KR20230079172A - 간-유도 유전자 대체 요법에 의한 pku의 치료를 위한 인간 pah 발현 카세트 - Google Patents

간-유도 유전자 대체 요법에 의한 pku의 치료를 위한 인간 pah 발현 카세트 Download PDF

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젠자임 코포레이션
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Abstract

간 세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트가 본원에 제공되며, 여기서 이식유전자는 PAH 폴리펩티드를 암호화한다. 또한, 페닐케톤뇨증(PKU)의 치료 및/또는 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하고/하거나 감소시키는 방법이 제공된다. 또한, PAH 폴리펩티드의 발현을 필요로 하는 개체에서 이를 발현시키기 위한 벡터(예를 들어, rAAV 벡터), 바이러스 입자, 약제학적 조성물, 및 키트가 본원에 제공된다.

Description

간-유도 유전자 대체 요법에 의한 PKU의 치료를 위한 인간 PAH 발현 카세트
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 10월 1일자로 출원된 미국 가출원 제63/086,537호 및 2020년 12월 4일자로 출원된 미국 가출원 제63/121,797호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일의 다음 제출 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 형태(CRF)(파일명: 159792017840SEQLIST.TXT, 기록일: 2021년 9월 22일, 파일 크기: 31,028바이트).
기술분야
본 개시내용은 페닐알라닌 하이드록실라제 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 유전자 요법을 이용한 페닐케톤뇨증 치료용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
페닐케톤뇨증(PKU)은, 페닐알라닌(Phe)의 티로신(Tyr)으로의 하이드록실화에 촉매 작용을 하는 간 효소 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)의 유전자 결핍증이다. 이 질환은 가장 흔한 선천성 아미노산 대사 이상 질환으로, 북미에서의 전체 발병률은 1:10~15,000이며, 대부분의 선진국에서 신생아 선별 프로그램에 의해 검출된다. 중증 형태의 PKU는 치료하지 않을 경우, 신경 독성 및 지적 장애와 관련된 혈중 Phe 수치가 매우 높아진다(Kochhar 2012, Ho 2014, Blau 2015). 영향을 받는 단백질인 PAH는 N-말단 조절 도메인(1 내지 117), 중앙 촉매 도메인(118 내지 410), 및 C-말단 사량체화 도메인(411 내지 452)으로 이루어진 다중 도메인 단백질이다(Flydal 2013). 현재까지, 560개 이상의 질병 유발 돌연변이가 각 도메인에 매핑되었으며, 촉매 영역이 가장 영향을 많이 받는 부위이다(Erlandsen 2003). 동종다량체 효소는 효소의 다양한 입체구조적 상태 및 다량체화 상태를 변경하여 PAH 효소 활성을 미세 조정하는 N-말단 도메인에 결합하는 기질 Phe에 의해 인산화 및 알로스테릭 활성화와 함께 복잡한 조절을 받는다(Knappskog 1996, Jaffe 2013, Arturo 2016).
PKU에 대한 현재의 치료법은 저단백식 및 액상 의약품을 사용하는 Phe의 평생 식이 제한이다(Kochhar 2012, Ho 2014, Blau 2015). 효과는 있지만, 의료용 식품의 맛이 좋지 않고 음식 선택에 대한 엄격한 제한으로 인해 식이요법을 준수하기 어렵고, 소아기에는 규정 미준수가 꾸준히 증가하여, 10대 후반에는 거의 80%의 환자가 권장 혈중 Phe 수치보다 높다(Waisbren 2007, Thomas 2017). 또한, Phe 제한 식이요법을 잘 준수함에도 불구하고, 많은 환자가 다양한 신경인지 및 신경정신과적 기능의 결핍을 경험할 뿐만 아니라 주의력 결핍 과잉행동 장애(ADHD)의 발생률이 높다는 증거가 나타나고 있다. 이러한 이유는 불분명하지만, 가능한 설명에는 뇌의 아미노산 불균형, 특정 비타민 및 미량 원소의 영양 결핍, 뿐만 아니라 간 PAH 활성에 의해 정상적으로 안정적으로 유지되는 혈중 Phe 수치의 변동이 포함된다(Cleary 2013, Gonzales 2016, Vogel 2017). 흥미롭게도, 경미한 형태의 PKU가 있는 환자를 합성 형태의 보조인자 테트라하이드로비옵테린(BH4)(사프롭테린 디하이드로클로라이드)으로 치료하는 것이 혈중 Phe 수치를 낮추는 데 효과적인 것으로 나타났을 뿐만 아니라, ADHD 증상의 감소와 같이 신경학적 결과를 개선시키는 것으로 입증되었다(Burton 2015). 이 치료법은 약리학적 샤페론(pharmacological chaperone)으로 작용하여 잔류 PAH 효소 활성을 증가시키므로, 정상적인 Phe 조절 PAH 활성을 제공하여 유전자 결함을 부분적으로 교정할 수 있다(Blau 2015). 최근 승인된 다른 치료법은 Phe를 트랜스-신남산으로 물질대사시키는 PEG화된 형태의 박테리아 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)를 사용하는 효소 대체 요법으로 구성된다. 이 치료법은 혈중 Phe 수치를 현저히 감소시키지만, 신경학적 평가변수에는 덜 효과적인 것으로 보인다(Longo 2014). PAH의 교정 없이 주로 혈중 Phe 수치를 낮추는 것에 기초한 이 치료법 또는 임의의 다른 치료법이 전신 Phe 수치의 조절인자로서 기능하는지, 및 Tyr의 생성원이 식이요법을 준수하는 PKU 환자에서도 관찰되는 인지 및 신경정신과적 문제를 해결할 수 있는지는 여전히 불분명하다.
유전자 Pah 유전자 전달에 의해 PKU 환자의 간으로 Phe 하이드록실라제 활성을 회복시키는 것은 질병을 치료하기 위한 매력적인 접근법이다. 충분한 PAH 발현이 회복될 수 있다면, 안정적이고 낮은 혈중 Phe 수치를 제공해야 한다. 여러 연구에서 Pahenu2 마우스의 간으로 PAH를 암호화하는 cDNA의 rAAV-매개 전달이 혈중 Phe 수치를 정상 범위 내로 감소시키고 행동을 수정함을 보여주었다(Mochizuki 2004; Ding 2006; Harding 2006, Yagi 2011, Winn 2018). 평균적으로, 간에서 하나의 rAAV 복제/세포 또는 정상 PAH 활성의 최소 10%는 간의 결함을 교정하기에 충분하다(Hamman 2010, Yagi 2011, Viecelli 2014). 야생형 간세포 또는 이형접합 Pahenu2/+ 공여자의 간세포를 PKU 마우스에 사용한 간세포 재증식 연구는 어느 한 간세포를 사용한 간 재증식의 3~10%가 혈중 Phe 수치를 부분적으로 감소시켰고 혈중 Phe 수치가 간 재증식의 10%로 완전히 교정되었음을 보여주었다(Hamman 2010). 이 개념의 증거는 최근 기능성 Pah 유전자 사본을 간으로 전달하는 유전자 치료 시험에서 나타났지만; 비교적 많은 양의 벡터가 필요했다(Chatterjee 2020). 필요한 것은 간으로의 효율적인 유전자 전달, 간에서 hPAH의 강력한 발현 및 후속 PKU 병리 교정을 위한 개선된 rAAV 벡터이다.
특허 출원 및 공보를 포함하여 본원에 인용된 모든 참조문헌은 전체가 참조로 포함된다.
본 발명은 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)를 암호화하는 발현 카세트의 발명자의 개발에 적어도 부분적으로 기초한다. 발현 카세트는 인간 세포 배양, PKU 마우스 모델의 간 및 비인간 영장류의 간 모두에서 간 세포에서의 이식유전자 발현을 구동할 수 있었다. 또한, 발현 카세트는 효소적으로 활성인 야생형 인간 PAH 폴리펩티드를 생산하였다. 따라서, 이 발현 카세트를 갖는 rAAV 벡터는 감소된 벡터 용량으로도 효능을 얻을 수 있도록 함으로써 PKU 유전자 요법을 위한 경로를 제공할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 rAAV 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 제공하며, 여기서 rAAV 벡터는 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하며, 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자 및 인핸서를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(pPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하며, AAV 바이러스 입자는 AAV-XL32 또는 AAV-XL32 1 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, mTTR 프로모터는 mTTR482 프로모터이다. 일부 구현예에서, 인핸서는 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 rAAV 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 제공하며, 여기서 rAAV 벡터는 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하며, 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자 및 3’-요소를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하며, 3’ 요소는 알부민 3’ 요소(3’Alb) 또는 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3’ 요소(3’AlbSMAR)이며, 여기서 이식유전자는 PAH 폴리펩티드를 암호화하며; 여기서 AAV 바이러스 입자는 AAV-XL32 또는 AAV-XL32.1 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, mTTR 프로모터는 mTTR482 프로모터이다. 일부 구현예에서, 3' 요소는 이식유전자에 대해 3'에 위치한다.
일부 양태에서, 본 발명은 rAAV 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자, 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트를 제공하며, 여기서 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자 및 인핸서 및 3' 요소를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(pPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하고, 상기 3' 요소는 알부민 3' 요소(3' Alb)이거나 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3' 요소(3' AlbSMAR)이며, 상기 이식유전자는 PAH 폴리펩티드를 암호화하고, 상기 AAV 바이러스 입자는 AAV-XL32 또는 AAV-XL32.1 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, mTTR 프로모터는 mTTR482 프로모터이다. 일부 구현예에서, 인핸서는 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있다. 일부 구현예에서, 3' 요소는 이식유전자에 대해 3'에 위치한다.
상기 양태들의 일부 구현예에서, 발현 카세트는 인트론을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 닭 β-액틴/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론이다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호이다.
상기 양태들의 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드는 야생형 PAH 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드는 인간 PAH 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 80% 동일하다.
상기 양태들의 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 서열에 의해 플랭킹된, 발현 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 발현 카세트는 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다. 일부 구현예에서, 벡터는 자기-상보성 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 PAH 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산 서열 및 PAH 폴리펩티드의 보체를 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 제1 핵산 서열은 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함한다.
상기 양태들의 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 AAV-XL32 캡시드이다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 캡시드는 서열번호 3과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV-XL32 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 캡시드는 VP1, VP2, 및 VP3을 포함하며, 여기서 VP1, VP2, 및 VP3은 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 AAV-XL32 1 캡시드이다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 1 캡시드는 서열번호 3과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 1 캡시드는 VP1, VP2, 및 VP3을 포함하며, 여기서 VP1, VP2, 및 VP3은 서열번호 6의 핵산 서열에 의해 암호화된다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기술되는 임의의 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기술되는 임의의 rAAV 입자를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 PAH 폴리펩티드의 제조 방법으로서, PAH 폴리펩티드를 생성하는 조건에서 본원에 기재된 바와 같이 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 PAH 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 개체는 PAH 활성이 부족하다.
일부 양태에서, 본 발명은 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 치료 전 개체의 혈중 페닐알라닌 수치는 연령대가 유사한 대조군 개체의 혈중 페닐알라닌 수치에 비해 높다. 일부 구현예에서, rAAV 입자, 조성물, 또는 세포는 정맥내, 동맥내, 간내, 간문맥내, 복강내, 또는 피하 투여된다. 일부 구현예에서, 투여는 다른 요법과 병용된다. 일부 구현예에서, 다른 요법은 테트라하이드로비옵테린을 사용한 치료, 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 또는 페길화 PAL을 사용한 치료, 또는 페닐알라닌-제한 식이요법이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 rAAV 입자, 조성물 또는 본원에 기재된 바와 같은 세포 중 어느 하나를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 사용 설명서; 완충제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 부형제; 및/또는 병, 바이알, 및/또는 주사기를 추가로 포함한다.
도 1a~1c는 PAH 단백질과 야생형 PAH 및 PAH 변이체의 활성 수준의 시험관내 비교를 보여준다. 4개의 발현 플라스미드(n=2/플라스미드)는 인간 간세포주인, Huh7 세포에 형질감염되고, 72시간 후, 세포가 수집되어, 용해물을 제조하였다. 도 1a는 PAH 활성 수치를 보여준다. 13C-Phe는 기질로 사용되고 분석이 30분 동안 수행되었다. 생성된 생성물(13C-Tyr)의 양을 LC-MS/MS로 측정하고 값이 총 단백질에 대해 정규화되었다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 모의 대조군, hPAH/G, hPAH-V1/G, hPAH/E(야생형 hPAH), hPAH-V1/E, 및 뮤린 PAH(mPAH)를 포함하는 x-축 상에 샘플의 신원이 표시된다. y-축은 PAH 활성(μM 13C Tyr/ mg 단백질)의 수준을 나타낸다. 도 1b는 PAH 단백질 수준을 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 세포 용해물(15 μg/레인)은 SDS-PAGE 겔 상에서 실행되고, 멤브레인으로 옮긴 다음, 인간 및 마우스 PAH 단백질 둘 다에 반응하는 항-PAH 항체로 프로브되었다. 샘플의 신원은 왼쪽에서 오른쪽으로 hPAH-V1/G, 야생형 hPAH/E, hPAH-V1/E, hPAH/G, 및 mPAH를 포함하는 블롯 상에 표시된다. 도 1c는 AzureSpot 소프트웨어를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 결정된 PAH 단백질 수준의 정량화를 나타낸다. 샘플의 신원은 왼쪽에서 오른쪽으로, hPAH-V1/G, 야생형 hPAH/E, hPAH-V1/E, hPAH/G, 및 mPAH를 포함하는 x-축 상에 표시된다. 도 1a~1c에서, "hPAH-V1/G"는 E183G 아미노산 치환을 갖는 인간 PAH 변이체 1을 나타내고; "WT hPAH/E"는 E183 잔기를 갖는 야생형 인간 PAH를 나타내고; "hPAH-V1/G"는 E183 잔기를 갖는 인간 PAH 변이체 1을 나타내고; "hPAH/G"는 E183G 아미노산 치환을 갖는 돌연변이 인간 PAH를 나타내고; "mPAH"는 양성 대조군으로 사용되는 FLAG-태그된 마우스 PAH를 나타낸다.
도 2a~2e는 비인간 영장류(NHP)에서 간 세포 및 기관으로의 유전자 전달을 위한 AAV 캡시드를 비교하고 NHP에서 A1M2-mTTR 프로모터를 검증한 실험의 결과를 보여준다. 도 2a는 왼쪽에서 오른쪽으로, AAV8, AAV-DJ, AAV-LK03, AAV-XL14, 및 AAV-XL32 캡시드 벡터를 사용하여, CBA-EGFP 발현 카세트를 함유하는 AAV 벡터로 형질도입된 인간 간 세포주(Huh7 세포)에서의 EGFP 단백질 수준을 나타낸다. 도 2b는 NHP 간(암회색) 및 비장(연회색)에서 벡터 게놈/세포의 수준을 나타낸다. 벡터 게놈 복사는 5e12 vg/kg의 IV 전달 후 qPCR에 의해 2주 후 측정되었다. 벡터 투여 14일 후 각 동물의 간 및 비장에서 VG 복사본이 표시된다. 간에 대한 값은 다양한 위치에서 수집된 4개 샘플의 평균을 나타낸다. 비장에 대한 값은 비장의 중간 섹션에서 수집된 2개의 인접한 샘플의 평균이다. 도 2c는 NHP 신장(암회색), 근육(연회색), 및 심장(중간 회색)에서 벡터 게놈/세포의 수준을 나타낸다. 값은 각 조직에서 수집된 2개의 인접한 샘플의 평균을 나타낸다. 캡시드 단백질의 신원은 왼쪽에서 오른쪽으로 AAV8, AAV-DJ, AAV-LK03, AAV-XL14, 또는 AAV-XL32를 포함하여 x-축을 따라 표시된다. 도 2d는 비교된 5개의 캡시드의 벡터 생체분포 비교의 요약을 나타낸다. 벡터 게놈/세포의 수준은 x-축 상에서 왼쪽에서 오른쪽으로, AAV8, AAV-DJ, AAV-LK03, AAV-XL14, 또는 AAV-XL32 캡시드 벡터와 함께 벡터로 투여된, NHP의 간, 비장, 근육, 심장 또는 신장에 대한 y-축 상에 나타낸다. 도 2e는 AAV8, AAV-DJ, AAV-LK03, AAV-XL14, 또는 AAV-XL32 캡시드 벡터의 투여 후 우측 내엽의 3개 부분 및 좌측 내엽의 1개 부분에서 EGFP의 발현을 보여준다.
도 3a~3e는 NHP 간 유전자 전달에 대한 XL32.1/ mA1MB2-mTTR482--EGFP의 용량-반응을 측정한 실험의 결과를 보여준다. 도 3a는 x-축 상에 표시된 바와 같이, 비히클 단독 대조군, 또는 5e11, 2e12, 5e12 및 2e13 vg/kg 용량의 XL32.1/ mA1MB2-mTTR482-가 투여된 NHP에서, y-축에 표시된 바와 같이, NHP 간에서 벡터 게놈의 풍부도를 나타낸다. 평균 벡터 게놈 복사본/세포는 하단 X-축 패널에 표시된다(n=3/투여 코호트). M, 남성 NHP, F, 여성 NHP(유의도: *, p < 0.05; **, p < 0.01). 도 3b는 x-축 상에 표시된 바와 같이, 비히클 단독 대조군, 또는 5e11, 2e12, 5e12 및 2e13 vg/kg 용량의 XL32.1/mA1MB2-mTTR482-EGFP가 투여된 NHP에서, y-축에 표시된 바와 같이, NHP 간에서 벡터 유래 전사체의 수준을 나타낸다. 도 3c는 x-축 상에 표시된 바와 같이, 비히클 단독 대조군, 또는 5e11, 2e12, 5e12 및 2e13 vg/kg 용량의 XL32.1/ mA1MB2-mTTR482-EGFP가 투여된 NHP에서, y-축에 표시된 바와 같이, EGFP 단백질 수준을 나타낸다. 도 3d는 간 벡터 게놈과 벡터 유래 mRNA 복사본 간의 상관관계를 나타낸다(고용량 2e13 vg/kg은 이 분석에서 생략됨). 도 3e는 간에서 벡터 유래 mRNA 복사본과 eGFP 단백질 수준 사이의 상관관계를 보여준다.
도 4a~4c는 NHP에 투여된 XL32.1/ mA1MB2-mTTR482-EGFP의 용량-반응 연구에서 간 제자리 혼성화 분석의 결과를 보여준다. 도 4a는 간에서 벡터를 검출하기 위한 대표적인 제자리 혼성화의 이미지를 보여준다. 동물 #203(2e12 vg/kg 그룹)에서의 검출은 오른쪽(qPCR에 의한 3 vg/세포)에 예시로 표시된다. 도 4b는 x-축 상에 표시된 바와 같이, 비히클 단독 대조군, 또는 5e11, 2e12, 5e12 및 2e13 vg/kg 용량의 XL32.1/mA1MB2-mTTR482-EGFP가 투여된 NHP에서, y-축에 표시된 바와 같이, 제자리 혼성화에 의해 검출된 간에서 EGFP-벡터 DNA 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 4c는 qPCR에 의해 결정된 바와 같은, VG 복사본의 평균 수(y-축)와, 제자리 혼성화에 의해 결정된 바와 같은, VG 양성 세포의 백분율(x-축) 사이의 상관관계를 나타낸다.
도 5a~5b는 NHP에서 XL32 및 XL32.1 캡시드 벡터의 생체분포의 비교를 나타낸다. 도 5a는 간 및 다양한 다른 기관에서 벡터 게놈/세포의 수준을 보여준다. 간 값은 각 그룹에서 3마리 동물의 평균을 나타내며(각 동물은 오른쪽 및 왼쪽 중간 엽으로부터의 하나의 샘플에 대해 테스트됨), 다른 기관에 대한 값은 3마리 동물의 평균(1개 샘플/동물 포함)이다. 도 5b는 간에서의 벡터 유래 mRNA의 수준을 보여준다. 각 값은 치료 그룹당 평균을 나타낸다(각 동물 n=2).
도 6a~6d는 Pah-KO 마우스에서 XL32.1/WT hPAH의 효능을 나타낸다. 도 6a는 혈중 Phe 수치에 대한 시간 경과를 나타낸다. 도 6b는 36일차의 혈중 Phe 수치를 보여준다(HOM은 차이 관찰을 위해 포함되지 않음). 도 6c는 혈중 Tyr 수치에 대한 시간 경과를 나타낸다. 도 6d는 36일차의 혈중 Tyr 수치를 보여준다. 벡터(mA1MB2-mTTR482 프로모터 포함)는 1e11, 3e11 및 1e12 vg/마우스의 용량으로 성체 수컷 동형접합체 Pah-KO 마우스에 IV 경로로 투여되었다. 벡터 처리 코호트는 n=8-10 동물/그룹, HET, n=10 및 C57BL66, n=5를 함유한다. 약어: HOM, 동형접합체 Pah-KO 마우스; HET, 이형접합체 Pah-KO 마우스; C57BL/6, 야생형 마우스.
도 7a~7e는 Pah-KO 마우스의 간에서 XL32.1/WT hPAH에 의한 유전자 전달 및 형질도입의 분석을 나타낸다. 도 7a는 간의 벡터 DNA 복사본을 나타낸다. 도 7b는 시험된 모든 조직(간, 비장, 근육, 신장 및 폐)의 벡터 DNA를 나타낸다. 도 7c는 간의 벡터 유래 mRNA 수준을 나타낸다. 도 7d는 간의 세포 당 벡터 유래 mRNA에 대한 벡터 게놈의 상관관계를 나타낸다. 도 7e는 혈중 Phe 수준에 대한 간에서의 벡터 게놈의 상관관계를 나타낸다. 각 데이터 포인트는 한 마리의 동물을 나타낸다. 5 pg DNA/세포(vg/세포) 및 30 pg/세포(mRNA/세포)를 기준으로 한 세포 당 정규화. 약어: HOM, 동형접합체 PAH-KO 마우스
도 8a~8c는 Pah-KO 마우스의 간에서 XL32.1/WT hPAH에 의한 전달 후 PAH 활성 및 단백질 수준의 분석을 나타낸다. 도 8a는 간 균질액에서의 PAH 활성을 나타낸다. 도 8b는 웨스턴 블롯에 의한 PAH 단백질 검출을 나타낸다. 도 8c는 PAH 면역조직화학법에 의한 PAH 양성 세포의 국소화를 나타낸다. 벡터 처리 코호트는 n=8-10 동물/그룹, HET, n=10 및 C57BL, n=5를 함유한다. 웨스턴 블롯의 경우, 각 코호트에서 3마리의 대표 동물이 분석에 사용되었고, 이들의 동등한 단백질 로딩은 b-액틴 프로빙에 의해 표시된다.
도 9a 및 9b는 간으로의 XL32.1/WT hPAH 전달이 뇌 아미노산 및 신경전달물질 수준에 미치는 효과를 나타낸다. 도 9a는 뇌 Phe, Tyr 및 Trp 수준을 나타낸다. 도 9b는 뇌 신경전달물질인 도파민, 노르에피네프린 및 세로토닌 수준을 나타낸다. 각 데이터 포인트는 한 마리의 동물을 나타낸다. 뇌 아미노산 분석을 위해, 벡터 처리 코호트는 n=7-10 동물/그룹, HET, n=9 및 C57BL/6, n=5를 함유한다. 뇌 신경전달물질 분석을 위해, 벡터 처리 코호트는 n=7 동물/그룹, HET, n=6 및 C57BL/6, n=4를 함유한다. 1-way ANOVA에 의한 통계적 분석.
도 10a 및 10b는 XL32.1/WT hPAH 전달 후 Pah-KO 마우스의 행동 분석을 나타낸다. 도 10a는 1 (나쁜 품질) 내지 5 (높은 품질)의 점수로부터의 각 점수 범위에 대한 네스트 품질의 이미지를 나타낸다. 도 10b는 rAAV-XL32.1/WT hPAH 처리 전 및 후 동물의 스코어링을 나타낸다. 각 데이터 포인트는 한 마리의 동물을 나타낸다. 벡터 처리 코호트는 n=8-10 동물/그룹, HET, n=10 및 C57BL/6, n=5, 1-way ANOVA에 의한 통계적 분석을 함유한다.
도 11a~11c는 Pah-KO 마우스에 대한 AAVXL32.1/WT hPAH 투여 후 4개월 연구 동안의 동물 성장을 나타낸다. 도 11a는 치료 전의 HET 및 WT(C57BL/6) 마우스와 비교하여, Pah-KO 마우스 (HOM 및 치료 코호트)에서 체중이 유의하게 상이하였음을 나타낸다. 도 11b는 WT PAH로 처리한지 4개월 후, 처리되지 않은 HOM 마우스와 비교하여 2개의 더 높은 용량 코호트에서 체중이 유의하게 증가했음을 나타낸다. 도 11c는 처리군에서 증가된 간 중량을 나타내며, HET 및 WT 마우스와 유사하였다. 유의도, *, p<0.05; **, p< 0.01, ***, p<0.001 및 ****, p<0.0001, Tukey의 다중 비교를 사용한 1-way ANOVA에 의함. 각 데이터 포인트는 한 마리의 동물을 나타낸다(그룹당 n, HOM=9; 저용량, n=6; 중간 용량, n=8, 고용량, n=8, HET, n=8 및 WT, n=8). 약어: HOM, 동형접합체 Pah-KO 마우스; HET, 이형접합체 Pah-KO 마우스; WT, 야생형 C57BL/6 마우스. 용량 vg/마우스.
