (g) 적어도 하나의 돌연변이는:
    (i) SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 글루타민으로의 치환, 선택적으로 E272Q; 및
    (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에 트립토판에서 시스테인으로의 돌연변이; 및
    (iii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에 알라닌에서 시스테인으로의 돌연변이를 포함하고/하거나;
    (h) 적어도 하나의 돌연변이는:
    (i) SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 글루타민으로의 치환, 선택적으로 E272Q; 및
    (ii) SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치에 트립토판에서 시스테인으로의 돌연변이; 및
    (iii) SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에 알라닌에서 시스테인으로의 돌연변이를 포함하고;
    상기 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖고, pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 적어도 85%의 활성을 유지하고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 야생형 GCase 폴리펩티드이고/이거나;
    (i) 변형된 GCase 폴리펩티드는 참조 GCase 폴리펩티드에 비해 더 높은 유효 활성 및/또는 증가된 안정성을 갖고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 내지 5 중 임의의 하나로부터 선택되는, 변형된 GCase 폴리펩티드.
  12. 전술하는 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 변형된 GCase 폴리펩티드는 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 400개, 300개 내지 497개, 400개 내지 497개, 또는 450개 내지 497개 아미노산의 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 단편과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (ii) 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (iii) 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 400개 내지 536개 아미노산의 단편과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (iv) 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2의 400개 내지 497개 아미노산의 단편과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (v) 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (vi) 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (vii) 변형된 GCase 폴리펩티드는 전술하는 항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (viii) 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (ix) 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치 및 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에 시스테인으로의 치환을 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (x) 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 351에 상응하는 위치 및 SEQ ID NO: 1의 위치 380에 상응하는 위치에 시스테인으로의 치환을 포함하고, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 272에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다는 것을 제외하고, 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드
  13. 변형된 글루코세레브로시다제(GBA) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 전술하는 항 중 어느 한 항의 변형된 GCase 폴리펩티드를 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항에 있어서,
    변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 내지 29 중 임의의 하나의 적어도 750개, 적어도 850개, 적어도 950개, 적어도 1000개, 적어도 1200개, 적어도 1400개, 또는 적어도 1494개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    (i) 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나;
    (ii) 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나;
    (iii) 변형된 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 26의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 폴리뉴클레오티드는 전사 조절 요소를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 전사 조절 요소는 A1AT 프로모터 또는 A1AT 프로모터의 단편을 포함하고/하거나;
    (ii) 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함하고/하거나;
    (iii) 폴리뉴클레오티드는 전사 조절 요소를 추가로 포함하고, 상기 전사 조절 요소는 인핸서를 포함하고, 선택적으로 상기 인핸서는 HCR 인핸서 또는 HCR 인핸서의 단편이고/이거나;
    (iv) 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 32 또는 SEQ ID NO: 33과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 인핸서를 포함하고/하거나;
    (v) 폴리뉴클레오티드는 전사 조절 요소를 추가로 포함하고, 상기 전사 조절 요소는 SEQ ID NO: 34와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일하고/하거나;
    (vi) 폴리뉴클레오티드는 전사 조절 요소를 추가로 포함하고, 상기 전사 조절 요소는 SEQ ID NO: 35와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한, 폴리뉴클레오티드.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는 바이러스 입자.
