CN116322744A - 稳定性提高的突变的β-葡糖脑苷脂酶 - Google Patents

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CN116322744A CN202180066422.7A CN202180066422A CN116322744A CN 116322744 A CN116322744 A CN 116322744A CN 202180066422 A CN202180066422 A CN 202180066422A CN 116322744 A CN116322744 A CN 116322744A
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Abstract

本发明涉及经修饰的β‑葡糖脑苷脂酶(GCase)多肽和包含经修饰的葡糖脑苷脂酶(GBA)核苷酸序列的多核苷酸。本发明还涉及包含含有本发明多核苷酸的重组基因组的病毒颗粒，以及包含本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸或病毒颗粒的组合物。本发明还涉及本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒和/或组合物的使用方法和用途。本发明还涉及用于治疗方法，或用于制造治疗方法中使用的药物的本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。

Description

稳定性提高的突变的β-葡糖脑苷脂酶
技术领域
本发明涉及经修饰的β-葡糖脑苷脂酶(β-glucocerebrosidase,GCase)多肽和包含经修饰的葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase,GBA)核苷酸序列的多核苷酸。本发明还涉及包含含有本发明的多核苷酸的重组基因组的病毒颗粒，以及包含本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸或病毒颗粒的组合物。本发明还涉及本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒和/或组合物的使用方法和用途。本发明还涉及本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于治疗方法，或用于制造治疗方法中使用的药物。
技术背景
戈谢病(GD)是特征在于葡糖脑苷脂在巨噬细胞-单核细胞系统的细胞中沉积的常染色体隐性脂质储积病。GD是由管家GBA基因的突变引起的，所述突变损害了β-葡糖脑苷脂酶(GCase)的活性和/或产生。GCase是具有葡糖神经酰胺酶活性(EC 3.2.1.45)的酶，其可水解化学物质葡糖脑苷脂的β-糖苷键联，葡糖脑苷脂是细胞膜中丰富的糖脂代谢的中间产物。突变导致活性降低的错误折叠的GCase产生，并可导致葡糖脑苷脂在浸润许多重要器官的巨噬细胞中积聚，这表现为GD。
有三种主要类型的GD(其特征在于已经鉴定的特定突变)，并且每种类型可以表现出不同的临床症状。1型GD几乎不或不涉及中枢神经系统，但主要以诸如脾和肝肿大、血细胞计数低、出血问题和骨病等内脏表现为特征。在过去的20年里，酶替代疗法已经成为1型GD的标准治疗。除了其高成本(～$200,000或～
Figure BDA0004148758090000011
150,000/患者/年)之外，GD的酶替代疗法治疗通常需要终身每隔一周注射一次或多次。这导致高比例的GD患者表现出高水平的治疗负担。
因此，需要为GD的治疗提供改进的和有效的疗法，即增加功能性GCase对受累靶器官的可用性的疗法，这将避免对频繁和终身静脉内注射GCase的需要。
发明内容
本发明涉及经修饰的β-葡糖脑苷脂酶(GCase)多肽，其包含一个或多个氨基酸取代突变。
因此，在本发明的第一方面，提供了包含至少一个突变的经修饰的β-葡糖脑苷脂酶(GCase)多肽，其中所述至少一个突变：
(i)提供更高的有效活性；和/或
(ii)提供增强的稳定性；和/或
(iii)提供生理pH值下的结构稳定性；和/或
(iv)提供更长的半衰期；和/或
(v)提供增强的热稳定性。
在本发明的第二方面，提供了经修饰的β-葡糖脑苷脂酶(GCase)多肽，其在对应于选自SEQ ID NO:1的351、380、272、262、313、404、407、482、484、490、494、503和534的位置的位置处包含至少一个突变。
在本发明的第三方面，提供了包含经修饰的葡糖脑苷脂酶(GBA)核苷酸序列的多核苷酸，其中经修饰的GBA核苷酸序列编码本发明的经修饰的GCase多肽。
在本发明的第四方面，提供了包含含有本发明的多核苷酸的重组基因组的病毒颗粒。
在本发明的第五方面，提供了包含本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸或病毒颗粒和药学上可接受的赋形剂的组合物。
在本发明的第六方面，提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于治疗方法中。
在本发明的第七方面，提供了治疗方法，其包括向患者施用有效量的本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
在本发明的第八方面，提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物在制备用于治疗方法的药物方面的用途。
在本发明的第九方面，提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于治疗疾病，其中与由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽或编码的经修饰的GCase多肽在pH 7.4下具有增强的稳定性。
在本发明的第十方面，提供了通过施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物来治疗疾病的方法，其中与由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽或编码的经修饰的GCase多肽在pH 7.4下具有增强的稳定性。
在本发明的第十一方面，提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物在治疗疾病方面的用途，其中与由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽或编码的经修饰的GCase多肽在pH 7.4下具有增强的稳定性。
在本发明的第十二方面，提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于治疗疾病，其中治疗疾病包括施用与需要施用的包含或编码由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽的等同多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物的剂量相比更低剂量的所述经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
在本发明的第十三方面，提供了通过施用本发明的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物来治疗疾病的方法，其中治疗疾病包括施用与需要施用的包含或编码由SEQ IDNO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽的等同多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物的剂量相比更低剂量的所述经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
在本发明的第十四方面，提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物在治疗疾病中的用途，其中治疗疾病包括施用与需要施用的包含或编码由SEQID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽的等同多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物的剂量相比更低剂量的所述经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
在本发明的第十五方面，提供了包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽：
(i)具有更高的有效活性；和/或
(ii)具有增强的稳定性；和/或
(iii)在生理pH下具有结构稳定性；和/或
(iv)具有更长的半衰期；和/或
(v)提供增强的热稳定性。
在本发明的第十六方面，提供了包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变减少了人白细胞抗原(HLA)-I和/或HLA-II结合物的数量。
在本发明的第十七方面，提供了包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽具有数量减少的HLA-I和/或HLA-II结合物。
在第十八方面，提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物在制备药物方面的用途，所述药物用于在患有与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者中：
(i)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(ii)减少储藏细胞(storage cell)的数量；和/或
(iii)降低活化的巨噬细胞的水平。
在第十九方面，提供了方法，所述方法通过向患有与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物而在所述受试者中
(i)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(ii)减少储藏细胞的数量；和/或
(iii)降低活化的巨噬细胞的水平。
在第二十方面，提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于在患有与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者中进行的以下方法中：
(iv)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(v)减少储藏细胞的数量；和/或
(vi)降低活化的巨噬细胞的水平；
任选地其中
(i)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(ii)减少储藏细胞的数量；和/或
(iii)降低活化的巨噬细胞的水平；
导致与GCase缺乏相关的疾病或疾患的治疗。
Gcase是溶酶体蛋白，其在酸性pH下正常发挥功能并且是稳定的。其在生理pH值(例如pH 7.4)下通常不稳定，半衰期仅为几分钟。例如，参见实施例2和图1，其显示在pH7.4下孵育后，VPRIV(维拉苷酶α，一种商购可得的ERT，其为重组GCase，具有与天然存在的人GCase多肽相同的氨基酸序列)的活性显著降低。SEQ ID NO:3包含维拉苷酶α的序列。现有的酶替代治疗(enzyme replacement treatment)(ERT)是GD患者的标准治疗方法。在ERT中，GCase酶通常是静脉内提供的，这意味着由于GCase酶需要行进的距离以及它们在血液中的不稳定性，此类治疗也遇到了将GCase酶有效递送至靶器官的问题。本发明人已经开发了稳定性增强的经修饰的GCase多肽。本发明人已经鉴定了GCase多肽中能够增强GCase多肽稳定性的氨基酸取代。
不希望受理论束缚，据信本发明的氨基酸突变可用于增强在生理pH(例如pH 7.4)下的稳定性，从而延长GCase稳定的时间，并因此提供更高的有效活性。如本发明的经修饰的GCase多肽相较于野生型GCase多肽在各种pH下具有更高的残留活性(例如参见实施例3和4)。根据本发明的经修饰的GCase多肽相较于野生型GCase多肽在各种pH下具有更长的半衰期(例如参见实施例5)。根据本发明的经修饰的GCase多肽可以显示比野生型GCase多肽更高的GCase有效活性(例如参见实施例8和9)。本发明的经修饰的GCase多肽可具有改善的热稳定性(例如参见实施例12)。根据本发明的经修饰的GCase多肽可以作为用于酶替代疗法的蛋白质提供。此外，本发明的经修饰的GCase多肽可通过在肝脏中表达(诸如以基因疗法的形式)并允许蛋白质通过血液运输到达靶器官来提供。相较于野生型GCase多肽的提供，根据本发明的经修饰的GCase多肽的提供(诸如以基因疗法的形式)可导致相关组织中的更高摄取(例如参见实施例10)。本发明人还发现，与野生型GCase多肽相比，根据本发明的经修饰的GCase多肽可具有降低的潜在免疫原性风险。根据本发明的经修饰的GCase多肽可具有较低预测数量的HLA-I的“强”结合物和较低预测数量的HLA-II的强结合物(例如参见实施例7)。
通过延长GCase稳定的时间，从而提供更高的有效活性，本发明的经修饰的GCase多肽在以与具有较低稳定性的GCase(例如，野生型GCase)的剂量相同或相似的剂量施用时可实现更大的治疗效果。此外，当以比具有较低稳定性的GCase(例如野生型GCase)更低的剂量施用本发明的经修饰的GCase多肽时，较低剂量的本发明的经修饰的GCase多肽可能能够实现与所述具有较低稳定性的GCase相同的治疗效果。因此，可以降低与疗法相关的成本，并且可以提高安全性。
附图说明
图1显示了在PBS(pH 7.4)中VPRIV的酶促活性。在与PBS一起孵育0分钟、15分钟、30分钟、60分钟和120分钟时测量残留酶促活性(残留GCase活性)。每个时间点的残留酶促活性计算为初始活性的百分比。
图2A和图2B提供了在各种条件下，即在37℃下于AB缓冲液(pH5.6)(图2A)和PBS缓冲液(pH 7.4)(图2B)中孵育7天的各种GCase变体(#21、#68、#69、#85和#21+85，参见表1)、野生型GCase和VPRIV(维拉苷酶α，一种与天然存在的人GCase具有相同氨基酸序列的重组GCase；VPRIV是一种商购可得的ERT)的残留酶促活性的比较。在孵育0分钟、10分钟、30分钟、60分钟、120分钟、3天、4天、5天、6天和7天后测量残留酶促活性(残留GCase活性)。每个时间点的残留酶促活性计算为初始活性的百分比。
图3A和图3B提供了在各种条件下，即在37℃下于人血浆(图3A)和人血清(图3B)中孵育7天的各种GCase变体(#21、#85和#21+85，见表1)、野生型GCase和VPRIV(维拉苷酶α，一种与天然存在的人GCase具有相同氨基酸序列的重组GCase；VPRIV是一种商购可提的ERT)的残留酶促活性的比较。在孵育0分钟、10分钟、30分钟、60分钟、120分钟、3天、4天、5天、6天和7天后测量残留酶促活性(残留GCase活性)。每个时间点的残留酶促活性计算为初始活性的百分比。
图4A-图4C提供了纯化的GCase变体#85(图4B)和维拉苷酶α(VPRIV，一种与天然存在的人GCase具有相同氨基酸序列的重组GCase)(图4A)在各种生理基质(即AB缓冲液(pH5.6)、PBS缓冲液(pH7.4)、小鼠血清、小鼠血浆和人血清)中的半衰期的比较。在与生理基质一起孵育0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、24小时、48小时、120小时和144小时(未显示所有时间点)后，测量残留酶促活性(残留GCase活性)。每个时间点的残留酶促活性计算为初始活性的百分比。测定纯化的GCase变体#85和野生型GCase(维拉苷酶α)的半衰期(单位为分钟)(图4C)。针对“溶酶体pH”计算的时间对应于使用AB缓冲液(pH 5.6)的结果，针对“生理pH”计算的时间对应于使用PBS缓冲液(pH 7.4)的结果。
图5A-图5C提供了GCase变体#85的酶促效率(即，GCase处理底物的能力)与其他人报道的野生型GCase和酶替代疗法(ERT)的伊米苷酶(Imiglucerase)和维拉苷酶α的酶促效率的比较。通过处理4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡糖苷酸(4-MUG)来测量酶促效率。在图5A和图5B中，分别用2.5x 106nM、5x 106nM、7.5x 106nM或1x 107nM的4-MUG孵育1nM和3.35nM的GCase变体#85。将每个4-MUG浓度的4+MU形成速率对4-MUG浓度作图，并用Michaelis-Menten模型拟合。以nM/秒为单位测量速率。图5C提供了GCase变体#85的Kcat(s-1)和Km(mM)，以及其他人报道的野生型GCase及酶替代疗法(ERT)伊米苷酶和维拉苷酶α的Km(mM)值。
图6提供了GCase变体#85的潜在免疫原性风险特征的计算机评估结果。对来自GCase变体#85和野生型GCase(GCaseWT)的片段评估其预测的结合HLA I类和HLA II类的能力。MHC：主要组织相容性复合体；HLA：人白细胞抗原。
图7显示了许多GCase变体和野生型GCase在AAV2/‘37’转导Huh-7细胞(人肝细胞系)后的有效GCase活性。测试了GCase变体#21、GCase变体#85和GCase变体#21+85各自的有效GCase活性。基于4-MU标准曲线，以nmol/小时/ml为单位表示有效的GCase活性。用于转导的MOI是5x103vg/细胞、1x104vg/细胞和5x104vg/细胞，MOI：感染复数。包括了未处理的对照。将结果以载体基因组拷贝数(如根据实施例1中标题为“载体基因组拷贝数”的部分测定的)作归一化。归一化是针对MOI组进行的，以说明转导效率。当在图中提到“GCase活性”时，是指“有效的GCase活性”。
图8A-图8C显示了在向野生型(C57BL/6)雄性小鼠注射AAV2/8病毒颗粒后血浆(图8A)、脾脏(图8B)和骨髓(图8C)中的有效GCase活性水平，所述病毒颗粒表达编码GCase变体#21、GCase变体#85和GCase变体#21+85或野生型GCase之一的序列。对照组(首次接触实验的)小鼠未接受处理。将AAV2/8病毒颗粒以6x1010 vg/kg的剂量注射到小鼠体内。在处理后4周宰杀动物。根据VPRIV标准曲线，以mU/ml血浆或mU/mg蛋白质(脾和骨髓)为单位表示有效的GCase活性水平。将结果以载体基因组拷贝数(如根据实施例1中标题为“载体基因组拷贝数”的部分测定的)作归一化。当在图中提到“GCase活性”时，是指“有效的GCase活性”。
图9显示了在向野生型(C57BL/6)雄性小鼠注射表达编码GCase变体#85或野生型GCase的序列的AAV2/8病毒颗粒后，肝脏、脾脏、肺和骨髓中的GCase水平(如通过免疫组织化学染色所测定的)。在处理后4周宰杀动物。
图10A-图10E显示了在向野生型(C57BL/6)雄性小鼠注射表达编码GCase变体#85的序列的AAV2/8病毒颗粒后，血浆(图10A)、脾脏(图10B)、骨髓(图10C)、肺(图10D)和白细胞(WBC)(图10E)中的GCase有效活性水平。对照组(首次接触实验的)小鼠未接受处理。将AAV2/8病毒颗粒以下列剂量注射入小鼠：2x109 vg/kg、2x1010 vg/kg、2x1011 vg/kg、6x1011vg/kg和2x1012vg/kg。对于图10A，在处理后14天、28天和42天获得血浆。对于图10B至图10E，在处理后6周宰杀动物。以mU/ml血浆为单位表示血浆中的有效GCase活性水平，以mU/mg蛋白质为单位表示组织和WBC中的有效GCase活性水平，它们都是使用VPRIV标准曲线测定的。将结果以载体基因组拷贝数(如根据实施例1中标题为“载体基因组拷贝数”的部分所测定的)作归一化。当在图中提到“GCase活性”时，是指“有效的GCase活性”。
图11-序列列表
图12显示了在pH 5.75(图12A)和pH 7(图12B)的溶液中，浓度为1.5μM、3μM和6μM的GCase变体#85与维拉苷酶α(VPRIV)之间的热稳定性比较。
图13显示了在Gba缺陷型小鼠中，单次注射编码GCase变体#85的AAV(剂量为2x1012vg/kg，“AAV”)或一个疗程的维拉苷酶α(每隔一周以60U/kg递送的VPRIV，“ERT”)后，肝脏(图13A)、白细胞(图13B)、骨髓(图13C)、脾脏(图13D)和肺(图13E)组织中GCase活性水平的比较。在注射AAV后12周和ERT递送后2小时内进行测量。Gcase活性的平均水平是相对于非缺陷型(野生型)小鼠中发现的GCase活性的平均水平显示的，结果计算为百分比(y轴，“相对于WT的百分比”)。虚线代表用于比较的野生型小鼠中GCase活性的平均水平。“未处理的”＝对照。数据表示为平均值±SD。
图14显示了在Gba缺陷型小鼠中，以所示剂量单次注射AAV或一个疗程的维拉苷酶α(VPRIV，每隔一周以60U/kg递送的“ERT”)后，血浆中己糖基鞘氨醇水平的比较。在注射AAV后12周和ERT递送后2小时内进行测量。显示了非缺陷型小鼠(“野生型”)中的己糖基鞘氨醇水平以供比较。0＝未处理的对照。数据表示为平均值±SD。****＝相对于未处理对照“0”的统计显著性差异(p<0.0001)。所执行的分析＝单因素ANOVA。
图15显示了在Gba缺陷型小鼠中以所示剂量(2x1011 vg/kg和2x1012vg/kg)单次注射AAV后或一个疗程的维拉苷酶α(VPRIV，每隔一周以60U/kg递送的“ERT”)后，肝脏(图15A)、脾脏(图15B)、骨髓(图15C)和肺(图15D)中的己糖基鞘氨醇水平的比较。在注射AAV后12周和ERT递送后2小时内进行测量。显示了非缺陷型小鼠(“野生型”)中的己糖基鞘氨醇水平以供比较。0＝未处理的对照。数据表示为平均值±SD。*＝相对于未处理对照“0”的差异(p<0.1)。****＝相对于未处理对照“0”的统计显著性差异(p<0.0001)。所执行的分析＝单因素ANOVA。
图16显示了在Gba缺陷型小鼠中，以所示剂量单次注射AAV或一个疗程的维拉苷酶α(VPRIV，每隔一周以60U/kg递送的“ERT”)后，肺中CD68密度水平(图16A)或储藏细胞数量(图16B)的比较。在注射AAV后12周和ERT递送后2小时内进行测量。显示了非缺陷型小鼠(“野生型”)的CD68密度水平和储藏细胞数量以供比较。0＝未处理的对照。所示p值是相对于未处理对照“0”而言的。数据表示为平均值±SD。
图17显示了在向恒河猴施用编码GCase变体#85的AAV(单次注射2x1012 vg/kg)后，血浆GCase活性水平的快速和持续升高，这种升高一直观察到AAV施用后的第57天(图17A)或第170天(图17B)。AAV显示出良好的安全性特征，并被发现具有良好的耐受性。在(图17B)中，动物17-020在第83天被处死，用于组织摄取研究。
图18显示了在Gba缺陷型小鼠中，在单次注射编码GCase变体#85的AAV(“AAV-#85”，剂量为2x 1011vg/kg和2x1012 vg/kg)、一个疗程的维拉苷酶α(每隔一周以60U/kg递送的VPRIV，“ERT”)后，或单次注射编码野生型GCase的AAV(“AAV-WT”，剂量为2x1012vg/kg)后，肝脏、白细胞、骨髓、脾和肺组织中GCase活性水平的比较。在注射AAV后12周以及最后一次ERT给药后2小时内进行测量。Gcase活性的平均水平是相对于非缺陷型(野生型)小鼠中发现的GCase活性的平均水平显示的，结果计算为百分比(y轴，“相对于WT的百分比”)。虚线代表用于比较的野生型小鼠中GCase活性的平均水平。“未处理的”＝对照。数据表示为平均值±Sd。n＝9至16/处理组。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001,****P≤0.0001，单因素ANOVA。所示p值是相对于未处理对照“0”而言的。对于x轴：1＝未处理的对照；2＝2x 1011vg/kg的“AAV-#85”；3＝2x 1012vg/kg的“AAV-#85”；4＝“ERT”；5＝2x 1012vg/kg的“AAV-WT”。
图19显示了在Gba缺陷型小鼠中，在单次注射编码GCase变体#85的AAV(“AAV-#85”，剂量为2x 1011vg/kg或2x1012 vg/kg)、一个疗程的维拉苷酶α(每隔一周以60U/kg递送的VPRIV，“ERT”)后，或在单次注射编码野生型GCase的AAV(“AAV-WT”，剂量为2x1012vg/kg)后，血浆(图19A)、肝脏(图19B)、脾脏(图19C)、骨髓(图19D)和肺(图19E)中己糖基鞘氨醇水平的比较。在注射AAV后12周以及最后一次ERT递送后2小时内进行测量。显示了非缺陷型小鼠(“野生型”)中的己糖基鞘氨醇水平以供比较。0＝未处理的对照。数据表示为平均值±SD。n＝9至16/组。*P≤0.05；****P≤0.0001，单因素ANOVA。所示p值是相对于未处理对照“0”而言的。
图20显示了在Gba缺陷型小鼠中，在注射不同剂量(2x 1010vg/kg,2x 1011vg/kg或2x1012 vg/kg)的编码GCase变体#85的AAV(“AAV-#85”)或编码野生型GCase的AAV(“AAV-WT”)后，血浆中GCase活性水平的比较。在注射AAV后12周进行测量。数据表示为平均值±SD。n＝9至16/治疗组。***P≤0.001,****P≤0.0001，学生T检验。
序列列表的描述
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具体实施方式
一般定义
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。
一般而言，术语“包含”、“包括”旨在表示包括但不限于。例如，短语“包含两个突变的经修饰的GCase多肽”应解释为意指经修饰的GCase多肽具有至少两个突变，但可包含更多突变。类似地，短语“包含经修饰的葡糖脑苷脂酶(GBA)核苷酸序列的多核苷酸”是指具有经修饰的GBA核苷酸序列的多核苷酸，但是该多核苷酸可包含额外的核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，词语“包含(comprising)”用短语“基本上由......组成”代替。术语“基本上由......组成”意指可以存在特定的另外组分，即不会对主题的基本特征产生实质性影响的那些组分。
在本发明的一些实施方案中，词语“包含(comprising)”用短语“由......组成”代替。术语“由......组成”旨在是限制性的。例如，短语“由两个突变组成的经修饰的GCase多肽”应被解释为意指经修饰的GCase多肽仅具有两个突变，没有额外的突变。类似地，短语“由经修饰的葡糖脑苷脂酶(GBA)核苷酸序列组成的多核苷酸”应理解为意指多核苷酸具有经修饰的GBA核苷酸序列，并且没有额外的核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，词语“具有(have)”可用词语“包含”或短语“由......组成”代替。在本发明的一些实施方案中，词语“具有(has)”可以用词语“包含”或短语“由......组成”代替。
如本文中所用，当涉及两个端点来定义数值范围时，“介于......之间(between)”应理解为“介于......之间并且包括”。因此，定义为“介于5与10之间”的范围包括所有大于5且小于10的值，以及离散值5和10本身。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物链。
术语“突变”、“取代突变”和“氨基酸取代”在本文中可互换使用，旨在意指用不同的氨基酸取代氨基酸序列中的一个氨基酸。例如，在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处包含突变的经修饰的GCase多肽可对应于具有SEQ ID NO:1的序列的GCase多肽，不同的是GCase多肽的位置272处的氨基酸与SEQ ID NO:1中的位置272处的氨基酸不同。或者，在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处包含突变的经修饰的GCase多肽可对应于具有SEQID NO:1的序列的GCase多肽，不同的是包括位置272处的氨基酸在内的少数氨基酸与SEQID No:1中的相应氨基酸不同(例如，包含位置272的GCase多肽的连续部分可包含不同于SEQ ID NO:1中相应氨基酸的氨基酸)。在短语“对应于SEQ ID NO:Z的位置X的位置处的突变是用氨基酸Y取代”和“所述至少一个突变包括在对应于SEQ ID NO:Z的位置X的位置处的突变”中，取代的残基是对应于SEQ ID NO:Z的位置X的位置处的氨基酸。氨基酸Y是替换氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:Z的位置X的位置处的原始或天然氨基酸的不同氨基酸。在短语对氨基酸X“的取代”或“(待)被取代的氨基酸X”中，氨基酸X是氨基酸序列中存在的并且将被取代的原始或天然氨基酸。例如，谷氨酸的取代意指原始或天然谷氨酸氨基酸被另一种氨基酸替代。在短语“被氨基酸Y取代”或“至氨基酸Y的突变”中，氨基酸Y是替代氨基酸序列中原始或天然氨基酸的不同氨基酸。例如，被谷氨酰胺取代是指用谷氨酰胺替代原始或天然(非谷氨酰胺)氨基酸。用于定义取代突变的标准速记命名法列出了氨基酸序列中待取代的位置处的原始或天然氨基酸，以及替代原始或天然氨基酸的氨基酸。例如，包含取代突变E272Q的经修饰的GCase多肽是指包含谷氨酰胺残基对对应于位置272的位置处的谷氨酸残基的取代(即，其在对应于位置272的位置处包含谷氨酰胺残基)的经修饰的GCase氨基酸序列。
“对应于”指定SEQ ID NO的指定位置的氨基酸可以是所述特定SEQ ID NO的指定位置处的氨基酸。例如，“对应于SEQ ID NO:1的位置272”的氨基酸可以是SEQ ID NO:1的位置272处的氨基酸。或者,“对应于”指定SEQ ID No的指定位置的氨基酸可以是来自备选氨基酸序列的对应于指定SEQ ID NO的指定位置的氨基酸。例如，“对应于SEQ ID NO:1的位置272”的氨基酸可以是来自备选氨基酸序列的对应于SEQ ID NO:1的位置272的氨基酸。确定备选氨基酸序列中的哪些氨基酸“对应于”指定SEQ ID NO中的指定位置在本领域技术人员的能力范围内。例如，本领域技术人员仅需要使用合适的比对算法，诸如本文所述的Needleman和Wunsch的算法，将替代氨基酸序列与指定的SEQ ID NO进行序列比对，并确定备选氨基酸序列的哪个区域与指定SEQ ID NO中的指定位置进行了比对。例如，技术人员能够将备选氨基酸序列与SEQ ID NO:1进行比对，并确定哪个氨基酸与例如SEQ ID NO：1的位置272进行比对，从而对应于所述位置272。
术语“保守取代”是指其中氨基酸被另一种具有相似生物化学性质(诸如大小、电荷或疏水性)的氨基酸取代的取代突变。氨基酸可以根据它们侧链的结构分成几类：脂族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)；含羟基/硫(丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸)；环状(脯氨酸)；芳族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；碱性(组氨酸、赖氨酸、精氨酸)；酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；和酸性胺(天冬酰胺、谷氨酰胺)。因此,“保守取代”是指其中氨基酸被同一组中的另一个氨基酸取代的取代突变。相反，术语“非保守取代”是指其中氨基酸被另一种具有不同生化特性的氨基酸取代的取代，即其中氨基酸被另一组中的氨基酸取代的取代突变。例如，用谷氨酸取代天冬氨酸可被认为是“保守取代”，而用谷氨酰胺取代谷氨酸可被认为是“非保守性”取代。
术语“野生型”和“天然的”在本文中可互换使用，旨在描述天然存在的事物。例如，“野生型GCase氨基酸序列”是天然存在的GCase氨基酸序列。
术语“生理pH”是指通常在人体中占优势的pH，其通常介于pH7.35与pH 7.45之间。为了本发明的目的，术语“生理pH”特别是指血液中发现的pH，约为pH 7.4，通常介于pH7.35与pH 7.45之间。因此，当至少一个突变在生理pH下提供结构稳定性时，这应理解为在血液中可发现的pH(例如pH 7.4)下提供结构稳定性。作为另一个实例，如果在生理pH下测量多肽的稳定性，则在可在血液中发现的pH(例如pH 7.4)水平下测量稳定性。优选地，生理pH为pH 7.4。
术语“溶酶体pH”指溶酶体的pH水平。换句话说，溶酶体pH是可在溶酶体中发现的pH水平，例如pH 5.6。例如，如果在溶酶体pH下测量多肽的稳定性，则在溶酶体中可发现的pH(例如pH 5.6)水平下测量稳定性。溶酶体的pH可介于pH 5.4与pH 5.8之间。溶酶体的pH可介于pH 5.5与pH 5.7之间。溶酶体的pH可介于pH 5.55与pH5.65之间。优选地，溶酶体的pH为pH 5.6。
术语“AAV病毒颗粒”和“AAV载体”在本文中可互换使用。
在描述核苷酸或氨基酸序列的长度的上下文中使用的术语“约”表示序列可包含确定数量±10％，更特别地±5％，更特别地±1％，或更特别地±单个整数的核苷酸或氨基酸，或由所述数量的核苷酸或氨基酸组成。例如，长度为“约”1494个核苷酸的核苷酸序列可以指长度为1345-1643个核苷酸，更特别地1420-1568个核苷酸，更特别地1480-1508个核苷酸，更特别地1493-1495个核苷酸的核苷酸序列。
在时间长度(例如16小时)的上下文中使用的术语“约”表示该时间长度包括指定时间长度±10％，更特别地±5％，或者更特别地±1％。
出于本发明的目的，为了确定两个序列(诸如两个多核苷酸或两个多肽序列)的同一性百分比，对序列进行比对以达到最佳比较的目的(例如，可以在第一序列中引入缺口，以便与第二序列进行最佳比对)。然后比较每个位置处的核苷酸或氨基酸残基。当第一序列中的位置被第二序列中相应位置处的相同核苷酸或氨基酸占据时，那么所述核苷酸或氨基酸在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列之间共有的相同位置的数目的函数(即同一性％＝相同位置的数目/参考序列中位置的总数x 100)。
通常地，在参考序列的长度上进行序列比较。例如，如果用户希望确定给定的(“测试”)序列是否与SEQ ID NO:1具有95％同一性,则SEQ ID NO:1将是参考序列。为了评估序列是否与SEQ ID NO:1(参考序列的一个实例)具有95％同一性，技术人员将在SEQ ID NO:1的长度上进行比对，并鉴定测试序列中有多少位置与SEQ ID NO:1的位置相同。如果至少95％的位置相同，则测试序列与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性。如果测试序列短于SEQID NO:1，则缺口或缺失的位置应该被认为是不相同的位置。
技术人员知道可用于确定两个序列之间的同源性或同一性的不同计算机程序。例如，序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。在实施方案中，使用Needleman和Wunsch(1970)算法，使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵，以及为16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和为1、2、3、4、5或6的长度权重，确定两个氨基酸或核酸序列之间的同一性百分比，所述算法已被并入Accelrys GCG软件包(可在http://www.Accelrys.Com/products/gcg/获得)中的GAP程序中。
除非内容另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物。因此，例如，“一个氨基酸(an amino acid)”包括此类氨基酸的两个或更多个实例或形式。
出于本发明的目的，术语“片段”是指序列的连续部分。例如，50个氨基酸的SEQ IDNO:1的片段是指SEQ ID NO:1的50个连续氨基酸。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是在上文还是在下文中，均由此通过引用以其整体并入。
经修饰的GCase多肽
本发明提供了包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽(也称为GCase变体)。术语“经修饰的”意指所述多肽与野生型GCase多肽相比至少有一处不同，例如引入了突变。据信，当从酸性pH变为生理pH时，先前带正电荷的残基会变成中性，而中性残基会变成带负电荷，导致吸引力消失或形成排斥力，这可能使多肽不稳定。不希望受理论束缚，据信本发明的氨基酸突变可用于增强在生理pH下(因此在血液中)的稳定性，从而延长GCase稳定并因此具有活性的时间。例如，用在酸性pH下是质子供体且在生理pH下也是质子供体的氨基酸(例如谷氨酰胺)取代在酸性pH下是质子供体但在生理pH下不是质子供体的氨基酸(例如谷氨酸)有可能起到稳定GCase多肽的作用。
任选地，所述至少一个突变包含20个或更少、10个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少的突变(或由所述数量的突变组成)。任选地，所述至少一个突变包含10个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少的突变(或由所述数量的突变组成)。任选地，所述至少一个突变包含5个或更少、4个或更少、3个或更少或者2个或更少的突变(或由所述数量的突变组成)。任选地，所述至少一个突变包含3个或更少的突变(或由所述数量的突变组成)。任选地，所述至少一个突变包含2个或更少的突变(或由所述数量的突变组成)。任选地，所述至少一个突变包含一个突变(或由一个突变组成)。任选地，所述至少一个突变包含两个突变(或由两个突变组成)。
本发明的经修饰的GCase多肽是有功能的。功能性GCase多肽是进行葡糖脑苷脂水解的多肽。确定GCase多肽是否有功能在本领域技术人员的能力范围之内。技术人员只需要测试GCase多肽是否有活性。例如，技术人员可确定本文所论述的GCase多肽的比活性。如果经修饰的GCase多肽具有野生型GCase多肽的至少20％(任选地，至少30％、至少40％、至少50％或至少75％)的比活性(使用相同方法测定的)，则其是有功能的。
优选地，本发明的经修饰的GCase多肽是经修饰的人GCase多肽。
本文提到的GCase多肽的“活性”(也称为“GCase活性”或“酶促活性”)是指在用于确定GCase多肽活性的功能性测定中观察到的活性。Gcase多肽的活性可使用诸如本文所述的显色测定或荧光测定来分析。例如，合适的荧光测定法如下。将GCase多肽与GCase的荧光底物4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUG)一起孵育。GCase水解4-MUG释放出荧光产物4-甲基伞形酮(4-MU)。产生的荧光产物的水平可以分别使用365nm和445nm的发射和激发波长来测量。任选地，基于4-MU(例如Sigma-Aldrich)标准曲线，将荧光水平转化为纳摩尔/小时/mL。任选地，基于VPRIV标准曲线，将荧光水平转化为mU/ml(例如血浆)或mU/mg(例如蛋白质)。任选地，将GCase多肽与4-MUG一起孵育30分钟。任选地，将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育。任选地，在pH 5.75下将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育30分钟。任选地，在不可逆GCase抑制剂(例如环己烯四醇β环氧化物(Conduritol B epoxide))存在和不存在的情况下，将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育1小时。例如，将一部分样品在不可逆GCase抑制剂(例如环己烯四醇β环氧化物)存在的情况下孵育，将一部分样品在不可逆GCase抑制剂(例如环己烯四醇β环氧化物)不存在的情况下孵育，比较结果以获得GCase的活性水平。任选地，在pH 5.6或pH 5.75下孵育GCase多肽。GCase多肽的活性可以根据实施例1中标题为“GCase活性测定”的部分中描述的方案或实施例13中标题为“方法”的部分中以“GCase活性测定”开始的段落中描述的方案来测量。
在一些实施方案中，在测量活性之前纯化GCase多肽。可使用本领域已知的技术，诸如柱色谱(例如亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱)、HPLC或者基于电荷或疏水性的分离来纯化蛋白质。例如，可使用琼脂糖柱(亲和色谱树脂)纯化蛋白质。例如，如实施例1中所述，可使用琼脂糖柱(亲和色谱树脂)纯化蛋白质。可通过对纯化的GCase多肽进行荧光测定(诸如本文所述的那些测定法)来测量GCase多肽活性。
本文提及的“有效活性”(也称为“有效GCase活性”)是指编码GCase多肽的GBA核苷酸序列在生物系统中表达后观察到的GCase多肽的活性。“有效活性”是GCase多肽的酶促效率和GCase多肽稳定性的函数。“有效活性”也可称为“总所得活性(total resultantactivity)”。在一些实施方案中，有效活性的增加是经修饰的GCase多肽稳定性增强的结果。在一些实施方案中，有效活性的增加是经修饰的GCase多肽的酶促效率增加的结果。在一些实施方案中，有效活性的增强是经修饰的GCase多肽的酶促效率和稳定性增强的结果。在一些实施方案中，通过产生包含含有与启动子可操作地连接的编码GCase多肽的GBA核苷酸序列的多核苷酸的AAV颗粒，用所述AAV颗粒转导细胞(诸如人细胞，任选地Huh-7细胞)，从细胞和/或培养基中收获GCase多肽，并任选地使用荧光测定法测量GCase多肽的活性，来测定GCase多肽的有效活性。任选地，将包含含有编码GCase多肽的GBA核苷酸序列的多核苷酸的AAV颗粒与Huh-7细胞一起孵育约16小时以允许转导，并从培养基中收获GCase多肽。任选地，AAV颗粒包含SEQ ID NO:37的衣壳。任选地，以5x103、1x104或5x104 vg/细胞的感染复数发生转导。收获的GCase多肽的活性可以根据本文所述的荧光测定方案来测量。例如，可将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育30分钟。任选地，在pH 5.75下将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育30分钟。任选地，在不可逆GCase抑制剂(例如环己烯四醇β环氧化物)存在和不存在的情况下，将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育1小时。例如，将一部分样品在不可逆GCase抑制剂(例如环己烯四醇β环氧化物)存在的情况下孵育，将一部分样品在不可逆GCase抑制剂(例如环己烯四醇β环氧化物)不存在的情况下孵育，比较结果以获得GCase的活性水平。任选地，在pH 5.6或pH 5.75下孵育GCase多肽。产生的荧光产物的水平可以分别使用365nm和445nm的发射和激发波长来测量。可基于4-甲基伞形酮(4-MU，例如Sigma-Aldrich)标准曲线，将荧光水平可以转换为纳摩尔/小时/mL。任选地，根据实施例1中标题为“GCase活性测定”的部分中描述的或实施例13中标题为“方法”的部分中以“GCase活性测定”开始的段落中描述的荧光测定方案，测量收获的GCase多肽的活性。任选地，将活性以载体基因组拷贝数作归一化。可测定(例如通过qPCR)转导后细胞中存在的载体基因组的数量并将其用于调节所测量的GCase多肽的活性。任选地，通过qPCR测定转导后细胞中存在的载体基因组的数量。任选地，使用与启动子结合(例如，与LSP-L启动子结合)的引物组，通过qPCR测定转导后细胞中存在的载体基因组的数量。任选地，根据实施例1中标题为“载体基因组拷贝数”的部分的第一段测定载体基因组拷贝数。任选地，使用实施例8中的方法测定GCase多肽的有效活性。
在一些实施方案中，通过产生包含多核苷酸的AAV颗粒，用所述AAV颗粒注射小鼠，并任选地使用荧光测定法测量小鼠血浆、白细胞和/或组织(诸如肝脏、脾脏、骨髓和/或肺)中的活性水平，来测定GCase多肽的有效活性，所述多核苷酸包含与启动子可操作地连接的编码GCase多肽的GBA核苷酸序列。任选地，可通过单次尾静脉注射，以例如2x109 vg/kg至2x1012 vg/kg的剂量将包含多核苷酸的AAV颗粒注射入小鼠，所述多核苷酸包含编码GCase多肽的GBA核苷酸序列。任选地，剂量选自2x109 vg/kg、2x1010 vg/kg、2x1011 vg/kg、6x1011vg/kg和2x1012 vg/kg。任选地，剂量为6x1010 vg/kg。任选地，AAV颗粒包含AAV8衣壳。血浆样品可在处理后14天(通过眶后放血)或处理后28天(通过眶后放血)获得。可在处理后4或6周宰杀动物，并收获血浆、白细胞和/或其它组织(例如肝脏、脾脏、骨髓和/或肺)。任选地，在处理后4周宰杀动物。可根据本文所述的荧光测定方案来测量所收获的血浆、白细胞和/或其它组织中GCase多肽的活性。例如，可将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育30分钟。任选地，在pH 5.75下将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育30分钟。任选地，在不可逆GCase抑制剂(例如环己烯四醇β环氧化物)存在和不存在的情况下，将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育1小时。例如，将一部分样品在不可逆GCase抑制剂(例如环己烯四醇β环氧化物)存在的情况下孵育，将一部分样品在不可逆GCase抑制剂不存在的情况下孵育，比较结果以获得GCase的活性水平。任选地，在pH 5.6或pH 5.75下孵育GCase多肽。产生的荧光产物的水平可以分别使用365nm和445nm的发射和激发波长来测量。可使用VPRIV标准曲线，以mU/ml血浆(对于血浆)或mU/mg蛋白质(对于组织和WBC)为单位表示血浆、组织和WBC中GCase多肽的活性。任选地，可使用4-MU标准曲线分别将血浆或组织的GCase活性计算为nmole/h/ml或nmole/h/mg。任选地，可根据实施例1中标题为“GCase活性测定”的部分中描述的或者实施例13中标题为“方法”的部分中以“GCase活性测定”开始的段落中描述的荧光测定方案，来测量所收获的血浆、白细胞和/或其它组织中GCase多肽的活性。任选地，活性以载体基因组拷贝数作归一化。可测定(例如通过qPCR)AAV颗粒注射后肝脏中存在的载体基因组的数量，并将其用于调节所测量的GCase多肽的活性。任选地，通过qPCR测定AAV颗粒注射后肝脏中存在的载体基因组的数量。任选地，使用与启动子结合的(例如，与LSP-L启动子结合的)引物组，通过qPCR测定AAV颗粒注射后肝脏中存在的载体基因组的数量。任选地，根据实施例1中标题为“载体基因组拷贝数”一节的第二段测定载体基因组拷贝数。任选地，使用实施例9中的方法测定GCase多肽的有效活性。
本发明提供了包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽。所述至少一个突变可以：
(i)提供更高的有效活性；和/或
(ii)提供增强的稳定性；和/或
(iii)提供生理pH下的结构稳定性；和/或
(iv)提供更长的半衰期；和/或
(v)提供增强的热稳定性。
在一些实施方案中，所述至少一个突变提供更高的有效活性。本文公开了提供更高的有效活性的示例性突变。提及“至少一个突变提供更高的有效活性”，是指包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相较于参考GCase多肽具有更高的有效活性，所述参考GCase多肽不包含所述至少一个突变但在其它方面与包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相同。例如，如果所述至少一个突变提供更高的有效活性，并且包含该至少一个突变的经修饰的GCase多肽除了其包含所述至少一个突变(例如，突变W351C和A380C)外在其它方面与野生型GCase多肽相同，则包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相较于野生型GCase多肽具有更高的有效活性。在一些实施方案中，如果除了所述至少一个突变外与SEQ ID NO:1相同的“测试”多肽与SEQ ID NO:1的多肽相比具有更高的有效活性，则所述至少一个突变“提供更高的有效活性”，任选地，其中“测试”多肽和SEQ ID NO:1是通过在同一细胞系中表达产生的。包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相较于野生型GCase多肽不一定具有更高的有效活性。例如，设想包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽可包含降低该多肽的有效活性的一个或多个另外的修饰(诸如缺失部分)。在这种情况下，本文公开的所述至少一个突变可用于为经修饰的GCase多肽提供更高的有效活性，使得经修饰的GCase多肽可能不具有与野生型GCase多肽相同的有效活性，但仍然相较于参考GCase多肽具有更高的有效活性，所述参考GCase多肽在其它方面与经修饰的GCase多肽相同，但缺少所述至少一个突变。或者，所述至少一个突变可提供增强的有效活性，这将经修饰的GCase多肽的有效活性恢复到野生型GCase多肽的有效活性水平。
在一些实施方案中，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽具有更高的有效活性。在一些实施方案中，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽相对于本文所述的参考GCase多肽具有更高的有效活性。例如，参考GCase多肽可以是野生型GCase多肽。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:3的多肽。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:4或5的多肽。在一些实施方案中，将经修饰的GCase的有效活性与参考GCase多肽的有效活性进行比较。本文公开了增强经修饰的GCase多肽的有效活性的示例性突变。
“参考GCase多肽”是不包含本发明的经修饰的GCase多肽的所述至少一个突变的GCase多肽。任选地，参考GCase多肽不包含所述至少一个突变，但在其它方面与本发明的经修饰的GCase多肽相同。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:1-5中任一个的多肽。参考GCase多肽可以是野生型GCase多肽。参考GCase多肽可以是任何野生型GCase多肽。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:1-3中任一个的多肽。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:1的多肽。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的多肽。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:3的多肽。任选地，参考GCase多肽不是野生型GCase多肽，并且不包含所述至少一个突变。任选地，参考GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置184的位置处包含至亮氨酸的突变(任选为H184L)。任选地，参考GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置184的位置处包含至亮氨酸的突变(任选为H184L)，并且参考GCase多肽还包含在对应于SEQ ID NO:1的位置360的位置处包含至天冬酰胺的突变(任选为K360N)。任选地，参考GCase多肽包含H184L和K360N。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:4或5的多肽。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ IDNO:41或44的多肽。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:43或46的多肽。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:42或45的多肽。
在一些实施方案中，参考GCase多肽可以是野生型GCase多肽，诸如VPRIV。任选地，在无菌或无核酸酶的水中复原VPRIV。在一些实施方案中，参考GCase多肽可以是伊米苷酶。在一些实施方案中，参考GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置534的位置处包含至组氨酸的突变，任选为R534H。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含或者是SEQ ID NO:1或2的序列，不同之处在于在对应于SEQ ID NO:1的位置534的位置处突变成组氨酸。
为了确定经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽(如本文所述，诸如野生型GCase多肽)是否具有更高的有效活性，使用相同的方法测定经修饰的GCase多肽和参考GCase多肽的有效活性，并比较结果。该方法可以是本文所述的用于测定有效活性的任何方法。
本发明的经修饰的GCase多肽可具有参考GCase多肽(诸如野生型GCase多肽)的有效活性的至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍高的有效活性。经修饰的GCase多肽可具有参考GCase多肽(诸如野生型GCase多肽)的有效活性的至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍或至少50倍高的有效活性。经修饰的GCase多肽可具有参考GCase多肽(诸如野生型GCase多肽)的有效活性至少5倍、至少10倍、至少25倍或至少50倍高的有效活性。经修饰的GCase多肽可具有参考GCase多肽(诸如野生型GCase多肽)的有效活性的1.2倍至3倍、1.2倍至5倍、3倍至6倍、5倍至10倍、1.5倍至8倍、2倍至10倍、3倍至15倍、6倍至15倍、10倍至15倍、15倍至20倍、10倍至30倍、20倍至30倍、25倍至30倍、25倍至40倍或30倍至50倍高的有效活性。经修饰的GCase多肽可具有参考GCase多肽(诸如野生型GCase多肽)的有效活性的2至100倍、10至100倍、10至80倍、25至100倍或25至80倍高的有效活性。当提到活性的倍数变化时，术语“介于......之间”/“……至……”包括指定的值。因此，例如，“1.5倍至8倍”包括值1.5倍和8倍。
在一些实施方案中，所述至少一个突变提供了增强的稳定性(也称为更高的稳定性)。本文公开了提供增强的稳定性的示例性突变。提及“至少一个突变提供增强的稳定性”，是指包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相较于参考GCase多肽具有更高的稳定性，所述参考GCase多肽不包含所述至少一个突变但在其它方面与包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相同。例如，如果所述至少一个突变提供增强的稳定性，并且包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽除了其包含所述至少一个突变(例如突变W351C和A380C)外在其它方面与野生型GCase多肽相同，则包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相较于野生型GCase多肽具有更高的稳定性。在一些实施方案中，如果除了所述至少一个突变外与SEQ ID NO:1相同的“测试”多肽与SEQ ID NO:1的多肽相比具有更高的稳定性，则所述至少一个突变“提供增强的稳定性”，任选地，其中“测试”多肽和SEQ ID NO:1是通过在同一细胞系中表达产生的。包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相较于野生型GCase多肽具有更高的稳定性。例如，设想包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽可包含降低多肽稳定性的一个或多个另外的修饰(如缺失部分)。在这种情况下，本文公开的所述至少一个突变可用于为经修饰的GCase多肽提供更高的稳定性，使得经修饰的GCase多肽可能不具有与野生型GCase多肽相同的稳定性，但仍然相较于参考GCase多肽具有更高的稳定性，所述参考GCase多肽在其它方面与经修饰的GCase多肽相同，但缺少所述至少一个突变。或者，所述至少一个突变可提供增强的稳定性，这将经修饰的GCase多肽的稳定性恢复到野生型GCase多肽的稳定性水平。
在一些实施方案中，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性。在一些实施方案中，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽相对于本文所述的参考GCase多肽具有增强的稳定性。在一些实施方案中，由所述至少一个突变提供的增强的稳定性或包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽的增强的稳定性是在pH 7.4下的增强的稳定性。在一些实施方案中，所述增强的稳定性是在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量的。在一些实施方案中，由所述至少一个突变提供的增强的稳定性或包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽的增强的稳定性是在pH 5.6下的增强的稳定性。在一些实施方案中，所述增强的稳定性是在pH 5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量的。在一些实施方案中，增强的稳定性是相对于本文所述的参考GCase多肽而言增强的稳定性。例如，参考GCase多肽可以是野生型GCase多肽。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:3的多肽。参考GCase多肽可以是SEQ IDNO:4或5的多肽。任选地，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽具有增强的稳定性。任选地，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽具有增强的稳定性，并且所述增强的稳定性是在pH 7.4下增强的稳定性。在一些实施方案中，将经修饰的GCase的稳定性与参考GCase多肽的稳定性进行比较。本文公开了增强经修饰的GCase多肽稳定性的示例性突变。例如，使得能够形成二硫桥的突变。
相对于参考GCase多肽具有增强的稳定性的经修饰的GCase多肽随着时间的推移，与参照GCase多肽相比保留了更高比例的GCase活性。在一些实施方案中，通过测量GCase多肽的残留酶促活性来测定GCase多肽的稳定性。本文提及“残留酶促活性”(也称为“残留GCase活性”或“残留活性”)是指在特定的时间段过去后仍保留的GCase多肽的活性。在一个或多个特定时间段过去后，可测量样品中GCase的残留酶活性。任选地，通过用包含编码GCase多肽的核苷酸序列的表达载体转染宿主细胞(例如Expi293F细胞)并从培养基中收获GCase多肽来获得样品。任选地，转染后4天从培养基中收获GCase多肽。任选地，根据实施例1中标题为“Expi293F细胞的扩增”、“Expi293F细胞转染的前一天”、“Expi293F细胞的转染”和“转染的Expi293F细胞的收获”部分中描述的方法获得样品。可将含有GCase多肽的样品转移到基质(诸如pH 5.6的AB缓冲液、pH 7.4的PBS、血清或血浆)中并孵育。可选择基质的pH值，以便测定在该特定pH值下的残留活性(或稳定性)。可选择培养的温度，以便测定在该特定温度下的残留活性(或稳定性)。除了在初始时间点获取等份试样之外，还可以在一系列时间点(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个或更多个时间点)获取含有GCase多肽的孵育样品的等份试样，并且可测定每个等份试样中的GCase活性。初始时间点(即0分钟或0小时)是将样品转移到基质中进行孵育时的时间。通过将给定时间点的GCase活性与初始时间点的GCase活性进行比较能够测定给定时间点的残留GCase活性。可在0分钟、30分钟、60分钟、120分钟、3天、4天、5天、6天和/或7天取出含有GCase多肽的样品的等分试样。任选地，将样品在pH 7.4的PBS中孵育120分钟。任选地，将样品在pH 7.4的PBS中孵育72小时。任选地，将样品在pH 7.4的PBS中孵育7天。任选地，将样品在pH 5.6的AB缓冲液中孵育72小时。任选地，根据实施例1中标题为“稳定性评估”的部分，测量样品中的残留酶促活性。等分试样中的GCase多肽活性可根据本文所述的荧光测定方案来测量。例如，可将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育30分钟。任选地，在pH 5.75下将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育30分钟。任选地，在不可逆GCase抑制剂(例如环己烯四醇β环氧化物)存在和不存在的情况下，将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育1小时。例如，将一部分样品在不可逆GCase抑制剂(例如环己烯四醇β环氧化物)存在的情况下孵育，将一部分样品在不可逆GCase抑制剂不存在的情况下孵育，比较结果以获得GCase的活性水平。任选地，在pH 5.6或pH 5.75下孵育GCase多肽。产生的荧光产物的水平可以分别使用365nm和445nm的发射和激发波长来测量。任选地，等分试样中的GCase多肽活性可以根据实施例1中标题为“GCase活性测定”的部分中描述的或者实施例13中标题为“方法”的部分中以“GCase活性测定”开始的段落中描述的荧光测定方案来测量。可将给定时间点的GCase活性与样品的初始GCase活性(即，也通过测定初始时间点的GCase活性)进行比较，并且可将残留GCase活性计算为占初始GCase活性的百分比。因此，相对于参考GCase多肽具有增强的稳定性的经修饰GCase多肽可相较于参考GCase多肽具有更高的残留活性(即，作为初始GCase多肽活性的百分比)。任选地，参考GCase多肽可以是诸如VPRIV等野生型GCase多肽。任选地，在无核酸酶水或无菌水中复原VPRIV。任选地，使用实施例3的方法测定GCase多肽的残留酶促活性。任选地，使用实施例4的方法测定GCase多肽的残留酶促活性。
任选地，可在每个时间点测定比活性。“比活性”是指每单位GCase多肽的活性，使得该活性经“归一化”以考虑样品中GCase多肽的量或浓度。这可通过测量(例如通过使用标准ELISA测定法)样品中GCase多肽的浓度，并将活性除以GCase浓度来完成。荧光测定法可用于测量“比活性”。荧光测定法可以是本文所述的任一种荧光测定法。
在ELISA测定法的实例中，可将与GCase多肽结合的抗体结合到平板上。可将包含未知浓度的GCase多肽的样品通过平板。可将与GCase多肽结合的第二检测抗体施加到板上，并洗掉任何多余的抗体。残留的(即未被洗掉的)检测抗体将与GCase多肽结合。可将检测抗体与诸如辣根过氧化物酶等酶连接。可通过测量检测抗体的量来测量与平板上的GCase多肽结合的检测抗体的水平。例如，如果检测抗体与辣根过氧化物酶连接，辣根过氧化物酶可以催化从底物诸如TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)产生蓝色反应产物，并且蓝色产物的水平可通过450nm处的吸光度来检测。蓝色产物的水平与洗涤步骤后残留的检测抗体的量成比例，所述检测抗体的量与样品中GCase多肽的量成比例。或者，例如当使用纯化的蛋白质时，GCase多肽的量或浓度可用分光光度法来测定。
在一些实施方案中，通过测定GCase多肽的半衰期来测定GCase多肽的稳定性。半衰期可以如本文所述来确定。
为了确定经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽(如本文所述，诸如野生型GCase多肽)是否具有增强的稳定性，使用相同的方法测定经修饰的GCase多肽和参考GCase多肽的稳定性，并比较结果。该方法可以是本文所述的用于测定稳定性的任何方法。
可在孵育至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时，至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天后测定经修饰的GCase多肽的稳定性或残留活性。任选地，可在孵育至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时，至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天后观察经修饰的GCase多肽的增强的稳定性或增强的残留活性。