도 12a~12c는 Pah-KO 마우스에 대한 AAVXL32.1/WT hPAH 투여 후 4개월 연구 동안의 혈장 Phe 수치를 나타낸다. 도 12a는 120일에 걸쳐 각 코호트의 평균 혈중 Phe 수치를 나타낸다. 마우스 처리 후 7일(도 12b) 및 120일(도 12c)에 개별 마우스의 혈중 Phe 수치. 모든 처리 그룹(용량 vg/마우스)은 처리되지 않은 HOM 마우스와 비교하여 혈중 Phe 수치를 유의하게 감소시켰다. 어느 시점에서든 HET 및 WT 마우스와 비교하여 3e11 및 1e12 용량의 WT PAH 처리군 간에는 유의한 차이가 없었다. 용량 1e11은 가변성을 나타내며, HET/WT와 비교할 수 없다. 도 11a-11c 범례에서와 같은 동물 수, 통계 분석 및 약어.
도 13a~13e는 Pah-KO 마우스에 AAVXL32.1/WT hPAH 투여 4개월 후 간에서의 벡터 DNA 및 mRNA를 나타낸다. 도 13a는 간에서의 벡터 DNA 복사본을 나타내고, 도 13b는 간에서의 벡터 유래 mRNA 수준을 나타낸다. 두 종점 모두 용량-반응성 증가를 보였다. 간에서 세포당 벡터 유래 mRNA 수준에 대한 벡터 게놈의 양호한 상관관계(도 13c) 및 혈중 Phe 수치에 대한 간에서의 벡터 게놈의 상관관계(도 13d)가 있었다. 후자는 혈중 Phe 정규화(100 uM)가 최소 0.1 VG/세포에서 필요함을 보여주었다. 도 13e는 벡터 DNA(적색)에 대한 제자리 검출에 대한 대표적인 이미지를 나타내고, 전사체(녹색)는 각각의 처리 코호트에 대한 H&E-염색된 절편에 나타낸다. 도 11a-11c에서와 같은 동물 수, 통계 분석 및 약어.
도 14a~14d는 Pah-KO 마우스에 AAVXL32.1/WT hPAH 투여 4개월 후 간에서의 PAH 활성 및 PAH 단백질 검출을 나타낸다. 도 14a는 간 균질액에서의 PAH 활성을 나타낸다. 1e11 및 3e11 처리 코호트에서의 PAH 효소 활성은 HET 마우스에서의 활성과 유의하게 상이하지 않은 반면, 1e12 처리는 정상 마우스에서 관찰된 것보다 훨씬 더 많은 PAH 활성을 발생시켰다. 도 14b는 PAH 단백질의 생성이 간 절편에서 PAH IHC에 의해 확인되었고 PAH 양성 세포의 백분율을 정량화하기 위해 HALO 분석이 사용되었음을 보여준다. 도 14c는 혈중 Phe 정규화(100 μM)가 최소 20%의 PAH 양성 세포에서 필요하다는 것을 보여주었던 간에서의 벡터 DNA 복사본에 대한 이것의 상관관계를 보여준다. 도 14d는 모든 연구 코호트에 대한 PAH IHC의 대표적인 이미지를 나타낸다. 각 이미지(동물 #)의 퍼센트 PAH 양성 세포는 다음과 같다: HOM (#4), 0%; 1e11 (#19), 38%; 3e11 (#21), 62%; 1e12 (#34), 72%; HET (#46), 94% 및 WT (#56), 99%.
도 15a 및 15b는 Pah-KO 마우스에 AAVXL32.1/WT hPAH 투여 4개월 후 뇌 아미노산 및 신경전달물질 수준을 나타낸다. 도 15a는 뇌 Phe, Tyr 및 Trp 수준을 나타낸다. 저용량(1e11 vg/마우스) 용량 코호트에서 가변성이 관찰되었지만, 모든 치료 코호트는 뇌 Phe 수준을 유의하게 감소시켰다. 이 그룹에서, 뇌 Phe 수치가 더 높은 3마리의 동물은 혈중 Phe 수치가 더 높고, 간으로의 유전자 전달이 더 낮았다. 도 15b는 뇌 신경전달물질인 도파민, 노르에피네프린 및 세로토닌 수준을 나타낸다. 다시, 신경전달물질 수준이 낮은 저용량 그룹의 3마리 동물은 혈중 Phe 수치가 더 높은 동물을 나타낸다. 도 11a-11c 범례에서와 같은 동물 수, 통계 분석 및 약어.
도 16a~16c는 간으로의 AAVXL32.1/WT hPAH 전달이 뇌 백질 함량에 미치는 영향을 나타낸다. 백질 함량은 MRI로 뇌량을 정량화하여 분석되었다. 이는 살아있는 동물에서 치료 전(도 16a) 및 치료 후 106일(도 16b)에 측정되었다. 도 16c는 각 동물에 대한 뇌량 부피의 백분율 변화를 보여준다. 처리된 모든 동물은 4개월 연구 내에 HET 및 WT 동물에서 변화가 관찰되지 않은 반면 유의미한 증가를 보였다. 치료되지 않은 Pah-KO 마우스(HOM)는 이 기간 동안 약간의 감소를 보였다. 도 16d는 연구 종료 시(치료 후 120일) 뇌 중량을 나타낸다. 3e11 용량 코호트만이 뇌 중량의 유의미한 증가를 나타냈고, 정상 동물의 뇌 중량에 도달하지 못했다. 도 11a-11c 범례에서와 같은 동물 수, 통계 분석 및 약어.
도 17a 및 17b는 Pah-KO 마우스에 대한 AAVXL32.1/WT hPAH 투여 후 4개월 연구 동안의 행동 분석을 나타낸다. 도 17a 는 둥지의 품질이 점수화되는 둥지 짓기 분석에 의해 평가된 행동을 나타낸다(점수 1, 둥지 없음 또는 낮은 품질에서 5, 높은 품질). 도 17b는 치료 전 및 치료 후 35일 및 97일에 수행된 둥지 짓기 분석의 결과를 나타낸다. 둥지 짓기 점수의 개선은 이미 35일에 관찰되었으며, 치료 후 97일까지 지속되었다. 점수가 낮은 저용량 그룹의 3마리 동물은 혈중 Phe 수치가 더 높은 동물을 나타낸다. 도 11a-11c 범례에서와 같은 동물 수, 통계 분석 및 약어.
도 18a~18g는 XL32.1/WT hPAH 벡터와 시험관내 및 생체내 다양한 간 발현 카세트의 비교를 나타낸다. 도 18a는 벡터의 다이어그램을 도시한다. rAAVXL32.1/mA1MB2-mTTR482-WT hPAH (A1MB2)는 4개월 연구에서 사용된 것과 동일한 벡터를 나타낸다. rAAVXL32.1/LP1-HI2는 rAAVXL32.1/mA1MB2-mTTR482--WT hPAH에 사용된 것과 동일한 인트론을 가진 LP1 프로모터를 함유한다. rAAVXL32.1/LP1-SI 작제물은 혈우병 B 시험에 사용된 것과 동일한 프로모터 및 인트론을 갖는다(Nathwani 2011). 인간 간 세포주에서의 시험관내 분석을 위해, 플라스미드 작제물을 함유하는 각각의 ITR을 3중으로 Huh7 세포에 일시적으로 형질감염시키고, 3일 후에 세포 용해물이 생성되었다. 도 18b는 시험관내 인간 세포에서의 PAH 단백질 수준을 나타낸다. 10 μg의 세포 용해물을 레인당 실행하고, 항-PAH 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 PAH 수준이 분석되었다. 동등한 로딩은 β- 액틴 검출로 표시된다. 도 18c는 시험관내 인간 세포에서의 PAH 활성 분석을 나타낸다. Phe에서 Tyr로의 전환은 비색 검정에 의해 측정되었고, BCA에 의해 측정된 총 단백질에 대해 정규화되었다. 데이터는 인간 간 세포에서 A1MB2 작제물에 의해 생성된 더 높은 PAH 단백질 및 활성을 입증했다. 생체 내 분석을 위해 각 벡터가 PAH-KO 마우스에 3e11 vg/마우스로 IV 투여되고 5주 동안 평가되었다. 도 18d는 벡터 전달 후 36일째 혈장 Phe 수치를 나타낸다. 도 18e는 각각의 치료 코호트에서 간 벡터 유래 전사체 수치를 나타낸다. 도 18f는 각각의 치료 코호트에서 간 PAH 활성을 나타낸다. 도 18g는 각 동물에서 벡터 DNA에 의해 정규화된 PAH 활성을 나타낸다. PAH 활성은 간에서 벡터 DNA 수치의 관찰된 가변성으로 인해 벡터 DNA에 의해 정규화되었다. 유의도, *, p<0.05; **, p< 0.01, ***, p<0.001 및 ****, p<0.0001, Tukey의 다중 비교를 사용한 1-way ANOVA에 의함. 각 데이터 포인트는 한 마리의 동물을 나타낸다(모든 그룹 n=10, HOM 제외, n=4).
일부 양태에서, 본 발명은 PAH 폴리펩티드를 암호화하는 이식유전자를 포함하는 발현 카세트, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터와 바이러스 입자, 및 약제학적 조성물을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들어 PAH 활성을 증가시키고, 티로신 및 트립토판의 뇌 수송을 향상시키고, 도파민 및 세로토닌을 포함한 뇌 신경전달물질 수치를 정규화하여 페닐케톤뇨증(PKU)을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 개시내용의 발현 카세트를 사용하여 개체에서 PKU를 치료하기 위한 키트를 제공한다.
일반 기술
본원에 기술되거나 언급된 기술 및 절차는 예를 들어, 하기 문헌에 기술된 널리 이용되는 방법과 같이, 당업자에 의해 일반적으로 잘 이해되어 있고 종래의 방법을 사용하여 통상적으로 이용된다: 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003)]; 시리즈인 문헌[Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995)]; 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988)]; 문헌[Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th　ed., J. Wiley and Sons, 2010)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; 문헌[Methods in Molecular Biology, Humana Press]; 문헌[Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998)]; 문헌[Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998)]; 문헌[Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8)]; 문헌[Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996)]; 문헌[Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; 문헌[Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002)]; 문헌[Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004)]; 문헌[Antibodies (P. Finch, 1997)]; 문헌[Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; 문헌[Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; 문헌[Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; 문헌[The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 문헌[Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011)].
정의
본원에서 사용되는 "벡터"는 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포에 전달되는 핵산을 포함하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드)를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단일-, 이중-, 또는 여러-가닥의 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 푸린 및 피리미딘 염기를 포함하는 폴리머, 또는 기타 천연의, 화학적, 또는 생화학적으로 변형된, 비천연적인, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오티드의 백본은 당 및 포스페이트기(일반적으로 RNA 또는 DNA에서 발견될 수 있음), 또는 변형되거나 치환된 당 또는 포스페이트기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 백본은 포스포르아미데이트와 같은 합성 서브유닛의 중합체를 포함할 수 있고, 따라서 올리고데옥시뉴클레오시드 포스포르아미데이트(P-NH2) 또는 혼합된 포스포르아미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 또한, 상보적 가닥을 합성하고 적절한 조건에서 가닥을 어닐링함으로써, 또는 적절한 프라이머와 함께 DNA 중합효소를 사용하여 새로운 상보적 가닥을 합성함으로써 화학적 합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 산물로부터 이중가닥 폴리뉴클레오티드가 수득될 수 있다.
용어 "폴리펩티드"와 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 최소 길이로 제한되지 않는다. 이러한 아미노산 잔기의 폴리머는 천연 또는 비천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 펩티드, 올리고펩티드, 아미노산 잔기의 이량체, 삼량체, 및 다량체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전장 단백질 및 이의 단편이 모두 상기 정의에 포함된다. 이 용어는 또한 폴리펩티드의 발현후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 목적상, "폴리펩티드"는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대한 결실, 부가, 및 치환(일반적으로는 사실상 보존적)과 같은 변형을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위-특이적 돌연변이유발을 통해서와 같이 계획적일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통해서와 같이 우연적일 수 있다.
"재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종 서열(즉, 바이러스 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다. 재조합 AAV 벡터의 경우, 재조합 핵산은 적어도 하나의, 구현예에 따라 2개의 역위 말단 반복 서열(ITR)에 의해 플랭킹되어 있다.
"재조합 AAV 벡터(rAAV 벡터)"는 적어도 하나의, 일부 구현예에 따라 2개의 AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)에 의해 플랭킹된 하나 이상의 이종 서열(즉, AAV 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다. 이러한 rAAV 벡터는 적절한 헬퍼 바이러스로 감염되고(또는 적절한 헬퍼 기능을 발현하고), AAV rep 및 cap 유전자 산물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 숙주 세포에 존재할 때 복제될 수 있고, 감염성 바이러스 입자로 패키징될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 염색체, 또는 클로닝이나 형질감염에 사용되는 플라스미드와 같은 다른 벡터)에 통합될 때, 이러한 rAAV 벡터는 AAV 패키징 기능 및 적절한 헬퍼 기능의 존재하에서 복제 및 캡시드화에 의해 "회수"될 수 있는 "프로-벡터(pro-vector)"로 지칭될 수 있다. rAAV 벡터는 플라스미드, 선형 인공 염색체, 지질과 복합체화된 형태, 리포솜 내에 캡슐화된 형태, 및 바이러스 입자, 예를 들어 AAV 입자에 캡시드화된 형태를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 형태 중 임의의 형태로 존재할 수 있다. rAAV 벡터는 AAV 바이러스 캡시드에 패키징되어 "재조합 아데노-관련 바이러스 입자(rAAV 입자)"를 생성할 수 있다.
"이종"은 비교 대상이 되거나 내부에 도입 또는 통합되는 개체의 나머지와는 유전자형으로 구분되는 개체로부터 유래된 것을 의미한다. 예를 들어, 유전 공학 기술에 의해 다양한 세포 유형에 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종 폴리뉴클레오티드이다(발현되는 경우, 이종 폴리펩티드를 암호화할 수 있음). 마찬가지로, 바이러스 벡터에 통합되는 세포 서열(예를 들어, 유전자 또는 이의 부분)은 벡터에 대해 이종 뉴클레오티드 서열이다.
용어 "이식유전자"는 세포에 도입되어 RNA로 전사될 수 있고, 필요에 따라, 적절한 조건에서 번역 및/또는 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 양태에 따라, 이는 도입된 세포에 요구되는 특성을 제공하거나, 요구되는 치료적 또는 진단적 결과를 유도한다.
"닭 β-액틴(CBA) 프로모터"는 닭 β-액틴 유전자(예를 들어, GenBank Entrez Gene ID 396526으로 표시되는 Gallus gallus 베타 액틴)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "닭 β-액틴 프로모터"는 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소, 닭 β-액틴 유전자의 프로모터 및 제1 엑손과 인트론, 및 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체를 함유하는 프로모터, 예컨대 문헌[Miyazaki, J., et al. (1989) Gene 79(2):269-77]에 기재된 서열을 지칭할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "CAG 프로모터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "CMV 초기 인핸서/닭 베타 액틴(CAG) 프로모터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
바이러스 역가와 관련하여 사용된 용어 "게놈 입자(gp)", "게놈 당량", 또는 "게놈 복사본"은 감염성 또는 기능성과 무관하게, 재조합 AAV DNA 게놈을 포함하는 비리온의 수를 지칭한다. 특정 벡터 제제 중 게놈 입자의 수는 본원의 실시예에 기술되거나, 예를 들어, 문헌[Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039]; 문헌[Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278]에 기재된 바와 같은 절차에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터 게놈(vg)"은 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터의 한 세트의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 벡터 게놈은 바이러스 입자에 캡시드화될 수 있다. 특정 바이러스 벡터에 따라, 벡터 게놈은 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA, 또는 단일가닥 RNA, 또는 이중가닥 RNA를 포함할 수 있다. 벡터 게놈은 특정 바이러스 벡터와 관련된 내인성 서열 및/또는 재조합 기술을 통해 특정 바이러스 벡터에 삽입되는 임의의 이종 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 AAV 벡터 게놈은 프로모터를 플랭킹하는 적어도 하나의 ITR 서열, 스터퍼, 관심 서열(예컨대, RNAi), 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 완전한 벡터 게놈은 벡터의 폴리뉴클레오티드 서열의 완전한 세트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 핵산 역가는 vg/ml 단위로 측정될 수 있다. 이러한 역가를 측정하는 데 적합한 방법은 당업계에 알려져 있다(예컨대, 정량적 PCR).
바이러스 역가와 연관하여 사용된 용어 "감염 단위(iu)", "감염성 입자", 또는 "복제 단위"는 예를 들어, 문헌(McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973)에 기술된 바와 같이, 복제 중심 검정으로도 알려져 있는, 감염 중심 검정으로 측정된, 감염성 및 복제 능력이 있는 재조합 AAV 벡터 입자들의 수를 지칭한다.
바이러스 역가와 관련하여 사용되는 용어 "형질도입 단위(tu)"는 본원의 실시예에 기재되거나, 예를 들어, 문헌[Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; 또는 Fisher et al. Virol., 70:520532(LFU 검정)에 기술된 것과 같은 기능적 검정으로 측정된, 기능성 이식유전자 생성물의 생산을 초래하는 감염성 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 지칭한다.
"역위 말단 반복" 또는 "ITR" 서열은 당업계에서 널리 이해되는 용어로, 반대 방향의 바이러스 게놈의 말단에서 발견되는 상대적으로 짧은 서열을 지칭한다.
당업계에서 널리 이해되는 용어인 "AAV 역위 말단 반복(ITR)" 서열은 고유한 단일가닥의 AAV 게놈의 양 말단에 존재하는 대략 145-뉴클레오티드 서열이다. ITR의 가장 바깥쪽 125개 뉴클레오티드는 두 가지 대안적인 방향 중 하나로 존재할 수 있어, 상이한 AAV 게놈들 사이에, 그리고 단일 AAV 게놈의 양 말단 사이에 이질성을 초래한다. 가장 바깥쪽의 125개의 뉴클레오티드는 또한 자기-상보성의 여러 짧은 영역(A, A', B, B', C, C' 및 D 영역으로 명명됨)을 포함하며, 이는 가닥내 염기쌍 형성이 ITR의 상기 부분 내에서 발생하는 것을 가능케 한다.
"말단 분해 서열" 또는 "trs"는 바이러스 DNA 복제 중에 AAV rep 단백질에 의해 절단되는 AAV ITR의 D 영역 내의 서열이다. 돌연변이 말단 분해 서열은 AAV rep 단백질에 의한 절단에 불응한다.
"AAV 헬퍼 기능"은 AAV가 숙주 세포에 의해 복제되고 패키징될 수 있도록 하는 기능을 지칭한다. AAV 헬퍼 기능은 비제한적으로 AAV 복제 및 패키징을 보조하는 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 임의의 여러 형태로 제공될 수 있다. 유전자독성제와 같은 다른 AAV 헬퍼 기능은 당업계에 알려져 있다.
AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는 (결함이 있는 파보바이러스인) AAV가 숙주 세포에 의해 복제되어 패키징될 수 있게 하는 바이러스를 지칭한다. 헬퍼 바이러스는 AAV의 복제를 가능하게 하는 "헬퍼 기능"을 제공한다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스, 예를 들어, 백시니아 및 배큘로바이러스를 비롯한 다수의 이러한 헬퍼 바이러스가 확인되었다. 아데노바이러스는 많은 상이한 서브그룹을 포함하지만, 서브그룹 C의 아데노바이러스 5형(Ad5)이 가장 흔히 사용된다. 인간, 비인간 포유류, 및 조류 기원의 여러 아데노바이러스가 알려져 있으며, ATCC와 같은 기탁기관으로부터 입수 가능하다. ATCC와 같은 기탁기관으로부터 또한 입수 가능한 헤르페스 패밀리의 바이러스는, 예를 들어 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 및 가성 광견병 바이러스(PRV)를 포함한다. AAV의 복제를 위한 아데노바이러스 헬퍼 기능의 예는 E1A 기능, E1B 기능, E2A 기능, VA 기능, 및 E4orf6 기능을 포함한다. 기탁기관으로부터 입수 가능한 배큘로바이러스는 Autographa californica 핵 다면체형성 바이러스를 포함한다.
rAAV의 조제물은 감염성 AAV 입자 대 감염성 헬퍼 바이러스 입자의 비가 적어도 약 102:l; 적어도 약 104:l, 적어도 약 106:l; 또는 적어도 약 108:l 이상인 경우, 헬퍼 바이러스가 "실질적으로 없는" 것으로 언급된다. 일부 구현예에서, 조제물은 등가량의 헬퍼 바이러스 단백질(즉, 상기 언급된 헬퍼 바이러스 입자 불순물이 손상된 형태로 존재하는 경우 그러한 수준의 헬퍼 바이러스의 결과로서 존재할 단백질)이 또한 없다. 바이러스 및/또는 세포 단백질 오염은 일반적으로 SDS 겔 상의 쿠마시 염색 밴드의 존재(예컨대, AAV 캡시드 단백질 VPl, VP2, 및 VP3에 상응하는 밴드가 아닌 밴드의 출현)로서 관찰될 수 있다.
참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열과 관련된 "서열 동일성 백분율(%)"은 서열을 정렬하고, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성하기 위해, 필요한 경우 갭을 도입한 후, 참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로서 정의되며, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부분으로 고려하지 않는다. 아미노산 또는 핵산 서열 동일성 퍼센트 결정의 목적을 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 포함하여, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기재된 것과 같고 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 포함하는 공적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 이용하여 당 분야의 기술 범위 내인 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 바람직한 정렬 프로그램은 ALIGN 플러스(Scientific and Educational Software, Pennsylvania)이다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬 측정을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 본원의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 이와, 또는 이에 대하여, 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(이는 대안적으로는 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 이와, 또는 이에 대하여, 특정 %의 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라고 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다: 100 x 분율 X/Y(X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램에 의한 프로그램 정렬시, 동일한 매칭으로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B의 총 아미노산 잔기수임). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 아미노산 서열 동일성%는 B 대 A의 아미노산 서열 동일성%와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다. 본원의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에 대해, 이에 의해, 또는 이와 연관하여, 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성%(대안적으로는, 주어진 핵산 서열 D에 대해, 이에 의해, 또는 이와 연관하여, 특정 핵산 서열 동일성%를 가지거나 이를 포함하는 주어진 핵산 서열 C로서 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다: 100 x 분율 W/Z(W는 C 및 D의 서열 정렬 프로그램에 의한 프로그램 정렬시, 동일한 매칭으로 스코어링된 뉴클레오티드의 수이며, Z는 D의 총 뉴클레오티드 수임). 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, C 대 D의 핵산 서열 동일성%는 D 대 C의 핵산 서열 동일성%와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다.
"단리된" 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질) 또는 세포는 천연 환경 성분으로부터 확인되고, 분리되고/분리되거나 회수되었음을 의미한다.
"유효량"은 임상 결과(예를 들어, 증상의 개선, 임상 평가변수의 달성 등)를 포함하여 유익하거나 요망되는 결과를 가져오기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 질병 상태의 측면에서, 유효량은 질병을 완화하거나, 안정화하거나, 또는 발생을 지연시키기에 충분한 양이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유류이다. 포유류는 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류(예컨대, 인간 및 원숭이와 같은 비인간 영장류), 토끼, 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 "치료"는 유익하거나 요망되는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 요망되는 임상 결과는 검출 가능하든 검출 불가능하든 증상의 경감, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화된(예컨대, 악화되지 않은) 상태, 질병의 확산(예컨대, 전이) 방지, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 완화 또는 일시적 억제, 및 관해(부분적이든 전체적이든)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존에 비해 연장되는 생존을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "예방적 치료"는 개체가 장애를 갖거나 장애를 가질 위험이 있는 것으로 알려지거나 의심되지만 장애의 증상을 나타내지 않거나 최소 증상을 나타낸 치료를 의미한다. 예방적 치료를 받는 개체는 증상의 발생 전에 치료될 수 있다.
본원에서 사용되는 "페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)"는 페닐알라닌의 방향족 측쇄의 하이드록실화에 촉매 작용을 하여 티로신을 생성하는 효소(EC 1.14.16.1)이다. PAH는 테트라하이드로비옵테린(BH4, 프테리딘 보조인자) 및 촉매작용을 위한 비헴철을 사용하는 모노옥시게나제이다. 반응 중에, 분자 산소는 하나의 산소 원자가 BH4 및 페닐알라닌 기질에 순차적으로 통합되면서 이종 분해된다. 페닐알라닌의 티로신으로의 하이드록실화는 페닐알라닌 이화작용에서 율속 단계이며, 이 효소 활성의 결핍은 상염색체 열성 장애인 페닐케톤뇨증을 유발한다. PAH는 PH, PKU, 또는 PKU1로 지칭될 수도 있다. PAH는 N-말단 조절 도메인(1 내지 117), 중앙 촉매 도메인(118 내지 410), 및 C-말단 사량체화 도메인(411 내지 452)으로 이루어진 다중 도메인 단백질이다. 인간 PAH는 GenBank; 예를 들어, GenBank: AAA60082.1, NCBI 참조 서열: NP_000268.1 (단백질), 및 NCBI 참조 서열: NM_000277.3 (mRNA)에 제공된다. 야생형 인간 PAH의 예는 서열번호 1로서 제공된다.
본원에서 사용되는 "페닐케톤뇨증(PKU)"은 간 효소 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)의 유전자 결핍을 지칭한다. 중증 형태의 PKU는 치료하지 않을 경우, 신경 독성이며 중증 정신 지체와 관련된 매우 높은 혈중 Phe 수치로 이어진다.
"mTTR 프로모터"는 뮤린 트랜스티레틴 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. mTTR 프로모터의 예(mTTR482)는 문헌[Kyostio-Moore (2016) 및 Nambiar (2017)]에서 제공된다.