  18. 제17항에 있어서,
    (i) AAV, 아데노바이러스, 또는 렌티바이러스 바이러스 입자이고, 선택적으로 상기 바이러스 입자는 AAV 바이러스 입자이고/이거나;
    (ii) 바이러스 입자는 간-친화성 또는 CNS-친화성 캡시드를 포함하고, 선택적으로 상기 간-친화성 캡시드는 SEQ ID NO: 36, 37 또는 38의 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 700개, 600개 내지 736개, 650개 내지 736개, 또는 700개 내지 736개 아미노산의 단편과 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 서열을 포함하고/하거나;
    (iii) 상기 바이러스 입자는 하기를 추가로 포함하고/하거나:
    a) AAV2 ITR;
    b) 폴리A 서열; 및/또는
    c) 인트론;
    (iv) 상기 재조합 게놈 단일-가닥이고/이거나;
    (v) 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 SEQ ID NO: 14 또는 18의 서열에 의해 코딩되는 GCase 폴리펩티드의 유효 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%인, 바이러스 입자.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    (i) 숙주 세포 내로 형질도입 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 숙주 세포 내로의 형질도입 후 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 동일하거나 더 높고/높거나;
    (ii) 숙주 세포 내로 형질도입 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 숙주 세포 내로의 형질도입 후 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 더 높고/높거나;
    (iii) 바이러스 입자의 투여 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여, 혈장, 백혈구 세포, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 동일하거나 더 높고/높거나;
    (iv) 바이러스 입자의 투여 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 간에서 동일하거나 더 높고/높거나;
    (v) 바이러스 입자의 투여 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 혈장, 백혈구 세포, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 더 높고/높거나;
    (vi) 바이러스 입자의 투여 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은, 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성과 비교하여 간에서 더 높고/높거나;
    (vii) 바이러스 입자의 투여 후, 변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 GCase 효소 대체 요법의 유효 활성과 비교하여, 간, 백혈구 세포, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 동일하거나 더 높고/높거나;
    (viii) 바이러스 입자의 투여 후, 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준은 하기의 헥소실스핑고신 및/또는 헥소실세라미드의 수준에 비해 혈장, 간, 비장, 골수, 폐 조직, 및/또는 임의의 다른 고셔병-영향 장기에서 더 낮고/낮거나:
    a. GCase 효소 대체 요법 투여 후; 또는
    b. 고셔병이 있는 대상체에서; 또는
    c. 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 밖의 동일한 바이러스 입자의 투여 후;
    (ix) 바이러스 입자의 투여 후, 저장 세포의 수 또는 활성화된 대식세포의 수준은 GCase 효소 대체 요법 투여 후 저장 세포의 수 또는 활성화된 대식세포의 수준에 비해 간 또는 폐 조직에서 더 낮은, 바이러스 입자.
  20. 제19항에 있어서,
    변형된 GCase 폴리펩티드의 유효 활성은 참조 GCase 폴리펩티드의 유효 활성에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 또는 적어도 40배 더 높은, 바이러스 입자.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    (i) 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 41 또는 44의 폴리펩티드를 포함하고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 또는 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나;
    (ii) 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 43 또는 46의 폴리펩티드를 포함하고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 22 또는 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나;
    (iii) 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 42 또는 45의 폴리펩티드를 포함하고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 14 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나;
    (iv) 참조 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 폴리펩티드를 포함하고, 선택적으로 상기 참조 GCase 폴리펩티드를 코딩하는 GBA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 59 또는 60의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 입자.
  22. 전술하는 항 중 어느 한 항의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 바이러스 입자 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 조성물.
  23. 전술하는 항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료 방법에 사용하기 위한 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물로서, 선택적으로 상기 치료 방법은 유효량의 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    (i) 치료 방법은 GCase 결핍과 관련된 질환의 치료 방법이거나;
    (ii) 치료 방법은 파킨슨병의 치료 방법이거나;
    (iii) 치료 방법은 고셔병의 치료 방법이고, 선택적으로 상기 고셔병은 고셔병 I형, II형 또는 III형이거나;
    (iv) 치료 방법은 고셔병의 치료 방법이고, 이전에 효소 대체 요법의 일부로서 치료받은 적이 있는 환자는 재조합 GCase에 대한 항체 또는 억제제를 가지고 있고, 선택적으로 상기 고셔병은 I형, II형 또는 III형인, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드와 비교하여 pH 7.4에서 증가된 안정성을 갖는, 질환 치료에 사용하기 위한, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    - 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 의해 유지되는 활성에 비해 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 또는 적어도 2배 더 높은 활성을 유지하고/하거나;
    - 변형된 GCase 폴리펩티드 또는 코딩된 변형된 GCase 폴리펩티드는 pH 7.4 및 37℃에서 120분의 인큐베이션 후 측정되는 경우 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드에 의해 유지된 활성에 비해 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 7배, 적어도 10배, 또는 적어도 15배 더 높은 활성을 유지하는, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물.
  27. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환 치료는 SEQ ID NO: 40의 GBA 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 GCase 폴리펩티드를 포함하거나, 코딩하는 동등한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물의 투여가 요구되는 용량과 비교하여, 보다 낮은 용량의 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환 치료에 사용하기 위한, 변형된 GCase 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 입자, 또는 조성물.
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