经修饰的GCase多肽的残留活性可以表示为初始GCase活性的百分比。在本文中，当提到经修饰的GCase多肽在特定时间点“保留”至少X％的活性(例如，X可以是30)时，这应解释为意指经修饰的GCase多肽在该特定时间点具有至少X％的残留活性(例如，具有至少30％的残留活性)。当如本文所述进行测量时(例如，当随时间推移测量活性并将给定时间点的活性与样品的初始GCase活性进行比较时)，经修饰的GCase多肽可保留至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的活性。可在pH 5.6下孵育后测量活性。当在pH5.6和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的活性。当在pH 5.6和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少80％或至少85％的活性。当在pH 5.6和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少90％或至少95％的活性。当在pH 5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少60％的活性。当在pH 5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少80％的活性。当在pH 5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少85％的活性。当在pH 5.6和37摄氏度下孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少40％的活性。当在pH 5.6和37摄氏度下孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少60％的活性。当在pH 5.6和37摄氏度下孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少80％的活性。可在pH 7.4下孵育后测量活性。可在37摄氏度孵育后测量活性。可在pH7.4和37摄氏度下孵育后测量活性。孵育可在PBS中进行。孵育可在血清或血浆中进行。当在pH 7.4and 37摄氏度下孵育至少10分钟、至少30分钟、至少60分钟、至少120分钟、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的活性。在一些实施方案中，经修饰的GCase多肽保留的活性是在相同条件下测量(例如，经修饰的GCase多肽和参考(例如野生型)GCase的活性均在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量)的参考GCase多肽诸如野生型GCase多肽)的活性的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍或至少3倍高。提及“相同条件”表示包括鉴于实验公差(experimentaltolerances)可接受的任何变化。经修饰的GCase多肽可保留在相同条件下测量的参考GCase多肽的活性的至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍或至少90倍高的活性。当在pH7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留参考GCase多肽的活性至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少2.5倍、至少2.8倍或至少3倍高的活性。当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留参考GCase多肽的活性1.1倍至10倍、2倍至8倍或2倍至5倍高的活性。当在pH7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的活性。当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的活性。当在pH 7.4和37摄氏度下孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍或至少90倍的活性。当在pH 7.4和37摄氏度下孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性1.1倍至150倍、2倍至120倍或2倍至100倍的活性。当在pH 7.4和37摄氏度下孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的活性。当在pH 7.4和37摄氏度下孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少60％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的活性。当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍或至少90倍的活性。当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性1.1倍至150倍、2倍至120倍或2倍至100倍的活性。当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少15％的活性。当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少20％的活性。当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少40％的活性。孵育可在血清或血浆中进行。孵育可在PBS中进行。当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少60％的活性。当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少80％的活性。可在人血浆中孵育后测量活性。当在人血浆中于37摄氏度孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍的活性。当在人血浆中于37摄氏度孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性1.1倍至10倍、2倍至8倍或4倍至8倍的活性。当在人血浆中于37摄氏度孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％的活性。当在人血浆中于37摄氏度孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或至少50倍的活性。当在人血浆中于37摄氏度孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留参考GCase多肽的活性10倍至100倍、20倍至100倍或20倍至80倍高的活性。当在人血浆中于37摄氏度孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的活性。当在人血浆中于37摄氏度下孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留参考GCase多肽的活性的至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或至少50倍高的活性。当在人血浆中于37摄氏度孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留参考GCase多肽的活性的10倍至100倍、20倍至100倍或20倍至80倍高的活性。
当在人血浆中于37摄氏度孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少20％的活性。当在人血浆中于37摄氏度孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少30％的活性。当在人血浆中于37摄氏度孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少40％的活性。可在人血清中孵育后测量活性。当在人血清中于37摄氏度孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.8倍或至少2倍的活性。当在人血清中于37摄氏度孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性1.1倍至10倍、1.1倍至8倍或1.1倍至5倍的活性。当在人血清中于37摄氏度孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％的活性。当在人血清中于37摄氏度孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍或至少40倍的活性。当在人血清中于37摄氏度孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性1.1倍至100倍、2倍至80倍或5倍至80倍的活性。当在人血清中于37摄氏度孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少2％、至少5％、至少20％、至少30％或至少40％的活性。当在人血清中于37摄氏度孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少10倍、至少20倍、至少30倍或至少40倍的活性。当在人血清中于37摄氏度孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性10倍至100倍、20倍至100倍或20倍至80倍的活性。当在人血清中于37摄氏度孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少20％的活性。当在人血清中于37摄氏度孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少30％的活性。当在人血清中于37摄氏度孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少40％的活性。
当在pH 7.4(任选地在PBS中)和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少1.5倍、至少1.7倍或至少1.8倍的活性，其中参考GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置184的位置处包含组氨酸至亮氨酸的取代。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:4。当在pH 7.4(任选地在PBS中)和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少1.1倍或至少1.2倍的活性，其中参考GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置184的位置处包含组氨酸至亮氨酸的取代以及在对应于SEQ ID NO:1的位置360的位置处包含赖氨酸至天冬酰胺的取代。任选地，参考GCase多肽为SEQ ID NO:5。当在pH 7.4(任选地在PBS中)和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为SEQ ID NO:3的参考GCase多肽的活性至少1.5倍或至少1.7倍的活性。当在pH 7.4(任选地在PBS中)和37摄氏度下孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍或至少90倍的活性，其中参考GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置184的位置处包含组氨酸至亮氨酸的取代。任选地，参考GCase多肽为SEQ ID NO:4。当在pH 7.4(任选地在PBS中)和37摄氏度下孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍或至少90倍的活性，其中参考GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置184的位置处包含组氨酸至亮氨酸的取代以及在对应于SEQ ID NO:1的位置360的位置处包含赖氨酸至天冬氨酰胺的取代。任选地，参考GCase多肽为SEQ ID NO:5。当在pH 7.4(任选地在PBS中)和37摄氏度下孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为SEQ ID NO:3的参考GCase多肽的活性至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍或至少90倍的活性。当在pH 7.4(任选地在PBS中)和37摄氏度下孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少1.1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少5倍或至少10倍的活性，其中参考GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置184的位置处包含组氨酸至亮氨酸的取代。任选地，参考GCase多肽为SEQ ID NO:4。当在pH 7.4(任选地在PBS中)和37摄氏度下孵育7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少1.1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少5倍或至少10倍的活性，其中参考GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置184的位置处包含组氨酸至亮氨酸的取代以及在对应于SEQ ID NO:1的位置360的位置处包含赖氨酸至天冬氨酰胺的取代。任选地，参考GCase多肽为SEQ ID NO:5。当在pH 7.4(任选地在PBS中)和37摄氏度下培养7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为SEQ ID NO:3的参考GCase多肽的活性至少1.1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少5倍或至少10倍的活性。当在人血浆中于37摄氏度孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为SEQ ID NO:3的参考GCase多肽的活性至少3倍、至少4倍或至少5倍的活性。当在人血清中于37摄氏度孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为SEQ ID NO:3的参考GCase多肽的活性至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.8倍或至少2倍的活性。
当在pH 5.6和37摄氏度下孵育至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天后测量时，经修饰的GCase多肽可保留至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的活性。任选地，当在pH 7.4的PBS中于37摄氏度孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽保留至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％的活性。任选地，当在pH 7.4的PBS中于37摄氏度孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽保留至少50％的活性。当在pH 5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍或至少50倍的活性。例如，当在pH 5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留为参考GCase多肽的活性至少30倍的活性。当在pH7.4的PBS中于37摄氏度孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍或至少50倍的活性。例如，当在pH 7.4的PBS中于37摄氏度孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽可保留高为参考GCase多肽的活性至少30倍的活性。任选地，当在pH 5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，经修饰的GCase多肽保留至少80％的活性。
在一些实施方案中，所述至少一个突变在生理pH(例如pH 7.4)下提供结构稳定性。本文公开了提供结构稳定性的示例性突变。提及“至少一个突变在生理pH下提供结构稳定性”，是指包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽在生理pH下与参考GCase多肽相比在结构上更稳定，所述参考GCase多肽不包含所述至少一个突变但在其它方面与包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相同。例如，如果所述至少一个突变在生理pH下提供结构稳定性，并且包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽除了其包含所述至少一个突变(例如突变W351C和A380C)外在其它方面与野生型GCase多肽相同，则包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽在生理pH下与野生型GCase多肽相比在结构上更稳定性。在一些实施方案中，如果除了所述至少一个突变外与SEQ ID NO:1相同的“测试”多肽与SEQ IDNO:1的多肽相比在生理pH下具有更强的结构稳定性，则所述至少一个突变“在生理pH下提供结构稳定性”，任选地，其中“测试”多肽和SEQ ID NO:1是通过在同一细胞系中表达产生的。包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽在生理pH下不一定比野生型GCase多肽在结构上更稳定。例如，设想包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽可包含一个或多个另外的修饰(诸如缺失部分)，其降低多肽在生理pH下的结构稳定性。在这种情况下，本文公开的所述至少一个突变可用于为经修饰的GCase多肽提供生理pH下更高的结构稳定性，使得经修饰的GCase多肽在生理pH下可不具有与野生型GCase多肽相同的结构稳定性，但仍然相较于参考GCase多肽在生理pH下具有更高的结构稳定性，所述参考GCase多肽在其它方面与经修饰的GCase多肽相同但缺少所述至少一个突变。或者，所述至少一个突变可提供生理pH下的结构稳定性，这将经修饰的GCase多肽在生理pH下的结构稳定性恢复到野生型GCase多肽的结构稳定性水平。
在一些实施方案中，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽在生理pH(例如，pH7.4)下在结构上更稳定。
在一些实施方案中，所述至少一个突变在pH 7.4下提供结构稳定性。在一些实施方案中，包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽在pH 7.4下在结构上更稳定。在一些实施方案中，包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽在生理pH(例如，pH 7.4)下相对于本文所述的参考GCase多肽在结构上更稳定。例如，参考GCase多肽可以是野生型GCase多肽。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:3的多肽。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:4或5的多肽。任选地，相对于参考GCase多肽，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽在生理pH下结构更稳定。任选地，包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽在pH 7.4下相对于参考GCase多肽在结构上更稳定。在一些实施方案中，将经修饰的GCase在生理pH下的结构稳定性与参考GCase多肽在生理pH下的结构稳定性进行比较。本文公开了提供包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽在生理pH下的结构稳定性的示例性突变。例如，使得能够形成二硫桥的突变。
GCase多肽在pH 7.4下的结构稳定性可使用本文所述的用于测定GCase多肽的稳定性或半衰期的任一种方法来测定。在此类方法中，含有GCase多肽的样品的任何孵育将在生理pH(例如pH 7.4)下进行。
为了确定经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽(如本文所述，诸如野生型GCase多肽)是否在生理pH下更具结构稳定性，使用相同的方法测定经修饰的GCase多肽和参考GCase多肽在生理pH下的结构稳定性，并比较结果。该方法可以是本文所述的用于测定稳定性或半衰期的任何方法。
多肽的稳定性或结构稳定性通常由氨基酸侧链之间的相互作用和/或一个或多个氨基酸侧链与蛋白质主链之间的相互作用介导。相互作用可以是非共价相互作用。或者，可以形成共价键(例如二硫键)因此，GCase多肽可通过稳定氨基酸侧链之间和/或氨基酸侧链与GCase多肽的蛋白质主链之间的相互作用的氨基酸取代(取代突变)来稳定(例如，相对于参考GCase多肽)。例如，在对应于经修饰的GCase多肽中SEQ ID NO:1的位置351和380的位置处的半胱氨酸之间形成的二硫键可提供增强的稳定性或结构稳定性。在对应于SEQ IDNO:1的位置351和380的位置处的半胱氨酸之间形成二硫键的经修饰的GCase多肽，相对于参考GCase多肽可具有增强的稳定性或结构稳定性。
在一些实施方案中，所述至少一个突变提供了更长的半衰期。本文公开了提供更长半衰期的示例性突变。提及“至少一个突变提供更长的半衰期”，是指包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽相较于参考GCase多肽具有更长的半衰期，所述参考GCase多肽不包含所述至少一个突变但在其它方面与包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相同。例如，如果所述至少一个突变提供了更长的半衰期，并且包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽除了其包含所述至少一个突变(例如突变W351C和A380C)外在其它方面与野生型GCase多肽相同，则包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相较于野生型GCase多肽具有更长的半衰期。在一些实施方案中，如果除了所述至少一个突变外与SEQ ID NO:1相同的“测试”多肽与SEQ ID NO:1的多肽相比具有更长的半衰期，则所述至少一个突变“提供更长的半衰期”，任选地，其中“测试”多肽和SEQ ID NO:1是通过在同一细胞系中表达产生的。包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相较于野生型GCase多肽不一定具有更长的半衰期。例如，设想包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽可包含缩短多肽半衰期的一个或多个另外的修饰(诸如缺失部分)。在这种情况下，本文公开的所述至少一个突变可用于为经修饰的GCase多肽提供更长的半衰期，使得经修饰的GCase多肽可不具有与野生型GCase多肽相同的半衰期，但仍具有比参考GCase多肽更长的半衰期，所述参考GCase多肽在其它方面与经修饰的GCase多肽相同，但缺少所述至少一个突变。或者，所述至少一个突变可提供更长的半衰期，这将经修饰的GCase多肽的半衰期恢复至野生型GCase多肽的典型半衰期。
在一些实施方案中，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽具有更长的半衰期。在一些实施方案中，所述经修饰的GCase多肽相对于本文所述的参考GCase多肽具有更长的半衰期。例如，参考GCase多肽可以是野生型GCase多肽。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:3的多肽。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:4或5的多肽。在一些实施方案中，将包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽的半衰期与参考GCase多肽的半衰期进行比较。本文公开了延长包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽的半衰期的示例性突变。在一些实施方案中，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽的稳定性或结构稳定性可通过测定半衰期来测定。
任选地，经修饰的GCase多肽可具有长为参考GCase多肽的半衰期至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍的半衰期。换句话说，经修饰的GCase多肽可具有长为参考GCase多肽的半衰期至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍的更长的半衰期。任选地，经修饰的GCase多肽可具有长为参考GCase多肽的半衰期1.2倍至30倍或1.2倍至25倍的半衰期。换句话说，经修饰的GCase多肽可具有长为参考GCase多肽的半衰期1.2倍至30倍或1.2倍至25倍的半衰期。任选地，经修饰的GCase多肽可具有长为参考GCase多肽的半衰期1.2倍至20倍、1.2倍至15倍或2倍至15倍的半衰期。换句话说，经修饰的GCase多肽可具有长为参考GCase多肽的半衰期1.2倍至20倍、1.2倍至15倍或2倍至15倍的半衰期。更长的半衰期可以是在生理pH(诸如pH 7.4)下的更长半衰期。任选地，可在pH 5.6或pH 7.4下测量半衰期。更长的半衰期可以是在pH 7.4下的更长半衰期。例如，经修饰的GCase多肽在pH 7.4下可具有长为参考GCase多肽的半衰期至少1.8倍的半衰期。较长的半衰期可以是在溶酶体pH下的较长半衰期。更长的半衰期可以是在pH 5.6下的更长半衰期。例如，经修饰的GCase多肽在pH 5.6下可具有长为参考GCase多肽的半衰期至少20倍的半衰期。任选地，可以在合适的基质例如血清(例如人或小鼠)或血浆(例如人或小鼠)中测量半衰期。更长的半衰期可以是在血清或血浆中更长的半衰期。优选地，当在血清(例如人)中测量半衰期时，半衰期长为参考GCase多肽的半衰期至少5倍。可使用荧光测定法来测量半衰期。半衰期可通过本领域任何已知的方法来测定。半衰期可通过在一系列特定时间段过去后测量样品中残留的酶促活性来测定。任选地，通过用包含编码GCase多肽的核苷酸序列的表达载体转染宿主细胞(例如Expi293F细胞)并从培养基中收获GCase多肽来获得样品。任选地，转染后4天从培养基中收获GCase多肽。任选地，根据实施例1中标题为“Expi293F细胞的扩增”、“Expi293F细胞转染的前一天”、“Expi293F细胞的转染”和“转染的Expi293F细胞的收获”部分中描述的方法获得样品。可将含有GCase多肽的样品转移到基质(诸如pH 5.6的AB缓冲液、pH 7.4的PBS、血清或血浆)中并孵育。可选择基质的pH值，以便测定在该特定pH值下的半衰期。可选择孵育的温度，以便测定在该特定温度下的半衰期。孵育可以在37℃进行。可在合适的时间点(诸如0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、24小时、48小时、120小时和144小时)取出含有GCase多肽的孵育样品的等分试样。初始时间点(即0分钟或0小时)是将样品转移到基质中进行孵育时的时间。将给定时间点的GCase活性与初始时间点的GCase活性进行比较，允许测定给定时间点的残留GCase活性。任选地，根据实施例1中标题为“稳定性评估”的部分，在时间点0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、24小时、48小时、120小时和144小时测量样品中的残留酶促活性。等分试样中的GCase多肽活性可根据本文所述的荧光测定方案来测量。例如，可将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育30分钟。任选地，在不可逆GCase抑制剂(例如环己烯四醇β环氧化物)存在和不存在的情况下，将GCase多肽与4-MUG一起在37℃孵育1小时。例如，将一部分样品在不可逆GCase抑制剂(例如环己烯四醇β环氧化物)存在的情况下孵育，将一部分样品在不可逆GCase抑制剂不存在的情况下孵育，比较结果以获得GCase的活性水平。任选地，在pH 5.6或pH 5.75下孵育GCase多肽。产生的荧光产物的水平可以分别使用365nm和445nm的发射和激发波长来测量。任选地，等分试样中的GCase多肽活性可以根据实施例1中标题为“GCase活性测定”的部分中描述的或者实施例13中标题为“方法”的部分中以“GCase活性测定”开始的段落中描述的荧光测定方案来测量。所述值可应用于单相衰变模型(one-phase decay model)，诸如实施例5中概述的模型。任选地，可在确定半衰期之前纯化GCase多肽。可如本文所述，例如根据实施例1中标题为“GCase蛋白质纯化”的部分纯化Gcase多肽。任选地，使用实施例5的方法测定GCase多肽的半衰期。
为了确定经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽(如本文所述，诸如野生型GCase多肽)是否具有更长的半衰期，使用相同的方法测定经修饰的GCase多肽和参考GCase多肽的半衰期，并比较结果。该方法可以是本文所述的用于测定半衰期的任何方法。
可在pH 5、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH 5.4、pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7、pH 5.8、pH5.9、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9或pH 8、或pH5至pH 6、pH 5.3至pH 5.7、pH 5.6至pH 5.8、pH 6.8至pH 7.8、pH 7至pH 7.6、pH 7.2至pH7.5或pH 7.3至pH 7.8下测定经修饰的GCase多肽的有效活性、稳定性、残留活性或半衰期。任选地，pH是溶酶体pH(诸如pH 5.6)或生理pH(诸如pH 7.4)。任选地，pH为pH 7.35至pH7.45。优选地，pH是生理pH，诸如pH 7.4。任选地，经修饰的GCase多肽的更高有效活性、增强的稳定性、更高的残留活性或更长的半衰期分别指在pH 5、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH5.4、pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7、pH 5.8、pH 5.9、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9或pH 8、或pH 5至pH 6、pH 5.3至pH 5.7、pH 5.6至pH 5.8、pH6.8至pH 7.8、pH 7至pH 7.6、pH 7.2至pH 7.5或pH 7.3至pH 7.8下的更高有效活性、增强的稳定性、更高的残留活性或更长的半衰期。任选地，pH是溶酶体pH(诸如pH 5.6)或生理pH(诸如pH 7.4)。任选地，pH为pH 7.35至pH 7.45。优选地，pH是生理pH，诸如pH 7.4。
可在18℃(摄氏度)、20℃、25℃、30℃、35℃或37℃下测定经修饰的GCase多肽的有效活性、稳定性、残留活性或半衰期。优选地，在37℃下测定经修饰的GCase多肽的有效活性、稳定性、残留活性或半衰期。任选地，经修饰的GCase多肽的更高的有效活性、增强的稳定性、增强的残留活性或更长的半衰期分别指18℃(摄氏度)、20℃、25℃、30℃、35℃或37℃下的更高的有效活性、增强的稳定性、增强的残留活性或更长的半衰期。优选地，更高的有效活性、增强的稳定性、增强的残留活性或更长的半衰期分别是37℃下更高的有效活性、增强的稳定性、增强的残留活性或更长的半衰期。
经修饰的GCase多肽在液体中(即，当在溶液中时)可具有增强的稳定性。任选地，GCase多肽在液体中具有更长的半衰期。任选地，液体是条件培养基，诸如在其中培养表达GCase多肽的宿主细胞的条件培养基。任选地，液体是生物样品。生物样品可以是血液、血清或血浆。任选地，经修饰的GCase多肽在血浆中具有更高的稳定性。任选地，经修饰的GCase多肽在血浆中具有更长的半衰期。
在一些实施方案中，所述至少一个突变提供增强的热稳定性。本文公开了提供增强的热稳定性的示例性突变。提及“至少一个突变提供增强的热稳定性”，是指包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽与参考GCase多肽相比具有增强的热稳定性，所述参考GCase多肽不包含所述至少一个突变但在其它方面与包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相同。例如，如果所述至少一个突变提供增强的热稳定性，并且包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽除了其包含至少一个突变(例如突变W351C和A380C)外在其它方面与野生型GCase多肽相同，则包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽与野生型GCase多肽相比具有增强的热稳定性。在一些实施方案中，如果除了所述至少一个突变外与SEQ ID NO:1的多肽相同的“测试”多肽与SEQ ID NO:1的多肽相比具有增强的热稳定性，则所述至少一个突变“提供增强的热稳定性”，任选地，其中“测试”多肽和SEQ ID NO:1是通过在同一细胞系中表达产生的。与野生型GCase多肽相比，包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽不一定具有增强的热稳定性。例如，设想包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽可包降低多肽的热稳定性的含一个或多个另外的修饰(诸如缺失部分)。在这种情况下，本文公开的所述至少一个突变可用于为经修饰的GCase多肽提供增强的热稳定性，使得经修饰的GCase多肽可不具有与野生型GCase多肽相同的热稳定性，但仍具有比参考GCase多肽更高的热稳定性，所述参考GCase多肽在其它方面与经修饰的GCase多肽相同，但缺少所述至少一个突变。或者，所述至少一个突变可提供增强的热稳定性，这将经修饰的GCase多肽的热稳定性恢复到野生型GCase多肽的典型热稳定性。
热稳定性可通过确定解链温度(也称为中间变性温度或一半多肽变性时的温度)来测量。具有较高解链温度的多肽比具有较低解链温度的多肽更加热稳定，因此在一些实施方案中，如果除了至少一个突变外与SEQ ID NO:1相同的“测试”多肽与SEQ ID NO:1的多肽相比具有更高的解链温度，则所述至少一个突变“提供增强的热稳定性”，任选地，其中“测试”多肽和SEQ ID NO:1是通过在同一细胞系中表达产生的。在一些实施方案中，经修饰的GCase多肽在pH 5.75下具有至少55摄氏度、至少56摄氏度或至少57摄氏度的解链温度。任选地，经修饰的GCase多肽在pH 5.75下具有至少53摄氏度或至少54摄氏度的解链温度。任选地，经修饰的GCase多肽在pH 7下具有至少52摄氏度、至少53摄氏度或至少53.5摄氏度的解链温度。
在一些实施方案中，经修饰的GCase多肽相对于本文所述的参考GCase多肽具有增强的热稳定性。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:3的多肽。参考GCase多肽可以是SEQ IDNO:4或5的多肽。在一些实施方案中，将包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽的热稳定性与参考GCase多肽的热稳定性进行比较。本文公开了增强包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽的热稳定性的示例性突变。
任选地，在pH 5.75下，经修饰的GCase多肽的解链温度相对于参考GCase多肽高至少1摄氏度、至少2摄氏度、至少3摄氏度、至少4摄氏度、至少5摄氏度或至少5.4摄氏度。任选地，在pH 7下，经修饰的GCase多肽的解链温度相对于参考GCase多肽高至少1摄氏度、至少2摄氏度或至少2.5摄氏度。
任选地，解链温度是在1.5μM、3μM或6μM的经修饰的GCase多肽浓度下计算的解链温度。任选地，解链温度是在1.5μM或3μM的经修饰的GCase多肽浓度下计算的解链温度。任选地，解链温度是在3μM的经修饰的GCase多肽浓度下计算的解链温度。
热稳定性可使用热位移测定法(thermal shift assay)来测量。使用热位移测定法测量多肽(诸如本文所述的经修饰的GCase多肽或参考GCase多肽)的热稳定性主要包括在递升的温度下孵育多肽，并随着温度升高监测多肽的解折叠。例如，可将多肽(诸如经修饰的GCase多肽或参考GCase多肽)在25℃保持一段时间(诸如两分钟)，然后使温度随时间推移逐渐升高。任选地，使温度每分钟升高1摄氏度。任选地，使温度每分钟升高1摄氏度，直至所有经修饰的GCase多肽变性的温度，诸如95摄氏度的温度。任选地，热位移测定法包括在每分钟升高1摄氏度的温度下孵育经修饰的GCase多肽。任选地，热位移测定法包括当在每分钟升高1摄氏度的温度下孵育经修饰的GCase多肽或参考GCase多肽时，测量经修饰的GCase多肽或参考GCase多肽的解折叠，即当在每分钟升高1摄氏度的温度下孵育经修饰的GCase多肽或参考GCase多肽时，通过测量经修饰的GCase多肽或参考GCase多肽的解折叠来计算解链温度。
可使用对蛋白质结构变化敏感的荧光染料来监测多肽的解折叠。例如，诸如SYPROTM Orange蛋白质凝胶染色剂等染料与疏水蛋白质区域结合，并在蛋白质解折叠时发出荧光。当使用荧光染料监测多肽的解折叠时，在热位移测定过程中，将荧光染料加入到孵育多肽的培养基中，并监测荧光。
可以生成解链曲线，在Y轴上绘制荧光水平(以相对荧光单位或RFU表示),在X轴上绘制温度。解链温度对应于解链曲线的负一阶导数的最小导数。任选地，可以使用标题为“热稳定性测试”的实施例1中所述的测试法来测量解链温度。
任选地，在进行热稳定性测定法诸如热位移测定法之前，将经修饰的GCase多肽和/或参考GCase多肽储存在pH 5.75的缓冲液(诸如柠檬酸钠缓冲液)中。任选地，参考GCase多肽可以是诸如VPRIV等野生型GCase多肽。任选地，在进行热稳定性测定法诸如热位移测定法之前，在无核酸酶的水中复原VPRIV。
在一些实施方案中，所述至少一个突变减少了人白细胞抗原(HLA)-I和/或HLA-II结合物的数量。本文公开了减少HLA-I和/或HLA-II结合物数量的示例性突变。提及HLA-I和/或HLA-II结合物的减少，例如至少一个突变“减少HLA-I和/或HLA-II结合物的数量”或经修饰的GCase多肽“具有数量减少的HLA-I和/或HLA-II结合物”，应解释为意指HLA-I和/或HLA-II结合物的数量预计会减少。可如本文所述预测HLA-I和/或HLA-II结合物的数量。提及“至少一个突变减少HLA-I和/或HLA-II结合物的数量”，是指包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽与参考GCase多肽相比，具有数量减少的HLA-I和/或HLA-II结合物，所述参考GCase多肽不包含所述至少一个突变但与在其它方面与包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相同。例如，如果所述至少一个突变减少HLA-I和/或HLA-II结合物的数量，并且包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽除了其包含所述至少一个突变(例如突变W351C和A380C)外在其它方面与野生型GCase多肽相同，则包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽与野生型GCase多肽相比具有数量减少的HLA-I和/或HLA-II结合物。在一些实施方案中，如果除了至少一个突变外与SEQ ID NO:1相同的“测试”多肽与SEQ ID NO:1的多肽相比具有数量减少的HLA-I和/或HLA-II结合物，则所述至少一个突变“减少HLA-I和/或HLA-II结合物的数量”，任选地，其中“测试”多肽和SEQ ID NO:1是通过在同一细胞系中表达产生的。
在一些实施方案中，所述至少一个突变减少HLA-I和/或HLA-II结合物的数量。在一些实施方案中，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽具有数量减少的HLA-I和/或HLA-II结合物。任选地，HLA-I和/或HLA-II结合物是强结合物。任选地，HLA-I结合物是强结合物。任选地，HLA-II结合物是强结合物。“HLA-I结合物”是来自所述多肽的可与HLA-I结合的片段。“HLA-II结合物”是来自所述多肽的可与HLA-II结合的片段。如果来自所述多肽的HLA-I和/或HLA-II结合物(特别是“强”结合物)的数量较低，则多肽诱导免疫反应的风险可能较低。HLA-I和HLA-II结合物(特别是“强”结合物)的数量可以如下面进一步论述的那样进行预测。如下文进一步论述的，“强”结合物可被定义为具有0至≤50nM的IC50截断值范围。在一些实施方案中，使用IC50结合亲和力预测HLA-I和/或HLA-II结合物的数量。优选地，数量减少的HLA-I和/或HLA-II结合物是强结合物。数量减少的HLA-I结合物可以是强结合物。数量减少的HLA-II结合物可以是强结合物。在一些实施方案中，对于本文所述的参考GCase多肽，HLA-I和/或HLA-II结合物(例如强结合物)的数量减少是分别相对于HLA-I和/或HLA-II结合物(例如强结合物)的数量而言。例如，参考GCase多肽可以是野生型GCase多肽。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:3中的多肽。参考GCase多肽可以是SEQ ID NO:4或5的多肽。所述至少一个突变可以减少HLA-I结合物(例如强结合物)的数量。相对于参考GCase多肽的HLA-I结合物(例如强结合物)的数量，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽可具有数量减少的HLA-I结合物(例如强结合物)。所述至少一个突变可以减少HLA-II结合物(例如强结合物)的数量。相对于参考GCase多肽的HLA-II结合物(例如强结合物)的数量，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽可具有数量减少的HLA-II结合物(例如强结合物)。本文公开了减少经修饰的GCase多肽中HLA-I和/或HLA-II结合物的数量的示例性突变。
可使用已知的计算机分析或预测来评估GCase多肽的免疫风险特征。例如，可使用免疫表位数据库(Immune Epitope Database)和分析资源数据库(Analysis Resourcedatabase)输入数据用于计算。所使用的预测方法可以是etMHCpan EL 4.0(针对HLA-I)和NetMHCIIpan3.2(针对HLA-II)。例如，可根据实施例7的方法评估GCase多肽的免疫原性风险特征。例如，来自经修饰的GCase多肽中跨越相关氨基酸取代的上游50个氨基酸和下游50个氨基酸的区域(例如，来自跨越W351C上游50个氨基酸到A380C下游50个氨基酸的区域)的长度为9和15个氨基酸的肽片段(用于分别计算与HLA-I和HLA-II受体分子的结合亲和力)可用作使用免疫表位数据库和分析资源数据库进行计算的输入。可使用的预测方法可包括NetMHCpan EL 4.0(用于HLA-I)和NetMHCIIpan 3.2(用于HLA-II)。IC50值可用作肽结合亲和力的量度。IC50值可用于将结合物分类为“强”结合物或“中等”结合物。IC50值越低，预测结合越好。对于“强”给合物，可使用0nM至≤50nM的IC50截断值范围，对于“中等”给合物，可使用>50nM至≤500nM的IC50截断值范围。
为了确定经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽(如本文所述，例如野生型GCase多肽)是否具有数量减少的HLA-I和/或HLA-II结合物，使用相同的方法预测经修饰的GCase多肽和参考GCase多肽的HLA-I和/或HLA-II结合物的数量，并比较结果。该方法可以是本文所述的用于预测HLA-I和/或HLA-II结合物的数量的任何方法。
在一些实施方案中，所述至少一个突变可提供降低的免疫原性。在一些实施方案中，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽具有降低的免疫原性。在一些实施方案中，将包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽的免疫原性水平与本文所述的参考GCase多肽的水平进行比较。在一些实施方案中，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽相对于本文所述的参考GCase多肽的免疫原性具有降低的免疫原性。本文公开了可降低经修饰的GCase多肽的免疫原性的示例性突变。
提及“至少一个突变提供降低的免疫原性”，是指与参考GCase多肽相比，包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽具有降低的免疫原性，所述参考GCase多肽不包含所述至少一个突变但在其它方面与包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相同。例如，如果所述至少一个突变降低了免疫原性，并且包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽除了其包含所述至少一个突变(例如突变W351C和A380C)外在其它方面与野生型GCase多肽相同，则包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽与野生型GCase多肽相比具有降低的免疫原性。在一些实施方案中，如果除了所述至少一个突变外与SEQ ID NO:1相同的“测试”多肽与SEQ ID NO:1的多肽相比具有降低的免疫原性，则所述至少一个突变“提供降低的免疫原性”，任选地，其中“测试”多肽和SEQ ID NO:1是通过在同一细胞系中表达产生的。
在一些实施方案中，通过预测本文所述的HLA-I和/或HLA-II结合物的数量来评估GCase多肽的免疫原性。
在一些实施方案中，通过测量针对GCase多肽产生的免疫反应来评估GCase多肽的免疫原性。例如，可向测试动物诸如小鼠施用GCase多肽施，并且可测量测试动物中的免疫反应，并将其与施用了参考GCase多肽的可比测试动物中的免疫反应进行比较。可通过测试血液中的炎症标志物(诸如细胞因子或急性期蛋白)来测量免疫反应。可测量的细胞因子的实例是TNF-α、IL-1β和/或INF-γ。可测量的急性期蛋白的实例是C反应蛋白、甘露聚糖结合凝集素和/或补体因子。炎症标志物的减少可用于指示较低的免疫原性。
在一些实施方案中，使用T细胞增殖测定法评估GCase多肽的免疫原性，所述测定法测试与全蛋白(例如，本发明的野生型GCase多肽或经修饰的GCase多肽)一起孵育时人外周血单核细胞(PMBC)中T细胞的活化水平。例如，可以使用
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CFSE T细胞增殖测定法(https://www.proimmune.com/promap-t-cell-proliferation-assays/)。
为了确定经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽(如本文所述，诸如野生型GCase多肽)是否具有降低的免疫原性，使用相同的方法评估经修饰的GCase多肽和参考GCase多肽的免疫原性，并比较结果。该方法可以是本文所述的用于评估免疫原性(例如预测HLA-I和/或HLA-II结合物的数量)的任何方法。
可对本发明的经修饰的GCase多肽计算未观察到不良事件的水平(noobservation of adverse event level)(NOAEL)。如果NOAEL高，这表明本发明的经修饰的GCase多肽具有低免疫原性。例如，可以以递增的剂量向测试动物诸如小鼠施用GCase多肽，并监测小鼠以观察它们是否有不良事件。与不良事件相关联的最低剂量是NOAEL。如下文更详细地论述的，可将本发明的经修饰的GCase多肽作为病毒颗粒的一部分施用。例如，可以以递增的剂量诸如1x108、1x109、5x109、1x1010、5x1010等剂量向小鼠施用编码GCase多肽的病毒颗粒。任选地，所述经修饰的GCase多肽由经修饰的GBA核苷酸序列编码，并且将GBA核苷酸序列在包含重组基因组的病毒颗粒中施用，所述重组基因组包含含有GBA核苷酸序列的多核苷酸，并且NOAEL为至少1x1012 vg/kg、至少5x1012vg/kg、至少1x1013 vg/kg或至少2x1013vg/kg。
本发明的经修饰的GCase多肽的酶促效率可以与野生型GCase多肽的酶促效率相同。将第一GCase多肽(例如经修饰的GCase多肽)的酶促效率(即处理底物的能力)描述为与第二GCase多肽(例如野生型GCase多肽)的酶促效率“相同”，是指第一GCase多肽的酶促效率可以与第二GCase多肽的酶促效率±10％，更特别地±5％，或更特别地±1％相同。出于本发明的目的，“酶促效率”是指GCase多肽处理底物诸如甲基伞形基-β-D-吡喃葡糖苷酸(4-MUG)或其天然底物葡糖脑苷脂的能力。本发明的经修饰的GCase多肽的酶促效率可与野生型GCase多肽的酶促效率相同，但本发明的经修饰的GCase多肽的有效活性或残留活性可高于野生型GCase多肽。这一观察结果可能是由于本发明的经修饰的GCase多肽更稳定，因此保持活性的时间更长。因此，本发明的经修饰的GCase多肽可具有与野生型GCase多肽相同的处理底物的能力，但保持活性的时间更长，导致更高的有效活性和/或更高的残留活性。
GCase多肽的酶促效率可通过测定Km和/或Kcat值来测量。Km和/或Kcat值可通过本领域的标准方法来测定。酶促效率可通过处理4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡糖苷酸(4-MUG)来测量，诸如通过实施例6中描述的方法来测量。例如，可以如本文中(诸如实施例1中)所述纯化GCase多肽。可将纯化的蛋白质(例如1或3.5nM)在AB缓冲液中与递增量(例如2.5x106、5x 106、7.5x 106或1x 107nM)的4-MUG一起孵育。任选地，在pH 5.75下于组合物中将纯化的蛋白质与4-MUG一起孵育。通过测量所得到的荧光(激发波长：365nm，发射波长：445nm)，可以在例如15分钟内监测4-甲基伞形酮(4-MU)的形成。可将每个4-MUG浓度下的4-MU形成速度相对于4-MUG浓度作图，并用Michaelis-Menten模型拟合。Kcat值可为32s-1至40s-1、32.8s-1至39.2s-1、33s-1至39s-1或35s-1至37s-1。Kcat值可为约36.0s-1。本发明的经修饰的GCase多肽的Km值可为1.4mM至2.5mM、1.6mM至2.2mM或1.8mM至2.2mM。任选地，经修饰的GCase多肽的Km值可为约2.0mM。
本发明的经修饰的GCase多肽在生理pH下可具有更高的有效活性和/或增强的稳定性和/或结构稳定性和/或更长的半衰期。本发明的经修饰的GCase多肽可具有数量减少的HLA-I和/或HLA-II结合物。本发明的经修饰的GCase多肽可具有降低的免疫原性。本发明的经修饰的GCase多肽可以具有增强的热稳定性。与本文所述的参考GCase多肽相比，本发明的经修饰的GCase多肽在宿主细胞中可以以更高的水平表达。
本发明的经修饰的GCase多肽包含至少一个突变。在一些实施方案中，所述至少一个突变(即一个或多个取代突变)位于对应于选自SEQ ID NO:1的351、380、272、262、313、404、407、482、484、490、494、503和534中的位置的位置。所述至少一个突变(诸如对应于上文所列位置的位置处的突变)可提供一种或多种本文所述的性质(例如更高的有效活性、增强的稳定性、在生理pH下的结构稳定性、更长的半衰期、更高的残留活性、更低的HLA-I和/或HLA-II结合物数量、减少的免疫原性或增强的热稳定性)。包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽(诸如对应于上文所列位置的位置处的突变)可具有一种或多种本文所述的性质(例如更高的有效活性、增强的稳定性、在生理pH下的结构稳定性、更长的半衰期、更高的残留活性、减少的HLA-I和/或HLA-II结合物数量、降低的免疫原性、增强的热稳定性等)。
在一些实施方案中，所述至少一个突变可包括用在pH 7.4下充当质子供体的氨基酸取代。
任选地，所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的突变。优选地，所述突变是用谷氨酰胺取代。例如，所述突变可以是E272Q。
任选地，所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置262的位置处的突变。突变可以是用天冬酰胺或酪氨酸取代。优选地，突变是用天冬酰胺取代。例如，突变可以是H262N。
任选地，所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置262的位置处的至酪氨酸的突变，例如H262Y。
任选地，所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置313的位置处的突变。优选地，所述突变是用天冬酰胺取代。例如，所述突变可以是H313N。
任选地，所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置404的位置处的突变。优选地，所述突变是用赖氨酸取代。例如，所述突变可以是H404K。
任选地，所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置490的位置处的突变。优选地，所述突变是用赖氨酸取代。例如，所述突变可以是H490K。
任选地，所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置534的位置处的突变。优选地，所述突变是用天冬酰胺取代。例如，所述突变可以是R534N。
任选地，经修饰的GCase多肽的所述至少一个突变包括两个突变，其中所述两个突变中的每一个都是用半胱氨酸取代，这使得能够形成二硫桥。二硫桥的形成可以例如在生理pH下稳定经修饰的GCase的结构。二硫键的形成可通过质谱测定。例如，二硫键的形成可通过任选地在有限的蛋白水解后分析怀疑含有二硫键的多肽的片断化模式来确定，例如如Gorman等人2002,Mass Spectrometry Reviews 21,183-216中所概述的。或者，二硫键的形成可通过对多肽进行有限的蛋白水解并在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE(任选地与N-末端测序结合)分析所得的蛋白片段来确定。
任选地，所述至少一个突变(例如包括两个突变)包括(i)对应于SEQ ID NO:1的位置482的位置处的突变，和(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置503的位置处的突变。任选地，(i)对应于SEQ ID NO:1的位置482的位置处的突变是用半胱氨酸取代，和(ii)对应于SEQ IDNO:1的位置503的位置处的突变是用半胱氨酸取代。任选地，(i)对应于SEQ ID NO:1的位置482的位置处的突变是天冬氨酸至半胱氨酸的突变，和(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置503的位置处的突变是丝氨酸至半胱氨酸的突变。例如，所述突变可以是D482C/S503C。
任选地，所述至少一个突变(例如包括两个突变)包括(i)对应于SEQ ID NO:1的位置494的位置处的突变，和(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置534的位置处的突变。任选地，(i)对应于SEQ ID NO:1的位置494的位置处的突变是用半胱氨酸取代，和(ii)对应于SEQ IDNO:1的位置534的位置处的突变是用半胱氨酸取代。任选地，(i)对应于SEQ ID NO:1的位置494的位置处的突变是丝氨酸至半胱氨酸的突变，和(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置534的位置处的突变是精氨酸至半胱氨酸的突变。例如，所述突变可以是S494C/R534C。
任选地，所述至少一个突变(例如包括两个突变)包括(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的突变，和(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的突变。任选地，(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的突变是用半胱氨酸取代，和(ii)对应于SEQ IDNO:1的位置380的位置处的突变是用半胱氨酸取代。任选地，(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的突变是色氨酸至半胱氨酸的突变，和(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的突变是丙氨酸至半胱氨酸的突变。例如，所述突变可以是W351C/A380C。
任选地，所述至少一个突变(例如包括两个突变)包括(i)对应于SEQ ID NO:1的位置407的位置处的突变，和(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置484的位置处的突变。任选地，(i)对应于SEQ ID NO:1的位置407的位置处的突变是用半胱氨酸取代，和(ii)对应于SEQ IDNO:1的位置484的位置处的突变是用半胱氨酸取代。任选地，(i)对应于SEQ ID NO:1的位置407的位置处的突变是异亮氨酸至半胱氨酸的突变；和(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置484的位置处的突变是天冬氨酸至半胱氨酸的突变。例如，所述突变可以是I407C/D484C。
任选地，所述至少一个突变(例如包含三个突变)包含(i)对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的突变，(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的突变，和(iii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的突变。任选地，(i)对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的突变是用谷氨酰胺取代，(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的突变是用半胱氨酸取代，以及(iii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的突变是用半胱氨酸取代。任选地，(i)对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的突变是谷氨酸至谷氨酰胺的突变，(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的突变是色氨酸至半胱氨酸的突变，以及(iii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的突变是丙氨酸至半胱氨酸的突变。例如，所述突变可以是E272Q/W351C/A380C。
任选地，所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的的位置272的位置处的用谷氨酰胺取代，并且与本文所述的参考GCase多肽(诸如野生型GCase多肽)相比，经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，保留至少85％的活性。任选地，所述至少一个突变包括(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的用半胱氨酸取代(例如色氨酸至半胱氨酸的突变)；和(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的用谷氨酰胺取代(例如丙氨酸至半胱氨酸的突变)，并且与本文所述的参考GCase多肽(诸如野生型GCase多肽)相比，经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，保留至少85％的活性。在一个实施方案中，所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的用谷氨酰胺取代，并且其中与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4的PBS中于37摄氏度孵育72小时后测量时，保留至少60％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。在一个实施方案中，所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的用谷氨酰胺取代，并且其中与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，保留至少50％或至少55％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
任选地，所述至少一个突变包括(i)对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处用谷氨酰胺取代(例如E272Q)；和(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处用半胱氨酸取代(例如色氨酸至半胱氨酸的突变)；和(iii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处用半胱氨酸取代(例如丙氨酸至半胱氨酸的突变)。任选地，与本文所述的参考GCase多肽(诸如野生型GCase多肽)相比，经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，保留至少85％的活性。在一个实施方案中，所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处丙氨酸至半胱氨酸的突变；
并且与参考GCase多肽相比，经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4的PBS中于37摄氏度孵育72小时后测量时，保留至少60％的活性，任选地其中参考GCase多肽是野生型GCase多肽。在一个实施方案中，所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处丙氨酸至半胱氨酸的突变；
并且与参考GCase多肽相比，经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，保留至少50％或至少55％的活性，任选地其中参考GCase多肽是野生型GCase多肽。在一个实施方案中，所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处用谷氨酰胺取代，任选地为E272Q；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(iii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处丙氨酸至半胱氨酸的突变；
并且与参考GCase多肽相比，经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4的PBS中于37摄氏度孵育72小时后测量时，保留至少60％的活性，任选地其中参考GCase多肽是野生型GCase多肽。在一个实施方案中，所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处用谷氨酰胺取代，任选地为E272Q；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(iii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处丙氨酸至半胱氨酸的突变；
并且与参考GCase多肽相比，经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，保留至少50％或至少55％的活性，任选地其中参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
任选地，所述至少一个突变包括(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处用半胱氨酸取代(例如色氨酸至半胱氨酸的突变)；和(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处用半胱氨酸取代(例如丙氨酸至半胱氨酸的突变)，并且与本文所述的参考GCase多肽(诸如野生型GCase多肽)相比，经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，保留至少15％或至少20％的活性。在一个实施方案中，所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的用谷氨酰胺取代，并且其中与参考GCase多肽相比，经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4的PBS中于37摄氏度孵育7天之后测量时，保留至少15％或至少20％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。在一个实施方案中，所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处用谷氨酰胺取代；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(iii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处丙氨酸至半胱氨酸的突变；
并且与参考GCase多肽相比，经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4的PBS中于37摄氏度孵育7天后测量时，保留至少60％或至少80％的活性，任选地其中参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
任选地，与本文所述的参考GCase多肽相比，经修饰的GCase多肽具有更高的有效活性和/或增强的稳定性。任选地，参考GCase多肽不包含所述至少一个突变，但在其它方面与经修饰的GCase多肽相同。任选地，参考GCase多肽选自SEQ ID NO:1至5中的任一个。
任选地，所述至少一个突变不包括选自H184L、E272L、W351C、K360N和A380T(它们为分别对应于SEQ ID NO:1中的位置184、272、351、360和380的位置)的一个或多个突变。任选地，所述至少一个突变不包括H184L突变(其为对应于SEQ ID NO:1中的位置184的位置)。任选地，所述至少一个突变不包括K360N突变(其为对应于SEQ ID NO:1中的位置360的位置)。任选地，所述至少一个突变不包括H184L突变和K360N突变(它们是分别对应于SEQ IDNO:1中的位置184和360的位置)。任选地，经修饰的GCase多肽不包括或不具有SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列。
任选地，所述至少一个突变不包括A380T突变(其为对应于SEQ ID NO:1中的位置380的位置)。任选地，所述至少一个突变不包括R534H突变(其为对应于SEQ ID NO:1中的位置534的位置)。
任选地，所述至少一个突变不包括选自H184L、H184F、F355A、L356F、K360N和K360A(它们为分别对应于SEQ ID NO:1中的位置184、355、356和360的位置)的一个或多个突变。任选地，所述至少一个突变不包括选自H184F、F355A、L356F和K360A(它们为分别对应于SEQID NO:1中的位置184、355、356和360的位置)的一个或多个突变。任选地，所述至少一个突变不包括F355A突变和L356F突变(它们为分别对应于SEQ ID NO:1中的位置355和356的位置)。任选地，所述至少一个突变不包含F355A突变、L356F突变和K360N突变(它们为分别对应于SEQ ID NO:1中的位置355、356和360的位置)。