"변형된 프로트롬빈 인핸서(mPrT2)"는 인간 프로트롬빈 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열의 2개의 복사본을 지칭한다. mPrT2 인핸서의 예는 문헌[McEachern 2006, Jacobs 2008]에서 제공된다. mPrT2 서열의 예는 서열번호 7에 의해 제공된다.
"변형된 알파1-마이크로비쿠닌(mA1MB2)"은 인간 알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열의 2개의 복사본을 지칭한다. mA1MB2 인핸서의 예는 문헌[McEachern 2006, Jacobs 2008]에서 제공된다. mA1MB2 서열의 예는 서열번호 8에 의해 제공된다.
"변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb)"는 뮤린 알부민 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. mEalb 인핸서의 예는 문헌[Kramer 2003]에서 제공된다. mEalb 서열의 예는 서열번호 9에 의해 제공된다.
"B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11)"는 PreCore 프로모터의 상류에 위치한, B형 간염 바이러스로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. hEII 인핸서의 예는 문헌[Kramer 2003]에서 제공된다. HEII 서열의 예는 서열번호 10에 의해 제공된다.
"CRM8"은 인간 Serpina1 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 유래된 cis-작용 조절 모듈을 지칭한다(Chuah 2014). CRM8 서열의 예는 서열번호 11에 의해 제공된다.
"Alb 3"은 인간 알부민 유전자의 코딩 영역에 대해 3'의 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. Alb 3' 요소의 예는 문헌[Wooddell (2008)]에서 제공된다. Alb 3' 서열의 예는 서열번호 12에 의해 제공된다. "Alb3'/SMAR"은 인간 알파1-항트립신 유전자(AF156542)의 스캐폴드/매트릭스 부착 영역에 연결된 Alb3'을 지칭한다. Alb3'/SMAR 서열의 예는 서열번호 13에 의해 제공된다.
본원에서 값 또는 매개변수에 언급된 "약"은 그 값 또는 매개변수 자체에 관한 구현예를 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"에 대한 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본원에 사용된 단수형은 달리 표시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예를 "포함하는", 양태 및 구현예로 "이루어진", 및/또는 양태 및 구현예로 "본질적으로 이루어진" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
간 특이적 발현 카세트
일부 양태에서, 본 발명은 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 인핸서에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(mPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하는, 발현 카세트를 제공한다. 일부 구현예에서, mTTR 프로모터는 mTTR482 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 mTTR 코어 프로모터 및 mTTR 업스트림 인핸서를 포함한다. 일부 구현예에서, 인핸서는 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 본원에 기재된 바와 같은 PAH 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 3' 요소에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 3' 요소는 알부민 3' 요소(3' Alb)이거나 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3' 요소(3' AlbSMAR)인, 발현 카세트를 제공한다. 일부 구현예에서, mTTR 프로모터는 mTTR482 프로모터이다. 일부 구현예에서, 3' 요소는 이식유전자에 대해 3'에 위치한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 본원에 기재된 바와 같은 PAH 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 인핸서 및 3' 요소에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(mPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하고, 상기 3' 요소는 알부민 3' 요소(3' Alb)이거나 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3' 요소(3' AlbSMAR)인, 발현 카세트를 제공한다. 일부 구현예에서, mTTR 프로모터는 mTTR482 프로모터이다. 일부 구현예에서, 인핸서는 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있다. 일부 구현예에서, 3' 요소는 이식유전자에 대해 3'에 위치한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 본원에 기재된 바와 같은 PAH 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 간 세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트를 제공하며, 여기서 이식유전자는 PAH 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드는 야생형 PAH 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드는 인간 PAH 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 서열번호 2의 핵산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드는 E183 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드는 아미노산 잔기 번호 183에 글루탐산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드는 E183G 아미노산 치환을 포함하는 PAH 폴리펩티드보다 더 높은 수준의 PAH 활성을 나타낸다.
일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 암호화하는 이식유전자는 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 암호화하는 이식유전자는 진핵세포와 같은 특정 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 진핵세포는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 또는 비인간 영장류를 비제한적으로 포함하는 포유류와 같은 특정 유기체의 세포이거나 이러한 유기체로부터 유래된 세포일 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 아미노산 서열을 유지하면서 천연 서열의 적어도 하나의 코돈을, 관심 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 숙주 세포에서의 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종이 특정 아미노산의 소정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 사용 표는 예를 들어 "코돈 사용 데이터베이스(Codon Usage Database)"에서 쉽게 입수 가능하고, 이들 표는 다수의 방식으로 맞춰질 수 있다(예를 들어 문헌[Nakamura, Y.et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:292]). 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 코돈 최적화하기 위한 컴퓨터 알고리즘, 예컨대 Gene Forge(Aptagen; Jacobus, Pa.), DNA2.0, GeneArt(GA) 또는 Genscript(GS), 및 CpG 함량의 감소와 결합된 GS 알고리즘도 이용 가능하다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 암호화하는 이식유전자는 GA 알고리즘을 사용하여 코돈 최적화된다.
일부 구현예에서, 발현 카세트는 인트론을 추가로 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 다양한 인트론은 당업자에게 알려져 있고, MVM 인트론, F IX 절단 인트론 1, β-글로빈 SD/면역글로빈 중쇄 SA, 아데노바이러스 SD/면역글로빈 SA, SV40 후기 SD/SA(19S/16S), 및 하이브리드 아데노바이러스 SD/IgG SA를 포함한다. (Wu et al. 2008, Kurachi et al., 1995, Choi et al. 2014, Wong et al., 1985, Yew et al. 1997, Huang and Gorman (1990). 일부 구현예에서, 인트론은 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론이다. 일부 구현예에서, 인트론은 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 프로모터 및 인트론이며, 여기서 모든 ATG 부위가 제거되어 잘못된 번역 시작 부위(서열번호 15)를 최소화한다. 일부 구현예에서, 인트론은 MVM 인트론, F IX 절단된 인트론 1, β-글로빈 SD/면역글로빈 중쇄 SA, 아데노바이러스 SD/면역글로빈 SA, SV40 후기 SD/SA(19S/16S), 또는 하이브리드 아데노바이러스 SD/IgG SA이다. 일부 구현예에서, 인트론은 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론이다.
일부 구현예에서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 또는 HSV TK pA이다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 문헌[Levitt, N et al. (1989), Genes Develop. 3:1019-1025]에 기재된 바와 같은 합성 폴리아데닐화 신호이다.
일부 구현예에서, 발현 카세트는 스터퍼 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 리포터 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 스터퍼 핵산은 핵산 내의 다양한 영역에 위치할 수 있고, 핵산 내의 연속 서열(예를 들어, 단일 위치에서의 단일 스터퍼 핵산) 또는 여러 서열(예를 들어, 둘 이상의 위치(예컨대, 2개의 위치, 3개의 위치 등)에서의 2개 이상의 스터퍼 핵산)로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 PAH 폴리펩티드를 암호화하는 이식유전자의 하류에 위치할 수 있다. 구현예에서, 스터퍼 핵산은 PAH 폴리펩티드를 암호화하는 이식유전자의 상류(예를 들어, 프로모터와 이식유전자 사이)에 위치될 수 있다. 당업자에 의해 또한 이해되는 바와 같이, 다양한 핵산이 스터퍼 핵산으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 인간 알파-1-항트립신(AAT) 스터퍼 서열 또는 C16 P1 염색체 16 P1 클론(인간 C16) 스터퍼 서열의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 스터퍼 서열은 유전자의 전부 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, 스터퍼 서열은 인간 AAT 서열의 일부를 포함한다. 당업자는 유전자(예컨대, 인간 AAT 서열)의 상이한 부분이 스터퍼 단편으로 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 스터퍼 단편은 유전자의 5' 말단, 유전자의 3' 말단, 유전자의 중간, 유전자의 비코딩 부분(예컨대, 인트론), 유전자의 코딩 영역(예컨대, 엑손), 또는 유전자의 비코딩 및 코딩 부분의 혼합물로부터 유래될 수 있다. 또한, 당업자는 스터퍼 서열의 전부 또는 일부가 스터퍼 서열로 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 스터퍼 서열은 내부 ATG 코돈을 제거하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 스터퍼 서열은 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 카세트는 벡터에 통합된다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 바이러스 벡터에 통합된다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열번호 14의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터이다.
벡터 및 바이러스 입자
특정 양태에서, PAH 폴리펩티드(예를 들어, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드)를 발현하기 위한 발현 카세트는 벡터에 함유된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 바이러스 입자, 예를 들어 하기의 바이러스 입자에 패키징하기 위해 PAH 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 도입하기 위한 재조합 바이러스 게놈의 사용을 고려한다. 재조합 바이러스 게놈은 PAH 폴리펩티드의 발현을 확립하기 위한 임의의 요소, 예를 들어 프로모터, ITR, 리보솜 결합 요소, 종결인자, 인핸서, 선별 마커, 인트론, 폴리A 신호, 및/또는 복제 원점을 포함할 수 있다. 예시적인 바이러스 게놈 요소 및 바이러스 입자 전달 방법은 아래에 더 상세히 설명되어 있다.
비바이러스 전달 시스템
핵산을 세포 또는 표적 조직에 도입하기 위해 종래의 비바이러스 유전자 전달 방법이 사용될 수도 있다. 비바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 조작되지 않은 핵산, 및 전달 시스템에 복합된 핵산을 포함한다. 예를 들어, 벡터는 지질(예컨대, 양이온성 또는 중성 지질), 리포솜, 다가양이온, 나노입자, 또는 핵산의 세포내 흡수 향상제와 복합체를 형성할 수 있다. 벡터는 본원에 기재된 임의의 전달 방법에 적합한 제제와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 바이러스 ITR(예컨대, AAV ITR)을 포함한다.
바이러스 입자
일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드(예를 들어, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드)를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하는 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터, 재조합 아데노바이러스 벡터, 재조합 렌티바이러스 벡터, 또는 재조합 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터이다.
rAAV 입자
일부 구현예에서, 벡터는 재조합 AAV(rAAV) 벡터이다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드(예를 들어, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드)를 발현하기 위한 발현 카세트는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 서열에 측접되어 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 1개 또는 2개의 ITR이 측접된 PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 입자이다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트는 2개의 AAV ITR에 측접되어 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열번호 14의 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트는 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 성분, 전사 개시 서열 및 종결 서열을 포함하는 조절 서열에 의해 발현 카세트를 형성한다. 발현 카세트는 5' 및 3' 말단에서 적어도 하나의 기능적 AAV ITR 서열에 의해 플랭킹된다. "기능적 AAV ITR 서열"은 ITR 서열이 AAV 비리온의 회수, 복제, 및 패키징을 위해 의도된 바와 같이 기능함을 의미한다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)342832; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; 및 Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16] 참조. 본 발명의 일부 양태를 실시하기 위해, 재조합 벡터는 rAAV에 의한 감염을 위한 물리적 구조 및 캡시드화에 필수적인 AAV의 적어도 모든 서열을 포함한다. 본 발명의 벡터에서 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요가 없으며(예를 들어, 문헌[Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801]에 기재된 바와 같음), 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있거나, AAV ITR은 여러 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 현재 40개가 넘는 AAV 혈청형이 알려져 있고, 새로운 혈청형 및 기존 혈청형의 변종이 계속 확인되고 있다. 문헌[Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):60816; 및 Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810] 참조.
임의의 AAV 혈청형의 사용은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV ITR 등의 AAV ITR을 제한없이 포함하는 AAV 혈청형으로부터 유래된 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV의 핵산은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 등의 AAV ITR의 ITR을 포함한다. 특정 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다.
일부 구현예에서, 벡터는 스터퍼 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 녹색 형광 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트에 대해 3'에 위치할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 재조합 자기-상보성 게놈을 포함하는 바이러스 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터는 자기-상보성 벡터이다. 자기-상보성 게놈을 갖는 AAV 바이러스 입자 및 자기-상보성 AAV 게놈의 사용 방법은 미국 특허 6,596,535호; 7,125,717호; 7,765,583호; 7,785,888호; 7,790,154호; 7,846,729호; 8,093,054호; 및 8,361,457호; 및 문헌[Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 자기-상보성 게놈을 포함하는 rAAV는 이의 부분적 상보성 서열(예컨대, 이식유전자의 상보성 코딩 및 비코딩 가닥)로 인해 이중가닥 DNA 분자를 빠르게 형성할 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 AAV 게놈을 포함하는 AAV 바이러스 입자를 제공하며, 여기서 rAAV 게놈은 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열(예컨대, 본 발명의 PAH 폴리펩티드의 코딩 가닥) 및 제2 이종 폴리뉴클레오티드 서열(예컨대, 본 발명의 PAH 폴리펩티드의 비코딩 또는 안티센스 가닥)을 포함하고, 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 폴리뉴클레오티드 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열과 제2 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 가닥내 염기쌍 형성, 예컨대, 헤어핀 DNA 구조를 용이하게 하는 서열에 의해 연결된다. 예를 들어 siRNA 분자에서, 헤어핀 구조는 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열과 제2 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 돌연변이 ITR(예컨대, 우측 ITR)에 의해 연결된다. 돌연변이 ITR은 말단 분해 서열을 포함하는 D 영역의 결실을 포함한다. 결과적으로, AAV 바이러스 게놈의 복제시, rep 단백질은 돌연변이 ITR에서 바이러스 게놈을 절단하지 못할 것이고, 따라서, 5'에서 3'의 순서로 다음을 포함하는 재조합 바이러스 게놈이 바이러스 캡시드에 패키징될 것이다: AAV ITR, 조절 서열을 포함하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열, 돌연변이 AAV ITR, 제1 이종 폴리뉴클레오티드에 대해 역방향의 제2 이종 폴리뉴클레오티드, 및 제3 AAV ITR.
일부 구현예에서, 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열은 돌연변이 ITR(예컨대, 우측 ITR)에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, ITR은 폴리뉴클레오티드 서열 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG - 3' (서열번호 17)을 포함한다. 돌연변이 ITR은 말단 분해 서열을 포함하는 D 영역의 결실을 포함한다. 결과적으로, AAV 바이러스 게놈의 복제시, rep 단백질은 돌연변이 ITR에서 바이러스 게놈을 절단하지 못할 것이고, 따라서, 5'에서 3'의 순서로 다음을 포함하는 재조합 바이러스 게놈이 바이러스 캡시드에 패키징될 것이다: AAV ITR, 조절 서열을 포함하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열, 돌연변이 AAV ITR, 제1 이종 폴리뉴클레오티드에 대해 역방향의 제2 이종 폴리뉴클레오티드, 및 제3 AAV ITR.
일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 입자 내에 캡시드화된다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 재조합 AAV 벡터를 포함하는 재조합 AAV 바이러스 입자이다. 특정 표적 세포의 형질도입을 최적화하거나 특정 표적 조직(예를 들어, 간 조직) 내의 특이적 세포 유형을 표적으로 하기 위해 상이한 AAV 혈청형이 사용된다. rAAV 입자는 동일 혈청형 또는 혼합 혈청형의 바이러스 단백질 및 바이러스 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, rAAV 입자는 본 발명의 AAV2 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 AAV2 ITR을 포함하거나 AAV2 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 AAV1 ITR을 포함할 수 있다. rAAV 입자의 생성을 위한 AAV 혈청형의 임의의 조합은 각 조합이 본원에 명시적으로 언급된 것처럼 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 AAV2 캡시드를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 AAVrh8R 캡시드를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 조작된 AAV 캡시드를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 AAV-XL32 캡시드를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 AAV-XL32.1 캡시드를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드(예를 들어, 야생형 AAV6 캡시드, 또는 변이체 AAV6 캡시드, 예컨대 U.S.PG Pub. PG 공개 제 2012/0164106호에 기재된 ShH10), AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAVrh8R 캡시드, AAV9 캡시드(예로, 야생형 AAV9 캡시드, 또는 U.S. PG 공개 제 2013/0323226호에 기재된 변형된 AAV9 캡시드), AAV10 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV12 캡시드, 티로신 캡시드 돌연변이체, 헤파린 결합 캡시드 돌연변이체, AAV2R471A 캡시드, AAVAAV2/2-7m8 캡시드, AAV DJ 캡시드(예로, AAV-DJ/8 캡시드, AAV-DJ/9 캡시드, 또는 U.S. PG 공개 제 2012/0066783호에 기재된 임의의 다른 캡시드), AAV2 N587A 캡시드, AAV2 E548A 캡시드, AAV2 N708A 캡시드, AAV V708K 캡시드, 염소 AAV 캡시드, AAV1/AAV2 키메라 캡시드, 소 AAV 캡시드, 마우스 AAV 캡시드, rAAV2/HBoV1 캡시드, 또는 U.S.특허 번호 제 8,283,151호 또는 국제 공개 번호 WO/2003/042397호에 기재된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 AAV-XL32.1 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 AAV-XL32 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 국제 공개 번호 WO 2019241324 A1에 기재된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이 캡시드 단백질은 AAV 캡시드를 형성하는 능력을 유지한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV5 티로신 돌연변이 캡시드를 포함한다(Zhong L. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(22):7827-7832). 추가 구현예에서, rAAV 입자는 계통군 A 내지 F로부터의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다(Gao, et al., J. Virol. 2004, 78(12):6381). 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드 단백질 또는 이의 돌연변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, rAAV 입자는 AAV2 캡시드 단백질 또는 이의 돌연변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, 또는 AAVrh10이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV1) 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 2(AAV2) 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV8, AAVrh8R, AAV9, 및/또는 AAVrh10 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV1, AAV2, AAV8, AAVrh8R, AAV9, 및/또는 AAVrh10 캡시드는, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 티로신 돌연변이 또는 헤파란 결합 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드는 간 표적화 캡시드이다(예를 들어, LK03 캡시드, HSC15 캡시드, 17 캡시드, AAV-XL-32, 또는 AAV-XL32.1, 단 이에 한정되지 않음). 일부 구현예에서, 캡시드는 조작된 AAV 캡시드(예를 들어, 셔플링된 캡시드)이다. 조작된 AAV 캡시드의 예는 DJ (Grimm D et al., J Virol. 2008, 82:5887-911), LK03 (Lisowski L et al., Nature, 2014, 506:382-6) 및 HSC15 및 HSC17 (Smith LJ et al., Mol Ther, 2014 Sep;22(9):1625-34])을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
AAV의 캡시드(예를 들어, AAV2, AAV8 등)는 3개의 캡시드 단백질, 즉 VP1, VP2, 및 VP3을 포함하는 것으로 알려져 있다. 이러한 단백질은 유의한 양의 중첩 아미노산 서열 및 고유의 N-말단 서열을 포함한다. AAV2 캡시드는 정20면체 대칭에 의해 배열된 60개의 서브유닛을 포함한다(Xie, Q., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(16):10405-10). VP1, VP2, 및 VP3은 1:1:10의 비로 존재하는 것으로 밝혀졌다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 a) 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과 상호작용하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드, 및 b) 이종 핵산과 적어도 하나의 AAV 역위 말단 반복을 포함하는 rAAV 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에 대한 rAAV 입자의 결합을 감소시키거나 제거하는 캡시드 단백질의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고/하거나, 하나 이상의 아미노산 치환은 AAV2의 VP1 넘버링에 기초하여 넘버링된 484, 487, 532, 585, 또는 588번 위치에 존재한다. 본원에 사용된 바와 같이, "AAV2의 VP1에 기초한 넘버링"은 AAV2의 VP1의 언급된 아미노산에 상응하는 언급된 캡시드 단백질의 아미노산을 지칭한다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환이 AAV2의 VP1에 기초하여 넘버링된 347, 350, 390, 395, 448, 451, 484, 487, 527, 532, 585, 및/또는 588번 위치에 존재하는 경우, 하나 이상의 아미노산 치환은 AAV2의 VP1의 347, 350, 390, 395, 448, 451, 484, 487, 527, 532, 585, 및/또는 588번 아미노산에 상응하는 언급된 캡시드 단백질의 아미노산(들)에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 AAV2의 VP1의 484, 487, 532, 585, 또는 588번 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 AAV2의 VP1에 기초하여 넘버링된, AAV3의 VP1의 484, 487, 532, 585, 또는 588번 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 AAVrh8R의 VP1 넘버링에 기초하여 넘버링된 485, 488, 528, 533, 586, 또는 589번 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 585 및/또는 588번(AAV2의 VP1에 기초한 넘버링) 아미노산에 상응하는 위치(들)의 하나 이상의 아미노산은 아르기닌 잔기(예를 들어, AAV1 또는 AAV6의 경우 S586 및/또는 T589; AAV9의 경우 S586 및/또는 A589; AAVrh8R의 경우 A586 및/또는 T589; AAV8의 경우 Q588 및/또는 T591; 및 AAVrh10의 경우 Q588 및/또는 A591)로 대체된다. 다른 구현예에서, 484, 487, 527, 및/또는 532번(AAV2의 VP1에 기초한 넘버링) 아미노산에 상응하는 위치(들)의 하나 이상의 아미노산(예컨대, 아르기닌 또는 라이신)은 양전하를 띠지 않은 아미노산(들), 예컨대 알라닌(예를 들어, AAV1 또는 AAV6의 경우 R485, R488, K528, 및/또는 K533; AAV9 또는 AAVrh8R의 경우 R485, R488, K528, 및/또는 R533; 및 AAV8 또는 AAVrh10의 경우 R487, R490, K530, 및/또는 R535)으로 대체된다.
XL32 및 XL32.1 캡시드 및 캡시드 단백질
일부 구현예에서, AAV 입자는 조작된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 AAV 캡시드는 AAV-XL32 캡시드이다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 캡시드는 AAV-XL32 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 캡시드는 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV-XL32 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 캡시드는 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화되는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 캡시드는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산으로 암호화된 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 입자는 AAV-XL32 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 캡시드는 VP1, VP2, 및 VP3을 포함하며, 여기서 VP1, VP2, 및 VP3은 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 캡시드는 VPX를 포함하고, 여기서 VPX는 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 캡시드는 캡시드 단백질을 포함하고, 여기서 캡시드 단백질은 서열번호 4의 핵산 서열 내의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 캡시드는 1, 2, 3 또는 4개의 캡시드 단백질을 포함하며, 여기서 1, 2, 3 또는 4개의 캡시드 단백질은 서열번호 4의 핵산 서열 내의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, AAV 입자는 AAV-XL32 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 캡시드 단백질은 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화되는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 캡시드는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산으로 암호화된 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32 캡시드 단백질은 서열번호 4의 핵산 서열 내의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 1, 2, 3 또는 4개의 캡시드 단백질을 포함하며, 여기서 1, 2, 3 또는 4개의 캡시드 단백질은 서열번호 4의 핵산 서열 내의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화되는 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 VP1, VP2, 및 VP3을 포함하며, 여기서 VP1, VP2, 및 VP3은 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 VPX를 포함하고, 여기서 VPX는 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 VP1, VP2, VP3, 및 VPX를 포함하고, 여기서 VP1, VP2, VP3, 및 VPX는 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, AAV 입자는 조작된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 AAV 캡시드는 AAV-XL32.1 캡시드이다. 일부 구현예에서, AAV-XL32.1 캡시드는 AAV-XL32.1 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32.1 캡시드는 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV-XL32.1 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32.1 캡시드는 서열번호 6의 핵산 서열에 의해 암호화되는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32.1 캡시드는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산으로 암호화된 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 입자는 AAV-XL32.1 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32.1 캡시드는 VP1, VP2, 및 VP3을 포함하며, 여기서 VP1, VP2, 및 VP3은 서열번호 6의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV-XL32.1 캡시드는 캡시드 단백질을 포함하고, 여기서 캡시드 단백질은 서열번호 6의 핵산 서열 내의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, AAV 입자는 AAV-XL32.1 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32.1 캡시드 단백질은 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 서열번호 6의 핵산 서열에 의해 암호화되는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32.1 캡시드는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산으로 암호화된 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV-XL32.1 캡시드 단백질은 서열번호 6의 핵산 서열 내의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 1, 2, 또는 3개의 캡시드 단백질을 포함하며, 여기서 1, 2, 또는 3개의 캡시드 단백질은 서열번호 6의 핵산 서열 내의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 서열번호 6의 핵산 서열에 의해 암호화되는 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 VP1, VP2, 및 VP3을 포함하며, 여기서 VP1, VP2, 및 VP3은 서열번호 6의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 1, 2, 또는 3개의 캡시드 단백질을 포함하며, 여기서 1, 2, 또는 3개의 캡시드 단백질은 서열번호 6의 핵산 서열 내의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, AAV 입자는 국제 공개 번호 WO 2019241324 A1에 기재된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 국제 공개 번호 WO 2019241324A1에 기재된 AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
AAV 입자의 생성
형질감염, 안정적인 세포주 생성, 및 아데노바이러스-AAV 하이브리드, 헤르페스바이러스-AAV 하이브리드(Conway, JE et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789), 및 배큘로바이러스-AAV 하이브리드(Urabe, M. et al., (2002) 인간 Gene Therapy 13(16):19351943; Kotin, R. (2011) Hum Mol Genet. 20(R1): R2-R6)를 포함한 감염성 하이브리드 바이러스 생성 시스템을 비롯해, rAAV 벡터 생성을 위한 다수의 방법이 당업계에 알려져 있다. rAAV 바이러스 입자 생성을 위한 rAAV 생성 배양은 1) 적합한 숙주 세포, 2) 적합한 헬퍼 바이러스 기능, 3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 산물, 4) 적어도 하나의 AAV ITR 서열(예를 들어, PAH 폴리펩티드를 암호화하는 AAV 게놈)에 의해 플랭킹된 핵산(예컨대, 치료 핵산), 및 5) rAAV 생성을 유지시키기에 적합한 배지 및 배지 성분을 모두 필요로 한다. 일부 구현예에서, 적합한 숙주 세포는 영장류 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 적합한 숙주 세포는 인간 유래 세포주, 예컨대 HeLa, A549, 293, 또는 Perc.6 세포이다. 일부 구현예에서, 적합한 헬퍼 바이러스 기능은 야생형 또는 돌연변이 아데노바이러스(예컨대, 감온성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스(HSV), 배큘로바이러스, 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 작제물에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자 산물은 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 절대적이진 않지만, 일반적으로 AAV rep 유전자 산물은 rep 유전자 산물이 rAAV 게놈의 복제 및 패키징 기능을 할 수 있는 한, rAAV 벡터 게놈의 ITR과 동일한 혈청형을 갖는다. 당업계에 알려진 적합한 배지를 rAAV 벡터의 생성에 사용할 수 있다. 이러한 배지는 변형된 이글 배지(Modified Eagle Medium, MEM), 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM), 미국 특허 6,566,118호에 기재된 것과 같은 주문제조형 제제, 및 미국 특허 6,723,551호에 기재된 것과 같은 Sf-900 II SFM 배지를 비롯해, Hyclone Laboratories 및 JRH에서 제조된 배지를 제한없이 포함한다(각각의 특허는, 특히 재조합 AAV 벡터의 생성에 사용하기 위한 주문제조형 배지 제제와 관련하여, 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일부 구현예에서, AAV 헬퍼 기능은 아데노바이러스 또는 HSV에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 헬퍼 기능은 배큘로바이러스에 의해 제공되며, 숙주 세포는 곤충 세포(예를 들어, Spodoptera frugiperda(Sf9) 세포)이다.
rAAV 입자를 생성하는 한 가지 방법은 삼중 형질감염 방법이다. 간략히 말하면, 헬퍼 아데노바이러스 플라스미드와 함께, rep 유전자 및 캡시드 유전자를 포함하는 플라스미드가 (예를 들어, 인산칼슘 방법을 사용하여) 세포주(예를 들어, HEK-293 세포)에 형질감염될 수 있고, 바이러스가 수집되고 필요에 따라 정제될 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 암호화하는 핵산, AAV rep 및 cap을 암호화하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 삼중 형질감염시켜 생성되었으며, 핵산을 숙주 세포에 형질감염시키면 rAAV 입자를 생성할 수 있는 숙주 세포가 생성된다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 생산자 세포주 방법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269; 미국 PG 공개 번호 US2004/0224411; 및 문헌[Liu, X.L. et al. (1999) Gene Ther. 6:293-299] 참조). 간략히 말하면, 세포주(예를 들어, HeLa, 293, A549, 또는 Perc.6 세포주)는 rep 유전자, 캡시드 유전자, 및 프로모터-이종 핵산 서열(예를 들어, PAH 폴리펩티드)을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 플라스미드를 사용하여 안정적으로 형질감염될 수 있다. 세포주는 rAAV 생성을 위한 선도 클론을 선택하기 위해 스크리닝될 수 있고, 이어서 생산 생물반응기로 확장되고 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 또는 HSV)로 감염되어 rAAV 생성을 개시할 수 있다. 이후, 바이러스가 수거될 수 있고, 아데노바이러스가 비활성화(예를 들어, 열에 의해 비활성화)되고/되거나 제거될 수 있고, rAAV 입자가 정제될 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, rAAV 벡터를 암호화하는 핵산, AAV rep 및 cap을 암호화하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 암호화하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 생산자 세포주에 의해 rAAV 입자를 생성하였다. 본원에 기재된 바와 같이, 생산자 세포주 방법은 삼중 형질감염 방법에 비해 거대 게놈을 갖는 rAAV 입자를 생성하는 데 유리할 수 있다.
일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자를 암호화하는 핵산 및/또는 rAAV 게놈은 생산자 세포주에서 안정적으로 유지된다. 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자를 암호화하는 핵산 및/또는 rAAV 게놈은 하나 이상의 플라스미드 상에서 세포주에 도입되어 생산자 세포주를 생성한다. 일부 구현예에서, AAV rep, AAV cap, 및 rAAV 게놈은 동일한 플라스미드 상에서 세포에 도입된다. 다른 구현예에서, AAV rep, AAV cap, 및 rAAV 게놈은 상이한 플라스미드 상에서 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 플라스미드를 사용하여 안정적으로 형질감염된 세포주는 세포주의 다회 계대(예를 들어, 세포의 5, 10, 20, 30, 40, 50회, 또는 50회 초과 계대)를 위해 플라스미드를 유지한다. 예를 들어, 플라스미드(들)는 세포가 복제함에 따라 복제될 수 있거나, 플라스미드(들)는 세포 게놈에 통합될 수 있다. 플라스미드가 세포(예를 들어, 인간 세포)에서 자체적으로 복제할 수 있도록 하는 다양한 서열이 확인되었다(예를 들어, Krysan, P.J.et al. (1989) Mol. Cell Biol. 9:1026-1033] 참조). 일부 구현예에서, 플라스미드(들)는 플라스미드를 유지하는 세포의 선택을 가능하게 하는 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 마커)를 포함할 수 있다. 포유류 세포에서 일반적으로 사용되는 선별 마커는 블라스티시딘, G418, 하이그로마이신 B, 제오신, 퓨로마이신, 및 이들의 유도체를 제한없이 포함한다. 세포에 핵산을 도입하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 바이러스 형질도입, 양이온성 형질감염(예를 들어, DEAE-덱스트란과 같은 양이온성 중합체, 또는 리포펙타민과 같은 양이온성 지질을 사용), 인산칼슘 형질감염, 미량주사, 입자 폭격, 전기천공, 및 나노입자 형질감염을 제한없이 포함한다(더 자세한 내용은, 예를 들어 문헌[Kim, T.K. and Eberwine, J.H. (2010) Anal. Bioanal. Chem. 397:3173-3178] 참조).
일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자를 암호화하는 핵산 및/또는 rAAV 게놈은 생산자 세포주의 게놈에 안정적으로 통합된다. 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자를 암호화하는 핵산 및/또는 rAAV 게놈은 하나 이상의 플라스미드 상에서 세포주에 도입되어 생산자 세포주를 생성한다. 일부 구현예에서, AAV rep, AAV cap, 및 rAAV 게놈은 동일한 플라스미드 상에서 세포에 도입된다. 다른 구현예에서, AAV rep, AAV cap, 및 rAAV 게놈은 상이한 플라스미드 상에서 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 플라스미드(들)는 플라스미드를 유지하는 세포의 선택을 가능하게 하는 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 마커)를 포함할 수 있다. 핵산을 다양한 숙주 세포에 안정적으로 통합하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 선별 마커(및 AAV cap 및 rep 유전자 및/또는 rAAV 게놈)를 포함하는 핵산이 통합된 세포를 선택하기 위해 (예를 들어, 선별 마커의 사용을 통한) 반복 선택이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 핵산은 부위-특이적 방식으로 세포주에 통합되어 생산자 세포주를 생성할 수 있다. 몇몇 부위-특이적 재조합 시스템, 예컨대 FLP/FRT(예를 들어, O’Gorman, S. et al. (1991) Science 251:1351-1355 참조), Cre/loxP(예를 들어, 문헌[Sauer, B. and Henderson, N. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5166-5170] 참조), 및 phi C31-att(예를 들어, 문헌[Groth, A.C. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5995-6000] 참조)가 당분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 생산자 세포주는 영장류 세포주(예를 들어, Vero 또는 FRhL-2 세포주와 같은 비인간 영장류 세포주)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포주는 인간 세포주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 생산자 세포주는 HeLa, 293, A549, 또는 PERC.6®(Crucell) 세포로부터 유래된다. 예를 들어, 생산자 세포주를 생성하기 위해 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화하는 핵산 및/또는 거대 rAAV 게놈을 세포주에 도입하고/하거나 안정적으로 유지/통합하기 전에, 세포주는 HeLa, 293, A549, 또는 PERC.6®(Crucell) 세포주, 또는 이들의 유도체이다.
일부 구현예에서, 생산자 세포주는 현탁액에서의 성장에 적합하다. 당업계에 알려진 바와 같이, 부착-의존적 세포는 일반적으로 마이크로캐리어 비드와 같은 기질 없이는 현탁액에서 성장할 수 없다. 세포주가 현탁액에서 성장하도록 설계하는 것은, 예를 들어 교반 패들을 갖춘 회전 배양에서의 세포주 성장, 응집을 방지하기 위해 칼슘 및 마그네슘 이온이 없는 배양 배지(및 필요에 따라 소포제)의 사용, 실리콘화 화합물로 코팅된 배양 용기의 사용, 및 각 계대에서 (큰 덩어리나 용기 측면이 아닌) 배양물에서의 세포 선택을 포함할 수 있다. 추가적인 설명에 대해서는, 예를 들어 ATCC 자주 묻는 질문 문서(www.atcc.org/Global/FAQs/9/1/Adapting%20a%20monolayer%20cell%20line%20to%20suspension-40.aspx 에서 이용 가능) 및 거기에 인용된 참고문헌을 참조.
일부 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 임의의 rAAV 입자를 생성하는 방법으로서, (a) (i) 하나 이상의 AAV 패키징 유전자(상기 AAV 패키징 유전자 각각은 AAV 복제 및/또는 캡시드화 단백질을 암호화함), (ii) 적어도 하나의 AAV ITR에 의해 플랭킹된 본원에 기재된 바와 같은 이종 핵산을 암호화하는 핵산을 포함하는 rAAV 프로-벡터, 및 (iii) AAV 헬퍼 기능을 포함하는 숙주 세포를, rAAV 입자가 생성되는 조건에서 배양하는 단계; 및 (b) 숙주 세포에 의해 생성된 rAAV 입자를 회수하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, 또는 AAVrh10이다. 특정 구현예에서, AAV의 핵산은 AAV2 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 캡시드화 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 마우스 AAV 캡시드, rAAV2/HBoV1 혈청형, AAV-XL32, 또는 AAV-XL32.1 캡시드 단백질 또는 이의 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 캡시드화 단백질은 AAV8 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV2 ITR, 및 치료 이식유전자/핵산을 암호화하는 핵산(예를 들어, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트)을 포함하는 재조합 게놈 및 AAV8 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드화 단백질은 AAV-XL32 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 캡시드화 단백질은 AAV-XL32.1 캡시드 단백질이다. 으로 표시될 수 있다. 일부 구현예에서, 캡시드화 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 적합한 rAAV 생성 배양 배지는 0.5% 내지 20%(v/v 또는 w/v) 수준의 혈청 또는 혈청-유래 재조합 단백질로 보충될 수 있다. 대안적으로, 당업계에 알려진 바와 같이, rAAV 벡터는 동물-유래 생성물이 없는 배지로 언급될 수도 있는 무혈청 조건에서 생성될 수 있다. 당업자는 생성 배양물에서 rAAV의 역가를 높이기 위해, rAAV 벡터의 생성을 유지하도록 설계된 상용 또는 주문제조형 배지에, 포도당, 비타민, 아미노산, 및/또는 성장인자를 제한없이 포함하는 당업계에 알려진 하나 이상의 세포 배양 성분을 보충할 수 있음을 이해할 수 있다.
rAAV 생성 배양물은 이용되는 특정 숙주 세포에 적합한 다양한 조건(넓은 온도 범위, 다양한 기간 등)에서 성장될 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, rAAV 생성 배양물은 적합한 부착-의존성 용기, 예를 들어, 회전병, 중공 섬유 필터, 미세담체, 및 패킹된 베드(packed-bed) 또는 유체화된-베드 생물반응기에서 배양될 수 있는 부착-의존성 배양물을 포함한다. rAAV 벡터 생성 배양물은 또한, 예를 들어, 회전 플라스크, 교반 탱크 생물반응기, 및 일회용 시스템, 예를 들어, 웨이브 백(Wave bag) 시스템을 포함하는 다양한 방식으로 배양될 수 있는 현탁-적합화 숙주 세포, 예를 들어, HeLa, 293, 및 SF-9 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 rAAV 벡터 입자는 생성 배양물의 숙주 세포의 용해 또는 생성 배양물로부터 소모된 배지의 수거에 의해 rAAV 생성 배양물로부터 수거될 수 있으나, 단, 상기 세포는 미국 특허 번호 6,566,118호에 더욱 충분히 기재된 바와 같이 온전한 세포로부터 배지로 rAAV 입자를 방출시키는 당업계에 알려진 조건에서 배양되어야 한다. 또한, 세포를 용해하는 적합한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 다수의 동결/해동 사이클, 초음파처리, 미세유체화, 및 세제 및/또는 프로테아제와 같은 화학물질에 의한 처리를 포함한다.
추가 구현예에서, rAAV 입자는 정제된다. 본원에 사용된 용어 "정제"는 rAAV 입자가 자연 발생하는 장소나 최초 제조된 장소에 존재할 수도 있는 다른 성분 중 적어도 일부가 없는 rAAV 입자의 제조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 단리된 rAAV 입자는 배양 용해물 또는 생성 배양 상청액과 같은 공급원 혼합물로부터 입자를 농축시키는 정제 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 농축은 예를 들어, 용액 내에 존재하는 DNase-저항성 입자(DRP) 또는 게놈 복사본(gc)의 비율, 또는 감염력에 의해서와 같이 다양한 방법으로 측정될 수 있거나, 생성 배양 오염물 또는, 헬퍼 바이러스, 배지 성분 등을 비롯한 공정 중 오염물을 포함하는 오염물과 같은, 공급원 혼합물에 존재하는 제2의 잠재적 간섭 물질과 관련하여 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 생성 배양 수거물은 숙주 세포 조직파편을 제거하기 위해 정화된다. 일부 구현예에서, 생성 배양 수거물은, 예를 들어 등급 DOHC Millipore Millistak+ HC Pod 필터, 등급 A1HC Millipore Millistak+ HC Pod 필터, 및 0.2 μm Filter Opticap XL1O Millipore Express SHC 친수성 막 필터를 포함하는 일련의 심층 필터를 통한 여과에 의해 정화된다. 정화는 또한 당업계에 알려진 다양한 다른 표준 기술, 예를 들어, 원심분리 또는 당업계에 알려진 0.2 μm 이상의 포어 크기의 임의의 셀룰로스 아세테이트 필터를 통한 여과에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 생성 배양물 수거물은 생성 배양물에 존재하는 임의의 고분자량 DNA를 분해하기 위해 Benzonase®로 추가로 처리된다. 일부 구현예에서, Benzonase® 분해는, 예를 들어, 30분 내지 수시간의 기간 동안 주위 온도 내지 37℃의 온도에서 최종 농도 1~2.5 단위/ml의 Benzonase®을 포함하는 당업계에 알려진 표준 조건에서 수행된다.
rAAV 입자는 다음 정제 단계 중 하나 이상을 이용하여 단리되거나 정제될 수 있다: 평형 원심분리; 플로우-쓰루 음이온 교환 여과; rAAV 입자의 농축을 위한 접선류 여과(TFF); 아파타이트 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획; 헬퍼 바이러스의 열 불활성화; 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획; 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 완충액 교환; 나노여과; 및 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 친화성 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획. 이들 단계는 단독으로, 다양한 조합으로, 또는 다양한 순서로 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 기술된 순서대로 모든 단계를 포함한다. rAAV 입자의 정제 방법은, 예를 들어 문헌[Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232; 미국 특허 제6,989,264호 및 미국 특허 제8,137,948호; 및 WO 2010/148143]에서 발견된다.
치료 방법
본 발명의 특정 양태는 페닐케톤뇨증의 치료 및/또는 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하고/하거나 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량을 투여하여 PKU를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드는 야생형 PAH 폴리펩티드이다. PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트는 특정 관심 조직에 투여되거나 전신에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량은 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여 경로는 정맥내, 복강내, 골내, 동맥내, 뇌내, 근육내, 척수강내, 피하, 뇌실내, 간내 등을 제한없이 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 간 이외의 조직에서 PAH 폴리펩티드를 발현하려면, (예를 들어, 전신에 전달되거나 핵산에서 공동발현되는) 보조인자 BH4의 존재가 필요할 수 있다(문헌[Ding et al., Mol Ther 2008, 16:673-681]). 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량은 하나의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량은 2개 이상의 투여 경로의 조합을 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량은 하나의 부위에 투여된다. 다른 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량은 2개 이상의 부위에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트는 DNA이다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트는 RNA(예컨대, mRNA)이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량을 투여하여 PKU를 갖는 개체에서 페닐알라닌 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 투여한 후 PKU를 갖는 개체에서 페닐알라닌 수준은 PKU 없는 개체에서 발견되는 수준으로 감소된다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 투여한 후 PKU를 갖는 개체에서 페닐알라닌 수준은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 감소된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량을 투여하여 PKU를 갖는 개체의 혈액내 페닐알라닌 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 투여한 후 PKU를 갖는 개체의 혈액내 페닐알라닌 수준은 PKU 없는 개체의 혈액내에서 발견되는 수준으로 감소된다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 투여한 후 PKU를 갖는 개체의 혈액내 페닐알라닌 수준은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 감소된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량을 투여하여 PKU를 갖는 개체의 뇌내 페닐알라닌 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 투여한 후 PKU를 갖는 개체의 뇌내 페닐알라닌 수준은 PKU 없는 개체에서 발견되는 수준으로 감소된다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 투여한 후 PKU를 갖는 개체의 뇌내 페닐알라닌 수준은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 감소된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량을 투여하여 PKU를 갖는 개체의 뇌내 신경전달물질 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 신경전달물질은 도파민, 노르에피네프린 또는 세로토닌 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 투여한 후 PKU를 갖는 개체의 뇌내 신경전달물질 수준은 PKU 없는 개체에서 발견되는 수준으로 증가된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량을 투여하여 PKU를 갖는 개체에서 티로신 및/또는 트립토판 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 투여한 후 PKU를 갖는 개체에서 티로신 및/또는 트립토판 수준은 PKU 없는 개체에서 발견되는 수준으로 증가된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량을 투여하여 PKU를 갖는 개체의 혈액내 티로신 및/또는 트립토판 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 투여한 후 PKU를 갖는 개체의 혈액내 티로신 및/또는 트립토판 수준은 PKU 없는 개체에서 발견되는 수준으로 증가된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량을 투여하여 PKU를 갖는 개체의 뇌내 티로신 및/또는 트립토판 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 투여한 후 PKU를 갖는 개체의 뇌내 티로신 및/또는 트립토판 수준은 PKU 없는 개체에서 발견되는 수준으로 증가된다.
본 발명의 일부 양태에서, PAH 폴리펩티드(예를 들어, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드)를 발현하기 위한 발현 카세트는 바이러스 벡터를 통해 개체에게 전달된다. 유전자 요법을 위한 바이러스 벡터는 당업계에 알려져 있다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 암호화하는 렌티바이러스 입자의 유효량을 투여하여 PKU를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 암호화하는 rAAV 입자의 유효량을 투여하여 PKU를 치료하는 방법을 제공한다. rAAV는 특정 관심 조직에 투여되거나 전신에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV의 유효량은 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여 경로는 정맥내, 복강내, 골내, 동맥내, 뇌내, 근육내, 척수강내, 피하, 뇌실내, 간내 등을 제한없이 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV의 유효량은 하나의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV의 유효량은 2개 이상의 투여 경로의 조합을 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV의 유효량은 하나의 부위에 투여된다. 다른 구현예에서, rAAV의 유효량은 2개 이상의 부위에 투여될 수 있다.
rAAV(일부 구현예에서는 입자 형태)의 유효량은 치료 목적에 따라 투여된다. 예를 들어, 낮은 백분율의 형질도입이 원하는 치료 효과를 달성할 수 있는 경우, 치료의 목적은 일반적으로 이러한 수준의 형질도입을 충족시키거나 초과하는 것이다. 일부 경우에, 이러한 수준의 형질도입은 원하는 조직 유형의 표적 세포의 약 1 내지 5%만을, 일부 구현예에서는 원하는 조직 유형의 세포의 약 20% 이상을, 일부 구현예에서는 약 50% 이상을, 일부 구현예에서는 약 80% 이상을, 일부 구현예에서는 약 95% 이상을, 일부 구현예에서는 원하는 조직 유형의 세포의 약 99% 이상을 형질도입하여 달성될 수 있다. rAAV 조성물은 동일한 절차 동안, 또는 수일, 수주, 수개월, 또는 수년의 간격으로, 1회 이상의 투여에 의해 투여될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 투여 경로 중 하나 이상이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간을 치료하기 위해 다중 벡터가 사용될 수 있다.
AAV 바이러스 입자에 의해 형질도입된 세포를 식별하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 바이러스 입자(예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 rAAV 캡시드를 포함하는 바이러스 입자)의 형질도입을 검출하기 위해 면역조직화학 또는 강화된 녹색 형광 단백질과 같은 마커가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 유효량의 rAAV 입자는 2개 이상의 부위에 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 다른 구현예에서, 유효량의 rAAV 입자는 단일 부위에 2회 이상(예를 들어, 반복하여) 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 다회 주사 간격은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 9시간, 12시간, 또는 24시간 이하이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하여 PKU가 있는 인간을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 하나 이상의 부형제를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에서 PKU를 치료하기 위해 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1012개, 6 × 1012개, 7 × 1012개, 8 × 1012개, 9 × 1012개, 10 × 1012개, 11 × 1012개, 15 × 1012개, 20 × 1012개, 25 × 1012개, 30 × 1012개, 또는 50 × 1012개의 게놈 복사본/mL 중 임의의 수의 게놈 복사본/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 약 5 × 1012개 내지 약 6 × 1012개, 약 6 × 1012개 내지 약 7 × 1012개, 약 7 × 1012개 내지 약 8 × 1012개, 약 8 × 1012개 내지 약 9 × 1012개, 약 9 × 1012개 내지 약 10 × 1012개, 약 10 × 1012개 내지 약 11 × 1012개, 약 11 × 1012개 내지 약 15 × 1012개, 약 15 × 1012개 내지 약 20 × 1012개, 약 20 × 1012개 내지 약 25 × 1012개, 약 25 × 1012개 내지 약 30 × 1012개, 약 30 × 1012개 내지 약 50 × 1012개, 또는 약 50 × 1012개 내지 약 100 × 1012개의 게놈 복사본/mL 중 임의의 수의 게놈 복사본/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 약 5 × 1012개 내지 약 10 × 1012개, 약 10 × 1012개 내지 약 25 × 1012개, 또는 약 25 × 1012개 내지 약 50 × 1012개의 게놈 복사본/mL 중 임의의 수의 게놈 복사본/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 109개, 적어도 약 6 × 109개, 적어도 약 7 × 109개, 적어도 약 8 × 109개, 적어도 약 9 × 109개, 적어도 약 10 × 109개, 적어도 약 11 × 109개, 적어도 약 15 × 109개, 적어도 약 20 × 109개, 적어도 약 25 × 109개, 적어도 약 30 × 109개, 또는 적어도 약 50 × 109개의 형질도입 단위/mL 중 임의의 수의 형질도입 단위/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 약 5 × 109개 내지 약 6 × 109개, 약 6 × 109개 내지 약 7 × 109개, 약 7 × 109개 내지 약 8 × 109개, 약 8 × 109개 내지 약 9 × 109개, 약 9 × 109개 내지 약 10 × 109개, 약 10 × 109개 내지 약 11 × 109개, 약 11 × 109개 내지 약 15 × 109개, 약 15 × 109개 내지 약 20 × 109개, 약 20 × 109개 내지 약 25 × 109개, 약 25 × 109개 내지 약 30 × 109개, 약 30 × 109개 내지 약 50 × 109개, 또는 약 50 × 109개 내지 약 100 × 109개의 형질도입 단위/mL 중 임의의 수의 형질도입 단위/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 약 5 × 109개 내지 약 10 × 109개, 약 10 × 109개 내지 약 15 × 109개, 약 15 × 109개 내지 약 25 × 109개, 또는 약 25 × 109개 내지 약 50 × 109개의 형질도입 단위/mL 중 임의의 수의 형질도입 단위/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1010개, 적어도 약 6 × 1010개, 적어도 약 7 × 1010개, 적어도 약 8 × 1010개, 적어도 약 9 × 1010개, 적어도 약 10 × 1010개, 적어도 약 11 × 1010개, 적어도 약 15 × 1010개, 적어도 약 20 × 1010개, 적어도 약 25 × 1010개, 적어도 약 30 × 1010개, 적어도 약 40 × 1010개, 또는 적어도 약 50 × 1010개의 감염 단위/mL 중 임의의 수의 감염 단위/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1010개 내지 적어도 약 6 × 1010개, 적어도 약 6 × 1010개 내지 적어도 약 7 × 1010개, 적어도 약 7 × 1010개 내지 적어도 약 8 × 1010개, 적어도 약 8 × 1010개 내지 적어도 약 9 × 1010개, 적어도 약 9 × 1010개 내지 적어도 약 10 × 1010개, 적어도 약 10 × 1010개 내지 적어도 약 11 × 1010개, 적어도 약 11 × 1010개 내지 적어도 약 15 × 1010개, 적어도 약 15 × 1010개 내지 적어도 약 20 × 1010개, 적어도 약 20 × 1010개 내지 적어도 약 25 × 1010개, 적어도 약 25 × 1010개 내지 적어도 약 30 × 1010개, 적어도 약 30 × 1010개 내지 적어도 약 40 × 1010개, 적어도 약 40 × 1010개 내지 적어도 약 50 × 1010개, 또는 적어도 약 50 × 1010개 내지 적어도 약 100 × 1010개의 감염 단위/mL 중 임의의 수의 감염 단위/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1010개 내지 적어도 약 10 × 1010개, 적어도 약 10 × 1010개 내지 적어도 약 15 × 1010개, 적어도 약 15 × 1010개 내지 적어도 약 25 × 1010개, 또는 적어도 약 25 × 1010개 내지 적어도 약 50 × 1010개의 감염 단위/mL 중 임의의 수의 감염 단위/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 rAAV 입자이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 XL32 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 XL32.1 캡시드를 포함한다.