任选地，经修饰的GCase多肽包含SEQ ID NO:41至46中任一个所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO 41至46中的任一个所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。任选地，经修饰的GCase多肽包含SEQID NO:42或45中所示的氨基酸序列。
通常，GCase多肽最初以前体“未成熟”形式表达(例如，SEQ ID NO:1的GCase多肽)，包含信号肽(例如SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至39)和成熟GCase多肽区域。加工后,GCase多肽的“成熟”形式缺少信号肽。术语“成熟GCase”或“成熟GCase多肽”是指不包含信号肽的GCase多肽，诸如SEQ ID NO:2的GCase多肽。
野生型人GCase多肽的序列示于SEQ ID NO:1(未成熟)和SEQ ID NO:2(成熟)中。经修饰的GCase多肽可包含与SEQ ID No:1的片段具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％或至少99.8％同一性的氨基酸序列。经修饰的GCase多肽可包含与SEQ ID NO:2的片段具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％或至少99.7％同一性的氨基酸序列。任选地，所述片段为至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个或至少450个氨基酸，或300至497个、400至497个或450至497个氨基酸。任选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少200个、至少250个、至少300个、至少400个、300至497个、400至497个或450至497个氨基酸的片段具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。任选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
任选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1的400至536个氨基酸的片段具有至少98％同一性的氨基酸序列。
任选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:2的400至497个氨基酸的片段具有至少98％同一性的氨基酸序列。
任选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％或至少99.7％或至少99.8％同一性的氨基酸序列。任选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％或至少99.7％同一性的氨基酸序列。优选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少98％同一性的氨基酸序列。优选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少98％同一性的氨基酸序列。
优选地，经修饰的GCase多肽可包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，不同之处在于经修饰的GCase多肽包含本文定义的所述至少一个突变(即一个或多个取代突变)。换句话说，经修饰的GCase多肽可包含与SEQ ID NO:1或2中所示的氨基酸序列相异在于所述至少一个突变的GCase氨基酸序列。优选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQID NO:1或SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，不同之处在于经修饰的GCase多肽在对应于SEQID NO:1的位置272的位置处包含突变。优选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，不同之处在于经修饰的GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处和对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处包含用半胱氨酸取代和任选地，在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处包含突变。
任选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列相异在于20个或更少、15个或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少或1个取代突变的GCase氨基酸序列。任选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列相异在于5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少或1个取代突变的GCase氨基酸序列。任选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列相异在于3个或更少的取代突变的GCase氨基酸序列。任选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列相异在于2个或更少的取代突变的GCase氨基酸序列。任选地，经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列相异在于至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少8个、至少10个、至少15个或至少20个取代突变的GCase氨基酸序列。任选地，GCase多肽可包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列相异在于1至20个、1至15个、1至10个、1至5个、1至3个、2至6个、3至8个、5至10个、8至13个、10至15个、13至18个或15至20个取代突变的GCase氨基酸序列。任选地，取代突变是非保守取代。
当将经修饰的GCase多肽的氨基酸序列与野生型GCase氨基酸序列比较时，除了本文定义的所述至少一个突变(即一个或多个取代突变)之外，任何或所有经修饰的GCase多肽可包含一个或多个另外的修饰，诸如取代、插入和/或缺失。所述一个或多个另外的修饰可以是一个或多个取代。所述一个或多个另外的修饰可以是一个或多个保守取代。所述一个或多个另外的修饰可以是一个或多个非保守的取代。所述至少一个突变可以位于所述一个或多个另外的修饰中。例如，GCase多肽的连续部分(诸如多达50个、多达20个或多达10个氨基酸)可能已被包含所述至少一个突变的替代部分替换。
包含葡糖脑苷脂酶(GBA)核苷酸序列的多核苷酸
本发明提供了包含经修饰的葡糖脑苷脂酶(GBA)核苷酸序列的多核苷酸，其中经修饰的GBA核苷酸序列编码本发明的经修饰的GCase多肽。术语“经修饰的”意指所述核苷酸序列与野生型GBA核苷酸序列相比具有至少一处不同，例如引入了突变。
术语“核酸分子”、“多核苷酸”和“核苷酸序列”旨在指具有任何长度的核苷酸(包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物)的聚合物链。例如，所述核酸分子、多核苷酸或核苷酸序列可包括DNA(脱氧核糖核苷酸)或RNA(核糖核苷酸)。所述核酸分子、多核苷酸或核苷酸序列可由DNA组成。所述核酸分子、多核苷酸或核苷酸序列可以是mRNA。由于所述核酸分子、多核苷酸或核苷酸序列可包括RNA或DNA，所有提及T(胸腺嘧啶)核苷酸的地方都可用U(尿嘧啶)替换。
在一些实施方案中，术语“核苷酸序列”可用术语“核酸分子”来替换。
GBA核苷酸序列编码GCase多肽。本发明的多核苷酸包含经修饰的GBA核苷酸序列，并且经修饰的GBA核苷酸序列编码本发明的经修饰的GCase多肽。术语“编码……的序列”或“序列编码……”是指包含开放阅读框的核苷酸序列，所述开放阅读框包含编码所编码的多肽的密码子。例如，编码GCase多肽的核苷酸序列包含编码GCase多肽的氨基酸序列的密码子。编码野生型GCase的GBA核苷酸序列的一个实例提供于SEQ ID NO:40中。
编码多肽的密码子也被称为“编码核苷酸”。GBA核苷酸序列可被非编码核苷酸(例如内含子)中断，但是只有编码多肽的核苷酸(即编码核苷酸)应该被认为是所述GBA核苷酸序列的一部分。例如，编码GCase多肽的GBA核苷酸序列将包含编码形成GCase多肽的一部分的氨基酸的任何密码子(即编码核苷酸)，无论这些密码子在序列上是连续的还是被一个或多个非编码核苷酸分开的。换句话说，含有被非编码核苷酸区段中断的编码核苷酸区段的GBA多核苷酸将被认为包含由紧邻并置的非连续编码区段(即减去非编码核苷酸区段)组成的“GBA核苷酸序列”。然而，在本文中，终止密码子的核苷酸将被认为是编码核苷酸。
编码GCase多肽的GBA核苷酸序列也可包含编码信号肽的序列。众所周知，一些蛋白质，特别是那些输出到不同组织的蛋白质与信号肽一起表达。信号肽可位于蛋白质序列的N-末端(在这种情况下，位于编码序列的5’末端)，并且许多信号肽在细胞加工后被切割。因此，在本文中，成熟蛋白质或多肽(诸如成熟GCase蛋白质或多肽)将被认为是信号肽被加工和去除/切割(因此不再形成多肽序列的一部分)后得到的蛋白质或多肽。
下表描述了编码每个氨基酸的密码子：
表2
Figure BDA0004148758090000651
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Figure BDA0004148758090000661
相应的RNA密码子将包含U来替代上表中的T。
本发明提供了包含经修饰的GBA核苷酸序列的多核苷酸，其中经修饰的GBA核苷酸序列编码本发明的经修饰的GCase多肽。任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包与SEQ ID NO:6至29中任一个的至少750个、至少850个、至少950个、至少1000个、至少1200个、至少1300个、至少1400个、至少1494个、1494个或更少、1611个或更少、1000至1494个、1000至1611个、1300至1494个、1300至1611个或约1494个核苷酸的片段具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％同一性的序列。任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:6至29中任一个的至少750个、至少850个、至少950个、至少1000个、至少1200个、至少1400个或至少1494个核苷酸的片段具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列。任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:6至29中任一个的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.45％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％同一性的序列。任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:6至29中任一个的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列。任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:6或10的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％同一性的序列。任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列。任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10的核苷酸序列。任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％同一性的序列。任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列。任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18的核苷酸序列。任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％同一性的序列。任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列。任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:22或SEQID NO:26的核苷酸序列。
本发明的经修饰的GBA核苷酸序列可包含经密码子优化的部分。经密码子优化的部分可对应于编码部分或全部经修饰的GCase多肽的序列。任选地，经密码子优化的GBA核苷酸序列的一部分是连续部分。本发明的经修饰的GBA核苷酸序列可以是经密码子优化的。经修饰的GBA核苷酸序列可以是经密码子优化的，以便在人肝细胞中表达。任选地，所述人肝细胞是Huh-7细胞。如上所述，遗传密码是简并的，许多氨基酸可由不止一种可选密码子编码。然而，不同生物体、组织或细胞的遗传密码可能偏向于使用一种特定的密码子来编码特定的氨基酸。“经密码子优化的”核苷酸序列可被优化用于在特定宿主细胞或生物中表达，例如在人肝细胞中表达。优选地，经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列相对于未经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列被修饰，而由经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸和未经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列编码的氨基酸序列是相同的。
本发明的经修饰的GBA核苷酸序列可包含替代一个或多个野生型密码子的一个或多个可选密码子，其中“可选”密码子是具有与野生型密码子不同的序列但与野生型密码子编码相同的氨基酸的密码子(即简并密码子)。表2描述了编码每个氨基酸的密码子。
经密码子优化的核苷酸序列可以比相应的未经密码子优化的核苷酸序列多包含至少一个“优选”密码子。与未经密码子优化的相应核苷酸序列相比，经密码子优化的核苷酸序列可包含更高百分比的“优选”密码子。经密码子优化的核苷酸序列可以比相应的未经密码子优化的核苷酸序列少包含至少一个“非优选”密码子。与未经密码子优化的相应核苷酸序列相比，经密码子优化的核苷酸序列可包含更低百分比的“非优选”密码子。例如，如果为了在人肝脏中表达而对核苷酸序列进行密码子优化，则修饰该核苷酸序列以增加在人肝脏中可能是优选的(在此类密码子对应于比对相同氨基酸特异的其它tRNA种类更丰富的tRNA种类的意义上)密码子的数量。作为另一个实例，如果就在人肝细胞中的表达对核苷酸序列进行密码子优化，则可修饰该核苷酸序列以增加在人肝细胞中可能是优选的(在此类密码子对应于比对相同氨基酸特异的其它tRNA种类更丰富的tRNA种类的意义上)密码子的数量。技术人员会理解，对序列进行密码子优化可以不需要改变每个密码子，尤其是因为“优选密码子”可能已经存在于某些位置。
这种密码子优化可受其它因素影响。例如，可以看出CpG(即CG二核苷酸)的存在对表达有不利影响，因此用户可以决定在使用优选密码子会将CpG引入序列的位置处不使用优选密码子；这仍然被认为是密码子优化。在一个实施方案中，以C核苷酸结束的优选密码子将不包括在经密码子优化的编码序列的部分中，其中序列中的下一个密码子以G开始。例如，密码子CTC编码亮氨酸。在CTC是优选密码子的方案中，其不应该用于编码序列中下一个密码子以G开始的亮氨酸，诸如密码子GTT(或者，下一个密码子-可能的话-可被选择以避免第一个位置上的G)。
通过将核苷酸序列描述为“经密码子优化的”，并非所有的密码子都需要优化。因此，当与野生型GBA核苷酸序列的相应部分相比时，经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列的部分可包含一个或多个选择性密码子来代替一个或多个野生型密码子。如果经修饰的GBA核苷酸序列包含经密码子优化的部分，则由GBA核苷酸序列编码的多肽可以以比野生型GBA核苷酸序列编码的多肽更高的水平表达。经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列或经修饰的GBA核苷酸序列的部分可经密码子优化以在人肝细胞中表达。因此，当序列在人肝细胞中表达时，由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可以以比由等同的未经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列编码的多肽高的水平表达。任选地，人肝细胞是Huh-7细胞。“等同的”未经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列是相同的(即编码相同的GCase多肽并包含相同的转录调控元件等)，不同之处在于用于编码GCase多肽的密码子对应于野生型GCase序列的相应密码子，诸如SEQ ID NO:40的相应密码子。任选地，编码本发明经修饰的GCase多肽的至少一个突变的序列(例如密码子)不是经密码子优化的。任选地，除了编码所述至少一个突变的序列外，经修饰的GBA核苷酸序列是经密码子优化的。通常，经修饰的GBA核苷酸序列的经密码子优化的部分不包含终止密码子。
与未经密码子优化的GBA核苷酸序列相比，经密码子优化的GBA核苷酸序列编码的多肽可在人肝细胞中以更高水平表达。与由未经密码子优化的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽相比，由本发明的经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列编码的本发明的经修饰的GCase多肽可在人肝细胞中以更高的水平表达。当序列在人肝细胞中表达时，由本发明的经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可以以比由未经密码子优化的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽更高的水平表达。例如，由经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽在人肝细胞中的表达可高为未经密码子优化的参考GBA核苷酸序列的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或至少50倍。“未经密码子优化的参考GBA核苷酸序列”可以是使用野生型密码子编码GCase多肽的任何GBA核苷酸序列，诸如SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列。任选地，未经密码子优化的参考GBA核苷酸序列是“等同的”GBA核苷酸序列，即未经密码子优化的参考GBA核苷酸序列与与其比较的GBA核苷酸序列编码相同的GCase多肽。与由未经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽相比，由本发明的经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列编码的本发明的经修饰的GCase多肽可在人肝细胞中以更高的水平表达。当序列在人肝细胞中表达时，由本发明的经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可以以比由未经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽更高的水平表达。任选地，所述人肝细胞是Huh-7细胞。
在一些实施方案中，经修饰的GBA核苷酸序列的一部分未经密码子优化，例如编码序列的一部分未经密码子优化以在肝脏中表达。在一些实施方案中，未经密码子优化的部分为至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、200个或更少、170个或更少、140个或更少、或约117个核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的GBA核苷酸序列中未经密码子优化的部分是编码信号肽的部分。任选地，经密码子优化的GBA核苷酸序列的部分编码成熟的经修饰的GCase多肽。在一些实施方案中，经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列的部分不编码全部或一部分信号肽。例如，经修饰的GBA核苷酸序列可以编码未成熟GCase多肽(即包含信号肽)，经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列的部分编码成熟GCase蛋白，不编码全部或部分信号肽。在一些实施方案中，经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列的部分编码全部或部分信号肽。例如，经修饰的GBA核苷酸序列可编码未成熟经修饰的GCase多肽(即包含信号肽)，经密码子优化的经修饰的GBA核苷酸序列的部分编码成熟经修饰的GCase多肽和全部或部分信号肽。在一些实施方案中，对编码整个成熟经修饰的GCase多肽序列的经修饰GBA核苷酸序列进行密码子优化。
任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:59或60的氨基酸序列，不同之处在于由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽包含本文所述的至少一个突变。例如，由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处包含用半胱氨酸取代(任选地为W351C)以及在对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处包含用半胱氨酸取代(任选地为A380C)。作为另一个实例，由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处包含突变(任选地为E272Q)。作为另一个实例，由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处包含用半胱氨酸取代(任选地为W351C)以及在对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处包含用半胱氨酸取代(任选地为A380C)，并且由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处包含突变(任选地为E272Q)。
任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:64的序列，不同之处在于由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽包含如本文所述的至少一个突变。例如，由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ IDNO:1的位置351的位置处包含用半胱氨酸取代(任选地为W351C)和在对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处包含用半胱氨酸取代(任选地为A380C)。作为另一个实例，由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处包含突变(任选地为E272Q)。作为另一个实例，由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处包含用半胱氨酸取代(任选地为W351C)以及在对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处包含用半胱氨酸取代(任选地为A380C)，并且由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处包含突变(任选地为E272Q)。
任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含WO 2019/070893或WO 2019/070894的SEQID NO:15的序列，不同之处在于由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽包含本文所述的至少一个突变。例如，由经修饰的GBA核苷酸编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处包含突变。作为另一个实例，由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处和在对应于SEQID NO:1的位置380的位置处包含用半胱氨酸取代。作为另一个实例，由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处和对应于SEQID NO:1的位置380的位置处包含用半胱氨酸取代，并且由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处包含突变。
任选地，经修饰的GBA核苷酸序列包含WO2020/012149或WO 2020/012164的SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列，不同之处在于由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽包含至少一个本文所述的突变。例如，由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处包含突变。作为另一个实例，由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处和对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处包含用半胱氨酸突变。作为另一个实例，由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处和对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处包含用半胱氨酸取代，并且由经修饰的GBA核苷酸序列编码的经修饰的GCase多肽可在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处包含突变。
本发明的多核苷酸可包含转录调控元件。
可使用任何合适的转录调控元件，诸如HLP2、HLP1、LP1、HCR-hAAT、ApoE-hAAT或LSP，它们都是肝脏特异性转录调控元件。这些转录调控元件在以下参考文献中有更详细的描述：HLP1:McIntosh J.等人，Blood 2013年4月25日，121(17):3335-44；LP1:Nathwani等人，Blood.2006年4月1日，107(7):2653–2661；HCR-hAAT:Miao等人，Mol Ther.2000；1:522-532；ApoE-hAAT:Okuyama等人，Human Gene Therapy,7,637-645(1996)；和LSP:Wang等人，Proc Natl Acad Sci U S A.1999March 30,96(7):3906–3910。转录调控元件可包含肝脏特异性启动子。
任选地，如果转录调控元件相较于其它细胞在肝细胞中通常驱动更高水平的表达，则该转录调控元件是“肝脏特异性的”。例如，技术人员可通过比较肝细胞(诸如Huh 7细胞)中多核苷酸的表达与来自其它组织的细胞(诸如肾细胞，例如HEK293T细胞)中多核苷酸的表达来确定转录调控元件是否是肝脏特异性转录调控元件。如果与来自其它组织的细胞相比，肝细胞中的表达水平更高，则转录调控元件是肝脏特异性转录调控元件。任选地，肝脏特异性转录调控元件在非肝细胞中不驱动显著水平的表达。
转录调控元件可包括启动子和/或增强子，诸如来自HLP2、HLP1、LP1、HCR-hAAT、ApoE-hAAT或LSP的启动子元件和/或增强子元件。这些转录调控元件中的每一种都包含启动子、增强子和任选地其它核苷酸。
在一些实施方案中，所述转录调控元件包括启动子，所述启动子是人α-1抗胰蛋白酶启动子(A1AT；Miao等人(2000),Molecular Therapy 1(6):522)，或其片段。在一个实施方案中，A1AT启动子的片段长度为至少100个、至少120个、至少150个、至少180个、255个或更少，100至255个、150至225个、150至300个或180至255个核苷酸。任选地，A1AT启动子的片段长度为150至300个核苷酸。任选地，A1AT启动子的片段长度为180至255个核苷酸。在一个实施方案中，A1AT启动子的片段长度为至少200个、至少250个、至少300个、500个或更少，200至500个、250至500个或350至450个核苷酸。任选地，A1AT启动子的片段长度为350至450个核苷酸。
合适的A1AT启动子片段描述于SEQ ID NO:30和31。任选地，所述转录调控元件包括长度为至少100个、至少120个、至少150个、至少180个、255个或更少、100至255个、150至300个或180至255个核苷酸的启动子，并且所述启动子包含与SEQ ID NO:30具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的多核苷酸序列。任选地，所述转录调控元件包括长度为180至255个核苷酸的启动子，并且所述启动子包含与SEQ ID NO:30具有至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的多核苷酸序列。任选地，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:30的至少100个、至少120个或至少150个核苷酸的片段具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的多核苷酸序列。任选地，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:30具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的启动子。任选地，所述多核苷酸包括与SEQID NO:30具有至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的启动子。任选地，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:30的启动子。任选地，所述转录调控元件包含长度等于或少于418个核苷酸、等于或少于255个核苷酸或者等于或少于185个核苷酸的A1AT启动子的片段，并且包含SEQ ID NO:30。
所述转录调控元件可包括长度为至少200个、至少250个、至少300个、500个或更少、200至500个、250至500个、350至450个核苷酸或约418个核苷酸的启动子，并且所述启动子包含与SEQ ID NO:31具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的多核苷酸序列。任选地，所述转录调控元件包括长度为350至450个核苷酸的启动子，并且所述启动子包含与SEQ ID NO:31具有至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的多核苷酸序列。任选地，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:31的至少350个核苷酸的片段具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的启动子。任选地，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:31具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的启动子。任选地，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:31具有至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的启动子。任选地，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:31的启动子。
任选地，所述转录调控元件可包括最小肾病蛋白(nephrin)启动子NPHS1或足突蛋白(podocin)启动子NPHS2。
所述转录调控元件可包括增强子。在一些实施方案中，所述转录调控元件包括增强子，所述增强子是人载脂蛋白E(ApoE)肝基因座控制区(HCR；Miao等人(2000),MolecularTherapy 1(6):522)，或其片段。在一个实施方案中，所述转录调控元件包含HCR增强子的片段，所述片段是长度为至少80个、至少90个、至少100个、192个或更少、80至192、90至192个、100至250个或117至192个核苷酸的片段。任选地，所述HCR增强子的片段长度为100至250个核苷酸。任选地，所述HCR增强子的片段长度为117至192个核苷酸。在一个实施方案中，所述HCR增强子的片段是长度为至少150个、至少190个、至少230个、400个或更少的核苷酸、150至400个核苷酸、190至370个核苷酸、230至340个核苷酸、250至340个核苷酸或约321个核苷酸。任选地，所述HCR增强子的片段长度为250至340个核苷酸。
在SEQ ID NO:32和33中定义了合适的HCR增强子元件片段。任选地，所述转录调控元件包括长度为至少80个、至少90个、至少100个、192个或更少、80至192个、90至192个、100至250个或117至192个核苷酸的增强子，并且所述增强子包含与SEQ ID NO:32具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的多核苷酸序列。任选地，所述转录调控元件包括长度为117至192个核苷酸的增强子，并且所述增强子包含与SEQ ID NO：32具有至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的多核苷酸序列。任选地，所述转录调控元件包括与SEQ ID NO:32的至少90个、至少100个或至少110个核苷酸的片段具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的增强子。任选地，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:32具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的增强子。任选地，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:32具有至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的增强子。任选地，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:32的增强子。任选地，所述转录调控元件包含长度等于或少于321个核苷酸、等于或少于192个核苷酸或者等于或少于117个核苷酸的HCR增强子的片段，并且包含SEQ ID NO:32。
在一些实施方案中，所述转录调控元件包含长度为至少150个、至少190个、至少230个、少于400个、150至400个、190至370、230至340个、250至340个核苷酸或约321个核苷酸的增强子，并且所述增强子包含与SEQ ID NO:33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的多核苷酸序列。任选地，所述转录调控元件包括长度为250至340个核苷酸的增强子，并且所述增强子包含与SEQ ID NO:33具有至少98％、至少99％、至少99.5％、99.8％或100％同一性的多核苷酸序列。任选地，所述转录调控元件包括与SEQ ID NO:33的至少250个核苷酸的片段具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、99.8％或100％同一性的增强子。任选地，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、99.8％或100％同一性的增强子。任选地，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:33具有至少98％、至少99％、至少99.5％、99.8％或100％同一性的增强子。任选地，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:33的增强子。
在一个实施方案中，所述转录调控元件与SEQ ID NO:34具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:34具有至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的转录调控元件。任选地，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:34具有至少98％同一性的转录调控元件。任选地，所述转录调控元件包含与SEQ ID NO:34具有100％同一性的序列。任选地，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:34具有100％同一性的转录调控元件。任选地，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:34的转录调控元件。任选地，所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:34组成的转录调控元件。
在一个实施方案中，所述转录调控元件与SEQ ID NO:35具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:35具有至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的转录调控元件。任选地，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:35具有至少98％同一性的转录调控元件。任选地，所述转录调控元件包含与SEQ ID NO:35具有100％同一性的序列。任选地，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:35具有100％同一性的转录调控元件。任选地，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:35的转录调控元件。任选地，所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:35组成的转录调控元件。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)或其变体。例如，本发明的多核苷酸包含Zanta-Boussif等人(2009),Gene Therapy,16:605-619中描述的突变的WPRE序列。任选地，所述土拨鼠肝炎转录后调控元件与SEQ ID NO:61至63中的任一个具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性。任选地，所述多核苷酸包含土拨鼠肝炎转录后调控元件，其与SEQ ID NO 61至63中的任一个具有至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性。任选地，所述多核苷酸包含土拨鼠肝炎转录后调控元件，其与SEQ ID NO:61至63中的任一个具有至少98％同一性。任选地，所述多核苷酸包含土拨鼠肝炎转录后调控元件，其具有SEQ ID NO:61至63中的任一个的序列。任选地，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:61至63中的任一个的土拨鼠肝炎转录后调控元件。任选地，所述多核苷酸包含土拨鼠肝炎转录后调控元件，其由SEQ ID NO:61至63中的任一个组成。在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸不包含土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)。
本发明的多核苷酸还可包含一个或两个ITR。在一个实施方案中，所述ITR或每个ITR的核苷酸序列的长度少于157个核苷酸、少于154个核苷酸或为约145个核苷酸。任选地，所述ITR或每个ITR是野生型ITR。任选地，所述ITR或每个ITR是AAV2 ITR。
本发明的多核苷酸还可包含poly A序列。所述poly A序列可位于编码本发明经修饰的GCase多肽的经修饰的GBA核苷酸序列的下游。所述poly A序列可以是牛生长激素polyA序列(bGHpA–SEQ ID NO:58)。所述poly A序列的长度可为250至270个核苷酸。
本发明的多核苷酸还包含内含子序列，诸如病毒内含子序列，任选地SV40内含子序列(SEQ ID NO:57)。
在一些实施方案中，包含至少一个突变的经修饰的GCase多肽可在宿主细胞中以比本文所述的参考GCase多肽高的水平表达。例如，包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相较于参考GCase多肽可以以至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍或至少5倍高表达。任选地，包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽的表达相较于参考GCase多肽可以以1.1倍至5倍、1.2倍至5倍、1.5倍至5倍、1.8倍至5倍、2倍至5倍、2.5倍至5倍、3.5倍至5倍、4倍至5倍或4.5倍至5倍高表达。
GCase多肽的表达水平(以及因此经修饰的GCase多肽在宿主细胞中是否以比参考GCase多肽高的水平表达)通常可通过测量样品中GCase多肽的水平来确定。可将宿主细胞中本发明经修饰的GCase多肽的表达水平与宿主细胞中参考GCase多肽的表达水平进行比较。这可定量测定。例如，GCase多肽的表达水平可通过如上所述的ELISA测定法来确定。或者，可以例如通过SDS-PAGE电泳或蛋白质印迹半定量测定GCase多肽的表达水平。
宿主细胞分泌的GCase多肽的水平可用于测定GCase多肽的表达水平(即，与宿主细胞保留在细胞内的GCase多肽的水平相反)。任选地，本发明的GCase多肽由宿主细胞以比参考GCase多肽更高的水平分泌。例如，包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相较于参考GCase多肽可以以至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍或至少5倍高的水平分泌。任选地，包含所述至少一个突变的经修饰的GCase多肽相较于参考GCase多肽可以以1.1倍至5倍、1.2倍至5倍、1.5倍至5倍、1.8倍至5倍、2倍至5倍、2.5倍至5倍、3.5倍至5倍、4倍至5倍或4.5倍至5倍高的水平分泌。
宿主细胞分泌的GCase多肽的水平可以例如通过从含有GCase多肽的液体(例如，生物样品，诸如血液、血清或血浆，或培养基，诸如培养表达GCase多肽的宿主细胞的条件培养基)中分离细胞(例如，宿主细胞)并测定液体中GCase多肽的表达水平来测定。例如，可通过离心或过滤来分离细胞，和/或可以从细胞中倾析(例如，通过移液)液体。可在生物样品，诸如血液、血清或血浆中测定Gcase多肽的表达水平，或者可在培养基，诸如培养表达GCase多肽的宿主细胞的条件培养基中测定Gcase多肽的表达水平。
宿主细胞可以是任何真核细胞，诸如哺乳动物细胞或昆虫细胞。宿主细胞可以是表达本发明的经修饰的GCase多肽(或参考GCase多肽)的任何真核宿主细胞。任选地，所述宿主细胞可以是表达本发明的经修饰的GCase多肽(或参考GCase多肽)的昆虫细胞。通常，宿主细胞可以是表达本发明经修饰的GCase多肽(或参考GCase多肽)的哺乳动物宿主细胞。哺乳动物宿主细胞包括人(例如Expi293F人胚胎肾细胞)、狗、猪、小鼠、仓鼠或豚鼠细胞。更具体地，宿主细胞可以是哺乳动物肝细胞，更具体地可以是人肝细胞。任选地，宿主细胞可以是Huh7细胞。任选地，宿主细胞可以是生物体内的宿主细胞。任选地，表达可以是体内表达。任选地，表达可以是体内表达，并且可以测定血浆中的表达。
包含所述多核苷酸的病毒颗粒
本发明还提供了包含重组基因组的病毒颗粒，所述重组基因组包含本发明的多核苷酸。出于本发明的目的，术语“病毒颗粒”是指全部或部分病毒体。例如，病毒颗粒包含重组基因组，并且还可包含衣壳。病毒颗粒可以是基因疗法载体。在本文中，术语“病毒颗粒”和“载体”可互换使用。出于本申请的目的，“基因疗法”载体是可用于基因疗法的病毒颗粒，即包含施用后在宿主细胞中表达转基因(诸如GBA核苷酸序列)所需的所有功能元件的病毒颗粒。
合适的病毒颗粒包括细小病毒、逆转录病毒、慢病毒或单纯疱疹病毒。细小病毒可以是腺相关病毒(AAV)。任选地，病毒颗粒是AAV、腺病毒或慢病毒颗粒。病毒颗粒优选是重组AAV载体或慢病毒载体。更优选地，病毒颗粒是AAV病毒颗粒。除非上下文中另有明显暗示，否则术语“AAV”和“rAAV”在本文中可互换使用。
所有已知AAV血清型的基因组结构非常相似。AAV的基因组是长度小于约5,000个核苷酸的线性单链DNA分子。反向末端重复序列(ITR)位于非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列的侧翼。VP蛋白(VP1、VP2和VP3)形成衣壳。末端约145nt(ITR)是自互补的和组织化的，因此可以形成能量稳定的分子内双链体，形成T形发夹。这些发夹结构作为病毒DNA复制的起点，充当细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中野生型(wt)AAV感染后，Rep基因(即编码Rep78和Rep52蛋白)分别从P5启动子和P19启动子表达，并且这两种Rep蛋白在病毒基因组的复制中具有功能。Rep ORF中的剪接事件导致四种Rep蛋白(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已经表明，哺乳动物细胞中编码Rep78和Rep52蛋白的未拼接的mRNA足以用于AAV载体的生产。同样在昆虫细胞中，Rep78和Rep52蛋白足以用于AAV载体的生产。
本发明的重组病毒基因组可包含ITR。重组基因组或病毒颗粒可包含一个或两个ITR，诸如上述的ITR。本发明的AAV载体可能仅与一个ITR一起发挥作用。因此，病毒基因组通常包含至少一个ITR，但更通常地，包含两个ITR(通常病毒基因组的两端各有一个，即一个在5’端，一个在3’端)。在本发明的多核苷酸与一个或多个ITR之间可以有间插序列。可将多核苷酸掺入病毒颗粒中，位于两个常规ITR之间或位于用两个D区改造的ITR任一侧。
可用于本发明生产AAV载体的AAV序列可源自任何AAV血清型的基因组。通常，AAV血清型在氨基酸和核酸水平上具有拥有显著同源性的基因组序列，提供相同的一组遗传功能，产生基本上物理和功能等同的病毒体，并通过实际上相同的机制复制和装配。关于各种AAV血清型的基因组序列和基因组相似性的概述，参见例如GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；Chiorini等人，1997；Srivastava等人，1983；Chiorini等人，1999；Rutledge等人，1998和Wu等人，2000。AAV血清型1、2、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11或12可用于本发明。当用于基因疗法载体的生产时，可对来自AAV血清型的序列进行突变或改造。
任选地，AAV载体包含源自AAV1、AAV2、AAV4和/或AAV6的ITR序列。优选地，所述ITR序列是AAV2 ITR序列。在本文中，术语AAVx/y是指包含基因组成分诸如至少来自AAVx的ITR(其中x是AAV血清型编号)并具有来自AAVy的衣壳(其中y是相同或不同血清型的编号)的病毒颗粒。例如，AAV2/8载体可包含病毒基因组的一部分，包括来自AAV2株的ITR和来自AAV8株的衣壳。
在一个实施方案中，所述病毒颗粒是包含衣壳的AAV病毒颗粒。AAV衣壳通常由三种蛋白VP1、VP2和VP3形成。VP1的氨基酸序列包含VP2的序列。不构成VP2的部分的VP1部分被称为VP1unique或VP1U。VP2的氨基酸序列包含VP3的序列。不构成VP3的部分的VP2部分被称为VP2unique或VP2U。任选地，病毒颗粒包含嗜肝或嗜CNS的衣壳。病毒颗粒(衣壳)是否对特定组织具有嗜性可以例如通过施用这种表达标记基因诸如萤光素酶的颗粒并在多个时间点进行体内成像来评估(例如如Zincarelli等人(2008),Molecular Therapy,16:1073-1080中所述)。分别驱动肝脏或CNS组织中强标志物表达(特别是如果与在其它组织中的较低表达相反)的颗粒将被认为是嗜肝性的或嗜CNS性的。
在一些实施方案中，所述嗜肝衣壳可以是AAV3衍生、AAV3B衍生、AAV5衍生或AAV8衍生的衣壳。任选地，所述嗜肝衣壳可以是AAV3衍生、AAV3B衍生或AAV 8衍生的衣壳。任选地，所述嗜肝衣壳可以是AAV3衍生的或AAV3B衍生的衣壳。任选地，所述嗜肝衣壳包含与SEQID NO:36、37或38的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段具有至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的序列。任选地，所述嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:36具有至少99％同一性的多肽。任选地，所述嗜肝衣壳包含与SEQID NO:37具有至少99％同一性的多肽。任选地，所述嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:38具有至少99％同一性的多肽。任选地，所述嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:36、37或38的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段具有100％同一性的序列。任选地，所述嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:36具有100％同一性的序列。任选地，所述嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:37具有100％同一性的序列。任选地，所述嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:38具有100％同一性的序列。任选地，所述嗜CNS衣壳包含与SEQ ID NO:39的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段具有至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的序列。任选地，所述嗜CNS衣壳包含与SEQ IDNO:39的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段具有至少100％同一性的序列。任选地，所述嗜CNS衣壳包含与SEQ ID NO:39具有至少99％同一性的序列。任选地，所述嗜CNS衣壳包含与SEQ ID NO:39具有100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述嗜CNS衣壳可以是AAV9或AAVrh.10衍生的衣壳。本发明的病毒颗粒可以是“杂交”颗粒，其中病毒ITR和病毒衣壳来自不同的细小病毒，诸如不同的AAV血清型。优选地，病毒ITR和衣壳来自AAV的不同血清型，在这种情况下，此类病毒颗粒被称为转衣壳化的(transcapsidated)或假型化的。同样，细小病毒可具有“嵌合”衣壳(例如，含有来自不同细小病毒，优选不同AAV血清型的序列)或“靶向”衣壳(例如，定向嗜性(directedtropism))。
在一些实施方案中，所述重组AAV基因组包含完整的ITR，其包含功能性末端解链位点(terminal resolution site)(TRS)。这种AAV基因组可含有一个或两个可解链的ITR，即含有功能性TRS的ITR，在该功能性TRS上可以发生位点特异性缺刻以产生游离的3’羟基，该羟基可作为DNA聚合酶解链和复制ITR的底物。
优选地，所述重组基因组是单链的(即，其以单链形式包装在病毒颗粒中)。任选地，所述重组基因组不以自互补构型包装，即所述基因组不包含具有在病毒颗粒中退火的大体自互补部分的单个共价连接的多核苷酸链。或者，可以以“单体双链体”形式包装重组基因组。WO 2011/122950中描述了“单体双链体”。所述基因组可被包装成两个大体互补但非共价连接的多核苷酸，它们在病毒颗粒中退火。
如上所述，本发明的多核苷酸可包含polyA序列。因此，所述重组基因组或病毒颗粒可包含polyA序列，如上述的polyA序列。
如上所述，本发明的多核苷酸可包含内含子序列。因此，本发明的重组基因组或病毒颗粒可包含内含子序列，诸如上述内含子序列。
在一个实施方案中，所述病毒颗粒包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含转录调控元件(包含例如启动子和/或增强子)、经修饰的GBA核苷酸序列和polyA序列，诸如bGHpA序列。在此类实施方案中，所述polyA序列，诸如bGHpA序列，可位于经修饰的GBA核苷酸序列的下游。在一些实施方案中，所述病毒颗粒包含AAV2 ITR和polyA序列(诸如bGHpA序列)。
在一个实施方案中，所述病毒颗粒包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含转录调控元件(包含例如启动子和/或增强子)、内含子序列(诸如SV40内含子序列)、经修饰的GBA核苷酸序列和polyA序列，诸如bGHpA序列。在此类实施方案中，内含子序列，诸如SV40内含子序列，可位于转录调控元件与经修饰的GBA核苷酸序列之间。在此类实施方案中，polyA序列，诸如bGHpA序列，可位于经修饰的GBA核苷酸序列的下游。在一些实施方案中，病毒颗粒包含AAV2ITR、poly A序列(诸如bGHpA序列)和/或内含子(诸如SV40内含子)。
在一些实施方案中，与将包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒转导至宿主细胞(例如，Huh-7细胞)中后参考GCase多肽的有效活性相比，在将本发明的病毒颗粒转导至宿主细胞(例如，Huh-7细胞)后，经修饰的GCase多肽的有效活性相同或更高。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:41或44的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:41或44的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:6或10的核苷酸序列。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ IDNO:43或46的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:43或46的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:22或26的核苷酸序列。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:42或45的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:42或45的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:14或18的核苷酸序列。在一些实施方案中，参考GCase多肽是野生型GCase多肽。任选地，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:1或2的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:1或2的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:59或60的核苷酸序列。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性更高。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性为其至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍或至少70倍。任选地，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性为其至少50倍、至少60倍或至少70倍。任选地，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性为其高达50倍、高达60倍、高达70倍、高达80倍或高达100倍。任选地，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性为其2倍至100倍、3倍至100倍、5倍至100倍、15倍至100倍、20倍至100倍、30倍至100倍、40倍至100倍、50倍至100倍或70倍至100倍。任选地，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性为其2倍至80倍、5倍至80倍、20倍至80倍或50倍至80倍。任选地，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性为其2倍至70倍、2倍至10倍、3倍至20倍、5倍至10倍、15倍至30倍、20倍至40倍、30倍至50倍、40倍至60倍或50倍至70倍。在一些实施方案中，参考GCase多肽是野生型GCase多肽。任选地，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:1或2的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:1或2的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:59或60的核苷酸序列。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:41或44的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:41或44的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:6或10的核苷酸序列。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:43或46的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:43或46的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:22或26的核苷酸序列。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:42或45的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:42或45的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:14或18的核苷酸序列。任选地，经修饰的GCase多肽的有效活性是由SEQ ID NO:14或18的序列编码的GCase多肽的有效活性的至少50％、至少60％、至少750％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。任选地，所述宿主细胞是Huh-7细胞。任选地，本发明的病毒颗粒和其它方面相同的病毒颗粒包含SEQ ID NO:37的衣壳。
将经修饰的GCase多肽的有效活性描述为与参考GCase多肽的有效活性“相同”是指经修饰的GCase多肽的有效活性可以与参考GCase多肽的有效活性±10％、更特别地±5％或更特别地±1％相同。
包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的“在其它方面相同”的病毒颗粒是除了GBA核苷酸序列不同外与本发明的病毒颗粒相同(即，病毒颗粒包含相同的衣壳，重组基因组包含相同的转录调控元件等)的病毒颗粒。例如，被比较的编码不同GCase多肽的不同GBA核苷酸序列与相同的启动子序列可操作地连接。
在一些实施方案中，施用本发明的病毒颗粒后，与施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒后参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在肝脏、血浆、白细胞、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的有效活性相同或更高。在一些实施方案中，施用本发明的病毒颗粒后，与施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒后参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在肝脏中的有效活性相同或更高。在一些实施方案中，施用本发明的病毒颗粒后，与施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒后参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在血浆、白细胞、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的有效活性相同或更高。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在骨髓、脾脏和/或血浆中的有效活性相同或更高。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在脾脏、肺和/或骨髓中的有效活性相同或更高。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:41或44的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:41或44的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:6或10的核苷酸序列。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:43或46的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:43或46的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:22或26的核苷酸序列。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:42或45的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:42或45的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:14或18的核苷酸序列。在一些实施方案中，参考GCase多肽是野生型GCase多肽。任选地，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:1或2的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:1或2的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:59或60的核苷酸序列。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性更高。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性为其至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍或至少70倍。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性为其至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍或至少10倍。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在血浆中的有效活性为其至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍或至少10倍。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性为其至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍或至少40倍。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在血浆中的有效活性为其至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍或至少40倍。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性为其至少2倍、至少3倍或至少4倍。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在脾脏中的有效活性为其至少2倍、至少3倍或至少4倍。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在骨髓中的有效活性为其至少2倍、至少3倍或至少4倍。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性为其2倍至5倍、2倍至10倍、3倍至7倍、3倍至20倍、5倍至10倍、15倍至30倍、20倍至40倍、30倍至50倍、40倍至60倍或50倍至70倍。在一些实施方案中，与参考GCase多肽的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性为其2倍至20倍、2倍至15倍、2倍至10倍、2倍至7倍、2倍至5倍或3倍至5倍。在一些实施方案中，参考GCase多肽是野生型GCase多肽。任选地，参考GCase多肽包含SEQ IDNO:1或2的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:1或2的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:59或60的核苷酸序列。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:41或44的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:41或44的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:6或10的核苷酸序列。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:43或46的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:43或46的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ IDNO:22或26的核苷酸序列。在一些实施方案中，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:42或45的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:42或45的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:14或18的核苷酸序列。在一些实施方案中，经修饰的GCase多肽的有效活性是由SEQ ID NO:14或18的序列编码的GCase多肽的有效活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。任选地，本发明的病毒颗粒和其它方面相同的病毒颗粒包含AAV8衣壳。