일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 용량은 체중 1 kg당 적어도 약 1 × 108개 내지 약 6 × 1013개의 게놈 복사본이다. 일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 용량은 체중 1 kg당 약 1 × 108개 내지 약 6 × 1013개의 게놈 복사본이다. 일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 용량은 1 × 1010, 2 × 1010, 3 × 1010, 4 × 1010, 5 × 1010, 6 × 1010, 7 × 1010, 8 × 1010, 9 × 1010, 1 × 1011, 2 × 1011, 3 × 1011, 4 × 1011, 5 × 1011, 6 × 1011, 7 × 1011, 8 × 1011, 9 × 1011, 1 × 1012, 2 × 1012, 13× 1012, 4 × 1012, 5 × 1012, 6 × 1012, 7 × 1012, 8 × 1012, 9 × 1012, 또는 1 × 1013의 게놈 복사본/체중 kg 중 대략 어느 하나이다.
일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 총량은 적어도 약 1 × 109개 내지 약 1 × 1014개의 게놈 복사본이다. 일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 총량은 약 1 × 109개 내지 약 1 × 1014개의 게놈 복사본이다. 일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 총량은 1 × 1011, 2 × 1011, 3 × 1011, 4 × 1011, 5 × 1011, 6 × 1011, 7 × 1011, 8 × 1011, 9 × 1011, 1 × 1012, 2 × 1012, 3 × 1012, 4 × 1012, 5 × 1012, 6 × 1012, 7 × 1012, 8 × 1012, 9 × 1012, 1 × 1013, 2 × 1013, 13× 1013, 4 × 1013, 5 × 1013, 6 × 1013, 7 × 1013, 8 × 1013, 9 × 1013, 또는 1 × 1014의 게놈 복사본 중 대략 어느 하나이다.
본 발명의 조성물(예를 들어, 본 발명의 PAH 폴리펩티드를 암호화하는 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 입자)는 단독으로 사용되거나, PKU 치료용 하나 이상의 추가 치료제와 병용하여 사용될 수 있다. 순차적 투여의 간격은 수분, 수시간, 또는 수일 이상(또는 대안적으로, 미만)의 단위일 수 있다.
rAAV(일부 구현예에서는 입자 형태)의 유효량은 치료 목적에 따라 투여된다. 예를 들어, 낮은 백분율의 형질도입이 원하는 치료 효과를 달성할 수 있는 경우, 치료의 목적은 일반적으로 이러한 수준의 형질도입을 충족시키거나 초과하는 것이다. 일부 경우에, 이러한 수준의 형질도입은 표적 세포의 약 1 내지 5%만을, 일부 구현예에서는 원하는 조직 유형의 세포의 적어도 약 20% 이상을, 일부 구현예에서는 적어도 약 50% 이상을, 일부 구현예에서는 적어도 약 80% 이상을, 일부 구현예에서는 적어도 약 95% 이상을, 일부 구현예에서는 원하는 조직 유형의 세포의 적어도 약 99% 이상을 형질도입하여 달성될 수 있다. rAAV 조성물은 동일한 절차 동안, 또는 수일, 수주, 수개월, 또는 수년의 간격으로, 1회 이상의 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 포유류(예컨대, 인간)를 치료하기 위해 다중 벡터가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 rAAV 조성물은 인간에게 투여하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 rAAV 조성물은 소아 투여를 위해 사용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, PKU의 많은 증상은 본질적으로 발달증상(예를 들어, 중증 정신 장애)이므로, 가능한 한 어릴 때 PKU를 치료하는 것이 특히 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV(일부 구현예에서는 입자 형태)의 유효량은 1개월 미만, 2개월 미만, 3개월 미만, 4개월 미만, 5개월 미만, 6개월 미만, 7개월 미만, 8개월 미만, 9개월 미만, 10개월 미만, 11개월 미만, 1년 미만, 13개월 미만, 14개월 미만, 15개월 미만, 16개월 미만, 17개월 미만, 18개월 미만, 19개월 미만, 20개월 미만, 21개월 미만, 22개월 미만, 2세 미만, 또는 3세 미만 연령의 환자에 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 rAAV 조성물은 청소년에게 투여하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV(일부 구현예에서는 입자 형태)의 유효량은 12세 미만, 13세 미만, 14세 미만, 15세 미만, 16세 미만, 17세 미만, 18세 미만, 19세 미만, 20세 미만, 21세 미만, 22세 미만, 23세 미만, 24세 미만, 또는 25세 미만 연령의 환자에게 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드(예를 들어, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드)를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하는 세포의 유효량을 투여하여 PKU를 치료하는 방법을 제공한다. PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하는 세포는 특정 관심 조직에 투여되거나 전신에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하는 세포의 유효량은 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여 경로는 정맥내, 복강내, 골내, 동맥내, 뇌내, 근육내, 척수강내, 피하, 뇌실내, 간내 등을 제한없이 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 캡슐화되거나 장치에 포함된다. 일부 구현예에서, 간 외부에서 세포를 발현하는 PAH는 외인성 추가 또는 공동발현 보조인자 BH4를 필요로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 캡슐화되거나, BH4를 추가로 포함하는 장치에 포함된다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하는 세포의 유효량은 하나의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량은 2개 이상의 투여 경로의 조합을 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량은 하나의 부위에 투여된다. 다른 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트의 유효량은 2개 이상의 부위에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하는 세포는 간세포, 근세포, 섬유아세포, 내피세포, 상피세포, 혈액세포, 골수세포, 줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 외인성 추가 보조인자 BH4 및/또는 공동발현 보조인자 BH4를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주(예컨대, CHO 세포주, HeLa 세포주 등)이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 PAH 폴리펩티드를 생성하기 위한 조건 하에 PAH 폴리펩티드를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, PAH 폴리펩티드(예를 들어, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드)를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 생성하는 방법은 PAH 폴리펩티드를 정제하는 하나 이상의 단계를 추가로 포함한다.
키트 또는 제조 물품
발현 카세트(예를 들어, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드와 같은 PAH 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 카세트), rAAV 벡터, 입자, 및/또는 본원에 기재된 약제학적 조성물은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법들 중 하나에 사용하기 위해 설계된 키트 또는 제조 물품 내에 함유될 수 있다.
일반적으로, 이러한 시스템은 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 캐뉼라, 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 이상)의 주사기, 및 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 이상)의 유체를 포함한다.
주사기는 유체 전달용 캐뉼라에 연결될 수 있다면 임의의 적합한 주사기일 수 있다. 일부 구현예에서, 시스템은 하나의 주사기를 갖는다. 일부 구현예에서, 시스템은 2개의 주사기를 갖는다. 일부 구현예에서, 시스템은 3개의 주사기를 갖는다. 일부 구현예에서, 시스템은 4개 이상의 주사기를 갖는다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 유체는 본원에 기재된 것들, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 벡터의 유효량을 각각 포함하는 하나 이상의 유체, 및 하나 이상의 치료제를 포함하는 하나 이상의 유체를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 단일 유체(유효량의 벡터를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 유체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 2개의 유체를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 3개의 유체를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 4개 이상의 유체를 포함한다. 유체는 본 개시내용의 PAH 폴리펩티드 또는 rAAV 벡터 조성물을 발현하기 위한 발현 카세트의 전달, 희석, 안정화, 완충, 또는 그 외 수송에 적합한 희석제, 완충제, 부형제, 또는 본원에 기재되거나 당업계에 알려진 임의의 다른 액체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 하나 이상의 완충제, 예를 들어 수성 pH 완충 용액을 포함한다. 완충제의 예는 포스페이트, 시트레이트, Tris, HEPES, 및 기타 유기산 완충제를 제한없이 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 용기를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 바이알, 백, 주사기, 및 병을 포함할 수 있다. 용기는 유리, 금속, 또는 플라스틱과 같은 하나 이상의 재질로 만들어질 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 본 발명의 rAAV 조성물을 수용하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 용기는 유체 및/또는 다른 치료제를 수용할 수도 있다.
일부 구현예에서, 키트는 본 발명의 rAAV 조성물과 함께 추가 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물과 추가 치료제는 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물과 추가 치료제는 분리 보관될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물과 추가 치료제는 동일한 용기에 수용될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물과 추가 치료제는 서로 다른 용기에 수용될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물과 추가 치료제는 동시에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물과 추가 치료제는 같은 날에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물은 추가 치료제의 투여 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 2주, 3주, 4주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월 내에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 AAV 투여 전에 면역계를 일시적으로 억제하는 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 AAV 입자에 대한 T 세포 반응을 저해하기 위해서 바이러스 주사 직전 및 직후 일시적으로 면역 억제된다(예를 들어, Ferreira et al., Hum. Gene Ther. 25:180-188, 2014 참조). 일부 구현예에서, 키트는 시클로스포린, 미코페놀레이트 모페틸, 및/또는 메틸프레드니솔론을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명의 rAAV 입자 및/또는 조성물은 사용 설명서를 포함하는 키트로 패키징될 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 rAAV 입자 조성물의 전달(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 유형의 비경구 투여)을 위한 장치를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 사용 설명서는 본원에 기재된 방법 중 하나에 따른 지침을 포함한다. 일부 구현예에서, 지침은 용기와 함께 제공되는(예를 들어, 용기에 부착되는) 라벨에 인쇄된다. 일부 구현예에서, 사용 설명서는, 예를 들어 개체에서 PKU를 치료하기 위한, rAAV 입자의 유효량을 개체(예컨대, 인간)에게 투여하기 위한 지침을 포함한다.
예시적인 구현예
구현예 1. rAAV 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자로서, 상기 rAAV 벡터는 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하며, 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자 및 인핸서를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(pPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하며, AAV 바이러스 입자는 AAV-XL32 또는 AAV-XL32 1 캡시드를 포함하는, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, mTTR 프로모터가 mTTR482 프로모터인, rAAV 입자.
구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 인핸서가 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있는, rAAV 입자.
구현예 4. rAAV 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자로서, 상기 rAAV 벡터는 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하며, 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자 및 3’-요소를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하며, 3’ 요소는 알부민 3’ 요소(3’Alb) 또는 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3’ 요소(3’AlbSMAR)이며, 여기서 이식유전자는 PAH 폴리펩티드를 암호화하며; 여기서 AAV 바이러스 입자는 AAV-XL32 또는 AAV-XL32.1 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
구현예 5. 구현예 4에 있어서, mTTR 프로모터가 mTTR482 프로모터인, rAAV 입자.
구현예 6. 구현예 4 또는 5에 있어서, 3' 요소가 이식유전자에 대해 3'에 위치하는, rAAV 입자.
구현예 7. rAAV 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자, 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 상기 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자 및 인핸서 및 3' 요소를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(pPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하고, 상기 3' 요소는 알부민 3' 요소(3' Alb)이거나 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3' 요소(3' AlbSMAR)이며, 상기 이식유전자는 PAH 폴리펩티드를 암호화하고, 상기 AAV 바이러스 입자는 AAV-XL32 또는 AAV-XL32.1 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
구현예 8. 구현예 7에 있어서, mTTR 프로모터가 mTTR482 프로모터인, rAAV 입자.
구현예 9. 구현예 7 또는 8에 있어서, 인핸서가 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있는, rAAV 입자.
구현예 10. 구현예 7 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 3' 요소가 이식유전자에 대해 3'에 위치하는, rAAV 입자.
구현예 11. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 발현 카세트는 인트론을 추가로 포함하는, rAAV 입자.
구현예 12. 구현예 11에 있어서, 인트론이 닭 β-액틴/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론인, rAAV 입자.
구현예 13. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는, rAAV 입자.
구현예 14. 구현예 13에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, rAAV 입자.
구현예 15. 구현예 1 내지 14 중 어느 한 구현예에 있어서, PAH 폴리펩티드는 야생형 PAH 폴리펩티드인, rAAV 입자.
구현예 16. 구현예 1 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, PAH 폴리펩티드는 인간 PAH 폴리펩티드인, rAAV 입자.
구현예 17. 구현예 1 내지 16 중 어느 한 구현예에 있어서, PAH 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, rAAV 입자.
구현예 18. 구현예 1 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 이식유전자는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 80% 동일한, rAAV 입자.
구현예 19. 구현예 1 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 플랭킹된 발현 카세트를 포함하는, rAAV 입자.
구현예 20. 구현예 19에 있어서, 구현예 1 내지 18 중 어느 한 구현예의 발현 카세트가 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹된, rAAV 입자.
구현예 21. 구현예 19 또는 20에 있어서, AAV ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, rAAV 입자.
구현예 22. 구현예 19 내지 21 중 어느 한 구현예에 있어서, AAV ITR이 AAV2 ITR인, rAAV 입자.
구현예 23. 구현예 19 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 자기-상보성 벡터인, rAAV 입자.
구현예 24. 구현예 23에 있어서, PAH 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산 서열 및 PAH 폴리펩티드의 보체를 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고, 제1 핵산 서열은 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, rAAV 입자.
구현예 25. 구현예 24에 있어서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열이 돌연변이 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함하는, rAAV 입자.
구현예 26. rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자로서, 상기 rAAV 벡터가 5’ 내지 3’에 AAV2 ITR, 변형된 알파1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터, 닭 β-액틴/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론, 코돈-최적화된 인간 PAH 유전자, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, 알파-1-항트립신 유전자로부터 유래된 스터퍼 단편 및 AAV2 ITR을 포함하는, rAAV 입자.
구현예 27. 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예에 있어서, AAV 캡시드가 AAV-XL32 캡시드인, rAAV 입자.
구현예 28. 구현예 27에 있어서, AAV-XL32 캡시드는 서열번호 3과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV-XL32 캡시드 단백질을 포함하는, rAAV 입자.
구현예 29. 구현예 28에 있어서, AAV-XL32 캡시드는 VP1, VP2, 및 VP3을 포함하며, 여기서 VP1, VP2, 및 VP3은 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화되는, rAAV 입자.
구현예 30. 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예에 있어서, AAV 캡시드가 AAV-XL32.1 캡시드인, rAAV 입자.
구현예 31. 구현예 30에 있어서, AAV-XL32.1 캡시드는 서열번호 3과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 입자.
구현예 32. 구현예 30에 있어서, AAV-XL32.1 캡시드는 VP1, VP2, 및 VP3을 포함하며, 여기서 VP1, VP2, 및 VP3은 서열번호 6의 핵산 서열에 의해 암호화되는, rAAV 입자.
구현예 33. 구현예 1 내지 32 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자를 포함하는 조성물.
구현예 34. 구현예 33에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물.
구현예 35. 구현예 1 내지 32 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자를 포함하는 세포.
구현예 36. PAH 폴리펩티드의 제조 방법으로서, PAH 폴리펩티드를 생성하는 조건에서 구현예 35의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 37. 구현예 36에 있어서, PAH 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 38. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 37 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 39. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 33 또는 34의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 40. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 35의 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 41. 구현예 38 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 개체는 PAH 활성이 부족한, 방법.
구현예 42. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 1 내지 32 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 43. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 33 또는 34의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 44. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 35의 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 45. 구현예 42 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서, 치료 전 개체의 혈중 페닐알라닌 수치는 연령대가 유사한 대조군 개체의 혈중 페닐알라닌 수치에 비해 높은, 방법.
구현예 46. 구현예 38 내지 45 중 어느 한 구현예에 있어서, rAAV 입자, 조성물, 또는 세포는 정맥내, 동맥내, 간내, 간문맥내, 복강내, 또는 피하 투여되는, 방법.
구현예 47. 구현예 38 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, 투여는 다른 요법과 병용되는, 방법.
구현예 48. 구현예 47에 있어서, 다른 요법은 테트라하이드로비옵테린을 사용한 치료, 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 또는 페길화 PAL을 사용한 치료, 또는 페닐알라닌 제한 식이요법인, 방법.
구현예 49. 구현예 1 내지 32 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자, 구현예 33 또는 34의 조성물, 또는 구현예 35의 세포를 포함하는 키트.
구현예 50. 구현예 49에 있어서, 사용 설명서; 완충제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 부형제; 및/또는 병, 바이알, 및/또는 주사기를 추가로 포함하는 키트.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 완전히 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시를 위한 것이며, 이러한 관점에서 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이고 본 출원의 사상 및 범주와 첨부된 구현예의 범위 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다.
실시예 1. PAH 암호화 서열의 시험관내 평가
하기 예는 인간 PAH를 암호화하는 벡터의 생성을 설명한다. 구체적으로, E183G 아미노산 치환을 갖거나, 갖지 않는 야생형 및 변이 PAH 대립유전자를 벡터로 클로닝하고, 간 세포내 PAH 발현 및 활성을 측정하였다.
재료 및 방법
PAH 암호화 서열
E183G 아미노산 치환을 갖거나 갖지 않는 야생형 또는 변이 1 PAH를 암호화하는 인간 PAH cDNA는 하기 표 1에 요약되어 있다. PAH의 "변이체 1" 대립유전자는 국제 본원에 참조로 포함된 공개 번호 WO 2020077250A1에 기재된 바와 같은, M180T, K199P, S250P 및 G256A 아미노산 치환을 갖는다.
GeneArt(GA) 코돈 최적화를 사용하여 PAH cDNA의 코돈 사용을 최적화했다.
[표 1]
Figure pct00001
플라스미드 벡터 및 재조합 AAV 생성
PAH 암호화 서열은 본원에 참조로 포함된 국제 공개 번호 WO 2020077250A1에 기재되어 표현되었다.
구체적으로, 간 프로모터 강도를 높이기 위해, 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터, 내인성 mTTR 인핸서, 및 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화(pA) 부위를 포함하는 플라스미드 mTTR482-HI-hFVIII-BGHpA에 변형을 도입하였다(Kyostio-Moore 2016, Nambiar 2017). 이 플라스미드에서, FVIII cDNA는 분비 배아 알칼리 포스파타제(SEAP)를 암호화하는 cDNA로 대체되었고, 기존 인트론은 1069 bp의 닭 b-액틴(CBA)/토끼 베타-글로빈 하이브리드 인트론으로 대체되었다. 변형된 알파1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2)(McEachern 2006, Jacobs 2008)의 2개 복사본이 mTTR482 인핸서의 업스트림에 클로닝되어, mA1MB2-mTTR482 프로모터를 생성하였다.
잘못된 번역 시작을 줄이기 위해 5개의 기존 ATG 서열을 제거하도록 변경된, 닭 베타-액틴/토끼 베타-글로빈 인트론으로 형성된 하이브리드 인트론을 사용하였다(HI2라고도 함).
모든 벡터는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위(BGHpA)를 함유하였다.
마지막으로, 알파-항트립신 유전자 인트론 서열(SerpinA1= A1AT) 염색체 14 NG_008290.1; nt13638-17363)로 이루어진 필러 서열("스터퍼")은 BGHpA와 ITR 부위 사이에 포함되어, 총 벡터 게놈 크기가 4.6 kb가 되었다. 스터퍼 서열의 7개 ATG 부위를 TTG로 변경시켜, 잠재적인 번역 시작 부위를 제거하였다.
간 프로모터, 하이브리드 인트론, PAH cDNA 및 BGHpA를 갖는 7개의 AAV2 ITR 함유 플라스미드를 rAAV 벡터 생성에 사용하였다. AAVXL32 혈청형 캡시드가 있는 rAAV 벡터는 삼중 형질감염 방법에 이어 CsCl 정제(SabTech) 또는 컬럼 정제(Sanofi Vector Core)를 사용하여 생성되었다. BGHpA에 대한 qPCR(Nambiar 2017)로 벡터 로트를 정량화하였다.
시험관내 배양
모든 조직 배양 시약은 Irvine Scientific(Santa Ana, CA) 또는 Invitrogen에서 입수하였다. 일시적 형질감염을 위해, 고농도 포도당, 10% 소태아 혈청(FBS), 및 10 ml/L의 Pen Strep(10 단위/ml의 페니실린 및 10 μg/ml의 스트렙토마이신)이 함유된 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)의 6-웰 디시에 인간 293 또는 인간 간 암종 세포(Huh7 또는 HepG2)(8 × 105개 세포/웰)를 플레이팅하였다. 플라스미드(2 μg)를 Lipofectamine 2000(Invitrogen)으로 형질감염시켰다. PAH 분석 또는 SEAP 활성을 위해 각각 48시간 또는 72시간 후에 세포 용해물 또는 배양 배지를 채취하였다.
활성 분석 및 단백질 검출
PAH 활성을 측정하기 위해, 용해 완충액 또는 RIPA 완충액에 세포를 용해하여 48시간 후에 전체 세포 용해물을 생성하였다. 추가적으로, 일부 실험에서는 세포 용해를 향상시키기 위해 초음파 또는 전단 처리를 사용하였다. 해동 후, 분석 전에 용해물을 14,000 g로 30분 동안 원심분리하였다. 약간의 수정을 가하여 이전에 문헌[Yew et al. 2013]에 기재된 바와 같이 PAH 단백질의 효소 활성을 측정하였다. 이전에 기술된 바와 같이(Heintz 2012), 13C-표지된 Phe를 사용하여 활성도 측정하였다.
PAH 검출을 위한 웨스턴 블롯팅은 표준 프로토콜에 따라 항-hPAH 항체(LS-C344145; LSBio)를 사용하여 수행되었다. 생체내 샘플을 BCA 단백질 분석 키트(Pierce)로 측정된 총 단백질 함량으로 정규화하였다. 키트 표준 또는 자체 정제된 3xFLAG-mPAH-FL을 단백질 표준으로 사용하여 제조업체의 지침에 따라 FLAG ELISA(SE002-flag; ABSbio)에 의한 FLAG-PAH 단백질 수치의 정량화 측정을 수행하였다.
결과
mA1MB2-mTTR482의 제어 하에 PAH를 암호화하는 4개의 벡터가 생성되었다. 구체적으로, hPAH/183G, hPAH-V1/G, hPAH-V1/E 및 야생형 PAH("hPAH/E")를 발현시키고, Huh7 세포내 PAH 활성(도 1a) 및 단백질 수준(도 1b, 1c)을 시험하였다.
야생형 PAH는 도 1a에 도시된 바와 같이, 최고 수준의 PAH 활성을 입증하였다. hPAH/G 돌연변이 암호화 서열의 경우, 변이체 1의 4개 아미노산 치환을 추가하면 활성과 단백질 생산이 10배 향상되었다. 변이체 1의 4개 아미노산 치환을 야생형 PAH 암호화 서열에 통합하면, PAH 활성을 증가시키지 않았지만 PAH 단백질 수준을 2배 증가시켰다(도 1b, 1c).
이러한 결과에 기초하여, Pah-KO 마우스에서의 생체내 효능 연구를 위한 이식유전자로서 야생형 PAH를 선택하였다.
실시예 2. 비인간 영장류 간에서 캡시드, 리드 간 프로모터 및 용량-반응성의 평가
다음 실시예는 간 세포를 형질도입하는 다양한 AAV 캡시드 단백질의 능력을 평가하는 실험을 설명한다. 또한, 비인간 영장류(NHP)에서 이식유전자 발현을 촉진하는 mA1M2-mTTR482 프로모터의 능력을 시험하였고, NHP에 대한 XL32.1/mA1MB2-mTTR482-EGFP 벡터의 투여를 평가하기 위해 용량-반응 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
AAV 캡시드 단백질
Huh7 세포 및 비인간 영장류(NHP) 간을 형질도입하는 능력에 대해 다양한 AAV 캡시드 단백질을 시험하였다. 구체적으로, XL32, LK03(Lisowski L et al., Nature, 2014, 506:382-6), DJ (Grimm D, et al. J Virol 2008, 82:5887-5911), AAV8, 및 XL14 캡시드 단백질을 Huh7 세포 및 NHP에서의 초기 실험에서 시험하였다(도 2a-2d). NHP에서의 후속 용량-반응 실험에서, XL32.1 캡시드 단백질을 사용하였다(도 3a-3b, 4a-4c).
국제 공개 번호 WO 2019241324 A1에 기재된 바와 같이, XL32 및 XL32.1은 AAV 혈청형 1, 2, 3B, 4, 6, 7, 8, 및 9의 캡시드 유전자로 구성된 AAV 캡시드 유전자 셔플 라이브러리로부터 생성된 하이브리드 캡시드이다. XL32는 마우스 간에서의 농축으로 인해 라이브러리에서 선택하였다. 전형적인 VP1, VP2 및 VP3 단백질 생성물에 더하여, XL32는 또한 XL32 암호화 서열 내의 약한 비-ATG 시작 코돈으로 인해 생성되는 것으로 생각되는 네 번째 단백질 생성물("VPX"라고 함)을 생성했다. 구체적으로, XL32는 VP1 시작 코돈으로부터 카운팅하는 뉴클레오티드 219에 C에서 G로의 돌연변이를 가졌다. XL32.1은 야생형 AAV7 및 AAV8 서열과 일치하도록, C에서 G로의 돌연변이를 다시 원래의 C로 되돌리기 위한 부위-지정 돌연변이유발에 의해 XL32로부터 유래되었다. 국제 공개 번호 WO 2019241324 A1에 따르면, XL32.1은 벡터 수율과 감염성에서 뚜렷한 차이를 나타내지 않았다. XL32 및 XL32.1의 아미노산 서열은 하기 표 2에 제공된다.
[표 2]
Figure pct00002
비인간 영장류(NHP) 연구
모든 연구는 2세 내지 3세(3 내지 4kg)의 수컷 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis), 아시아 기원)를 사용하였다. 벡터 투여 전에 벡터 캡시드에 대한 중화 항체에 대해 동물을 스크리닝하였다. 선택된 동물은 주입 펌프를 사용하여 복재 정맥으로 천천히 정맥 주입(1 ml/분)하여 벡터를 받았다. 혈액 샘플은 다양한 시간에 수집하였다. 부검 시, 벡터 생체분포 분석을 위해 간 및 기타 여러 기관의 샘플을 수집했다.
벡터 검출을 위해, 1.4 mm 세라믹 비드 및 Omni Ruptor-24를 사용하여 각 조직으로부터 총 조직 DNA를 단리한 후, 프로테이나제 K 소화 및 페놀/클로로포름 추출을 수행하였다. DNA를 이소프로필 알코올로 침전시키고, 회전시키고 Tris-EDTA에 재현탁시켰다. DNA를 정량화하고, 벡터 유래 DNA의 수준을 각 VG에 존재하는 BGHpA 서열에 대한 특정 프라이머를 사용하여 qPCR로 측정했다(Kyostio-Moore et al. 2016). VG의 수준은 세포당 복사본으로 표현되었다(이배체 세포 게놈당 5 pg dsDNA 사용).
총 EGFP 단백질 측정을 위한 균질액은 프로테아제 억제제(Roche)가 첨가된 ELISA 키트 추출 버퍼 PRT(Abcam GFP ELISA 키트; ab171581)에서 옴니 비드 비터(Omni bead beater)를 사용하여 생성되었다. 원심분리 후, 상청액을 회수하고 키트 추출 버퍼 PRT로 희석하고 EGFP 단백질 수준을 제조업체의 지침에 따라 ELISA로 정량화했다. 모든 값들은 ng EGFP/mg 총 단백질로 표현되었다. 총 단백질은 BCA 분석으로 측정하였다.
벡터 유래 전사체 정량화를 위해, 1.4 mm 세라믹 비드 및 1 mL Trizol(Thermofisher, A33250)을 함유하는 2 ml 튜브에서 옴니 비드 비터를 사용하여 간 및 비장 균질액을 생성하였다. 클로로포름을 첨가하고, 혼합한 다음, 수성상을 SV 총 RNA 키트인 Promega Z3100의 컬럼으로 옮겼다. 컬럼 상에서 DNase 처리를 수행하고, 컬럼을 세척한 후 RNA를 물에 용출하였다. Nanodrop 8000을 사용하여 총 RNA를 정량화했다. 고용량 cDNA RT 키트(Thermofisher, 4368814)를 사용하여 무작위 프라이머로 cDNA를 생성하였다. 벡터 유래 mRNA의 수준은 BGHpA 서열에 대한 특정 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 측정되었다. 전사체의 수준은 세포당 복사본(이배체 세포 게놈당 5 pg dsDNA 사용) 또는 μg RNA당으로 표현되었다.
중성 완충 포르말린-고정 파라핀 포매 블록으로부터 절단한 4 μM 절편으로 간에 대한 면역조직화학 및 제자리 혼성화 분석을 수행하였다. 자동화된 형광 제자리 혼성화(RNAscope) 및 IHC의 경우, 모든 단계를 Leica Bond RX 기기(Leica Bios, systems Inc., Buffalo Grove, IL)에서 수행하였다. RNAscope 2.5 LS Multiplex Fluorescent 분석법(Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA)으로 시작하여 IHC가 뒤따르는 순차적인 이중 염색 모드를 활용했다. 간단히 말해, 굽지 않은 파라핀 절편을 60℃에서 30분 동안 굽고 60℃에서 파라핀을 제거한 다음, 음성 프로브의 혼성화 전에 표적 검색을 위한 Bond ER 솔루션 2, 프로테아제 및 과산화수소, DapB(cat#320878, Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA), 양성 프로브, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) PPIB(cat#320908), 또는 표적 프로브, eGFP(cat#400288, Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA)로 42℃에서 2시간 동안 전처리하였다. 예비증폭제와 증폭제를 연속적으로 혼성화한 다음 슬라이드를 1:1500으로 희석한 OPAL690(cat#FP1497001KT, Akoya Biosciences, Marlborough, Ma)과 함께 인큐베이션하였다. HRP 차단제를 가하고, 자동 프로토콜의 IHC 부분에 앞서 Bond ER 솔루션 1을 사용하여 절편을 표적 검색에 적용했다. 슬라이드를 항체 희석제/차단제(Akoya Biosciences, Marlborough, Ma)로 차단한 다음, 토끼 IgG 이소형 대조군(cat#AB105-C, R&D Systems, Minneapolis, MN) 또는 토끼 항-GFP와 함께 인큐베이션하고, 실온에서 30분 동안 1 μg/mL(cat#A11122, Invitrogen/ThermoFisher, Waltham, MA)로 사용하였다. 2차 항체인, 항-토끼 폴리머 HRP(cat#PV6119, Leica Biosystems Inc., Buffalo Grove, IL)를 가하고, 1:150으로 희석한 OPAL570(cat#FP1488001KT, Akoya Biosciences, Marlborough, Ma)로 검출을 달성했다. 세포를 Spectral DAPI(Akoya Biosciences, Marlborough, MA)로 대조염색했다. 20X 이미지는 Zeiss AxioScan Z1로 획득했다. 20x 이미지는 HALO(Indica labs) 이미지 분석 소프트웨어로 가져오고, FISH-IF v1.1.3 이미징 모듈을 사용하여 분석하였다.
XL32 및 XL32.1 캡시드 단백질의 비교
mA1M2-mTTR482 프로모터를 사용하여 hPAH-V1/G를 발현하는 벡터를 XL32 또는 XL32.1 캡시드에 패키징하고 NHP에 투여하였다. 5e12 vg/kg의 벡터를 IV 전달로 투여하고, qPCR에 의해 투여 2주 후에 간 및 다양한 다른 기관에서의 세포당 벡터 게놈 복사본 수를 측정하였다(도 5a). 또한, 간 내 벡터-유래 mRNA의 수준을 측정하였다(도 5b).
결과
초기 AAV 캡시드 연구
인간 유전자 전달에 대한 양호한 번역가능성을 제공할 PAH 유전자 전달을 위한 AAV 캡시드를 선택하기 위해, 각각이 CBA-EGFP 벡터 게놈을 함유하는 5개의 AAV 캡시드를 생성하였다. 벡터는 시험관 내에서 Huh7 세포에서의 다양한 수준의 EGFP 검출을 나타냈다(도 2a). 그런 다음, AAV 벡터를 정맥 내 경로로 NHP에 전달한 다음, 간 및 다양한 기관을 2주 후에 수집하였다. 간 샘플의 경우, VG는 3개의 다른 영역에서 오른쪽 중간 엽에서 측정되었으며, 각 샘플 내에서 비슷한 수준을 보여 엽 내에서 고른 분포를 나타냈다(데이터는 표시되지 않음). 엽 사이의 분포는 또한 오른쪽 및 왼쪽 중간 엽에서 VG를 정량화하여 평가되었으며, 두 엽에서 유사한 VG 복사본을 나타냈다(데이터는 표시되지 않음). 각 동물에 대한 간에서의 이들 4개 샘플의 평균은 도 2b에 도시되어 있다. 가장 높은 벡터 유전자 전달은 rAAV-XL32에서 관찰되었고, 그 다음으로 AAV-LK03, AAV8, rAAV-XL14가 관찰되었고, 가장 낮은 것은 rAAV-DJ에서 관찰되었으며, 최고 순위와 최저 순위 캡시드 벡터 간에 약 22배의 차이가 있었다. 각 캡시드 처리 그룹에서, 개별 동물의 VG 수준은 비슷했다. VG 복사본은 또한 비장(도 2b) 및 근육, 신장 및 심장(도 2c)에서 측정하였다. 다른 조직에서는 XL32에 대해 매우 적은 벡터 게놈이 관찰되었다. 요약하면, 전신 투여에 의해 전달된 XL32 캡시드 벡터는 간으로의 강력한 흡수를 제공하는 반면, 이 캡시드를 가진 벡터는 검사된 다른 기관에서 거의 검출되지 않았다(도 2d). 엽 내 그리고, 엽 사이의 EGFP 발현은 도 2e에 개시되어 있다.
NHP 용량 반응 연구
제2 NHP 연구에서, XL32.1/mA1MB2-mTTR482-EGFP에 의한 간 유전자 전달의 용량-반응성을 평가하였다. 벡터는 IV 경로로 전달되었고, 조직은 16일 후에 수집하였다. 간 분석을 위해, 2개의 간 샘플(우측 및 좌측 내엽에서 수집)은 유사한 VG 수준을 나타냈다(데이터는 표시되지 않음). 용량 코호트 @ 5e11, 2e12, 5e12 및 2e13 vg/kg은 각각 평균 0.9, 3.5, 8.8 및 7.3(M 및 F) 및 19.0 VG/세포를 가졌다(도 3a). 따라서, 용량-반응은 가장 높은 용량을 제외한 모든 용량에서 입증되었다. 2개의 가장 높은 용량 내에서, 이식유전자에 대한 면역 반응으로 인한 것일 수 있는 개별 동물 사이에 가변성이 있었다. 5e12 vg/kg 코호트에서 수컷 및 암컷 동물에 대해 유사한 벡터 게놈이 검출되었다(도 3a).
간 샘플에서 벡터 유래 eGFP mRNA 수준을 측정함으로써 벡터 프로모터 기능을 평가하였다. 전반적으로, 용량이 증가함에 따라 세포당 전사 수준이 증가하는 경향이 있었다(도 3b). 테스트된 가장 높은 용량(2e13 vg/kg)은 eGFP 단백질에 대한 면역 반응(및 낮은 VG 검출에 해당)으로 인해 낮은 mRNA를 초래했다.
간내 eGFP 단백질 수준을 측정하여 벡터 형질도입을 평가하였다. 데이터는 eGFP 단백질 수준에 대한 용량-반응을 나타내지 않았으며; 높은 eGFP 수준은 2개의 더 낮은 용량에서도 검출된 반면, 가장 높은 용량은 가장 낮은 eGFP 수준을 초래했다(도 3c). 그럼에도 불구하고, 간 VG와 벡터 유래 mRNA 복사본 사이에 양호한 상관관계가 있었다(r2=0.57)(도 3d). 양호한 상관관계(r2=0.85)는 또한 mRNA 복사본과 eGFP 단백질 수준 사이에서 관찰되었다(도 3e). 이것은 모든 벡터 게놈이 전사적으로 활성화된 것은 아니지만 일단 전사가 발생하면 eGFP 단백질 생산이 전사 수준에 정비례한다는 것을 시사할 수 있다.
간에서의 벡터 흡수 및 국소화는 벡터를 흡수한 % 간세포를 이해하기 위해 eGFP 프로브와의 혼성화에 의해 평가되었다. 이 프로브는 벡터 DNA와 mRNA를 모두 검출할 것으로 예상된다. 제자리 혼성화 이미지의 예가 도 4a에 도시되어 있다. 벡터 양성 간세포를 정량하여, 간에서의 벡터 양성 세포의 백분율을 추정하였다(도 4b). 데이터는 벡터 양성 세포가 벡터 용량에 따라 증가함을 입증했다. 5e12 vg/kg의 용량에서, 간 세포의 약 50~80%가 수컷 및 암컷 동물의 간에서 양성이었다. 간에서 양성 세포의 백분율과 평균 VG 복사본 수 사이에는 양호한 상관관계가 있었다(도 4c).
XL32 및 XL32.1 캡시드 단백질의 비교
NHP에서 XL32 및 XL32.1 캡시드 벡터의 생체분포를 비교하기 위한 실험을 수행하였다. 도 5a-5b에 도시된 바와 같이, XL32 및 XL32.1은 간에서 유사한 수준의 바이러스 게놈 및 벡터 유래 mRNA를 생성하였다.
실시예 3. Pah-KO 마우스에서 XL32.1/mA1MB2-mTTR482-WT PAH의 생체내 효능
다음 실시예는 Pah-KO 마우스에서 XL32.1/mA1MB2-mTTR482-WT PAH의 생체내 효능에 대한 연구를 설명한다.
재료 및 방법
PAH-KO 마우스에서 효능 시험
동형접합(HOM) 및 이형접합(HET) Pah-KO 수컷 마우스를 8~12주령에 입수하고, 동물 보호 및 사용에 관한 인도적 지침에 따라 수용하고 유지하였다. 모든 동물 절차는 Sanofi’s Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인을 받았다.
꼬리 정맥을 통해 정맥내 경로로 재조합 AAVXL32.1 벡터를 투여한다(6~10마리 동물/처치). 동물을 이소플루란 마취로 희생시킨다. 전혈을 안와채혈로 EDTA 수집 튜브에 수집하고, 원심분리하여 분석 전까지 냉동 보관한다. 일부 동물은 조직 수집 전에 좌심실을 통해 PBS로 관류시킨다. 간 샘플을 수집하여 분석 전까지 냉동시킨다. 뇌 분석을 위해, 두개골에서 전체 뇌를 채취하여, 무게를 재고, 시상으로 절단하여 분석 전까지 -80℃에서 냉동시킨다.
혈액 및 조직 분석
혈장 Phe 및 Tyr 수준은 UHPLC-MS/MS에 의해 분석한다. 뇌 신경전달물질 정량화를 위해, 약간의 수정을 가하여 문헌[Kankaanpaa 2001]에 기재된 바와 같이 뇌를 처리한다. 간 샘플의 경우, 벡터 게놈, PAH 활성, 및 단백질 수치를 정량화한다. qPCR(Martin 2013)로 벡터 게놈의 복사본을 정량화한다. 간 균질액의 PAH 단백질 활성은 위에서 설명한 대로 수행하고, 총 단백질로 정규화한다(BCA 단백질 분석 키트; Pierce).
결과
PKU 마우스 모델에서 효능에 대해 XL32.1/mA1MB2-mTTR482-WT PAH를 테스트하였다. PAH 단백질 생성이 없는 Pah-KO 모델을 사용한다. 벡터를 성체 마우스에 IV로 투여하고 처치 후 35일 또는 4개월 동안 효능을 평가한다.
혈액 및 뇌에서의 Phe 및 Tyr의 수준을 측정한다. 도파민과 세로토닌 수치를 뇌에서 측정한다. 마지막으로, 예를 들어 둥지 형성 분석에 의해 행동을 평가한다.
투여 4개월 후, 뇌 병리 및 백질 변화에 대한 심층 분석을 수행한다. 이들은 생체 내 MRI 및 말단 백질 염색에 의해 평가한다.
실시예 4. PAH-KO 마우스에서 XL32.1/mA1MB2-mTTR482-WT hPAH의 단기 생체내 효능
PKU 마우스 모델에서 5주 동안 XL32.1/mA1MB2-mTTR482-WT hPAH 벡터(XL32.1/WT hPAH로도 알려짐)를 생체 내에서 평가하였다. Pah 유전자가 간으로 전달된 후, 혈중 Phe 수치의 용량-의존적 감소와 혈중 Tyr의 증가가 관찰되었다. 이는 처치된 마우스의 간에서 벡터 게놈, 벡터 유래 mRNA 및 PAH 활성의 용량-의존적 검출과 상관관계가 있었다. Phe 저하제는 뇌 및 다양한 신경전달물질 수준으로의 아미노산 수송을 증가시켰다. 간에서 PAH 양성 세포 수준의 평가는 벡터 용량과 상관관계가 있는 증가하는 강도로 PAH 양성 간세포의 중심주위 검출을 입증했다. 요약하면, 본 작업은 WT hPAH를 암호화하는 최적화된 rAAVXL32.1 벡터가 PAH-KO 마우스 모델에서 PKU 관련 병리를 변형시켜 인간 PKU 치료에 사용하는 것을 지원함을 보여준다.
재료 및 방법
벡터 생성. 최적화된 간 프로모터 및 인트론(mA1MB2-mTTR482-HI2)으로부터 발현된 WT hPAH를 암호화하는 XL32.1 캡시드 벡터는 상기한 바와 같이 삼중 형질감염에 의해 생성되었다. 벡터를 친화도 컬럼에 이어 CsCl 구배로 정제하였다. 벡터를 qPCR 및 PAH 생산에 의해 적정하고, 동물 연구 전에 시험관 내에서 기능을 테스트하였다.
PAH-KO 마우스에서 효능 시험. C57BL/6 배경에서 생성된 Pah-KO 마우스의 군집을 Jackson 연구소에서 유지하였다(Singh et al, 2020; 제출됨). 일부 연구에서는 WT C57BL/6 마우스도 일반 대조군으로 사용했다. 동형접합(HOM) 및 이형접합(HET) 수컷 마우스를 8~12주령에 입수하고, 동물 보호 및 사용에 관한 인도적 지침에 따라 수용하고 유지하였다. 꼬리 정맥을 통해 정맥내 경로로 벡터를 투여하였다(6~10마리 동물/처치). 동물을 이소플루란 마취로 희생시켰다. 전혈을 안와채혈로 EDTA 수집 튜브에 수집하고, 원심분리하여 분석 전까지 냉동 보관하였다. 일부 동물은 조직 수집 전에 좌심실을 통해 PBS로 관류시켰다. 간 샘플을 수집하여 분석 전까지 냉동시켰다. 뇌 분석을 위해, 두개골에서 전체 뇌를 채취하여, 무게를 재고, 시상으로 절단하여 분석 전까지 -80℃에서 냉동시켰다.
혈액 및 조직 분석. 혈장 Phe 및 Tyr 수준은 Singh et al, 2021에 기재된 바와 같이, UHPLC-MS/MS에 의해 분석하였다. 뇌 신경전달물질 정량화를 위해, 약간의 수정을 가하여 문헌[Kankaanpaa 2001; Singh 2020]에 기재된 바와 같이 뇌를 처리하였다. 다양한 조직에서 qPCR로 벡터 게놈의 복사본을 정량화하였다(Martin 2013). 간 균질액에서의 PAH 단백질 활성 및 PAH 단백질 검출은 이전에 설명한 대로 수행하고(Heintz 2012, Nambiar 2017), 총 단백질로 정규화했다(BCA 단백질 분석 키트; Pierce).
동물 행동 분석. 약간의 수정을 가하여 이전에 공개된 대로 둥지 형성 분석을 수행하였다(Deacon 2006). 동물을 깨끗한 개별 케이지로 옮기고, 3.0 gm +/-0.02 제곱의 면화(Nestlet; cabfm00088, Ancare)를 제공했다. 사용하지 않은 침구는 다음날 무게를 재고, 둥지의 품질은 다음 평가 척도에 따라 두 사람이 점수를 매겼다: 1- 손대지 않은 네슬렛(Nestlet)(90% 이상 온전함), 2- 부분적으로 찢어진 네슬렛(50-90% 온전함), 3- 대부분 파쇄되었지만 식별 가능한 둥지 사이트가 없는 경우가 많은 네슬렛(50% 미만 온전함), 4- 식별할 수 있지만 평평한 둥지(네슬렛의 90% 이상이 찢어짐), 5- 크레이터와 높은 벽이 있는 완벽한 둥지(네슬렛의 90% 넘게 찢어짐).
그래프화 및 통계적 분석. 모든 데이터는 GraphPad Prism(버전 8.0.2) 또는 Excel(Microsoft)을 사용하여 그래프로 작성되었다. 통계적 분석은 Excel의 스튜던트 t-검정 또는 GraphPad Prism의 1-way ANOVA를 사용하여 수행하였다.
결과
XL32/WT hPAH 유전자를 Pah-KO 마우스로 전달한 후 혈중 Phe 및 Tyr 변형. PAH 단백질 생성이 없는 Pah-KO 모델을 사용하여, IV 전달 후 XL32/WT PAH 벡터의 효능을 테스트하고 효능을 36일 동안 평가하였다. 처치는 HET 및 WT 마우스에 비슷한 수준으로 용량-의존적 방식으로 혈중 Phe 수치를 감소시켰다(도 6a 및 6b). 처치는 또한 테스트된 모든 벡터 용량으로 얻은 정상적인 혈중 Tyr 수치로 혈중 Tyr 수치를 증가시켰다(도 6c 및 6d).
처치된 마우스의 간을 유전자 전달 효율 및 간 형질도입에 대해 평가하였다. 벡터 DNA는 1e11, 3e11 및 1e12 vg/마우스로 간에서 용량-의존적 방식으로 검출되어, 평균 0.2, 1.3 및 6.8 vg/세포가 되었다(도 7a). 벡터는 주로 간에서 검출되었으며, 테스트된 다른 조직(비장, 심장, 근육, 신장 및 폐)에서는 10배 이상 낮은 수준으로 측정되었다(도 7b). 용량 의존적 벡터 DNA 검출은 간에서 벡터 유래 PAH mRNA의 용량-의존적 증가로 번역되었다(도 7c 및 7d). 혈중 Phe 수치에 대한 vg 복사본/세포의 상관관계는 혈중 Phe 정상화에 최소 0.1 vg/세포가 필요함을 입증했다(도 7e). PAH 단백질의 기능은 간에서의 PAH 활성을 측정하여 테스트되었다. 저용량(1e11 vg/마우스)은 Het 마우스에서의 활성과 유사한 PAH 활성을 초래한 반면, 2개의 고용량은 Het 간에서 측정된 활성을 초과했다(도 8a). PAH 단백질 수준의 유사한 용량-반응 패턴이 또한 간 균질액의 웨스턴 블롯팅에 의해 관찰되었다(도 8b). 형질도입된 간세포의 위치를 이해하기 위해, 처치된 간도 면역조직화학(IHC)으로 평가했다. 증가하는 PAH 염색은 주로 중심주위인 형질도입 패턴으로 용량이 증가함에 따라 검출되었다(도 8c).
뇌 아미노산 및 신경전달물질 수준에 대한 XL32.1/WT hPAH의 효과. 아미노산 Phe, Tyr 및 Trp 수준은 뇌에서 측정되었다. 데이터는 처치 후 정상화 뇌 Phe 수치가 Hets 및 WT 마우스에서 측정된 것과 유사함에 따라 수치들이 정규화되었음을 입증했다. 혈중 Phe 감소는 또한 아미노산 Tyr 및 Trp가 동일한 아미노산 수송체를 공유하기 때문에 뇌로의 상기 아미노산 수송을 증가시켰다(도 9a).
신경전달물질인 도파민 및 세로토닌은 PKU 환자의 뇌에서 감소하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 신경전달물질 수준은 벡터 처리된 마우스의 뇌에서 정량화하였다. rAAVXL32.1/WT hPAH 벡터로 처리하면, 도파민, 노르에피네프린 및 세로토닌이 Het 및 WT 마우스에서 관찰되는 수준으로 정상화되었다(도 9b).
Pah-KO 마우스의 행동 분석. 동물 행동에 대한 뇌의 생화학적 변화의 효과를 평가하기 위해 네스팅 행동 분석을 수행하였다(도 10a 및 10b). 이 분석은 마우스가 둥지를 생성하는 능력을 측정한다. 그런 다음 사용된 네스팅 재료의 양과 네스트의 전반적인 품질을 기준으로 점수를 매긴다(도 10a). 처치 전, 처치되지 않은 모든 PKU 마우스는 Het 마우스에 의해 생성된 것과 비교하여 상당히 낮은 둥지 점수를 가졌다(도 10b). 그러나, 처치 36일 후, 처치된 마우스에서 점수가 상당히 개선되었다(도 10b). Het와 WT 마우스 사이의 네스팅 점수에는 차이가 관찰되지 않았다.
요약
우리의 데이터는 XL32.1 캡시드로 구성되고 최적화된 간 프로모터로부터 WT hPAH를 발현하는 rAAV 벡터가 5주 처치 후 인간 PKU의 마우스 모델에서 다중 PKU 관련 병리를 교정할 수 있음을 입증했다. 이 벡터의 전신 전달은 Pah-KO 마우스의 간에서 벡터, 벡터 유래 mRNA 및 PAH 활성의 용량-의존적 증가를 초래했다. 이것은 혈액 내 Phe 수치의 감소뿐만 아니라 Tyr 수치의 증가와 관련이 있었고, 이후에 모든 용량을 테스트한 뇌에서 증가했다. 혈액과 뇌 모두에서의 Phe의 감소는 또한 뇌의 신경전달물질인 도파민과 세로토닌 수치를 정규화했다. 이러한 생화학적 변화는 마우스의 행동 개선과 관련이 있다. 이 연구에서 사용된 5e12 vg/kg(1e11 vg/마우스)의 가장 낮은 용량은 평균 0.2 vg/세포의 벡터를 제공하여 Het 마우스에서 측정된 유사한 간 PAH 활성을 초래했다.