在一些实施方案中，在从施用本发明的病毒颗粒起至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量有效活性。优选地，在12周时或12周之后测量有效活性。例如，可将从施用本发明的病毒颗粒起至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或至少12周(例如在12周时)的有效活性分别与从施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒起至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或至少12周(例如在12周时)后的水平进行比较。作为具体的实例，可在从施用本发明的病毒颗粒起至少12周后(例如在12周时)测量有效活性水平，并将其与从施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒起至少12周后(例如在12周时)测量的水平进行比较。优选地，在施用后的同一时间点，在同一测定中测量有效活性水平。
在一些实施方案中，使用荧光测定法(诸如本文所述的那些)，例如使用对GCase特异的荧光底物测量GCase有效活性。荧光底物可以是如本文所述的。
在一些实施方案中，与GCase酶替代疗法的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在血浆、肝脏、白细胞、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的有效活性相同或更高。在一些实施方案中，与GCase酶替代疗法的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在肝脏、白细胞、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的有效活性相同或更高。在一个实施方案中，与GCase酶替代疗法的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在骨髓和/或肺组织中的有效活性相同或更高。
在一个实施方案中，与GCase酶替代疗法的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性更高。在一个实施方案中，与GCase酶替代疗法的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性为其至少1.1倍、至少1.2倍或至少1.3倍。在一个实施方案中，与GCase酶替代疗法的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在肺组织中的有效活性为其至少1.5倍或至少2倍。
在一个实施方案中，优选在受试者开始治疗后至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量有效活性时，与GCase酶替代疗法的有效活性相比，经修饰的GCase多肽的有效活性(例如，在受试者中)更高。优选地，在12周时或12周之后测量有效活性。
“Gcase酶替代疗法”可以指包括向受试者施用GCase多肽的任何疗法。Gcase多肽可以是野生型，诸如具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的GCase多肽和/或维拉苷酶α。Gcase多肽可以以任何合适的剂量(任选地以40-100U/kg BW、50-80U/kg BW、60-70U/kg BW或约60U/kg BW的剂量)施用。Gcase多肽可通过任何合适的途径施用，任选通过静脉内注射或皮下注射施用。优选在施用一剂(例如，前一剂)GCase酶替代疗法后2小时测量Gcase酶替代疗法的有效活性。举例来说，当每两周向受试者施用GCase酶替代疗法时，在12周时测量GCase酶替代疗法的有效活性将涉及在施用第12周(即第7)剂量后2小时从受试者获得组织样品。任选地，测量GCase酶替代疗法的有效活性包括每两周施用的GCase酶替代疗法的剂量。任选地，测量GCase酶替代疗法的有效活性包括施用GCase酶替代疗法的剂量至少12或12周。任选地，测量GCase酶替代疗法的有效活性包括每两周施用GCase酶替代疗法的剂量，并且在施用最终剂量的GCase酶替代疗法后2小时测量GCase酶替代疗法的有效活性。
在一个实施方案中，施用病毒颗粒后，与如上所述施用GCase酶替代疗法后的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平相比，血浆、肝脏、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平更低。在一个相关实施方案中，在施用病毒颗粒后，与患有戈谢病的受试者中(例如，在相同或等同器官中)的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平相比，血浆、肝脏、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平更低。任选地，在施用病毒颗粒后，己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平低于施用GCase酶替代疗法后的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的50％、40％、30％、25％、10％或介于其0％与25％之间。任选地，在施用病毒颗粒后，己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平低于患有戈谢病的受试者(例如，在相同或等同器官中)的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的50％、40％、30％、25％、10％或介于其0％与25％之间。在一个实施方案中，通过质谱法，例如通过实施例13中描述的方法测量己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平。患有戈谢病的受试者可以是戈谢病模型生物，诸如戈谢病的小鼠模型(例如9V/无效小鼠)。
在一些实施方案中，在施用病毒颗粒后，与施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒后的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平相比，血浆、肝脏、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平较低。任选地，在施用病毒颗粒后，己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平低于施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒后的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平的50％、40％、30％、25％、10％或介于其0％与25％之间。任选地，参考GCase多肽是野生型GCase多肽。任选地，参考GCase多肽包括SEQ ID NO:1或2的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:1或2的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:59或60的核苷酸序列。任选地，在施用病毒颗粒后，己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平低于患有戈谢病的受试者(例如，在相同或等同器官中)的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的50％、40％、30％、25％、10％或介于其0％与25％之间。在一个实施方案中，通过质谱法，例如通过实施例13中描述的方法测量己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平。患有戈谢病的受试者可以是戈谢病模型生物，诸如戈谢病的小鼠模型(例如9V/无效小鼠)。
在一个实施方案中，在施用病毒颗粒后，与如上所述施用GCase酶替代疗法后储藏细胞的数量或活化巨噬细胞的水平相比，在肝或肺组织(和/或任何其它受戈谢病影响的器官)中储藏细胞的数量或活化巨噬细胞的水平更低。任选地，储藏细胞的数量少于施用GCase酶替代疗法后储藏细胞数量的50％、40％、30％、25％、15％或介于其0％与25％之间。任选地，活化的巨噬细胞的水平低于施用GCase酶替代疗法后活化的巨噬细胞的水平的50％、40％、30％、25％、15％或介于其0％至25％之间。
在一个实施方案中，在施用病毒颗粒后至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后，测量己糖基鞘氨醇的水平、己糖基神经酰胺的水平、储藏细胞的数量和/或活化的巨噬细胞的水平。优选地，在12周时或12周后测量己糖基鞘氨醇的水平、己糖基神经酰胺的水平、储藏细胞的数量和/或活化的巨噬细胞的水平。
在一些实施方案中，在从施用病毒颗粒起至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平。优选地，在12周时或12周后测量己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平。例如，可将从施用本发明的病毒颗粒起至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或至少12周(例如在12周时)的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平分别与从施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒起至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或至少12周(例如在12周时)后的水平进行比较。作为一个具体的实例，可在从施用本发明的病毒颗粒起至少12周后(例如在12周时)测量己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平，并将其与从施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒起至少12周后(例如在12周时)测量的水平进行比较。优选地，在施用后的同一时间点，在相同测定中测量己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平。
当在GCase酶替代疗法后测量己糖基鞘氨醇的水平、己糖基神经酰胺的水平、储藏细胞的数量和/或活化的巨噬细胞的水平时，优选在施用一剂(例如前一剂)Case酶替代疗法后2小时测量己糖基鞘氨醇的水平、己糖基神经酰胺的水平、储藏细胞的数量和/或活化的巨噬细胞的水平。举例来说，当每两周向受试者施用GCase酶替代疗法时，在第12周时测量己糖基鞘氨醇的水平、己糖基神经酰胺的水平、储藏细胞的数量和/或活化的巨噬细胞的水平将涉及在施用第12周(即第7)剂量后两小时从受试者获得组织样品。任选地，在施用GCase酶替代疗法后测量己糖基鞘氨醇的水平、己糖基神经酰胺的水平、储藏细胞的数量和/或活化的巨噬细胞的水平包括每两周施用GCase酶替代疗法的剂量。任选地，在施用GCase酶替代疗法后测量己糖基鞘氨醇的水平、己糖基神经酰胺的水平、储藏细胞的数量和/或活化的巨噬细胞的水平包括施用GCase酶替代疗法的剂量至少12或12周。任选地，在施用GCase酶替代疗法后测量己糖基鞘氨醇的水平、己糖基神经酰胺的水平、储藏细胞的数量和/或活化的巨噬细胞的水平包括每两周施用GCase酶替代疗法的剂量，并且在施用最后剂量的GCase酶替代疗法后2小时测量施用GCase酶替代疗法后的己糖基鞘氨醇的水平、己糖基神经酰胺的水平、储藏细胞的数量和/或活化的巨噬细胞的水平。
在一个实施方案中，通过显微镜检查测量储藏细胞的数量。在一个实施方案中，通过使用免疫组织化学测量CD68密度来检测活化的巨噬细胞的水平。鉴定储藏细胞和/或CD68阳性细胞可通过本领域已知的方法，诸如通过免疫组织化学或显微镜检查(例如实施例13中描述的方法)来进行。
在一个实例中，己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平的降低可以分别代表葡糖神经酰胺和/或葡糖鞘氨醇水平的降低。例如，己糖基神经酰胺的减少可能代表葡糖神经酰胺的减少。作为另一个实例，己糖基鞘氨醇水平的降低可以代表葡糖鞘氨醇水平的降低。
组合物、方法和用途
在本发明的另一方面，提供了包含本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸或载体/病毒颗粒和药学上可接受的赋形剂的组合物。
所述药学上可接受的赋形剂可包括载体、稀释剂和/或其它药物、药剂或佐剂等。任选地，所述药学上可接受的赋形剂包括盐水溶液。任选地，所述药学上可接受的赋形剂包括人血清白蛋白。
本发明还提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、载体/病毒颗粒或组合物用于治疗方法中。任选地，所述治疗方法包括向患者施用有效量的本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、载体/病毒颗粒或组合物。
本发明还提供了治疗方法，其包括向患者施用有效量的本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、载体/病毒颗粒或组合物。
本发明还提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、载体/病毒颗粒或组合物在制备用于治疗方法的药物方面的用途。任选地，所述治疗方法包括向患者施用有效量的本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、载体/病毒颗粒或组合物。
任选地，所述治疗方法是基因疗法。“基因疗法”涉及施用本发明的载体/病毒颗粒，其能够在施用了其的宿主(例如患者)中表达转基因(诸如GBA核苷酸序列)。
任选地，所述治疗方法是GCase酶替代疗法。“Gcase酶替代疗法”可以指包括向受试者施用GCase多肽的任何疗法。可施用本发明的经修饰的GCase多肽。经修饰的GCase多肽可以以任何合适的剂量，任选地以40至100U/kg BW、50至80U/kg BW、60至70U/kg BW或约60U/kg BW的剂量施用。GCase多肽可以通过任何合适的途径施用，任选通过静脉内注射或皮下注射施用。
任选地，所述治疗方法是治疗与GCase缺乏相关联的疾病的方法。如上所述，GCase缺乏可导致葡糖脑苷脂在浸润许多重要器官的巨噬细胞中积聚，这可导致包括新纽蛋白病变(如WO08/144591中所述)或帕金森病在内的多种疾病。任选地，所述治疗方法是治疗帕金森病或新纽蛋白病变的方法。任选地，所述治疗方法是治疗帕金森病的方法。任选地，所述治疗方法是治疗路易体痴呆、周围神经病、多系统萎缩或纯自主神经衰竭的方法。
任选地，所述治疗方法是治疗溶酶体贮积症诸如戈谢病(GD)，例如I型、II型或III型GD的方法。优选地，所述溶酶体贮积症的特征在于瘀伤、疲劳、贫血、低血小板计数和肝脾肿大。任选地，所述治疗方法是治疗GD的方法。任选地，所述治疗方法是治疗I型GD的方法。任选地，治疗方法是治疗II型GD的方法。任选地，所述所述治疗方法是治疗III型GD的方法。在一些实施方案中，所述患者是患有GD的患者。在一些实施方案中，所述患者是患有I型GD的患者。在一些实施方案中，所述患者是患有II型GD的患者。在一些实施方案中，所述患者是患有III型的患者。任选地，所述患者具有针对重组GCase(例如伊米苷酶、维拉苷酶α或他利苷酶α(taliglucerase alfa))的抗体或抑制剂，所述患者先前已经用所述抗体或抑制剂作为酶替代疗法的一部分进行了治疗。
任选地，所述治疗方法是治疗尼曼-匹克病(例如尼曼-匹克C型(NPC))的方法。
任选地，静脉内施用所述经修饰的GCase多肽、多核苷酸、载体/病毒颗粒和/或组合物。任选地，仅向患者施用一次(即单剂量)所述经修饰的GCase多肽、多核苷酸、载体/病毒颗粒和/或组合物。
任选地，将经修饰的GCase多肽、多核苷酸、载体/病毒颗粒和/或组合物例如通过直接注射入受试者的脑和/或脊髓来直接施用于受试者的CNS。任选地，直接注射是脑内注射、脑室内注射、脑池内注射、脑实质内注射、鞘内注射或其任意组合。任选地，对流增强递送(convection enhanced dekivery,CED)用于直接注射至受试者的CNS。CED是一直治疗策略，其包括外科手术暴露脑并将小直径导管直接放置到脑的靶区域，随后将治疗剂(例如本文所述的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、载体/病毒颗粒和/或组合物)直接输注至受试者的脑。CED描述于例如Debinski等人(2009)Expert Rev Neurother.9(10):1519-27中。任选地，例如通过外周注射向受试者外周施用经修饰的GCase多肽、多核苷酸、载体/病毒颗粒和/或组合物。任选地，外周注射是皮下注射、静脉内注射、动脉内注射(例如注射到受试者的颈动脉中)、腹膜内注射或其任意组合。任选地，向受试者的CNS外周和直接施用经修饰的GCase多肽、多核苷酸、载体/病毒颗粒和/或组合物。例如，在一些实施方案中，通过动脉内注射(例如，注射入颈动脉)和实质内注射(例如，通过CED进行实质内注射)向受试者施用组合物。任选地，对CNS的直接注射和外周注射同时进行。任选地，直接注射在外周注射之前(例如，在外周注射之前1分钟至1周或更长时间)进行。任选地，直接注射在外周注射之后(例如，在外周注射之后1分钟至1周或更长时间)进行。
任选地，通过注射到肾动脉中来施用经修饰的GCase多肽、多核苷酸、载体/病毒颗粒和/或组合物。任选地，通过逆行施用，例如使用导尿管经由输尿管施用经修饰的GCase多肽、多核苷酸、载体/病毒颗粒和/或组合物。
当如本文所述(例如在本发明的方法或用途中)“治疗”疾病或病症(例如GD，诸如I型GD)时，这意味着所述疾病或病症(例如GD，诸如I型GD)的一个或多个症状得到改善。这并不意味着所述疾病或病症(例如GD，诸如I型GD)的症状得到完全治疗，使得它们不再存在于患者中，尽管在一些方法中，情况可能是这样。因此，在所有情况下，术语“治疗(treatment)”或“处理(treating)”可以分别用术语“改善(amelioration)”或“缓解(ameliorating)”代替。本发明的方法或用途(诸如治疗(treatment)或治疗(treating)的方法)可导致疾病或病症(例如GD，诸如I型GD)的一种或多种症状不如治疗前严重。任选地，相对于施用前的情况，本发明的方法或用途(诸如治疗(treatment)或治疗(treating)的方法)导致患者血液中循环GCase的量/浓度增加，和/或在给定体积的患者的血液和/或巨噬细胞中可检测到的GCase活性的总体水平升高。在一个实施方案中，相对于施用前的情况，本发明的方法或用途(例如治疗(treatment)或治疗(treating)的方法)导致以下一种或多种情况：血红蛋白浓度增加；血小板计数增加；脾脏体积缩小；肝脏尺寸缩小。
另外，本发明的方法或用途可以“预防”诸如戈谢病等疾病。戈谢病通常与葡糖脑苷脂酶在各种组织中的积累相关，如果对年轻受试者(诸如青少年、年轻人、儿童或婴儿)实施本发明的方法或用途，应该可以防止戈谢病的发生。因此，在所有情况下，术语“治疗(treatment)”或“处理(treating)”可以分别用术语“预防(prevention)”或“预防(preventing)”代替。
“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗效果，诸如提高受试者中功能性GCase的水平(从而导致以足以改善所述疾病或病症诸如GD(例如I型GD)的症状的水平产生功能性GCase)的量。
任选地，以低于1x 1011、低于2x 1011、低于1x 1012、低于5x 1012、低于2x 1012、低于1.5x 1012、低于3x 1012、低于1x 1013、低于2x 1013或低于3x 1013个载体基因组/kg患者体重(vg/kg)的剂量施用所述载体/病毒颗粒。任选地，选择施用的载体/病毒颗粒的剂量，使得受试者以未患有GD的健康受试者的水平的10％-90％、20％-80％、30％-70％、25％-50％、20％-150％、30％-140％、40％-130％、50％-120％、60％-110％或70％-100％的水平表达GCase。
本发明还提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于治疗疾病，其中与野生型GCase多肽(诸如由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽)相比，经修饰的GCase多肽或编码的经修饰的GCase多肽在pH 7.4下可具有增强的稳定性。任选地，当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽或编码的经修饰的GCase多肽保留SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽保留的活性的至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.8倍或至少2倍高的活性。任选地，当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽或编码的经修饰的GCase多肽保留SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽保留的活性的至少3倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍或至少15倍高的活性。
本发明还提供了通过施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物来治疗疾病的方法，其中所述经修饰的GCase多肽或编码的经修饰的GCase多肽与参考野生型GCase多肽(诸如由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽)相比，在pH7.4下可具有增强的稳定性。任选地，当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽或编码的经修饰的GCase多肽保留SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽保留的活性的至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.8倍或至少2倍高的活性。任选地，当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽或编码的经修饰的GCase多肽保留SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽保留的活性的至少3倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍或至少15倍高的活性。
本发明还提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物治疗疾病的用途，其中经修饰的GCase多肽或编码的经修饰的GCase多肽与野生型GCase多肽(诸如由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽)相比，在pH 7.4下可具有增强的稳定性。任选地，当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽或编码的经修饰的GCase多肽保留SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽保留的活性的至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.8倍或至少2倍高的活性。任选地，当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，经修饰的GCase多肽或编码的多肽保留高为SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽保留的活性的至少3倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍或至少15倍高的活性。
本发明还提供了用于治疗疾病的本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其包括施用与需要施用的包含或编码由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽的等同多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物的剂量相比更低的剂量的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
本发明还提供了通过施用本发明的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物来治疗疾病的方法，其中治疗疾病包括施用比需要施用的包含或编码由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽的等同多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物的剂量更低的剂量的本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
本发明还提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物治疗疾病的用途，其中治疗疾病包括施用比需要施用的包含或编码由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽的等同多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物的剂量更低的剂量的本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
关于短语“治疗疾病”，该“疾病”可以是上面讨论的任何一种疾病或病症。因此，治疗疾病可以是治疗受试者或患者的溶酶体贮积症，诸如戈谢病(GD)，例如I型、II型或III型GD。优选地，溶酶体贮积症的特征在于瘀伤、疲劳、贫血、低血小板计数和肝脾肿大。任选地，“治疗疾病”可以指治疗受试者或患者的GD，例如I型GD。在一些实施方案中，受试者或患者是患有GD例如I型GD的受试者或患者。
关于“包含或编码由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽的等同多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物”，“等同”多肽包含(或者是)由SEQ ID NO:40编码的GCase多肽。“等同”多核苷酸与被比较的本发明的多核苷酸相同，只是“等同”多核苷酸编码由SEQID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽而不是本发明的经修饰的GCase多肽。“等同”病毒颗粒与被比较的本发明的病毒颗粒相同，只是“等同”病毒颗粒编码由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽而不是本发明的经修饰的GCase多肽。“等同”组合物与被比较的本发明组合物相同，只是“等同”组合物包含或编码由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽而不是本发明的经修饰的GCase多肽。
一方面，提供了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物在制备药物方面的用途，所述药物用于在患有与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者中：
(i)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(ii)减少储藏细胞的数量；和/或
(iii)降低活化的巨噬细胞的水平。
一方面，提供了通过向患有与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物，在所述受试者中
(i)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(ii)减少储藏细胞的数量；和/或
(iii)降低活化的巨噬细胞的水平
的方法。
任选地，
(i)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(ii)减少储藏细胞的数量；和/或
(iii)降低活化的巨噬细胞的水平；
治疗与GCase缺乏相关的疾病或疾患。
一方面，本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于在患有与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者中
(iv)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(v)减少储藏细胞的数量；和/或
(vi)降低活化的巨噬细胞的水平的方法，
任选地其中
(iv)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(v)减少储藏细胞的数量；和/或
(vi)降低活化的巨噬细胞的水平
导致与GCase缺乏相关的疾病或疾患的治疗。
任选地，在施用后至少6周、至少8周、至少10周、至少12周或12周测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平。当与施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物时的(起始)己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平相比时，己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平可降低至1/2或更少、1/3或更少、1/4或更少、1/5或更少、1/6或更少、1/3至1/2、1/4至1/2、1/5至1/2、1/6至1/2或1/5至1/3。例如，在施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物后(例如施用后至少6周、至少8周、至少10周、至少12周或12周)，当与施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物时的(起始)己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平相比时，患者中的己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平可为50％或更少、40％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少。任选地，当与健康受试者或未患有与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者相比时，患者可具有升高的己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平，即，在施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物之前，当与健康受试者或未患有与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者相比时，患者具有升高的己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平。例如，在测量患者/受试者的肺、脾脏、肝脏和/或骨髓中的己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平。任选地，测量肺、脾脏、肝脏和/或骨髓中的己糖基神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平包括基于在小鼠研究中获得的数据估计肺、脾脏、肝脏和/或骨髓中的己糖基神经酰胺水平和/或己糖神经鞘氨醇水平。例如，通过测试GCase多肽是否能降低小鼠脾脏中的己糖基鞘氨醇水平，可以测试GCase多肽是否能降低患者脾脏中的己糖基鞘氨醇水平。可测量患者/受试者的血清和/或白细胞(例如巨噬细胞)中的己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平。可测量患者/受试者血浆中的己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平。测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平的方法在本领域中是已知的，并且优选使用质谱法(LC/MS分析)，例如通过实施例13中描述的方法测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇的水平。
任选地，优选在治疗开始后至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平时，己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇的水平(例如在患者/受试者的肺、血清、白细胞(例如巨噬细胞)、脾脏、肝脏和/或骨髓中；另一个实例是在患者/受试者的血浆中)的降低大于从GCase酶替代疗法获得的降低。例如，可将从施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物起至少6周(例如，在6周时)、至少8周(例如，在8周时)、至少10周(例如，在10周时)或至少12周后(例如，在12周时)的水平分别与从首次施用GCase酶替代疗法起至少6周(例如，在6周时)、至少8周(例如，在8周时)、至少10周(例如，在10周时)或至少12周(例如，在12周时)后的水平进行比较。作为具体的实例，可在施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物后至少12周后(例如在12周时)测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平，并将其与首次施用GCase酶替代疗法后至少12周(例如在12周时)测量的水平进行比较。优选地，在施用后的同一时间点，在同一测定中测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇的水平。任选地，GCase酶替代疗法可以每两周施用一次。任选地，优选在开始治疗后至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平时，己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平降低至低于在接受GCase酶替代疗法的受试者中获得的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的50％、40％、30％、25％、10％或降低至其5％至25％。任选地，优选地在开始治疗后至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平时，己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平降低至低于在已施用了有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中获得的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平的50％、40％、30％、25％、10％或降至其5％至25％。当测量在施用有效剂量的GCase酶替代疗法后在受试者中获得的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平时，优选在施用一剂(例如，前一剂)GCase酶替代疗法后2小时测量己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平。举例来说，当每两周向受试者施用GCase酶替代疗法时，在第12周测量例如血清中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平将涉及在施用第12周(即第7)剂量后两小时从受试者获得血清样品。
任选地，施用本发明的病毒颗粒后，己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的降低(例如在患者/受试者的肺、血浆、血清、白细胞(例如巨噬细胞)、脾脏、肝脏和/或骨髓中)大于在施用了包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒的受试者中实现的降低。
任选地，与参考GCase多肽相比，本发明的经修饰的GCase多肽或本发明的多核苷酸提供了己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的更大降低(例如在患者/受试者的肺、血浆、血清、白细胞(例如巨噬细胞)、脾脏、肝脏和/或骨髓中)，如果其作为编码本发明的经修饰的GCase多肽的病毒颗粒或包含本发明的多核苷酸的病毒颗粒的一部分提供，即，在施用编码本发明的经修饰的GCase多肽的病毒颗粒或包含本发明的多核苷酸的病毒颗粒后，己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的降低(例如在患者/受试者的肺、血浆、血清、白细胞(例如巨噬细胞)、脾脏、肝脏和/或骨髓中)大于在施用了包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒的受试者中实现的降低。
在此类实施方案中，包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的“在其它方面相同的”病毒颗粒是除GBA核苷酸序列不同外与以下病毒颗粒相同的病毒颗粒(即，病毒颗粒包含相同的衣壳，并且重组基因组包含相同的转录调控元件等)：
(i)本发明的病毒颗粒；
(ii)编码本发明的经修饰的GCase多肽的病毒颗粒；或
(iii)包含本发明的多核苷酸的病毒颗粒。
例如，编码不同GCase多肽的不同GBA核苷酸序列与相同的启动子序列可操作地连接。
优选地，在从施用起至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平。例如，将从施用(i)本发明的病毒颗粒、(ii)编码本发明的经修饰的GCase多肽的病毒颗粒或(iii)包含本发明的多核苷酸的病毒颗粒起至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或至少12周(例如在12周时)后的水平，分别与从施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒起至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或至少12周(例如在12周时)后的水平进行比较。作为具体的实例，可在从施用(i)本发明的病毒颗粒、(ii)编码本发明的经修饰的GCase多肽的病毒颗粒或(iii)包含本发明的多核苷酸的病毒颗粒起至少12周(例如在12周时)后测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平，并将其与施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒后至少12周(例如在12周时)测量的水平进行比较。优选地，在施用后的同一时间点，在同一测定中测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇的水平。任选地，优选在从施用起至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平时，己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平降低至低于在施用了包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒的受试者中获得的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的50％、40％、30％、25％、10％或降低至其5％至25％。在一些实施方案中，参考GCase多肽是野生型GCase多肽。任选地，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:1或2的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:1或2的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:59或60的核苷酸序列。
任选地，测量受试者血浆中己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇的水平。任选地，测量受试者的骨髓中己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇的水平。任选地，测量受试者的脾脏中己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇的水平。任选地，测量受试者的肝脏中己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇的水平。任选地，测量受试者的肺中己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇的水平。测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平的方法在本领域中是已知的，并且优选使用质谱法(LC/MS分析)，例如通过实施例13中描述的方法测量己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇的水平。
任选地，在施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物后，受试者(或患者)中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的降低使得己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平(例如在骨髓、肺、血清、白细胞(例如巨噬细胞)、肝脏和/或脾脏中；另一个实例是在患者/受试者的血浆中)不超过在健康受试者或未患与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者中测量的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的200％、150％或125％。在一个实例中，己糖基神经酰胺和/或己糖基鞘氨醇水平的降低可以分别代表葡糖神经酰胺和/或葡糖鞘氨醇水平的降低。例如，己糖基神经酰胺的减少可能代表葡糖神经酰胺的减少。作为另一个实例，己糖基鞘氨醇水平的降低可以代表葡糖鞘氨醇水平的降低。
在一个实例中，己糖基神经酰胺和/或己糖神经鞘氨醇水平的降低分别是葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平的降低。换句话说，施用了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物的患者(例如，患有与GCase缺乏相关的疾病或疾患的患者)在施用后，优选在施用后至少6周、至少8周、至少10周、至少12周或12周测量葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平时可具有降低的葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平。当与施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物时的(起始)葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平相比时，葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平可降低至1/2或更低、1/3倍或更低、1/4倍或更低、1/5倍或更低、1/6倍或更低、1/3至1/2倍、1//4至1/2、1/5至1/2、1/6至1/2或1/5至1/3。例如，在施用本发明的多核苷酸病毒颗粒或组合物后(例如在施用后至少6周、至少8周、至少10周、至少12周或12周时)，当与施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物时的(起始)葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平相比时，患者中的葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平可以是50％或更少、40％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少。任选地，(在施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物之前)，当与健康受试者或未患与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者相比，患者可具有升高的葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平。例如，测量患者/受试者的肺、脾脏、肝脏和/或骨髓中的葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平。可测量患者/受试者的血清和/或白细胞(例如巨噬细胞)中的葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平。可测量患者/受试者血浆中的葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平。测量葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平的方法是本领域已知的，并且葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇的水平优选使用质谱法(LC/MS分析)，例如通过实施例13中描述的方法来测量。任选地，优选当在治疗开始后至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量葡糖神经酰胺和/或葡糖鞘氨醇水平时，葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平(例如在患者/受试者的血清、白细胞(例如巨噬细胞)、脾脏、肝脏和/或骨髓中；另一个实例是在患者/受试者的血浆中)的降低大于从GCase酶替代疗法实现的降低。例如，可将从施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物起至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如，在8周时)、至少10周(例如在10周时)或至少12周后(例如，在12周时)的水平分别与从首次施用GCase酶替代疗法起至少6周(例如，在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如，在10周时)或至少12周(例如，在12周时)后的水平进行比较。作为具体的实例，可在施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物后至少12周后(例如在12周时)测量葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平，并将其与首次施用GCase酶替代疗法后至少12周(例如在12周时)测量的水平进行比较。优选地，在施用后的同一时间点，在同一测定中测量葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇的水平。任选地，GCase酶替代疗法可以每两周施用一次。当测量施用有效剂量的GCase酶替代疗法后在受试者中获得的葡糖鞘氨醇和/或葡糖神经酰胺的水平时，优选在施用一剂(例如前一剂)GCase酶替代疗法后2小时测量葡糖鞘氨醇和/或葡糖神经酰胺的水平。举例来说，当每两周向受试者施用GCase酶替代疗法时，测量12周时例如血清中葡糖鞘氨醇和/或葡糖神经酰胺的水平将涉及在施用第12周(即第7)剂量后2小时从受试者获得血清样品。
任选地，施用本发明的病毒颗粒后葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平的降低(例如在患者/受试者的肺、血浆、血清、白细胞(例如巨噬细胞)、脾脏、肝脏和/或骨髓中)大于在施用了包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒的受试者中实现的降低。
任选地，与参考GCase多肽相比，本发明的经修饰的GCase多肽或本发明的多核苷酸提供了葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平的更大降低(例如在患者/受试者的肺、血浆、血清、白细胞(例如巨噬细胞)、脾脏、肝脏和/或骨髓中)，如果其作为编码本发明的经修饰的GCase多肽的病毒颗粒或包含本发明的多核苷酸的病毒颗粒的一部分提供，即，在施用编码本发明的经修饰的GCase多肽的病毒颗粒或包含本发明的多核苷酸的病毒颗粒后，葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平的降低(例如在患者/受试者的肺、血浆、血清、白细胞(例如巨噬细胞)、脾脏、肝脏和/或骨髓中)大于在施用了包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒的受试者中实现的降低。
在此类实施方案中，包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的“在其它方面相同的”病毒颗粒是除GBA核苷酸序列不同外与以下病毒颗粒相同的病毒颗粒(即，病毒颗粒包含相同的衣壳，并且重组基因组包含相同的转录调控元件等)：
(i)本发明的病毒颗粒，
(ii)编码本发明的经修饰的GCase多肽的病毒颗粒，或
(iii)包含本发明的多核苷酸的病毒颗粒。
例如，编码不同GCase多肽的不同GBA核苷酸序列与相同的启动子序列可操作地连接。
优选地，在从施用起至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平。例如，将从施用(i)本发明的病毒颗粒、(ii)编码本发明的经修饰的GCase多肽的病毒颗粒或(iii)包含本发明的多核苷酸的病毒颗粒起至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或至少12周(例如在12周时)后的水平，分别与从施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒起至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或至少12周(例如在12周时)后的水平进行比较。作为具体的实例，可在从施用(i)本发明的病毒颗粒、(ii)编码本发明的经修饰的GCase多肽的病毒颗粒或(iii)包含本发明的多核苷酸的病毒颗粒起至少12周(例如在12周时)后测量葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平，并将其与在从施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒起至少12周(例如在12周时)测量的水平进行比较。优选地，在施用后的同一时间点，在同一测定中测量葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇的水平。任选地，优选当在从施用起至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平时，葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平降低至低于在施用了包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒的受试者中获得的葡糖神经酰胺和/或葡糖神经鞘氨醇水平的50％、40％、30％、25％、10％或降低至其5％至25％。在一些实施方案中，参考GCase多肽是野生型GCase多肽。任选地，参考GCase多肽包含SEQ ID NO:1或2的多肽。任选地，参考GCase多肽是SEQ ID NO:1或2的多肽。任选地，编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:59或60的核苷酸序列。
任选地，在施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物后，受试者(或患者)中葡糖神经酰胺水平的降低使得葡糖神经酰胺水平(例如在血清、白细胞(例如巨噬细胞)、肝脏和/或脾脏中)不超过在健康受试者或未患与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者中测量的葡糖神经酰胺水平的200％、150％或125％。
任选地，优选在施用后至少6周(例如在6周时)、至少8周(例如在8周时)、至少10周(例如在10周时)或至少12周(例如在12周时)后计数细胞时，施用了本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物的患者(例如，患有与GCase缺乏相关的疾病或疾患的患者)可在施用后显示受试者的肝脏或肺(例如，肺组织)中的储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的数量减少。肝脏或肺(例如，肺组织)中储藏细胞和/或活化的巨噬细胞数量的减少可能是炎症减轻的指征，并因此具有治疗益处。可通过测量CD68阳性细胞的数量来指示或估计活化的巨噬细胞的数量。鉴定储藏细胞和/或CD68阳性细胞可通过本领域已知的方法进行，诸如通过免疫组织化学或显微镜检查，例如实施例13中描述的方法进行。
任选地，测量肝脏和/或肺中活化的巨噬细胞的数量和/或储藏细胞的数量包括基于在小鼠研究中获得的数据估计肝脏和/或肺中活化的巨噬细胞的数量和/或储藏细胞的数量。例如，可通过测试GCase多肽是否能够减少小鼠肝脏中储藏细胞的数量，来测试GCase多肽是否减少患者肝脏中储藏细胞的数量。
任选地，优选当在治疗开始后至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量肝脏或肺(例如肺组织)中储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的数量时，受试者的肝脏或肺(例如肺组织)中储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的减少大于从GCase酶替代疗法实现的减少。例如，可将从施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物起至少6周(例如，在6周时)、至少8周(例如，在8周时)、至少10周(例如，在10周时)或至少12周后(例如，在12周时)的水平分别与从首次施用GCase酶替代疗法起至少6周(例如，在6周时)、至少8周(例如，在8周时)、至少10周(例如，在10周时)或至少12周(例如，在12周时)后的水平进行比较。作为具体实例，可在施用本发明的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物后至少12周后(例如在12周时)测量肝脏或肺(例如肺组织)中储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的水平(例如数量)，并将其与首次施用GCase酶替代疗法后至少12周(例如在12周时)测量的水平进行比较。优选地，在施用后的同一时间点，在同一测定中测量肝脏或肺(例如肺组织)中储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的水平(例如数量)。任选地，GCase酶替代疗法可以每两周施用一次。任选地，优选当在治疗开始后至少6周、至少8周、至少10周或至少12周后测量肝脏或肺(例如肺组织)中储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的水平(例如数量)时，肝脏或肺(例如肺组织)中储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的水平(例如数量)降低至低于在接受GCase酶替代疗法的受试者中获得的肝脏或肺(例如肺组织)中储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的水平(例如数量)的60％、50％、40％、30％、25％、10％、降低至其0％至25％或5％至25％。任选地，优选在治疗开始后至少6周、至少8周、至少10周、至少12周后或12周时测量肝脏或肺(例如肺组织)中储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的水平(例如数量)时，肝脏或肺(例如肺组织)中储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的水平(例如数量)降低至低于在已施用了有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中获得的储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的水平(例如数量)的50％、40％、30％、25％、10％、降低至其0％至25％或5％至25％。当测量在施用有效剂量的GCase酶替代疗法后在受试者中获得的肝脏或肺(例如肺组织)中储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的水平(例如数量)时，优选在施用一剂(例如前一剂)Gcase酶替代疗法后2小时测量肝脏或肺(例如肺组织)中储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的水平(例如数量)。举例来说，当每两周向受试者施用GCase酶替代疗法时，在第12周时测量肝脏或肺(例如肺组织)中储藏细胞和/或活化的巨噬细胞的水平(例如数量)将涉及在施用第12周(即第7)剂量后两小时从所述受试者获得组织样品。
“GCase酶替代疗法”可以指包括向受试者施用GCase多肽的任何疗法。GCase多肽可以是野生型，诸如具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的GCase多肽，例如维拉苷酶α。GCase多肽可以以任何合适的剂量(任选地以40-100U/kg BW、50-80U/kg BW、60-70U/kg BW或约60U/kg BW的剂量)施用。GCase多肽可通过任何合适的途径施用，任选通过静脉内注射或皮下注射施用。
本发明的方面
在以下方面进一步描述本发明。
1.一种经修饰的β-葡糖脑苷脂酶(GCase)多肽，其包含至少一个突变，其中所述至少一个突变：
(i)提供更高的有效活性；和/或
(ii)提供增强的稳定性；和/或
(iii)在生理pH下提供结构稳定性；和/或
(iv)提供更长的半衰期；和/或
(v)提供增强的热稳定性。
2.一种经修饰的β-葡糖脑苷脂酶(GCase)多肽，其在对应于选自SEQ ID NO:1的351、380、272、262、313、404、407、482、484、490、494、503和534中的位置的位置处包含至少一个突变。
3.方面1或2的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变提供更高的有效活性。
4.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变提供增强的稳定性。
5.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变在生理pH下提供结构稳定性。
6.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变提供更长的半衰期。
7.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽具有更高的有效活性。
8.方面7的经修饰的GCase多肽，其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽，任选地，其中所述参考GCase多肽是SEQ ID NO:3的多肽。
9.方面7的经修饰的GCase多肽，其中所述参考GCase多肽是SEQ ID NO:4或5的多肽。
10.方面7至9中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中与所述参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽的有效活性为其至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍或至少50倍。
11.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变提供增强的稳定性，且所述增强的稳定性在pH 7.4下。
12.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变提供增强的稳定性，并且所述增强的稳定性是在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量的。
13.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变在pH 7.4下提供结构稳定性。
14.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽在生理pH下相对于参考GCase多肽在结构上更稳定，任选地其中所述pH为pH 7.4。
15.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽具有增强的稳定性，任选地，其中所述增强的稳定性是在pH 7.4下的增强的稳定性。
16.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中当在pH7.4和37摄氏度下孵育至少10分钟、至少30分钟、至少60分钟、至少120分钟、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的活性。
17.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中当在pH5.6和37摄氏度下孵育至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的活性。
18.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中当在pH7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留高为所述参考GCase多肽的活性至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少2.5倍、至少2.8倍或至少3倍的活性。
19.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中当在pH5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留高为参考GCase多肽的活性至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍或至少50倍的活性。
20.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中当在pH7.4的PBS中于37摄氏度孵育72小时后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留高为参考GCase多肽的活性至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍或至少50倍的活性。
21.方面10至20中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
22.方面10至20中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述参考GCase多肽是SEQID NO:4或5的多肽。
23.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中当在pH7.4的PBS中于37摄氏度孵育72小时后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％的活性。
24.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中当在pH7.4的PBS中于37摄氏度孵育72小时后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少50％的活性。
25.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中：
-当在pH 7.4和37摄氏度孵育120分钟后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的活性；和/或
-当在pH 7.4和37摄氏度孵育120分钟后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少80％或至少85％的活性。
26.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中：
-当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少15％或至少20％的活性，任选地其中所述孵育在血清或血浆中进行；和/或
-当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少40％的活性，任选地其中所述孵育在血清或血浆中进行。
27.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中当在pH7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少60％的活性。
28.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中当在pH7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少80％的活性。
29.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中当在pH5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少80％的活性。
30.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中使用荧光测定法来测定所述活性、有效活性、稳定性和/或半衰期。
31.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变提供增强的热稳定性。
32.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽在pH 5.75下具有至少55、至少56或至少57摄氏度的解链温度。
33.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽在pH 7下具有至少52、至少53或至少53.5摄氏度的解链温度。
34.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽具有增强的热稳定性。
35.根据权利要求34所述的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽的解链温度相对于pH 5.75下的所述参考GCase多肽高至少1摄氏度、至少2摄氏度、至少3摄氏度、至少4摄氏度、至少5摄氏度或至少5.4摄氏度。
36.根据权利要求34所述的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽的解链温度相对于pH 7下的所述参考GCase多肽高至少1摄氏度、至少2摄氏度或至少2.5摄氏度。
37.方面34至36中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽，任选地是SEQ ID NO:3的多肽。
38.方面32至37中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述解链温度是在经修饰的GCase多肽浓度为1.5μM或3μM时计算的解链温度。
39.方面32至38中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述解链温度使用热位移测定法来测量。
40.方面32至39中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中当所述经修饰的GCase多肽在每分钟增加1摄氏度的温度下孵育时，通过测量所述经修饰的GCase多肽的解折叠来计算所述解链温度。
41.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变减少了HLA-I和/或HLA-II结合物的数量。
42.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽具有数量减少的HLA-I和/或HLA-II结合物。
43.方面41或42的经修饰的GCase多肽，其中使用IC50结合亲和力预测HLA-I和/或HLA-II结合物的数量。
44.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中相对于参考GCase多肽，所述至少一个突变减少了HLA-I结合物的数量，或者所述经修饰的GCase多肽具有数量减少的HLA-I结合物。
45.方面41至44中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述HLA-I和/或HLA-II结合物是强结合物。
46.方面41至45中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述HLA-I结合物是强结合物。
47.方面41至46中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述HLA-II结合物是强结合物。
48.方面42至47中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
49.方面42至47中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述参考GCase多肽是SEQID NO:4或5的多肽。
50.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其相对于参考GCase多肽具有更长的半衰期。
51.方面50的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽的半衰期具有长为所述参考GCase多肽的半衰期至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍的半衰期。
52.方面50或51的经修饰的GCase多肽，其中所述较长半衰期是在pH 7.4下的较长半衰期。
53.方面50或51的经修饰的GCase多肽，其中所述较长半衰期是在pH 5.6下的较长半衰期。
54.方面53的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽在pH 5.6下具有长为所述参考GCase多肽的半衰期至少20倍的半衰期。
55.方面50至52中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述较长半衰期是在血清或血浆中的较长半衰期。
56.方面50至55中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中使用荧光测定法测定半衰期。
57.方面50至56中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
58.方面50至57中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述参考GCase多肽是SEQID NO:3的多肽。
59.方面50至56中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述参考GCase多肽是SEQID NO:4或5的多肽。
60.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽具有1.8至2.2mM或约2.0mM的Km值。
61.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的突变。
62.方面61的经修饰的GCase多肽，其中所述对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的突变是用谷氨酰胺取代，任选地为E272Q。
63.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置262的位置处的突变。
64.方面63的经修饰的GCase多肽，其中所述对应于SEQ ID NO:1的位置262的位置处的突变是用天冬酰胺或酪氨酸取代。
65.方面64的经修饰的GCase多肽，其中所述对应于SEQ ID NO:1的位置262的位置处的突变是用天冬酰胺取代，任选地为H262N。
66.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置313的位置处的突变。
67.方面66的经修饰的GCase多肽，其中所述对应于SEQ ID NO:1的位置313的位置处的突变是用天冬酰胺取代，任选地为H313N。
68.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置404的位置处的突变。
69.方面68的经修饰的GCase多肽，其中所述对应于SEQ ID NO:1的位置404的位置处的突变是用赖氨酸取代，任选地为H404K。
70.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置490的位置处的突变。
71.方面70的经修饰的多肽，其中所述对应于SEQ ID NO:1的位置490的位置处的突变是用赖氨酸取代，任选地为H490K。
72.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置534的位置处的突变。
73.方面72的经修饰的GCase多肽，其中所述对应于SEQ ID NO:1的位置534的位置处的突变是用天冬酰胺取代，任选地为R534N。
74.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括两个突变，其中所述两个突变中的每一个都是用半胱氨酸取代，这使得能够形成二硫桥。
75.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置482的位置处的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置503的位置处的突变。
76.方面75的经修饰的GCase多肽，其中:
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置482的位置处的突变是用半胱氨酸取代，任选地为天冬氨酸至半胱氨酸的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置503的位置处的突变是用半胱氨酸取代，任选地为丝氨酸至半胱氨酸的突变。
77.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置494的位置处的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置534的位置处的突变。
78.方面77的经修饰的GCase多肽，其中：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置494的位置处的突变是用半胱氨酸取代，任选地为丝氨酸到半胱氨酸的突变；以用
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置534的位置处的突变是用半胱氨酸取代，任选地为精氨酸到半胱氨酸的突变。
79.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的突变。
80.方面79的经修饰的GCase多肽，其中：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的突变是用半胱氨酸取代，任选地是色氨酸至半胱氨酸的突变；以及
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的突变是用半胱氨酸取代，任选地是丙氨酸至半胱氨酸的突变。
81.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置407的位置处的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置484的位置处的突变。
82.方面81的经修饰的GCase多肽，其中：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置407的位置处的突变是用半胱氨酸取代，任选地是异亮氨酸至半胱氨酸的突变；以及
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置484的位置处的突变是用半胱氨酸取代，任选地是天冬氨酸至半胱氨酸的突变。
83.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的用谷氨酰胺取代，并且其中与所述参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，保留至少85％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
84.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的用谷氨酰胺取代，并且其中与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4的PBS中于37摄氏度孵育72小时后测量时，保留至少60％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
85.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的用谷氨酰胺取代，并且其中与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，保留至少50％或至少55％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
86.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的丙氨酸至半胱氨酸的突变；
并且其中与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，保留至少85％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
87.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的丙氨酸至半胱氨酸的突变；
并且其中与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4的PBS中于37摄氏度孵育72小时后测量时，保留至少60％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
88.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的丙氨酸至半胱氨酸的突变；
并且其中与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，保留至少50％或至少55％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
89.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的用谷氨酰胺取代，任选地E272Q；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(iii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的丙氨酸至半胱氨酸的突变。
90.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的用谷氨酰胺取代，任选地E272Q；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(iii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的丙氨酸至半胱氨酸的突变；
并且其中与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，保留至少85％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
91.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的用谷氨酰胺取代，任选地E272Q；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(iii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的丙氨酸至半胱氨酸的突变；
并且其中与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 7.4的PBS中于37摄氏度孵育72小时后测量时，保留至少60％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
92.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的用谷氨酰胺取代，任选地E272Q；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(iii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的丙氨酸至半胱氨酸的突变；
并且其中与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH 5.6和37摄氏度下孵育72小时后测量时，保留至少50％或至少55％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
93.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有更高的有效活性和/或增强的稳定性，任选地，其中参考GCase多肽选自SEQ ID NO:1至5中的任一个。
94.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中：
(i)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少200个、至少250个、至少300个、至少400个、300至497个之间、400至497个或450至497个氨基酸的片段具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或、至少99％同一性的氨基酸序列；或
(ii)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或、至少99％同一性的氨基酸序列；或
(iii)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1的400至536个氨基酸的片段具有至少98％同一性的氨基酸序列；或
(iv)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:2的400至497个氨基酸的片段具有至少98％同一性的氨基酸序列；或
(v)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少98％同一性的氨基酸序列；或
(vi)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少98％同一性的氨基酸序列；或
(vii)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，不同之处在于所述经修饰的GCase多肽包含前述方面中任一方面定义的所述至少一个突变；或
(viii)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，不同之处在于所述经修饰的GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处包含突变；或
(ix)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，不同之处在于所述经修饰的GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处和对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处包含用半胱氨酸取代；或
(x)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，不同之处在于所述经修饰的GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处和对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处包含突变，并且所述经修饰的GCase多肽在对应于SEQID NO:1的位置272的位置处包含突变。
95.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变不包括对应于SEQ ID NO:1的位置184的位置处的组氨酸至亮氨酸的突变。
96.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变不包括对应于SEQ ID NO:1的位置360的位置处的赖氨酸至天冬酰胺的突变。
97.一种包含经修饰的葡糖脑苷脂酶(GBA)核苷酸序列的多核苷酸，其中所述经修饰的GBA核苷酸序列编码前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽。
98.方面97的多核苷酸，其中所述经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:6至29中的任一个的至少750个、至少850个、950个、至少1000个、至少1200个、至少1400个或至少1494个核苷酸的片段具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列。
99.方面97或98的多核苷酸，其中所述经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:6至29中的任一个的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列。
100.方面97至99中任一方面的多核苷酸，其中所述经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列。
101.方面97至99中任一方面的多核苷酸，其中所述经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列。
102.方面97至99中任一方面的多核苷酸，其中所述经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列。
103.方面97至102中任一方面的多核苷酸，其中所述经修饰的GBA核苷酸序列是经密码子优化的。
104.方面97至103中任一方面的多核苷酸，其中所述经修饰的GBA核苷酸序列经密码子优化用于在人肝细胞中表达。
105.方面97至104中任一方面的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含转录调控元件。
106.方面105的多核苷酸，其中所述转录调控元件包括肝脏特异性启动子。
107.方面105或106的多核苷酸，其中所述转录调控元件包括A1AT启动子或A1AT启动子的片段。
108.方面107的多核苷酸，其中A1AT启动子的片段长度为至少100个、至少120个、至少150个、至少180个、255个或更少，100至255个、150至225个、150至300个或180至255个核苷酸。
109.方面108的多核苷酸，其中A1AT启动子的片段长度为180至255个核苷酸。
110.方面97至109中任一方面的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的启动子。
111.方面110的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31具有至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的启动子。
112.方面110或111的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:30或SEQ IDNO:31的启动子。
113.方面105至112中任一方面的多核苷酸，其中所述转录调控元件包含长度等于或少于418个核苷酸、等于或少于255个核苷酸或等于或少于185个核苷酸的A1AT启动子的片段，并且包括SEQ ID NO:30的启动子。
114.方面105至113中任一方面的多核苷酸，其中所述转录调控元件包括增强子。
115.方面114的多核苷酸，其中所述增强子是HCR增强子或HCR增强子的片段。
116.方面115的多核苷酸，其中HCR增强子的片段是长度为至少80个、至少90个、至少100个、192个或更少、80至192个、90至192个、100至250个或117至192个核苷酸的片段。
117.方面116的多核苷酸，其中HCR增强子的片段长度为117至192个核苷酸。
118.方面97至117中任一方面的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的增强子。
119.方面118的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33具有至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的增强子。
120.方面119的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的增强子。
121.方面105至120中任一方面的多核苷酸，其中所述转录调控元件包含长度等于或少于321个核苷酸、等于或少于192个核苷酸、或等于或少于117个核苷酸的HCR增强子的片段，并且包含SEQ ID NO:32。
122.方面105至121中任一方面的多核苷酸，其中所述转录调控元件与SEQ ID NO:34具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性。
123.方面122的多核苷酸，其中所述转录调控元件包含与SEQ ID NO:34具有100％同一性的序列或所述转录调控元件与SEQ ID NO:34相同。
124.方面105至121中任一方面的多核苷酸，其中所述转录调控元件与SEQ ID NO:35具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性。
125.方面124的多核苷酸，其中所述转录调控元件包含与SEQ ID NO:35具有100％同一性的序列或所述转录调控元件与SEQ ID NO:35相同。
126.一种包含重组基因组的病毒颗粒，所述重组基因组包含方面97至125中任一方面的多核苷酸。
127.方面126的病毒颗粒，其为AAV、腺病毒或慢病毒颗粒。
128.方面127的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是AAV病毒颗粒。
129.方面126至128中任一方面的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含嗜肝性或嗜CNS衣壳。
130.方面129的病毒颗粒，其中所述嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:36、37或38的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段具有至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的序列。
131.方面129的病毒颗粒，其中所述嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:36具有至少99％或100％同一性的序列。
132.方面129的病毒颗粒，其中所述嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:37具有至少99％或100％同一性的序列。
133.方面129的病毒颗粒，其中所述嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:38具有至少99％或100％同一性的序列。
134.方面129的病毒颗粒，其中所述嗜CNS衣壳包含与SEQ ID NO:39的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段具有至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的序列。
135.方面129的病毒颗粒，其中所述嗜CNS衣壳包含与SEQ ID NO:39具有至少98％或100％同一性的序列。
136.方面126至135中任一方面的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒还包含：
a)AAV2 ITR；
B)polyA序列；和/或
c)内含子。
137.方面126至136中任一方面的病毒颗粒，其中所述重组基因组是单链的。
138.方面126至137中任一方面的病毒颗粒，其中在转导至宿主细胞后，与将包含编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒转导至宿主细胞后参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽的有效活性相同或更高。
139.方面138的病毒颗粒，其中与所述参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽的有效活性更高。
140.方面139的病毒颗粒，其中与所述参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽的有效活性为其至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍或至少70倍。
141.方面138至140中任一方面的病毒颗粒，其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
142.方面141的病毒颗粒，其中所述参考GCase多肽包含SEQ ID NO:1或2的多肽。
143.方面142的病毒颗粒，其中编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQID NO:59或60的核苷酸序列。
144.方面138至140中任一方面的病毒颗粒，其中所述参考GCase多肽包含SEQ IDNO:41或44的多肽。
145.方面144的病毒颗粒，其中编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQID NO:6或10的核苷酸序列。
146.方面138至140中任一方面的病毒颗粒，其中所述参考GCase多肽包含SEQ IDNO:43或46的多肽。
147.方面146的病毒颗粒，其中编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQID NO:22或26的核苷酸序列。
148.方面138至140中任一方面的病毒颗粒，其中所述参考GCase多肽包含SEQ IDNO:42或45的多肽。
149.方面148的病毒颗粒，其中编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQID NO:14或18的核苷酸序列。
150.方面126至149中任一方面的病毒颗粒，其中所述经修饰的GCase多肽的有效活性为由SEQ ID NO:14或18的序列编码的GCase多肽的有效活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。
151.方面138至150中任一方面的病毒颗粒，其中所述宿主细胞是Huh-7细胞。
152.方面126至151中任一方面的病毒颗粒，其中施用所述病毒颗粒后，与施用包含编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒后参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽在血浆、白细胞、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的有效活性相同或更高。
153.方面126至152中任一方面的病毒颗粒，其中在施用所述病毒颗粒后，与施用包含编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒后参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽在肝脏中的有效活性相同或更高。
154.方面152或153的病毒颗粒，其中所述经修饰的GCase多肽的有效活性高于所述参考GCase多肽的有效活性。
155.方面154的病毒颗粒，其中与所述参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽的有效活性为其至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍或至少10倍。
156.方面153至155中任一方面的病毒颗粒，其中与所述参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽的有效活性为其至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍或至少40倍。
157.方面152至156中任一方面的病毒颗粒，其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
158.方面157的病毒颗粒，其中所述参考GCase多肽包含SEQ ID NO:1或2的多肽。
159.方面158的病毒颗粒，其中所述编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQID NO:59或60的核苷酸序列。
160.方面152至156中任一方面的病毒颗粒，其中所述参考GCase多肽包含SEQ IDNO:41或44的多肽。
161.方面160的病毒颗粒，其中所述编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQID NO:6或10的核苷酸序列。
162.方面152至156中任一方面的病毒颗粒，其中所述参考GCase多肽包含SEQ IDNO:43或46的多肽。
163.方面162的病毒颗粒，其中编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQID NO:22或26的核苷酸序列。
164.方面152至156中任一方面的病毒颗粒，其中所述参考GCase多肽包含SEQ IDNO:42或45的多肽。
165.方面164的病毒颗粒，其中编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQID NO:14或18的核苷酸序列。
166.方面152至165中任一方面的病毒颗粒，其中所述经修饰的GCase多肽的有效活性为由SEQ ID NO:14或18的序列编码的所述GCase多肽的有效活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。
167.方面126至166中任一方面的病毒颗粒，其中在施用所述病毒颗粒后，与GCase酶替代疗法的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽在肝脏、白细胞、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的有效活性相同或更高。
168.方面167的病毒颗粒，其中与GCase酶替代疗法的有效活性相比，经修饰的GCase多肽在骨髓和/或肺组织中的有效活性更高。
169.方面167的病毒颗粒，其中与所述GCase酶替代疗法的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽的有效活性更高。
170.方面167至169中任一方面的病毒颗粒，其中与所述GCase酶替代疗法的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽的有效活性为其至少1.1倍、至少1.2倍或至少1.3倍。
171.方面167至170中任一方面的病毒颗粒，其中与所述GCase酶替代疗法的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽在肺组织中的有效活性为其至少1.5倍或至少2倍。
172.方面167至171中任一方面的病毒颗粒，其中所述GCase酶替代疗法是施用SEQID NO:3的GCase多肽和/或维拉苷酶α(VPRIV)。
173.方面167至172中任一方面的病毒颗粒，其中所述GCase酶替代疗法的有效活性是在施用一剂所述GCase酶替代疗法后2小时测量的有效活性。
174.方面167至173中任一方面的病毒颗粒，其中所述GCase酶替代疗法包括以40至100U/kg BW、50至80U/kg BW、60至70U/kg BW或约60U/kg BW的剂量施用GCase多肽。
175.方面167至174中任一方面的病毒颗粒，其中在施用所述病毒颗粒后至少12周或12周时测量所述经修饰的GCase多肽的活性。
176.方面126至175中任一方面的病毒颗粒，其中使用对GCase特异的荧光底物来测量所述有效活性。
177.方面126至176中任一方面的病毒颗粒，其中在施用所述病毒颗粒后，与施用GCase酶替代疗法后的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平相比，血浆、肝脏、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平较低。
178.方面126至177中任一方面的病毒颗粒，其中在施用所述病毒颗粒后，与患有戈谢病的受试者中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平相比，血浆、肝脏、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平较低。
179.方面177或178的病毒颗粒，其中己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平低于在施用GCase酶替代疗法后的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的50％、40％、30％、25％、10％或为其0％至25％。
180.方面177至179的病毒颗粒，其中所述GCase酶替代疗法是施用SEQ ID NO:3的多肽和/或维拉苷酶α(VPRIV)。
181.方面126至180中任一方面的病毒颗粒，其中在施用所述病毒颗粒后，与施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒后的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平相比，血浆、肝脏、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平较低。
182.方面181的病毒颗粒，其中己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平低于施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒后的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平的50％、40％、30％、25％、10％或为其0％至25％。
183.方面181或182的病毒颗粒，其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
184.方面181至183中任一方面的病毒颗粒，其中所述参考GCase多肽包含SEQ IDNO:1或2的多肽。
185.方面181至184中任一方面的病毒颗粒，其中编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:59或60的核苷酸序列。
186.方面177至185中任一方面的病毒颗粒，其中己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平低于患有戈谢病的受试者中己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的50％、40％、30％、25％、10％或为其0％与25％。
187.方面177至186中任一项的病毒颗粒，其中施用GCase酶替代疗法后的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平是施用一剂GCase酶替代疗法后2小时测量的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平。
188.方面177至187中任一方面的病毒颗粒，其中在施用病毒颗粒后至少12周测量己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平。
189.方面177至188中任一方面的病毒颗粒，其中通过质谱法测量己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平。
190.方面126至189中任一方面的病毒颗粒，其中在施用所述病毒颗粒后，与施用GCase酶替代疗法后储藏细胞的数量或活化的巨噬细胞的水平相比，肝脏或肺组织中储藏细胞的数量或活化的巨噬细胞的水平较低。
191.方面190的病毒颗粒，其中储藏细胞数量少于施用GCase酶替代疗法后的储藏细胞数量的50％、40％、30％、25％、15％或为其0％至25％。
192.方面190或方面191的病毒颗粒，其中活化的巨噬细胞水平低于施用GCase酶替代疗法后的活化的巨噬细胞水平的50％、40％、30％、25％、20％或为其0％至25％。
193.方面190至192中任一方面的病毒颗粒，其中所述GCase酶替代疗法是施用SEQID NO:3的多肽和/或维拉苷酶α(VPRIV)。
194.方面190至193中任一方面的病毒颗粒，其中施用GCase酶替代疗法后的储藏细胞数量或活化的巨噬细胞水平是在施用一剂GCase酶替代疗法后2小时测量的储藏细胞数量或活化的巨噬细胞水平。
195.方面190至194中任一方面的病毒颗粒，其中在施用所述病毒颗粒后至少12周测量施用所述经修饰的GCase多肽后的储藏细胞数量或活化的巨噬细胞水平。
196.方面190至195中任一方面的病毒颗粒，其中通过显微镜检查测量储藏细胞数量。
197.方面190至196中任一方面的病毒颗粒，其中通过使用免疫组织化学测量CD68密度来检测活化巨的噬细胞水平。
198.一种组合物，其包含前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸或病毒颗粒以及药学上可接受的赋形剂。
199.前述方面中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于治疗方法。
200.方面199的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中所述治疗方法包括向患者施用有效量的方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
201.一种治疗方法，其包括向患者施用有效量的方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
202.方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于制备用于治疗方法的药物的用途。
203.方面202的用途，其中所述治疗方法包括向患者施用有效量的方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
204.方面199至203中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述治疗方法是治疗与GCase缺乏相关的疾病的方法。
205.方面199至204中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述治疗方法是治疗帕金森病的方法。
206.方面199至204中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述治疗方法是治疗戈谢病的方法。
207.方面206的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述戈谢病是I型戈谢病。
208.方面206的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述戈谢病为II型戈谢病。
209.方面206的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述戈谢病为III型戈谢病。
210.方面200、201或203至209中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述患者具有针对重组GCase的抗体或抑制剂，所述患者先前已用所述抗体或抑制剂作为酶替代疗法的一部分进行过治疗。
211.方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于治疗疾病，其中与由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽或所述编码的经修饰的GCase多肽在pH 7.4下具有增强的稳定性。
212.一种通过施用方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物治疗疾病的方法，其中与由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽或所述编码的经修饰的GCase多肽在pH 7.4下具有增强的稳定性。
213.方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物在治疗疾病方面的用途，其中与由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽或所述编码的经修饰的GCase多肽在pH 7.4下具有增强的稳定性。
214.方面211、212或213中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中：
-当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，所述经修饰的GCase多肽或所述编码的经修饰的GCase多肽保留高为由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽保留的活性至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.8倍或至少2倍的活性；和/或
-当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，所述经修饰的GCase多肽或所述编码的经修饰的GCase多肽保留高为由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽保留的活性至少3倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍或至少15倍的活性。
215.方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于治疗疾病，其中治疗所述疾病包括施用与需要施用的包含或编码由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽的等同多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物的剂量相比，较低剂量的所述经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
216.一种通过施用方面1至198中任一方面的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物来治疗疾病的方法，其中治疗疾病包括施用与包含或编码由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽的等同多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物的所需施用剂量相比，较低剂量的所述经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
217.方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物在治疗疾病方面的用途，其中治疗疾病包括施用与包含或编码由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽的等同多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物的所需施用剂量相比，较低剂量的所述经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
218.方面211至217中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中所述疾病为戈谢病，任选地为I型戈谢病、II型戈谢病或III型戈谢病。
219.方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物在制备药物方面的用途，所述药物用于在患有与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者中：
(i)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(ii)减少储藏细胞的数量；和/或
(iii)降低活化的巨噬细胞水平。
220.一种方法，其通过向所述受试者施用方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物来在患有与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者中
(i)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(ii)减少储藏细胞的数量；和/或
(iii)降低活化的巨噬细胞的水平。
221.方面219或220的用途或方法，其中：
(i)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(ii)减少储藏细胞的数量；和/或
(iii)降低活化的巨噬细胞的水平；
治疗与GCase缺乏相关的疾病或疾患。
222.方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于在患有与GCase缺乏相关的疾病或疾患的受试者中
(i)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(ii)减少储藏细胞的数量；和/或
(iii)降低活化的巨噬细胞的水平；
的方法中，任选地其中
(i)降低己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平；
(ii)减少储藏细胞的数量；和/或
(iii)降低活化的巨噬细胞的水平；
导致与GCase缺乏相关的疾病或疾患的治疗。
223.方面219至222中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平降低至低于施用方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物时的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平的50％、40％、30％、25％、10％或降低至其0％至25％。
224.方面219至223中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或供其使用的组合物、用途或方法，其中在施用经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物后至少6周、至少8周、至少10周、至少12周或在12周时测量己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平。
225.方面219至224中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的降低大于在施用了有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中实现的降低。
226.方面225的供使用的经修饰的GCase多肽、用于使用的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平降低至低于在施用了有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中获得的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的50％、40％、30％、25％、10％或降低至其5％至25％。
227.方面225或方面226的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述GCase酶替代疗法包括施用具有SEQ ID NO:3的序列的GCase多肽。
228.方面225至227中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、供使用的多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中GCase酶替代疗法包括以40至100U/kg BW、50至80U/kg BW、60至70U/kg BW或约60U/kg BW的剂量施用GCase多肽。
229.方面225至228中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中在施用一剂GCase酶替代疗法后2小时测量施用有效剂量的GCase酶替代疗法后在受试者中获得的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平。
230.方面219至229中任一项的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中在施用
(i)病毒颗粒；
(ii)编码经修饰的GCase多肽的病毒颗粒；和/或
(iii)包含多核苷酸的病毒颗粒；
后己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的降低，大于在施用了包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒的受试者中实现的减少。
231.方面230的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平降低至低于在施用了包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列的在其它方面相同的病毒颗粒的受试者中获得的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平的50％、40％、30％、25％、10％或降低至其5％于25％。
232.方面230或231的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽。
233.方面230至232中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述参考GCase多肽包含SEQ ID NO:1或2的多肽。
234.方面230至233中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:59或60的核苷酸序列。
235.方面219至234中任一项的供使用经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者血浆中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平。
236.方面219至235中任一项的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者骨髓中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平。
237.方面219至236中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者脾脏中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平。
238.方面219至237中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者肝脏中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平。
239.方面219至238中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者肺中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平。
240.方面219至239中任一项的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中通过质谱法测量己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺水平。
241.方面219至240中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中储藏细胞的数量减少至少于施用方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物时的储藏细胞的数量的50％、40％、30％、25％、15％或减少至其0％于25％。
242.方面241的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中在施用经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物后至少6周、至少8周、至少10周、至少12周或在12周时测量储藏细胞的数量。
243.方面219至242中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中储藏细胞数量的减少大于在施用了有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中实现的减少。
244.方面243的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中储藏细胞的数目减少至少于在施用了有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中获得的储藏细胞数目的50％、40％、30％、25％、15％或减少至其0％至25％。
245.方面243或244的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中GCase酶替代疗法包括施用具有SEQ ID NO:3的序列的GCase多肽。
246.方面243至245中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中GCase酶替代疗法包括以40至100U/kg BW、50至80U/kg BW、60至70U/kg BW或约60U/kg BW的剂量施用GCase多肽。
247.方面243至246中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中在施用一剂GCase酶替代疗法后2小时测量在施用了有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中获得的储藏细胞的数量。
248.方面219至247中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者肝脏中的储藏细胞数量。
249.方面219至248中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者肺组织中的储藏细胞数量。
250.方面219至249中任一方面的供使用经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中使用显微镜检查测量储藏细胞的数量。
251.方面219至250中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中活化的巨噬细胞的水平降低至低于施用方面1至198中任一方面的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物时的活化的巨噬细胞水平的60％、50％、30％、25％或降低至其0％至30％。
252.方面219至251中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中在施用经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物后至少6周、至少8周、至少10周、至少12周或12周测量活化的巨噬细胞水平。
253.方面219至252中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中活化的巨噬细胞的水平降低至低于在施用了有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中获得的活化的巨噬细胞水平的60％、50％、30％、25％或降低至其0％至30％。
254.方面253的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述GCase酶替代疗法包括施用具有SEQ ID NO:3的序列的GCase多肽。
255.方面253或254的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述GCase酶替代疗法包括以40至100U/kg BW、50至80U/kg BW、60至70U/kg BW或约60U/kg BW的剂量施用GCase多肽。
256.方面253、254或255中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中在施用一剂GCase酶替代疗法后2小时测量在施用了有效剂量的GCase酶替代疗法的受试者中获得的活化的巨噬细胞水平。
257.方面219至256中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者的肝脏中的活化的巨噬细胞水平。
258.方面219至257中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中测量受试者的肺组织中的活化的巨噬细胞的水平。
259.方面219至258中任一方面的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中通过使用免疫组织化学测量CD68密度来测量活化的巨噬细胞的水平。
260.方面219至259中任一项的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述疾病为戈谢病。
261.方面260的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述戈谢病是I型戈谢病。
262.方面260的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述戈谢病为II型戈谢病。
263.方面260的供使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物、用途或方法，其中所述戈谢病为III型戈谢病。
现在将参考下面的实施例描述本发明，所述实施例仅仅是说明性的，不应该以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1–一般材料和方法
实施例中使用的一些试剂和材料的详述：
·Expi293F细胞(Thermo Fisher，目录号A14527)
·Expi293无血清培养基(Thermo Fisher，目录号A1435101)
·带透气盖、PETG、无菌、平底的
Figure BDA0004148758090001441
一次性爱伦美氏烧瓶(ThermoScientific，目录号4115-0125)
·台盼蓝染色(Thermo Fisher，目录号T10282)
·50ml离心管CentriStar(Corning，目录号430829)
·聚丙烯2.0mL深孔96孔微量培养板96孔(Fisher Scientific，目录号10447181)
·
Figure BDA0004148758090001442
透气胶带(Invitrogen，目录号10544453)
·克隆载体pCDNA5/FRT(来自Thermo Fisher的pCDNA5/FRT，目录号V601020；包含定制合成基因(例如GCase变体或野生型GCase)的克隆性载体(pCDNA5/FRT)由GenScript生产)中编码GCase变体的定制合成的基因
·无核酸酶水(未经DEPC处理的)(Invitrogen，目录号AM9937)
·96V形底部孔板(Corning,REF 3894)
·Opti-MEM I减血清培养基(Opti-MEM I reduced serum medium)(Gibco，目录号31985062)
·转染试剂：ExpiFectamineTM293转染试剂盒(Thermo Fisher，目录号A14524)
·小鼠血清(Sigma-Aldrich，目录号号M5905-10ML)
·小鼠血浆，EDTA(Rockland，目录号D508-04-0050)
·人血清(Sera Laboratories International Ltd.)