실시예 5. PAH-KO 마우스에서 XL32.1/mA1MB2-mTTR482-WT hPAH의 장기 생체내 효능
재료 및 방법
벡터 생성. WT hPAH를 암호화하는 XL32.1 캡시드 벡터는 변형된 A1MB2 인핸서(2개의 알파1-마이크로글로불린 복사본), 변형된 마우스 트랜스티레틴 코어 프로모터 및 원위 인핸서(mTTR482), 하이브리드 인트론 2(HI2, 닭 베타 액틴/토끼 베타 글로빈 하이브리드 인트론으로 구성된 인크론) 및 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 부위(BGH)(Nambiar 2017)(전체 게놈 명칭 ITR-/mA1M2-mTTR482-HI2-WT hPAH-BGHpA-스터퍼-ITR; XL32.1/WT hPAH로도 알려져 있음)를 갖는 간-특이적 발현 카세트를 함유하였다. LP1 간 프로모터를 갖는 2개의 추가 벡터가 또한 구성되었다; 한 벡터는 하이브리드 인트론 2(HI2)(A1MB2-mTTR482 작제물에 사용된 것과 동일) 또는 짧은 인트론(SI, Nathwani 2012)을 함유하였다. 모든 작제물의 크기는 스터퍼 서열(A1AT 인트론 서열)을 추가하여 야생형 AAV 게놈의 크기로 조정하였다. 모든 ITR 함유 플라스미드를 인간 간 세포주, Huh7 세포, PAH 웨스턴으로의 일시적 형질감염 및 이전에 기술된 바와 같이 수행된 활성과 함께 시험관 내에서 PAH 단백질 생산 및 활성에 대해 테스트하였다(Singh 2021). 모든 XL32.1 캡시드 벡터는 상기한 바와 같이 삼중 형질감염에 의해 생성되었다. 4개월 효능 연구를 위한 벡터는 친화도 컬럼에 이어 CsCl 구배로 정제되었다. 1개월 및 4개월 효능 연구를 위한 벡터는 친화도 컬럼에 이어 CsCl 구배로 정제되었다. BGHpA에 대한 qPCR로 모든 벡터 로트를 정량화하였다(Nambiar 2017).
4개월 동안의 PAH-KO 마우스에서의 효능 시험. 효능 시험을 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다. 모든 동물은 조직 수집 전에 좌심실을 통해 PBS로 관류시켰다.
혈액 및 조직 분석. 실시예 4에 기재된 바와 같이 혈액 및 조직 분석을 수행하였다. 간의 벡터 DNA 복사본은 간에서 qPCR로 정량화하였다(Nambiar 2017). 간 균질액에서의 PAH 단백질 활성 및 PAH 단백질 검출은 이전에 설명한 대로 수행하고(Heintz 2012, Nambiar 2017), 총 단백질로 정규화했다(BCA 단백질 분석 키트; Pierce). 포르말린 고정 파라핀 포매된 간은 Singh 2021에 설명된 대로 PAH IHC에 사용하였다. IHC 양성 세포 백분율의 디지털 정량화를 위해, VISIOPHARM 이미지 분석 소프트웨어(버전 2020.08)를 사용하여 IHC 슬라이드를 분석하고 전체 간 슬라이드 이미지에서 관심 영역(ROI)을 측정했다. PAH 염색 강도를 측정하고 각 세포를 PAH 양성 또는 음성으로 분류하기 위해 핵으로부터 3 μm의 둘레를 그렸다. 포르말린 고정 파라핀 포매된 간 절편은 Advanced Cell Diagnostics, Inc(ACD)의 BaseScopeTM Duplex Reagent Kit를 프로토콜에 따라 수동 모드로 사용하여 제자리 혼성화를 통해 선택 동물의 벡터 DNA 및 전사체를 검출하는 데에도 사용하였다. 전체 절편의 ISH 염색은 HALO ISH 이미지 분석 모듈(v4.1)을 사용하여 분석하였다. 정량된 종점은 벡터 DNA 및 mRNA 양성 세포의 %였다.
뇌 이미징. Singh 2021에 설명된 대로 다양한 시점에서 살아있는 동물의 뇌 백질 함량을 분석하였다. 뇌 주변의 관심 영역과 눈에 보이는 뇌량 구조는 뇌량 부피를 계산하기 위해 관상 절편에 걸쳐 그려졌다.
동물 행동 분석. 실시예 4에 기재된 바와 같이 동물 행동을 분석하였다.
그래프화 및 통계적 분석. 모든 데이터는 GraphPad Prism(버전 8.0.2) 또는 Excel(Microsoft)을 사용하여 그래프로 작성되었다. Tukey의 다중 비교를 사용하여 GraphPad Prism에서 1-way ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행했다.
결과
4개월 처치후 XL32.1/WT PAH 유전자 전달이 건강, 혈중 Phe 수치 및 간 PAH 교정에 미치는 영향
PAH 단백질 생성이 없는 Pah-KO 모델을 사용하여, IV 전달 후 XL32.1/WT PAH 벡터의 효능을 테스트하고 효능을 4개월 동안 평가하였다. 테스트한 벡터 용량은 1e11, 3e11 및 1e12 vg/마우스였으며, 이는 대략 5e12, 2e12 및 5e13 vg/kg으로 변환되었다. 4개월 연구 동안 성장을 모니터링하기 위해 연구 전반에 걸쳐 동물 체중을 평가하였다. 투여 8일 전에 동물의 체중을 측정하여 기준선 체중을 설정한 다음, 벡터 전달 후 120일째 연구 종료 시 체중을 측정했다(도 11a, 11b). XL32.1/WT PAH로 처치한 모든 Pah-KO 마우스는 체중이 평균 130~145% 증가했다. 처치는 또한 모든 처치 그룹에서 HET 및 WT 마우스의 간 중량에 도달하는 중량으로 PAH-KO 마우스의 간 중량을 증가시켰다(도 11c). 따라서, 간에서의 PAH의 발현은 처치된 마우스의 상당한 성장과 건강 개선을 제공했다.
간으로의 XL32.1/WT hPAH 벡터 전달은 혈중 Phe 수치를 감소시켰다(도 12a-12c). 데이터는 7일 Phe 수치가 337 ± 123 μM(1e11 vg/마우스), 94 ± 14 μM(3e11 vg/마우스) 및 70 ± 11 μM(1e12 vg/마우스)이었기 때문에, 나이브 Pah-KO 마우스(2742 ± 70 μM)와 비교하여 치료 코호트에서 혈중 Phe 수치의 급격한 감소를 입증하였다. 이들은 HET 및 WT 마우스의 Phe 수치(각각 84 ± 9 및 62 ± 5 μM)과 비슷했다(도 12b). 120일째에, 미처치된 Pah-KO의 혈중 Phe 수치는 2612 ± 71 μM이었고, 처치 코호트의 평균 Phe 수치는 1237 ± 483 μM(1e11 vg/마우스), 158 ± 32 μM(3e11 vg/마우스) 및 64 ± 5 μM(1e12 vg/마우스)이었다. 2개의 고용량 코호트에서의 Phe 수치는 HET(110 ± 13 μM) 및 WT(82 ± 3 μM) 마우스에서의 Phe 수치와 유의하게 다르지 않았다(도 12c). 따라서, 중간 및 고용량 벡터 코호트(3e11 및 1e12 vg/마우스)는 혈중 Phe 수치의 지속적인 정규화를 제공했다. 가장 낮은 용량(1e11 vg/마우스)은 6마리의 마우스 중 3마리가 정상 혈중 Phe 수치를 나타내는 변동성을 보여주었다. 나머지 3마리 동물은 초기에 혈중 Phe 수치가 감소했지만 그 효과는 지속되지 않았다.
처치된 마우스의 간을 유전자 전달 효율 및 간 형질도입에 대해 평가하였다. 벡터 DNA는 1e11, 3e11 및 1e12 vg/마우스 코호트로 간에서 용량-의존적 방식으로 검출되어, 평균 vg/세포 수준은 다음과 같다: 각각 0.042 vg/세포 ± 0.02, 0.321 vg/세포 ± 0.111 및 3.40 vg/세포 ± 0.49(도 13a). 간에서 벡터 유래 mRNA의 정량은 각 용량 코호트에서 각각 평균 2.1e6 ± 1.0e6, 9.0e6 ± 2.0e6 및 3.7e7 ± 0.6e7 mRNA 복사본/μg RNA로 입증되었다(도 13b). 이것은 각 용량에서 발현이 약 4배 증가한 것이다. 벡터 DNA 및 mRNA 수준(R2=0.90)과 양호한 상관관계가 있었다(도 13c). 혈중 Phe 수치에 대한 vg 복사본/세포의 상관관계는 혈중 Phe 정상화에 최소 0.1 vg/세포가 필요함을 입증했다(도 13d). 저용량 코호트에서 벡터 DNA 분석은 혈중 Phe 정규화를 가진 3마리의 동물이 0.1 vg/세포를 함유한 반면, 시간이 지남에 따라 증가된 Phe 수치를 가진 나머지 3마리의 동물은 0.1 vg/세포 미만을 가짐을 나타냈다. 벡터 흡수 및 유전자 발현은 또한 벡터 DNA 및 벡터 유래 전사체에 대한 제자리 혼성화에 의해 확인되었고, 대표적인 이미지가 도 13e에 도시되어 있다.
벡터 발현된 PAH의 기능은 간에서의 PAH 활성을 측정하여 테스트되었다. PAH 활성은 MS-기반 검정에 의해 Tyr으로의 Phe 전환을 정량화함으로써 측정되었다. 3개의 처리 코호트(저용량 내지 고용량)에서의 PAH 활성은 11.5 ± 7.9 μM (n=6), 42.8 ± 12.4 μM (n=8) 및 168.2 ± 21.4 μM (n=8) 13C-Tyr/mg 단백질이었다(도 14a). 비교를 위해, HET 및 WT 동물의 PAH 활성은 63.7 ± 5.9 μM (n=6) 및 111.8 ± 9.9 μM (n=6)인 반면, 미처치 Pah-KO 마우스(HOM, n=7)에서는 PAH 활성이 검출되지 않았다. 분석은 매우 낮은 벡터 DNA 및 mRNA 복사본을 가진 동일한 동물이 있는 저용량 코호트에서 검출 가능한 PAH 활성이 없는 3마리의 동물을 입증했다. PAH 활성은 벡터 전사 수준과 양호한 상관관계가 있었다(R2=0.88; 표시되지 않음).
간에서의 PAH 양성 세포의 수준을 이해하기 위해, 간 절편을 항-PAH 항체를 사용하여 IHC로 평가했다. 각 처치 코호트에서 간의 평균 PAH 양성 세포는 grp. 1 (HOM), 0.4 ± 0.1%, grp 2 (낮음) 21.0 ± 8.6%, grp 3 (중간) 42.2 ± 4.0%, grp 4 (높음) 52.8 ± 4.6%, grp 5 (HET) 93.6 ± 1.7% 및 grp 6 (WT) 97.4 ± 0.4% (WT)이었다(도 14b). 데이터는 PAH 양성 간의 약 20%가 혈중 Phe 정규화에 필요함을 보여주었다(도 14c). 20% PAH 양성 간 요건은 간세포 이식 실험에서 야생형 또는 이형접합체 간세포의 최소 10%가 Pahenu2 마우스에서의 혈중 Phe 수준을 정규화하는 데 필요하다는 것을 입증한 Hamman et al. (2011)의 발표된 간 재증식 결과와 일치한다. PAH IHC의 대표적인 이미지는 WT PAH를 암호화하는 벡터의 용량이 증가함에 따라 염색 강도가 증가함을 보여주었다(도 14d). PAH 염색은 처치된 간에서 음성 세포 사이에 분산된 매우 양성인 세포의 클러스터로 불균일한 염색 패턴을 보였다. 이는 염색 강도가 간 절편 전체에 걸쳐 균일한 HET 및 WT 간에서 관찰된 염색과 대조적이었다(도 14d).
XL32.1/WT PAH가 뇌 아미노산, 신경전달물질 수준 및 백질 함량에 미치는 영향
높은 혈중 Phe는 뇌로의 증가된 Phe 흡수로 인해 신경독성을 유발한다. 높은 혈중 Phe 수치는 또한 동일한 아미노산 수송체(LAT1)의 사용으로 인해 다른 대형 중성 아미노산(Tyr, Trp)의 뇌로의 흡수를 감소시킬 수 있다. 우리의 데이터는 각각의 처치 코호트가 다양한 효능을 나타내는 저용량으로 뇌 Phe 수준을 감소시켰음을 입증하였다(도 15a). 평균 뇌 Phe 수치는 grp. 1 (HOM), 167 ± 4 μM, grp 2 (낮음) 94 ± 27 μM, grp 3 (중간) 28 ± 3 μM, grp 4 (높음) 26 ± 1 μM, grp 5 (HET) 30 ± 3 μM 및 grp 6 (WT) 30 ± 1 μM이었다. 저용량 WT PAH 벡터 코호트를 제외한 모든 것은 HET 및 WT 마우스의 것과 비슷한 정규화된 뇌 Phe 수준을 보였다. 혈중 Phe 감소는 또한 뇌에서의 Tyr 수치를 개선했다: grp. 1 (HOM), 13 ± 1 μM, grp 2 (낮음) 16 ± 1 μM, grp 3 (중간) 16 ± 1 μM, grp 4 (높음) 19 ± 1 μM, grp 5 (HET) 20 ± 2 μM 및 grp 6 (WT) 20 ± 1 μM. 뇌로의 Trp 수송도 개선되었으며; 각 처치 grp의 평균 Trp 수준은 grp. 1 (HOM) 4.6 ± 0.2 μM, grp 2 (낮음) 5.7 ± 0.5 μM, grp 3 (중간) 5.4 ± 0.3 μM, grp 4 (높음) 6.5 ± 0.3 μM, grp 5 (HET) 6.3 ± 0.5 μM 및 grp 6 (WT) 6.4 ± 0.3 μM이었다. 그러나, 뇌 Tyr 및 Trp 수준에서 유의미한 처치 효과는 가장 높은 용량에서만 나타났다.
신경전달물질 수준 도파민 및 세로토닌은 PKU 환자의 뇌에서 감소된다. 기질 결핍(Tyr, Trp)과 이러한 신경전달물질에 대한 합성에 대한 Phe 독성이 설명으로 제안되었다. 본원에서 데이터는 간으로의 PAH 유전자 전달이 뇌에서 신경전달물질인 도파민 및 세로토닌 수준을 둘 다 향상시켰음을 입증했다(도 15b). 3e11 및 1e12/마우스 용량으로 처치하면, HET 및 WT 마우스에서와 유사한 신경전달물질 수준이 정규화되는 반면, 저용량 코호트에서는 가변성이 관찰되었다. 저용량 코호트(1e11 vg/마우스)의 가변성은 그들의 유전자 전달 효율 및 후속 Phe 제어(3마리의 효능 및 3마리의 비효능 동물)와 상관관계가 있었다. 도파민 및 세로토닌 수준과 뇌의 Phe 또는 기질 수준(도파민의 경우 Tyr 및 세로토닌의 경우 Trp)에 대한 상관 분석은 Phe 저하가 그들의 아미노산 기질 수준보다 더 많은 개선을 제공한다는 것을 보여주었다. 따라서, 도파민 생산은 뇌의 Tyr 수준(R2=0.3887)과 어느 정도 상관관계가 있었지만 뇌의 감소된 Phe 수준(R2=0.5057)과는 더 나은 상관관계를 나타냈다. 유사하게, 세로토닌 생성은 뇌에서 증가된 Trp 수준(R2=0.1938)에 대해 덜 교정되었지만, 뇌 Phe 수준(R2=0.6418.) 감소와 긴밀한 상관관계를 나타냈다.
뇌 건강에 대한 치료의 효능을 평가하기 위해 뇌 백질 변화를 평가하기 위해 생체내 MRI 연구를 수행하였다. 3D 체적 MRI 세분화 및 측정을 적용하여 뇌량에서 MRI 특성 모양을 정량화했다. MRI 분석은 MRI 뇌량 부피가 HET 및 WT 마우스와 비교하여 Pah-KO 마우스에서 유의하게 더 낮았고, 모든 Pah-KO 코호트가 기준선 평가에서 유사함을 보여주었다(도 16a). Pah-KO 마우스 처치 106일 후, 뇌량 부피는 특히 각 개별 동물의 기준선에 대한 백분율로 비교할 때 모든 용량 코호트에서 증가하였다(도 16b, 16c). 그러나, 처치 코호트 중 어느 것도 106일 시점에서 뇌량 부피를 정상 수준으로 교정하지 않았으며; 처치 코호트 중 어느 것으로도 뇌 중량이 정규화되지 않았다(도 16d).
Pah-KO 마우스의 행동 분석.
PKU 환자는 더 높은 비율의 불안, 우울증 및 운동 떨림을 앓는다. 마우스가 둥지를 만드는 능력을 측정하는 행동 분석이 이러한 문제를 측정하는 데 사용되었다(Deacon et al., 2006). 정상적인 동물은 패딩 재료를 찢고 원형의 볼록한 모양의 둥지로 정리하지만 우울증을 앓고 있는 동물은 이 재료를 전혀 사용하지 않거나 거의 사용하지 않는다. 사용된 네스팅 점수는 도 17a에 도시되어 있다. 처치전 점수는 다음과 같다: grp. 1 (HOM), 1.7 ± 0.4, grp 2 (낮음) 1.4 ± 0.2, grp 3 (중간) 1.7 ± 0.4, grp 4 (높음) 1.8 ± 0.4, grp 5 (HET) 5.0 ± 0.0 및 grp 6 (WT) 5.0 ± 0.0이고, 처치되지 않은 Pah-KO 마우스 코호트 간에는 유의한 차이가 없었다(도 17b). 처치 후 35일째, 처치된 Pah-KO 마우스 사이에서 네스팅 점수가 상당히 개선되었으며, grp 평균은 grp. 1 (HOM), 2.1 ± 0.6, grp 2 (낮음) 3.8 ± 0.5, grp 3 (중간) 4.6 ± 0.2, grp 4 (높음) 3.9 ± 0.4, grp 5 (HET) 5.0 ± 0.0 및 grp 6 (WT) 4.9 ± 0.1이었다. 처치된 Pah-KO 마우스는 HET 및 WT 마우스의 점수와 유의하게 상이하지 않았다. 97일에, grp 평균은 35일째와 유사했으며, 다음과 같았다: grp. 1 (HOM), 1.7 ± 0.3, grp 2 (낮음) 2.5 ± 0.6, grp 3 (중간) 4.1 ± 0.3, grp 4 (높음) 4. ± 0.3, grp 5 (HET) 5.0 ± 0.0 및 grp 6 (WT) 4.9 ± 0.1. 낮은 처리 그룹을 제외한 모든 그룹은 처치되지 않은 Pah-KO 마우스에 비해 유의하게 개선되었다. 유사하게, 저용량 코호트를 제외한 모든 코호트는 HET 또는 WT 마우스와 유의하게 상이하지 않았다.
요약
PKU 환자의 간에서 결함이 있는 PAH 활성을 교정하기 위해 기능적 Pah 유전자를 간으로 전달하는 유전자 요법은 PKU 환자에게 장기간 Phe 제어를 제공하는 매력적인 전략이다. 우리의 데이터는 XL32.1 캡시드로 구성되고 최적화된 간 발현 카세트(mA1MB2-mTTR482-HI2)에서 WT hPAH를 발현하는 rAAV 벡터가 4개월 연구기간 동안 인간 PKU 모델인 Pah-KO 마우스에서 여러 PKU 관련 병리를 교정할 수 있음을 입증했다. 이 벡터의 전신 전달은 Pah-KO 마우스의 간에서 벡터 DNA, 벡터 유래 mRNA, PAH 단백질 및 PAH 활성의 용량-의존적 증가를 초래했다. 테스트한 세 가지 벡터 용량(약 5e11, 2e13 및 5e13 vg/kg) 모두 최저 용량 코호트에서 가변성이 관찰되었지만 혈중 Phe 수치를 감소시켰다. 다양한 연구 종점에 대한 혈중 Phe 수치의 교정은 4개월 연구 기간 동안의 치료 이점이 혈중 Phe 정규화를 허용하기 위해 최소 0.1 벡터 DNA/세포, 3x106 mRNA/μg RNA 및 20% PAH 양성 간을 유지해야 함을 나타낸다. 20% PAH 양성 간 요건은 야생형 또는 이형접합체 간세포의 최소 10% 이식이 Pahenu2 마우스에서의 혈중 Phe 수치를 정규화하는 데 필요하다는 것을 입증한 Hamman et al. (16)의 발표된 간 재증식 결과와 유사하다. 본 실시예는 또한 4개월 동안 정규화된 아미노산 수송, 신경전달물질 도파민 및 세로토닌 수준 및 뇌량 부피 증가로 뇌 건강의 지속적인 개선을 입증했다. 이러한 생화학적 변화는 마우스의 행동 개선과 관련이 있으며; 이점은 처치 후 35일째에 이미 관찰되었고, 나중 시점(97일)까지 유지되었다. 흥미롭게도, 지속적인 Phe 제어가 부족한 저용량 그룹의 3마리 동물은 혈중 Phe 및 질환 병리와 상관관계가 있음을 시사하는 측정된 모든 종점에서 더 낮은 값을 나타냈다. 또한, 혈중 Phe의 정규화는 처치된 동물의 체중을 증가시켰고, 이는 PKU 동물의 전반적인 성장 및 대사에 대한 고페닐알라닌혈증의 주요 영향을 강조한다. 이 성장은 간세포의 증식을 암시하는 WT 및 HET 마우스 수준으로의 간 중량의 증가에 반영되었다. 그럼에도 불구하고 중간 및 높은 벡터 코호트는 연구가 끝날 때까지 효능을 제공하기에 충분한 벡터 DNA를 유지했다. 또한, 저용량 1e11 vg/마우스(5×1012 vg/kg) 용량 코호트에서 관찰된 가변성은 간 손상 또는 증식과 같은 벡터 게놈의 손실을 초래할 수 있는 상황에서 필요한 유전자 전달의 임계 수준을 정의할 수 있게 했다.
요약하면, 본 실시예는 rAAVXL32.1/WT hPAH 유전자 전달이 혈중 Phe 수치를 감소시켜 성장을 개선하고, 뇌 백질, 뇌 아미노산 함량 및 신경전달물질 수준을 증가시키고, 지속된 방식으로 전반적으로 행동을 개선할 수 있음을 입증하였다. 임상에서 이미 사용된 간 발현 카세트(LP1-SI, Nathwani 2011)에 대한 생체 내 리드 게놈(mA1MB2-mTTR482-HI2)의 비교는 마우스 간에서 리드 후보에 의한 전사 및 효소 활성의 더 높은 수준을 보여주었다. 따라서, 리드 후보의 더 높은 발현 수준과 XL32.1 캡시드에 의한 우수한 유전자 전달 효율의 조합은 잠재적으로 더 낮은 벡터 용량으로 임상에서 PKU 환자를 치료할 수 있게 하여 치료의 안전성 측면을 개선한다. 종합하면, 본 실시예는 임상적으로 효과적이고 실행 가능하며 안전한 AAV 벡터 용량으로 치료할 수 있게 함으로써 PKU 치료를 위한 이 벡터의 사용을 뒷받침한다.
실시예 6. 생체 내 간 발현 요소의 비교
상기 4개월 연구에서 사용된 mA1MB2-mTTR482-HI2를 갖는 XL32.1 벡터는 혈우병 B 시험에서 사용된 간 발현 카세트(LP1-SI)에 대해 평가되었다(Nathwani 2011). HI2 인트론을 갖는 LP1 프로모터를 갖는 중간 작제물도 평가하였다. (도 18a). 일시적 형질감염에 의한 인간 간 세포주, Huh7 세포에서 ITR 함유 플라스미드 작제물의 시험은 LP1 프로모터를 갖는 작제물과 비교하여 A1MB2 작제물로부터 더 높은 PAH 단백질 및 활성을 나타내었다(도 18b, 18c). XL32.1 캡시드에 포장된 3개의 발현 카세트를 비슷한 용량(3e11 vg/마우스)으로 투여하고, Pah-KO 마우스에서 5주 동안 평가하였다. 발현 카세트 비교에 사용된 모든 rAAV 벡터는 CsCl 구배로 정제하였다. 모든 벡터는 처치되지 않은 Pah-KO 마우스(HOM)의 것과 비교하여 혈중 Phe 수치를 상당히 감소시켰고, Phe 수치는 HET 마우스에서 관찰된 것과 유사하였다(도 18d). 근접 분석은 벡터 발현 수준의 차이를 보여주었다. 간에서 mRNA 수준의 정량화는 LP1-SI와 비교하여 mA1MB2-mTTR482 프로모터가 있는 벡터에서 더 높은 발현 경향을 보였고, 전사 수준이 정규화되었을 때 VG당 약 3배 더 높은 수준의 mRNA가 mA1MB2-mTTR482 프로모터로 관찰되었다. 평균 정규화된 RNA 수준(mRNA/VG)은: A1MB2, 133.9 ± 19.5, LP1-HI2, 95.5 ± 11.0, 및 LP1-SI, 43.0 ± 4.9 (도 18e)이었다. 유사하게, 간 PAH 효소 활성은 LP1-SI 작제물에 비해 mA1MB2-mTTR482-HI2 처치된 동물에서 3배 더 높았다. 연구 코호트에 대한 평균 간 PAH 활성(μM Tyr/mg 단백질)은 다음과 같다: A1MB2, 157.4 ± 25.7, LP1-HI2, 42.9 ± 10.2, LP1-SI, 54.9 ± 13.4, 및 HET 67.8 ± 10.9 (도 18f). PAH 활성이 VG 복사본으로 정규화되었을 때, 이 차이는 6배였다(도 18g). 활성이 mRNA 복사본으로 정규화되었을 때 더 적은 차이(2배)가 관찰되었으며, 이는 벡터 DNA로부터의 증가된 발현이 mRNA당 PAH 생산보다는 차이의 주요 원인임을 나타낸다(표시되지 않음). 따라서, 데이터는 LP1-SI 발현 카세트보다 mA1MB2-mTTR482-HI2로부터 마우스 간에서 더 강한 발현을 입증하였다.