·人血浆(Sera Laboratories International Ltd.)
·1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Gibco，目录号14190-094)
·用于微量培养板的可刺穿的粘合箔(VWR，目录号391-1275)
·透明的EasySeal平板密封器(Greiner bio-one，目录号676001)
·4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-Aldrich，目录号M3633-500MG)
·柠檬酸(Sigma-Aldrich，目录号251275-100G)
·牛磺脱氧胆酸钠水合物(Sigma-Aldrich，目录号T0557-5g)。
·甘氨酸(Glentham life Sciences，目录号GM2385)
·柠檬酸钠(Glentham life Sciences，目录号GK0137)
·氢氧化钠((Fisher Scientific，目录号BP359-500)
·维拉苷酶α(VPRIV)(Shire Human Genetic Therapies)
·补充有10％ FBS和1％GlutaMAX的DMEM低葡萄糖(D-10)
·补充有1％GlutaMAX的DMEM低葡萄糖(D-0)
·Gcase测定冲液(AB缓冲液)：50mM柠檬酸钠，25mM牛磺胆酸盐，pH 5.75
·裂解缓冲液：含有0.25％Triton X和1X Halt(蛋白酶抑制剂混合物)的AB缓冲液
·带有10kDa截留膜(10kD MWCO)的Amicon超离心过滤器(Millipore)，(SigmaAldrich)
·SYPROTM Orange Protein凝胶染色剂(ThermoFisher，目录号SS6651)
·一次性PD-10脱盐柱(VWR，目录号17-0851-01)
实施例中使用的一些设备的详述：
·轨道振荡器，New BrunswickTMS41i125 rpm，用于Expi293F细胞。能够400rpm的平板振荡器(Eppendorf)
·微量培养板支架(Eppendorf，目录号M1289-0700)
·实验室离心机(Beckman Coulter,Avanti J-15R)
·培养箱in55(Memmert,Germany)
·CountessTMII FL自动细胞计数器(ThermoFisher，目录号AMQAF1000)
·
Figure BDA0004148758090001451
i3x多模微量培养板读数器(Molecular Devices)
方法
除非另有说明，否则在下述实施例中遵循以下一般方法。
Expi293F细胞的扩增
Expi293F细胞用于表达GCase变体。在37℃、125rpm、8％ CO2气氛和80％湿度下，在带有透气盖的塑料烧瓶中，使Expi293F细胞在Expi293培养基中生长。在维持和扩增阶段，当细胞达到3-5x106个细胞/ml的密度时，将细胞分离成0.3x106个活细胞/ml。传代时，对细胞进行计数，并使用血细胞计数器和台盼蓝拒染法测定其存活力。将细胞在50ml离心管中于室温下以200xg离心10分钟，通过抽吸除去培养基，然后将细胞重悬于预温热的新鲜Expi293培养基中。细胞需要每4天分离一次。用于分离的体积是125ml烧瓶中的30mlExpi293培养基。
转染Expi293F细胞的前一天
用于转染的细胞显示出至少95％的存活力。转染前一天，在两个125ml烧瓶中的新鲜预温热的Expi293培养基中将细胞分离开并稀释至2x106个细胞/ml。将细胞在标准条件下孵育，直至转染之日。
Expi293F细胞的转染
在转染当天，对细胞进行计数，并测定存活力。使用预温热的Expi293培养基将每个烧瓶的细胞浓度调整成2.8×106个细胞/ml的密度。对于96深孔板中的转染，每孔加入0.5ml的于培养基中的细胞。用多孔胶带密封平板，并置于转速为400rpm的振荡培养箱中的微量培养板支架上。
在96深孔板的每个孔中，将80μl无核酸酶的水加入到冻干的质粒DNA(4μg/孔的由GenScript生产的含有定制合成的基因(例如GCase变体或野生型GCase)的pCDNA5/FRT)中。在单独的96孔板(V形底)的孔中，将14 l的每种复原的质粒DNA用21 l Opti-MEM I无血清培养基稀释，而在另一个板的孔中将1.9 l基于阳离子脂质的转染试剂(ExpiFectamine293或类似物)用35 l Opti-MEM I稀释。通过将稀释的DNA与稀释的转染试剂混合来制备DNA-脂质复合物。在室温下孵育20分钟后，向Expi293F细胞中加入50μl/孔的DNA脂质复合物。将平板密封，并将细胞在37℃、5-8％ CO2的湿润气氛中进行振荡培养(400rpm)。
第二天，在转染后16-20小时，加入来自ExpiFectamine 293转染试剂盒的增强子1和增强子2的混合物(27.5μL/孔)。将平板密封并放回37℃的湿润的5-8％ CO2培养箱中，以400rpm摇动。
收获转染的Expi293细胞
转染后4天，通过将平板以200x g离心10分钟收获细胞，收集所有上清液并转移到新的96深孔板中。可以分析上清液中存在的GCase(例如野生型GCase或GCase变体)。例如，上清液可用于如下所述的“稳定性评估”。
Huh-7细胞的转导
将Huh-7细胞维持在补充有10％ FBS和1％ GlutaMAX(D-10)的DMEM低葡萄糖中。使用CountessTMII FL自动细胞计数器对细胞进行计数。对于转导，将细胞以2x105个细胞/孔接种在12孔板中，并使其粘附24小时，然后进行转导。随后，为了增加体外转导效率，用丝裂霉素C(10μg/mL，于D-10中)在37℃处理细胞1小时，并用补充有1％ GlutaMAX(D-0)的DMEM低葡萄糖洗涤。制备含有AAV病毒颗粒的D-10的转导混合物，加入到细胞(500μL/孔)并在37℃、5％CO2下孵育过夜(约16小时)。以所需的AAV感染复数(MOI)：5x103、1x104或5x104Vg/细胞进行转导。以一式三份进行每个转导。
GBA表达盒
产生了编码GCase变体或野生型GCase的GBA表达盒(关于编码多肽的核苷酸序列见下表1)。所用的启动子是“LSP-L”，其为肝脏特异性转录调控元件(SEQ ID NO:35)。
AAV的产生
对于体内实验采用AAV2/8或对于体外实验采用AAV2/‘37’(其使用SEQ ID NO:37和AAV2的ITR)对GBA表达盒进行假型化。通过用编码AAV Rep和Cap功能的质粒、编码腺病毒辅助功能的质粒和编码含有侧翼为AAV2 ITR的GBA表达盒的重组基因组的质粒对HEK293T细胞进行三质粒瞬时转染来产生AAV病毒颗粒(AAV载体)。用AVB琼脂糖(用于AAV2/‘37’)或POROSTMCaptureSelectTM(用于AAV2/8)亲和色谱树脂纯化AAV载体。通过qPCR对纯化的原液进行滴定，并通过碱性琼脂糖凝胶电泳进行表征。
稳定性评估
在96深孔板中，将纯化的蛋白质(诸如GCase变体)、购自Shire Human GeneticTherapies(商业ERT)的纯化的VPRIV或上清液(诸如从上述标题为“收获包含GCase变体或野生型GCase的转染的Expi293F细胞”的方法获得的上清液)与预温热的AB缓冲液、PBS、血清或血浆混合。稀释样品，使得时间点0的初始活性在信号的动态窗口(小于1x109 RFU)的较高范围内(即避免信号饱和，或信号过于接近背景)，以便一致地测量不同样品间的活性变化。在振荡的条件下于37℃下孵育密封的平板。在不同时间长度(诸如0分钟、30分钟、60分钟、120分钟、3天、4天、5天、6天和7天)后，取20μL的等分试样用于GCase活性测定。将每个时间点的残留活性计算为初始活性的百分比。残留活性(残留酶促活性)用于评估稳定性。
GCase活性测定
以4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUG)为底物，用荧光测定法测定活性GCase的水平。简言之，将等分试样(20μL)(诸如在上述“稳定性评估”期间获取的20μL等分试样；按照上文标题为“Huh-7细胞的转导”的部分所述，在细胞转导和过夜孵育后，从孔中取出的20μL培养基；或如下面标题为“血浆和组织的采集”的部分所述的20μL稀释的血浆或裂解的WBC)在37℃下于100μL 50mM柠檬酸钠、25mM牛磺胆酸盐(pH 5.75)(测定缓冲液)、6mM 4-MUG中测定30分钟。通过裂解组织并在37℃下于50mm柠檬酸钠、25mM牛磺胆酸盐(pH5.75)、6mM 4MUG中测定组织蛋白质裂解物来测量采集(如下面标题为“血浆和组织的采集”的部分中所述)的组织的GCase活性。在所有上述情况下，pH为10的0.3M氢氧化钠、0.5M甘氨酸的溶液用作终止溶液。使用
Figure BDA0004148758090001481
i3板读数器，使用分别为365nm和445nm的激发和发射波长进行样品的荧光测量和原始数据输出。对于体外和体内研究，基于4-甲基伞形酮(4-MU，Sigma-Aldrich)标准曲线，将荧光水平转换成纳摩尔/小时/mL。以mU/ml血浆(对于血浆)或mU/mg蛋白质(对于组织和WBC)测量血浆、组织和WBC中的荧光水平，全部使用VPRIV标准曲线。
动物和处理程序(野生型小鼠)
本研究使用野生型(C57BL/6)雄性小鼠(6-8周龄，n＝5)。通过单尾静脉注射，以2x109 vg/kg至2x1012 vg/kg范围内的剂量施用AAV载体。另一组动物未经处理，作为处理效果的对照(未接受过处理的(treatment-naive))。根据研究，在处理后4周或6周宰杀动物。在终点，采集小鼠血液和组织用于分子和组织学分析。
动物和处理程序(9V/无效小鼠)
使用携带Gba1突变D409V/D409V(9V/9V)的9V/无效小鼠。9V/无效小鼠具有接近正常的寿命，具有内脏异常(炎症和储藏细胞)和底物积累(Xu等人，Am J Pathol.2003年11月；163(5):2093-101；Xu等人PLoS One.2010年5月20日；5(5):e10750)。通过将携带Gba1突变D409V/D409V(9V/9V)与Gba1无效/WT的小鼠杂交产生9V/无效小鼠。每窝大约产两只9V/无效。9V/无效和WT小鼠的品系背景为C57BL/6、129SvEvBrd和FVB。将来自多窝的9V/无效小鼠在滚动的基础上随机分配到每个处理组中。每组都有雄性和雌性小鼠参加，试图平衡各组中的性别。所有小鼠都在无病原体的条件下饲养，每天监测，每周称重。所有经AAV处理的小鼠显示正常生长和体重增加。
将AAV的等分试样在-80℃下贮存。注射前，将等分试样在冰上解冻，用X-VIVO 10(Lonza，pH7.4，4℃)稀释，并通过短暂低速涡旋轻轻混合。注射前将稀释的AAV保存在冰上，并在2小时内使用。
将
Figure BDA0004148758090001491
重新悬浮并等分(25μl、50μl、100μl)并于-80℃下贮存。注射前，将等分试样在冰上解冻，并用酸化的X-VIVO 10(Lonza，pH5.5，4℃)稀释至指定剂量，并通过短暂低速涡旋轻轻混合。注射前将稀释的酶保存在冰上，并在2小时内使用。
以5μL/g体重(BW)的指定剂量对8周龄的9V/无效小鼠给予一次AAV和媒介物(X-vivo)。对8周龄的WT小鼠施用媒介物。在异氟醚短暂作用下，通过尾静脉向小鼠施用AAV和媒介物。从8周龄开始，每两周一次(共7次注射)以60U/kg和2.5μL/g Bw的剂量通过尾静脉推注向在生物气泡室中用异氟烷和氧气的混合物麻醉的9V/无效小鼠施用
Figure BDA0004148758090001501
动物和处理程序(非人灵长类动物)
以2x1012 vg/kg给恒河猴(经处理的3只雄性和3只雌性)施用编码GCase变体#85的AAV2/’37’。对动物进行至少6个月(2只雄性和2只雌性)或最长60个月(1只雄性和1只雌性)的给药后观察期。
将AAV在室温下解冻，并在从冰箱中取出后的3小时内施用。将AAV输注(IV，30分钟)到来自Keeling比较医学和研究中心(KCCMR)恒河猴繁殖和研究资源(RMBRR)聚居地(Keeling Center for Comparative Medicine and Research(KCCMR)Rhesus MonkeyBreeding and Research Resource(RMBRR)colony)(MDAndersen,Texas,USA)的三只雄性和三只雌性恒河猴中。对动物进行AAV中和抗体的预筛选，结果为阴性。在第一个月内每周采集血样用于分析，然后以每月的间隔采集血样用于分析，并与基线样品比较。
测量包括死亡率、局部耐受性发现、临床观察、体重、食物消耗量、血液病学和血液化学。该研究还包括在终止时对组织进行完整的组织病理学评估，以确定对GCase的长期超生理血浆暴露的效果和免疫原性(抗GBA)。
在第一个月中，每周监测血浆中的GCase活性一次，在第二个月中每两周监测一次，并且在之后的前6个月中每月监测一次。在终止时采集代表性组织样品，以评估GCase摄取和生物分布。
使用荧光底物4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4MUG)在荧光测定法中测定GCase活性。新鲜制备由1％的于50mM柠檬酸钠(pH5.75)中的牛磺胆酸钠(Sigma，目录号T0557-56)组成的Gcase测定冲液(AB缓冲液)，然后测定血浆中的GCase活性。测定前，将血浆样品在AB缓冲液中稀释至1:25。将25μL血浆与25μL 6mM 4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUG,Sigma Aldrich，目录号M3633500Mg)混合并在37℃孵育30分钟。孵育后，每个反应加入将50μL pH10的终止溶液(0.3M氢氧化钠，Fisher Scientific目录号BP 359-500；0.5M甘氨酸，Glentham Life Science目录号GM2385)每个反应中加入0.5M甘氨酸，Glentham Life Science Cat#GM2385)。用荧光测定法(
Figure BDA0004148758090001511
i3平板读数器[Molecular Devices]；λex＝365nm，λem＝445nm)评估酶促活性。基于7-点4-甲基伞形酮(4-MU)标准曲线，以nmol/h/ml为单位表示GCase特异性活性。
血浆和组织的采集
对于野生型小鼠，通过在K2-EDTA存在的情况下(以避免凝结)从保存在冰上10分钟的全血中分离获得鼠血浆。通过在冷冻离心机中以5xg离心5分钟来分离血浆。分离后，将血浆等分，通过用50mM柠檬酸钠、25mM牛磺胆酸盐、pH 5.75缓冲液(AB缓冲液，稀释度1∶25，即1份血浆对24份AB缓冲液)稀释血浆来保持GCase活性。收获组织(肝脏、脾脏、骨髓、肺)并保存在10％缓冲福尔马林中(组织学)或快速冷冻(GCase活性)。
使用200μl经K2-EDTA处理的试管从全血中获得白细胞(WBC)。在冰上孵育10分钟后，通过加入1800μl水使红细胞溶血。混合30秒后，加入10X PBS以防止进一步的细胞裂解。通过以1000xg离心5分钟沉淀WBC。弃去上清液，将细胞重悬于含有200μl含有0.25％Triton X和1X Halt(裂解缓冲液)的AB缓冲液中，在干冰中冷冻并于-80℃下储存。
载体基因组拷贝数
为了确定体外转导后Huh-7细胞中载体基因组的数量，首先用PBS-1X洗涤细胞，并用40μl TrypLE(Thermo Fisher)处理5分钟。在沉淀后，向细胞中加入PBS(110μl),将其冷冻并于-80℃下储存。在三次冷冻/解冻循环以裂解并释放DNA后，将一式三份孔合并并离心(14000xg，持续5分钟),然后取出等分试样(15μl),并用ddH2O以1:33稀释。利用结合启动子的引物组，诸如结合LSP-L启动子的引物组，使用qPCR进行AAV拷贝数估计。
为了确定AAV病毒颗粒注射后每个肝细胞的载体基因组的数量，使用QIAGENDNeasy血液和组织试剂盒(QIAGEN)按照制造商的方案从冷冻的肝脏样品中分离DNA。DNA分离后，利用结合启动子的引物组，诸如结合LSP-L启动子的引物组，使用qPCR进行AAV拷贝数估计。
免疫组织化学
采集后，将组织保存在缓冲福尔马林中，用于随后的石蜡包埋(FFPE)。用二甲苯和乙醇洗涤对FFPE鼠组织进行脱蜡。根据Ventana Cc1建议进行抗原修复处理。使用VentanaDiscovery XT仪，使用Ventana DAB Map检测试剂盒(760-124)进行免疫组织化学染色。兔抗人酸性β-葡糖脑苷脂酶(Abcam,Ab125065,1:100–400)用于显现鼠组织中的GCase。用3,3′--二氨基联苯胺(DAB)显现GCase染色。切片用苏木精复染。使用自动光学显微镜(Leica)捕捉图像。
GCase蛋白纯化
通过以5000rpm离心来澄清转染的Expi293F细胞的培养基。按照制造商建议的浓度将蛋白酶抑制剂(Roche complete tablet)添加到澄清的培养基中。然后将澄清的培养基与正-丁醇(1∶4v/v，丁醇∶培养基)混合，并在4℃于旋转振荡器上进行脱脂超过1小时。然后将混合物转移到分液漏斗中，放置至少30分钟，以将脂质层从澄清的培养基中分离出来。使用AKTA pure系统，利用
Figure BDA0004148758090001521
CL-4B柱纯化GCase变体。以<1ml/min的流速装载澄清和去脂的培养基，并用两个柱体积的25％、50％和75％乙二醇(于pH 5.75的25mM柠檬酸磷酸盐缓冲液中)洗涤。用100％乙二醇洗脱GCase蛋白，用PD-10柱将缓冲液换成25mM柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH 5.75)，用Amicon超离心过滤器(10kD MWCO膜)浓缩至所需浓度。
热稳定性测试
使用基于
Figure BDA0004148758090001522
3和5实时PCR系统和SYPROTMOrange蛋白质凝胶染色剂(一种与疏水蛋白质区域结合的环境敏感性荧光染料，增加荧光发射)的热位移测定(thermal shift assay)来研究GCase的热稳定性。
将已知浓度的GCase溶液与5x SYPROTMOrange蛋白质凝胶染色剂混合，以在蛋白质分子随着温度升高而解折叠时产生荧光信号。在
Figure BDA0004148758090001531
3和5实时PCR系统中生成解链曲线，其中选择‘ROX’作为报告基因。从在25℃保持2分钟开始，使温度以每分钟1℃的速度升高，直至95℃。解链温度对应于解链曲线(以RFU为单位的荧光对温度的曲线)的负导数的最小值。
实施例2-pH 7.4时的VPRIV活性
为了确定VPRIV在pH 7.4(生理pH)下的稳定性，根据实施例1中标题为“稳定性评估”的部分，将VPRIV在PBS(pH 7.4)中孵育超过120分钟。如实施例1中标题为“GCase活性测定”的部分所述测定酶促活性(GCase活性)。
在每个时间点(0分钟、15分钟、30分钟、60分钟和120分钟)计算VPRIV的残留酶促活性(残留GCase活性)。将每个时间点的残留酶促活性计算为占初始活性(在时间点0时)的百分比。
结果显示，在pH 7.4的PBS中孵育120分钟后，VPRIV几乎没有(如果有的话)残存的残留酶促活性(图1)。
实施例3–GCase变体的稳定性
表1
Figure BDA0004148758090001532
Figure BDA0004148758090001541
产生了89种GCase变体。标准程序诸如定点诱变可用于产生GCase变体。基因合成编码GCase变体的经密码子优化的核苷酸序列，并由GenScript克隆到商购可得的表达载体pcDNA5/FRT(Thermo Fisher)中。
测试89种GCase变体的残留酶促活性。简言之，根据实施例1中标题为“Expi293F细胞的扩增”、“Expi293F细胞转染的前一天”、“Expi293F细胞的转染”和“收获转染的Expi293F细胞”的部分中描述的方法表达GCase变体。根据实施例1中标题为“稳定性评估”和“GCase活性测定”的部分中描述的方法测量酶促活性(GCase活性)。
关于“稳定性评估”，在pH 7.4的PBS缓冲液中于37℃孵育2小时后，测试所述89种GCase变体和野生型GCase的残留酶促活性(残留GCase活性)。残留酶促活性计算为2小时后剩余的活性相对于初始活性的百分比。
表1中所示的12种GCase变体(19、21、34、47、57、63、68、69、74、79、85和89)与野生型(数据未显示)相比具有更高的残留活性(至少高10％)。另外，GCase变体H262Y(数据未显示)具有与变体19相似的残留活性。
在这12种GCase变体中，两种变体，具体地#21和#85，显示出最高的残留活性，因此选择它们用于进一步表征。还测试了具有变体#21和#85的所有突变的GCase变体(变体#21+85)。
实施例4-通过具有增强的蛋白质稳定性的GCase变体实现的生理pH下GCase活性的拯救
测试了各种GCase变体、野生型GCase和VPRIV在各种条件下的残留酶促活性。
简言之，根据实施例1中标题为“Expi293F细胞的扩增”、“Expi293F细胞转染的前一天”、“Expi293F细胞的转染”和“收获转染的Expi293F细胞”的部分中描述的方法表达GCase变体和野生型GCase。根据实施例1中标题为“稳定性评估”和“GCase活性测定”的部分中描述的方法测量酶促活性(GCase活性)。在不同的时间点(如下所述)计算GCase变体、野生型GCase和VPRIV的残留酶促活性(残留GCase活性)。将每个时间点的残留酶促活性计算为占初始活性的百分比。
在一个实验中，比较了GCase变体#21和#85(来自实施例2的具有最高残留活性的两个GCase变体)、变体#21+85、野生型GCase、两个参照(变体#68和#69)和VPRIV在不同pH条件下的活性。关于“稳定性评估”，将GCase变体、野生型GCase、参考GCase或VPRIV在AB缓冲液(pH 5.6)或PBS缓冲液(pH 7.4)中孵育达7天。在孵育0分钟、10分钟、30分钟、60分钟、120分钟、3天、4天、5天、6天和7天后，测量残留酶促活性(残留GCase活性)。发现变体#21、#85和#21+85在两种pH条件下在7天的过程中保持了比野生型GCase、参考GCase和VPRIV更高的酶活性(图2A和B)。
在进一步的实验中，也在人血清或人血浆中孵育达7天后比较变体#21、#85和#21+85以及VRPIV的活性。关于“稳定性评估”，在人血清或人血浆中孵育0分钟、10分钟、30分钟、60分钟、120分钟、3天、4天、5天、6天和7天之后，测量残留酶促活性(残留GCase活性)。发现变体#21和#85在2小时内在人血清和人血浆中保持比VPRIV更高的酶促活性，并且发现变体#21+85在7天内在人血清和人血浆中均保持比所有测试的另外GCase变体和VPRIV更高的酶促活性(图3A和B)。
实施例5–与VPRIV相比，GCase变体#85在各种生理基质中的半衰期延长
测定了纯化的VPRIV(维拉苷酶α)和纯化的GCase变体#85变体的半衰期。
简言之，根据实施例1中标题为“Expi293F细胞的扩增”、“Expi293F细胞转染的前一天”、“Expi293F细胞的转染”和“收获转染的Expi293F细胞”的部分中描述的方法表达GCase变体。纯化的VPRIV(维拉苷酶α)购自Shire Human Genetic Therapies。如实施例1中标题为“GCase蛋白质纯化”的部分所述，纯化GCase变体#85。根据实施例1中标题为“稳定性评估”和“GCase活性测定”的部分中描述的方法测量酶促活性(GCase活性)。
关于“稳定性评估”，将纯化的蛋白质(变体#85和VPRIV)与AB缓冲液(pH 5.6)、PBS缓冲液(pH 7.4)、小鼠血清、小鼠血浆或人血清在37℃下一起孵育0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、24小时、48小时、120小时和144小时(未显示所有时间点)。在每个时间点计算VPRIV和GCase变体#85的残留酶促活性(残留GCase活性)。每个时间点的残留酶促活性计算为占初始活性的百分比。
使用GraphPad Prism根据单相衰变模型计算半衰期。对于每种测试的基质，GCase变体#85显示出比VPRIV更高的残留酶促活性(图4A、B和C)。在溶酶体pH、生理pH、小鼠血清和人血清中，GCase变体#85的半衰期比VPRIV长(图4C)。
实施例6–当加工4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡萄糖苷酸(4-MUG)时，GCase变体#85显示出与针对野生型GCase和ERT报道的相似的酶促效率(即GCase变体加工底物的能力)
测定了GCase变体#85在加工4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡萄糖苷酸(4-MUG)时的酶促效率。如实施例1中标题为“GCase蛋白质纯化”的部分所述，纯化GCase变体#85蛋白质。将1nM或3.5nM的纯化蛋白(GCase变体#85)与递增量(2.5x 106nM、5x 106nM、7.5x 106nM或1x107nM)的AB缓冲液中的4-MUG(GCase的荧光底物)一起孵育。通过测量产生的荧光(激发波长：365Nm，发射波长：445Nm)在15分钟内监测4-MU的形成。将每个4-MUG浓度下的4-甲基伞形酮(4-MU)形成速度对4-MUG浓度作图，并用Michaelis-Menten模型拟合(图5A和图5B)。
图5C显示了GCase变体#85的Km和Kcat，以及其他人报道的野生型GCase和酶替代疗法(ERT)伊米苷酶和维拉苷酶α的Km(mM)值。
Gcase变体#85与其他人报道的已用于治疗戈谢病的野生型GCase和ERT具有大约2.0mM的相似Km。
实施例7–GCase变体#85的计算机免疫原性评估表明其免疫原性风险特征低于野生型GCase
使用计算机计算和分析来评估和比较野生型GCase和GCase变体#85的潜在免疫原性风险特征。该评估基于一定长度的肽对MHC受体分子的预测结合亲和力的计算。肽-MHC结合是免疫反应中第一关键的必须步骤。来自GCase变体中跨越氨基酸取代的上游50个氨基酸和下游50个氨基酸的区域(例如，来自跨越W351C上游50个氨基酸到A380C下游50个氨基酸的区域)的长度为9个(9聚体)和15个(15聚体)氨基酸的肽片段(用于分别计算与HLA-I和HLA-II受体分子的结合亲和力)可用作使用免疫表位数据库和分析资源数据库(https:// www.iedb.org/)进行计算的输入。使用的预测方法是NetMHCpan EL 4.0(用于HLA-I)和NetMHCIIpan 3.2(用于HLA-II)。计算的IC50值(以纳摩尔单位(nM)给出)用作肽结合亲和力的量度，IC50截断值用于将肽分类为“强”或“中等”结合物。IC50值越低，预测结合越好。对于“强”粘合剂，使用的IC50截断值范围为0nM至≤50nM，对于“中等”粘合剂，IC50截断值为>50nM至≤500nM。基于计算机分析和比较结果，与野生型GCase相比，GCase变体#85具有总体上更低的潜在免疫原性风险特征，如通过其较少数量的MHC I类(HLA-I)“强”结合物和较少数量的MHC II类(HLA-II)“强”结合物所显示的(图6)。
实施例8–在AAV2/‘37’转导Huh-7细胞后，GCase变体显示出与野生型GCase相比增强的GCase有效活性
对来自前述实施例的GCase变体，即GCase变体#21、GCase变体#85、GCase变体#21+85以及野生型GCase进行了体外研究。根据实施例1中标题为“AAV的产生”的部分生产AAV2/‘37’病毒颗粒。AAV2/‘37’病毒颗粒表达编码GCase变体之一或野生型GCase的序列。根据实施例1中标题为“Huh-7细胞的转导”的部分，用AAV2/‘37’病毒颗粒转导Huh-7细胞。用于转导的MOI为5x103、1x104和5x104vg/细胞，包括未经处理的对照。根据标题为“GCase活性测定”的部分测量GCase有效活性。基于4-MU标准曲线，以nmol/小时/ml为单位测量GCase有效活性。将结果以载体基因组拷贝数(如根据实施例1中标题为“载体基因组拷贝数”的部分测定的)作归一化。归一化是针对MOI组进行的，以体现转导效率。
当与野生型GCase相比时，所有GCase变体(#21、#85和#21+85)显示出增强的有效GCase活性。特别地，GCase变体#85(含有二硫键)显示出最高水平的GCase活性(图7)。
实施例9-注射到野生型小鼠中后，GCase变体显示出循环GCase水平和受戈谢病影响的关键组织中的摄取增加
对来自前述实施例的GCase变体，即GCase变体#21、GCase变体#85、GCase变体#21+85以及野生型GCase进行了体内研究。在将表达编码GCase变体(#21、#85或#21+85)之一或野生型GCase的序列的AAV2/8病毒颗粒注射到野生型(C57BL/6)雄性小鼠中后，测量循环GCase水平(图8A)和受戈谢病影响的关键组织中的GCase水平(图8B和图8C)。根据实施例1中标题为“AAV的产生”的部分产生AAV2/8病毒颗粒。AAV2/8病毒颗粒表达编码GCase变体之一或野生型GCase的序列。在实施例1中标题为“动物和处理程序”的部分描述了小鼠和小鼠的处理方式。将AAV2/8病毒颗粒以6x1010 vg/kg的剂量注射到小鼠体内。处理后4周，宰杀动物。如实施例1中标题为“血浆和组织收集”的部分所述采集血浆和组织。如标题为“GCase活性测定”的部分所述测量GCase的有效活性。根据VPRIV标准曲线，以mU/ml的血浆或mU/mg的蛋白质(脾脏和骨髓)为单位测量有效GCase活性的水平。将结果以载体基因组拷贝数(如根据实施例1中标题为“载体基因组拷贝数”的部分测定的)作归一化。
与野生型GCase相比，GCase变体(#21、#85和#21+85)显示出升高的有效GCase活性水平。特别地，GCase变体#85显示出循环GCase的最高有效GCase活性水平以及关键器官诸如脾脏和骨髓的最高摄取水平。选择变体#85用于进一步表征。
实施例10-用GCase变体#85处理后，在脾脏、肺和骨组织中实现了GCase的更大摄取
如实施例9所述，在AV2/8病毒颗粒注射到野生型(C57BL/6)雄性小鼠中后，检测肝脏、脾脏、肺和骨髓中的GCase水平。如实施例9中所述，从小鼠采集组织。如实施例1中标题为“血浆和组织的的采集”的部分所述，采集并保存实施例9中小鼠的肝脏、肺、脾脏和骨髓。在石蜡切片上进行免疫组织化学染色，并如实施例1中标题为“免疫组织化学”的部分中所述进行显现。图9显示，与实施例9中的活性数据一致，在受戈谢病影响的器官诸如肺、脾脏和骨髓中，与野生型GCase相比，注射了表达编码GCase变体#85的序列的AAV2/8病毒颗粒的小鼠中GCase的组织摄取增加。
实施例11–AAV2/8-GCase变体#85显示了血浆中循环GCase的剂量依赖性增加，以及WBC、脾脏、肺和骨髓组织摄取的剂量依赖性增加
如实施例9所述，在将表达编码GCase变体#85的序列的AAV2/8病毒颗粒注射到野生型(C57BL/6)雄性小鼠中后，测量循环GCase水平(图10A)、受戈谢病影响的关键组织中的GCase水平(图10B-图10D)和白细胞中的GCase水平(图10E)。该方法与实施例9相同，不同之处在于使用2x109 vg/kg至2x1012 vg/kg的AAV2/8病毒颗粒的剂量范围，并在处理后14天(通过眶后放血)、处理后28天(通过眶后放血)和处理后42天(宰杀后)获得血浆。对于组织和WBC，在处理后6周宰杀动物。如实施例1中标题为“GCase活性测定”的部分所述测量GCase水平。
图10A显示了在42天内血浆中循环的活性GCase的剂量依赖性增加。还观察到关键戈谢病器官诸如脾脏、骨髓和肺对GCase的剂量依赖性摄取(图10B-图10D)。另外，观察到白细胞对GCase的剂量依赖性摄取(图10E)。未达到稳定状态。
实施例12–GCase变体#85在pH 5.75和pH 7.0的浓度范围内表现出比维拉苷酶α更高的热稳定性
使用了实施例1中标题为“热稳定性测试”的部分描述的热位移测定法研究了GCase变体#85的热稳定性，并将其与维拉苷酶α(VPRIV)的热稳定性进行了比较。
根据实施例1中标题为“Expi293F细胞的扩增”、“Expi293F细胞转染的前一天”、“Expi293F细胞的转染”和“转染的Expi293F细胞的收获”的部分中描述的方法表达GCase变体#85蛋白。随后如实施例1中标为“GCase蛋白质纯化”的部分所述纯化Gcase变体#85。将GCase变体#85蛋白储存在pH 5.75的25mM柠檬酸钠缓冲液中，并在无核酸酶的水中复原VPRIV。在pH 5.75和pH 7下研究GCase变体#85和VPRIV，将其交换到使用一次性PD-10脱盐柱建立的各自溶液中。将1.5μM、3μM和6μM的GCase变体#85和VPRIV与5xSYPROTMOrange蛋白凝胶染色剂混合，如实施例1所述生成解链曲线。
随着pH 5.75和pH 7时蛋白质浓度的增加，GCase变体#85和VPRIV各自的解链温度(即50％的蛋白质解折叠时的温度)分别显示在图12A和图12B中。
实施例13–注射到GBA缺陷型小鼠后，与酶替代疗法(ERT)和编码野生型GCase的AAV相比，GCase变体#85显示出循环GCase水平升高和关键组织中的摄取增加
方法
携带Gba1突变D409V/D409V(9V/9V)的9V/无效小鼠在本研究中用作戈谢病模型，如以上实施例1中所述。本研究的目的是评估编码GCase变体#85蛋白的AAV载体在9V/无效小鼠中的治疗潜力，所述9V/无效小鼠是1型戈谢病的良好表征的模型。
八周龄的雄性和雌性9V/无效小鼠接受剂量为0(“未经处理的”媒介物对照，X-vivo 10)、2x1010 vg/kg、2x1011 vg/kg或2x1012 vg/kg的单次静脉内剂量的编码GCase变体#85(由SEQ ID NO:18编码的)的AAV2/8。另一组9V/无效小鼠用维拉苷酶α(
Figure BDA0004148758090001611
一种被批准用于戈谢病的酶替代疗法[ERT]的GCase)治疗，临床剂量为60U/kg，每2周通过尾静脉注射一次。另一组9V/无效小鼠用编码野生型GCase(由SEQ ID NO:60)的AAV治疗，剂量为2x1010 vg/kg、2x1011vg/kg或2x1012 vg/kg。所有组的n数为每组9至16。编码野生型GCase的序列与用于编码GCase变体#85的经密码子优化序列相同，不同之处在于编码野生型GCase的序列在对应于GCase变体#85(GCaseW351C/A380C)中的突变的位置处含有不同的密码子。
经AAV处理的小鼠显示出与接受媒介物或
Figure BDA0004148758090001612
的小鼠相当的体重增加；类似地，在尸检时，所有组之间的血液病学参数以及肝脏和脾脏的重量是可比较的。血液病学血液取样：在终点采集组织前1至3天，将新鲜血液(～100μL)从尾静脉采集到0.5M EDTA(5μL)管中，并在24小时内在Hemavet 950FS(Drew Scientific Inc.USA)上读取血液病学参数。
小鼠组织的采集和处理：在对应于处理开始后12周的终点采集小鼠血浆和选择的组织。简言之，通过戊巴比妥(100mg/kg)对小鼠实施安乐死。通过门静脉将血液(～700μL)采集到0.5M EDTA(20μL)管中。处理一部分血液(～400μL)以采集白细胞(WBC)用于GCase活性测定。将剩余的血液加工成血浆，等分，然后于-80℃贮存用于后续的蛋白质和底物分析。在采集后2小时内，对新鲜血浆的一部分进行加工以用于GCase活性测定。
在组织收获之前，用盐水经心脏灌注小鼠。解剖出肝脏、脾脏、肺、脑和脊髓。在进一步解剖以进行多项测定法之前，对整个肝脏和脾脏进行称重。将肝脏、肺、脾脏分为四份。在活性、蛋白质和底物分析之前，将三份冷冻在储存于-80℃下的单独的管中；将一份固定在10％福尔马林中用于组织学分析。从颈部区域解剖脊髓并固定在10％福尔马林中用于组织学分析。另外，从双腿的股骨和胫骨采集骨髓(BM)细胞，并冷冻在储存于-80℃冰箱中的两个管中，用于活性和底物测定。
在预定的酶注射后2小时内进行来自
Figure BDA0004148758090001621
处理组的每次血浆采集和GCase活性测定。
白细胞(WBC)分离：通过裂解红细胞(RBC)从血液中分离出WBC。将采集在0.5MEDTA管中的血液(～400μL)悬浮在10倍体积的PBS中，并以3,000rpm离心20分钟以分离细胞。然后将细胞悬浮在10倍体积的RBC裂解缓冲液(8.3gm/L的于0.01M Tris–HCL缓冲液中的NH4Cl，pH 7.5)中，并以3,000rpm离心20分钟。裂解过程重复三次，直至沉淀变成浅色。用PBS洗涤最终的WBC，并通过离心采集。在GCase活性测定之前，将收集的WBC于-80℃下贮存。
GCase活性测定：使用
Figure BDA0004148758090001622
2mL组织匀浆混合珠试剂盒(BertinInstruments，France)在1％牛磺胆酸钠和1％ Triton X-100(Tc/Tx)中匀浆WBC、BM和组织样品，并通过具有Cryolys thermo control的Precellys Evolution组织匀浆器(40℃,Bertin Instruments，France)在40℃下操作两个循环(每个循环20秒，间隔30秒)。在40℃下通过超声处理于1％ Tc/Tx中匀浆细胞(BM和WBC)。在测定混合物(0.025M柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH 5.6)中用反应缓冲液稀释(5X)组织和细胞裂解物(2μL)。将每个样品一式三份的稀释裂解产物(10μL)装载到反应板上。对于血浆样品，将血浆在0.025M柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 5.6)中稀释。将GCase活性以血浆体积作归一化，并表示为nmole/h/mL。在2mM环己烯四醇β环氧化物(CBE，Millipore.CA,USA))(一种不可逆的GCase抑制剂)存在和不存在的情况下，在37℃下与4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MU-葡萄糖，4mM)(Biosynth AG，Switzerland)孵育一起1小时(h)后，用荧光测定法(Molecular Devise M5荧光光谱仪，激发和发射波长分别为365nm和445nm)测定GCase活性的相对荧光单位(RFU)，以评估切割4-MU-葡萄糖的非酸性-β-葡萄糖苷酶。4-MU-葡萄糖系数因子(CF)为56,000，其是从每次测量一式三份的两次测量所生成的4-MU标准曲线推导而来的。净RFU/CF＝nmole。对于血浆或组织，将GCase活性分别计算为nmole/h/ml或nmole/h/mg。
通过LC/MS分析血浆、肝脏、脾脏、肺和BM样品中的GCase底物，葡糖神经酰胺和葡糖鞘氨醇。
将冷冻的肝脏、脾脏和肺称重(～50mg)并在3.6mL甲醇/氯仿/H2O(2:1:0.6v/v/v)中使用带有7mm不锈钢发生器探针的Omni TipTM匀浆试剂盒(OMNI International)匀浆15秒。一份等份(500μL)裂解物用于LC/MS分析。将定量的葡糖神经酰胺和葡糖基神经鞘氨醇以组织重量作归一化。
对血浆(～100μL)进行LC/MS分析。将葡糖神经酰胺和葡糖神经鞘氨醇水平以所用血浆体积作归一化。
将BM细胞悬浮在200μL水中，超声处理，然后涡旋以制备细胞裂解物。将160μL裂解物用于LC/MS分析。剩余的裂解物用于蛋白质评估。将葡糖神经酰胺和葡糖鞘氨醇水平以蛋白质的量作归一化。
己糖基神经酰胺和己糖基鞘氨醇的LC/MS分析在Medical University of SouthCarolina的脂质组学共享资源中心进行。己糖基神经酰胺和己糖基鞘氨醇的最低定量限为25pmole/mL。己糖基神经酰胺由葡糖神经酰胺和半乳糖神经酰胺组成。己糖基鞘氨醇包括葡糖鞘氨醇和半乳糖鞘氨醇。因为在血浆、肝脏、脾脏、肺和BM中检测不到半乳糖神经酰胺和半乳糖鞘氨醇，所以定量的己糖基神经酰胺和己糖基鞘氨醇分别代表葡糖神经酰胺和葡糖鞘氨醇。
通过将泡沫状巨噬细胞计数为储藏细胞并定量巨噬细胞上CD68强度染色信号(戈谢病中的炎症标志物)来确定9V/无效小鼠的内脏病理学。
储藏细胞计数：组织切片用苏木精和伊红(H&E)通过自动染色机(LeicaAutostainner XL,CCHMC core facility)染色。用Aperio AT2(Leica,20X)扫描染色的组织。用Aperio eSlide ImageScope(V12.4.0.0543)处理组织图像。随机选择来自小鼠肝脏和肺的10张20倍大小的照片(500μm X 800μm图像)用于分析。从每个图像中手动计数储藏细胞。使用从分析的10副图像中观察到的平均细胞计数，并示于图中。“储藏细胞”的定义基于细胞(巨噬细胞)的尺寸，例如，肝脏中储藏细胞的尺寸>10μm，肺中储藏细胞的尺寸>15μm。从通过Aperio eSlide ImageScope软件(V12.4.0.0543)处理的图像中的比例尺确定储藏细胞尺寸。实验者对样品的身份一无所知。
CD68染色和定量：使用Discover Ultra自动IHC/ISH玻片染色机，利用兔抗小鼠CD68抗体(1∶25Abcam Ab53444))对组织切片进行染色。用苏木精(蓝色)对组织进行反染，以显现细胞核。用Aperio AT2(Leica,20X)扫描染色的组织，用Aperio eSlide ImageScope(V12.4.0.0543)获取图像。选择20倍大小(500μm X 800μm)的肝脏和肺图像用于CD68信号(棕色)密度的定量分析。使用Image J(Fiji,v5.1)分析来自每只小鼠肝脏或肺的5幅图像的免疫组织化学信号。实验者对样品身份一无所知。
信号密度校准：CD68染色在两个分开的实验中进行：
1)媒介物-9V/无效、WT媒介物和VPRIV
2)媒介物-9V/无效和AAV-GCase#85。
两个实验之间的密度变化(转换系数)由来自每个实验的一组参考样品(三个雄性和三个雌性的媒介物-9V/无效)确定。应用转换因子将来自两个实验的样品中的CD68密度针对相同的背景水平进行校准。在每只小鼠分析的五个图像中观察到的平均CD68信号用于数据分析。
结果
在注射后12周和最后一次ERT注射后2小时内测量了AAV递送后GCase活性的增加，这与之前的数据一致，该数据显示这是在组织中ERT处于其C-max的时期内。注射编码GCase变体#85的AAV将肝脏、脾脏、肺、白细胞(WBC)和骨髓中的组织GCase活性增加到野生型(WT)水平之上(图13)。此外，在施用编码GCase变体#85的AAV后分析的血浆(图14)和所有组织中观察到随着疾病进展而积累的葡糖鞘氨醇的显著减少(图15)。对于葡糖神经酰胺也观察到类似的减少。
注射编码GCase变体#85的AAV后的组织GCase活性水平也高于注射编码野生型GCase的AAV后观察到的水平。参见图18，其包含来自图13的数据加上注射编码野生型GCase的AAV后的GCase活性水平，以2x1011的剂量注射编码GCase变体#85的AAV后的GCase活性水平，以及来自未处理组中另外四只小鼠的数据。另外，施用编码GCase变体#85的AAV后的葡糖鞘氨醇水平的降低程度也大于施用编码野生型GCase的AAV后的葡糖鞘氨醇水平的降低程度。参见图19A，其包含来自图14的数据加上注射编码野生型GCase的AAV后的葡糖鞘氨醇水平，以及来自未处理组中另外四只小鼠的数据。同样，参见图19B至图19E，其包含来自图15A至图15D的数据加上注射编码野生型GCase的AAV后的葡糖鞘氨醇水平，以及来自未处理组中另外四只小鼠的数据。
在单次注射编码GCase变体#85的AAV后，肺和骨髓显示出显著提高的底物清除率。通过AAV注射，葡糖鞘氨醇(一种戈谢病生物标志物lysoGb1)在这些组织和血浆中均降低至大约WT水平。此外，如通过抗CD68抗体染色以及肝脏和肺中储藏细胞计数所评估的，经AAV处理的小鼠中组织炎症显著减轻。参见图16A，其显示了肺中CD68密度水平的比较，以及参见图16B，其显示了肺中储藏细胞数量的比较。
在施用编码GCase变体#85的AAV或编码野生型GCase的AAV后12周，观察到9V/无效小鼠血浆中循环GCase水平的剂量依赖性升高(图20)。另外，与施用了编码野生型GCase的AAV的小鼠相比，在施用了编码GCase变体#85的AAV的小鼠中观察到更高水平的GCase活性(图20)。与施用编码野生型GCase的AAV相比，施用编码GCase变体#85的AAV后，观察到高达42倍的更高水平GCase活性。
实施例14-在注射AAV-GCase#85后对非人灵长类动物的长期调查研究显示，在所有时间点，在所有经AAV处理的动物中GCase活性相对于处理前水平升高
研究目标是评估雄性和雌性猴(恒河猴)单次AAV IV(输注)施用后60个月的观察期内的全身性长期毒性可能性和生物分布。
如以上实施例1中所述进行实验。如以上实施例1所述，给恒河猴(经处理的3只雄性和3只雌性)施用编码GCase变体#85的AAV2/’37’。将对动物进行至少6个月(2只雄性和2只雌性)或最长60个月(1只雄性和1只雌性)的给药后观察期。
测量包括死亡率、局部耐受性发现、临床观察、体重、食物消耗量、血液病学和血液化学。该研究还将包括在终止时对组织进行完整的组织病理学评估，以确定对GCase的长期超生理血浆暴露的效果和免疫原性(抗GBA)。在第一个月中每周一次测定GCase活性水平，第二个月每隔一周测定一次，之后每月测定一次。将在终止时收集代表性组织样品，以评估GCase摄取和生物分布。
这项研究目前正在进行中。研究期间未出现死亡，也未出现对临床状况、给药后观察、体重、食物消耗量、血液病学、血液化学、外周白细胞免疫表型分型的处理相关影响。
对第8天、第15天、第22天、第29天、第43天和第57天的样品进行的初步血浆分析检测到，在所有时间点，所有经AAV处理的动物中，GCase活性相对于处理前水平(即第0天)升高(图17A)。Gcase水平在第8天前迅速升高；在第22天与第43天之间出现了一些波动，从第43天开始水平趋于稳定。获得的GCase水平与Gba缺陷型小鼠中获得的水平一致，并且在与组织中底物清除相关的范围内。
图17B显示了在AAV施用后第8天、第15天、第22天、第29天、第43天、第57天、第85天、第113天、第141和第170天在相同的经AAV处理的动物中观察到的GCase活性水平。动物17-020在第83天被处死以用于组织摄取研究。
序列表
<110> Freeline Therapeutics Limited
<120> 多肽
<130> N417179WO
<150> GB2011813.9
<151> 2020-07-29
<150> GB2100648.1
<151> 2021-01-18
<150> GB2105924.1
<151> 2021-04-26
<160> 64
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 536
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Glu Phe Ser Ser Pro Ser Arg Glu Glu Cys Pro Lys Pro Leu Ser
1 5 10 15
Arg Val Ser Ile Met Ala Gly Ser Leu Thr Gly Leu Leu Leu Leu Gln
20 25 30
Ala Val Ser Trp Ala Ser Gly Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe
35 40 45
Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser
50 55 60
Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu
65 70 75 80
Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln
85 90 95
Ala Asn His Thr Gly Thr Gly Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln
100 105 110
Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu
130 135 140
Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val
145 150 155 160
Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp
165 170 175
Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp
180 185 190
Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln
195 200 205
Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu
210 215 220
Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro
225 230 235 240
Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu
245 250 255
Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu
260 265 270
Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu
275 280 285
Gly Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly
290 295 300
Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu
305 310 315 320
Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr
325 330 335
Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr
340 345 350
Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg
355 360 365
Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser
370 375 380
Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met
385 390 395 400
Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly
405 410 415
Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp
420 425 430
Val Arg Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp
435 440 445
Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys
450 455 460
Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys
465 470 475 480
Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val
485 490 495
Val Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys
500 505 510
Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile
515 520 525
His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg Gln
530 535
<210> 2
<211> 497
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys
1 5 10 15
Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro
20 25 30
Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg
35 40 45
Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly
50 55 60
Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly
65 70 75 80
Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu
85 90 95
Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu
100 105 110
Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe
115 120 125
Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu
130 135 140
His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu
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Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala
165 170 175
Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn
180 185 190
Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr
195 200 205
Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys
210 215 220
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225 230 235 240
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260 265 270
His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu
275 280 285
Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser
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Gln
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<211> 497
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<213> 人工序列
<220>
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Gln
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Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu
130 135 140
Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val
145 150 155 160
Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp
165 170 175
Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu Leu Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp
180 185 190
Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln
195 200 205
Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu
210 215 220
Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro
225 230 235 240
Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu
245 250 255
Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu
260 265 270
Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu
275 280 285
Gly Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly
290 295 300
Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu
305 310 315 320
Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr
325 330 335
Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr
340 345 350
Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg
355 360 365
Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser
370 375 380
Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met
385 390 395 400
Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly
405 410 415
Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp
420 425 430
Val Arg Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp
435 440 445
Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys
450 455 460
Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys
465 470 475 480
Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val
485 490 495
Val Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys
500 505 510
Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile
515 520 525
His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg Gln
530 535
<210> 5
<211> 536
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的GCase蛋白
<400> 5
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1 5 10 15
Arg Val Ser Ile Met Ala Gly Ser Leu Thr Gly Leu Leu Leu Leu Gln
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Ala Val Ser Trp Ala Ser Gly Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe
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50 55 60
Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu
65 70 75 80
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115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu
130 135 140
Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val
145 150 155 160
Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu
245 250 255
Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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420 425 430
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435 440 445
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Val Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys
500 505 510
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515 520 525
His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg Gln
530 535
<210> 6
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 6
gccaggccct gcatccctaa gagctttggc tacagctctg tggtgtgtgt gtgcaatgcc 60
acctactgtg acagctttga cccccccacc tttcctgccc tgggcacctt cagcagatat 120
gagagcacca ggtctgggag gaggatggag ctgagcatgg ggcccatcca ggctaatcac 180
actggcactg gcctgctgct gaccctgcag cctgagcaga agttccagaa agtaaagggc 240
tttggagggg ccatgactga tgctgctgct ctgaacatcc tggccctgag cccccctgcc 300
cagaatctgc tgctgaagag ctacttctct gaggagggca ttggctataa catcatcagg 360
gtgcccatgg ccagctgtga cttcagcatc aggacctaca cctatgctga cacccctgat 420
gatttccagc tgcacaactt cagcctgcct gaggaggata ccaagctgaa gatcccactg 480
atccacaggg ctctgcagct ggcccagagg cctgtgagcc tgctggccag cccctggacc 540
agccccactt ggctgaagac caatggggct gtgaatggga aggggagcct gaagggacag 600
cctggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660
gctgagcaca agctgcagtt ctgggctgtg actgctcaga atgagccttc tgctgggctg 720
ctgtctggct accccttcca atgcctgggc ttcacccctg agcatcagag ggacttcatt 780
gccagggacc tgggccctac cctggccaac agcactcacc ataatgttag gctgctgatg 840
ctggatgacc agaggctgct gctgccccac tgggctaagg tggtgctgac tgaccctgag 900
gctgctaaat atgtgcatgg cattgctgtg cattggtacc tggactttct ggctcctgcc 960
aaggccaccc tgggggagac ccacaggctg ttccccaaca ccatgctgtt tgcctctgag 1020
gcctgtgtgg gcagcaagtt ctgggagcag tctgtgaggc tgggcagctg ggataggggg 1080
atgcagtaca gccacagcat catcaccaac ctgctgtacc atgtggtggg ctggactgac 1140
tggaacctgg ccctgaaccc tgagggagga cctaactggg tcagaaactt tgtggacagc 1200
cccatcattg tggacatcac caaggacacc ttttacaagc agcccatgtt ctaccacctg 1260
ggccacttca gcaagttcat ccctgagggc agccagagag tggggctggt ggccagccag 1320
aagaatgacc tggatgctgt ggctctgatg catcctgatg gctctgctgt ggtggtggtg 1380
ctgaacagga gctctaagga tgtgcctctg accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440
gagaccatca gccctggcta cagcatccac acctacctgt ggaggaggca gtga 1494
<210> 7
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 7
gccaggccct gtatccctaa gagctttggc tacagctcag tagtttgtgt ctgtaatgcc 60
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gagtcaacaa gatcaggaag gaggatggag ctgtcaatgg gacccatcca ggctaatcac 180
acaggcacag gcctgctgct gaccctgcag ccagaacaga agttccagaa agtgaaggga 240
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cagaatctgc tgctgaagtc atacttctct gaagaaggaa ttggatataa catcatcagg 360
gtgcccatgg ccagctgtga cttctccatc aggacctaca cctatgctga cacccctgat 420
gatttccagc tgcacaactt cagcctccca gaggaagata ccaagctcaa gatccctctg 480
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gagacaatct cacctggcta ctccatccac acctacctgt ggaggaggca gtga 1494
<210> 8
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 8
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attcacaggg ccctgcagct ggcccagagg cctgtttcac tgctggccag cccctggaca 540
tcacccacct ggctgaagac caatggagct gtgaatggga aggggtcact gaagggacag 600
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gccagggacc tgggccctac cctggccaat agcacccacc ataatgtgag gttgctgatg 840
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gagacaatct cacctggcta ctccattcac acctacctgt ggagaaggca gtga 1494
<210> 9
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 9
gccaggcctt gcatcccaaa gtctttcggc tacagctccg tggtgtgcgt gtgcaacgcc 60
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cagaatctgc tgctgaagtc ctacttctct gaggagggca tcggctataa catcatccgg 360
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ctgagcggct atcccttcca gtgcctgggc tttacacctg agcaccagcg ggactttatc 780
gccagagatc tgggcccaac cctggccaac tccacacacc acaatgtgag gctgctgatg 840
ctggacgatc agcgcctgct gctgcctcac tgggccaagg tggtgctgac cgacccagag 900
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cccatcatcg tggacatcac caaggataca ttctacaagc agccaatgtt ttatcacctg 1260
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gagactattt cacctggcta ttcaattcat acctacctgt ggaggaggca gtga 1494
<210> 10
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 10
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
aggccctgca tccctaagag ctttggctac agctctgtgg tgtgtgtgtg caatgccacc 180
tactgtgaca gctttgaccc ccccaccttt cctgccctgg gcaccttcag cagatatgag 240
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ggaggggcca tgactgatgc tgctgctctg aacatcctgg ccctgagccc ccctgcccag 420
aatctgctgc tgaagagcta cttctctgag gagggcattg gctataacat catcagggtg 480
cccatggcca gctgtgactt cagcatcagg acctacacct atgctgacac ccctgatgat 540
ttccagctgc acaacttcag cctgcctgag gaggatacca agctgaagat cccactgatc 600
cacagggctc tgcagctggc ccagaggcct gtgagcctgc tggccagccc ctggaccagc 660
cccacttggc tgaagaccaa tggggctgtg aatgggaagg ggagcctgaa gggacagcct 720
ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780
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agggacctgg gccctaccct ggccaacagc actcaccata atgttaggct gctgatgctg 960
gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gctaaggtgg tgctgactga ccctgaggct 1020
gctaaatatg tgcatggcat tgctgtgcat tggtacctgg actttctggc tcctgccaag 1080
gccaccctgg gggagaccca caggctgttc cccaacacca tgctgtttgc ctctgaggcc 1140
tgtgtgggca gcaagttctg ggagcagtct gtgaggctgg gcagctggga tagggggatg 1200
cagtacagcc acagcatcat caccaacctg ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260
aacctggccc tgaaccctga gggaggacct aactgggtca gaaactttgt ggacagcccc 1320
atcattgtgg acatcaccaa ggacaccttt tacaagcagc ccatgttcta ccacctgggc 1380
cacttcagca agttcatccc tgagggcagc cagagagtgg ggctggtggc cagccagaag 1440
aatgacctgg atgctgtggc tctgatgcat cctgatggct ctgctgtggt ggtggtgctg 1500
aacaggagct ctaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560
accatcagcc ctggctacag catccacacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611
<210> 11
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 11
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
aggccctgta tccctaagag ctttggctac agctcagtag tttgtgtctg taatgccaca 180
tactgtgact cctttgaccc ccctaccttc cctgccctgg gaaccttcag cagatatgag 240
tcaacaagat caggaaggag gatggagctg tcaatgggac ccatccaggc taatcacaca 300
ggcacaggcc tgctgctgac cctgcagcca gaacagaagt tccagaaagt gaagggattt 360
ggaggagcca tgacagatgc tgctgctctc aacatcctgg ccctgtcacc ccctgcccag 420
aatctgctgc tgaagtcata cttctctgaa gaaggaattg gatataacat catcagggtg 480
cccatggcca gctgtgactt ctccatcagg acctacacct atgctgacac ccctgatgat 540
ttccagctgc acaacttcag cctcccagag gaagatacca agctcaagat ccctctgata 600
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cccacttggc tcaagaccaa tggagctgtg aatggaaagg gatcactcaa gggacagcct 720
ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780
gagcacaagc tgcagttctg ggcagtgaca gctcagaatg agccttctgc tggactgctg 840
tcaggatacc ccttccagtg tctgggcttc acccctgaac atcagaggga cttcattgcc 900
agggacctgg gacctaccct tgccaactca actcaccaca atgtcaggct gctcatgctg 960
gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gccaaggtgg tgctgacaga cccagaagct 1020
gctaaatatg tgcatggcat tgctgtgcat tggtacctgg acttcctggc tccagccaag 1080
gccaccctgg gagagacaca caggctgttc cccaacacca tgctctttgc ctctgaggcc 1140
tgtgtgggct ccaagttctg ggagcagtca gtgaggctgg gctcctggga taggggaatg 1200
cagtacagcc acagcatcat cacaaacctc ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260
aacctggccc tgaaccctga aggaggaccc aactgggtca gaaattttgt ggactcaccc 1320
atcattgtgg acatcaccaa ggacacattc tacaagcagc ccatgttcta ccacctgggc 1380
cacttcagca agttcatccc tgagggctcc cagagggtgg gactggtggc ctcacagaag 1440
aatgacctgg atgcagtggc cctgatgcat cctgatggct ctgctgtggt ggttgtgctg 1500
aatagatcct ctaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560
acaatctcac ctggctactc catccacacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611
<210> 12
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 12
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
aggccctgca tccctaagag ctttggctac agctctgtgg tgtgtgtgtg caatgccaca 180
tactgtgact cctttgaccc ccccaccttt cctgccctgg gcacattctc cagatatgag 240
agcacaagat ctgggagaag gatggagctg agcatggggc ccatccaggc taatcacact 300
ggcacaggcc tgctgctgac cctgcagcct gaacagaagt ttcagaaagt gaagggattt 360
ggaggggcca tgacagatgc tgctgctctg aatatcctgg ccctgtcacc ccctgcccag 420
aatctgctgc tgaagagcta cttttcagaa gaaggaattg gatataatat catcagagtg 480
cccatggcca gctgtgactt ttccatcaga acctacacct atgcagacac ccctgatgat 540
tttcagctgc acaattttag cctgcctgag gaagatacca agctgaagat acccctgatt 600
cacagggccc tgcagctggc ccagaggcct gtttcactgc tggccagccc ctggacatca 660
cccacctggc tgaagaccaa tggagctgtg aatgggaagg ggtcactgaa gggacagcct 720
ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agtttctgga tgcctatgct 780
gagcacaagc tgcagttttg ggcagtgaca gctcagaatg agccttcagc tgggctgctg 840
tcaggatacc cctttcagtg cctgggcttt acccctgaac atcagaggga ctttattgcc 900
agggacctgg gccctaccct ggccaatagc acccaccata atgtgaggtt gctgatgctg 960
gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gcaaaggtgg tgctgacaga ccctgaagca 1020
gctaaatatg ttcatggcat tgctgtgcat tggtacctgg actttctggc tcctgccaag 1080
gccaccctgg gggagacaca caggctgttt cccaatacca tgctgtttgc ctctgaggcc 1140
tgtgtgggct ccaagttttg ggagcagtct gtgaggctgg gctcctggga tagagggatg 1200
cagtacagcc acagcatcat caccaatctg ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260
aatctggccc tgaatcctga aggaggacct aactgggtca ggaattttgt ggacagcccc 1320
atcattgtgg acatcaccaa ggacaccttt tacaagcagc ccatgtttta ccacctgggc 1380
cactttagca agtttattcc tgagggctcc cagagagtgg ggctggttgc cagccagaag 1440
aatgacctgg atgcagtggc actgatgcat cctgatggct cagctgttgt ggtggtgctg 1500
aatagatcca gcaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg ctttctggag 1560
acaatctcac ctggctactc cattcacacc tacctgtgga gaaggcagtg a 1611
<210> 13
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 13
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
aggccttgca tcccaaagtc tttcggctac agctccgtgg tgtgcgtgtg caacgccacc 180
tattgtgact ccttcgatcc ccctaccttt cccgccctgg gcacattttc tagatacgag 240
tctacacgca gcggccggag aatggagctg agcatgggcc ctatccaggc caatcacaca 300
ggaacaggcc tgctgctgac cctgcagcca gagcagaagt tccagaaggt gaagggcttt 360
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aatctgctgc tgaagtccta cttctctgag gagggcatcg gctataacat catccgggtg 480
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ttccagctgc acaatttttc cctgccagag gaggatacaa agctgaagat ccccctgatt 600
caccgggccc tgcagctggc acagcggccc gtgagcctgc tggccagccc ctggacctcc 660
cctacatggc tgaagaccaa cggcgccgtg aatggcaagg gctctctgaa gggacagcct 720
ggcgacatct accaccagac atgggccaga tatttcgtga agtttctgga tgcctacgcc 780
gagcacaagc tgcagttctg ggccgtgaca gcacagaatg agccttctgc cggcctgctg 840
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agagatctgg gcccaaccct ggccaactcc acacaccaca atgtgaggct gctgatgctg 960
gacgatcagc gcctgctgct gcctcactgg gccaaggtgg tgctgaccga cccagaggcc 1020
gccaagtacg tgcacggcat cgccgtgcac tggtatctgg atttcctggc acctgcaaag 1080
gccaccctgg gagagacaca ccggctgttc cctaacacca tgctgtttgc cagcgaggcc 1140
tgcgtgggct ccaagttttg ggagcagtcc gtgaggctgg gatcttggga cagaggcatg 1200
cagtactccc actctatcat caccaatctg ctgtatcacg tggtgggctg gacagactgg 1260
aacctggccc tgaatccaga gggcggcccc aactgggtga gaaatttcgt ggatagcccc 1320
atcatcgtgg acatcaccaa ggatacattc tacaagcagc caatgtttta tcacctgggc 1380
cacttctcta agtttatccc tgagggcagc cagagggtgg gcctggtggc cagccagaag 1440
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aatcgctcta gcaaggacgt gcctctgacc atcaaggatc cagccgtggg atttctggag 1560
actatttcac ctggctattc aattcatacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611
<210> 14
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 14
gccaggccct gcatccctaa gagctttggc tacagctctg tggtgtgtgt gtgcaatgcc 60
acctactgtg acagctttga cccccccacc tttcctgccc tgggcacctt cagcagatat 120
gagagcacca ggtctgggag gaggatggag ctgagcatgg ggcccatcca ggctaatcac 180
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cagaatctgc tgctgaagag ctacttctct gaggagggca ttggctataa catcatcagg 360
gtgcccatgg ccagctgtga cttcagcatc aggacctaca cctatgctga cacccctgat 420
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atccacaggg ctctgcagct ggcccagagg cctgtgagcc tgctggccag cccctggacc 540
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gccagggacc tgggccctac cctggccaac agcactcacc ataatgttag gctgctgatg 840
ctggatgacc agaggctgct gctgccccac tgggctaagg tggtgctgac tgaccctgag 900
gctgctaaat atgtgcatgg cattgctgtg cattgctacc tggactttct ggctcctgcc 960
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cccatcattg tggacatcac caaggacacc ttttacaagc agcccatgtt ctaccacctg 1260
ggccacttca gcaagttcat ccctgagggc agccagagag tggggctggt ggccagccag 1320
aagaatgacc tggatgctgt ggctctgatg catcctgatg gctctgctgt ggtggtggtg 1380
ctgaacagga gctctaagga tgtgcctctg accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440
gagaccatca gccctggcta cagcatccac acctacctgt ggaggaggca gtga 1494
<210> 15
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 15
gccaggccct gtatccctaa gagctttggc tacagctcag tagtttgtgt ctgtaatgcc 60
acatactgtg actcctttga cccccctacc ttccctgccc tgggaacctt cagcagatat 120
gagtcaacaa gatcaggaag gaggatggag ctgtcaatgg gacccatcca ggctaatcac 180
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tttggaggag ccatgacaga tgctgctgct ctcaacatcc tggccctgtc accccctgcc 300
cagaatctgc tgctgaagtc atacttctct gaagaaggaa ttggatataa catcatcagg 360
gtgcccatgg ccagctgtga cttctccatc aggacctaca cctatgctga cacccctgat 420
gatttccagc tgcacaactt cagcctccca gaggaagata ccaagctcaa gatccctctg 480
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cctggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660
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<210> 16
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 16
gccaggccct gcatccctaa gagctttggc tacagctctg tggtgtgtgt gtgcaatgcc 60
acatactgtg actcctttga cccccccacc tttcctgccc tgggcacatt ctccagatat 120
gagagcacaa gatctgggag aaggatggag ctgagcatgg ggcccatcca ggctaatcac 180
actggcacag gcctgctgct gaccctgcag cctgaacaga agtttcagaa agtgaaggga 240
tttggagggg ccatgacaga tgctgctgct ctgaatatcc tggccctgtc accccctgcc 300
cagaatctgc tgctgaagag ctacttttca gaagaaggaa ttggatataa tatcatcaga 360
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gattttcagc tgcacaattt tagcctgcct gaggaagata ccaagctgaa gatacccctg 480
attcacaggg ccctgcagct ggcccagagg cctgtttcac tgctggccag cccctggaca 540
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cctggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagtttct ggatgcctat 660
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ctgtcaggat acccctttca gtgcctgggc tttacccctg aacatcagag ggactttatt 780
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<210> 17
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 17
gccaggcctt gcatcccaaa gtctttcggc tacagctccg tggtgtgcgt gtgcaacgcc 60
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gagtctacac gcagcggccg gagaatggag ctgagcatgg gccctatcca ggccaatcac 180
acaggaacag gcctgctgct gaccctgcag ccagagcaga agttccagaa ggtgaagggc 240
tttggcggag ccatgacaga tgcagccgcc ctgaacatcc tggccctgtc cccacccgcc 300
cagaatctgc tgctgaagtc ctacttctct gaggagggca tcggctataa catcatccgg 360
gtgcccatgg ccagctgcga cttttccatc agaacctaca catatgccga tacccctgac 420
gatttccagc tgcacaattt ttccctgcca gaggaggata caaagctgaa gatccccctg 480
attcaccggg ccctgcagct ggcacagcgg cccgtgagcc tgctggccag cccctggacc 540
tcccctacat ggctgaagac caacggcgcc gtgaatggca agggctctct gaagggacag 600
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ctgagcggct atcccttcca gtgcctgggc tttacacctg agcaccagcg ggactttatc 780
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atgcagtact cccactctat catcaccaat ctgctgtatc acgtggtggg ctggacagac 1140
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gagactattt cacctggcta ttcaattcat acctacctgt ggaggaggca gtga 1494
<210> 18
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 18
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
aggccctgca tccctaagag ctttggctac agctctgtgg tgtgtgtgtg caatgccacc 180
tactgtgaca gctttgaccc ccccaccttt cctgccctgg gcaccttcag cagatatgag 240
agcaccaggt ctgggaggag gatggagctg agcatggggc ccatccaggc taatcacact 300
ggcactggcc tgctgctgac cctgcagcct gagcagaagt tccagaaagt aaagggcttt 360
ggaggggcca tgactgatgc tgctgctctg aacatcctgg ccctgagccc ccctgcccag 420
aatctgctgc tgaagagcta cttctctgag gagggcattg gctataacat catcagggtg 480
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ttccagctgc acaacttcag cctgcctgag gaggatacca agctgaagat cccactgatc 600
cacagggctc tgcagctggc ccagaggcct gtgagcctgc tggccagccc ctggaccagc 660
cccacttggc tgaagaccaa tggggctgtg aatgggaagg ggagcctgaa gggacagcct 720
ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780
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gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gctaaggtgg tgctgactga ccctgaggct 1020
gctaaatatg tgcatggcat tgctgtgcat tgctacctgg actttctggc tcctgccaag 1080
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tgtgtgggca gcaagttctg ggagcagtct gtgaggctgg gcagctggga tagggggatg 1200
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accatcagcc ctggctacag catccacacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611
<210> 19
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 19
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
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tactgtgact cctttgaccc ccctaccttc cctgccctgg gaaccttcag cagatatgag 240
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ggcacaggcc tgctgctgac cctgcagcca gaacagaagt tccagaaagt gaagggattt 360
ggaggagcca tgacagatgc tgctgctctc aacatcctgg ccctgtcacc ccctgcccag 420
aatctgctgc tgaagtcata cttctctgaa gaaggaattg gatataacat catcagggtg 480
cccatggcca gctgtgactt ctccatcagg acctacacct atgctgacac ccctgatgat 540
ttccagctgc acaacttcag cctcccagag gaagatacca agctcaagat ccctctgata 600
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cccacttggc tcaagaccaa tggagctgtg aatggaaagg gatcactcaa gggacagcct 720
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acaatctcac ctggctactc catccacacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611
<210> 20
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 20
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
aggccctgca tccctaagag ctttggctac agctctgtgg tgtgtgtgtg caatgccaca 180
tactgtgact cctttgaccc ccccaccttt cctgccctgg gcacattctc cagatatgag 240
agcacaagat ctgggagaag gatggagctg agcatggggc ccatccaggc taatcacact 300
ggcacaggcc tgctgctgac cctgcagcct gaacagaagt ttcagaaagt gaagggattt 360
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cccatggcca gctgtgactt ttccatcaga acctacacct atgcagacac ccctgatgat 540
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cacagggccc tgcagctggc ccagaggcct gtttcactgc tggccagccc ctggacatca 660
cccacctggc tgaagaccaa tggagctgtg aatgggaagg ggtcactgaa gggacagcct 720
ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agtttctgga tgcctatgct 780
gagcacaagc tgcagttttg ggcagtgaca gctgaaaatg agccttcagc tgggctgctg 840
tcaggatacc cctttcagtg cctgggcttt acccctgaac atcagaggga ctttattgcc 900
agggacctgg gccctaccct ggccaatagc acccaccata atgtgaggtt gctgatgctg 960
gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gcaaaggtgg tgctgacaga ccctgaagca 1020
gctaaatatg ttcatggcat tgctgtgcat tgctacctgg actttctggc tcctgccaag 1080
gccaccctgg gggagacaca caggctgttt cccaatacca tgctgtttgc ctctgagtgc 1140
tgtgtgggct ccaagttttg ggagcagtct gtgaggctgg gctcctggga tagagggatg 1200
cagtacagcc acagcatcat caccaatctg ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260
aatctggccc tgaatcctga aggaggacct aactgggtca ggaattttgt ggacagcccc 1320
atcattgtgg acatcaccaa ggacaccttt tacaagcagc ccatgtttta ccacctgggc 1380
cactttagca agtttattcc tgagggctcc cagagagtgg ggctggttgc cagccagaag 1440
aatgacctgg atgcagtggc actgatgcat cctgatggct cagctgttgt ggtggtgctg 1500
aatagatcca gcaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg ctttctggag 1560
acaatctcac ctggctactc cattcacacc tacctgtgga gaaggcagtg a 1611
<210> 21
<211> 1611
<212> DNA
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<400> 21
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aggccttgca tcccaaagtc tttcggctac agctccgtgg tgtgcgtgtg caacgccacc 180
tattgtgact ccttcgatcc ccctaccttt cccgccctgg gcacattttc tagatacgag 240
tctacacgca gcggccggag aatggagctg agcatgggcc ctatccaggc caatcacaca 300
ggaacaggcc tgctgctgac cctgcagcca gagcagaagt tccagaaggt gaagggcttt 360
ggcggagcca tgacagatgc agccgccctg aacatcctgg ccctgtcccc acccgcccag 420
aatctgctgc tgaagtccta cttctctgag gagggcatcg gctataacat catccgggtg 480
cccatggcca gctgcgactt ttccatcaga acctacacat atgccgatac ccctgacgat 540
ttccagctgc acaatttttc cctgccagag gaggatacaa agctgaagat ccccctgatt 600
caccgggccc tgcagctggc acagcggccc gtgagcctgc tggccagccc ctggacctcc 660
cctacatggc tgaagaccaa cggcgccgtg aatggcaagg gctctctgaa gggacagcct 720
ggcgacatct accaccagac atgggccaga tatttcgtga agtttctgga tgcctacgcc 780
gagcacaagc tgcagttctg ggccgtgaca gcagagaatg agccttctgc cggcctgctg 840
agcggctatc ccttccagtg cctgggcttt acacctgagc accagcggga ctttatcgcc 900
agagatctgg gcccaaccct ggccaactcc acacaccaca atgtgaggct gctgatgctg 960
gacgatcagc gcctgctgct gcctcactgg gccaaggtgg tgctgaccga cccagaggcc 1020
gccaagtacg tgcacggcat cgccgtgcac tgctatctgg atttcctggc acctgcaaag 1080
gccaccctgg gagagacaca ccggctgttc cctaacacca tgctgtttgc cagcgagtgc 1140
tgcgtgggct ccaagttttg ggagcagtcc gtgaggctgg gatcttggga cagaggcatg 1200
cagtactccc actctatcat caccaatctg ctgtatcacg tggtgggctg gacagactgg 1260
aacctggccc tgaatccaga gggcggcccc aactgggtga gaaatttcgt ggatagcccc 1320
atcatcgtgg acatcaccaa ggatacattc tacaagcagc caatgtttta tcacctgggc 1380
cacttctcta agtttatccc tgagggcagc cagagggtgg gcctggtggc cagccagaag 1440
aacgacctgg atgccgtggc cctgatgcac cctgatggct ccgccgtggt ggtggtgctg 1500
aatcgctcta gcaaggacgt gcctctgacc atcaaggatc cagccgtggg atttctggag 1560
actatttcac ctggctattc aattcatacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611
<210> 22
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 22
gccaggccct gcatccctaa gagctttggc tacagctctg tggtgtgtgt gtgcaatgcc 60
acctactgtg acagctttga cccccccacc tttcctgccc tgggcacctt cagcagatat 120
gagagcacca ggtctgggag gaggatggag ctgagcatgg ggcccatcca ggctaatcac 180
actggcactg gcctgctgct gaccctgcag cctgagcaga agttccagaa agtaaagggc 240
tttggagggg ccatgactga tgctgctgct ctgaacatcc tggccctgag cccccctgcc 300
cagaatctgc tgctgaagag ctacttctct gaggagggca ttggctataa catcatcagg 360
gtgcccatgg ccagctgtga cttcagcatc aggacctaca cctatgctga cacccctgat 420
gatttccagc tgcacaactt cagcctgcct gaggaggata ccaagctgaa gatcccactg 480
atccacaggg ctctgcagct ggcccagagg cctgtgagcc tgctggccag cccctggacc 540
agccccactt ggctgaagac caatggggct gtgaatggga aggggagcct gaagggacag 600
cctggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660
gctgagcaca agctgcagtt ctgggctgtg actgctcaga atgagccttc tgctgggctg 720
ctgtctggct accccttcca atgcctgggc ttcacccctg agcatcagag ggacttcatt 780
gccagggacc tgggccctac cctggccaac agcactcacc ataatgttag gctgctgatg 840
ctggatgacc agaggctgct gctgccccac tgggctaagg tggtgctgac tgaccctgag 900
gctgctaaat atgtgcatgg cattgctgtg cattgctacc tggactttct ggctcctgcc 960
aaggccaccc tgggggagac ccacaggctg ttccccaaca ccatgctgtt tgcctctgag 1020
tgctgtgtgg gcagcaagtt ctgggagcag tctgtgaggc tgggcagctg ggataggggg 1080
atgcagtaca gccacagcat catcaccaac ctgctgtacc atgtggtggg ctggactgac 1140
tggaacctgg ccctgaaccc tgagggagga cctaactggg tcagaaactt tgtggacagc 1200
cccatcattg tggacatcac caaggacacc ttttacaagc agcccatgtt ctaccacctg 1260
ggccacttca gcaagttcat ccctgagggc agccagagag tggggctggt ggccagccag 1320
aagaatgacc tggatgctgt ggctctgatg catcctgatg gctctgctgt ggtggtggtg 1380
ctgaacagga gctctaagga tgtgcctctg accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440
gagaccatca gccctggcta cagcatccac acctacctgt ggaggaggca gtga 1494
<210> 23
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 23
gccaggccct gtatccctaa gagctttggc tacagctcag tagtttgtgt ctgtaatgcc 60
acatactgtg actcctttga cccccctacc ttccctgccc tgggaacctt cagcagatat 120
gagtcaacaa gatcaggaag gaggatggag ctgtcaatgg gacccatcca ggctaatcac 180
acaggcacag gcctgctgct gaccctgcag ccagaacaga agttccagaa agtgaaggga 240
tttggaggag ccatgacaga tgctgctgct ctcaacatcc tggccctgtc accccctgcc 300
cagaatctgc tgctgaagtc atacttctct gaagaaggaa ttggatataa catcatcagg 360
gtgcccatgg ccagctgtga cttctccatc aggacctaca cctatgctga cacccctgat 420
gatttccagc tgcacaactt cagcctccca gaggaagata ccaagctcaa gatccctctg 480
atacataggg cactgcagct ggcccagagg cctgtgtcac tcctggccag cccctggaca 540
tcacccactt ggctcaagac caatggagct gtgaatggaa agggatcact caagggacag 600
cctggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660
gctgagcaca agctgcagtt ctgggcagtg acagctcaga atgagccttc tgctggactg 720
ctgtcaggat accccttcca gtgtctgggc ttcacccctg aacatcagag ggacttcatt 780
gccagggacc tgggacctac ccttgccaac tcaactcacc acaatgtcag gctgctcatg 840
ctggatgacc agaggctgct gctgccccac tgggccaagg tggtgctgac agacccagaa 900
gctgctaaat atgtgcatgg cattgctgtg cattgctacc tggacttcct ggctccagcc 960
aaggccaccc tgggagagac acacaggctg ttccccaaca ccatgctctt tgcctctgag 1020
tgctgtgtgg gctccaagtt ctgggagcag tcagtgaggc tgggctcctg ggatagggga 1080
atgcagtaca gccacagcat catcacaaac ctcctgtacc atgtggtggg ctggactgac 1140
tggaacctgg ccctgaaccc tgaaggagga cccaactggg tcagaaattt tgtggactca 1200
cccatcattg tggacatcac caaggacaca ttctacaagc agcccatgtt ctaccacctg 1260
ggccacttca gcaagttcat ccctgagggc tcccagaggg tgggactggt ggcctcacag 1320
aagaatgacc tggatgcagt ggccctgatg catcctgatg gctctgctgt ggtggttgtg 1380
ctgaatagat cctctaagga tgtgcctctg accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440
gagacaatct cacctggcta ctccatccac acctacctgt ggaggaggca gtga 1494
<210> 24
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 24
gccaggccct gcatccctaa gagctttggc tacagctctg tggtgtgtgt gtgcaatgcc 60
acatactgtg actcctttga cccccccacc tttcctgccc tgggcacatt ctccagatat 120
gagagcacaa gatctgggag aaggatggag ctgagcatgg ggcccatcca ggctaatcac 180
actggcacag gcctgctgct gaccctgcag cctgaacaga agtttcagaa agtgaaggga 240
tttggagggg ccatgacaga tgctgctgct ctgaatatcc tggccctgtc accccctgcc 300
cagaatctgc tgctgaagag ctacttttca gaagaaggaa ttggatataa tatcatcaga 360
gtgcccatgg ccagctgtga cttttccatc agaacctaca cctatgcaga cacccctgat 420
gattttcagc tgcacaattt tagcctgcct gaggaagata ccaagctgaa gatacccctg 480
attcacaggg ccctgcagct ggcccagagg cctgtttcac tgctggccag cccctggaca 540
tcacccacct ggctgaagac caatggagct gtgaatggga aggggtcact gaagggacag 600
cctggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagtttct ggatgcctat 660
gctgagcaca agctgcagtt ttgggcagtg acagctcaga atgagccttc agctgggctg 720
ctgtcaggat acccctttca gtgcctgggc tttacccctg aacatcagag ggactttatt 780
gccagggacc tgggccctac cctggccaat agcacccacc ataatgtgag gttgctgatg 840
ctggatgacc agaggctgct gctgccccac tgggcaaagg tggtgctgac agaccctgaa 900
gcagctaaat atgttcatgg cattgctgtg cattgctacc tggactttct ggctcctgcc 960
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tgctgtgtgg gctccaagtt ttgggagcag tctgtgaggc tgggctcctg ggatagaggg 1080
atgcagtaca gccacagcat catcaccaat ctgctgtacc atgtggtggg ctggactgac 1140
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cccatcattg tggacatcac caaggacacc ttttacaagc agcccatgtt ttaccacctg 1260
ggccacttta gcaagtttat tcctgagggc tcccagagag tggggctggt tgccagccag 1320
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ctgaatagat ccagcaagga tgtgcctctg accatcaagg atcctgctgt gggctttctg 1440
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<210> 25
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 25
gccaggcctt gcatcccaaa gtctttcggc tacagctccg tggtgtgcgt gtgcaacgcc 60
acctattgtg actccttcga tccccctacc tttcccgccc tgggcacatt ttctagatac 120
gagtctacac gcagcggccg gagaatggag ctgagcatgg gccctatcca ggccaatcac 180
acaggaacag gcctgctgct gaccctgcag ccagagcaga agttccagaa ggtgaagggc 240
tttggcggag ccatgacaga tgcagccgcc ctgaacatcc tggccctgtc cccacccgcc 300
cagaatctgc tgctgaagtc ctacttctct gaggagggca tcggctataa catcatccgg 360
gtgcccatgg ccagctgcga cttttccatc agaacctaca catatgccga tacccctgac 420
gatttccagc tgcacaattt ttccctgcca gaggaggata caaagctgaa gatccccctg 480
attcaccggg ccctgcagct ggcacagcgg cccgtgagcc tgctggccag cccctggacc 540
tcccctacat ggctgaagac caacggcgcc gtgaatggca agggctctct gaagggacag 600
cctggcgaca tctaccacca gacatgggcc agatatttcg tgaagtttct ggatgcctac 660
gccgagcaca agctgcagtt ctgggccgtg acagcacaga atgagccttc tgccggcctg 720
ctgagcggct atcccttcca gtgcctgggc tttacacctg agcaccagcg ggactttatc 780
gccagagatc tgggcccaac cctggccaac tccacacacc acaatgtgag gctgctgatg 840
ctggacgatc agcgcctgct gctgcctcac tgggccaagg tggtgctgac cgacccagag 900
gccgccaagt acgtgcacgg catcgccgtg cactgctatc tggatttcct ggcacctgca 960
aaggccaccc tgggagagac acaccggctg ttccctaaca ccatgctgtt tgccagcgag 1020
tgctgcgtgg gctccaagtt ttgggagcag tccgtgaggc tgggatcttg ggacagaggc 1080
atgcagtact cccactctat catcaccaat ctgctgtatc acgtggtggg ctggacagac 1140
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cccatcatcg tggacatcac caaggataca ttctacaagc agccaatgtt ttatcacctg 1260
ggccacttct ctaagtttat ccctgagggc agccagaggg tgggcctggt ggccagccag 1320
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<210> 26
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 26
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
aggccctgca tccctaagag ctttggctac agctctgtgg tgtgtgtgtg caatgccacc 180
tactgtgaca gctttgaccc ccccaccttt cctgccctgg gcaccttcag cagatatgag 240
agcaccaggt ctgggaggag gatggagctg agcatggggc ccatccaggc taatcacact 300
ggcactggcc tgctgctgac cctgcagcct gagcagaagt tccagaaagt aaagggcttt 360
ggaggggcca tgactgatgc tgctgctctg aacatcctgg ccctgagccc ccctgcccag 420
aatctgctgc tgaagagcta cttctctgag gagggcattg gctataacat catcagggtg 480