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서열
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Figure pct00007
SEQUENCE LISTING <110> GENZYME CORP <120> HUMAN PAH EXPRESSION CASSETTE FOR TREATMENT OF PKU BY LIVER-DIRECTED GENE REPLACEMENT THERAPY <130> 15979-20178.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/121,797 <151> 2020-12-04 <150> US 63/086,537 <151> 2020-10-01 <160> 17 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 452 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Thr Ala Val Leu Glu Asn Pro Gly Leu Gly Arg Lys Leu Ser 1 5 10 15 Asp Phe Gly Gln Glu Thr Ser Tyr Ile Glu Asp Asn Cys Asn Gln Asn 20 25 30 Gly Ala Ile Ser Leu Ile Phe Ser Leu Lys Glu Glu Val Gly Ala Leu 35 40 45 Ala Lys Val Leu Arg Leu Phe Glu Glu Asn Asp Val Asn Leu Thr His 50 55 60 Ile Glu Ser Arg Pro Ser Arg Leu Lys Lys Asp Glu Tyr Glu Phe Phe 65 70 75 80 Thr His Leu Asp Lys Arg Ser Leu Pro Ala Leu Thr Asn Ile Ile Lys 85 90 95 Ile Leu Arg His Asp Ile Gly Ala Thr Val His Glu Leu Ser Arg Asp 100 105 110 Lys Lys Lys Asp Thr Val Pro Trp Phe Pro Arg Thr Ile Gln Glu Leu 115 120 125 Asp Arg Phe Ala Asn 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cgtgccctgg 360 ttccccagaa ccatccagga actggacaga ttcgccaacc agatcctgtc ctacggcgcc 420 gagctggatg ccgaccaccc tggcttcaag gaccccgtgt accgggccag acggaagcag 480 ttcgccgata tcgcctacaa ctaccggcac ggccagccca tccccagagt cgagtacatg 540 gaagaggaga agaaaacctg gggcaccgtg ttcaagaccc tgaagtccct gtacaagacc 600 cacgcctgct acgagtacaa ccacatcttc ccactgctcg aaaagtactg cggcttccac 660 gaggacaata tccctcagct ggaggacgtg tcccagtttc tgcagacctg caccggcttc 720 agactcaggc ctgtggccgg cctgctgagc agcagagatt ttctgggcgg actggccttc 780 cgggtgttcc actgcaccca gtacatcaga cacggcagca agcccatgta cacccctgag 840 cccgacatct gccacgagct gctgggacat gtgcccctgt tcagcgacag aagcttcgcc 900 cagttcagcc aggaaatcgg cctggcctct ctgggcgctc ccgacgagta tatcgagaag 960 ctggccacca tctactggtt caccgtggaa ttcggcctgt gcaagcaggg cgacagcatc 1020 aaggcctatg gcgccggact cctgtccagc ttcggcgagc tgcagtactg tctgagcgag 1080 aagcccaagc tgctgcccct ggaactggaa aagaccgcca tccagaacta caccgtgacc 1140 gagttccagc ccctgtacta cgtggccgag agcttcaacg acgccaaaga aaaagtgcgg 1200 aacttcgccg ccaccatccc tcggcccttc agcgtcagat acgaccccta cacccagcgg 1260 atcgaggtgc tggacaacac acagcagctg aaaattctgg ccgactccat caacagcgag 1320 atcggcatcc tgtgcagcgc cctgcagaaa atcaagtga 1359 <210> 3 <211> 737 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp 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aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120 gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctgg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420 ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc cagactcctc tacgggcatc 480 ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt ttggtcagac tggcgactca 540 gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag cagcgccctc tggtgtggga 600 cctaatacaa tggcttcagg cggtggcgca ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660 ggagtgggta atgcctcagg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720 atcaccacca gcacccgaac atgggccttg cccacctata acaaccacct ctacaagcaa 780 atctccagtg cttcaacggg ggccagcaac gacaaccact acttcggcta cagcaccccc 840 tgggggtatt ttgatttcaa cagattccac tgccatttct caccacgtga ctggcagcga 900 ctcatcaaca acaattgggg attccggccc aagagactca acttcaagct cttcaacatc 960 caagtcaagg aggtcacgac gaatgatggc gtcacgacca tcgctaataa ccttaccagc 1020 acggttcaag tcttctcgga ctcggagtac cagttgccgt acgtcctcgg ctctgcgcac 1080 cagggctgcc tccctccgtt cccggcggac gtgttcatga ttccgcaata cggctacctg 1140 acgctcaaca atggcagcca agccgtggga cgttcatcct tttactgcct ggaatatttc 1200 ccttctcaga tgctgagaac gggcaacaac tttaccttca gctacacctt tgaggaagtg 1260 cctttccaca gcagctacgc gcacagccag agcctggacc ggctgatgaa tcctctcatc 1320 gaccagtacc tgtattacct gaacagaact cagaatcagt ccggaagtgc ccaaaacaag 1380 gacttgctgt ttagccgtgg gtctccagct ggcatgtctg ttcagcccaa aaactggcta 1440 cctggaccct gttaccggca gcagcgcgtt tctaaaacaa aaacagacaa caacaacagc 1500 aactttacct ggactggtgc ttcaaaatat aacctcaatg ggcgtgaatc catcatcaac 1560 cctggcactg ctatggcctc acacaaagac gacaaagaca agttctttcc catgagcggt 1620 gtcatgattt ttggaaagga gagcgccgga gcttcaaaca ctgcattgga caatgtcatg 1680 atcacagacg aagaggaaat caaagccact aaccccgtgg ccaccgaaag atttgggact 1740 gtggcagtca atctccagag cagcagcaca gaccctgcga ccggagatgt gcatgttatg 1800 ggagccttac ctggaatggt gtggcaagac agagacgtat acctgcaggg tcctatttgg 1860 gccaaaattc ctcacacgga tggacacttt cacccgtctc ctctcatggg cggctttgga 1920 cttaagcacc cgcctcctca gatcctcatc aaaaacacgc ctgttcctgc gaatcctccg 1980 gcagagtttt cggctacaaa gtttgcttca ttcatcaccc agtattccac aggacaagtg 2040 agcgtggaga ttgaatggga gctgcagaaa gaaaacagca aacgctggaa tcccgaagtg 2100 cagtatacat ctaactatgc aaaatctgcc aacgttgatt ttactgtgga caacaatgga 2160 ctttatactg agcctcgccc cattggcacc cgttacctca cccgtcccct gtaa 2214 <210> 5 <400> 5 000 <210> 6 <211> 2214 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60 gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120 gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420 ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc cagactcctc tacgggcatc 480 ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt ttggtcagac tggcgactca 540 gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag cagcgccctc tggtgtggga 600 cctaatacaa tggcttcagg cggtggcgca ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660 ggagtgggta atgcctcagg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720 atcaccacca gcacccgaac atgggccttg cccacctata acaaccacct ctacaagcaa 780 atctccagtg cttcaacggg ggccagcaac gacaaccact acttcggcta cagcaccccc 840 tgggggtatt ttgatttcaa cagattccac tgccatttct caccacgtga ctggcagcga 900 ctcatcaaca acaattgggg attccggccc aagagactca acttcaagct cttcaacatc 960 caagtcaagg aggtcacgac gaatgatggc gtcacgacca tcgctaataa ccttaccagc 1020 acggttcaag tcttctcgga ctcggagtac cagttgccgt acgtcctcgg ctctgcgcac 1080 cagggctgcc tccctccgtt cccggcggac gtgttcatga ttccgcaata cggctacctg 1140 acgctcaaca atggcagcca agccgtggga cgttcatcct tttactgcct ggaatatttc 1200 ccttctcaga tgctgagaac gggcaacaac tttaccttca gctacacctt tgaggaagtg 1260 cctttccaca gcagctacgc gcacagccag agcctggacc ggctgatgaa tcctctcatc 1320 gaccagtacc tgtattacct gaacagaact cagaatcagt ccggaagtgc ccaaaacaag 1380 gacttgctgt ttagccgtgg gtctccagct ggcatgtctg ttcagcccaa aaactggcta 1440 cctggaccct gttaccggca gcagcgcgtt tctaaaacaa aaacagacaa caacaacagc 1500 aactttacct ggactggtgc ttcaaaatat aacctcaatg ggcgtgaatc catcatcaac 1560 cctggcactg ctatggcctc acacaaagac gacaaagaca agttctttcc catgagcggt 1620 gtcatgattt ttggaaagga gagcgccgga gcttcaaaca ctgcattgga caatgtcatg 1680 atcacagacg aagaggaaat caaagccact aaccccgtgg ccaccgaaag atttgggact 1740 gtggcagtca atctccagag cagcagcaca gaccctgcga ccggagatgt gcatgttatg 1800 ggagccttac ctggaatggt gtggcaagac agagacgtat acctgcaggg tcctatttgg 1860 gccaaaattc ctcacacgga tggacacttt cacccgtctc ctctcatggg cggctttgga 1920 cttaagcacc cgcctcctca gatcctcatc aaaaacacgc ctgttcctgc gaatcctccg 1980 gcagagtttt cggctacaaa gtttgcttca ttcatcaccc agtattccac aggacaagtg 2040 agcgtggaga ttgaatggga gctgcagaaa gaaaacagca aacgctggaa tcccgaagtg 2100 cagtatacat ctaactatgc aaaatctgcc aacgttgatt ttactgtgga caacaatgga 2160 ctttatactg agcctcgccc cattggcacc cgttacctca cccgtcccct gtaa 2214 <210> 7 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 gcgagaactt gtgcctcccc gtgttcctga cctttgaccc tctgtcctac ttagactaat 60 attgactttg ggtactgcaa acaggaaatg ggggagggat tcgatgcgag aacttgtgcc 120 tccccgtgtt cctgaccttt gaccctctgt cctacttaga ctaatattga ctttgggtac 180 tgcaaacagg aaatggggga ggga 204 <210> 8 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 ggccccaggt taatttttaa aaagcagtca aaggtcaaag tggcccttgg cagcatttac 60 tctctctatt gactttggtt aataatctca ggagcacaaa cattcctgga ggcaggagaa 120 gaaatcaaca tcctggactt atcctctggg cctctcccca ccttcgatgg ccccaggtta 180 atttttaaaa agcagtcaaa ggtcaaagtg gcccttggca gcatttactc tctctattga 240 ctttggttaa taatctcagg agcacaaaca ttcctggagg caggagaaga aatcaacatc 300 ctggacttat cctctgggcc tctccccacc 330 <210> 9 <211> 377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 gttcctagat tacattacac attctgcaag catagcacag gtcaaagttc aactttaatt 60 actttcattt tcttgtatcc tcacagccta gaaaataacc tgcgttacag catccactca 120 gtatcccttg agcatgaggt gacactactt aacataggga cgagatggta ctttgtgtct 180 cctgctctgt cagcagggca ctgtacttgc tgataccagg gaatattgat ttgtaaatac 240 catcattccg aacgtgtttg ccttggccag ttttccatgt acatgcagaa agaagtttgg 300 gactgatcaa tacagtcctc tgcctttaaa gcaataggaa aaggccaact tgtctacgtt 360 tagtatgtgg ctgtaga 377 <210> 10 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 ccatcagatc ctgcccaagg tcttacataa gaggactctt ggactcccag caatgtcaac 60 gaccgacctt gaggcctact tcaaagactg tgtgtttaag gactgggagg agctggggga 120 ggagattagg ttaaaggtct ttgtattagg aggctg 156 <210> 11 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 ggggaggctg 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tggattataa 720 acattcaaaa taatattttg acattatgat aattctgaat aaaagaacaa aaaccatggt 780 ataggtaagg aatataaaac atggctttta ccttagaaaa aacaattcta aaattcatat 840 ggaatcaaaa aagagcctgc aggtaccct 869 <210> 13 <211> 1302 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 ctcaattgga tgacactagt catcacattt aaaagcatct caggtaacta tattttgaat 60 tttttaaaaa agtaactata atagttatta ttaaaatagc aaagattgac catttccaag 120 agccatatag accagcaccg accactattc taaactattt atgtatgtaa atattagctt 180 ttaaaattct caaaatagtt gctgagttgg gaaccactat tatttctatc tactgtttta 240 attaaaatta tctctaaggc atgtgaactg gctgtcttgg ttttcatctg tacttcatct 300 gctacctctg tgacctgaaa catatttata attccattaa gctgtgcata tgatagattt 360 atcatatgta ttttccttaa aggatttttg taagaactaa ttgaattgat acctgtaaag 420 tctttatcac actacccaat aaataataaa tctctttgtt cagctctctg tttctataaa 480 tatgtaccag ttttattgtt tttagtggta gtgattttat tctctttcta tatatataca 540 cacacatgtg tgcattcata aatatataca atttttatga ataaaaaatt attagcaatc 600 aatattgaaa accactgatt tttgtttatg tgagcaaaca gcagattaaa aggaattcct 660 gcagattcag cagccgtaag tctaggacag gcttaaattg ttttcactgg tgtaaattgc 720 agaaagatga tctaagtaat ttggcattta ttttaatagg tttgaaaaac acatgccatt 780 ttacaaataa gacttatatt tgtccttttg tttttcagcc taccatgaga ataagagaaa 840 gaaaatgaag atcaaaagct tattcatctg tttttctttt tcgttggtgt aaagccaaca 900 ccctgtctaa aaaacataaa tttctttaat cattttgcct cttttctctg tgcttcaatt 960 aataaaaaat ggaaagaatc taatagagtg gtacagcact gttatttttc aaagatgtgt 1020 tgctatcctg aaaattctgt aggttctgtg gaagttccag tgttctctct tattccactt 1080 cggtagagga tttctagttt cttgtgggct aattaaataa atcattaata ctcttctaag 1140 ttatggatta taaacattca aaataatatt ttgacattat gataattctg aataaaagaa 1200 caaaaaccat ggtataggta aggaatataa aacatggctt ttaccttaga aaaaacaatt 1260 ctaaaattca tatggaatca aaaaagagcc tgcaggtacc ct 1302 <210> 14 <211> 4567 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60 cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttccttaccg cgtggcccca ggttaatttt taaaaagcag 180 tcaaaggtca aagtggccct tggcagcatt tactctctct attgactttg gttaataatc 240 tcaggagcac aaacattcct ggaggcagga gaagaaatca acatcctgga cttatcctct 300 gggcctctcc ccaccttcga tggccccagg ttaattttta aaaagcagtc aaaggtcaaa 360 gtggcccttg gcagcattta ctctctctat tgactttggt taataatctc aggagcacaa 420 acattcctgg aggcaggaga agaaatcaac atcctggact tatcctctgg gcctctcccc 480 accgatatct acctgctgat cgcccggccc ctgttcaaac atgtcctaat actctgtcgg 540 ggcaaaggtc ggcagtagtt ttccatctta ctcaacatcc tcccagtgta cgtaggatcc 600 tgtctgtctg cacatttcgt agagcgagtg ttccgatact ctaatctccc ggggcaaagg 660 tcgtattgac ttaggttact tattctcctt ttgttgacta agtcaataat cagaatcagc 720 aggtttggag tcagcttggc agggatcagc agcctgggtt ggaaggaggg ggtataaaag 780 ccccttcacc aggagaagcc gtcacacaga tccacaagct cctgctagcc aattgagtcg 840 ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc 900 tctgactgac cgcgttactc 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cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg 1800 gctctagagc ctctgctaac cttgttcttg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca 1860 acgtgctggt tattgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attcatttcg aagccgccac 1920 catgagcaca gccgtgctgg aaaaccccgg cctgggcaga aagctgagcg acttcggcca 1980 ggaaaccagc tacatcgagg acaactgcaa ccagaacggc gccatcagcc tgatcttcag 2040 cctgaaagaa gaagtgggcg ccctggccaa ggtgctgcgg ctgttcgagg agaacgacgt 2100 gaacctgacc cacatcgaga gccggcccag cagactgaag aaggacgagt acgagttctt 2160 cacccacctg gacaagcgga gcctgcccgc cctgaccaac atcatcaaga tcctgcggca 2220 cgacatcggc gccaccgtgc acgagctgag ccgggacaag aaaaaggaca ccgtgccctg 2280 gttccccaga accatccagg aactggacag attcgccaac cagatcctgt cctacggcgc 2340 cgagctggat gccgaccacc ctggcttcaa ggaccccgtg taccgggcca gacggaagca 2400 gttcgccgat atcgcctaca actaccggca cggccagccc atccccagag tcgagtacat 2460 ggaagaggag aagaaaacct ggggcaccgt gttcaagacc ctgaagtccc tgtacaagac 2520 ccacgcctgc tacgagtaca accacatctt cccactgctc gaaaagtact gcggcttcca 2580 cgaggacaat atccctcagc tggaggacgt gtcccagttt ctgcagacct gcaccggctt 2640 cagactcagg cctgtggccg gcctgctgag cagcagagat tttctgggcg gactggcctt 2700 ccgggtgttc cactgcaccc agtacatcag acacggcagc aagcccatgt acacccctga 2760 gcccgacatc tgccacgagc tgctgggaca tgtgcccctg ttcagcgaca gaagcttcgc 2820 ccagttcagc caggaaatcg gcctggcctc tctgggcgct cccgacgagt atatcgagaa 2880 gctggccacc atctactggt tcaccgtgga attcggcctg tgcaagcagg gcgacagcat 2940 caaggcctat ggcgccggac tcctgtccag cttcggcgag ctgcagtact gtctgagcga 3000 gaagcccaag ctgctgcccc tggaactgga aaagaccgcc atccagaact acaccgtgac 3060 cgagttccag cccctgtact acgtggccga gagcttcaac gacgccaaag aaaaagtgcg 3120 gaacttcgcc gccaccatcc ctcggccctt cagcgtcaga tacgacccct acacccagcg 3180 gatcgaggtg ctggacaaca cacagcagct gaaaattctg gccgactcca tcaacagcga 3240 gatcggcatc ctgtgcagcg ccctgcagaa aatcaagtga actagtctgt gccttctagt 3300 tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact 3360 cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat 3420 tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc 3480 aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gtaccaccgg tccaggggtg agtgaaggtt 3540 tggaagagtg tagcagaata agaaaccatg agtcccctcc ctgagaagcc ctgagccccc 3600 ttgacgacac acatccctcg aggctcagct tcatcatctg taaaaggtgc tgaaactgac 3660 catccaagct gccgaaaaag attgtgtggg gataattcaa aactagagga agatgcagaa 3720 tttctacatc gtggcgatgt caggctaaga gttgccatcg tggctgtcca tcgattttat 3780 tggaatcata tgtttatttg agggtgtctt ggatattaca aataaattgt tggagcatca 3840 ggcatatttg gtaattctgt ctaaggctcc ctgccccttg ttaattggca gctcagttat 3900 tcatccaggg caaacattct gcttactatt cctgagagct ttcctcatcc tctagattgg 3960 caggggaatt gcagttgcct gagcagcctc ccctctgcca taccaacaga gcttcaccat 4020 cgaggcttgc agagtggaca ggggcctcag ggacccctga tcccagcttt ctcattggac 4080 agaaggagga gactggggct ggagagggac ctgggccccc actaaggcca cagcagagcc 4140 aggactttag ctgtgctgac tgcagcctgg cttgcctcca ctgccctcct ttgcctcaag 4200 agcaagggag cctcagagtg gaggaagcag cccctggcct tgcctcccac ctcccctccc 4260 ctttgctgtt ttcctgggac 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480 ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgta cggggcgtgg 540 cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg 600 gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg 660 ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttttgg taatcgtgcg agagggcgca 720 gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc 780 ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaattgg gcggggaggg 840 ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg 900 gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac 960 cggcggctct agagcctctg ctaaccttgt tcttgccttc ttctttttcc tacagctcct 1020 gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattc 1069 <210> 16 <211> 901 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 ccaggggtga gtgaaggttt ggaagagtgt agcagaataa gaaaccatga gtcccctccc 60 tgagaagccc tgagccccct tgacgacaca catccctcga ggctcagctt catcatctgt 120 aaaaggtgct gaaactgacc atccaagctg ccgaaaaaga ttgtgtgggg ataattcaaa 180 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tcgcccacgc 60 ccgggctttg cccgggcg 78

Claims (50)

  1. rAAV 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자로서, 상기 rAAV 벡터는 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하며, 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자 및 인핸서를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(pPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하며, 여기서 이식유전자는 PAH 폴리펩티드를 암호화하며;
    AAV 바이러스 입자는 AAV-XL32 또는 AAV-XL32.1 캡시드를 포함하는, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자.
  2. 제1항에 있어서,
    mTTR 프로모터가 mTTR482 프로모터인, rAAV 입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    인핸서가 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있는, rAAV 입자.
  4. rAAV 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자로서, 상기 rAAV 벡터는 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하며, 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자 및 3’-요소를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하며, 3’ 요소는 알부민 3’ 요소(3’Alb) 또는 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3’ 요소(3’AlbSMAR)이며, 여기서 이식유전자는 PAH 폴리펩티드를 암호화하며;
    AAV 바이러스 입자는 AAV-XL32 또는 AAV-XL32.1 캡시드를 포함하는, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자.
  5. 제4항에 있어서,
    mTTR 프로모터가 mTTR482 프로모터인, rAAV 입자.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    3' 요소가 이식유전자에 대해 3'에 위치하는, rAAV 입자.
  7. rAAV 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자, 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서,
    상기 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자 및 인핸서 및 3' 요소를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(pPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하고, 상기 3' 요소는 알부민 3' 요소(3' Alb)이거나 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3' 요소(3' AlbSMAR)이며, 상기 이식유전자는 PAH 폴리펩티드를 암호화하고;
    AAV 바이러스 입자는 AAV-XL32 또는 AAV-XL32.1 캡시드를 포함하는, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자.
  8. 제7항에 있어서,
    mTTR 프로모터가 mTTR482 프로모터인, rAAV 입자.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    인핸서가 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있는, rAAV 입자.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    3' 요소가 이식유전자에 대해 3'에 위치하는, rAAV 입자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    발현 카세트는 인트론을 추가로 포함하는, rAAV 입자.
  12. 제11항에 있어서,
    인트론이 닭 β-액틴/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론인, rAAV 입자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    발현 카세트는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는, rAAV 입자.
  14. 제13항에 있어서,
    폴리아데닐화 신호가 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, rAAV 입자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    PAH 폴리펩티드는 야생형 PAH 폴리펩티드인, rAAV 입자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    PAH 폴리펩티드는 인간 PAH 폴리펩티드인, rAAV 입자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    PAH 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, rAAV 입자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    이식유전자는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 80% 동일한, rAAV 입자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 플랭킹된 발현 카세트를 포함하는, rAAV 입자.
  20. 제19항에 있어서,
    제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 발현 카세트가 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹된, rAAV 입자.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, rAAV 입자.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV ITR은 AAV2 ITR인, rAAV 입자.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 자기-상보성 벡터인, rAAV 입자.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 벡터는 PAH 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산 서열 및 PAH 폴리펩티드의 보체를 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고, 제1 핵산 서열은 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, rAAV 입자.
  25. 제24항에 있어서,
    제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함하는, rAAV 입자.
  26. rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자로서,
    상기 rAAV 벡터가 5’ 내지 3’에 AAV2 ITR, 변형된 알파1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터, 닭 β-액틴/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론, 코돈-최적화된 인간 PAH 유전자, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, 알파-1-항트립신 유전자로부터 유래된 스터퍼 단편 및 AAV2 ITR을 포함하는, rAAV 입자.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 캡시드가 AAV-XL32 캡시드인, rAAV 입자.
  28. 제27항에 있어서,
    AAV-XL32 캡시드는 서열번호 3과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV-XL32 캡시드 단백질을 포함하는, rAAV 입자.
  29. 제28항에 있어서,
    AAV-XL32 캡시드는 VP1, VP2, 및 VP3을 포함하며, 여기서 VP1, VP2, 및 VP3은 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화되는, rAAV 입자.
  30. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 캡시드가 AAV-XL32.1 캡시드인, rAAV 입자.
  31. 제30항에 있어서,
    AAV-XL32.1 캡시드는 서열번호 3과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 입자.
  32. 제30항에 있어서,
    AAV-XL32.1 캡시드는 VP1, VP2, 및 VP3을 포함하며, 여기서 VP1, VP2, 및 VP3은 서열번호 6의 핵산 서열에 의해 암호화되는, rAAV 입자.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 rAAV 입자를 포함하는 조성물.
  34. 제33항에 있어서,
    약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  35. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 rAAV 입자를 포함하는 세포.
  36. PAH 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
    PAH 폴리펩티드를 생성하는 조건에서 제35항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    PAH 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서,
    제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서,
    제33항 또는 제34항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서,
    제35항의 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체는 PAH 활성이 부족한, 방법.
  42. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서,
    제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  43. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서,
    제33항 또는 제34항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서,
    제35항의 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료 전 개체의 혈중 페닐알라닌 수치는 연령대가 유사한 대조군 개체의 혈중 페닐알라닌 수치에 비해 높은, 방법.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    rAAV 입자, 조성물, 또는 세포는 정맥내, 동맥내, 간내, 간문맥내, 복강내, 또는 피하 투여되는, 방법.
  47. 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여는 다른 요법과 병용되는, 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    다른 요법은 테트라하이드로비옵테린을 사용한 치료, 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 또는 페길화 PAL을 사용한 치료, 또는 페닐알라닌 제한 식이요법인, 방법.
  49. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 rAAV 입자, 제33항 또는 제34항의 조성물, 또는 제35항의 세포를 포함하는 키트.
  50. 제49항에 있어서,
    사용 설명서; 완충제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 부형제; 및/또는 병, 바이알, 및/또는 주사기를 추가로 포함하는 키트.
KR1020237014666A 2020-10-01 2021-09-30 간-유도 유전자 대체 요법에 의한 pku의 치료를 위한 인간 pah 발현 카세트 KR20230079172A (ko)

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