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cacagggctc tgcagctggc ccagaggcct gtgagcctgc tggccagccc ctggaccagc 660
cccacttggc tgaagaccaa tggggctgtg aatgggaagg ggagcctgaa gggacagcct 720
ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780
gagcacaagc tgcagttctg ggctgtgact gctcagaatg agccttctgc tgggctgctg 840
tctggctacc ccttccaatg cctgggcttc acccctgagc atcagaggga cttcattgcc 900
agggacctgg gccctaccct ggccaacagc actcaccata atgttaggct gctgatgctg 960
gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gctaaggtgg tgctgactga ccctgaggct 1020
gctaaatatg tgcatggcat tgctgtgcat tgctacctgg actttctggc tcctgccaag 1080
gccaccctgg gggagaccca caggctgttc cccaacacca tgctgtttgc ctctgagtgc 1140
tgtgtgggca gcaagttctg ggagcagtct gtgaggctgg gcagctggga tagggggatg 1200
cagtacagcc acagcatcat caccaacctg ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260
aacctggccc tgaaccctga gggaggacct aactgggtca gaaactttgt ggacagcccc 1320
atcattgtgg acatcaccaa ggacaccttt tacaagcagc ccatgttcta ccacctgggc 1380
cacttcagca agttcatccc tgagggcagc cagagagtgg ggctggtggc cagccagaag 1440
aatgacctgg atgctgtggc tctgatgcat cctgatggct ctgctgtggt ggtggtgctg 1500
aacaggagct ctaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560
accatcagcc ctggctacag catccacacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611
<210> 27
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 27
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
aggccctgta tccctaagag ctttggctac agctcagtag tttgtgtctg taatgccaca 180
tactgtgact cctttgaccc ccctaccttc cctgccctgg gaaccttcag cagatatgag 240
tcaacaagat caggaaggag gatggagctg tcaatgggac ccatccaggc taatcacaca 300
ggcacaggcc tgctgctgac cctgcagcca gaacagaagt tccagaaagt gaagggattt 360
ggaggagcca tgacagatgc tgctgctctc aacatcctgg ccctgtcacc ccctgcccag 420
aatctgctgc tgaagtcata cttctctgaa gaaggaattg gatataacat catcagggtg 480
cccatggcca gctgtgactt ctccatcagg acctacacct atgctgacac ccctgatgat 540
ttccagctgc acaacttcag cctcccagag gaagatacca agctcaagat ccctctgata 600
catagggcac tgcagctggc ccagaggcct gtgtcactcc tggccagccc ctggacatca 660
cccacttggc tcaagaccaa tggagctgtg aatggaaagg gatcactcaa gggacagcct 720
ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780
gagcacaagc tgcagttctg ggcagtgaca gctcagaatg agccttctgc tggactgctg 840
tcaggatacc ccttccagtg tctgggcttc acccctgaac atcagaggga cttcattgcc 900
agggacctgg gacctaccct tgccaactca actcaccaca atgtcaggct gctcatgctg 960
gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gccaaggtgg tgctgacaga cccagaagct 1020
gctaaatatg tgcatggcat tgctgtgcat tgctacctgg acttcctggc tccagccaag 1080
gccaccctgg gagagacaca caggctgttc cccaacacca tgctctttgc ctctgagtgc 1140
tgtgtgggct ccaagttctg ggagcagtca gtgaggctgg gctcctggga taggggaatg 1200
cagtacagcc acagcatcat cacaaacctc ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260
aacctggccc tgaaccctga aggaggaccc aactgggtca gaaattttgt ggactcaccc 1320
atcattgtgg acatcaccaa ggacacattc tacaagcagc ccatgttcta ccacctgggc 1380
cacttcagca agttcatccc tgagggctcc cagagggtgg gactggtggc ctcacagaag 1440
aatgacctgg atgcagtggc cctgatgcat cctgatggct ctgctgtggt ggttgtgctg 1500
aatagatcct ctaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560
acaatctcac ctggctactc catccacacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611
<210> 28
<211> 1611
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的构建体
<400> 28
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
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aggccctgca tccctaagag ctttggctac agctctgtgg tgtgtgtgtg caatgccaca 180
tactgtgact cctttgaccc ccccaccttt cctgccctgg gcacattctc cagatatgag 240
agcacaagat ctgggagaag gatggagctg agcatggggc ccatccaggc taatcacact 300
ggcacaggcc tgctgctgac cctgcagcct gaacagaagt ttcagaaagt gaagggattt 360
ggaggggcca tgacagatgc tgctgctctg aatatcctgg ccctgtcacc ccctgcccag 420
aatctgctgc tgaagagcta cttttcagaa gaaggaattg gatataatat catcagagtg 480
cccatggcca gctgtgactt ttccatcaga acctacacct atgcagacac ccctgatgat 540
tttcagctgc acaattttag cctgcctgag gaagatacca agctgaagat acccctgatt 600
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tcaggatacc cctttcagtg cctgggcttt acccctgaac atcagaggga ctttattgcc 900
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gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gcaaaggtgg tgctgacaga ccctgaagca 1020
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gccaccctgg gggagacaca caggctgttt cccaatacca tgctgtttgc ctctgagtgc 1140
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aatagatcca gcaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg ctttctggag 1560
acaatctcac ctggctactc cattcacacc tacctgtgga gaaggcagtg a 1611
<210> 29
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 29
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
aggccttgca tcccaaagtc tttcggctac agctccgtgg tgtgcgtgtg caacgccacc 180
tattgtgact ccttcgatcc ccctaccttt cccgccctgg gcacattttc tagatacgag 240
tctacacgca gcggccggag aatggagctg agcatgggcc ctatccaggc caatcacaca 300
ggaacaggcc tgctgctgac cctgcagcca gagcagaagt tccagaaggt gaagggcttt 360
ggcggagcca tgacagatgc agccgccctg aacatcctgg ccctgtcccc acccgcccag 420
aatctgctgc tgaagtccta cttctctgag gagggcatcg gctataacat catccgggtg 480
cccatggcca gctgcgactt ttccatcaga acctacacat atgccgatac ccctgacgat 540
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caccgggccc tgcagctggc acagcggccc gtgagcctgc tggccagccc ctggacctcc 660
cctacatggc tgaagaccaa cggcgccgtg aatggcaagg gctctctgaa gggacagcct 720
ggcgacatct accaccagac atgggccaga tatttcgtga agtttctgga tgcctacgcc 780
gagcacaagc tgcagttctg ggccgtgaca gcacagaatg agccttctgc cggcctgctg 840
agcggctatc ccttccagtg cctgggcttt acacctgagc accagcggga ctttatcgcc 900
agagatctgg gcccaaccct ggccaactcc acacaccaca atgtgaggct gctgatgctg 960
gacgatcagc gcctgctgct gcctcactgg gccaaggtgg tgctgaccga cccagaggcc 1020
gccaagtacg tgcacggcat cgccgtgcac tgctatctgg atttcctggc acctgcaaag 1080
gccaccctgg gagagacaca ccggctgttc cctaacacca tgctgtttgc cagcgagtgc 1140
tgcgtgggct ccaagttttg ggagcagtcc gtgaggctgg gatcttggga cagaggcatg 1200
cagtactccc actctatcat caccaatctg ctgtatcacg tggtgggctg gacagactgg 1260
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atcatcgtgg acatcaccaa ggatacattc tacaagcagc caatgtttta tcacctgggc 1380
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的GCase蛋白
<400> 42
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<220>
<223> 合成的GCase蛋白
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<223> 合成的GCase蛋白
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<223> 合成的GCase蛋白
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Gln
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的GCase蛋白
<400> 46
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Gln
<210> 47
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 47
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<400> 48
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<210> 56
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 56
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
aggccctgca tccctaagag ctttggctac agctctgtgg tgtgtgtgtg caatgccacc 180
tactgtgaca gctttgaccc ccccaccttt cctgccctgg gcaccttcag cagatatgag 240
agcaccaggt ctgggaggag gatggagctg agcatggggc ccatccaggc taatcacact 300
ggcactggcc tgctgctgac cctgcagcct gagcagaagt tccagaaagt aaagggcttt 360
ggaggggcca tgactgatgc tgctgctctg aacatcctgg ccctgagccc ccctgcccag 420
aatctgctgc tgaagagcta cttctctgag gagggcattg gctataacat catcagggtg 480
cccatggcca gctgtgactt cagcatcagg acctacacct atgctgacac ccctgatgat 540
ttccagctgc acaacttcag cctgcctgag gaggatacca agctgaagat cccactgatc 600
cacagggctc tgcagctggc ccagaggcct gtgagcctgc tggccagccc ctggaccagc 660
cccacttggc tgaagaccaa tggggctgtg aatgggaagg ggagcctgaa gggacagcct 720
ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780
gagcacaagc tgcagttctg ggctgtgact gctgagaatg agccttctgc tgggctgctg 840
tctggctacc ccttccaatg cctgggcttc acccctgagc atcagaggga cttcattgcc 900
agggacctgg gccctaccct ggccaacagc actcaccata atgttaggct gctgatgctg 960
gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gctaaggtgg tgctgactga ccctgaggct 1020
gctaaatatg tgcatggcat tgctgtgcat tggtacctgg actttctggc tcctgccaag 1080
gccaccctgg gggagaccca caggctgttc cccaacacca tgctgtttgc ctctgaggcc 1140
tgtgtgggca gcaagttctg ggagcagtct gtgaggctgg gcagctggga tagggggatg 1200
cagtacagcc acagcatctg caccaacctg ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260
aacctggccc tgaaccctga gggaggacct aactgggtca gaaactttgt ggacagcccc 1320
atcattgtgg acatcaccaa ggacaccttt tacaagcagc ccatgttcta ccacctgggc 1380
cacttcagca agttcatccc tgagggcagc cagagagtgg ggctggtggc cagccagaag 1440
aatgacctgt gcgctgtggc tctgatgcat cctgatggct ctgctgtggt ggtggtgctg 1500
aacaggagct ctaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560
accatcagcc ctggctacag catccacacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611
<210> 57
<211> 66
<212> DNA
<213> 猿猴病毒 40
<400> 57
gtaaatataa aatttttaag tgtataatgt gttaaactac tgattctaat tgtttctctc 60
ttttag 66
<210> 58
<211> 208
<212> DNA
<213> 家牛(Bos taurus)
<400> 58
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctgggga 208
<210> 59
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 59
gccaggccct gcatccctaa gagctttggc tacagctctg tggtgtgtgt gtgcaatgcc 60
acctactgtg acagctttga cccccccacc tttcctgccc tgggcacctt cagcagatat 120
gagagcacca ggtctgggag gaggatggag ctgagcatgg ggcccatcca ggctaatcac 180
actggcactg gcctgctgct gaccctgcag cctgagcaga agttccagaa agtaaagggc 240
tttggagggg ccatgactga tgctgctgct ctgaacatcc tggccctgag cccccctgcc 300
cagaatctgc tgctgaagag ctacttctct gaggagggca ttggctataa catcatcagg 360
gtgcccatgg ccagctgtga cttcagcatc aggacctaca cctatgctga cacccctgat 420
gatttccagc tgcacaactt cagcctgcct gaggaggata ccaagctgaa gatcccactg 480
atccacaggg ctctgcagct ggcccagagg cctgtgagcc tgctggccag cccctggacc 540
agccccactt ggctgaagac caatggggct gtgaatggga aggggagcct gaagggacag 600
cctggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660
gctgagcaca agctgcagtt ctgggctgtg actgctgaga atgagccttc tgctgggctg 720
ctgtctggct accccttcca atgcctgggc ttcacccctg agcatcagag ggacttcatt 780
gccagggacc tgggccctac cctggccaac agcactcacc ataatgttag gctgctgatg 840
ctggatgacc agaggctgct gctgccccac tgggctaagg tggtgctgac tgaccctgag 900
gctgctaaat atgtgcatgg cattgctgtg cattggtacc tggactttct ggctcctgcc 960
aaggccaccc tgggggagac ccacaggctg ttccccaaca ccatgctgtt tgcctctgag 1020
gcctgtgtgg gcagcaagtt ctgggagcag tctgtgaggc tgggcagctg ggataggggg 1080
atgcagtaca gccacagcat catcaccaac ctgctgtacc atgtggtggg ctggactgac 1140
tggaacctgg ccctgaaccc tgagggagga cctaactggg tcagaaactt tgtggacagc 1200
cccatcattg tggacatcac caaggacacc ttttacaagc agcccatgtt ctaccacctg 1260
ggccacttca gcaagttcat ccctgagggc agccagagag tggggctggt ggccagccag 1320
aagaatgacc tggatgctgt ggctctgatg catcctgatg gctctgctgt ggtggtggtg 1380
ctgaacagga gctctaagga tgtgcctctg accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440
gagaccatca gccctggcta cagcatccac acctacctgt ggaggaggca gtga 1494
<210> 60
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 60
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
aggccctgca tccctaagag ctttggctac agctctgtgg tgtgtgtgtg caatgccacc 180
tactgtgaca gctttgaccc ccccaccttt cctgccctgg gcaccttcag cagatatgag 240
agcaccaggt ctgggaggag gatggagctg agcatggggc ccatccaggc taatcacact 300
ggcactggcc tgctgctgac cctgcagcct gagcagaagt tccagaaagt aaagggcttt 360
ggaggggcca tgactgatgc tgctgctctg aacatcctgg ccctgagccc ccctgcccag 420
aatctgctgc tgaagagcta cttctctgag gagggcattg gctataacat catcagggtg 480
cccatggcca gctgtgactt cagcatcagg acctacacct atgctgacac ccctgatgat 540
ttccagctgc acaacttcag cctgcctgag gaggatacca agctgaagat cccactgatc 600
cacagggctc tgcagctggc ccagaggcct gtgagcctgc tggccagccc ctggaccagc 660
cccacttggc tgaagaccaa tggggctgtg aatgggaagg ggagcctgaa gggacagcct 720
ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780
gagcacaagc tgcagttctg ggctgtgact gctgagaatg agccttctgc tgggctgctg 840
tctggctacc ccttccaatg cctgggcttc acccctgagc atcagaggga cttcattgcc 900
agggacctgg gccctaccct ggccaacagc actcaccata atgttaggct gctgatgctg 960
gatgaccaga ggctgctgct gccccactgg gctaaggtgg tgctgactga ccctgaggct 1020
gctaaatatg tgcatggcat tgctgtgcat tggtacctgg actttctggc tcctgccaag 1080
gccaccctgg gggagaccca caggctgttc cccaacacca tgctgtttgc ctctgaggcc 1140
tgtgtgggca gcaagttctg ggagcagtct gtgaggctgg gcagctggga tagggggatg 1200
cagtacagcc acagcatcat caccaacctg ctgtaccatg tggtgggctg gactgactgg 1260
aacctggccc tgaaccctga gggaggacct aactgggtca gaaactttgt ggacagcccc 1320
atcattgtgg acatcaccaa ggacaccttt tacaagcagc ccatgttcta ccacctgggc 1380
cacttcagca agttcatccc tgagggcagc cagagagtgg ggctggtggc cagccagaag 1440
aatgacctgg atgctgtggc tctgatgcat cctgatggct ctgctgtggt ggtggtgctg 1500
aacaggagct ctaaggatgt gcctctgacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560
accatcagcc ctggctacag catccacacc tacctgtgga ggaggcagtg a 1611
<210> 61
<211> 588
<212> DNA
<213> 土拨鼠肝炎病毒
<400> 61
atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60
cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120
tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180
ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240
gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300
ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360
tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg 420
cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480
atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540
gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc 588
<210> 62
<211> 245
<212> DNA
<213> 土拨鼠肝炎病毒
<400> 62
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttag ttcttgccac ggcggaactc 180
atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc 240
gtggt 245
<210> 63
<211> 589
<212> DNA
<213> 土拨鼠肝炎病毒
<400> 63
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589
<210> 64
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人
<400> 64
gcccgcccct gcatccctaa aagcttcggc tacagctcgg tggtgtgtgt ctgcaatgcc 60
acatactgtg actcctttga ccccccgacc tttcctgccc ttggtacctt cagccgctat 120
gagagtacac gcagtgggcg acggatggag ctgagtatgg ggcccatcca ggctaatcac 180
acgggcacag gcctgctact gaccctgcag ccagaacaga agttccagaa agtgaaggga 240
tttggagggg ccatgacaga tgctgctgct ctcaacatcc ttgccctgtc accccctgcc 300
caaaatttgc tacttaaatc gtacttctct gaagaaggaa tcggatataa catcatccgg 360
gtacccatgg ccagctgtga cttctccatc cgcacctaca cctatgcaga cacccctgat 420
gatttccagt tgcacaactt cagcctccca gaggaagata ccaagctcaa gatacccctg 480
attcaccgag ccctgcagtt ggcccagcgt cccgtttcac tccttgccag cccctggaca 540
tcacccactt ggctcaagac caatggagcg gtgaatggga aggggtcact caagggacag 600
cccggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660
gctgagcaca agttacagtt ctgggcagtg acagctgaaa atgagccttc tgctgggctg 720
ttgagtggat accccttcca gtgcctgggc ttcacccctg aacatcagcg agacttcatt 780
gcccgtgacc taggtcctac cctcgccaac agtactcacc acaatgtccg cctactcatg 840
ctggatgacc aacgcttgct gctgccccac tgggcaaagg tggtactgac agacccagaa 900
gcagctaaat atgttcatgg cattgctgta cattggtacc tggactttct ggctccagcc 960
aaagccaccc taggggagac acaccgcctg ttccccaaca ccatgctctt tgcctcagag 1020
gcctgtgtgg gctccaagtt ctgggagcag agtgtgcggc taggctcctg ggatcgaggg 1080
atgcagtaca gccacagcat catcacgaac ctcctgtacc atgtggtcgg ctggaccgac 1140
tggaaccttg ccctgaaccc cgaaggagga cccaattggg tgcgtaactt tgtcgacagt 1200
cccatcattg tagacatcac caaggacacg ttttacaaac agcccatgtt ctaccacctt 1260
ggccacttca gcaagttcat tcctgagggc tcccagagag tggggctggt tgccagtcag 1320
aagaacgacc tggacgcagt ggcactgatg catcccgatg gctctgctgt tgtggtcgtg 1380
ctaaaccgct cctctaagga tgtgcctctt accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440
gagacaatct cacctggcta ctccattcac acctacctgt ggcgtcgcca gtga 1494

Claims (27)

1.一种经修饰的β-葡糖脑苷脂酶(GCase)多肽，其包含至少一个突变，其中所述至少一个突变提供增强的稳定性。
2.根据权利要求1所述的经修饰的GCase多肽，其中当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少80％或至少85％的活性。
3.根据权利要求1或2所述的经修饰的GCase多肽，其中所述突变位于对应于选自由SEQID NO:1的351、380、272、262、313、404、407、482、484、490、494、503和534组成的组的位置的位置处，任选地，其中所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的突变。
4.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的GCase多肽，其中所述至少一个突变：
(i)提供更高的有效活性；和/或
(ii)提供增强的热稳定性；和/或
(iii)提供在生理pH值下的结构稳定性；和/或
(iv)提供更长的半衰期。
5.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的GCase多肽，其中所述经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽具有更高的有效活性，任选地，其中：
(i)所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽，任选地是SEQ ID NO:3的多肽，或者SEQID NO:4或5的多肽；和/或
(ii)所述经修饰的GCase多肽的有效活性是所述参考GCase多肽的有效活性的至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍或至少50倍高。
6.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的GCase多肽，其中：
(i)所述至少一个突变提供了增强的稳定性，并且所述增强的稳定性是在pH 7.4下；和/或
(ii)所述至少一个突变提供了增强的稳定性，所述增强的稳定性是在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量的；和/或
(iii)所述至少一个突变提供了pH 7.4下的结构稳定性；和/或
(iv)所述经修饰的GCase多肽在生理pH下相对于参考GCase多肽在结构上更稳定，任选地其中所述pH为pH 7.4，进一步任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽或者SEQ ID NO:4或5的多肽；和/或
(v)所述经修饰的GCase多肽相对于参考GCase多肽具有增强的稳定性，任选地，其中所述增强的稳定性是在pH 7.4下的增强的稳定性，进一步任选地，其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽或者SEQ ID NO:4或5的多肽；和/或
(vi)当在pH 7.4和37摄氏度下孵育至少10分钟、至少30分钟、至少60分钟、至少120分钟、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的活性；和/或
(vii)当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留的活性是参考GCase多肽的活性的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少2.5倍、至少2.8倍或至少3倍高，任选地，其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽或者SEQ ID NO:4或5的多肽。
7.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的GCase多肽，其中：
(i)当在pH 7.4和37摄氏度孵育120分钟后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的活性；和/或
(ii)当在pH 7.4和37摄氏度下孵育72小时后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％的活性，任选地其中所述孵育在PBS中进行；和/或
(iii)当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少15％或至少20％的活性，任选地其中所述孵育在血清或血浆中进行；和/或
(iv)当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少40％的活性，任选地其中所述孵育在血清或血浆中进行；和/或
(v)当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少60％的活性；和/或
(vi)当在pH 7.4和37摄氏度下孵育7天后测量时，所述经修饰的GCase多肽保留至少80％的活性；和/或
(vii)使用荧光测定法测定所述活性、有效活性、稳定性和/或半衰期。
8.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的GCase多肽，其相对于参考GCase多肽而言具有更长的半衰期，任选地，其中所述经修饰的GCase多肽的半衰期是所述参考GCase多肽的半衰期的至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。
9.根据权利要求8所述的经修饰的GCase多肽，其中：
a.更长半衰期是在pH 7.4或pH 5.6下的更长半衰期；和/或
b.所述经修饰的GCase多肽在pH5.6下的半衰期是所述参考GCase多肽的半衰期的至少20倍；和/或
c.更长半衰期是在血清或血浆中的更长半衰期；和/或
d.使用荧光测定法测定所述半衰期；和/或
e.所述参考GCase多肽是(a)野生型GCase多肽，(b)SEQ ID NO:3的多肽，或(c)SEQ IDNO:4或5的多肽。
10.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的GCase多肽，其中：
a.所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的突变，任选地其中对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的所述突变是用谷氨酰胺取代，进一步任选地为E272Q；和/或
b.所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置262的位置处的突变，任选地其中对应于SEQ ID NO:1的位置262的位置处的所述突变是用天冬酰胺或酪氨酸取代；和/或
c.所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置262的位置处的突变，其中对应于SEQ ID NO:1的位置262的位置处的所述突变是用天冬酰胺取代，任选地为H262N；和/或
d.所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置313的位置处的突变，任选地其中对应于SEQ ID NO:1的位置313的位置处的所述突变是用天冬酰胺取代，进一步任选地为H313N；和/或
e.所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置404的位置处的突变，任选地其中对应于SEQ ID NO:1的位置404的位置处的所述突变是用赖氨酸取代，进一步任选地为H404K；和/或
f.所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置490的位置处的突变，任选地其中对应于SEQ ID NO:1的位置490的位置处的所述突变是用赖氨酸取代，进一步任选地为H490K；和/或
g.所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置534的位置处的突变，任选地其中对应于SEQ ID NO:1的位置534的位置处的所述突变是用天冬酰胺取代，进一步任选地为R534N。
11.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的GCase多肽，其中：
(a)所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置482的位置处的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置503的位置处的突变，
任选地，其中
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置482的位置处的所述突变是用半胱氨酸取代，任选地为天冬氨酸至半胱氨酸的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置503的位置处的所述突变是用半胱氨酸取代，任选地是丝氨酸至半胱氨酸的突变；和/或
(b)所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置494的位置处的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置534的位置处的突变，
任选地，其中
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置494的位置处的所述突变是用半胱氨酸取代，任选地为丝氨酸至半胱氨酸的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置534的位置处的所述突变是用半胱氨酸取代，任选地为精氨酸至半胱氨酸的突变；和/或
(c)所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的突变，
任选地，其中
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的所述突变是用半胱氨酸取代，任选地为色氨酸至半胱氨酸的突变；以及
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的所述突变是用半胱氨酸取代，任选地为丙氨酸至半胱氨酸的突变；和/或
(d)所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置407的位置处的突变；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置484的位置处的突变，
任选地，其中
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置407的位置处的所述突变是用半胱氨酸取代，任选地为异亮氨酸至半胱氨酸的突变；以及
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置484的位置处的所述突变是用半胱氨酸取代，任选地为天冬氨酸至半胱氨酸的突变；和/或
(e)所述至少一个突变包括对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处用谷氨酰胺的取代，并且其中所述经修饰的GCase多肽与参考GCase多肽相比具有增强的稳定性，当在pH7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，保留至少85％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽；和/或
(f)所述至少一个突变包括:
(i)在对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(ii)在对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的丙氨酸至半胱氨酸的突变；
并且其中与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，保留至少85％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽；和/或
(g)所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的用谷氨酰胺取代，任选地为E272Q；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(iii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的丙氨酸至半胱氨酸的突变；和/或
(h)所述至少一个突变包括：
(i)对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的用谷氨酰胺取代，任选地为E272Q；和
(ii)对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处的色氨酸至半胱氨酸的突变；和
(iii)对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处的丙氨酸至半胱氨酸的突变；
并且其中与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有增强的稳定性，当在pH7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，其保留至少85％的活性，任选地其中所述参考GCase多肽是野生型GCase多肽；和/或
(i)与参考GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽具有更高的有效活性和/或增强的稳定性，任选地，其中所述参考GCase多肽选自SEQ ID NO:1至5中的任一个。
12.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的GCase多肽，其中：
(i)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少200个、至少250个、至少300个、至少400个、300至497个之间、400至497个或450至497个氨基酸的片段具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列；或
(ii)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列；或
(iii)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1的400至536个氨基酸的片段具有至少98％同一性的氨基酸序列；或
(iv)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:2的400至497个氨基酸的片段具有至少98％同一性的氨基酸序列；或
(v)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少98％同一性的氨基酸序列；或
(vi)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少98％同一性的氨基酸序列；或
(vii)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，不同之处在于所述经修饰的GCase多肽包含前述权利要求中任一项所定义的至少一个突变；或
(viii)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，不同之处在于所述经修饰的GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处包含突变；或
(ix)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，不同之处在于所述经修饰的GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处和在对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处包含用半胱氨酸取代；或
(x)所述经修饰的GCase多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，不同之处在于所述经修饰的GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置351的位置处和在对应于SEQ ID NO:1的位置380的位置处包含用半胱氨酸取代，并且所述经修饰的GCase多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置272的位置处的突变。
13.一种包含经修饰的葡糖脑苷脂酶(GBA)核苷酸序列的多核苷酸，其中所述经修饰的GBA核苷酸序列编码前述权利要求中任一项所述的经修饰的GCase多肽。
14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中所述经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ IDNO:6至29中任一序列的至少750个、至少850个、至少950个、至少1000个、至少1200个、至少1400个或至少1494个核苷酸的片段具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列。
15.根据权利要求13或14所述的多核苷酸，其中：
(i)所述经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列；或
(ii)所述经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列；或
(iii)所述经修饰的GBA核苷酸序列包含与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的序列。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的多核苷酸，其中：
(i)所述多核苷酸还包含转录调控元件，任选地，其中所述转录调控元件包含A1AT启动子或A1AT启动子的片段；和/或
(ii)所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的启动子；和/或
(iii)所述多核苷酸还包含转录调控元件，并且其中所述转录调控元件包含增强子，任选地，其中所述增强子是HCR增强子或HCR增强子的片段；和/或
(iv)所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性的增强子；和/或
(v)所述多核苷酸还包含转录调控元件，并且其中所述转录调控元件与SEQ ID NO:34具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性；和/或
(vi)所述多核苷酸还包含转录调控元件，并且其中所述转录调控元件与SEQ ID NO:35具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％同一性。
17.一种包含重组基因组的病毒颗粒，所述重组基因组包含根据权利要求13至16中任一项所述的多核苷酸。
18.根据权利要求17所述的病毒颗粒：
(i)其为AAV、腺病毒或慢病毒颗粒，任选地其中所述病毒颗粒为AAV病毒颗粒；和/或
(ii)其中所述病毒颗粒包含嗜肝衣壳或嗜CNS衣壳，任选地其中所述嗜肝衣壳包含与SEQ ID NO:36、37或38的至少600个、至少650个、至少700个、600至736个、650至736个或700至736个氨基酸的片段具有至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的序列；和/或
(iii)其中所述病毒颗粒还包含：
a)AAV2 ITR；
b)polyA序列；和/或
c)内含子；和/或
(iv)其中所述重组基因组是单链的；和/或
(v)其中所述经修饰的GCase多肽的有效活性是由SEQ ID NO:14或18的序列编码的所述GCase多肽的有效活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。
19.根据权利要求17或18所述的病毒颗粒，其中：
(i)在转导进入宿主细胞后，与在将包含编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列、在其它方面相同的病毒颗粒转导进入宿主细胞后参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽的有效活性相同或更高；和/或
(ii)在转导进入宿主细胞后，与在将包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列、在其它方面相同的病毒颗粒转导进入宿主细胞后所述参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽的有效活性更高；和/或
(iii)在施用所述病毒颗粒后，与在施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列、在其它方面相同的病毒颗粒后所述参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽在血浆、白细胞、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的有效活性相同或更高；和/或
(iv)在施用所述病毒颗粒后，与施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列、在其它方面相同的病毒颗粒后所述参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽在肝脏中的有效活性相同或更高；和/或
(v)在施用所述病毒颗粒后，与施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列、在其它方面相同的病毒颗粒后所述参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽在血浆、白细胞、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的有效活性更高；和/或
(vi)在施用所述病毒颗粒后，与施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列、在其它方面相同的病毒颗粒后所述参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽在肝脏中的有效活性更高；和/或
(vii)在施用所述病毒颗粒后，与GCase酶替代疗法的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽在肝脏、白细胞、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的有效活性相同或更高；和/或
(viii)在施用所述病毒颗粒后，与下述情形下的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平相比：
a.施用GCase酶替代疗法后；
b.患有戈谢病的受试者中；或
c.在施用包含编码参考GCase多肽的GBA核苷酸序列、在其它方面相同的病毒颗粒后；
血浆、肝脏、脾脏、骨髓、肺组织和/或任何其它受戈谢病影响的器官中的己糖基鞘氨醇和/或己糖基神经酰胺的水平更低；和/或
(ix)施用所述病毒颗粒后，与施用GCase酶替代疗法后储藏细胞的数量或活化的巨噬细胞的水平相比，肝脏或肺组织中所述储存细胞的数量或活化的巨噬细胞的水平更低。
20.根据权利要求19所述的病毒颗粒，其中与参考GCase多肽的有效活性相比，所述经修饰的GCase多肽的有效活性是其至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍或至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍或至少40倍高。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的病毒颗粒，其中：
(i)所述参考GCase多肽包含SEQ ID NO:41或44的多肽，任选地，其中编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:6或10的核苷酸序列；或
(ii)所述参考GCase多肽包含SEQ ID NO:43或46的多肽，任选地，其中编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:22或26的核苷酸序列；或
(iii)所述参考GCase多肽包含SEQ ID NO:42或45的多肽，任选地，其中编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:14或18的核苷酸序列；或
(iv)所述参考GCase多肽包含SEQ ID NO:1或2的多肽，任选地，其中编码所述参考GCase多肽的GBA核苷酸序列包含SEQ ID NO:59或60的核苷酸序列。
22.一种组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的GCase多肽、多核苷酸或病毒颗粒以及药学上可接受的赋形剂。
23.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于治疗方法，任选地，其中所述治疗方法包括向患者施用有效量的根据权利要求1至22中任一项所述的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
24.根据权利要求23所述的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中：
(i)所述治疗方法是治疗与GCase缺乏相关的疾病的方法；或
(ii)所述治疗方法是治疗帕金森病的方法；或
(iii)所述治疗方法是治疗戈谢病的方法，任选地，其中所述戈谢病是I型、II型或III型戈谢病；或
(iv)所述治疗方法是治疗戈谢病的方法，并且其中所述患者具有针对重组GCase的抗体或抑制剂，所述患者先前已用所述重组GCase作为酶替代疗法的一部分进行了治疗，任选地，其中所述戈谢病是I型、II型或III型戈谢病。
25.根据权利要求1至22中任一项所述的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于治疗疾病，其中与由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽相比，所述经修饰的GCase多肽或所述编码的经修饰的GCase多肽在pH 7.4下具有增强的稳定性。
26.根据权利要求25所述使用的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其中：
-当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，所述经修饰的GCase多肽或编码的经修饰的GCase多肽保留的活性是由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽保留的活性的至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.8倍或至少2倍高；和/或
-当在pH 7.4和37摄氏度下孵育120分钟后测量时，所述经修饰的GCase多肽或编码的经修饰的GCase多肽保留的活性是由SEQ ID NO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽保留的活性的至少3倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍或至少15倍高。
27.根据权利要求1至22中任一项所述的经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物，其用于治疗疾病，其中治疗所述疾病包括施用与需要施用的包含或编码由SEQ IDNO:40的GBA核苷酸序列编码的GCase多肽的等同多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物的剂量相比更低剂量的所述经修饰的GCase多肽、多核苷酸、病毒颗粒或组合物。
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